BRPI0707215A2 - composições de detergentes - Google Patents

Abstract

COMPOSIçõES DETERGENTES. A presente invenção refere-se a composições compreendendo determinadas variantes de lipase e um fotobranqueador, bem como processos para a produção e o uso dessas composições. Isso inclui o uso dessas composições para limpar e/ou tratar um local.

Description

Relatório Descritivo do Registro de Desenho Industrial para"COMPOSIÇÕES DETERGENTES".CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a composições compreendendolipases e alvejantes fotoativados, bem como a processos para a produção eo uso desses produtos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O aparecimento das enzimas Iipase adequadas a aplicações de-tergentes ofereceu ao formulador uma nova abordagem para otimizar a re-moção de graxais. Essas enzimas catalisam a hidrólise de triglicerídeos, queconsistem em um componente principal de muitas sujeiras gordurosas co-mumente encontradas, como sebo, gorduras de origem animal (por exemplobanha, manteiga líquida, manteiga) e óleos vegetais (por exemplo óleo deoliva, óleo de girassol, óleo de amendoim). No entanto, essas enzimas tipi-camente demonstravam um desempenho fraco no primeiro ciclo de lavageme, tipicamente, traziam consigo um odor desagradável oriundo, acredita-se,da hidrólise de gorduras presentes em sujeiras lácteas como leite, creme,manteiga e iogurte. Sem se ater à teoria, acredita-se que essas sujeiras se-jam propensas à geração de odor desagradável induzida por lipase, já quecontêm triglicerídeos funcionalizados com unidades acila graxa de cadeiacurta (por exemplo C4), que liberam ácidos graxos voláteis malcheirosos a-pós a lipólise. Mesmo quando o desempenho dessas enzimas foi aprimora-do, o problema de odor desagradável permaneceu. Portanto, o uso dessatecnologia estava gravemente limitado.

Descobriu-se que a combinação de um fotobranqueador com de-terminadas variantes de lipase dá origem a benefício de desempenho delimpeza otimizado, ao mesmo tempo em que minimiza o odor desagradávelinaceitável. Sem se ater à teoria, acredita-se que os seguintes mecanismosdêem origem a tais benefícios: remoção otimizada de manchas compreen-dendo materiais à base de carotenóides, antocianinas, porfirinas, taninose flavinas, por exemplo caril, molho de pimenta, molhos à base de tomatepara massas, café e chá, devido à ação sinérgica entre a lipase e o foto-branqueador, bem como à oxidação da enzima Iipase pelo fotobranqueador,após a lavagem, por exemplo durante a secagem do local limpo ou tratado,levando assim a uma redução no odor desagradável.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a composições compreendendoum fotobranqueador e uma variante de Iipase com potencial reduzido parageração de odores e um bom desempenho relativo, sem a ligação de umaextensão carbóxi-terminal. A variante de Iipase é obtida mediante a introdu-ção de mutações em uma ou mais regiões identificadas na Iipase original. Avariante assim obtida precisa ter uma atividade de Iipase que não seja me-nor que 80% da atividade da Iipase original, expressa como DesempenhoRelativo.

Alinhamento de seqüências de lipases.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

A SEQ. ID ns 1 mostra a seqüência de DNA codificando Iipase apartir de Thermomyces lanoginosus.

A SEQ. ID n- 2 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipa-se obtida de Thermomyces lanoginosus.

A SEQ. ID nQ 3 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipa-se obtida de Absidia reflexa.A SEQ. ID nQ 4 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipa-se obtida de Absidia corymbifera.

A SEQ. ID nQ 5 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipa-se obtida de Rhizomucor miehei.

A SEQ. ID ns 6 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipa-se obtida de Rhizopus oryzae.

A SEQ. ID n9 7 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipa-se obtida de Aspergillus niger.

A SEQ. ID nQ 8 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipa-se obtida de Aspergillus tubingensis.

A SEQ. ID ne 9 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipa-se obtida de Fusarium oxysporrum.

A SEQ. ID ne 10 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Ii-pase obtida de Fusarium heterosporum.

A SEQ. ID n- 11 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Ii-pase obtida de Aspergillus oryzae.

A SEQ. ID nQ 12 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Ii-pase obtida de Penicillium camemberti.

A SEQ. ID nQ 13 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Ii-pase obtida de Aspergillus foetidus.

A SEQ. ID n9 14 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Ii-pase obtida de Aspergillus niger.

A SEQ. ID ns 15 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Ii-pase obtida de Aspergillus oryzae.

A SEQ. ID ne 16 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Ii-pase obtida de Landerina penisapora.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições

Para uso na presente invenção, o termo "composição de limpe-za" inclui, exceto onde indicado em contrário: agentes de lavagem para múl-tiplas finalidades ou para "tarefas pesadas", sob a forma de grânulos ou pó,especialmente detergentes para lavagem de roupas, agentes de lavagempara múltiplas finalidades, sob a forma de líquido, gel ou pasta, especialmen-te aqueles do tipo líquido para tarefas pesadas, detergentes líquidos paratecidos finos, agentes para lavagem de pratos à mão ou agentes para Iava-gem de pratos do tipo para tarefas leves, especialmente aqueles do tipo comalta formação de espuma, agentes para lavagem de pratos à máquina, inclu-sive os diversos tipos sob a forma de tabletes, grânulos, líquidos e de auxílioao enxágüe, para uso doméstico e institucional, agentes líquidos para limpe-za e desinfecção, inclusive dos tipos como bactericida para lavagem dasmãos, sabão em barra para lavanderia, enxaguatórios bucais, limpadores dedentadura, xampus para limpeza de carros ou tapetes, limpadores para ba-nheiros, xampus e condicionadores para cabelo, géis de banho e banhos deespuma, e limpadores para metal, bem como produtos auxiliares de limpezacomo aditivos para alvejamento e produtos do tipo "bastão removedor demanchas" ou produtos de pré-tratamento.

Para uso na presente invenção, a expressão "é independente-mente selecionado do grupo consistindo em... " significa que as porções ouelementos que são selecionados do grupo de Markush mencionado podemser iguais, podem ser diferentes, ou podem consistir em qualquer mistura deelementos.

Os métodos de teste descritos na seção de Métodos de Teste dopresente pedido de patente precisam ser usados para determinar os valoresrespectivos dos parâmetros das invenções das Requerentes.

Exceto onde especificado em contrário, todos os teores de com-ponentes ou da composição referem-se ao teor ativo do componente ou dacomposição, e excluem impurezas, como solventes residuais ou subprodu-tos, que possam estar presentes nas fontes disponíveis comercialmente.

Todas as porcentagens e razões são calculadas em peso, exce-to onde indicado em contrário. Todas as porcentagens e razões são calcula-das com base no total da composição, exceto onde indicado em contrário.

Deve-se compreender que cada limite numérico máximo men-cionado neste relatório descritivo inclui todos os limites numéricos inferiores,como se tais limites numéricos inferiores estivessem expressamente regis-trados no presente documento. Gada limite numérico mínimo mencionadoneste relatório descritivo inclui cada um dos limites numéricos superiores,como se tais limites numéricos superiores estivessem expressamente regis-trados no presente documento. Cada intervalo numérico mencionado nesterelatório descritivo inclui cada intervalo numérico mais restrito que esteja si-tuado dentro desse intervalo numérico mais amplo, como se tais intervalosnuméricos mais restritos estivessem expressamente registrados no presentedocumento.

Todos os documentos citados estão, em suas partes relevantes,aqui incorporados por referência, sendo que a menção a qualquer documen-to não deve ser interpretada como admissão de que este represente técnicaanterior com respeito à presente invenção.

Composições

As composições da presente invenção tipicamente contêm decerca de 0,0001% a cerca de 1%, de cerca de 0,0002% a cerca de 0,5%, oumesmo de cerca de 0,0005% a cerca de 0,3% de fotobranqueador e de cer-ca de 0,0005% a cerca de 0,1%, de cerca de 0,001% a cerca de 0,05%, oumesmo de cerca de 0,002% a cerca de 0,03% de lipase.

Essas composições pode assumir qualquer forma, por exemplo,a forma de uma composição para limpeza e/ou de uma composição de tra-tamento.

A quantidade restante de quaisquer aspectos das composiçõesde limpeza anteriormente mencionadas é formada por um ou mais materiaisauxiliares.

Variantes de lipase adequadas

A lipase da composição da presente invenção consiste em vari-antes de lipase sem extensão carbóxi-terminal, porém com mutações intro-duzidas em determinadas regiões de uma lipase original, de modo que atendência a gerar odores fica reduzida.

Lipase original

A lipase original pode ser uma lipase fúngica com uma seqüên-cia de aminoácidos tendo pelo menos 50% de homologia, conforme definidona seção "Homologia e alinhamento", com a seqüência da lipase de T. Ianu-ginosus mostrada na SEQ. ID n9 2.

A lipase original pode ser um polipeptídeo de levedura como umpolipeptídeo de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizo-saccharomyces ou Yarrowia ou, com mais preferência, um polipeptídeo defungo filamentoso, como um polipeptídeo de Acremonium, Aspergillus, Aure-obasidium, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe,Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicilli-um, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Toly-pocladium ou Trichoderma.

Em um aspecto preferencial, a lipase original é um polipeptídeocom atividade de lipase, proveniente de Saccharomyces earlsbergensis,Saccharomyees cerevisiae, Saccharomyees diastaticus, Saccharomyeesdouglasii, Saceharomyces kluyveri, Saccharomyees norbensis ou Saccha-romyces oviformis.

Em um outro aspecto preferencial, a lipase original é um polipep-tídeo de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus,Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillusniger, Aspergillus oryzae, Aspergillus turbigensis, Fusarium bactridioides,Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusariumgraminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium ne-gundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusa-rium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusa-rium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusariumvenenatum, Humicola insolens, Thermomyces Ianoginosus (sinônimo: Humi-cola lanuginosa), Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurosporacrassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichodermakoningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichodermaviride.

Em um outro aspecto preferencial, a lipase original é uma lipasede Thermomyces.

Em um aspecto mais preferencial, a lipase original é uma lipasede Thermomyces lanuginosus. Em uma modalidade ainda mais preferencial,a lipase original é a lipase de SEQ. ID ns 2.

Identificação de regiões e substituições.

As posições mencionadas nas Regiões de I a IV, abaixo, sãoposições dos resíduos de aminoácido na SEQ. ID ne 2. Para encontrar asposições correspondentes (ou homólogas) em uma lipase diferente, é usadoo procedimento descrito em "Homologia e alinhamento".

Substituições na Região I

A Região I consiste em resíduos de aminoácido circundando oresíduo N-terminal E1. Nessa região, é preferencial substituir um aminoácidoda lipase original com um aminoácido mais positivo. Os resíduos de aminoá-cido correspondentes às seguintes posições são compreendidos pela Regi-ão I: de 1 a 11 e de 223 a 239. As seguintes posições são de particular inte-resse: 1, 2, 4, 8, 11, 223, 227, 229, 231, 233, 234 e 236. Em particular, foramidentificadas as seguintes substituições: X1N/*, X4V, X227G, X231R eX233R.

Em uma modalidade preferencial, a Iipase original tem pelo me-nos 80%, como 85% ou 90%, como pelo menos 95% ou 96%, ou 97%, ou98%, ou 99% de identidade com SEQ. ID n9 2. Em uma modalidade da má-xima preferência, a Iipase original é idêntica a SEQ. ID n9 2.

Substituições na Região Il

A Região Il consiste em resíduos de aminoácido em contato como substrato em um lado da cadeia de acila e um lado da parte de álcool.

Nessa região, é preferencial substituir um aminoácido da Iipase original comum aminoácido mais positivo ou com um aminoácido menos hidrofóbico. Osresíduos de aminoácido correspondentes às seguintes posições são com-preendidos pela Região II: de 202 a 211 e de 249 a 269. As seguintes posi-ções são de particular interesse: 202, 210, 211, 253, 254, 255, 256 e 259.

Em particular, foram identificadas as seguintes substituições: X202G,X210K/W/A, X255Y/V/A, X256K/R e X259G/M/Q/V.

Em uma modalidade preferencial, a Iipase original tem pelo me-nos 80%, como 85% ou 90%, como pelo menos 95% ou 96%, ou 97%, ou98%, ou 99% de identidade com a SEQ. ID n9 2. Em uma modalidade damáxima preferência, a Iipase original é idêntica à SEQ. ID ns 2.

Substituições na Região Ill

A Região Ill consiste em resíduos de aminoácido que formamuma estrutura flexível permitindo, assim, que o substrato entre no sítio ativo.

Nessa região, é preferencial substituir um aminoácido da Iipase original comum aminoácido mais positivo ou com um aminoácido menos hidrofóbico. Osresíduos de aminoácido correspondentes às seguintes posições são com-preendidos pela Região III: de 82 a 102. As seguintes posições são de parti-cular interesse: 83, 86, 87, 90, 91, 95, 96 e 99. Em particular, foram identifi-cadas as seguintes substituições: X83T, X86V e X90A/R.Em uma modalidade preferencial, a Iipase original tem pelo me-nos 80%, como 85% ou 90%, como pelo menos 95% ou 96%, ou 97%, ou98%, ou 99% de identidade com a SEQ. ID nQ 2. Em uma modalidade damáxima preferência, a Iipase original é idêntica à SEQ. ID ns 2.

Substituições na Região IV

A Região IV consiste em resíduos de aminoácido que se ligameletrostaticamente a uma superfície. Nessa região, é preferencial substituirum aminoácido da Iipase original com um aminoácido mais positivo. Os resí-duos de aminoácido correspondentes às seguintes posições são compreen-didos pela Região IV: 27 e 54 a 62. As seguintes posições são de particularinteresse: 27, 56, 57, 58 e 60. Em particular, foram identificadas as seguintessubstituições: X27R, X58N/AG/T/P e X60V/S/G/N/R/K/A/L.

