BRPI0707440A2 - produto alimentìcio compreendendo uma protease especìfica de prolina, sua preparação e seu uso para a degradação de peptìdeos de glúten alergêncios ou tóxicos - Google Patents
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Abstract
PRODUTO ALIMENTìCIO COMPREENDENDO UMA PROTEASE ESPECìFICA DE PROLINA, SUA PREPARAçáO E SEU USO PARA A DEGRADAçãO DE PEPTIDEOS DE GLUTEN ALERGENICOS OU TóXICOS A presente invenção refere-se a um produto alimentício pasteurizado apresentando uma atividade de água de pelo menos 0,80, preferencialmente, de pelo menos 0,85 e contendo uma protease específica da prolina.
Description
PRODUTO ALIMENTÍCIO COMPREENDENDO UMA PROTEASE ESPECÍFICADE PROLINA, SUA PREPARAÇÃO E SEU USO PARA A DEGRADAÇÃO DEPEPTÍDEOS DE GLÚTEN ALERGÊNICOS OU TÓXICOS
Campo da Invenção
A invenção refere-se a um produto alimentíciocompreendendo uma protease específica de prolina, suapreparação e sua utilização para a degradação de peptídeosde glúten alergênicos ou tóxicos.
Antecedentes Técnicos
Sabe-se que a ingestão de glúten, uma proteína de usohabitual presente no trigo, farelo, centeio, espelta e grãode trigo, provocam doenças em alguns indivíduos. 0 glúten éuma complexa mistura de gliadinas e gluteninas ricas emglutamina e prolina, que se pensa serem as responsáveispara a indução de um número de doenças. Dada a suascomposições de aminoácidos, partes específicas dessesglútens resistem a degradação proteolítica no tratogastrointestinal humano. Como resultado, peptídeos ricos emprolina podem se acumular e levar a efeitos indesejáveis,tais como intolerância a uma variedade de tais peptídeosderivadas do glúten. Por exemplo, foram descritas asseqüências de aminoácidos dos peptídeos responsáveis pelograu de toxicidade observado em pacientes sofrendo dedoença celíaca (Arentζ-Hansen e colaboradores, J.Exp.Med.2000;6:337-342; Vader e colaboradores, Gastroenterology20002;122:1729-1737).
A doença celíaca é uma doença auto-imune amplamentedistribuída do intestino pequeno. Entre os pacientes docelíaco prevalece em grau elevado várias doenças auto-imunes, especialmente diabetes do tipo I, herpetiforme dadermatite, tiróide auto-imune, doenças do colágeno,alopecia auto-imune e hepatite auto-imune, entre asobservadas. A doença celíaca é ocasionalmente realizadatambém por sintomas neurológicos e psiquiátricos ilustrandoas conseqüências de longo alcance de um metabolismopertubado que os peptídeos ricos em prolina podem trazer.
Até o momento uma dieta livre de glúten por todotempo pode efetivamente prevenir os sintomas clínicos empacientes com doenças celíacas. Infelizmente, para essespacientes, o glúten é uma proteína barata compossibilidades de aplicações interessantes de modo que éutilizada em uma ampla variedade de produtos alimentíciosincluindo sopas comerciais, molhos de soja, molhos emgeral, sorvetes, batatas fritas e cachorros quentes. Ospacientes que não toleram o glúten necessitam de listasdetalhadas dos produtos alimentícios para prevenirem-sequanto a ingestão das problemáticas moléculas de glúten.Após o que, a ingestão de quantidades de glúten tão baixasquanto 5 0 mg por dia, podem induzir o retorno dos sintomasclínicos.
Atualmente, compreende-se que os problemáticospeptídeos ricos em prolina presentes no glúten sãoaltamente resistentes a dissoluções por peptidasesgástricos e pancreáticos tais como a pepsina,tripisina,quimotripsina e similares. Somente enzimasespecíficas que possam hidrolizar as aglutinações depeptídeos envolvendo a prolina, são capazes de prolongadahidrolização de seqüências ricas em prolina destruindoassim os principais epítopos na doença celíaca. Ocorremrelatos de várias enzimas como tendo uso benéfico nadesativação dos peptídeos ricos em prolinas tóxicas, taiscomo os oligopeptidases da prolila (EC 3.4.21.26;Shan ecol. Science 297, pg 2275-2279) e peptídeose de dipeptidilaIV (EC3.4.14.5;US-A-2002/0041871). Ainda, um número depedidos de patente tem sido publicados mencionando aspossíveis implicações das proteases específicas de prolinana queda da antigenicidade dos produtos alimentícioscontendo glúten, como se vê em WO-A-2002/45523, bem como autilização de tais enzimas na prevenção dos sintomasclínicos das doenças celíacas e similares, como, porexemplo em, WO 03068170 e WO 2005/027953. Muitorecentemente, a validez da terapia da enzima no tratamentode pacientes do celíaco foi demonstrada pela utilização deextratos duodenais (Cornell e col., Scandinavian Journal ofGastroenterology, 2 005;40:1304-1312).
0 documento WO-A-2002/45523 especifica umaendoprotease específica de prolina para uso na proteolisedos polipeptídeos, incluindo peptídeos ricos em prolina.Ele descreve a incorporação da endoprotease nos produtosalimentícios protéticos eliminando o amargor ou reduzindo aalerginicidade dos mesmos. Deve-se reconhecer no documentoWO-A-20 05/02 7 953 que esta endoprotease particular éidealmente adequado como um suplemento dietético suportandoo processo de digestão do glúten dietético, uma vez queexibe um amplo pH otimizado que possibilita a enzima a serativa na boca, no esôfago, no estômago e continuar na suaatividade no duodeno.
0 documento WO-A-2005/027953 objetiva a remoção dospeptídeos tóxicas ricas em prolina do alimento antes doconsumo, prevenindo ou minimizando a exposição do corpojunto os peptídeos tóxicas ricas em prolina. Tambémdescreve o uso de formulações de enzima estabilizada comoum auxiliar digestivo. Nesta abordagem a enzima é consumidaem conjunto com o produto alimentício de modo a degradar asseqüências de proteínas ricas em glutamina e/ou ricas emprolina do produto alimentício durante a passagem do tratogastrointestinal. Contudo, de acordo com o documento WO-A-2005/027953, a formulação da enzima pode ser incluídasomente nos produtos alimentícios ricos em glutamina e/ouricos em prolina apresentando um teor líquido abaixo de0,85 para manter as enzimas suficientemente ativas. No casodo produto alimentício ser estocado por períodos maiores, ocontato com a umidade ou o ar úmido deve ser evitado,sugerindo-se assim o uso de produtos desidratados. Essacondição impõe restrições no número de escolhas de produtosalimentícios que podem ser combinados com o endoprotease.
A utilização de formulações da enzima em produtosalimentícios contendo líquido tais como a margarina oudispersões similares em regra é de amplo conhecimento noramo. Contudo, na maioria dos casos as enzimas sãoadicionadas como auxiliares de processamento e umaatividade enzimática prolongada não é desejável, ou seja,não se deseja uma atividade que prossiga após oempacotamento do produto, Por exemplo, o documento DE-A-10104945 descreve dispersões com baixo teor de gorduracontendo fosfolipídeos e enzimas, por exemplo otransglutaminase, sem a utilização de emulsificadores ouauxiliares de estabilização. Após um breve período deincumbação durante a fase de produção do produto, otransglutaminase é desativado pelo aquecimento a 95°C por 23 minutos.
