BRPI0707165A2

BRPI0707165A2 - sitio de ligação para retigabina sobre kcnq5

Info

Publication number: BRPI0707165A2
Application number: BRPI0707165-5A
Authority: BR
Inventors: Kun Liu; Qiang Wang; Thomas Michael Argentieri
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2006-01-19
Filing date: 2007-01-17
Publication date: 2011-04-26
Also published as: CN101370824A; JP2009525024A; CA2634221A1; EP1973939A2; US20070190554A1; AU2007207596A1; WO2007084531A3; WO2007084531A2

Abstract

SìTIO DE LIGAçãO PARA RETIGABINA SOBRE KCNQ5. São aqui mostrados sequências de ácidos nucléicos e polipeptídeos de canais de potássio KCNQ5 mutados que carecem de capacidade de resposta para o ativador de canal de potássio retigabina. Também são aqui mostrados processos e kits relacionados ao uso dos canais de potássio KCNQ5 mutados mencionados anteriormente.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SITIO DE LI-GAÇÃO PARA RETIGABINA SOBRE KCNQ5".

Campo da Invenção

É aqui mostrado um novo sítio de ligação para retigabina sobreKCNQ5, e o gene, ácido nucléico, proteína, vetores, e processos de seu uso.

Antecedentes da Invenção

Canais de íons são proteínas celulares que regulam o fluxo deíons, incluindo cálcio, potássio, sódio e cloreto , dentro e fora de células. Es-tes canais afetam processos tais como transmissão de nervo, contração demúsculo e secrèção. Entre os canais de íons, canais de potássio são osmais ubíquos e diversos, sendo encontrados em uma variedade de célulasanimais como tecido de nervo, muscular, glandular, imune, reprodutivo, eepitelial. Tais canais permitem o fluxo de potássio dentro e/ou fora da célulasob certas circunstâncias. Por exemplo, o fluxo para fora de íons potássiocom abertura destes canais torna o interior da célula mais negativo, contra-balançando voltagens despolarizantes aplicadas à célula. Estes canais sãoregulados, por exemplo, por sensibilidade de cálcio, bloqueio de voltagem,segundos mensageiros, Iigantes extracelulares, e sensibilidade de ATP.

Canais de potássio são proteínas atravessando membrana quegenericamente atuam para hiper-polarizar neurônios e células de músculo.Estudos fisiológicos indicam que correntes de potássio são encontradas namaioria de células e são associadas com uma ampla faixa de funções, inclu-indo a regulação das propriedades elétricas de células excitáveis. Depen-dendo do tipo de canal de potássio, sua atividade funcional pode ser contro-Iada por voltagem de transmembrana, Iigantes diferentes, fosforilação deproteína, ou outros segundos mensageiros (ver, por exemplo, patente US 6893 858).

A família de canal de potássio possui aproximadamente setentamembros em tecidos mamíferos. A recentemente identificada subfamíliaKCNQ (Kv7) foi mostrada desempenhar um importante papel funcional comodeterminantes de excitabilidade de célula. Recente evidência indica que assubunidades de canal de potássio KCNQ formam a base molecular paraatividade de corrente M em vários tipos de tecidos. Esta família de genesevoluiu para conter pelo menos cinco principais subunidades designadasKCNQ1 até KCNQ5 (Kv7.1-7.5). Esta subunidades foram mostradas co-montarem para formação de canais de íons funcionais heteroméricos e ho-moméricos.

Canais de potássio dependentes de voltagem são reguladoreschaves do potencial de membrana em descanso e modulam a excitabilidadede células eletricamente ativas, tais como neurônicos ou miócitos. Váriasclasses de canais de potássio (K+) dependentes de voltagem foram clonadas(ver, por exemplo, Lerche C et al., J. Biol. Chem. 275:22395-22400 (2000)).

Mutações em quatro dos cinco genes de canal de potássioKCNQ são implicadas em diversas doenças, causando síndrome LQT cardí-aca (KCNQ1), epilepsia (KCNQ2, e 3), surdez congenital (KCNQ4). Devido àimportância de KCNQ5 em formação de corrente -M demonstrada no siste-ma nervoso central (CNS), é presumido que a falha deste gene pode resultarem distúrbio de excitabilidade neuronal (ver, por exemplo, Lerche C et al., J.Biol. Chem. 275:22395-22400 (2000); Schroeder BC et al., J. Biol. Chem.275:24089-95(2000)).

Canais de potássio estão envolvidos em um número de proces-sos fisiológicos, incluindo regulação de batimento cardíaco, dilatação de ar-térias, liberação de insulina, excitabilidade de células de nervos, e regulaçãode transporte de eletrólito renal.

Retigabina (etil éster de ácido (N-(2-amino-4-(4-flúor benzil ami-no) fenil) carbâmico foi verificada abrir certos tipos de canais KCNQ, incluin-do KCNQ5. Retigabina, entretanto, não tem efeito de aperfeiçoamento sobreKCNQ1, que é homólogo a KCNQ5 através de 37% de identidade de se-qüência. Retigabina exerce seus efeitos celulares através de aumento deprobabilidade aberta destes canais (Main J, Mol. Pharmacol. 58:253-62(2000); Wickenden A et al., Mol Pharmacol. 58:591-600 (2000)). Este au-mento na abertura de canais KCNQ individuais resulta coletivamente na hi-per-polarização de membranas de células, particularmente em células des-polarizadas, produzida por significantes aumentos em condutância mediadapor KCNQ em célula integral.

São aqui mostrados mutantes de KCNQ5 que perderam a pro-priedade funcional para responderem a retigabina.

Resumo da Invenção

Um aspecto é para um polinucleotídeo isolado codificando todoou uma porção de um polipeptídeo KCNQ5 (W270L).

Um outro aspecto é para um polinucleotídeo isolado compreen-dendo um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em:

(a) uma seqüência de ácidos nucléicos compreendendo SEQ ID NO: 1;

(b) um polinucleotídeo codificando SEQ ID NO: 2;

(c) uma seqüência de ácidos nucléicos codificando um polipeptí-deo tendo pelo menos cerca de 95% de homologia com SEQ ID NO: 1, con-tanto que uma substituição em nucleotídeos 808-810 seja por um códon queproduz uma substituição conservativa para o aminoácido leucina;

(d) uma molécula de ácido nucléicò que é capaz de hibridizarsob condições altamente rigorosas para SEQ ID NO: 1;

(e) uma molécula de ácido nucléicò que é complementar a (a),(b), (c), ou (d); e

(f) uma variante de SEQ ID NO: 1.

Uma outra realização é um polinucleotídeo isolado codificandoum polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembrana S5-S6 deKCNQ1.

Ainda um aspecto é para um polinucleotídeo isolado compreen-dendo um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em:

(a) uma seqüência de ácidos nucléicos compreendendo SEQ IDNO: 3, onde nucleotídeos 769-1062 são substituídos com SEQ ID NO: 5;

(b) um polinucleotídeo codificando SEQ ID NO: 4, onde aminoá-cidos 257-354 são substituídos com um domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1;

(c) uma molécula de ácido nucléicò que é capaz de hibridizarsob condições altamente rigorosas para a seqüência de ácidos nucléicos de(a) ou (b); e

(d) uma molécula de ácido nucléico que seja complementar a(a),(b), ou (c).

(a) uma seqüência de ácidos nucléicos compreendendo SEQ IDNO: 3, onde nucleotídeos 769-873 são substituídos com nucleotídeos 1-105de SEQ ID NO: 5;

(b) um polinucleotídeo codificando SEQ ID NO; 4. onde aminoá-cidos 257-291 de SEQ ID NO: 4 são substituídos com um domínio trans-membrana S5 de KCNQ1;

(c) uma molécula de ácido nucléico que é capaz de hibridizarsob condições altamente rigorosas à seqüência de ácidos nucléicos de (a)ou (b); e

(d) uma molécula de ácido nucléico que é complementar a (a),(b), ou (c).

Uma outra realização é um polipeptídeo isolado compreendendouma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em:

(a) uma seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo KCNQ5(W270L);

(b) uma seqüência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 2;

(c) uma variante de (a); e

(d) uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 90% deidentidade à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, contanto que umasubstituição no aminoácido 270 seja uma substituição conservativa para oaminoácido leucina.

Ainda um aspecto é para um canal dimérico KCNQ compreen-dendo pelo menos uma subunidade KCNQ5 que é o polipeptídeo isoladomencionado anteriormente. Um outro aspecto é para um canal tetraméricoKCNQ compreendendo pelo menos uma subunidade KCNQ5 que é o poli-peptídeo isolado mencionado anteriormente.Ainda uma realização é um anticorpo que se liga especificamen-te a um polipeptídeo KCNQ5(W270L) compreendendo SEQ ID NO: 2.

Um outro aspecto é um anticorpo que se liga especificamente aum fragmento de polipeptídeo KCNQ5(W270L) compreendendo pelo menos8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2, onde o dito fragmento inclui a-minoácido 270 de SEQ ID NO: 2.

Ainda um aspecto é um polipeptídeo KCNQ5 isolado contendoum domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1.

Ainda um aspecto é um polipeptídeo KCNQ5 isolado contendoum domínio transmembrana S5 de KCNQ1. Ainda um aspecto é um canaldimérico KCNQ compreendendo pelo menos uma subunidade KCNQ5 que éo polipeptídeo KCNQ5 isolado mencionado anteriormente contendo um do-mínio transmembrana S5-S6 ou um domínio transmembrana S5 de KCNQ1.Um outro aspecto é um canal tetramérico KCNQ compreendendo pelo me-nos uma subunidade KCNQ5 que é o polipeptídeo KCNQ5 isolado mencio-nado anteriormente contendo um domínio transmembrana S5-S6 ou um do-mínio transmembrana S5 de KCNQ1.

Um outro aspecto é um processo para seleção de agentes, oprocesso compreendendo:

(a) contato de um agente com uma molécula KCNQ5 seleciona-da do grupo consistindo em:

(i) um polinucleotídeo codificando todo ou uma porção de umpolipeptídeo KCNQ5(W270L);

(ii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1;

(iii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio transmembrana S5 de KCNQ1;

(iv) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá-cidos de um polipeptídeo KCNQ5(W270L);

(v) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembra-na S5-S6 de KCNQ1; e

(vi) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmem-brana S5 de KCNQ1; e

(b) detectando um efeito do dito agente sobre a atividade deKCNQ5;

onde detecção de uma diminuição ou um aumento em atividade de KCNQ5é indicativa de um agente sendo um modulador de KCNQ5.

Ainda uma realização é um processo de seleção para agentes, oprocesso compreendendo:

(a) contato de uma célula com um agente; e

(b) determinação de nível de expressão de uma molécula deKCNQ5 selecionada do grupo consistindo em:

(vi) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmem-brana S5 de KCNQ1;

onde detecção de uma diminuição ou um aumento em expressão de KCNQ5é indicativa de um agente sendo um modulador de KCNQ5.

Um outro aspecto é para processos de indução ou manutençãode controle de bexiga, tratamento ou prevenção de incontinência urinária, outratamento ou prevenção de dor neuropática em um mamífero, o processocompreendendo administração a um mamífero em sua necessidade de umaquantidade farmacologicamente efetiva do agente identificado através dequalquer um dos processos mencionados anteriormente.

Um outro aspecto é para um processo para identificação de poli-peptídeos capazes de ligação a um polipeptídeo KCNQ5 compreendendo:(a) aplicação de um procedimento dois híbridos mamíferos ondeuma seqüência codificando um polipeptídeo KCNQ5 é carreada por um vetorhíbrido e seqüência de uma biblioteca de ADN genômico ou ADNc é carrea-da pelo segundo vetor híbrido, onde o polipeptídeo KCNQ5 é selecionado dogrupo consistindo em:

(i) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá-cidos de um polipeptídeo KCNQ5 (W270L);

(ii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembra-na S5-S6 de KCNQ1; e

(iii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmem-brana S5 de KCNQ1;

(b) transformação de célula hospedeira com os vetores;

(c) isolamento de células transformadas positivas; e

(d) extração do dito segundo vetor híbrido para obter uma se-qüência codificando um polipeptídeo que se liga ao polipeptídeo KCNQ5.

Ainda um aspecto é para processo para detecção de um poli-peptídeo KCNQ5 compreendendo detecção de ligação de um anticorpo se-lecionado do grupo consistindo em

(a) um anticorpo que liga seletivamente um polipeptídeo KCNQ5compreendendo uma seqüência de aminoácidos de um polipeptídeoKCNQ5(W270L);

(b) um anticorpo que liga seletivamente um polipeptídeo KCNQ5contendo um domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1;

(c) um anticorpo que liga seletivamente um polipeptídeoKCNQ5contendo um domínio transmembrana S5 nde KCNQ1; e

(d) um anticorpo que liga seletivamente um fragmento de poli-peptídeo KCNQ5(W270L) compreendendo pelo menos 8 aminoácidos contí-guos de SEQ ID NO: 2, onde o dito fragmento inclui aminoácido 270 de SEQID NO: 2;

a uma molécula em uma amostra suspeita de conter um polipeptídeoKCNQ5, um polipeptídeo KCNQ5(W270L), ou um fragmento de polipeptídeoKCNQ5(W270L), onde o anticorpo é contatado com a amostra sob condi-ções que permitem específica ligação com qualquer polipeptídeo KCNQ5,polipeptídeo KCNQ5(W270L), ou fragmento de polipeptídeo KCNQ5(W270L)presente na amostra e ligação do anticorpo à molécula na amostra indica apresença de um polipeptídeo KCNQ5, polipeptídeo KCNQ5(W270L), oufragmento de polipeptídeo KCNQ5(W270L).

Ainda uma realização é um processo para detecção de expres-são de KCNQ5 compreendendo detecção de ARNm codificando um polipep-tídeo KCNQ5 selecionado do grupo consistindo em:

(i) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá-cidos de um polipeptídeo KCNQ5(W270L);

(ii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio trans-membrana S5-S6 de KCNQ1; e

(iii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio trans-membrana S5 de KCNQ1;

em uma amostra de uma célula ou tecido suspeito de expressar KCNQ5com uma sonda compreendendo pelo menos 12 nucleotídeos contíguos apartir de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em:

(ii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio de trans-membrana S5-S6 de KCNQ1; e

(iii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio trans-membrana S5 de KCNQ1.

Uma outra realização é um processo para determinação de seum gene KCNQ5 sofreu mutação ou supressão compreendendo detecção,em uma amostra de células ou tecido de um sujeito, a presença ou ausênciade uma alteração genética caracterizada por pelo menos uma alteração afe-tando a integridade de um gene codificando uma proteína KCNQ5 ou a máexpressão de um gene KCNQ5, onde a etapa de detecção é realizada compelo menos uma sonda ou iniciador compreendendo pelo menos 12 nucleo-tídeos contíguos a partir de um polinucleotídeo selecionado do grupo consis-tindo em:(i) um polinucleotídeo codificando todo ou uma porção de umpolipeptídeo KCNQ5(W270L);

(ii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio trans-membrana S5-S6 de KCNQ1; e

Ainda um aspecto é para um processo de identificação de vari-antes de um polipeptídeo KCNQ5 compreendendo seleção de uma bibliote-ca combinatorial compreendendo mutantes KCNQ5 para agonistas ou anta-gonistas de polipeptídeo KCNQ5; onde o polipeptídeo KCNQ5 é selecionadodo grupo consistindo em:

(iii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio trans-membrana S5 de KCNQ1.

Ainda um aspecto é para um processo de isolamento de um po-lipeptídeo KCNQ5 compreendendo:

(a) contato de um anticorpo KCNQ5 com uma amostra suspeitade conter um polipeptídeo KCNQ5 selecionado do grupo consistindo em:

(v) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio trans-membrana de KCNQ1; e

(vi) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio trans-membrana S5 de KCNQ1; e

(b) isolamento de um complexo de anticorpo KCNQ5 - polipeptí-deo KCNQ5 a partir da amostra.

Ainda uma realização é um processo de produção de um poli-peptídeo KCNQ5 compreendendo:

(a) cultura de uma célula hospedeira transformada compreen-dendo um vetor de expressão; onde o dito vetor de expressão compreendeum polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em:

(iii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio trans-membrana S5 de KCNQ1;

em um meio apropriado de modo que um polipeptídeo KCNQ5 seja produzido; e

(b) opcionalmente, recuperando o polipeptídeo KCNQ5 de etapa (a).

Uma outra realização é um processo para o tratamento de ummamífero em necessidade de aumentada atividade de KCNQ5 compreen-dendo administração ao mamífero em sua necessidade de uma quantidadeterapeuticamente efetiva de uma molécula de KCNQ5 selecionada do grupoconsistindo em:

(ii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio trans-membrana S5-S6 de KCNQ1;

(v) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio trans-membrana S5-S6 de KCNQ1 ;e

(vi) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio trans-membrana S5 de KCNQ1.

Ainda um aspecto é para um processo para o tratamento de ummamífero em necessidade de diminuída atividade de KCNQ5 compreenden-do administração ao mamífero em sua necessidade, de uma quantidade te-rapeuticamente efetiva de:

(a) um polinucleotídeo anti - sentido KCNQ5 que é anti-sentidopara um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em:

(iii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio trans-membrana S5 de KCNQ1; ou

(b) um anticorpo KCNQ5 selecionado do grupo consistindo em:

(A) um anticorpo que seletivamente liga um polipeptídeo KCNQ5compreendendo uma seqüência de aminoácidos de um polipeptídeoKCNQ5(W270L);

(B) um anticorpo que liga seletivamente um polipeptídeo KCNQ5contendo um domínio trans-membrana S5-S6 de KCNQ1;

(C) um anticorpo que liga seletivamente um polipeptídeo KCNQ5contendo um domínio trans-membrana S5 de KCNQ1; e

(D) um anticorpo que liga seletivamente um fragmento de poli-peptídeo KCNQ5(W270L) compreendendo pelo menos 8 aminoácidos contí-

guos de SEQ ID NO: 2, onde o dito fragmento inclui aminoácido 270 de SEQID NO: 2.

Um outro aspecto é para um processo para obtenção de anticor-pos polipeptídeo anti-KCNQ5 compreendendo:

(a) imunização de um animal com um polipeptídeo KCNQ5 imu-nogênico ou uma sua porção imunogênica única para um polipeptídeoKCNQ5, onde o dito polipeptídeo KCNQ5 é selecionado do grupo consistin-do em:

(iii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio trans-membrana S5 de KCNQ1; e

(b) isolamento a partir de anticorpos animais que especificamen-te ligam-se a um polipeptídeo KCNQ5.

Ainda um aspecto é par aum processo para ensaio de habilidadede um polipeptídeo KCNQ5 codificar um canal de íon funcional compreen-dendo:

(a) tranfecção de uma célula hospedeira com um polinucleotídeocodificando um polipeptídeo KCNQ5 selecionado do grupo consistindo em:

(iii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio trans-membrana S5 de KCNQ1;

(b) expressão de polipeptídeo KCNQ5 na célula hospedeira; e

(c) medição eletrofisiológica de magnitude de corrente de íon dopolipeptídeo KCNQ5.

Uma outra realização é um processo para prevenção em um su-jeito de uma doença ou condição que pode se beneficiar de modulação deatividade e/ou expressão de KCNQ5 compreendendo administração ao su-jeito de um polipeptídeo ou agente KCNQ5 que modula expressão deKCNQ5 ou pelo menos uma atividade de KCNQ5, onde o polipeptídeoKCNQ5 é selecionado do grupo consistindo em:

(iii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio trans-membrana S5 de KCNQ1.

Ainda uma realização é um kit para detecção de polipeptídeo oupolinucleotídeo KCNQ5 compreendendo:

(a) um composto ou agente marcado capaz de detectar um poli-peptídeo ou polinucleotídeo KCNQ5 em uma amostra biológica;

(b) meios para determinação de quantidade de polipeptídeo oupolinucloeotídeo KCNQ5 na amostra;

(c) meios para comparação de quantidade de polipeptídeo oupolinucleotídeo KCNQ5 na amostra com um padrão; e

(d) opcionalmente, instruções para uso do kit para detectar poli-peptídeo ou polinucleotídeo KCNQ5;

onde o polipeptídeo ou polinucleotídeo KCNQ5 é selecionado do grupo con-sistindo em:

(iii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio trans-membrana de KCNQ1;

(v) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio trans-membrana S5-S6 de KCNQ1; e

(vi) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio trans-membrana S5 de KCNQ1.

Uma outra realização é um kit para identificação de moduladoresde atividade de KCNQ5 compreendendo:

(a) uma célula ou composição compreendendo um polipeptídeoKCNQ5;

(b) meios para determinação de atividade de polipeptídeoKCNQ5; e

(c) opcionalmente, instruções para uso do kit para identificaçãode moduladores de atividade de KCNQ5;

onde o polipeptídeo KCNQ5 é selecionado do grupo consistindo em:

(i) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá-cidos de um polipeptídeo KCNQ5(W270L);(ii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio trans-membrana S5-S6 de KCNQ1; e

(iii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio trans-membrana S5 de KCNQ1.

Ainda uma realização é um kit para diagnóstico de um distúrbioassociado com aberrante expressão e/ou atividade de KCNQ5 em um sujeitocompreendendo:

(a) um reagente para determinação de expressão de um polipep-tídeo ou polinucleotídeo KCNQ5;

(b) um controle ao qual os resultados do sujeito são compara-dos; e

(c) opcionalmente, instruções para uso do kit para propósitosdiagnósticos;onde o polipeptídeo ou polinucleotídeo KCNQ5 é selecionado do grupo con-sistindo em:

(iv) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá-cidos de um polipeptídeo KCMQ5(W270L);

um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio trans-membranaS5 de KCNQ1.

Outros objetos e vantagens tornar-se-ão aparentes para aquelesversados na técnica com referência à descrição detalhada que se segue.

Breve Descrição das Seqüências

SEQ ID NO: 1 representa ADNc KCNQ(W270L).SEQ ID NO: 2 representa uma proteína KCNQ(W270L).SEQ ID NO: 3 representa ADNc KCNQ5 humano tipo selvagem.

SEQ ID NO: 4 representa proteína KCNQ5 humana tipo selvagem.

SEQ ID NO: 5 representa um domínio trans-membrana S5-S6 de ADNcKCNQ1 humano.

SEQ ID NO: 6 representa um domínio trans-membrana S5-S6 de KCNQ1humano (seqüência de aminoácidos traduzida).

SEQ ID NO: 7 representa ADN KCNQ1 humano tipo selvagem.

SEQ ID NO: 8 representa proteína KCNQ1 humana tipo selvagem.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 (A), traços de corrente de Q5Q1P evocados por uma série depulsos de voltagem despolarizados a partir de -100 a 60 mV em incrementosde 10 mV (potencial de retenção foi -100 mV) na ausência (painel esquerdo)e presença (painel direito) de retigabina 50 μΜ. (B)1 o curso de tempo deefeito de retigabina sobre mutantes Q5Q1P. (C)1 relação corrente (/) - volta-gem de mutantes Q5Q1P na ausência (n = 9) e presença (n = 7, 5 minutosapós a aplicação) de retigabina 50 μΜ. Nenhma diferença significante é en-contrada em qualquer um dos pontos de dado (p> 0,05).

A Figura 2 (A), traços de corrente de Q5Q1S5 evocados por umasérie de pulsos de voltagem despolarizados a partir de -100 a 60 mV em in-crementos de 10 mV (potencial de retenção foi -100 mV) na ausência (painelesquerdo) e presença (painel direito) de retigabina 50 μΜ. (Β), o curso detempo de efeito de retigabina sobre mutantes Q5Q1P. (C)1 relação de cor-rente (/) - voltagem de mutantesd Q5Q1S5 na ausência (n = 7) e presença (n= 7) de retigabina 50 μΜ. Nenhuma diferença significante é encontrada emqualquer um dos pontos de dados (p>0,05) entre estes dois grupos.

Figura 3 Análises de mutagênese de domínio S5 em KCNQ5.

Alinhamento de seqüência de todos os cinco membros em família KCNQ émostrado no alto. Os resíduos mais diversos entre KCNQ1 e os outrosmembros são destacados em negrito e os correspondentes resíduos emKCNQ5 foram individualmente mutados para suas contrapartes em KCNQ1.

Então cada mutante com mutação simples foi testado com retigabina 50 μΜe as vezes de aumento (ΙΔ/!ο) em amplitude de corrente foi plotado no gráficono fundo. Em todos os mutantes, η igual a 6.

Figura 4 (A), traços de corrente anotados sobre KCNQ1 tipo sel-vagem na ausência (Controle) e na presença de retigabina 50 μΜ e 200 μΜ.(Β), traços de corrente anotados de KCNQ1 L171W na ausência (Controle) epresença de retigabina 50 μΜ e 200 μΜ. (C), traços de corrente superpostosevocados por pulso de voltagem de 80 mV a partir de KCNQ1 L171W naausência e presença de retigabina 50 μΜ e 200 μΜ. (D), relações de corren-te - voltagem de KCNQ1 L171W na ausência (círculo aberto) e presença deretigabina 50 μ (quadrado aberto) e 200 μΜ (triângulo aberto). As amplitudesde estado estável das correntes evocadas por uma série de pulsos de volta-gem despolarizados a partir de -100 a 80 mV em incremento de 10 mV fo-ram normalizados para o nível evocado pelo potencial de membrana de 80mV no grupo controle. O potencial de retenção foi -100 mV. Dados foramcoletados de 10 oócitos em cada grupo. O gráfico inserido mostra a condu-tância de canal (G) normalizada para o nível em 80 mV (Gmax na ausência(círculo aberto) e presença de retigabina 200 μΜ (triângulo aberto), paracomparar o efeito de retigabina sobre dependência de voltagem de ativaçãode canal.

Descrição Detalhada da Invenção

Os requerentes especificamente incorporam os inteiros conteú-dos de todas as referências citadas nesta exposição. Ainda, quando umaquantidade, concentração, ou outro valor ou parâmetro é dado tanto com ouma faixa, faixa preferida, ou uma lista de valores superiores preferíveis ouvalores inferiores preferíveis, isto é para ser entendido como especificamen-te mostrando todas as faixas formadas a partir de qualquer par de qualquerlimite de faixa superior ou valor preferido e qualquer limite de faixa inferior ouvalor preferido, independente de se faixas são mostradas separadamente.Onde uma faixa de valores numéricos é aqui recitada, à menos que de outromodo estabelecido, a faixa é pretendida para incluir os seus pontos finais, etodos os inteiros e frações dentro da faixa. Não é pretendido que o escopoda invenção seja limitado aos específicos valores recitados quando definindouma faixa.I. Definições

No contexto desta exposição, um número de termos devem serutilizados.

Como aqui usado, o termo "cerca" ou "aproximadamente" signifi-ca dentro de 20%, preferivelmente dentro de 10%, e mais preferivelmentedentro de 5% de um dado valor ou faixa.

"Níveis alterados" refere-se à produção de produto(s) gene emorganismos em quantidades ou proporções que diferem daquela de orga-nismos normais ou não-transformados. Superexpressão do polipeptídeo po-de ser realizada através de primeiro construindo um gene quimérico ouconstrução quimérica na qual a região codificante está operavelmente ligadaa um promotor capaz de direcionar expressão de um gene ou construçãonos desejados tecidos no desejado estágio de desenvolvimento. Por razõesde conveniência, o gene quimérico ou construção quimérica pode compre-ender seqüências promotoras e seqüências líderes de tradução derivadasdos mesmos genes. Seqüências não-codificantes 3' codificando sinais determinação de transcrição também podem ser providas. O presente genequimérico ou construção quimérica então pode ser construída. A escolha devetor plasmídeo é dependente do processo que será usado para transformarcélulas hospedeiras. O técnico versado está bem ciente elementos genéticosque têm de estar presentes sobre o vetor plasmídeo de modo a transformar,selecionar, e propagar com sucesso células hospedeiras contendo o genequimérico ou construção quimérica. O técnico versado também reconheceráque diferentes eventos de transformação independentes resultarão em dife-rentes níveis e padrões de expressão (ver, por exemplo, De Almedia ERP etal., Mol. Genet. Genomics 218:78-86 (1989)), e assim que múltiplos eventostêm de ser selecionados de modo a obter linhas mostrando os desejadosnível de expressão e padrão. Tal seleção pode ser realizada por análisesSouthern de ADN, análises Northern de expressão de ARNm análises Wes-tern ou imuno citoquímica de expressão de proteína, ou análises fenotípicas.

Um "anticorpo" inclui uma molécula de imunoglobulina capaz deligação de um epítopo presente sobre um antígeno. Como aqui usado, otermo abrange não somente moléculas de imunoglobulina intactas tais comoanticorpos monoclonais e policlonais, mas também anticorpos anti-idiotípicos, mutantes, fragmentos, proteínas de fusão, anticorpos bi-específicos, proteínas humanizadas, e modificações da molécula de imuno-globulina que compreendem um sítio de reconhecimento de antígeno da re-querida especificidade.

O termo "ADNcs" inclui ADN complementar, ou seja moléculasde ARNm presentes em uma célula ou organismo feitas em ADNc com umaenzima tal como transcriptase reversa. Uma "biblioteca de ADNC" inclui umacoleção de moléculas de ARNm presentes em uma célula ou organismo,convertidas em moléculas de ADNc com a enzima transcriptase reversa,então inseridas em vetores. A biblioteca então pode ser sondada para o es-pecífico ADNc (è assim ARNm) de interesse.

O termo "compreendendo" é pretendido incluir realizações a-brangidas pelos termos "consistindo essencialmente em" e "consistendo em". Similarmente, o termo "consistindo essencialmente em" é pretendido inclu-ir realizações abrangidas pelo termo "Consistindo em".

Um "polipeptídeo KCNQ5", "seqüência de aminoácidos deKCNQ5", ou "proteína KCNQ5" como aqui usado refere-se as polipeptídeosKCNQ5 tipo não-selvagem tendo pelo menos uma modificação de aminoáci-do que torna o polipeptídeo KCNQ5 substancialmente insensível ao ativadorde canal de K+ retigabina enquanto retendo atividade de canal de potássiode corrente M de KCNQ5. "KCNQ5 tipo selvagem" (por exemplo, SEQ IDNO: 4, que representa KCNQ5 tipo selvagem humano), por outro lado, res-ponde a retigabina (ver Wickendon AD et al., Brit. J. Pharmacol. 132:381-84(2001)). "polipeptídeo KCNQ5(W270L)", "seqüência de aminoácidos deKCNQ5(W270L)", ou "proteína KCNQ5(W270L)" refere-se a um polipeptídeoKCNQ5 humano tendo uma mutação ponto em aminoácido 270 a partir deum resíduo triptofano (em posição de aminoácido 270 na proteína tipo sel-vagem humana, de inteiro comprimento) para um resíduo leucina, que pro-porciona insensibilidade a retigabina para o polipeptídeo KCNQ5(W270L).SEQ ID NO: 2 representa um polipeptídeo KCNQ5(W270L).Polipeptídeo KCNQ5, em uma realização, é um polipeptídeoKCNQ5 humano. Em uma outra realização, polipeptídeo KCNQ5 é um poli-peptídeo KCNQ5mamífero, não-humano. Polipeptídeos KCNQ5 mamíferos,não-humanos preferidos incluem polipeptídeo KCNQ5 de rato (co-propriedade, pedido de patente provisório co-pendente N0 60/760 249) epolipeptídeo KCNQ5 de camundongo (N0 de Acesso GenBank NM_023872),ambos os quais são sensíveis a retigabina (ver, por exemplo, Jensen HS etal., Brain Res. Mol. Brain Res. 139:52-62 (2005)), compartilham alta homolo-gia com KCNQ5 tipo selvagem humano (94,7% para rato e 95,2% para ca-mundongo), e contêm um aminoácido que é acreditado ser equivalente aW270 (W269 em rato e W271 em camundongo).

Como aqui usado, uma "proteína quimérica" ou "proteína de fu-são" KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) compreende um polipeptídeo KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) operavelmente ligado a um polipeptídeo não-KCNQ5 ounão-KCNQ5(W270L). Um "polipeptídeo não-KCNQ5" refere-se a um polipep-tídeo tendo uma seqüência de aminoácidos correspondendo a uma proteínaque não é substancialmente homóloga à proteína KCNQ5, por exemplo pro-teína que é diferente da proteína KCNQ5 e que é derivada do mesmo ou umdiferente organismo. Um "polipeptídeo não-KCNQ5(W270L)" refere-se a umpolipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos correspondendo a umaproteína que não é substancialmente homóloga à proteína KCNQ5(W270L),por exemplo, uma proteína que é diferente da proteína KCNQ5(W270L) eque é derivado do mesmo ou de um diferente organismo. Dentro de umaproteína de fusão KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), o polipeptídeo KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) pode corresponder a toda ou uma porção de uma proteínaKCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Em uma realização preferida, uma proteína defusão KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) compreende pelo menos uma porção bio-Iogicamente ativa de uma proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Dentro deproteína de fusão, o termo "ligado operavelmente" é pretendido indicar que opolipeptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) e o polipeptídeo não-KCNQ5 ounão-KCNQ5(W270L) são usados em-estrutura um para o outro. O polipeptí-deo não-KCNQ5 ou não-KCNQ5(W270L) pode ser fundido ao terminus-N outerminus-C do polipeptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L).

Um "polinucleotídeo KCNQ5" ou "seqüência de ácidos nucléicosde KCNQ5" refere-se a polinucleotídeos KCNQ5 tipo não-selvagem que co-dificam polipeptídeos KCNQ5 tendo pelo menos uma modificação de amino-ácido que torna o polipeptídeo KCNQ5 substancialmente insensível ao ati-vador de canal de K+ retigabina enquanto retendo uma atividade de canal depotássio de corrente - M de KCNQ5. "Polinucleotídeo KCNQ5 tipo selvagem"ou "seqüência de ácidos nucléicos de KCNQ5 tipo selvagem" (por exmeplo,SEQ ID NO: 3, que representa polinucleotídeo KCNQ5 tipo selvagem), poroutro lado, codifica KCNQ5 tipo selvagem que responde a retigabina (verWickendon AD et al., Brit. J. Pharmacol. 132:381-84 (2001)).

Uma "seqüência codificante" ou uma seqüência "codificando" umproduto de expressão, tal como um ARN, polipeptídeo, proteína, ou enzima,é uma seqüência de nucleotídeos que, quando expressa, resulta na produ-ção daquele ARN, polipeptídeo, proteína, ou enzima, isto é, a seqüência denucleotídeos codifica uma seqüência de aminoácidos para aquele polipeptí-deo, proteína, ou enzima.

O termo "complementar" é usado para descrever a relação entrebases nucleotídeos que são capazes de hibridizarem umas às outras. Porexemplo, com relação a ADN, adenosina é complementar para timina e cito-sina é complementar para guanina.

Os termos "quantidade efetiva", "quantidade terapeuticamenteefetiva", e "dosagem efetiva" como aqui usados, referem-se à quantidade deuma molécula efetora que, quando administrada a um mamífero em neces-sidade, é efetiva para pelo menos melhorar parcialmente condições relacio-nadas a ou condições adversas de, por exemplo, o sistema nervoso central(CNS) e sistemas periféricos, incluindo vários tipos de dor como, por exem-plo, dor somática, cutânea ou visceral causada por exemplo, por queimadu-ra, hematoma, abrasão, laceração, osso quebrado, Iigamento lacerado, ten-dão lacerado, músculo lacerado, infecção viral, bacteriana, de protozoário oufungos, dermatite de contato, inflamação (causada por exemplo, por trauma,infecção, cirurgia, queimaduras, ou doenças com um componente inflamató-rio), câncer, dor de dentes; dor neuropática causada por exemplo, por danono sistema nervoso central ou periférico devido a câncer, infecção de HIV(vírus de imunodeficiência humana), trauma de tecido, infecção, doença auto- imune, diabetes, artrite, neuropatia diabética, neuralgia trigeminal, ou ad-ministração de droga; tratamento de ansiedade causada por exemplo, pordistúrbio de pânico, distúrbio de ansiedade generalizada, ou distúrbio detensão, particularmente distúrbio de tensão aguda, distúrbios afetivos, malde Alzheimer, ataxia, dano de CNS causado por trauma, acidente vascularcerebral ou doença degenerativa, déficits cognitivos, comportamento com-pulsivo, demência, depressão, mal de Huntington, mania, prejuízo de memó-ria, distúrbios de memória, disfunção de memória, distúrbios de movimento,distúrbios motores, perda de memória relacionada a idade, doenças neuro-degenerativas, mal de Parkinson, e distúrbios motores semelhantes a Par-kinson, fobias, mal de Pick, psicose, esquizofrenia, dano de cordão espinhal,tremor, ataques, convulsões, epilepsia, distrofia macualr semelhante a Star-gardt, distrofia macular de cone - bastão, mal de Salla, epilepsia, relaxantesde músculo, redutores de febre, anxiolíticos, agentes anti - enxaqueca, anal-gésicos, distúrbios bipolares, depressão unipolar, distúrbios funcionais dointestino (por exemplo, dispepsia e síndrome de intestino irritável), diarréia,constipação, vários tipos de incontinência urinária (por exemplo, incontinên-cia urinária estimulada, incontinência urinária de tensão, incontinência uriná-ria de transbordamento ou incontinência urinária inconsciente, e incontinên-cia urinária mista), urgência urinária, instabilidade de bexiga, bexiga neuro-gênica, perda de audição, tinido, glaucoma, distúrbios cognitivos, dor infla-matória crônica e neurálgica; para prevenção e redução de dependência dedroga ou tolerância para tratamento de, por exemplo, câncer, inflamação,distúrbios oftálmicos, e vários distúrbios de CNSA.

Os termos "expressa" e "expressão" significam permitindo oucausando a informação em um gene ou seqüência de ADN tornar-se mani-festa, por exemplo, produzindo uma proteína através de ativação de funçõescelulares envolvidas em transcrição e tradução de um correspondente geneou seqüência de ADN. Uma seqüência de ADN é expressa em ou por umacélula para formar um "produto de expressão" tal como uma proteína. O pró-prio produto de expressão, por exemplo, a resultante proteína, também podeser dito ser "expresso" pela célula. Um produto de expressão pode ser ca-racterizado como intracelular, extracelular, ou secretado. O termo "intracelu-lar" significa algo que está dentro de uma célula. O termo "extracelular" signi-fica algo que está fora de uma célula. Uma substância é "secretada" por umacélula se ela aparece em medida significante fora da célula, a partir de al-gum lugar sobre ou dentro da célula. "Inibição anti - sentido" refere-se à pro-dução de transcrições ARN anti-sentido capazes de supressão de expressãoda proteína alvo. "Superexpressão" refere-se à produção de um produto ge-ne em um organismo que excede níveis de produção em organismos nor-mais ou não-transformados. "Supressão" refere-se a supressão de expres-são de genes estranhos ou endógenos ou transcritos de ARN.

O termo "sistema de expressão" significa uma célula hospedeirae vetor compatível sob condições apropriadas, por exemplo, para a expres-são de uma proteína codificada por ADN estranho carreado pelo vetor e in-troduzido na célula hospedeira.

O termo "gene" significa uma seqüência de ADN, incluindo se-qüências reguladoras precedendo (seqüências não-codificantes 5') e se-guindo (seqüência não-codificantes 3') a seqüência codificante, que codificaou corresponde a uma particular seqüência de aminoácidos que compreen-de toda ou parte de uma ou mais proteínas ou enzimas. "Gene nativo" refe-re-se a um gene como encontrado em natureza com suas próprias seqüên-cias reguladoras. "Gene quimérico" ou "construção quimérica" refere-se aqualquer gene ou construção, não um gene nativo, compreendendo seqüên-cias reguladoras e codificantes que não são encontradas juntas na natureza.

Da mesma maneira, um gene quimérico ou construção quimérica pode com-preender seqüências reguladoras e seqüências codificantes que são deriva-das de diferentes fontes, ou seqüências reguladoras e seqüências codifican-tes derivadas da mesma fonte, mas dispostas em uma diferente maneiradaquela encontrada na natureza, "gene endógeno" refere-se a um gene na-tivo em sua localização natural no genoma de um organismo. Um gene "es-tranho" refere-se a um gene normalmente não encontrado no organismohospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro através detransferência de gene. Genes estranhos podem compreender genes nativosinseridos em um organismo não-nativo, ou genes quiméricos. Um "transge-ne" é um gene que foi introduzido no genoma através de um procedimentode transformação.

O termo "geneticamente modificado" inclui uma célula contendoe/ou expressando um gene estranho ou seqüência de ácidos nucléicos quepor sua vez modifica o genótipo ou fenótipo da célula ou sua progênie. Estetermo inclui qualquer adição, supressão, ou interrupção para nucleotídeosendógenos de célula.

Um "produto gene" inclui um aminoácido (por exemplo, peptídeoou polipeptídeo) gerado quando um gene é transcrito e traduzido.

O termo "heterólogo" refere-se a uma combinação de elementosnão ocorrendo naturalmente. Por exemplo, ADN heterólogo refere-se a ADNnão localizado naturalmente na célula, ou em um sítio cromossômico da cé-lula. Preferivelmente, o ADN heterólogo inclui um gene estranho para a célu-la. Um elemento regulador de expressão heterólogo é um elemento tal ope-ravelmente associado com um gene diferente daquele que está associadona natureza.

O termo "homomérico" como aqui usado refere-se a um canal deíon compreendendo somente um tipo de subunidade. Por exemplo, um canalKCNQ dímero homomérico ("homodímero") pode ser composto por duassubunidades polipeptídeo KCNQ5 idênticas. Um tetrâmero homomérico("homotetrâmero") pode ser composto por quatro subunidades de polipeptí-deo KCNQ5 idênticas. O termo "heteromérico" como aqui usado refere-se aum canal de íon compreendendo pelo menos duas subunidades diferentes.Por exemplo, um canal KCNQ dímero heteromérico ("heterodímero") podeser composto por uma subunidade polipeptídeo KCNQ5 e uma subunidadeKCNQ3, ou um canal KCNQ heterodímero pode ser composto por uma su-bunidade polipeptídeo KCNQ5 e uma subunidade polipeptídeo KCNQ5 dife-rente. Um canal KCNQ tetrâmero heteromérico ("heterotetrâmero")pode sercomposto por 1, 2, 3, ou 4 subunidades polipeptídeo KCNQ5, contanto quese todas as quatro subunidades sejam subunidades polipeptídeo KCNQ5que pelo menos uma das subunidades seja diferente das outras três.

"Homologo" refere-se ao grau de similaridade de seqüência en-tre dois polímeros (isto é, moléculas de polipeptídeo ou moléculas de ácidonucléico). Os números de porcentagens de homologia aqui referidos refletema máxima homologia possível entre os dois polímeros, isto é, a porcentagemde homologia quando os dois polímeros são alinhados de modo a terem omaior número de posições emparelhadas (homólogas). Os termos "homólo-go" e "homologia" também referem-se à relação entre proteínas que possu-em uma "origem evolucionária comum", incluindo proteínas das super - famí-lias (por exemplo, a super - família imunoglobulina) e proteínas homólogasde diferentes espécies (por exemplo, cadeia leve miosina, etc.) (ver, por e-xemplo, Reeck GR et al., Cell 50:667 (1987)). Tais proteínas (e seus genescodificantes) têm homologia de seqüência, como refletida por sua similarida-de de seqüência, se em termos de porcentagem de similaridade ou a pre-sença de específicos resíduos ou motivos em posições conservadas. Damesma maneira, o termo "similaridade de seqüência" refere-se ao grau deidentidade ou correspondência entre seqüências de ácidos nucléicos ou a-minoácidos de proteínas que podem ou não compartilhar uma origem evolu-cionária comum (ver Reeck GR et al., supra). Entretanto, em utilização co-mum e no presente pedido de patente, o termo "homólogo", quando modifi-cado com um advérbio tal como "altamente", pode referir-se a similaridadede seqüência e pode ou não relacionar-se a uma origem evolucionária co-mum.

