BRPI0707272A2 - uso de um fragmento de ácido nucleico de seq id no: 1 ou 2, ou de uma variante de seq id no: 1 ou 2, fragmento de ácido nucleico de senso e/ou anti-senso de seq id no: 1 ou 2, ou de uma variante de seq id no: 1 ou 2, composição, proteìna, método para diagnosticar cánceres de origem neuroectodermal, e, kit diagnóstico - Google Patents

Abstract

USO DE UM FRAGMENTO DE áCIDO NUCLEICO DE SEQ ID NO: 1 OU 2, OU DE UMA VARIANTE DE SEQ ID NO: 1 OU 2, FRAGMENTO DE áCIDO NUCLEICO DE SENSO E/OU ANTI-SENSO DE SEQ ID NO: 1 OU 2, OU DE UMA VARIANTE DE SEQ ID NO: 1 OU 2, COMPOSIçãO, PROTEINA, METODO PARA DIAGNOSTICAR CáNCERES DE ORIGEM NEUROECTODERMAL, E, KIT DIAGNóSTICOA presente invenção refere-se às novas moléculas de ácido nucleico e de proteína e ao seu uso em diagnose e terapia de câncer.

Description

"USO DE UM FRAGMENTO DE ÁCIDO NUCLEICO DE SEQ ID NO: 1OU 2, OU DE UMA VARIANTE DE SEQ ID NO: 1 OU 2, FRAGMENTODE ÁCIDO NUCLEICO DE SENSO E/OU ANTI-SENSO DE SEQ ID NO:1 OU 2, OU DE UMA VARIANTE DE SEQ ID NO: 1 OU 2,COMPOSIÇÃO, PROTEÍNA, MÉTODO PARA DIAGNOSTICARCÂNCERES DE ORIGEM NEUROECTODERMAL, E, KITDIAGNÓSTICO"

Campo da invenção

A presente invenção refere-se a uma nova proteína tipo cortinadupla (DCL) e a uma nova variante de mRNA de união codificadora damesma. São proporcionadas seqüências de ácido nucleico (RNA e DNA) decamundongo e de humano codificadoras da nova proteína DCL, bem como aprópria proteína de camundongo e de humano e vários fragmentos de ácidonucleico e variantes adequados para aplicações diagnosticas e terapêuticas. Ainvenção adicionalmente refere-se aos métodos para modular níveis deproteína DCL em terapia de câncer, especialmente terapia de neuroblastoma,e aos métodos de diagnose e aos kits de diagnose.

Fundamentos da invenção

Como o tumor sólido mais comum em crianças, neuroblastomaé responsável por 8 - 10% de todos os cânceres em crianças (para uma revisãoveja Lee et al., 2003, Urol. Clin. N. Am. 30, 881890). Incidência anual variade 10 a 15 por 100.000 infantes, de acordo com a triagem baseada empopulação conduzida em Canadá, Alemanha e Japão. Neuroblastoma é umadoença heterogênea, com 40% diagnosticado em crianças abaixo de 1 ano deidade que possuem um prognóstico muito bom, e o restante em crianças maisvelhas e adultos jovens que possuem prognóstico insatisfatório a despeito damanejo médico e cirúrgico avançado. Um tratamento comum para pacientessob risco alto e imediata é quimioterapia seguida por resseção cirúrgica.Contudo, erradicação completa de células de neuroblastoma é raramenterealizada. Conseqüentemente, a maior parte dos pacientes sofre recidiva, queé muitas vezes resistente ao tratamento convencional e rapidamentedevastadora. Assim, após indução da remissão aparente por terapia deprimeira linha, novas estratégias terapêuticas são necessárias paracompletamente erradicar o número pequeno de células sobreviventes, paraprevenir a recidiva (Lee et al, 2003, supra).

Desenvolvimento do cérebro requer a configuração precisa ecoordenada de divisão, migração e diferenciação celulares de neuroblastos(Noctor et al, 2001, Nature 409, 714-720; Noctor et al., 2004, Nat.Neuroscience 7, 136-144). Um evento chave em ambos estes processos é a(re)organização e (des)estabilização do citoesqueleto, que é compreendido demicrotúbulos e de proteínas microtúbulo-associadas (MAPS). Uma interaçãocuidadosamente orquestrada de microtúbulos com várias MAPS é requeridaantes de poder ocorrer a migração neuronal (revisto em Feng e Walsh, 2001,Nat. Rev. Neurosci. 2, 408-416). Embora os fatores envolvidos em migraçãoneuronal estejam bem estabelecidos, relativamente pouco é sabido sobre osgenes que controlam os processos iniciais, como mitose e proliferação deneuroblasto. Tais fatores muito provavelmente também envolvem regulaçãodinâmica dos elementos microtubulares e citoesqueletais (Haydar et al, 2003,Proc. Natl. Acad. Sei. 100, 2890-2895; Kaltschmidt et al, 2000, Nat. CellBiol. 2, 7-12; Knoblich, 2001, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 11-20).

Recentemente, vários genes envolvidos em reorganização decitoesqueleto têm sido identificados os quais, quando interrompidos oumutados, causam distúrbios de migração neuronal (revisto em Feng e Walsh,2001, supra). Um destes genes é cortina dupla (DCX) que codifica umaproteína de 365 AA crítica para migração de neurônios corticais de recém-nascidos (veja W099/27089).

No genoma de humano e de roedor, um gene relacionado,chamado de quinase tipo de cortina dupla (DCLK), está presente o qual possuiuma identidade de seqüência substancial com o gene DCX. O gene DCLK dehumano abarca mais do que 250 kb e é sujeito à união alternativa extensiva,gerando múltiplos transcritos codificadores de proteínas diferentes(Matsumoto et al, 1999, Genomics 56, 179-183). Um dos transcritosprincipais, DCLK-long, codifica um domínio de DCX fusionado em umdomínio de quinase-semelhante que possui homologia de aminoácidos com afamília de proteínas dependentes de Ca++/Calmodulina (CaMK). Outrotranscrito, DCLK-short, é principalmente expressado em cérebro de adulto,falta o domínio de DCX e codifica uma quinase com propriedades de CaMK-semelhante (Engels et al, 1999, Brain Res. 835, 365368; Engels et al, 2004,Brain Res. 120, 103-114; Omori et al, 1998, J. Hum. Genet. 43, 169-177;Vreugdenhil et al, 2001, Brain Res. Mol. Brain Res. 94, 67-74).

Estudos recentes sugerem papéis importantes para o geneDCLK em neurodegeneração e plasticidade neuronais dependentes de cálcio(Burgess and Reiner, 2001, J. Biol. Chem. 276, 36397-36403; Kruidering etal, 2001, J. Biol. Chem. 276, 38417-38425). DCLK-long é expressadodurante o desenvolvimento inicial (Omori et al, 1998, supra) e como DCX, écapaz de polimerização de microtúbulo (Lin et al, 2000, J. Neurosci. 20,9152-9161). Contudo, o papel preciso do gene DCLK no desenvolvimento dosistema nervoso é desconhecido.

Várias variantes de união alternativas de DCLK têm sidodescritas e tem sido verificado que duas destas são diferentementeexpressadas e possuem atividades de quinase diferentes (Burgess e Reiner2002, J Biol. Chem. 277, 17696-17705). Os presentes inventores clonaram efuncionalmente caracterizaram uma nova variante de união do gene DCLK,referido aqui como tipo cortina dupla (DCL), e têm mostrado que DCL é umgene de citoesqueleto que está associado com fusos mitóticos de neuroblastosse dividindo. Em adição, os presentes inventores têm planejado novosmétodos para diagnose e terapia de câncer, especialmente para diagnose eterapia de neuroblastoma.

Recentemente, novas abordagens para tratamento deneuroblastoma têm sido publicadas, envolvendo o uso de oligonucleotídeos deanti-senso de alvejamento de dois oncogenes diferentes (Pagnan et al., 2000,J. Natl. Câncer Inst. Vol 92, 253-261; Brignole et al. 2003, Câncer Lett. 197,231-235; Burkhart et al, 2003, J. Natl. Câncer Inst. 95, 1394-1403). Aprimeira abordagem foi direcionada contra o oncogene c-Myb (Pagnan et al.,2000, supra). Expressão de gene c-Myb tem sido relatada em vários tumoressólidos de origens embriônicas diferentes, incluindo neuroblastoma, onde estáligado em diferenciação e proliferação celulares. Foi mostrado que umfosforotioato oligodesoxinucleotídeo complementar aos códons 2 - 9 de c-Myb mRNA de humano inibiu o crescimento de células de in vítro. Seu efeitoinibitório foi mais alto quando foi liberado em células em lipossomosestericamente estabilizados revestidos com um anticorpo monoclonal (mAb)específico para antígeno de neuroectoderma disialogangliosídeo GD2 (Pagnanet al., 2000, supra). Embora estudos farmacocinéticos e de biodistribuiçãoapós injeção intravenosa de lipossomos anti-GD2-alvejados tenham sidorealizados (Brignole et al., 2003, supra), o efeito em um modelo deneuroblastoma in vivo não tem sido mostrado até agora. Efeitos colateraistóxicos potenciais de um oligonucleotídeo de anti-senso c-Myb tambémdevem ser considerados, porque a proteína c-Myb desempenha um papelfundamental na proliferação de células normais e já tem sido mostrado queum oligonucleotídeo de anti-senso c-Myb inibe a hematopoiese de humanonormal in vitro (Gewirtz e Calabretta, 1988, Science 242, 1303-1306).

Outra abordagem de anti-senso foi direcionada contra ooncogene MYCN (N-myc) (Burkhart et al., 2003, supra). Amplificação dogene MYCN ocorre apenas em 25 a 30% dos neuroblastomas, mas estáassociada com uma doença de estado avançado, progressão rápida de tumor euma taxa de sobrevivência de menor do que 15%. O efeito de umfosforotioato oligodesoxinucleotídeo complementar aos cinco primeiroscódons de MYCN mRNA de humano foi testada in vivo em um modelomurino de neuroblastoma. Foi mostrado que liberação contínua dooligonucleotídeo por 6 semanas via uma bomba microosmóticasubcutaneamente implantada pôde diminuir a incidência de tumor e a massade tumor no sítio da bomba implantada (Burkhart et al., 2003, supra).

Conduto esta abordagem é muito local, e permanece para ser estabelecido umefeito sistêmico do oligonucleotídeo sobre metástases para sítios de órgãodistantes, em adição aos efeitos colaterais tóxicos potenciais sobre célulasnormais após liberação sistêmica. Também, o efeito do oligonucleotídeosobre um tumor já estabelecido não tem sido mostrado.

A escolha do gene alvo é crucial para o desenvolvimento deum diagnóstico e de uma terapia de neuroblastoma efetivos. Comomencionado acima, os presentes inventores têm clonado uma nova variante deunião de mRNA do gene DCLK, codificadora de nova proteína DCL, e têmfuncionalmente caracterizado esta variante de união. Foi surpreendentementeverificado que esta variante de união é exclusivamente expressada emneuroblastomas, enquanto que não é detectável em tecido e linhagenscelulares saudáveis testados. Esta descoberta foi usada para planejar novosmétodos diagnósticos e terapêuticos.

Definições

"Silenciamento de gene" refere-se aqui a uma redução (infra-regulação) ou abolição completa de produção de proteína alvo em uma célula.

Silenciamento de gene pode ser o resultado de uma redução de transcriçãoe/ou tradução do gene alvo. O(s) "gene(s) alvo(s)" é/são o(s) gene(s) queé/são para ser(em) silenciado(s). O gene alvo é normalmente um geneendógeno, mas pode em certas circunstâncias ser um transgene. Comométodos que podem ser usados para silenciar todos ou vários membros deuma família de genes, o termo "gene alvo" também pode ser referir a umafamília de genes que é para ser silenciada.

O termo "gene" refere-se à seqüência de ácido nucleico que étranscrita em uma molécula de mRNA ("região transcrita"), operacionalmenteligada em vários elementos de seqüência necessários para transcrição, taiscomo uma seqüência regulatória de transcrição, intensificadores, seqüêncialíder-5', região codificadora e seqüência 3'-não-traduzida. Um gene endógenoé um gene naturalmente encontrado dentro de uma célula.

"Senso" refere-se à fita codificadora de uma molécula de ácidonucleico, tal como a fita codificadora de uma molécula de DNA duplex ou deuma molécula de transcrito de mRNA. "Anti-senso" refere-se à fitacomplementar inversa da fita de senso. Uma molécula de anti-senso pode serum DNA de anti-senso ou um RNA de anti-senso, i.e. possuindo umaseqüência de ácido nucleico idêntica a do DNA de anti-senso, com a diferençade que T (timina) é substituída por U (uracila).

O termo "compreendendo" é para ser interpretado comoespecificando a presença de partes, etapas ou componentes enunciados, masnão exclui a presença de uma ou mais partes, etapas ou componentesadicionais. Uma seqüência de ácido nucleico compreendendo a região X,pode portanto compreender regiões adicionais, i.e. região X pode estarembebida em uma região de ácido nucleico maior.

Os termos "substancialmente idêntico(a)", "identidadesubstancial" ou "essencialmente similar" ou "similaridade essencial"significam que dois peptídeos ou duas seqüências de nucleotídeos, quandootimamente alinhados, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usandoparâmetros pré-estabelecidos, compartilham pelo menos cerca de 75%,preferivelmente pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência,preferivelmente pelo menos cerca de 85 ou 90% de identidade de seqüência,mais preferivelmente pelo menos 95%, 97%, 98% de identidade de seqüênciaou mais (e.g., 99%, de identidade de seqüência). GAP usa o algoritmo dealinhamento global de Needleman e Wunsch para alinhar duas seqüênciassobre o comprimento inteiro delas, maximizando o número de combinações eminimizando o número de lacunas. Geralmente, os parâmetros pré-estabelecidos de GAP são usados, com uma penalidade de criação de lacuna =50 (nucleotídeos) / 8 (proteínas) e penalidade de extensão de gap = 3(nucleotídeos) / 2 (proteínas). Para nucleotídeos a matriz de escore pré-estabelecida usada é nwsgapdna e para proteínas a matriz de escore pré-estabelecida é Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad.Science 89, 915-919). Está claro que quando é citado que seqüências de RNAsão essencialmente similares ou possuem um certo grau de identidade deseqüência com seqüências de DNA, timina (T) na seqüência de DNA éconsiderada igual à uracila (U) na seqüência de RNA. Seqüências "idênticas"possui identidade de seqüência de aminoácidos ou de ácido nucleico de 100%quando alinhadas. Também neste caso uma seqüência de RNA é 100% a umaseqüência de DNA se a única diferença entre as seqüências é que a seqüênciade RNA compreende U em vez de T em posições idênticas. Alinhamentos deseqüências e escores para identidade de seqüência percentual podem serdeterminados usando programas de computador, tal como o GCG WisconsinPackage, Version 10.3, disponível na Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, SanDiego, CA 92121-3752 USA. Alternativamente identidade ou similaridadepercentual pode ser determinada pela pesquisa contra banco de dados taiscomo FASTA, BLAST, etc.

Quando for feita aqui referência às "seqüências" ou aos"fragmentos de seqüência", é para ser entendido que se refere às moléculascom uma certa seqüência de nucleotídeos (DNA ou RNA) ou de aminoácidos.

"Condições de hibridização estringentes" também podem serusadas para identificar seqüências de nucleotídeos, que são substancialmenteidênticas a uma dada seqüência de nucleotídeos. Condições estringentes sãodependentes de seqüência e serão diferentes em circunstâncias distintas.Geralmente, condições estringentes são selecionadas para serem cerca de 5°Cabaixo do ponto de fusão térmico (Tm) para as seqüências específicas em umaforça iônica e pH definidos. O Tm é a temperatura (sob pH e força iônicadefinidos) na qual 50% da seqüência alvo hibridiza em uma sondaperfeitamente combinada. Condições tipicamente estringentes serãoescolhidas nas quais a concentração de sal é cerca de 0,02 molar em pH 7 e atemperatura é pelo menos 60°C. Abaixamento da concentração de sal e/ouaumento da temperatura aumenta a estringência. Condições estringentes parahibridizações de RNA-DNA (Northern blots usando uma sonda de e.g. IOOnt)são por exemplo aquelas que incluem pelo menos uma lavagem em 0,2X SSCa 63 0C por 20 min, ou condições equivalentes. Condições estringentes parahibridização de DNA-DNA (Southern blots usando uma sonda de e.g. IOOnt)são por exemplo aquelas que incluem pelo menos uma lavagem (normalmente2) em 0,2X SSC em uma temperatura de pelo menos 50°C, normalmentecerca de 55°C, por 20 min, ou condições equivalentes.

Um "indivíduo" refere-se aqui a um indivíduo mamífero,especialmente um indivíduo animal ou humano.

"Célula(s) alvo" refere-se aqui às células nas quais os níveis deproteína DCL são para serem modificados (especialmente reduzidos) eincluem quaisquer células de câncer nas quais a proteína DCL é normalmenteproduzida, em particular as células de câncer de origem neuroectodermal,especialmente células de neuroblastoma. A presença de DCL em células alvopode ser determinada como descrito aqui alhures. Abaixo apenas diagnose eterapia de neuroblastoma são referidos, mas é entendido que qualquerreferência a células de neuroblastoma pode ser aplicada analogamente aoutros tipos de células alvo de câncer, em particular células alvo de câncer deorigem neuroectodermal, e que tais métodos, usos e kits são aqui incluídos.