0 documento WO-A-95/28092 volta-se para a utilizaçãode auxiliares de estabilização, tais como pólióis, para aestabilização de emulsões água-em-óleo adequadas paraprodutos, aonde as emulsões compreendem um compostotermicamente instável, tal como uma enzima. Em contrárioaos dois pedidos mencionados acima, o documento WO-A-95/28092 objetiva uma estabilização a longo prazo dasatividades enzimáticas. Para esta finalidade, sãoexemplificadas quantidades de 40 e 50% de glicerol na faselíquida. Contudo, a inclusão de tais quantidades elevadasde polióis nos produtos alimentícios ou não é permitida oué organolepticamente inaceitável.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Descobriu-se agora que as proteases específicas deprolina podem ser utilizadas como um ingrediente nosprodutos alimentícios exibindo uma elevada atividade deágua e não apresentando estabilizadores de enzima em altasdoses. Tais produtos podem até mesmo ser pasteurizados paragarantia adequada de estabilidade em prateleira sem perdasdramáticas da atividade relevante da enzima. No pedidopresente, demonstra-se que em produtos alimentícios taiscomo recheios em sanduíches, coberturas, codimentos,molhos, vários tipos de bebidas e emulsões tais comodispersões com pouca gordura, as proteases específicas daprolina permanecem suficientemente ativos para atingiremuma hidrólise gástrica adequada de seqüências de glútenricas em prolina. Em geral, o sabor do produto alimentícionão é afetado ou alterado pela presença da enzima.
0 fato que a enzima resiste ao tratamento depasteurização é surpreendente, uma vez que se acredita naárea técnica que sob condições de uma alta atividade deágua a maior parte das enzimas não consiga sobreviver àscondições de pasteurização. Similarmente, espera-se que amaior parte das enzimas se torne inativa dentro de umasemana caso estocadas em produtos apresentando um alto teorliquido. Por conseguinte, é da mesma forma surpreendenteque de acordo com a invenção, a enzima mantenha-se ematividade durante períodos até de um ano, caso o produtoalimentício apresentando um alto teor líquido seja estocadosob condições de refrigeração. Sob condições derefrigeração entende-se temperaturas abaixo de IO0C,preferencialmente entre 0 e 10° C, mais preferencialmenteentre 2 e 8°C.
A invenção refere-se assim a produtos alimentíciospasteurizados e estabilizados em prateleiras apresentandouma atividade de água de pelo menos 0,80, preferencialmentede pelo menos 0,85 e contendo uma atividade proteolíticaespecífica de prolina que seja alta o bastante paradesintoxicar as seqüências de proteína rica em prolina. Asquantidades tóxicas das seqüências de proteína rica emprolina são consideradas como estando presentes emquantidades de glúten maiores do que 1 mg.
De acordo com um outro aspecto da invenção, descreve-se um produto alimentício estabilizado em prateleiraapresentando um teor líquido de pelo menos 0,80,preferencialmente de pelo menos 0,85 e contendo umaatividade proteolítica específica de prolina que seja capazde desintoxicar as seqüências de proteína ricas em prolina,aonde o produto alimentício compreende menos do que l%p/pde proteína ou peptídeos, e preferencialmente o produtoalimentício esteja isento de glúten.
A presente invenção refere-se também à proteaseespecífica de prolina estéril. Por estéril quer-sesignificar isento de microorganismos, preferencialmenteisento também de esporos microbióticos. A proteaseespecífica de prolina é preferencialmente filtrado isentode microorganismos, preferencialmente também isento deesporos microbióticos.
As proteínas de cereais podem ser subdivididas emalbuminas, globulinas, prolaminas e glutelinas. O glúten éa fração de proteína insolúvel em água dos cereais como otrigo, centeio, espelta, aveia, cevada, milho e arroz quepermanecem após a lavagem para remoção dos componenteslíquidos e o amido. Podem ser subdivididos em gliadinas egluteninas. As gluteninas podem ser subdividiads emsubunidades de baixo e alto peso molecular. Para umadiscussão adicional das proteínas do glúten, veja WheatGlúten(P.R. Shewry e A.S. Tatham eds. Cambridge; RoyalSociety of Chemistry, 2000) ou a revisão por Wieser (1996)Acta Paediatr.,Suppl. 412:3-9.
De acordo com esquemas reconhecidosinternacionalmente para a classificação e nomenclatura detodas as enzimas a partir dos IUMB, oligopeptidases,dipeptidilpeptidaseses e endoproteases, seriam todasaquelas enzimas que hidrolizam as aglutinações de peptídeosinternas, que estejam então divididas em sub-classes combase em seus mecanismos catalíticos. A protease específicada prolina preferido para a finalidade desta invenção éestável ao ácido e a endoprotease estável à pepsina apartir da Anopheles niger conforme descrito no documentoWO-A- 02/45524 e documento W0-A-2005/027953, capaz departir peptídeos e manter intactas proteínas no ladocarboxílico dos resíduos de prolina e capaz de partirpeptídeos e manter intactas proteínas sob muito baixascondições de pH e em presença da pepsina. Este endoproteasesobrevive diante da presença da pepsina da enzima sobcondições ácidas e provavelmente prossegue sua atividadeatravés do duodeno. A endoprotease mais preferida é umaendoprotease específica de prolina derivado a partir de umfungo de teor alimentar Aspergillus ou uma endoproteaseespecífica de prolina pertencendo a família S28 dasproteases da serina.
A atividade de água é de avaliabilidade relativa daágua em uma substância. Definida na técnica como pressão devapor da água dividida pela água pura à mesma temperatura.Portanto, a água pura destilada apresenta uma atividade deágua de exatamente um. A atividade da água é diferente noteor de umidade (% em água) em um produto alimentício. 0teor de umidade é a umidade total, ou seja, a quantidade deaglutinação mais a água livre presente na amostra, aonde aatividade de água somente proporciona uma medida da umidadelivre e, normalmente, é expressa como aw ou um percentualdenominado Umidade Relativa de Equilíbrio (% ERH). Aatividade de água de um produto alimentício é a umidaderelativa constante do ar na vizinhança direta do produtoalimentício quando o equilíbrio entre o produto alimentícioe o ar em volta é estabelecido. Esta umidade relativaconstante é então denominada "% ERH», caso seja expressa empercentagens (0 a 100%), ou "atividade de água» caso sejaexpressa em valores entre 0 e 1,0. Métodos paradeterminações da atividade de água são detalhados nosmétodos oficiais de análise Método 978,18, AOACInternational (1995).
Por tratamento térmico, no pedido atual, quer-sesignificar um tratamento térmico de pelo menos 65°C,preferencialmente 70°C, e por pelo menos 2 segundos,preferencialmente por pelo menos 20 segundos. Um exemplo detal tratamento térmico é uma pasteurização conformeaplicada ao leite, ou seja, aquecimento a 72°C por 15segundos. A pasteurização compreende um conceito doconhecimento técnico. 0 produto alimentício resultante é umproduto alimentício livre de micróbios apresentando umavida melhorada na prateleira.
Por produto alimentício quer-se significar um produtoou ingrediente alimentício que esteja voltado ao consumosem tratamentos térmicos anteriores tais como, na gordura,fritura, ou cozimento.
Compreende-se que um produto alimentar apresentandouma vida estendida ou melhorada na prateleira tenha umavida de pelo menos uma semana até um ano ou mais, durante oque são garantidas as propriedades organolepticais bem comoa segurança quanto a micróbios do produto. Obviamente, aduração do tempo de vida na prateleira depende fortementedas condições presentes de estocagem do produto alimentar.Muitos produtos alimentícios perecíveis tem de serestocados frescos de forma a maximizarem as suas vidas nasprateleiras.
Caso sejam utilizados auxiliares de estabilização noproduto alimentício da invenção, em particular polióis,tais como, glicerol, sorbitol, sacarose, polipropileno deglicol, trehalose, maltodextrinas, lactose e glicose, cujasquantidades se apresentam em regra menores do que 10% empeso, preferencialmente menores do que 5% em peso doproduto alimentício.
