BRPI0707514A2 - mÉtodo de identificaÇço de um agente que module ossos ou um lipÍdio; mÉtodo de identificaÇço de um agente que module a atividade de norrin-frizzled4; kit para identificar um agente que module a atividade de lrp5-norrin-frizzled4; cÉlula ou linhagem celular desprovida de norrin nativo e que expresse uma lrp5 nço nativa e uma frizzled4 nço nativa - Google Patents

Abstract

MÉTODO DE IDENTIFICAÇçO DE UM AGENTE QUE MODULE OSSOS OU UM LIPÍDIO; MÉTODO DE IDENTIFICAÇçO DE UM AGENTE QUE MODULE A ATIVIDADE DE NORRIN-FRIZZLED4; KIT PARA IDENTIFICAR UM AGENTE QUE MODULE A ATIVIDADE DE LRP5-NORRIN-FRIZZLED4; CÉLULA OU LINHAGEM CELULAR DESPROVIDA DE NORRIN NATIVO E QUE EXPRESSE UMA LRP5 NçO NATIVA E UMA FRIZZLED4 NçO NATIVA. O relatório apresenta materiais e métodos para a triagem e identificaçào de reagentes que modulem a atividade de Norrin conforme se relacionada com a sinalização da via de Wnt. De preferência, os agentes assim identificados modulam a remodelagem óssea e/ou os níveis de lipidios e podem ser miméticos de Norrin e agonistas de Norrin, assim como outros agonistas e miméticos do complexo LRP5/Norrin/Frizzled4.

Description

"MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE UM AGENTE QUEMODULE OSSOS OU UM LIPÍDIO; MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE UMAGENTE QUE MODULE A ATIVIDADE DE N0RRIN-FRIZZLED4; KITPARA IDENTIFICAR UM AGENTE QUE MODULE A ATIVIDADE DELRP5-NORRIN-FRIZZLED4; CÉLULA OU LINHAGEM CELULARDESPROVIDA DE NORRIN NATIVO E QUE EXPRESSE UMA LRP5 NÃONATIVA E UMA FRIZZLED4 NÃO NATIVA"

REFERÊNCIA A LISTAGENS DE SEQÜÊNCIAS

As listagens de seqüência aqui apresentadas,contendo SEQ ID NOS: 1-28, são aqui incorporadas por re-ferência para todas as finalidades.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a materiais emétodos para regular o gene de Norrin ou a proteínaNorrin, miméticos de Norrin, ou agentes que interajam comNorrin e, dessa forma, modulem sua atividade no complexoLRP5/Norrin/Friζzled4.

FUNDAMENTOS

Mutações na proteína Norrin ou da doença deNorrie (NDP ou Ndph) levam à doença de Norrie (ND), umasíndrome neurológica recessiva ligada a X (Berger et al.,1992 Nat. Genet. 1: 199-203; e Chen et al., 1992 Nat. Ge-net. 1: 204-208; por exemplo, N0 de Acesso NCBI AAH29901,BC029901 e CAA46639 para seqüências humanas, e CAA58725,CAA63134 e X83794 para seqüências de Mus musculus). 0 ge-ne que codifica NDP está localizado em Xpll.4 no genomahumano. As características da doença incluem displasiaretiniana, cegueira e retardo mental. Camundongos com NDPdesativado têm um fenótipo ocular que se assemelha à do-ença de Norrie humana (Rhem et al., 2002 J. Neuroscience22: 4286-4292) e mostram falha na angiogênese retiniana.0 gene também está ligado à doença de Coats (telangiecta-sia retiniana), vítreo-retinopatia exsudativa ligada a X(EVRX) e retinopatia avançada de prematuridade (ROP).

Mutações em NDP também podem causar a forma li-gada a X da Vítre-retinopatia Exsudativa Familiar (FEVR),que apresenta alguns dos sintomas de ND. FEVR também écausada por mutações no gene Frizzled4 {Fz4) , que codifi-ca um dos dez receptores sete-transmembrana de serpentinada sinalização Wnt (Robitaille et al., 2002 Nat. Genet.32: 326-330) .

A família Wnt consiste em 19 membros, e elesmostram interação de alta afinidade com 10 proteínasFrizzled (Fz). Diferentes Wnts têm diferentes afinidadespor várias proteínas Frizzled e podem se engajar em dife-rentes vias (Wu et al., 2002 J. Biol. Chem. 211: 41762 -41769). A via canônica de Wnt envolve a estabilização debeta-catenina mediante interação com Frizzled e sua pro-teína receptora relacionada a lipoproteína co-receptora 5ou 6 (LRP5/LRP6). Em pacientes e camundongos, as mutaçõesde perda de função em LRP5 também mostram defeitos ocula-res vasculares, além de osteoporose, e dão origem à sín-drome de osteoporose-pseudoglioma (OPPG) (Gong et al.,2001 Cell 207: 513-523; e Kato et al., 2002 J. Cell Biol.157: 303-314) .

Norrin pode induzir a via Wnt-beta-catenina (Xuet al., 2004 Cell 116: 883-895). Norrin funciona muitocomo uma Wnt, porque ambas requerem um receptor Fz e umco-receptor LRP5/LRP6 para sinalização, e ambas se ligampredominantemente ao domínio rico em cisteína (CRD) de Fzcom afinidade nanomolar (Hsieh et al., 1999 Proc. NatfI.Acad. Sei. 96: 3546-3551; Wu et al., 2002 J. Biol. Chem.277: 41762-41769; e Xu et al., 2004 Cell 116: 883-895).Norrin é uma pequena proteína rica em cisteína que é se-cretada; forma oligômeros ligados por dissulfeto e perma-nece associada à superfície celular e matriz extracelular(Perez-Vilar et al., 1997 J. Biol. Chem. 272: 33410-33415) . A partir de comparações de seqüências e estudosde modelagem, sugeriu-se que a Norrin tivesse uma simila-ridade de estrutura terciária à TGF-beta (Meitinger etal., 1993 Nat. Genet. 5: 376-380), fator de von Wille-brand, e à mucina (Meindl et al., 1992 Nat. Genet. 2:139-143). 0 gene de Norrin é expressado predominantementeno cérebro e na retina (Berger et al., 1992 Nat. Genet.1: 199-203; e Chen et al., 1992 Nat. Genet. 1: 204-208).Candidatos a fármacos para o tratamento de do-enças relacionadas à remodelagem óssea estão sendo cons-tantemente buscados. 0 esqueleto adulto humano está em umestado dinâmico, sendo continuamente degradado e reforma-do pelas ações coordenadas de osteoclastos e osteoblastosem superfícies ósseas trabeculares (também chamadas decancelosas) e em sistemas haversianos. A ruptura da remo-delagem óssea pode levar a doenças e condições como oste-oporose (osteoporose pós-menopausa, osteoporose induzidapor glicocorticóides, osteoporose induzida por transplan-tes e juvenil), raquitismo, osteomalacia, osteomálaciainduzida por tumores, hipofosfatasia, doença de Paget eoutras. Assim, é necessário elucidar mais detalhadamenteas vias que controlam a remodelagem óssea e identificaralvos nessas cascatas que sejam úteis para o desenvolvi-mento de agentes que modulem os alvos.

SUMÁRIO

Os materiais e métodos aqui descritos propor-cionam uma maior elucidação do envolvimento de Norrin navia de Wnt mediante sua interação com LRP5 e 6 e Friz-zled4 para remodelagem ósseoa e modulação do metabolismolipidico, e proporcionam genericamente ensaios que usamNorrin e compostos que interagem com Norrin (por exemplo,agonistas de Norrin) para a triagem de compostos que se-jam úteis na modulação de transtornos ósseos e modulaçãode lipidios. Também são considerados métodos e materiaispara a identificação de miméticos de Norrin, assim comomiméticos do complexo LRP5/Frizzled4/Norrin.

Portanto, um aspecto se refere a um método deidentificação de um agente que module ossos ou um Iipi-dio, compreendendo: (a) a colocação de uma proteína Friz-zled4 ou polipeptídio Frizzled4 biologicamente ativo comuma proteína LRP5 ou proteína LRP5 biologicamente ativana presença do agente; e (b) a determinação de se o ditoagente é um agente que interaja com Frizzled4 e/ou LRP5ou polipeptídio ativo de Frizzled4 ou LRP5, e module pelomenos um parâmetro de ossos e/ou um lipídio na presençado agente. Em um aspecto, a proteína Frizzled4 ou frag-mento polipeptídio de Frizzled4 biologicamente ativo éligado à proteína LRP5 ou fragmento polipeptídico biolo-gicamente ativo de LRP5; isso pode ser na forma de umaproteína de fusão. 0 agente submetido à triagem por essemétodo pode ser um mimético de Norrin, assim como agonis-tas e antagonistas de Norrin.

Outro aspecto se refere a um método de identi-ficação de um agente que module o metabolismo ósseo oumetabolismo lipídico, compreendendo: (a) a colocação deuma proteína Norrin ou um fragmento polipeptídico de Nor-rin biologicamente ativo e uma proteína ou fragmento po-lipeptídio biologicamente ativo de Frizzled4 fusionadoproteínas LRP5 e/ou LRP6 ou seus fragmentos polipeptídi-cos biologicamente ativo na presença do agente; e (b) amedição in vitro ou in vivo de pelo menos um parâmetro demodulação óssea e/ou modulação lipídica, para identificaro agente que module metabolismo ósseo ou metabolismo Ii-pidico.

Os parâmetros de modulação óssea para qualquerum dos métodos discutidos pode ser qualquer um ou mais dedensidade óssea, resistência óssea, número de trabéculas,tamanho do osso ou conectividade do tecido, ou quaisquerde suas combinações. Os parâmetros de modulação lipidicadiscutidos em qualquer um desses métodos de triagem podemincluir uma alteração no nivel de HDL, VLDL, colesterol,triglicerideos, apoE ou LDL. Outro aspecto da triagem deagentes nesses métodos é observar se eles alteram padrõesde expressão de genes associados ao metabolismo lipidicoou metabolismo ósseo. Por exemplo, se eles alteram a ex-pressão de um ou mais de COX-2, Jun, Fos, ciclina Dl,WntlOB, SFRPl, conexina 43, eNOS, WntlOB, ciclina Dl,Frizzled2, e se WISP2 é modulada.

Os métodos também podem incluir proteína Dkk ouum fragmento polipeptídico de Dkk biologicamente ativoe/ou uma proteína Kremen, um fragmento polipeptídico deKremen biologicamente ativo e/ou uma proteína Wnt ou umfragmento polipeptídico de Wnt biologicamente ativo.

Em ainda outro aspecto, considera-se o métodopara a identificação de um agente que module uma ativida-de de Norrin-Frizzled4, compreendendo: (a) a colocação doagente, uma proteína Norrin ou um fragmento polipeptidicobiologicamente ativo de Norrin e uma proteína Frizzled4ou um fragmento polipeptidico biologicamente ativo deFrizzled4 fusionado a LRP5 e/ou LRP6 ou um fragmento po-lipeptídico biologicamente ativo de LRP5 e/ou LRP6, oufusionado a um domínio de ligação a ligante (LBD) conten-do o fragmento polipeptidico de LRP5 ou LRP6 e:

(i) uma proteína Kremen ou fragmento polipepti-dico biologicamente ativo de Kremen; e/ou

(ii) uma proteína Dkk ou fragmento polipeptidi-co biologicamente ativo de Dkk; e

(b) a determinação de se o agente modula umaatividade de Norrin-Frizzled4. Os agentes podem ser ummimético de Norrin, agonista de Norrin, antagonista deDkk ou a um antagonista de Kremen. Também pode ser paraavaliar agonistas de Frizzled4 e agonistas de LRP5.

Para alguns desses métodos, as proteínas oufragmentos polipeptídicos biologicamente ativos das pro-teínas podem ser fixados a um substrato como PVDF ou ni-trocelulose.

Um aspecto adicional considera um método de i-dentificação de um agente que regule a modulação óssea oumodulação lipídica, compreendendo: (a) a administração doagente a uma célula que expresse Frizzled4 e LRP5, em queFrizzled4 é uma proteína Frizzled4 ou fragmento polipep-tidico biologicamente ativo de Frizzled4, e LRP5 é umaproteína LRP5 ou um fragmento polipeptídico biologicamen-te ativo de LRP5; (b) a determinação de se a dita admi-nistração do agente de teste modula uma interação LRP5-Frizzled4; e (c) a determinação de se o agente modula umparâmetro ósseo e/ou um parâmetro lipidico. Um aspectodesse método considera que a célula não expressa Norrin,o que é útil na identificação de miméticos de Norrin. Ou-tro aspecto tem a célula expressando uma Frizzled4, LRP5,LRP6 e/ou Norrin não endógena, e o uso da célula para,por exemplo, identificar agonistas de Norrin.

Outro aspecto considera um método de identifi-cação de um agente que regule a modulação óssea ou modu-lação lipídica, compreendendo: (a) a administração de umagente de teste a uma célula que expresse LRP5, Norrin eFrizzled4, em que LRP5 é uma proteína LRP5 ou um fragmen-to polipeptídico biologicamente ativo de LRP5, Norrin éuma proteína Norrin ou um polipeptídio de Norrin biologi-camente ativo, e Frizzled4 é uma proteína Frizzled4 ou umfragmento polipeptídico biologicamente ativo de Friz-zled4; (b) a determinação de se a dita administração doagente de teste modula a interação Norrin-Frizzled4; e(c) a determinação de se o agente de teste modula um pa-râmetro da modulação óssea ou modulação lipídica. Issoconsidera que a célula expressa de maneira ótima uma Nor-rin, LRP5 e/ou Frizzled4 não endógena. Alternativamente,a célula pode não expressar uma Norrin, LRP5, LRP6 e/ouFrizzled4 endógena.

Qualquer um dos agentes testados pode ser ummimético de Norrin, antagonista de Dkk ou antagonista deKremen, assim como agonista e mimético de Frizzled4, ago-nista de Norrin e agonista de LRP5.

Em qualquer um dos métodos ou células conside-rados, as células podem ser células de vertebrados. Célu-las de vertebrados podem incluir, mas não se limitam a,células ósseas, células renais, células mesenquimais, a-dipócitos, pré-adipócitos ou células de Xenopus.

Em qualquer um dos métodos, kits, célu-las/linhagens celulares discutidos, a Dkk pode ser Dkkl,Dkk2, Dkk3 ou Dkk4, ou um polipeptidio biologicamente a-tivo de Dkkl, Dkk2, Dkk3 ou Dkk4. Da mesma forma, paraKremen, quando Kremen é citada em qualquer aspecto, podeser Kremenl ou Kremen2, ou um polipeptidio biologicamenteativo de Kremenl ou Kremen2. Wnt também pode ser qualqueruma de Wntl a Wntl9 (por exemplo, Wntl, Wnt3, Wnt3a ou WntlOb) ou um fragmento biologicamente ativo de qualqueruma dessas.

Linhagens celulares para uso com qualquer dosmétodos e kits podem incluir, mas não se limitam a, célu-las KHOS/NP, células KHOS-240S, células KHOS-321H, célu-las DSDh, células VA-ES-BJ, células 7F2, células U20S,células HOSTE85, células ROS, células MC3T3-E6, célulasUMR-106, células Saos2, células MG63, células HOB, célu-las-tronco mesenquimais (por exemplo, células-tronco me-senquimais adultas humanas), células C3H10T1/2, célulasHEK293A ou células HEK293T.

Animais também são considerados para uso natriagem dos reagentes para modulação de metabolismo ósseoe metabolismo lipidico. Modelos animais incluem animaistransgênicos. Por exemplo, o animais pode ser um animaltransgênico que expresse LRP5 ou HBM. Alternativamente, oanimal pode ser um animal com desativação, em que uma oumais de LRP5, LRP5, Norrin, uma Dkk, uma Kremen, uma Wnte Frizzled4 estão desativadas. Alternativamente, os ani-mais também consideram desativações e genes introduzidoscombinados. Os animais podem ser qualquer vertebrado, co-mo Xenopus ou camundongos.

Ainda outra modalidade considera um kit para aidentificação de um agente que module a atividade de Nor-rin-Frizzled4, compreendendo: (a) uma série de célulasincapazes de expressar Norrin que sejam co-transfectadascom ácidos nucléicos que codifiquem Frizzled4 ou um frag-mento polipeptidico biologicamente ativo de Frizzled4 eLRP5 ou um fragmento polipeptidico biologicamente ativode LRP5; (b) opcionalmente, um ácido nucléico de Dkk paraco-expressão em uma série de células que co-expressemFrizzled4 ou o fragmento polipeptidico biologicamente a-tivo de Frizzled4 e LRP5 ou o fragmento polipeptidico bi-ologicamente ativo de LRP5; (c) opcionalmente, um ácidonucléico de Kremen para co-expressão em uma série de cé-lulas que co-expressem Frizzled4 ou um fragmento polipep-tidico biologicamente ativo de Frizzled4 e LRP5 ou umfragmento polipeptidico biologicamente ativo de LRP5,e/ou para co-expressão em uma série de células que co-expressem Frizzled4 ou um fragmento polipeptidico biolo-gicamente ativo de Frizzled4, LRP5 ou um fragmento poli-peptidico biologicamente ativo de LRP5, e Dkk ou um frag-mento biologicamente ativo de Dkk; (d) opcionalmente, umácido nucléico de LRP6 para co-expressão em uma série decélulas que co-expressem Frizzled4 ou um fragmento poli-peptidico biologicamente ativo de Frizzled4 e LRP5 ou umfragmento polipeptidico biologicamente ativo de LRP5; e(e) opcionalmente, um ácido nucléico de Wnt para co-expressão em uma série de células que co-expressem Friz-zled4 ou um fragmento polipeptidico biologicamente ativode Frizzled4 e LRP5 ou um fragmento polipeptidico biolo-gicamente ativo de LRP5.

Ainda outro aspecto considerado é uma célula oulinhagem celular desprovida de Norrin nativo e que ex-presse uma LRP5 não nativa e uma Frizzled4 não nativa, emque a LRP5 não nativa é uma proteína LRP5 não nativa, e aFrizzled4 não nativa é uma proteína Frizzled4 não nativa,em que a LRP5 é a proteína completa ou um fragmento poli-peptidico biologicamente ativo de LRP5, e Frizzled4 é aproteína completa ou um fragmento polipeptídico biologi-camente ativo de Frizzled4, e Norrin é a proteína comple-ta ou um fragmento polipeptídico biologicamente ativo deNorrin. A expressão dessas proteínas pode ser uma expres-são transitória ou estável. Outro aspecto considera a ex-pressão não nativa (não endógena) de LRP5, LRP6, Friz-zled4, uma Dkk e/ou uma Kremen, em que qualquer uma des-sas pode ser a proteína inteira ou seus fragmentos poli-peptídicos biologicamente ativos.

Outro aspecto considera os agentes identifica-dos por qualquer um dos métodos acima isoladamente ou emuma composição farmacêutica com excipientes e/ou veículosfarmaceuticamente aceitáveis adequados. 0 agente pode serusado para tratar um transtorno lipídico e/ou um trans-torno ósseo ou usado para formular um medicamento parauso no tratamento de um desses transtornos.

Deve-se entender que tanto a descrição genéricaprecedente, quanto a descrição detalhada a seguir são e-xemplificativas e explicativas e se destinam a explicarmais aprofundadamente a invenção conforme reivindicada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os desenhos anexos, que são incluídos para pro-porcionar uma melhor compreensão dos materiais e métodosapresentados e que são incorporados em e fazem parte des-te relatório, ilustram as modalidades.FIG. 1. Norrin ativa a sinalização TCF em célu-las do tipo osteoblasto U20S, mas não em células HEK-293A. Ensaios de co-transfecção transitória foram condu-zidos em células renais embrionária humanas (HEK) HEK-293A e células U20S com repórteres TCF-Iuci e renila. Ográfico de barras representa a razão de sinais de Iumi-nescência de TCF-Iuci para sinais de renila que normali-zam as respostas entre várias transfecções usando dife-rentes construtos de cDNA no vetor pcDNA.

FIG. 2. A co-transfecção de Frizzled4 (Fz4) in-duzir o sinal TCF mediado por Norrin em células HEK-293Ae intensifica aquele em células U20S. 0 gráfico de barrasmostra os resultados de respostas de TCF-Iuci obtidas u-sandó-se transfecções transitórias de células HEK-293A eU20S com várias combinações de cDNAs.

FIG. 3. O sinal LRP5-Fz4-TCF induzido por Nor-rin pode sesr inibido sinergicamente por Dkkl e Kremen2em células U20S.

FIG. 4. O sinal TCF mediado por Norrin com mu-tante LRP5-G171V (fenótipo HBM) é menos inibido do queaquele com LRP5 na presença de Dkkl e Kremen2.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Como era intrigante que três genes, NDP,Frizzled4 (Fz4) e proteína receptora relacionada alipoproteina 5 (LRP5), se mostrassem envolvidos navascularização da retina, investigações nessa linharevelaram que interagem no nível molecular; e que aNorrin é um ligante do complexo LRP5-Fz4. É interessantenotar que a ativação mediada por Norrin de LRP5/6 envolveFz4 e não os outros cinco membros da família Fz (isto é,mFZ3, hFZ5, mFz6, mFz7 e mFz8). Entretanto, a Norrin temespecificidade por Fz4 e não mostra nenhuma homologia deseqüência significativa com Wnts.

Mutações de LRP5 em seres humanos e em camun-dongos revelaram o papel central que o sinal LRP5 e Wntdesempenha no metabolismo ósseo (Gong et al. , 2001 Cell207: 513-523; Kato et al., 2002 J. Cell Biol. 157: 303-314; Boyden et al., 2002 N. Engl. J. Med. 346: 1513-1521;e Little et al., 2002 Am. J. Hum. Genet. 70: 1-19). A mu-tação G171V (de alta massa óssea ou do tipo "HBM") e ou-tras dessas mutações no primeiro domínio propulsor deLRP5 resulta em uma afinidade diminuída das variantes HBMpela proteína Dikkopfl (Dkkl) em comparação com a LRP5 detipo selvagem (Boyden et al., 2002 N. Engl. J. Med. 346;e Ai et al., 2005 Mol. Cell. Biol. 25: 4946-4955). A mu-tação HBM leva a uma inibição diminuída por Dkkl e à ati-vação de sinais Wnt-beta-catenina mediados por mutanteHBM in vitro. Especula-se que esse fenômeno seja o meca-nismo molecular subjacente importante para o fenótipo dealta massa óssea (HBM) em seres humanos e em camundongostransgênicos com mutações do tipo HBM (Babij et al., 2003J. Bone Mineral Res. 18: 960-974).

Dkkl é um dos antagonistas secretados do sinalLRP5/6-Wnt (Glinka et al., 1998 Nature 391: 357-362; Ka-wano et al., 2003 J. Cell. Sei. 116: 2627-2634; e Baficoet al., 2001 Nat. Cell Biol. 3: 683-686). Além disso,Dkkl na presença de Kremenl/2, outro tipo de receptortransmembrana de passagem única, intensifica a inibiçãodo sinal LRP5/6-TCF mediado por Wnt (Mao et. al., 2002Nature 417: 664-667) por internalização do complexo ter-nário LRP5—Dkkl-Kremen. Kremens forma o complexo ternáriona superfície celular com LRP5/6 e Dkkl para facilitarsua internalização ou endocitose. Kremens facilita a rá-pida endocitose de LRP5 e LRP6 a partir da membrana celu-lar e, dessa forma, bloqueia a sinalização LRP5/6-Wnt. Osmateriais e métodos aqui apresentados surgiram da especu-lação de que o padrão de expressão desses interatores emum dado tipo celular possa regular a sinalização Wnt outrazer uma especificidade adicional.à função de LRP5/6 emcélulas como osteoblastos. Deve-se notar que, a menos queespecificamente mencionado, em todos os casos em que sefaz referência a Dkkl, pode-se substituir por qualqueruma das outras Dkks isoladamente ou em combinação.

A análise das quatro variantes de união de Kre-men2 (Krm2) revelou uma variante desprovida de 44 aminoá-cidos na terminação carbóxi, que pode intensificar a ini-bição mediada por Dkkl de LRP5/6 (B. Mao et al., "Kremenproteins are Dickkopf Receptors that Regulate Wnt/beta-Catenin Signaling," 2002 Nature 417(6889): 664-667). E-feitos máximos da intensificação com Dkkl são observadoscom um clone Krm2 de comprimento total. A atividade deKrm2 é mediada por sua interação com o segundo domíniorico em cisteína de Dkkl. Krm2 também pode converter oativador de sinal LRP6-Wnt Dkk2 em um inibidor em célulasHEK-293A. Deve-se notar que, a menos que especificamentemencionado, em todos os casos em que se faz referência aKremen2, pode-se substituir por Kremenl isoladamente ouem combinação com Kremen2.