Em uma modalidade preferencial, a Iipase original tem pelo me-nos 80%, como 85% ou 90%, como pelo menos 95% ou 96%, ou 97%, ou98%, ou 99% de identidade com SEQ. ID ne 2. Em uma modalidade da má-xima preferência, a Iipase original é idêntica a SEQ. ID ne 2.Aminoácidos em outras posições

A Iipase original pode, opcionalmente, compreender substitui-ções de outros aminoácidos, especificamente menos que 10 ou menos que5 dessas substituições. Exemplos são substituições correspondentes a umaou mais das posições 24, 37, 38, 46, 74, 81, 83, 115, 127, 131, 137, 143,147, 150, 199, 200, 203, 206, 211, 263, 264, 265, 267 e 269 da Iipase origi-nal. Em uma modalidade específica, há uma substituição em pelo menosuma das posições correspondentes a 81, 143, 147, 150 e 249. Em uma mo-dalidade preferencial, pelo menos uma substituição é selecionada do grupoconsistindo em X81Q/E, X143S/C/N/D/A, X147M/Y, X150G/K e X249R/I/L.

A variante pode compreender substituições fora das Regiões deI a IV definidas, sendo que o número dessas substituições é, de preferência,menor que seis, ou menor que cinco, ou menor que quatro, ou menor quetrês, ou menor que duas, como cinco, ou quatro, ou três, ou duas ou uma.Alternativamente, a variante não compreende qualquer substituição fora dasRegiões de I a IV definidas.Além disso as substituições podem, por exemplo, ser feitas deacordo com os princípios conhecidos na técnica, por exemplo substituiçõesdescritas em WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079 eWO 97/07202.

Variantes da Iipase original

Em um aspecto, a dita variante, quando comparada à dita Iipaseoriginal, compreende um total de pelo menos três substituições, as quais sãoselecionadas de um ou mais dos seguintes grupos de substituições:

a) pelo menos duas, ou pelo menos três, ou pelo menos quatro,ou pelo menos cinco, ou pelo menos seis, como duas, três, quatro, cinco ouseis substituições na Região I,

b) pelo menos uma, pelo menos duas, ou pelo menos três, oupelo menos quatro, ou pelo menos cinco, ou pelo menos seis, como uma,duas, três, quatro, cinco ou seis substituições na Região II,

c) pelo menos uma, pelo menos duas, ou pelo menos três, oupelo menos quatro, ou pelo menos cinco, ou pelo menos seis, como uma,duas, três, quatro, cinco ou seis substituições na Região III,

d) e/ou pelo menos uma, pelo menos duas, ou pelo menos três,ou pelo menos quatro, ou pelo menos cinco, ou pelo menos seis, como uma,duas, três, quatro, cinco ou seis substituições na Região IV,

A variante pode compreender substituições, em comparação àIipase original da variante, correspondentes àquelas listadas abaixo na Ta-bela 1.

Tabela 1: Algumas variantes específicas

<table>table see original document page 10</column></row><table><table>table see original document page 11</column></row><table>

Em uma outra modalidade específica, a Iipase original é idênticaà SEQ. ID ne 2, e as variantes da Tabela 1 serão, portanto:

Tabela 2: Algumas variantes específicas da SEQ. ID ns 2

<table>table see original document page 11</column></row><table>

Nomenclatura para modificações de aminoácido

Na descrição das variantes de Iipase de acordo com a presenteinvenção, é usada a seguinte nomenclatura, para facilidade de referência:aminoácidos originais:posições:aminoácidos substituídos

De acordo com essa nomenclatura, por exemplo, a substituiçãodo ácido glutâmico por glicina na posição 195 é mostrada como G195E. Adeleção da glicina na mesma posição é mostrada como G195*, e a inserçãode um resíduo de aminoácido adicional, como lisina, é mostrada comoG195GK. Nos casos em que uma Iipase específica contém uma "deleção"em comparação com outras Iipases e uma inserção é feita nessa posição,isso é indicado como *36D para a inserção de um ácido aspártico na posição36. Mutações múltiplas são separadas por sinais de soma, isto é,R170Y+G195E, representando mutações nas posições 170 e 195, substitu-indo tirosina e ácido glutâmico por arginina e glicina, respectivamente.

X231 indica o aminoácido em um polipeptídeo original corres-pondente à posição 231, quando se aplica o procedimento de alinhamentodescrito. X231R indica que o aminoácido é substituído por R. Para a SEQ.ID n9 2 X é T, e X231R indica, portanto, uma substituição de T por R na posi-ção 231. Nos casos em que o aminoácido em uma posição (por exemplo231) pode ser substituído por outro aminoácido selecionado de um grupo deaminoácidos, por exemplo o grupo consistindo em R e P e Y, isso será indi-cado por X231 R/P/Y.

Em todos os casos, é empregada a abreviação IUPAC para ami-noácidos, de letra única ou tripla, comumente aceita.Agrupamento de aminoácidos

Neste relatório descritivo, os aminoácidos são classificados co-mo negativamente carregados, positivamente carregados ou eletricamenteneutros, de acordo com sua carga elétrica em pH 10. Portanto, os aminoáci-dos negativos são E, D, C (cisteína) e Y, particularmente E e D. Os aminoá-cidos positivos são R1 K e H, particularmente R e K. Os aminoácidos neutrossão G, A, V, L, P, F, W, S1 T Μ, N, Q e C, quando formando parte de umaponte dissulfeto. A substituição por outro aminoácido no mesmo grupo (ne-gativo, positivo ou neutro) é chamada de substituição conservativa.

Os aminoácidos neutros podem ser divididos em hidrofóbicos ounão-polares (G, A, V, L11, P1 F1 W e C como parte de uma ponte de dissulfeto)e hidrofílicos ou polares (S, T Μ, N, Q).

Identidade de aminoácidos

O nível de relacionamento entre duas seqüências de aminoácidoou entre duas seqüências de nucleotídeo é descrita pelo parâmetro "identi-dade".

Para os propósitos da presente invenção, o alinhamento de duasseqüências de aminoácido é determinado mediante o uso do programa Nee-dle, do pacote de software EMBOSS (http://emboss.org), Versão 2.8.0. Oprograma Needle implementa o algoritmo de alinhamento global descrito emNeedleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. A matrizde substituição usada é BLOSUM62, a penalidade por abertura de buraco éde 10, e a penalidade por ampliação de buraco é de 0,5.

O grau de identidade entre uma seqüência de aminoácidos dapresente invenção ("seqüência da invenção", por exemplo aminoácidos de 1a 269 da SEQ. ID ne 2) e uma seqüência de aminoácidos diferente ("se-qüência estranha") é calculado como o número de igualdades exatas em umalinhamento das duas seqüências, dividido pelo comprimento da "seqüênciada invenção" ou o comprimento da "seqüência estranha", aquela que formais curta. O resultado é expresso em porcentagem de identidade.

Uma igualdade exata ocorre quando a "seqüência da invenção"e a "seqüência estranha" têm resíduos de aminoácido idênticos nas mesmasposições da sobreposição. O comprimento de uma seqüência é o número deresíduos de aminoácido presentes na mesma (por exemplo, o comprimentoda SEQ. ID n9 2 é 269).

A lipase original tem uma identidade de aminoácidos de pelomenos 50% com a Iipase de T. Ianuginosus (SEQ. ID ns 2), particularmentepelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelomenos 90%, mais de 95% ou mais de 98%. Em uma modalidade específica,a lipase original é idêntica à Iipase de T. Ianuginosus (SEQ. ID n9 2).

O procedimento acima pode ser usado para cálculo de identida-de, bem como para homologia e alinhamento. No contexto da presente in-venção, a homologia e o alinhamento foram calculados conforme descritomais adiante neste documento.Homologia e alinhamento

Para os propósitos da presente invenção, o grau de homologiapode ser adequadamente determinado por meio de programas de computa-dor conhecidos na técnica, como o GAP, fornecido no pacote de programasGCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versão 8, agosto de1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin,EUA 53711) (Needleman, S.B. e Wunsch, C.D., (1970), Journal of MolecularBiology, 48, 443-45), usando-se o dito GAP com as seguintes configuraçõespara comparação de seqüências de polipeptídeos: penalidade para criaçãode espaços de 3,0 ("GAP criation penalty") e penalidade para criação de es-paços ("GAP criation penalty") de 0,1.

Na presente invenção, as posições correspondentes (ou homó-logas) nas seqüências de Iipase de Absidia reflexa, Absidia corymbefera,Rhizmucor miehei, Rhizopus deiemar, Aspergillus niger, Aspergillus tubigen-sis, Fusarium oxysporum, Fusarium heterosporum, Aspergillus oryzea, Peni-cilium camembertii, Aspergillus foetidus, Aspergillus niger, Thermomyces Ia-noginosus (sinônimo: Humicola lanuginosa) e Landerina penisapora são de-finidas pelo alinhamento mostrado na Figura 1.

Para encontrar as posições homólogas nas seqüências de Iipasenão mostradas no alinhamento, a seqüência de interesse é alinhada às se-qüências mostradas na Figura 1. A nova seqüência é alinhada ao presentealinhamento na Figura 1, mediante o uso de alinhamento GAP com a se-qüência mais homóloga encontrada pelo programa GAP. O programa GAP éfornecido no pacote de programas GCG (Program Manual for the WisconsinPackage, Versão 8, agosto 1994, Genetics Computer Group, 575 ScienceDrive, Madison, Wisconsin, EUA 53711) (Needleman, S.B. e Wunsch, C.D.,(1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45). São usadas as seguintesconfigurações para a comparação de seqüências de polipeptídeos: penali-dade de 3,0 para abertura de buraco e penalidade de 0,1 para ampliação deburaco.

A Iipase original tem uma homologia de pelo menos 50% com alipase de Τ. Ianuginosus (SEQ. ID η9 2), particularmente pelo menos 55%,pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, maisde 95% ou mais de 98%. Em uma modalidade específica, a lipase original éidêntica à Iipase de T. Ianuginosus (SEQ. ID ne 2).

Hibridização

A presente invenção refere-se, também, a polipeptídeos isoladoscom atividade de lipase, os quais são codificados por polinucleotídeos quese hibridizam sob condições de muito baixa estringência, de preferência sobcondições de baixa estringência, com mais preferência sob condições demédia estringência, com mais preferência sob condições de média-alta es-tringência, com mais preferência ainda sob condições de alta estringência e,com a máxima preferência, sob condições de muito alta estringência com (i)nucleotídeos de 178 a 660 da SEQ. ID n9 1, (ii) a seqüência de cDNA contidaem nucleotídeos de 178 a 660 da SEQ. ID n9 1, (iii) uma subseqüência de (i)ou (ii), ou (iv) um filamento complementar de (i), (ii) ou (iii) (J. Sambrook, E.F.Fritsch, e T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a.Edição, Cold Spring Harbor, New York, EUA). Uma subseqüência da SEQ. IDn- 1 contém pelo menos 100 nucleotídeos contíguos ou, de preferência, pelomenos 200 nucleotídeos contíguos. Além disso, a subseqüência pode codifi-car um fragmento de polipeptídeo que tem atividade de lipase.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos em com-primento, as condições de estringência de muito baixas a muito altas sãodefinidas como pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0,3%SDS, 200 ug/mL de DNA de esperma de salmão submetido a cisalhamento edesnaturado, e ou 25% de formamida para estringências muito baixas e bai-xas, 35% de formamida para estringências médias e médias-altas, ou 50%de formamida para estringências altas e muito altas, seguindo os padrões deprocedimentos para manchamento Southern para 12 a 24 horas, otimamente.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de com-primento, o material carreador é finalmente lavado três vezes cada um du-rante 15 minutos, mediante o uso de 2X SSC, 0,2% SDS, de preferência pe-lo menos a 45°C (muito baixa estringência), com mais preferência pelo me-nos a 50°C (baixa estringência), com mais preferência pelo menos a 55°C(média estringência), com mais preferência pelo menos a 60°C (média-altaestringência), com mais preferência ainda pelo menos a 65°C (alta estrin-gência) e, com a máxima preferência, pelo menos a 70°C (muito alta estrin-gência).

Seqüência de DNA, vetor de expressão, célula hospedeira, produção de Ii-pase

A invenção apresenta uma seqüência de DNA que codifica a Ii-pase da invenção, um vetor de expressão que abriga a seqüência de DNA, euma célula hospedeira transformada que contém a seqüência de DNA ou ovetor de expressão. Esses itens podem ser obtidos por métodos conhecidosna técnica.

A invenção apresenta, também, um método para produção de Ii-pase mediante a cultura da célula hospedeira transformada sob condiçõesapropriadas à produção da lipase, seguida da recuperação da dita Iipase apartir do caldo resultante. O método pode ser praticado de acordo com osprincípios conhecidos na técnica.Atividade de lipase

- Atividade de lipase em tributirina sob pH neutro (LU)

Um substrato para a lipase é preparado mediante a emulsifica-ção de tributirina (tributirato de glicerina), usando-se goma arábica comoemulsificante. A hidrólise de tributirina a 30°C e a um pH de 7 ou 9 é seguidaem um experimento de titulação pH-stat. Uma unidade de atividade de lipase(1 LU) é igual à quantidade de enzima capaz de liberar 1 micro mol de ácidobutírico/min sob pH 7.

- Relação risco/benefício

O fator risco/benefício descrevendo o desempenho em compa-ração ao risco reduzido para ocorrência de odores é definido como: RB =DRmédio/R- As variantes de lipase aqui descritas podem ter RBs maiores que1, maiores que 1,1, ou mesmo maiores que 1 até cerca de 1.000.

- Desempenho relativo médio

O procedimento para calcular desempenho relativo médio (DR-médio) é encontrado no Exemplo 5 do presente relatório descritivo. As vari-antes de Iipase aqui descritas podem ter um (DRmédio) de pelo menos 0,8.pelo menos 1,1, pelo menos 1,5, ou mesmo de pelo menos 2 a cerca de1.000.