Preferencialmente, o produto alimentício de acordocom a invenção contém menos do que 1% em peso de caseína,mais preferencialmente, o produto alimentício de acordo coma invenção não contém caseína.
A absorção de proteases específicas de prolina naforma de uma pílula ou um tablete possibilita a um pacientesem toleração ao glúten consumir tais produtos alimentícioscontendo glúten, com segurança. Contudo, descobriu-se agoraque a protease pode também convenientemente ser incorporadanos produtos alimentícios que, por sua vez, podem nãoconter qualquer glúten ou então baixas quantidades deglúten, aonde tais produtos alimentícios são habitualmentecombinados com alimentos contendo glúten. Maispreferencialmente, os produtos alimentícios de acordo com ainvenção contendo endoprotease são ingredientes alimentaresque são considerados, na técnica, como "isentos de glúten".De acordo com o Código Padrão para alimentos isentos deGlúten ("Codex Standard for Glúten-Free Foods"(Codex Stan118-198)) do Código alimentar (Codex alimentarius), o teorde nitrogênio dos ingredientes alimentares derivados doscereais contendo glúten podem não exceder 0,05 g (50 mg)por 100 g de produto em uma base desidratada, quando sãoutilizados em um alimento isento de glúten.
De acordo com a presente invenção descreve-se umproduto alimentar que compreenda uma atividade proteolíticaespecífica de prolina mais elevada do que 0,5 PPU porserviço, ou seja, a atividade enzimática presente em umserviço pode hidrolisar 25 mg de glúten. Um serviço é aquantidade de alimento consumido durante uma refeição,normalmente dentro do intervalo de uma hora,preferencialmente dentro de 40 minutos.
Os produtos alimentícios preferidos como condutorespara proteases específicas da prolina são aqueles produtosalimentícios que são estocados refrigerados. Prefere-seespecialmente que o protease contendo o produto alimentarseja um codimento, ou seja um alimento que seja usado paraacentuar o sabor de outros alimentos, especialmentealimentos contendo glúten. Codimentos apresentam a vantagemde estarem presentes na casa, nos jantares e nosrestaurantes e supermercados, de forma abundante, etipicamente, apresentam uma vida de prateleira prolongada.Os exemplos preferidos de codimentos são molho de tomate ouketchup de tomate. Tais produtos apresentam, um pHtipicamente abaixo de 4,2, mais preferencialmente, abaixode 4,0, o que implica que eles necessitam de somente umtratamento de pasteurização limitado. Exemplos de outrosprodutos ácidos requerendo tratamentos de pasteurizaçãolimitados e que são perfeitamente adequados como condutoresa uma proteasa específica de prolina são sucos de fruta econcentrados de fruta. De fato, mesmo água engarrafadacarbonatada ou com acidez apresentar-se-á como excelentecondutor para a enzima. "Avulsos" como concentrados defrutas e vegetais também se incluem nesta categoria. Damesma forma produtos ácidos contendo um preservativoalimentar tal como o benzoato ou o sorbato presenteexcelentes condutores para a enzima. Por exemplo,coberturas ou recheios de sanduíches tipicamente consumidosem combinação com o alimento contendo glúten tal como, pão,apresentando valores de atividade de água acima de 0,85.
Também produtos muito ácidos que não necessitem depasteurização, tal como a Coca-Cola, se apresentam comoexcelentes condutores, uma vez que o protease específico daprolina é destacadamente estável sob essas condições. Aindamais, a enzima é bastante compatível com as preparaçõescontendo altas concentrações de probióticos viáveis.Normalmente, tais produtos probióticos apresentam umaatividade de água maior do que 0,95 e são estabilizados porum pH menor do que 4,0.
Adicionalmente, a invenção refere-se a um processopara a preparação de um produto alimentício contendo aformulação da enzima da invenção, em que uma proteaseespecífica de prolina é adicionado ao produto alimentícioapós o produto alimentício ter sido sujeito a um tratamentode pasteurização. Nesta abordagem, a enzima pode seradicionada estéril a um produto já pasteurizado. Um exemplode uma tecnologia de viabilização para tal abordagem é atecnologia de dosagem aséptica como é o caso comercializadopela TetraPak (Tetra Aldose TM S; veja, por exp.,http://www.tetrapak-processincr.de/produkte/pdf/aldose.pdf).
Ainda uma outra modalidade da invenção é a emulsãoágua-em-óleo ou óleo-em-água, uma dispersão,preferencialmente, uma margarina ou um expansor com poucagordura. As dispersões com baixo teor de gordura amplamenteutilizados destinados para consumo juntamente com produtosalimentícios contendo glúten são, excepcionalmente,adequados como condutores para o auxílio digestivoenzimático. 0 elevado teor de água desses produtos permitea inclusão de grandes quantidades de enzima e o produto étipicamente armazenado em condições refrigeradas,convencionalmente a temperaturas de 7°C ou maisbaixas.Devido a enzima estar confinada á fase líquida, taisemulsões se incluem na categoria de produtos apresentandouma atividade de água de pelo menos 0,85.
Outras vantagens importantes desta modalidade dainvenção é que o pão e a dispersão são bem misturados naboca, dando início assim a degradação das moléculas doglúten pela protease específico de prolina. Além do mais, apresença de compostos gordurosos é sabida inibir oesvaziamento gástrico por um mecanismo orosensorial. Ambosos mecanismos resultam em períodos de interação mais longose mais intensos entre a enzima e o glúten de modo que aenzima e o glúten possam interagir de forma máxima antes dosuco gástrico alcançar o duodeno. Isto é importante uma vezque é sabido que o duodeno é a parte ascendente de maiorimportância do trato gastrointestinal que pode provocarreações patogênicas das moléculas da prolina ricas emglúten. Descobriu-se que o protease específico da prolina,em particular a endoprotease específica de prolina estávela acidez de A. niger de acordo com o documento WO-A-2002/45523, apresenta uma larga faixa otimizada de pH quepossibilita-o a ser ativo na boca, no esôfago, no estômagoe no duodeno. É bastante insólito o fato da endoproteaseespecífica de prolina exibir tais atividades residuaiselevadas caso incorporado em uma emulsão. Existe uma quasetotalidade de literatura concluindo que o contato comemulsificadores e a subseqüente incorporação nas emulsõesexerce uma tensão significativa nas enzimas e leva, comfacilidade a desativação das mesmas (veja, por exemplo,Gatorae e colaboradores em "Stability and Stabilisation ofEnzimes, Elsevier Sei.Publish. 1993, pg. 329 or De Roos andWalstra, Colloids and Interfaces B; Biointerfaces 6(1996)201-208). Então, uma enzima especialmente adequadapara esta invenção é:
uma enzima apresentando uma atividade endoproteaseespecífica de prolina e
apresentando uma seqüência de aminoácido idêntica aSEQ ID NO: 2 de WO 2002/45523 ou apresentando uma seqüênciade aminoácido que compreenda pelo menos 80%,preferencialmente pelo menos 90% da identidade de seqüênciade aminoácido com aminoácidos de 1 a 526 da SEQ ID NO:2 deWO 2002/45523. 0 nível de identidade entre as seqüênciasaminoácidos é determinada pelo método mencionado em WO2002/45523, página 15.
A formulação da enzima de acordo com a invenção podeser incorporada no produto alimentício em uma quantidade
que corresponda com a quantidade total de proteína a ser
digerida. Por exemplo, uma dispersão com baixo teor de
gordura é aplicado, tipicamente, em uma fatia de pão.