Os materiais e métodos aqui apresentados se re-ferem às interações funcionais entre Norrin, Frizzled4,LRP5 ou variantes HBM de LRP5, por exemplo, G171V. Con-forme aqui descrito, Norrin intensifica modestamente osinal TCF do mutante G171V-LRP5 com relação ao sinal ob-servado com LRP5 em células ósseas U20S. Norrin tambémleva a uma inibição diminuída da via por Dkkl e/ou Kre-men2. Aqui são apresentados materiais e métodos para ouso de Norrin como um agente de triagem para encontrarreagentes que sejam miméticos de Norrin e agonistas deNor rin. Esses agentes de modulação de Norrin e miméticosde Norrin podem ser úteis para modulação óssea. Modulado-res de Norrin e miméticos de Norrin incluem, mas não selimitam a, pequenas moléculas químicas, polipeptídios,peptídios, siRNAs e imunoglobulinas.

1. Abreviações e Definições1.1 Abreviações

As abreviações a seguir foram usadas no relató-rio. Embora esses acrônimos e abreviações possam ter di-ferentes significados em outras técnicas, são conformeindicados abaixo ou conforme separadamente distinguidosno relatório.

ACP5 fosfatase ácida 5

Akt-3 proteína quinase B (PKB) ou RAC-PK

AlPASE fosfatase alcalina

ALFA ensaio homogêneo de proximidade lumines-cente amplificado

APE proteína relacionada a adaptador 1

APlBl complexo de proteína adaptadora AP-I,

subunidade beta 1

AXIN axina

b.i.d. bis in die (duas vezes ao dia)

BGN biglicano específico para osso

BMC teor mineral ósseo

BMD densidade mineral óssea

BMPl proteína morfogenética óssea 1

BMP4 proteína morfogenética óssea 4

BMU unidade de remodelagem óssea

BSA albumina sérica bovinaBTG2 gene 2 de translocação de células B,anti-proliferatiνο

CBFB fator beta de ligação a núcleo

CCNDl ciclina Dl

CCND3 ciclina D3

CCNI ciclina I

cDNA DNA complementar

CELSR2 receptor 2 do tipo G de sete passa-gens da caderina EGF LAG

CFP proteína ciano fluorescente

CHUK/IKK quinase ubíqua de hélice-alça-hélicaalfa conservada, IkB quinase alfa

CKl alfa caseína quinase 1, alfa 1

CKB creatina quinase, cérebro

CNKl intensificador de conector do tipoKSR

CollAl colágeno, tipo 1, alfa 1

Col3Al colágeno, tipo 3, alfa 1

Col6A3 colágeno, tipo VI, alfa 3

Connx43 Conexina 43

COX-2 ciclooxigenase-2

CRABP2 proteína de ligação a ácido retinóicocellular II

CRD domínio rico em cisteína

CSFlR receptor do fator estimulador de co-lônias 1CSPG2 condroitina sulfato proteoglicano CTGF fator de crescimento de tecido con- j untivo CTSK catepsina K CX3CR1 receptor 1 de quimicina (C-X3-C) Ciclina Dlveja também CCNDl DELTEX homólogo deltex 2 (Drosophila) , veja EphB2 Dkk Dikkopf Dkkl Dikkopfl Dkk2 Dikkopf2 Dkk3 Dikkopf3 Dkk4 Dikkopf4 DMSO sulfóxido de dimetila d s RNA RNA de fita dupla DVLl despenteado, homólogo dsh (Drosophi- la) DXA absorciometria de raios X dupla EDTA ácido etilenodiaminatetraacético EGTA ácido etileno glicol-O-O'-bis(2- aminoetil) -NrNfNf N' -tetraacético eNOS óxido nitrico sintetase excitável EPHB2 intensificador de conector do tipo KSR (supressor quinase de ras de Drosophila) EPHB6 receptor de Eph B6ERBB3 oncogene GROl

ERK também conhecida como proteína quina-se ativada por mitógeno p44/42 (MAPK)

EVRX vitreo-retinopatia exsudativa ligadaa X

FAP proteína de ativação de fibroblastos,

alfa

FBLNl fibulina 1

FBS soro bovino fetal

FEVR vítreo-retinopatia exsudativa famili-

FGF-2 Fator de crescimento de fibroblastos

2 (básico)

FGF-7 Fator de crescimento de fibroblastos7 (fator de crescimento de queratinócitos)

FOS homólogo do oncogene viral de osteos-sarcoma murídeo FBJ

FOSLl antígeno 1 do tipo Fos

FRET transferência de energia por resso-nância fluorescente

Frizzled2 Frizzled (Drosophila) homólogo 2,também chamada de FZD2

Fz Frizzled

Fz4 Frizzled4

FZD2 Frizzled (Drosophila) homólogo 2

FZD4 Frizzled homólogo 4G171V mutação de glicina para valina na po-sição 171 de LRP5 humana

GADD4 5A induzivel por parada do crescimento edano ao DNA, alfa

GADD4 5B induzivel por parada do crescimento edano ao DNA 45, beta

GADD4 5G induzivel por parada do crescimento edano ao DNA 45, gama

GAS6 especifico para parada de crescimento6

GFP proteína fluorescente verde

GJAl proteína alfa 1 de canal de membranade junção de vão (também conhecida como Conexina 43)

GJB3 proteína beta 3 de canal de membranade junção de vão

GSK-3 glicogênio sintetase quinase-3

GSK-3a glicogênio sintetase quinase-3, iso-forma alfa

ΰ3Κ-3β glicogênio sintetase quinase-3, iso-forma beta

HBM fenótipo de alta massa óssea

HDL lipoproteína de alta densidade

HEK rim embrionário humano

HERPUD1 membro 1 do domínio do tipo ubiquiti-na induzivel por estresse de retículo endoplasmático, in-duzivel por homocisteínaHRT terapia de substituição hormonal

i.m. intramuscular

i.v. intravenoso

IDB2 inibidor de ligação 2 a DNA

IDB3 fator de crescimento do tipo insulina

2 (somatomedina A)

IGF2R receptor do fator de crescimento dotipo insulina 2

IGFBP6 proteína de ligação 6 ao fator decrescimento do tipo insulina

iGSK inibidor de GSK

iGSK-3 inibidor de GSK-3

IL-I interleucina-1

ILlRl receptor de interleucina-1, tipo I

ILlRLl do tipo receptor de interleucina-1 1

IL4RA receptor de interleucina 4, alfa

IL-6 interleucina-6 .

ITGA5 integrina alfa 5 (receptor alfa defibronectina)

ITGB5 integrina, beta

ITGBLl integrina, do tipo beta 1

JNK via da c-jun amino quinase

JUN homólogo do oncogene de vírus de sar-coma aviário 17 v-jun

JUNDl gene dl relacionado ao proto-oncogene

JunKremen gene que codifica Kringle que marca oolho e o nariz

Krml Kremenl

Krm2 Kremen2

LBD domínio de ligação a ligante de LRP5,LRP6, HBM

LDL lipoproteina de baixa densidade

LDLR receptor de lipoproteina de baixadensidade

LOX lisil oxidase

LRP5 proteína 5 relacionada ao receptor delipoproteina de baixa densidade

LRP6 proteína 6 relacionada ao receptor delipoproteina de baixa densidade

LSPl proteína 1 específica para linfócitos

LUM lumicano

mAb anticorpo monoclonal

MAPK proteína quinase ativada por mitógeno(p42,4 4) (ERK)

MAPKAPK2 proteína quinase 2 ativada por prote-ína quinase ativada por mitógeno, também chamada de MK2

MCC mutação para cânceres colo-retais

MDSC células tronco derivadas de mesênqui-ma

MET proto-oncogene ιnet (receptor do fatorde crescimento de hepatócitos)MMP-14 metaloproteinase de matriz 14

MMP-9 metaloproteinase de matriz 9

MSXl homeo caixa, do tipo msh 1

MYBLl homólogo de oncogene viral de mielo-blastose v-myb (aviário) do tipo 1

MYC homólogo do oncogene viral de mielo-citomatose aviária v-myc

MYCS oncogene do tipo Myc, proteína s-myc

NCAMl molécula de adesão de células neurais1

ND doença de Norrie

NDP proteína da doença de Norrie (tambémNdph)

NFATCl fator nuclear de células T ativadas,citoplasmático 1

NFKBl fator nuclear do intensificador de

gene de cadeia leve kapa em células B 1, pl05

Non-TG não transgênico

N0S3 óxido nítrico sintetase 3, tambémconhecida como eNOS

NR4A1 subfamília 4 de receptor nuclear,grupoa A, membro 1

OGN osteoglicina

OPG osteoprotegerina

OPPG síndrome de osteoporosepseudoglioma

OSMR receptor de oncostatina MPCOLCE proteína intensificadora da pró-colágeno c-proteinase

PDGFA Incl. Aglomerador M29464:fator decrescimento derivado de plaquetas alfa

PDGFRA polipeptidio do receptor de fator decrescimento derivado de plaquetas alfa

PKA proteína quinase A

PKC proteína quinase C

PLAT ativador de plasminogênio do tipotissular, t-PA

PNA ácido nucléico peptídico

PRDC-PENDING proteína relacionada a DAC eCerberus

PTGIS prostaglandina sintetase

PTGS silenciamento de gene pós-transcrição

PTGSl prostaglandina endoperóxido sintetase1, também chamada de COX-I

PTGS2 prostaglandina endoperóxido sintetase

2 (prostaglandina G/H sintetase ou ciclooxigenase 2) ouCOX-2

PTH hormônio paratireoidiano

RAMP3 proteína 3 modificadora de atividadede receptor (calcitonina)

RANK ativador de receptor de NF-kB

RANKL ligante de ativador de receptor deNF-kBRLUs unidades relativas de luciferase

RNAi interferência de RNA

ROP retinopatia de prematuridade

RUNXl fator de transcrição relacionado arunt 1

RUNX2/CBFAl fator de transcrição relacionadoa runt 2

S100A10 proteína de ligação a cálcio similara calpactina

SDCl sindecano 1

SDFl fator derivado de estroma 1

SERM modulador de receptor de estrogênioseletivo

SERPINE1 inibidor da serina (ou cisteína) pro-teinase, clade E (nexina, inibidor do ativador de plasmi-nogênio tipo 1), membro 1

SFRPl proteína relacionada a frizzled se-cretada 1

SFRP4 proteína relacionada a frizzled se-cretada 4shRNA RNA em forma de grampo curto

siRNA RNA de interferência curto

SPARC sparc/osteonectina

SPARCLl do tipo SPARC 1 (mast9, hevina)

SPPl fosfoproteína secretada 1

SPR ressonância de plasmon de superfícieTATl transdutor de sinal e ativador detranscrição 1

STAT3 gene RIKEN cDNA 1110034C02

TANK ativador de Nf-kappa B associado amembro da família TRAF

TCF fator de células T

TG transgênico

TGFBl fator de crescimento transformador,beta 1

TGFBR2 fator de crescimento transformador,beta receptor II

TGF-β fator de crescimento tumoral beta

THBD trombomodulina

THBSl trombospondina 1

TIEG gene precoce induzível por TGFB

TIMPl inibidor tissular de metaloproteinase

TIMP2 inibidor tissular de metaloproteinase2

TIMP3 inibidor tissular de metaloproteinase3

TNF fator de necrose tumoral

TNFRSF10B superfamília de receptor de fator denecrose tumoral, membro IOb

TNFRSF11B superfamília de receptor de fator denecrose tumoral, membro Ilb (osteoprotegerina)TNFSF11 superfamília fator de necrose tumoral(Iigante), membro 11 (veja RANKL)

TOBl transdutor de ErbB-2.1

TRAF3 fator 3 associado a receptor de TNF

TUNEL etiquetagem de extremidade de entalhe

dUTP de desoxinucleotidil transferase terminal

UNK_D83402 prostaglandina 12 (prostacicli-

na) sintetase

VCAMl molécula de adesão de células vascu-lares 1

VEH veiculo

VLDL lipoproteina de densidade muito baixa

WIF fator inibitório de Wnt

WISPl proteína 1 da via induzível por WNTl

WISP2 proteína 2 da via de sinalização in-

duzível por WNTl

Wnt 3A membro da família de sítios de inte-gração MMTV do tipo sem aba

Wnt família de sítios de integração MMTVdo tipo sem aba (por exemplo, Wntl a Wnt 19)

WntlOB membro da família de sítios de inte-gração MMTV do tipo sem aba IOB

Wnt6 membro da família de sítios de inte-

gração MMTV do tipo sem aba 6

YFP proteína fluorescente amarela

1.2 DefiniçõesDe acordo com esta descrição detalhada, apli-cam-se as seguintes abreviações e definições. Deve-se no-tar que, conforme aqui usado, as formas singulares "um","uma", "o" e "a" incluem os respectivos plurais, a menosque o contexto claramente indique de outra forma. Assim,por exemplo, referência a "um mimético" inclui uma plura-lidade desses miméticos, e referência a "a dosagem" in-clui referência a uma ou mais dosagens e seus equivalen-tes conhecidos por aqueles versados na técnica, e assimpor diante.

A menos que definido de outra forma, todos ostermos técnicos e científicos aqui usados têm os mesmossignificados que os comumente entendidos por aqueles ver-sados na técnica. Os seguintes termos são apresentadosabaixo. Os genes aqui citados pretendem incluir os núme-ros de acesso mencionados, assim como outras seqüênciasnão especificadas.

"Animal" significa qualquer vertebrado. "Ani-mal" inclui "mamíferos". Mamíferos preferidos incluem a-nimais de criação (por exemplo, ungulados, como gado, bú-falos, cavalos, ovelhas, porcos e cabras), assim como ro-edores (por exemplo, camundongos, hamsters, ratos e co-baias) , caninos, felinos, primatas (por exemplo, chimpan-zés, orangotangos, humanos), lupinos, camelídeos e cerví-deos. Outros vertebrados incluem aves (por exemplo, gali-nhas, patos, gansos, aves selvagens), anfíbios (por exem-plo, Xenopus) e ictióides (peixes).

"Norrin" pretende incluir todas as formas ver-tebradas de Norrin e todas as suas formas de polipeptí-dios e ácidos nucléicos. "Norrin" também é chamada de ND,proteína da doença de Norrie, precursor de Norrin, NDP,Ndp e homologia da proteína de doença de Norrie (Ndph).Variantes de Norrin também são consideradas.

"Atividade de Norrin" seria uma atividade deNorrin ao envolver a via de sinalização de Wnt e sua in-teração com Frizzled4 e LRP5/6. Isso incluiria a intera-ção de Norrin com Frizzled4 (Fz4) e sua intensificação daatividade de LRP5. A única proteína Frizzled com a qualNorrin interage é a Frizzled4. Entretanto, as Wnts aquidiscutidas podem ser usadas nos sistemas de ensaio paracomparar a especificidade de qualquer molécula que modulea interação Norrin-Frizzled4 e LRP5 e LRP6 no sistema desinalização de Wnt. Assim, "agente modulador de Norrin" éum agente que module uma atividade de Norrin, em que aatividade de Norrin seja parte da sinalização de Wnt. Umaatividade de Norrin preferida é a regulação da remodela-gem óssea e/ou modulação lipídica. Com relação à modula-ção lipídica, veja o pedido de patente norte-americana n°09/578.900. 0 conteúdo do pedido de patente norte-americana n° 09/578.900 é aqui incorporado por referênciapara todas as finalidades em sua inteireza. Agentes modu-ladores de Norrin incluem agonistas e antagonistas da a-tividade óssea e/ou níveis lipídicos. Um agonista de Nor-rin, por exemplo, intensificaria o crescimento ósseo emum sujeito quando administrado.

"Dkk" pretende incluir todas as formas verte-bradas de Dkkl, Dkk2, Dkk3 e Dkk4 e todas as formas deácidos nucléicos e polipeptidios. "Dkkl" também se referea Dickkopf-1, precursor de proteína-1 relacionada a Dick-kopf, Dkk-I, DKK-I, hDkk-1 (para a forma humana de Dkkl),AK e UNQ492/PROIOO8. "Dkk2" também se refere a Dickkopf-2, precursor de proteína-2 relacionada a Dickkopf, Dkk-2,DKK-2, hDkk-2 (para a forma humana de Dkk2) eUNQ682/PR01316. "Dkk3" também se refere a Dickkopf-3,precursor de proteína-3 relacionada a Dickkopf, Dkk-3,hDkk-3 (forma humana de Dkk3), REIC e UNQ258/PR0295."Dkk4" pretende incluir Dickkopf-4, precursor de proteí-na-4 relacionada a Dickkopf, Dkk-4, DKK-4 e hDkk-4 (paraa forma humana de Dkk4). Variantes de Dkk também são con-sideradas. Agentes moduladores de Dkk incluiriam antago-nistas e agonistas de Dkk.

"Kremen" pretende incluir todas as formas ver-tebradas de Kremenl e Kremen2 e todas as formas de ácidosnucléicos e polipeptidios. "Kremenl" também é chamado dereceptor de Dickkopf, FLJ31863, KREMEN, proteína contendoKringle que marca o olho e o nariz, proteína 1 transmem-brana contendo Kringle e KRMl. "Kremen2" também é chamadode receptor 2 de Dickkopf, precursor de proteína 2 Kre-men, proteína contendo Kringle que marca o olho e o na-riz, KRM2, MGCl07 91, MGC16709 e a forma Kremen2 associadaà Equipe do Programa de Coleção de Genes de Mamíferos(MGC), 2002 "Generation and initial analysis of more than15,000 full length human and mouse cDNA sequences," Proc.NatfI Acad. Sei. USA 99(26): 16899-16903. Variantes deKremen também são consideradas. Agentes moduladores deKremen incluem antagonistas e agonistas de Kremen.

"LRP5" ou "proteína 5 relacionada ao receptorde lipoproteína de baixa densidade" pretende incluir to-das as formas de ácidos nucléicos e polipeptídios verte-bradas de LRP5. Outros nomes para LRP5 e homóogos rela-cionados incluem BMNDl, Zmaxl, HGNC:8152, proteína 5 re-lacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade,LR3, LRP7, OPPG, OPS e VBCH2. "LRP5" também é conhecidacomo "arr" em Drosophila e tem os seguintes sinônimos a-dicionais: BEST:CK00539, CK00539, l(2)k08131, LDLR-Iike,LRP, LRP5/6 e LRP6. Por exemplo, uma variante "HBM" ou"alta massa óssea" de LRP5 tem uma única alteração de a-minoácido na forma polipeptídica de uma glicina para umavalina na posição 171 na seqüência polipeptídica humana,hà uma mutação similar na posição 170 da seqüência de ca-mundongo. Homólogos adicionais em outros vertebrados po-dem ser determinadas em outras espécies dados os domíniosde hélice tridimensional. 0 uso de HBM considera a inclu-são da variante G171V e seu homólogo de outras espéciesde vertebrados. Uma variante de HBM é uma que produz umfenótipo de alta massa óssea, que resulta de uma mutaçãoem LRP5 diferente da alteração G171V. Para as formasZmaxl e HBM, veja a patente norte-americana n° 6.770.461,que é aqui incorporada em sua inteireza para todas as fi-nalidades. Assim, um exemplo de uma variante ou homólogode tipo selvagem de LRP5 é a Zmaxl. Quando se faz refe-rência a LRP5, todas as formas de LRP5, incluindo uma va-riante ou homólogo de tipo selvagem, também são conside-radas. Variantes de LRP5 e HBM também são consideradas.Agentes moduladores de LRP5 incluiriam agonistas e anta-gonistas de LRP5. Também se consideram miméticos de LRP5.

"LRP6" ou "proteína 6 relacionada a receptor delipoproteina de baixa densidade" pretende incluir todasas formas de ácidos nucléicos e polipeptídios vertebradosde LRP6. LRP6 também é chamada de precursor da proteína 6relacionada a lipoproteina de baixa densidade. Variantesde LRP6 também são consideradas. Quando se faz referênciaa LRP6, todas as formas de LRP6, incluindo uma varianteou homólogo de tipo selvagem, também são consideradas.Quando se discute o complexo Frizzled4/LRP5, o complexotambém se refere a Frizzled4/LRP6 e Frizzled4/LRP5/LRP6.Agentes moduladores de LRP6 incluem agonistas e antago-nistas de LRP6. Miméticos de LRP6 mimetics também sãoconsiderados aqui para uso na modulação da via de Wnt demodo a intensificar o crescimento ósseo.

"Wnt" pretende incluir qualquer proteína e áci-do nucléico de Wnt (membro da família de sítios de inte-gração MMTV do tipo sem aba), incluindo aqueles de Wntl-Wnt19. Formas exemplificativas de Wnt incluem Wntl (tam-bém conhecida como membro da família de sítios de inte-gração MMTV do tipo sem aba 1, INTl e precursor da prote-ína de proto-oncogene Wnt-I), Wnt3 (também conhecida comomembro da família de sítios de integração MMTV do tiposem aba 3, INT4 e precursor da proteína de proto-oncogeneWnt-3), Wnt3a (também conhecida como membro da família desítios de integração MMTV do tipo sem aba 3A e precursorda proteína Wnt—3a) e WntlOb (também conhecida como mem-bro da família de sítios de integração MMTV do tipo semaba 10B, precursor da proteína Wnt-lOb, WNT-12, Wnt-12 eWNT-12). Variantes de qualquer uma das formas de Wnt tam-bém são consideradas. Agentes moduladores de Wnt incluemagonistas e antagonistas de Wnt.

"Variante" pretende incluir uma forma de um á-cido nucléico que codifique uma proteína, em que a prote-ína tenha atividade biológica na cascata de Wnt e estejaenvolvida na modulação do metabolismo ósseo e metabolismolipídico. Isso pode incluir variantes aumentadas de LRP5,como a variante G171V que produz uma alta massa óssea noser humano que expressa essa proteína.

"Fragmento biologicamente ativo", "fragmentopolipeptídico" e "polipeptídio biologicamente ativo" sig-nificam um fragmento biologicamente ativo de LRP5, LRP6,HBM, Kremenl, Kremen2, qualquer Dkk, qualquer Wnt e Nor-rin, em que essa atividade modula a via de Wnt e, de pre-ferência, a via de Wnt com relação ao desenvolvimento ós-seo, modulação óssea e/ou metabolismo de um lipidio. Es-ses são domínios das proteínas completas que estão envol-vidas na sinalização de Wnt e, dessa forma, na modulaçãoinduzida pela via de Wnt de lipídios e/ou desenvolvimentoósseo. Por exemplo, polipeptídios biologicamente ativosde LRP5 e LRP6 podem ser a parte extracelular dessas pro-teínas (por exemplo, aminoácidos 1-1.376 da LRP5 humana(N° de Acesso no GenBank ΝΡ_00232β), Zmaxl, ou HBM). Alémdisso, para LRP5 humana, que tem 1.615 aminoácidos decomprimento, outros domínios com atividade biológica po-dem incluir o domínio transmembrana (aminoácidos 1.385 a1.407), o domínio citoplasmático (aminoácidos 1.408 a1.615) e o domínio extracelular (aminoácidos 1-1.384 ou20-1.384, se os primeiros 19 aminoácidos do peptídio desinal forem removidos). Para LRP6 humana, que tem 1.613aminoácidos de comprimento, haveria domínios análogos:domínio extracelular (aminoácidos 1-1.370 ou 20-1.370, seos primeiros 19 aminoácidos do peptídio de sinal foremremovidos), domínio transmembrana (aminoácidos 1.371-1.393) e o domínio citoplasmático (aminoácidos 1.394-1.613). Demonstrou-se que o domínio extracelular rico emcisteína (CRD) de Frizzled4 interage com Norrin, isto é,aminoácidos 36-165 (N° de Acesso IPR000024; N0 de Acessono GenBank NP_036325; Xu et al., 2004 Cell 116: 883-895);assim, um polipeptidio biologicamente ativo de Frizzled4poderia conter o CRD. Um polipeptidio biologicamente ati-vo de Norrin poderia incluir o domínio CRD de Norrin, porexemplo, aminoácidos 15-150. Em outro exemplo, relatou-seque, para que uma proteína Dkk se ligue a Kremenl ou Kre-men2, é necessário o domínio extracelular inteiro, porexemplo, aminoácidos 1-362 para Kremen2 humana (N° de A-cesso no GenBank BAC00872). Assim, partes biologicamenteativas de Kremenl e Kremen2 conteriam pelo menos o domí-nio extracelular, assim como suas seqüências mais longas.Para Dkkl, por exemplo, um polipeptidio biologicamenteativo conteria pelo menos o domínio rico em cisteína C-terminal (aminoácidos 183-266 para Dkkl humana; N0 de A-cesso no GenBank AAQ89364). Sabe-se que o domínio rico emcisteína C-terminal está envolvido na ligação de LRP5 eLRP6 a Kremen2. Assim, para qualquer polipeptidio biolo-gicamente ativo de uma proteína Dkk, o polipeptidio pode-ria conter pelo menos o domínio rico em cisteína de cadaDkk. Entretanto, outros exemplos incluem polipeptídioscontendo o domínio rico em cisteína de uma proteína Dkk,assim como, por exemplo em Dkkl, seqüências das extremi-dades N-terminais e/ou C-terminais do domínio rico emcisteína de Dkkl. Seqüências similares seriam considera-das para outras Dkks. Esses fragmentos biologicamente a-tivos também podem incluir proteínas completas menos umou mais aminoácidos na terminação carbóxi, ou terminaçãoamio ou dentro do polipeptídio que forma a proteína, masque tenham a mesma atividade que a proteína de comprimen-to total, e em que esses fragmentos polipeptídicos biolo-gicamente ativos não ajam como um inibidor de bloqueio,quando comparados com a atividade induzida pelo polipep-tídio de comprimento total.