Fotobranqueadores adequados

Fotobranqueadores adequados incluem fotobranqueadores cata-líticos e fotoiniciadores. Os fotobranqueadores catalíticos adequados inclu-em aqueles selecionados do grupo consistindo em ftalocianinas solúveis emágua com a seguinte fórmula:

<formula>formula see original document page 17</formula>

em que:

PC é o sistema de anel de ftalocianina;

Me é Zn, Fe(II), Ca, Mg1 Na, K, Al-Zi, Si(IV), P(V), Ti(IV), Ge(IV),Cr(VI), Ga(III), Zr(IV), In(III), Sn(IV) ou Hf(VI);

Zi é um haleto, sulfato, nitrato, carboxilato, alcanolato ou íon hi-droxila;

q é 0, 1 ou 2;

r é de 1 a 4;

Qi, é um grupo sulfo ou carboxila, ou um radical com a fórmula

-SO2X2-RrXa+, -O-R1-Xg+, ou -(CH2),-Y/;em que

R1 é um alquileno C1 -Ce ramificado ou não-ramificado, ou 1,3- ou1,4-fenileno;

X2 é -NH- ou -N-C1-C5 alquila;

X3+ é um grupo com a fórmula

<formula>formula see original document page 17</formula>

ou, caso R1 = C1-Cealquileno, também um grupo com a fórmula<formula>formula see original document page 18</formula>

Y1+ é um grupo com a fórmula

<formula>formula see original document page 18</formula>

t é 0 ou 1

sendo que, nas fórmulas acima

R2 e R3 são, independentemente um do outro, alquila C1-C6;

R4 é alquila C1-C5, cicloalquila C5-C7 ou NR7R8;

R5 e R6 são, independentemente um do outro, alquila C1-C5;

R7 e Re são, independentemente uns do outros, hidrogênio oualquila C1-C5;

Rg e R10 são, independentemente uns do outros, alquila C1-C6não-substituída ou alquila C1-C6 substituída com hidroxila, ciano, carboxila,Carb-C1-C6alcóxi, alcóxi C1-C6,fenila, naftila ou piridila;

u é de 1 a 6;

A1 é uma unidade que completa um heterociclo de nitrogênio a-romático com 5 a 7 membros que pode, quando adequado, também conterum ou dois outros átomos de nitrogênio como membros do anel, e

B1 é uma unidade que completa um heterociclo de nitrogênio sa-turado com 5 a 7 membros que pode, quando adequado, também conter de1 a 2 átomos de nitrogênio, oxigênio e/ou átomos de enxofre como membrosdo anel;

Q2 é hidroxila, alquila C1- C22, alquila C3-C22 ramificada, alquenilaC2- C22, alquenila C3-C22 ramificada e misturas dos mesmos, alcóxi CrÇ22,um radical sulfo ou carboxila, um radical com a seguinte fórmula

<formula>formula see original document page 18</formula><formula>formula see original document page 19</formula>

um radical alcóxi ramificado com a seguinte fórmula

<formula>formula see original document page 19</formula>

uma unidade alquil etilenóxi com a seguinte fórmula

<formula>formula see original document page 19</formula>

ou um éster com a seguinte fórmula

<formula>formula see original document page 19</formula>

em que

B2 é hidrogênio, hidroxila, alquila C1-C30, alcóxi C1- C30, -CO2H1-CH2COOH, -SO3-M1, - OSO3-M1, -POs2-M1, -OPOs2-M1 e misturas dos mes-mos;B3 é hidrogênio, hidroxila, -COOH, -SO3-M1, -OSO3 M1 ou alcóxiC1-Ce;

M1 é um cátion solúvel em água;T1 é -O- ou -NH-;

X1 e X4 são, independentemente um do outro, -O-, -NH- ou -N-C1-C5 alquila;

R11 e R12 são, independentemente um do outro, hidrogênio, umgrupo sulfo e seus sais, um grupo carboxila e seus sais ou um grupo hidroxi-la, sendo que pelo menos um dos radicais Rn e R12 é um grupo sulfo oucarboxila, ou seus sais,

Y2 é -O-, -S-, -NH- ou -N-Ci-C5alquila;

Ri3 e R14 são, independentemente um do outro, hidrogênio, al-quila C1-C6, Ndroxi-C1-C6 alquila, Ciano-C1-C6 alquila, sulfo- C1-C6 alquila,carbóxi ou halogeno-C-i-C6 alquila, fenila não-substituída ou fenila substituídacom halogênio, alquila C1-C4 ou alcóxi C1-C4, sulfo ou carboxila ou R13 e R14juntos com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados para formar um anelheterocíclico saturado de 5 ou 6 membros que, adicionalmente, pode tam-bém conter um átomo de nitrogênio ou oxigênio como um membro do anel;

R15 e Ri6 são, independentemente um do outro, radicais alquilaC1-C6OuariIa-C1-CeaIquiIa;

R17 é hidrogênio, uma alquila C1-C6 não-substituída ou uma al-quila C1-C6 substituída com halogênio, hidroxila, ciano, fenila, carboxila,Carb-C1-C6 alcóxi ou alcóxi C1-C6;

R18 é alquila C1- C22, alquila C3-C22 ramificada, alquenila C1-C22ou alquenila C3- C22 ramificada, glicol C3-C22, alcóxi C1-C22, alcóxi C3-C22 ra-mificado e misturas dos mesmos;

M é hidrogênio, ou um íon de metal alcalino ou íon amônio,

Z2" é um íon cloro, bromo, alquilsulfato ou arilsulfato;

a é O ou 1;

b é de O a 6;

c é de O a 100;

d é O ou 1;e é de 0 a 22;

ν é um número inteiro de 2 a 12;

w é 0 ou 1; e

A" é um ânion orgânico ou inorgânico, e

sé igual a r nos casos de ânions monovalentes A" e menor queou igual a r nos casos de ânions polivalentes, o que é necessário para queAs' compense a carga positiva, sendo que, quando r não é igual a 1, os radi-cais Qi podem ser idênticos ou diferentes,

e sendo que o sistema de anel de ftalocianina pode, também,compreender outros grupos solubilizantes;

Outros fotobranqueadores catalíticos adequados incluem coran-tes xanteno e misturas dos mesmos. Em outro aspecto, o fotobranqueadorescatalíticos adequados incluem fotobranqueadores catalíticos selecionadosdo grupo consistindo em ftalocianina de zinco sulfonatada, ftalocianina dealumínio sulfonatada, eosina Y, foxina B, rosa de bengala, Vermelho Comes-tível I.C. 14 e misturas dos mesmos. Em outro aspecto, um fotobranqueadoradequado pode ser uma mistura de ftalocianina de zinco sulfonatada e ftalo-cianina de alumínio sulfonatada, sendo que a dita mistura tem uma razão depeso entre ftalocianina de zinco sulfonatada e ftalocianina de alumínio sulfo-natada maior que 1, maior que 1 porém menor que cerca de 100, ou mesmode cerca de 1 a cerca de 4.

Os fotoiniciadores adequados incluem aqueles selecionados dogrupo consistindo em 1,4-quinonas aromáticas, como antraquinonas e nafta-quinonas, alfa aminocetonas, particularmente aquelas contendo uma porçãobenzoíla, de outro modo denominada alfa-amino acetofenonas, alfa-hidróxicetonas, particularmente alfa-hidróxi acetofenona, fotoiniciadores contendofósforo, inclusive óxido de monoacil, bisacil e trisacil fosfina e sulfetos, dial-cóxi acetofenonas, alfa-haloacetofenonas, óxidos de trisacil fosfina, benzoí-na e fotoiniciadores à base de benzoína, e misturas dos mesmos. Em outroaspecto, os fotoiniciadores adequados incluem aqueles selecionados dogrupo consistindo em 2-etil antraquinona, vitamina K3, 2-sulfato-antraqui-nona, 2-metil 1-[4-fenil]-2-morfolinopropan-1-ona (Irgacure® 907), (2-benzil-2-dimetilamino-1-(4-morfolinofenil)-butan-1-ona (Irgacure® 369), (1-[4-(2-hidróxi etóxi)-fenil]-2 hidróxi-2-metil-1-propan-1-ona) (Irgacure® 2959), 1-hidróxi cicloexil-fenilcetona (Irgacure® 184), oligo[2-hidróxi 2-metil-1-[4(1-metil)-fenil] propanona (Esacure® KIP 150), óxido de 2-4-6-(trimetil benzo-il)difenil-fosfina, óxido de bis(2,4,6-trimetil benzoil)-fenil-fosfina (Irgacure®819), éster etílico de ácido (2,4,6 trimetil benzoil)fenil fosfínico (Lucirin®TPO-L) e misturas dos mesmos.

Os alvejantes fotoativados anteriormente mencionados podemser usados em combinação (qualquer mistura de alvejantes fotoativados po-de ser usada). Os alvejantes fotoativados adequados podem ser obtidos jun-to à Aldrich, Milwaukee, Wisconsin, EUA, Frontier Scientific, Logan, Utah,EUA, Ciba Specialty Chemicals, Basel, Suíça, BASF, Ludwigshafen, Alema-nha, Lamberti S.p.A, Gallarate, Itália, Dayglo Color Corporation, Mumbai,índia, Organic Dyestuffs Corp., East Providence, Rhode Island, EUA, e/ouproduzidos de acordo com os exemplos aqui contidos.

Materiais auxiliares

Embora não essencial para os propósitos da presente invenção,a lista não-limitadora de compostos auxiliares mostrada mais adiante nestedocumento é adequada ao uso nas composições instantâneas e pode serdesejavelmente incorporada em certas modalidades da invenção, por exem-plo para auxiliar ou melhorar o desempenho da limpeza, para tratamento dosubstrato a ser limpo ou para modificar a estética da composição de limpeza,como no caso de perfumes, corantes ou similares. À natureza exata dessescomponentes adicionais, bem como seus níveis de incorporação, dependeráda forma física da composição e da natureza da operação de limpeza emque será utilizada. Os materiais auxiliares adequados incluem, mas não selimitam a, tensoativos, builders, agentes quelantes, agentes inibidores detransferência de corantes, dispersantes, enzimas adicionais e estabilizantesde enzimas, materiais catalíticos, ativadores de alvejamento, peróxido dehidrogênio, fontes de peróxido de hidrogênio, perácido pré-formado, agentespoliméricos dispersantes, remoção de sujeira à base de argila/agentes antir-redeposição, alvejantes, supressores de espuma, corantes, agentes de ma-tiz para tecidos, perfumes, agentes elastificantes de estrutura, amaciantesde tecidos, veículos, hidrótropos, elementos auxiliares ao processamento,solventes e/ou pigmentos. Em adição à descrição abaixo, os exemplos ade-quados desse tipo de compostos auxiliares, bem como seus teores de uso,são encontrados nas patentes U.S. n2 5.576.282, 6.306.812 B1 e 6.326.348B1, que estão aqui incorporadas a título de referência.

Conforme consta, os ingredientes auxiliares não são essenciaisàs composições das Requerentes. Portanto, determinadas modalidades dascomposições das Requerentes não contêm um ou mais dos seguintes mate-riais auxiliares: tensoativos, builders, agentes quelantes, agentes inibidoresde transferência de pigmentos, dispersantes, enzimas adicionais e estabili-zantes de enzimas, materiais catalíticos, ativadores de alvejamento, peróxi-do de hidrogênio, fontes de peróxido de hidrogênio, perácidos pré-formados,agentes poliméricos dispersantes, agentes de remoção de sujeira/ antirrede-posição à base de argila, clareadores, supressores de espuma, corantes,perfumes, agentes elasticizantes de estrutura, amaciantes de tecido, veícu-los, hidrótropos, elementos auxiiiares ao processamento, solventes e/oupigmentos. No entanto, quando estão presentes um ou mais compostos au-xiliares, estes podem estar presentes conforme detalhado abaixo:

Agentes de alvejamento - As composições de limpeza da pre-sente invenção podem compreender um ou mais agentes de alvejamento.Os agentes de alvejamento adequados, outros que não os catalisadores dealvejamento, incluem alvejantes fotoativados, ativadores de alvejamento,peróxido de hidrogênio, fontes de peróxido de hidrogênio, perácidos pré-formados e combinações dos mesmos. Em geral, quando é usado um agen-te de alvejamento, as composições da presente invenção podem compreen-der de cerca de 0,1% a cerca de 50%, ou mesmo de cerca de 0,1% a cercade 25% de agente de alvejamento, em peso da presente composição paralimpeza. Exemplos de agentes de alvejamento adequados incluem:

(1) perácidos pré-formados: Os perácidos pré-formados ade-quados incluem, mas não se limitam a, compostos selecionados do grupoconsistindo em ácidos e sais percarboxílicos, ácidos e sais percarbônicos,ácidos e sais perimídicos, ácidos e sais peroximonossulfúricos, por exemploOxzone®, e combinações dos mesmos. Os ácidos percarboxílicos adequa-dos incluem perácidos hidrofóbicos e hidrofílicos tendo a fórmula R-(C=O)O-O-M, em que R é um grupo alquila, opcionalmente ramificado tendo, quandoo perácido é hidrofóbico, de 6 a 14 átomos de carbono, ou de 8 a 12 átomosde carbono e, quando o perácido é hidrofílico, menos de 6 átomos decarbono, ou mesmo menos de 4 átomos de carbono, sendo que M é umcontraíon, por exemplo sódio, potássio ou hidrogênio;

(2) fontes de peróxido de hidrogênio, por exemplo sais deperidrato inorgânicos, inclusive sais de metais alcalinos como sais sódicosde perborato (geralmente mono ou tetraidrato), percarbonatò, persulfato,perfosfato, sais de persilicato e misturas dos mesmos. Em um aspecto dainvenção, os sais de peridrato inorgânicos são selecionados a partir dogrupo consistindo em sais sódicos de perborato, de percarbonato, e combin-ações dos mesmos. Quando utilizados, os sais de peridrato inorgânicosestão, tipicamente, presentes em quantidades de 0,05 a 40%, em peso, oude 1 a 30%, em peso do totaí da composição estando, tipicamente, incor-porados nessas composições sob a forma de um sólido cristalino que podeser revestido. Os revestimentos adequados incluem sais inorgânicos comometal alcalino silicato, carbonato ou sais de borato ou misturas dos mesmos,ou materiais orgânicos como água-solúvel ou polímeros dispersíveis, ceras,óleos ou sabões graxos; e

(3) ativadores de alvejamento tendo R-(C=O)-L, em que R é umgrupo alquila, opcionalmente ramificado tendo, quando o ativador dealvejamento é hidrofóbico, de 6 a 14 átomos de carbono, ou de 8 a12 átomos de carbono e, quando o ativador de alvejamento é hidrofílico,menos que 6 átomos de carbono ou mesmo menos que 4 átomos decarbono, e sendo que L é um grupo de saída. Exemplos de grupos de saídaadequados são ácido benzóico e derivados do mesmo, especialmentebenzeno sulfonato. Os ativadores de alvejamento adequados incluemdodecanoil oxibenzeno sulfonato, decanoil oxibenzeno sulfonato, ácidodecanoil oxibenzóico ou seus sais, sulfonato de 3,5,5-trimetil hexanoiloxibenzeno, tetraacetil etileno diamina (TAED) e nonanoil oxibenzenosulfonato (NOBS). Os ativadores de alvejamento adequados são tambémdescritos em WO 98/17767. Embora qualquer ativador de alvejamentoadequado possa ser utilizado, em um aspecto da invenção a presentecomposição para limpeza pode compreender NOBS, TAED ou misturas dosmesmos.