Descrição detalhada da invençãoA presente invenção proporciona novas seqüências de proteínae de ácido nucleico para uso em métodos diagnósticos e terapêuticos deneuroblastoma. Foi verificado que a proteína DCL é expressadaespecificamente em célula em todas as linhagens de célula de neuroblastomatestadas até agora (linhagens de célula de camundongo e de humano). Foiverificado que DCL polimeriza e estabiliza microtúbulos e a co-localização deDCL endógena com fusos mitóticos em células de neuroblastoma se dividindoindica um papel de DCL em formação correta do fuso mitótico em células sedividindo. Silenciamento de gene DCL em linhagens de célula deneuroblastoma resultou em deformação dramática ou até mesmo ausência dofuso mitótico e desmontagem de microtúbulo.

Células de neuroblastoma são de origem neuroectodermal. Emvertebrados, as células-tronco multipotentes de tubo neural embriônico(neuroectoderma) produzem os principais tipos de célula do sistema nervosocentral (CNS) e do sistema nervoso periférico (PNS). Tais tipos de célula sãodefinidos como células derivadas de neuroectoderma ou em outras palavras deorigem neuroectodermal. Tumores de origem neuroectodermal incluem todosos neoplasmas dos CNS e PNS, tais como neuroblastoma, meduloblastoma,glioblastoma, oligodendroglioma, oligoastrocitoma, astrocitoma,neurofibroma, ependimoma, MPNST (tumores malignos de bainha de nervoperiférico), ganglioneuroma ou Schwannoma. Também de origemneuroectodermal são os tumores tais como rabdomiossarcoma,retinoblastoma, carcinoma pulmonar de célula pequena, feocromocitomaadrenal, PNET primitivo (tumor neuroectodermal periférico), sarcoma deEwing e melanoma. Visto que todos estes tumores compartilham uma origemembriônica comum com células de neuroblastoma, DCL será um alvo paradiagnose e tratamento nestes casos.

Seqüências de ácido nucleico e seqüências de aminoácidos de acordo com a

invençãoA presente invenção proporciona novas seqüências demolécula de ácido nucleico, SEQ ID NO: 1 {dcl mRNA e cDNA decamundongo) e SEQ ID NO: 2 {dcl mRNA e cDNA de humano), quecodificam as proteínas SEQ ID NO: 3 (DCL de camundongo) e SEQ ID NO:4 (DCL de humano). As seqüências de dcl mRNA de SEQ ID NO: 1 e 2 sãonovas variantes de união do gene DCLK de camundongo e de humano. Asvariantes de união compreendem exon 1 ao exon 8 (parcialmente, até umcódon de parada) no qual o exon 1 é não-codificador. Em ambas asseqüências, exon 6 do gene DCLK está ausente. Na seqüência de mRNA decamundongo, o códon de início de tradução é encontrado em nucleotídeos189-191, enquanto que o códon de parada de tradução é encontrado emnucleotídeos 1275-1277. Exon 2 inicia em nt 169, exon 3 inicia em nt 565,exon 4 inicia em nt 912, exon 5 inicia em nt 1012, exon 7 inicia em nt 1129 eexon 8 inicia em nt 1224. Na seqüência de mRNA de humano mRNA, ocódon de início de tradução é encontrado em nucleotídeos 213-215, enquantoque o códon de parada de tradução é encontrado em nucleotídeos 1302-1304.Exon 2 inicia em nt 194, exon 3 inicia em nt 589, exon 4 inicia em nt 936,exon 5 inicia em nt 1036, exon 7 inicia em nt 1153 e exon 8 inicia em nt1248. As proteínas DCL de camundongo e de humano são muito similares emsuas seqüências de aminoácidos e ambas possuem um peso molecular decerca de 40 kDa. A proteína DCL de camundongo compreende 362aminoácidos, enquanto que a proteína DCL de humano compreende 363aminoácidos. Identidade de seqüência de aminoácidos é cerca de 98%, asapenas 4 diferenças de aminoácido estão presentes. Estas estão no aminoácido172, que é G na seqüência de camundongo e S na seqüência de humano, naposição 290 (A na seqüência de camundongo vs. S na seqüência de humano),na posição 294 (G na seqüência de camundongo vs. S na seqüência dehumano) e a V na posição 359 da seqüência de humano está ausente naseqüência de camundongo. Devido à similaridade de seqüência alta também,em nível de cDNA/mRNA (que é cerca de 90% para a região codificadora),qualquer seqüência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 1 ou 2), ou seusfragmentos ou suas variantes, podem ser usadas nas abordagens desilenciamento de gene de células alvo, especialmente de células de câncer dehumano de origem neuroectodermal. É entendido que quando referência forfeita aqui a uma molécula de RNA ou mRNA, embora a listagem deseqüências mostre uma seqüência de DNA, a molécula de RNA é idêntica àseqüência de DNA com a diferença de que T (timina) é substituída por U(uracila).

A parte das seqüência de ácido nucleico completas de dcl(SEQ ID NO: 1 e 2), também são proporcionados fragmentos de senso e/ou deanti-senso de SEQ LD NO: 1 e 2, que são adequados para uso em métodos desilenciamento de gene possuindo dcl como gene alvo. O(s) fragmento(s) têmque ser funcionais quando usados em qualquer um dos métodos desilenciamento de gene descritos abaixo, e em particular causam uma reduçãosignificativa da produção da proteína DCL de SEQ ID NO: 3 ou 4 quandopresente em células de câncer de origem neuroectodermal. Uma "reduçãosignificativa na produção de SEQ ID NO: 3 ou 4" refere-se a uma redução daproteína-DCL de pelo menos 50%, 60%, 70%, preferivelmente pelo menos80%, 90% ou 100% em células de câncer de origem neuroectodermalcompreendendo o fragmento de senso e/ou de anti-senso de SEQ ID NO: 1e/ou 2, comparado com o nível de proteína-DCL encontrado em células decâncer de origem neuroectodermal nas quais fragmentos de senso e/ou deanti-senso de SEQ ID NO: 1 e/ou 2 não foram introduzidos. Em adição, aintrodução do fragmento de senso e/ou de anti-senso de SEQ ID NO: 1 e/ou 2causa, por redução ou abolição significativa da produção de proteína-DCL nacélula, uma mudança fenotípica na célula. Em particular, resultamdeformação e desmontagem de microtúbulo do fuso mitótico e ésignificativamente reduzida a proliferação de células de câncer de origemneuroectodermal, e.g. células de neuroblastoma. A "redução significativa deproliferação de células de câncer de origem neuroectodermal, e.g. proliferaçãode células de neuroblastoma" refere-se a uma redução ou inibição completaem crescimento (divisão celular) e por exemplo células de neuroblastomacompreendendo os fragmentos de senso e/ou de anti-senso de SEQ ID NO: 1e/ou 2. Uma pessoa experiente pode facilmente testar, usando os métodosaqui descritos, se um fragmento de senso e/ou de anti-senso de SEQ ID NO: 1e/ou 2 possui a capacidade para causar o efeito desejado. O método mais fácilpara testar isto é introduzir os fragmentos de senso e/ou de anti-senso em e.g.linhagens de células de neuroblastoma cultivadas in vitro e analisar níveis deproteína-DCL e/ou de dcl mRNA e/ou mudanças fenotípicas e/ou proliferaçãode células de neuroblastoma naquelas células, comparado com as células decontrole. O efeito in vitro reflete a adequabilidade dos fragmentos de sensoe/ou de anti-senso a serem usados para preparar uma composição para otratamento de por exemplo neuroblastoma.

Em princípio, um fragmento (senso e/ou anti-senso) de SEQID NO: 1 e/ou 2 pode ser qualquer parte de SEQ ID NO: 1 ou 2compreendendo pelo menos 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 50, 100, 200,500, 1000 ou mais nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 1 ou 2, ou seucomplemento ou seu complemento inverso. O fragmento de senso e/ou deanti-senso pode ser um fragmento de RNA ou um fragmento de DNA.Ademais, o fragmento pode ser de fita única ou de fita dupla (duplex). Ofragmento de ácido nucleico também pode ser 100% idêntico à parte da regiãonão-codificadora de SEQ ID NO: 1 ou 2 (e.g. a uma região de nucleotídeos1188 de SEQ ID NO: 1 ou nucleotídeos 1-212 de SEQ ID NO: 2), ou à parteda região codificadora (nucleotídeos 189 a 1274 de SEQ ID NO: 1 ounucleotídeos 213 a 1301 de SEQ ID NO: 2) ou a uma região que éparcialmente não-codificadora e parcialmente codificadora (tais como limitesde intron-exon ou exon 1). Um fragmento de ácido nucleico pode ser feito denovo por síntese química, usando por exemplo um sintetizador deoligonucleotídeo como fornecido e.g. por Applied Biosystems Inc. (Fosters,CA, USA), ou pode ser clonado usando métodos de biologia molecularpadrão, tais como descritos em Sambrook et al. (1989) e Sambrook e Russell(2001). Os fragmentos de ácido nucleico de acordo com a invenção podem serusados para vários propósitos, tais como: como iniciadores de PCR, comosondas para hibridização de ácido nucleico, como oligonucleotídeos de DNAou RNA a serem liberados para as células alvo ou como siRNAs (RNAsinterferentes pequenos) a serem liberados para ou a serem expressados emcélulas alvo. Devido ao fato de os métodos de silenciamento de gene fazeremuso de fragmentos de ácido nucleico de senso e/ou anti-senso diferentes,estes serão descritos em detalhe abaixo, sem limitação do escopo da presenteinvenção.

Em adição, variantes de SEQ ID NO: 1 e 2, seu complementoou seu complemento inverso, como descrito acima, são proporcionados."Variantes" não são 100% idênticas em seqüência de ácido nucleico à SEQID NO: 1 ou 2 (ou seu complemento ou complemento inverso), mas são"essencialmente similares" em sua seqüência de ácido nucleico. "Variantes deSEQ ID NO: 1 ou 2" incluem seqüências de ácido nucleico que, devido àdegeneração do código genético, também codificam os aminoácidos de SEQID NO: 3 ou 4, ou seus fragmentos. Variantes de SEQ ID NO: 1 ou 2, seucomplemento, complemento inverso incluem também SEQ ID NO: 1 ou 2 quedifere de SEQ ID NO: 1 ou 2 através de substituições, deleções e/ou reposiçãode um ou mais nucleotídeos. "Variantes de SEQ ID NO: 1 e 2" tambémincluem seqüências compreendendo ou consistindo de miméticos denucleotídeos tais como PNA's (Ácido Peptídeo-Nucleico), LNA's (ÁcidoNucleico Bloqueado) e semelhantes ou compreendendo morfolino, 2'-0-metil-RNA ou 2'-0-alil-RNA.

Seqüências de ácido nucleico variante podem, por exemplo,ser preparadas de novo por síntese química, geradas por mutagênese oumétodos de embaralhamento de gene ou isoladas de fontes naturais, usandopor exemplo tecnologia de PCR ou hibridização de ácido nucleico. Umavariante de SEQ ID NO: 1 ou 2 também pode ser definida como umaseqüência de ácido nucleico que é "essencialmente similar" (como definidoacima) à SEQ ID NO: 1 ou 2, seu complemento ou complemento inverso.Especialmente, variantes que possuem pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%,95% ou mais de identidade de seqüência com SEQ ID NO: 1 ou 2 sobre ocomprimento inteiro das seqüências são aqui incluídas. Em uma modalidadeda invenção fragmentos de senso e/ou de anti-senso de seqüências de ácidonucleico que são essencialmente similares à SEQ ID NO: 1 ou 2 sãoproporcionados. Como descrito para os fragmentos de SEQ ID NO: 1 ou 2, osfragmentos de variantes de SEQ ID NO: 1 ou 2 possuem a capacidade designificativamente reduzir os níveis celulares da proteína-DCL quandointroduzidos em quantidades adequadas em células de câncer de origemneuroectodermal, e.g. células de neuroblastoma. Funcionalmente, estesfragmentos variante portanto têm que ser equivalentes aos fragmentos desenso e/ou de anti-senso descritos, e uma pessoa experiente pode testar afuncionalidade de tais fragmentos em alguma maneira como descrito.

Também são proporcionadas proteínas isoladas de SEQ IDNO: 3 e SEQ ID NO: 4, bem como seus fragmentos e variantes. As proteínasDCL (ou seus fragmentos ou variantes) de acordo com a invenção podem serpor exemplo usadas para produzir anticorpos, tais como anticorposmonoclonais ou policlonais, que podem ser então usados em vários métodosde detecção de DCL, métodos diagnósticos ou terapêuticos, ou kits.Alternativamente, epítopos, que geram uma resposta imune podem seridentificados dentro das proteínas. As proteínas DCL, seus fragmentos ouvariantes podem ser sinteticamente preparadas, podem ser purificadas dasfontes naturais ou podem ser expressadas em células recombinantes ouculturas de células. Um fragmento de proteína DCL pode ser qualquerfragmento de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 compreendendo 20, 50, 100,200, ou mais de aminoácidos consecutivos idênticos ou essencialmentesimilares à parte correspondente de SEQ ID NO: 3 ou 4. Variantes de proteínaDCL incluem seqüências de aminoácido que possuem identidade deseqüência substancial à SEQ ID NO: 3 ou 4, por exemplo seqüências deaminoácido que diferem de SEQ ID NO: 3 ou 4 em 1, 2, 3, 4, 5 ou mais desubstituições, deleções ou inserções de aminoácido. Variantes tambémincluem proteínas compreendendo modificações de estrutura principal depeptídeo ou miméticos de aminoácido, tais como aminoácidos de não-proteína(e.g. β-, γ-, δ-aminoácidos, β-, γ-, δ-iminoácidos) ou derivados de L-α-aminoácidos. São conhecidos pelo técnico experiente numerosos miméticosde aminoácido, incluem ciclo-hexil-alanina, ácido 3-ciclo-hexil-propiônico,L-adamantil-alanina, ácido adamantil-acético e semelhantes. Miméticos depeptídeo adequados para peptídeos da presente invenção são discutidos porMorgan e Gainor, (1989) Ann. Repts. Med. Chem. 24:243-252.

Métodos de acordo com a invenção

Em uma modalidade, a invenção proporciona métodos parasilenciar gene(s) dcl em tecidos ou células alvo, em particular em células decâncer de origem neuroectodermal, especialmente células de neuroblastoma.Estes métodos possuem em comum o fato de que um ou mais fragmentos deácido nucleico de senso e/ou anti-senso de SEQ ID NO: 1 ou 2 ou fragmentosde variantes de SEQ ID NO: 1 ou 2 (como descrito acima) é/são liberado(s)para a(s) célula(s) alvo (células de neuroblastoma) e é/são introduzido(s) na(s)célula(s) alvo, deste modo a introdução em célula(s) alvo(s) resulta emsilenciamento do(s) gene(s) dcl endógeno(s) (o gene alvo), e em particularresulta em uma redução significativa de proteína-DCL e proliferação decélulas de câncer de origem neuroectodermal, e.g. proliferação de células deneuroblastoma.Vários métodos de silenciamento de gene são conhecidos natécnica. Geralmente, RNA ou DNA com homologia de seqüência a um genealvo endógeno é introduzido em uma célula com o objetivo de interferir coma transcrição e/ou tradução do gene alvo endógeno. Produção da proteína alvoé deste modo significativamente reduzida ou preferivelmente completamenteabolida. Métodos de silenciamento de gene conhecidos incluem expressão deRNA de anti-senso RNA (veja e.g. EP140308B1), co-supressão (expressão deRNA de senso, veja e.g. EP0465572B1), liberação ou expressão de RNAsinterferentes pequenos (siRNA) em células (veja W003/070969, Fire et al.1998, Nature 391, 806-811, W003/099298, EP1068311, Zamore et al 2000,Cell 101: 25-33, Elbashir et al. 2001, Genes and Development 15:188-200;Sioud 2004, Trends Pharmacol. Sei. 25:22-28) e liberação de oligonucleotídeode anti-senso em células (veja e.g. W003/008543, Pagnan et al. 2000 supra,Burkhard et al. 2003, supra). Veja também Yen e Gerwitz (2000, Stem Cells18:307-319) para uma revisão de abordagens de silenciamento de gene.

Em adição, há vários métodos para liberação de moléculas deácido nucleico nas células alvo, que podem ser aqui usados, tais comoliberação de lipossomo (catiônico) (Pagnan et al. 2000, supra), porfirinascatiônicas, peptídeos fusogênicos (Gait, 2003, Cell. MoL Life Sei. 60: 844-853) ou virossomos artificiais (para revisão veja Lysik e Wu-Pong, 2003, J.Pharm. Sei. 92:1559-1573; Seksek e Bolard, 2004, Methods Mol. Biol. 252:545-568).

A clonagem e a caracterização das variantes de união de DCLde camundongo e de humano permitem o uso de qualquer um dos métodos desilenciamento de gene conhecidos para significativamente reduzir o nível deproteína DCL (ou para completamente abolir a produção de proteína DCL)em células de câncer de camundongo ou de humano de células de origemneuroectodermal ín vitro (em cultura de células ou de tecido) ou in vivo.Especialmente, o efeito fenotípico de silenciamento de DCL é visto comouma deformação do fuso mitótico em células de câncer de origemneuroectodermal se dividindo, e.g. células de neuroblastoma e/ou umaredução significativa ou inibição completa de proliferação de células decâncer de origem neuroectodermal, e.g. células de neuroblastoma in vivo ou invitro.