"Parâmetro lipídico" pretende incluir, mas nãose limita a, um parâmetro medido in vitro ou in vivo paraanalisar uma alteração da concentração de lipídios, combase na exposição a um reagente. 0 parâmetro lipídico po-de incluir a medição de apoE, HDL, LDL, VLDL, triglicerí-deos, colesterol, o número de adipócitos, uma alteraçãona expressão do gene de adipócitos ou uma combinação des-ses parâmetros. Um parâmetro lipídico também se refere arazões de, por exemplo HDL:VLDL. No estudo de alteraçõesin vivo, podem-se fazer perfis lipídicos, como perfis Ii-pídicos em jejum (colesterol total, triglicerídeos, LDL eHDL) para avaliar a modulação dos níveis de lipídios de-vidos à administração de um reagente de teste.

"Transtornos lipídicos", "doenças lipídicas" e"condições lipídicas" que possam ser mediadas por Norrinpretendem incluir, mas não se limitam a, deficiência delipoproteína lipase familiar, deficiência de apoproteínaCII familiar, hiperlipoproteinemia do tipo 3 familiar,hipercolesterolemia familiar, hipertrigliceridemia fami-liar, hiperlipidemia do tipo lipoproteinas múltiplas, ní-veis de lipidios elevados devido a diálise e/ou diabetese níveis de lipidios elevados de etiologias desconheci-das .

"Desenvolvimento ósseo" se refere genericamentea qualquer processo envolvido na alteração do osso com otempo, incluindo, por exemplo, desenvolvimento normal,alterações que ocorrem durante um estado patológico e al-terações que ocorrem durante o envelhecimento ou altera-ções do padrão hormonal. Isso pode se referir a altera-ções estruturais e alterações de taxa dinâmica, como ta-xas de crescimento, taxas de ressorção, taxas de reparoósseo e outras. "Transtorno do desenvolvimento ósseo" serefere particularmente a qualquer transtorno no desenvol-vimento ósseo, incluindo, por exemplo, alterações que o-correm durante estatos patológicos e alterações que ocor-rem durante o envelhecimento. 0 desenvolvimento ósseo po-de ser de natureza progressiva ou cíclica. Aspectos dosossos que podem se alterar durante o desenvolvimento in-cluem, por exemplo, mineralização, formação de caracte-rísticas anatômicas específicas e números relativos ouabsolutos de vários tipos de células. Outros transtornosósseos considerados que podem não estar relacionados aodesenvolvimento incluem, mas não se limitam a, perda ós-sea relacionada à idade, fraturas ósseas (por exemplo,fratura do quadril, fratura de Colle, fraturas por esma-gamento de vértebras), condrodistrofias, transtornos in-duzidos por fármacos (por exemplo, osteoporose devida àadministração de glicocorticóides ou heparina e osteoma-lacia devida à administração de hidróxido de alumínio,anticonvulsivantes ou glutetimida), elevado turnover ós-seo, hipercalcemia, hiperostose, osteogenese imperfeita,osteomalacia, osteomielite, osteoporose, doença de Paget,osteoartrite e raquitismo.

"Modulação óssea" ou "modulação da formação ós-sea" se refere à capacidade de afetar qualquer um dosprocessos fisiológicos envolvidos na remodelagem óssea,conforme será percebido por aqueles versados na técnica,incluindo, por exemplo, ressorção óssea e crescimento ós-seo aposicional por , entre outras coisas, ativadade os-teoclástica e osteoblástica, e pode compreender algumasou todas as formações ou desenvolvimentos ósseos, confor-me aqui usado.

O osso é um tecido dinâmico que está continua-mente se adaptando e renovando mediante a renovação deosso velho ou desnecessário por osteoclastos e a recons-trução de osso novo por osteoblastos. A natureza do aco-plamento entre esses processos é responsável tanto pelamodelagem do osso durante o crescimento, quanto pela ma-nutenção da integridade esqueléti ca do adulto medianteremodelagem e reparo para atender às necessidades diáriasde uso mecânico. Há inúmeras doenças que resultam de umdesacoplamento do equilíbrio entre a ressorção e a forma-ção óssea. Com o envelhecimento, há uma desequilíbrio"fisiológico" gradual no turnover ósseo, que é particu-larmente exacerbado em mulheres devido à perda de suporteestrogênico na menopausa, que leva a uma progressiva per-da de osso. Quando a densidade mineral óssea cai abaixodas normas populacionais, há um conseqüente aumento nafragilidade e óssea e suscetibilidade a fraturas espontâ-neas. Para cada 10 por cento de osso que são perdidos, orisco de fratura dobra. Indivíduos com densidade mineralóssea (BMD) na espinha ou fêmur proximal 2,5 ou ou maisdesvios padrão abaixo da massa óssea de pico normal sãoclassificados como osteoporóticos. Entretanto, indivíduososteopênicos com BMD entre 1 e 2,5 desvios padrão abaixoda norma também estão em risco.

O osso é medido por várias formas diferentes deabsorciometria de raios X. Todos os instrumentos medem oteor inorgânico ou mineral ósseo do osso. Medições DXApadronizadas dão um valor que é uma densidade de área,não uma medição de densidade verdadeira pela definiçãoclássica de densidade (massa/unidade de volume). Todavia,esse é o tipo de medição usada clinicamente para diagnos-ticar osteoporose. Entretanto, embora a BMD seja o prin-cipal fator contribuinte para a resistência óssea, até40% da resistência óssea derivam de outros fatores, in-cluindo, mas não limitados a: (1) tamanho do osso (istoé, diâmetros maiores aumentam a rigidez no nivel do ór-gão, mesmo em face de uma menor densidade); (2) a conec-tividade das estruturas trabeculares; (3) o nivel de re-modelagem (loci de remodelagem são concentrações locaisde distorção); e (4) a resistência intrínseca do própriomaterial ósseo, que, por sua vez, é função da história decargas (isto é, mediante lesões de fadiga acumuladas) e ograu de reticulação do colágeno e nível de mineralização.Há boa evidência de que todos esses fatores de resistên-cia/fragilidade desempenhem algum papel em fraturas oste-oporóticas, assim como também um conjunto de influênciasextra-esqueléticas (como, mas não limitadas a, padrões dequedas, amortecimento com tecido macio e respostas refle-xas do sistema nervoso central) .

Instrumentos analíticos adicionais podem serusados para verificar essas características do osso. Porexemplo, a pQCT permite a medição de compartimentos tra-beculares e corticais separados quanto ao tamanho e àdensidade. A μΟΤ (micro CT) fornece informações quantita-tivas de características arquitetônicas, como conectivi-dade trabecular. A μΟΤ também fornece uma medida verda-deira da densidade óssea. Com essas ferramentas, os im-portantes parâmetros não BMD podem ser medidos para diag-nosticar a extensão da doença e a eficácia dos tratamen-tos. Os atuais tratamentos para osteoporose se baseiam nacapacidade de fármacos de prevenirem ou retardarem a res-sorção óssea. Embora os novos agentes anti-ressortivosestejam se mostrando úteis na terapia de osteoporose, e-Ies são vistos como soluções de curto prazo para o desa-fio mais definitivo de se desenvolverem tratamentos queaumentem a massa óssea e/ou os parâmetros de qualidadeóssea acima mencionados. Assim, a modulação óssea podeser avaliada por medição de parâmetros como a densidademineral óssea (BMD) e o teor mineral ósseo (BMC) por mé-todos de raios X pDXA, tamanho, espessura ou volume doosso, conforme medido por raios X, taxas de formação ós-sea, conforme medidas, por exemplo, por marcação com cal-cieno, densidade total, trabecular e no meio do eixo(conforme medida por métodos de pQCT e/ou μΟΤ), conecti-vidade e outros parâmetros histológicos (conforme medidospor métodos de μΟΤ), resistências mecânicas de dobramentoe compressiva (conforme medido, de preferência, no fêmure nas vértebras, respectivamente). Assim, parâmetros men-suráveis incluem, mas não se limitam a, densidade óssea,resistência óssea, número de trabéculas, tamanho do ossoe conectividade do tecido ósseo. Devido à natureza dessasmedições, cada uma pode ser mais ou menos apropriada parauma dada situação, conforme perceberão aqueles versadosna técnica. Além disso, parâmetros e metodologias, comohistória clinica livre de fraturas, formato do osso, mor-fologia óssea, conectividade, histologia normal, taxas dereparo de fraturas e outros parâmetros de qualidade ósseasão conhecidos e usados na técnica. Mais preferivelmente,a qualidade óssea pode ser avaliada pela resistência com-pressiva de vértebras, quando essa medição é apropriada.A modulação óssea também pode ser avaliada pelas taxas dealterações nos vários parâmetros. Mais preferivelmente, amodulação óssea é avaliada em mais de uma idade. Podem-seavaliar compostos quanto a qualquer um ou mais dos parâ-metros aqui relacionados para determinar a modulação dadensidade óssea.

"Densidade óssea normal" se refere a uma densi-dade óssea dentro de dois desvios padrão de uma contagemZ de 0 no contexto do estudo de ligação HBM. Em um con-texto genérico, a faixa de parâmetros normais de densida-de óssea é determinada por métodos estatísticos de roti-na. Um parâmetro normal está dentro de cerca de 1 ou 2desvios padrão do parâmetro normalizado para idade e se-xo, de preferência cerca de 2 desvios padrão. Uma medidaestatística de significância é o valor P, que pode repre-sentar a probabilidade de que a medição associada sejasignificativamente diferente da média. Valores P signifi-cativos são P < 0,05, 0,01, 0,005, e 0,001, de preferên-cia pelo menos P < 0,01.Os termos "força", "carga", "tensão" e "distor-ção" são aqui usados de maneira intercambiável e se refe-rem aos princípios de força que, em mecânica, são qual-quer ação que tenda a manter ou alterar a posição de umcorpo ou distorcê-lo, e esse termo é usado de maneira in-tercambiável com carga neste documento. A força, conformemedida por unidade de área, é definida como "tensão" etambém é aqui chamada de "tensão mecânica" e pode serclassificada como compressiva, de tração ou cisalhamento,dependendo de como as forças (carga) são aplicadas. Espe-cificamente, desenvolvem-se tensões compressivas se ascargas forem aplicadas de modo que o material se tornemais curto, ao passo que tensões de tração se desenvolvemquando o material é estirado. Tensões de cisalhamento sedesenvolvem quando uma região de um material desliza comrelação a uma região adjacente. 0 resultado da tensão édefinido como deformação, e a porcentagem da deformaçãorelativa ou alteração de comprimento é chamada de "dis-torção". Se, por exemplo, um material for estirado a 101%de seu comprimento original, tem uma distorção de 0,01 ou1%. Como a distorção não tem unidades, é relatada comodeformação relativa, em que a distorção de 0,01 é igual a1% de deformação, ou em termos de microdistorção, em queuma microdistorção de 10.000 é igual a uma distorção de0,01 ou 1% de deformação (Turner et al., 1993 Bone, 14:595-608)."Agente de teste" e "reagente de teste" preten-dem incluir pequenos compostos, composições, peptidios,miméticos, polipeptidios, siRNAs e imunoglobulinas. Com-posições incluem combinações de dois ou mais compostosativos, em que um ou mais dos compostos ativos são modu-ladores da via (cascata) de Wnt.

"Imunoglobulinas" pretende incluir anticorpos efragmentos de anticorpos. Conforme aqui usado, o termo"anticorpo" pretende se referir a anticorpos completos,intactos, diacorpos e fragmentos de anticorpos, comofragmentos Fab, Fab' e fragmentos F(ab)2. Anticorpos com-pletos incluem anticorpos monoclonais (mAb), como anti-corpos monoclonais murideos, anticorpos quiméricos, anti-corpos humanizados, anticorpos primatizados e anticorposhumanos. A produção de anticorpos e partes geneticamentemanipuladas ou enzimaticamente produzidas de anticorpos ea organização das seqüências genéticas que codificam es-sas moléculas são bem conhecidas e estão descritas, porexemplo, em Harlow et al., ANTIBODIES: a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,. Cold Spring Harbor, N.Y.(1988); Harlow et al. , Using Antibodies: A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Press, New York, 1998); e Breitlinget al., Recombinant Antibodies (Wiley-Spektrum, 1999), quesão aqui incorporados por referência para todas as fina-lidades. Imunoglobulinas também incluem fragmentos comoscFv."Imunologicamente ativo" significa qualquerproteína de imunoglobulina ou seu fragmento que reconheçae se ligue a um antígeno. De preferência, a proteína imu-nologicamente ativa ou seu fragmento modula o antígeno ao5 qual se liga. Por exemplo, se ela se liga a Norrin ou aum ligante de Norrin, a proteína imunologicamente ativaou seu fragmento modularia a atividade de Norrin ou a a-tividade do ligante de Norrin.

"Fvs de cadeia simples" ("scFvs") são fragmen-tos de anticorpos recombinantes consistindo apenas na ca-deia leve variável (Vl) e cadeia pesada variável (Vh) co-valentemente conectadas entre si por um elo polipeptídi-co. Vl ou Vh pode ser o domínio NH2 -terminal. O elo poli-peptídico pode ser de comprimento e composição variáveis,contanto que os dois domínios variáveis formem uma pontesem interferência estérica grave. Tipicamente, os elossão compostos principalmente por trechos de resíduos gli-cina e serina com alguns resíduos ácido glutâmico ou Ii-sina interpostos para solubilidade.

"Diacorpos" são scFvs diméricos. Os componentesde diacorpos tipicamente têm elos peptídicos mais curtosdo que a maioria dos scFvs e mostram uma preferência pelaassociação como dímeros.

Um fragmento "Fv" é um fragmento de anticorpoque consiste em um domínio Vh e um Vl mantidos juntos porinterações não covalentes. 0 termo "dsFv" é aqui usadopara se referir a um Fv com uma ligação dissulfeto inter-molecular manipulada para estabilizar o par Vh-Vl.

Um fragmento "F(ab'!2" é um fragmento de anti-corpo essencialmente equivalente ao obtido a partir deimunoglobulinas (tipicamente IgG) por digestão com a en-zima pepsina a pH 4,0-4,5. 0 fragmento também pode serproduzido de maneira recombinante.

Um fragmento "Fab" é um fragmento de anticorpoessencialmente equivalente ao obtido por redução da ponteou pontes dissulfeto que unem os dois pedaços de cadeiapesada no fragmento F(ab')2- 0 fragmento Fab' também podeser produzido de maneira recombinante.

O termo "agente de captura de proteína" signi-fica uma molécula ou complexo multi-molecular que possaligar uma proteína a si mesmo. Agentes de captura de pro-teína de preferência se ligam a seus parceiros de ligaçãode maneira substancialmente específica. Agentes de captu-ra de proteína com uma constante de dissociação (K0) demenos de cerca de ICT6 são preferidos (por exemplo, 10~7,10¯8, 10¯9, 10¯10) . Anticorpos ou fragmentos de anticorpossão altamente adequados como agentes de captura de prote-ína. Antígenos também podem servir de agentes de capturade proteína, pois são capazes de se ligar a anticorpos.Um receptor que se ligue a um ligante de proteína é outroexemplo de um possível agente de captura de proteína. De-ve-se entender que agentes de captura de proteína não selimitam a agentes que apenas interajam com seus parceirosde ligação mediante interações não covalentes. Agentes decaptura de proteína também podem opcionalmente se tornarcovalentemente ligados às proteínas às quais se ligam.

Por exemplo, o agente de captura de proteína pode ser fo-to-reticulado a seu parceiro de ligação após a ligação.

0 termo "parceiro de ligação" significa umaproteína que seja ligada por um agente de captura de pro-teína particular, de preferência de maneira substancial-mente específica. Em alguns casos, o parceiro de ligaçãopode ser a proteína normalmente ligada in vivo por umaproteína que seja um agente de captura de proteína. Emoutras modalidades, entretanto, o parceiro d eligação po-de ser a proteína ou peptídio no qual o agente de capturade proteína foi selecionado (mediante seleção in vitro ouin vivo) ou gerado (como no caso de anticorpos). Um par-ceiro de ligação pode ser compartilhado por mais de umagente de captura de proteína. Por exemplo, um parceirode ligação que seja ligado por vários anticorpos policlo-nais pode possuir inúmeros epítopos diferentes. Um agentede captura de proteína também pode se ligar a uma multi-plicidade de parceiros de ligação (por exemplo, se osparceiros de ligação compartilharem o mesmo epítopo).

"Condições adequadas para ligação de proteína"significa aquelas condições (em termos de concentração desal, pH, detergente, concentração de proteína, temperatu-ra e outras) que permitem que a ligação ocorra entre umaproteína seu parceiro de ligação em solução. De preferên-cia, as condições não são tão suaves para que ocorra umaquantidade significativa de ligação de proteína não espe-cífica.

Um "arranjo" é um arranjo de entidades em umpadrão sobre um substrato. Embora o padrão seja freqüen-temente um padrão bidimensional, o padrão também pode serum padrão tridimensional para uma maior aplicação de ma-terial ao substrato do arranjo.

O termo "substrato" se refere ao material devolume, subjacente e de núcleo dos arranjos da invenção.O substrato é o material ao qual ácidos nucléicos, anti-corpos, imunoglobulinas e outros compostos se fixam.

"Animal transgênico" significa um animal por-tando em uma linhagem germinativa um gene ou ácido nu-cléico que tenha sido introduzido por tecnologia de cDNA.Isso pode ser, por exemplo, introdução de genes humanosem roedores ou um gene de camundongo em um camundongo. Otermo pode incluir animais com desativação e animais comativação e combinações, por exemplo, em que um animal te-nha tido seu gene do tipo selvagem desativado e, então,substituído. O gene substituído pode ser um gene nativodo tipo selvagem, um gene cognato de outro animal, comoum gene humano, ou uma variante, como LRP5. 0 gene intro-duzido também pode estar sob o controle d eum promotorinduzível. O cDNA da variante HBM pode ser uma variantenativa ou não nativa. Por exemplo, a variante HBM humanade G171V pode ser introduzida em um camundongo. Alterna-tivamente, a contrapartida de camundongo ao G171V tambémpode ser introduzida em um camundongo, fornecendo um ca-mundongo HBM transgênico que expressa uma variante HBMnativa. Animal transgênico não pretende incluir seres hu-manos transgênicos, mas pode incluir primatas não humanose outros animais. O animal transgênico pode ter desativa-ção ou introdução de qualquer uma ou mais de Dkk, Norrin,LRP5, LRP6, Kremen, Wnt ou Frizzled4. Considera-se que umanimal transgênico seja um animal não humano, mas podeincluir primatas não humanos.

"Animal transgênico LRP5" pretende incluir umanimal que expresse tanto uma forma nativa, quanto de cD-NA de LRP5 ou apenas uma forma de cDNA de LRP5 se o ani-mal tiver a forma nativa de LRP5 removida ou incapaz defunção (desativada). A forma de cDNA de LRP5 pode estarsob um elemento induzivel. 0 animal pode ser um em que ogene nativo esteja desativado, e LRP5 nativa ou não nati-va tenha sido introduzida ou ativada. Esses animais comativação também podem ter os genes de preferência sobcontrole induzivel.

"Animais transgênico HBM" significa um animalem que a LRP5 nativa esteja presente ou desativada, e umcDNA que codifica a variante HBM esteja presente."Quantidade eficaz" ou "quantidade de dose efi-caz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" significauma quantidade de um agente que module uma atividade bio-lógica de Norrin suficiente para modular um parâmetro ós-seo e/ou um parâmetro lipidico.

O termo "reconhece e se liga a", quando usadopara definir interações de nucleotideos anti-sentido,siRNAs (pequenos RNA inibidores) ou shRNAs (RNAs em formade grampo curto) com uma seqüência alvo, significa queuma seqüência anti-sentido, de siRNA ou shRNA é substan-cialmente complementar à seqüência alvo e, portanto, seligará especificamente a uma parte de um mRNA que codifi-que um polipeptidio. Assim, tipicamente, as seqüênciasserão altamente complementares à seqüência alvo de mRNA eterão no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 faltas decorrespondência de bases em toda a seqüência. Em muitoscasos, pode ser desejável que as seqüências sejam corres-pondências exatas, isto é, sejam completamente complemen-tares à seqüência à qual o oligonucleotideo se liga espe-cificamente e, conseqüentemente, tenham zero faltas decorrespondência ao longo do trecho complementar. Seqüên-cias altamente complementares tipicamente se ligam muitoespecificamente à região de seqüência alvo do mRNA e,conseqüentemente, são altamente eficientes na reduçãoe/ou mesmo inibição da tradução da seqüência de mRNA alvono produto polipeptidico.Seqüências de oligonucleotideos substancialmen-te complementares são mais do que cerca de 80 por centocomplementares (ou "% de identidade") à seqüência alvo demRNA correspondente à qual o oligonucleotideo se liga es-pecificamente e, mais preferivelmente, são mais de 85 porcento complementares à seqüência alvo de mRNA complemen-tar à qual o oligonucleotideo se liga especificamente. Emcertos aspectos, conforme acima descrito, será desejávelter seqüências oligonucleotidicas ainda mais substancial-mente complementares para uso na prática da invenção e,nesses casos, as seqüências oligonucleotidicas serão maisde cerca de 90 por cento complementares à seqüência alvode mRNA correspondente à qual o oligonucleotideo se ligaespecificamente, e podem, em certas modalidades, ser maisde cerca de 95 por cento complementares à seqüência alvode mRNA correspondente à qual o oligonucleotideo se ligaespecificamente, e ainda até e incluindo 96%, 97%, 98%,99% e mesmo 100% complementares com correspondência exataao mRNA alvo ao qual o oligonucleotideo desejado se ligaespecificamente.

A porcentagem de similaridade ou porcentagem decomplementariedade de qualquer uma das seqüências expos-tas pode ser determinada, por exemplo, por comparação deinformações de seqüências usando o programa de computadorGAP, versão 6.0, disponível no Grupo de Genética Computa-cional da Universidade de Wisconsin (UWGCG). 0 programaGAP utiliza o método de alinhamento de Needleman e Wuns-ch, 1970 J. Mol. Biol. 48(3): 443-53. Resumidamente, oprograma GAP define a similaridade como o número de sím-bolos alinhados (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) quesejam similares, dividido pelo número total de símbolosna mais curta das duas seqüências. Os parâmetros de de-fault preferidos para o programa GAP incluem: (1) uma ma-triz de comparação binária (contendo um valor de 1 paraidentidades e 0 para não identidades) para nucleotídeos,e a matriz de comparação ponderada de Gribskov e Burgess(1986 Nucleic Acids Res. 14(1): 327-34), (2) uma penali-dade de 3,0 para cada vão e uma penalidade adicional de0,10 para cada símbolo em cada vão; e (3) nenhuma penali-dade para vãos nas extremidades.