Quando presente, o perácido e/ou o ativador de alvejamento es-tá geralmente presente na composição em uma quantidade de cerca de 0,1a cerca de 60%, de cerca de 0,5 a cerca de 40%, ou mesmo de cerca de 0,6a cerca de 10%, em peso, com base na composição. Um ou mais perácidoshidrofóbicos ou precursores dos mesmos podem ser usados em combinaçãocom um ou mais perácidos hidrofílicos ou precursores dos mesmos.

As quantidades da fonte de peróxido de hidrogênio e de perácidoou ativador de alvejamento podem ser selecionadas de modo que a razãomolar entre o oxigênio disponível (da fonte de peróxido) e o perácido seja de1:1 a 35:1, ou mesmo de 2:1 a 10:1.

Tensoativos - As composições de limpeza de acordo com a pre-sente invenção podem compreender um tensoativo ou um sistema tensoati-vo no qual o tensoativo pode ser selecionado de tensoativos não-iônicos,tensoativos aniônicos, tensoativos catiônicos, tensoativos anfolíticos, tensoa-tivos zwitteriônicos, tensoativos não-iônicos semipolares e combinações dosmesmos. Quando presente, o tensoativo está, tipicamente, presente em umteor de cerca de 0,1% a cerca de 60%, de cerca de 1% a cerca de 50%, oumesmo de cerca de 5% a cerca de 40%, em peso, da presente composição.

Builders - As composições de limpeza da presente invenção po-dem compreender um ou mais builders detergentes ou sistemas de builder.Quando um builder é usado, a presente composição compreenderá, tipica-mente, ao menos cerca de 1%, de cerca de 5% a cerca de 60%, ou mesmode cerca de 10% a cerca de 40% de builder, em peso da presente composi-ção. Os builders incluem, mas não se limitam a, sais de polifosfatos de metalalcalino, amônio e alcanol amônio, silicatos de metal alcalino, alcalino-terroso e carbonatos de metal alcalino, builders de aluminossilicato, compos-tos de policarboxilato, éter hidróxi policarboxilatos, copolímeros de anidridomaléico com etileno ou vinil metil éter, ácido 1, 3, 5-triidróxi benzeno-2, 4, 6-trissulfônico e ácido carbóxi metil óxi succínico, os diversos sais de metalalcalino, amônio e amônio substituído de ácidos poliacéticos como ácido eti-lenodiamino tetraacético e ácido nitrilotriacético, bem como policarboxilatoscomo ácido melítico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido oxidissuccínico,ácido polimaléico, ácido benzeno 1,3,5-tricarboxílico, ácido carbóxi metil óxisuccínico, e sais solúveis dos mesmos.

Agentes quelantes - As composições de limpeza da presente in-venção podem conter um agente quelante. Os agentes quelantes adequadosincluem agentes quelantes de cobre, ferro e/ou manganês, e combinaçõesdos mesmos. Quando um agente quelante é usado, a presente composiçãopode compreender de cerca de 0,005% a cerca de 15%, ou mesmo de cercade 3,0% a cerca de 10% de agente quelante, em peso da presente composi-ção.

Agentes inibidores de transferência de pigmentos - As composi-ções de limpeza da presente invenção podem conter também um ou maisagentes inibidores de transferência de pigmentos. Agentes poliméricos inibi-dores de transferência de corantes adequados incluem, mas não se limitama, polímeros de polivinil pirrolidona, polímeros de poliamina N-óxido, copolí-meros de N-vinil pirrolidona e N-vinil imidazol, polivinil oxazolidonas e polivi-nil imidazóis, ou misturas desses itens. Quando presentes em uma composi-ção da presente invenção, os agentes inibidores de transferência de pigmen-tos podem estar presentes em teores na faixa de cerca de 0,0001% a cercade 10%, de cerca de 0,01% a cerca de 5%, ou mesmo de cerca de 0,1% acerca de 3%, em peso da composição.

Clareadores - As composições de limpeza da presente invençãopodem, também, conter componentes adicionais que podem tonalizar osartigos sendo limpos, como clareadores fluorescentes. Os teores de clarea-dor fluorescente adequado incluem teores desde teores mais baixos, de cer-ca de 0,01, de cerca de 0,05, de cerca de 0,1 ou mesmo de cerca de 0,2%,em peso, até teores mais altos, de 0,5 ou mesmo 0,75%, em peso.Dispersantes - As composições da presente invenção podem,também, conter dispersantes. Os materiais orgânicos solúveis em água ade-quados incluem os ácidos homo ou copoliméricos, ou seus sais, em que oácido policarboxílico contenha ao menos dois radicais carboxila separadosum do outro por não mais de dois átomos de carbono.

Enzimas adicionais - As composições de limpeza podem conteruma ou mais enzimas, as quais proporcionam desempenho da limpeza e/oubenefícios de tratamento de tecidos. Exemplos de enzimas adequadas in-cluem, mas não se limitam a, hemicelulases, peroxidases, proteases, celula-ses, xilanases, lipases, fosfolipases, esterases, cutinases, pectinases, ma-nanases, pectato liases, queratinases, redutases, oxidases, fenoloxidases,lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases,β-glucanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase, Iacase e amila-ses, ou misturas dos mesmos. Uma combinação típica é um coquetel de en-zimas que pode compreender, por exemplo, uma protease e uma Iipase emconjunto com amilase. Quando presentes em uma composição para limpeza,as enzimas adicionais anteriormente mencionadas podem estar presentesem teores na faixa de cerca de 0,00001% a cerca de 2%, de cerca de0,0001% a cerca de 1%, ou mesmo de cerca de 0,001% a cerca de 0,5% deproteína de enzima, em peso da composição.

Estabilizantes de enzimas - As enzimas para uso em detergen-tes podem ser estabilizadas por meio de várias técnicas. As enzimas empre-gadas neste caso podem ser estabilizadas pela presença de fontes solúveisde água de íons de cálcio e/ou magnésio nas composições finais que forne-cem tais íons às enzimas. No caso de composições aquosas compreenden-do protease, um inibidor reversível de protease, como um composto de boro,pode ser adicionado para otimizar ainda mais a estabilidade.

Complexos de metal catalíticos - As composições de limpezadas Requerentes podem incluir complexos de metal catalíticos. Um tipo decatalisador de alvejante contendo metal é um sistema catalisador que con-tém um cátion de metal de transição com atividade cataiítica definida paraalvejante, como cátions de cobre, ferro, titânio, rutênio, tungstênio, molibdê-nio ou manganês, um cátion de metal auxiliar com pouca ou nenhuma ativi-dade catalítica para alvejante, como cátions de zinco ou alumínio, e um se-qüestrado que tem constantes de estabilidade definidas para os cátions demetal catalíticos e auxiliares, particularmente ácido etilenodiamino tetraacéti-co, etileno diamino tetra(ácido metileno fosfônico), e sais solúveis em águadessas substâncias. Esses catalisadores são descritos em U.S. 4.430.243.

Caso se deseje, as composições da presente invenção podemser catalisadas por meio de um composto de manganês. Esses compostos eteores de uso são bem-conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, oscatalisadores baseados em manganês descritos em U.S. 5.576.282.

Os catalisadores de alvejante à base de cobalto úteis à presenteinvenção são conhecidos, e são descritos, por exemplo, em U.S. 5.597.936e U.S. 5.595.967. Esses catalisadores à base de cobalto são prontamentepreparados mediante procedimentos conhecidos, conforme descrito, por e-xemplo, em U.S. 5.597.936 e U.S. 5.595.967.

As composições da presente invenção podem, também, ade-quadamente incluir um complexo de metais de transição de Iigandos comobispidonas (WO 05/042532 A1) e/ou Iigandos macropolicíclicos rígidos, a-breviados como "LMRs". Por uma questão de prática, mas sem que istoconstitua uma limitação, as composições e processos da presente invençãopodem ser ajustados para oferecer algo na ordem de pelo menos uma partepor cem milhões da espécie de LMR ativa no meio aquoso para lavagem,sendo que tipicamente oferecerá de cerca de 0,005 ppm a cerca de 25 ppm,de cerca de 0,05 ppm a cerca de 10 ppm, ou mesmo de cerca de 0,1 ppm acerca de 5 ppm do LMR no líquido de lavagem.

Os metais de transição adequados no presente catalisador bran-queador à base de metal de transição incluem, por exemplo, manganês, fer-ro e cromo. Os LMRs adequados incluem 5,12-dietil-1,5,8,12-tetraazabiciclo[6,6,2]hexadecano.

Os LMRs de metal de transição adequados são prontamentepreparados mediante procedimentos conhecidos, como aqueles descritos,por exemplo, em WO 00/32601 e U.S. 6.225.464.Solventes - Os solventes adequados incluem água e outros sol-ventes, como fluidos lipofílicos. Exemplos de fluidos lipofílicos adequadosincluem siloxanos, outros silicones, hidrocarbonetos, éteres de glicol, deriva-dos de glicerina como éteres de glicerina, aminas perfluoradas, solventesperfluorados e à base de éter hidrofluorado, solventes orgânicos não-fluora-dos de baixa volatilidade, solventes à base de diol, outros solventes ambien-talmente amigáveis e misturas desses itens.

Processos para produção de composições

As composições da presente invenção podem ser formuladasem qualquer forma adequada e preparadas por meio de qualquer processoescolhido pelo formulador, sendo alguns exemplos não-limitadores dasmesmas descritos nos exemplos das Requerentes e em U.S. 4.990.280,U.S. 20030087791A1, U.S. 20030087790A1, U.S. 20050003983A1, U.S.20040048764A1, U.S. 4.762.636, U.S. 6.291.412, U.S. 20050227891A1, EP1070115A2, U.S. 5.879.584, U.S. 5.691.297, U.S. 5.574.005, U.S.5.569.645, U.S. 5.565.422, U.S. 5.516.448, U.S. 5.489.392, U.S. 5.486.303,estando todos esses documentos aqui incorporados, a título de referência.Método de Uso

A presente invenção inclui um método para limpeza e/ou trata-mento de um local entre outros uma superfície ou um tecido. Esse métodoinclui as etapas de colocar uma modalidade da composição de limpeza dasRequerentes, em sua forma pura ou diluída em um líquido de lavagem, emcontato com pelo menos uma porção de uma superfície ou tecido e então,opcionalmente, enxaguar essa superfície ou esse tecido. Pode-se submetera superfície ou o tecido a uma etapa de lavagem antes da etapa de enxágüemencionada acima. Para as finalidades da presente invenção, a lavageminclui, porém não se limita a, esfregamento e agitação mecânica. Como seráapreciado por um elemento versado na técnica, as composições de limpezada presente invenção são idealmente adequadas para uso em aplicações delavagem de roupas. Conseqüentemente, a presente invenção inclui um mé-todo de lavagem de um tecido. O método inclui as etapas de colocar um te-cido a ser lavado em contato com a dita solução de limpeza para lavanderiacontendo ao menos uma modalidade das Requerentes para composição delimpeza, aditivo de limpeza ou uma mistura desses itens. O tecido pode con-ter praticamente qualquer tecido que possa ser lavado em condições de usonormais pelo consumidor. A solução tem, de preferência um pH na faixa decerca de 8 a cerca de 10,5. As composições podem ser usadas em concen-trações de cerca de 500 ppm a cerca de 15.000 ppm em solução. As tempe-raturas da água situam-se, tipicamente, na faixa de cerca de 5°C a cerca de90°C. A razão entre água e tecido situa-se, tipicamente, na faixa de cerca de1:1 a cerca de 30:1.

Exemplos

Exemplos de variantes de Iipase

Os produtos químicos usados como tampões e substratos sãoprodutos comercialmente disponíveis pelo menos com grau de reagente.

- Meios e soluções: LAS (Surfac OS®) e Zeolite A (Wessalith P®).

Outros ingredientes usados são reagentes para laboratório convencionais.

- Materiais: EMPA221, disponível junto à EMPA St. Gallen, Ler-chfeldstrasse 5, CH-9014 St. Gallen, Suíça

Exemplo 1. Produção de enzima

Um plasmídio contendo o gene que codifica a Iipase é construídoe transformado em uma célula hospedeira adequada, mediante o uso demétodos-padrão da técnica.