Para determinar a porcentagem de identidade de duas seqüên-cias de aminoácidos ou de duas seqüências de ácidos nucléicos, as se-qüências são alinhadas para propósitos de ótima comparação (por exemplo,folgas podem ser introduzidas em uma ou ambas de uma primeira e umasegunda seqüência de aminoácidos ou ácidos nucléicos para ótimo alinha-mento)Em uma realização preferida, o comprimento de uma seqüência refe-rência alinhada para propósitos de comparação é pelo menos 30%, preferi-velmente pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mesmomais preferivelmente pelo menos 60%, e mesmo mais preferivelmente pelomenos 70%, 80%, ou 90% do comprimento da seqüência referência. Os re-síduos em correspondentes posições são então comparados e quando umaposição em uma seqüência é ocupada pelo mesmo resíduo como a corres-pondente posição na outra seqüência, então as moléculas são idênticas na-quela posição. A porcentagem de identidade entre duas seqüências, por is-so, é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelasduas seqüências (isto é, % de identidade = # de posições idênticas / total #de posições χ 100). A porcentagem de identidade entre as duas seqüênciasé uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas se-qüências, levando em conta o número de folgas, e o comprimento de cadafolga, que são introduzidas para ótimo alinhamento das duas seqüências.

A comparação de seqüências e determinação de porcentagemde identidade entre duas seqüências podem ser realizadas usando um algo-ritmo matemático. Um exemplo não-limitante de um algoritmo matemáticoutilizado para comparação de seqüências é o algoritmo de Karlin S e Alts-chul SF, Proc. Natl. Acad. Sei, USA 87:2264-68 (1990), modificado como emKarlin S and Altschul SF, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-77 (1993). Umtal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST (version 2.0)de Altschul SF et al., J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990). Buscas de nucleotídeoBLAST podem ser realizadas com o escore de programa NBLAST = 100,comprimento de palabra = 12 para obter seqüências de nucleotídeos homó-logas às moléculas de ácido nucléico. Buscas de proteína BLAST podem serrealizadas com o programa XBLAST, escore = 50, comprimento de palavra =3 para obter seqüências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteí-na. Para obter alinhamentos com folga para propósitos de comparação,Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul SF et al., Nu-cleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997). Quando utilizando programas BLASTe Gapped BLAST, os parâmetros default dos respectivos programas (porexemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados.

Um outro algoritmo não-limitante preferido utilizado para a com-paração de seqüências é o algoritmo de Myers EW and Miller W, Comput.Appl. Biosci. 4:11-17 (1988). Um tal algoritmo é incorporado no programaALIGN (versão 2.0) que é parte do pacote de software de alinhamento deseqüência GCG. Quando utilizando o programa ALIGN para comparação deseqüências de aminoácidos, uma tabela de resíduo de peso PAM120, umapenalidade de comprimento de folga de 12, e uma penalidade de folga de 4podem ser usados.

Um outro exemplo não-limitante de um algoritmo matemáticoutilizado para o alinhamento de seqüências de proteínas é o algoritmo deLipman - Pearson (Lipman DJ and Pearson WR, Science 227:1435-41(1985)). Quando usando o algoritmo de Lipman - Pearson, uma tabela deresíduo de peso PAM250, uma penalidade de comprimento de folga de 12,uma penalidade de folga de 4, e um Kutple de 2 podem ser usados. Um e-xemplo não-limitante, preferido, de um algoritmo matemático utilizado para oalinhamento de seqüências de ácidos nucléicos é o algoritmo de Wilbur -Lipman (Wilbur WJ and Lipman DJ, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:726-30(1983)). Quando usando o algoritmo de Wilbur - Lipman, uma janela de 20,uma penalidade de folga de 3, Ktuple de 3 podem ser usados. Ambos, o al-goritmo de Lipman - Pearsoin e o algoritmo de Wilbur - Lipman são incorpo-rados, por exemplo, no programa MEGALIGN (por exemplo, versão 3.1.7)que é parte do pacote de software de análise de seqüência DNASTAR.

Adicionais algoritmos para análises de seqüências são conheci-dos na técnica, e incluem ADVANCE e ADAM, descritos em Torelli A andRobotti CA, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5 (1994); e FASTA, descrito em Pe-arson WR and Lipman DJ, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444-48 (1988).

Em uma realização preferida, a porcentagem de identidade entreduas seqüências de aminoácidos é determinada usando o programa GAP nopacote de software GCG, usando uma matriz Blosum 62 ou uma matrizPAM250, e um peso de folga de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso decomprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Ainda em uma outra realização preferida,a porcentagem de identidade entre duas seqüências de nucleotídeos é de-terminada usando o programa GAP no pacote de software GCG, usando umNWSgapdna. Matriz CMP e um peso de folga de 40, 50, 60, 70, ou 80 e umpeso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.

Alinhamentos de proteínas também podem ser feitos usando oprograma de alinhamento de proteína global Geneworks (por exemplo, ver-são 2.5.1) com o custo para folga aberta fixado em 5, o custo para folga au-mentando fixado em 5, e comprimento diagonal mínimo fixado em 4, o offsetdiagonal máximo fixado em 130, e corte consenso fixado em 50% e utilizan-do a matriz Pam 250.

As seqüências de ácidos nucléicos e proteínas ainda podem serusadas como uma "seqüência questão" para realização de uma busca con-tra bases de dados públicas para, por exemplo, identificar outros membrosde família ou seqüências relacionadas. Tais buscas podem ser realizadasusando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul SF et al.,J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990). Buscas de nucleotídeos BLAST podem serrealizadas com o programa NBLAST, escore = 100, comprimento de palavra= 12 para obter seqüências de nucleotídeos homólogas a moléculas de áci-do nucléico KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Buscas de proteína BLAST podemser realizadas com o programa XBLAST, escore = 50, comprimento de pala-vra = 3 para obtenção de seqüências de aminoácidos homólogas a molécu-Ias de proteína KCNQ5 ou KCNQ5(M270L). Para obter alinhamentos comfolgas para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizadocomo descrito em Altschul SF et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997). Quando utilizando programas BLAST e Gapped BLAST, os parâme-tros default dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST)podem ser usados. Por exemplo, as seqüências de nucleotídeos podem seranalisadas usando a matriz Blastn default 1-3 com penalidades de folga fi-xadas em: existência 11 e extensão 1. As seqüências de aminoácidos po-dem ser analisadas usando as fixações default: a matriz Blosum62 com pe-nalidades de folga fixadas em existência 11 e extensão 1.

O termo "célula hospedeira" significa qualquer célula de qual-quer organismo que é selecionada, modificada, transformada, crescida, ouusada ou manipulada de qualquer maneira, para a produção de uma subs-tância pela célula, por exemplo, a expressão pela célula de um gene, umaseqüência de ADN ou ARN, uma proteína, ou uma enzima.

Uma molécula de ácido nucléico é "hibridizável" a uma outra mo-,lécula de ácido nucléico, tal como ADNc, ADN genômico, ou ARN, quandouma forma de fita simples da molécula de ácido nucléico pode anelar para ooutra molécula de ácido nucléico sob as condições apropriadas de tempera-tura e resistência iônica de solução (Sambrook et al. (eds.), Molecular Clo-ning: A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) Cold spring Harbor LaboratoryPress, NY. Vols. 1-3 (ISBN 0-87696-309-6)). As condições de temperatura eresistência iônica determinam a "rigorosidade" da hibridização. Para seleçãopreliminar para ácidos nucléicos homólogos, condições de hibridização debaixa rigorosidade, correspondendo a uma Tm de 55°C, podem ser usadas,por exemplo, 5x SSC, SDS 0,1%, leite 0,25%, e nenhuma formamida; ouformamida 30%, 5x SSC, SDS 0,5%). Condições de hibridização de rigorosi-dade moderada correspondem a uma maior Tm, por exemplo, formamida40%, com 5x ou 6x SCC. Condições de hibridização de alta rigorosidadecorrespondem à mais alta Tm, por exemplo, formamida 50%, 5x ou 6x SCC.Hibridização requer que os dois ácidos nucléicos contenham seqüênciascomplementares embora, dependendo da rigorosidade da hibridização, de-semparelhamentos entre bases sejam possíveis. A apropriada rigorosidadepara hibridização de ácidos nucléicos depende do comprimento dos ácidosnucléicos e o grau de complementação, variáveis bem conhecidas na técni-ca. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre duas seqüên-cias de nucleotídeos, maior o valor de Tm para híbridos de ácidos nucléicostendo aquelas seqüências. A estabilidade relativa (correspondendo a maiorTm) de hibridizações de ácido nucléico diminui na seguinte ordem: ARN :ARN, ADN : ARN, ADN : ADN. Para híbridos maiores que 100 nucleotídeosem comprimento, equações para cálculo de Tm foram derivadas (Sambrooket al., supra).

"Inibidores", "ativadores", "abridores", ou "moduladores" de ca-nais de potássio de voltagem bloqueada compreendendo uma subunidadeKCNQ referem-se a moléculas inibidoras ou ativadoras identificadas usandoensaios in vitro e in vivo para função de canal KCNQ. Em particular, inibido-res, ativadores, e moduladores referem-se a compostos que aumentam fun-ção de canal KCNQ, pelo que reduzindo dor em um sujeito. "Inibidores" sãocompostos que diminuem, bloqueiam, previnem, retardam ativação, inati-vam, dessensibilizam, ou regulam descendentemente o canal, ou velocidadeou aperfeiçoam desativação. "Ativadores" são compostos que aumentam,abrem, ativam, facilitam, aperfeiçoam ativação, sensibilizam ou regulam as-cendentemente atividade de canal, ou retardam ou diminuem inativação.Tais ensaios para inibidores e ativadores também incluem, por exemplo, ex-pressão de KCNQ recombinante em células ou membranas de células e en-tão medição de fluxo de íons através de canal direta ou indiretamente.

O termo "isolado" significa que o material é removido de seuambiente original ou nativo (por exemplo, o ambiente natural se ele está o-correndo naturalmente). Por isso, um polinucleotídeo ou polipeptídeo ocor-rendo naturalmente presente em um animal vivo não é isolado, mas o mes-mo polinucleotídeo ou polipeptídeo, separado ou modificado por intervençãohumana a partir de alguns ou de todos os materiais coexistentes no sistemanatural, é isolado. Por exemplo, um "fragmento de ácido nucléico isolado" éum polímero de ARN ou ADN que é de fita dupla ou simples, opcionalmentecontendo bases nucleotídeos sintéticas, não-naturais ou alteradas. Umfragmento de ácido nucléico isolado na forma de um polímero de ADN podeser compreendido por um ou mais segmentos de ADNc, ADN genômico, ouADN sintético. Tais polinucleotídeos podem ser parte de um vetor e/ou taispolinucleotídeos ou polipeptídeos podem ser parte de uma composição eainda serem isolados em que tal vetor ou composição não é parte do ambi-ente no qual eles são encontrados em natureza. Similarmente, o termo"substancialmente purificado" refere-se a uma substância, que foi separadaou de outro modo removida, através de intervenção humana, do ambientequímico imediato no qual ela ocorre em natureza. Polipeptídeos pou ácidosnucléicos substancialmente purificados podem ser obtidos ou produzidosatravés de qualquer uma de um número de técnicas e procedimentos gene-ricamente conhecidos no campo (ver, por exemplo, Scopes R (1987) In: Pro-tein purification: principies and practice, Springer-Verlag, NY. General proteinand DNA/RNA purification references: Current Protocols in Molecular Bio-logy, Green publishing associates and John Wiley & Sons).

O termo "mamífero" refere-se a um humano, um primata não-humano, canino, felino, bovino, ovino, suíno, murino, ou outro mamífero ve-terinário ou de laboratório. Aqueles versados na técnica reconhecem queuma terapia que reduz a severidade de uma patologia em uma espécie demamífero é anunciadora do efeito da terapia sobre outras espécies de mamí-feros.

O termo "modula" refere-se à supressão, aperfeiçoamento, ouindução da função. Por exemplo, "modulação" ou "regulação" de expressãode gene refere-se a uma mudança na atividade de um gene. Modulação deexpressão pode incluir, mas não é limitada a, ativação de gene e repressãode gene. "Modula" ou "regula" também refere-se a processos, condições, ouagentes que aumentam ou diminuem a atividade biológica de uma proteína,enzima, inibidor, transdutor de sinal, receptor, ativador de transcrição, cofa-tor, e semelhantes. Esta mudança em atividade pode ser aumentada ou di-minuída de tradução de ARNm, transcrição de ADN, e/ou degradação deARNm ou proteína, que pode por sua vez corresponder a um aumento oudiminuição em atividade biológica. Tal aperfeiçoamento ou inibição pode sercontingente com ocorrência de um específico evento, tal como ativação deum caminho de transdução de sinal e/ou pode ser manifesta somente emparticulares tipos de células.

"Atividade modulada" refere-se a qualquer atividade, condição,doença ou fenótipo que é modulado por uma forma bioíogicamente ativa deuma proteína. Modulação pode ser afetada através de afetação de concen-tração de proteína bioíogicamente ativa, por exemplo, através de regulaçãode expressão ou degradação, ou através de efeito agonístico ou antagonísti-co direto como, por exemplo, através de inibição, ativação, ligação, ou Iibe-ração de substrato, modificação tanto química como estrutural, ou através deinteração direta ou indireta que pode envolver adicionais fatores.

Como aqui usado, uma molécula de ácido nucléico "ocorrendonaturalmente" refere-se a uma molécula de ARN ou ADN tendo uma se-qüência de nucleotídeos que ocorre em natureza (por exemplo, codifica umaproteína natural).

Como aqui usado, "molécula de ácido nucléico" refere-se à for-ma polimérica fosfato éster de ribonucleosídeos (adenosina, guanosina, uri-dina, ou citidina; "moléculas de ARN") ou desoxirribonucleosídeos (desoxia-denosina, desoxiguanosina, desoxitimidina, ou desoxicitidina; "moléculas deADN"), ou quaisquer seus análogos fosfoéster, como fósforotioatos e tioéste-res, em forma de fita simples ou uma hélice de fita dupla. Hélices ADN-ADN,ADN-ARN e ARN-ARN de fita dupla são possíveis. O termo molécula de áci-do nucléico, e em particular molécula de ADN ou ARN, refere-se somente àestrutura primária e secundária da molécula, e não a limita a quaisquer for-mas terciárias particulares. Assim, este termo inclui ADN de fita dupla encon-trado, inter alia, em moléculas de ADN lineares (por exemplo, fragmentos derestrição) ou circulares, plasmídeos, e cromossomas. Na discussão de estru-tura de particulares moléculas de ADN de fita dupla, seqüências podem seraqui descritas de acordo com a convenção normal de dar-se somente a se-qüência na direção 5' para 3' ao longo da fita não-transcrita de ADN (isto é, afita tendo uma seqüência homóloga ao ARNm).

O termo "operavelmente ligada" significa que uma molécula deácido nucléico, isto é, ADN, e uma ou mais seqüências reguladoras (por e-xemplo, um promotor ou sua porção) estão conectadas de modo a permitirtranscrição de ARNm a partir da molécula de ácido nucléico ou permitir ex-pressão do produto (isto é, um polipeptídeo) da molécula de ácido nucléicoquando as apropriadas moléculas são ligadas às seqüências reguladoras.

Dentro de uma construção de fusão, o termo "operavelmente ligado" é pre-tendido para indicar que o polinucleotídeo KCN5 ou KCNQ5(W270L) e umpolinucleotídeo não-KCNQ5 ou não-KCNQ5(W270L) estão fundidos em es-trutura um ao outro. O polinucleotídeo não-KCNQ5 ou não-KCNQ5(W270L)pode ser fundido 3' ou 5' ao polinucleotídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L).

O termo "porcentagem de homologia) refere-se à extensão deidentidade de seqüência de aminoácidos entre polinucleotídeos ou polipeptí-deos. A homologia entre quaisquer dois polinucleotídeos ou polipeptídeos éuma função direta do número total de nucleotídeos ou aminoácidos empare-lhando em uma dada posição em qualquer seqüência, por exemplo, se me-tade do número total de nucleotídeos em qualquer das seqüências são osmesmos então as duas seqüências são ditas exibirem 50% de homologia.

Um "polinucleotídeo" ou "seqüência de nucleotídeos" é uma sé-rie de bases nucleotídeos (também chamadas "nucleotídeos") em um ácidonucléico, tal como ADN ou ARN1 e significa qualquer cadeia de dois ou maisnucleotídeos. Uma seqüência de nucleotídeos tipicamente carreia informa-ção genética, incluindo a informação usada por maquinaria celular para fa-bricar proteínas e enzimas. Estes termos incluem ADNc e genômico de fitasimples e dupla, ARN, qualquer polinucleotídeo sintético e manipulado gene-ticamente, e ambos polinucleotídeos sentido e anti - sentido. Isto inclui molé-culas de fita simples e dupla, isto é, híbridos ADN-ADN, ADN-ARN, e ARN-ARN, assim como "ácidos nucléicos de proteína" (PNA) formados por conju-gação de bases a uma cadeia principal de aminoácido. Isto também incluiácidos nucléicos contendo bases modificadas tais como, por exemplo, tio-uracila, tio-guanina, e flúor uracila.

É contemplado que onde a molécula de ácido nucléico é ARN, aT (timina) em seqüências não-ARN aqui providas é substituída com U (uraci-Ia). Por exemplo, SEQ ID NO: 1 é aqui mostrada como uma seqüênciaADNc. Assim, pode ser óbvio para aqueles versados na técnica que umamolécula de ARN compreendendo seqüências a partir destas seqüências,por exemplo, podem ter T substituída com U.

O termo "polipeptídeo" inclui um composto de dois ou mais ami-noácidos subunidades, análogos de aminoácidos, ou peptidomiméicos. Assubunidades podem estar ligadas por ligações peptídeo. Em uma outra rea-lização, a subunidade pode ser ligada por outras ligações, por exemplo, és-ter, éter, etc. Como aqui usado o termo "aminoácido" inclui tanto aminoáci-dos naturais e/ou não-naturais ou sintéticos, incluindo glicina e ambos isô-meros óticos D ou L, e análogos de aminoácidos e peptidomiméticos. Umpeptídeo de três ou mais aminoácidos é comumente referido como um oligo-peptídeo. Cadeias de peptídeo de mais que três ou mais aminoácidos sãoreferidas como um polipeptídeo ou uma proteína.

Um "primer" inclui um polinucleotídeo curto, genericamente comum grupo 3'-OH livre que se liga a um alvo ou "molde" presente em umaamostra de interesse através de hibridização com o alvo, e a seguir promo-vendo polimerização de um polinucleotídeo complementar para o alvo. Uma"reação de cadeia polimerase" ("PCR") é uma reação na qual cópias réplicassão feitas de um polinucleotídeo alvo usando um "par de iniciadores" ou"conjunto de iniciadores" consistindo em um iniciador "à montante" e um "àjusante", e um catalisador de polimerização, tal como uma ADN polimerase,e tipicamente uma enzima polimerase termicamente estável. Processos paraPCR são bem conhecidos na técnica, e são ensinados, por exemplo, emMacPherson et al., IRL Press at Oxford University Press (1991). Todos osprocessos de produção de cópias réplicas de um polinucleotídeo, tal comoPCR ou clonagem de gene, são coletivamente aqui referidos como "replica-ção". Um iniciador também pode ser usado como uma sonda em reações dehibridização, tais como análises de Southern ou Northern blot (ver, por e-xemplo, Sambrook J et al., supra).

Uma "sonda" quando usada no contexto de manipulação de po-linucleotídeo inclui um oligonucleotídeo que é provido como uma reagentepara detectar um alvo presente em uma amostra de interesse através dehibridização com o alvo. Usualmente, uma sonda compreenderá um marca-dor ou um meio através do qual um marcador pode ser ligado, tanto antescomo subseqüente à reação de hibridização. Apropriados marcadores inclu-em, mas não são limitados a, radioisótopos, fluorocromos, compostos quimi-oluminescentes, corantes, e proteínas, incluindo enzimas.

Uma "seqüência promotora" é uma região reguladora de ADNcapaz de ligação de ARN polimerase em uma célula e iniciação de transcri-ção de uma seqüência codificante À jusante (direção 3'). Para os presentespropósitos, a seqüência promotora está ligada em seu terminus 3' através desítio de iniciação de transcrição e estende-se à montante (direção 5') paraincluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciartranscrição em níveis detectáveis acima de fundo. Dentro de seqüência pro-motora será encontrado um sítio de iniciação de transcrição (conveniente-mente definido, por exemplo, através de mapeamento com nuclease S1),assim como domínios de ligação de proteína (seqüências consenso) respon-sáveis pela ligação de ARN polimerase.

O termo "purificado" como aqui usado refere-se a material quefoi isolado sob condições que reduzem ou eliminam a presença de materiaisnão-relacionados, ou seja, contaminantes, incluindo materiais nativos dosquais o material é obtido. Por exemplo, uma proteína purificada é preferivel-mente substancialmente livre de outras proteínas ou ácidos nucléicos comos quais ela está associada em um célula; uma molécula de ácido nucléicopurificada está substancialmente livre de proteínas ou outras moléculas deácidos nucléicos não-relacionadas com as quais ela pode ser encontradadentro de uma célula. Como aqui usado, o termo "substancialmente livre" éusado operacionalmente, no contexto de testes analíticos do material. Prefe-rivelmente, material purificado substancialmente livre de contaminantes épelo menos 50% puro; mais preferivelmente, pelo menos 90% puro; e maispreferivelmente ainda pelo menos 99% puro. Pureza pode ser avaliada porcromatografia, eletroforese com gel, ensaio imuno, análise de composição,ensaio biológico, e outros processos conhecidos na técnica.

Processos para purificação são bem conhecidos na técnica. Porexemplo, ácidos nucléicos podem ser purificados por precipitação, cromato-grafia (incluindo cromatografia de fase sólida preparativa, hibridização deoligonucleotídeo, e cromatografia de hélice tripla), ultracentrifugação, e ou-tros meios. Polipeptídeos e proteínas podem ser purificados através de vá-rios processos incluindo, sem limitação, eletroforese de disco - gel preparati-va, focalização isoelétrica, HPLC, HPLC de fase reversa, filtração com gel,cromatografia de troca de íons e partição, precipitação e cromatografia dedessalinização, extração e distribuição em contra-corrente. Para alguns pro-pósitos, é preferível produzir o polipeptídeo em um sistema recombinante noqual a proteína contem uma adicional seqüência etiqueta que facilita purifi-cação, tal como, mas não limitado a, uma seqüência poli histidina, ou umaseqüência que especificamente liga-se a um anticorpo, tal como FLAG eGST. O polipeptídeo então pode ser purificado a partir de um Iisado bruto dacélula hospedeira através de cromatografia sobre uma apropriada matriz defase sólida. Alternativamente, anticorpos produzidos contra a proteína oucontra peptídeos derivados da mesma podem ser usados como reagentesde purificação. Células podem ser purificadas através de várias técnicas,incluindo, por exemplo, centrifugação, separação com matriz (por exemplo,separação com lã de nylon), panning e outras técnicas de seleção imuno,depleção (por exemplo, depleção complemento de células contaminantes), eclassificação dé célula (por exemplo, classificação de célula ativada comfluorescência (FACS)). Outros processos de purificação são possíveis. Ummaterial purificado pode conter menos que cerca de 50%, preferivelmentemenos que cerca de 75%, e mais preferivelmente menos que cerca de 90%,dos componentes celulares com os quais ele foi originalmente associado. O"substancialmente puro" indica o mais alto grau de pureza que pode ser ob-tido usando técnicas de purificação padrões conhecidas.

O termo "composto teste" inclui compostos com conhecida estru-tura química mas não necessariamente com uma conhecida função ou ativi-dade biológica. Compostos testes também podem ter estruturas não-identificadas ou serem misturas de compostos desconhecidos, por exemplo,a partir de amostras biológicas brutas como extratos de plantas. Grandesnúmeros de compostos podem ser randomicamente selecionados a partir de"bibliotecas químicas" que referem-se a coleções de compostos químicospurificados ou coleções de extratos brutos a partir de várias fontes. As biblio-tecas químicas podem conter compostos que foram sintetizados quimica-mente ou purificados de produtos naturais. Os compostos podem compreen-der moléculas pequenas inorgânicas ou orgânicas ou maiores compostosorgânicos tais como, por exemplo, proteínas, peptídeos, glicoproteínas, este-róides, lipídeos, fosfolipídeos, ácidos nucléicos, e lipoproteínas. A quantida-de de composto testado pode variar dependendo da biblioteca química, mas,para bibliotecas de composto purificado (homogêneo), 10 μΜ é tipicamentea mais alta dose inicial testada. Processos de introdução de compostos tes-tes em células são bem conhecidos na técnica.

O termo "transfecção" significa a introdução de um ácido nucléi-co estranho em uma célula. O termo "transformação" significa a introduçãode um gene "estranho" (isto é, extrínseco ou extracelular), seqüência deADN OU ARN a uma célula hospedeira, de modo que a célula hospedeiraexpressará o gene ou seqüência introduzida para produzir uma desejadasubstância, tipicamente uma proteína ou enzima codificada pelo gene ouseqüência introduzida. O gene ou seqüência introduzida também pode serchamada um gene ou seqüência "clonado" ou "estranho", pode incluir se-qüências reguladoras ou controles, tal como partida, parada, promotora, si-nal, secreção, o outras seqüências usadas por uma maquinaria genética decélula. O gene ou seqüência pode incluir seqüências não-funcionais ou se-qüências com função desconhecida. Uma célula hospedeira que recebe eexpressa ADN ou ARN introduzido foi "transformada" e é um "transformante"ou um "clone". O ADN ou ARN introduzido em uma célula hospedeira podeprovir de qualquer fonte, incluindo células do mesmo gênero ou espécie co-mo a célula hospedeira, ou células de um gênero ou espécie diferente. Damesma maneira, ainda uma realização é para uma célula hospedeira trans-formada com o vetor descrito acima. Em uma realização, a célula hospdeiraé uma célula procariótica. Ainda em uma realização, a célula hospedeira éuma célula eucariótica. Em uma realização preferida, a célula hospedeira éuma célula de E. coli.

O termo "variante" também pode ser usado para indicar um genemodificado ou alterado, seqüência de ADN, enzima, célula, etc. Abrangidaspelo termo "variante(s)" estão substituições, adições ou supressões de nu-cleotídeos e aminoácidos. Também, abrangidas pelo termo "variante(s)" es-tão moléculas de KCNQ5 naturais e sintéticas. Por exemplo, variante podereferir-se a polipeptídeos que diferem de um polipeptídeo referência. Generi-camente, as diferenças entre o polipeptídeo referência e o polipeptídeo quedifere em seqüência de aminoácidos de polipeptídeo referência são limitadasde modo que as seqüências de aminoácidos da referência e a variante sãono total similares de perto e, em algumas regiões, idênticas. Um polipeptídeovariante e referência podem diferir em seqüência de aminoácidos por umaou mais substituições, supressões, adições, fusões, e truncações que po-dem ser conservativas ou não-conservativas e podem estar presentes emqualquer combinação. Por exemplo, variantes podem ser aquelas nas quaisvários, por exemplo, de 50 a 30, de 30 a 20, de 20 a 10, de 10 a 5, de 5 a 3,de 3 a 2, de 2 a 1 aminoácidos são inseridos, substituídos ou suprimidos, emqualquer combinação. Adicionalmente, uma variante pode ser um fragmentode um polipeptídeo que difere de uma seqüência polipeptídeo referênciasendo menor que a seqüência referência, tal como através de uma supres-são terminal ou interna. Uma variante de um polipeptídeo também inclui umpolipeptídeo que retém essencialmente a mesma função ou atividade bioló-gica como tal polipeptídeo, por exemplo, proteínas precursoras que podemser ativadas através de clivagem da porção precursora para produzir um po-lipeptídeo maduro ativo. Estas variantes podem ser variações alélicas carac-terizadas por diferenças nas seqüências de nucleotídeos do gene estruturalcodificando a proteína, ou podem envolver união diferencial ou modificaçãopós-traducional. Variantes também incluem uma proteína relacionada tendosubstancialmente a mesma atividade biológica, mas obtida de uma espéciediferente. Aqueles versados na técnica podem produzir variantes tendosubstituições, supressões, adições de aminoácidos simples ou múltiplas.Estas variantes podem incluir, inter alia: (i) uma na qual um ou mais dos re-síduos de aminoácidos estão substituídos com um resíduo de aminoácidoconservado ou não-conservado (preferivelmente um resíduo de aminoácidoconservado) e tal resíduo de aminoácido substituído pode ou não ser umcodificado pelo código genético, ou (ii) uma na qual um ou mais aminoácidossão suprimidos do peptídeo ou proteína, ou (iii) uma na qual um ou mais a-minoácidos são adicionados ao polipeptídeo ou proteína, ou (iv) uma na qualum ou mais dos resíduos de aminoácidos incluem um grupo substituinte, ou(v) uma na qual o polipeptídeo maduro está fundido com um outro composto,tal como um composto para aumentar a meia-vida do polipeptídeo (por e-xemplo, polietileno glicol), ou (vi) uma na qual os adicionais aminoácidosestão fundidos ao polipeptídeo maduro tal como uma seqüência líder ou se-cretora ou uma seqüência que é empregada para purificação do polipeptídeomaduro ou uma seqüência de proteína precursora. Uma variante do polipep-tídeo também pode ser uma variante ocorrendo naturalmente tal como umavariante alélica ocorrendo naturalmente, ou ela pode ser uma variante quenão é conhecida ocorrer naturalmente. Todas tais variantes definidas acimasão julgadas estarem dentro do escopo de ensinamentos na técnica.

Os termos "vetor", "vetor de clonagem",e "vetor de expressão"referem-se ao veículo através do qual ADN pode ser introduzido em umacélula hospedeira, resultando em expressão da seqüência introduzida. Um"vetor inter-genérico" é um vetor que permite conjugação inter-genérica, istoé, utiliza um sistema de passagem de ADN a partir de E. coli para uma outralinha de células diretamente. Conjugação inter-genérica tem menos manipu-lações que transformação.

Vetores tipicamente compreendem o ADN de um agente trans-missível, no qual ADN estranho é inserido. Um meio comum para inserir umsegmento de ADN em um outro segmento de ADN envolve o uso de enzi-mas chamadas enzimas de restrição que clivam ADN em sítios específicos(grupos específicos de nucleotídeos) chamados sítios de restrição. Um "cas-sete" refere-se a uma seqüência codificando ADN ou segmento de ADN quecodifica um produto de expressão que pode ser inserido em um vetor em/ definidos sítios de restrição. Os sítios de restrição de cassete são desenha-dos para assegurar inserção do cassete no quadro de leitura próprio. Gene-ricamente, ADN estranho é inserido em um ou mais sítios de restrição doADN vetor, e então é carreado pelo vetor em uma célula hospedeira juntocom o ADN vetor transmissível. Um segmento ou seqüência de ADN tendoADN inserido ou adicionado, tal como um vetor de expressão, também podeser chamado uma "construção de ADN". Um tipo comum de vetor é um"plasmídeo", que genericamente é uma molécula auto - contida de ADN defita dupla, usualmente de origem bacteriana, que pode rapidamente aceitarADN adicional (estranho) e que pode ser facilmente introduzida em uma a-propriada célula hospedeira. Um vetor plasmídeo freqüentemente contemADN codificante e ADN promotor e tem um ou mais sítios de restrição apro-priados para inserção de ADN estranho. ADN codificante é uma seqüênciade ADN que codifica uma particular seqüência de aminoácidos para umaparticular enzima ou proteína. ADN promotor é uma seqüência de ADN queinicia, regula, ou de outro modo media ou controla a expressão do ADN codi-ficante. ADN promotor e ADN codificante podem ser do mesmo gene ou degenes diferentes, e podem ser dos mesmos ou diferentes organismos. Veto-res de clonagem recombinantes freqüentemente incluirão um ou mais siste-mas de replicação para clonagem ou expressão, um ou mais marcadorespara seleção no hospedeiro, por exemplo, resistência a antibiótico, e um oumais cassetes de expressão. Construções de vetores podem ser produzidasusando técnicas padrões de biologia molecular e ADN recombinante dentrodo conhecimento da técnica. Tais técnicas são inteiramente explicadas naliteratura. Ver, por exemplo, Sambrook J et al., supra; DNA Cloning: A Prac-tical Approach, Volumes I and Il (D.N. Glover ed. 1985); Ausubel FM et al.(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.(1994). Vetores comumente usados, comercialmente disponíveis incluem,por exemplo, vetores pcDNA3 e pCR de Invitrogen (Carlsbad, Calif.) e veto-res pGEM de Promega (Madison, Wis.).

Atividade de "voltagem bloqueada" ou "bloqueio de voltagem" ou"dependência de voltagem" referem-se a uma característica de um canal depotássio composto por monômeros ou subunidades polpeptídeo individuais.Genericamente, a probabilidade de uma abertura de canal de potássio devoltagem bloqueada aumenta quando uma célula é despolarizada. Canaisde potássio de voltagem bloqueada primariamente permitem efluxo de po-tássio em potenciais de membrana mais positivos que o potencial reversopara potássio (Ek) em células típicas, porque eles têm maior probabilidadede serem abertos em tais voltagens. Ek é o potencial de membrana no qualnão há fluxo líquido de íons potássio porque o potencial elétrico (isto é, po-tencial de voltagem) dirigindo efluxo de potássio é balanceado pelo gradientede concentração para potássio. O potencial de membrana de células depen-de primariamente de seus canais de potássio e está tipicamente entre -60 e -100 mV para células mamíferas. Este valor é também conhecido como o"potencial reverso" ou o potencial "Nernst" para potássio. Alguns canais depotássio bloqueados com voltagem sofrem inativação, o que pode reduzirefluxo de potássio em maiores potenciais de membrana. Canais de potássiotambém podem permitir influxo de potássio em certos exemplos quando elespermanecem abertos em potenciais de membrana negativos para Ek (ver,por exemplo, Adams and Nonner, in Potassium Channels, pp. 40-60 (Cook,ed. 1990)).A característica de bloqueio com voltagem pode ser medida atra-vés de uma variedade de técnicas para medição de mudanças em fluxo decorrente e fluxo de íons através de um canal, por exemplo, através de mu·dança de [K+] da solução externa e medição de potencial de ativação da cor-rente de canal (ver, por exemplo, patente US 5 670 335), através de medi-ção de corrente com técnicas de grampo de remendo ou grampo de volta-gem sob diferentes condições, e através de medição de íons com traçadoresmarcados com rádio ou corantes sensíveis a voltagem sob diferentes condições.

II. Polinucleotídeos isolados codificando KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) ou Suas Porções

Na prática de processos aqui mostrados, vários agentes podemser usados para modular a atividade e/ou expressão de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) em uma célula. Em uma realização, um agente é uma mo-lécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) ou uma sua porção. Tais moléculas de ácido nucléico sãodescritas em mais detalhes abaixo.

Existe uma conhecida e definida correspondência entre a se-qüência de aminoácidos de uma particular proteína e as seqüências de nu-cleotídeos que podem codificar a proteína, como definido pelo código gené-tico (mostrado abaixo). Do mesmo modo, há uma conhecida e definida cor-respondência entre a seqüência de nucleotídeos de uma particular molécu-las de ácido nucléico e a seqüência de aminoácidos codificada por aquelamolécula de ácido nucléico, como definido pelo código genético.

Código Genético

Alanina (Ala, A) GCA, GCC, GCG, GCTArginina (Arg, R) AGA, ACG, CGA, CGC1 CGG1 CGTAsparagina (Asn, Ν) AAC1 AATÁcido aspártico (Asp, D) GAC1 GATCisteína (Cys, C) TGC, TGTÁcido glutâmico (Glu, E) GAA, GAGGlutamina (Gln, Q) CAA, CAGGlicina (Gly, G) GGA1 GGC1 GGG1 GGTHistidina (His, H) CAC1 CATIsoleucina (lie, I) ATA, ATC, ATTLeucina (Leu, L) CTA, CTC1 CTG, CTT, TTA, TTGLisina(Lys1K)AAA1AAGMetionina (Met1M) ATGFenil alanina (Phe, F) TTC, TTTProlina (Pro, P) CCA, CCC, CCG, CCTSerina (Ser, S) AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, TCTTreonina (Thr, T) ACA, ACC, ACG1 ACTTriptofano (Trp, Wj TGGTirosina (Tyr, Y) TAC, TATValina (Vai, V) GTA, GTC, GTG, GTTSinal de terminação (fim) TAA, TAG, TGA

Uma importante e bem conhecida característica do código gené-tico é é sua redundância, pelo que, para maior parte dos aminoácidos usa-dos para fabricar proteínas, mais de um codificando tripleto nucleotídeo podeser empregado (ilustrado acima). Por isso, um número de diferentes se-qüências de nucleotídeos podem codificar uma dada seqüência de aminoá-cidos. Tais seqüências de nucleotídeos são consideradas funcionalmenteequivalentes porque elas resultam na produção da mesma seqüência deaminoácidos em todos os organismos (embora certos organismos possamtraduzir algumas seqüências mais eficientemente do que outras). Além dis-so, ocasionalmente, uma variante metilada de uma purina ou pirimidina podeser encontrada em uma dada seqüência de nucleotídeos. Tais metilaçõesnão afetam a relação codificante entre o códon trinucleotídeo e o correspon-dente aminoácido.

Em vista do anterior, a seqüência de nucleotídeos de uma molé-cula de ADN ou ARN para um polipeptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) (ouuma sua porção) pode ser usada para derivar a seqüência de aminoácidoKCNQ5 ou KCNQ5(W270L), usando o código genético para traduzir a molé-cula de ADN ou ARN em uma seqüência de aminoácidos. Da mesma manei-ra, para qualquer seqüência de aminoácido KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), cor-respondentes seqüências de polinucleotídeos que podem codificar proteínaKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) podem ser deduzidas do código genético (que,devido sua redundância, produzirá múltiplas seqüências de polinucleotídeospara qualquer dada seqüência de aminoácidos). Assim, descrição e/ou ex-posição aqui de uma seqüência de polinucleotídeos KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) deve ser considerada para também incluir descrição e/ouexposição da seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência de poli-nucleotídeos. Similarmente, descrição e/ou exposição de uma seqüência deaminoácidos KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) aqui deve ser considerada paratambém incluir descrição e/ou exposição de todas possíveis seqüências depolinucleotídeos que podem codificar a seqüência de aminoácidos.

Um aspecto pertence a moléculas de ácido nucléico isoladasque codificam proteínas KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) ou suas porções biolo-gicamente ativas, assim como fragmentos de ácidos nucléicos suficientespara uso como sondas de hibridização para identificar polinucleotídeos codi-ficando KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) (por exemplo, ARNm KCNQ5 ouKCNQ5(W270L)) e fragmentos para uso como primers PCR para a amplifi-cação ou mutação de polinucleotídeos KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Porçõesbiologicamente ativas de proteínas KCNQ5 incluem, por exemplo, os seisdomínios transmembrana, a região de poro, e a região terminal-C conserva-da. Será entendido que, na discussão de usos de moléculas de ácido nucléi-co KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), fragmentos de tais polinucleotídeos assimcomo polinucleotídeos KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) de inteiro comprimentopodem ser usados.

Um polinucleotídeo aqui mostrado, por exemplo, SEQ ID NO: 1,ou uma sua porção, pode ser isolado usando técnicas de biologia molecularpadrão e a informação de seqüência aqui provida. Por exemplo, usando todaou uma porção da seqüência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 1 comouma sonda de hibridização, polinucleotídeos KCNQ5(W270L) podem serisolados usando técnicas padrões de hibridização e clonagem (por exemplo,como descrito em Sambrook, J., Fritsh1 E.F., e Maniatisj T. Molecular Clo-ning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Coldspring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

Além disso, um polinucleotídeo abrangendo toda ou uma porçãode SEQ ID NO: 1 pode ser isolado por PCR usando primers oligonucleotí-deos sintéticos desenhados baseado na seqüência de, por exemplo, SEQ IDNO: 1.

Um polinucleotídeo pode ser amplificado usando ADNc, ARNmou alternativamente, ADN genômico, como um molde e apropriados primersoligonucleotídeos de acordo com técnicas padrões de amplificação de PCR.O polinucleotídeo assim amplificado pode ser clonado em um vetor apropri-ado e caracterizado por análise de seqüência de ADN. Além disso, oligonu-cleotídeos correspondendo a seqüências de polinucleotídeos KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) podem ser preparados através de técnicas sintéticas pa-drões, por exemplo, usando um sintetizador de ADN automatizado.

Em uma realização preferida, um polinucleotídeo isolado com-preende a seqüência de polinucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 1.

Em uma outra realização preferida, um polinucleotídeo isoladocompreende um polinucleotídeo que é um complemento da seqüência depolinucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 1 ou uma porção desta seqüên-cia de polinucleotídeos. Um polinucleotídeo que é complementar para a se-qüência de polinucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 1 é um que é sufici-entemente complementar para a seqüência de polinucleotídeos mostradaem SEQ ID NO: 1 de modo que ela pode hibridizar para a seqüência de poli-nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 1, pelo que formando um duplex es-tável.

Ainda em uma outra realização preferida, um polinucleotídeoisolado compreende uma seqüência de polinucleotídeos que é pelo menoscerca de 95%, 98%, ou mais homóloga à seqüência de polinucleotídeos (porexemplo, ao inteiro comprimento da seqüência de nucleotídeos) mostradaem SEQ ID NO: 1 ou uma porção desta seqüência de nucleotídeos.

Além disso, um polinucleotídeo pode compreender somente umaporção da seqüência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 1; por exemplo, umfragmento que pode ser usado como uma sonda ou primer ou um fragmentocodificando uma porção biologicamente ativa de uma proteínaKCNQ5(W270L), contanto que o fragmento inclua nucleotídeos 808-810 deSEQ ID NO:1. A sonda / primer tipicamente compreende um oligonucleotí-deo substancialmente purificado. Em uma realização, o oligonucleotídeocompreende uma região de seqüência de nucleotídeos que hibridiza sobcondições rigorosas para pelo menos cerca de 12 ou 15, preferivelmentecerca de 20 ou 25, mais preferivelmente cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,65, 75, ou 100 polinucleotídeos consecutivos de uma seqüência sentido deSEQ ID NO: 1. Em uma outra realização, um polinucleotídeo compreendeuma seqüência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 100, 200,300, 400, 500, 600 ou 700 nucleotídeos em comprimento e hibridiza sobcondições rigorosas de hibridização a uma seqüência de polinucleotídeos deSEQ ID NO: 1 ou os seus complementos.

Em uma outra realização, um polinucleotídeo compreende pelomenos cerca de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, ou mais nucleotídeoscontíguos de SEQ ID NO: 1, contanto que o fragmento inclua nucleotídeos808-81 Ode SEQ ID NO: 1.

Em outras realizações, um polinucleotídeo tem pelo menos 95%de identidade, e mais preferivelmente 98% de identidade, com um polinucle-otídeo compreendendo pelo menos cerca de 100, 200, 300, 400, 500, 600,700, ou mais polinucleotídeos de SEQ ID NO: 1, contanto que uma substitui-ção em nucleotídeos 808-810 seja para um códon que produz uma substitui-ção conservativa para o aminoácido Ieucina (por exemplo, uma substituiçãoque codifica para alanina, glicina, isoleucina ou valina).

Em uma outra realização, um polinucleotídeo codifica um poli-peptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1no lugar do domínio transmembrana S5-S6 tipo selvagem de KCNQ5. Odomínio transmembrana S5-S6 humano foi determinado através de previsãode estrutura secundária usando o programa GCG baseado em hidrofobici-dade da seqüência de aminoácidos. S5 contem aminoácidos L266 a V287, eS6 contem aminoácidos L326 a L352. Devido à falta de estrutura cristal deKCNQ5, SEQ ID NO: 6 inclui uma região estendida no Iigador S4-S5 putati-vo. Assim, em uma realização, o domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ5inclui nucleotídeos 769-1062 de SEQ ID NO: 3, correspondendo a aminoáci-dos 257-354 de SEQ ID NO: 4. Preferivelmente, o domínio transmembranaS5-S6 é de KCNQ1 humano, mais preferivelmente o domínio transmembra-na S5-S6 codificado por SEQ ID NO: 5. Em uma realização, o polinucleotí-deo é uma seqüência de ácido nucléico compreendendo SEQ ID NO: 3, on-de nucleotídeos 769-1062 são substituído com SEQ ID NO: 5. Em uma outrarealização, o polinucleotídeo codifica SEQ ID NO: 4, onde aminoácidos 257-354 estão substituídos com um domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1,preferivelmente o domínio transmembrana S5-S6 representado por SEQ IDNO: 6.