Em uma modalidade é proporcionado o uso de fragmentos deácido nucleico de senso e/ou anti-senso de SEQ ID NO: 1 ou 2, oufragmentos de variantes de SEQ ID NO: 1 ou 2, para a preparação de umacomposição para a redução significativa de níveis de proteína DCL em célulasde câncer de origem neuroectodermal, e para o tratamento de neuroblastoma,meduloblastoma, glioblastoma, oligodendroglioma, oligoastrocitoma,astrocitoma, neurofibroma, ependimoma, MPNST (tumores malignos debainha de nervo periférico), ganglioneuroma, Schwannoma,rabdomiosarcoma, retinoblastoma, carcinoma pulmonar de célula pequena,feocromocitoma adrenal, PNET primitivo (tumor neuroectodermal periférico),sarcoma de Ewing e melanoma. em particular, administração da composiçãoem quantidades adequadas e em intervalos de tempo apropriados resulta emuma redução ou inibição completa de proliferação células de câncer deorigem neuroectodermal.

Em outra modalidade é proporcionado um método paratratamento in vitro de células de câncer de origem neuroectodermal. Estemétodo pode ser usado para testar a funcionalidade de fragmentos de ácidonucleico e de composições compreendendo estes. O método compreende a)estabelecimento de culturas celulares de linhagens de células de câncer deorigem neuroectodermal, b) o tratamento das células com fragmentos de ácidonucleico ou composições compreendendo os fragmentos de ácido nucleico deacordo com a invenção e c) as análises de mudanças fenotípicas das células decâncer de origem neuroectodermal comparadas com células de controle(proliferação celular, desmontagem de microtúbulo, etc., usando avaliaçãovisual, microscopia, etc.) e/ou a análise molecular das células (analisandoníveis de transcrito dcl, níveis de proteína DCL5 etc., usando e.g. métodos dePCR5 hibridização, métodos de detecção quimioluminescente, etc.).

Exemplos não limitantes de moléculas de DNA ou RNA desenso e/ou anti-senso com identidade de seqüência ou similaridade deseqüência essencial à SEQ ID NO: 1 e/ou 2, adequadas para silenciamento degene dcl, são os seguintes:

1) RNAs interferentes pequenos (siRNA)

RNAs interferentes pequenos consistem de RNA de fita dupla(dsRNA) de 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, ou mais nucleotídeos contíguosda SEQ ID NO: 1 ou 2. Tais moléculas de dsRNA podem ser preparadassinteticamente por oligonucleotídeos de RNA simples curto da seqüênciadesejada e anelamento destes subseqüentemente (veja Exemplos).

Preferivelmente um, dois ou três nucleotídeos adicionais estão presentes comoprojeções-3', mais preferivelmente dois nucleotídeos de timidina oudesoxinucleotídeos de timidina (TT extremidade-31). Estes dsRNAscompreendem ambos RNA de senso e anti-senso. Exemplos não limitantessão os seguintes:

(siDCL-2)

5'- CAAGAAGACGGCUCACUCCTT -3' (SEQ ID NO: 5)3'- TTGUUCUUCUGCCGAGUGAGG -5' (SEQ ID NO: 6)(hu-siDCL-2)

5'- CAAGAAAACGGCUCAUUCCTT -3' (SEQ ID NO: 7)3'- TTGUUCUUUUGCCGAGUAAGG -5' (SEQ ID NO: 8)(siDCL-3)

5GAAAGCCAAGAAGGUUCGATT -3' (SEQ ID NO: 9)3'- TTCUUUCGGUUCUUCCAAGCT -5' (SEQ ID NO: 10)(hu-siDCL-3)

5'- GAAGGCCAAGAAAGUUCGUTT -3' (SEQ ID NO: 11)3'- TTCUUCCGGUUCUUUCAAGCA -5' (SEQ ID NO: 12)

Como mencionado acima, qualquer outro fragmento de SEQID NO: 1 ou 2, ou de uma variante de SEQ ID NO: 1 ou 2, pode seradequadamente usado para construir siRNAs. Moléculas de siRNA tambémpodem compreender marcadores, tais como marcadores fluorescentes ouradioativos, para monitoração e detecção.

Convenientemente, siRNAs também podem ser expressados deum vetor de DNA. Tais vetores de DNA podem compreender nucleotídeosadicionais entre o fragmento de senso e anti-senso, resultando em umaestrutura de tronco-alça, seguindo dobramento do transcrito de RNA. Em vezde liberação e introdução das moléculas de siRNA em células deneuroblastoma tais vetores de DNA podem ser transiente ou estavelmenteintroduzidos nas células alvo, de modo que o siRNA seja transcrito dentro dascélulas alvo. Por exemplo, vetores para liberação de gene, tais como aquelesdesenvolvidos para terapia de gene, podem ser usados para liberar DNA emcélulas de neuroblastoma, do qual fragmentos de senso e/ou de anti-senso deSEQ ID NO: 1 ou 2 de variantes de SEQ ID NO: 1 ou 2 são transcritos.Exemplos são vetores virais adeno-associados (AAV), como descritos emHirata et al, 2000 (J. of Virology 74:4612-4620), Pan et al. (J. of Virology1999, Vol 73, 4: 3410-3417), Ghivizanni et al. (2000, Drug Discov. Today6:259-267) ou W099/61601.

Uma pessoa experiente pode facilmente testar se umamolécula de siRNA é adequada, para, e efetiva em, silenciamento de gene dcl,por exemplo por liberação da molécula em linhagens de células deneuroblastoma e subseqüente avaliação dos níveis de dcl mRNA e/ou proteínaDCL produzidos pelas células compreendendo a(s) molécula(s) de siRNA,usando métodos conhecidos, tais como RT-PCR, Northern Blotting, ensaiosde proteção de nuclease, Western Blotting, ensaios ELISA e semelhantes.Linhagens de células de neuroblastoma adequadas são por exemplo SHSY5de humano, NlEl 15 de camundongo, NS20Y de camundongo ou linhagensNGl08 híbridas de glioma de rato / neuroblastoma de camundongo, ou outras.Alternativamente, efeitos fenotípicos de silenciamento de gene dcl, tal comodeformação de fuso mitótico, podem ser avaliados, como descrito nosExemplos usando, por exemplo imunofluorescência ou coloraçãoimunocitoquímica. Anticorpos anti-DCL podem ser gerados por uma pessoaexperiente, e.g. como descrito nos Exemplos, ou um anticorpo existente(Kruidering et al. 2001, supra), que como aqui verificado possui umaespecificidade alta para DCL, pode ser usado.

Níveis de proteína DCL são preferivelmente reduzidos empelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% após introdução demoléculas de siRNA em células de neuroblastoma, comparadas com célulassem as moléculas de siRNA ou comparadas com células compreendendomoléculas de siRNA de controle negativo, tal como siDCL-1 descrito nosExemplos.

2) Oligonucleotídeos de RNA de anti-senso

Oligonucleotídeos de RNA de anti-senso consistem de cercade 12, 14, 16, 18, 20, 22, 25, 30, ou mais nucleotídeos contíguos da seqüênciade complemento inverso de SEQ ID NO: 1 ou 2. Tais oligonucleotídeos deRNA podem ser facilmente sintetizados ou transcritos de um vetor de DNA.

Modificações de estrutura principal, tal como o uso defosforotioato, podem ser utilizadas para aumentar a estabilidade deoligonucleotídeo. Outras modificações, tal como no grupo 2'-açúcar, e.g. comO-metila, fluoro, O-propila, O-alila ou outros grupos também podemmelhorar a estabilidade..

Exemplos não limitantes de oligonucleotídeos de RNA de anti-senso RNA são:

(DCLex2C) (2'O-metil RNA fosforotioato)

5'- GCUGGGCAGGCCAUUCACAC -3' (SEQ ID NO: 13)(hu-DCLex2C) (2O-metil RNA fosforotioato)

5'- GCUCGGCAGGCCGUUCACCC -3' (SEQ ID NO: 14)

(DCLex2D) (2'O-metil RNA fosforotioato)

5'- CUUCUCGGAGCUGAGUGUCU -3' (SEQ ID NO: 15)

(hu-DCLex2D) (2'O-metil RNA fosforotioato)

5'- CUUCUCGGAGCUGAGCGUCU -3' (SEQ ID NO: 16)

Como para as moléculas de siRNA, uma pessoa experientepode facilmente preparar outros oligonucleotídeos de RNA de anti-sensoRNA adequados e testar sua eficácia de silenciamento de gene dcl comodescrito acima. Em vez do uso de segmentos contínuos, que combinam com ocomplemento inverso SEQ ID NO: 1 ou 2 em 100%, seqüências que sãoessencialmente similares ao complemento inverso de SEQ ID NO: 1 ou 2podem ser usadas, por exemplo por adição, substituição ou deleção de 1, 2 ou3 nucleotídeos.

São incluídas também moléculas de DNA, em particularvetores de DNA capazes de produzirem oligonucleotídeos de RNA de anti-senso como transcritos de RNA ou como parte de um transcrito. Tais vetorespodem ser usados para produzir os oligonucleotídeos de RNA de anti-sensoquando o vetor está presente em linhagens celulares adequadas. Vetores deDNA (e.g. vetores AAV, veja acima) também podem ser liberados em célulasde neuroblastoma in vivo com o objetivo de silenciar expressão de gene dclendógeno. Assim, em vez da liberação de oligonucleotídeos de RNA de anti-senso, vetores de DNA podem ser liberados para as células de neuroblastomae prevenir ou reduzir a proliferação de células de neuroblastoma.

Níveis de proteína DCL são preferivelmente reduzidos empelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% após introdução deoligonucleotídeos de RNA de anti-senso em células de neuroblastoma,comparadas com células sem os oligonucleotídeos de RNA de anti-senso oucomparadas com células compreendendo oligonucleotídeos de RNA de anti-senso de controle negativo (i.e. sem efeito sobre níveis de proteína DCL).

3) Oligonucleotídeos de DNA de anti-senso

Oligonucleotídeos de DNA de anti-senso consistem de cercade 12, 14, 16, 18, 20, 22, 25, 30, ou mais oligonucleotídeos contíguos docomplemento inverso de SEQ ID NO: 1 ou 2. Tais oligonucleotídeos de DNApodem ser facilmente sinteticamente preparados.

Modificações de estrutura principal, tal como o uso defosforotioato oligodesoxinucleotídeos, podem ser utilizadas para aumentar aestabilidade de oligonucleotídeo. Outras modificações, tais como no grupo 2'- açúcar, e.g. com, O-metila, fluoro, O-propila, O-alila ou outros grupostambém podem melhorar a estabilidade.

Exemplos não limitantes de oligonucleotídeos de DNA deanti-senso adequados são:

(DCLex2A) (DNA fosforotioato)

5'- GCTGGGCAGGCCATTCACAC -3' (SEQ ID NO: 17)(hu-DCLex2A) (DNA fosforotioato)5'- GCTCGGCAGGCCGTTCACCC -3' (SEQ ID NO: 18)(DCLex2B) (DNA fosforotioato)

5'- CTTCTCGGAGCTGAGTGTCT -3' (SEQ ID NO: 19)

(hu-DCLex2B) (DNA fosforotioato)

5'- CTTCTCGGAGCTGAGCGTCT -3' (SEQ ID NO: 20)

Como para as moléculas de siRNA e os oligonucleotídeos deRNA de anti-senso, uma pessoa experiente pode facilmente preparar outrosoligonucleotídeos de DNA de anti-senso adequados e testar sua eficácia desilenciamento de gene dcl como descrito acima.

Em vez do uso de segmentos contíguos, que combinam com ocomplemento inverso de SEQ ID NO: 1 ou 2 em 100%, seqüências que sãoessencialmente similares ao complemento inverso de SEQ ID NO: 1 ou 2podem ser usadas, por exemplo por adição, substituição ou deleção de 1, 2 ou3 nucleotídeos.

Níveis de proteína DCL são preferivelmente reduzidos empelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% após introdução deoligonucleotídeos de DNA de anti-senso em células de neuroblastoma,comparadas com células sem os oligonucleotídeos de DNA de anti-senso oucomparadas com células compreendendo oligonucleotídeos de DNA de anti-senso de controle negativo (i.e. sem efeito sobre níveis de proteína DCL).

E entendido, que liberação de misturas de moléculas desiRNA, oligonucleotídeos de RNA de anti-senso e/ou oligonucleotídeos deDNA de anti-senso também pode ser usada para silenciamento específico dedcl.

As composições de acordo com a invenção assimcompreendem uma quantidade adequada de um fragmento de senso e/ou deanti-senso de SEQ ID NO: 1 ou 2 ou de uma seqüência que é essencialmentesimilar à SEQ ID NO: 1 ou 2 e um a veículo fisiologicamente aceitável.Quando as composições são usadas para introdução em culturas de células deneuroblastoma in vitro, a composição também pode compreender umcomposto de alvejamento, embora a presença de um composto de alvejamentonão seja requerida, porque as moléculas podem ser introduzidas simplesmentepor transfecção usando por exemplo kits de transfecção disponíveis (e.g.Superfect, Qiagen, Velancia, CA), eletroporação, transfecção mediada porlipossomo, e semelhantes. Um "composto de alvejamento" refere-se a umcomposto ou a uma molécula que é capaz de transportar os fragmentos deácido nucleico in vivo para as células de neuroblastoma alvo, i.e. possuicapacidades de seleção de célula.

Uma "quantidade adequada" ou uma "quantidadeterapeuticamente adequada" refere-se a uma quantidade que, quando presenteem uma célula de neuroblastoma, é capaz de fazer com que os níveis deproteína DCL sejam significativamente reduzidos ou abolidos e de fazer comque a proliferação de células de neuroblastoma seja significativamentereduzida ou inibida completamente. Uma quantidade adequada pode serfacilmente determinada por uma pessoa experiente sem experimentaçãoindevida, como descrito. Quantidades adequadas das moléculas de senso e/ouanti-senso (siRNA, oligonucleotídeos de DNA ou de RNA de anti-senso)variam por exemplo de 0,05 μηιοί a 5 μιηοΐ por mL e são infiisionadas a de 1a 100 mL por kg de peso corporal.

Composições que são para serem administradas a umindivíduo, em vez de às culturas de célula de neuroblastoma, compreendemuma quantidade terapeuticamente adequada das moléculas de ácido nucleicoda invenção e em adição um ou mais compostos de alvejamento. Taiscompostos de alvejamento podem, por exemplo, ser imunolipossomos, taiscomo descritos por Pagnan et al (2000, supra) ou por Patorino et al (ClinCâncer Res. 2003, 9(12):4595-605). Imunolipossomos compreendemanticorpos superfície-direcionados sobre o exterior deles. Por exemplo,anticorpos monoclonais produzidos contra antígenos de células deneuroblastoma, tal como o antígeno disialogangliosídeo GD2, podem serusados para alvejar os lipossomos para células de neuroblastoma. Claramente,outros antígenos de célula de neuroblastoma podem ser usados para produziranticorpos específicos para célula. As moléculas de ácido nucleico sãoencapsuladas nos imunolipossomos usando métodos conhecidos e osanticorpos monoclonais são covalentemente copulados no exterior doslipossomos (veja e.g. p254 de Pagnan et al 2000, supra). A ligação doslipossomos em células de neuroblastoma e a captação das moléculas de ácidonucleico pelas células de neuroblastoma podem ser avaliadas in vitro usandométodos conhecidos, como descrito em Pagnan et al (2000). Similarmente,efeitos fenotípicos e/ou efeitos moleculares da presença intracelular dosácidos nucleicos podem ser avaliados.

Outros compostos de alvejamento podem ser anticorpos taiscomo, por exemplo anticorpos monoclonais produzidos contra um antígeno desuperfície de célula de neuroblastoma conjugado em moléculas de ácidonucleico. Por exemplo um anticorpo anti-receptor de transferrina pode serusado, tal como o anticorpo monoclonal quimérico de rato/camundongochi7217 que, como tem sido mostrado, alveja citocinas em células de tumorde neuroblastoma em camundongos (Dreier et al., 1998, Bioconj. Chem. 9:482-489). Tais métodos são bem conhecidos na técnica, veja e.g. Guillemarde Saragovi (Oncogene, Advanced online publication, published 22 March2004, "Prodrug chemotherapeutics bypass p-glycoprotein resistance and killtumors in vivo with high efficacy and target-dependent selectivity").

Similarmente, as moléculas de ácido nucleico de acordo com ainvenção podem ser conjugadas em ligantes naturais ou sintéticos, oumimétidos ligantes, que se ligam nos receptores de superfície de célula alvo(e.g. receptores de superfície de célula de neuroblastoma) e que resulta naendocitose das moléculas de ácido nucleico. Um exemplo de um tal ligante épor exemplo transferrina. Tem sido mostrado que injeção intravenosa decomplexos de transferrina-PEG-PEI / DNA resultou em transferência de genepara tumores de neuroblastoma Neuro2a subcutâneos em camundongos(Ogris etal., 2003, J. ControlledRelease 91: 173-181).

A composição terapêutica pode adicionalmente compreendervários outros componentes, tais como mas não são limitados a água, soluçãosalina, glicerol ou etanol. Substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveisadicionais podem estar presentes, tais como emulsifícadores, agentesumectantes, tampões, agentes ajustadores de tonicidade, estabilizadores esemelhantes, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio,cloreto de potássio, cloreto de cálcio, monolaurato de sorbitana, e oleato detrietanol-amina. Outras moléculas biologicamente ativas podem estarpresentes, tais como moléculas de nucleotídeo que silenciam outros alvosgene (e.g. c-Myb), marcadores ou genes marcadores (e.g. luciferase), ligantes,anticorpos, drogas, etc.

As composições terapêuticas podem ser administradaslocalmente, e.g. por injeção, preferivelmente para dentro do tecido alvo, ousistemicamente, e.g. pr infusão em gotas de um fluido parenteral ou umdispositivo de liberação subcutânea lenta.