A fermentação é realizada sob a forma de fermentação por lotealimentado, mediante o uso de um meio com temperatura constante de34°C, e um volume inicial de 1,2 litros. O pH inicial do meio é ajustado para6,5. Uma vez que o pH tenha aumentado para 7,0, esse valor é mantido me-diante a adição de 10% H3P04. O teor de oxigênio dissolvido no meio écontrolado mediante a variação da taxa de agitação, usando-se uma taxa deaeração fixa de 1,0 litro de ar por litro de meio, por minuto. A taxa de adiçãode alimento é mantida a um teor constante durante toda a fase de "Fed-batch" (lote alimentado). O meio do lote continha xarope de maltose comofonte de carbono, uréia e extrato de levedura como fonte de nitrogênio, euma mistura de oligoelementos metálicos e sais. O alimento adicionado demaneira contínua durante a fase de lote alimentado contém xarope de mal-tose como fonte de carbono, enquanto extrato de levedura e uréia são adi-cionados para assegurar um suprimento suficiente de nitrogênio.

A purificação da Iipase pode ser feita mediante o uso de méto-dos-padrão conhecidos na técnica, por exemplo mediante a filtração dosobrenadante da fermentação, e a subseqüente cromatografia hidrofóbicae troca de ânions, por exemplo conforme descrito em EP 0 851 913, Exem-plo 3.

Exemplo 2: TEMA (Teste de Esforço Mecânico Automatizado) para cálculodo Desempenho Relativo (PR).

As variantes de enzima do presente pedido de patente são tes-tadas mediante o uso de Teste de Esforço Mecânico Automatizado (TEMA).Com o teste TEMA, pode-se examinar o desempenho de lavagem de umagrande quantidade de soluções enzimáticas detergentes em pequenos vo-lumes. A placa de TEMA tem um certo número de fendas para soluções deteste, e uma tampa que comprime firmemente a amostra de produto têxtil aser lavada contra as aberturas em fenda. Durante o tempo de lavagem, aplaca, as soluções de teste, o produto têxtil e a tampa são vigorosamenteagitados para colocar a solução de teste em contato com o produto têxtil, epara aplicar esforço mecânico. Para uma descrição mais detalhada, vide WO02/42740, especialmente o parágrafo "Special method embodiments", naspáginas 23 a 24. Os recipientes, que contêm a solução de teste do detergen-te, consistem em orifícios cilíndricos (6 mm de diâmetro, 10 mm de profundi-dade) em uma placa de metal. O tecido manchado (material de teste) fica notopo da placa de metal e é usado como tampa e lacre nos recipientes. Umaoutra placa de metal fica no topo do tecido manchado para evitar qualquerderramamento de cada um dos recipientes. As duas placas de metal, juntascom o tecido manchado, são vibradas para cima e para baixo a uma fre-qüência de 30 Hz, com uma amplitude de 2 mm.

O ensaio é conduzido sob as condições experimentais abaixoespecificadas:Tabela 3

<table>table see original document page 32</column></row><table>

Amostras com creme e turmérico são preparadas mediante amisturação de 5 g de turmérico (Santa Maria, Dinamarca) com 100 g decreme (38% de gordura, Ária, Dinamarca) a 50°C, sendo que a mistura foideixada a essa temperatura durante cerca de 20 minutos e filtrada (50°C)para remover quaisquer partículas não dissolvidas. A mistura é resfriada até20°C, e amostras de tecido de algodão, EMPA221, são imersas na misturade creme e turmérico, sendo então deixadas secar à temperatura ambientede um dia para outro e congeladas até o uso. A preparação das amostras decreme-turmérico são apresentadas no Pedido de Patente PA 2005 00775,depositado em 27 de maio de 2005.

O desempenho da variante de enzima é medido como o brilhoda cor das amostras de produto têxtil lavadas com aquela variante de enzi-ma específica. O brilho pode, também, ser expresso como a intensidade daclaro refletida a partir da amostra de produto têxtil quando iluminada com luzbranca. Quando o produto têxtil está manchado, a intensidade da luz refleti-da é mais baixa que aquela de um produto têxtil limpo. Portanto, a intensida-de da luz refletida pode ser usada para medir o desempenho de lavagem deuma variante de enzima.

As medições de cor são feitas em uma scanner de base planade uso profissional (PFU DL2400pro), a qual é usada para capturar uma i-magem das amostras de produto têxtil lavadas. As digitalizações são feitascom uma resolução de (200 dpi) e com uma profundidade de cor na saída de24 bits. Para a obtenção de resultados acurados, a scanner é calibrada fre-qüentemente com um alvo reflexivo Kodak IT8.

Para extrair um valor da intensidade de luz das imagens digitali-zadas, é usado um aplicativo de software especialmente projetado (No-vozymes Color Vector Analyzer). O programa recupera os valores de pixelem 24 bits da imagem, e os converte em valores para vermelho, verde e azul(RGB, ou Red, Green, Blue). O valor da intensidade (Int) é calculado medi-ante a adição dos valores RGB como vetores e, então, tomando-se o com-primento do vetor resultante:

Int=Jr2+ g2+b2

O desempenho de lavagem (D) das variantes é calculado de a-cordo com a seguinte fórmula:

D= lnt(v) - lnt(r) em que

lnt(v) é o valor de intensidade de luz da superfície do produtotêxtil lavada com a enzima testaxda, enquanto lnt(r) é o valor de intensidadede luz da superfície do produto têxtil lavada sem a enzima testada.

É dada uma pontuação de desempenho relativo como resultadoda lavagem TEMA, de acordo com a definição: as pontuações de Desempe-nho Relativo (DR) são a somatória dos desempenhos (D) das variantes deenzima testadas contra a enzima de referência: DR = D(enzima de tes-te)/D(enzima de referência).

O DRmédio indica o desempenho relativo médio em comparaçãoao da enzima de referência em todas as quatro concentrações de enzimas(0,125, 0,25, 0,5, 1,0 mg ep/l)

DRmédio = média(DR(0,125), DR(0,25), DR(0,5), DR(1,0))

Considera-se que a variante exibe desempenho de lavagem oti-mizado se tiver um desempenho melhor que o da referência. No contexto dapresente invenção, a enzima de referência é a Iipase da SEQ. ID ns 2, comas substituições T231R + N233R.

Exemplo 3: CG - cromatóqrafo qasoso - para cálculo do fator de risco.

A liberação de ácido butírico a partir das amostras lavadas comIipase é medida por meio de cromatografia a gás por microextração em fasesólida (MEFS-CG), utilizando-se o método exposto a seguir. Quatro peçasde produto têxtil (com 5 mm de diâmetro), lavadas na solução especificadana Tabela 3, contendo 1 mg/L de lipase, são transferidas para um frasco decromatografia gasosa (CG). As amostras são analisadas em um cromatógra-fo gasoso Varian 3800 GC equipado com uma coluna de proteção Stabilwax-DA w/Integra (30 m, 0,32 mm ID e 0,25 micro-m df) e uma fibra CarboxenPDMS para MEFS (75 micro-m). Cada amostra foi pré-incubada durante 10min a 40°C, seguido de 20 min de amostragem com a fibra para MEFS noespaço livre sobre as peças de produto têxtil. A amostra foi, subseqüente-mente, injetada na coluna (temperatura do injetor =250°C). Fluxo da coluna= 2 mL hélio/min. Gradiente de temperatura do forno de coluna: 0 min =40°C, 2 min = 40°C, 22 min = 240°C, 32 min = 240°C. O ácido butírico foidetectado por meio de detecção FlD, e a quantidade de ácido butírico foicalculada com base em uma curva-padrão para ácido butírico.

O desempenho de risco para odor, R, de uma variante de lipaseé a razão entre a quantidade de ácido butírico liberado pela amostra lavadacom a variante de lipase e a quantidade de ácido butírico liberado por umaamostra lavada com a lipase da SEQ. ID ne 2 com as substituições T231R +N233R (enzima de referência), depois de ambos os valores terem sido corri-gidos para a quantidade de ácido butírico liberado por uma amostra lavadasem lipase. O risco (R) das variantes é calculado de acordo com a fórmulaabaixo:

Odor = medido em micro g de ácido butírico desenvolvido a 1 mgde proteína de enzima/l corrigido para a amostra de controle

Clenzima de teste = Odor enzima de teste " amostra de ControleQenzima de referência = OdOΓ enzima de referência " amOStra de ControleR= Qenzima de teste/Qenzima de referência

Considera-se que a variante exibe odor reduzido, em compara-ção à referência, se o fator R for menor que 1.

Exemplo 4: Atividade (LU) em relação à absorbância a 280 nm

A atividade de uma lipase em relação à absorbância a 280 nm édeterminada por meio do ensaio LU/A280:

A atividade da lipase é determinada conforme descrito acima naseção "Atividade da lipase". A absorbância da lipase a 280 nm é medida(A280), e a razão LU/A280 é calculada. A LU/A280 reíativa é calculada comoa LU/A280 da variante dividida pela LU/A280 de uma enzima de referência.No contexto da presente invenção, a enzima de referência é a lipase daSEQ. ID ne 2, com as substituiçõesT231R + N233R.

Exemplo 5: RB - Relação risco/benefício

O fator risco/benefício descrevendo o desempenho em compa-ração ao risco reduzido para ocorrência de odores é, portanto, definido co-mo: RB = DRmédio/R

Considera-se que a variante exibe desempenho de lavagem oti-mizado e odor reduzido, se o fator RB for mais alto que 1.

Mediante a aplicação dos métodos acima descritos, são obtidosos seguintes resultados:Tabela 4

<table>table see original document page 36</column></row><table>

A Iipase de referência e as variantes 7 e 8 na Tabela 4 são des-critas em WO 2000/060063.

Exemplo 6

RB - Relação risco/benefício

A relação risco/benefício foi medida para as variantes relaciona-das na Tabela 5. O fator risco/benefício foi medido da mesma forma descritano Exemplo 5, e descobriu-se que o mesmo estava acima de 1 para todasas variantes relacionadas.Tabela 5

<table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table>

A lipase de referência é descrita em WO 2000/060063.

Exemplos de composição

Exceto onde indicado em contrário, os materiais podem ser obti-dos junto à Aldrich, P.O. Box 2060, Milwaukee, Wl, 53201, EUA.Exemplos de 1 a 6

Composições detergentes granulares para lavagem de roupas,criado para lavagem à mão ou para máquinas de lavar com carregamentopelo topo.

<table>table see original document page 40</column></row><table><table>table see original document page 41</column></row><table>

Qualquer das composições acima é usada para lavar tecidos auma concentração de 600 a 10.000 ppm em água, com as condições típicasmédias de 2.500 ppm, 25°C e uma razão água:pano de 25:1.

Exemplos de 7 a 10

Composições detergentes granulares para lavagem de roupas,criado para máquinas de lavar automáticas com carregamento frontal.

<table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table>

Qualquer das composições acima é usada para lavar tecidos auma concentração de 10.000 ppm em água, de 20 a 90°C e a uma razãoágua:pano de 5:1. O pH típico é de cerca de 10.

Exemplos de 11 a 16 - composições detergentes líquidas para lavagem deroupas para tarefas pesadas<table>table see original document page 43</column></row><table>Matérias-primas e observações para os exemplos de composição de 1 a 16

Sulfonato de alquil benzeno linear com uma média de compri-mento de cadeia de carbono alifático Cn-Ci2, disponível junto à Stepan, deNorthfield, Illinois, EUA

Cloreto de dimetil hidróxi etilamônio C12-M, disponível junto à Cla-riant GmbH, Sulzbach, Alemanha

AE3S é sulfato de alquila C12-15 etoxilado (3), disponível junto àStepan, Northfield, Illinois, EUA

AE7 é álcool C 12-15 etoxilato, com um grau médio de etoxilaçãode 7, disponível junto à Huntsman, Salt Lake City, Utah, EUA

Tripolifosfato de sódio, disponível junto à Rhodia, Paris, FrançaZeólito A, disponível junto à Industrial Zeolite (Reino Unido) Ltd,Grays, Essex, Reino Unido

1,6R Silicato, disponível junto à Koma, Nestemica, RepúblicaCheca

Carbonato de sódio, disponível junto à Solvay, Houston, Texas,EUA

Poliacrilato com PM 4500, disponível junto à BASF, Ludwigsha-fen, Alemanha

A carbóxi metil celulose é Finnfix® BDA, disponível junto à CP-Kelco, Arnhem, Holanda

Savinase®, Natalase®, Termamyl® e Mannaway®, disponíveisjunto à Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca

Variantes de Iipase de 1 a 5, descritas no Exemplo 5, Tabela 4, ecombinações das mesmas.

O clareador fluorescente 1 é Tinopal® AMS, o clareador fluores-cente 2 é Tinopal® CBS-X, ftalocianina de zinco sulfonada disponível juntò àCiba Specialty Chemicals, Basel, Suíça

Ácido dietileno triamina pentacético, disponível junto à DowChemical, Midland, Michigan, EUA

Percarbonato de sódio, disponível junto à Solvay, Houston, Te-xas, EUAPerborato de sódio, disponível junto à Degussa, Hanau, Alema-nha

NOBS é sulfonato de nonanoil oxibenzeno sódico, disponíveljunto à Eastman, Batesville, Arkansas, EUA

TAED é tetraacetil etileno diamina, disponível sob o nome co-mercial Peractive® junto à Ciariant GmbH, Sulzbach, Alemanha

O agente de liberação de sujeira é Repel-o-tex® PF, disponíveljunto à Rhodia, Paris, França

O copolímero de ácido acrílico/ácido maléico tem peso molecular70.000 e uma razão acrilato:maleato de 70:30, e está disponível junto àBASF, Ludwigshafen, Alemanha

A protease era FN3, disponível junto à Genencor International,Palo Alto, Califórnia, EUA

Sal sódico de ácido etilenodiamino-N,N'-dissuccínico, (S,S) isô-mero (EDDS), disponível junto à Octel, Ellesmere Port, Reino Unido

Difosfonato de hidróxi etano (HEDP), disponível junto à DowChemical, Midland, Michigan, EUA

Aglomerado de supressor de espuma, disponível junto à DowCorning, Midland, Michigan, EUA

HSAS é um sulfato de alquila com ramificação média, conformedescrito em US 6.020.303 e US 6.060.443

Óxido de dimetilamina C12-14, disponível junto à Procter & Gam-ble Chemicals, Cincinnati, Ohio, EUA

O não-iônico é, de preferência, um etoxilato C12-C13, de prefe-rência com um grau médio de etoxilação de 9,

Protease, disponível junto à Genencor International, Palo Alto,Califórnia, EUA

* Números dados em mg de enzima/100 g

1 conforme descrito em US 4.597.898.