"Mimético" significa uma molécula que desempe-nha a mesma função ou se comporta de maneira similar aoagente imitado ou tenha uma atividade que seja intensifi-cada com relação àquela do agente que está sendo imitado.Por exemplo, um mimético de Norrin interagiria com LRP5e/ou LRP6 e Frizzled4 como o polipeptídio Norrin e modu-laria a massa óssea e/ou os níveis lipídicos como Norrinou em um nível intensificado com relação ao observado pa-ra Norrin. Por exemplo, o mimético poderia induzir um fe-nótipo do tipo alta massa óssea, como o observado para ofenótipo HBM (que resulta, por exemplo, da mutação G171Vno polipeptídio LRP5 humano, ou a localização cognata emoutra LRP5 vertebrada). A molécula mimética pode ser umpolipeptidio, peptídio, imunoglobulina ou um pequeno com-posto químico.

"Elemento repórter" significa um polinucleotí-deo que codifica um polipeptidio capaz de ser detectadoem um ensaio de triagem. Exemplos de polipeptídios codi-ficados por elementos repórteres incluem, mas não se li-mitam a, IacZ, GFP, YFP (ou outro repórter fluorescente),luciferase e cloranfenicol acetiltransferase.

"Célula" ou "célula hospedeira" pretende inclu-ir células de vertebrados, assim como células de levedu-ras ou certas células procarióticas para uso em ensaiosde triagem. Por exemplo, uma célula adequada pode ser umacélula de levedura em um ensaio de dois híbridos de levedura.

"Célula óssea" pretende incluir células de cul-tura de tecidos ("célula cultivada") ou células obtidasde tecido ósseo. Essas células incluem, mas não se limi-tam a, osteoblastos, pré-osteoblastos, células osteopro-genitoras, osteoclastos, osteócitos, células tronco me-senquimais, quaisquer das células aqui discutidas ouquaisquer combinações delas. Tecido ósseo pretende inclu-ir uma combinação dessas células, conforme obtida em umabiópsia de osso.

"Antagonista de Dkk" pretende incluir, mas nãose limita a, anticorpos policlonais ou seus fragmentosimunogenicamente ativos, aptâmeros peptidicos, uma prote-ína de ligação a GSK, uma molécula anti-sentido para umácido nucléico de GSK, uma molécula de interferência comRNA, um morfolino oligonucleotídeo, um ácido nucléicopeptídico (PNA), uma ribozima e um peptídio que possa i-nibir a atividade de Dkk na via da Wnt.

Da mesma forma, "antagonista de Kremen" preten-de incluir, mas não se limita a, anticorpos monoclonaisou policlonais ou seus fragmentos ativos imunogênicos,aptâmeros peptidicos, uma molécula de interferência comRNA, um morfolino oligonucleotídeo, um ácido nucléicopeptídico (PNA), uma ribozima e um peptídio que possa i-nibir a atividade de Kremen na via da Wnt.

"Agonista de Wnt 3A" pretende incluir reagentesque possam regular positivamente a síntese e/ou atividadede Wnt 3A. "Mimético de Wnt 3A" significa uma moléculaque imite a atividade de Wnt3A. "Variante de Wnt 3A" in-cluiria qualquer variante funcional que, quando adminis-trada com carga possa intensificar a ativação com umaresposta de Wnt/p-catenina.

O termo "proteína de fusão" se refere a umaproteína composta por dois ou mais polipeptídios que, em-bora tipicamente não unidos entre si em seu estado nati-vo, estejam unidas por suas respectivas terminações aminoe carboxila mediante uma ligação peptídica, para formarum único polipeptídio contínuo. Deve-se entender que osdois ou mais componentes polipeptidicos podem estar dire-tamente unidos ou indiretamente unidos mediante um e-lo/espaçador peptidico.

2 . Ensaios de Triagem de Agentes de Teste queModulem Norrin

Os materiais e métodos aqui apresentados se re-ferem em parte a métodos de triagem de agentes que modu-lem genes NDP ou das proteínas Norrin codificadas por es-ses genes ou identificação de miméticos de Norrin e ago-nistas de Norrin. Os ensaios também se referem a materi-ais e métodos de triagem de agentes que modulem reagentesque interajam com proteínas Norrin, identificação de ago-nistas de Norrin e identificação de miméticos de Norrin.Esses poderiam ser reagentes que, por ligação com Friz-zled4, modulassem a atividade de Norrin. Esses também po-dem ser reagentes que, por modulação da atividade de Dkkl(o gene ou a proteína), modulem a atividade de Norrin.Outro exemplo seria Kremen2 , em que a modulação de Kre-men2 (o gene ou a proteína) modulasse a atividade de Nor-rin. Nos casos de Dkkl e Kremen2, de preferência o rea—gente que modula a atividade desses compostos seria umantagonista de Dkkl ou Kremen2. De preferência, os ensai-os resultariam em reagentes que também modulassem a ati-vidade de LRP5 mediante interação com Frizzled4 e Norrin.A modulação de LRP5 preferida seria na forma de atividadeintensificada, como a produzida por um agonista ou um mi-mético (por exemplo, um mimético de Norrin ou mimético deFrizzled4) .

Sistemas de ensaio podem incluir uma etapa emque agentes de teste são triados quanto à sua capacidadede se liga a Frizzled4, Norrin, Dkkl, Kremen2, LRP5, ouagir como um mimético de Norrin. Esse pode ser qualquersistema tanto envolvendo substratos, quanto livre em so-lução, em que se deixe ocorrer a ligação dos agentes deteste a qualquer um dos substratos acima mencionados o-correr, e, então, se ensaie a ligação determinada. Agen-tes de teste podem ser misturados com Frizzled4, Norrin,Dkkl, Kremen2 ou LRP5 sob condições fisiológicas (por e-xemplo, pH de cerca de 7,0 a cerca de 7,4; 240C a cercade 400C) durante um período de tempo suficiente para per-mitir a ligação, por exemplo, de cerca de 1 minuto to 6horas.

Os agentes de teste podem ser submetidos a umatriagem de ligação conforme acima discutido ou podem sercandidatos de qualquer biblioteca química. Os agentes deteste podem ser ensaiados em um sistema de ensaio à basede células. Esse sistema de ensaio à base de células podeser um em que as células sejam transfectadas de maneiratransitória ou estável com um ácido nucléico que codifi-que pelo menos uma das seguintes: Frizzled4, Norrin,Dkkl, Kremen2 ou LRP5, ou qualquer de suas combinaçoes.Assim, as células expressariam individualmente pelo menosFrizzled4 e Norrin, assim como os três genes restantes.Também haveria uma série de células co-transfectadas demaneira estável ou transitória com as seguintes combina-ções de ácidos nucléicos:

(a) Norrin e LRP5 e/ou LRP6

(b) Norrin, uma Dkk (por exemplo, Dkk 1 aDkk4) e LRP5 e/ou LRP6

(c) Norrin, uma Kremen (por exemplo, Kremen 1ou 2) e LRP5 e/ou LRP6

(d) Norrin, uma Kremen, uma Dkk e LRP5 e/ouLRP6

(e) Frizzled4 e Norrin; (f) Frizzled4, Norrin e : LRP5 (g) Frizzled4, Norrin e uma Dkk (por exemplo,Dkkl to Dkk4); (h) Frizzled4, Norrin e uma Kremen (por exem- pio, Kremen 1 e/ou 2); (i) Frizzled4, Norrin, uma Dkk e Kremen2; (j) Frizzled4, Norrin, LRP5 e Dkkl;

(k) Frizzled4, Norrin, LRP5 e Kremen2; e/ou (1) Frizzled4, Norrin, LRP5, Dkkl e Kremen2,e/ou

(m) ou qualquer combinação.

Também são consideradas para qualquer uma dascombinações acima LRP6, HBM, outras Dkks (por exemplo,Dkk2, Dkk3 e/ou Dkk4), Wnts e/ou Kremenl.Aqueles versados na técnica compreenderão queesse sistema de ensaio também pode requerer controles devetor, em que o vetor é um em que o ácido nucléico quecodifica qualquer uma das proteínas acima esteja opera-cionalmente ligado para expressão nas células. 0 controlede vetor pode consistir na transfecção transitória ou es-tável de células com apenas o vetor e/ou sem nenhum ve-tor. A transfecção transitória e a transfecção estável decélulas pode ser efetuada usando-se técnicas conhecidasna arte. Veja, por exemplo, Sambrook et al., MolecularCloning: A Laboratory Manual, volumes 1-3 (3a ed., Cold SpringHarbor Press, NY 2001) ou qualquer das edições anterioresde Sambrook. Co-transfecções podem ser preparadas de ma-neira transitória ou estável, conforme se sabe na técni-ca. Sambrook et al., 2001

Ácidos nucléicos que codificam Frizzled4, Nor-rin, LRP5, Dkkl e Kremen são relacionados na parte abai-xo, juntamente com suas seqüências de proteínas associa-das. As modalidades deste pedido não se limitam às se-qüências aqui apresentadas.

<table>table see original document page 60</column></row><table><table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table>

Seqüências adicionais de HBM e LRP5 (por exem-plo, Zmaxl) são apresentadas nos pedidos norte-americanosn° 09/544.398 (agora patente norte-americana n°6.770.461) e 10/240.851, que são aqui incorporados porreferência em sua inteireza para todas as finalidades.

As células que podem ser transfectadas podemser qualquer linhagem celular de mamíferos. Linhagens ce-lulares preferidas são linhagens celulares humanas, par-ticularmente quando se usam ácidos nucléicos que codifi-cam proteínas humanas para qualquer uma das acima. Assim,as transfecções podem ocorrer para ácidos nucléicos decamundongo em linhagens de camundongo ou para ácidos nu-cléicos humanos em linhagens humanas. As linhagens celu-lares podem ser linhagens celulares de osso, linhagenscelulares de rim, linhagens de células tronco de sereshumanos ou outros vertebrados. Linhagens celulares de rimexemplificativas incluem, mas não se limitam a, célulasHEK-293 cells (ATCC® No. CRL-1573) e células HepG2. Li-nhagens celulares de ossso exemplificativas incluem, masnão se limitam a, KHOS/NP (R-970-5) (ATCC® No. CRL-1544),KHOS-240S (ATCC® No. CRL-1545), KHOS-321H (ATCC® No. CRL-1546), DSDh (ATCC® No. CRL-2131), VA-ES-BJ (ATCC® No.CRL-2138), 7F2 (ATCC® No. CRL-12557), U-2 OS (também co-nhecida como U20S; ATCC® No. HTB-96), HOSTE85, ROS,MC3T3-E6, UMR-IO6, Saos2, MG63, e HOBs. Linhagens de cé-lulas tronco exemplificativas incluem, mas não se limitama, células tronco mesenquimais adultas humanas (CambrexBioscience) e a linhagem de células tronco de camundongo,C3H10T1/2 (ATCC).

Os ácidos nucléicos que codificam quaisquer dasproteínas incluiriam os quadros de leitura abertos(ORFs), assim como qualquer informação transcricional ne-cessária para transcrição e tradução. Os ácidos nucléicosque codificam as proteínas estariam, por sua vez, opera-cionalmente ligados a um vetor adequado para transfecçãoestável e/ou transitória em uma célula. Vetores adequadosincluem, mas não se limitam a, TK-renila, pcDNA3.1 (Invi-trogen), e pUSE (Upstate Biotech). Podem-se usar outrosvetores operacionais capazes de expressão em células devertebrados.

Qualquer sistema repórter que forneça informa-ções sobre a regulação de genes e suas proteínas associa-das poderia ser utilizado, incluindo, mas não limitadosa, TK-renila, β-galactosidase (β-gal), fosfatase alcali-na, proteína fluorescente verde (GFP) ou outro marcadorde prote ína fluorescente. Um sistema preferido, conformeaqui descrito é a combinação de TCF-Iuci e TK-renila,conforme descrito nos exemplos. Também se podem utilizaroutras combinações de repórter e vetor operacionais emcélulas de vertebrados.

Em um aspecto, as quantidades relativas de Nor-rin ou de uma proteína de interação com Norrin de uma po-pulação de células que tenha sido exposta ao agente a sertestado são comparadas a uma população de células de con-trole não expostas. Podem-se usar anticorpos para monito-rizar a expressão diferencial da proteína nas diferentespopulações celulares. Linhagens ou populações celularessão expostas ao agente a ser testado sob condições e tem-po apropriados. Podem-se preparar lisados celulares apartir da linhagem ou população celular exposta e um con-trole, linhagem ou população celular não exposta. Os li-sados celulares são, então, analisados com a sonda, con-forme se sabe na técnica. Veja, por exemplo, Ed Harlow eDavid Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Har-bor, NY, 1988) e Ed Harlow e David Lane, Using Antibodies: ALaboratory Manual (Cold Spring Harbor, NY 1998) .

Por exemplo, fragmentos N- e C-terminais deNorrin podem ser expressados em bactérias e usados para apesquisa de proteínas que se liguem a esses fragmentos.Podem-se preparar proteínas de fusão, como His-tag ou fu-são de GST às regiões N- ou C-terminais de Norrin (ou adomínios biologicamente ativos de Norrin) ou uma proteínaNorrin inteira. Essas proteínas de fusão podem ser aco-pladas, por exemplo, a glóbulos de Talon ou Glutationa-Sepharose e, então, sondados com lisados celulares paraidentificar quais se ligam a Norrin. Antes da lise, ascélulas podem ser tratadas com proteínas Wnt purificadas,RNA ou fármacos que modulem a sinalização de Wnt ou pro-teínas que interajam com elementos a jusante da via deWnt. Proteínas do lisado que se ligam às proteínas de fu-são podem ser resolvidas por SDS-PAGE, isoladas e identi-ficadas, por exemplo, por seqüenciamento de proteína ouespectroscopia de massa, conforme se sabe na técnica. Ve-ja, por exemplo, Protein Purification Applications: A PracticalApproach (Simon Roe, ed., 2a ed. Oxford Univ. Press, 2001)e "Guide to Protein Purification" em Meth. Enzymologyvol. 182 (Academic Press, 1997).

A atividade de Norrin, de um mimético de Nor-rin, de uma proteína de interação com Norrin (por exem-plo, agonista de Norrin ou antagonista de Norrin) ou deum complexo de Norrin com LRP5/LRP6/HBM e/ou uma proteínaKremen ou proteína Dkk pode ser afetada por compostos quemodulem a interação entre Norrin e uma proteína de inte-ração com Norrin, e/ou Norrin e LRP5/LRP6/HBM, Norrine/ou Frizzled4, uma proteína Dkk ou uma proteína Kremen.Apresentam-se aqui métodos e ferramentas de pesquisa paraa descoberta e caracterização desses compostos. A intera-ção entre Norrin ou um mimético de Norrin e uma proteínade interação com Norrin/Frizzled4 e/ou Norrin eLRP5/6/HBM, e Norrin/Dkk, e Norrin/Kremen pode ser moni-torizada in vivo e in vitro. Ensaios similares também po-dem ser usados para avaliar agonistas e antagonistas deNorrin. Compostos que modulam a estabilidade de um com-plexo Norrin/Fz4 são compostos terapêuticos em potencial.

Métodos in vitro exemplificativos incluem: aligação de LRP5/6/HBM, Norrin/Fz4 ou de uma proteína deinteração com Norrin/Fz4 a um chip sensor projetado paraum instrumento, como o fabricado pela Biacore (Uppsala,Suécia) para realizar uma observação por espectroscopíade ressonância de plasmon. Por exemplo, usando-se essemétodo, um chip com uma de Norrin/Fz4, uma proteína deinteração com Norrin/Fz4 ou LRP5/LRP6 pode ser primeiroexposto ao outro sob condições que permitam a formação deum complexo. Introduz-se, então, um composto de teste, eo sinal de saída do instrumento proporciona uma indicaçãode qualquer efeito exercido pelo composto de teste. Comesse método, podem-se ensaiar compostos rapidamente. Essemétodo pode ser usado para qualquer combinação de Nor-rin/Fz com LRP5, LRP6, HBM, qualquer Dkk, qualquer Kre-men, qualquer Wnt e qualquer combinação delas.

Outro método in vitro é exemplificado pelos mé-todos SAR-por-NMR (Shuker et al., 1996 Science 21 A:1531-4). Por exemplo, um domínio de ligação a Norrin/Fz4e/ou LRP5/LRP6/HBM LBD pode ser expressado e purificadocomo proteína marcada com 15N por expressão em meios mar-cados. Deixa-se que a(s) proteína(s) marcada(s) forme(m)o complexo em solução em um tubo de amostra de ressonân-cia magnética nuclear (NMR). 0 espectro de correlação he-teronuclear na presença e ausência de um composto de tes-te fornece dados no nível de resíduos individuais com re-lação a interações com o composto de teste e a alteraçõesna interface proteína-proteína do complexo. Esse métodopode ser usado com qualquer combinação de Nor-rin/Frizzled4 com LRP5, LRP6, HBM, qualquer Dkk, qualquerKremen, qualquer Wnt e qualquer de suas combinações.

Aqueles versados na técnica conhecem muitos ou-tros protocolos, por exemplo, eletroforese capilar de a-finidade (Okun et al., 2001 J. Biol. Chem. 276:1057-1062), espectroscopia de fluorescência, ressonânciaparamagnética de elétrons e outros, que também podem serusados para monitorizar a modulação de um complexo e/oumedir afinidades de ligação para formação de complexop napresença e ausência de um agente de teste para qualqueruma das combinações acima relacionadas de proteínas ouseus fragmentos biologicamente ativos.

Protocolos para monitorizar a modulação de umainteração Norrin/Frizzled4, uma interação Nor-rin/LRP5/Frizzled4 ou a interação de um mimético de Nor-rin com qualquer uma ou mais de LRP5, LRP6, HBM, Kremenl,Kremen2, qualquer Dkk e qualquer Wnt podem ser realizadosusando-se um protocolo de híbrido de levedura. 0 métodode dois ou mais híbridos de levedura pode ser usado paramonitorizar a modulação de um complexo por monitorizaçãoda expressão de genes ativados pela formação de um com-plexo de proteínas de fusão de Norrin/Frizzled4 e/ouqualquer outra proteína acima relacionada. Se for usadaLRP5, LRP6 ou HBM, então, a proteína completa pode serusada ou os domínios de ligação a ligante (LBDs) ou par-tes da hélice beta contendo as repetições YWTD. Ácidosnucléicos de acordo com a invenção que codificam domíniosde interação Norrin e Frizzled4 ou Norrin e LRP5/LRP6/HBMLBD são incorporados em plasmídios de isca e presa. O mé-todo de dois híbridos de levedura (Y2H) ou o método dehíbrido de levedura para três ou mais proteínas é reali-zado na presença de um ou mais compostos de teste. A mo-dulação do complexo é observada por uma alteração na ex-pressão do gene ativado no complexo. Aqueles versados natécnica perceberão que compostos de teste podem ser adi-cionados ao ensaio diretamente ou, no caso de proteína,podem ser co-expressados na levedura com os compostos deisca e presa. Da mesma forma, proteínas de fusão de Nor-rin e proteínas de interação com Norrin também podem serusadas em uma triagem Y2H para identificar outras proteí-nas que modulem o complexo Norrin/Frizzled4 (como Dkk,Kremen, outros reguladores negativos e reguladores posi-tivos). As tecnologias de híbrido de levedura são conhe-cidas na técnica. Veja, por exemplo, Li Zhu ε Gregory J.Ηάννον, Yeast Hybrid Technologies (2000) .

Protocolos de ensaio como esses podem ser usa-dos em métodos para a triagem de compostos, fármacos,tratamentos que modulem o complexo Norrin/Frizzled4, queressa modulação ocorra por ligação competitiva, agindo co-mo um mimético de Norrin, ou por alteração da estruturado complexo Norrin/Frizzled4, ou por estabilização ou de-sestabilização da interface proteina-proteina. Pode-seantecipar que aptâmeros peptidicos possam se ligar compe-titivamente, embora a indução de uma estrutura de sitiode ligação alterada por efeitos esféricos também sejapossível. Conforme aqui usado, um processo biológico oupatológico modulado por Norrin/Frizzled4 e o complexoNorrin/Fz4/LRP5 pode incluir a ligação de Norrin a Friz-zled4 ou a uma proteína que interaja com o complexo Nor-rin/Frizzled4/LRP5, ou impeça a regulação negativa de Dkke/ou Kremen do complexo Norrin/Frizzled4. Isso pode in-cluir compostos que interajam com a Norrin ou modulem asíntese das proteínas envolvidas com o complexo, assimcomo miméticos de Norrin.

Podem-se observar marcadores relacionados a os-so adicionais, como atividade de fosfatase alcalina, pro-dução de osteocalcina ou mineralização, além de outrosfatores relacionados a ossos que possam ser avaliados emconjunto com a análise bioquímica da modulação do comple-xo Norrin/Frizzled4/LRP5, conforme aqui discutido.

Processos patológicos se referem a uma catego-ria de processos biológicos que produzem um efeito preju-dicial. Por exemplo, a expressão ou regulação positiva daexpressão de LRP5 ou LRP6 e/ou Dkk e/ou uma proteína deinteração com Dkk pode estar associada a certas doençasou condições patológicas. Conforme aqui usado, diz-se queum agente modula um processo patológico quando o agentealtera o processo a partir de seu nível basal no sujeitopara um nível estatisticamente significativo. Por exem-plo, o agente pode reduzir o grau ou gravidade do proces-so mediado por essa proteína no sujeito ao qual o agentefoi administrado. Por exemplo, uma doença ou condição pa-tológica pode ser prevenida, ou a progressão de uma doen-ça modulada pela administração de agentes que reduzam oumodulem de alguma forma a expressão ou pelo menos uma a-tividade de uma proteína da invenção.

Como Frizzled4/Norrin e LRP5/LRP6 (assim comoKremen, Dkk e Wnt) estão envolvidas direta e/ou indireta-mente na modulação de massa óssea, uma modalidade destainvenção é usar o complexo Norrin/Frizzled4 e ligantes docomplexo Norrin/Frizzled4 como um método de diagnósticode uma condição ou doença óssea. Certos marcadores estãoassociados a condições de sinalização de Wnt específicas(por exemplo, ativação de TCF/LEF). Testes diagnósticospara condições ósseas podem incluir as etapas de teste deuma amostra ou seu extrato quanto à presença de ácidosnucléicos de Dkk ou de proteína de interação com Dkk (is-to é, DNA ou RNA), oligômeros ou seus fragmentos ou pro-dutos protéicos da expressão regulada de TCF/LEF. Por e-xemplo, hibridização in situ padrão ou outras técnicas deformação de imagem podem ser utilizadas para observarprodutos da sinalização de Wnt.

Também se discutem aqui métodos e materiais pa-ra a modulação do desenvolvimento ósseo ou condições deperda óssea. A inibição da perda óssea pode ser consegui-da por inibição ou modulação de alterações no complexoNorrin/Frizzled4 e, dessa forma, a via de sinalização deWnt. Por exemplo, a ausência de atividade de Norrin ouuma atividade de Dkkl aumentada pode estar associada abaixa massa óssea. Uma atividade aumentada de Norrin eFrizzled4 pode estar associada a alta massa óssea. Conse-qüentemente, a modulação da' atividade de Norrin/Frizzled4modulará, por sua vez, a massa óssea. A modulação de umainteração de Dkk com o complexo Norrin/Frizzled4 medianteagonistas e antagonistas é uma modalidade de um métodopara regular o desenvolvimento ósseo.

Os agentes da presente invenção podem ser apre-sentados isoladamente ou em combinação com outros agentesque modulem um processo patológico particular. Conforme 'aqui usado, diz-se que dois agentes são administrados emcombinação quando os dois agentes são administrados si-multaneamente ou são administrados independentemente, masde modo que os agentes ajam ao mesmo tempo.

Os agentes da presente invenção podem ser admi-nistrados a um animal de teste não humano, por exemplo,pelas vias parenteral, subcutânea (s.c.), intravenosa(i.v.), intramuscular (i.m.), intraperitoneal (i.p.),transdérmica ou bucal. Alternativamente, ou concomitante-mente, a administração pode ser pela via oral. A dosagemadministrada dependerá da idade, saúde e peso do recep-tor, do tipo de tratamento concomitante, caso haja, dafreqüência do tratamento e da natureza do efeito deseja-do.