Em uma outra realização, um polinucleotídeo codifica um poli-peptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembrana S5 de KCNQ1 nolugar do domínio transmembrana S5 tipo selvagem de KCNQ5. O domíniotransmembrana S5 em KCNQ5 humano corresponde a polinucleotídeos 769-873 de SEQ ID NO: 3, codificando aminoácidos S257-A291 de SEQ ID NO:4. Preferivelmente, o domínio transmembrana S5 é de KCNQ1 humano,mais preferivelmente o domínio transmembrana S5 codificado por nucleotí-deos 1-105 de SEQ ID NO: 5. Em uma realização, o polinucleotídeo é umaseqüência de ácidos nucléicos compreendendo SEQ ID NO: 3, onde nucleo-tídeos 769-873 estão substituídos com nucleotídeos 1-105 de SEQ ID NO: 5.Em uma outra realização, o polinucleotídeo codifica SEQ ID NO: 4, ondeaminoácidos 257-291 são substituídos com um domínio transmembrana S5de KCNQ1, preferivelmente o domínio transmembrana S5 representado poraminoácidos 1-35 de SEQ ID NO: 6.Sondas baseadas na seqüência de polinucleotídeos KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) podem ser usadas para detectarem seqüências transcritasou genômicas codificando as mesmas proteínas ou proteínas homólogas.Em realizações preferidas, a sonda ainda compreende um grupo rótulo Iiga-do à mesma, por exemplo, o grupo rótulo pode ser um radioisótopo, umcomposto fluorescente, uma enzima, ou um co-fator enzima. Tais sondaspodem ser usadas como parte de um kit teste diagnóstico para identificaçãode células ou tecidos, particularmente o cérebro, músculo de esqueleto, e abexiga urinária, que expressa erroneamente uma proteína KCNQ5 tipo sel-vagem, tal como através de medição de um nível de um polinucleotídeo co-dificando KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) em uma amostra de células a partir deum · sujeito, por exemplo, detectando níveis de ARNm KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) ou determinando se um gene KCNQ5 tipo selvagem sofreumutação ou foi suprimido.

Um fragmento de ácido nucléico codificando uma "porção biolo-gicamente ativa de uma proteína KCNQ5(W270L) pode ser preparado atra-vés de isolamento de uma porção da seqüência de polinucleotídeos de SEQID NO: 1, contanto que o fragmento inclua nucleotídeos 808-810 de SEQ IDNO: 1, que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade biológicaKCNQ5(W270L) (isto é, a geração de correntes seletivas de K+ de ativaçãolenta, dependentes de voltagem que são insensíveis para o bloqueador decanal K+ TEA e mostram uma acentuada retificação interna em voltagenspositivas de membrana), expressão de porção codificada da proteínaKCNQ5(W270L) (por exemplo, através de expressão recombinante in vitro),e avaliação de atividade da porção codificada da proteína KCNQ5(W270L).

Polinucleotídeos que diferem de SEQ ID NO: 1 devido a degene-rescência do código genético, e assim codificam a mesma proteínaKCNQ5(W270L) como aquela codificada por SEQ ID NO: 1 são abrangidospela presente exposição. Da mesma maneira, em uma outra realização, umpolinucleotídeo isolado tem uma seqüência de polinucleotídeos codificandouma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ IDNO: 2.Moléculas de ácidos nucléicos correspondendo a variantes aléli-cas naturais e homólogos das moléculas de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) po-dem ser isoladas, por exemplo, baseado em sua homologia aos polinucleotí-deosKCNQõ ou KCNQ%(W270L) aqui mostrados usando os ADNcs aquimostrados, ou suas porções, como uma sonda de hibridização de acordocom técnicas padrões de hibridização. Por exemplo, um ADNKCNQ5(W270L) pode ser isolado de uma biblioteca de ADN genômico u-sando toda ou uma porção de SEQ ID NO: 1 como uma sonda de hibridiza-ção e técnicas padrões de hibridização ( por exemplo, como descrito emSambrook J. et ál., supra). Além disso, um polinucleotídeo abrangendo todoou uma porção de um gene KCNQ5 pode ser isolado através de reação decadeia polimerase usando iniciadores oligonucleotídeos desenhados basea-do na seqüência de SEQ ID NO: 1. Por exemplo, ARNm pode ser isolado decélulas (por exemplo, através do procedimento de extração com guanidínio -tiocianato de Chirgwin et al., Biochemistry 18: 5294-99 (1979)) e ADNc podeser preparado usando transcriptase reversa (por exemplo, Moloney MLV re-verse transcriptase, disponível de Gibco/BRL, Bethesda, Md.; ou AMV rever-se transcriptase, disponível de Seikagaku América, Inc., St. Petersburg,Fla.). Iniciadores oligonucleotídeos sintéticos para amplificação PCR podemser desenhados baseado na seqüência de polinucleotídeos mostrada emSEQ ID NO: 1. Um polinucleotídeo pode ser amplificado usando ADNc ou,alternativamente, ADN genômico, como um molde e apropriados iniciadoresoligonucleotídeos de acordo com técnicas padrões de amplificação PCR. Opolinucleotídeo assim amplificado pode ser clonado em um apropriado vetore caracterizado através de análises de seqüência de ADN. Além disso, oli-gonucleotídeos correspondendo a uma seqüência de polinucleotídeosKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) podem ser preparados através de técnicas sin-téticas padrões, por exemplo, usando um sintetizador de ADN automatizado.

Em uma outra realização, um polinucleotídeo isolado pode seridentificado baseado em identidade de seqüência de nucleotídeos comparti-lhada usando um algoritmo matemático. Tais algoritmos são esboçados emmais detalhes acima (ver, por exemplo, seção I, infra).Em uma outra realização, um polinucleotídeo isolado é pelo me-nos 15, 20, 25, 30 ou mais polinucleotídeos em comprimento e hibridiza sobcondições rigorosas para a molécula de ácido nucléico compreendendo aseqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou seus complementos, Emuma outra realização, o polinucleotídeo é pelo menos 30, 50, 100, 150, 200,250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, ou 600 nucleotídeos em comprimento.Preferivelmente, as condições são tais que seqüências pelo menos 95%,preferivelmente pelo menos cerca de 98%, homólogas umas às outras tipi-camente permanecem hibridizadas umas às outras. Preferivelmente, umamolécula de ácido nucléico isolada que hibridiza sob condições rigorosas àseqüência de SEQ ID NO: 1 ou seus complementos corresponde a uma mo-lécula de ácido nucléico ocorrendo naturalmente.

Em uma outra realização, menores mudanças podem ser intro-duzidas através de mutação em seqüências de polinucleotídeos, por exem-pio, de SEQ ID NO: 1, pelo que conduzindo a mudanças na seqüência deaminoácido da proteína codificada, sem alteração de atividade funcional deuma proteína KCNQ5(W270L). Por exemplo, substituições de nucleotídeosconduzindo a substituições de aminoácidos em resíduos de aminoácidos"não-essenciais" podem ser feitas na seqüência de SEQ ID NO: 1. Um resí-duo de aminoácido "não-essencial11 é um resíduo que pode ser alterado da; seqüência de um polinucleotídeo KCNQ5(W270L) (por exemplo, a seqüênciade SEQ ID NO: 1) sem alteração der atividade funcional de uma molécula deKCNQ5(W270L). Resíduos exemplares que são não-essenciais e, por isso,suscetíveis a substituição podem ser identificados por aqueles versados natécnica através de realização de um alinhamento de aminoácidos de molécu-las relacionadas com KCNQ5(W270L) e determinando resíduos que não sãoconservados. Tais resíduos, devido não terem sido conservados, são maisprovavelmente suscetíveis a substituição.

Da mesma maneira, um outro aspecto pertence a polinucleotí-deos codificando proteínas KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) que contêm mudan-ças em resíduos de aminoácidos que não são essenciais para uma atividadeKCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Tais proteínas KCNQ5(W270L), por exemplo,diferem em seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ainda retendo umainerente atividade KCNQ5(W270L). Um polinucleotídeo isolado codificandouma variante não-natural de, por exemplo, uma proteína KCNQ5(W270L)pode ser criado através de introdução de uma ou mais substituições, adiçõesou supressões de nucleotídeos na seqüência de polinucleotídeos de SEQ IDNO: 1 de modo que uma ou mais substituições, adições ou supressões deaminoácidos são introduzidas na proteína codificada, contanto que umasubstituição em nucleotídeos 808-810 seja para um códon que produza umasubstituição conservativa para o aminoácido leucina. Mutações podem serintroduzidas em SEQ ID NO: 1 através de técnicas padrões, como mutagê-nese direcionada a sítio e mutagênese mediada por PCR. Preferivelmente,substituições conservativas de aminoácidos são feitas em um ou mais resí-duos de aminoácidos não-essenciais. Uma "substituição conservativa deaminoácido" é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído com umresíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resí-duos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas natécnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, his-tidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmi-co), cadeias laterais polares não-carregadas (por exemplo, glicina, asparagi-na, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não-polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenil alani-na, metionina, triptofano), cadeias laterais beta - ramificadas (por exemplo,troenina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tiro-sina, fenil alanina, triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácidonão-essencial em um polipeptídeo KCNQ5(W270L) é preferivelmente substi-tuído com um outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral.

Alternativamente, em uma outra realização, mutações podemser introduzidas randomicamente ao longo de toda ou parte de uma seqüên-cia codificando KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), tal como através de mutagêne-se de saturação, e os mutantes resultantes podem ser selecionados, porexemplo, por sua habilidade para ativar transcrição ou para identificar mu-tantes que retêm atividade funcional. Seguindo mutagênese, a proteína mu-tante KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) pode ser expressa recombinantemente emuma célula hospedeira e a atividade funcional da proteína mutante pode serdeterminada usando ensaios disponíveis na técnica para avaliação de ativi-dade KCNQ5. Os ensaios incluem, mas não são limitados a, gravação decélula integral de grampo remendo usando células mamíferas como hospe-deiros ou grampeamento de voltagem de dois eletrodos usando oócitos deXenopus laevis como hospedeiros.

Ainda um outro aspecto pertence a polinucleotídeos isoladoscodificando proteínas de fusão KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Tais polinucleo-tídeos, compreendendo pelo menos uma primeira seqüência de polinucleotí-deos codificando proteína, polipeptídeo ou peptídeo KCNQ5 ouKCNQ%(W270L) de inteiro comprimento tendo atividade KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) ligado operavelmente a uma segunda seqüência de polinu-cleotídeo codificando uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo não-KCNQ5 ounão-KCNQ5(W270L) podem ser preparados através de técnicas padrões deADN recombinante.

Em uma realização preferida, uma proteína KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) pode ser ensaiada para a habilidade para codificar canaisde íons funcionais usando processos eletrofisiológicos como descrito acima,por exemplo, gravação de célula integral de grampo de remendo usandocélulas mamíferas como hospedeiros ou grampeamento de voltagem de doiseletrodos usando oócitos de Xenopus Iaevis como hospedeiros. Em um as-pecto, o polipeptídeo KCNQ5 contem um domínio transmembrana S5-S6 deKCNQ1. Em um outro aspecto, o polipeptídeo KCNQ5 contem um domíniotransmembrana S5 de KCNQ1.

Em adição aos polinucleotídeos codificando proteínas KCNQ5ou KCNQ5(W270L) descritos acima, um outro aspecto pertence a polinu-cleotídeos isolados que são anti - sentido. Um ácido nucléico "anti-sentido"compreende uma seqüência de nucleotídeos que é complementar a um áci-do nucléico "sentido" codificando uma proteína, por exemplo, complementarà fita codificando de uma molécula de ADNc de fita dupla ou complementar auma seqüência de ARNm. Da mesma maneira, um ácido nucléico anti-sentido pode ligar com hidrogênio a um ácido nucléico sentido. O ácido nu-cléico anti-sentido pode ser complementar a uma inteira fita codificanteKCNQ5 ou KCNQ5(W270L), ou somente a uma sua porção. Em uma reali-zação, uma molécula de ácido nucléico anti - sentido é anti-sentido para uma"região codificante" da fita codificante de uma seqüência de nuçleotídeoscodificando KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). O termo "região codificante" refere-se à região da seqüência de nuçleotídeos compreendendo códons que sãotraduzidos em resíduos de aminoácidos. O termo "região não-codificante"refere-se a seqüências 5' e 3' que flanqueiam a região codificante que nãosão traduzidas em aminoácidos (isto é, também referidas como regiões não-traduzidas 5' e 3').

Dadas as seqüências de fita codificantes codificando KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) aqui mostradas, ácidos nucléicos anti-sentido podem serdesenhados de acordo com as regras de emparelhamento de bases de Wat-son e Crick. O polinucleotídeo anti - sentido pode ser complementar para ainteira região codificante de ARNm KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), mas maispreferivelmente é um oligonucleotídeo que é anti - sentido para somenteuma porção da região cidificante ou não-codificante de ARNM de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L). Por exemplo, o oligonucleotídeo anti-sentido pode sercomplementar para a região circundando o sítio de partida de tradução deARNm KCNQ5(W270L). Um oligonucleotídeo anti - sentido pode ser, porexemplo, de cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 nuçleotídeos emcomprimento. Um polinucleotídeo anti - sentido pode ser construído usandosíntese química e reações de ligação enzimática usando procedimentos co-nhecidos na técnica. Por exemplo, um ácido nucléico anti - sentido (por e-xemplo, um oligonucleotídeo anti-sentido) pode ser quimicamente sintetizadousando nuçleotídeos ocorrendo naturalmente ou nuçleotídeos variadamentemodificados desenhados para aumento de estabilidade biológica das molé-cuias ou para aumento de estabilidade física do duplex formado entre osácidos nucléicos anti - sentido e sentido, por exemplo, derivados de fósforo-tioato e nuçleotídeos substituídos com acridina podem ser usados. Exemplosde nucleotídeos modificados que podem ser usados para geração de ácidonucléico anti - sentido incluem 5-flúor uracila, 5-bromo uracila, 5-cloro uraci-Ia1 5-iodo uracila, hipoxantina, xantina, 4-acetil citoxina, 5-(carboxi hidroxilmetil) uracila, 5-carboxi metil amino metil-2-tio uridina, 5-carboxi metil aminometil uracila, diidro uracila, beta-D-galactosil queosina, inosina, N6-isopentenil adenina, 1-metil guanina, 1-metil inosina, 2,2-dimetil guanina, 2-metil adenina, 2-metil guanina, 3-metil citosina, 5-metil citosina, N6-adenina,7-metil guanina, 5-metil amino meil uracila, 5-metoxi amino metil-2-tio uraci-la, beta-D-manosil queosina, 5'-metoxi carboxi metil uracila, 5-metoxi uracila,2-metil tio-N6-isopentenil adenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina,pseudo uracila, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tio uracila, 2-tio uracila, 4-tio uracila, 5-metil uracila, metil éster de ácido uracil-5-oxi acético, ácido ura-cil-5-oxi acético (v), 5-metil-2-tio uracila, 3-(3-amino-3-N-2-carboxi propil)uracila, (acp3)w, e 2,6-diamino purina. Alternativamente, o ácido nucléicoanti - sentido pode ser produzido biologicamente usando um vetor de ex-pressão no qual um ácido nucléico foi subclonado em uma orientação anti -sentido (isto é, ARN transcrito do ácido nucléico inserido será de uma orien-tação anti- sentido para um ácido nucléico alvo de interesse, ainda descritona sub-seção seguinte).

Os polinucleotídeos anti - sentido são tipicamente administrados/ a um sujeito ou gerados in situ de modo que eles hibridizam com ou ligam-sea ARNm celular e/ou ADN genômico codificando uma proteína KCNQ% ouKCNQ5(W270L) para pelo que inibir expressão da proteína , por exemplo,através de inibição de transcrição e/ou tradução. A hibridização pode seratravés de complementaridade de nucleotídeo convencional para formar umduplex estável, ou, por exmeplo, no caso de um polinucleotídeo anti - sentidoque se liga a duplexes ADN, através de específicas interações na ranhuraprincipal da hélice duplex. Um exemplo de uma rota de administração depolinucleotídeos anti - sentido inclui injeção direta em um sítio de tecido. Al-ternativamente, polinucleotídeos anti - sentido podem ser modificados paraalvejar células selecionadas e então administrados sistemicamente. Por e-xemplo, para administração sistêmica, moléculas anti - sentido podem sermodificadas de modo que elas liguem-se especificamente a receptores ouantígenos expressos sobre uma superfície de célula selecionada, por exem-plo, através de ligação de polinucleotídeos anti - sentido a peptídeos ou anti-corpos que se ligam a receptores ou antígenos de superfície de célula. Ospolinucleotídeos anti - sentido também podem ser liberados para células u-sando os vetores aqui descritos. Para obter suficiente concentrações intrace-lulares das moléculas anti - sentido, construções de vetores nas quais o po-linucleotídeo anti - sentido é colocado sob o controle de um promotor pol Ilou pol Ill forte são preferidas.

Ainda em uma outra realização, o polinucleotídeo anti - sentido éuma molécula de ácido nucléico alfa-anomérica. Uma molécula de ácido nu-cléico alfa-anomérica forma específicos híbridos de fita dupla com ARNcomplementar onde, contrário às usuais unidades - beta, as fitas correm pa-ralelas uma à outra (Gaultier C et al., Nucleic Acids Res. 15:6625-41 (1987)).A molécula de ácido nucléico anti - sentido também pode compreender um2'-o-metil ribonucleotídeo (lnoue H et al., Nucleic Acids Res. 15:61-3148(1987)), ou um análogo ARN - ADN quimérico (lnoue H et al., FEBS Lett.215:327-30(1987)).

Ainda em uma outra realização, um polinucleotídeo anti - sentidoé uma ribozima. Ribozimas são moléculas de ARN catalíticas com atividaderibonuclease que são capazes de clivar um ácido nucléico de fita simples, talcomo um ARN, para o qual elas têm uma região complementar. Assim, ribo-zimas (por exemplo, ribozimas cabeça de martelo (descritas em Haselhoff Je Gerlach WL, Nature 334:585-91 (1988))podem ser usadas para clivagemcatalítica de transcritos de ARNm KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) para pelo queinibir tradução de ARNm KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Uma ribozima tendoespecificidade para um ácido nucléico codificando KCNQ5(W270L) pode serdesenhada baseado na seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1. Porexemplo, um derivado de um ARN de Tetrahymena L-19 IVS pode ser cons-truído no qual a seqüência de nucleotídeos do sítio ativo é complementar àseqüência de nucleotídeos a ser clivada em um ARNm codificandoKCNQ5(W270L) (ver, por exemplo, patentes US 4 987 071 e 5 116 742).Alternativamente, ARNm KCNQ5(W270L) pode ser usado para selecionarum ARN catalítico tendo uma específica atividade ribonuclease a partir deuma reunião de moléculas de ARN (ver, por exemplo, Bartel D and SzostakJW, Science 261:1411-18 (1993)).

Alternativamente, expressão de gene pode ser inibida alvejantoseqüências de nucleotídeos complementares para uma região reguladora deKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) (por exemplo, promotor e/ou aperfeiçoadoresKCNQ5(W270L) para formar estruturas de hélice tripla para prevenir trans-crição de um gene KCNQ5 ou KCNQ5)(W270L) em células alvos (ver gene-ricamente, Helene C, Anticancer Drug Des. 6:569-84 (1991); Helene C et al.,Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 660:27-36 (1992); Maher LJ1 Bioassays 14:807-15(1992)).

Ainda em uma outra realização, os polinucleotídeos KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) podem ser modificados na metade base, metade açúcar, oucadeia principal fosfato para aperfeiçoar, por exemplo, a estabilidade, hibri-dização, ou solubilidade da molécula. Por exemplo, a cadeia principal fosfatodesoxirribose dos polinucleotídeos pode ser modificada para gerar ácidosnucléicos peptídeos (ver Hyrup B et al., Bioorg. Med. Chem. 4:5-23 (1996)).Como aqui usados, os termos "ácidos nucléicos peptídeos" e "PNAs" refe-rem-se a imitações de ácidos nucléicos, por exemplo, imitações de ADN, nasquais a cadeia principal fosfato desoxirribose é substituída por uma cadeiaprincipal pseudo-peptídeo e somente as quatro nucleobases naturais sãoretidas. A cadeia principal neutra de PNAs foi mostrada permitir específicahibridização para ADN e Arn sob condições de baixa resistência iônica. Asíntese de oligômeros PNA pode ser realizada usando protocolos de síntesede peptídeo de fase sólida padrão como descrito em Hyrup B et al., supra;Perry-O1Keefe H et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:14670-75 (1996).

PNAs de polinucleotídeos KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) podemser usados em aplicações terapêuticas e diagnosticas. Por exemplo, PNAspodem ser usados como agentes anti - sentido ou anti - gene para modula-ção específica de seqüência de expressão de gene através de, por exemplo,indução de impedimento de transcrição ou tradução ou inibição de replica-ção. PNAs de moléculas de ácido nucléico também podem ser usados naanálise de mutações de par de base simples em um gene (por exemplo, a-través de grampeamento de PCR direcionada por PNA), como "enzimas derestrição artificiais" quando usados em combinação com outras enzimas (porexemplo, S1 nucleases (Hyrup B et al., supra), ou como sondas ou iniciado-res para seqüenciamento ou hibridização de ADN (Hyrup B et al., supra; Per-ry-0'Keefe H et al, supra).

Em uma outra realização, polinucleotídeos KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) podem ser modificados (por exemplo, para aperfeiçoamen-to de sua estabilidade ou tomada celular) através de ligação de grupos Iipofí-Iicos ou outros auxiliares a PNA, através de formação de quimeras PNA-ADN, ou através do uso de Iipossomas ou outras técnicas conhecidas deliberação de droga. Por exemplo, quimeras PNA-ADN de polinucleotídeosKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) podem ser geradas as quais podem combinaras vantajosas propriedades de PNA e ADN. Tais quimeras permitem queenzimas de reconhecimento de ADN (por exemplo, RNase H e ADN polime-rases) interajam com a porção ADN enquanto a porção PNA pode proveralta afinidade de ligação e especificidade. Quimeras de PNA-ADN podemser ligadas usando Iigadores de apropriados comprimentos selecionados emtermos de empilhamento de bases, número de ligações entre as núcleoba-ses, e orientação (Hyrup B et al., supra). A síntese de quimeras de PNA-ADN pode ser realizada como descrito em Hyrup B et al., supra, e Finn PJ etal., Nucleic Acids Res. 24:3357-63 (1996). Por exemplo, uma cadeia ADNpode ser sintetizada sobre um suporte sólido usando química de acoplamen-to de fosforamidito padrão e análogos de nucleosídeos modificados, por e-xemplo, 5'-(4-metoxi tritil) amino-5'-desoxi timidina fosforamidito, pode serusado como um entre PNA e a extremidade 5' de ADN (Mag M et al., NucleicAcids Res. 17:5973-88 (1989)). Monômeros PNA são então acoplados emuma maneira em etapas para produção de uma molécula quimérica com umsegmento 5' PNA e um segmento 3' ADN (Finn PJ et al., supra). Alternati-vamente, moléculas quiméricas podem ser sintetizadas com um segmentoADN 5' e um segmento PNA 3' (Petersen KH et al., Bioorg. Med. Chem. Lett.5:1119-24 (1995)).

Em outras realizações, o oligonucleotídeo pode incluir outrosgrupos apostos tais como peptídeos (por exemplo, para alvejar receptoresde célula hospedeira in vivo), ou agentes facilitando o transporte através demembrana de célula (ver, por exemplo, Letsinger RL et al., Proc. Natl. Acad.Sei, USA 86:6553-56 (1989); Lemaitre M et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA84:648-52 (1987); PCT Publication No. W088/09810) ou a barreira sangue -cérebro (ver, por exemplo, PCT Publication No. W089/10134). Em adição,oligonucleotídeos podem ser modificados com agentes de clivagem dispara-dos por hibridização (ver, por exemplo, van der Krol AR et al., Biotechniques6:958-76 (1988)) ou agentes intercalantes (ver, por exemplo, Zon G, Pharm.Res. 5:539-49 (1988)). Para este fim, o oligonucleotídeo pode ser conjugadoa uma outra molécula (por exemplo, um peptídeo, agente de reticulação dis-parado com hibridização, agente de transporte, ou agente de clivagem dis-parado com hibridização).

Em uma realização, expressão de polinucleotídeo KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) pode ser inibida através de ARNs interferentes curtos (siR-NA). O siRNA pode ser dsRNA tendo 19-25 nucleotídeos. siRNAs podem serproduzidos endogenamente através de degradação de moléculas de dsRNAmaiores por uma nuclease relacionada a RNase Ill chamada Dicer. SiRNAstambém podem ser introduzidos em uma célula exogenamente, ou atravésde transcrição de uma construção de expressão. Uma vez formado, os siR-NAs montam com componentes de proteína em complexos contendo endor-ribonucleases conhecidos como complexos de silêncio induzido por ARN(RISCs). Desenrolamento gerado por ATP do siRNA ativa os RISCs, que porsua vez alvejam o transcrito ARNm complementar através de emparelha-mento de bases de Watson-Crick, pelo que clivando e destruindo o ARNm.Clivagem do ARNm ocorre próximo do meio da região ligada pela fita desiRNA. Esta degradação de ARNm específica de seqüência resulta em si-Ienciamento de gene.

Pelo menos duas maneiras podem ser empregadas para obten-ção de silenciamento de gene mediado por siRNA. Primeiro, siRNAs podemser sintetizados in vitro e introduzidos em células para suprimirem transien-temente a expressão de gene. siRNAs sintéticos proporcionam uma maneirafácil e eficiente para obtenção de ARNi. SiRNA são duplexes de oligonucleo-tídeos mistos, curtos que podem incluir, por exemplo, 19 nucleotídeos ARNscom projeções 3' de dinucleotídeo simétricos. Usando duplexes de siRNA de21 pb sintéticos (por exemplo, 19 bases ARN seguido por uma projeção 3'UU ou dTdT), silenciamento de gene específico de seqüência pode ser obti-do em células mamíferas. Estes siRNAs podem especificamente suprimiralvejada tradução de gene em células mamíferas sem ativação de proteínacinase dependente de ADN (PKR) através de ARNs de fita dupla mais lon-gos (dsRNA), que pode resultar em repressão não-específica de tradução demuitas proteínas.

Segundo, siRNAs podem ser expressos in vivo a partir de veto-res. Esta abordagem pode ser usada para expressar estavelmente siRNAsem células ou animais transgênicos. Em uma realização, vetores de expres-são de siRNA são engenheirados para dirigirem transcrição de siRNA a par-tir de unidades de transcrição polimerase Ill (pol III). Unidades de transcriçãoPol Ill são apropriadas para expressão de siRNA grampo porque elas dis-põem de um sítio de terminação de transcrição rico em AT curto que conduzà adição de 2 pb de projeções (por exemplo, UU) para siRNAs grampos -uma característica que é útil para função de siRNA. Os vetores de expressãoPol Ill também podem ser usados para criação de camundongo transgênicoque expressa siRNA.

Em uma outra realização, siRNAs podem ser expressos em umamaneira específica de tecido. Sob esta abordagem, longos dsRNAs são pri-meiro expressos a partir de um promotor (tal como CMV (pol Il)) nos núcleosde selecionadas linhas de células ou camundongos transgênicos. Os longosdsRNAs são processados em siRNAs nos núcleos (por exemplo, por Dicer).Os siRNAs deixam os núcleos e mediam silenciamento especifico de gene.Uma abordagem similar pode ser usada em conjunção com promotores es-pecíficos de tecido (pol II) para criação de camundongo nocaute específicode tecido.Qualquer projeção de dinucleotídeo 3', tal como UU1 pode serusada para desenho de siRNA. Em alguns casos, resíduos G na projeçãosão evitados devido ao potencial para o siRNA ser clivado por RNase emresíduos G de fita simples.

Com relação à própria seqüência de siRNA, foi verificado quesiRNAs com teor GC de 30-50% podem ser mais ativos que aqueles com ummaior teor G/C em certos casos. Além disso, uma vez que um trato poli(T)de 4-6 nucleotídeos pode atuar como um sinal de terminação para pol IIIARN, estiramentos de >4 Ts ou As na seqüência alvo podem ser evitadosem certos casos quando desenhando seqüências a serem expressas a partirde um promotor pol Ill ARN. Em adição, algumas regiões de ARNm podemser altamente estruturadas ou ligadas por proteínas reguladoras. Assim, po-de ser útil selecionar sítios alvos de siRNA em diferentes posições ao longodo comprimento da seqüência de gene. Finalmente, os potenciais sítios al-vos podem ser comparados à apropriada base de dados de genoma (huma-no, camundongo, rato, etc.). Quaisquer seqüências alvos com mais que 16-17 pares de bases contíguos de homologia a outras seqüências codificantespodem ser eliminadas de consideração em certos casos.

Em uma realização, siRNA pode ser desenhado para ter duasrepetições invertidas separadas por uma seqüência espaçadora curta e ter-mina com uma corda de Ts que serve como um sítio de terminação detranscrição. Este desenho produz um transcrito ARN que é previsto dobrarem um siRNA grampo curto. A seleção de seqüência alvo de siRNA, o com-primento das repetições invertidas que codificam a haste de um grampo pu-tativo, a ordem das repetições invertidas, o comprimento e composição daseqüência espaçadora que codifica o laço do grampo, e a presença ou au-sência de projeções-5', podem variar para obtenção de desejáveis resulta-dos.

Os alvos siRNA podem ser selecionados através de exploraçãode uma seqüência de ARNm para dinucleotídeos AA e gravando os 19 nu-cleotídeos imediatamente à jusante do AA. Outros processos também po-dem ser usados para seíeção de alvos siRNA. Em um exemplo, a seleção daseqüência alvo siRNA é puramente empiricamente determinada (ver, porexemplo, Sui G et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99:5515-20 (2002)), tantoquanto a seqüência alvo comece com GG e não compartilhe significantehomologia de seqüência com outros genes como analisado por buscaBLAST. Em um outro exemplo, um processo mais elaborado é empregadopara selecionar as seqüências alvos siRNA. Este procedimento explora umaobservação que qualquer sítio acessível em ARNm endógeno pode ser alve-jado para degradação através do processo de oligodesoxirribonucleotídeosintético / RNase H (ver, por exemplo, Lee NS et al., Nature Biotechnol.20:500-05(2002)).

Em uma outra realização, o cassete de expressão de siRNA éconstruído para conter a fita sentido do alvo , seguida por um espaçador cur-to, a fita anti - sentido do alvo, e 5-6 Ts como terminador de transcrição. Aordem das fitas sentido e anti - sentido dentro das construções de expressãode siRNA pode ser alterada sem afetar as atividades de silenciamento degene do siRNA grampo. Em certos exemplos, a reversão da ordem podecausar redução parcial em atividades de silenciamento de gene.

O comprimento da seqüência de nucleotídeos sendo usada co-mo a haste de cassete de expressão de siRNA pode variar, por exemplo, de19 a 29. O tamanho de laço pode variar de 3 a 23 nucleotídeos. Outroscomprimentos e/ou tamanhos de laços também podem ser usados.

Ainda em uma outra realização, uma projeção 5' na construçãode siRNA grampo pode ser usada, contanto que o siRNA grampo seja fun-cional em silenciamento de gene. Em um exemplo específico, a projeção 5'inclui cerca de 6 resíduos de nucleotídeos.

Ainda em uma outra realização, a seqüência alvo para ARNi éum fragmento de seqüência de 21-meros de SEQ ID NO: 1, preferivelmenteincluindo nucleotídeos 808-810 de SEQ ID NO: 1. A extremidade 5' da se-qüência alvo tem dinucleotídeo "NA", onde "N" pode ser qualquer base e "A"representa adenina. A restante seqüência de 19-meros tem um teor GC deentre 35% e 55%. Em adição, a restante seqüência de 19-meros não incluiqualquer quatro consecutivas A ou T (isto é, AAAA ou mm), três consecuti-vas G ou C (isto é, GGG ou CCC), ou sete "GC" em uma fila.

Adicionais critérios também podem ser usados para seleção deseqüências alvos ARNi. Por exemplo, o teor GC da restante seqüência de 19meros pode ser limitado para entre 45% e 55%. Além disso, qualquer se-qüência de 19 meros tendo três bases idênticas consecutivas (isto é, GGG,CCC, TTT, ou AAA) ou uma seqüência palíndromo com 5 ou mais bases éexcluída. Além disso, a seqüência de 19 meros restante pode ser seleciona-da para ter baixa homologia de seqüência a outros genes. Em um exemploespecífico, potenciais seqüências alvos são buscadas por BLASTN contrabase de dados de seqüência cacho UniGene humana de NCBI. A base dedados UniGene humana contem conjuntos não-redundantes de cachos ori-entados de gene. Cada cacho UniGene inclui seqüências que representamum único gene. Seqüências de 19 meros não produzindo acerto para outrosgenes humanos sob a busca BLASTN podem ser selecionadas. Durante abusca, o valor-e pode ser fixado em um valor rigoroso (tal como "1").

A eficácia das seqüências de siRNA, assim como qualquer outraseqüência de RNAi derivada, pode ser avaliada usando-se vários processosconhecidos na técnica. Por exemplo, uma seqüência de siRNA pode ser in-troduzida em uma célula que expressa KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). O nívelde ARNm ou polipeptídeo de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) na célula pode serdetectado. Uma mudança substancial no nível de expressão de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) antes e após a introdução da seqüência de siRNA é indica-tiva da eficácia da seqüência de siRNA na supressão de expressão deKCNQ5 ou KCNQ5(W270L). em um exemplo específico, os níveis de ex-pressão de outros genes também são monitorados antes e após a introdu-ção da seqüência de siRNA. Uma seqüência de siRNA que tem efeito inibi-dor sobre expressão de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) mas não afeta signifi-cantemente a expressão de outros genes pode ser selecionada. Em um ou-tro exemplo específico, múltiplos siARN ou outras seqüências de ARNi po-dem ser introduzidas na mesma célula alvo. Estas seqüências de siRNA ouRNAi inibem especificamente expressão de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) masnão a expressão de outros genes. Ainda em um outro exemplo específico,seqüências de siRNA ou outras de RNAi que inibem a expressão de KCNQ5ou KCNQ5(W270L) e outro gene ou genes podem ser usadas.

Polinucleotídeos anti - sentido podem ser produzidos a partir deum cassete de expressão heterólogo em uma célula transfectante ou célulatransgênica. Alternativamente, os polinucleotídeos anti - sentido podemcompreender oligonucleotídeos solúveis que são administrados ao milieuexterno, tanto no meio de cultura in vitro como no sistema circulatório ou emfluido intersticial in vivo. Polinucleotídeos anti - sentido solúveis presentes nomillieu externo foram mostrados ganharem acesso ao citoplasma e inibiremtradução de específicas espécies de ARNm.

III. Proteínas, Seus Fragmentos KCNQ5 e KCNQ5(W270L) e Anti-corpos anti-KCNQ5 e anti-KCNQ5(W270L)

Um outro aspecto pertence a proteínas KCNQ5 eKCNQ5(W270L), e suas porções biologicamente ativas, assim como frag-mentos de polipeptídeos apropriados para uso como imunógenos para ele-var anticorpos anti-KCNQ5 ou anti-KCNQ5(W270L). Em uma realização,proteínas KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) podem ser isoladas de fontes de célu-las ou tecidos através de um apropriado esquema de purificação usandotécnicas padrões de purificação de proteína. Em uma outra realização, prote-ínas KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) são produzidas através de técnicas deADN recombinante. Em alternativa a expressão recombinante, um polipeptí-deo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) pode ser sintetizado quimicamente usandotécnicas padrões de síntese de peptídeo. Será entendido que na discussãode usos de proteínas KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), por exemplo, como mos-trado em SEQ ID NO: 2, que fragmentos de tais proteínas que são polipeptí-deos KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) de comprimento não-inteiro assim comoproteínas KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) de inteiro comprimento podem serusadas.

Um outro aspecto pertence a proteínas KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) isoladas. Preferivelmente, as proteínas KCNQ5(W270L)compreendem a seqüência de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 1 ouuma sua porção. Em uma outra realização preferida, a proteína compreendea seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma sua porção. Em ou-tras realizações, â proteína tem pelo menos 90%, mais preferivelmente 95%,e mesmo mais preferivelmente 98% de identidade de aminoácidos, com aseqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2 ou uma sua porção,contanto que uma substituição em aminoácido 270 não reestabeleça sensiti-vidade de retigabina para o polipeptídeo KCNQ5. Porções preferidas de mo-léculas de polipeptídeo KCNQ5(W270L) são biologicamente ativas, por e-xemplo, uma porção do polipeptídeo KCNQ5(W270L) tendo a habilidade decodificar canais de íons seletivos de potássio funcionais em um sistemahospedeiro, por exemplo, linhas de células mamíferas ou oócitos de Xeno-pus laevis.

Porções biologicamente ativas de uma proteína KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) incluem peptídeos compreendendo seqüências de aminoá-cidos suficientemente homólogas a ou derivadas da seqüência de aminoáci-dos da proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), que inclui menos aminoácidosque as proteínas KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) de inteiro comprimento, e exi-bem pelo menos uma atividade de uma proteína KCNQ5 ouKCNQ5(W270L).

Um aspecto é para polipeptídeos KCNQ5 contendo um domíniotransmembrana S5-S6 de KCNQ1 no lugar do domínio transmembrana tiposelvagem de KCNQ5. Preferivelmente, o domínio transmembrana S5-S6 éde KICNQ1 humano. Em uma realização, a seqüência de aminoácidos dopolipeptídeo KCNQ5 compreende SEQ ID NO: 4 com aminoácidos 257-354substituídos com o domínio transmembrana de S5-S6 de KCNQ1. Preferi-velmente, aminoácidos 257-354 de SEQ ID NO: 4 são substituídos com SEQID NO: 6.

Um outro aspecto é para polipeptídeos KCNQ5 contendo umdomínio transmembrana S5 de KCNQ1 no lugar do domínio transmembranatipo selvagem de KCNQ5. Preferivelmente, o domínio transmembrana S5 éde KCNQ1 humano. Em uma realização, a seqüência de aminoácidos dopolipeptídeo KCNQ5 compreende SEQ ID NO: 4 com aminoácidos 257-291substituídos com o domínio transmembrana S5 de KCNQ1. Preferivelmente,aminoácidos 257-291 de SEQ ID NO: 4 são substituídos com 1-35 SEQ IDNO: 6.

Também são providas proteínas de fusão ou quimérícas KCNQ5ou KCNQ5(W270L). Por exemplo, em uma realização, a proteína de fusão éuma proteína de fusão membro GST-KCNQ5(W270L) onde as seqüênciasde membro KCNQ5(W270L) são fundidas ao terminus-C das seqüênciasGST. Em uma outra realização, a proteína de fusão é uma proteína de fusãoKCNQ5(W270L)-HÁ onde a seqüência de nucleotídeos membroKCNQ5(W270L) é inserida em um vetor tal como vetor pCEP4-HÁ (Herrs-cher RF et al., Genes Dev. 9:3067-82 (1995)) de modo que as seqüênciasmembros KCNQ5(W270L) estão fundidas em estrutura a uma etiqueta epí-topo hemaglutinina de influenza. Tais proteínas de fusão podem facilitar apurificação de um membro KCNQ5(W270L) récombinante.

Proteínas e peptídeois de fusão produzidos através de técnicasrecombinantes podem ser secretados e isolados de uma mistura de célulase meio contendo a proteína ou peptídeo. Alternativamente, a proteína oupeptídeo pode ser retido citoplasmicamente e as células colhidas, lisadas, ea proteína isolada. A cultura de célula tipicamente inclui células hospedeiras,meios e outros subprodutos. Meios apropriados para cultura de células sãoconhecidos na técnica. Proteína e peptídeos podem ser isolados dos meiosde cultura de células, células hospedeiras, ou ambas usando técnicas co-nhecidas para purificação de proteínas e peptídeos. Técnicas para transfec-ção de células hospedeiras e purificação de proteínas e peptídeos são co-nhecidas.

Preferivelmente, uma proteína de fusão KCNQ5 ou

KCNQ5(W270L) é produzida através de técnicas de ADN recombinante pa-drão. Por exemplo, fragmentos de ADN codificando diferentes seqüências depolipeptídeos são ligados em estrutura de acordo com técnicas padrões, porexemplo, empregando termini embotados ou terminados alternados ára Iiga-ção, digestão com enzima de restrição para prover apropriados termini, en-chimento de extremidades coesivas quando apropriado, tratamento com fos-fatase alcalina para evitar indesejável ligação, e ligação enzimática. Em umaoutra realização, o gene de fusão pode ser sintetizado através de técnicaspadrões incluindo sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente,amplificação com PCR de fragmentos de genes pode ser realizada usandoiniciadores âncoras que originam projeções complementares entre doisfragmentos de gene consecutivos que subseqüentemente podem ser anela-dos e reamplificados para geração de uma seqüência de gene quimérico(ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel etal., John Wiley & Sons: 1992). Além disso, muitos vetores de expressão sãocomercialmente disponíveis que já codificam uma metade de fusão (por e-xemplo, um polipeptídeo GST ou um rótulo epítopo HÁ). Um ácido nucléicocodificando KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) pode ser clonado em um tal vetor deexpressão de modo que a metade de fusão é ligada em estrutura a proteínaKCNQ5 ou KCNQ5(W270L).

Em uma outra realização, a proteína de fusão é uma proteínaKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) contendo uma seqüência sinal heteróloga emseu terminus-N. Em certas células hospedeiras (por exemplo, células hos-pedeiras mamíferas), expressão e/ou secreção de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) pode ser aumentada através do uso de uma seqüência si-nal heteróloga. As proteínas de fusão KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) podemser incorporadas em composições farmacêuticas e administradas a um sujei-to in vivo. Uso de proteínas de fusão KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) pode serterapeuticamente útil para o tratamento de distúrbios, por exemplo, condi-ções relacionadas a incontinência urinária ou dor neuropática. Além disso,as proteínas de fusão KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) podem ser usadas comoimunógenos para produção de anticorpos anti-KCNQ5 ou anti-KCNQ5(W270L) em um sujeito.

Como aqui providos são canais de potássio funcionais onde pelomenos uma das subunidades do canal funcional é uma proteína ou polipep-tídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) como aqui descrito. Canais KCNQ sãoconhecidos formarem homodímeros, heterodímeros, homotetrâmeros, e he-terotetrâmeros. Por exemplo, uma proteína KCNQ5(W270L) pode formar umhomodímero com si própria, um heterodímero com uma proteína KCNQ5 deoutras espécies, um heterodímero com uma variante de proteínaKCNQ5(W270L), um heterodímero com KCNQ3, um homotetrâmero com 3subunidades KCNQ5(W270L) idênticas, um heterotetrâmero com pelo me-nos uma subunidade KCNQ5 diferente, ou um heterotetrâmero com elo me-nos uma proteína KCNQ diferente, por exemplo, KCNQ3.

Um outro aspecto pertence a variantes das proteínas KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) que funcionam tanto como agonistas (miméticos) deKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) ou como antagonistas de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L). Variantes das proteínas KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) po-dem ser geradas por mutagênese, por exemplo, mutação ou truncação deponto discreta de uma proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Um agonistadas proteínas KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) pode reter substancialmente asmesmas, ou um subconjunto das, atividades biológicas da forma ocorrendonaturalmente de uma proteína KCNQ5. Um antagonista de uma proteínaKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) pode inibir uma ou mais das atividades do formaocorrendo naturalmente da proteína KCNQ5 através de, por exemplo, modu-lação competitiva de uma atividade celular de uma proteína KCNQ5 tipo sel-vagem. Assim, específicos efeitos biológicos podem ser elicitados através detratamento com uma variante de função limitada. Em uma realização, trata-mento de um sujeito com uma variante tendo um subconjunto das atividadesbiológicas da forma ocorrendo naturalmente da proteína tem menos efeitoscolaterais em um sujeito em relação a tratamento com a forma ocorrendonaturalmente da proteína KCNQ5.

Uma realização pertence a derivados de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L)que podem ser formados através de modificação de pelo menos um resíduode aminoácido de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) por oxidação, redução, ououtros processos de derivação conhecidos na técnica.

Em uma realização, variantes de uma proteína KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) que funcionam como agonistas (miméticos) de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) ou como antagonistas de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) po-dem ser identificadas através de seleção de bibliotecas combinatoriais demutantes, por exemplo, mutantes de truncação, de uma proteína KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) ou para atividade agonista ou antagonista de proteínaKCNQ5 ou KCNQ5(W270L). O polipeptídeo KCNQ5 pode conter um domíniotransmembrana S5-S6 de KCNQ1. Alternativamente, o polipeptídeo KCNQ5pode conter um domínio transmembrana S5 de KCNQ1. Em uma realização,uma variada biblioteca de variantes KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) é geradaatravés de mutagênese combinatorial no nível de ácido nucléico e é codifi-cada por uma variada biblioteca de genes. Uma variada biblioteca de varian-tes de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) pode ser produzida através de, por e-xemplo, ligação enzimática de uma mistura de oligonucleotídeos sintéticosem seqüências de genes de modo que um conjunto degenerado de potenci-ais seqüências KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) seja expressável como polipep-tídeos individuais, ou alternativamente, como um conjunto de maiores prote-ínas de fusão (por exemplo, para mostra de fago) contendo ali o conjunto deseqüências de KCNQ5 o KCNQ5(W270L).