2 disponível sob o nome comercial LUTENSIT® junto à BASF, econforme aqueles descritos em WO 01/05874

t Lipase descrita no presente relatório descritivo.Embora modalidades particulares da presente invenção tenhamsido ilustradas e descritas, deve ficar evidente aos versados na técnica quevárias outras alterações e modificações podem ser feitas sem que se desviedo caráter e âmbito da invenção. Portanto, pretende-se cobrir nas reivindica-ções anexas todas essas alterações e modificações que se enquadram noescopo da presente invenção.Listagem de Seqüências

<110> Procter & Gamble Company

<120> Composições Detergentes

<130> 10280M

<160> 16

<170> Patente versão 3.3

<210> 1

<211> 807

<212> DNA

<213> Thermomyces Ianuginosus

<220>

<221> CDS

<222> Cl)- -C807)

<220>

<22l> características peptideo<222> Cl)..O

<400> 1

gag gtc tcg cag gat ctg ttt aacGlu Val ser Gln Asp Leu Phe Asn1 5

tct gca gcc gca tac tgc gga aaaSer Ala Ala Ala Tyr cys Gly Lys20

aac att acg tgc acg gga aat gccAsn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala35 40

gca acg ttt ctc tac tcg ttt gaaAla Thr Phe Leu Tyr ser Phe Glu50 55

ggc ttc ctt gct ctc gac aac acgGTy Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr65 70

cgt ggc tct cgt tcc ata gag aacArg Gly ser Arg Ser Ile Glu Asn85

ttg aaa gaa ata aat gac att tgcLeu Lys Glu Ile Asn Asp Ile cys100

ttc act tcg tcc tgg agg tct gtaphe Thr ser Ser Trp Arg ser Val115 120

gag gat gct gtg agg gag cat cccGlu Asp Ala vai Arg Glu His Pro130 135

cat age ttg ggt gat gca ttg gcaHis Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala

cag ttcGln Phe10

aac aatAsn Asn25

tgc cccCys Pro

gac tctAsp Ser

aac aaaAsn Lys

tgg ateTrp lie90

tcc ggcser Giy105

gcc gatAla Asp

aat ctc ttt gca cag tatAsn Leu Phe Ala Gln Tyr15

gat gcc cca gct ggt acaAsp Ala Pro Ala Gly Thr30

gag gta gag aag gcg gatGlu vai Glu Lys Ala Asp45

gga gtg ggc gat gtc accGly Val Gly Asp vai Thr60

ttg ate gtc ctc tct ttcLeu Ile Val Leu ser Phe75 80

ggg aat ctt aac ttc gacGly Asn Leu Asn Phe Asp

9S

tgc agg gga cat gac ggcCys Arg Gly His Asp Giy110

acg tta agg cag aag gtgThr Leu Arg Gln Lys vai125

gac tatAsp Tyr

act gttThr vai

cgc gtg gtg ttt acc ggaArg Val vai Phe Thr Gly140

gcc gga gca gac ctg cgtAla Gly Ala Asp Leu Arg155 160

145 150

gga aat ggg tat gat ate gac gtg ttt tca tat ggc gcc ccc cga gtc

48

96

144

192

240

288

336

384

432

480

528Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp vai Phe ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val165 170 175

gga aac agg gct ttt gca gaa ttc ctg acc gta cag acc ggc gga acaGly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr180 185 190

cgc gaa ttc ggt tac age cat tet age cca gag tac tgg ate aaa tetArg Glu Phe Gly Tyr Ser His ser ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser210 215 220

576

ctc tac cgc att acc cac acc aat gat att gtc cct aga ctc ccg ccg 624

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro195 200 205

672

gga acc ctt gtc ccc gtc acc cga aac gat ate gtg aag ata gaa ggc 720

Gly Thr Leu vai Pro vai Thr Arg Asn Asp Ile vai Lys Ile Glu Gly225 230 235 240

ate gat gcc acc ggc ggc aat aac cag cct aac att ccg gat ate cct 768

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp lie Pro245 250 255

gcg cac cta tgg tac ttc gag tta att ggg aca tgt ctt 807

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu lie Gly Thr Cys Leu260 265

<210> 2<211> 269<212> PRT

<213> Thermomyces lanuginosus<400> 2

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr1 5 10 15

ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Ásn Asp Ala Pro Ala Gly Thr20 25 30

Asn He Thr Cys Thr Gly Asn Ala cys Pro Glu vai Glu Lys Ala Asp35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp vai Thr50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile vai Leu Ser Phe65 70 75 80

Arg Gly ser Arg ser lie Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp85 90 95

Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly cys Arg Gly His Asp Gly100 105 110

Phe Thr Ser Ser Trp Arg ser vai Ala Asp Thr Leu Arg Gln Iys Val115 120 125

Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg vai vai Phe Thr Gly130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr vai Ala Gly Ala Asp Leu Arg145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp vai Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg vai165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr vai Gln Thr Gly Gly Thr180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile vai Pro Arg Leu Pro Pro195 200 205

Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys ser210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile vai Lys Ile Glu Gly225 230 235 240

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu260 265

<210> 3<211> 265<212> PRT

<213> Absidia reflexa<400> 3

Ser Ser Ser ser Thr Gln Asp Tyr Arg Ile Ala Ser Glu Ala Glu- Ile1 5 10 15

Lys Ala His Thr Phe Tyr Thr Ala Leu ser Ala Asn Ala Tyr Cys Arg20 25 30

Thr vai Ile Pro Gly Gly Arg Trp ser Cys Pro His Cys Gly Val Ala35 40 45

Ser Asn Leu Gln Ile Thr Lys Thr Phe ser Thr Leu lie Thr Asp Thr50 55 60

Asn vai Leu Val Ala vai Gly Glu Lys Glu Lys Thr He Tyr Val vai65 70 75 80

Phe Arg Gly Thr Ser Ser Ile Arg Asn Ala Ile Ala Asp Ile vai Phe85 90 95

vai Pro vai Asn Tyr Pro Pro Val Asn Gly Ala Lys Val His Lys Gly100 105 110Phe Leu Asp Ser Tyr Asn Glu Val Gln Asp Lys Leu Val Ala Glu Val115 120 125

Lys Ala Gln Leu Asp Arg His Pro Gly Tyr Lys Ile Val vai Thr Gly130 135 140

His ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Val Leu Ser Ala Leu Asp Leu Tyr145 150 155 160

His His Gly His Ala Asn Xle Glu Ile Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg165 170 175

Ile Gly Thr Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Ile Gly Thr Lys Ile Pro180 185 190

Tyr Gln Arg Leu Val His Glu Arg Asp He Val Pro His Leu Pro Pro195 200 205

Gly Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Phe Trp Ile Met Lys210 215 220

Asp Ser ser Leu Arg vai Cys Pro Asn Gly Ile Glu Thr Asp Asn Cys225 230 235 240

Ser Asn ser Ile Val Pro Phe Thr Ser vai Ile Asp His Leu ser Tyr245 250 255

Leu Asp Met Asn Thr Gly Leu Cys Leu260 265

<210> 4<211> 264<212> PRT

<213> Absidia corymbifera<400> 4

Ser ser ser Thr Gln Asp Tyr Arg Ile Ala Ser Glu Ala Glu Ile Lys1 5 10 15

Ala His Thr Phe Tyr Thr Ala Leu Ser Ala Asn Ala Tyr Cys Arg Thr20 25 30

vai Ile Pro Gly Gly Gln Trp Ser Cys Pro His Cys Asp Val Ala Pro35 40 45

Asn Leu Asn Ile Thr Lys Thr Phe Thr Thr Leu Ile Thr Asp Thr Asn50 55 60

vai Leu vai Ala vai Gly Glu Asn Glu Lys Thr Ile Tyr Val Val Phe65 70 75 80Arg Gly Thr Ser ser Ile Arg Asn Ala Ile Ala Asp Ile Val Phe vai85 90 95

Pro vai Asn Tyr Pro Pro vai Asn Gly Ala Lys Val His Lys Gly Phe100 105 110

Leu Asp Ser Tyr Asn Glu vai Gln Asp Lys Leu Val Ala Glu Val Lys115 120 125

Ala Gln Leu Asp Arg His Pro Gly Tyr Lys Ile Val vai Thr Gly His130 135 140

Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Val Leu ser Ala Leu Asp Leu Tyr His145 150 155 160

His Gly His Asp Asn Ile Glu Ile Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Ile165 170 175

Gly Thr Pro Glu Phe Ala Asn Tyr Val Ile Gly Thr Lys Ile Pro Tyr180 185 190

Gln Arg Leu Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro Gly195 200 205

Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Phe Trp Ile Met Lys Asp210 215 220

Ser Ser -Leu Arg Val Cys Pro Asn Gly Ile Glu Thr Asp Asn Cys Ser225 230 235 240

Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Ile Asp His Leu ser Tyr Leu245 250 255

Asp Met Asn Thr Gly Leu Cys Leu260

<210> 5<211> 269<212> PRT

<213> Rhizomucor miehei<400> 5

Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu1 5 10 15

Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val20 25 30

lie Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu Asp35 40 45Leu Lys ITe xle Lys Thr Trp ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala50 55 60

Met vai Ala Arg Gly Asp ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile vai Phe Arg65 70 75 80

Gly ser ser ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe vai Pro85 90 95

vai Ser Tyr Pro Pro Val ser Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe Leu100 105 110

Asp Ser Tyr Gly Glu vai Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr vai Leu Asp115 120 125

Gln Phe Lys Gln Tyr Pro ser Tyr Lys Val Ala vai Thr Gly His ser130 135 140

Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Asp Leu Tyr Gln Arg145 150 155 160

Glu Glu Gly Leu ser ser Ser Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln165 170 175

Pro Arg vai Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr vai vai ser Thr Gly180 185 190

Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Il e Val Pro Hls Leu195 200 205

Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile210 215 220

Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu225 230 235 240

Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile vai Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp245 250 255

His Leu Ser Tyr Phe Gly lie Asn Thr Gly Leu Cys Thr260 265

<210> 6<211> 271<212> PRT

<213> Rhizopus oryzae<400> 6

Ser Ala ser Asp Gly Gly Lys vai Val Ala Ala Thr Thr Ala Gln Ile1 5 10 15

Gln Glu Phe Thr Lys Tyr Ala Gly Ile Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg20 25 30

Ser VaT Val Pro Gly Asn Lys Trp Asp Cys VaT Gln Cys Gl η Lys Trp35 40 45

Val Pro Asp Gly Lys Ile Ile Thr Thr Phe Thr ser Leu Leu Ser Asp50 55 60

Thr Asn Gly Tyr Val Leu Arg ser Asp Lys Gln Lys Thr Ile Tyr Leu65 70 75 80

Val Phe Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg ser Ala Ile Thr Asp Ile Val85 90 95

Phe Asn Phe ser Asp Tyr Lys Pro vai Lys Gly Ala Lys Val His Ala100 105 110

Gly Phe Leu ser ser Tyr Glu Gln vai vai Asn Asp Tyr Phe Pro Val115 120 125

vai Gln Glu Gln Leu Thr Ala His Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr130 135 140

Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu145 150 155 160

Tyr Gln Arg Glu Pro Arg Leu Ser Pro Lys Asn Leu ser Ile Phe Thr165 170 175

vai Gly Gly Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr vai Glu180 185 190

ser Thr Gly Ile Pro Phe Gln Arg Thr vai His Lys Arg Asp Ile Val195 200 205

Pro His vai Pro Pro Gln ser Phe Gly Phe Leu His Pro Gly vai Glu210 215 220

Ser Trp Ile Lys Ser Gly Thr ser Asn vai Gln Ile Cys Thr ser Glu225 230 235 240

Ile Glu Thr Lys Asp Cys Ser Asn Ser ile vai Pro Phe Thr ser Ile245 250 255

Leu Asp His Leu ser Tyr Phe Asp Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu260 265 270

<210> 7<211> 267<212> PRT

<213> Aspergillus niger<400> 7

Thr Ala Gly His Ala Leu Ala Ala Ser Thr Gln Gly He Ser Glu Asd1 5 10 15

Leu Tyr ser Arg Leu Val Glu Met Ala Thr Ile Ser Gln Ala Ala Tyr20 25 30

Ala Asp Leu Cys Asn Ile Pro ser Thr Ile Ile Lys Gly Glu Lys Ile35 40 45

Tyr Asn ser Gln Thr Asp Ile Asn Gly Trp Ile Leu Arg Asp Asp Ser50 55 60

ser Lys Glu Ile Ile Thr vai Phe Arg Gly Thr Gly Ser Asp Thr Asn65 70 75 80

Leu Gln Leu Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Thr Pro Phe Asp Thr Leu Pro85 90 95

Gln Cys Asn Gly Cys Glu Val His Gly Gly Tyr Tyr Ile Gly Trp Val100 105 110

Ser vai Gln Asp Gln vai Glu Ser Leu Val Lys Gln Gln Val Ser Gln115 120 125

Tyr Pro Asp Tyr Ala Leu Thr Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ser130 135 140

Leu Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gln Leu ser Ala Thr Tyr Asp Asn Ile145 150 155 160