Aplica-se em uma fatia de pão de 18 gramas, tipicamente 5
gramas de dispersão. 0 pão contém, tipicamente 8% de
proteína, das quais 7% é glúten, ou seja uma fatia de pão
contém 1,5 grama de proteína. Para se chegar a hidrólise
adequada durante a digestão gastrointestinal com todas as
proteínas presentes, ou seja, incluindo-se a fração de
glúten e utilizando-se a enzima descrita em WO 2002/45523,aproximadamente 2 0 PPU por grama de proteína presente deve-se fazer necessário (veja a seção Materials & Methods, paraentender as definições). Portanto, a digestão de 1,5 gramade proteína necessita de uma vez e meia o tempocorrespondendo a 20 PPU para com 3 0 PPU. Esses 3 0 PPU temde ser fornecidos através das 5 gramas de dispersão combaixo teor de gordura que implica em uma atividadeenzimática de 6000 PPU/kg da dispersão com baixo teor degordura. A inclusão da formulação de enzima de acordo com ainvenção dificilmente afeta o preparo e as propriedades deuma dispersão com baixo teor de gordura. Contudo, para seevitar o efeito da amargura que freqüentemente se relata emreferência aos produtos do leite mediante tratamento comenzimas apresentando atividades proteolíticas, a dispersãode acordo com a invenção é, preferencialmente, desprovidode proteínas hidrofóbicas, tais como as caseínas. Assim, osabor da dispersão pode ser melhorado pela inclusão de umaproteína de soro de leite fermentada proporcionando o saborde uma manteiga típica. Encontra-se que as proteínasresiduais conforme presentes no soro de leite fermentadosão hidrolisadas pela enzima específica da prolina, masisto não traz nenhum efeito organoleptico negativo. Aprotease específica da prolina é, preferencialmente,adicionado estéril após a pasteurização da fase líquida,mas antes da formação da emulsão. Existem vários métodospara uma eficiente produção de dispersões de baixasgorduras. De acordo com um método, a fase oleosa, contendoemulsificantes, aromas, vitaminas e cores, é mantidamoderadamente aquecida e levemente agitada de forma a nãoafetar de maneira prejudicial a qualidade do óleo. A faselíquida e a fase oleosa são então misturadas e alimentadasno Votator. Descrições mais detalhadas do preparo dasemulsões podem ser encontradas na literatura, Moustafaem:Praticai handbook of Soybean Processing and Utilization;
David R.Erickson - editor; uma publicação conjunta da AOCSPress and United Soybean Board. Atualmente, dispersõesincorporando compostos promovendo a saúde tais como ácidosaraquidônicos ou fitoesteróis usufruem de grandepopularidade. Devido a que esses compostos são solúveis emóleo, a estabilidade da enzima na fase líquida não éafetada por tais compostos.
Assim, a invenção refere-se a um processo para apreparação de um produto alimentício contendo a formulaçãode enzima da invenção, aonde uma protease específica daprolina é adicionada junto ao produto alimentício tantoantes ou após se submeter o produto alimentício apasteurização.
A princípio, outras enzimas que sejam capazes dehidrolisação das aglutinações de peptídeo envolvendo resíduos da prolina, como o oligopeptídeose prolila (EC3.4.21.26) ou o peptídeose IV de dipeptidila (DPP IV, EC3.4.14.5) ou peptídeose II de dipeptidila (DPP II, EC3.4.14.2) poderiam ser igualmente aplicados. Essasproteases tem sido listadas por Augustyns e col. (CurrentMedicinal Chemistry, 2005, 12, 971-998). Contudo, de formaa que a protease específica da prolina seja adequada comoum auxiliar digestivo em um produto alimentar, tanto umalimento contendo glúten ou um produto alimentar voltadopara uso em combinação com alimentos contendo glúten, aprotease específica da prolina deve: i) exibir um pH ótimoque possibilite uma atividade adequada sob valores de pHácido prevalecendo no estômago, preferencialmente abaixo depH 5 ; ii) sobreviver a presença da pepsina e a enzimaproteolítica gastrointestinal sob essas condições deacidez; iii) permanecer ativo em um ambiente contendo águapor pelo menos o tempo de vida na prateleira do produtoalimentar. Além do mais, é possível se incluir uma co-enzima para se obter uma sinergia em sentido a hidrólisedas proteínas de glúten. Obviamente, a co-enzima tem desatisfazer os mesmos requisitos de estabilidade da enzimaespecífica da prolina no produto alimentício. A invençãorefere-se também ao uso da protease específica de prolinapara uso como um auxiliar digestivo na fabricação de umproduto alimentar pasteurizado apresentando uma atividadede água de pelo menos 0,85 conforme descrito acima, paraprevenção dos sintomas clínicos da doença celíaca oudesordens relacionadas com o mesmo. Preferencialmente, oproduto alimentício destina-se ao consumo em combinação como produto alimentício contendo glúten.
A doença celíaca é causada por uma intolerância acertos peptídeos ricos em prolina e glutamina. A degradaçãoincompleta dessos peptídeos contribui para odesenvolvimento e para o agravamento da doença celíaca. Adoença celíaca é ocasionalmente realizada por sintomas25 neurológicos e psiquiátricos. Já em 1979 Panksepp (Trendsin Neuroscience 1979:174-177) propôs a teoria do excessoopióide aonde se sugere que um metabolismo opióide afetadoé parte da patogenia no altismo. Daí que, um produtoalimentar contendo a endoprotease da invenção pode serutilizado também por pacientes sofrendo de desordenspsquiátricas incluindo o altismo, a esquizofrenia, o ADHD,as desordens bipolares e a depressão, que estão todosrelacionados com o consumo de proteínas dietéticas ricas emprolina. Outras desordens relacionadas com a doença celíacacompreendem as desordens auto-imunes, especialmente adiabetes do tipo I, a herpetiforme da dermatite, câncer dointestino, limfomas intestinais não-Hodgkin, tiroiditesauto-imunes, doenças do colágeno, hepatite auto-imune ealopecia auto-imune. Ainda, a Sindrome da IrritabilidadeBowel (IBS) tem sido relacionada com as seqüências deproteína rica em prolina de difícil digestão. Os pacientesque podem se beneficiar da presente invenção podem sofrerde qualquer uma das desordens mencionadas acima. Taispacientes podem ser de qualquer idade, incluindo-se adultose crianças. As crianças, em particular, se beneficiam dosbenefícios profiláticos, uma vez que a prevenção daexposição prematura junto os peptídeos tóxicas do glútenpodem impedir o desenvolvimento inicial da doença. Ainclusão da formulação de endoprotease específica deprolina é, especialmente vantajosa para esta categoria depacientes, devido a popularidade dos codimentos,particularmente da maionese e do ketchup, neste grupo. Ascrianças elegíveis a profilaxia podem ser identificadas portestes genéticos quanto a pré-disposição, por exemplo, Porteste HLA, histórico familiar, por ensaios com a célula T,ou por outros mecanismos médicos.
LEGENDAS DAS FIGURAS
A figura 1: níveis das epítopos de estimulação dacélula T recuperados do "estômago" sem a endoproteaseespecífica de prolina. As condições conforme explicadas noExemplo 3. "Alfa" se refere ao nível reativo das moléculasalfa-gliadinas, "gama" refere-se ao nível reativo dasmoléculas gama-gliadinas, "HMW" refere-se ao nível reativodas gluteninas-HMW e "LMW" em relação ao nível reativo dasgluteninas-LMW.
A figura 2; níveis das epítopos de estimulação dacélula T recuperados a partir do "estômago" contendo aendoprotease específica de prolina. As condições conformeexplicado no Exemplo 3. Veja a legenda da figura 1 para aexplicação de "alfa', "gama", "HMW" e "LMW".
A figura 3: níveis dos péletes recuperadas dasepítopos de estimulação da célula T a partir do "estômago"com e sem a endoprotease específica de prolina adicionado etestado em um Western blot tratado com anti alfa-gliadina.As condições conforme explicado no Exemplo 3.