Existe uma variedade de processo que podem ser usados para aprodução de bibliotecas de potenciais variantes KCNQ5 ou KCNQ5(W270L)a partir de uma seqüência de oligonucleotídeos degenerada. Síntese quími-ca de uma seqüência de gene degenerada pode ser realizada em um sinteti-zador de ADN automatizado, e o gene sintético então ligado em um apropri-ado vetor de expressão. Uso de um conjunto degenerado de genes permiteprovisão, em uma mistura, de todas as seqüências codificando o desejadoconjunto de potenciais seqüências KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Processospara síntese de oligonucleotídeos degenerados são conhecidos na técnica(ver, por exemplo, Narang AS, Tetrahedron 39:3-22 (1983); Itakura K et al.,Annu. Ver. Biochem. 53:323-56 (1984); Itakura K et al., Science 198:1056-63(1977); IkeYet al., Nucleic Acids Res. 11:477-88 (1983)).

Em adição, bibliotecas de fragmentos de uma seqüência codifi-cando proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) podem ser usados para geraçãode uma variada população de fragmentos de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L)para separação e subseqüente seleção de variantes uma proteína KCNQ5ou KCNQ5(W270L). Em uma realização, uma biblioteca de fragmentos deseqüências codificantes pode ser gerada através de tratamento de um frag-mento de PCR de fita dupla de uma seqüência codificando KCMQ5 ouKCNQ5(W270L) com uma nuclease sob condições onde ocorra entalhe so-mente cerca de uma vez por molécula, desnaturação de ADN de fita dupla,renaturação de ADN para formar ADN de fita dupla que pode incluir paressentido / anti-sentido de diferentes produtos entalhados, remoção de por-ções de fita simples de duplexes reformados através de tratamento com Slnuclease, e ligação de resultante biblioteca de fragmentos em um vetor deexpressão. Através deste processo, uma biblioteca de expressão pode serderivada que codifica fragmentos internos e terminais-C e terminais-N devários tamanhos da proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L).

Várias técnicas são conhecidas para separação de produtos ge-nes de bibliotecas combinatoriais feita por mutações de ponto ou truncação,e para separação de bibliotecas de ADNc para produtos gene tendo umapropriedade selecionada. Tais técnicas são adaptáveis para rápida separa-ção das bibliotecas de genes através de mutagênese combinatorial de prote-ínas KCNQ5 ouKCNQ5(W270L). As técnicas mais amplamente usadas, quesão suscetíveis a análises de alta produtividade, para separação de grandesbibliotecas de genes tipicamente incluem clonagem de biblioteca de genesem vetores de expressão replicáveis, transformação de células apropriadascom a resultante biblioteca de vetores, e expressão de genes combinatoriaissob condições nas quais detecção de uma desejada atividade facilita isola-mento do vetor codificando o gene cujo produto foi detectado. Mutagênesede montagem recursiva (REM), uma técnica que aperfeiçoa a freqüência demutantes funcionais nas bibliotecas, pode ser usada em combinação com osensaios de separação para identificação de variantes de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) (Arkin AP and Youvan DC, Proc. Natl. Acad. Sei. USA89:781 i-15 (1992); Delgrave S et al., Protein Eng. 6:327-31 (1993)).

Em uma realização, ensayos baseados em célula podem ser explora-dos para analisar uma variedade de bibliotecas de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L). Por exemplo, uma biblioteca de vetores de expressão podeser transfectada em uma linha de células que sintetizam KCNQ5(W270L). Ascélulas transfectadas são então cultivadas de modo que KCNQ5(W270L) eum particular mutante KCNQ5(W270L) são sintetizados e o efeito de expres-são do mutante sobre atividade de KCNQ5(W270L) em sobrenadantes decélulas pode ser detectado, por exemplo, através de qualquer um de umnúmero de ensaios enzimáticos. ADN plasmídeo então pode ser recuperadodas células cujo escore para inibição, ou alternativamente, potencializaçãode atividade de KCNQ5(W270L), e os clones individuais ainda caracteriza-dos.

Em adição a polipeptídeos KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) consistindosomente em aminoácidos ocorrendo naturalmente, peptidomiméticos deKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) também são providos. Análogos de peptídeossão comumente usados na indústria farmacêutica como drogas não-peptídeo com propriedades análogas àquelas do peptídeo molde. Estes ti-pos de compostos não-peptídeos são chamados "miméticos de peptídeo" ou"peptidomiméticos"" (Fauchere J, Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber DFand Freidinger RM, Trends Neurosci. 8:392-96 (1985); Evans BE et al., J.Med. Chem 30:1229-39 (1987)) e são usualmente desenvolvidos com o au-xílio de modelagem molecular computadorizada. Miméticos de peptídeosque são estruturalmente similares a peptídeos terapeuticamente úteis podemser usados para produção de um efeito terapêutico ou profilático equivalente.Genericamente, peptidomiméticos são estruturalmente similares a um poli-peptídeo paradigma (isto é, um polipeptídeo que tem uma atividade biológicaou farmacológica), tal ocmo KCNQ5(W270L), mas têm uma ou mais ligaçõespeptídeo opcionalmente substituídas com uma ligação selecionada do grupoconsistindo em: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (eis e trans), --COCH2-, -CH(OH)CH2", e -CH2SO-, através de processos conhecidosna técnica e ainda descritos nas seguintes referências: : Spatola AF in"Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins," B.Weinstein, ed., Mareei Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, AF, VegaData (March 1983), Vol. 1, Issue 3, "Peptide Backbone Modifications" (gene-ral review); Morley JS, Trends Pharmcol. Sei. 1:463-68 (1980) (general revi-ew); Hudson D et al., Int. J. Pept. Prot. Res. 14:177-85 (1979) (-CH2NH-,CH2CH2-); Spatola AF et al., Life Sei. 38:1243-49 (1986) (-CH2--S); HannMM1 J. Chem. Soe. Perkin Trans. 1, 307-314 (1982) (--CH--CH--, eis andtrans); Almquist RG et ai, J. Med. Chem. 23:1392-98 (1980) (--COCH2--);Jennings-White C et ai, Tetrahedron Lett. 23:2533-34 (1982) (--COCH2--);EP O 045 665 (-CH(OH)CH2-); Holladay MW et ai, Tetrahedron Lett.,24:4401-04 (1983) (-C(OH)CH2-); Hruby VJ, Life Sei. 31:189-99 (1982) (--CH2-S--). Uma ligação não-peptídeo particularmente preferida é -CH2NH-.

Tais miméticos de peptídeos podem ter excelentes vantagens sobre realiza-ções de polipeptídeos, incluindo, por exemplo: produção mais econômica,maior estabilidade química, aperfeiçoadas propriedades farmacológicas(meia - vida, absorção, potência, eficácia, etc.), especificidade alterada (porexemplo, um amplo espectro de atividades biológicas), reduzida antigenici-dade, e outras. Marcação de peptidomiméticos usualmente envolve ligaçãocovalente de uma ou mais etiquetas, diretamente ou através de um espaça-dor (por exemplo, um grupo amida), para posição(ões) não-interferente so-bre o peptidomimético que são previstas por dados de quantitativos de estru-tura - atividade e/ou modelagem molecular. Tais posições não-interferentesgenericamente são posições que não formam contatos diretos com as ma·cromoléculas às quais o peptidomimético se liga para produzir o efeito tera-pêutico. Derivação (por exemplo, marcação) de peptidomiméticos não deveinterferir substancialmente com a desejada atividade biológica ou farmacoló-gica do peptidomimético.

Substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de umaseqüência de aminoácidos KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) com um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-Iisina no lugar de L-lisina) podeser usada para gerar peptídeos mais estáveis. Em adição, peptídeos restrin-gidos compreendendo uma seqüência de aminoácidos KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) ou uma variação de seqüência substancialmente idênticapode ser gerada através de processos conhecidos na técnica (Rizo J andGierasch LM, Ann. Ver. Biochem. 61:387-416 (1992)); por exemplo, atravésde adição de resíduos cisteína internos capazes de formarem pontes dissul-feto intramoleculares que ciclizam o peptídeo.

As seqüências de aminoácidos de polipeptídeos KCNQ5 ouKCNQ(W270L) aqui identificadas permitirão aqueles versados na técnicaproduzirem polipéptídeos correspondendo a seqüências de peptídeos deKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) e suas variantes de seqüências. Tais polipeptí-deos podem ser produzidos em células procarióticas ou eucarióticas atravésde expressão de polinucleotídeos codificando uma seqüência de peptídeosKCNQ(W270L), freqüentemente como parte de um polipeptídeo maior. Al-ternativamente, tais peptídeos podem ser sintetizados através de processosquímicos. Processos para expressão de proteínas heterólogas em hospedei-ros recombinantes, síntese química de polipeptídeos, e tradução in vitro sãobem conhecidos na técnica e são ainda descritos em Sambrook J et al., su-pra; Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Mo-lecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.;Gutte B and Merrifield RB, J. Am. Chem. Soe. 91:501-02 (1969); Chaiken IM,CRC Crit. Rev. Biochem. 11:255-301 (1981); Kaiser ET et al., Science243:187-92 (1989); Merrifield B, Science, 232:341-47 (1986); Kent SBH1Ann. Rev. Biochem. 57:957-89 (1988); Offord, R. E. (1980) semisyntheticProteins, Wiley Publishing.

Peptídeos tipicamente podem ser produzidos através de síntesequímica direta. Peptídeos podem ser produzidos como peptídeos modifica-dos, com metades não-peptídeo ligadas por ligação covalente ao terminus-Ne/ou terminus-C. Em certas realizações preferidas, tanto o terminus-carboxicomo o terminus-amino, ou ambos, são quimicamente modificados. As modi-ficações mais comuns dos grupos terminais amino e carboxila são acetilaçãoe amidação, respectivamente. Modificações de terminal amino como acila-ção (por exemplo, acetilação) ou alquilação (por exemplo, metilação) e modi-ficações terminais carboxi como amidação, assim como outras modificaçõesterminais, incluindo ciclização, podem ser incorporadas em várias realiza-ções. Certas modificações terminais amino e/ou terminais carboxi e/ou ex-tensões de peptídeos para a seqüência núcleo podem prover vantajosaspropriedades físicas, químicas, bioquímicas e farmacológicas, tais como:aperfeiçoada estabilidade, aumentada potência e/ou eficácia, resistência aproteases de soro, desejáveis propriedades fármaco - cinéticas, e outras.Peptídeos podem ser usados terapeuticamente para tratamento de doenças.

Uma proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), ou uma sua porçãoou fragmento, também pode ser usada como um imunógeno para gerar anti-corpos que se ligam a KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) usando técnicas padrõespara preparação de anticorpo policlonal e monoclonal. Uma proteína KCNQ5ou KCNQ5(W270L) de inteiro comprimento pode ser usada ou, alternativa-mente, um outro aspecto provê fragmentos de peptídeos antigênicos deKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) para uso como imunogênios. Um peptídeo anti-gênico de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) compreende pelo menos 8 resíduosde aminoácidos e abrange um epítopo de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) demodo que um anticorpo elevado contra o peptídeo forma um específicocomplexo imuno com KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Preferivelmente, o peptí-deo antigênico compreende pelo menos 10 resíduos de aminoácidos, maispreferivelmente pelo menos 15 resíduos de aminoácidos, mesmo mais prefe-rivelmente pelo menos 20 resíduos de aminoácidos, e mais preferivelmentepelo menos 30 resíduos de aminoácidos. Em uma realização, o peptídeoantigênico inclui aminoácido 270 de SEQ ID NO: 2.

Epítopos preferidos abrangidos pelo peptídeo antigênico sãoregiões de um polipeptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) que estão Iocaliza-das sobre a superfície da proteína, por exemplo, regiões hidrofílicas, e quesão únicas para um polipeptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Em uma reali-zação, tais epítopos podem ser específicos para proteínas KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) de uma espécie, tal como humana (isto é, um peptídeo an-tigênico que atravessa uma região de um polipeptídeo KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) que não é conservada através de espécies é usado comoimunógeno; tais resíduos não-conservados podem ser determinados usandoum alinhamento tal como aquele aqui provido). Uma análise de hidrofobici-dade padrão da proteína pode ser realizada para identificar regiões hidrofíli-cas.

Um imunogeno KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) tipicamente é usadopara preparar anticorpos através de imunização de um sujeito apropriado(por exemplo, coelho, cabra, camundongo, ou outro mamífero) com o imu-nógeno. Uma apropriada preparação imunogênica pode conter, por exemplo,uma proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) expressa recombinantemente ouum peptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) sintetizado quimicamente. A prepa-ração ainda pode incluir um adjuvante, tal como adjuvante completo ou in-completo de Freund, ou agente imuno estimulador similar. Imunização de umsujeito apropriado com uma preparação KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) imuno-gênica induz uma resposta de anticorpo anti-KCN5 ou anti-KCNQ5(W270L)policlonal.

Da mesma maneira, um outro aspecto pertence ao uso de anti-corpos anti-KCNQ5 ou anti-KCNQ5(W270L). Anticorpos anti-KCNQ5 ou anti-KCNQ5(W270L) policlonais podem ser preparados como descrito acima a-través de imunização de um sujeito apropriado com um imunógeno KCNQ5ou KCNQ5(W270L). O título de anticorpo anti-KCNQ5 ou anti-KCNQ5(W270L) no sujeito imunizado pode ser monitorado com o tempo a-través de técnicas padrões, como com um ensaio imuno - sorvente ligado aenzima (ELISA) usando polipeptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) imobiliza-do. Se desejado, as moléculas de anticorpos direcionadas contra um poli-peptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) podem ser isoladas a partir do mamífe-ro (por exemplo, a partir do sangue) e ainda purificadas através de técnicasbem conhecidas, como cromatografia de proteína A para obter a fração IgG.

Em um momento apropriado após imunização, por exemplo, quando os títu-los de anticorpos anti-KCNQ5 ou anti-KCNQ5(W270L) são mais altos, célu-las produzindo anticorpos podem ser obtidas a partir do sujeito e usadas pa-ra preparar anticorpos monoclonais através de técnicas padrões, como atécnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler G and MilsteinC, Na-ture 256:495-97 (1975) (ver também, Brown JP et al., J. Immunol. 127:539-46(1981); Brown JP et al., J. Biol. Chem. 255:4980-83 (1980); Yeh MY et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:2927-31 (1979); Yeh MY et al., Int. J. câncer29:269-75 (1982)), a técnica de hibridoma de célula B humana mais recente(Kozbor D and Roder JC, Immunol. Today 4:72-79 (1983)), a técnica hibri-doma - EBV (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy,Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96), ou técnicas trioma. A tecnologia para produçãode hibridomas de anticorpo monoclonal é bem conhecida (ver genericamenteKenneth RH, em Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological A-nalyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); Lerner EA, Yale J.Biol. Med., 54:387-402 (1981); Gefter ML et al., Somatic Cell Genet. 3:231-36 (1977)). Em resumo, uma linha de célula immortal (tipicamente um mie-loma) é fundida a linfócitos (tipicamente esplenócitos) a partir de um mamífe-ro imunizado com um imunógeno KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) como descritoacima, e os sobrenadantes de cultura das resultantes células hibridomas sãoseparados para identificação de um hibridoma produzindo um anticorpo mo-noclonal que se liga especificamente a um polipeptídeo KCNQ5 ouKCNQ5(W270L).

Qualquer um dos protocolos bem conhecidos usados para fusãode linfócitos e linhas de células imortalizadas pode ser aplicado para o pro-pósito de geração de um anticorpo monoclonal anti-KCNQ5 ou anti-KCNQ5(W270L) (ver, por exemplo, Galfre G et al., Nature 266:550-52(1977); Geifer ML et al., supra; Lerner EA, supra; Kenneth RH, supra). Alémdisso, aqueles versados na técnica apreciarão que existem muitas variaçõesde tais processos que também podem ser úteis. Tipicamente, a linha de cé-lula imortal (por exemplo, uma linha de célula mieloma) é derivada dasmesmas espécies mamíferas como os linfócitos. Por exemplo, hibridomasmurinos podem ser fabricados através de fusão de linfócitos de um camun-dongo imunizado com uma preparação imunogênica com uma linha de célu-la de camundongo imortalizada. Linhas de células imortais preferidassãolinhas de células de mieloma de camundongo que são sensíveis a meio decultura contendo hipoxantina, aminopterina, e timidina ("meio HAT"). Qual-quer uma de um número de linhas de células de mieloma pode ser usadacomo um parceiro de fusão de acordo com técnicas padrões, por exemplo,as linhas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653, ou p2/0-Ag 14. Es-tas linhas de mieloma são disponíveis de American Type Culture Collection(ATCC), Rockville, Md. Tipicamente, células mieloma de camundongo sensí-veis a HAT são fundidas a esplenócitos de camundongo usando polietilenoglicol ("PEG"). Células hibridoma resultantes da fusão são então seleciona-das usando meio HAT, que mata células de mieloma fundidas improdutiva-mente e não-fundidas (esplenócitos nãofundidos morrem após vários diasporque eles não são transformados). Células hibridoma produzindo um anti-corpo monoclonal são detectadas através de separação de sobrenadantesde cultura de hibridoma para anticorpos que ligam uma molécula KCNQ5 ouKCNQ5(W270L), por exemplo, usando um ensaio ELISA padrão.

Como uma alternativa para preparação de hibridomas secretan-do anticorpo monoclonal, um anticorpo anti-KCNQ5 ou anti-KCNQ5(W270L)monoclonal pode ser identificado e isolado através de separação de umabiblioteca de imunoglobulina combinatorial recombinante (por exemplo, umabiblioteca de mostra de fago anticorpo) com KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) pa-ra pelo que isolar membros de bibloteca de imunoglobulina que se ligam apolipeptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Kits para geração e seleção debibliotecas de mostra de fago são comercialmente disponíveis (por exemplo,o GE Healthcare Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01). Adicionalmente, exemplos de processos e reagentes particular-mente apropriados para uso em geração e seleção de biblioteca de mostrade anticorpo podem ser encontrados em, por exemplo, Patente U.S. No.5,223,409; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; Fuchs P et al., Bio-technology (N.Y.) 9:1370-72 (1991); Hay BN et al., Hum. Antibodies Hybri-domas 3:81-85 (1992); Huse WD et al., Science 246:1275-81 (1989); Griffi-ths AD et al., EMBO J. 12:725-34 (1993); Hawkins RE et al., J. Mol. Biol.226:889-96 (1992); Clarkson T et al., Nature 352:624-28 (1991); Gram H etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:3576-80 (1992); Garrard LJ et al., Biotech-nology (N.Y.) 9:1373-77 (1991); Hoogenboom HR et al., Nucleic Aeids Res.19:4133-37 (1991); Barbas CF et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:7978-82(1991); e MeCafferty J et ai, Nature 348:552-54 (1990).

Adicionalmente, anticorpos anti-KCNQ5 ou anti-KCNQ5(W270L)recombinantes, tais como anticorpos monoclonais quiméricos e humaniza-dos, compreendendo ambas porções humanas e não-humanas, que podemser fabricados usando técnicas de ADN recombinante padrão, estão dentrodo escopo da presente exposição. Tais anticorpos monoclonais humaniza-dos e quiméricos podem ser produzidos através de técnicas de ADN recom-binante conhecidas, por exemplo, usando processos descritos em WO87/02671; EP 0 184 187; EP 0 171 496; EP 0 173494; WO 86/01533; Paten-te U.S. No. 4,816,567; EP O 125 023; Better M et ai, Science 240:1041-43(1988); Liu AY et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3439-43 (1987); Liu AYet ai, J. Immunol. 139:3521-26 (1987); Sun LK et ai, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 84:214-18 (1987); Nishimura Y et ai, Câncer Res. 47:999-1005 (1987);Wood CR et al., Nature 314:446-49 (1985); Shaw DR et ai, J. Natl. CâncerInst. 80:1553-59 (1988); Morrison SL, Science 229:1202-07 (1985); U.S. Pa-tent No. 5,225,539; Verhocyan M et ai, Science 239:1534-36 (1988); e Bei-dlerCB et ai, J. Immunol. 141:4053-60(1988).

Em adição, anticorpos humanizados podem ser fabricados deacordo com protocolos padrões tais como aqueles mostrados na patenteU.S. 5 565 332. Em uma outra realização, cadeias de anticorpos ou mem-bros de pares de ligação específica podem ser produzidos através de re-combinação entre vetores compreendendo moléculas de ácido nucléico codi-ficando uma fusão de uma cadeia de polipeptídeo de um membro de par deligação específica e um componente de um pacote de mostra genética repli-cável e vetores contendo moléculas de ácido nucléico codificando uma se-gunda cadeia de polipeptídeos de um membro de para de ligação simplesusando técnicas conhecidas, por exemplo, como descrito nas patentes U.S.5 565 332; 5 871 907; ou 5 733 743.

Um anticorpo anti-KCNQ5 ou anti-KCNQ5(W270L) (por exemplo,anticorpo monoclonal) pode ser usado para isolar um polipeptídeo KCNQ5ou KCNQ5(W270L) através de técnicas padrões, tal como cromatografia deafinidade ou imunoprecipitação. O polipeptídeo KCNQ5 pode conter um do-mínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1. Alternativamente, o polipeptídeoKCNQ5 pode conter um domínio transmembrana S5 dê KCNQ1. Anticorposanti-KCNQ5 ou anti-KCNQ5(W270L) podem facilitar a purificação de polipep-tídeos KCNQ5 naturais de células e de polipeptídeos KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) produzidos recombinantemente expressos em células hos-pedeiras. Além disso, um anticorpo anti-KCNQ5 ou anti-KCNQ5(W270L) po-de ser usado para detectar uma proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) (porexemplo, em um Iisado celular ou sobrenadante de células). O polipeptídeoKCNQ5 pode conter um domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1. Altema-tivamente, o polipeptídeo KCNQ5 pode conter um domínio transmembranaS5 de KCNQ1. Detecção pode ser facilitada através de acoplamento (isto é,ligação física) de anticorpo a uma substância detectável. Da mesma manei-ra, em uma realização, um anticorpo anti-KCNQ5 ou anti-KCNQ5(W270L) émarcado com uma substância detectável. Exemplos de substâncias detectá-veis incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, ma-teriais luminescentes, e materiais radioativos. Exemplos de apropriadas en-zimas incluem peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, beta - galactosi-dase.ou acetil colinesterase; exemplos de apropriados complexos de grupoprotético incluem streptavidina / biotina e avidina / biotina; exemplos de a-propriados materiais fluorescentes incluem umbeliferona, fluoresceína, isoti-ocianato de fluoresceína, rodamina, dicloro triazinil amina fluoresceína, clo-reto de dansila, ou ficoeritrina; um exemplo de um material Iuminescente in-clui luminol; e exemplos de apropriado material radioativo incluem 125I, 131I135S1Ou3H.

Anticorpos anti-KCNQ5 ou anti-KCNQ5(W270L) também sãoobteníveis através de um processo compreendendo:

(a) imunização de um animal com um polipeptídeo KCNQ5 ou umasua porção imunogênica única para um polipeptídeo KCNQ5; e

(b) isolamento a partir do animal, de anticorpos que se ligam especi-ficamente a um polipeptídeo KCNQ5.

Preferivelmente, o polipeptídeo KCNQ5 é selecionado do grupoconsistindo em (i) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de ami-noácidos de um polipeptídeo KCNQ5(W270L); (ii) um polipeptídeo KCNQ5contendo um domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1; e (iii) um polipeptí-deo KCNQ5 contendo um domínio transmembrana S5 de KCNQ1. Mais pre-ferivelmente, o polipeptídeo imunogênico é SEQ ID NO: 2.

Da mesma maneira, em uma realização, anticorpos anti-KCNQ5ou anti-KCNQ5(W270L) podem ser usados, por exemplo, intracelularmentepara inibir atividade de proteína. O uso de anticorpos intracelulares para ini-bir função de proteína em uma célula é conhecido na técnica (ver, por e-xemplo, Carlson JR, Mol. Cell. Biol. 8:2638-46 (1988); Biocca S et ai, EMBOJ. 9:101-08 (1990); Werge TM et al., FEBS Lett. 274:193-98 (1990); CarlsonJR, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:7427-28 (1993); Marasco WA et al., Proc.Natl. Acad. Sei. USA 90:7889-93 (1993); Biocca S et al., Biotechnology(N.Y.) 12:396-99 (1994); Chen S-Y et al., Hum. Gene Ther. 5:595-601(1994); Duan L ei ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:5075-79 (1994); Chen S-Y et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:5932-36 (1994); Beerli RR et al., J.Biol. Chem. 269:23931-36 (1994); Beerli RR et ai, Biochem. Biophys. Res.Commun. 204:666-72 (1994); Mhashilkar AM et ai, EMBO J. 14:1542-51(1995); Richardson JH et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:3137-41 (1995);WO 94/02610; e WO 95/03832).

Em uma realização, um vetor de expressão recombinante é pre-parado o qual codifica as cadeias de anticorpos em uma forma tal que, comintrodução do vetor em uma célula, as cadeias de anticorpos são expressascomo um anticorpo funcional em um compartimento intracelular da célula.

Para inibição de atividade de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) de acordo com osprocessos inibidores aqui mostrados, um anticorpo intracelular que se ligaespecificamente a proteína KCQ5 ou KCNQ5(W270L) é expresso no cito-plasma da célula ou extracelularmente. Para preparar um vetor de expres-são de anticorpo intracelular, ADNc1S de cadeia leve e pesada de anticorpocodificando cadeias de anticorpos específicas para a proteína alvo de inte-resse, por exemplo, KCNQ5(W270L), são isolados, tipicamente de um hibri-doma que secreta um anticorpo monoclonal específico para a proteínaKCNQ5(W270L). Hibridomas secretando anticorpos monoclonais anti-KCNQ5(W270L), ou anticorpos monoclonais anti-KCNQ5(W270L) recombi-nantes, podem ser preparados como descrito acima. Uma vez um anticorpomonoclonal específico para proteína KCNQ5(W270L) tenha sido identificado(por exemplo, tanto um anticorpo monoclonal derivado de hibridoma comoum anticorpo recombinante de uma biblioteca combinatorial), ADNs codifi-cando as cadeias leve e pesada do anticorpo monoclonal são isolados atra-vés de técnicas padrões de biologia molecular. Para anticorpos derivados dehibridoma, ADNc1S de cadeia leve e pesada podem ser obtidos, por exemplo,através de amplificação PCR ou seleção de biblioteca de ADNc. Para anti-corpos recombinantes, tal como para uma biblioteca de mostra de fago,ADNc codificando as cadeias leve e pesada pode ser recuperado do pacotede mostra (por exemplo, fago)isolado durante o processo de seleção de bi-blioteca. Seqüências de nucleotídeos de genes de cadeia leve e pesada deanticorpo dos quais iniciadores de PCR ou sondas de biblioteca de ADNcpodem ser preparadas são conhecidas na técnica. Por exemplo, muitas taisseqüências são mostradas em Kabat EA et ai (1991) Sequences of Proteinsof Immunological lnterest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Hu-man Services, NIH Publication No. 91-3242 e na "Vbase" human germlinesequence database.

Uma vez obtidas, as seqüências de cadeias leve e pesada deanticorpo são clonadas em um vetor de expressão recombinante usandoprocessos padrões. Para permitir expressão citoplásmica das cadeias leve epesada, as seqüências de nucleotídeos codificando os líderes hidrofóbicosdas cadeias leve e pesada são removidas. Um vetor de expressão de anti-corpo intracelular pode codificar um anticorpo intracelular em uma de váriasdiferentes formas. Por exemplo, em uma realização o vetor codifica cadeiasleve e pesada de anticorpo de inteiro comprimento de modo que um anticor-po de inteiro comprimento é expresso intracelularmente. Em uma outra reali-zação, o vetor codifica uma cadeia leve de inteiro comprimento mas somentea região VH/CH1 da cadeia pesada de modo que um fragmento Fab é ex-presso intracelularmente. Na realização mais preferida, o vetor codifica umanticorpo de cadeia simples (scFv) onde as regiões variáveis das cadeiasleve e pesada estão ligadas por um Iigador peptídeo flexível (por exemplo,(GIy4Ser)3) e expresso como uma molécula de cadeia simples. Para inibiratividade de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) em uma célula, o vetor de expres-são codificando o anticorpo intracelular anti-KCNQ5 ou anti-KCNQ5(W270L)é introduzido na célula através de processos padrões de transfecção, comoaqui discutidos.

IV. Vetores de expressão Recombinantes e Células Hospedeiras

Um outro aspecto pertence a vetores, preferivelmente vetores deexpressão, contendo um ácido nucléico codificando uma proteína KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) (ou uma sua porção). O ácido nucléico pode codificar umpolipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembrana S5-S6 deKCNQ1. Alternativamente, o ácido nucléico pode codificar um polipeptídeoKCNQ5 contendo um domínio transmembrana S5 de KCNQ1. Os vetores deexpressão recombinantes compreendem um ácido nucléico em uma formaapropriada para expressão do ácido nucléico em uma célula hospedeira, oque significa que os vetores d expressão recombinantes incluem uma oumais seqüências reguladoras, selecionadas nas bases das células hospedei-ras usadas para expressão, que está operavelmente ligada à seqüência deácido nucléico a ser expressa. O termo "seqüência reguladora" é pretendidoincluir promotores, aperfeiçoadores, e outros elementos de controle de ex-pressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Tais seqüências regulado-ras são descritas em, por exemplo, Goeddel, Gene expression Technology:Methods in Enzimology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Se-qüências reguladoras incluem aquelas que direcionam expressão constituti-va de uma seqüência de nucleotídeos em muitos tipos de célula hospedeirae aquelas que direcionam expressão da seqüência de nucleotídeos somenteem certas células hospedeiras (por exemplo, seqüências reguladoras espe-cíficas de tecido). Será apreciado por aqueles versados na técnica que odesenho do vetor de expressão pode ser dependente de fatores tais como aescolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão deproteína desejado, e semelhantes. Os vetores de expressão podem ser in-troduzidos em células hospedeiras para pelo que produzirem proteínas oupeptídeos, incluindo proteínas ou peptídeos de fusão, codificados por ácidosnucléicos como aqui descrito (por exemplo, proteínas KCNQ5(W270L), for-mas mutantes de proteínas KCNQ5(W270L), proteínas de fusão, e seme-lhantes).

Os vetores de expressão recombinantes podem ser desenhadospara expressão de proteínas KCNQ5 ou KCNQ%(W270L) ou fragmentos deproteínas em células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, proteínasKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) podem ser expressa em células bacterianascomo células de inseto, E.coli (usando vetores de expressão baculovírus),células de levedura, células anfíbias, ou células mamíferas. Células hospe-deiras apropriadas são ainda discutidas em Goeddel, supra. Alternativamen-te, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vi-tro, por exemplo, usando seqüências reguladoras promotor T7 e T7 polime-rase.

Expressão de proteínas em procariotes é mais freqüentementerealizada em E.coli com vetores contendo promotores constitutivos ou indu-zíveis direcionando expressão de proteínas de fusão ou não-fusão. Vetoresde fusão adicionam um número de aminoácidos a um proteína ali codificada,usualmente ao terminus amino da proteína recombinante. Tais vetores defusão servem tipicamente para três propósitos: 1) para aumentar expressãode proteína recombinante, 2) aumentar a solubilidade da proteína recombi-nante, e 3) para auxiliar na purificação da proteína recombinante através deatuação como um Iigante em purificação por afinidade. Freqüentemente, emvetores de expressão de fusão, um sítio de clivcagem proteolítica é introdu-zido na junção da metade de fusão e a proteína recombinante para permitirseparação da proteína recombinante da metade de fusão subseqüente apurificação da proteína de fusão. Tais enzimas, e suas seqüências de reco-nhecimento cognatas* incluem Fator Xa, trombina, e enterocinase. ípicosvetores de expressão de fusão incluem, por exemplo, pGEX (Pharmacia Bio-tech lnc; Smith DB and Johnson KS, Gene 67:31-40 (1988)) e pMAL (NewEngland Biolabs, Beverly, Mass.) que fundem glutationa S-transferae (GST)ou proteína de ligação maltose E, respectivamente, à proteína recombinantealvo.

Proteínas de fusão purificadas podem ser utilizadas, por exem-pio, em ensaios de atividade KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) (por exmeplo, en-saios diretos ou ensaios competitivos descritos em detalhes abaixo), ou parageração de anticorpos específicos para proteína KCNQ5 ouKCNQ5(W270L).

Exemplos de apropriados vetores de expressão E.coli de não-fusão induzíveis incluem pTrc (amann E et al., Gene 69:301-15 (1988)) epET 11d (Studier et al., Gene expression Technology: Methods in Enzymo-Iogy 185, Academic Press, San Diego, calif. (1990) pp. 60-89). Expressão degene alvo a partir de vetyor pTrc baseia-se em transcrição de RNA polimera-se a partir de um promotor de fusão trp-lac híbrido. Expressão de gene alvoa partir de vetor pEt 11 d baseia-se em transcrição a partir de um promotorde fusão T7 gn10 - Iac mediada por uma ARN polimerase viral co-expressa(T7 gn1). Está polimerase viral é suprida por linhagens hospedei-ras.BL21(DE3) ou HMS174(DE3) a partir de um pró-fago residente abrigan-do um gene T7 gn1 sob o controle transcricional do promotor IacUV 5.

Uma estratégia para maximizar expressão de proteína recombi-nante em E. coli é expressar a proteína em bactérias hospedeiras com umacapacidade prejudicada para clivar proteoliticamente a proteína recombinan-te (Gottesman S, Gene Expression Technology: Methods in Enzimology 185,Academic Press, San Diego, Calif. (1990) pp. 119-28). Uma outra estratégiaé alterar a seqüência de ácido nucléico do ácido nucléico a ser inserido emum vetor de expressão de modo que os códons individuais para cada ami-noácido são aqueles preferencialmente utilizados em E. coli (Wada K et al.,Nucleic Acids Res. 20(Suppl.):2111-18 (1992)). Tal alteração de seqüênciasde ácidos nucléicos podem ser realizadas através de técnicas padrões desíntese de ADN.

Em uma outra realização, o vetor de expressão de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) é um vetor de expressão levedura. Exemplos de vetorespara expressão em levedura S. cerevisiae incluem pYepSed (Baldari C etal., EMBO J. 6:229-34 (1987)), pMFa (Kurjan J and Herskowitz I, Cell30:933-43 (1982)), pJRY88 (Schultz LD et al., Gene 54:113-23 (1987)),pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), e picZ (Invitrogen Corp,San Diego, Calif.).

Alternativamente, proteínas ou polipeptídeos KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) podem ser expressos em células de inseto usando vetoresde expressão baculovírus. Vetores de expressão baculovírus disponíveispara expressão de proteínas em células de inseto cultivadas (por exemplo,células Sf 9) incluem as séries pAc (Smith GE et al., Mol. Cell. Biol. 3:2156-65 (1983)) e as séries (Lucklow VA and Summers MD, Virology 170:31-39(1989)).

Ainda em uma realização, um ácido nucléico é expresso em cé-lulas mamíferas usando um vetor de expressão mamífero. Exemplos de ve-tores de expressão mamíferos incluem pCDMB (Seed B, Nature 329:840-41(1987)) e pMT2PC (Kaufman RJ et al., EMBO J. 6:187-95 (1987)). Quandousados em células mamíferas, as funções controles de vetor de expressãosão freqüentemente providas por elementos reguladores virais. Por exemplo,promotores comumente usados são derivados de polioma, Adenovírus 2,citomegalovírus e Vírus Símio 40. Para outros sistemas de expressão apro-priados para ambas células procarióticas e eucarióticas, ver capítulos 16 e17 de Sambrook1 J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A La-boratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Har-bor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

Em uma outra realização, o vetor de expressão mamífero re-combinante é capaz de direcionar expressão do ácido nucléico preferencial-mente em um particular tipo de célula (por exemplo, elementos reguladoresespecíficos de tecido são usados para expressarem o ácido nucléico). Ele-mentos reguladores específicos de tecido são conhecidos na técnica. Exem-plos não-limitantes de apropriados promotores específicos de tecido incluemo promotor de albumina (específico de fígado; Pinkert CA et al., Genes Dev.1:268-77 (1987)), promotores específicos de linfóide (Calame K e Eaton S,Adv. Immunol. 43:235-75 (1988)), em particulares promotores de receptoresde célula T (Winoto A and Baltimore D, EMBO J. 8:729-33 (1989)) e imuno-globulinas (Banerji J et al., Cell 33:729-40 (1983); Queen C and Baltimore D,Cell 33:741-48 (1983)), promotores específicos de neurônios (por exmeplo, opromotor de neurofilamento; Byrne GW e Ruddle FH, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 86:5473-77 (1989)), promotores específicos de pancreas (Edlund T etal., Science 230:912-16 (1985)), e promotores específicos de glândula ma-mária (por exemplo, promotor de soro de leite coalhado; patente U.S. 4 873316 e EP 0 264 166). Promotores regulados desenvolvimentalmente tambémsão abrangidos, por exemplo, os promotores hox murinos (Kessel M andGruss P. Science 249:374-79 (1990)) e o promotor alfa-feto proteína (Cam-per AS e Tilghman SM, Genes Dev. 3:537-46 (1989)).

Além disso, sistemas reguladores induzíveis para uso em célulasmamíferas são conhecidos na técnica, por exemplo, sistemas nos quais ex-pressão de gene é regulada por íons de metais pesados (ver, por exemplo,Mayo KE et ai, Cell 29:99-108 (1982); Brinster RL et al., Nature 296:39-42(1982); Searle PF et ai, Mol. Cell. Biol. 5:1480-89 (1985)), heat shock (ver,por exemplo, Nouer L et al. (1991) in Heat Shock Response, ed. Nouer L,CRC, Boca Raton, Fla., pp. 167-220), hormones (ver, por exemplo, Lee F etal., Nature 294:228-32 (1981); Hynes NE et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA78:2038-42 (1981); Klock G et ai, Nature 329:734-36 (1987); Israel Dl andKaufman RJ, Nucleic Acids Res. 17:2589-2604 (1989); WO 93/23431),FK506-related molecules (see e.g., WO 94/18317) ou tetraciclinas (GossenM and Bujard H, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5547-51 (1992); Gossen M etai, Science 268:1766-69 (1995); WO 94/29442; WO 96/01313). Da mesmamaneira, uma outra realização provê um vetor de expressão recombinanteno qual um ADN KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) está operavelmente ligado aum promotor eucariótico induzível, pelo que permitindo expressão induzívelde uma proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) em células eucarióticas.

Também são conhecidos na técnica processos para expressãode proteínas endógenas usando recombinação homóloga de um braço (ver,por exemplo, pedido de patente U.S. publicado 2005/0003367; Zeh et al.,Assay Drug Dev. Technol. 1:755-65 (2003); Qureshi et al., Assay Drug Dev.Technol. 1:767-76 (2003)). Em resumo, uma construção genômica isoladacompreendendo um promotor ligado operavelmente a uma seqüência alve-jando KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) é introduzida em uma população homo-gênea de células (tais como, por exemplo, uma população homogênea deuma linha de células humanas ou uma população homogênea de células deovário de hamster Chinês (CHO)). O promotor é heterólogo para o gene alvoKCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Seguindo recombinação, o promotor controlatranscrição de um ARNm que codifica um polipeptídeo KCNQ5 ouKCNQ5(W270L). A população de células é então incubada sob condiçõesque causam expressão do polipeptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L).

Ainda um aspecto provê um vetor de expressão recombinantecompreendendo uma molécula de ADN clonada no vetor de expressão emuma orientação anti - sentido. Ou seja, a molécula de ADN está operavel-mente ligada a uma seqüência reguladora em uma maneira que permite ex-pressão (através de transcrição da molécula de ADN) de uma molécula deARN que é anti - sentido para ARNm KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Seqüên-cias reguladoras operavelmente ligadas a um ácido nucléico clonado na ori-entação anti - sentido podem ser escolhidas as quais direcionam a expres-são contínua da molécula de ARN anti - sentido em uma variedade de tiposde células, por exemplo, promotores e/ou aperfeiçoadores virais, ou seqüên-cias reguladoras podem ser escolhidas que direcionam expressão constituti-va direta, específica de tecido ou específica de tipo de célula de ARN anti -sentido. O vetor de expressão anti - sentido pode estar na forma de umplasmídeo recombinante, fagemídeo, ou vírus atenuado no qual ácidos nu-cléicos anti - sentido são produzidos sob o controle de uma região regulado-ra de alta eficiência, a atividade da qual pode ser determinada através dotipo de célula na qual o vetor é introduzido. Para uma discusão da regulaçãode expressão de gene usando genes anti - sentido, ver Weintraub H et al.,Trends Genet. 1:22-25 (1985).

Um outro aspecto pertence a células hospedeiras nas quais umvetor de expressão recombinante foii introduzido. Por exemplo, uma proteínaKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) pode ser expressa em células bacterianas (co-mo, por exmeplo, E.coli), células de insetos, células de leveduras, célulasanfíbias (como, por exemplo, oócitos de Xenopus laevis), ou células mamífe-ras (como, por eemplo, células CHO ou células COS). Outras células hospe-deiras apropriadas são conhecidas por aqueles versados na técnica.

ADN vetor pode ser introduzido em células procarióticas ou eu-carióticas via técnicas de transformação ou transfecção padrões. Como aquiusados, os termos "transformação" e "transfecção" são pretendidos referi-rem-se a uma variedade de técnicas reconhecidas para introdução de ácidonucléico estranho (por exemplo, ADN) em uma célula hospedeira, incluindo,por exemplo, co-precipitação com cloreto de cálcio ou fosfato de cálcio,transfecção mediada por DEAE-dextrano, lipofecção, ou eletroporação. Pro-cessos apropriados para transformação ou transfecção de células hospedei-ras podem ser encontrados em Sambrook J et al. (supra), e outros manuaisde laboratório.

Para transfecção estável de células mamíferas, é conhecidoque, dependendo de vetor de expressão e técnica de transfecção usada,somente uma pequena fração de células pode integrar o ADN estranho emseu genoma. De modo a identificar e selecionar estes integrantes, um geneque codifica um marcador selecionável (por exemplo, resistência a antibióti-cos) é genericamente introduzido nas células hospedeiras junto com o genede interesse. Marcadores selecionáveis preferidos incluem aqueles que con-ferem resistência a drogas, tais como G418, higromicina, e metotrexato. Áci-do nucléico codificando um marcador selecionável pode ser introduzido emuma célula hospedeir a no mesmo vetor como aquele codificando prote-ína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) ou pode ser introduzido em um vetor sepa-rado. Células estavelmente transfectadas com o ácido nucléico introduzidopodem ser identificadas por seleção de droga (por exemplo, células que in-corporaram o gene marcador selecionável sobreviverão, enquanto as outrascélulas morrem).

No caso de E.coli que são estavelmente transfectadas comKCNQ5 ou KCNQ5(W270L), tais linhas podem ser obtidas de modo que ogene KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) seja induzível. Por exemplo, a regulaçãodo gene expresso pode ser efetuada através de expressão estável duplaprimeiro de um plasmídeo "regulador", que contem o transativador controla-do - tet (tTA) e um segundo plasmídeo "resposta", que contem KCNQ5 ouKCNQ5(W270L), sob o controle de uma seqüência promotora que inclui oelemento de resposta de tetraciclina (TER). Os plasmídeos reguladores co-mercialmente disponíveis estão em vetores engenheirados para seleção deneomicina, neessitando que vetores resposta sejam construídos para incluí-rem um segundo marcador selecionável. Usando tais processos, expressãode KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) pode ser desligada na presença de um agen-te, por exemplo, tetraciclina, ou um composto relacionado com tetraçiclina(por exemplo, doxiciclina) e ligada quando o agente, por exemplo, tetracicli-na, não é adicionado ao meio de cultura. Construção deste tipo de linha decélulas permite a expressão estável de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) em célu-las nas quais ele é normalmente tóxico.