A presente invenção também apresenta composi-ções contendo um ou mais agentes que modulem a expressãoou pelo menos uma atividade de Norrin ou do complexo Nor-rin/Frizzled4 ou que ajam como um mimético de Norrin. Em-bora as necessidades individuais variem, a determinaçãode faixas, ótimas de quantidades eficazes de cada compo-nente está ao alcance da técnica. Dosagens típicas do a-gente ativo, que incluem um mimético de Norrin ou um a-gente que medeie Norrin, uma proteína de interação comNorrin, ou um ligante do complexo Norrin/Frizzled4 (oucomplexo Norrin/Frizzled4/LRP5, que também é consideradosempre que complexos Norrin/Frizzled4 são discutidos),podem compreender de cerca de 0,0001 a cerca de 50 mg/kgde peso corporal. As dosagens preferidas podem compreen-der de cerca de 0,001 a cerca de 50 mg/kg de peso corpo-ral. As dosagens mais preferidas podem compreender decerca de 0,1 a cerca de 1 mg/kg de peso corporal. Em umser humano médio de 70 kg, a faixa seria de cerca de 7 pga cerca de 3,5 g, com uma faixa preferida de cerca de 0,5mg a cerca de 5 mg (e, por exemplo, gualquer valor de 0,1mg dentro dessa faixa).

Além do agente farmacologicamente ativo, ascomposições da presente invenção podem conter veículosfarmaceuticamente aceitáveis adequados, compreendendo ex-cipientes, veículos e auxiliares que facilitem o proces-samento dos compostos ativos em preparações que possamser usadas farmaceuticamente para distriuição no sítio deação. Formulações adequadas para administração parenteralincluem soluções aquosas dos compostos ativos em formasolúvel em água, por exemplo, sais solúveis em água. Alémdisso, podem-se administrar suspensões dos compostos ati-vos, como suspensões para injeção oleosa apropriadas.Solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleosgraxos (por exemplo, óleos vegetais, como óleo de gerge-lim) ou ésteres de ácidos graxos sintéticos (por exemplo,oleato de etila ou triglicerídeos). Suspensões aquosaspara injeção podem conter substâncias que aumentem a vis-cosidade da suspensão e incluem, mas não se limitam a,carboximetil celulose sódica, sorbitol e/ou dextrano. Op-cionalmente, a suspensão também pode conter estabilizado-res. Lipossomos e outros vetores não virais também podemser usados para encapsular o agente para distribuição nacélula.

A formulação farmacêutica para administraçãosistêmica de acordo com a invenção pode ser formulada pa-ra administração enteral, parenteral ou tópica (top). Defato, todos os três tipos de formulações podem ser usadossimultaneamente para se conseguir uma administração sis-têmica do ingrediente ativo.

Formulações adequadas para administração oralincluem cápsulas de gelatina dura ou macia, pílulas, com-primidos, incluindo comprimidos revestidos, elixires,suspensões, xaropes ou inalações e suas formas de libera-ção controlada.

Potencialmente, qualquer composto que se liguea e, dessa forma, module Norrin, um mimético de Norrin,um ligante de Norrin ou o complexo Norrin/Frizzled4 podeser um composto terapêutico. Em uma modalidade da inven-ção, um aptâmero peptídico ou de ácido nucléico de acordocom a invenção é usado em uma composição terapêutica. Es-sas composições podem compreender um aptâmero ou um frag-mento de Norrin/Frizzled4, não modificado ou modificado.

Em outra modalidade, o composto terapêutico compreendeuma proteína de interação com Norrin ou com complexo Nor-rin/Frizzled4 ou seu fragmento biologicamente ativo.Aptâmeros de ácido nucléico são usados em com-posições, por exemplo, por ligação quimica a uma moléculade veiculo, como polietileno glicol (PEG), que pode faci-litar a captação ou estabilizar o aptâmero. Uma fraçãodialquilglicerol ligada a um RNA pode. ser usada para in-crustar o aptâmero em lipossomos, estabilizando, dessaforma, o composto. A incorporação de substituições quími-cas (isto é, a troca do grupo 2'-OH da ribose por um 2 ' -NH no RNA confere resistência a ribonuclease) e remate, eoutros, pode evitar a degradação. Várias dessas técnicassão discutidas para aptâmeros de RNA em Brody e Gold,2000 Rev. Mol. Biol. 74: 3-13.

Aptâmeros peptídicos podem ser usados em apli-cações terapêuticas pela introdução de um vetor de ex-pressão que dirija a expressão do aptâmero no tecido afe-tado como, por exemplo, por distribuição retroviral, porencapsulação do DNA em um complexo de distribuição ousimplesmente por injeção de DNA nu. Ou o próprio aptâmeroou um análogo sintético pode ser usado diretamente comoum fármaco. A encapsulação em polímeros e lipídios podeauxiliar na distribuição. 0 uso de aptâmeros peptídicoscomo agentes terapêuticos e diagnósticos é revisado emHoppe-Syler e Butz, 2000 J. Mol. Med. 78: 426-430.

Em outro aspecto, a estrutura de um aptâmeropeptídico restringido da invenção pode ser determinadapor NMR ou cristalografia de raios X (Cavanagh et al.,Protein NMR Spectroscopy: Principles and Practice, Academic Press,1996; Drenth, Principles of Protein X-Ray Crystallography, Sprin-ger Verlag, 1999). De preferência, a estrutura pode serdeterminada no complexo com a proteína alvo. Um análogode molécula pequena é, então, projetado de acordo com asposições de elementos funcionais da estrutura tridimensi-onal do aptâmero. (Guidebook on Molecular Modeling in Drug Design,Cohen, Ed., Academic Press,. 1996; Molecular Modeling and DrugDesign (Topics in Molecular and Structural Biology) , Vinter eGardner Eds., CRC Press, 1994). Apresentam-se aqui méto-dos para a identificação e projeto de fármacos eficazes eespecíficos que modulem a atividade de Norrin, ajam ummimético de Norrins, proteínas de interação com Norrin,proteínas de interação com Norrin/Frizzled4 e o complexoNorrin/Frizzled4. Mimétodos de molécula pequena dos aptâ-meros peptídicos também são considerados dentro do âmbi-to .

2 .1 Ensaio Repórter Funcional de Norrin à Basede Células

Os ensaios repórteres de TCF descritos nos e-xemplos abaixo podem ser desenvolvidos em ensaios de tri-agem para identificar miméticos de Norrin (FIGS. 1 e 2)ou para identificar antagonistas de inibidores do sinalde Norrin, como antagonistas de Dkkl/Kremen2 (FIG. 3). Emambos os tipos de ensaios, quando efetuados em células dotipo ósseo ou não ósseo, as moléculas ativas intensifica-riam os sinais de TCF-Iuciferase ou outro método de sinaladequado.

2.2 Ensaios de Norrin/LRP5/LRP6 eDKK/LRP5/LRP6/Kremen

Outro método que pode ser usado para a triagemde reagentes que modulem a interação de Norrin com Friz-zled4/LRP5/LRP6 é mediante um ensaio imunossorvente liga-do a enzima (ELISA). Duas possíveis permutações desse en-saio são exemplificadas, mas outras também podem ser uti-lizadas. Por exemplo, LRP5 pode ser imobilizadas em umasuperfície sólida, como um poço de placa de cultura detecido. Aqueles versados na técnica reconhecerão que ou-tros suportes, como, mas não limitados a, uma membrana denáilon ou nitrocelulose, um chip de silício, uma lâminade vidro, glóbulos e outros, podem ser usados como subs-titutos. Uma maneira de fazer isso pode ser com a formade LRP5/LRP6/Fz4 como uma proteína de fusão, em que o do-mínio extracelular de LRP5/LRP6/Fz4 é fusionado à parteFc de uma IgG humana ou outra IgG. A proteína de fusãoLRP5/LRP6/Fz4-Fc pode ser produzida em células de ováriode hamster chinês (CHO) (ou outra linhagem celular ade-quada) , em que as proteínas de fusão são extraídas daslinhagens celulares ou dos meios. A proteína de fusãoLRP5/6/Fz4-Fc isolada pode ser imobilizada na superfíciesólida mediante um anticorpo anti-Fc humano ou por placasrevestidas com Proteina-A ou Proteína G, por exemplo. 0substrato pode ser, então, lavado para remover qualquerproteína não ligada. Meios condicionados contendo proteí-na Norrin secretada ou proteína etiquetada no epítopo deNorrin secretada (ou Norrin purificada, proteína etique-tada no epítopo de Norrin purificada, mimético de Norrinou um fragmento contendo uma parte biologicamente ativade Norrin envolvida na modulação óssea) podem ser incuba-dos nos poços ou recipientes. Alternativamente, um rea-gente de teste pode ser incubado com a proteína de fusãofixada para a triagem de miméticos de Norrin. A ligaçãode Norrin ou de um mimético de Norrin a LRP5/LRP6/Fz4 po-de ser avaliada usando-se anticorpos contra Norrin oucontra uma etiqueta no epítopo. Por exemplo, uma proteínaetiquetada no epítopo de Norrin-V5 ou seu fragmento podeser detectada com um anticorpo anti-V5. Esse ensaio podeser, então, usado, por exemplo, para identificar miméti-cos de Norrin, agonistas de Norrin e imunoglobulinas quese liguem de maneira similar à Norrin à proteína de fusãoLRP5/LRP6/Fz4. Os ensaios podem, por exemplo, estar naforma de um ensaio competitivo, reagentes de teste eti-quetados e outros. Esses sistemas de ensaio também podemser utilizados com HBM. O ensaio também pode ser modifi-cado para ter lavagens que incluem uma proteína Dkk, Kre-men e/ou Wnt ou seu fragmento biologicamente ativo, quan-do da triagem de agentes de teste que modulem a interaçãoe formação de complexos entre esas proteínas e polipeptí-dios.

Alternativamente, a proteína Norrin ou seufragmento biologicamente ativo (todas as referência àproteína Norrin consideram que um fragmento biologicamen-te ativo também pode ser usado) ou um mimético de Norrin,que esteja envolvido na modulação óssea, poderia ser di-retamente fusionado a um marcador de detecção, como fos-fatase alcalina. Aqui, a detecção da interação Norrin-LRP5/LRP6/Fz4 pode ser diretamente investigada, sem expe-rimentos baseados em anticorpos subseqüentes. A Norrin oumimético de Norrin ligado é detectado em um ensaio defosfatase alcalina ou por outro ensaio de detecção. Se aproteína de fusão Norrin-fosfatase alcalina estiver liga-da à LRP5/LRP6/Fz4 imobilizada, a atividade de fosfatasealcalina seria detectada em uma leitura colorimétrica,radioativa ou fluorescente. Como resultado, pode-se en-saiar a capacidade de compostos de molécula pequena dealterar a ligação de Norrin a LRP5/LRP6/Fz4 usando-se es-se sistema ou se o reagente de teste é um mimético deNorrin ou agonista de Norrin. Por exemplo, compostos,quando adicionados com Norrin (ou Norrin etiquetada noepítopo) a cada poço da placa, podem ser classificadosquanto a sua capacidade de modular a interação entre Nor-rin e LRP5/LRP6/Fz4 com base na intensidade do sinal deNorrin ligada presente no poço após um tempo de incubaçãoadequado e lavagem. O ensaio pode ser calibrado fazendo-se experimentos de competição coom Norrin não marcada oucom um segundo tipo Norrin etiquetada no epitopo. Qual-quer molécula que seja capaz de modular (por exemplo, in-tensificar) a interação Norrin-LRP5/LRP6/Fz4 pode ser umcandidato terapêutico adequado, mais preferivelmente umcandidato terapêutico osteogênico ou um candidato capazde modular um lipidio (por exemplo, ApoE, LDL, HDL, VLDL,triglicerídeo, colesterol). Essas moléculas incluem com-postos químicos pequenos, peptídios e imunoglobulinas;(anticorpos, fragmentos de anticorpos) todos podendo serexaminados com um sistema de ensaio.

2.3 Ensaio Homogêneo de Norrin-LRP5/6/Fz4Outro método para investigar a modulação de in-terações proteína-proteína é mediante Transferência deEnergia por Ressonância de Fluorescência (FRET). A FRET éum processo mecânico quântico, em que uma molécula fluo-rescente, a doadora, transfere energia para uma moléculacromófora receptora que esteja em íntima proximidade. Damesma forma, um Ensaio Homogêneo de Proximidade Lumines-cente Amplificada (triagem ALFA) também pode ser usadopara avaliar domínios de interação com Norrin-LRP5/6 ouFz4 e a função de miméticos de Norrin no complexoFz4/LRP5. Esses sistemas foram usados com sucesso na li-teratura para caracterizar as interações intermolecularesentre LRP5 e Axina (veja, por exemplo, Maio et al., Mo-lec. Cell Biol. 7: 801-9). Há muitas etiquetas flúores-centes diferentes para esses estudos, e há muitas manei-ras para etiquetar de maneira fluorescente as proteínasde interesse. Por exemplo, CFP (isto é, proteína fluores-cente ciano) e YFP (isto é, proteína fluorescente amare-la) podem ser usadas como doador e receptor, respectiva-mente. Proteínas de fusão, com um doador e um receptor,podem ser manipuladas, expressadas e purificadas ou con-jugadas a glóbulos doadores e receptores específicos.

Por exemplo, em ensaios do tipo FRET, proteínasNorrin purificadas, ou seus polipeptídios biologicamenteativos, ou agentes que estejam sendo triados como miméti-cos de Norrin podem ser fusionados a CFP (ou outra prote-ína fluorescente), e proteína LRP5/6/Fz4 purificada ouseus polipeptídios biologicamente ativos (por exemplo,LBD ou domínio contendo hélice beta) fusionada a YFP podeser gerada e purificada usando-abordagens padronizadas.Se Norrin-CFP e LRP5/Fz4-YFP forem encontradas em íntimaproximidade, a transferência de energia de CFP para YFPresultará em uma redução na emissão de CFP e um aumentona emissão de YFP. A energia é suprida com um comprimentode onda de excitação de 450 nm, e a transferência de e-nergia é registrada a comprimentos de onda de emissão de480 nm e 570 nm. A razão de emissão de YFP para emissãode CFP proporciona um calibre para alterações na intera-ção entre Norrin (ou mimético de Norrin) e LRP5/Fz4. Essesistema é capaz de fazer a triagem de compostos de molé-cuia pequena que possam alterar a interação proteína-proteína Norrin-LRP5/Fz4 e a atividade na cascata de Wnt.Compostos que intensificam ou rompem a interação seriaidentificados por um aumento ou diminuição, respectiva-mente, na razão de emissão de YFP para emissão de CFP.Compostos que modulam a interação LRP5/Fz4 da mesma ma-neira que Norrin seriam, então, considerados candidatos amoléculas miméticas de Norrin. Também seria feita a tria-gem de agentes que intensificassem a atividade do tipoNorrin. Esses sistemas de ensaio também podem ser modifi-cados com diferentes proteínas fluorescentes, para inclu-ir Kremen, Dkk e/ou Wnt em-várias combinações. A caracte-rização adicional dos compostos pode ser feita usando-seos ensaios de TCF-Iuciferase ou embrião de Xenopus paraelucidar os efeitos dos compostos sobre a sinalização deNorrin funcional.

2.4 Ensaio de Híbrido de Levedura0 sistema de dois híbridos, três híbridos ououtros de levedura ou outro sistema de híbrido delevedura é extremamente útil para estudar interaçõesproteína:proteína. Veja, por exemplo, Chien et al. , 1991Proc. NatfI Acad. Sei. USA 88: 9578-82; Fields et al.,1994 Trends Genetics 10: 286-92; Harper et al., 1993 Cell75: 805-16; Vojtek et al., 1993 Cell 74: 205-14; Luban etal., 1993 Cell 73: 1067-78; Li et al., 1993 FASEB J. 7:957-63; Zang et al., 1993 Nature 364: 308-13; Golemis etal., 1992 Mol. Cell. Biol. 12: 3006-14; Sato et al. , 1994Proc. NatfI. Acad. Sei. USA 91: 9238-42; Coghlan et al.,1995 Science 267: 108-111; Kalpana et al. , 1994 Science266: 2002-6; Helps et al. , 1994 FEBS Lett. 340: 93-8;Yeung et al., 1994 Genes & Devei. 8: 2087-9; Durfee etal., 1993 Genes & Devei. 1: 555-569; Paetkau et al., 1994Genes & Devei. 8: 2035-45; Spaargaren et al., 1994 Proc.NatrI. Acad. Sei. USA 91: 12609-13; Ye et al., 1994 Proc.NatfI Acad. Sei. USA 91: 12629-33; e patentes norte-americanas n° 5.989.808, 6.251.602 e 6.284.519.

Variações do sistema são disponíveis para atriagem de fagemídio de levedura (veja, por exemplo,Harper, Cellular Interactions and Development: A Practical Approach,153-179 (1993); e Elledge et al., 1991 Proc. NatfI Acad.Sei. USA 88: 1731-5), ou bibliotecas de cDNA deplasmídios (Bartel, 1993 Cell 14: 920-4); Finley et al. ,1994 Proc. NatfI Acad. Sei. USA 91: 12980-4) para clonarproteínas que interajam, assim como para estudas pares deproteínas conhecidas.

O sucesso do sistema de dois híbridos se baseiano fato de que os domínios de ligação a DNA e de ativaçãode polimerase de muitos fatores de transcrição, comoGAL4, podem ser separados e, então, reunidos pararestaurar a funcionalidade (Morin et al., 1993 Nuc. AcidsRes. 21: 2157-63). Embora esses exemplos descrevemtriagens de dois híbridos no sistema de levedura, deve-seentender que uma triagem de dois híbridos pode serconduzida em outros sistemas, como linhagens celulares demamíferos. A invenção, portanto, não se limita ao uso deum sistema de dois híbridos de levedura, mas englobaesses sistemas alternativos.

Cepas de leveduras com cópias integradas devários cassetes de gene repórter como, por exemplo,GAL^LacZ, GAL-HIS3 ou GAL-URA3 (Bartel, in CellularInteractions and Development: A Practical Approach, 153-17 9(1993); Harper et al., 1993 Cell 75: 805-16; Fields etal., 1994 Trends Gerietics 10: 286-92) são co-transfectadas com dois plasmídios, cada um expressandouma proteína de fusão diferente. Um plasmídio codificauma fusão entre a proteína "X" e o domínio de ligação aDNA de, por exemplo, o ativador de transcrição delevedura GAL4 (Brent et al., 1985 Cell 43: 729-36; Ma etal., 1987 Cell 48: 847-53; Keegan et al., 1986 Science231: 699-704), enquanto o outro plasmídio codifica umafusão entre a proteína "Y" e o domínio de ativação de RNApolimerase de GAL4 (Keegan et al. , 1986). Os plasmídiossão transformados em uma cepa da levedura que contém umgene repórter, como IacZ, cuja região reguladora contémsítios de ligação a GAL4. Se as proteínas XeYinteragirem, elas reconstituem uma proteína ativadora detranscrição GAL4 funcional por colocação dos doiscomponentes GAL4 em proximidade suficiente para ativar atranscrição. Compreende-se bem que o papel das proteínasde isca e presa pode ser alternativamente trocado e,portanto, as modalidades desta invenção consideram ambosos arranjos alternativos.

Qualquer proteína híbrida isoladamente tem deser incapaz de ativar a transcrição do gene repórter. Ohíbrido de domínio de ligação a DNA tem de ser incapaz deativar a transcrição, porque não apresenta uma função deativação, e o híbrido de domínio de ativação tem de serincapaz de ativar a transcrição, porque não podelocalizar os sítios de ligação a GAL4. A interação das duas proteínas de teste reconstitui a função de GAL4 eresulta na expressão do gene repórter. Os cassetes degene repórter consistem em promotores mínimos que contêmo sítio de reconhecimento de DNA de GAL4 (Johnson et al.,1984 Mol. Cell. Biol. 4: 1440-8; Lorch et al. , 1984 J.Mol. Biol. 186: 821-824) clonado em 5' com relação a suacaixa TATA. A ativação da transcrição é classificadamedindo-se a expressão de β-galactosidase (ou outrorepórter) ou o crescimento dos transformantes em meiomínimo desprovido do nutriente específico que permita aseleção auxotrófica do produto de transcrição, porexemplo, URA3 (seleção de uracila) ou HIS3 (seleção dehistidina). Veja, por exemplo, Bartel, 1993; Durfee etal., 1993 Genes & Devei. 7: 555-569; Fields et al., 1994Trends Genet. 10: 286-292; e patente norte-americana n°5.283.173.

Genericamente, esses métodos incluem duasproteínas a serem testadas quanto à interação, que sãoexpressadas como híbridos no núcleo de uma célula delevedura. Uma das proteínas é fusionada ao domínio deligação a DNA (DBD) de um fator de transcrição,e a outraé fusionada a um domínio de ativação de transcrição (AD).Se as proteínas interagirem, elas reconstituem um fatorde transcrição funcional que ativa um ou mais genesrepórteres que contêm sítios de ligação para o DBD.Ensaios de dois híbridos exemplificativos são de Norrin,Norrin/Frizzled4 ou fusões Frizzled4/LRP5.

3. Métodos In vivo de Ensaio de Agentes

Além dos métodos in vitro aqui identificados,os métodos e materiais também podem incluir o uso de ani-mais para estudas o efeito de agentes de teste triados eidentificados por análises in vitro. Por exemplo, animaistransgênicos em que um (ou mais) dos genes de Norrin,Kremen (Kremen 1 e/ou 2), Dkk (Dkkl, Dkk2, Dkk3 e/ouDkk4), LRP5, LRP6, HBM, Wnt (Wntl a Wntl9) e Frizzled4genes são introduzidos como cDNAs. Exemplos de animaistransgênicos de LRP5 e HBM podem ser encontrados no Pedi-do Internacional PCT n° PCT/US02/14876 e no pedido de pa-tente norte-americana n° 10/680.287. A matéria desses pe-didos é aqui incorporada por referência em sua inteirezapara todas as finalidades.

Assim, em um aspecto, depois das etapas de tri-agem do agente de teste contra qualquer uma das linhagenscelulares transfectadas acima discutidas e/ou depois queos agentes tiverem sido testados para se observar se elesse ligam a qualquer uma de Dkk, Norrin, Frizzled4, LRP5,LRP6, HBM, Wnt e/ou Kremen, esses agentes de teste tambémpodem ser avaliados in vivo. A adição da etapa de testede reagentes in vivo acrescenta uma etapa de validaçãoaos testes obtidos por qualquer um dos meios discutidosna Seção 2 acima. Os reagentes podem ser administradosaos animais mediante qualquer meio de administração ade-quado para o composto, por exemplo, oral, intravenosa,intramuscular, intraperitoneal, cutânea e outros. A admi-nistração pode depender da formulação do composto de tes-te. Por exemplo, pequenos RNAs inibidores (siRNAs) e imu-noglobulinas podem ser administrados por via intravenosa,em vez de oral. Pequenos compostos químicos podem ser ad-ministrados por via oral ou intravenosa. As quantidadesdo composto de teste seriam administradas com base no pe-so do animal.Os animais também poderiam ser utilizados paratestar a biodisponibilidade e os produtos de degradaçãodos compostos.

Os animais receberiam a administração do com-posto de teste durante um período de dias, semanas ou me-ses. A administração pode ser diária, semanal, bimensal,mensal ou outra. Os animais podem receber apenas a admi-nistração do agente ou em conjunto com exercício, o quecausa distorção dos ossos do animal. A discussão de comoa distorção pode ser imposta aos ossos dos animais é des-crita no Pedido Internacional PCT n° PCT/US2004/17951. 0conteúdo desse pedido é aqui incorporado por referênciaem sua inteireza para todas as finalidades.

Por exemplo, o pDXA pode ser medido em animaisdo tipo selvagem e transgênicos que recebam a administra-ção de várias dosagens dos agentes. Por exemplo, camun-dongos do tipo selvagem e transgênicos são anestesiados,pesados, e varreduras de raios X de corpo inteiro no es-queleto são geradas usando-se o dipositivo LUNAR PIXImuspara pequenos animais. As varreduras podem ser realizadasquando os camundongos são desmamados (isto é, com 3 sema-nas de idade) e repetidas a intervalos de 2 semanas. Ani-mais do tipo selvagem podem receber varreduras em 3, 5,7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 27 e 29 semanas. A var-redura de animais transgênicos pode ser realizada duranteperíodos de até 17 semanas. As varreduras podem ser ana-lisadas quanto a BMD (densidade mineral óssea), BMC (teormineral ósseo), TTM (massa tissular total) e porcentagem(%) de gordura para várias regiões do corpo.