Arg Leu Tyr Thr Phe Gly Glu Pro Arg Ser Gly Asn Gln Ala Phe Ala165 170 175

Ser Tyr Met Asn Asp Ala phe Gln Ala Ser ser Pro Asp Thr Thr Gln180 185 190

Tyr Phe Arg vai Thr His Ala Asn Asp Gly Ile Pro Asn Leu Pro Pro195 200 205

vai Glu Gln Gly Tyr Ala His Gly Gly vai Glu Tyr Trp Ser Val Asp210 215 220

Pro Tyr ser Ala Gln Asn Thr Phe vai Cys Thr Gly Asp Glu vai Gln225 230 235 240

Cys Cys Glu Ala Gln Gly Gly Gln Gly Val Asn Asn Ala His Thr Thr245 250 255

Tyr Phe Gly Met Thr Ser Gly Ala Cys Thr Trp260 265<210> 8<211> 266<212> PRT

<21Β> Aspergillus tubirigensis<400> 8

Thr Ala Gly His Ala Leu Ala Ala ser Thr Glri Gly He Ser Glu Asp1 5 10 15

Leu Tyr Ser Arg Leu Val Glu Met Ala Thr Ile Ser Gln Ala Ala Tyr20 25 30

Ala Asp Leu Cys Asn Ile Pro ser Thr Ile Ile Lys Gly Glu Lys Ile35 40 45

Tyr Asn Ser Gln Thr Asp Ile Asn Gly Trp Ile Leu Arg Asp Asp ser50 55 60

ser Lys Glu Ile lie Thr Val Phe Arg Gly Thr Gly ser Asp Thr Asn65 70 75 80

Leu Gln Leu Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Thr Pro Phe Asp Thr Leu Pro85 90 95

Gln Cys Asn Ser Cys Glu vai His Gly Gly Tyr Tyr Ile Gly Trp Xle100 105 110

ser vai Gln Asp Gln vai Glu Ser Leu vai Gln Gln Gln vai Ser Gln115 120 125

Phe Pro Asp Tyr Ala Leu Thr Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ser130 135 140

Leu Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gln Leu ser Ala Thr Tyr Asp Asn lie145 150 155 160

Arq Leu Tyr Thr Phe Gly Glu Pro Arg Ser Asn Gln Ala Phe Ala sera 165 170 175

Tyr Met Asn Asp Ala Phe Gln Ala Ser Ser Pro Asp Thr Thr Gln Tyr180 185 190

Phe Arg vai Thr His Ala Asn Asp Gly Ile Pro Asn Leu Pro Pro Ala195 200 205

Asd Glu Gly Tyr Ala His Gly Val Val Glu Tyr Trp Ser vai Asp Pro210 215 220

Tyr ser Ala Gln Asn Thr Phe Val Cys Thr Gly Asp Glu vai Gln Cys225 230 235 240Cys Glu Ala Gln Gly Gly Gln Gly Val Asn Asn Ala· His Thr Thr Tyr245 250 255

Phe Gly Met Thr Ser Gly His Cys Thr Trp260 265

<210> 9<211> 276<212> PRT

<213> Pusarium oxysporum<400> 9

Ala vai Gly vai Thr Thr Thr Asp Phe Ser Asn Phe Lys Phe Tyr Ile1 5 10 15

Gln His Gly Ala Ala Ala Tyr Cys Asn ser Glu Ala Ala Ala Gly ser20 25 30

Lys Ile Thr Cys Ser Asn Asn Gly Cys Pro Thr Val Gln Gly Asn Gly35 40 45

Ala Thr ile Val Thr Ser phe vai Gly Ser Lys Thr Gly Ile Gly Gly50 55 60

Tyr vai Ala Thr Asp Ser Ala Arg Lys Glu He vai Val ser Phe Arg65 70 75 80

Gly Ser lie Asn Ile Arg as η Trp Leu Thr Asn Leu Asp Phe Gly Gln85 90 95

Glu Asp cys ser Leu Val ser Gly Cys Gly Val His Ser Gly Phe Gln100 105 HO

Arg Ala Trp Asn Glu Ile ser Ser Gln Ala Thr Ala Ala vai Ala Ser115 120 125

Ala Arg Lys Ala Asn Pro ser Phe Asn Val Ile Ser Thr Gly His ser130 135 140

Leu Gly Gly Ala Val Ala vai Leu Ala Ala Ala Asn Leu Arg Val Gly145 150 155 160

Gly Thr pro Val Asp Ile Tyr Thr Tyr Gly ser Pro Arg Val Gly Asn165 170 175

Ala Gln Leu ser Ala Phe vai Ser Asn Gln Ala Gly Gly Glu Tyr Arg180 185 190

vai Tht- His Ala Asp Asp pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Leu ile Phe195 200 205Gly Tyr Arg His Thr Thr Pro Glu Phe Trp Leu Ser Gly Gly Gly Gly210 215 220

Asp Ly5 vai Asp Tyr Thr Ile ser Asp Val Lys Val Cys Glu Gly Ala225 230 235 240

Ala Asn Leu Gly Cys Asn Gly Gly Thr Leu Gly Leu Asp Xle Ala Ala245 250 255

His Leu His Tyr Phe Gln Ala Thr Asp Ala Cys Asn Ala Gly Gly Phe260 265 270

Ser Trp Arg Arg275

<210> 10

<211> 273

<212> PRT

<213> Fusarium heterosporum<400> 10

Thr Val Thr Thr Gln Asp Leu ser Asn Phe Arg Phe Tyr Leu Gln His1 5 10 15

Ala Asp Ala Ala Tyr Cys Asn Phe Asn Thr Ala vai Gly Lys Pro Val20 25 30

His Cys Ser Ala Gly Asn Cys Pro Asp Ile Glu Lys Asp Ala Ala Ile35 ^O 45

Val vai Gly ser vai vai Gly Thr Lys Thr Gly Ile Gly Ala Tyr Val50 55 60

Ala Thr Asp Asn Ala Arg Lys Glu Ile vai vai ser vai Arg Gly Ser65 70 75 80

Ile Asn vai Arg Asn Trp Xle Thr Asn Phe Asn Phe Gly Gln Lys Thr85 90 95

cys Asp Leu vai Ala Gly cys Gly vai His Thr Gly Phe Leu Asp Ala100 105 110

Trp Glu Glu Val Ala Ala Asn Val Lys. Ala Ala Val ser Ala Ala Lys115 120 125

Thr Ala Asn Pro Thr Phe Lys Phe Val vai Thr Gly His Ser Leu Gly130 135 140

Gly Ala Val Ala Thr Ile Ala Ala Ala Tyr Leu Arg Lys Asp Gly Phe145 150 155 160

Pro Phe Asp Leu Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn Asp Phe165 170 175

Phe Ala Asn Phe vai Thr Gln Gln Thr GTy Ala Glu Tyr Arg Val Thr180 185 190

Hi s Gly Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Ile Val Phe Gly Tyr195 200 205

Arg His Thr Ser Pro Glu Tyr Trp Leu Asn Gly Gly Pro Leu Asp Lys210 215 220

Asp Tyr Thr Val Thr Glu Ile Lys vai Cys Glu Gly Ile Ala Asn vai225 230 235 240

Met Cys Asn Gly Gly Thr Ile Gly Leu Asp Ile Leu Ala His Ile Thr245 250 255

Tyr Phe Gln ser Met Ala Thr Cys Ala Pro Ile Ala Ile Pro Trp Lys260 265 270

Arg

<210> 11<211> 278<212> PRT

<213> Aspergillus oryzae<400> 11

Asp Ile Pro Thr Thr Gln Leu Glu Asp Phe Lys Phe Trp Val Gln Tyr1 5 10 15

Ala Ala Ala Thr Tyr Cys Pro Asn Asn Tyr Val Ala Lys Asp Gly Glu20 25 30

Lys Leu Asn Cys Ser Val Gly Asn Cys Pro Asp vai Glu Ala Ala Gly35 40 45

Ser Thr vai Lys Leu ser Phe Ser Asp Asp Thr Ile Thr Asp Thr Ala50 55 60

Gly Phe vai Ala vai Asp Asn Thr Asn Lys Ala Ile Val vai Ala Phe65 70 75 80

Arg Gly ser Tyr Ser Ile Arg Asn Trp Val Thr Asp Ala Thr Phe Pro85 90 '95

Gln Thr Asp Pro Gly Leu Cys Asp Gly Cys Lys Ala Glu Leu Gly Phe100 105 110

Trp Thr Ala Trp Lys Val vai Arg Asp Arg Ile Ile Lys Thr Leu Asp115 120 125Glu Leu Lys Pro Glu His ser Asp Tyr Lys Ile Val Val Val Gly His130 135 140

Ser Leu Gly Ala Ala Ile Ala ser Leu Ala Ala Ala Asp Leu Arg Thr145 150 155 160

Lys Asn ryr Asp Ala Ile Leu Tyr Ala Tyr Ala Ala Pro Arg Val Ala165 170 175

Asn Lys Pro Leu Ala Glu Phe Ile Thr Asn Gln Gly Asn Asn Tyr Arg180 185 190

Phe Thr His Asn Asp Asp Pro vai Pro Lys Leu Pro Leu Leu Thr Met195 200 205

Gly Tyr vai His Ile Ser Pro Glu Tyr Tyr Ile Thr Ala Pro Asp Asn210 215 220

Thr Thr vai Thr Asp Asn Gln vai Thr vai Leu Asp Gly Tyr Val Asn225 230 235 240

Phe Lys Gly Asn Thr Gly Thr Ser Gly Gly Leu Pro Asp Leu Leu Ala245 250 255

Phe His ser His vai Trp Tyr Phe Ile His Ala Asp Ala Cys Lys Gly260 265 270

Pro Gly Leu Pro Leu Arg275

<210> 12

<211> 278

<212> PRT

<213> Penicillium camemberti

<400> 12

Asp vai ser Thr ser Glu Leu Asp Gln Phe Glu Phe Trp vai Gln ryr1 5 10 15

Ala Ala Ala Ser Tyr Tyr Glu Ala Asp Tyr Thr Ala Gln vai Gly Asp20 25 30

Lys Leu ser cys Ser Lys Gly Asn Cys Pro Glu vai Glu Ala Thr Gly35 40 45

Ala Thr vai ser Tyr Asp Phe ser Asp ser Thr Ile Thr Asp Thr Ala50 55 60

Gly Tyr Ile Ala vai Asp His Thr Asn ser Ala Val Val Leu Ala Phe65 70 75 80Arg Gly ser Tyr ser Val Arg Asn Trp Val Ala Asp Ala Thr Phe Val85 90 95

Hts Thr Asn Pro Gly Leu Cys Asp Gly Cys Leu Ala Glu Leu Gly Phe100 105 110

Trp ser ser Trp Lys Leu vai Arg Asp Asp Ile Ile Lys Glu Leu Lys115 120 125

Glu Val vai Ala Gln Asn Pro Asn Tyr Glu Leu vai vai Val Gly His130 135 140

ser Leu Gly Ala Ala vai Ala Thr Leu Ala Ala Thr Asp Leu Arg Gly145 150 155 160

Lys Gly Tyr Pro Ser Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Ala Ser Pro Arg Val165 170 175

Gly Asn Ala Ala Leu Ala Lys Tyr Ile Thr Ala Gln Gly Asn Asn Phe180 185 190

Arg phe Thr His Thr Asn Asp Pro vai Pro Lys Leu Pro Leu Leu Ser195 200 205

Met Gly Tyr vai His Val ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Pro Asn210 215 220

Asn Ala Thr vai ser Thr ser Asp lie Lys vai Ile Asp Gly Asp vai225 230 235 240

ser phe Asp Gly Asn Thr Gly Thr Gly Leu Pro Leu Leu Thr Asp Phe245 250 255

Glu Ala His Ile Trp Tyr Phe vai Gln vai Asp Ala Gly Lys Gly Pro260 265 270

Gly Leu Pro Phe Lys Arg275

<210> 13<211> 270<212> PRT<213> Aspergillus foetidus

<400> 13

Ser vai ser Thr ser Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ala Gln Trp1 5 10 15

ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ser Asn Asn Ile Asp ser Lys Asp Ser Asn20 25 30Leu Thr Cys Thr Ala Asn Ala Cys Pro ser vai Glu Glu Ala Ser Thr35 40 45

Thr Met Leu Leu Glu Phe Asp Leu Thr Asn Asp Phe Gly Gly Thr Ala50 55 60

Gly Phe Leu Ala Ala Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val vai Ala Phe65 70 75 80

Arg Gly ser Ser Thr Ile Glu Asn Trp Ile Ala Asn Leu Asp Phe Ile85 90 95

Leu Glu Asp Asn Asp Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys vai His Thr Gly100 105 110

Phe Trp Lys Ala Trp Glu Ser Ala Ala Asp Glu Leu Thr ser Lys lie115 120 125

Lys ser Ala Met Ser Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly130 135 140

His ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg145 150 155 160

Asn Asp Gly Tyr ser Val Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Ile165 170 175

Gly Asn Tyr Ala Leu Ala Glu His Ile Thr Ser Gln Gly Ser Gly Ala180 185 190

Asn Phe Arg vai Thr His Leu Asn Asp Il e vai Pro Arg Val Pro Pro195 200 205

Met Asp Phe Gly Phe Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr ser210 215 220

Gly Asn Gly Ala ser vai Thr Ala ser Asp Ile Glu Val Ile Glu Gly225 230 235 240

Ile Asn ser Thr Ala Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val Ser Val Leu245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Phe Ala Ile ser Glu Cys Leu Leu260 265 270

<210> 14<211> 270<212> PRT<213> Aspergillus niger

<400> 14

Ser Val ser Thr ser Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ser Gln Trp1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr cys Ser Asn Asn lie Asp ser Asp Asp ser Asn20 25 30

VaT Thr cys Thr Ala Asp Ala Cys Pro Ser Val Glu Glu Ala ser Thr35 40 45

Lys Met Leu Leu Glu Phe Asp Leu Thr Asn Asn Phe Gly Gly Thr Ala50 55 60

Gly Phe Leu Ala Ala Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu vai vai Ala Phe65 70 75 80

Arg Gly ser ser Thr lie Lys Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asp Phe Ile85 90 95

Leu Gln Asp Asn Asp Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys vai His Thr Gly100 105 110