Uma célula hospedeira, tal como uma célula hospedeira procari-ótica ou eucariótica, pode ser usada para produzir (isto é, expressar) umaproteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Da mesma maneira, ainda um aspectoprovê processos para produção de uma proteína KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) usando as células hospedeiras. Em uma realização, o pro-cesso compreende cultura de célula hospedeira (na qual um vetor de ex-pressão recombinante codificando uma proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L)foi introduzido) em um meio apropriado de modo que uma proteína KCNQ5ou KCNQ5(W270L) seja produzida. Em uma outra realização, o processoainda compreende isolamento de uma proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L)a partir do meio ou célula hospedeira.

Certas células hospedeiras também podem ser usadas paraprodução de animais transgênicos não-humanos. Por exemplo, em uma rea-lização, a célula hospedeira é um oócito fertilizado ou uma célula tronco em-briônica na qual seqüências codificando KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) foramintroduzidas. Tais células hospedeiras então podem ser usadas para criaçãode animais transgênicos não-humanos nos quais seqüências de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) exógenas foram introduzidas em seus genomas ou animaisrecombinantes homólogos nos quais seqüências de KCNQ5 endógenas fo-ram alteradas. Tais animais são úteis para estudo de função e/ou atividadede um polipeptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) e para identificação e/ouavaliação de moduladores de atividade de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Co-mo aqui usado, um "animal transgêmico" é um animal não-humano, preferi-velmente um mamífero, mais preferivelmente um roedor tal como um rato oucamundongo, no qual uma ou mais das células do animal inclui um transge-ne. Outros exemplos de animais transgênicos incluem primatas não-humanos, ovelha, cães, vacas, cabras, galinhas, anfíbios, e semelhantes.Um transgene é ADN exógeno que é integrado no genoma de uma célula apartir da qual um animal transgênico se desenvolve e que permanece nogenoma do animal maduro, pelo que dirigindo a expressão de um produtogene codificado em um ou mais tipos de células ou tecidos no animal trans-gênico. Como aqui usado, um "animal recombinante homólogo" é um animalnão-humano, preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um ca-mundongo, no qual um gene KCNQ5 endógeno foi alterado através de re-combinação homóloga entre o gene endógeno e uma molécula de ADN exó-gena introduzida em uma célula do animal, por exemplo, uma célula embriô-nico do animal, antes de desenvolvimento do animal.

Um animal transgênico pode ser criado através de introdução deum ácido nucléico codificando KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) no pró-núcleomacho de um oócito fertilizado, por exemplo, através de microinjeção ou in-fecção retroviral, e permitindo que o oócito se desenvolva em um animal a-dotado fêmea pseudo-grávida. A seqüência de KCNQ5(W270L) de SEQ IDNO: 1 ou uma sua porção pode ser introduzida como um transgene no ge-noma de um animal não-humano. Alternativamente, um homólogo de geneKCNQ5(W270L), tal como um outro membro de família KCNQ, pode ser iso-lado baseado na hibridização das seqüências de ADNc de famíliaKCNQ5(W270L) de SEQ ID NO: 1 (descrita acima) e usado como um trans-gene.

Seqüências intrônicas e sinais de poliadenilação também podemser incluídos no transgene para aumentar a eficiência de expressão dotransgene. Uma seqüência reguladora específica de tecido pode ser opera-velmente ligada a um transgene KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) para direcionara expressão de uma proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) para células parti-culares. Processos para geração de animais transgênicos via manipulação eembrião e microinjeção, particularmente animais tais como camundongos,tornaram-se padrões na técnica e são descritos, por exemplo, em patentesU.S. 4,736,866; 4,870,009; 4,873,191; and in Hogan B, Manipulating theMouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y., 1986). Processos similares são usados para produção de outros ani-mais transgênicos. Um animal fundador transgênico pode ser identificadobaseado na presença de um transgene KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) em seugenoma e/ou expressão de ARNm KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) em tecidosou células dos animais. Um animal fundador transgênico então pode ser u-sado para reproduzir animais adicionais transportando o transgene. Alémdisso, animais transgênicos carreando um transgene codificando uma prote-ína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) podem ser ainda reproduzidos para outrosanimais transgênicos transportando outros oncogenes.

Para criar um animal recombinante homólogo, um vetor é prepa-rado o qual contem pelo menos uma porção de um gene KCNQ5 no qualuma supressão, adição, ou substituição foi introduzida para através do quealterar, por exemplo, interromper funcionalmente, o gene KCNQ5. Em umarealização preferida, o vetor é desenhado de modo que, com recombinaçãohomóloga, o gene KCNQ5 endógeno é funcionalmente interrompido (istonão codifica mais uma proteína funcional; também referido como um vetor"nocaute"). Alternativamente, o vetor pode ser desenhado de modo que, comrecombinação homóloga, o gene KCNQ5 endógeno sofre mutação ou deoutro modo alterado mas ainda codifica uma proteína funcional (por exem-plo, nucleotídeos 808-810 de SEQ ID NO: 1 podem ser alterados para peloque alterar o aminoácido 270 da proteína KCNQ5 endógena). Em um vetorde recombinação homólogo , a porção alterada do gene KCNQ5 é flanquea-da por suas extremidades 5' e 3' através de adicional seqüência de ácidonucléico do gene KCNQ5 para permitir ocorrência de recombinação homólo-ga entre o gene KCNQ5 exógeno carreado pelo vetor e um gene KCNQ5endógeno em uma célula tronco embriônica. A seqüência de ácido nucléicoKCNQ5 flanqueante adicional é de comprimento suficiente para recombina-ção homóloga bem sucedida com o gene endógeno. Tipicamente, váriosquilobases de ADN flanqueante (em ambas extremidades 5' e 3') são incluí-das no vetor (ver, por exemplo, Thomas KR and capecchi MR, Cell 51:503-12 (1987) para uma descrição de vetores de recombinação homóloga). Ovetor é introduzido em uma linha de célula tronco embriônica (por exemplo,através de eletroporação) e células nas quais o gene KCNQ5 introduzidorecombinou homologamente com o gene KCNQ5 endógeno são seleciona-das (ver, por exemplo, Li E et ai., Cell 69:915-26 (1992)). As células selecio-nadas são então injetadas em um blastocisto de um animal (por exemplo,um camundongo) para formação de quimeras de agregação (ver, por exem-plo, Bradley A, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Ap-proach, Robertson EJ, ed. (IRL, Oxford, 1987) pp. 113-152). Um embriãoquimérico então pode ser implantado em um animal adotado fêmea pseudo-grávida apropriado, e o embrião levado a termo. Progênie abrigando o ADNrecombinado homologamente em suas células germes pode ser usada parareproduzir animais nos quais todas as células do animal contêm o ADN re-combinado homologamente através de transmissão de linha germe dotransgene. Processos para construção de vetores de recombinação homólo-ga e animais recombinantes homólogos são ainda descritos em, por exem-plo, Bradley A, Curr. Opin. Biotechnol. 2:823-29 (1991); WO 90/11354; WO91/01140; e WO 93/04169.

Em adição ao anterior, aqueles versados na técnica apreciarãoque outras abordagens conhecidas na técnica para recombinação homólogapodem ser aplicadas à presente exposição. Sistemas de integração específi-ca de sítio assistida por enzima são conhecidos na técnica e podem ser apli-cados para integrar uma molécula de ADN em uma localização predetermi-nada em uma segunda molécula de ADN alvo. Exemplos de tais sistemas deintegração assistida por enzima incluem o sistema alvo Cre recombinase-lox(por exemplo, como descrito por Baubonis W and Sauer B, Nucleic AcidsRes. 21:2025-29 (1993); and Fukushige S and Sauer B, Proc. Natl. Acad.Sei. USA 89:7905-09 (1992)) e o FLP recombinase-FRT target system (porexemplo, como descrito em Dang DT and Perrimon N, Dev. Genet. 13:367-75 (1992); e Fiering S et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:8469-73 (1993)).Sistemas de recombinação homóloga induzível regulada com tetraciclina,tais como aqueles descritos em WO 94/29442 e WO 96/01313, também po-dem ser usados.

Por exemplo, em uma outra realização, animais não-humanostransgênicos podem ser produzidos os quais contêm sistemas selecionadosque permitem eexpressão regulada do transgene. Um eemplo de um tal sis-tema é o sistema cre/loxP recombinase de bacteriófago P1. Para uma des-crição do sistema cre/loxP recombinase, ver, por exemplo, Lakso M et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:6232-36 (1992). Um outro exemplo de um sis-tema recombinase é o sistema recombinase FLP de Saccharomyces cerevi-siae (O1Gorman S et al., Science 251:1351-55 (1991)). Se um sistemacre/loxP recombinase é usado para regular expressão do transgene, animaiscontendo transgenes codificando ambas a Cre recombinase e uma selecio-nada proteína são requeridos. Tais animais podem ser providos através deconstrução de animais transgênicos "duplos", por exemplo, através de aca-salamento de dois animais transgênicos, um contendo um transgene codifi-cando uma proteína selecionada e o outro contendo um transgene codifi-cando uma recombinase.

Clones dos animais transgênicos não-humanos aqui descritostambém podem ser produzidos de açodo com os processos descritos em,por exemplo, Wilmut I et al., Nature 385:810-13 (1997); WO 97/07668; e WO97/07669. Em resumo, uma célula, por exemplo, uma célula somática, deum animal transgênico pode ser isolada e induzida a deixar o ciclo de cres-cimento e entrar em fase G0. A célula quiescente então pode ser fundida, porexemplo, através de uso de pulsos elétricos, a um oócito enucleado de umanimal da mesma espécie da qual a célula quiescente é isolada. O oócitoreconstruído é então cultivado de modo que ele desenvolve para mórula oublastócito e então transferido para animal adotado fêmea pseudo-grávida. Adescend-encia nascida deste animal adotado fêmea será um clone do ani-mal do qual a célula, por exemplo, a célula somática, é isolada.

V. Usos e Processos da Invenção

Canais de íons são excelentes alvos para drogas. Os polinucleo-tídeos aqui mostrados codificam canais de potássio bloqueados com volta-gem mutantes, moduladores dos quais podem ser úteis para identificação decompostos para diagnóstico, tratamento, prevenção ou alívio de doençasrelacionadas com ou condições adversas do sistema nervoso central (CNS)e sistemas periféricos, incluindo vários tipos de de dor tais como, por exem-plo, dor somática, cutânea ou visceral causada por exemplo, por quimadura,hematoma, abrasão, laceração, osso quebrado, Iigamento rompido, tendãorompido, músculo lacerado, infecção viral, bacteriana, de protozoário ou defungos, dermatite de contato, inflamação (causada por exemplo, por trauma,infecção, cirurgia, queimaduras ou doenças com um componente inflamató-rio), câncer, dor de dente; dor neuropática causada por eemplo, por dano aosistema nervoso central ou periférico devido a câncer, infecção de HIV (vírusde imunodeficiência humana), trauma de tecido, infecção, doença autoimu-ne, diabetes, artrite, neuropatia diabética, neuralgia trigeminal, ou adminis-tração de droga; tratamento de ansiedade causada por eemplo, por distúrbiode pânico, distúrbio de ansiedade generalizada, ou distúrbio de tensão, par-ticularmente distúrbio de tensão aguda, distúrbios afetivos, mal de Alzhei-mer, ataxia, dano de CNS causado por trauma, acidente vascular cerebralou doença neurodegenerativa, déficits cognitivos, cormportamento compulsi-vo, demência, depressão, doença de Huntington, mania, prejuízo de memó-ria, distúrbios de memória, disfunção de memória, distúrbios de movimento,distúrbios motores, perda de memória relacionada com idade, doenças neu-rodegenerativas, mal de Parkinson e distúrbios motores semelhantes a Par-kinson, fobias, doença de Pick, psicose, esquizofrenia, dano de cordão espi-nhal, tremor, ataques, convulsões, epilepsia, distrofia macular semelhante aStargardt, distrofia macular de cone - bastão, doença de Salla, epilepsia,relaxantes musculares, redutores de febre, anxiolíticos, agentes anti-enxaqueca, analgésicos, distúrbios bipolares, depressão unipolar, distúrbiosfuncionais de intestino (por exemplo, dispepsia e síndrome de intestino irritá-vel), diarréia, constipação, vários tipos de incontinência urinária (por exem-plo, incontinência urinária de desejo, incontinência urinária de tensão, incon-tinência urinária de transbordamento ou incontinência urinária inconsciente ,e incontinência urinária mista), urgência urinária, instabilidade de bexiga,bexiga neurogênica, perda de audição, tinido, glaucoma, distúrbios cogniti-vos, dor neurálgica e inflamatória crônica; para prevenção e redução de de-pendência de droga ou tolerância para tratamento de, por exemplo, câncer,inflamação, doenças oftálmicas, e vários distúrbios de CNS.

As moléculas de ácido nucléico, proteínas, homólogos de proteí-nas, e anticorpos aqui descritos podem ser usados em um ou mais dos se-guintes processos: a) processos de tratamento, preferivelmente no cérebro,músculo de esqueleto, ou bexiga urinária; b) ensaios de seleção; c) medica-mentos anunciadores, ensaios prognósticos, experimentos clínicos de moni-toração, ou fármaco - genéticos). As moléculas de ácidos nucléicos isoladaspodem ser usadas, por exemplo, para expressão de proteína KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) (por exemplo, via um vetor de expressão recombinante emuma célula hospedeira em aplicações de terapia de gene), para detecção deARNm KCNQ5 Ou KCNQ5(W270L) (por exemplo, em uma amostra biológi-ca) ou uma alteração genética em um gene KCNQ5, e para modular ativida-de de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), como ainda descrito abaixo. Em adição,as proteínas KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) podem ser usadas para selecionarproteínas de ligação KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) ocorrendo naturalmente,para seleção de drogas ou compostos que modulam atividade de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L), assim como para tratamento de distúrbios que podem sebeneficiar de modulação de KCNQ5, por exemplo, caracterizados por insufi-ciente ou excessiva produção de proteína KCNQ5 ou produção de formas deproteína KCNQ5 que tem atividade diminuída ou aberrante comparadas aproteína KCNQ5 tipo selvagem. Além disso, os anticorpos anti- KCNQ5 ouanti - KCNQ5(W270L) podem ser usados para detecção e isolamento deproteínas KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), regulação da biodisponibilidade deproteínas KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), e modulação de atividade de KCNQ5(por exemplo, redução de atividade de KCNQ5 no cérebro aumentará a exci-tabilidade neuronal no CNS). Em realizações preferidas os processos aquimostrados, por exemplo, detecção, modulação de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L), etc., são realizados no CNS, músculo de esqueleto, oumúsculo liso de bexiga urinária.

A. Processos de Modulação de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L)Um aspecto provê processos de modulação de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) ém uma célula, por exemplo, para o propósito de identifica-ção de agentes que modulam expressão e/ou atividade de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L), assim como ambos processos profilático e terapêutico detratamento de um sujeito em risco de (ou suscetível a) um distúrbio ou tendoum distúrbio associado com aberrante expressão ou atividade de KCNQ5 ouum distúrbio que pode se beneficiar de modulação de atividade de KCNQ5.

Ainda um outro aspecto pertence a processos de modulação deexpressão e/ou atividade de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) em uma célula. Osprocessos moduladores envolvem contato de célula com um agnete quemodula expressão e/ou atividade de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) de modoque expressão e/ou atividade de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) são modula-das. O agente pode atuar através de modulação de atividade de proteínaKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) na célula ou através de modulação de transcri-ção do gene KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) ou tradução de ARNm KCNQ5 ouKCNQ5(W270L).

Da mesma maneira, em uma realização, o agente inibe atividadede KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Um agente inibidor pode funcionar, por e-xemplo, através de inibição direta de atividade de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) ou através de modulação de um caminho sinalizante queregula negativamente KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). em uma outra realização,o agente estimula atividade de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Um agente es-timulador pode funcionar, por exemplo, através de estimulação direta de ati-vidade de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), ou através de modulação de um ca-minho sinalizante que conduz a estimulação de atividade KCNQ5 ouKCNQ5(W270L). Agentes inibidores exemplares incluem moléculas de áci-dos nucléicos KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) anti - sentido (por exemplo, parainibição de tradução de ARNm KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), anticorpos anti -KCNQ5 ou anti - KCNQ5(W270L) (por exmeplo, para inibição de atividadede proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L)), e mutantes negativos dominantesda proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Outros agentes inibidores que po-dem ser usados para inibição de atividade de uma proteína KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) são compostos químicos que inibem atividade de KCNQ5ou KCNQ5(W270L). Tais compostos podem ser identificados usando ensai-os de seleção que selecionam tais compostos, como aqui descrito. Adico-nalmente ou alternativamente, compostos que inibem atividade de KCNQ5ou KCNQ5(W270L) podem ser desenhados usando-se abordagens conheci-das na técnica.

De acordo com um outro processo modulador, atividade deKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) é estimulada em uma célula através de contatode célula com um agente estimulador. Exemplos de tais agentes estimulado-res incluem moléculas ativas de proteína e ácido nucléico KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) codificando KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) que são introduzi-dos na célula para aumentar atividade de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) nacélula. Um agente estimulador preferido é uma molécula de ácido nucléicocodificando uma proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), onde a molécula deácido nucléico é introduzida na célula em uma forma apropriada para ex-pressão da proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) ativa na célula. Para ex-pressar uma proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) em uma célula, tipicamen-te um ADNc KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) é primeiro introduzido em um vetorde expressão recombinante usando técnicas padrões de biologia molecular,como aqui descrito. Um ADNc KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) pode ser obtido,por exemplo, através de amplificação usando a PCR ou através de seleçãode uma apropriada biblioteca de ADNc1S como aqui descrito. Seguindo iso-lamento ou amplificação de ADNc KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), o fragmentode ADN é introduzido em um vetor de expressão e transfectado em célulasalvos através de processos padrões, como aqui descrito. Outros agentesestimuladores que podem ser usados para estimulação de atividade e/ouexpressão de uma proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) são compostosquímicos que estimulam atividade e/ou expressão de KCNQ5 em células,tais como compostos que aperfeiçoam atividade de KCNQ5. Tais compostospodem ser identificados usando-se ensaios de seleção que selecionam taiscompostos, como aqui descrito em detalhes.

Os processos moduladores podem ser realizados in vitro (porexmeplo, através de cultura de célula com o agente ou através de introduçãode agente em células em cultura) ou, alternativamente, in vivo (por exmeplo,através de administração de agente a um sujeito ou através de introdução deagente em células de um sujeito, tal como através de terapia de gene). Paraprática de processo modulador in vitro, células podem ser obtidas de um su-jeito através de processos padrões e incubadas (isto é, cultivadas) in vitrocom um agente modulador para modular atividade de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) nas células.

Para agentes estimuladores ou inibidores que compreendemácidos nucléicos (incluindo vetores de expressão recombinantes codificandoproteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), ARN anti - sentido, anticorpos intrace-lulares, ou inibidores negativos dominantes), os agentes podem ser introdu-zidos nas células do sujeito usando processos conhecidos na técnica paraintrodução de ácido nucléico (por exemplo, ADN) em células in vivo. Exem-pios de tais processos abrangem ambos processos não-virtal e viral, incluindo:

Injeção Direta:ADN nú pode ser introduzido em células in vivoatravés de injeção direta de ADN nas células (ver, por exemplo, Acsadi G etal., Nature 332:815-18 (1991); Wolff JÁ et al., Science 247:1465-68 (1990)).

Por exemplo, uma aparelhagem de liberação (por exemplo, uma "pistola degene") para injeção de ADN em células in vivo pode ser usada. Uma tal apa-relhagem é comercialmente disponível (por exmeplo, de Bio-Rad Laboratori-es, Hercules, Calif.).

Lipídeos Catiônicos: ADN nú pode ser introduzido em células invivo através de complexação de ADN com lipídeos catiônicos ou encapsula-ção de ADN em Iipossomas catiônicas. Exemplos de apropriadas formula-ções de lipídeo catiônico incluem cloreto de N-[1-(2,3-dioleoiloxi) propil]-Ν,Ν,Ν-trietil amônio (DOTMA) e uma razão molar 1:1 de brometo de 1,2-dimiristiloxi propil-3-dimetil hidroxi etil amônio (DMRIE) e dioleoil fosfatidiletanol amina (DOPE) (ver, por exemplo, Logan JJ et al., Gene Ther. 2:38-49(1995); San H et al., Hum. Gene Ther. 4:781-88 (1993)).

Tomada de ADN Mediada Por Receptor: ADN nú também podeser introduzido em células in vivo através de complexação de ADN a um cá-tion, tal como poli lisina, que é acoplado a um Iigante para um receptor desuperfície de célula (ver, por exemplo, Wu GY and Wu CH, J. Bio!. Chem.263:14621-24 (1988); Wilson JM et al., J. Biol. Chem. 267:963-67 (1992);and U.S. Patent No. 5,166,320). Ligação do complexo de AND - Iigante aoreceptor facilita tomada do AND através de endocitose mediada por recep-tor. Um complexo de ADN - Iigante ligado a capsídeos de adenovírus quenaturalmente rompem endossomas, pelo que liberando material no citoplas-ma pode ser usado para evitar degradação do complexo através de Iiposso-mas intracelulares (ver, por exemplo, Curiel DT et al., Proc. Natl. Acad. Sei.USA 88:8850-54 (1991); Cristiano RJ et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA90:2122-26(1993)).

Retrovírus: Retrovírus defectives são bem caracterizados pa-ra uso em transferência de gene para propósitos de terapia de gene (parauma revisão, ver Miller AD, Blood 76:271-78 (1990)). Um retrovírus recombi-nante pode ser construído tendo uma seqüência: de nucleotídeos de interes-se incorporada no genoma retroviral. Adicionalmente, porções do genomaretroviral podem ser removidas para tornar o retrovírus defeituoso em repli-cação. O retrovírus de replicação defeituosa é então empacotado em viríonsque podem ser usados para infectar a célula alvo através de uso de um vírusauxiliar através de técnicas padrões.Protocolos para produção de retrovírusrecombinantes e para infecção de células in vitro ou in vivo com tais víruspodem ser encontrados em Current Protocols in Molecular Biology, AusubelFM et al. (eds.) Greene Publishing Associates (1989), Sections 9.10-9.14 eoutros manuais padrões de laboratório. Exemplos de apropriados retrovírusincluem pLJ, pZIP, pWE e pEM que são bem conhecidos por aqueles versa-dos na técnica. Exemplos de apropriadas linhas de vírus de embalagem in-cluem xPCrip, vFCre, Ψ2 ΨΑιτι. Retrovírus têm sido usados para introduçãode uma variedade de genes em muitos tipos diferentes de células, incluindocélulas epiteliais, células endoteliais, linfócitos, mioblastos, hepatócitos, célu-las de medula óssea, in vitro ou in vivo (ver, por exemplo, Eglitis MA et al.,Science 230:1395-98 (1985); Danos O and Mulligan RC, Proc. Natl. Acad.Sei. USA 85:6460-64 (1988); Wilson JM et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA85:3014-18 (1988); Armentano D et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:6141-45 (1990); Huber BE et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:8039-43 (1991);Ferry N et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:8377-81 (1991); ChowdhuryJRet al., Science 254:1802-05 (1991); van Beusechem VW et al., Proc. Natl.Acad. Sei. USA 89:7640-44 (1992); Kay MA et al., Hum. Gene Ther. 3:641-47 (1992); Dai Y et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10892-95 (1992); HwuP et al., J. Immunol. 150:4104-15 (1993); U.S. Patent No. 4,868,116; U.S.Patent No. 4,980,286; WO 89/07136; WO 89/02468; WO 89/05345; and WO92/07573. Vetores retrovirais requerem divisão de célula alvo de modo que ogenoma retroviral (e ácido nucléico estranho inserido no mesmo) seja inte-grado no genoma hospedeiro para introduzir estavelmente ácido nucléico nacélula. Assim, pode ser necessário estimular replicação da célula alvo.

Adenovírus: O genoma de um adenovírus pode ser manipula-do de modo que ele codifique e expresse um produto de gene de interessemas seja inativado em termos de sua habilidade para replicar em um ciclo devida viral lítico normal (ver, por exemplo, Berkner KL, Biotechniques 6:616-29 (1988); Rosenfeld MA et al., Science 252:431 -34 (1991); e Rosenfeld MAet al., Cell 68:143-55 (1992)). Apropriados vetores adenovirais derivados delinhagem de adenovírus Ad tipo 5 d1324 ou outras linhagens de adenovpirus(por exemplo, Ad2, Ad3, Ad7, etc.) são bem conhecidas por aqueles versa-dos na técnica. Adenovírus recombinantes são vantajosos em que eles nãorequerem células se dividindo para serem efetivos veículos de liberação degene e podem ser usados para infectarem uma ampla variedade de tipos decélulas, incluindo epitélio de vias aéreas (Rosenfeld MA et al., Cell 68:143-55(1992)), células endoteliais (Lemarchand P et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA89:6482-86 (1992)), hepatócitos (Herz J and Gerard RD, Proc. Natl. Acad.Sei. USA 90:2812-16 (1993)), e células de músculo (Quantin B et al., Proc.Natl. Acad. Sei. USA 89:2581-84 (1992)). Adicionalmente, ADN adenoviralintroduzido (e ADN estranho ali contido) não é integrado no genoma de umacélula hospedeira mas permanece epissomal, pelo que evitando potenciaisproblemas que podem ocorrer como um resultado de mutagênese de inser-ção em situações onde ADN introduzido torna-se integrado no genoma hos-pedeiro (por exmelo, ADN retroviral). Além disso, a capacidade de carrea-mento do genoma adenoviral para ADN estranho é grande (até 8 quilobases)em relação a outros vetores de liberação de gene (Berkner KL et al., supra;

Haj-Ahmad Y and Graham FL, J. Virol. 57:267-74 (1986)). Maioria de vetoresadenovirais de replicação defeituosa correntemente em uso são suprimidosde todos ou partes do genes E1 e E3 virais mas retêm tanto quanto 80% domaterial genético adenoviral.

Vírus Adeno-Associados: Vírus adeno - associado (AAV) é umvírus defeituoso ocorrendo naturalmente que requer um outro vírus, tal comoum adenovírus, ou um vírus de herpes, ou um vírus auxiliar para eficientereplicação e um ciclo de vida produtivo (para uma revisão, ver Muzyczka N,Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:97-129 (1992)). Ele é também um dospoucos vírus que pode integrar seu ADN em células não se dividindo, e exi-be uma alta freqüência de integração estável (ver, por exemplo, Flotte TR etal., Am. J. Respir. Cell.' Mol. Biol. 7:349-56 (1992); Samulski RJ et al., J. Vi-rol. 63:3822-28 (1989); e McLaughIin SK et al., J. Virol. 62:1963-73 (1988)).Vetores contendo tão poiucoi quanto 300 pares de bases de AAV podem serembalados e podem integrar. Espaço para ADN exógeno é limitado a cercade 4,5 kb. Um vetor AAV tal como aquele descrito por Tratschin JD et al.,Mol. Cell.. BioL 5:3251-60 (1985), pode ser usado para introduzir ADN emcélulas. Uma variedade de ácidos nucléicos foram introduzidos em diferen-tes tipos de células usando vetores AAV (ver, por exemplo, Hermonat PLand Muzyczka N, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6466-70 (1984); TratschinJD et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-81 (1985); Wondisford FE et al., Mol. Endo-crinol. 2:32-39 (1988); Tratschin JD et al., J. Virol. 51:611-19 (1984); andFlotte TR et al., J. Biol. Chem. 268:3781 -90 (1993)).

A eficácia de um particular sistema de vetor de expressão e pro-cesso de introdução de ácido nucléico em uma célula pode ser avaliado a-través de abordagens padrões rotineiramente usadas na técnica. Por exem-plo, ADN introduzido em uma célula pode ser detectado por uma técnica dehibridização de filtro (por exemplo, Southern blotting), e ARN produzido portranscrição de ADN introduzido pode ser detectado, por exemplo, por Nor-thern blot, proteção com RNase, ou reação de cadeia polimerase - transcrip-tase reversa (RT-PCR). O produto gene pode ser detectado através de umensaio apropriado, por exmeplo, através de detecção imunológica de umaproteína produzida, tal como com um anticorpo específico, ou através de umensaio funcional para detectar uma atividade funcional do produto de gene.

Existe uma variedade de condições patológicas para as quaisagentes de modulação de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) podem ser usadosem tratamento (ver, por exemplo, seção V, aqui).

1.Processos Profiláticos

Um aspecto provê um processo para prevenção em um sujeito,de uma doença ou condição que pode se beneficiar de modulaçde uma ati-vidade e/ou expressão de KCNQ5, por exemplo, um distúrbio associado comuma expressão ou atividade aberrante de KCNQ5 (tal como por exemplo,incontinência urinária e dor neuropática), através de administração ao sujeitode um polipeptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) ou um agnete que modulaexpressão de polipeptídeo KCNQ5 ou pelo menos uma atividade de KCNQ5.Em um aspecto, o polipeptídeo KCNQ5 pode conter um doimínio transmem-brana S5-S6 de KCNQ1. Alternativamente, o polipeptídeo KCNQ5 pode con-ter um domínio transmembrana S5 de KCNQ1. Sujeitos em risco para umadoença que é causada ou contribuída por expressão ou atividade aberrantede KCNQ5 podem ser identificados através de, por exemplo, qualquer um ouuma combinação de ensaios diagnósticos ou prognósticos como aqui descri-tos. Administração de um agnete profilático pode ocorrer antes da manifes-tação de sintomas característicos de aberração de KCNQ5, de modo que adoença ou distúrbio é prevenida ou, alternativamente, retardada em sua pro-gressão. Dependendo do tipo de aberração ou condição de KCNQ5, por ex-meplo, um polipeptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), agonista de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L), ou agente antagosnista de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L)pode ser usado para tratamento do sujeito. O apropriado agente pode serdeterminado baseado em ensaios de seleção aqui descritos.

2. Processos TerapêuticosUm outro aspecto pertence a processos de modulação de ex-pressão ou atividade de KCNQ5 para propósitos terapêuticos. Da mesmamaneira, em uma realização exemplar, o processo modulador envolve conta-to de uma célula com um polipeptídeo ou agente KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) que modula uma ou mais das atividades de proteínaKCNQ5 associada com a célula. Um agnete que modula atividade de proteí-na KCNQ5 pode ser um agnete como aqui descrito, tal como um ácido nu-cléico ou uma proteína, uma molécula alvo ocorrendo naturalmente de umaproteína KCNQ5 (por exemplo, uma proteína de ligação KCNQ5), um anti-corpo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), um agonista ou antagonista de KCNQ5ou KCNQ5(W270L), um peptidomimético de um agonista ou antagonista deKCNQ5 ou KCNQ5(W270L), ou outra molécula pequena. Em uma realiza-ção, o agente estimula uma ou mais atividades de KCNQ5. Exemplos de taisagentes estimuladores incluem proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) ativa euma molécula de ácido nucléico codificando polipeptídeo KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) que foi introduzido na célula. Em uma outra realização, oagente inibe uma ou mais atividades KCNQ5. Exemplos de tais agentes ini-bidores incluem moléculas de ácido nucléico KCNQ5 ou KCNQ5(W270LKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) anti - sentido, anticorpos anti - KCNQ5 ou anti -KCNQ5(W270L), e inibidores de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Estes proces-sos moduladores podem serr realizados in vitro (por exemplo, através decultura de célula com o agente) ou, alternativamente, in vivo (por exemplo,através de administração de agente a um sujeito). Como tal, ainda um as-pecto provê processos de tratamento de um indivíduo afligido com uma do-ença ou distúrbio que pode se beneficiar de modulação de uma proteínaKCNQ5 (por exemplo, como descrito em seção V, aqui), ou que é caracteri-zada por expressão ou atividade aberrante de uma molécula de ácido nu-cléico ou proteína KCNQ5. Em uma realização, o processo envolve adminis-tração de um agente (por exemplo, um agente identificado através de umensaio de seleção aqui descrito), ou combinação de agentes que modula(por exemplo, regula ascendentemente ou regula descendentemente) ex-pressão ou atividade de KCNQ5. Em uma outra realização, o processo en-volve administração de uma molécula de ácido nucléico ou proteína KCNQ5ou KCNQ5(W270L) como terapia para compensar reduzida ou aberranteexpressão ou atividade de KCNQ5.

Estimulação de atividade de KCNQ5 é desejável em situaçõesnas quais KCNQ5 'w anormalmente regulado descendentemente e/ou ondeaumentada atividade de KCNQ5 é provável de ter um efeito benéfico. Damesma maneira, inibição de atividade de KCNQ5 é desejável em situaçõesnas quais KCNQ5 é anormalmente regulada ascendentemente e/ou ondediminuída atividade de KCNQ5 é provável de ter um efeito benéfico. Sistua-ções exemplares nas quais modulação de KCNQ5 será desejável estão notratamento de distúrbios associados com KCNQ5 (ver, por exemplo, seçãoV1 aqui).

Agentes identificados pelos processos aqui mostrados são úteispara indução, auxílio ou manutenção de desejável controle de bexiga em ummamífero experimentando ou suscetível a instabilidade de bexiga ou inconti-nência urinária. Estes processos incluem prevenção, tratamento ou inibiçãode condições urinárias relacionadas com bexiga e instabilidade de bexiga,incluindo instabilidade de bexiga idiopática, enurese noturna, noturia, disfun-ção de esvaziamento e incontinência urinária. Também tratável ou prevení-vel com os processos desta invenção é instabilidade de bexiga secundáriapara hipertrofia de próstata. Os agentes identificados pelos processos aquimostrados também são úteis na promoção de retardo temporário de micçãoquando desejável. Os agentes também podem ser usados para estabilizaçãode bexiga e tratamento ou prevenção de incontinência urinária de desejo,oincontinência urinária de tensão ou uma combinação de incontinência detensão e desejo em um mamífero, que também pode ser referida como in-continência de tensão e desejo mista. Estes processos incluem auxílio emprevenção ou tratamento de incontinência urinária associada com condiçõessecundárias como hipertrofia de próstata.

Estes processos podem ser utilizados para permitir um receptorcontrolar a urgência e freqüência de micção. Os processos desta invençãoincluem o tratamento, prevenção, inibição e melhora de incontinência uriná-ria de desejo também conhecida como instabilidade de bexiga, bexiga neu-rogênica, disfunção de esvaziamento, bexiga hiperativa, superatividade dedetrusor, hiper-reflexia de detrusor ou bexiga não-inibida.

Como descrito acima, processos úteis incluem tratamentos, pre-venção, inibição ou melhora de bexiga hiperativa ou instável, bexiga neuro-gênica, urgência de bexiga sensória, ou bexiga hiper-reflexiva. Estes usosincluem, mas não são limitados àqueles para atividades e instabilidades debexiga nas quais a urgência urinária está associada com prostatite, hipertro-fia prostática, cistite intersticial, infecções de trato urinário ou vaginite. Osagentes também podem ser usados para auxiliarem em inibição ou correçãodas condições de Síndrome de Frqüência - Urgência, e bexiga preguiçosa,também conhecida como síndrome de esvaziamento infreqüente.

Os agentes também podem ser usados para tratamento, pre-venção, inibição ou limitação de incontinência urinária, instabilidade urináriaou urgência urinária associada com ou resultante de administrações de ou-tras medicações, incluindo diuréticos, antagonistas de vasopressina, agentesanticolinérgicos, sedativos ou agentes hipnóticos, narcóticos, agonístas alfa-adrenérgicos, antagonistas alfaadrenérgicos, ou bloqueadores de canal decálcio.

Os agentes identificados pelos processos aqui mostrados podemser úteis para indução ou auxílio em controle de bexiga urinária ou preven-ção ou tratamento de doenças aqui descritas em humanos em necessidadede tal alívio, incluindo usos adulto e pediátrico. Entretanto, eles também po-dem ser utilizados para aplicações veterinárias, particularmente incluindoprocessos de controle de bexiga de caninos e felinos. Se desejado, os pre-sentes processos também podem ser usados com animais de fazenda, co-mo criações de ovinos, bovinos, porcinos e eqüinos.

B. Ensaios de Seleção:

Um aspecto provê um processo (também referido aqui como um"ensaio de seleção") para identificação de moduladores, ou seja, compostoscandidatos ou testes ou agentes (por exemplo, peptídeos, peptidomiméticos,moléculas pequenas e outras drogas) que se ligam a proteínas KCNQ5 ouKCNQ5(W270L), têm um efeito estimulador ou inibidor sobre, por exemplo,expressão de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), ou atividade de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L).

Os compostos testes podem ser obtidos usando qualquer umade numerosas abordagens em processos de biblioteca combinatorial conhe-cidos na técnica, incluindo: bibliotecas biológicas; bibliotecas de fase sólidaou fase solução paralelas espacialmente endereçáveis; processos de biblio-teca sintética requerendo desconvolução; o processo de biblioteca de "uma·pérola um-composto"; e processos de biblioteca sintéticos usando seleçãode cromatografia de afinidade. A abordagem de biblioteca biológica é limita-da a bibliotecas de peptídeos, enquanto as outras quatro abordagens sãoaplicáveis a bibliotecas de moléculas pequenas ou, não-peptídeo oligômero,peptídeo de compostos (Lam KS1 Anticancer Drug Des. 12:145-67 (1997)).

Exemplos de processos para a síntese de bibliotecas molecula-res podem ser encontrados na técnica, por exemplo em: DeWitt SH et ai,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6909-13 (1993); Erb E et ai, Proc. Natl. Acad.Sei. USA 91:11422-26 (1994); Zuckermann RN et ai, J. Med. Chem.37:2678-85 (1994); Cho CY et ai, Science 261:1303-05 (1993); Carrell T etai, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059-61 (1994); Carrell T et ai, Angew.Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061-64 (1994); e Gallop MA et ai, J. Med. Chem.37:1233-51 (1994).

Bibliotecas de compostos podem ser apresentadas, por exem-plo, em solução (por exemplo, Houghten RA et ai, Biotechniques 13:412-21(1992)), ou sobre pérolas (Lam KS et ai, Nature 354:82-84 (1991)), chips(Fodor SPA et al., Nature 364:555-56 (1993)), bactérias (Patente U.S. No.5,223,409), esporos (Patente U.S. No. 5,223,409), plasmídeos (Cull MG etai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:1865-69 (1992)), ou sobre fago (Scott JKand Smith GP, Science 249:386-90 (1990); Devlin JJ et ai, Science 249:404-06 (1990); Cwirla SE et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. 87:6378-82 (1990); Felici Fet ai, J. Mol. Biol. 222:301-10 (1991); Patente U.S. No. 5,223,409).

Em muitos programas de seleção de drogas que testam bibliote-cas de agentes de modulação e extratos naturais, ensaios de alta produtivi-dade são desejáveis de modo a a maximizar o número de agentes de modu-lação sobreviventes em um dado período de tempo. Ensaios que são reali-zados em sistemas livres de células, tal como pode ser derivado com proteí-nas purificadas ou semi - purificadas, são freqüentemente preferidos comoseleções "primárias" em que elas podem ser geradas para permitirem rápidodesenvolvimento e detecção relativamente fácil de uma alteração em umalvo molecular que é mediada por um agente de modulação teste. Além dis-so, os efeitos de toxidez celular e/ou biodisponibilidade do agnete de modu-lação teste podem ser genericamente ignorados no sistema in vitro, o ensaioao invés sendo focalizado primariamente sobre o efeito da droga sobre oalvo molecular como pode ser manifesto em uma alteração de afinidade deligação com elementos à montante ou à jusante.

Em um aspecto, um agente é selecionado através de contato deagente com uma molécula de KCNQ5 e detectando o efeito do agnete sobreatividade de KNCQ5. Detecção de um aumento ou uma diminuição de ativi-dade de KNCQ5 é indicativa de um agente sendo um modulador de KCNQ5.A molécula de KCNQ5 pode ser um polinucleotídeo codificando todo ou umaporção de um polipeptídeo KCNQ5(W270L), um polinucleotídeo codificandoum polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembrana S5-S6 deKCNQ1, ou um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 conten-do um domínio transmembrana S5 de KCNQ1. Alternativamente, a moléculade KCNQ5 pode ser um polipeptídeo compreendendo uma seqüência deaminoácidos de um polipeptídeo KCNQ5(W270L), um polipeptídeo KCNQ5contendo um domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1, ou um polipeptídeoKCNQ5 contendo um domínio transmembrana S5 de KCNQ1.

Em um outro aspecto, um agente é selecionado através de con-tato de uma célula com um agente e determinando o nível de expressão deuma molécula de KCNQ5. Detecção de uma diminuição ou um aumento emexpressão de KCNQ5 é indicativa de um agente sendo um modulador deKCNQ5. A molécula de KCNQ5 pode ser um polinucleotídeo codificandotodo ou uma porção de um polipeptídeo KCNQ5(W270L), um polinucleotídeocodificando um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembranaS5-S6 de KCNQ1, ou um polinucleotídeo codificando um polipeptídeoKCNQ5 contendo um domínio transmembrana S5 de KCNQ1. Alternativa-mente, a molécula de KCNQ5 pode ser um polipeptídeo compreendendouma seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo KCNQ5(W270L), umpolipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembrana S5-S6 deKCNQ1, ou um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembranaS5 de KCNQ1.

Uma realização provê ensaios para seleção de compostos can-didatos ou testes que se ligam a ou modulam a atividade de uma proteína oupolipeptídeo KCNQ5 ou sua porção biologicamente ativa, por exemplo, mo-dula a habilidade de polipeptídeo KCNQ5 para reduzir excitabilidade neuro-nal ansiedade e/ou dor neuropática, ou para "acalmar" atividade de músculoliso de bexiga para incontinência urinária. Por "acalmar" é pretendido supri-mir contrações anormais de células de músculo liso de bexiga em pacientesde incontinência.

Ensaios podem ser usados para seleção de agentes modulan-tes, incluindo homólogos de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), que são agonistasou antagonistas da função celular normal dos polipeptídeos KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) de sujeito. Por exemplo, um aspecto provê um processo noqual uma composição indicadora é provida que tem uma proteína KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) tendo uma atividade KCNQ5. A composição indicadora po-de ser contactada com um composto teste. O efeito do composto teste sobreatividade de KCNQ5, como medido através de uma mudança na composiçãoindicadora, então pode ser determinado para através do que identificar umcomposto que modula a atividade de uma proteína KCNQ5. Uma mudançaestatisticamente significante, tal como uma diminuição ou aumento, no nívelde atividade de KCNQ5 na presença do composto teste (em relação ao queé detectado na ausência do composto teste) é indicativa do composto testesendo um agente de modulação de KCNQ5. A composição indicadora podeser, por exemplo, uma célula ou um extrato de célula.

A eficácia do agente de modulação pode ser avaliada através degeração de curvas de dose resposta a partir de dados obtidos usando váriasconcentrações do agnete de modulação teste. Além disso, um ensaio contro-le também pode ser realizado para prover uma linha base para comparação.No ensaio controle, proteína ou KCNQ5(W270L) isolada e purificada é adi-cionada a uma composição contendo um elemento de ligação de KCNQ5, ea formação de um complexo é quantificada na ausência do agente de modu-lação teste.

Ainda em uma outra realização, um ensaio é um ensaio isento de cé-lula no qual uma protéina ou KCNQ5(W270L) ou sua porção biologicamenteativa é contactada com um composto teste e a habilidade do composto testepara se ligar à proteína ou KCNQ5(W270L) ou sua porção biologicamenteativa é determinada. Ligação do composto teste à proteína ouKCNQ5(W270L) pode ser determinada direta ou indiretamente como descri-to acima. Em uma realização, o ensaio inclui contato de proteína ouKCNQ5(W270L) ou sua porção biologicamente ativa com um composto co-nhecido que liga KCNQ5 tipo selvagem para formar uma mistura de ensaio,contato de mistura de ensaio com um composto teste, e determinação dehabilidade do composto teste para interagir com uma proteína ouKCNQ5(W270L), onde determinação de habilidade do composto teste parainteragir com uma proteína ou KCNQ5(W270L) compreende determinaçãode habilidade do composto teste ligar-se preferencialmente a polipeptídeo ouKCNQ5(W270L) ou sua porção biologicamente ativa comparado ao compos-to conhecido.