Além disso ou alternativamente, podem-se obterradiografias faxitron dos animais acima. Por exemplo, a-pós a varredura pDXA de animais anestesiados, pode-se ti-rar um raio X adicional usando-se um dispositivo Faxitronque permita a medição do tamanho do osso.

Além disso ou alternativamente, pode-se reali-zar a marcação com calceina dos animais acima. Por exem-plo, os animais podem ser dosados com calceina a 15 mg/kgde peso do animal em duas ocasiões consecutivas. A pri-meira dose pode ser dada 9 dias antes do animal ser sub-metido à eutanásia, e a segunda dose dois dias antes daeutanásia. Também se pode determinar a medição da forma-ção óssea.

Certos tipos de análises ex vivo dos animaisacima também podem ser opcionalmente realizadas. Por e-xemplo, pode-se fazer o isolamento de RNA do tecido, pQCTe microCT ^CT), histologia, análise de resistência aodobramento, análise de resistência compressiva de vérte-bras e análises séricas podem ser realizadas. Por exem-plo, RNA pode ser isolado da tibia e outros tecidos usan-do-se TRIzol7 para determinar a expressão de mRNA. A aná-Iise pQCT de qualquer um dos animais acima pode ser rea-lizada por obtenção de um fêmur e limpeza de tecidos mo-les. 0 fêmur pode ser, então, armazenado em etanol a 70%para a determinação de densidade total e trabecular dametáfise distai, e a densidade cortical do meio do eixo,então, determinada.

A análise do fêmur do animal também pode serusada para determinar índices trabeculares da metáfisedistai.

Opcionalmente, pode-se realizar uma análisehistológica dos animais acima. Por exemplo, o fêmur de umcamundongo pode ser usado para determinar a área óssea eparâmetros estáticos e dinâmicos da metáfise distai. Al-ternativamente ou além disso, pode-se realizar uma imuno-histoquímica (por exemplo, hibridização in situ de marca-dores osteogênicos e coloração TUNEL das células que so-fram apoptose).

Qualquer um dos animais acima também pode terseus ossos examinados quanto à resistência ao dobramentoou resistência compressiva de vértebras. Para a resistên-cia ao dobramento, o fêmuro do animal (ou outro osso ade-quado) pode ser limpado do tecido mole e armazenado acerca de -20°C antes da análise da resistência ao dobra-mento em 3 pontos do eixo médio. A resistência compressi-va pode ser medida por remoção da espinha, por exemplo,de um camundongo em TlO a L6 ou L7. 0 tecido mole é dei-xado na espinha, que é, então, congelada a cerca de -20°Caté a análise. A resistência compressiva é freqüentementemedida na vértebra L5.

Para fins de análise de lipidios, pode-se ava-liar o soro dos animais. Por exemplo, os animais podemser submetidos à eutanásia, e o soro preparado a partirdo sangue para medir o colesterol total, triglicerideos,osteocalcina e outros marcadores bioquímicos substitutos.

Os transcritos de gene e a modulação da expres-são também podem ser avaliados nos animais. Por exemplo,sabe-se que a carga sobre os ossos tem um impacto sobreos genes da seguinte maneira:

TABELA 1

<table>table see original document page 91</column></row><table><table>table see original document page 92</column></row><table>

Qualquer um ou mais dos genes acima menciona-dos, em qualquer combinação, pode ser avaliado quanto aalterações na expressão devido à administração de um a-gente de teste, agente de controle, tensão sobre o ossoou célula óssea e assim por diante. O perfil de genes po-de ser produzido e, então, avaliado em conjunto com o e-feito que o agente tem sobre a Norrin-Frizzled4 ou o com-plexo Frizzled4-LRP5 e sua atividade na via de Wnt. Porexemplo, o perfil de gene/proteina obtido pelo agente quemodulou o complexo Norrin-Frizzled4-LRP5 ou um miméticode Norrin produz um perfil como o observado com a admi-nistração de um antagonista de Dkk ou antagonista de Kre-men ou por tensão sobre o osso ou célula óssea.

com a modulação por um agente também pode ser realizadain vitro. Por exemplo, a carga gravitacional pode ser u-sada para induzir tensão sobre qualquer uma das célulasósseas aqui discutidas, e o perfil da expressão de genede qualquer um ou mais dos genes ou qualquer combinaçãodos seguintes genes pode ser avaliado como parte de umperfil de tensão óssea. 0 perfil de tensão óssea pode seravaliado para ver se, por exemplo, um mimético de Norrininduz uma intensificação no perfil de tensão óssea ou di-minui a inibição de Dkk e/ou Kremen nos genes de um per-fil de tensão óssea.

A carga óssea e a comparação da carga óssea com

Gene

TABELA 2

<table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 94</column></row><table><table>table see original document page 95</column></row><table><table>table see original document page 96</column></row><table>

A determinação de se os agentes de teste admi-nistrados podem induzir um efeito modulador ósseo podeser avaliada por raios X quanto a alterações da densidadeóssea ou por sacrifício do animal e exame de osso corti-cal, conforme descrito no pedido de patente norte-americana n° 10/680.287 e Pedido Internacional PCT n°PCT/US2004/17951, ou qualquer um dos métodos aqui descri-tos ou conhecidos na técnica. O conteúdo desses pedidos éaqui incorporado por referência em sua inteireza para to-das as finalidades.

4. Métodos de Estudo da Carga Óssea In vitroUm aspecto da invenção é o estudo do efeito dacarga óssea in vitro e meios pelos quais os benefícios dacarga óssea (isto é, mineralização óssea aumentada) podemser intensificados. O estudo da intensificação da cargaóssea pode ser feito tanto in vivo (conforme acima discu-tido) , quanto in vitro. Ά intensificação da carga ósseapode ser primeiro realizada in vitro, seguida, então, porexperimentos in vivo, como aqueles acima discutidos.

Conseqüentemente, um aspecto da invenção envol-ve a colocação das células sob condições que simulem es-timulos de carga. Há vários métodos disponíveis para adistorção de culturas celulares para simular a respostade carga óssea observada in vivo. Esses métodos incluem,mas não se limitam a, cisalhamento com fluido, compressãohidrostática, estiramento uniaxial, estiramento biaxial,carga gravitacional e carga induzida usando-se um Flexer-cell® ou sistema equivalente.

4.1 Estímulos de Carga Óssea

Genes preferidos que são modulados por um estí-mulo de carga óssea, como aqueles proporcionados porqualquer um dos métodos acima, incluem, mas não se limi-tam a, SFRPl, conexina, WISP2 43, CCND1, WntlOb, Jun,Fos, PTGS2 (COX-2) e eNOS. Genes adicionais podem ser mo-nitorizados quanto a aumentos em sua atividade (por exem-plo, transcritos de mRNA aumentados e proteína), conformerefletido nas presentes Tabelas. Pelo menos seis genesque se mostraram consistentemente regulados positivamenteem resposta à carga óssea (isto é, Jun, Fos, eNOS, SFRP1,COX-2 e Conexina 43) também são intensificados pela adi-ção de um agente que ative a via de Wnt. Outros genes,como Wnt2, não são intensificados pela adição de reagen-tes que ativaram a via de Wnt (por exemplo, inibidores deGSK-3 e Wnt 3A e seus agonistas, miméticos e variantes) eapenas respondem à carga óssea. Assim, um aspecto inclui-ria o uso desses sistemas in vítro para estudas a inten-sificação dos genes de perfil de tensão em resposta a,por exemplo, um mimético de Norrin, um agonista de Nor-rin, um mimético de Frizzled4 ou um mimético de Friz-zled4.

4.1.1 Estimulo de Cisalhamento com FluidoUm método de indução da carga óssea é por cisa-lhamento com fluido. 0 cisalhamento com fluido pode uti-lizar um viscosimetro de cone e placa que gera um cisa-lhamento lamina continuo por um mecanismo de agitação.Alternativamente, um aparelho de alça de fluxo pode pro-duzir esse cisalhamento em uma câmara de cultura de fluxoparalelo. Estes últimos método e aparelho são exemplifi-cados pelo sistema Streamer produzido pela Flexcell In-ternational Corporation. Também se sabe que o aparelhode alça de fluxo produz um estimulo reprodutivel e con-sistente. As únicas desvantagens são que os pontos extre- mos são tipicamente de curta duração e se essas altera-ções têm impacto sobre a função de osteoblastos diferen-ciados (Basso et al., 2002 Bone 30(2): 347-51).

4.1.2 Estimulo de Compressão HidrostáticaUm segundo método de indução de carga óssea é ouso de compressão hidrostática. A compressão hidrostáticapode utilizar ar comprimido para gerar uma força continuaou intermitente que se acredita que localiza a força es-pecificamente em regiões em que as células interagem coma proteína de matriz extracelular/proteinas de adesão.

4.1.3 Estímulo de Estiramento Uniaxial

Um terceiro meio de induzir carga óssea in vi-tro é o uso de um estímulo de estiramento uniaxial. O mé-todo de estiramento uniaxial utiliza força de estiramentoem uma direção. O método envolve o crescimento de célulasem uma cultura de tecido em uma tira tratada de películade poliestireno ou outra película, que é fixada a uma ca-mada flexível de silicone. A camada de silicone é adicio-nalmente fixada a duas barras metálicas. As barras metá-licas podem ser manipuladas uma com relação à outra usan-do-se um eletromagneto ou algum outro meio de movimenta-is ção. Esse método não cria nenhum cisalhamento com fluido.A falta de cisalhamento com fluido torna esse método me-nos preferido, porque o fluxo de fluido intersticial podedesempenhar um papel maior na remodelagem óssea que o es-tiramento mecânico. Portanto, esse método pode não simu-lar completamente o que ocorre in vivo, a despeito do es-timula reprodutível e consistente produzido (Basso etal., 2002 Bone 30(2): 347-51).

4.1.4 Estímulo de Estiramento Biaxial

0 estiramento biaxial é essencialmente o siste-ma Flexercell® aqui discutido. Esse método usa uma mem-brana de silastic revestida com colágeno, sobre a qual ascélulas são cultivadas. As placas são, então, colocadasem uma bandeja especial, que é fixada a uma bomba de vá-cuo. A bomba de vácuo estira e relaxa a membrana, por es-5 tiramento ou outra forma de distorção da membrana celu-lar. Além disso, qualquer movimentação do meio ou fluidoaumentará ainda mais o cisalhamento com fluido.

4.1.5 Estimulo de Carga Gravitacional

A carga gravitacional é outro método pelo quala carga óssea pode ser induzida in vitro. Essencialmente,aplica-se força às células, fazendo com que as células seachatem. Para detalhes adicionais, veja, por exemplo,Hatton et al., 2003 J. Bone & Min. Res. 18(1): 58-66; eFitzgerald et al., 1996 Exp. Cell. Res. 228: 168-71. Es-pecificamente, as células são cultivadas sobre placas oulaminulas e, então, expostas a forças G crescentes.

4.1.6 Estimulo Flexercell®

Um método preferido para a avaliação da inten-sificação a base de reagentes da via de Wnt e da minera-lização óssea é o uso do sistema Flexercell®, um estimulode estiramento biaxial. Resumidamente, células ósseas(por exemplo, células MC3T3) são expostas a cerca de3.400 με. Cargas de cerca de 50 με a cerca de 5.000 με (equalquer valor intermediário) também podem ser usadas pa-ra estímulos de carga mecânica. Qualquer estímulo nessafaixa simula estímulos fisiológicos de carga óssea. Esti-mulos acima de 5.000 με resultam em cargas patofisiológi-cas e, portanto, não são preferidas. As células tambémpodem ser expostas a um modulador da via de Wnt (por e-xemplo, um inibidor de GSK) antes da exposição ao estira-mento biaxial.

Os genes regulados positivamente pela adminis-tração apenas da carga ou com um inibidor de GSK-3 inclu-em, mas não se limitam a, COX-2, eNOS, conexina 43, Fos,Jun, WISP2, Wnt10b, Ciclina Dl e SFRPl. 0 perfil de ex-pressão obtido in vitro com os estudos Flexercell® simu-lam o perfil de expressão de genes sob carga in vivo (is-to é, análise de RNA realizada em células de tíbias decamundongos HBM TG em que os camundongos tenha sido sub-metidos a carga óssea usando um sistema de quatro pon-tos). Assim, esse ensaio de carga mecânica, ou o uso deoutro meio de carga mecânica com as várias linhagens ce-lulares aqui apresentadas, pode ser usado para identifi-car moléculas pequenas, peptídios, imunoglobulinas e ou-tras que modulem e, de preferência, ativem a via de Wntcanônica e que simulem o fenótipo HBM. Um mimético deNorrin pode produzir a mesma resposta que Norrin ou umaresposta intensificada, como a resposta intensificada davariante HBM de LRP5 de massa óssea aumentada. Assim, ouso desse sistema seria útil para a triagem de reagentesque intensifiquem os genes regulados positivamente doperfil de tensão de da maneira HBM, assim como uma açãode maneira equivalente à Norrin de tipo selvagem.

Os métodos in vitro de indução de estímulos detensão mecânica sobre células também podem ser usados pa-ra estudas a proliferação celular e a apoptose, o que érelevante para a remodelagem óssea, e a necessidade deproliferação de osteoblastos e osteoclastos e ressorçãode osteoclastos. Por exemplo, células osteoblásticas HBMe não afetadas podem ser vistas em placas bioflex de 6poços e cultivadas durante 2-3 dias em meios de cresci-mento contendo 10% de FBS até que as células estejam cer-ca de 60% confluentes. Vinte e quatro horas antes da car-ga mecânica, o meio é substituído por 1 mL de meio basalcontendo de cerca de 2 a cerca de 4% de FBS. As célulassão, então, submetidas de cerca de 50 a cerca de 5.000 μεde carga durante cerca de 1 a cerca de 5 horas. As célu-las podem ser adicionalmente estudadas quanto a reagentesque sejam miméticos de Norrin ou que sejam agonistas docomplexo LRP5/Norrin/Frizzled4 (por exemplo, agonistas deNorrin, agonistas de Frizzled4 ou agonistas de LRP5), as-sim como seus antagonistas.

Depois da carga, as células são cultivadas du-rante um período de tempo adicional. Subseqüentemente, onúmero de células e a proliferação podem ser avaliadosusando-se inúmeros ensaios comerciais ou ensaios conheci-dos na técnica, incluindo, mas não limitados a, incorpo-ração de [3H]-timidina, incorporação de 5-bromo-2desoxiuridina (BrdU), ensaio de sais de 3-(4,5 dimetilti-azol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-triazólio (MTS), ensaio TUNEL (isto é, etiquetagem de ex-tremidade de entalhe dUTP de desoxinucleotidiltransferaseterminal) ou ensaio de Anexina V.

Os seguintes genes podem ser analisados com re-lação ao perfil. Em outra modalidade, antagonistas de Wntpodem ser triados ou usados para tratar indivíduos em queseja necessária a desmineralização óssea (por exemplo,osteopetrose). Antagonistas de Wnt incluem, mas não selimitam a, antagonistas de Dkkl e antagonistas de Kremen.Agonistas de Norrin e miméticos de Norrin juntamente comagonistas e miméticos de Frizzled4, agonistas e miméticosde Wnt e agonistas e miméticos de LRP5 e LRP6 também po-dem ser avaliados com esse sistema.

TABELA 3

Genes Para o Desenvolvimento de Microarranjo de AltaMassa Óssea ou Arranjo de Proteína/Anticorpo

<table>table see original document page 103</column></row><table><table>table see original document page 104</column></row><table><table>table see original document page 105</column></row><table><table>table see original document page 106</column></row><table>

Os materiais e métodos relacionados aos arran-jos de proteínas e ácidos nucléicos para carga óssea sãodiscutidos em maiores detalhes no Pedido InternacionalPCT n° PCT/US2 004/17951, que é aqui incorporado em suainteireza para todas as finalidades.4.2 Avaliação Funcional de Norrin em Xenopus

Embriões de Xenopus são um sistema de ensaio invivo informativo e bem estabelecido para avaliar a modu-lação da sinalização de Wnt veja, por exemplo, McMahon etal., 1989 Cell 58: 1075-84; Smith e Harland 1991 Cell 67:753-65, revisado em Wodarz e Nusse, 1998 Annu. Rev. Cell.Dev. Biol. 14: 59-88).

A modificação da via de sinalização de Wnt porimpacto sobre o complexo Norrin-Frizzled4-LRP5 pode servisualizada por exame dos embriões quanto a um fenótipode dorsalização (eixo corporal duplicado) após injeção deRNA no blastômero ventral no estágio de 4 ou 8 células.No nivel molecular, os fenótipos podem ser analisadosbuscando-se a expressão de vários genes marcadores em em-briões no estágio de 10,5 dias. Esses marcadores inclui-riam marcadores genéricos de endoderma, mesoderma e ecto-derma, assim como vários transcritos específicos para te-cido.

A análise dos embriões pode ser feita usando-seRT-PCR/TaqMan® e pode ser feita em tecido embrionário to-tal ou de maneira mais restrita (microdissecção). Comoesse sistema é muito flexível e rápido, pela injeção decombinações de transcritos, como Norrin, LRP5/LRP6 e Fz4,pode-se dissecar o mecanismo da via de sinalização deNorrin. Estudos anteriores demonstraram que LRP6 isolada-mente ou em combinação com LRP5 + Wnt5a ΘΓ3 capaz de in—duzir duplicação do eixo (dorsalização) nesse sistema(Tamai et al., 2000 Nature 407: 530-35). Uma vez estabe-lecida a sinalização de Norrin, pode ser usada para ava-liar por antagonistas de Dkk e Kremen e agonistas de Nor-rin e miméticos de Norrin.

4.2.1 Construtos Para Expressão em Xenopus(Vetor pCS2 + )

cDNAs de Norrin, LRP5/6, Fz4, Dkk (por exemplo,Dkkl), Wnt e Kremenl/2 podem ser subclonados emum vetor,como pCS2+, na orientação em sentido com relação ao pro-motor do vetor SP6. 0 vetor pCS2+ contém um sinal de po-liadenilação do virus SV40 e a seqüência do promotor T3(para geração de mRNA anti-sentido) a jusante do enxerto.

Outros vetores também podem ser utilizados para expressãodas proteínas, em qualquer combinação.

4.2.2 Protocolo de Síntese e Microinjeçãode mRNA

mRNA para microinjeção em embriões de Xenopuspode ser gerado por transcrição in vitro usando-se osconstrutos de cDNA no vetor pCS2+, por exemplo, conformeacima descrito, como molde. O RNA é sintetizado usando-seo kit de transcrição de RNA rematado de alto rendimentoAmbion mMessage mMachine (Ambion Cat. N0 1340) segundo asespecificações do fabricante para as reações de polimera-se Sp6. Os produtos de RNA podem ser levados a um volumefinal de 50 pL em água estéril e destilada em vidro e pu-rificada em Colunas Quick Spin para Purificação de RNARadiomarcado usando-se uma coluna de G50-Sephadex (Roche,Cat. N0 1274015) segundo as especificações do fabricante.O eluido resultante foi finalmente extraído com fe-nol:clorofórmio:álcool isoamílico e precipitado com iso-propanol usando-se protocolos padronizados (Sambrook etal., 1989). Os volumes de RNA finais normalmente são deaproximadamente 50 pL. A concentração de RNA pode ser de-terminada por valores de absorbância a 260 nm e 280 nm. Aintegridade do RNA pode ser visualizada por coloração combrometo de etídio de eletroforese em gel de agarose des-naturante (formaldeído) (Sambrook et al., 1989). Váriasquantidades de RNA (de cerca de 2 pg a cerca de 1 ng) sãoinjetadas no blastômero ventral do embrião de 4 ou 8 cé-lulas de Xenopus. Esses protocolos são descritos em Moonet al., 1989 Technique-J. Meth. Cell & Mol. Biol. 1: 76-89, e Peng, 1991 Meth. Cell. Biol. 36: 657-62.

Moléculas identificadas como moduladoras dafunção de Norrin ou que ajam como miméticos de Norrin emqualquer dos ensaios aqui descritos podem ser adicional-mente validadas usando-se modelos animais ou outros en-saios de triagem in vitro.

4.3 Avaliação de Norrin Quanto ao Efeito Oste-ogênico em Células Tronco Mesenquimais

Células tronco mesenquimais humanas (hMSCs)(Cambrex Bio Science, Walkersville, MD) e células troncode camundongo (por exemplo, C3H10T1/2, ATCC) podem serinduzidas a se diferenciarem em nódulos ósseos minerali-zados (Jaiswal et al., 1997 J. Cell Biol. 64: 295-312) outecidos adiposos (Pettinger et al. , 1999 Science 284:143-147) in vitro por meio osteogênico ou adipogênico,respectivamente. A ativação do sinal de Wnt intensifica aosteogênese e inibe a adipogênese em hMSCs. Espera-se quea sinalização mediada por Norrin-Fz4-LRP5 proporcione umtipo similar de padrões de diferenciação em hMSCs. Assim,a identificação de miméticos de Norrin e agonistas deNorrin usando hMSCs (ou outra célula MSC de outro verte-brado) é um ensaio de triagem considerado.

Além de células tronco mesenquimais humanas,células tronco de outros animais vertebrados também podemser usadas. Células tronco mesenquimais são células pro-genitoras de várias células ósseas (por exemplo, osteo-blastos), assim como de adipócitos (veja, por exemplo,Bennett et al., 2005 Proc. NatfI Acad. Sei. USA 102(9):3324-3329). Alternativamente, podem-se substituir por cé-lulas mais diferenciadas como pré-osteoblastos, osteóci-tos e osteoblastos maduros. Deve-se notar que, em casosem que a linhagem celular é indicada como sendo uma li-nhagem celular derivada de seres humanos, estas podem sersubstituídas por células análogas de outro animal verte-brado.

4.3.1 Avaliação da Atividade Osteogênicapor Superexpressão de Norrin

Resumidamente, a Norrin pode ser adicionada ahMSCs (passagem 3-6) como uma proteína purificada ou comoparte de um meio condicionado, ou expressada por infecçãode hMSCs usando-se vétores virais. Alternativamente, Nor-rin, agonistas de agonistas de Norrin e miméticos de Nor-rin podem ser adicionados às hMSCs juntamente com o meioosteogênico (meio de crescimento suplementado com 10 nMde dexametasona, 50 pg/mL de ácido L-ascórbico e 5 mM debeta-glicerofosfato). Depois de cerca de 1 a cerca de 3semanas de incubação juntamente com o meio de controleapropriado a cerca de 37°C, e com reabastecimento semanalde memio fresco com ou sem Norrin, a atividade osteogêni-ca pode ser medida por técnicas padronizadas. Por exem-plo, a atividade osteogênica pode ser medida por colora-ção das células quanto à expressão da proteína fosfatasealcalina (AlkPhos), determinação da atividade enzimáticada AlkPhos, indução de mRNAs de AlkPhos ou osteocalcina edetecção da mineralização por Vermelho Alizerina ou colo-rações von-Kossa juntamente com controles apropriados.

4.3.2 Avaliação da Modulação de Adipogênesepor Superexpressão de NorrinNorrin, agonistas de Norrin ou miméticos deNorrin podem ser adicionados a hMSCs por expressão usan-do-se vetores virais ou de outros tipos juntamente commeio de diferenciação adipogênica (isto é, meio de cres-cimento contendo 10 nM de dexametasona, 50 pg/mL de fos-fato de ácido L-ascórbico, 500 μΜ de isobutilmetilxantinae 60 μΜ de indometacina) durante 1-3 semanas. 0 efeito deNorrin, agonistas de Norrin ou miméticos de Norrin sobrea modulação de adipócitos pode ser determinado pela alte-ração da expressão de genes marcadores adipogênicos (porexemplo, Adipsina) ou por coloração das células com rea-gente óleo vermelhor 0.