A figura 4: percentagem de atividade enzimáticaresidual na fase líquida após a fusão de um expansor combaixo teor de gordura a 53°C, adicionando-se a endoproteaseespecífica de prolina junto a fase líquida e agitando amistura de água/gordura por 10, 70 e 100 minutos a 530C. Ascondições são conforme explicado no Exemplo 4.
A figura 5: Estabilidade de prateleira da endoproteaseespecífica de prolina na fase aquosa de um expansor combaixo teor de gordura mantido a várias temperaturas. Ascondições conforme explicado no Exemplo 5.
MATERIAIS E MÉTODOSTestes de atividade da enzima
A atividade de endoprotease específica de prolina A. nigerfoi testada utilizando-se o CBZ-Gly-Pro-pNA(Bachem,Budenfdorf, Switser land) na forma de umsubstrato a 37°C em um tampão de fosfato citrato/disódio pH4,6. Os produtos da reação foram monitoradosespectrofotometricamente a 4 05 nM. 0 aumento na absortânciaa 405 nm no tempo é uma medida para a atividade enzimática.
Uma Unidade de Protease da Prolina(PPU) é definida como aquantidade de enzimas que liberam 1 μτηοΐ de p-nitroanilidapor minuto sob as condições especificadas e junto a umaconcentração de substrato de 0,37 mM Z-Gly-Pro_pNA.
Detecção da quantidade de epítopos estimulatórios dacélula T
A concentração de epítopos estimulatórios da célula Ttanto das gluteninas e gliadina nas frações solúveis dadinâmica gastrointestinal foi determinada utilizando-seensaios de competição com base nos anticorpos monoclonais(mAB). Para esta finalidade as amostras foram diluídas emum tampão contendo50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH 7,0, 150 mMNaCl, 0,1 % Tween-29 e um coquetel inibidor do protease(Complete, Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Alemanha). Osensaios foram realizados em duplas conforme anteriormentedescrito (Spaenij-Dekking e col., (2004) Gut 53, 1267-1273).
Análise da proteína por ID SDS-PAGE e Western blot
Para determinar-se o nível das epítopos estimulatóriasda célula T presentes nas frações sólidas (precipitados)das diferentes amostras da dinâmica gastrointestinal nomodelo in vitro, foram realizados experimentos ID SDS-PAGE.As frações sólidas foram solubilizadas no tampão de amostrade proteína 6x (60% glicerol, 300 mM Tris (pH 6,8), 12 mMEDTA pH 8,0, 12% SDS, 2-mercaptoetanol 864 mM, 0,05% azulde bromofenol) e corridas em um gel a 12,5% SDS-PAGE. Asproteínas foram visualizadas tanto diretamente utilizando-se Corante de Proteína Imperial (Pierce, Rockford IL, USA),ou após o Western blot para membranas PVDF com os mAbsespecíficos para epítopos estimulatórias da célula T apartir da a- e γ-gliadinas (Spaenij-Dekking e col., (2004)Gut 53, 1267-1273) e HMW e LMW-gluteninas (Spaenij-Dekkinge col., Gastroenterology 2005; 797-806).Ensaio de competição com base em anticorpo
Para a geração de um ensaio com base em anticorpo,foram criados anticorpos monoclonais no camundongo Balb Ccontra uma alfa-, gama-gliadina estimulatória de Célula Tconhecida e um peptídeo de glutenina LMW. Após a fusão dobaço do camundongo com uma linhagem de célula de mieloma decamundongo, foram obtidas hibridomas produtoras deanticorpos. Estas foram clonadas por diluição de limitaçãoe os mAbs secretados por estas células foram testados paraseu uso em um ensaio de competição mAb. Para cada uma dasespecifieidades foram selecionados um ou dois mAb adequadose os epítopos reconhecidos pela mAb diferenciada foramdeterminados (Tabela 1).
Especificidade Epítopo da célula t Epítopo do Anticorpoα-gliadina(a9) qlqpfpqpqlpy qpfpqpq(a20) pfrpqqpypqpqpq rpqqpypγ - gliadina qpqqpqqspfqqqrf qqrpfilmw glutenina qppfsqqqqspfsq qspfs ou ppfsqqhmw- glutenina gyyptspqqs
Com os mAbs ensaios de competição foram desenvolvidos,pelos quais epítopos estimulatórios de Célula T presentestanto em proteínas intactas quanto em peptídeos pequenos detamanhos a partir de 11 aminoácidos (o tamanho de umepítopo de Célula T) podem ser detectados quantativamente
em baixos níveis.
Em um ensaio de competição as diferentes diluições dasamostras foram misturadas com uma concentração fixa de umpeptídeo indicativa de bioestanhado (que codifica o epítopoda célula T) . Para a quantficação dos ensaios de gliadinauma curva padrão foi feita utilizando-se a referênciaeuropéia da gliadina IRMM-480 em uma faixa de concentraçãode 10 pg/ml - 10 ng/ml. 0 ensaio para a glutenina LMW foiquantificado utilizando-se um peptídeo sintéticocodificando o epítopo estimulatório da célula T em umafaixa de 1 pg/ml-lng/ml. Nos quais os ensaios para aglutenina HMW foram quantificados utilizando-se umadigestão de pepsina/tripsina de proteínas da glutenina HMWrecombinantes em uma faixa de 1 pg/ml- lng/ml. A presençade peptídeo bioestanhado de ligação de anticorpo foivisualizada com estreptavidina marcada.
Exemplo 1
Esterilização por filtro da endoprotease específica deprolina
A filtração apresenta uma opção preferida paraesterilização de enzimas. A solução da enzima a seresterilizada pode ser obtida após a purificaçãocromatográfica e a solução de enzima pode compreender um oumais solventes ou outros aditivos para ajustar a atividadeenzimática e para ainda estabilizar a enzima. Osestabilizadores adequados são, por exemplo, o sorbitol e oglicerol. Os solventes de glicerol podem ser adicionadosjunto a uma concentração de 10 a 70 %p/p, ou maispreferencialmente de 30 a 60 %p/p, da solução de enzima.
A esterilização por filtro pode ser realizada porbombeamento da solução de enzima através de um filtroestéril. Preferencialmente, a esterilização por filtro éconduzida por uma pré-filtração seguida de uma segundafiltração através de um filtro em cartucho 0,22 nm. Assim,a solução de enzima esterilizada pode ser adicionada, porum dispositivo de dosagem estéril, no recipiente deresguardo contendo um produto alimentício ou ingredientealimentar aquoso previamente pasteurizado ou esterilizado.0 produto ou ingrediente alimentar contendo a enzima podeser imediatamente empacotado. Caso a solução de enzimatenha sido incorporada em uma disperção de gordura ou depouca gordura, a solução de enzima esterilizada pode ser misturada com a fase aquosa pasteurizada que é entãoemulsifiçada com uma gordura ou um óleo a uma temperatura
elevada, apropriada.
Para se obter uma solução de enzima esterilizada parauso em uma escala laboratorial, uma solução de endoproteaseespecífica de prolina conforme obtido a partir de A. nigerfoi esterelizada por filtração, de acordo com orpocedimento a seguir. Uma seringa foi enchida com 1 mlconcentrado de enzima, e um filtro estéril, Millex GV 0,22μπι da Millipore com uma superfície de 4,91 cm2, foi posicionado no topo da seringa. Mediante aplicação depressão manual a solução de enzima foi impulsionada pelofiltro Millipore 0,22 μτη proporcionando uma soluçãoesterilizada com uma atividade enzimática correspondendocom a atividade da solução de enzima anterior a filtração estéril.Exemplo 2
A digestão do pão em uma dinâmica gastrointestinal nomodelo in vitro na ausência e na presença de umaendoprotease específica de prolina
A passagem da comida através do trato gastrointestinal
compreende um processo muito dinâmico que não pode sersimulado em modelos estáticos in vitro. 0 modelo in vitrodinâmico gastrointestinal conforme desenvolvido por TNO(Zeist, Noruega) é um modelo de digestão validado que simula em alto grau os processos dinâmicos sucessivos noestômago e no intestino delgado (Minekus e col., ATLA1995,23, 197-209; Larsson e col., J Sci Food Agic, 1997,74, 99-106). Os resultados obtidos nestes modelos temdemonstrado muita boa semelhança com os resultados obtidos por estudos em seres humanos e animais.