A proteína ou KCNQ5(W270L) pode ser provida como um Iisado decélulas que expresam ou KCNQ5(W270L), como um polipeptídeo purificadoou semi - purificado, ou como um polipeptídeo expresso recombinantemente.Em uma realização, um sistema de ensaio isento de células ainda compre-ende pelo menos uma molécula alvo com a qual KCNQ5 ou KCNQ5(W270L)interage, e a habilidade do composto teste para modular a interação daKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) com a molécula(s) alvo é monitorada para peloque identificar o composto teste como um modulador de atividade deKCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Determinação de habilidade do composto testepara modular a atividade de uma proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) podeser realizada, por exemplo, através de determinação de habilidade da prote-ína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) se ligar a uma moléucla alvo KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) através de um dos processos descritos acima para deter-minação de ligação direta. Determinação de habilidade da proteínaKCNQ5(W270L) para ligar-se a uma molécula alvo KCNQ5(W270L) tambémpode ser realizada usando uma trecnologia tal ocmo Análise de InteraçãoBiomolecular de tempo real (BIA) (ver, por exemplo, Sjolander S and Urba-niczky C, Anal. Chem. 63:2338-45 (1991) and Szabo A et ai, Curr. Opin.Struct. Biol. 5:699-705 (1995)). Como aqui usado, "ΒΙΑ" é uma tecnologiapara estudo de interações bioespecíficas em tempo real, sem marcação dequalquer dos inter-atuantes (por exemplo, BIAcore). Mudanças no fenômenoótico de ressonância plasmon de superfície (SPR) podem ser usadas comouma indicação de reações em tempo real entre moléculas biológicas.

Ainda em uma outra realização, o ensaio livre de células envolve con-tato de uma proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) ou sua porção biologica-mente ativa com um composto conhecido que se liga com a proteína KCNQ5tipo selvagem para formar uma mistura de ensaio, contato de mistura de en-saio com um composto teste, e determinação de habilidade do compostoteste interagir com a proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), onde determina-ção de habilidade do composto teste de interagir com a proteína KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) compreende determinação de habilidade da proteínaKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) para ligar preferencialmente a ou modular a ati-vidade de uma molécula alvo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L).

Os ensaios isentos de células são suscetíveis ao uso de ambas for-mas de proteínas, solúveis e/ou ligadas a membrana. No caso de ensaiosisentos de células onde é usada uma forma de proteína ligada a membrana(por exemplo, proteínas KCNQ5 ou KCNQ5(W270L)) pode ser desejávelutilizar um agente solubilizante de modo que a forma de proteína ligada amembrana seja mantida em solução. Exemplos de tais agentes solubilizan-tes incluem detergentes não-iônicos como n-octil glicosídeo, n-dodecil glico-sídeo, n-dodecil maltosídeo, octanoil-N-metil glucamida, decanoil-N-metilglucamida, Triton X-100, Triton X-114, Thesit, Istotridecil poli( etileno glicoléter)n, sulfonato de 3-[(3-colamido propil) dimetil amminio]-1-propano(CHAPS), sulfonato de 3-[(3-colamido propil) dimetil amminio]-2-hidroxi-1-propano (CHAPSO), ou sulfonato de N-dodecil=N,N-dimetil-3-amônio-1-propano.

Uma molécula alvo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) pode ser, por exem-plo, uma proteína. Apropriados ensaios são conhecidos na técnica que per-mitem a deteção de interações proteína - proteína (por exemplo, imunopre-cipitações, ensaios de dois híbridos, e semelhantes). Através de realizaçãode tais ensaios na presença e ausência de compostos testes, estes ensaiospodem ser usados para identificação de compostos que modulam (por e-xemplo, inibem ou aperfeiçoam) a interação de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L)com uma molécula(s) alvo.

Determinação de habilidade da proteína KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) para ligar-se a ou interagir com um Iigante de uma moléculade KCNQ5 o KCNQ5(W270L) pode ser realizada, por exemplo, através deligação direta= Em um ensaio de ligação direta, a proteína KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) pode ser acoplada com radioisótopo ou marcador enzimáti-co de modo que ligação da proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) a uma mo-lécula alvo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) pode ser determinada através dedetecção de proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) em um complexo. Por e-xemplo, moléculas de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), por exemplo, proteínasKCNQ5 ou KCNQ5(W270L), podem ser marcadas com, por exemplo, 125I,35s, 14C, 32P, ou 3H1 tanto diretamente como indiretamente, e o radioisótopodetectado através de contagem direa de rádio - emissão ou através de con-tagem de cintilação. Alternativamente, moléculas de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) podem ser enzimaticamente marcadas com, por exemplo,peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, ou luciferase, e o marcador en-zimático detectado através de determinação de conversão de um substratoapropriado para produto.

Tipicamente, será desejável imobilizar KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) ou suas proteínas Iigantes para facilitar separação de com-plexos de formas não complexadas de uma ou ambas das proteínas, assimcomo acomodar automação do ensaio. Ligação de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) à um elemento de ligação à montante ou à jusante, na pre-sença e ausência de um agente candidato, pode ser realizada em qualquervaso apropriado para conter os reagentes. Exemplos incluem placas de mi-cro - titulação, tubos de ensaio, e tubos de micro - centrífuga. Em uma reali-zação, uma proteína de fusão pode ser provida que adiciona um domínioque permite que a proteína seja ligada a uma matriz. Por exemplo, proteínasde fusão glutationa-S-transferase / KCNQ5(W270L) (GST / KCNQ5(W270L)podem ser adsorvidas sobre pérolas de glutationa sefarose (Sigma Chemi-cal, St. Louis, Mo.) ou placas de microtitulação derivadas de glutationa, quesão então combinadas com os Iisados de células e o agente de modulaçãoteste, e a mistura incubada sob condições que conduzem a formação decomplexo, por exemplo, em condições fisiológicas para sal e pH, emboracondições levemente mais rigorosas possam ser desejadas. Seguindo incu-bação, as pérolas são lavadas para remoção de qualquer marcador não -Iigadoi e a matriz imobilizada e radio - marcador determinado diretamente(por exemplo, pérolas colocadas em cintilante), ou no sobrenadante após oscomplexos serem subseqüentemente dissociados. Alternativamente, oscomplexos podem ser dissociados da matriz, separados por SDS-PAGE, e onível de proteína de ligação de KCNQ5-(W270L) encontrado na fração depérolas quantificado a partir do gel usando técnicas eletroforéticas padrões.

Outras técnicas para imobilização de proteínas ou matrizes tam-bém são disponíveis para uso no ensaio objeto. Por exemplo,KCNQ5(W270L) ou sua proteína Iigante cognata pode ser imobilizada utili-zando conjugação de biotina e streptavidina. Por exemplo, moléculasKCNQ5(W270L) biotiniladas podem ser prpearadas a partir de bitoina-NHS-(N-hidroxi succinimida) usando-se técnicas bem conhecidas (por exmeplo,kit de biotinilação, Pierce Biotechnology, Rocford, Ill.), e imobilizadas nascavidades de placas de 96 cavidades revestidas com streptavidina (PierceTechnology). Alternativamente, anticorpos reativos com KCNQ5(W270L)mas que não interferem com ligação de elementos à montante ou à jusantepodem ser derivados para as cavidades da placa, e KCNQ5(W270L) arras-tado para as cavidades através de conjugação de anticorpo. Como acima,preparações de uma proteína de ligação de KCNQ5(W270L)(KCNQ5(W270L)-BP) e um agente de modulação teste são incubadas nascavidades apresentando KCNQ5(W270L) da placa, e a quantidade de com-plexo arrastada na cavidade pode ser quantificada. Processos exemplarespara detecção de tais complexos, em adição àqueles descritos açima paraos complexos imobilizados em GST1 incluem imuno - detecção de comple-xos usando anticorpos reativos com o elemento de ligação deKCNQ5(W270L), ou que são reativos com proteína KCNQ5(W270L) e com-petem com o elemento de ligação; assim como ensaios ligados a enzimaque se baseiam na detecção de uma atividade enzimática associada com oelemento de ligação, atividade tanto intrínseca como extrínseca. No exemploda última, a enzima pode ser quimicamente conjugada ou provida como umaproteína de fusão com a proteína de ligação de KCNQ5(W270L). Para ilus-trar, a proteína de ligação de KCNQ5(W270L) pode ser quimicamente reticu-Iada eu geneticamente fundida com peroxidase de raiz forte, e a quantidadede proteína arrastada no complexo pode ser avaliada com um substratocromog-enico da enzima, por exemplo, tetra cloridrato de 3,3'-diamino ben-zadina ou 4-cloro-T-naftol. Da mesma maneira, uma proteína de fusão com-preendendo a proteína e glutationa-S-transferase pode ser provida, e forma-ção de complexo quantificada através de detecção de atividade GST usando1-cloro-2,4-dinitro benzeno (Habig WH et al., J. Biol. Chem. 249:7130-39(1974)).

Para processos que baseiam-se em imuno - detecção paraquantificação de uma das proteínas arrastadas no complexo, anticorpos con-tra a proteína, tais como anticorpos anti-KCNQ5 ou anti-KCNQ5(W270L),podem ser usados. Alternativamente, a proteína a ser detectada no comple-xo pode ser "etiquetada em epítopo" na forma de uma proteína de fusão queinclui, em adição à seqüência KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), uma segundaproteína para a qual anticorpos são facilmente disponíveis (por exemplo, defontes comerciais). Por exemplo, as proteínas de fusão GST descritas acimatambém podem ser usadas para quantificação de ligação usando anticorposcontra a metade GST. Outras etiquetas epítopos úteis incluem myc - epíto-pos (ver, por exemplo, Ellison MJ and Hochstrasser M, J. Biol. Chem.266:21150-57 (1991)) que inclui uma seqüência de 10 resíduos a partir de c-myc, assim como o sistema pFLAG (SigmaAIdrich, St. Louis, Mo.) ou o sis-tema pEZZ-protein A (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Também está dentro do escopo da presente exposição determi-nar a habilidade de um composto modular a interação entre KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) e suas respectivas moléculas alvos sem a marcação dequalquer um dos inter-atuantes. Por exemplo, um microfisiômetro pode serusado para detectar a interação de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) com suasrespectivas moléculas alvos sem a marcação de KCNQ5, KCNQ5(W270L),ou as moléculas alvos (ver, por exemplo, McConneII HM et al., Science257:1906-12 (1992)). Como aqui usado, um "microfisiômetro" (por exemplo,Cytosensor) é um instrumento analítico que mede a taxa na qual uma célulaacidula seu ambiente usando um sensor potenciométrico enderável à luz(LAPS). Mudanças nesta taxa de acidulação podem ser usadas como umaindicação da interação entre composto e receptor.

Em adição a ensaios isentos de células, a presente exposiçãode proteínas KCNQ5 e KCNQ5(W270L) facilita a geração de ensaios basea-dos em células para identificação de agonistas / antagonistas de moléculapequena e semelhantes. Por exemplo, células podem ser feitas expressaremou super-expressarem uma proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) na presen-ça e ausência de um agente de modulação teste de interesse, com o ensaioclassificando para modulação em respostas KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) a-través de célula alvo mediada pelo agente teste. Por exemplo, como com osensaios isentos de células, agentes de modulação que produzem uma mu-dança estatisticamente significante em respostas dependentes de KCNQ5ou KCNQ5(W270L) (tanto um aumento como diminuição) podem ser identifi-cados.

Vetores de expressão recombinante que podem ser usados paraexpressão de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) são conhecidos na técnica (verdiscussão acima). Em uma realização, dentro de vetor de expressão, as se-qüências codificantes KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) estão operavelmente liga-das a seqüências reguladoras que permitem expressão constitutiva ou indu-zível de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) na célula(s) indicadora. Uso de um ve-tor de expressão recombinante que permite expressão constitutiva ou indu-zível de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) em uma célula é preferido para identifi-cação de compostos que aperfeiçoam ou inibem a atividade de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L). Em uma realização alternativa, dentro de vetor de expres-são, as seqüências codificantes de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) estão opera-velmente ligadas a seqüências reguladoras do gene KCNQ5 endógeno (istoé, a região reguladora promotora derivada do gene endógeno). Uso de umvetor de expressão recombinante no qual expressão de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) é controlada pelas seqüências reguladoras endógenas épreferido. Em uma realização, um ensaio é um ensaio baseado em célulacompreendendo contato de uma célula expressando uma molécula alvoKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) (por exemplo, uma molécula de inter-atuaçãointracelular KCNQ5) com um composto teste e determinando a habilidade docomposto teste para modular (por exemplo, estimular ou inibir) a atividadeda molécula alvo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Determinação de habilidadedo composto teste para modular a atividade de uma molécula alvo KCNQ5ou KCNQ5(W270L) pode ser realizada, por exemplo, através de determina-ção da habilidade da proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) ligar a ou interagircom a moléucla alvo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) ou seu ligante.

Em uma realização ilustrativa, a expressão ou atividade deKCNQ5(W270L) é modulada em células e os efeitos de agentes de modula-ção de interesse na leitura de interesse pode ser medida (tal como, por e-xemplo, a magnitude de corrente de íons pode ser medida eletrofisiologica-mente a partir de oócitos de Xenopus Iaevis expressando os canaisKCNQ5(W270L)).

Em uma outra realização, moduladores de expressão de KCNQ5ou KCNQ5(W270L) são identificados em um processo onde uma célula écontactada com um composto candidato e a expressão de ARNm ou proteí-na KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) na célula é determinada. O nível de expres-são de ARNm ou proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) na presença do com-posto candidato é comparado ao nível de expressão de ARNm ou proteínaKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) na ausência do composto candidato. O compos-to candidato então pode ser identificado como um modulador de expressãode KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) baseado nesta comparação. Por exemplo,quando expressão de ARNm ou proteína de KCNQ5(W270L) é maior (porexemplo, maior estatisticamente significantemente) na presença do compos-to candidato que em sua ausência, o composto candidato é identificado co-mo um estimulador de expressão de ARNm ou proteína KCNQ5(W270L).Alternativamente, quando expressão de ARNm ou proteína KCNQ5(W270L)é menor (por exmeplo, menor estasiticamente significantemente) na presen-ça do composto candidato que em sua presença, o composto candidato éidentificado como um inibidor de expressão de ARNm ou proteínaKCNQ5(W270L). O nível de expressão de ARNm ou proteínaKCNQ5(W270L) nas células pode ser determinado através de processosaqui descritos para detecção de ARNm ou proteína KCNQ5 ouKCNQ5(W270L).

Em uma realização preferida, determinação de habilidade daproteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) ligar-se a ou interagir com uma molécu-Ia alvo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) pode ser realizada através de mediçãode uma leitura da atividade de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) ou da moléculaalvo. Por exemplo, a atividade de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) ou uma molé-cula alvo pode ser determinada através de detecção de indução de um se-gundo mensageiro celular do alvo, detectando atividade catalítica / enzimáti-ca do alvo de um substrato apropriado, detectando a indução de um generepórter (compreendendo um elemento regulador responsivo alvo ligado o-peravelmente a um ácido nucléico codificando um marcador detectável, porexemplo, cloranfenicol acetil transferase), ou detectando uma resposta celu-lar regulada - alvo, por exemplo, influxo de Ca2+ induzido por bloqueio doscanais KCNQ5 ou KCNQ5(W270L).

Ainda em um outro aspecto, proteínas KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) ou suas porções podem ser usadas como "proteínas iscas"em um ensaio de dois híbridos ou um ensaio de três híbridos (ver, por e-xemplo, Patente U.S. No. 5,283,317; Zervos AS etal., Cell 72:223-32 (1993);Madura K etal., J. Biol. Chem. 268:12046-54 (1993); Bartel P etal., Biotech-niques 14:920-24 (1993); Iwabuchi K et al., Oncogene 8:1693-96 (1993); eWO 94/10300) para identificar outras proteínas que se ligam ou interagemcom KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) e/ou estão envolvidas em atividade deKCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Tais proteínas de ligação de KCNQ5 tambémsão prováveis de estarem envolvidas na propagação de sinais pelas proteí-nas KCNQ5 ou alvos KCNQ5 como, por exemplo, elementos à jusantes deum caminho de sinalização mediado por KCNQ5. Alternativamente, tais pro-teínas de ligação de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) podem ser inibidores deKCNQ5 ou KCNQ5(W270L).

O sistema de dois híbridos é baseado na natureza modular demaioria de fatores de trancrição, que consistem em domínios de ativação eligação de ADN separáveis. Em resumo, o ensaio utiliza duas diferentesconstruções de ADN. Em uma construção, o gene que codifica uma proteínaKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) é fundido a um gene codificando o domínio deligação de ADN de um fator de transcrição conhecido (por exemplo, GAL-4).A proteína KCNQ5 pode ser um poipeptídeo KCNQ5 que contem um domí-nio transmembrana S5-S6 de KCNQ1. Alternativamente, a proteína KCNQ5pode ser um polipeptídeo KCNQ5 que contem um domínio transmembranaS5 de KCNQ1. Na outra construção, uma seqüência de ADN, de uma biblio-teca de seqüências de ADN, que codifica uma proteína não-identificada("presa" ou "amostra") é fundida a um gene que codifica o domínio de ativa-ção do fator de transcrição conhecido. Se as proteínas "isca" e a "presa" sãocapazes de interagirem, in vivo, formando um complexo dependente deKCNQ5 ou KCNQ5(W270L), os domínios de ativação e ligação de ADN dofator de transcrição são colocados em proximidade. Esta proximidade permi-te transcrição de um gene repórter (por exemplo, LacZ) que é operavelmenteligado a um sítio regulador transcricional responsivo ao fator de transcrição.Expressão do gene repórter pode ser detectada e colônias de células con-tendo o fator de transcrição funcional podem ser isoladas e usadas para ob-ter o gene clonado que codifica a proteína que interage com a proteínaKCNQ5 ou KCNQ5(W270L).

Em um aspecto, os agentes identificados são novos análogos debloqueadores ou ativadores de canal KCNQ conhecidos. Por exemplo, emuma realização, os agentes identificados são análogos de retigabina. Emuma outra realização exemplar, os agentes identificados são análogos deXE991. Em uma realização exemplar, os agentes são novos análogos de umcomposto da fórmula:

<formula>formula see original document page 116</formula>

onde:

R1 é selecionado de hdrogênio, CrC6-alquila, C2-C6-alcanoíla ouo radical Ar;

R2 é selecionado de hidrogênio ou CrC6-alquila;

R3 é selecionado de Ci-C6-alcoxi, NH2, Ci-C6-alquil amino, Ci-C6-Clialquil amino, amino substituído com o radical Ar, CrC6-alquila, C2-C6-alquenila, C2-C6-alquinila, o radical Ar ou o radical ArO--;

R4 é selecionado de hidrogênio, CrC6-alquila ou o radical Ar;

R5 é selecionado de hidrogênio ou CrC6-alquila ou o radical Ar;

Alq é um grupo alquileno reto ou ramificado com 1-9 átomos decarbono, que também pode estar substituído com o radical Ar;

Ar é um radical fenila substituído com os radicais R6, R7 e/ou Reonde estes radicais R6, R7 e R8 são idênticos ou diferentes e representam H1Ci-C6-alquila, C3-C7-Cido alquila, hidroxi, CrC6-alcoxi, C2-C6-alcanoiloxi, ha-logênio, hidroxi, CrC6-halogênio alquila, --CN, --NH2, -NH-CrCe-alquila, --N(CrC6-alquil)2, -CO2H, -CO-Ci-C6-alquila, -CO-O--C1-C6-alquila, -COAr1 -CO--OAr, -CONH2, -CONH-CrC6-alquila, -CONÍCrCe-alquil^, -CONHAr1 --NH--C0--CrC6-alqui!a, --NHCO--Ar1 -NHCO-CrCe-alcoxi, -N-H--CO-Ar, -NHCO-NH2, -NHCO-N(-C1-C6-alquila)2, -NHCO--NHAr, -NH-S02-CrC6-alquila, -NH-SO2Ar1 -NH-S02-nitro fenila, -SO2-OH, -SO2-C1-Ce-alquila, -SO2-Ar1 ~S02-C1-C6-alcoxi, -SO2--OAr, -SO2-NH2l -S02~NH-CrC6-alquila, -S02-N(Ci-C6-alquila)2, -SO2--NHAr1 -SO2-C2-C6-alcoxi;

η é O ou 1.

Ainda um aspecto pertence a novos agentes identificados atra-vés dos ensaios descritos acima. Da mesma maneira, está dentro do escopoda presente exposição ainda usar um agente identificado como aqui descritoem um modelo animal apropriado. Por exemplo, um agente identificado co-mo aqui descrito (por exemplo, um agente de modulação deKCNQ5(W270L), um polinucleotídeo KCNQ5(W270L), um anticorpo especí-fico de KCNQ5(W270L), ou um parceiro de ligação de KCNQ5(W270L) podeser usado em um modelo animal para determinar a eficácia, toxidez, ou efei-tos colaterais de tratamento com um tal agente. Alternativamente, um agneteidentificado como aqui descrito pode ser usado em um modelo animal paradeterminar o mecanismo de ação de um tal agente. Além disso, um outroaspecto pertence a usos de novos agentes identificados através dos ensaiosdescritos acima para tratamentos como aqui descrito. 0

C. Processos de Desenho Racional de DrogaKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) e polipeptídeos de ligação deKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) podem ser usados para desenho racional dedroga de candidatos a agentes de modulação de KCNQ5. Os polipeptídeosKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) podem ser usados para cristalografia de raio-Xde proteína ou outros processos de análise de estrutura, tal como o progra-ma DOCK (ver, Kuntz ID et al., J. Mol. Biol. 161:269-88 (1982); Kuntz ID,Science 257:1078-82 (1992)) e suas variantes. Potenciais drogas terapêuti-cas podem ser desenhadas racionalmente nas bases de informação estrutu-ral assim provida.

D. Ensaios de DetecçãoPorções ou fragmentos das seqüências de ADNc aqui identifica-das (e as correspondentes seqüência de gene completo) podem ser usadosem numerosas maneiras como reagentes polinucleotídeos. Por exmeplo,estas seqüências podem ser usadas para: (i) mapear seus respectivos ge-nes sobre um cromossoma e, assim, localizar regiões de gene associadascom doença genética; (ii) identificar um indivíduo a partir de uma amostrabiológica diminuta (tipificação de tecido); e (iii) em identificação forense deuma amostra biológica.

E. Medicina Preditiva

Um outro aspecto pertence ao campo de medicina preditiva on-de ensaios diagnósticos, ensaios prognósticos, e experimentos clínicos demonitoração são usados para propósitos prognósticos (preditivos) para peloque tratar profilaticamente um indivíduo. Da mesma maneira, um aspectorefere-se a ensaios diagnósticos para determinação de expressão de ácidonucléico e/ou proteína KGNQ5 ou KCNQ5(W270L) assim como atividade deKCNQ5 ou KCNQ5(W270L), no contexto de uma amostra biológica (por e-xemplo, sangue, soro, células, tecido (preferivelmente o cérebro, músculo deesqueleto, ou bexiga urinária)) para pelo que determinar se o indivíduo estáafligido com uma doença ou distúrbio, ou está em risco de desenvolver umdistúrbio, associado com expressão ou atividade aberrante de KCNQ5. Ain-da um aspecto provê ensaios prognósticos (ou preditivos) para determinação/ de se um indivíduo está em risco de desenvolver um distúrbio associadocom expressão ou atividade de ácido nucléico ou proteína KCNQ5. Por e-xemplo, mutações em um gene KCNQ5 podem ser ensaiadas em uma a -mostra biológica. Tais ensaios podem ser usados para propósito prognósticoou preditivo para pelo que tratar profilaticamente um indivíduo antes do iníciode um distúrbio caracterizado por ou associado com expressão ou atividadede ácido nucléico ou proteína KCNQ5.

Um outro aspecto pertence a monitoração de influência de agen-tes (por exemplo, drogas, compostos) sobre a expressão ou atividade deKCNQ5 em experimentos clínicos.

Estes e outros agentes são descritos ainda em detalhes nas se-ções seguintes.1. Ensaios Diagnósticos

Um processo exemplar para detecção de presença ou ausênciade proteína ou ácido nucléico KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) em uma amostrabiológica envolve obtenção de uma amostra biológica de um sujeito teste econtato de amostra biológica com um composto ou agente capaz de detectarproteína ou ácido nucléico KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) (por eemplo, ARNm1ADN genômico) que codifica proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) de modoque a presença de proteína ou ácido nucléico KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) édetectada na amostra biológica. Um agente preferido para detecção deARNm ou ADN genômico KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) é uma sonda de ácidonucléico marcada capaz de hibridizar para ARNm ou ADN genômico KCNQ5ou KCNQ5(W270L). A sonda de ácido nucléico pode ser, por exemplo, umácido nucléico KCNQ5(W270L), tal como o ácido nucléico de SEQ ID NO: 1,ou uma sua porção, tal como um oligonucleotídeo de pelo menos 12, 15, 30,50, 100, 250, 500 ou mais nucleotídeos em comprimento e suficiente parahibridizar especificamente sob condições rigorosas para ARNm ou ADN ge-nômico de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Outras sondas apropriadas para usonos ensaios diagnósticos são aqui descritas.

Um agnete preferido para detecção de proteína KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) é um anticorpo capaz de ligação a proteína KCNQ5 ouKCNQ5(W270L), preferivelmente um anticorpo com um marcador detectável.Anticorpos podem ser policlonais, ou mais preferivelmente, monoclonais. Umanticorpo intacto, ou um seu fragmento (por exemplo, Fab ou F(ab')2) podeser usado. O termo "marcado", com relação à sonda ou anticorpo, é preten-dido abranger marcação direta da sonda ou anticorpo através de acoplamen-to (isto é, ligação física) de uma substância detectável à sonda ou anticorpo,assim como marcação indireta da sonda ou anticorpo através de reatividadecom um outro reagente que é diretamente marcado. Exemplos de marcaçãoindireta incluem detecção de um anticorpo primário usando um anticorposecundário marcado fluorescentemente e marcação de extremidade de umasonda de ADN com biotina de modo que ela possa ser detectada com strep-tavidina marcada fluorescentemente. O termo "amostra biológica" é preten-dido incluir tecidos, células, e fluidos biológicos isolados de um sujeito, assimcomo tecidos, células (preferivelmente cérebro, músculo de esqueleto, oubexiga urinária), e fluidos presentes dentro de um sujeito; ou seja, o proces-so de detecção pode ser usado para detectar ARNm, proteína ou ADN ge-nômico KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) em uma amostra biológica in vitro assimcomo in vivo. Por exemplo, técnicas in vitro para detecção de ARNm KCNQ5ou KCNQ5(W270L) incluem hibridizações Northern e hibridizações in situ.

Técnicas in vitro para detecção de proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) in-cluem ELISAs, Western blots, imunoprecipitação, e imunofluorescência.Técnicas in vitro para detecção de ADN genômico KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) incluem hibridizações Southern. Além disso, técnicas in vivopara detecção de proteína KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) incluem introduçãoem um sujeito de um anticorpo anti-KCNQ5 ou anti-KCNQ5(W270L) marca-do. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado com um marcador radioativocuja presença e localização em um sujeito podem ser detectadas através detécnicas padrões de formação de imagem.

Em uma realização, a amostra biológica contem moléculas deproteína do sujeito teste. Alternativamente, a amostra biológica pode contermoléculas de ARNm do sujeito teste ou moléculas de ADN genômico do su-jeito teste. Uma amostra biológica preferida é uma amostra de cérebro oubexiga urinária isolada através de meios padrões a partir de um sujeito.

Em uma outra realização, os processos ainda envolvem obten-ção de uma amostra biológica controle a partir de um sujeito, contato de a -mostra controle com um composto ou agente capaz de detectar proteína,ARNm, ou ADN genômico KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), de modo que a pre-sença de proteína, ARNm, ou ADN genômico KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) édetectada na amostra biológica, e comparação de presença de proteína,ARNm ou ADN genômico de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) na amostra contro-le com a presença de proteína, ARNm ou ADN genômico de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) na amostra teste.

Um aspecto também abrange kits para detecção de presença deKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) em uma amostra biológica. Por exemplo, o kitpode compreender um composto ou agnete marcado capaz de detecção deproteína ou ARNm KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) em uma amostra biológica;meios para determinação de quantidade de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) naamostra; e meios para comparação de quantidade de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) na amostra com um padrão. O composto ou agente podeser embalado em um recipiente apropriado. O kit ainda pode compreenderinstruções para uso do kit para detectar proteína ou ácido nucléico KCNQ5ou KCNQ5(W270L).

2. Ensaios Prognósticos

Os processos diagnósticos aqui descritos além disso podem serutilizados para identificação de sujeitos tendo ou em risco de desenvolveruma doença ou distúrbio associada com expressão ou atividade aberrantede KCNQ5. Por exemplo, os ensaios aqui descritos, tais como os ensaiosdiagnósticos anteriores ou os ensaios seguintes, podem ser utilizados paraidentificar um sujeito tendo ou em risco de desenvolver um distúrbio associ-ado com expressão ou atividade de proteína ou ácido nucléico KCNQ5. As-sim, ainda um aspecto prúvê um processo para identificçaão de uma doençaou distúrbio associada com expressão ou atividade aberrante de KCNQ5onde uma amostra teste é obtida de um sujeito e proteína ou ácido nucléico(por exemplo, ARNm, ADN genômico) de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) é de-tectado, onde a presença de proteína ou ácido nucléico KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) é diagnostica para um sujeito tendo ou em risco de desen-volver uma doença ou distúrbio associado com expressão ou atividade aber-rante de KCNQ5. Como aqui usado, uma "amostra teste" refere-se a u aamostra biológica obtida de um sujeito de interesse. Por exemplo, uma a-mostra teste pode ser um fluido biológico (por exmeplo, soro), amostra decélula, ou tecido.

Além disso, os ensaios prognósticos aqui descritos podem serusados para determinar se um sujeito pode ser administrado com um agente(por exemplo, um agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, peptí-deo, ácido nucléico, molécula pequena, ou outro candidato a droga) paratratar uma doença ou distúrbio associado com expressão ou atividade aber-rante de KCNQ5. Assim, um outro aspecto provê processos para determinarse um sujeito pode ser efetivamente tratado com um agente para um distúr-bio associado com expressão ou atividade aberrante de KCNQ5 onde umaamostra teste é obtida e expressão ou atividade de proteína ou ácido nucléi-co KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) é detectada (por exemplo, onde a abundân-cia de expressão ou atividade de proteína ou ácido nucléico KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) é diagnostica para um sujeito que pode ser administradocom o agente para tratar um distúrbio associado com expressão ou atividadeaberrante de KCNQ5).

Os processos também podem ser usados para detecção de alte-rações genéticas em um gene KCNQ5, pelo que determinando se um sujeitocom o gene alterado está em risco para um distúrbio associado com o geneKCNQ5. Em realizações preferidas, o processos incluem detecção, em umaamostra de células do sujeito, a presença ou aus~encia de uma alteraçãogenética caracterizada por pelo menos uma de uma alteração afetando aintegridade de um gene codificando uma proteína KCNQ5 ou a expressãoerrônea do gene KCNQ5. Por exemplo, tais alterações genéticas podem serdetectadas por verificação de existência de pelo menos uma de 1) uma su-pressão de um ou mais nucleotídeos de um gene KCNQ5; 2) uma adição deum ou mais nucleotídeos a um gene KCNQ5; 3) uma substituição de um oumais nucleotídeos de um gene KCNQ5; 4) um rearranjo cromossômico deum gene KCNQ5; 5) uma alteração no nível de transcrito de ARN mensagei-ro de um gene KCNQ5; 6) modificação aberrante de um gene KCNQ5, talcomo o padrão de metilação do ADN genômico; 7) a presença de um padrãode união tipo não-selvagem de um transcrito de ARN mensageiro de um ge-ne KCNQ5; 8) um nível tipo não-selvagem de uma proteína KCNQ5; 9) per-da alélica de um gene KCNQ5; e 10) modificação pós-traducional imprópriade uma proteína KCNQ5. Como aqui descrito, existe um grande número detde ensaio conhecidas que podem ser usadas para detecção de alteraçõesem um gene KCNQ5. Uma amostra biológica preferida é uma amostra detecido isolada através de meios padrões a partir de um sujeito, por exemplo,uma amostra de cérebro, ou bexiga urinária. A detecção pode ser realizadacom pelo menos um de uma sonda ou um iniciador compreendendo pelomenos 12 nucleotídeos contíguos a partir de um polinucleotídeo KCNQ5.Preferivelmente, o polinucleotídeo KCNQ5 codifica todo ou uma porção deum polipeptídeo KCNQ5(W270L), codifica um polipeptídeo KCNQ5 contendoum domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1, ou codifica um polipeptídeoKCNQ5 contendo um domínio transmembrana S5 de KCNQ1.-Ma.is preferi-velmente, a sonda ou iniciador compreende pelo menos 12 nucleotídeoscontíguos de SEQ ID NO: 1 incluindo nucleotídeos 808-810.

Em certas realizações, detecção da alteração envolve o uso deuma sonda / iniciador em PCR (ver, por exemplo, patente U.S. 4 683 195 e 4683 202), tal como PCR âncora ou RACE PCR, ou, alternativamente,emuma reação de cadeia de ligação (LCR) (ver, por exemplo, Landegren U etal., Science 241:1077-80 (1988); Nakazawa H et al., Proc. Natl. Acad. Sei.USA 91:360-64 (1994)), a última das quais pode ser particularmente útil paradetecção de mutações de ponto no gene KCNQ5 (ver, por exemplo, Abrava-ya K et al., Nucleic Acids Res. 23:675-82 (1995)). Este processo pode incluiras etapas de coleta de uma amostra de células de um paciente, isolamentode ácido nucléico (por exemplo, genômico, ARNm, ou ambos) a partir dascélulas da amostra, contato de amostra de ácido nucléico com um ou maisiniciadores que hibridizam especificamente para um gene KCNQ5 sob con-dições tais que hibridização e amplificação do gene KCNQ5 (se presente)ocorrem, e detecção de presença ou ausência de um produto de amplifica-ção, ou detecção de tamanho do produto de amplificação e comparação decomprimento a uma amostra controle. É antecipado que PCR e/ou LCR po-de ser desejável para uso como uma etapa de amplificação preliminar emconjunção com qualquer uma das técnicas usadas para detecção de muta-ções aqui descritas.

Processos de amplificação alternativos incluem, por exemplo,replicação de seqüência auto - sustentada (Guatelli JC et al., Proc. Natl. A-cad. Sei. USA 87:1874-78 (1990)), transcriptional amplification system (KwohDY et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:1173-77 (1989)), Q-Beta Replicase(Lizardi PM et al., Biotechnology (N.Y.) 6:1197 (1988)), ou qualquer outroprocesso de amplificação de ácido nucléico, seguido por detecção das molé-culas amplificadas usando técnicas bem conhecidas por aqueles versadosna técnica. Estes esquemas de detecção são especialmente úteis para adetecção de moléculas de ácido nucléico se tais moléculas estão presentesem números muito baixos.

Em uma realização alternativa, mutações em um gene KCNQ5de uma amostra de células pode ser identificado através de alterações empadrões de clivagem de enzima de restrição. Por exemplo, amostra e ADNcontrole são isolados, amplificados (opcionalmente), digeridos com uma oumais endonucleases de restrição, e tamanhos de comprimento de fragmentosão determinados por eletroforese de gel e comparados. Diferenças em ta-manhos de comprimento de fragmento entre amostra e ADN controle indi-cam mutações no ADN amostra. Além disso, ribozimas específicas de se-qüência (ver, por exemplo, patente U.S 5 498 531) podem ser usadas paraclassificar a presença de específicas mutações através de desenvolvimentoou perda de um sítio de clivagem de ribozima.

Em outras realizações, mutações genéticas em KCNQ5 podemser identificadas através de hibridização de uma amostra e ácidos nucléicoscontroles, por exemplo, ADN ou ARN, para arranjos de alta densidade con-tendo centenas ou milhares de sondas de oligonucleotídeos (Cronin MT etal., Hum. Mutat. 7:244-55 (1996); Kozal MJ et al., Nat. Med. 2:753-59(1996)). Por exemplo, mutações genéticas em KCNQ5 podem ser identifica-das em arranjos bidimensionais contendo sondas ADN geradas com luz co-mo descrito em Cronin MT et al. (supra). Resumidamente, um primeiro ar-ranjo de hibridização de sondas pode ser usado para exploração através delongos estiramentos de ADN em uma amostra e controle para identificaçãode mudanças de bases entre as seqüências através de fabricação de arran-jos lineares de sondas de sobreposição seqüencial. Esta etapa permite aidentificação de mutações de ponto. Esta etapa é seguida por um segundoarranjo de hibridização que permite a caracterização de específicas muta-ções através do uso de arranjos de sondas especializados, menores, com-plementares para todas as variantes ou mutações detectadas. Cada arranjode mutação é composto por conjuntos de sondas paralelas, um complemen-tar para o gene tipo selvagem e o outro complementar para o gene mutante.

Ainda em uma outra realização, qualquer uma de uma variedadede reações de seqüenciamento conhecidas na técnica pode ser usada paraseqüenciar diretamente o gene KCNQ5 e detectar mutações através decomparação de seqü-encia da amostra de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) coma correspondente seqüência tipo selvagem (controle). Exemplos de reaçõesde seqüenciamento incluem aquelas baseadas em técnicas desenvolvidaspor Maxam AM e Gilbert W., Proc. Natl. Acad. Ci. USA 74:560-64 (1977) ouSanger F et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463-67 (1977). Também écontemplado que qualquer um de uma variedade de procedimentos de se-qüenciamento pode ser utilizado quando realizando os ensaios diagnósticos(ver, por exemplo,, Naeve CW et al., Biotechniques 19:448-53 (1995)), inclu-indo seqüenciamento através de espectrometria de massa (ver, por exem-pio, Naeve CW et al., Biotechniques 19:448-53 (1995)), incluindo seqüenci-amento por espectrometria de massa (ver, por exemplo, WO 94/16101; Co-hen AS et al., Adv. Chromatogr. 36:127-62 (1996); and Griffin HG and GriffinAM, Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-59 (1993)).

Outros processos para detecção de mutações no gene KCNQ5incluem processos nos quais proteção a partir de agentes de clivagem é u-sada para detectar bases desemparelhadas em hetero - duplexes ARN /ARN ou ARN / ADN (Myers RM et al., Science 230:1242-46 (1985)). Em ge-ral, a técnica de "clivagem de desemparelhamento" começa através de pro-vimento de hetero - duplexes formados através de hibridização de ARN ouADN (marcados) contendo a seqüência KCNQ5 tipo - selvagem com ARN ouADN potencialmente mutante obtido de uma amostra de tecido. Os duplexesde fita dupla são tratados com um agente que cliva regiões de fita simples doduplex tais como as que existirão devido a desemparelhamento de pares debases entre as fitas de amostra e controle. Por exemplo, duplexes de ARN /ADN podem ser tratados com RNase e híbridos ADN / ADN tratados com S1nuclease para digerir enzimaticamente as regiões desemparelhadas. Emoutras realizações, duplexes ADN / ADN ou ARN / ADN podem ser tratadoscom hidroxilamina ou teróxido de ósmio e com piperidina de modo a digerirregiões desemparelhadas. Após digestão das regiões desemparelhadas, omaterial resultante é então separado por tamanho sobre géis de poliacrila-mida desnaturantes para determinar o sítio de mutação (ver, por exemplo,Cotton RGH et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:4397-4401 (1988); SaleebaJA and Cotton RGH, Meth. Enzymol. 217:286-95 (1993)). Em uma realizaçãopreferida, o ADN ou ARN controle pode ser marcado para detecção. Aindaem uma outra realização, a reação de clivagem de desemparelhamento em-prega uma ou mais proteínas que reconhecem pares de bases desempare-lhados em ADN de fita dupla (as assim chamadas enzimas de "reparo dedesemparelhamento de ADN") em sistemas definidos para detecção e ma-peamento de mutações de ponto em KCNQ5 obtido de amostras de células.Por exemplo, a enzima mutY de E.coli cliva A em desemparelhamentos G/Ae a timidina ADN glicosilase de células HeLa cliva T em desemparelhamen-tos G/T (Hsu IC et al., Carcinogenesis 15:1657-62 (1994)). De acordo comuma realização exemplar, uma sonda baseada em uma seqüênciaKCNQ5(W270L), por exemplo, SEQ ID NO: 1, é hibridizada para um ADNcou outro produto ADN a partir de uma célula(s) teste. O duplex é tratado comuma enzima de reparo de desemparelhamento de ADN, e os produtos declivagem, se algum, podem ser detectados a partir de protocolos de eletrofo-rese ou semelhantes (ver, por exemplo, patente U.S. 5 459 039).

Em outras realizações, alterações em mobilidade eletroforéticaserão usadas para identificar mutações em genes KCNQ5. Por exmeplo,polimorfismo de conformação de fita simples (SSCP) pode ser usado paradetectar diferenças em mobilidade eletroforética entre ácidos nucléicos mu·tantes e tipos selvagens (Orita M et al., Proc Natl. Acad. Sci USA: 86:2766-70 (1989); see also, Cotton RGH, Mutat. Res. 285:125-44 (1993); Hayashi K,Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79 (1992)). Fragmentos de ADN de ácidosnucléicos KCNQ5 controle e KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) amostras serãodesnaturados e deixados renaturar. A estrutura secundária de ácidos nucléi-cos de fita simples varia de acordo com seqüência; a resultante alteração emmobilidade eletroforética permite a detecção de mesmo uma simples mu-dança de base. Os fragmentos de ADN podem ser marcados ou detectadoscom sondas marcadas. A sensitividade do ensaio pode ser aperfeiçoada a-través de uso de ARN (antes que ADN), onde a estrutura secundária é maissensível a uma mudança em seqüência. Em uma realização preferida, opresente processo utiliza análise de heteroduplex para separar moléculas deheteroduplex de fita dupla nas bases de mudanças em mobilidade eletroforé-tica (Keen J et al., Trends Genet. 7:5 (1991)).

Ainda em uma outra realização, o movimento de fragmentos mu-tantes ou tipos selvagens em géis de poliacrilamida contendo um gradientede desnaturante é avaliado usando eletroforese de gel de gradiente desnatu-rante (DGGE) ((Myers RM et al., Nature 313:495-98 (1985)). Quando DGGEé usado como o processo de análise, ADN será modificado para assegurarque ele não desnature completamente, por exemplo, através de adição deum grampo GC de aproximadamente 40 pb de ADN rico em GC de alta fu-são através de PCR. Ainda em uma realização, um gradiente de temperaturaé usado no lugar de um gradiente de desnaturação para identificação de di-ferenças na mobilidade dê ADN controle e amostra (Rosenbaum V and Ri-esner D, Biophys. Chem. 26:235-46 (1987)).

Exemplos de outras técnicas para detecção de mutação de pon-to incluem, mas não são limitadas a, hibrídização de oligonucleotídeo seleti-va, amplificação seletiva, ou extensão de primer seletiva. Por exemplo, pri-mers oligonucleotídeos podem ser preparados nos quais a mutação conhe-cida é colocada centralmente e então hibridizada para ADN alvo sob condi-ções que permitem hibrídização somente se um perfeito emparelhamento éverificado (Saiki RK et al., Nature 324:163-66 (1986); Saiki RK et al., Proc.Natl. Acad. Sei. USA 86:6230-34 (1989)). Tais oligonucleotídeos específicosde alelo são hibridizados para ADN alvo amplificado por PCR ou um númerode diferentes mutações quando os oligonucleotídeos são ligados à membra-na hibridizante e hibridizados com ARN alvo marcado.

Alternativamente, tecnologia de amplificação específica de aleloque depende de amplificação PCR seletiva pode ser usada em conjunçãocom as composições e processos mostrados. Oligonucleotídeos usados co-mo iniciadores para amplificação específica podem transportar a mutação deinteresse no centro da molécula (de modo que amplificação depende de hi-bridização diferencial) (Gibbs RA et al., Nucleic Acid Res. 17:2437-48(1989)) ou na extremidade 3' extrema de um iniciador onde, sob condiçõesapropriadas, desemparelhamento pode prevenir, ou reduzir extensão de po-Iimerase (Prosser J, Trends Biotechnol. 11:238-46 (1993)). Em adição, podeser desejável introduzir-se um novo sítio de restrição na região da mutaçãopara criar detecção baseada em clivagem (Gasparini P et al., Mol. Cell. Pro-bes 6:1-7 (1992)). É antecipado que em certas realizações amplificaçãotambém pode ser realizada usando Taq Iigase para amplificação (Barany F,Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189-93 (1991)). Em tais casos, ligação somen-te ocorrerá se existir um perfeito emparelhamento na extremidade 3' da se-qüência 5' tornando possível detectar a presença de uma mutação conheci-da em um sítio específico através de procura pela presença ou ausência deamplificação.