Sistemas de liberação injetáveis incluem soluções, suspensões,geles, microesferas e injetáveis poliméricos, e podem compreenderexcipientes tais como agentes alteradores de solubilidade (e.g. etanol,propileno-glicol e sacarose) e polímeros (e.g. policaprilactonas, e PLGAs).Orientação adicional relacionada às formulações que são adequadas paravários tipos de administração pode ser encontrada em Remington'sPharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17thed. (1985).

Em uma modalidade as composições de acordo com ainvenção são usadas para complementar outras terapias de neuroblastoma, taiscomo quimioterapia, terapia de radiação, cirurgia e/ou transplantação demedula óssea. Assim, quer antes, ao mesmo tempo e/ou imediatamente apósum ou mais tratamentos convencionais, as composições são administradas aoindivíduo, preferivelmente semanalmente, com maior preferênciamensalmente, em quantidades efetivas. Quaisquer células de neuroblastoma,que não são efetivamente removidas ou erradicadas por outra terapia sãoportanto impedidas de se proliferarem por silenciamento de dcl. Estetratamento reduz o risco de disseminação de células de neuroblastoma paraoutras partes do corpo (formação de metástase) e previne ou pelo menosretarda relapsos, i.e. recorrência do neuroblastoma (primário). Silenciamentode DCL tem como vantagem sobre quimioterapia ou cirurgia o fato deapresentar toxicidade baixa para o tecido normal e uma especificidade altapara células de neuroblastoma. Portanto é provável que efeitos colateraisindesejáveis estejam ausentes ou sejam mínimos.Em outra modalidade um método para o tratamento de umindivíduo é proporcionado, por meio do qual não são realizadas nenhumasoutras terapias de neuroblastoma (e.g. quimioterapia, cirurgia, etc.). O métodocompreende a) estabelecer um diagnóstico de neuroblastoma, e b) administraruma quantidade adequada de uma composição de acordo com a invenção, e c)monitorar em vários intervalos de (tratamento de acompanhamento médico).

Etapa a), diagnose, pode, por exemplo, ser estabelecida usandoo método diagnóstico e kits diagnósticos descritos abaixo. Alternativamente,diagnose de neuroblastoma pode ser estabelecida usando métodosconvencionais, tais como varreduras CT ou CAT, varreduras MRI, varreduramlBG scan (meta-iodo-benzil-guanidina), raios-X, biopsias ou anise decatecol-aminas ou seus metabólitos em amostras de urina ou de plasma desangue (e.g. dopamina, ácido homovanílico, ácido vanilil-mandélico). Etapab) é descrita aqui alhures. Etapa c) pode envolver testes de acompanhamentomédico, tais como o teste diagnóstico descrito abaixo, testes de sangue ou deurina, varreduras CT, varredura MRI, etc. O propósito da monitoração doacompanhamento médico é garantir que as células de tumor estãocompletamente erradicadas e não retornarão. Se este não for o caso,tratamento novo necessita ser iniciado.

Em uma outra modalidade são proporcionados métodosdiagnósticos e kits diagnósticos que são úteis para triagem seletiva deocorrência de neuroblastoma no estágio inicial em indivíduos. Indivíduospodem já ter sido testados positivos em um ou outros testes de neuroblastoma,em cujo caso o presente teste pode confirmar a diagnose inicial.

Alternativamente, podem não ter sido ainda diagnosticados comneuroblastoma, mas podem mostrar sintomas que poderiam ser causados porneuroblastoma. Dependendo da localização do tumor, sintomas podem variarenormemente, tais como perda de apetite, cansaço, dificuldades de respirar ede engolir, abdômen inchado, constipação, fraqueza/instabilidade nas pernas,etc. Alternativamente, indivíduos de risco alto não mostrando quaisquersintomas ainda podem ser profilaticamente testados em intervalos regularesusando o método diagnóstico de acordo com a invenção para garantirdiagnose inicial, que sobremaneira aumenta as chances de erradicação dascélulas de neuroblastoma. Os métodos diagnósticos ex vivo compreendemretirar uma amostra de sangue de um indivíduo e detectar a presença ouausência de células de neuroblastoma livres no soro. Alternativamente, ométodo diagnóstico ex vivo pode ser realizado em uma amostra de biopsia do(presumido) tecido de tumor. Como a proteína DCL e o dcl mRNA sãoespecíficos para células de neuroblastoma, a presença das células pode serdetectada, e opcionalmente quantificada, por análise da presença de dclmRNA e/ou de proteína DCL na amostra. Isto pode ser feito usando métodosconhecidos na técnica, tais como RT-PCR (quantitativa) usando iniciadoresdcZ-específicos ou degenerados, outros métodos de PCR, tais como porexemplo amplificação específica de regiões do gene dcl, arranjos de DNA,sondas de DNA para hibridização, ou métodos que testam a proteína DCL,tais como ensaios imunoabsorventes ligados à enzimas (ELISA) ou Westernblotting usando anticorpos específicos para DCL (e.g. anticorpos monoclonaisou policlonais). Em uma modalidade o método e kit diagnósticos de acordocom a invenção compreendem o anticorpo monoclonal anti-DCLK (tambémreferido como antiCaMLK em Kruidering et ai. 2001, supra), que reconhece ese liga em proteína DCL de camundongo e/ou de humano (detectável comopossuindo um peso molecular de cerca de 40 kDa) de acordo com a invenção.Embora anti-DCLK também reconheça outras variantes de união, tais comoDCLK-short (i.e. cpgló) e CARP, a separação espaço-temporal de expressãode DCL, de cpgló e de CARP, e as diferenças em peso molecular, podem serusadas para facilmente minimizar/evitar falsos positivos. Claramente, outrosanticorpos monoclonais específicos para DCL podem ser gerados e usados.

Também, iniciadores ou sondas específicos para exon 8 RNA(presente em DCL RNA mas ausente em DCLK-short RNA) podem serusados em métodos de detecção de RNA. Como controles, por exemploiniciadores ou sondas que se ligam em (hibridizam com) exon 6 RNA deDCLK-short (i.e. cpgló) e CARP5 ou em exon 9 a 20 de DCLK podem serempregados, que estão ausentes em DCL RNA.

Sondas, antibióticos e pares de iniciadores queespecificamente detectam (e.g. por amplificação específica de seqüência, porhibridização específica de seqüência ou por ligação específica) o RNA ouDNA de SEQ ID NO: 2 ou a proteína de SEQ ID NO: 4 podem ser preparadospor uma pessoa experiente usando métodos de biologia molecular, comoencontrados em referências aos livros-texto padrão abaixo. Sondas e pares deiniciadores podem ser preparados tendo por base a SEQ ID NO: 2.

Anticorpos monoclonais ou policlonais específicos paraproteína-DCL podem ser produzidos como conhecido na técnica.

O método diagnóstico compreende as etapas de a) analisaruma amostra de sangue de um indivíduo para a presença ou ausência de SEQID NO: 2 RNA ou DNA e/ou ara a presença ou ausência de proteína DCL deSEQ ID NO: 4 e b) opcionalmente quantificar a quantidade de SEQ ID NO: 2e/ou SEQ ID NO: 4 presente. Uma quantificação pode permitir umacorrelação direta com o número de células de neuroblastoma presentes, quepor sua vez inidica a severidade do desenvolvimento e do espalhamento deneuroblastoma.

Também são proporcionados kits diagnósticos ex vivo pararealizar o método acima. Um kit diagnóstico pode, portanto, compreender,iniciadores, sondas e/ou anticorpos, e outros reagentes (tampões, marcadores,etc.), adequados para detecção de gene dcl, dcl mRNA e/ou proteína DCL eopcionalmente quantificação. Em adição, kits compreendem instruções eprotocolos de como usar os reagentes (e.g. reagentes imunodetecção) eamostras de controle, por exemplo proteína-DCL ou dcl DNA isolado.Os seguintes exemplos não limitantes ilustram a identificação,o isolamento e a caracterização da nova variante de união de DCL. A não serque seja enunciado de outro modo, a prática da invenção empregará métodosconvencionais padrão de biologia molecular, virologia, microbiologia oubioquímica. Tais técnicas são descritas em Sambrook e Russell (2001)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring HarborLaboratory Press, NY, em Volumes 1 e 2 de Ausubel et al. (1994) CurrentProtocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA e em Volumes I e IIde Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, AcademicPress (UK), Oligonucleotídeo Synthesis (N. Gait editor), Nucleic AcidHibridização (Hames and Higgins, eds.), "Enzyme immunohistochemistry"em Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, P. Tijssen (Elsevier1985). Métodos e materiais padrão para PCR podem ser encontrados emDieffenbach e Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Labroatory Press, e em McPherson et al (2000) PCR Basics:From Background to Bench, first edition, Springer Verlag Germany. Métodospara preparar anticorpos monoclonais ou policlonais são por exemplodescritos em Harlow e Lane, Using Antibodies: A laboratory Manual, NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998, e em Leddell e Cryer "APractical Guide to Monoclonal Antibodies", Wiley and Sons 1991. Todas asreferências acima são aqui incorporadas como referências.

Em toda a descrição e nos Exemplos é feita referência àsseguintes seqüências:

SEQ ID NO 1: seqüência de cDNA de DCL de camundongoSEQ ID NO 2: seqüência de cDNA de DCL de humanoSEQ ID NO 3: seqüencia de aminoácidos de DCL de camundongoSEQ ID NO 4: seqüencia de aminoácidos de DCL de humanoSEQ ID NO 5: oligonucleotídeo siDCL-2 senso RNA (fita desiRNA)SEQ ID NO 6: oligonucleotídeo siDCL-2 anti-senso RNA (fita de

siRNA)

SEQ ID NO 7: oligonucleotídeo hu-siDCL-2 senso RNA (fita de

siRNA)

SEQ ID NO 8: oligonucleotídeo hu-siDCL-2 anti-senso RNA (fitade siRNA)

SEQ ID NO 9: oligonucleotídeo siDCL-3 senso RNA (fita de

siRNA)

SEQ ID NO 10: oligonucleotídeo siDCL-3 anti-senso RNA (fita de

siRNA)

SEQ ID NO 11: oligonucleotídeo hu-siDCL-3 senso RNA (fita de

siRNA)

SEQ ID NO 12: oligonucleotídeo hu-siDCL-3 anti-senso RNA (fitade siRNA)

SEQ ID NO 13: oligonucleotídeo DCLex2C anti-senso RNASEQ ID NO 14: oligonucleotídeo hu-DCLex2C anti-senso RNASEQ ID NO 15: oligonucleotídeo DCLex2D anti-senso RNASEQ ID NO 16: oligonucleotídeo hu-DCLex2D anti-senso RNASEQ ID NO 17: oligonucleotídeo DCLex2A anti-senso DNASEQ ID NO 18: oligonucleotídeo hu-DCLex2A anti-senso DNASEQ ID NO 19: oligonucleotídeo DCLex2B anti-senso DNASEQ ID NO 20: oligonucleotídeo hu-DCLex2B anti-senso DNALegendas das figuras

Figura 1. - Organização Genômica de DCL e Alinhamento com DCX

(A): Organização genômica do gene DCLK e a estratégia declonagem do DCL cDNA. Apenas a estrutura de exon-intron da parte DCL éindicada incluindo o exon 8 recentemente identificado codificador daextremidade 3' comum de CARP e DCL (Vreugdenhil et al., 2001, supra).Exons são representados por retângulos e indicados por números arábicos;introns são linhas sólidas. O transcrito de DCL é indicado abaixo (DCL) aestrutura genômica. A ORP é representada por um retângulo, seqüências nãotraduzidas por linhas. A localização dos iniciadores, usados para clonar DCL5são indicadas por setas.

(B): Alinhamento da proteína DCL e DCX. Resíduos idênticossão cinza escuro e substituições conservadas são cinza claro. Os doisdomínios DCX e o domínio rico em serina/prolina (SP) são indicados porsetas.

Figura 2. - DCL é uma M.A.P. e Estabiliza MicrotúbulosPainel I:

(A-C) Sobreexpressão de DCL em células COS-1.

(D-F) Sobreexpressão de DCL em células COS-I tratadas comcolchicina.

Verde representa DCL; vermelho representa α-tubulina eamarelo indica co-localização de DCL com α-tubulina. Azul representa DNA(núcleo). Setas indicam feixes de microtúbulos associados com DCL, que sãoresistentes ao tratamento com colchicina. Também notar a associação claracom um centrossomo em AeB. Barra de escala é de 10 μm.

Painel II. Polimerização de microtúbulos in vitro por DCL.Concentrações diferentes de proteína recombinante DCL foram incubadascom tubulina purificada e a turbidez da mistura de DCL/tubulina foimonitorada a 340 nm por 30 min. Taxol foi usado como um controle positivoe água como um controle negativo. O gráfico mostrado é um exemplo típicode experimentos múltiplos (N=4) com resultados similares.

Figura 3. - Expressão de DCL é Desenvolvimentalmente Regulada

Reatividade cruzada de anticorpos reconhecedores de DCX ede DCLK. Análise de Western de lisados de células COS-I sobreexpressandoDCL (pista 4-6) ou duas variantes diferentes de DCX (pistas 2 e 3) com anti-DCX (painel superior) ou anti-DCLK (painel inferior). Anti-DCLKfortemente reconhece DCL (pista 4-6).

Início de proteína DCL e DCX durante embriogênese.Immunoblots de frações cerebrais embriônicas de idade ED8 a ED18 e deadulto são corados com antiDCLK e anti-DCX. Como um controle positivopara o anticorpo CARP/DCL, foi usado um extrato de células COS-Isobreexpressando DCL.

(C): Análise de Western blot de DCL e DCX em várias regiõescerebrais de adulto. 1: cabeça ED12 (controle positivo), M: Marcador de pesomolecular 2: cerebelo, 3: tronco cerebral, 4: hipotálamo, 5: córtex cerebral, 6:hipocampo 7: bulbo olfativo.

Figura 4. - Localização e Ontogenia de Expressão de DCL em CérebroEmbriônico

I.: Hibridização in situ de uma seção cerebral transversal dodia embriônico (ED) 8 (painel A); e seções sagitais em EDlO e ED12 (painéisB e C, respectivamente). Em ED8 e ED10, o sinal foi baixo mas aumentouconsideravelmente em ED12. Abreviações: di -diencéfalo, Iv - ventrículolateral, me - mesencéfalo; mo -medula oblongata, mt - metencéfalo, mv-vesícula mesencefálica, nc - córtex neopalial, ne - neuroepitélio, rh -rombencéfalo, te - telencéfalo, tv - vesícula telencefálica, IV ν - 4o ventrículo.Barra de escaça: 1 mm; tempo de exposição: 14 dias).

II: Distribuição de proteína DCL no neuroepitélio decamundongo prematuro.

A: Distribuição de proteína DCL em ED 11 (seção sagital).Coloração é restringida às regiões proliferativas (telencéfalo e diencéfalo àesquerda e à direita, respectivamente) e encontrada nas camadas externaspróximas da pia bem como na zona ventricular interna (cabeças de seta; vejatambém magnificações maiores abaixo), enquanto que tecido não-neuronalcomo o componente mandibular do primeiro arco branquial (M) estádestituído de qualquer sinal. IV; quarto ventrículo. Barra representa 150 μιη.B + C: Seções adjacentes transversais (coronais) deneuroepitélio prematuro em ED 9 imunocorado para DCX (B) e DCL (C).Não é observada coloração de DCX (cabeças de seta em B), enquanto queDCL já é expressada tanto na região ependimal (2 setas superiores) bemcomo região marginal, externa (seta inferior). Barra representa 25 μηι.

D: Seção sagital do neuroepitélio do tubo neural em EDl 1,mostrando expressão abundante na borda luminal (cabeças de seta), enquantoque em tecido neuronal desenvolvente, células se dividindo isoladas tambémsão imunopositivas (setas). L indica o lúmen neural do tubo neural. Barrarepresenta 70 μηι.

Ε: Detalhe de uma célula mitótica DCL-imunopositiva noneuroepitélio. Os cromossomos (cabeça de seta) orientados no plano declivagem de linha do meio são óbvios. Barra representa 3 μηι.

F: Visão geral do neuroepitélio do telencéfalo em ED10,mostrando expressão de DCL na camada ventricular (ependimal) (cabeça deseta à esquerda) bem como na zona de placa marginal/cortical (cabeça de setaà direita). 2 Dubletos imunopositivos de células se dividindo na zonaintermediária também são visíveis (setas). Barra representa 15 μηι.

G + Η: Seções transversais de neuroepitélio cortical, ilustrandoas distribuições diferenciais, parcialmente sobrepostas, de DCX e DCL. DCXnão é expressada até EDll (G), e principalmente na parte mais superior daregião de placa cortical e de placa marginal/cortical (seta) do neuroepitéliocortical. DCL, em contraste, já é expressada em ED9 (H) em níveisparticularmente altos na camada ventricular (ependimal) (cabeça de seta àesquerda) com níveis menores nas zonas intermediária e marginal (cabeça deseta à direita). Notar que a camada ventricular (asterisco em G) está destituídade sinal de DCX. Barra representa 5 μιη.

I: Detalhe da camada ependimal da zona ventricular em ED9mostrando expressão de DCL em fibras se estendendo do neuroepitélio paradentro da zona intermediária (cabeças de seta). Barra representa 12 μιη.

J: Detalhe da camada ependimal mostrando imunorreatividadeclara em células neuroepiteliais se dividindo adjacentes ao lúmen, que estãoem; telófase (esquerda), anáfase (meio), enquanto também uma célulapositiva para DCL na prófase média está visível que aparece verticalmentedividida (cabeças de seta) enquanto migrando para longe do lúmen (direita).Barra representa 8 μιη.