Alterações na expressão devidas à administraçãode agentes de teste podem ser realizadas usando-se tecno-logia de arranjo de DNA. Essa tecnologia já é usada paratestar obesidade e diabetes. Conseqüentemente, um aspectoseria a triagem de agentes de teste usando-se tecnologiade arranjo de DNA desenvolvida para obesidade. Veja, porexemplo, Nadler et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sei.97(21): 11371-11376, e os genes indicados por metabolismolipidico, proteínas secretadas, assim como outros genescom expressão diminuída ou aumentada associados à obesi-dade. As células usadas juntamente com a tecnologia dearranjo de DNA podem ser células mesenquimais, adipócitosou pré-adipócitos ou outras células aqui discutidas.

Alterações in vivo nos níveis de lipídios e a-dipogênese podem ser medidas por vários testes diferen-tes. Sangue e soro podem ser coletados e analisados quan-to à química sangüínea. Assim, miméticos de Norrin ou a-gonistas de Norrin podem ser triados quanto aos efeitosin vivo. Da mesma forma, inibidores de Dkk e/ou inibido-res de Kremen podem ser triados quanto a seu impacto so-bre a atividade de Norrin (na presença ou ausência de umagonista de Norrin) ou mimético de Norrin com o complexoLRP5/LRP6/Frizzled4.

4.3.3 Avaliação da Modulação de Osteogênesee Adipogênese por Desativação do Gene de Norrin

Com o uso de um meio osteogênico ou adipogêni-co, hMSCs se diferenciam em linhagens osteogênicas ou a-dipogênicas. RNAs em forma de grampo pequeno de Norrin,Frizzled4 ou LRP5 podem ser usados como um controle parademonstrar os efeitos intensificadores de Norrin e Friz-zled4 na via e para mostrar o impacto que a inibição des-sas proteínas tem sobre a adipogênese e osteogênese. Porexemplo, na presença de meio osteogênico e infecção dovetor viral contendo shRNA de Norrin, a transcrição dogene de Norrin pode ser bloqueada e a diferenciação dehMSCs em osteoblastos ou a produção de nódulos ósseos mi-neralizados que possam ser detectados por vários dos mé-todos acima indicados.

A desativação de gene em cultura de tecido e invivo pode ser conseguida por análogos de DNA ou RNA espe-cificos para seqüência que possam bloquear a atividade deseqüências genéticas de fita simples selecionadas. Exem-plos dessas abordagens incluem a tecnologia de oligonu-cleotideos anti-sentido e a introdução de um RNA de fitadupla homólogo (dsRNA) ou RNA de interferência curto(siRNA), que também é chamada de silenciamento de genepós-transcrição (PTGS) ou interferência de RNA (RNAi).

Isso pode ser conseguido pela introdução na célula desiRNAs específicos para os mRNAs do gene alvo dados medi-ante shRNAs (RNAs em forma de grampo curto) usando-se vá-rios vetores de distribuição de gene viral ou por trans-fecção de vetores plasmídicos. Métodos para a realizaçãode interferência de RNA e silenciamento de gene são co-nhecidos conforme discutido, por exemplo, em Meister eTuschl, 2004 "Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA," Nature 431: 343-349; Dorsett e Tuschl,2005 "siRNAs: applications in functional genomics e po-tential as therapeutics," Nat. Rev. RNA Interference Col-lection 40-51, e referências aí citadas. Uma vez que osiRNA seja introduzido, a extensão da desativação do genealvo é medida por técnicas padronizadas, incluindo qRT-PCR, Northern Blots para RNAs ou por Western blots paraexpressão de proteínas.5. Kits Para Agentes de Teste que ModulamNorrin

Outro aspecto considera kits para teste de a-gentes que modulem a atividade de Norrin e, de preferên-cia, para agentes que, mediante modulação da atividade deNorrin, modulem a via de Wnt. Esses kits podem ser usadospara a triagem de miméticos de Norrin e agonistas de Nor-rin, assim como outros miméticos e agonistas do complexoLRP5/Norrin/Frizzled4.

Os kits considerados incluiriam células e áci-dos nucléicos que codificam pelo menos Norrin e Friz-zled4. De preferência, haveria ácidos nucléicos que codi-ficam LRP5, Dkk (qualquer uma das Dkks), HBM e/ou Kremen(Kremen 1 e 2), assim como Norrin e Frizzled4 e/ou qual-quer de suas combinações. LRP6 e Wnts também podem estarincluídas. Ácidos nucléicos que codificam os polipeptí-dios acima estariam operacionalmente ligados a um vetor.

0 vetor também estaria de preferência incluído para finsde controle. Os kits poderiam ser planejados para uso detransfecção transitória ou para transfecção estável decélulas.

Alternativamente, os kits podem conter proteí-nas purificadas de quaisquer das proteínas acima para usoem sistemas de ensaio in vitro, como aqueles aqui descri-tos. Podem incluir substratos como nitrocelulose, placasELSA ou outros substratos adequados.Os kits incluiriam, de preferência, um sistemarepórter apropriado para o ensaio, se de fosfatase alca-lina, ou proteínas mais fluorescentes, e outras.

Em um aspecto, o kit poderia vir com linhagenscelulares congeladas para uso na triagem. Em outro aspec-to, o kit poderia vir com instruções relacionado célulasapropriadas, previamente testadas, que sejam adequadaspara os ensaios in vitro aqui descritos.

Em outro aspecto, o kit poderia vir com os vá-rios repórteres, enzimas e reagentes necessários para de-tectar o repórter usado para detectar a modulação. Porexemplo, se for usado o sistema de ensaio TCF-Iuci e TK-renila, o kit poderia vir com TCF-Iuci e TK-renila Iuci-ferases e reagentes de detecção. Os kits também poderiamvir com animais transgênicos, em que um cDNA para Dkk,Norrin, LRP5, LRP6, HBM, Kremen, Wnt e/ou Frizzled4 foiintroduzido em um animal(ais). Os kits podem incluir umasérie desses animais para elucidação da atividade de umreagente de teste particular.

6. Linhagens Celulares

Outro aspecto é a preparação de linhagens celu-lares que não expressem Norrin e/ou Frizzled4. Essas li-nhagens celulares podem ter, então, expressado de maneiratransitória ou estável formas não nativas de LRP5, LRP6,Frizzled, Norrin, Dkk, Kremen, Wnt e Norrin em qualquerdas combinações aqui discutidas. Conseqüentemente, as li-nhagens celulares podem ser usadas para a triagem de rea-gentes que sejam miméticos de Norrin ou agonistas de Nor-rin. Por exemplo, em uma linhagem celular que tenha for-mas não nativas (não endógenas) de LRP5 e Frizzled4 ex-pressadas e seja desprovida de Norrin, não haveria meiopelo qual ativar a via de Wnt através do mecanismo deLRP5-Frizzled4-Norrin. Entretanto, com a introdução de ummimético de Norrin, as vias seriam ativadas. Essas linha-gens celulares seriam controles úteis para a identifica-ção de miméticos de Norrin. As células poderiam ter, en-tão, transcritos não endógenos adicionais de Dkk e/ouKremen introduzidos, com a triagem examinada para agentesde teste que modulem a interação de Dkk e/ou Kremen com ocomplexo Frizzled4-LRP5/6-Norrin. Usando-se esse proces-so, antagonistas de Dkk e/ou antagonistas de Kremen podemser identificados. A introdução de Norrin não endógena emuma dessas linhagens livres de Norrin pode ser usada paraavaliar agonistas de Norrin sobre a interação Norrin-LRP5-Frizzled4.

A expressão estável e transitória de ácidos nu-cléicos que codifiquem qualquer uma das proteínas ou seusfragmentos polipeptídicos biologicamente ativos pode serrealizada por meios conhecidos na técnica. Veja, por ex-emplo, R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of BasicTechnique (2 000) e Joseph Sambrook ε David W. Russell, MolecularCloning: A Laboratory Manual (3rd ed. 2 001).Células que não têm Norrin endógeno incluem,mas não se limitam a, células renais. Conseqüentemente,células renais proporcionam uma ferramente útil para atriagem de miméticos de Norrin. Alternativamente, podem-se preparar linhagens celulares que estejam desativadas,em que um ou mais dos genes que codificam LRP5, LRP6,Norrin, uma Wnt, uma Dkk, uma Kremen e/ou Frizzled4 estãodesativados, de modo que um polipeptidio endógeno nãopossa mais ser sintetizado. Esse procedimento pode serrealizado em qualquer células, como, mas não limitadas a,adipócitos, pré-adipócitos, células mesenquimais, váriascélulas ósseas e células renais.

Ficará claro para aqueles versados na técnicaque várias modificações e variações podem ser feitas nosmateriais e métodos aqui descritos, sem sair do espiritoou âmbito da invenção. Assim, pretende-se que a presenteinvenção cubra as modificações e variações desta inven-ção, contanto que estejam dentro do âmbito das reivindi-cações anexas e seus equivalentes.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: Ensaio de Sinal de Norrin/Wnt-TCFIsolamento do clone de Norrin. cDNA foi clonadopor métodos de PCR padronizados a partir dos clonesIMAGE. Especificamente, a seqüência de quadro de leituraaberta (ORF) de Norrin do NCBI (NM_000266) foi usada parabuscar clones IMAGE disponíveis. 0 clone n° 5179578 foiidentificado como um cDNA de comprimento total previsto.0 clone IMAGE foi adquirido na Open Biosystems (Hunts-ville, AL). O ORF foi amplificado por técnicas de PCR pa-dronizadas usando-se os seguintes primers: 5'-CATATGAATTCACCATGAGAAAACATGTACTAGCTGCATC-31 (SEQ ID NO: 1)(que traz um sitio EcoRI para clonagem, assim como umconsenso Kozak imediatamente em 51 do ATG de iniciação),e 5 1 -gatatgcggccgctctagatcaggaattgcattcctcgcagtg-3' (SEQ IDNO:2) (que traz tanto um sitio XbaI, quanto um NotI apóso códon de parada). 0 produto de PCR resultante foi dige-rido com EcoRI e NotI e clonado nos sítios EcoRI e NotIde pcDNA3.1 (Invitrogen). Isolados positivos foram iden-tificados por digestão de restrição e confirmados por a-nálise de seqüência de DNA quanto à correspondência à se-qüência publicada (N° de Acesso NM_000266).

Isolamento do clone de Kremen. 0 fragmento decomprimento total amplificado por PCR foi subclonado novetor pcDNA3.1 nos sítios de enzima de restrição Eco-RI/BamHI. A seqüência isolada foi, então, verificadaquanto à correspondência com a seqüência de Kremen2 huma-na publicada (N° de Acesso NM_172229/ AB086405.1 eNP_757384.1). 0 cDNA foi isolado do RNA total da linhagemcelular U20S do tipo osteoblasto humano. 0 RNA total decerca de 2,5xl06 células U20S foi purificado usando-se okit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) segundo o protocolo dofabricante. Isolado de cDNA de Kremen2 foi amplificadosegundo métodos de PCR padronizados. Os primers de PCRusados foram:

primer 5': 5' -GGACGAATTCACCATGGGGACACAAGCCCTGCAG-3' (SEQ ID NO:3)

primer 3': 5'-ctcgctcatctccgctctctgaggatcccagg-3'(SEQ ID N0:4). Fragmento de comprimento total amplificadopor PCR foi subclonado no vetor pcDNA3.1.nos sítios deenzima de restrição EcoRI/BamHI, e a seqüência inteirafoi verificada quanto à correspondência com a seqüênciade Kremen2 humana publicada (N° de Acesso NM_172229/ABO86405.1, NP_757384).

Isolamento do clone de Dkk. Um cDNA humano como número de acesso no GenBank AF127563 estava disponívelna base de dados pública. Usando-se essa seqüência, pro-jetaram-se primers de PCR para amplificar o quadro deleitura aberto com uma seqüência de consenso Kozak imedi-atamente a montante do ATG de iniciação. Oligos 117162(5' -caatagtcgacgaattcaccatggctctgggcgcagcgg-3 1 ; SEQ ID NO: 5) e 117163 ( 5' -gtattgcggccgctctagattagtgtctctgacaagtgtgaa-3';SEQ ID NO:6) foram usados para a triagem de uma bibliote-ca de cDNA de útero humano por PCR. 0 produto de PCR re-sultante foi purificado, subclonado em pCRII-TOPO (Invi-trogen Corp.), teve sua seqüência verificada e foi dige-rido com EcoRI/Xhol. Esse enxerto foi subclonado no vetorpCS2+ nos sítios Ecoí?I-XhoI.Um cDNA de comprimento total codificando Dkk2humana foi isolado para investigar a especificidade dainteração Zmax/LRP5/HBM com a família de moléculas Dkk.Dkkl foi identificada em levedura como um parceiro de Ii-gação em potencial de Zmax/LRP5/HBM. Dkkl também foi de-monstrada na literatura como um antagonista da via de si-nalização de Wnt, ao passo que Dkk2 não é (Krupnik etal.r 1999). O cDNA de comprimento total de Dkk2 serve deferramenta para discriminar a especificidade e significa-do biológico de interações Zmax/LRP5/HBM com a famíliaDkk (por exemplo, Dkkl, Dkk2, Dkk3, Dkk4, Soggy, seus ho-mólogos e variantes e outros). Uma seqüência de cDNA hu-mano para Dkk2 (N° de Acesso no GenBank NM_014421) estavadisponível na base de dados pública. Usando-se essa se-qüência, projetaram-se primers de PCR para amplificar oquadro de leitura aberto com uma seqüência de consensoKozak imediatamente a montante do ATG de iniciação. Oli-gos 51409 (5'- CTAACGGATCCACCATGGCCGCGTTGATGCGG-3'; SEQID NO:7) e (5'-GATTCGAATTCTCAAATTTTCTGACACACATGG-3'; SEQID NO:8) foram usados para a triagem de bibliotecas decDNA de embrião e cérebro humano por PCR. 0 produto dePCR resultante foi purificado, subclonado em pCRII-TOPO,teve sua seqüência verificada e foi digerido com Ba-mHI/EcoRI. Esse enxerto foi subclonado no vetor pCS2+nossít ios BamHI-.Eco.RI. Para uma discussão adicional referen—te a clones de Dkkl e Dkk2, veja o Pedido InternacionalPCT n° PCT/US02/15982. Construções similares para Dkk3 eDkk4 podem ser preparadas usando-se as seqüências aquimencionadas.

Clones de LRP6 clones. LRP6 de comprimento to-tal foi isolado do vetor pED6dpc4 por diqestão com XhoI-XbaI. 0 cDNA de comprimento total foi remontado nos sí-tios XhoI-XbaI de pCS2+. A orientação do enxerto foi con-firmada por seqüenciamento de DNA.

LRP5 (Zmaxl) e HBM. O cDNA de enxerto foi iso-lado dos construtos de retrovírus de cDNA de comprimentototal (com seqüências de Kozak otimizadas) por digestãocom BgIII-EcoRI e subclonado nos sítios BaraHI-EcoRI dovetor pCS2+. Para maiores detalhes quanto a construtos deLRP5 e HBM, veja a patente norte-americana n° 6.770.461 eo Pedido Internacional PCT n° PCT/US01/16946, intitulado"Regulação dos níveis de lipídios pelo gene de Zmaxl ou HBM".

Clones de Wnt. Os genes de Wnt utilizados nosexperimentos aqui mostrados foram obtidos da seguinte ma-neira. Dez cDNAs diferentes de Wnt de comprimento totalforam adquiridos na Upstate Biotechnology (Lake Placid,NY) no vetor pUSEamp(+). Os genes são: Wntl (Cat. No. 21-121), Wnt2 (Cat. No. 21-122), Wnt3 (Cat. No. 21-123),Wnt3a (Cat. No. 21-124), Wnt4 (Cat. No. 21-125), Wnt5a(Cat. No. 21-133), Wnt5b (Cat. No. 12-126), Wnt6 (Cat.No. 21-127), Wnt7a (Cat. No. 21-128) e Wnt7b (Cat. No.21-129). Os enxertos foram liberados por digestão comXbaI e subclonados no sitio XbaI do vetor pCS105 para ex-pressão em Xenopus. A orientação foi confirmada poranálise de seqüência.

cDNA de Wntll de comprimento total foi isoladode IxlO6 células de osteoblasto humanas (HOBs, passagemn° 13) por RT-PCR usando-se o Kit GCRich (Clontech, Moun-tain View, CA) e os seguintes primers específicos: (Dire-to) : 5' -GGGAATTCGCGACGATGAGGGCGCGGCCGCA-3' (SEQ ID NO:9)(inclui o sítio EcoRI) e (Reverso): 5'-GGGCGGCCGCAGGGCCTCACTTGCAGACATAGC-3' (SEQ ID NO:10) (in-clui o sítio NotI). 0 fragmento de DNA gerado por RT-PCRfoi digerido com EcoRI e NotI e enxertado nos sítios cri-ados EcoRI e NotI do vetor pcDNA3.1. A seqüência de com-primento total foi verificada quanto à correspondência àseqüência de Wntll publicada (N° de Acesso Y12692).

cDNAs de comprimento total para outros genes deWnt podem ser obtidos por técnicas de PCR padronizadas apartir de várias fontes de bibliotecas de cDNA humano,usando-se a seqüência pública para projetar primers paraa amplificação do quadro de leitura aberto do gene e fa-cilitar a suclonagem no vetor pCS105 ou vetor de mamíferodo tipo pcDNA3.1 ou outro vetor de mamífero adequado.Primers adequados para outros genes de Wnt são apresenta-dos na Tabela 1 abaixo. "F" significa primer "direto" e"R" primer "reverso".

OligoNo.

5130451306

118978118977

5129451296

5129851296

5130051302

118973118980

118979

118974

118975

118976

TABELA 1Seqüência

Wnt IOb - N0 de Acesso U81787

F 5-CTAACGGATCCACCATGCTGGAGGAGCCCCG-3

R 5-GATTCGAATTCTCACTTACACACATTCACCC-3

Wnt 10a - N0 de Acesso AY009400F 5-CTAACGGATCCACCATGGGCAGCGCCCACCC-3

R 5-GATTCGAATTCTCACTTGCAGACGCTGACC-3

Wntl6a - N0 de Acesso AF169963F 5-CTAACGGATCCACCATGGAAAGGCACCCACCC-3

R 5-GATTCGAATTCTTACTTGCAAGTGTGGACATC-3

Wnt16 - N0 de Acesso AF152584F 5-CTAACGGATCCACCATGGACAGGGCGGCGCTC-3R 5-GATTCGAATTCTTACTTGCAAGTGTGGACATC-3

Wnt8d - N0 de Acesso AY009402)F 5-CTAACGGATCCACCATGGGGGAACCTGTTTATGC-3R 5-GATTCTCTAGACTAGATATAGACCCCAAACC-3Wnt8b - N0 de Acesso Y11094

F 5-

CTAACGGATCCACCATGTTTCTTTCAAAGCCTTCTGTG-3

R 5-GATTCGAATTCTTAGGGTTTTCTCCCGGGTTTG-3

Wnt2b2 - N0 de Acesso AB045117F 5-CTAACGATTCAACATGCTGAGACCGGGTGGTG-3

R 5-GATTCTCTAGATCAGGTCTGGTCCAGCCAC-3

Wnt2bl - N0 de Acesso AB045116F 5-CTAACTCTAGAATGTTGGATGGCCTTGGAG-3

R 5-GATTCTCTAGATCAGGTCTGGTCCAGCCAC-3

SEQID NO

1112

13

14

15

16

17

18

19

20

2122

23

24

25

26

Ensaio Repórter. 0 ensaio TCF envolve um repór-ter 16x-TCF (contendo 16 cópias do elemento TCF sensívelao sinal de Wnt-beta-catenina com promotor TK basal) egene de Luciferase. O construto contém 16 cópias dos sí-tios de ligação a TCF localizados a montante de um promo-tor TK mínimo (timidina quinase) e gene de luciferase novetor pGL3 (Promega, Madison, WI). A seqüência dos quatrosítios de ligação a TCF (vejas as seqüências pareadas a-baixo) foi gerada por abordagem de síntese de oligonucle-otídeos e contém a seguinte seqüência com sítios de enzi-mas de restrição NheI e XhoI nas extremidades 5' e 3' ,respectivamente. Os domínios sublinhados indicam os sí-tios de ligação a TCF. Apresentam-se ambas as fitas.

Quando as duas fitas são aneladas, sítios de restriçãocompatíveis NheI (5') e XhoI (3') são introduzidos paraclonagem adicional e contêm sítios de ligação a TCF (SEQID NOS: 27 e 28 respectivamente):

5 ' -CTAGCGAGAACAAAGGAGATTCAAAGGAGATCAAAGGAGATCAAAGGACTAGTTC-3 '3'-TCGAGAACTAGTCCTTTGATCTCCTTTGATCTCCTTTGAATCTCCTTTGTTCTCG-5 1TK-renila (Promega Corp., WI) como controle denormalização de ensaio interno; e construtos baseados novetor ρcDNA de cDNAs de Norrin, Wntl, Wnt3a, Dkkl e Kre-men2 conforme acima discutidos, e um construto de Fr.iz-zled4 (Origene Tech. Inc.; Rockville, MD) também fazemparte do ensaio. Pode-se substituir por outros vetorescapazes de expressar diferentes formas de Norrin, Wntl,Wnt3a, Dkkl e Kremen2 de vertebrados.

Os clones individualmente contendo esses genessão co-transfectados em células Renais Embrionárias Huma-nas (HEK)-293A (ATCC, Manassas, VA) ou em uma linhagemcelular do tipo osso/osteoblasto derivada de osteossarco-ma humano, U20S (ATCC). As células foram cultivadas emMeio Essencial Minimo de Dulbecco (DMEM) (Invitrogen) oumeio RPMI (Invitrogen) suplementado com 10% de soro bovi-no fetal termicamente inativado (FBS), 1% de glutamax(Invitrogen) e 1% de penicilina/estreptomicina (Invitro-gen) .

Células HEK-293A (50.000 células por poço) oucélulas U20S (25.000 células por poço) foram plaqueadasem placas de 96 poços. Após 24 horas de incubação depoisdo plaqueamento (aproximadamente 80-90% confluentes), omeio foi substituído com 100 pL de meio OPTIM livre desoro fresco (Gibco/BRL). Ambos os tipos de células foramtransfectadas com 16x-TCF(TK)-Luciferase de Vaga-Iume(0,3 pg/poço) e TK-Renila-Iuciferase (0,06 pg/poço) usan-do-se o reagente de transfecção Lipofectamine 2000 (Pro-mega; Madison, WI) de acordo com as instruções do fabri-cante. Os experimentos foram realizados em duplicata.

Os construtos de cDNA de teste foram transfec-tados a diferentes concentrações, conforme necessário.Cerca de 0,0005 pg/poço a 0,05 pg/poço de cDNA de cada umdos construtos foram usados. A transfecção foi realizadacom Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) de acordo com asinstruções do fabricante. A mistura de DNA e o reagenteforam incubados durante 30 min. 50 pL/poço da mistura deDNA-reagente foram adicionados aos 100 pL de meio OPTIM.

As células foram, então, cinbuadas durante quatro horas a37°C. O meio de transfecção foi substituído por 150 yL demeio DMEM ou RPMI nas células HEK 293A e U20S, respecti-vãmente. Após 20-24 horas de incubação a 370C em um incu-bador de CO2, o meio foi removido. As monocamadas de cé-lulas transfectadas foram lisadas pela adição de 150 pLde IX tampão de Iise Dual Luci Reagent (Promega Corp.).

Depois de 10 minutos, 20 pL do lisado foramtransferidos para uma nova placa branca de 96 poços (Pac-kard/Costar). Os lisados de células foram misturados com100 pL/poço de tampão LARII (Dual Luci Reagent), e as U-nidades de Luciferase Relativas (RLUs) foram medidas u-sando-se um contador de luminescência Packard TopcountNXT™ (Meriden, CT). Isso foi seguido pela adição de 100pL/poço de reagente "stop & glo" (Dual Luci Reagent), e arenila luciferase de controle de ensaio interno foi medi-da usando-se o contador de luminescência Packard Topcount NXT™.

A razão de TCF-Iuciferase de vaga-lume para re-nila foi calculada e é apresentada como gráficos de bar-ras nas FIGS. 1-4. Os experimentos foram feitos em qua-druplicata, com os desvios padrão calculados para o graude erro mostrado.

A FIG. 1 indica que, quando o cDNA de Norrinera transfectado em células U20S humanas, proporcionavauma indução de aproximadamente 2 a 3 vezes (barrainclinada rosa) do sinal de TCF na ausência detransfecção com cDNA de Wnt. Entretanto, as células HEK-293A transfectadas não produziram nenhuma ativaçãosignificativa do sinal de TCF. A FIG. 1 também mostra quea co-transfecção de Norrin e LRP5, um de seus co-receptores em células HEK-293A, não ativou o sinal de TCF(barra quadriculada roxa).