Para testar da digestão de pão branco na ausência e napresença de endoprotease específica de prolina derivado apartir de A. niger, conduziu-se um experimento neste modelogastrointestinal dinâmico. Estes experimentos foramrealizados sob as condições fisiológicas normais do tratogastrointestinal conforme descrito para jovens adultos apósa ingestão de um alimento semi-sólido. 0 pão foiprimeiramente "mastigado", ou seja, cuidadosamentemisturado com enzimas salivares durante 5 minutos e na ausência (referência) ou presença de endoproteaseespecífica de prolina a partir da A. niger. No experimentoatual, 7 0 gramas de pão branco (contendo 5 gramas deglúten) foi homogeneizado em conjunto com 11 ml de sucogástrico na ausência ou presença de endoprotease específicade prolina 100 PPU. Após a homogeneização de 25% da misturafoi adicionado ao sistema digestivo in vitro. Nocompartimento gástrico o pH foi diminuido gradualmenteatravés da secreção de ácido gástrico. As enzimas salivares"engolidas" (amilase) estavam imediatamente presentesenquanto que as enzimas gástricas (pepsina e lipasegástrica) foram gradualmente segregadas. A pepsina tornou-se ativa a um pH abaixo de 5,0. Durante duas horas e meia,os teores gástricos foram gradualmente liberados nointestino delgado pela "válvula pilórica". No compartimentodo duodeno o pH foi controlado a um pH 6,5 pela secreção debicarbonato. 0 suco pancreático contendo amilase, lipase eenzimas proteolíticas (por exemplo, tripsina equimotripsina) e bile foram gradualmente secretadas nocompartimento duodenal. Os produtos de secreção forammisturados através do alimento vindo do estômago por umamistura peristáltica e transferidos gradualmente aoscompartimentos do íleo e jejuno.
Após 4-5 horas, aproximadamente 8 0% do conteúdo dointestino delgado foi gradualmente liberado no "intestinogrosso" (garrafa de amostragem) por "válvula íleo-cecal".Os compostos digeridos foram dialisados de modo contínuo apartir dos compartimentos ileal e do jejuno do modelo porsistemas de membrana de fibra oca semipermeável. Asgarrafas de diálise foram trocadas a cada duas horas.
Durante a passagem das proteínas de glúten (e doalimento) através dos compartimentos do sistema dinâmico,pequenas amostras de aproximadamente 2 ml foram tomadas apartir dos compartimentos gástrico, duodenal e jejunal nosseguintes pontos de tempo: t= 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120,150, 180 e 240 minutos. Imediatamente após coleta, asamostras foram congeladas em gelo seco para interromper aatividade enzimática. Ao final de cada experimento, osresíduos nos vários compartimentos foram coletados em geloseco e estocados em dois tubos de 10 ml cada a umatemperatura de -20°C.
Exemplo 3
Teste de pão digerido in vitro para a presença de epítoposde glúten tóxicos
Dois tipos de reagentes estão disponíveis podendo ser usados para medição da presença de peptídeos de glúten emamostras alimentares: os clones de célula T que foramisolados a partir do intestino delgado de pacientes doentesdo celíaco e anticorpos monoclonais específicos para váriospeptídeos de glúten. Os clones de célula T respondem aos peptídeos do glúten quando estes estão ligados às moléculasHLA-DQ2 ou HLA-DQB pré-dispostas à doença. Essas respostasinflamatórias da célula T são acreditadas como sendo ofator primário da doença celíaca. Os clones de célula Tespecíficos para peptídeos em alfa, gama-gliadina, LMW- glutenina e HMW-glutenina estão disponíveis (ref. Wal vande, Y. e col., Eur. J. Immunol. 29, 3133-3139(1999) e Vadere col., Gastroenterology, 122: 1729-1737(2002)). Anticorposmonoclonais específicos para alfa-gliadina, gama-gliadinaestimulatória de célula T e peptídeos de gluteninas de Baixo Peso Molecular (LMW) e Alto Peso Molecular (HMW)estão também disponíveis e tem sido incorporados em umensaio de competição para a detecção desses peptídeos nasamostras alimentares (Spaenij-Dekking e col., Gut, 53:1267-1273(2004)).
As frações do estômago e duodeno coletadas nos pontostemporais t= 0, 15, 30, 45, 60, 90, e 120 minutos,preparadas com e sem adição de endoprotease específica deprolina, foram pré-tratadas de acordo com o protocoloadiante com o objetivo de inativar a endoproteaseespecífica de prolina. Primeiramente, o pH das amostras foielevados a 11-12 utilizando-se NaOH IM e então,imediatamente neutralizado utilizando-se HCL IM. Após umacentrifugação por 10 minutos a 14.000 rpm, os sobrenadantesbem como os péletes das várias amostras foram coletados eaquecidos por 10 minutos a 850C para interromper quaisqueratividades enzimáticas restantes. Foram preparadasdiluições de 1:40; 1:200; 1:1000 e 1:5000 em tampão defosfato 20 mM a pH7, NaCl 150 mM, 0,1 % Tween-20, misturainibidora de protease 2x sem EDTA, a partir dossobrenadantes. Essas diluições bem como as frações depéletes foram estocadas a -20°C até a medição no diaseguinte.
Após o degelo das amostras, as frações solúveis emágua das amostras foram testadas no ensaio de competiçãocom anticorpos monoclonais específicos para a alfa- e beta-gliadina e para as LMW- e HMW-gluteninas. Para estafinalidade as amostras foram tratadas conforme indicado naseção de Materiais e Métodos e várias diluições forammedidas. Os resultados obtidos com essas amostras deestômago solúveis em água são mostrados na Figura 1(geradas na ausência de endoprotease específica de prolina)e na Figura 2 (geradas na presença de endoproteaseespecífica de prolina). Com a exceção de HMW-gluteninas,todos os componentes do glúten puderam ser detectados. Osdados obtidos mostram claramente que a adição deendoprotease específica de prolina de A. niger apresenta umefeito dramático na presença dessas proteínas do glúten nafração solúvel: mesmo para t = 0 (ou seja, menos de umminuto após a adição da enzima à preparação oral) uma fortediminuição da presença de proteínas/peptídeos do glútenpode ser observada.
Em um experimento em separado, as frações insolúveisem água (isto é, péletes) das amostras do estômago foramsujeitas ao SDS-PAGE seguida pela transferência dasproteínas separadas para membrana PVDF. Estas membranas sãoentão coradas com o anticorpo específico da alfa-gliadina(figura 3) . Enquanto o anticorpo detectava a gliadina emtodas frações sem a endoprotease específica de prolina, aadição de endoprotease específica de prolina levou a umaforte redução no sinal após 45 minutos de tempo. Nos pontostemporais 90 e 120 minutos dificilmente podia-se detectarqualquer gliadina nas amostras estomacais obtidas a partirdo material digerido na presença de endoprotease específicade prolina.