Phe Trp Lys Ala Trp Glu Ala Ala Ala Asp Asn Leu Thr ser Lys Ile115 120 125

Lys Ser Ala Met ser Thr Tyr ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr vai Leu Arg145 150 155 160

Asn Asp Gly Tyr Ser Val Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Val165 170 175

Gly Asn Tyr Ala Leu Ala Glu His Ile Thr Ser Gln Gly Ser Gly Ala180 185 190

Asn Phe Pro vai Thr His Leu Asn Asp Ile Val Pro Arg Val Pro Pro195 200 205

Met Asp Phe Gly Phe ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp lie Thr ser210 215 220

Gly Thr Gly Ala ser vai Thr Ala Ser Asp Ile Glu Leu Ile Glu Gly225 230 235 240

Ile Asn ser Thr Ala Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr vai Asp Val Leu245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Phe Ala Ile Ser Glu Cys Leu Leu260 265 270

<210> 15<211> 269<212> PRT

<213> Aspergillus oryzae<400> 15

Asp vai ser Ser Ser Leu Leu Asn Asn Leu Asp Leu Phe Ala Gln Tyr1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Asp Glu Asn Leu Asn Ser Thr Gly Thr Lys20 25 30

Leu Thr cys ser Val Gly Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala ser Thr35 40 45

Gln ser Leu Asp Glu Phe Asn Glu Ser Ser Ser Tyr Gly Asn Pro Ala50 55 60

Gly Tyr Leu Ala Ala Asp Glu Thr Asn Lys Leu Leu Val Leu Ser Phe65 70 75 80

Arg Gly ser Ala Asp Leu Ala Asn Trp vai Ala Asn Leu Asn Phe Gly85 90 95

Leu Glu Asp Ala ser Asp Leu Cys Ser Gly Cys Glu Val His Ser Gly100 105 HO

Phe Trp Lys Ala Trp ser Glu xle Ala Asp Thr Ile Thr ser Lys vai115 120 125

Glu Ser Ala Leu ser Asp His ser Asp Tyr ser Leu Val Leu Thr Gly130 135 140

His ser Tyr Gly Ala Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Thr Ala Leu Arg145 150 155 160

Asn ser Gly His Ser Val Glu Leu Tyr Asn Tyr Gly Gln Pro Arg Leu165 170 175

Gly Asn Glu Ala Leu Ala Thr Tyr Ile Thr Asp Gln Asn Lys Gly Gly180 185 190

Asn Tyr Arg Val Thr His Thr Asn Asp Ile vai Pro Lys Leu Pro Pro195 200 205

Thr Leg Leu Gly Tyr His His Phe ser Pro Glu Tyr Tyr Ile ser Ser210 215 220

Ala Asp Glu Ala Thr Val Thr Thr Thr Asp vai Thr Glu vai Thr Gly225 230 235 240

Ile ASp Ala Thr Gly Gly Asn Asp Gly Thr Asp Gly Thr ser ile Asp245 250 255Ala His Arg Trp Tyr Phe Ile Tyr Ile Ser Glu Cys Ser260 265

<210> 16<211> 251<212> PRT<213> Landerina penisapora

<400> 16

pro Gln Asp Ala Tyr Thr Ala Ser His Ala Asp Leu Val Lys Tyr Ala1 5 10 15

Thr Tyr Ala Gly Leu Ala Tyr Glr» Thr Thr Asp Ala Trp Pro Ala Ser20 25 30

Arg Thr vai Pro Lys Asp Thr Thr Leu Ile ser Ser Phe Asp His Thr35 40 45

Leu Lys Gly ser ser Gly Tyr Ile Ala Phe Asn Glu Pro Cys Lys Glu50 55 60

Ile Ile vai Ala Tyr Arg Gly Thr Asp ser Leu Ile Asp Trp Leu Thr65 70 75 80

Asn Leu Asn Phe Asp Lys Thr Ala Trp Pro Ala Asn Ile ser Asn Ser85 90 95

Leu Val His Glu Gly Phe Leu Asn Ala Tyr Leu Val ser Met Gln Gln100 105 110

vai Gln Glu Ala vai Asp Ser Leu Leu Ala Lys Cys pro Asp Ala Thr115 120 125

Ile ser Phe Thr Gly His ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Cys Ile Ser130 135 140

Met Val Asp Thr Ala Gln Arg His Arg Gly Ile Lys Met Gln Met Phe145 150 155 160

Thr Tyr Gly Gln Pro Arg Thr Gly Asn Gln Ala Phe Ala Glu Tyr Val165 170 175

Glu Asn Leu Gly His Pro vai Phe Arg vai vai Tyr Arg His Asp Ile180 185 190

vai Pro Arg Met Pro Pro Met Asp Leu Gly Phe Gln His His Gly Gln195 200 205

Glu vai Trp Tyr Glu Gly Asp Glu Asn lie Lys Phe Cys Lys Gly Glu210 215 220

Gly Glu Asn Leu Thr Cys Glu Leu Gly vai Pro Phe Ser Glu Leu Asn225 230 235 240

Ala Lys Asp His ser Glu Tyr pro Gly Met His245 250<table>table see original document page 65</column></row><table>ID UQ 14.ιID NO ISi

RSVftOTLBQK VEDAVREHPD YRWFTGHSL GGALAWAGADLRGNGYLVSMQQVQEA VDSLiiAKCPD ATISFTGHSL GGAI1ACISMVDT AQRHRGX

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OVEYWSV DPYSAQNTFVCTGDEVQCCB AjQGGQG

WEYWSV DPYSAQNTFVCTGDEVQCCB AQGGQGTPEFWLSGGGGDKVDYTISDVXVCEGAAMLG CNGGmSPEYWLNG GPLDKDYTVTEXXVCEGIANVM CNGGTI

SPEYYITA PDNTTVTDNQVTVLDGYVNFK GNTGTS

SPEYWITS PNNATVSTSDIKVIDGDVSFD GNTGTO

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SPEYWITS GTGASVTASDIELXEGINSTA GNAGEA

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SPEYraKS GTLVPVTRNDIVKIEGIDATG GNNQPN

GQEVWYEG DENIKFCKGSGBNLTCELGVP

ID NO li PFT SVIDHLSYLDMNTGL CL ID NO Zt PFT SVIDHLSYLDMNTGL· CL ID NO 3; PFT SVLDHLSYFGINTGL CT ID NO 4: PFT SILDHLSYFDINEGS CL ID NO Si VN NAHTTYF OfPSGACTW ID NO S : VH NAHTTYF GMTSGHCTW ID NO If GL DIAAHLHYF QATDA CNAGGFSWR R ID NO 8: GL DILAHITYF QSMAT CAPIAIPWK R ID NO 9: GGLFDLLAFHSHVWYFIHADACKGPGLPLR ID NO 10: LPLLTDFEAHIWYF VQVDA GÍCGPGLPFK R ID NO Ilf TV SVLAHLWYF FAISE CLL ID NO 12; TV DVLAHLWYF FAISE CLL ID NO 13 : GT SIDAHRWYF IYISE CS ID NO 14: IP DIPAHLWYF GLXGT CL XD NO 15: FSlL NAKDHSEYP G^tH ID NO: Micro oraanlsm SEQ ID NO.:1, Absldfa reflexa 32. Absiclfa corymbffera 43. Rhizmucor miehei 54, Rhlzopus detemmr (oryzea) 65. AspergiIIus niger 76. Aspergflfus tubfngensfs 87. Fusarfum oxysporum 98. Fusarfum heterosporum 109. Aspargitlus oryzae 1110. Penidlfum camembertif 1211. AspergiffusfoeMus 13

12 Aspergillusnigw 14

13. AspergUIusoryzea 15

14. Thermomyces lanuginosus 2

15. Landerinapenimpora 16

Claims (35)

1. Composição, caracterizada pelo fato de compreender um fo-tobranqueador e uma variante de uma Iipase original, sendo que a dita vari-ante, quando comparada à dita Iipase original, compreende um total de pelomenos três substituições, as quais são selecionadas de um ou mais dos se-guintes grupos de substituições:a.) pelo menos duas substituições na Região I,b) pelo menos uma substituição na Região II,c) pelo menos uma substituição na Região III, e/oud) pelo menos uma substituição na Região IV.

2. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1, emque as ditas substituições na Região I compreendem substituições nas posi-ções correspondentes a 231 e 233.

3. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 2, emque as ditas substituições nas posições 231 e 233 são substituídas com umR.

4. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 2, emque a dita variante compreende uma substituição na posição correspondentea 4 da SEQ. ID n° 2.

5. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 4, emque a dita substituição na posição correspondente a 4 da SEQ. ID n9 2 é V.

6. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 2, emque a dita variante compreende uma substituição na posição correspondentea 227 da SEQ. IDne 2.

7. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 6, emque a dita substituição na posição correspondente a 227 da SEQ. ID n9 2 éG.

8. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1, emque a dita pelo menos uma substituição na Região Il compreende uma subs-tituição selecionada do grupo consistindo em substituições nas posições cor-respondentes a 202, 211, 255 e 256.

9. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 8, emque a dita pelo menos uma substituição na Região Il compreende uma subs-tituição selecionada do grupo consistindo em X202G, X211L, X255Y/V eX256K.

10. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1,em que a dita pelo menos uma substituição na Região Il compreende umasubstituição na posição correspondente a 210.

11. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 10,em que a dita substituição na posição correspondente a 210 compreendeX210K.

12. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1,em que a dita pelo menos uma substituição na Região Ill compreende umasubstituição selecionada do grupo consistindo em substituições nas posiçõescorrespondentes a 86 e 90.

13. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 12,em que a dita pelo menos uma substituição na Região Ill compreende umasubstituição selecionada do grupo consistindo em X86V e X90A/R.

14. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1,em que a dita pelo menos uma substituição na Região Ill compreende umasubstituição da posição correspondente a 83.

15. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 14,em que a dita substituição na posição correspondente a 83 compreendeX83T.

16. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1,em que a dita pelo menos uma substituição na Região IV compreende umasubstituição selecionada do grupo consistindo em substituições nas posiçõescorrespondentes a 27, 58 e 60.

17. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 15,em que a dita pelo menos uma substituição na Região IV compreende umasubstituição selecionada do grupo consistindo em X27R, X58N/A/G/P/T eX60S/V/G/N/R/K/A/L.

18. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1,compreendendo pelo menos duas substituições ria Região IV, corresponden-tes às posições 27, 58 e 60.

19. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1,compreendendo pelo menos duas substituições na Região IV, selecionadasdo grupo consistindo em X27R, X58N/A/G/P^" e X60S/V/G/N/R/K/A/L.

20. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1,em que a dita variante compreende pelo menos uma substituição fora dasRegiões de I a IV definidas.

21. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 20,em que a dita pelo menos uma substituição fora das Regiões de I a IV defi-nidas, é selecionada do grupo consistindo em substituições nas posiçõescorrespondentes a 81, 147, 150 e 249.

22. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 20,em que a dita pelo menos uma substituição fora das Regiões de I a IV defi-nidas, é selecionada do grupo consistindo em X81Q/E, X147M/Y, X150G eX249R/I/L.

23. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 2,em que a dita Iipase original é pelo menos 90% idêntica à SEQ. ID n9 2.

24. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1,em que a Iipase original é idêntica à SEQ. ID nQ 2, sendo que a dita variantecompreende um dos seguintes grupos de substituições:a) T231R + N233R + I255Yb) I202G + T231R + N233Rc) I86V + L227G + T231R + N233R + P256Kd) Q4V + S58N + V60S + T231R + N233Re) S58N + V60S + I90R + T231R + N233Rf) I90A + T231R + N233R + I255Vg) S58N + V60S + I86V + A150G + L227G + T231R + N233R +P256Kh) S58N + V60S + L147M + F211L + T231R + N233Ri) Q4V + S58A + V60S + S83T + I86V + A150G + E210K +L227G + T231R + N233R + P256Kj) S58N + V60S + I86V + A150G + L227G + T231R + N233R +Ρ256Κ.

25. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1,em que a Iipase original é idêntica à SEQ. ID n9 2, sendo que a dita variantecompreende um dos seguintes grupos de substituições:a) Q4V + S58A + V60S + S83T + I86V + A150G + E210K +L227G + T231R + N233R + P256Kb) S58N + V60S + I86V + A150G + L227G + T231R + N233R +P256K.

26. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1,em que a variante de Iipase apresenta uma relação risco/benefício, quandomedida conforme descrito no relatório descritivo, maior que 1.

27. Composição detergente, compreendendo um fotobranquea-dor e um polipeptídeo com atividade de lipase, tendo ainda um desempenhorelativo médio de pelo menos 0,8 e uma relação risco/benefício de pelo me-nos 1,1 sob as condições de teste apresentadas no relatório descritivo.

28. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que acomposição compreende de 0,1% a 40% de tensoativo aniônico.

29. Composição, de acordo com a reivindicação 28, em que a re-ferida composição é uma composição de limpeza e/ou tratamento.

30. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que acomposição compreende ftalocianina de zinco sulfonatada.

31. Composição, de acordo com a reivindicação 25, em que acomposição compreende uma mistura de ftalocianina de zinco sulfonatada eftalocianina de alumínio sulfonatada, sendo que a dita mistura tem uma ra-zão de peso entre ftalocianina de zinco sulfonatada e ftalocianina de alumí-nio sulfonatada maior que 1:1.

32. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que acomposição compreende ftalocianina de alumínio sulfonatada.

33. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o fo-tobranqueador compreende um corante xanteno, antraquinona ou naftaqui-nona.

34. Processo para limpeza e/ou tratamento de uma superfície outecido, compreendendo as etapas de colocar a dita superfície ou o dito teci-do em contato com a composição como definida na reivindicação 1, e, então,opcionalmente lavar e/ou enxaguar a dita superfície ou o dito tecido.

35. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a ditavariante de Iipase é uma variante da SEQ. ID n9 2 compreendendo pelo me-nos uma das mutações Q4V, S58N/A/G/P/T, I90R ou Q249I/L.