Interessantemente, quando os vetores contendoos genes para Norrin (Nr) ou LRP5 (L5) eram co-transfectadas em células U20S, o sinal de TCF eraintensificado. Os materiais e métodos foram utilizadosconforme acima descrito. Veja a FIG. 1, lado direito.Quando tanto Norrin, quanto LRP5 eram co-transfectadas emcélulas U20S, o sindl de TCF era sinergicamenteintensificado (barra mais à direita, FIG. 1)aproximadamente 6 vezes mais que apenas vetor (controle).Como Norrin requer o receptor de Frizzled4 (Fz4), além doco-receptor de LRP5/6, os dados indicam que as célulasU20S contêm Fz4, ao passo que as células HEK-293A sãodesprovidas de Fz4 . Sem Fz4, Norrin não pode induzir osinal de TCF e, portanto, a falta de resposta nas célulasHEK-293A (lado esquerdo da FIG. 1).

EXEMPLO 2: Fz4 é Requerida Para Sinalização deNorrinPara avaliar a interação Fz4-Norrin, os cDNAsde Fz4 e LRP5 foram transfectados em ambos os tipos decélulas que também foram transfectados com Norrin. Astransfecções foram realizadas conforme acima discutido noExemplo 1. A detecção de TCF foi realizada, e osconstrutos foram usados conforme discutido no Exemplo 1.Os dados foram obtidos em quadruplicata, com a análiseestatística sendo um cálculo do desvio padrão.

As células HEK-2 93A mostram que não há nenhumaresposta de TCF para apenas vetor (V), apenas LRP5 (L5),apenas Fz4 (F4) ou LRP5 e Norrin (L5+Nr). A adição deNorrin e Fz4 (F4+Nr) proporciona um aumento de aproxima-damente 6 vezes no TCF com relação a vetor ou Fz4 apenas.

Os dados na FIG. 2 demonstram que, em células HEK-293A, aFz4 funcional era o fator limitativo para a ativação dosinal de Norrin-TCF. Também indicam que, em células HEK-293A, a interação Norrin-Fz4 provavelmente utiliza os re-ceptores de LRP5/6 endógenos das células. Além disso, aco-transfecção de LRP5 juntamente com Fz4 e Norrin(L5+F4+Nr) em células HEK-293 resulta em uma intensifica-ção adicional do sinal de TCF, até 16 vezes com relação acélulas HEK293A transfectadas com apenas LRP5 (L5) e ape-nas Norrin (Nr). Veja o lado esquerdo da FIG. 2.

Em contraste, os mesmos testes foram conduzidoscom células U20S. As células U20S proporcionaram uma ati-vidade de TCF significativamente maior por co-transfecçãode Fz4 e Norrin (F4+Nr) com relação a apenas vetor (V),apenas LRP5 (L5), apenas Frizzled4 (F4) e células U20Sco-transfectadas com LRP5 e Norrin (L5+Nr). Veja a FIG.

2. A resposta em células U20S foi adicionalmente intensi-ficada quando Fz4, LRP5 e Norrin (F4+L5+Nr) foram todasco-transfectadas nas células (de cerca de 2 vezes a cercade 6 vezes) . Esses dados em células U20S provavelmenteindicam a presença de componentes de sinal de Wnt endóge-nos, incluindo receptores de Fz4 e LRP5/6.

EXEMPLO 3: O Sinal de LRP5-Fz4-TCF Induzido por

Norrin Pode ser Inibido Sinergicamente por Dkkl e Kremen2em Células U20S

As células U20S foram transfectadas ou co-transfectadas com vetor em branco (V), LRP5 (L5),Frizzled4 (Fz4), Norrin (Nr), Kremen2 (Krm2) ou Dkkl,conforme indicado na FIG. 3, de acordo com osprocedimentos de ensaio apresentados no Exemplo 1. Osresultados foram obtidos em quadruplicata, e o desviopadrão foi calculado a partir deles.

A FIG. 3 apresenta a razão de modulação dosinal de TCF-Iuci para renila em ensaios U20S-TCF quandotransfectados com os vários construtos de cDNA. No ladodireito da FIG. 3, as barras indicam que a transfecção deLRP5 (L5) , Fz4 (Fz4) ou Norrin (Nr) proporcionou umaindicação de 2 a 5 vezes com relação ao controle devetor. Entretanto, a co-transfecção tanto de Fz4, quantode Norrin (Fz4 + Nr) resultaram em uma indução de 15vezes do sinal de TCF.

0 efeito de Fz4 e Norrin foi adicionalmenteintensificado pela expressão do cDNA de LRP5 (L5) (istoé, barra mais alta e mais escura). A atividade máxima deFz4+Nr+L5 foi inibida parcialmente pela co-transfecçãodas células com Dkkl. Quando tanto Dkkl, quanto Krm2foram adicionados às células co-transfectadas com LRP5,Fz4 e Norrin (L5 + Fz4+Nr), o sinal de TCF foi quasecompletamente inibido (lado direito, barra mais àdireita).

Os resultados apresentados na FIG. 3 indicamque o sinal de TCF mediado por Norrin-LRP5-Fz4 pode serinibido por Dkkl. Dkkl é considerada um inibidoreficiente da via canônica de Wnt induzida por Wnt-LRP5-Fz. Interessantemente, a adição de Kremen2 (Krm2) fazsinergia com Dkkl e, por sua vez, resultou no bloqueio daação de Norrin de intensificação da via de Wnt.

EXEMPLO 4: Sinais de TCF Mediados por Norrincom HBM e LRP5 São Diferencialmente Inibidos por Dkkl eKremen2

Uma comparação da modulação do sinal de Norrin-TCF por LRP5 ou seu mutante de ganho de função, HBM, foiestudada em células U20S transfectadas com cDNA. Os re-sultados são apresentados na FIG. 4. A transfecção de cé-lulas U20S com cDNA de HBM forneceu um sinal de TCF li-geiramente maior do que com a transfecção com cDNA deLRP5. Veja o lado esquerdo da FIG. 4, que mostra apenasvetor (V), apenas LRP5 (L5), apenas HBM (H), apenas Friz-zled4 (Fz4) e Norrin (Nr). As construções e condições sãoconforme descritas para o Exemplo 1. O experimento foirealizado em quadruplicata, com o o padrão de erro calcu-lado a partir dele.

A co-transfecção das células U20S com Norrin eFz4, assim como LRP5 (Nr+Fz4+L5) ou HBM (Nr+Fz4+H), re-sultou em sinal de TCF máximo tanto com cDNAs de LRP5,quanto de HBM, isto é, cerca de 25 vezes com relação àatividade basal. A co-transfecção de Dkkl com Norrin,Frizzled4, LRP5 ou as combinações de Norrin, Frizzled4 eHBM resultou em um ainibição de cerca de 38-40% do sinalde TCF. A inibição por Dkkl foi adicionalmente intensifi-cada com a adição de Kremen2 (Krm2). Veja o lado direitoda FIG. 2, duas barras mais à direita.

A análise comparativa do sinal de Norrin-TCFimplica que o sinal de Norrin-Fz4-TCF mediado por LRP5mutação G171V confere uma resistência parcial da ação i-nibidora de Kremen2 e Dkkl. Essa observação interessanteé muito similar aos resultados anteriormente observadoscom o sinal de TCF mediado por Wnt3a e Wntl com LRP5 eHBM na presença de Dkkl e Kremen2. Relatou-se que a sina-lização de LRP5-Wnt-TCF modula a osteogenese, ao passoque a mutação HBM leva a um fenótipo de alta massa ósseaem seres humanos e em camundongos transgênicos. Com bgasenesses resultados, é provável que Norrin, como um ligantemais especifico do complexo LRP5-Fz4 do que Wnts, desem-penhe um papel significativo no metabolismo ósseo.

Em cada um dos exemplos acima, Dkkl pode sersubstituído por Dkk2, Dkk3 e/ou Dkk4. Além disso, nos e-xemplos que usam Kremen2, entende-se que esta poderia sersubstituída por Kremenl, que seria usada da mesma manei-ra. Além disso, as proteínas ou polipeptídios biologica-mente ativos podem ser introduzidos por co-transfecçõesou pela adição da proteína purificada e/ou meios condi-cionados contendo a proteína e/ou polipeptídios biologi-camente ativos.

Com os dados in vitro acima discutidos, demons-trou-se que Norrin intensifica a via canônica de Wnt me-diada por LRP5-Frizzled4 por ativação do repórter TCF ecélulas ósseas U20S e não em células HEK-293A sem atransfecção da sincells without the transfection of Friz-zled4. A sinalização de Wnt mediada por LRP5 é importantena formação/manutenção óssea, conforme evidenciado pelofenótipo de alta massa óssea ("HBM") na mutação LRP5-G171V em seres humanos e animais transgênicos. Os dadostambém mostram que o sinal de TCF mediado por Norrin napresença do mutante LRP5-G171V (HBM) é menos sensível àinibição mediada por Dkkl, em comparação com LRP5. Com ahipótese de que uma inibição diminuída devido à mutaçãoG171V em LRP5 seja uma das causas do fenótipo HBM, espe-raríamos que a Norrin, sua expressão, sua indução e/oumiméticos de Norrin pudessem intensificar a formação oumanutenção óssea in vivo. Assim, uma desativação de Nor-rin in vivo poderia mostrar osteopenia. Os ensaios acimasão ensaios representativos para uso na triagem, entreoutros, de miméticos de Norrin, agonistas de Norrin e a-gonistas de Frizzled4.

Todas as referências aqui citadas são incorpo-radas por referência em sua inteireza para todas as fina-lidades.

Claims (67)

1. Método de identificação de um agente quemodule ossos ou um lipidio, caracterizado pelo fato deque compreende:(a) a colocação de uma proteína Frizzled4 ou umfragmento polipeptidico de Frizzled4 biologicamente ativocom uma proteína LRP5 ou uma proteína LRP5 biologicamenteativa na presença do agente; e(b) a determinação de se o dito agente interagecom Frizzled4 ou fragmento polipeptidico biologicamenteativo de Frizzled4 e/ou LRP5 ou fragmento polipeptidicobiologicamente ativo de LRP5 e modula pelo menos um parâ-metro de osso e/ou um lipidio.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a proteína Frizzled4 oufragmento polipeptidico biologicamente ativo de Frizzled4está ligado à proteína LRP5 ou fragmento polipeptidicobiologicamente ativo de LRP5.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o agente é um mimético deNorrin.

4. Método de identificação de um agente quemodule o metabolismo ósseo ou metabolismo lipídico, ca-racterizado pelo fato de que compreende:(a) a colocação de uma proteína Norrin ou umfragmento polipeptídico de Norrin biologicamente ativo euma proteína Frizzled4 ou um fragmento polipeptídico bio-logicamente ativo de Frizzled4 fusionado a proteínas LRP5e/ou LRP6 ou fragmentos polipeptídicos biologicamente a-tivos de LRP5 e/ou LRP6 na presença do agente; e(b) a medição de pelo menos um parâmetro de mo-dulação óssea e/ou modulação lipídica para identificar oagente que module metabolismo ósseo ou metabolismo lipí-dico.

5. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 4, caracterizado pelo fato de que oparâmetro de modulação óssea é um de densidade óssea, re-sistência óssea, número de trabéculas, tamanho do osso ouconectividade do tecido, ou qualquer de suas combinações.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o parâmetro de modulaçãolipídica é uma alteração no nível de HDL, VLDL, coleste-rol, triglicerídeos, apoE ou LDL.

7. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 4, caracterizado pelo fato de que oparâmetro ósseo medido é a expressão alterada de uma oumais de C0X-2, Jun, Fos, ciclina Dl, WntlOB, SFRP1, cone-xina 43, eNOS, WntlOB, ciclina Dl, Frizzled2, e a WISP2 émodulada.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o parâmetro ósseo medido éa expressão alterada de uma ou mais de COX-2, Jun, Fos,ciclina Dl, WntlOB, SFRP1, conexina 43, e eNOS é modula-da.

9. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 4, caracterizado adicionalmente pelofato de que compreende uma proteína Dkk ou um fragmentopolipeptídico de Dkk biologicamente ativo.

10. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 4, caracterizado adicionalmente pelofato de que compreende uma proteína Kremen ou um fragmen-to polipeptídico de Kremen biologicamente ativo.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado adicionalmente pelo fato de que compreendeuma proteína Dkk ou um fragmento polipeptídico de Dkk bi-ologicamente ativo.

12. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 4, caracterizado adicionalmente pelofato de que compreende uma proteína Wnt ou um fragmentopolipeptídico de Wnt biologicamente ativo.

13. Método de identificação de um agente quemodule a atividade de Norrin-Frizzled4, caracterizado pe-lo fato de que compreende:(a) a colocação do agente, uma proteína Norrinou fragmento polipeptidico biologicamente ativo de Norrine uma proteína Frizzled4 ou fragmento polipeptidico bio-logicamente ativo de Frizzled4 fusionado a LRP5 e/ou LRP6ou fragmento polipeptidico biologicamente ativo de LRP5e/ou LRP6, ou fusionada a um domínio de ligação a ligante(LBD) contendo um fragmento polipeptidico de LRP5, e:(i) uma proteína Kremen; e/ou(ii) uma proteína Dkk; e(b) a determinação de se o agente modula umaatividade de Norrin-Frizzled4.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que o agente é um mimético deNorrin, antagonista de Dkk ou um antagonista de Kremen.

15. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 4, ou 13, caracterizado pelo fato deque uma ou mais proteínas estão fixadas em um substrato.

16. Método de identificação de um agente queregule a modulação óssea ou modulação lipídica, caracte-rizado pelo fato de que compreende:(a) a administração do agente a uma célula queexpresse Frizzled4 e LRP5, em que Frizzled4 é uma proteí-na Frizzled4 ou um polipeptídio de Frizzled4 biologica-mente ativo, e LRP5 é uma proteína LRP5 ou um polipeptí-dio biologicamente ativo de LRP5;(b) a determinação de se a dita administraçãodo agente modula uma interação LRP5-Frizzled4; e(c) a determinação de se o agente modula um pa-râmetro ósseo ou parâmetro lipidico.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que o agente é um mimético deNorrin, a antagonista de Dkk ou um antagonista de Kremen.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que a célula não expressa Norrin.

19. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que a célula expressa umaFrizzled4, LRP5 e/ou Norrin não endógena.

20. Método de identificação de um agente queregule modulação óssea ou modulação lipidica, caracteri-zado pelo fato de que compreende:(a) a administração do agente a uma célula queexpresse LRP5, Norrin e Frizzled4, em que LRP5 é uma pro-teína LRP5 ou um polipeptídio de LRP5 biologicamente ati-vo, Norrin é uma proteína Norrin ou um polipeptídio deNorrin biologicamente ativo, e Frizzled4 é uma proteínaFrizzled4 ou um polipeptídio biologicamente ativo deFrizzled4;(b) a determinação de se a dita administraçãodo agente modula a interação Norrin-Frizzled4; e(c) a determinação de se o agente modula um pa-râmetro de modulação óssea ou modulação lipidica.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a célula expressa uma Nor-rin, LRP5 e/ou Frizzled4 não endógena.

22. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a célula não expressa umaNorrin endógena.

23. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que o agente é um mimético deNorrin, a antagonista de Dkk ou um antagonista de Kremen.

24. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que LRP5 é co-expressada comoum polipeptidio de fusão com Frizzled4.

25. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que as células são células devertebrados.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25,caracterizado pelo fato de que as células são células ós-seas, células renais, células mesenquimais, adipócitos,pré-adipócitos ou células de Xenopus.

27. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que o parâmetro de modulaçãolipidica é uma alteração no nivel de HDL, VLDL, coleste-rol, apoE e/ou LDL, ou qualquer de suas combinações.

28. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que o parâmetro de modulaçãoóssea é densidade óssea, resistência óssea, número detrabéculas, tamanho do osso ou conectividade do tecido,ou qualquer de suas combinações.

29. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que o parâmetro de modulaçãoóssea é expressão alterada induzida por administração doagente de um ou mais de C0X-2, Jun, Fos, ciclina Dl,WntlOB, SFRPl, conexina 43, eNOS, WntlOB, ciclina Dl,Frizzled2, e WISP2 é modulada pela administração do agente.

30. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que o parâmetro de modulaçãoóssea é expressão alterada induzida por administração doagente de um ou mais de COX-2, Jun, Fox, ciclina Dl,WntlOB, SFRPl, conexina 43 e eNOS.

31. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que outra série de células co-expressa Norrin-Frizzled4 e Dkk, e determinação de se odito agente modulação a inibição por Dkk de Norrin-Frizzled4.

32. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que outra série de células co-expressa Norrin, Frizzled4 e Kremen, e determinação de seo dito agente modula a inibição por Kremen de Norrin-Frizzled4.

33. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que outra série de células ex-pressa Norrin, Frizzled4, Kremen e Dkk, e determinação dese o dito agente modula a inibição por Kremen e/ou Dkk deNorrin-Frizzled4.

34. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que outra série de células ex-pressa Norrin, Frizzled4, Wnt e Dkk, e determinação de seo dito agente modulação a inibição por Dkk de Norrin-Frizzled4.

35. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 9, 11, 13, 14, 17, 23, 31, 33, ou 34, ca-racterizado pelo fato de que a Dkk é Dkkl, Dkk2, Dkk3 ouDkk4, ou um polipeptidio biologicamente ativo de Dkkl,Dkk2, Dkk3 ou Dkk4.

36. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 10, 32 e 33, caracterizado pelo fato deque Kremen é Kremenl ou Kremen2, ou um polipeptidio bio-logicamente ativo de Kremenl ou Kremen2.

37. Método, de acordo com a reivindicação 25,caracterizado adicionalmente pelo fato de que compreendea triagem do agente quanto à intensificação da atividadede LRP5 nas células.

38. Método, de acordo com a reivindicação 25,caracterizado pelo fato de que as células são células ós-seas, adipócitos, pré-adipócitos, células tronco, ou cé-lulas renais.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38,caracterizado pelo fato de que as células ósseas são cé-lulas KHOS/NP, células KHOS-240S, células KHOS-321H, cé-lulas DSDh, células VA-ES-BJ, células 7F2, células U20S,células' HOSTE85, células ROS, células MC3T3-E6, célulasUMR-106, células Saos2, células MG63 ou células HOB.

40. Método, de acordo com a reivindicação 41,caracterizado pelo fato de que as células ósseas são cé-lulas U20S .

41. Método, de acordo com a reivindicação 38,caracterizado pelo fato de que as células tronco são cé-lulas tronco mesenquimais e células C3H10T1/2.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41,caracterizado pelo fato de que as células tronco mesen-quimais são células tronco mesenquimais adultas humans.

43. Método, de acordo com a reivindicação 38,caracterizado pelo fato de que as células renais são cé-lulas HEK293A ou células HEK293T.

44. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado adicionalmente pelo fato de que compreendea etapa de administração do agente a um animal, e a de-terminação de se o dito agente induz uma alteração namassa óssea do dito animal.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44,caracterizado pelo fato de que o dito animal é um animaltransgênico.

46. Método, de acordo com a reivindicação 44,caracterizado pelo fato de que o dito animal transgênicoé um animal transgênico LRP5 ou HBM.

47. Método, de acordo com a reivindicação 44,caracterizado pelo fato de que o animal transgênico é umanimal com desativação de Norrin ou um animal com desati-vação de Frizzled4.

48. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 44-47, caracterizado pelo fato de que odito animal é um camundongo.

49. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 12, 34 e 47, caracterizado pelo fato deque Wnt é Wnt 1 a Wnt 19.

50. Método, de acordo com a reivindicação 49,caracterizado pelo fato de que Wnt é Wnt1, Wnt3, Wnt3a ouWntlOb.

51. Kit para identificar um agente que modulea atividade de LRP5-Norrin-Frizzled4, caracterizado pelofato de que compreende:(a) uma série de células incapazes de expressarNorrin que sejam co-transfectadas com ácidos nucléicosque codifiquem Frizzled4 e LRP5 ou fragmentos polipepti-dicos biologicamente ativos de Frizzled4 e LRP5;(b) opcionalmente, um ácido nucléico de Dkk pa-ra co-expressão em uma série de células que co-expressemFrizzled4 e LRP5 ou seus fragmentos polipeptidicos biolo-gicamente ativos;(c) opcionalmente, um ácido nucléico de Kremenpara co-expressão em uma série de células que co-expressem Frizzled4 e LRP5 ou seus fragmentos polipepti-dicos biologicamente ativos, e/ou para co-expressão emuma série de células que co-expressem Frizzled4, LRP5, eDkk ou seus fragmentos polipeptidicos biologicamente ati-vos;(d) opcionalmente, um ácido nucléico de LRP6para co-expressão em uma série de células que co-expressem Frizzled4 e LRP5, ou seus fragmentos polipepti-dicos biologicamente ativos; e(e) opcionalmente, um ácido nucléico de Wnt pa-ra co-expressão em uma série de células que co-expressemFrizzled4 e LRP5, ou seus fragmentos polipeptidicos bio-logicamente ativos.

52. Kit, de acordo com a reivindicação 51, ca-racterizado pelo fato de que as células são células devertebrados.

53. Kit, de acordo com a reivindicação 51, ca-racterizado adicionalmente pelo fato de que compreende umsistema repórter para medir a modulação da atividade deLRP5-Norrin-Frizzled4.

54. Kit, de acordo com a reivindicação 51, ca-racterizado pelo fato de que Dkk é Dkkl, Dkk2, Dkk3 ouDkk4, e Kremen é Kremenl ou Kremen2.

55. Kit, de acordo com a reivindicação 52, ca-racterizado pelo fato de que as células de vertebradossão células ósseas, adipócitos, células renais, célulasde Xenopus ou células tronco.

56. Kit, de acordo com a reivindicação 55, ca-racterizado pelo fato de que as células ósseas são célu-las KHOS/NP, células KHOS-240S, células KHOS-321H, célu-Ias DSDh, células VA-ES-BJ, células 7F2, células U20S,células HOSTE85, células ROS, células MC3T3-E6, célulasUMR-10β, células Saos2, células MG63 e células HOB.

57. Kit, de acordo com a reivindicação 55, ca-racterizado pelo fato de que as células renais são célu-Ias HEK293A ou células HEK293T.

58. Kit, de acordo com a reivindicação 55, ca-racterizado pelo fato de que as células tronco são célu-las tronco mesenquimais e células C3H10T1/2.

59. Kit, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 55 e 56, caracterizado pelo fato de que ascélulas ósseas são células U20S.

60. Kit, de acordo com a reivindicação 51, ca-racterizado pelo fato de que Wnt é Wnt 1 a Wnt 19.

61. Kit, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 51 e 60, caracterizado pelo fato de que Wnt éWnt1, Wnt3, Wnt3a ou WntlOb.

62. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-4, 13, 16, ou 20, caracterizado pelo fa-to de que compreende a etapa de determinação de se o a-gente modula um lipidio em um vertebrado.

63. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-4, 13, 16, ou 20, caracterizado pelo fa-to de que compreende a etapa de determinação de se o a-gente modula ossoem um vertebrado.

64. Célula ou linhagem celular desprovida deNorrin nativo e que expresse uma LRP5 não nativa e umaFrizzled4 não nativa, caracterizada pelo fato de que aLRP5 não nativa é uma proteína LRP5 não nativa ou a seufragmento biologicamente ativo e a Frizzled4 não nativa éuma proteína Frizzled4 não nativa ou seu fragmento biolo-gicamente ativo.

65. Linhagem celular, de acordo com a reivin-dicação 64, caracterizada pelo fato de que a LRP5 não na-tiva e/ou a Frizzled4 não nativa são expressadas de ma-neira estável.

66. Linhagem celular, de acordo com a reivin-dicação 64, caracterizada adicionalmente pelo fato de queexpressa uma Dkk não nativa e/ou uma Kremen não nativa oufragmentos polipeptidicos biologicamente ativos de umaDkk não nativa ou Kremen não nativa.

67. Linhagem celular, de acordo com a reivin-dicação 64, caracterizada pelo fato de que a Dkk não na-tiva é Dkkl, Dkk2, Dkk3 ou Dkk4 e a Kremen não nativa éKremenl ou Kremen2.