Κ: Imunorreatividade de DCL na camada ependimal em EDl 1,em células em prófase e telófase (cabeças de seta) bem como em uma célulablast-semelhante em metáfase /anáfase (seta). Barra representa 10 μηι.

L: Duas células mitóticas imunopositivas para DCL na camadaependimal exibindo imunorreatividade também nas estrutura centrossomo-semelhantes (setas inferiores). Barra representa 1,5 pm.

M + N: Exemplos de 2 células imunopositivas para DCL5 sedividindo em anáfase II / telófase II (M) e em metáfase / anáfase I, com oscromossomos claramente visíveis (seta), enquanto que também algumacoloração microtubular é observada (cabeças de seta). Barras representam 1μηι.

Figura 5. - Expressão de DCL em Células de neuroblastoma.Painel I:

A: DCL é endogenamente expressada em várias linhagens decélula de neuroblastoma. Triagem por análise de Western Blot para aslinhagens celulares positivas para DCL. Pista 1: células COS-1, pista 2:células Hela, pista 3: células NG108-15, pista 4: células NS20Y, pista 5:células NlE-115, pista 6: marcador de peso molecular, pista 7: célulasSHSY5. Notar que DCL é expressada em linhagens de células deneuroblastoma (pista s3, 4, 5 e 7) mas não em linhagens de célula de origemnão-neuronal (pista 1 e 2).

B: DCL é uma fosfoproteína. Lisados de NGl 08-15 coradoscom anti-DCL. Pista 1: lisado não tratado, pista 2: lisado incubado a 37°Csem fosfatase, pista 3: lisado incubado a 37°C com fosfatase. Pistas 4-6 sãosimilares às 1-3 mas com sobreexpressão de DCL. Notar que DCL endógenaco-migra com DCL sobreexpressada em pistas 4-6.

Painel II:

Análise de Western blot de expressão de DCL em célulasNlE-115 com (1 a 3) e sem (4) tratamento de siRNA realizado em duplo.Fora usadas três moléculas de siRNA diferentes de alvejamento de DCL:siDCL-1 (pista 1), siDCL-2 (pista 2) e siDCL-3 (pista 3). Notar que siDCL-2e 3 acarretam uma expressão reduzida "knock-down" enquanto que siDCL-1falhou em fazê-lo. Como uma referência, a mesma membrana foi re-coradacom a-tubulina.

Painel III.

Expressão reduzida "knock-down" de DCL acarreta arelaxação do citoesqueleto de microtúbulo em interfase. Coloração com anti-DCLK (verde) dá um padrão spickled, que é mais proeminente próximo donúcleo (A) em células não tratadas (Α-C). Este padrão não é afetado porsiDCL-1 (D) mas coloração com anti-DCLK está quase ausente por expressãoreduzida "knock-down" efetiva de DCL por siDCL-3 (G). O citoesqueleto,como indicado por coloração de α-tubulina (Β, E e H), possui uma estruturade labirinto fina em células não tratadas (B) e em células tratadas com si-DCL-1 (E) mas é sobremaneira relaxado por siDCL-3. Ilustrações unidas decoloração de α-tubulina e DCL mostram células não tratadas (C), célulastransfectadas com siDCL-1 (F) e células transfectadas com siDCL-3 (I).

Verde = DCL, Vermelho = α-tubulina, Amarelo =co-localização de DCL e a-tubulina. Barra de escala é 10 μιτι.

Painel IV:

Expressão reduzida "knock-down" de DCL não afeta aestrutura de centrossomo. Coloração de anti-DCLK spickled (A, D, G) estáelevadamente concentrada (A, D) ao redor de centrossomos como indicadopor coloração de anti-y-tubulina (Β, E and H) e expressão reduzida "knock-down" efetiva de DCL (G) não acarretou mudanças óbvias na estrutura ouforma de centrossomos (I). São mostradas ilustrações unidas de coloração a-tubulina e DCL de células não tratadas (C), células transfectadas com siDCL-1 (F) e células transfectadas com siDCL-3 (I). Verde = DCL5 Vermelho = γ-tubulina, Amarelo = co-localização de DCL e γ-tubulina. Barra de escala é 10μηι.

Figura 6. - Expressão reduzida "knock-down" de DCL acarretadeformação de fusos mitóticos. Em células não tratadas (A-C) DCL (A)largamente colocaliza com α-tubulina (Β). A imagem unida (C) indicapresença de DCL no cinetocore (seta). Transfecção com siDCL-1 (D-F) nãoacarretou uma expressão reduzida "knockdown" de DCL (D) e também nãomudou a formação de fusos mitóticos como indicado por coloração de α-tubulina (E). Expressão reduzida "knock-down" efetiva de DCL por siDCL-2(G-I) ou siDCL-3 (J-L) acarreta um desaparecimento de DCL (G, J) edesaparecimento (H) e deformação (K) de fusos mitóticos como indicado porcoloração de α-tubulina. Verde = DCL, Vermelho = α-tubulina, Amarelo =co-localização de DCL e α-tubulina. Barra de escala é 10 μηι.Figura 7 - Sobreexpressão de DCL em células COS-I se dividindo.

Α-C: Análise imunocitoquímica de sobreexpressão de DCL.Uma célula COS-I normal se dividindo corada com α-tubulina é mostradacomo referência (ref). Sobreexpressão de DCL (Verde, A) acarretaalongamento dos fusos mitóticos como indicado por co-coloração com a-tubulina (B). Notas a diferença em comprimento de fuso mitótico, indicadopor setas, de células transfectadas versus não-transfectadas. DNA é coradocomo DAPI (azul).

D-I: Microscopia confocal de sobreexpressão de DCL emcélulas COS-I durante divisão celular. Um fenótipo parece similar (D-F) àscélulas COS-I de tipo selvagem nas quais DCL (D) largamente co-localizacom α-tubulina (E). Similar à localização endógena de DCL em células NlΕ-115 se dividindo, DCL também está localizada no cinetocore. Localização deDCL é mostrada em verde, que recobre com fusos mitóticos como indicadopor coloração de α-tubulina (vermelho). O outro fenótipo observado acarretaalongamento e orientação alterada dos fusos mitóticos (G-I). Verde = DCL(A, D, G), Vermelho = α-tubulina (Β,Ε,Η), Amarelo = co-localização deDCL e α-tubulina (C, F, I). Barra de escala é 10 μm.

Exemplos

Exemplo 1 - Clonagem de DCL de camundongo e de humano

Análise de seqüência de DNA de um clone de DCL cDNA decamundongo (SEQ ID NO: 1) revelou uma matriz de leitura aberta de 362aminoácidos (SEQ ID NO: 3) com ma massa molecular predita de 40 kDa(Figura 1B) e 73% de identidade de aminoácido (similaridade de 81%) comDCX de camundongo sobre o comprimento inteiro de ambas as proteínas.Alinhamento das duas repetições preditas de DCX (Taylor et al, 2000, supra)com DCX de camundongo revelou uma identidade de aminoácido aindamaior de 81% (89% de similaridade) para domínio I de DCX e 90% deidentidade de aminoácido (99% de similaridade) para domínio II de DCX,fortemente sugerindo que este último domínio possui uma função similar emambas as proteínas. A terminação-C rica em serina/prolina (SP), quecorresponde largamente com CARP (Vreugdenhil et al, 1999, Neurobiology39, 41-50), exibe uma identidade de aminoácido menor de 63% (78% desimilaridade). Este domínio rico em SP está presente em ambas DCX e DCL.Tais domínios ricos em SP são motivos de MAP quinase potenciais (Sturgillet al, 1988, Nature 334, 715-718), sugerindo que a terminação-C é umsubstrato de MAP quinase. O interessante é que tem sido mostrado que omotivo YLPL nesta região de DCX interage com AP-I e AP-2 e tem estadoimplicado na seleção de proteína e no tráfego de vesícula (Friocourt et al,2001, Mol. Cell Neurose. 18, 307-319). Em DCL, contudo, o motivocorrespondente é YRPL no qual uma leucina hidrofóbica é substituída por umresíduo de arginina básico, indicando que DCL provavelmente não interagecom AP-I e AP-2.

As seqüências de dcl cDNA/mRNA (SEQ ID NO: 2) e deproteína (SEQ ID NO: 4) de humano foram obtidas de uma linhagem decélula de neuroblastoma de humano (SHSY5) usando as seqüências decamundongo e foi verificado que são muito similares às seqüências murinas,como descrito aqui alhures.

Exemplo 2 - DCL é uma MAP (proteína associada a microtúbulo) e estabilizao citoesqueleto

Tem sido mostrado que os dois domínios de DCX de ambasDCX e DCLK-Iong interagem com e estabilizam estruturas de microtúbulo(Francis et al, 1999, supra; Gleeson et al, 1999 supra; Kim et al., 2003,Struct. Biol. 10, 324-333; Lin et al, 2000, supra). Como DCL contémdomínios de DCX que são idênticos ao de DCLK-long, um efeito deestabilização e polimerização similar sobre microtúbulos foi esperado paraDCL. Para confirmar isto, três tipos de experimentos foram conduzidos:primeiro, sobreexpressão de DCL em células COS-I resultou em um padrãode coloração fibrilar no recobrimento de soma de distribuição de microtúbulo(Figura 2.1 A), como mostrado por co-localização com anticorpos para a-tubulina (Figuras 2.1 B e C). Segundo, para testar se feixes de microtúbulocontendo DCL exibem uma resistência similar à despolimerização como éconhecido para DCX e outras MAPS, células transfectadas com DCL foramexposta a 10 μg de colchicina, um composto que despolimeriza e interrompeos microtúbulos de tubulina. Células não transfectadas exibiramdespolimerização clara do citoesqueleto de microtúbulo, enquanto que ocitoesqueleto de microtúbulo de todas as células transfectadas com DCL foiresistente ao tratamento de colchicina de 1 h, em particular em feixescondensados de microtúbulo /DCL (Figura 2.1 D-F). Isto mostrou que DCL,similar a DCLK-Iong e DCX5 é capaz de estabilizar microtúbulos. Terceiro,em um ensaio de polimerização in vitro as propriedades de polimerização demicrotúbulo de DCL foram testadas pela incubação de concentraçõesdiferentes de DCL não-etiquetada recombinante com tubulina purificada.Taxol foi usado como um controle positivo, que é um composto depolimerização de microtúbulo bem conhecido. Monitoraçãoespectrofotométrica de polimerização de microtúbulo revelou que DCLpolimeriza microtúbulos em uma maneira dependente de dose (Figura 2.II).Juntos, estes dados mostram que DCL, como DCLK-Iong e DCX, podediretamente polimerizar e estabilizar microtúbulos.

Exemplo 3 - Caracterização de um anticorpo reconhecedor de DCL.

Recentemente a geração de um anticorpo contra CARP,chamado de anti-CaMKLK, tem sido descrita (Kruidering et al, 2001, supra)que também reconhece outras variantes de união do gene DCLK incluindoDCLK-short (também conhecido como cpgló (Silverman et al, 1999, J. BioLChem. 274, 2631-2636) ou CaMLK). CARP é uma proteína pequena de 55aminoácidos dos quais 43 são idênticos à terminação-C de DCL, quecompartilha 70% de homologia de aminoácido com DCX de humano(Vreugdenhil et al, 1999). Para solucionar a especificidade de anti-CaMLK,DCX e DCL foram sobreexpressadas em células COS-I e analisadas parapossível reatividade cruzada por análise de Western Blot. Anti-CaMLKfortemente reconheceu DCL (Figura 3A pista 4-6) enquanto que apenasalguma reatividade cruzada foi observada com DCX (Figura 3A pista 2 e 3).Por outro lado, o anticorpo para DCX aqui usado, produzido contra os 17aminoácidos C-terminais de DCX, fortemente reconheceu DCX (Figura 3Apista 2 e 3) e não DCL (Figura 3A pista 4-6). Assim, anti-CaMLK fortementereconhece numerosas variantes de união do gene DCLK incluindo DCLK-short e DCL e portanto é aqui referido como "anti-DCLK". Em adição,alguma reatividade cruzada de anti-DCLK com DCX pode ocorrer, enquantoque o anticorpo para DCX é específico para apenas DCX e não para DCL.

Exemplo 4- DCL é elevadamente expressada em estágios iniciais dedesenvolvimento cerebral

Análise de Western blot de homogeneizados de cérebroembriônico revelou a presença de uma proteína de 40 kDa imunopositiva paraanti-DCLK. O tamanho desta proteína corresponde àquele da proteína DCLrecombinante sobreexpressada em células COS-I (Figura 3B). Anti-DCLKreconhece apenas DCL no cérebro de camundongo em desenvolvimentoporque nenhumas outras bandas imunorreativas foram observadas (Figura 3 Bpista 8-18). Embora sinal já estivesse presente em ED10, níveis mais altos deproteína DCL imunorreativa foram encontrados em ED12 e ED14. O nível deproteína DCL declinou após ED14 e uma banda mais fraca mas clara de 40kDa ainda estava presente em cérebro de adulto. Aqui, uma banda adicionalde 53 kDa foi muito proeminente (Figura 3B). De acordo com seu pesomolecular de 53 kDa, esta banda mais provavelmente representou DCLK-short, que abundantemente expressada apenas em cérebro de adulto e não emcérebro em desenvolvimento (Vreugdenhil et al, 2001; Omori et al., 1998).

Dentro de cérebro de adulto, níveis mais altos de proteína DCL foramencontrados no bulbo olfativo, com níveis menores no hipocampo e no córtexcerebral, e níveis muito baixos no cerebelo, tronco cerebral e hipotálamo(Figura 3C).

Tem sido relatado que DCX é especificamente expressadadurante o desenvolvimento mas não cai abaixo do limite de detecção emcérebro de adulto (Francis et al., 1999 supra; Gleeson et al., 1999 supra),embora DCX permaneça expressada em quantidades muito baixas em regiõesselecionadas (Nacher et al., 2001, Eur J Neurosci 14, 629-644). Paracomparação com as descobertas de DCL, os lisados de proteína foramadicionalmente analisados com um anticorpo específico para DCXreconhecedor da terminação-C. De acordo com os outros estudos (Francis etal., 1999; Gleeson et al., 1999), as concentrações mais altas de DCX foramencontradas em ED12 e foram verificadas que declinam posteriormente(Figura 3B).

Em contraste à DCL, nenhuma expressão de DCX5 tambémapós exposição prolongada, pôde ser detectada em cabeças de embrião deED8 e EDlO ou no cérebro de adulto. Contudo, consistente com um papelpara DCX em migração neuronal, imunorreatividade de DCX foi observadano bulbo olfativo de adulto (Figura 3 C pista 7), mas não em outras estruturasdo cérebro (Figura 3C pista 2-6), indicando diluição de DCX para abaixo donível de detecção nos lisados de cérebro integrais.

Para analisar com mais detalhe as diferenças regionais emexpressão de DCX e de DCL, a expressão espaço-temporal de DCL durante odesenvolvimento embriônico inicial foi estudada usando hibridização ín sítu.Níveis baixos de expressão de DCL mRNA foram observados ao longo docomprimento do neuroepitélio (destinado para produzir o sistema nervosocentral e o córtex em camadas em estágios de desenvolvimento posteriores)em ED8 (Figura 4.1 A). Em ED10, quando divisões massivas começam a setornar proeminentes, expressão substancial foi encontrada no diencéfalo,telencéfalo e mesencéfalo imaturos, a.o. (Figura 4.1 B). Consistente com osexperimentos de RT-PCR e Western blot a intensidade de expressão de DCLem ED12 aumentou profundamente (Figura 4.1 C) em comparação com ED 8e 10, com níveis altos nas zonas ventriculares proliferativas.

Para estudar a distribuição espaço-temporal de proteína DCL,imuno-histoquímica foi realizada nas seções de embriões de camundongo de8, 9, 10, e 11 dias de idade usando o anticorpo para DCLK (anti-DCLK) quereconhece exclusivamente DCL nestas idades (veja acima e Figura 3B). EmED8, não foi observada coloração de DCL (dados não mostrados). Contudo,em ED 9, uma idade na qual expressão de DCX não foi ainda verificada(Figura 4.II Β), sinal de DCL foi proeminente nas paredes ventriculares e nosneuroepitélios principais, áreas bem definidas de neurogênese e mitosemassiva (Figura 4.II C e J). Em ED IOe 11, proteína DCL geralmente seguiuo padrão de hibridização in situ, com níveis altos nas regiões proliferativas dosistema nervoso central e periférico, incluindo o telencéfalo, diencéfalo,eminência gangliônica lateral, o neuroepitélio do tubo neural, bem como e.g.a raiz dorsal e gânglios simpatéticos, enquanto que tecidos não-neuronaiscomo osso ou os intestinos e.g., foram destituídos de qualquer sinal (Figura4.II A e D). Magnificações maiores do neocórtex imaturo, revelaram expressão de DCL não apenas nas camadas superiores da placa cortical, mastambém na zona ventricular interna, com níveis menores aparentes na zonaintermediária (Figura 4.II F e H).

Uma observação particularmente intrigante foi aimunorreatividade de DCL em células mitóticas, em e.g. a zona ventricular ea parede epitelial (exemplos em Figura 4.II C-F, H, J-N), enquanto quetambém células mitóticas, positivas para DCL, foram encontradas noneuroepitélio do tubo neural (Figura 4.II D) e na zona intermediária doneuroepitélio cortical (Figura 4.II F), geralmente com uma ocorrência maisisolada e em freqüências menores. Em adição ao padrão de coloração de DCLdos epitélios na mesma seção, dubletos imunopositivos claros foramobservados (Figura 4.II D e F). Também células mitóticas em estágiosespecíficos do ciclo celular puderam ser reconhecidas (Figura 4.II J-N), comimunorreatividade intensa entre cromossomos e até mesmo estruturascentrossomo-semelhantes imunopositivas (Figura 4.IIL) claramente visíveis.