Pode-se concluir, a partir destes dados que aendoprotease específica de prolina é altamente eficiente naquebra das moléculas de glúten, uma vez que estas estão nafração solúvel em água. Uma vez que os anticorposutilizados neste ensaio são específicos para estiramentosaminoácidos que são menores do que aqueles necessários paraa estimulação da célula T7 isto indica que o tratamento coma endoprotease específica de prolina resulta em uma forteredução do dano potencial das moléculas semelhantes aglúten na fração solúvel em água. Como é esperado que,especialmente, estes peptídeos solúveis em água possaminteragir eficazmente com os sítios receptores relevantes àdoença celiaca, estes dados obtidos com a fração de glútensolúvel em água são altamente relevantes em condições invivo.
Bastante surpreendente, é a endoprotease específica de
prolina ser capaz também de hidrolisar moléculas de glútenque estão presentes na fase insolúvel em água. Após 90minutos as moléculas de gliadinas não poderiam mais serdetectadas nas frações que são tratadas com a enzima emboratais moléculas estivessem ainda presentes nas amostras decontrole.
Juntamente, os resultados descritos neste Exemploindicam que a endoprotease específica de prolina de acordocom a invenção é capaz de degradar o glúten sob condiçõesque mimetizam as condições presentes no estômago humano.Mais ainda, a enzima pode fazer isso de maneira tão eficazque virtualmente não permanece nenhum dos epítopos deglúten tóxicos.
Exemplo 4
Compatibilidade da endoprotease específica de prolina com aprodução de uma dispersão com baixo teor de gordura
Para testar se a atividade de endoprotease específicade prolina iria sobreviver uma exposição aosemulsificadores à elevadas temperaturas e uma incorporação em uma emulsão aquosa/oleosa, o seguinte teste foirealizado.
Adquiriu-se em um supermercado local uma dispersão combaixo teor de gordura "Halvarine voor op brood" (4 0% degordura) produzido por Winner Food BV, Lopik, Noruega. Os ingredientes listados são mono e diglicerídeos de ácidograxos (E471) como emulsificadores, ácido sórbico(E200)como conservante, ácido cítrico, gorduras e óleos vegetais,água, flavorizantes, vitamnias AeDe sal. O comportamentode fusão da dispersão com baixo teor de gordura foi testadoem uma encumbadora de agitação, termicamente controlada. A5 3 0C, a dispersão com baixo teor de gordura foicompletamente liqüefeita resultando em uma lenta separaçãoda camada gordurosa e aquosa.
Para viabilizar a incorporação de uma quantidadeadequada de endoprotease específica de prolina na dispersãocom baixo teor de gordura, 15 ml de um concentrado líquidode enzima contendo aproximadamente 10 PPU/ml (videMateriais e Métodos para a definição da enzima) foiliofilizado em um tubo Greiner de 50 ml. 0 pó seco (emtorno de 2,25 gramas) foi misturado com 25 gramas dadispersão com baixo teor de gordura, após a qual a misturafoi fundida a 53 0C em uma incumbadora de agitaçãotermicamente controlada dissolvendo assim o pó da enzimaliofilizada. Imediatamente após a fusão e a separaçãoespontânea da água e gordura, retirou-se uma amostra (300μΐ) a partir da camada aquosa no tubo e resfriada àtemperatura ambiente. Após a retirada desta primeiraamostra, o tubo contendo a emulsão liqüefeita com a enzimafoi vigorosamente agitado por 10 segundos e deixada a 53°C.Após 10, 70 e 100 minutos novamente amostras de 300 μΐforam retiradas da camada aquosa seguida de uma vigorosaagitação após retirada da amostra. Finalmente, todas asamostras obtidas a partir da camada aquosa foram diluídas1000 vezes com tampão de acetato IOOmM de pH 4,2 e a3 0 atividade enzimática residual foi medida em um ensaio deplaca de microtitulação (MTP) . Para esta finalidade, ahidrólise do substrato de peptídeo sintético Ala-Ala-Pro-pNA (Pepscan, Lelysta, Noruega) viabilizando o tripeptídeoAla-Ala-Pro e a molécula pNA colorida, foi seguida a 405 nmutilizando-se medições cinéticas de 10 minutos a 40°C emuma leitora TECAN Gênios MTP Reader (Salzburg, Viena). Foiutilizado o substrato Ala-Ala-Pro-pNA (ao invés do Z-Gly-Pro-pNA) devido ao Ala-Ala-Pro-pNA possibilitar a mediçãode quantidades de enzima muito menores. Cada poço continha250 μΐ de solução do substrato, 3mM AAP-pNA em tampão deacetato IOOmM a pH4,2 e foi pré-aquecido em uma leitoraTecan Gênios MTP reader por 10 minutos a 40° C. Iniciou-sea reação pela adição de 50 μΐ de uma diluição apropriada deenzima (neste caso 1000 vezes). Em seguida fez-se aliberação da molécula pNA por 15 minutos. Realizou-se acoleta de dados com software Magellan(Tecan). 0 aumento nadensidade ótica a 4 05 nm foi registrado e adicionalmenteprocessado no Excel para viabilizar a descrição mostrada naFigura 4. A atividade da endoprotease específica de prolinaimediatamente após a fusão da dispersão foi definida comosendo 100%. Conforme mostram os resultados, a atividade daenzima dificilmente é afetada por em um ambiente dedispersão com baixo teor de gordura a 53°C. Mesmo agitando-se a dispersão fundida para mimitizar o processo deemulsificação teve pouca ou nenhuma influência comprovadana excessiva espuma resultante.
Exemplo 5
Estabilidade de prateleira de endoprotease específica deprolina na fase aquosa de uma dispersão com baixo teor de
gorduraPara testar a Estabilidade de prateleira deendoprotease especifica de prolina na fase aquosa de umadispersão com baixo teor de gordura, preparou-se uma faseaquosa contendo ácido lático apresentando um pH de 4,5 e umatividade de água de 0,98. Para se prevenir quanto acontaminação microbial da fase liquida, uma soluçãoconcentrada de benzoato de sódio foi adicionada de maneiraestéril para se atingir uma concentração de 600 ppm. Entãoa endoprotease espécifica da prolina filtrado estéril foi
adicionada de maneira estéril para se chegar a umaatividade enzimática de 15 PPU/grama. Esta solução foientão dividida por um amplo número de pequenos frascosestéreis. Alguns desses frascos foram colocados a - 20°Cpara servirem como uma referência, outros frascos foram
colocados a 8°C e a 30°C. A cada semana, mediu-se aatividade enzimática específica da prolina restante nosvários frascos. As atividades das enzimas foram medidas deacordo com o procedimento detalhado na seção de Materiais eMétodos.
Os resultados, mostrados na Figura 5, ilustram quecaso mantida a temperatura ambiente de 8 °C, a enzimapermanece perfeitamente ativa por um período de pelo menossemanas sob essas condições de a„ elevada.
Exemplo 6
Digestão in vitro de torradas com uma enzima contendo
cobertura de raspas de berries.
Para se ilustrar o conceito de utilização de umaenzima contendo cobertura para facilitação da quebra dasmoléculas tóxicas de glúten no alimento, foi conduzido o
experimento a seguir. Primeiramente 250 ml de uma coberturade framboesa estável em prateleira foram preparados. Foiadicionada a uma quantidade de 204g de concentrado deenzima líquida (12 PPU/ml), 20,7 gramas de sacarose, 1,0grama de ácido cítrico, 0,02% de flavorizante de fambroesa(Givaudan, 76525-36) e 20,7 g de um solução de sacarina a0,5% em água. Após a dissolução dos vários ingredientes,foram adicionadas e cuidadosamente agitadas 3,11 gramas dexantana (keltrol RD, CP KelcoiII). 0 pH final da massaviscosa foi de 3,7, a concentração final da enzima em tornode 9,8 PPU/g de cobertura, a atividade final da água emtorno de 0,99. A concentração de benzoato foi ajustada emtorno de 600 ppm. Da mesma maneira, preparou-se um produtoplacebo contendo todos os ingredientes mencionados mas sema enzima específica da prolina, ativa. Como uma referênciacom os experimentos anteriores (veja Exemplos 2 e 3) tambémfoi incluída no teste a solução de enzima não-espessada,pura.