Os processos aqui descritos podem ser realizados, por exmeplo,através de utilização de kits diagnósticos pré-embalados compreendendopleo menos um ácido nucléico sonda ou reagente anticorpo aqui descrito,que pode ser convenientemente usado, por exemplo, em instalações clínicaspara diagnóstico de pacientes exibindo sintomas ou história familiar de uma' doença envolvendo um gene KCNQ5.

Além disso, qualquer tipo de célula ou tecido no qual KCNQ5seja expresso pode ser utilizado nos ensaios prognósticos aqui descritos.VI. Administração de Agentes de Modulação de KCNQ5Agentes de modulação de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) são ad-ministrados aos sujeitos em uma forma biologicamente compatível apropria-da para administração farmacêutica in vivo para tratar, por exemplo, condi-ções descritas em seção V, supra. Por "forma biologicamente compatívelapropriada para administração in vivo" é pretendida uma forma da proteína aser administrada na qual quaisquer efeitos tóxicos são superados pelos efei-tos terapêuticos da proteína. O termo "sujeito" é pretendido incluir organis-mos vivos nos quais uma resposta imuno pode ser elicitada, por exemplo,mamíferos. Administração de um agente como aqui descrito pode ser emqualquer forma farmacológica incluindo uma quantidade terapeuticamenteativa de um agente sozinho ou em combinação com um carreador farmaceu-ticamente aceitável.

Administração de uma quantidade terapeuticamente ativa dascomposições terapêuticas é definida como uma quantidade efetiva, em do-sagens e por períodos de tempo necessários para obtenção de resultadodesejado. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente ativa de um agen-te de modulação de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) pode variar de acordo comfatores tais como o estado de doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e ahabilidade de peptídeo elicitar uma desejada resposta no indivíduo. Regimede dosagem pode ser ajustado para prover a ótima resposta terapêutica. Porexemplo, várias doses divididas podem ser administradas diariamente, ou adose pode ser proporcionalmente reduzida quando indicado pelas exigên-cias da situação terapêutica..

As composições terapêuticas ou farmacêuticas podem ser admi-nistradas através de qualquer rota apropriada conhecida na técnica incluin-do, por exmeplo, administração intravenosa, subcutânea, intramuscular,transdérmica, intratecal ou intracerebral ou administração a células em pro-tocolos de tratamento éx vivo. Administração pode ser rápida como atravésde injeção ou sobre um período de tempo como através de infusão lenta ouadministração de formulação de liberação lenta.

KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) também pode ser ligado ou conju-gado com agentes que proporcionam desejáveis propriedades farmacêuticasou fármaco - cinéticas. Por exemplo, KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) pode seracoplado a qualquer substância conhecida na técnica para promover pene-tração ou transporte através de barreira de sangue - cérebro tal como umanticorpo para o receptor de transferrina, e administrado através de injeçãointravenosa (ver, por exemplo, Friden PM et al., Science 259:373-77 (1993)).Além disso, KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) pode ser estavelmente ligado a umpolímero tal como polietileno glicol para obter desejáveis propriedades desolubilidade, estabilidade, meia- vida, e outras propriedades farmacêutica-mente vantajosas (ver, por exemplo, Davis et al., Enzyme Eng. 4:169-73(1978); Burnham NL1 Am. J. Hosp. Pharm. 51:210-18 (1994)).

Além disso, um polipeptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) podeestar em uma composição que auxilia em liberação no citosol de uma célula.

Por exemplo, o peptídeo pode ser conjugado com uma metade carreadoratal como uma Iipossoma que é capaz de liberar o peptídeo no citosol de umacélula. Tais processos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo,Amselem S et al., Chem. Phys. Lipids 64:219-37 (1993)). Alternativamente,um polipeptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) pode ser modificado para incluirespecíficos peptídeos trânsito ou fundidos a tais peptídeos trânsito que sãocapazes de liberarem seu polipeptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) em umacélula. Em adição, o polipeptídeo pode ser liberado diretamente em uma cé-lula através de microinjeção.

As composições são usualmente empregadas na forma de pre-parações farmacêuticas. Tais preparações são fabricadas em uma maneirabem conhecida na técnica farmacêutica. Uma preparação preferida utilizaum veículo de solução salina fisiológica, mas é contemplado que outros car-readores farmaceuticamente aceitáveis tais como concentrações fisiológicasde outros sais não-tóxicos, solução aquosa cinco porcento de glicose, águaestéril, ou semelhantes também podem ser usados. Como aqui usado, "car-reador farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes,meios de dispersão, revestimentos, agentes anti-bactérias e anti - fungos,agentes isotônicos e de retardo de absorção, e semelhantes. O uso de taismeios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conheci-do na técnica. Exceto tanto quanto quaisquer meios padrões ou agente se-jam incompatíveis com o composto ativo, seu uso nas composições terapêu-ticas é contemplado. Compostos ativos suplementares também podem serincorporados nas composições. Também pode ser desejável que um apro-priado tampão esteja presente na composição. Tais soluções podem, se de-sejado, ser Iiofilizadas em uma ampola estéril pronta para reconstituição a-través de adição de água estéril para fácil injeção. O solvente primário podeser aquoso ou alternativamente não-aquoso. KCNQ5 ou KCNQ5(W270L)também pode ser incorporado a uma matriz compatível biologicamente sóli-da ou semi - sólida que pode ser implantada em tecidos requerendo trata-mento.

O carreador também pode conter outros excipientes farmaceuti-camente aceitáveis para modificação ou manutenção de pH, osmolalidade,viscosidade, claridade, cor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução, ouodor da formulação. Similarmente, o carreador pode conter ainda outros ex-cipientes farmaceuticamente aceitável para modificação ou manutenção deliberação ou absorção ou penetração através de barreira de sangue - cére-bro. Tais excipientes são aquelas substâncias usual e costumeiramente em-pregadas para formulação de dosagens para administração parenteral emdosagem unitária ou forma de dosagem múltipla ou para infusão direta atra-vés de infusão contínua ou periódica.

Administração de dose pode ser repetida dependendo dos pa-râmetros fármaco - cinéticos da formulação de dosagem e a rota de adminis-tração usada.

É também provido que certas formulações contendo um polipep-tídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) ou seu fragmento são para serem adminis-tradas oralmente. Tais formulações são preferivelmente encapsuladas eformuladas com apropriados carreadores em formas de dosagem sólida.Alguns exemplos de apropriados carreadores, excipientes, e diluentes inclu-em lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, manitol, amidos, goma acácia, fosfa-to de cálcio, alginatos, silicato de cálcio, celulose micro - cristalina, polivinilpirrolidona, celulose, gelatina, xarope, metil celulose, hidroxi benzoato demetila e propila, talco, magnésio, estearato, água, óleo mineral, e semelhan-tes. As formulações adicionalmente podem incluir agentes lubrificantes, a-gentes umectantes, agentes emulsificantes e de suspensão, agentes preser-vativos, agentes adoçantes, ou agentes aromatizantes. As composições po-dem ser formuladas de modo a proverem liberação rápida, sustentada, ouretardada dos ingredientes ativos após administração ao paciente através deemprego de procedimentos bem conhecidos na técnica. As formulaçõestambém podem conter substâncias que diminuem degradação proteolíticae/ou substâncias que promovem absorção tais como, por exemplo, agentestensoativos.

É especialmente vantajoso formular composições parenteraisem forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformi-dade de dosagem. Forma unitária de dosagem como aqui usado refere-se aunidades fisicamente discretas apropriadas como dosagens unitárias para ossujeitos mamíferos a serem tratados; cada unidade contendo uma quantida-de predeterminada de composto ativo calculada para produzir o desejadoefeito terapêutico em associação com o requerido carreador farmacêutico. Aespecificação para as formas unitárias de dosagem é ditada por e direta-mente dependente de (a) as características únicas do composto ativo e oparticular efeito terapêutico a ser obtido e (b) as lãs limitações inerentes natécnica de composição de um tal composto ativo para o tratamento de sensi-tividade em indivíduos. A específica dose pode ser facilmente calculada poraqueles versados na técnica, por exemplo, de acordo com peso de corpoaproximado ou área de superfície do paciente ou o volume de espaço docorpo a ser ocupado. A dose também será calculada dependente da particu-lar rota de administração selecionada. Ainda refinamento dos cálculos ne-cessários para determinar a dosagem aproximada para tratamento é tornadorotineiro por aqueles versados na técnica. Tais cálculos podem ser feitossem indevida experimentação por aqueles versados na técnica à luz da ati-vidade aqui mostrada em preparações ensaios de células alvos. Dosagensexatas são determinadas em conjunção com estudos padrões de dose - res-posta. Será entendido que a quantidade da composição realmente adminis-trada será determinada por um praticante, à luz das circunstâncias relevan-tes incluindo a condição ou condições a serem tratadas; a escolha de com-posição a ser administrada; a idade, peso e resposta do paciente individual;a severidade dos sintomas do paciente; e a rota de administração escolhida.

Toxidez e eficácia terapêutica de tais compostos podem ser de-terminadas através de procedimentos farmacêuticos padrões em culturas decélulas ou animais experimentais, por exemplo, para determinação da LD50(a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamenteefetiva em 50% da população). A rzão de dose entre efeitos tóxicos e tera-pêuticos é o índice terapêutico e ele pode ser expresso como a razãoLD50/ED50. Compostos que exibem grandes índices terapêuticos são prefe-ridos. Embora compostos que exibem efeitos colaterais tóxicos possam serusados, deve ser tomado cuidado para desenho de um sistema de liberaçãoque alveja tais compostos para o sítio de tecido afetado de modo a minimizarpotencial dano para células não-afetadas e, pelo que, reduzir efeitos colaterais.

Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura de células e es-tudos animais podem ser usados em formulação de uma faixa de dosagempara uso em humanos. A dosagem de tais compostos cai preferivelmentedentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 compequena ou nenhuma toxidez. A dosagem pode variar dentro desta faixadependendo da forma de dosagem empregada e a rota de administraçãoutilizada. Para qualquer composto usado nos processos aqui mostrados, adose terapeuticamente efetiva pode ser inicialmente estimada a partir deensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelosanimais para obtenção de uma faixa de concentração de plasma circulanteque inclui a IC50 (isto é, a concentração do composto teste que obtém umainibição meio - máxima de sintomas) como determinado em cultura de célu-las. Tal informação pode ser usada para determinação mais precisa de do-ses úteis em humanos. Níveis em plasma podem ser medidos, por exemplo,através de cromatografia líquida de alta performance.

Em uma realização, um polipeptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L)pode ser terapeuticamente administrado através de implante em pacientesde vetores ou células capazes de produzirem uma forma biologicamente ati-va de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) ou um precursor de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L), ou seja, uma molécula que pode ser facilmente convertidaem uma forma biológica ativa de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) pelo corpo.

Em uma abordagem, células que secretam KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) podem ser encapsuladas em mebranas semi - permeáveispara implante em um paciente. As células podem ser células que expressamnormalmente KCNQ5 ou um seu precursor ou as células podem ser trans-formadas para expressarem KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) ou um seu frag-mento biologicamente ativo ou um seu precursor. É preferido que a célulaseja de origem humana. Entretanto, as formulações e processos aqui podemser usados para aplicações veterinárias assim como humanas e o termo"paciente " ou "sujeito" como aqui usado é pretendido incluir pacientes hu-manos e veterinários.

Monitoração de influência de agentes (por exemplo, drogas oucompostos) sobre a expressão ou atividade de uma proteína KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) pode ser aplicada não somente em seleção de droga bási-ca, mas também em experimentos clínicos. Por exemplo, a eficácia de umagente determinada através de um ensaio de seleção como aqui descritopara aumentar expressão de gene KCNQ5, níveis de proteínas, ou atividadede KCNQ5 regulada ascendentemente pode ser monitorada em experimen-tos clínicos de sujeitos exibindo diminuída expressão de gene KCNQ5, ní-veis de proteína, ou atividade de KCNQ5 regulada descendentemente. Al-ternativamente, a eficácia de um agente determinada por um ensaio de sele-ção para diminuir expressão de gene KCNQ5, níveis de proteína, ou regulardescendentemente atividade de KGNQ5 pode ser monitorada em experi-mentos clínicos de sujeitos exibindo aumentada expressão de gene KCNQ5,níveis de proteína ou atividade de KCNQ5 regulada ascendentemente. Emtais experimentos clínicos, a expressão ou atividade de um gene KCNQ5, epreferivelmente, outros genes que foi implicada em um distúrbio, pode serusada como uma "leitura" ou marcadores do fenótipo de uma particular célu-la.

Por exemplo, e não por limitação, genes, incluindo, KCNQ5, quesão modulados em células através de tratamento com um agente (por e-xemplo, composto, droga, ou molécula pequena) que modula atividadeKCNQ5 (por exmeplo, identificado em um ensaio de seleção como aqui des-crito) podem ser identificados. Assim, para estudar o efeito de agentes sobreum distúrbio associado com KCNQ5, por exemplo, em um experimento clíni-co, células podem ser isoladas e ARN preparado e analisado para os níveisde expressão de KCNQ5 e outros genes implicados no distúrbio associadocom KCNQ5, respectivamente. Os níveis de expressão de gene (isto é, umpadrão de expressão de gene) podem ser quantificados através de análisesde Northern blot ou RT-PCR, como aqui descrito, ou alternativamente atra-vés de medição de quantidade de proteína produzida, através de um dosprocessos como aqui descritos, ou através de medição de níveis de ativida-de de KCNQ5 ou outros genes. Desta maneira, o padrão de expressão degene pode servir como um marcador, indicativo da resposta fisiológica dascélulas para o agente. Da mesma maneira, este estado de resposta pode serdeterminado antes, e em vários pontos durante, tratamento do indivíduo como agente.

Uma realização preferida provê um processo para monitoraçãode eficácia de tratamento de um sujeito com um agente (por exemplo, umagonista, antagonista, peptidomimético, proteína, peptídeo, ácido nucléico,molécula pequena, ou outro candidato a droga identificado pelos ensaios deseleção aqui descritos) compreendendo as etapas de (i) obtenção de umaamostra de pré-administração a partir de um sujeito antes de administraçãodo agente; (ii) deteção de nível de expressão de uma proteína, ARNm ouADN genômico de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) na amostra de pré-administração; (iii) obtenção de uma ou mais amostras de pós-administraçãoa partir do sujeito; (iv) detecção de nível de expressão ou atividade da prote-ína, ARNm ou ADN genômico de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) nas amostrasde pós-administração; (v) comparação de nível de expressão ou atividade daproteína, ARNm ou ADN genômico de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) na amos-tra de pré-administração com a proteína, ARNm ou ADN genômico deKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) na amostra ou amostras de pós-administração;e (vi) alteração de administração do agente para o sujeito da mesma manei-ra. Por exemplo, aumentada administração do agnete pode ser desejávelpara aumentar a expressão ou atividade de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) paraníveis maiores que o detectado, ou seja, para aumentar a eficacia do agen-te. Alternativamente, diminuída administração do agente pode ser desejávelpara diminuir expressão ou atividade de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) paraníveis menores do que detectado, ou seja, para diminuir a eficácia do agen-te. De acordo com uma tal realização, expressão ou atividade de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) pode ser usada como um indicador da eficácia de um agen-te, mesmo na ausência de uma resposta fenotípica observável.

Em uma realização preferida, a habilidade de um agente de mo-dulação de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) para modular, por exemplo, condi-ções descritas na seção V (supra) em um sujeito que podem se beneficiar demodulação da expressão e/ou atividade de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) po-dem ser medidas através de detecção de um aperfeiçoamento na condiçãodo paciente após a administração do agente. Tal aperfeiçoamento pode serfacilmente medido por aqueles versados na técnica usando indicadores a-propriados para a específica condição do paciente. Monitoração da respostado paciente através de medição de mudanças na condição do paciente épreferida em situações onde a coleta de materiais de biópsia pode possuirum aumentado risco e/ou prejuízo para o paciente.

É provável que o nível de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) possa seralterado em uma variedade de condições e que quantificação de níveis deKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) possa prover informação clinicamente útil.

Além disso, no tratamento de condições de doença, composi-ções contendo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) podem ser administradas exoge-namente, e pode serr provavelmente desejável obter-se certos níveis alvosde polipeptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) em soro, em qualquer compar-timento de tecido desejado, ou no tecido afetado. Por isso, pode ser vantajo-so ser capaz de monitorar os níveis de polipeptídeo KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) em um paciente ou em uma amostra biológica incluindouma amostra de biopsia de tecido obtida de um paciente e, em alguns ca-sos, também monitorando os níveis de KCNQ5 nativos. Da mesm maneira,um outro aspecto provê processos para detecção de presença de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L) em uma amostra do paciente.

VII. Kits da Invenção

Um outro aspecto pertence a kits para realização de ensaios deseleção, processos moduladores, ou ensaios diagnósticos. Por exemplo, umkit para realização de um ensaio de seleção pode incluir uma célula compre-endendo um polipeptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), meios para determi-nação de atividade de polipeptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), e, opcio-nalmente, instruções para uso de kit para identificar moduladores de ativida-de de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L). Em uma outra realização, um kit pararealização de um ensaio de seleção pode incluir uma composição compre-endendo um polipeptídeo KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), meios para determi-nação de atividade de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), e, opcionalmente, instru-ções para uso do kit para identificar moduladores de atividade de KCNQ5 ouKCNQ5(W270L).

Uma outra realização provê um kit para realização de um pro-cesso modulador. O kit pode incluir, por exemplo, um agente modulador (porexemplo, um agente inibidor ou estimulador de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L)em um carreador apropriado e embalado em um recipiente apropriado op-cionalmente com instruções para uso do modulador para modular atividadede KCNQ5 ou KCNQ5(W270L).

Um outro aspecto pertence a um kit para diagnóstico de um dis-túrbio associado com expressão e/ou atividade aberrante de KCNQ5 em umsujeito.O kit pode incluir um reagente para determinação de expressão deKCNQ5 ou KCNQ5(W270L) (por exemplo, uma sonda(s) dê ácido nucléicopara detecção de ARNm de KCNQ5 ou KCNQ5(W270L) ou um ou mais anti-corpos para detecção de proteínas KCNQ5 ou KCNQ5(W270L), um controlepara o qual os resultados do sujeito são comparados, e, opcionalmente, ins-truções para uso do kit para propósitos diagnósticos.

A prática dos processos aqui mostrados empregará, a menosque de outro modo indicado, técnicas padrões de biologia celular, cultura decélulas, biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, ADN recom-binante, e munologia, que estão dentro do conhecimento da técnica. Taistécnicas são inteiramente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Molecu-lar Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Ma-niatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes Iand Ii (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed.,1984); U.S. Patent No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (Β. D. Hames &S. J. Higgins eds. 1984); Transeription And Translation (B. D. Hames & S. J.Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss,Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, APraetieal Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzy-mology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For MammalianCells (J. H. Miller and Μ. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Labora-tory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immuno-chemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.,Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating theMouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y., 1986).

Exemplos

A presente exposição é ainda definida nos exemplos que se se-guem. Deve ser entendido que estes exemplos, embora indicando realiza-ções preferidas, são dados somente a título de ilustração. A partir da discus-são acima e estes exemplos, aqueles versados na técnica podem determinaras preferidas características, e sem fugir de seu espírito e escopo, pode fa-zer várias mudanças e modificações para adaptá-la a vários usos e condi-ções.

Procedimentos Genéricos

Expressão de canais de KCNQ5 e KCNQ1 em oócitos de Xeno-pus - genes KCNQ5 e KCNQ1 humanos foram clonados em um vetor pKSMque foi engenheirado especificamente para expressão em oócito. As se-qüências de gene foram confirmadas por seqüenciamento de ADN. Os nú-meros de acesso de banco de gene são: KCNQ5, NM_019842 (SEQ ID NO:3); KCNQ1, U89364.1 (SEQ ID NO: 7). As construções foram Iinearizadaspor enzima de restrição Xbal (NEB, Beverly, MA). Transcrição in vitro foi rea-lizada com um kit mMESSAGE mMACHINE (Ambion, Austin, TX) e o ARNcfoi purificado por extração com fenol. Oócitos de Xenopus foram injetadoscom 46 nL de solução contendo aproximadamente 9,2 ng de ARNc usandoum injetor de oócito Drumond Nanojet (Drummond Scientific Co., Broomall,PA). Gravação eletrofisiológica foi realizada 3-7 dias após injeção.

Eletrofisiologia - Todos os experimentos foram realizados emtemperatura ambiente (22-23°C0 usando gravação de grampo de voltagem dedois eletrodos de oócito convencional (TEVC). Os eletrodos de gravação fo-ram retirados de pipeta de vidro de 1,5 mm usando um retirador de micropipe-ta Sutter P-97 (Sutter Instrument, Novato, CA) e enchidos com KCI 3M. A pon-ta de pipeta foi cuidadosamente quebrada para adquirir a resistência de ele-trodo em 0,5-1 Mohm. Um amplificador Dagan CA-1 (Dagan Corporation,Minneapolis, MN) foi usado e o potencial de retenção foi grampeado em -100mV. Para testar dependência de voltagem de ativação de canal, uma série depulsos de voltagem despolarizados foi aplicada. Para observar o curso detempo de efeito de retigabina, um pulso de voltagem simples (3 s) em 40 mVfoi aplicado repetidamente em intervalos de 15 s. Uma interface de computa-dor HEKA (HEKA Elektronik, Lambrecht, Germany) com software Pulse 8.5 foiusada para controlar o amplificador e digitou os dados para análise.

Soluções e Compostos Químicos - Solução ND96 contendo (emmM) NaCI1 96, KCI, 2, CaCI2, 1,8, MgCI2, 1, HEPES, 10, foi usada para incu-bação de oócito e gravação. Retigabina foi fabricado como uma solução es-toque em DMSO em 50 mM e diluído nas desejadas concentrações justoantes de aplicação em experimentos. DMSO foi testado sobre canais deKCNQ5 e nenhum efeito foi aobservado até 1 %. Em todos os experimentos,DMSO foi usado menos que 0,4%.

Compostos foram aplicados às células via um sistema de perfu-são de banho rápido (ALA Scientific Instruments, Westbury.NY), e uma mu-dança de solução de banho foi completada dentro de 10 segundos.

Análises de Dados - Amplitude de corrente foi medida em linhausando HEKA Pulsefit 8.5 software. Para adquiri condutância de canal a par-tir de corrente macroscópica, o potencial reverso de K+ foi aproximadado ser-80 mV em solução ND96 e a seguinte equação foi aplicada: G = l/(V+80),onde G é a condutância de oócito integral, I é a corrente de oócito integral eV é a voltagem usada para induzir a corrente. Dados foram expressos comomédia ± SE, e o teste t de student emparelhado foi realizado. Diferenças fo-ram consideradas serem significantes em P < 0,05.

Exemplo 1

Para fabricar o polinucleotídeo KCNQ5 contendo uma região S5-S6 de KCNQ1 (codificando SEQ ID NO: 6, aminoácidos S253-V355 de SEQID NO: 8), um par de oligoprimers flanqueando a região S5-S6 de geneKCNQ1 foi usado para obter o fragmento de ADN de KCNQ1. Ambos pri-mers contêm seqüências de ADN introduzidas em cada extremidade quesobrepõem a seqüência de gene KCNQ5 em correspondentes áreas de jun-ção à montante de S5 e à jusante de S6. O produto de PCR usando estesprimers plus a construção de KCNQ1 como um molde foi purificado e usadocomo iniciadores de mutagênese direcionada a sítio para segundo round dePCR com a construção KCNQ5 como um molde. Mutagênese direcionada asítio usando o protocolo QuickChange foi então aplicada (Stratagene, LaJolla, CA), as mutações foram confirmadas por seqüenciamento de ADN.

O efeito de retigabina sobre a quimera funcional (KCNQ5 con-tendo um domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1) foi testado. Comomostrado na Figura 1A e 1B, retigabina 50 μΜ não aumentou mais as ativi-dades de canal. Durante um período de aplicação de 5 minutos, nem ampli-tude de corrente nem ativação dependente de voltagem mudou significante-mente (Figura 1C). A dramática interrupção de ação de retigabina sobre estecanal quimérico sugeriu que o sítio de ação de retigabina em KCNQ5 foimais provavelmente localizado na região de domínio transmembrana S5-S6.

Exemplo 2

Para ainda dissecar o sítio de ação de retigabina, o domíniotransmembrana S5-S6 de KCNQ1 foi dividio em duas partes, o domíniotransmembrana S5 e o domínio transmembrana S6 (com ligador), e os cor-respondentes canais quiméricos de KCNQ5 contiveram domínio transmem-brana S5 ou domínio transmembrana S6 de KCNQ1. O canal quimérico comdomínio transmembrana S6 trocado não mostrou corrente no potencial demembrana variando de -100 a 100 mV. A outra quimera contendo o domínioS5 de KCNQ1 funcionou como um retificador para fora com uma proprieda-de de ativação muito única. Como mostrado na Figura 2A de painel esquer-do, este mutante pareceu inativar quando potencial de membrana foi maiorque 20 mV. Quando canal foi ativado por despolarização de membrana, umacorrente para fora transiente (150 - 200 ms) foi visualizada, tornando a ativa-ção de canal sifnificantemente semelhante a dois componentes. Quandopotencial de membrana foi menor que 20 mV, o padrão de ativação de canlfoi similar ao tipo selvagem e nenhuma inativação clara pode ser observada.

O efeito de retigabina sobre KCNQ5 contendo um domíniotransmembrana de KCNQ1 foi então testado. Retigabina foi aplicado aKCNQ5 contendo um domínio transmembrana S5 de oócitos expressandoKCNQ1 nos quais a amplitude de corrente de estado estável foi estabilizadano nível máximo. Como mostrado na Figura 2B, retigabina 50 μΜ não tevemais efeito sobre este mutante. Em 5 minutos de aplicação de banho, cor-rente de canal induzida por despolarização para 40 mV permaneceu inalte-rada. A Figura 2C mostra as curvas I-V antes e após o tratamento de retiga-bina. Nem amplitude de corrente nem dependência de voltagem das corren-tes foi modificada por retigabina (Figura 2A painel direito, Figura 2C). Estaverificação indica que a dependência molecular de ação de retigabina residedentro do domínio S5.

Exemplo 3

Os domínios S5 de todos os cinco membros KCNQ foram ali-nhados em seqüência e explorados para resíduos de aminoácidos únicosque possam ser responsáveis pela falta de resposta de KCNQ1 para retiga-bina. Como mostrado no painel superior de Figura 3, existem dez resíduosnão - emparelhados entre KCNQ1 e KCNQ5. Sete dos mesmos destacadosna Figura 3 podem ser únicos para KCNQ1. Por isso, mutações em KCNQ5foram geradas para cada um de 7 resíduos modificados individualmente pa-ra o correspondente em KCNQ1. Um mutante, KCNQ5(F282Y) perde suafuncionalidade quando expresso em oócitos. Os outros seis mutantes foramfuncionais e mostraram adequado nível de correntes na faixa experimentalde potenciais de membrana. Efeito de retigabina sobre cada um destes mu-tantes foi então testado. Como mostrado no painel de fundo de Figura 3,dois mutantes, KCNQ5(A269T) e KCNQ5(W270L) (SEQ ID NO: 1, codifican-do SEQ ID NO: 2) tiveram significantemente menos resposta para retigabina.Similar ao mutante trocado de domínio S5 em exemplo 2, KCNQ5(W270L)perde completamente a resposta para retigabina, sugerindo que este resíduotriptofano é crítico para ação de retigabina.

Exemplo 4

Para ainda investigar a dependência funcional dé efeito de reti-gabina sobre este particular resíduo de triptofano em S5, a mutação reversado correspondente resíduo em domínio S5 de KCNQ1 foi feita, presumindoque esta mutação pode tornar KCNQ1 capaz de ser ativado por retigabina.Surpreendentemente, este mutante, KCNQ1(L171W) realmente tornou-sesensível a retigabina. Entretanto, ao invés de ser ativado, KCNQ1(L171W)foi bloqueado por retigabina. Como mostrado na Figura 4A, os canaisKCNQ1 tipo selvagem não tiveram resposta significante para retigabina 50μΜ, mas uma resposta levemente inibidora para retigabina 200 μΜ. Em con-traste, retigabina 50 uM reduziu claramente amplitude de corrente de estadoestável de KCNQ1(L171W) e retigabina 200 uM inibiu a corrente de estadoestável por 62,5% em 80 mV (Figura 4B). Talvez a mais significante mudan-ça induzida por retigabina foi sobre ativação de canal. Como mostrado naFigura 4C, retigabina modificou as cinéticas de ativação da corrente evocadaem 80 mV de um curso de tempo de ativação exponencial simples para umduplo, que pode ser descrito pela modificação de cinéticas de inativação.Retigabina não somente reduziu o nível de corrente de estado estável deKCNQ1(L171W) mas também modificou a dependência de voltagem de ati-vação de canal (Figura 4D e a inserção). A aensitividade altamente aperfei-çoada para retigabina sugere fortemente que as moléculas de retigabina sãocapazes de terem acesso ao resíduo de triptofano em domínio S5 deKCNQ5 ou KCNQ1(L171W), resultando na regulação ascendente ou des-cendente da ativação dependente de voltagem.

Exemplos 1-A destacam a importância da hélice S5 em interrup-ção de canal KCNQ5 e provêm uma explicação molecular para a ação deretigabina sobre canais de potássio KCNQ.Seqüência de Listagem

<110> Wyeth

Liu, Kun Wang, Qiang

Argentieri, Thomas

<120> Sítio de Ligação para retigabina sobre KCNQ5<130> AM102223<150> US 60/760,252<151> 2006-01-19<160> 8

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 2799

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> KCNQ5(W270L) point mutation

<400> 1

atgccccgcc accacgcggg aggagaggag ggcggcgccg ccgggctctg ggtgaagagc 60ggcgcagcgg cggcggcggc gggcgggggg cgcttgggca gcggcatgaa ggatgtggag 120tcgggccggg gcagggtgct gctgaactcg gcagccgcca ggggcgacgg cctgctactg 180ctgggcaccc gcgcggccac gctcggtggc ggcggcggtg gcctgaggga gagccgccgg 240ggcaagcagg gggcccggat gagcctgctg gggaagccgc tctcttacac gagtagccag 300agctgccggc gcaacgtcaa gtaccggcgg gtgcagaact acctgtacaa cgtgctggag 360agaccccgcg gctgggcgtt catctaccac gctttcgttt ttctccttgt ctttggttgc 420ttgattttgt cagtgttttc taccatccct gagcacacaa aattggcctc aagttgcctc 480ttgatcctgg agttcgtgat gattgtcgtc tttggtttgg agttcatcat tcgaatctgg 540tctgcgggtt gctgttgtcg atatagagga tggcaaggaa gactgaggtt tgctcgaaag 600 cccttctgtg ttatagatac cattgttctt atcgcttcaa tagcagttgt ttctgcaaaa 660actcagggta atatttttgc cacgtctgca ctcagaagtc tccgtttcct acagatcctc 780cgcatggtgc gcatggaccg aaggggaggc acttggaaat tactgggttc agtggtttat 840tctttccttg tctatctggt ggaaaaggatgctctctggt ggggcacaat tacattgacaacttggctgg gaagattgct ttctgcaggccttcctgccg gcattcttgg ctcaggttttaaacactttg agaaaagaag gaacccagct

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àcagcagaac at-gagaccac agacgatctc 1800

aaacaggtac agtccataga atccaagctg 1860

cttcggaaag gctctgcctc agccctcgct 1920

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càaaacagtg gctgcttatc cagatcaact 2040

attctgacgc caaatgagtt cagtgcccag 2100

agtcaagcaa cacaggtgcc aattagtcaa 2160

accattgcaa accaaataaa tacggcaccc 2220

ccacctcctc tcccagccat caagcatctg 2280

gcaggcttac aggaaagcat ttctgacgtc 2340

gttcaggttg cacagtcaaa tctcaccaag 2400

ggaggagaaa ctctgttgtc tgtctgtccc 2460

tctgtgcaaa acctgatcag gtcgaccgag 2520

tcaagtggct ccagaggcag ccaagatttt 2580

ataactgatg aagaggtggg tcccgaagag 2640

cagcctgcca gggaagctgc ctttgcatca 2700

tctcagagca tttgtaaggc aggagaaagt 2760acagatgccc tcagcttgcc tcatgtcaaa ctgaaataa

<210> 2

<211> 932

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> KCNQ5(W270L) poinf mutation<400> 2

Met Pro Arg His His Ala Gly Gly Glu Glu Gly Gly Ala Ala Gly Leu15 10 15

Trp Val Lys Ser Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Arg Leu

20 25 30

Gly Ser Gly Met Lys Asp Val Glu Ser Gly Arg Gly Arg Val Leu Leu

35 40 45

Asn Ser Ala Ala Ala Arg Gly Asp Gly Leu Leu Leu Leu Gly Thr Arg

50 55 60

Ala Ala Thr Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Arg Glu Ser Arg Arg65 70 75 80

Gly Lys Gln Gly Ala Arg Met Ser Leu Leu Gly Lys Pro Leu Ser Tyr

85 90 95

Thr Ser Ser Gln Ser Cys Arg Arg Asn Val Lys Tyr Arg Arg Val Gln

100 105 110

Asn Tyr Leu Tyr Asn Val Leu Glu Arg Pro Arg Gly Trp Ala Phe Ile

115 120 125

Tyr His Ala Phe Val Phe Leu Leu Val Phe Gly Cys Leu Ile Leu Ser

130 135 140

Val Phe Ser Thr Ile Pro Glu His Thr Lys Leu Ala Ser Ser Cys Leu145 150 155 160

Leu Ile Leu Glu Phe Val Met Ile Val Val Phe Gly Leu Glu Phe Ile

165 170 175

Ile Arg Ile Trp Ser Ala Gly Cys Cys Cys Arg Tyr Arg Gly Trp Gln180 185 190Gly Arg Leu Arg Phe Ala Arg Lys Pro Phe Cys Val Ile Asp Thr Ile

195 200 205

Val Leu Ile Ala Ser Ile Ala Val Val Ser Ala Lys Thr Gln Gly Asn

210 215 220

Ile Phe Ala Thr Ser Ala Leu Arg Ser Leu Arg Phe Leu Gln Ile Leu225 230 235 240

Arg Met Val Arg Met Asp Arg Arg Gly Gly Thr Trp Lys Leu Leu Gly

245 250 255

Ser Val Val Tyr Ala His Ser Lys Glu Leu Ile Thr Ala Leu Tyr Ile

260 265 270

Gly Phe Leu Val Leu Ile Phe Ser Ser Phe Leu Val Tyr Leu Val Glu

275 280 285

Lys Asp Ala Asn Lys Glu Phe Ser Thr Tyr Ala Asp Ala Leu Trp Trp

290 295 300

Gly Thr Ile Thr Leu Thr Thr Ile Gly Tyr Gly Asp Lys Thr Pro Leu305 3i0 315 320

Thr Trp Leu Gly Arg Leu Leu Ser Ala Gly Phe Ala Leu Leu Gly Ile

325 330 335

Ser Phe Phe Ala Leu Pro Ala Gly Ile Leu Gly Ser Gly Phe Ala Leu

340 345 350

Lys Val Gln Glu Gln His Arg Gln Lys His Phe Glu Lys Arg Arg Asn

355 360 365

Pro Ala Ala Asn Leu Ile Gln Cys Val Trp Arg Ser Tyr Ala Ala Asp

370 375 380

Glu Lys Ser Val Ser Ile Ala Thr Trp Lys Pro His Leu Lys Ala Leu385 390 395 400

His Thr Cys Ser Pro Thr Lys Lys Glu Gln Gly Glu Ala Ser Ser Ser

405 410 415

Gln Lys Leu Ser Phe Lys Glu Arg Val Arg Met Ala Ser Pro Arg Gly

420 425 430

Gln Ser Ile Lys Ser Arg Gln Ala Ser Val Gly Asp Arg Arg Ser Pro435 440 445Ser Thr Asp Ile Thr Ala Glu Gly Ser Pro Thr Lys Val Gln Lys Ser450 455 460

Trp Ser Phe Asn Asp Arg Thr Arg Phe Arg Pro Ser Leu Arg Leu Lys465 470 475 480

Ser Ser Gln Pro Lys Pro Val Ile Asp Ala Asp Thr Ala Leu Gly Thr485 490 .495

Asp Asp Val Tyr Asp Glu Lys Gly Cys Gln Cys Asp Val Ser Val Glu500 505 510

Asp Leu Thr Pro Pro Leu Lys Thr Val Ile Arg Ala Ile Arg Ile Met515 520 525

Lys Phe His Val Ala Lys Arg Lys Phe Lys Glu Thr Leu Arg Pro Tyr530 535 540

Asp Val Lys Asp Val Ile Glu Gln Tyr Ser Ala Gly His Leu Asp Met545 550 555 560

Leu Cys Arg Ile Lys Ser Leu Gln Thr Arg Val Asp Gln Ile Leu Gly565 570 575

Lys Gly Gln Ile Thr Ser Asp Lys Lys Ser Arg Glu Lys Ile Thr Ala580 585 590

Glu His Glu Thr Thr Asp Asp Leu Ser Met Leu Gly Arg Val Val Lys595 600 605

Val Glu Lys Gln Val Gln Ser Ile Glu Ser Lys Leu Asp Cys Leu Leu610 615 620

Asp Ile Tyr Gln Gln Val Leu Arg Lys Gly Ser Ala Ser Ala Leu Ala625 630 635 640

Leu Ala Ser Phe Gln Ile Pro Pro Phe Glu Cys Glu Gln Thr Ser Asp645 650 655

Tyr Gln Ser Pro Val Asp Ser Lys Asp Leu Ser Gly Ser Ala Gln Asn660 665 670

Ser Gly Cys Leu Ser Arg Ser Thr Ser Ala Asn Ile Ser Arg Gly Leu675 680 685

Gln Phe Ile Leu Thr Pro Asn Glu Phe Ser Ala Gln Thr Phe Tyr Ala690 695 700Leu Ser Pro Thr Met His Ser Gln Ala Thr Gln Val Pro Ile Ser Gln705 710 715 720

Ser Asp Gly Ser Ala Val Ala Ala Thr Asn Thr Ile Ala Asn Gln Ile

725 730 735

Asn Thr Ala Pro Lys Pro Ala Ala Pro Thr Thr Leu Gln Ile Pro Pro

740 745 750

Pro Leu Pro Ala Ile Lys His Leu Pro Arg Pro Glu Thr Leu His Pro

755 760 765

Asn Pro Ala Gly Leu Gln Glu Ser Ile Ser Asp Val Thr Thr Cys Leu

770 775 780

Val Ala Ser Lys Glu Asn Val Gln Val Ala Gln Ser Asn Leu Thr Lys785 790 795 800

Asp Arg Ser Met Arg Lys Ser Phe Asp Met Gly Gly Glu Thr Leu Leu

805 810 815

Ser Val Cys Pro Met Val Pro Lys Asp Leu Gly Lys Ser Leu Ser Val

820 825 830

Gln Asn Leu Ile Arg Ser Thr Glu Glu Leu Asn Ile Gln Leu Ser Gly

835 840 845

Ser Glu Ser Ser Gly Ser Arg Gly Ser Gln Asp Phe Tyr Pro Lys Trp

850 855 860

Arg Glu Ser Lys Leu Phe Ile Thr Asp Glu Glu Val Gly Pro Glu Glu865 870 875 880

Thr Glu Thr Asp Thr Phe Asp Ala Ala Pro Gln Pro Ala Arg Glu Ala

885 890 895

Ala Phe Ala Ser Asp Ser Leu Arg Thr Gly Arg Ser Arg Ser Ser Gln

900 905 910

Ser Ile Cys Lys Ala Gly Glu Ser Thr Asp Ala Leu Ser Leu Pro His

915 920 925

Val Lys Leu Lys

930<210> 3<211> 2799<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

atgccccgcc accacgcggg aggagaggag ggcggcgccg ccgggctctg ggtgaagagc 60

ggcgcagcgg cggcggcggc gggcgggggg cgcttgggca gcggcatgaa ggatgtggag 120

tcgggccggg gcagggtgct gctgaactcg gcagccgcca ggggcgacgg çctgctactg 180

ctgggcaccc gcgcggccac gctcggtggc ggcggcggtg gcctgaggga gagccgccgg 240

ggcaagcagg gggcccggat gagcctgctg gggaagccgc tctcttacac gagtagccag 300

agctgccggc gcaacgtcaa gtaccggcgg gtgcagaact acctgtacaa cgtgctggag 360

agaccccgcg gctgggcgtt catctaccac gctttcgttt ttctccttgt ctttggttgc 420

ttgattttgt cagtgttttc taccatccct gagcacacaa aattggcctc aagttgcctc 480

ttgatcctgg agttcgtgat gattgtcgtc tttggtttgg agttcatcat tcgaatctgg 540

tctgcgggtt gctgttgtcg atatagagga tggcaaggaa gactgaggtt tgctcgaaag 600

cccttctgtg ttatagatac cattgttctt atcgcttcaa tagcagttgt ttctgcaaaa 660

actcagggta atatttttgc cacgtctgca ctcagaagtc tccgtttcct acagatcctc 720

cgcatggtgc gcatggaccg aaggggaggc acttggaaat tactgggttc agtggtttat 780

gctcacagca aggaattaat cacagcttgg tacataggat ttttggttct tattttttcg 840

tctttccttg tctatctggt ggaaaaggat gccaataaag agttttctac atatgcagat 900

gctctctggt ggggcacaat tacattgaca actattggct atggagacaa aactccccta 960

acttggctgg gaagattgct ttctgcaggc tttgcactcc ttggcatttc tttctttgca 1020

cttcctgccg gcattcttgg ctcaggtttt gcattaaaag tacaagaaca acaccgccag 1080

aaacactttg agaaaagaag gaacccagct gccaacctca ttcagtgtgt ttggcgtagt 1140

tacgcagctg atgagaaatc tgtttccatt gcaacctgga agccacactt gaaggccttg 1200

cacacctgca gccctaccaa gaaagaacaa ggggaagcat caagcagtca gaagctaagt 12 60

tttaaggagc gagtgcgcat ggctagcccc aggggccaga gtattaagag ccgacaagcc 1320

tcagtaggtg acaggaggtc cccaagcacc gacatcacag ccgagggcag tcccaccaaa 1380

gtgcagaaga gctggagctt caacgaccga acccgcttcc ggccctcgct gcgcctcaaa 1440

agttctcagc caaaaccagt gatagatgct gacacagccc ttggcactga tgatgtatat 1500

gatgaaaaag gatgccagtg tgatgtatca gtggaagacc tcaccccacc acttaaaact 156Ó

gtcattcgag ctatcagaat tatgaaattt catgttgcaa aacggaagtt taaggaaaca 1620

ttacgtccat atgatgtaaa agatgtcatt gaacaatatt ctgctggtca tctggacatg 1680

ttgtgtagaa ttaaaagcct tcaaacacgt gttgatcaaa ttcttggaaa agggcaaatc 1740acatcagata agaagagccg agagaaaata acagcagaac atgagaccac agacgatctc 1800agtatgctcg gtcgggtggt caaggttgaa aaacaggtac agtccataga atccaagctg 1860

gactgcctac tagacatcta tcaacaggtc cttcggaaag gctctgcctc agccctcgct 1920

ttggcttcat tccagatccc accttttgaa tgtgaacaga catctgacta tcaaagccct 1980

gtggatagca aagatctttc gggttccgca caaaacagtg gctgcttatc cagatcaact 2040

agtgccaaca tctcgagagg cctgcagttc attctgacgc caaatgagtt cagtgcccag 2100

actttctacg cgcttagccc tactatgcac agtcaagcaa cacaggtgcc aattagtcaa 2160

agcgatggct cagcagtggc agccaccaac accattgcaa accaaataaa tacggcaccc 2220

aagccagcag ccccaacaac tttacagatc ccacctcctc tcccagccat caagcatctg 2280

cccaggccag aaactctgca ccctaaccct gcaggcttac aggaaagcat ttctgacgtc 2340

accacctgcc ttgttgcctc caaggaaaat gttcaggttg cacagtcaaa tctcaccaag 2400

gaccgttcta tgaggaaaag ctttgacatg ggaggagaaa ctctgttgtc tgtctgtccc 2460

atggtgccga aggacttggg caaatctttg tctgtgcaaa acctgatcag gtcgaccgag 2520

gaactgaata tacaactttc agggagtgag tcaagtggct ccagaggcag ccaagatttt 2580

15 taccccaaat ggagggaatc caaattgttt ataactgatg aagaggtggg tcccgaagag 2640

acagagacag acacccttga 'cgccgcaccg cagc^tgcca gggaagctgc ctttgcatca 2700

gactctctaa ggactggaag gtcacgatca tctcagagca tttgtaaggc aggagaaagt 2760

acagatgccc tcagcttgcc tcatgtcaaa ctgaaataa 2799

<210> 4

<211> 932

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Pro Arg His His Ala Gly Gly Glu Glu Gly Gly Ala Ala Gly Leu