Tomados juntos, os dados mostraram claramente que apresença de expressão de DCL mRNA precede aquela de DCX iniciando já deED8, e proteína DCL de ED9 progressivamente. Expressão mais alta de DCLmRNA e proteína foi verificada em ED12 e ED14, respectivamente, enquantoque, contrário à DCX, também foi observada expressão de transcrito eproteína de DCL nos Western blots de cérebro de adulto. Distribuição deproteína durante desenvolvimento inicial não é apenas diferente daquela deDCX no tempo, mas também em localização, i.e., DCL foi encontrada nazona ventricular e na placa cortical em vez de apenas na placa cortical (Figura4.II C, F-H). Mais de modo impressionante, imunorreatividade de DCL foiregularmente encontrada em células mitóticas do neuroepitélio e algumasvezes na zona intermediária.

Exemplo 5 - DCL é endogenamente expressada em células de neuroblastomaPara investigar um possível papel para DCL em proliferaçãoneuronal, a expressão de DCL endógena em várias linhagens de célulasneuronais foi analisada. Uma banda imunorreativa de DCL deaproximadamente 40 kDa foi observada em 4 linhagens de células deneuroblastoma diferentes, que estava ausente em qualquer uma das linhagensde células de não-neuroblastoma estudadas (Figura 5.1 A), indicando aespecificidade para expressão de DCL em células com um fenótiposemelhante a neuroblasto. Seleção de outras linhagens de células de não-neuroblastoma incluindo células PC12, falhou em identificar qualquerlinhagem de célula positiva para DCL (dados não mostrados). Na linhagem decélula de neuroblastoma NlE-115, o dubleto imunorreativo de 40 kDa co-migrou com o dubleto resultante da sobreexpressão de DCL (Figura 5.1 B).Esta banda de 40 kDa não pôde ser explicada pela presença de DCX emcélulas Nl 15 porque ambos os experimentos de RT-PCR e análise de Westernfalharam em detectar sinais de DCX usando anticorpos e iniciadoresespecíficos para DCX (dados não mostrados). A banda superior do dubleto deDCL de 40 kDa portanto mais provavelmente representa uma fosfoisoformade DCL, uma noção que foi confirmada pelo desaparecimento da bandasuperior de ambas DCL endógena e sobreexpressada quando os lisados decélula foram incubados com fosfatase. Isto demonstra que DCL, similar àDCX, é uma fosfoproteína, pelo menos em linhagens de célula neuronal.Exemplo 6 - DCL afeta organização e arquitetura de microtúbulo em célulasNlE-115.

Para estudar a função e a localização subcelular de DCL,foram realizados experimentos imunocitoquímicos usando microscopiaconfocal após manipulação de expressão de DCL usando tecnologia de RNAinterferente pequeno (siRNA) em células de neuroblastoma NlE-115 eminterfase. Para estabelecer se siRNA capturado pelas células Nl 15, moléculasanti-DCL sintético siRNA foram marcadas com Cy-5 e sua presença ouausência foi monitorada em células Nl 15 por microscopia fluorescente. Estesestudos indicaram a presença de anti-DCL siRNA em aproximadamente 95%de todas as células Nl 15 (dados não mostrados). Três moléculas de siRNAdiferentes contra DCL foram construídas: siDCL-1, 2 e 3. Análise de Westernblot indicou que siDCL-1 falhou em diminuir a expressão "knock-down" deproteína DCL (Figura 5.II pista 1), uma descoberta que pode ser explicadapelos dinucleotídeos TT na extremidade-3' nesta fita de anti-senso. siDCL-1foi subseqüentemente usada como um controle negativo para os efeitos doprocedimento de siRNA. Comparado com células não tratadas e siDCL-1,transfecção de moléculas siDCL-2 e si-DCL-3 acarretou uma expressãoreduzida "knock-down" de respectivamente 80% e 90% conformedeterminado da análise de Western blot (Figura 5.II pista 2 e 3). Análiseimunocitoquímica subseqüente de células Nl 15 tratadas com siRNA usandoanticorpos anti-DCLK e α-tubulina ou γ-tubulina revelou efeitos profundossobre a arquitetura do citoesqueleto de microtúbulo de células em interfase.Em células não tratadas, coloração de anti-DCL foi tipicamente pontuada epresente em todo o restante do soma (veja Figura 5.III A). Em contraste àDCX, que parece estar seletivamente localizada na periferia do soma e atémesmo nas extremidades de processos neuronais (Friocourt et al., 2003;Schaar et al., 2004), imunorreatividade de DCL foi menos intensa na periferiado soma de célula (Figura 5.III A e C), e muitas vezes exibiu intensidadeaumentada próximo de um, o dois lados do núcleo (Figura 5.III A, C, D e F),sugerindo que DCL está concentrada particularmente ao longo docitoesqueleto circundando o centrossomo. Esta localização subcelular foiconfirmada por co-coloração com o marcador de centrossomo γ-tubulina(veja Figura 5.IV A-C).

De acordo com a análise de Western blot, transfecção desiDCL-1 não alterou o padrão de coloração imunocitoquímica de DCLendógena. Expressão reduzida "knock-down" de DCL por siDCL-3, contudo,induziu um desaparecimento quase completo da coloração anti-DCLK (vejaFigura 5.III G), fortemente indicando que o anticorpo anti-DCLK reconheceDCL em células Nl 15 em uma maneira elevadamente específica. De modoimpressionante, em 40% das células transfectadas com siDCL-2 e em 80%das células transfectadas com siDCL-3, o citoesqueleto foi interrompido,como foi evidente da organização irregular e do padrão de coloração de α-tubulina alterado, mais dispersado. Células Nl 15 transfectadas com siDCL-2e 3 nas com um citoesqueleto normal, também mostraram mais coloraçãoanti-DCLK do que as células com citoesqueleto aberrante. Istoadicionalmente confirma uma relação casual entre expressão reduzida"knock-down" efetiva de DCL e subseqüentes anormalidades em estabilidadede microtúbulo. Comparado com o citoesqueleto de microtúbulo normal emcélulas não tratadas, o padrão anormal após expressão reduzida "knock-down" de DCL é caracterizado por feixes de microtúbulos com uma estruturamais condensada e menos dispersada, claramente exibindo menosramificações laterais (Figura 5.III H e I). Isto indicou um papel para DCL emramificação e estabilização do citoesqueleto de microtúbulo.

Visto que a distribuição de proteína DCL foi verificada emconcentrações mais altas ao redor dos centrossomos, expressão reduzida"knock-down" de DCL pode afetar o complexo de centrossomo-proteína esubseqüentemente o posicionamento nuclear, a (re)organização e aconectividade de citoesqueleto. Para solucionar este problema, expressãoreduzida "knock-down" de DCL foi realizada em combinação com coloraçãode γ-tubulina (veja Figura 5.IV D-I). De acordo com a natureza euplóide decélulas Nl 15, foram observados múltiplos centrossomos por célula. Contudo,a despeito da expressão reduzida "knock-down" eficiente de DCL, não foivista mudança aparente no número ou na estrutura de centrossomos,indicando que DCL não é um fator chave na organização estrutural decentrossomos.

Exemplo 7 - DCL é essencial para formação de fuso mitótico em células deneuroblastoma.

A presença de DCL na zona ventricular (Figura 4) estáconsistente com um papel para DCL em proliferação neuronal e divisão deprogenitor. Células NlE-115 se dividindo foram portanto analisadas usandomicroscopia confocal após expressão reduzida "knock-down" de DCL porsiRNA. Imunorreatividade forte de DCL foi observada em todas as célulasNlE-115 se dividindo durante metáfase ou anáfase inicial (veja Figura 6A eD). Imunorreatividade de DCL largamente co-localizou com a-tubulinaindicando uma associação com os fusos mitóticos. Contudo, um gradiente deimunorreatividade foi aparente para DCL em todas as células analisadas, comníveis baixos próximos do centrossomo e níveis altos nos fusos mitóticos epróximos do cinetocore, sugerindo um papel para DCL na formação de fusosmitóticos. Consistentes com isto estão os efeitos dramáticos de expressãoreduzida "knock-down" de DCL por siDCL-2 e siDCL-3, que estãoassociados com uma deformação completa e algumas vezes ausência dosfusos mitóticos (Figura 6 G-L). Este efeito sobre os fusos mitóticos foiobservado em 40% de todas as células se dividindo (siDCL-2) e em todas ascélulas transfectadas com siDCL-3 se dividindo. Expressão reduzida "knock-down" ineficiente por siDCL-1 deixa co-localização de DCL com fusosmitóticos inalterados enquanto que a aparência fenotípica dos fusos mitóticosé similar àquela dos fusos mitóticos não tratados. (Figura 6 D-F). Assim,aparentemente, DCL é requerida para a formação correta do fuso mitótico deprogenitores neurais ou neuroblastos se dividindo.

Exemplo 8 - Sobreexpressão de DCL acarreta alongamento de fusosmitóticos.

Ganho-de-função foi estudado por sobreexpressão de DCL emcélulas COS-I que normalmente não expressam esta proteína. Consistentecom as descobertas acima sobre expressão de DCL endógena em célulasNl 15 se dividindo, imunorreatividade de DCL co-localizou com fusosmitóticos em células COS-I se dividindo (veja Figura 7). Dois fenótiposdiferentes foram observados: primeiro, em 20% (n=126) das células COS-I sedividindo analisadas, sobreexpressão de DCL co-localizou com a-tubulina,similar ao padrão de expressão de SCL endógena em células NlE-115 sedividindo (Figura 7 D-F), com DCL localizada no cinetocore e em fusosmitóticos. Contudo, diferentemente de célula NlE-115, DCL também foiverificada associada com os centrossomos e fibras astrais. Segundo, namaioria das células COS-I se dividindo (80%), comparação do estágiomitótico preciso de células expressando DCL e transfectadas com vetor foiimpedida pelo fato de que todas as células expressando DCL e se dividindomostraram um fenótipo anormal com fusos mitóticos alongados.

Mais impressionantemente, meio-fusos foram observadosindicando que sobreexpressão de DCL afeta a segregação de centrossomo e aorientação de fuso (Figura 7 Α-C, G-I). Em adição, os fusos mitóticospareceram ser muito mais longos e muitas vezes mais espessos do que osfusos de células de controle (comparar e.g. o comprimento do fuso de umacélula não transfectada, Figura 7B inserto de referência, com Figura 7C).

Notavelmente, estes efeitos de DCL estavam associados com padrão dedistribuição e coloração de DNA anormal, onde os cromossomos estãocompletamente deslocados e dispersados sobre o soma, um padrãoimpressionantemente diferente da orientação normal (Figura 7B inserto dereferência), que é perpendicular com respeito à posição de centrossomobipolar (veja referência comprimento comparado com Figura 7C). Assim,sobreexpressão de DCL em células COS-I acarreta o alongamento de fuso e aformação de meio-fiisos, sugerindo que DCL desempenha um papel crucialem comprimento e forma de fuso mitótico.

Exemplo 9 - Material e métodos

9.1 Clonagem de DCL murina

Os presentes inventores desenvolveram um iniciador de anti-senso IA: CTGGA ATTCT TACAC TGAGT CTCCT GAG (sítio de EcoRlsublinhado) correspondendo à região de códon de parada do exon CARP-específico e um iniciador de senso 2S: GCAGG TTCTC ACTGA CATTACCG correspondendo ao exon 3 do gene DCLK murino. Em 30 ciclos dePCR, um fragmento de 457 pb foi amplificado usando cDNA embriônico decamundongo como um modelo e polimerase PfuI (Stratagene). Análise deseqüência de DNA confirmou a seqüência de DNA como sendoespecífica para DCLK. Subseqüentemente, um DCL cDNAcodificador de proteína completa DCL foi amplificado usandoCCAGGATCCACCATGTCGTTCGGCAGAGATATG (sítio BamHlsublinhado) como um iniciador de senso e IA como um iniciador de anti-senso, cortado com BamHl e EcoRl e subclonado no plasmídeo de expressãopcDNA 3.1 (InVitrogen, Groningen, Países Baixos). Um construto de DCL-EGFP foi gerado por subclonagem de um fragmento Kpnl/EcoRV DCL depcDNA3.1 .DCL no sítio Smal/Kpnl de pEGFP-Cl (Clontech; veja tambémFigura 1).

9.2 Hibridização in situ

DCL mRNA inclui exon 8 (Figura 1), que está ausente emmais outros transcritos de DCLK exceto para CARP. Como CARP éexpressada em níveis muito baixos durante o desenvolvimento embriônico,um oligonucleotídeo de anti-senso de 40-mer foi desenvolvido (5' - TTTGCTGTTA GATGC TTGCT TAGGA AATGG GAAAC CTTGA-3')complementar a uma seqüência específica de exon 8. Como um controlenegativo foi usado o oligonucleotídeo 5'-TTTGA TGTTA TATGC TTGATTAGGA CATGG GAÇAC CTGGA-3' que contém 6 más combinações(sublinhadas). Ambos os oligonucleotídeos foram marcados na extremidadecom α- P dATP (NEN Life Science Products, Hoofddorp, Países-Baixos,2000Ci/mmol, 10 mCi/ml) usando terminal transferase de acordo com asinstruções do fabricante) (Roche Molecular Biochemicals, Almere, Países-Baixos). Hibridização in situ e visualização dos sinais foram realizadas comodescrito anteriormente (Meijer et al., 2000, Endocrinology 141, 2192-2199).

9.3 Anticorpos

A geração de anticorpos anti-DCL tem sido descritapreviamente (Kruidering et al., 2001, supra). Anticorpo monoclonal decamundongo anti-a-tubulina foi obtido de Sigma. Anticorpo policlonal decabra anti-cortina dupla (C-18), anticorpos secundários conjugados comrodamina e anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábanoforam de Santa Cruz Biotechnology, Inc.

9.4 Tratamentos e cultura de célula

Todos os compostos químicos para cultura de célula foramobtidos de Life Science Technologies, Inc. a não ser que seja enunciado deoutro modo. Todas as células foram mantidas a 37°C, CO2 5%. Células COS-1 foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM),suplementado com 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL deestreptomicina, e 10% de Soro Fetal Bovino. Células NGl08-15 e Nl 15foram cultivadas em DMEM sem piruvato de sódio, suplementadas com 100μg/mL de estreptomicina, mistura de hibridoma (HAT), e 10% de Soro FetalBovino. Para experimentos de transfecção transiente, as células foramcultivadas sobre placas ou lamínulas revestidas com poli-L-lisina. Neurôniosdissociados primários de camundongos recém-nascidos foram cultivados emmeio F-12 Ham, modificação de Kaighn (Sigma) suplementado com L-glutamina, 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, e10% de Soro Fetal Bovino. Neurônios primários foram isolados da região dohipocampo de um camundongo de um dia de idade, que foi incubado em umasolução de tripsina por 25 minutos a 37°C. Subseqüentemente, as célulasforam lavadas duas vezes com meio de cultura e plaqueadas sobre lamínulasrevestidas com poli-L-lisina. 24 Horas mais tarde, o meio de cultura foisubstituído e suplementado por citosina- β-D-arabinosídeo 7,5 μΜ (Sigma)para reduzir a quantidade de células gliais. Os experimentos de transfecçãotransiente foram realizados com Superfect (Qiagen, Valencia, CA) de acordocom as instruções do fabricante. Neurônios primários forma transfectadosquatro dias após isolamento.

9.5 Experimentos de siRNA

Para experimentos de siRNA, foi usada a linhagem de célulade neuroblastoma NIE-115 de camundongo (número ATCC de CRL-2263).Oligonucleotídeos sintéticos de RNA: 5'-CAAGA AGACG GCUCA CUCC-3' e 5'-GGAGU GAGCC GUCUU CUUG-3' (siDCL-1 anelado), 51CAAGAAGACG GCUCA CUCCT T- 3' (SEQ ID NO: 5) e 5'-GGAGU GAGCCGUCUU CUUGT T-3' (SEQ ID NO: 6) (siDCL-2 anelado) e 5'-GAAAGCCAAG AAGGU UCGAT T-3' (SEQ ID NO: 9) e 5'-TCGAA CCUUCUUGGC UUUCT T3' (SEQ ID NO: 10) (siDCL-3 anelado) nos quais 3'-timidinas são desoxinucleotídeos, foram obtidos de Eurogentec e dissolvidosem tampão de anelamento (KAc 100 mM, Hepes 30 mM pH7,5, MgAc 2mM) para uma concentração final de 100 μΜ. Para a formação de complexode siRNA, quantidades molares iguais de oligonucleotídeos de senso e deanti-senso oligonucleotídeos foram misturadas, aquecidas a 94°C por 1 minutoseguido por incubação a 37°C por 1 hora. Por cavidade foi usada umaconcentração final de duplex siRNA de 100 nM. Para silenciamento de gene,60 pmoles de duplex siRNA foram dissolvidos em 50 μL de opti-MEM (LifeTechnologies) e misturados por pipetação com 3 μL de reagenteoligofectamina (Invitrogen), dissolvidos em 12 μL de opti-MEM. Apósincubação de 20 minutos na temperatura ambiente, o volume foi aumentadocom 32 μL de opti-MEM e a mistura total (100 μL) foi adicionada nas células(500 μL ). Após 48 horas, silenciamento de gene foi testado por análise deWestern blot e imunofluorescência.