Para se testar a eficácia dessas várias preparaçõesna degradação dos epítopos de glúten tóxicos, conduziu-seum teste de digestão in vitro no qual o desaparecimento deum número de epítopos foi acompanhado temporalmente. Paraesta finalidade, aplicou-se a enzima em suas várias formasde preparação, em cada fatia (aproximadamente 10 gramas,contendo 1,4 g de proteína) de um pão de trigo brancotorrado comercialmente disponível (Bolletje, "Englesetoast"). Assim, uma fatia foi revestida com cobertura saborframboesa contendo enzima, uma fatia foi revestida com acobertura placebo (sem atividade enzimática presente) e auma fatia a enzima pura líquida foi adicionada. Tanto paraa cobertura contendo a enzima como a enzima líquida pura, aatividade enzimática dosada igualou a 20 PPU/g da proteínapresente. Cinco minutos após a aplicação de vários produtosnas torradas, as torradas foram moidas e misturadas com 60ml(para controle e variação líquida da enzima) e 62,3ml(para a formulação gel) de uma solução de pH 5,0mimetizando o líquido gástrico (NaCl(4,8g/L), KCl(2,2 g/L),CaCl2(),22 g/L) e NaHC03(l,5 g/L)), 2,3 ml da mesma soluçãocontendo pepsina a partir do estômago de porco (Sigma, P-7012) em uma concentração de 500 KU/L foi adicionada a cadauma das torradas.
Obteve-se uma primeira amostra a 0 minuto(ou seja, 5minutos após adição da solução de pepsina gástrica) . Então,gradualmente o pH de cada mistura foi reduzido paramimetizar uma acidificação lenta do conteúdo do estômago. OpH foi abaixado de pH 5 para pH 4,5 e 15 minutos após aprimeira amostra ter sido coletada, tirou-se uma segundaamostra. Nos 15 minutos seguintes, o pH foi abaixadonovamente para pH 4,0 e a um ponto no tempo de 3 0 minutos apartir do início do experimento, uma terceira amostra foicoletada. As amostras seguintes foram coletada como sesegue : em t=45 minutos (após redução do pH para 3,5) ; emt= 60 minutos (após redução do pH para 3,0) ; em t= 90minutos (após redução do pH para 2,5); então, o pH foireduzido para 2,0 e amostras adicionais forma tomadas a 120minutos e finalmente a 150 minutos. Todas as amostrasforam, instantaneamente congeladas, em nitrogênio líquido eestocadas posteriormente a - 80° C.
Para se medir o nível de níveis de epítopos de glútenresiduais nas várias preparações, as amostras congeladasforam, inicialmente, sujeitas a um procedimento dedesativação total das enzimas. As amostras ainda congeladasforam aquecidas a 95 0C por 3 0 minutos, então o pH daamostra foi elevado a 11-12, daí abaixado para 2 efinalmente neutralizado para um pH 6. Então, as amostrasforam, novamente, aquecidas por 15 minutos a 95°C após aqual uma alíquota de 1 ml foi tomada e centrifugada por 3 0minutos em uma centrífuga Eppendorf. 0 sobrenadanteresultante continha a fração solúvel em água e a fração depélete não solúvel em água. Os níveis de epítoposestimulatórias da célula T restantes na fração solúvel emágua foram quantificados utilizando-se o anticorpomonoclonal com base nos ensaios de competição de acordo comSpaenij-Dekking e col. (2004), Gut 53, 1267-1273 (videtambém a seção Materiais e métodos). 0 resultado dessesensaios de competição (o valor médio medido de duasmedições independentes) é mostrado na Tabela 2. Os níveisresiduais dos epítopos estimulatórios da célula T na fraçaode pélete foram visualizadas após o Western blot (vejaExemplo 3). Similarmente aos dados obtidos para a fraçãosolúvel em água, também os resultados do último experimento(fotografias não apresentadas) confirmam a eficácia daquebra dos vários epítopos estimulatórios da célula T paraambas preparações contendo as enzimas.
Coletivamente, os dados obtidos indicam, claramente,que as duas preparações contendo enzimas, seja na forma deuma enzima livre, pura ou na forma de um produto similar ageleia, gelifiçado com uma elevada atividade de água,efetivamente destrói a maioria dos epítopos de glútenestimulatórios da célula T caso incubadas por um período deem torno 3 0 minutos sob condições similares às do estômago.Somente a fração LMW(Peso Molecular Baixo) parece algoresistente a degradação enzimática no presente exprimentopreparado (in vitro) .
Tabela 2 - Níveis de epítopos estimulatórios da célula T<table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table>
Claims (16)
1. Produto alimentício pasteurizado caracterizado pelofato de possuir uma atividade de água de pelo menos 0,80,preferencialmente, de pelo menos 0,85 e compreeendendo umaprotease específica de prolina.
2. Produto alimentício caracterizado pelo fato depossuir uma atividade de água de pelo menos 0,80,preferencialmente de pelo menos 0,85, e compreendendo umaprotease específica da prolina, segundo a qual o produtoalimentício compreende menos de 1 %p/p de proteína oupeptídeos.
3. Produto alimentício, de acordo com a reivindicação-1 ou 2, caracterizado pelo fato do produto alimentício serlivre de glúten.
4. Produto alimentício, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de ser umcondimento, cobertura, recheio de sanduíche, molho, bebidaou uma emulsão tal como uma dispersão.
5. Produto alimentício, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de seruma dispersão com baixo teor de gordura.
6. Produto alimentício, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato deque a protease específica de prolina apresenta umaatividade ótima em um valor de pH entre 1 e 7,preferencialmente em um valor de pH entre 2 e 6.
7. Produto alimentício, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fatoda protease específica de prolina ser derivada a partir deAspergillus ou pertencer a família S28 dos proteases deserina.
8. Processo para a preparação de um produtoalimentício de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4,-5, 6 ou 7 caracterizado pelo fato de que uma proteaseespecífica de prolina é adicionada ao referido produtoalimentíco seguido pela sujeição do produto alimentício apasteurização.
9. Processo para a preparação de um produtoalimentício de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4,-5 ou 6 caracterizado pelo fato de que uma proteaseespecífica de prolina é adicionada a um produto alimentíciopasteurizado.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ou 9,caracterizado pelo fato da protease específica de prolinaestéril ser adicionada a um produto alimentíciopasteurizado.
11. Uso de uma protease específica de prolinacaracterizado pelo fato de ser na fabricação de um produtoalimentício pasteurizado de qualquer uma das reivindicações-1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7.
12. Uso de uma protease específica de prolina, deacordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato deser para prevenção de qualquer efeito prejudicial causadopelo alimento rico em prolina.
13. Uso de uma protease específica de prolina, deacordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato deser para prevenção dos sintomas clínicos da doença celíacaou desordens relacionadas a mesma.
14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações-11, 12 ou 13, caracterizado pelo fato do produtoalimentício ser destinado para consumo em combinação com umalimento contendo glúten.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 12 ou 13,caracterizado pelo fato do efeito prejudicial ou desordemestar relacionado com a doença celíaca compreendendodesordens autoimunes, especialmente diabetes do tipo I,dermatite herpetiforme, câncer intestinal, Iinfornasintestinais não-Hodgkin, sindrome do intestino irritado,tiroidite autoimune, doenças do colágeno, alopeciaautoimune e hepatite autoimune, e desordens psiquiátricasincluindo autismo, esquizofrenia, ADHD, desordenscomportamentais bipolares e depressão.
16. Protease específica de prolina caracterizada pelofato de ser estéril.
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