1 5 10 15

Trp Val Lys Ser Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Arg Leu

20 25 30

Gly Ser Gly Met Lys Asp Val Glu Ser Gly Arg Gly Arg Val Leu Leu35 40 45

Asn Ser Ala Ala Ala Arg Gly Asp Gly Leu Leu Leu Leu Gly Thr Arg50 55 60

Ala Ala Thr Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Arg Glu Ser Arg Arg65 70 75 80

Gly Lys Gln Gly Ala Arg Met Ser Leu Leu Gly Lys Pro Leu Ser Tyr

85 90 95

Thr Ser Ser Gln Ser Cys Arg Arg Asn Val Lys Tyr Arg Arg Val Gln

100 105 110

Asn Tyr Leu Tyr Asn Val Leu Glu Arg Pro Arg Gly Trp Ala Phe Ile

115 120 125

Tyr His Ala Phe Val Phe Leu Leu Val Phe Gly Cys Leu Ile Leu Ser

130 135 140

Val Phe Ser Thr Ile Pro Glu His Thr Lys Leu Ala Ser Ser Cys Leu145 150 155 160

Leu Ile Leu Glu Phe Val Met Ile Val Val Phe Gly Leu Glu Phe Ile

165 170 175

Ile Arg Ile Trp Ser Ala Gly Cys Cys Cys Arg Tyr Arg Gly Trp Gln

180 185 190

Gly Arg Leu Arg Phe Ala Arg Lys Pro Phe Cys Val Ile Asp Thr Ile

195 200 205

Val Leu Ile Ala Ser Ile Ala Val Val Ser Ala Lys Thr Gln Gly Asn

210 215 220

Ile Phe Ala Thr Ser Ala Leu Arg Ser Leu Arg Phe Leu Gln Ile Leu225 230 235 240

Arg Met Val Arg Met Asp Arg Arg Gly Gly Thr Trp Lys Leu Leu Gly

245 250 255

Ser Val Val Tyr Ala His Ser Lys Glu Leu Ile Thr Ala Trp Tyr Ile

260 265 270

Gly Phe Leu Val Leu Ile Phe Ser Ser Phe Leu Val Tyr Leu Val Glu

275 280 285

Lys Asp Ala Asn Lys Glu Phe Ser Thr Tyr Ala Asp Ala Leu Trp Trp

290 295 300

Gly Thr Ile Thr Leu Thr Thr Ile Gly Tyr Gly Asp Lys Thr Pro Leu305 310 315 320

Thr Trp Leu Gly Arg Leu Leu Ser Ala Gly Phe Ala Leu Leu Gly Ile325 330 335

Ser Phe Phe Ala Leu Pro Ala Gly Ile Leu Gly Ser Gly Phe Ala Leu

340 345 350

Lys Val Gln Glu Gln His Arg Gln Lys His Phe Glu Lys Arg Arg Asn

355 360 365

ProAla Ala Asn Leu Ile Gln Cys Val Trp Arg Ser Tyr Ala Ala. Asp

370 375 380

Glu Lys Sér Val Ser Ile Ala Thr Trp Lys Pro His Leu Lys Ala Leu385 390 395 400

His Thr Cys Ser Pro Thr Lys Lys Glu Gln Gly Glu Ala Ser Ser Ser

405 410 415

Gln Lys Leu Ser Phe Lys Glu Arg Val Arg Met Ala Ser Pro Arg Gly

420 425 430

Gln Ser Ile Lys Ser Arg Gln Ala Ser Val Gly Asp Arg Arg Ser Pro

435 440 445

Ser Thr Asp Ile Thr Ala Glu Gly Ser Pro Thr T.ys Val Gln Lys Ser

450 455 460

Trp Ser Phe Asn Asp Arg Thr Arg Phe Arg Pro Ser Leu Arg Leu Lys465 470 475 480

Ser Ser Gln Pro Lys Pro Val Ile Asp Ala Asp Thr Ala Leu Gly Thr

485 490 495

Asp Asp Val Tyr Asp Glu Lys Gly Cys Gln Cys Asp Val Ser Val Glu

500 505 510

Asp Leu Thr Pro Pro Leu Lys Thr Val Ile Arg Ala Ile Arg Ile Met

515 520 525

Lys Phe His Val Ala Lys Arg Lys Phe Lys Glu Thr Leu Arg Pro Tyr

530 535 540

Asp Val Lys Asp Val Ile Glu Gln Tyr Ser Ala Gly His Leu Asp Met545 550 555 560

Leu Cys Arg Ile Lys Ser Leu Gln Thr Arg Val Asp Gln Ile Leu Gly

565 570 575

Lys Gly Gln Ile Thr Ser Asp Lys Lys Ser Arg Glu Lys Ile Thr Ala580 585 590

Glu His Glu Thr Thr Asp Asp Leu Ser Het Leu Gly Arg Val Val Lys

595 600 605

Val Glu Lys Gln Val Gln Ser Ile Glu Ser Lys Leu Asp Cys Leu Leu

610 615 620

Asp Ile Tyr Gln Gln Val Leu Arg Lys Gly Ser Ala Ser Ala Leu Ala625 630 635 640

Leu Ala Ser Phe Gln Ile Pro Pro Phe Glu Cys Glu Gln Thr Ser Asp

645 650 655

Tyr Gln Ser Pro Val Asp Ser Lys Asp Leu Ser Gly Ser Ala Gln Asn

660 665 670

Ser Gly Cys Leu Ser Arg Ser Thr Ser Ala Asn Ile Ser Arg Gly Leu

675 680 685

Gln Phe Ile Leu Thr Pro Asn Glu Phe Ser Ala Gln Thr Phe Tyr Ala

690 695 700

Leu Ser Pro Thr Met His Set Gln Ala Thr Gln Val Pro Ile Ser Gln705 710 715 720

Ser Asp Gly Ser Ala Val Ala Ala Thr Asn Thr Ile Ala Asn Gln Ile

725 730 735

Asn Thr Ala Pro Lys Pro Ala Ala Pro Thr Thr Leu Gln Ile Pro Pro

740 745 750

Pro Leu Pro Ala Ile Lys His Leu Pro Arg Pro Glu Thr Leu His Pro

755 760 765

Asn Pro Ala Gly Leu Gln Glu Ser Ile Ser Asp Val Thr Thr Cys Leu

770 775 780

Val Ala Ser Lys Glu Asn Val Gln Val Ala Gln Ser Asn Leu Thr Lys785 790 795 800

Asp Arg Ser Met Arg Lys Ser Phe Asp Met Gly Gly Glu Thr Leu Leu

805 810 815

Ser Val Cys Pro Met Val Pro Lys Asp Leu Gly Lys Ser Leu Ser Val

820 825 830

Gln Asn Leu Ile Arg Ser Thr Glu Glu Leu Asn Ile Gln Leu Ser Gly835 840 845

Ser Glu Ser Ser Gly Ser Arg Gly Ser Gln Asp Phe Tyr Pro Lys Trp

850 855 860

Arg Glu Ser Lys Leu Phe Ile Thr Asp Glu Glu Val Gly Pro Glu Glu865 870 875 880

Thr Glu Thr Asp Thr Phe Asp Ala Ala Pro Gln Pro Ala Arg Glu Ala

885 890 895

Ala Phe Ala Ser Asp Ser Leu Arg Thr Gly Arg Ser Arg Ser Ser Gln

900 905 910

Ser Ile Cys Lys Ala Gly Glu Ser Thr Asp Ala Leu Ser Leu Pro His

915 920 925

Val Lys Leu Lys

930<210> 5<211> 309<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 5

tccgtggtct tcatccaccg ccaggagctg ataaccaccc tgtacatcgg cttcctgggc

ctcatcttct cctcgtactt tgtgtacctg gctgagaagg acgcggtgaa cgagtcaggc

cgcgtggagt tcggcagcta cgcagatgcg ctgtggtggg gggtggtcac agtcaccacc

atcggctatg gggacaaggt gccccagacg tgggtcggga agaccatcgc ctcctgcttc

tctgtctttg ccatctcctt ctttgcgctc ccagcgggga ttcttggctc ggggtttgcc

ctgaaggtg

<210> 6

<211> 103

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Ser Val Val Phe Ile His Arg Gln Glu Leu Ile Thr Thr Leu Tyr Ile1 5 10 15

Gly Phe Leu Gly Leu Ile Phe Ser Ser Tyr Phe Val Tyr Leu Ala GluLys Asp Ala Val Asn Glu Ser Gly Arg Val Glu Phe Gly Ser Tyr Ala

Asp Ala Leu Trp Trp Gly Val Val Thr Val Thr Thr Ile Gly Tyr Gly

Asp Lys Val Pro Gln Thr Trp Val Gly Lys Thr Ile Ala Ser Cys Phe

Ser Val Phe Ala Ile Ser Phe Phe Ala Leu Pro Ala Gly Ile Leu Gly

100

<210> 7<211> 1746<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 7

atggagacgc gcgggtctag gctcaccggc ggccagggcc gcgtctacaa cttcctcgag 60

cgtcccaccg gctggaaatg cttcgtttac cacttcgccg tcttcctcat cgtcctggtc 120

tgcctcatct tcagcgtgct gtccaccatc gagcagtatg ccgccctggc cacggggact 180

ctcttctgga tggagatcgt gctggtggtg ttcttcggga cggagtacgt ggtccgcctc 240

tggtccgccg gctgccgcag caagtacgtg ggcctctggg ggcggctgcg ctttgcccgg 300

aagcccattt ccatcatcga cctcatcgtg gtcgtggcct ccatggtggt cctctgcgtg 360

ggctccaagg ggcaggtgtt tgccacgtcg gccatcaggg gcatccgctt cctgcagatc 420

ctgaggatgc tacacgtcga ccgccaggga ggcacctgga ggctcctggg ctccgtggtc 480

ttcatccacc gccaggagct gataaccacc ctgtacatcg gcttcctggg cctcatcttc 540

tcctcgtact ttgtgtacct ggctgagaag gacgcggtga acgagtcagg ccgcgtggag 600

ttcggcagct acgcagatgc gctgtggtgg ggggtggtca cagtcaccac catcggctat 660

ggggacaagg tgccccagac gtgggtcggg aagaccatcg cctcctgctt ctctgtcttt 720

gccatctcct tctttgcgct cccagcgggg attcttggct cggggtttgc cctgaaggtg 78Ó

cagcagaagc agaggcagaa gcacttcaac cggcagatcc cggcggcagc ctcactcatt 840

cagaccgcat ggaggtgcta tgctgccgag aaccccgact cctccacctg gaagatctac 900

atccggaagg ccccccggag ccacactctg ctgtcaccca gccccaaacc caagaagtct 960gtggtggtaa agaaaaaaaa gttcaagctg gacaaagaca atggggtgac tcctggagag 1020

aagatgctca cagtccccca tatcacgtgc gaccccccag aagagcggcg gctggaccac 1080

ttctctgtcg acggctatga cagttctgta aggaagagcc caacactgct ggaagtgagc 1140

atgccccatt tcatgagaac caacagcttc gccgaggacc tggacctgga aggggagact 1200

ctgctgacac ccatcaccca catctcacag ctgcgggaac accatcgggc caccattaag 1260

gtcattcgac gcatgcagta ctttgtggcc aagaagaaat tccagcaagc gcggaagcct 1320

tacgatgtgc gggacgtcat tgagcagtac tcgcagggcc acctcaacct catggtgcgc 1380

atcaaggagc tgcagaggag gctggaccag tccattggga agccctcact gttcatctcc 1440

gtctcagaaa agagcaagga tcgcggcagc aacacgatcg gcgcccgcct gaaccgagta 1500

gaagacaagg tgacgcagct ggaccagagg ctggcactca tcaccgacat gcttcaccag 1560

ctgctctcct tgcacggtgg cagcaccccc ggcagcggcg gcccccccag agagggcggg 1620

gcccacatca cccagccctg cggcagtggc ggctccgtcg accctgagct cttcctgccc 1680

agcaacaccc tgcccaccta cgagcagctg accgtgccca ggaggggccc cgatgagggg 1740

tcctga 1746

<210> 8

<211> 581<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 8

Met Glu Thr Arg Gly Ser Arg Leu Thr Gly Gly Gln Gly Arg Val Tyr1 5 10 15

Asn Phe Leu Glu Arg Pro Thr Gly Trp Lys Cys Phe Val Tyr.His Phe

20 25 30

Ala Val Phe Leu Ile Val Leu Val Cys Leu Ile Phe Ser Val Leu Ser35 40 45

Thr Ile Glu Gln Tyr Ala Ala Leu Ala Thr Gly Thr Leu Phe Trp Met

50 55 60

Glu Ile Val Leu Val Val Phe Phe Gly Thr Glu Tyr Val Val Arg Leu65 70 75 80

Trp Ser Ala Gly Cys Arg Ser Lys Tyr Val Gly Leu Trp Gly Arg Leu

85 90 95

Arg Phe Ala Arg Lys Pro Ile Ser Ile Ile Asp Leu Ile Val Val Val100 105 110

Ala Ser Met Val Val Leu Cys Val Gly Ser Lys Gly Gln Val Phe Ala

115 120 125

Thr Ser Ala Ile Arg Gly Ile Arg Phe Leu Gln Ile Leu Arg Met Leu

130 135 140

His Val Asp Arg Gln Gly Gly Thr Trp Arg Leu Leu Gly Ser Val Val145 150 155 160

Phe Ile His Arg Gln Glu Leu Ile Thr Thr Leu Tyr Ile Gly Phe Leu

165 170 175

Gly Leu Ile Phe Ser Ser Tyr Phe Val Tyr Leu Ala Glu Lys Asp Ala

180 185 190

Val Asn Glu Ser Gly Arg Val Glu Phe Gly Ser Tyr Ala Asp Ala Leu

195 200 205

Trp Trp Gly Val Val Thr Val Thr Thr Ile Gly Tyr Gly Asp Lys Val

210 215 220

Pro Gln Thr Trp Val Gly Lys Thr Ile Ala Ser Cys Phe Ser Val Phe225 230 235 240

Ala Ile Ser Phe Phe Ala Leu Pro Ala Gly Ile Leu Gly Ser Gly Phe

245 250 255

Ala Leu Lys Val Gln Gln Lys Gln Arg Gln Lys His Phe Asn Arg Gln

260 265 270

Ile Pro Ala Ala Ala Ser Leu Ile Gln Thr Ala Trp Arg Cys Tyr Ala

275 280 285

Ala Glu Asn Pro Asp Ser Ser Thr Trp Lys Ile Tyr Ile Arg Lys Ala

290 295 300

Pro Arg Ser His Thr Leu Leu Ser Pro Ser Pro Lys Pro Lys Lys Ser305 310 315 320

Val Val Val Lys Lys Lys Lys Phe Lys Leu Asp Lys Asp Asn Gly Val

325 330 335

Thr Pro Gly Glu Lys Met Leu Thr Val Pro His Ile Thr Cys Asp Pro

340 345 350

Pro Glu Glu Arg Arg Leu Asp His Phe Ser Val Asp Gly Tyr Asp Ser355 360 365

Ser Val Arg Lys Ser Pro Thr Leu Leu Glu Val Ser Met Pro His Phe

370 375 380

Met Arg Thr Asn Ser Phe Ala Glu Asp Leu Asp Leu Glu Gly Glu Thr385 390 395 400

Leu Leu Thr Pro Ile Thr His Ile Ser Gln Leu Arg Glu His His Arg

405 410 415

Ala Thr Ile Lys Val Ile Arg Arg Met Gln Tyr Phe Val Ala Lys Lys

420 425 430

Lys Phe Gln Gln Ala Arg Lys Pro Tyr Asp Val Arg Asp Val Ile Glu

435 440 445

Gln Tyr Ser Gln Gly His Leu Asn Leu Met Val Arg Ile Lys Glu Leu

450 455 460

Gln Arg Arg Leu Asp Gln Ser Ile Gly Lys Pro Ser Leu Phe Ile Ser465 470 475 480

Val Ser Glu Lys Ser Lys Asp Arg Gly Ser Asn Thr Ile Gly Ala Arg

485 490 495

Leu Asn Arg Val Glu Asp Lys Val Thr Gln Leu Asp Gln Arg Leu Ala

500 505 510

Leu Ile Thr Asp Met Leu His Gln Leu Leu Ser Leu His Gly Gly Ser

515 520 525

Thr Pro Gly Ser Gly Gly Pro Pro Arg Glu Gly Gly Ala His Ile Thr

530 ■ 535 540

Gln Pro Cys Gly Ser Gly Gly Ser. Val Asp Pro Glu Leu Phe Leu Pro545 550 555 560

Ser Asn Thr Leu Pro Thr Tyr Glu Gln Leu Thr Val Pro Arg Arg Gly

565 570 575

Pro Asp Glu Gly Ser580

Claims

1. (cancelada)

2. Polinucleotídeo isolado compreendendo um polinucleotídeoselecionado do grupo consistindo em:(a) uma seqüência de ácido nucléico compreendendo SEQ IDNO: 1;(b) um polinucleotídeo codificando SEQ ID NO: 2;(c) uma seqüência de ácidos nucléicos codificando um polipeptí-deo tendo pelo menos cerca de 95% em homologia com SEQ ID NO: 1, con-tanto que uma substituição em nucleotídeos 808-810 seja para um códonque produz uma substituição conservativa para o aminoácido leucina;(d) uma molécula de ácido nucléico que é capaz de hibridizaçãosob condições de alta rigorosidade para SEQ ID NO: 1;(e) uma molécula de ácido nucléico que é complementar a (a),(b), (c), ou (d); e(f) uma variante de SEQ ID NO: 1.

3. (cancelada)

4. (cancelada)

5. Fragmento de polinucleotídeo isolado compreendendo pelomenos 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 100, 200, 300, 400,-500, 600, ou 700 nucleotídeos contíguos da seqüência sentido do polinu-cleotídeo isolado de reivindicação 2, onde o dito fragmento inclui nucleotí-deos 808-810 de SEQ ID NO: 1.

6. Iniciador ou sonda compreendendo o fragmento de polinucleo-tídeo isolado da reivindicação 5.

7. Polinucleotídeo isolado da reivindicação 2, onde a moléculade ácido nucléico de (d) hibridiza com SEQ ID NO: 1 sob as seguintes con-dições: 6xSSC a 45°C e lavada uma vez mais com 0,2xSSC, 0,1% SDS a 50°C.

8. Polinucleotídeo isolado da reivindicação 7, onde a moléculade ácido nucléico de (d) hibridiza com SEQ ID NO: 1 sob as seguintes con-dições: 6xSSC a 45°C e lavada pelo menos uma vez com 0,2xSSC, 0,1%SDS a 55°C.

9. Polinucleotídeo isolado da reivindicação 7, onde a moléculade ácido nucléico de (d) hibridiza com SEQ ID NO: 1 sob as seguintes con-dições: 6xSSC a 45°C e lavada pelo menos uma vez com 0,2xSSC, 0,1%SDS a 65°C.

10. Vetor compreendendo o polinucleotídeo isolado da reivindi-cação 2.

11. Vetor da reivindicação 10, onde o vetor é um plasmídeo.

12. Vetor da reivindicação 10, onde o vetor é um vetor de ex-pressão.

13. Célula hospedeira transformada com o vetor de qualqueruma das reivindicações 10-12.

14. Célula hospedeira da reivindicação 13 que é uma célula pro-cariótica.

15. Célula hospedeira da reivindicação 14, onde a célula proca-riótica é uma célula de E. col i.

16. Célula hospedeira da reivindicação 13 que é uma célula eu-cariótica.

17. Célula hospdeira da reivindicação 16, onde a célula eucarió-tica é uma célula de inseto, uma célula de levedura, uma célula mamífera,ou um oócito de Xenopus.

18. Animal transgênico não-humano compreendendo o polinu-cleotídeo isolado da reivindicação 2.

19. Polinucleotídeo anti - sentido isolado que é anti - sentido pa-ra o polinucleotídeo isolado da reivindicação 2.

20. Polinucleotídeo anti - sentido isolado da reivindicação 19,onde o polinucleotídeo anti - sentido isolado é um oligonucleotídeo anti -sentido, uma ribozima, ou um siRNA.

21. Polinucleotídeo isolado codificando um polipeptídeo KCNQ5contendo um domínio transmembrana S-5-S6de KCNQ1.

22. Polinucleotídeo isolado da reivindicação 21, onde o domíniotransmembrana S5-S6 é de KCNQ1 humano.

23. Polinucleotídeo isolado compreendendo um polinucleotídeoselecionado do grupo consistindo em:(a) uma seqüência de ácidos nucléicos compreendendo SEQ IDNO: 3, onde nucleotídeos 769-1062 estão substituídos com SEQ ID NO; 5;(b) um polinucleotídeo codificando SEQ ID NO: 4, onde aminoá-cidos 257-354 são substituídos com um domínio transmembrana S5-S6 deKCNQ1;(c) uma m olécula de ácido nucléico que é capaz de hibridizaçãosob condições altamente rigorosas à seqüência de ácido nucléico de (a) ou(b); e(d) uma molécula de ácido nucléico que é complementar para(a), (b), ou (c).

24. Polinucleotídeo isolado da reivindicação 23, onde o domíniotransmembrana S5-S6 de (b) é SEQ ID NO: 6.

25. Polinucleotídeo isolado codificando um polipeptídeo KCNQ5contendo um domínio transmembrana S5 de KCNQ1.

26. Polinucleotídeo isolado da reivindicação 25, onde o domíniotransmembrana S5 é de KCNQ1 humano.

27. Polinucleotídeo isolado compreendendo um polinucleotídeoselecionado do grupo consistindo em:(a) uma seqüência de ácidos nucléicos compreendendo SEQ IDNO: 3, onde nucleotídeos 769-873 estão substituídos com nucleotídeos 1--105 de SEQ ID NO: 5;(b) polinucleotídeo codificando SEQ ID NO: 4. onde aminoácidos - 257-291 de SEQ ID NO: 4 são substituídos com um domínio transmembranaS5 de KCNQ1;(c) uma molécula de ácido nucléico que é capaz de hibridizaçãosob condições altamente rigorosas à seqüência de ácidos nucléicos de (a)ou (b); e(d) uma molécula de ácido nucléico que é complementar a (a),(b), ou (c).

28. Polinucleotídeo isolado da reivindicação 27, onde o domíniotransmembrana S5 de (b) são aminoácidos 1-35 de SEQ ID NO: 6.

29. Polipeptídeo isolado compreendendo uma seqüência de a-minoácidos selecionada do grupo consistindo em:(a) uma seqüência de aminoácidos de um polipeptídeoKCNQ5(W270L);(b) uma seqüência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 2;(c) uma variante de (a); e(d) uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 90% deidentidade para à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, contanto queuma substituição em aminoácido 270 seja uma substituição conservativapara o aminoácido leucina.

30. Proteína de fusão compreendendo um primeiro polipeptídeoconsistindo no poloipeptídeo isolado da reivindicação 29 ligado operavel-mente a um segundo polipeptídeo não-KCNQ95(W270L).

31. Polinucleotídeo isolado codificando a proteína de fusão dareivindicação 30.

32. Peptidomimético compreendendo o polipeptídeo isolado dareivindicação 29, onde pelo menos uma ligação de peptídeo é substituídacom uma ligação selecionada do grupo consistindo em -CH2NH--, -CH2S--,--CH2-CH2-, eis -CH=CH-, trans -CH=CH--, -COCH2- -CH(OH)CH2-,e-CH2SO-.

33. Fragmento de peptídeo isolado compreendendo pelo menos-8 aminoácidos contíguos do polipeptídeo isolado da reivindicação 29, onde odito fragmento inclui aminoácido 270 de SEQ ID NO: 2.

34. Fragmento de peptídeo isolado compreendendo pelo menosaminoácidos contíguos do polipeptídeo isolado da reivindicação 29, ondeo dito fragmento inclui aminoácido 270 de SEQ ID NO: 2.

35. Fragmento de peptídeo isolado compreendendo pelo menos-15 aminoácidos contíguos do polipeptídeo isolado da reivindicação 29, ondeo dito fragmento inclui aminoácido 270 de SEQ ID NO: 2.

36. Fragmento de peptídeo isolado compreendendo pelo menos-20 aminoácidos contíguos do polipeptídeo isolado da reivindicação 29, ondeo dito fragmento inclui aminoácido 270 de SEQ ID NO: 2.

37. Fragmento de peptídeo isolado compreendendo pelo menosaminoácidos contíguos do polipeptídeo isolado da reivindicação 29, ondeo dito fragmento inclui aminoácido 270 de SEQ ID NO: 2.

38. Anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeoKCNQ5(W270L) compreendendo SEQ ID NO: 2.

39. Anticorpo da reivindicação 38, onde o anticorpo é um anti-corpo monoclonal.

40. Anticorpo da reivindicação 38, onde o anticorpo é um anti-corpo policlonal.

41. anticorpo que se liga especificamente a um fragmento depolipeptídeo KCNQ5(W270L) compreendendo pelo menos 8 aminoácidoscontíguos a partir de SEQ ID NO: 2, onde o dito fragmento inclui aminoácido-270 de SEQ ID NO: 2.

42. Polipeptídeo KCNQ5 isolado contendo um domínio trans-membrana S5-S6 de KCNQ1.

43. PolipeptídeoKCNQ5 isolado da reivindicação 42, onde o do-mínio transmembrana S5-S6 é de KCNQ1 humano.

44. Polipeptídeo KCNQ5 isolado da reivindicação 42, onde a se-qüência de aminoácidos do polipeptídeo KCNQ5 compreende SEQ ID NO: 4com aminoácidos 257-354 substituídos com o domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1.

45. Polipeptídeo KCNQ5 isolado da reivindicação 44, onde osaminoácidos 257-354 de SEQ ID NO: 4 estão substituídos com SEQ ID NO:-6.

46. Polipeptídeo KCNQ5 isolado contendo um domínio trans-membrana S5 de KCNQ1.

47. Polipeptídeo KCNQ5 isolado da reivindciação 46, onde odomínio transmembrana S5 é de KCNQ1 humano.

48. Polipeptídeo KCNQ5 isolado da reivindicação 46, onde a se-qüência de aminoácidos do polipeptídeo KCNQ5 compreende SEQ ID NO: 4com aminoácidos 257-291 substituídos com o domínio transmembrana S5de KCNQ1.49. Polipeptídeo KCNQ5 isolado da reivindicação 48, onde ami-noácidos 257-291 de SEQ ID NO: 4 estão substituídos com aminoácidos 1-35 de SEQ ID NO: 6.

49. <claim missing in original page>

50. Um canal dimérico KCNQ compreendendo pelo menos umasubunidade KCNQ5 que é o polipeptídeo isolado da reivindicação 29, 42, ou 46.

51. Canal dimérico KCNQ da reivindicação 50, onde ambas su-bunidades de canal são o polipeptídeo isolado da reivindicação 29, 42, ou 46.

52. Canal dimérico de KCNQ da reivindicação 50, onde uma su-bunidade é KCNQ3.

53. Canal dimérico de KCNQ da reivindicação 52, onde a subu-nidade KCNQ3 é KCNQ3 humano.

54. Canal tetramérico KCNQ compreendendo pelo menos umasubunidade KCNQ5 que é o polipeptídeo isolado de reivindicação 29, 42 ou 46.

55. Canal tetramérico de KCNQ da reivindicação 54, onde doisdas quatro subunidades de canal são o polipeptídeo isolado da reivindicação- 29, 42 ou 46.

56. Canal tetramérico de KCNQ da reivindicação 55, onde trêsdas quatro subunidades de canal são o polipeptídeo isolado da reivindicação- 29, 42, ou 46.

57. canal tetramérico de KCNQ da reivindicação 56, onde todasas quatro subunidades de canal são o polipeptídeo isolado da reivindicação- 29, 42 ou 46.

58. canal tetramérico de KCNQ da reivindicação 54, onde pelomenos uma subunidade é KCNQ3.

59. Canal tetramérico de KCNQ da reivindicação 58, onde a su-bunidade KCNQ3 é KCNQ3 humano.

60. Processo de seleção para agentes, o processo compreen-dendo:(a) contato de um agnete com uma molécula de KCNQ5 selecio-nada do grupo consistindo em:(i) um polinucleotídeo condificando todo ou uma porção de umpolipeptídeo KCNQ5(W270L);(ii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1;(iii) um poinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio transmembrana S5 de KCNQ1;(iv) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá-cidos de um polipeptídeo KCNQ5(W270L);(v) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembra-na S5-S6 de KCNQ1; e(vi) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmem-brana S5 de KCNQ1; e(b) detectando um efeito do dito agente sobre a atividade dèKCNQ5;onde detecção de uma diminuição ou um aumento em atividade de KCNQ5é indicativa de um agente sendo um modulador de KCNQ5.

61. Processo da reivindicação 60, onde a atividade de KCNQ5 éa redução de excitabilidade neuronal ou calma de músculos lisos de bexigaurinária.

62. Processo da reivindicação 60, onde a atividade de KCNQ5 édetectada através de medição eletrofisiológica de magnitude de corrente deíons de canais KCNQ5.

63. Processo da reivindicação 60 realizado através de um ensaioisento de células.

64. Processo de seleção para agentes, o processo compreendendo:(a) contato de uma célula com um agente; e(b) determinação de nível de expressão de uma molécula deKCNQ5 selecionada do grupo consistindo em:(i) um polinucleotídeo codificando todo ou uma porção de umpolipeptídeo KCNQ5(W270L);(ii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1;(iii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio transmembrana S5 de KCNQ1;(iv) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá-cidos de um polipeptídeo KCNQ5(W270L);(v) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembra-na S5-S6 de KCNQ1; e(vi) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmem-brana S5deKCNQ1 ;onde detecção de uma diminuição ou aumento em expressão de KCNQ5 éindicativa de um agnete sendo um modulador de KCNQ5.

65. Agente identificado através do processo de qualquer umadas reivindicações 60-64.

66. Agente da reivindicação 65, onde o agente é um análogo deretigabina.

67. Agente da reivindicação 65, onde o agnte é um análogo deum composto da fórmula:onde:R1 é selecionado de hdrogênio, CrC6-alquila, C2-C6-alcanoíla ouo radical Ar;R2 é selecionado de hidrogênio ou CrC6-alquila;R3 é selecionado de CrC6-alcoxi, NH2, Ci-C6-alquil amino, CrC6-Clialquil amino, amino substituído com o radical Ar, CrC6-alquila, C2-C6-alquenila, C2-C6-alquinila, o radical Ar ou o radical ArO--;R4 é selecionado de hidrogênio, C1-C6-alquila ou o radical Ar;R5 é selecionado de hidrogênio ou C1-C6-alquila ou o radical Ar;Alq é um grupo alquileno reto ou ramificado com 1-9 átomos decarbono, que também pode estar substituído com o radical Ar;Ar é um radical fenila substituído com os radicais R6, R7 e/ou R8onde estes radicais R6, R7 e R8 são idênticos ou diferentes e representam H,C1-C6-alquila, C3-C7-Cido alquila, hidroxi, C1-C6-alcoxi, C2-C6-alcanoiloxi, ha-logênio, hidroxi, C1-C6-halogênio alquila, --CN, --NH2, --NH--C1-C6-alquila, --N(C1-C6-alquil)2, --CO2H, --CO--C1-C6-alquila, -C0-0-C1-C6-alquila, --COAr, --CO--OAr1 -CONH2, -CONH-C1-C6-alquila, --CONiC1-C6-alquil)2, -CONHAr, -NH-CO-C1-C6-alquila, --NHCO--Ar, --NHCO--C1-C6-alcoxi, -N--H-CO-Ar, -NHCO-NH2, -NHCO-N(-CrC6-alquila)2, -NHCO-NHAr, -NH-SO2-C1-C6-alquila, -NH-SO2Ar, -NH-S02-nitro fenila, -SO2-OH, ~S02-CrC6-alquila, -SO2-Ar, -S02-C1-C6-alcoxi, -SO2--OAr, -SO2-NH2, -SO2--NH-C1-C6-alquila, -SO2-N(C1-C6-alquila)2, -SO2-NHAr, -SO2-C2-C6-alcoxi;η é O ou 1.

68. (cancelada)

69. (cancelada)

70. (cancelada)

71. Processo para identificação de polipeptídeos capazes deligarem-se a um polipeptídeo KCNQ5 compreendendo:(a) aplicação a um mamífero de um procedimento de dois híbri-dos onde uma seqüência codificando um polipeptídeo KCNQ5 é carreadapor um vetor híbrido e uma seqüência de uma biblioteca de ADNc ou ADNgenômico é carreada pelo segundo vetor híbrido, onde o polipeptídeoKCNQ5 é selecionado do grupo consistindo em:(i) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá-cidos de um polipeptídeo KCNQ5(W270L);(ii) um polipeptíeo KCNQ5 contendo um domínio transmembranaS5-S6 de KCNQ1; e(iii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo domínio transmembranaS5 de KCNQ1;(b) transformação de célula hospedeira com os vetores;(c) isolamento de células transformadas positivas; e(d) extração do dito segundo vetor híbrido para obter uma se-qüência codificando um polipeptídeo que se liga ao polipeptídeo KÇNQ5.

72. Processo para deteção de um polipeptídeo KCNQ5 compre-endendo detecção de ligação de um anticorpo selecionado do grupo consis-tindo em:(a) üm anticorpo que se liga seletivamente a um polipeptídeoKCNQ5 compreendendo uma seqüência de aminoácidos de um polipeptídeoKCNQ5(W270L);(b) um anticorpo que se liga seletivamente a um polipeptídeoKCNQ5 contendo um domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1;(c) um anticorpo que se liga seletivamente a um polipeptídeoKCNQ5 contendo um domínio transmembrana S5 de KCNQ1; e(d) um anticorpo que se liga seletivamente a um fragmento depolipeptídeo KCNQ5(W270L) compreendendo pelo menos 8 aminoácidoscontíguos de SEQ ID NO: 2, onde o dito fragmento inclui aminoácido 270 deEQ ID NO: 2;a uma molécula em uma amostra suspeita de conter um polipeptídeoJCNQ5, um polipeptíeo KCNQ5(W270L), ou um fragmento de polipeptídeoKCNQ5(W270L), onde o anticorpo é contactado com a amostra sob condi-ções que permitem específica ligação com qualquer polipeptídeo KCNQ5,polipeptídeo KCNQ5(W270L), ou fragmento de polipeptídeo KCNQ5(W270L)presente na amostra e ligação do anticorpo à molécula na amotra indica apresença de um polipeptídeo KCNQ5, polipeptídeo KCNQ5(W270L), oufragmento de polipeptídeo KCNQ5(W270L).

73. Processo da reivindicação 72, onde a amostra é do sistemanervoso central, músculo de esqueleto, ou músculo liso de bexiga urinária.

74. Processo da reivindicação 73, onde a amostra de sistemanervoso central é do cérebro.

75. Processo para detecção de expressão de KCNQ5 compre-endendo detecção de ARNm codificando um polipeptídeo KCNQ5 selecio-nado do grupo consistindo em:(i) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá-cidos de um polipeptídeo KCNQ5(W270L);(ii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembra-na S5-S6 de KCNQ1; e(iii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo domínio transmembranaS5 de KCNQ1;em uma amostra de uma célula ou tecido suspeito de expressar KCNQ5com uma sonda compreendendo pelo menos 12 nucleotídeos contíguos deum polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em:(i) um polinucleotídeo codificando todo ou uma porção de umpolipeptídeo KCNQ5(W270L);(ii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1; e(iii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio transmembrana S5 de KCNQ1.

76. Processo da reivindicação 75, onde a sonda compreendepelo menos 12 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1 incluindo nucleotí-deos 808-810.

77. Processo da reivindicação 75, onde o tecido é cérebro, mús-culo de esqueleto, ou bexiga urinária.

78. Processo para determinação de se um gene KCNQ5 sofreumutação ou foi suprimido, compreendendo detecção, em uma amostra decélulas ou tecido de um sujeito, de presença ou ausência de uma alteraçãogenética caracterizada por pelo menos uma de uma alteração afetando aintegridade de um gene codificando uma proteína KCNQ5 ou a expressãoerrada de um gene KCNQ5, onde a etapa de detecção é realizada com pelomenos uma sonda ou iniciador compreendendo pelo menos 12 nucleotídeoscontíguos de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em:(i) um polinucleotídeo codificando todo ou uma porção de umpolipeptídeo KCNQ5(W270L);(ii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1; e(iii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio transmembrana S5 de KCNQ1.

79. Processo da reivindicação 78, onde a sonda ou primer com-preende pelo menos 12 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1 incluindonucleotídeos 808-810.

80. Processo da reivindicação 78, onde o tecido é cérebro, mús-culo de esqueleto, ou bexiga urinária.

81. Processo de identificação de variantes de um polipeptídeoKCNQ5 compreendendo seleção de uma biblioteca combinatorial compre-endendo mutantes de KCNQ5 para agonistas ou antagonistas de polipeptí-deo KCNQ5; onde o polipeptídeo KCNQ5 é selecionado do grupo consisindoem:(i) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá-cidos de um polipeptídeo KCNQ5(W270L);(ii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembra-na S5-S6 de KCNQ1; e(iii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo domínio transmembranaS5 de KCNQ1.

82. Variante de KCNQ5 identificada através do processo da rei-vindicação 81.

83. Processo de isolamento de um polipeptídeo KCNQ5 com-preendendo:(a) contato de um anticorpo KCNQ5 com uma amostra suspeitade conter um polipeptídeo KCNQ5 selecionado do grupo consistindo em:(iv) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá-cidos de um polipeptídeo KCNQ5(W270L);(v) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembra-na S5-S6 de KCNQ1; e(vi) um polipeptídeo KCNQ5 contendo domínio transmembranaS5 de KCNQ1;(b) isolamento de um complexo de anticorpo KCNQ5 - polipeptí-deo KCNQ5 a partir da amostra.

84. Processo da reivindicação 83, onde o anticorpo é seleçiona-do do grupo consistindo em:(a) um anticorpo que liga especificamente um polipeptídeoKCNQ5 compreendendo SEQ ID NO: 2; e(b) um anticorpo que liga especificamente um fragmento de poli-peptídeo KCNQ5 compreendendo pelo menos 8 aminoácidos contíguos deSEQ ID NO: 2, onde o dito fragmento inclui aminoácido 270 de SEQ ID NO: 2.

85. Processo de rodução de um polipeptídeo KCNQ5 compreendendo:(a) cultura de uma célula hospedeira transformada compreen-dendo um vetor de expressão;onde o dito vetor de expressão compreende um polinucleotídeo selecionadodo grupo consistindo em:(i) um polinucleotídeo codificando todo ou uma porção de umpolipeptídeo KCNQ5(W270L);(ii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1; e(iii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio transmembrana S5 de KCNQ1.em um meio apropriado de modo que um polipeptídeo KCNQ5 seja produzido;e(b) opcionalmente, recuperando o polipeptídeo KCNQ5 de etapa (a).

86. (cancelada)

87. (cancelada)

88. (cancelada)

89. (cancelada)

90. Processo para obtenção de anticorpos polipeptídeos anti-KCNQ5 compreendendo:(a) imunização de um animal com um polipeptídeo KCNQ5 imu-nogênico ou uma sua porção imunogênica única para um polipeptídeoKCNQ5, onde o dito polipeptídeo KCNQ5 é selecionado do grupo consistindo em(i) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá-cidos de um polipeptídeo KCNQ5(W270L);(ii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembra-na S5-S6 de KCNQ1; e(iii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmem-brana S5 de KCNQ1; e(b) isolando anticorpos a partir dó animal, que se ligam especifi-camente a um polipeptídeo KCNQ5.

91. Processo da reivindicação 90, onde o polipeptídeo KCNQ5 éSEQ ID NO: 2.

92. Processo para ensaio de habilidade de um polipeptídeoKCNQ5 codificar um canal de Tons funcional compreendendo:(a) transfecção de uma célula hospedeira com um polinucleotí-deo codificando um polipeptídeo KCNQ5 selecionado do grupo consistindo em:(i) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá-cidos de um polipeptídeo KCNQ5(W270L);(ii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembra-na S5-S6 de KCNQ1; e(iii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmem-brana S5 de KCNQ1;(b) expressão de polipeptídeo KCNQ5 na célula hospedeira; e(c) medição eletrofisiológica de magnitude de corrente de íonsdo polipeptídeo KCNQ5.

93. Processo da reivindicação 92, onde a etapa (c) é realizadaatravés de gravação de célula integra! ou grampeamento de voltagem dedois eletrodos.

94. Processo da reivindicação 93, onde a gravação de célulaintegral a célula hospedeira é uma célula mamífera.

95. Processo da reivindicação 93, onde em grampeamento devoltagem de dois eletrodos a célula hospedeira é um oócito de Xenopus Iae-vis.

96.(cancelada)

97.(cancelada)

98. Kit para detecção de polipeptídeo ou polinucleotídeo KCNQ5compreendendo:(a) um composto marcado ou agente capaz de detectar um poli-peptídeo ou polinucleotídeo KCNQ5 em uma amostra biológica;(b) meios para determinação de quantidade de polipeptídeo oupolinucleotídeo KCNQ5 na amostra;(c) meios para comparar a quantidade de polipeptídeo ou polinu-cleotídeo KCNQ5 na amostra com um padrão; e(d) opcionalmente, instruções para uso de kit para detectar poli-peptídeo ou polinucleotídeo KCNQ5;onde o polipeptídeo ou polinucleotídeo KCNQ5 é selecionado do grupo con-sistindo em:(i) um polinucleotídeo codificando todo ou uma porção de umpolipeptídeo KCNQ5(W270L);(ii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1;(iii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio transmembrana S5 de KCNQ1;(iv) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá-cidos de um polipeptídeo KCNQ5(W270L);(v) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembra-na S5-S6 de KCNQ1; e(vi) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmem-brana S5 de KCNQ1.

99. Kit para identificação de moduladores de atividade deKCNQ5 compreendendo:(a) uma célula ou composição compreendendo um polipeptídeoKCNQ5;(b) meios para determinação de atividade de polipeptídeoKCNQ5; e(c) opcionalmente, instruções para uso de kit para identificarmoduladores de atividade KCNQ5;onde o polipeptídeo KCNQ5 é selecionado do grupo consistindo em:(i) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá-cidos de um polipeptídeo KCNQ5(W270L);(ii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembra-na S5-S6 de KCNQ1; e(iii) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmem-brana S5 de KCNQ1.

100. Kit para diagnóstico de um distúrbio associado com expres-são e/ou atividade aberrante de KCNQ5 em um sujeito compreendendo:(a) um reagente para determinação de expressão de polipeptí-deo ou polinucleotídeo KCNQ5;(b) um controle ao qual os resultados do sujeito são comparados; e(c) opcionalmente, instruções para uso do kit para propósitosdiagnósticos;onde o polipeptídeo ou polinucleotídeo KCNQ5 é selecionado do grupo con-sistindo em:(i) um polinucleotídeo codificando todo ou uma porção de umpolipeptídeo KCNQ5(W270L);(ii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1;(iii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio transmembrana S5 de KCNQ1;(iv) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá-cidos de um polipeptídeo KCNQ5(W270L);(v) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembra-na S5-S6 de KCNQ1; e(vi) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmem-brana S5 de KCNQ1.

101. (nova) Uso de uma molécula de KCNQ5 na fabricação deum medicamento para o tratamento de incontinência urinária ou dor neuro-pática, onde a molécula de KCNQ5 é selecionada do grupo consistindo em:(i) um polinucleotídeo codificando todo ou uma porção de umpolipeptídeo KCNQ5(W270L);(ii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio transmembrana S5-S6 de KCNQ1;(iii) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo KCNQ5 con-tendo um domínio transmembrana S5 de KCNQ1;(iv) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá-cidos de um polipeptídeo KCNQ5(W270L);(v) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmembra-na S5-S6 de KCNQ1; e(vi) um polipeptídeo KCNQ5 contendo um domínio transmem-brana S5 de KCNQ1.