9.6 Imunocitoquímica

Células foram cultivadas e transientemente transfectadas comodescrito acima. Nos tempos indicados, células sobre lamínulas foram fixadascom acetona 80% em água por 5 minutos na temperatura ambiente. Célulasforam lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS),Tween 20 0,05% e bloqueadas por pelo menos 1 hora em tampão de bloqueio:PBS, Tween 20 0,05%, Soro de Cabra Normal 5% (NGS, Sigma). Anticorpoprimário foi adicionado por 1 hora na temperatura ambiente no tampão debloqueio, lavado 3 vezes com PBS, Tween 20 0,05% e incubado comanticorpos secundários conjugados com rodamina por 30 minutos natemperatura ambiente em tampão de bloqueio. Após outra lavagem, osnúcleos foram corados com Hoechst 33258 0^g/mL por 5 minutos, lavados4 vezes e analisados. Imagens foram obtidas com um microscópiofluorescente Olympus AX70 acoplado em uma câmara de vídeo a cores Sony3CCD operada por programa de computador Analysis® (Soft ImagingSystem, Corp.). Para mapear a distribuição de proteína DCL, embriões decamundongo CDl embriônico de ED 9, 10 e 11 foram brevemente lavadosem PBS e então fixados por 4 h em metanol / acetona / água(40:40:20)(MAW, Franco et al, 2001) na temperatura ambiente e entãoarmazenados em etanol 70% por 2 semanas, antes de serem embebidos emParaplast Plus (Kendall, Tyco Healthcare, Mansfield, MA 02048, USA) apósas quais seções de espessura de 6 μηι foram montadas sobre lâminasSuperfrost Plus (Menzel-Glaser). TBS foi usado como um tampão de lavagemem todas as seguintes etapas. Após clarificação em xileno e etanol graduado,seções foram pós-fixadas em fixador de Bouin, antes da lavagem e dobloqueio de atividade de peroxidase endógena por tratamento com peróxidode hidrogênio 0,1% de 15 min. Para reduzir a ligação não específica, soluçãode leite em pó 1% (Camping, Países-Baixos) em PBS foi aplicada por 30 min.

O anticorpo DCL primário foi aplicado 1:50 em gelatina 0,25% / triton Χ-Ι 00 0,5% em TBS (Supermix) por 1 hora na temperatura ambiente e entãodurante a noite a 4°C. Incubação de anticorpo secundário (biotinilado anti-coelho, Amersham Life Sciences, 1:200) foi em Supermix por 1 h 30 min natemperatura ambiente, amplificado com avidina-biotina (ABC) Elite (VectorLaboratories, Burlingame), tiramida biotinilada (1:500) com peróxido 0,01%por 30 min seguida por outra incubação de 45 min com ABC. As 2 últimaslavagens foram em tampão Tris HCl 0,05 M (pH 7,6), que também foi usadopara dissolver diamino-benzidina (DAB)(0.05 M). Seções foram contra-coradas com violeta de cresila e cobertas com lamínula de Entellan (Merck).

Para comparação, também a distribuição de proteína DCX foimapeada em seções adjacentes, usando o anticorpo específico C-18 de cortinadupla (Santa Cruz Biotechnology, South Cruz CA, USA) em uma diluição de1:75. O protocolo de amostra foi usado como acima, exceto para a etapa debloqueio em solução de leite em pó que foi omitida e um anticorpo biotiniladoanti-cabra como anticorpo secundário.

9.7 Extração de proteína e western blotting

Células e tecido de camundongo foram solubilizados comtampão de Iise (trietanol-amina 20mM pH 7,5, NaCl 140mM, deoxicelato0,05%, dodecil-sulfato de sódio 0,05%, Triton X100 0,05%), suplementadocom mistura de inibidor de protease livre de EDTA Complete™ EDTA(Roche Molecular Biochemicals) e centrifugadas a 16.OOOg por 30 minutos.Sobrenadante foi coletado e concentração de proteína foi determinada usandoo método de Pierce. Quantidades iguais de proteína foram separadas SDS-PAGE, transferidas para membranas immobilon-P PVDF (Millipore). Blotsforam bloqueados por 1 hora com tampão de bloqueio (solução salinatamponada com Tris, Tween 20 0,2% (TBST), leite 5%), incubado comanticorpos primários em tampão de bloqueio por 1 hora, lavados 3 vezes comTBST, incubados com anticorpos secundários conjugados com peroxidase derábano em tampão de bloqueio por 30 minutos e lavados 3 vezes com TBST.Ligação de anticorpo foi detectada por ECL (Amersham Pharmacia Biotech).

9.8 Tratamento com fosfatase

Células NlE-115 transfectadas com DCL e não transfectadasforam solubilizadas com tampão de Iise (Tris-HCl 50 mM pH 9,3, MgCl2ImM, ZnCl2 0,1 mM, espermidina 1 mM suplementado com mistura deinibidor de protease livre de EDTA Complete™ (Roche MolecularBiochemicals), centrifugadas a 16.000 g por 30 minutos. Sobrenadante foicoletado e concentração de proteína foi determinada usando o método dePierce. Cada sobrenadante foi dividido em 3 amostras contendo 50 μg deproteína. Uma amostra foi não tratada, a segunda foi incubada por 30 minutosa 37sem enzima e a terceira foi incubada com 10 unidades de FosfataseAlcalina Intestinal (Promega Bioscience, Inc.). As amostras foram analisadasWestern blotting como descrito acima.

9.9 Ensaio de polimerização de tubulina

cDNa codificador de DCL foi excisado do construto deexpressão pcDNA3.1 e religado em pET28 usando BamHl e EcoRl. Oconstruto de expressão de DCL resultante foi transfectado para células BL21.Uma colônia única foi crescida em 500 mL de LB para OD 0,7, em cujoponto IPTG foi adicionado para uma concentração final 0,4 mM. Após trêshoras de incubação, as bactérias foram coletadas, lavadas com PBS epelotizadas. Proteína DCL recombinante foi isolada por ressuspensão dapelota e sua passagem através de uma French após o qual ela foi purificadausando a resina de Probond (Invitrogen) Ni de acordo com as instruções dofabricante. DCL purificada foi concentrada para 0,8 mg/mL usando umdispositivo de concentração Centricon 30. Ensaios de polimerização detubulina foram realizados de acordo Gleeson et al (Gleeson et al., 1999,supra) usando o kit de ensaio de polimerização de tubulina (cat no. BK006) deCitoskeleton. Resumidamente, 1 mg de tubulina foi dissolvido em 1,1 mL detampão de polimerização gelado de acordo com as instruções do fabricante e100 μΐ. disto foram adicionados em 10 pL dei proteína DCL de váriasconcentrações em uma placa de microtítulo de 96 cavidades.

Subseqüentemente, absorção a 340 nm foi medida por 30' em intervalos de30" usando HTS2000 (Biorad/Perkin Elmer).

SEQÜÊNCIAS DE Dcl E DCL

SEQ ID NO: 1

ccacgcgtcc gcggagaacc gcatttcaat gaggaccagc tccagcgcat cagtgcactagcggtcgcag cttccagacg ctcgtgctcc gcagccccag ccgcgcccag cccggcgaggacagctccag cagccggcca cagacaaccc agcctccacc cgcgaccggt tccataagcaagccagccat gtcgttcggc agagatatgg agttggagca ttttgatgag cgggacaaggcgcagaggta cagcaggggg tcccgtgtga atggcctgcc cagccccaca cacagcgccc

actgcagctt ctaccgcacc cgcaccctgc agacactcag ctccgagaag aaagccaagaaggttcgatt ctacagaaat ggtgaccgct acttcaaagg aattgtgtat gccatctccccagaccgctt cagatctttc gaggccctgc tggctgattt gacccgaact ctctcggataatgtgaattt gccccagggg gtgagaacca tctacaccat cgatggactc aagaagatctccagcctgga ccagctggtg gaaggtgaaa gctatgtctg cggctccatc gagccctttaagaagctgga gtacaccaag aatgtgaacc ccaactggtc agtgaacgtc aagaccacctcagcctcccg cgcagtgtct tctttggcca ctgccaaggg tgggccttcg gaggttcgggagaataagga tttcattcga cccaagctgg tcaccatcat cagaagtggg gtgaagccacggaaggctgt cagaatcctg ctgaacaaga agacggctca ctccttcgag caggttctcactgacattac cgacgctatc aagctggact ccggtgtggt gaagcgcctg tacactctggatgggaagca ggtgatgtgc cttcaggact tttttggtga cgatgacatt tttattgcatgtggaccaga gaagttccgt taccaggatg atttcttgct agatgaaagt gaatgtcgagtggtgaaatc aacttcttac accaaaatag catcagcgtc ccgcagaggc acaaccaagagcccaggacc ttcccggaga agcaagtccc cagcctccac cagctcagtt aatggaacccctggtagtca gctctctact ccacgctcgg gcaagtcacc aagtccatca cccaccagcccaggaagcct gcggaagcag agggacctgt accgccccct ctcgtcggat gatttggactcaggagactc agtgtaagaa ttc

SEQ ID NO: 2

gcacatccct gcactagtgg ccgcaaccga gacgccgcgc tccagcagct gctgccgcccagcccggccc cgccgccgcc ccccagccct gcagccccgc agccccggcc gcgcccagcccggcgaggac agcaccagga ggcggccccc agcgcggcca caaagacccc cggcggcgtctctccgcgga ccggtcctac ttgaagtcca tcatgtcctt cggcagagac atggagctggagcacttcga cgagcgggat aaggcgcaga gatacagccg agggtcgcgg gtgaacggcctgccgagccc gacgcacagc gcccactgca gcttctaccg cacccgcacg ctgcagacgctcagctccga gaagaaggcc aagaaagttc gtttctatcg aaacggagat cgatacttcaaagggattgt gtatgccatc tccccagacc ggttccgatc ttttgaggcc ctgctggctgatttgacccg aactctgtcg gataacgtga atttgcccca gggagtgaga acaatctacaccattgatggtatgtggctcggtcggtgaaaaggaagccctcatcagaagctcattcctttggtgaaacggtgatgatgatgctagatgacatcccgcagccaccagctccgccaagcccccctctcttc

gctcaagaagcatagagccccgtcaagaccttcagaggtgtggcgtgaagtgagcaggtccctgtacacgcatttttattaagtgaatgtgagcaccaccagttaatggaatcacccaccggatgacttg

atttccagccttcaagaaacacctcggcttcgagagaataccacggaaagctcaccgatattggatgggagcatgtggaccgagtggtaaaagagcccagacccctggtaagcccaggaagattcagtag

tggaccaacttggagtacacctcgggcagtaggatttcatctgtcaggattcaccgatgcaacaggtgatcggagaagttagtccacttcgaccgtccaggtcagctctcgcctgcggaagagactcagt

ggtggaaggacaagaatgtggtcttcactgtcggcccaagtctgctgaaccatcaagctggtgccttcagccgttaccagttacaccaaagcgtagcaagtactccgcgcgcagagggacgtaaaagaaa

gagagttatgaaccccaactgccactgccactggtcaccaaagaaaacgggactcgggaggacttttttggatgatttctatagcttcattcccctgccttcaggcaagtctgtaccgcc

SEQ ID NO: 3

Met Ser Phe Gly Arg Asp Met Glu Leu Glu His Phe Asp Glu Arg Asp15 10 15

Lys Ala Gln Arg Tyr Ser Arg Gly Ser Arg Val Asn Gly Leu Pro Ser20 25 30

Pro Thr His Ser Ala His Cys Ser Phe Tyr Arg Thr Arg Thr Leu Gln35 40 45

Thr Leu Ser Ser Glu Lys Lys Ala Lys Lys Val Arg Phe Tyr Arg Asn50 55 60

Gly Asp Arg Tyr Phe Lys Gly Ile Val Tyr Ala Ile Ser Pro Asp Arg65 70 75 80

Phe Arg Ser Phe Glu Ala Leu Leu Ala Asp Leu Thr Arg Thr Leu Ser85 90 95

Asp Asn Val Asn Leu Pro Gln Gly Val Arg Thr Ile Tyr Thr Ile Asp100 105 110

Gly Leu Lys Lys Ile Ser Ser Leu Asp Gln Leu Val Glu Gly Glu Ser115 120 125

Tyr Val Cys Gly Ser Ile Glu Pro Phe Lys Lys Leu Glu Tyr Thr Lys130 135 140

Asn Val Asn Pro Asn Trp Ser Val Asn Val Lys Thr Thr Ser Ala Ser145 150 155 160

Arg Ala Val Ser Ser Leu Ala Thr Ala Lys Gly Gly Pro Ser Glu Val165 170 175

Arg Glu Asn Lys Asp Phe Ile Arg Pro Lys Leu Val Thr Ile Ile Arg180 185 190Ser Gly Val Lys Pro Arg Lys Ala Val Arg Ile Leu Leu Asn Lys Lys195 200 205

Thr Ala His Ser Phe Glu Gln Val Leu Thr Asp Ile Thr Asp Ala Ile210 215 220

Lys Leu Asp Ser Gly Val Val Lys Arg Leu Tyr Thr Leu Asp Gly Lys225 230 235 240

Gln Val Met Cys Leu Gln Asp Phe Phe Gly Asp Asp Asp Ile Phe Ile245 250 255

Ala Cys Gly Pro Glu Lys Phe Arg Tyr Gln Asp Asp Phe Leu Leu Asp260 265 270

Glu Ser Glu Cys Arg Val Val Lys Ser Thr Ser Tyr Thr Lys Ile Ala275 280 285

Ser Ala Ser Arg Arg Gly Thr Thr Lys Ser Pro Gly Pro Ser Arg Arg290 295 300

Ser Lys Ser Pro Ala Ser Thr Ser Ser Val Asn Gly Thr Pro Gly Ser305 310 315 320

Gln Leu Ser Thr Pro Arg Ser Gly Lys Ser Pro Ser Pro Ser Pro Thr325 330 335

Ser Pro Gly Ser Leu Arg Lys Gln Arg Asp Leu Tyr Arg Pro Leu Ser340 345 350

Ser Asp Asp Leu Asp Ser Gly Asp Ser Val355 360

SEQ ID NO: 4

Met Ser Phe Gly Arg Asp Met Glu Leu Glu His Phe Asp Glu Arg Asp15 10 15

Lys Ala Gln Arg Tyr Ser Arg Gly Ser Arg Val Asn Gly Leu Pro Ser20 25 30

Pro Thr His Ser Ala His Cys Ser Phe Tyr Arg Thr Arg Thr Leu Gln35 40 45

Thr Leu Ser Ser Glu Lys Lys Ala Lys Lys Val Arg Phe Tyr Arg Asn50 55 60Gly Asp Arg Tyr Phe Lys Gly Ile Val Tyr Ala Ile Ser Pro Asp Arg65 70 75 80

Phe Arg Ser Phe Glu Ala Leu Leu Ala Asp Leu Thr Arg Thr Leu Ser85 90 95

Asp Asn Val Asn Leu Pro Gln Gly Val Arg Thr Ile Tyr Thr Ile Asp100 105 110

Gly Leu Lys Lys Ile Ser Ser Leu Asp Gln Leu Val Glu Gly Glu Ser115 120 125

Tyr Val Cys Gly Ser Ile Glu Pro Phe Lys Lys Leu Glu Tyr Thr Lys130 135 140

Asn Val Asn Pro Asn Trp Ser Val Asn Val Lys Thr Thr Ser Ala Ser145 150 155 160

Arg Ala Val Ser Ser Leu Ala Thr Ala Lys Gly Ser Pro Ser Glu Val165 170 175

Arg Glu Asn Lys Asp Phe Ile Arg Pro Lys Leu Val Thr Ile Ile Arg180 185 190

Ser Gly Val Lys Pro Arg Lys Ala Val Arg Ile Leu Leu Asn Lys Lys195 200 205

Thr Ala His Ser Phe Glu Gln Val Leu Thr Asp Ile Thr Asp Ala Ile210 215 220

Lys Leu Asp Ser Gly Val Val Lys Arg Leu Tyr Thr Leu Asp Gly Lys225 230 235 240

Gln Val Met Cys Leu Gln Asp Phe Phe Gly Asp Asp Asp Ile Phe Ile245 250 255

Ala Cys Gly Pro Glu Lys Phe Arg Tyr Gln Asp Asp Phe Leu Leu Asp260 265 270

Glu Ser Glu Cys Arg Val Val Lys Ser Thr Ser Tyr Thr Lys Ile Ala275 280 285

Ser Ser Ser Arg Arg Ser Thr Thr Lys Ser Pro Gly Pro Ser Arg Arg290 295 300

Ser Lys Ser Pro Ala Ser Thr Ser Ser Val Asn Gly Thr Pro Gly Ser305 310 315 320Gln Leu Ser Thr Pro Arg Ser Gly Lys Ser Pro Ser Pro Ser Pro Thr325 330 335

Ser Pro Gly Ser Leu Arg Lys Gln Arg Asp Leu Tyr Arg Pro Leu Ser340 345 350

Ser Asp Asp Leu Asp Ser Val Gly Asp Ser Val355 360LISTAGEM DE SEOÜENCIAS

<110> Prosensa BV<120> uma nova variante de união mRNA do gene quinasetipo cortina dupla e seu uso no diagnóstico e terapia de cânceres deorigem neuroectodermal

<130> <160> 20

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1283

<212> DNA

<213> desconhecido

<220><223> seqüência cDNA de dcl (camundongo)<220><221> códon de inicio <222> (189) .. (191)<223><220><221> exon2<222> (169)..(564)<223> inicio de exon 2 em 169<220><221> exon3<222> (565)..(911)<223> inicio de exon 3 em 565<220><221> exon4<222> (912)..(1011)<223> inicio de exon 4 em 912<220><221> exon5<222> (1012)..(1128)<223> inicio de exon 5 at 1012<220><221> exon7<222> (1129) ..(1223)<223> inicio de exon 7 em 1129<220><221> exon8<222> (1224 )..(1274)<223> inicio de exon 8 em 1224<220><221> códon de parada<222> (1275) .. (1277)<223>

60120180240300360420480540600660720780840900

<400> 1 ccacgcgtcc gcggagaacc gcatttcaat gaggaccagc tccagcgcat cagtgcactagcggtcgcag cttccagacg ctcgtgctcc gcagccccag ccgcgcccag cccggcgaggacagctccag cagccggcca cagacaaccc agcctccacc cgcgaccggt tccataagcaagccagccat gtcgttcggc agagatatgg agttggagca ttttgatgag cgggacaaggcgcagaggta cagcaggggg tcccgtgtga atggcctgcc cagccccaca cacagcgcccactgcagctt ctaccgcacc cgcaccctgc agacactcag ctccgagaag aaagccaagaaggttcgatt ctacagaaat ggtgaccgct acttcaaagg aattgtgtat gccatctccccagaccgctt cagatctttc gaggccctgc tggctgattt gacccgaact ctctcggataatgtgaattt gccccagggg gtgagaacca tctacaccat cgatggactc aagaagatctccagcctgga ccagctggtg gaaggtgaaa gctatgtctg cggctccatc gagccctttaagaagctgga gtacaccaag aatgtgaacc ccaactggtc agtgaacgtc aagaccacctcagcctcccg cgcagtgtct tctttggcca ctgccaaggg tgggccttcg gaggttcgggagaataagga tttcattcga cccaagctgg tcaccatcat cagaagtggg gtgaagccacggaaggctgt cagaatcctg ctgaacaaga agacggctca ctccttcgag caggttctcactgacattac cgacgctatc aagctggact ccggtgtggt gaagcgcctg tacactctggatgggaagca ggtgatgtgc cttcaggact tttttggtga cgatgacatt tttattgcat 960gtggaccaga gaagttccgt taccaggatg atttcttgct agatgaaagt gaatgtcgag 1020tggtgaaatc aacttcttac accaaaatag catcagcgtc ccgcagaggc acaaccaaga 1080gcccaggacc ttcccggaga agcaagtccc cagcctccac cagctcagtt aatggaaccc 1140ctggtagtca gctctctact ccacgctcgg gcaagtcacc aagtccatca cccaccagcc 1200caggaagcct gcggaagcag agggacctgt accgccccct ctcgtcggat gatttggact 1260caggagactc agtgtaagaa ttc 1283

<210> 2

<211> 1310

<212> DNA

<213> desconhecido

<220><223> seqüência de cDNA de humano dcl

<220><221> códon de inicio<222> (213)..(215)<223> inicio de tradução<220><221> códon de parada<222> (1302)..(1304)<223> parada de tradução

<220><221> exon2<222> (194) . (588)<223> inicio de exon 2 at 194<220><221> exon3<222> (589) . (935)<223> inicio de exon 3 at 589<220><221> exon4<222> (936). (1035)<223> inicio de exon 4 at 936<220><221> exon5<222> (1036) .(1152)<223> inicio de exon 5 at 1036<220><221> exon7<222> (1153) .(1247)<223> inicio de exon 7 at 1153<220><221> exon8<222> (1248) .(1301)<223> inicio de exon 8 at 1248

<4 00> 2

gcacatccct gcactagtgg ccgcaaccga gacgccgcgc tccagcagct gctgccgccc 60

agcccggccc cgccgccgcc ccccagccct gcagccccgc agccccggcc gcgcccagcc 120

cggcgaggac agcaccagga ggcggccccc agcgcggcca caaagacccc cggcggcgtc 180

tctccgcgga ccggtcctac ttgaagtcca tcatgtcctt cggcagagac atggagctgg 240

agcacttcga cgagcgggat aaggcgcaga gatacagccg agggtcgcgg gtgaacggcc 300

tgccgagccc gacgcacagc gcccactgca gcttctaccg cacccgcacg ctgcagacgc 360

tcagctccga gaagaaggcc aagaaagttc gtttctatcg aaacggagat cgatacttca 420

aagggattgt gtatgccatc tccccagacc ggttccgatc ttttgaggcc ctgctggctg 480

atttgacccg aactctgtcg gataacgtga atttgcccca gggagtgaga acaatctaca 540

ccattgatgg gctcaagaag atttccagcc tggaccaact ggtggaagga gagagttatg 600

tatgtggctc catagagccc ttcaagaaac tggagtacac caagaatgtg aaccccaact 660

ggtcggtgaa cgtcaagacc acctcggctt ctcgggcagt gtcttcactg gccactgcca 720

aaggaagccc ttcagaggtg cgagagaata aggatttcat tcggcccaag ctggtcacca 780tcatcagaag tggcgtgaag ccacggaaag ctgtcaggat tctgctgaac aagaaaacgg 840

ctcattcctt tgagcaggtc ctcaccgata tcaccgatgc catcaagctg gactcgggag 900

tggtgaaacg cctgtacacg ttggatggga aacaggtgat gtgccttcag gacttttttg 960

gtgatgatga catttttatt gcatgtggac cggagaagtt ccgttaccag gatgatttct 1020

tgctagatga aagtgaatgt cgagtggtaa agtccacttc ttacaccaaa atagcttcat 1080

catcccgcag gagcaccacc aagagcccag gaccgtccag gcgtagcaag tcccctgcct 1140

ccaccagctc agttaatgga acccctggta gtcagctctc tactccgcgc tcaggcaagt 1200

cgccaagccc atcacccacc agcccaggaa gcctgcggaa gcagagggac ctgtaccgcc 1260

ccctctcttc ggatgacttg gattcagtag gagactcagt gtaaaagaaa 1310

<210> 3

<211> 362

<212> PRT

<213> desconhecido

<220><223> seqüência de aminoácido de DCL (camundongo)<400> 3

Met Ser Phe Gly Arg Asp Met Glu Leu Glu His Phe Asp Glu Arg Asp1 5 10 15

Lys Ala Gln Arg Tyr Ser Arg Gly Ser Arg Val Asn Gly Leu Pro Ser20 25 30

Pro Thr His Ser Ala His Cys Ser Phe Tyr Arg Thr Arg Thr Leu Gln35 40 45

Thr Leu Ser Ser Glu Lys Lys Ala Lys Lys Val Arg Phe Tyr Arg Asn50 55 60

Gly Asp Arg Tyr Phe Lys Gly Ile Val Tyr Ala Ile Ser Pro Asp Arg65 70 75 80

Phe Arg Ser Phe Glu Ala Leu Leu Ala Asp Leu Thr Arg Thr Leu Ser85 90 95

Asp Asn Val Asn Leu Pro Gln Gly Val Arg Thr Ile Tyr Thr Ile Asp100 105 110

Gly Leu Lys Lys Ile Ser Ser Leu Asp Gln Leu Val Glu Gly Glu Ser115 120 125

Tyr Val Cys Gly Ser Ile Glu Pro Phe Lys Lys Leu Glu Tyr Thr Lys130 135 140Asn Val Asn Pro Asn Trp Ser Val Asn Val Lys Thr Thr Ser Ala Ser145 150 155 160

Arg Ala Val Ser Ser Leu Ala Thr Ala Lys Gly Gly Pro Ser Glu Val165 170 175

Arg Glu Asn Lys Asp Phe Ile Arg Pro Lys Leu Val Thr Ile Ile Arg180 185 190

Ser Gly Val Lys Pro Arg Lys Ala Val Arg Ile Leu Leu Asn Lys Lys195 200 205

Thr Ala His Ser Phe Glu Gln Val Leu Thr Asp Ile Thr Asp Ala Ile210 215 220

Lys Leu Asp Ser Gly Val Val Lys Arg Leu Tyr Thr Leu Asp Gly Lys225 230 235 240

Gln Val Met Cys Leu Gln Asp Phe Phe Gly Asp Asp Asp Ile Phe Ile245 250 255

Ala Cys Gly Pro Glu Lys Phe Arg Tyr Gln Asp Asp Phe Leu Leu Asp260 265 270

Glu Ser Glu Cys Arg Val Val Lys Ser Thr Ser Tyr Thr Lys Ile Ala275 280 285

Ser Ala Ser Arg Arg Gly Thr Thr Lys Ser Pro Gly Pro Ser Arg Arg290 295 300

Ser Lys Ser Pro Ala Ser Thr Ser Ser Val Asn Gly Thr Pro Gly Ser305 310 315 320

Gln Leu Ser Thr Pro Arg Ser Gly Lys Ser Pro Ser Pro Ser Pro Thr325 330 335

Ser Pro Gly Ser Leu Arg Lys Gln Arg Asp Leu Tyr Arg Pro Leu Ser340 345 350

Ser Asp Asp Leu Asp Ser Gly Asp Ser Val355 360

<210> 4

<211> 363

<212> PRT

<213> desconhecido

<220><223> seqüência de aminoácido de DCL (humano)

<4 00> 4Met Ser Phe Gly Arg Asp Met Glu Leu Glu His Phe Asp Glu Arg Asp1 5 10 15

Lys Ala Gln Arg Tyr Ser Arg Gly Ser Arg Val Asn Gly Leu Pro Ser20 25 30

Pro Thr His Ser Ala His Cys Ser Phe Tyr Arg Thr Arg Thr Leu Gln35 40 45

Thr Leu Ser Ser Glu Lys Lys Ala Lys Lys Val Arg Phe Tyr Arg Asn50 55 60

Gly Asp Arg Tyr Phe Lys Gly Ile Val Tyr Ala Ile Ser Pro Asp Arg65 70 75 80

Phe Arg Ser Phe Glu Ala Leu Leu Ala Asp Leu Thr Arg Thr Leu Ser85 90 95

Asp Asn Val Asn Leu Pro Gln Gly Val Arg Thr Ile Tyr Thr Ile Asp100 105 110

Gly Leu Lys Lys Ile Ser Ser Leu Asp Gln Leu Val Glu Gly Glu Ser115 120 125

Tyr Val Cys Gly Ser Ile Glu Pro Phe Lys Lys Leu Glu Tyr Thr Lys130 135 140

Asn Val Asn Pro Asn Trp Ser Val Asn Val Lys Thr Thr Ser Ala Ser145 150 155 160

Arg Ala Val Ser Ser Leu Ala Thr Ala Lys Gly Ser Pro Ser Glu Val165 170 175

Arg Glu Asn Lys Asp Phe Ile Arg Pro Lys Leu Val Thr Ile Ile Arg180 185 190

Ser Gly Val Lys Pro Arg Lys Ala Val Arg Ile Leu Leu Asn Lys Lys195 200 205

Thr Ala His Ser Phe Glu Gln Val Leu Thr Asp Ile Thr Asp Ala Ile210 215 220

Lys Leu Asp Ser Gly Val Val Lys Arg Leu Tyr Thr Leu Asp Gly Lys225 230 235 240

Gln Val Met Cys Leu Gln Asp Phe Phe Gly Asp Asp Asp Ile Phe Ile245 250 255Ala Cys Gly Pro Glu Lys Phe Arg Tyr Gln Asp Asp Phe Leu Leu Asp260 265 270

Glu Ser Glu Cys Arg Val Val Lys Ser Thr Ser Tyr Thr Lys Ile Ala275 280 285

Ser Ser Ser Arg Arg Ser Thr Thr Lys Ser Pro Gly Pro Ser Arg Arg290 295 300

Ser Lys Ser Pro Ala Ser Thr Ser Ser Val Asn Gly Thr Pro Gly Ser305 310 315 320

Gln Leu Ser Thr Pro Arg Ser Gly Lys Ser Pro Ser Pro Ser Pro Thr325 330 335

Ser Pro Gly Ser Leu Arg Lys Gln Arg Asp Leu Tyr Arg Pro Leu Ser340 345 350

Ser Asp Asp Leu Asp Ser Val Gly Asp Ser Val355 360

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> desconhecido

<220><223> fita senso siDCL-2

<4 00> 5

caagaagacg gcucacucct t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> desconhecido

<220><223> fita anti-senso siDCL-2

<4 00> 6

ggagugagcc gucuucuugt t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> desconhecido

<220><223> fita senso hu-siDCL-2

<4 00> 7

caagaaaacg gcucauucct t 21

<210> 8<211> 21<212> DNA<213> desconhecido

<220><223> fita anti-senso hu-siDCL-2<400> 8

ggaaugagcc guuuucuugt t 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> desconhecido

<220><223> fita senso siDCL-3

<4 00> 9

gaaagccaag aagguucgat t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> desconhecido

<220><223> fita anti-senso siDCL-3

<4 00> 10

tcgaaccuuc uuggcuuuct t 21

<210> 11<211> 21<212> DNA<213> desconhecido<220><223> fita senso hu-siDCL-3

<4 00> 11

gaaggccaag aaaguucgut t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> desconhecido

<220><223> fita anti-senso hu-siDCL-3<4 00> 12

acgaacuuuc uuggccuuct t 21

<210> 13

<211> 20

<212> RNA

<213> desconhecido

<220><223> oligonucleotideo de RNA anti-senso DCLex2C<4 00> 13

gcugggcagg ccauucacac 20

<210> 14<211> 20<212> RNA<213> desconhecido

<220><223> oligonucleotideo de RNA anti-senso hu-DCLex2C<400> 14

gcucggcagg ccguucaccc

20

<210> 15

<211> 20

<212> RNA

<213> desconhecido

<220><223> oligonucleotídeo de RNA anti-senso DCLex2D<400> 15

cuucucggag cugagugucu 20

<210> 16

<211> 20

<212> RNA

<213> desconhecido

<220><223> oligonucleotídeo de RNA anti-senso hu- DCLex2D

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> desconhecido

<220><223> oligonucleotídeo de DNA anti-senso DCLex2A<400> 17

gctgggcagg ccattcacac 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> desconhecido

<220><223> oligonucleotídeo de DNA anti-senso hu-DCLex2A

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> desconhecido

<220><223> oligonucleotídeo de DNA anti-senso DCLex2B<400> 19

cttctcggag ctgagtgtct 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> desconhecido

<220><223> oligonucleotídeo de DNA anti-senso hu-DCLex2B

<400> 16

cuucucggag cugagcgucu

20

<4 00> 18

gctcggcagg ccgttcaccc

20

<400> 20

cttctcggag ctgagcgtct

20

Claims (12)

1. Uso de um fragmento de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1ou 2, ou de uma variante de SEQ ID NO: 1 ou 2, o citado fragmento de ácidonucleico sendo capaz de causar uma redução significativa da quantidade deproteína-DCL de SEQ ID NO: 3 ou 4, caracterizado pelo fato de ser para apreparação de uma composição para o tratamento de câncer.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o citado câncer é de origem neuroectodermal.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de ser para o tratamento de neuroblastoma, meduloblastoma,glioblastoma, oligodendroglioma, oligoastrocitoma, astrocitoma,neurofibroma, ependimoma, MPNST (tumores malignos de bainha de nervoperiférico), ganglioneuroma, Schwannoma, rabdomiossarcoma,retinoblastoma, carcinoma pulmonar de célula pequena, feocromocitomaadrenal, PNET primitivo (tumor neuroectodermal periférico), sarcoma deEwing e melanoma.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3,caracterizado pelo fato de que o fragmento de ácido nucleico é selecionado deoligonucleotídeo de RNA de anti-senso, um oligonucleotídeo de DNA deanti-senso e/ou um RNA interferente pequeno de fita dupla.

5. Fragmento de ácido nucleico de senso e/ou anti-senso deSEQ ID NO: 1 ou 2, ou de uma variante de SEQ ID NO: 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que o citado fragmento de ácido nucleico é capaz de causar umaredução significativa da quantidade de proteína-DCL de SEQ ID NO: 3 ou 4quando introduzido em células de câncer de origem neuroectodermal.

6. Composição, caracterizada pelo fato de compreender um oumais fragmentos de ácido nucleico como definido na reivindicação 4 e umveículo fisiologicamente aceitável.

7. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de adicionalmentecompreender um ou mais compostos de alvejamento, na qual os citadoscompostos de alvejamento são capazes de alvejar células de câncer de origemneuroectodermal in vivo ou in vitro.

8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizadapelo fato de que o composto de alvejamento é um imunolipossomo ou umanticorpo monoclonal.

9. Composição de acordo com as reivindicações 6-8,caracterizada pelo fato de que a citada composição é adequada paratratamento de cânceres de origem neuroectodermal.

10. Proteína, caracterizado pelo fato de ser proteína tipocortina dupla de camundongo de SEQ ID NO: 3 e proteína tipo cortina duplade humano de SEQ ID NO: 4.

11. Método para diagnosticar cânceres de origemneuroectodermal, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de a)analisar uma amostra de soro sangüíneo ou uma amostra de biopsia de umindivíduo para a presença ou ausência de SEQ ID NO: 2 RNA ou DNA e/oupara a presença ou ausência de proteína DCL de SEQ ID NO: 4 e b)opcionalmente quantificar a quantidade de SEQ ID NO: 2 e/ou SEQ ID NO: 4presente na amostra.

12. Kit diagnóstico, caracterizado pelo fato de compreenderiniciadores, sondas e/ou anticorpos capazes de detectar a presença de SEQ IDNO: 2 e/ou SEQ ID NO: 4 em uma amostra, reagentes de detecção adicionaisrequeridos, e instruções para uso.