BRPI0707543B1 - Composiçao de polipeptideo e uso da mesma - Google Patents

Abstract

polipeptídeo, composição de polipeptídeo, metodos para produzir um polipeptídeo e uma construção de polipeptídeos, composição de vacina ou medicamento contra influenza, metodo para produzir uma composição de vacina ou medicamento, uso de um polipeptídeo, uma composição de polipeptídeo, uma construção de polipeptídeo ou uma composição de vacina ou medicamento, e, método de tratamento ou prevenção de influenza provê-se um polipeptídeo não tendo mais do que 100 aminoácidos, cujo polipeptídeo compreende uma ou mais seqüências tendo pelo menos 60% de homologia com qualquer uma de seq id 1-6 ou compreende dois ou mais epítopos tendo 7 aminoácidos ou mais, cada epítopo tendo, pelo menos, 60% homologia com uma sub-seqüência de qualquer seq id 1-6, que tem o mesmo comprimento que o epítopo: seq id 1 dlealmewlktrpilspltkgilgfvftltvp, seq id 2, llyclmvmylnpgnysmqvklgtlcalcekqashs, seq id 3, dliflarsalilrgsvahksc, seq id 4 pgiadiedltllarsmvwrp, seq id 5 llidgtaslspgmmmgmfnmlstvlgvsilnlgq, seq id 6 iigilhlilwildrlffkcfyrlf em que o polipeptídeo é imunogênico em um vertebrado expressando um alelo do complexo de histocompatibilidade principal (mhc), e em que o polipeptídeo não é uma proteína do vírus de influenza completa.

Description

[001] A invenção refere-se a sequências de peptideos, composições compreendendo as sequências de peptideos e, em particular, vacinas de influenza compreendendo as sequências e as composições, e usos das sequências. A presente invenção refere-se especialmente a vacinas que são protetoras contra uma pluralidade de cepas de virus de influenza, incluindo virus existentes através de diferentes espécies (por exemplo, protetoras tanto contra influenza humana como aviária) bem como virus futuros que mudaram de virus existentes (como uma forma mudada futura de gripe aviária que é prontamente transmissível de humano para humano, que pode potencialmente dar origem a uma pandemia de influenza) .

[002] A defesa contra doença é critica para sobrevivência de todos os animais, e o mecanismo de defesa empregado para este fim é o sistema imune do animal. Compreender o sistema imune é assim uma chave para compreender o desenvolvimento de tratamentos novos e mais sofisticados para humanos e aves similares.

[003] O mecanismo de operação do sistema imune se encontra sob investigação há muitos anos. O sistema é composto de vários tipos de células e uma variedade de moléculas, tornando o mesmo extremamente complexo. Mesmo após muitos anos de estudo, a extensão completa dos componentes do sistema imune e sua interação uns com os outros, é imperfeitamente compreendida.

Há muitos anos atrás foi reconhecido que uma pessoa que se recupera de uma doença particular pode adquirir alguma proteção no futuro contra essa doença, mas não contra uma doença que a pessoa ainda não 5 contraiu. Este aspecto fundamental do sistema imune foi interpretado em tal ocasião ao se considerar que o sistema imune adquire um tipo de “memória” contra determinados patógenos uma vez já tendo ocorrido a exposição a tais patógenos, sendo a memória específica para uma determinada doença.

Gradualmente, tomou-se conhecido que a exposição a bO variantes menos prejudiciais de um patógeno pode induzir proteção contra variantes mais prejudiciais (por exemplo, exposição a varíola bovina para proteger contra varíola, ou exposição a um antraz inativado para proteger contra antraz vivo). Assim, surgiu a idéia de vacinação contra uma doença.

Sabe-se agora que o sistema imune tem pelo menos duas 15 divisões: imunidade inata e imunidade adaptiva. O sistema inato é totalmente funcional antes de um patógeno entrar no sistema, enquanto o sistema adaptive é comutado após o patógeno entrar no sistema. Desenvolve-se então um ataque específico ao patógeno. O sistema inato compreende um número de componentes incluindo fagócitos como macrófagos, que (como o nome 20 sugere) “comem” ou engolem corpos estranhos como patógenos.

Tipicamente, mas não exclusivamente, a presente invenção refere-se ao sistema imune adaptive, e salvo especificamente indicado ao contrário, “sistema imune”, no presente contexto, refere-se ao sistema imune adaptive.

A fim de compreender mais completamente como o sistema imune funciona, o papel de seus componentes individuais pode ser cuidadosamente considerado. Em relação ao sistema imune adaptive, sabe-se bem que a imunidade contra patógenos é provida pela ação dos linfócitos, que constituem o tipo de células mais comuns no sistema imune. Existem dois tipos de linfócitos: o linfócito B e o linfócito T. Estes sâo geralmcnte denominados células B e células T, respectivamente.

As células B têm a capacidade de desenvolver-se nas células do plasma, que fabricam anticorpos. Os anticorpos são componentes muito 5 importantes do sistema imune animal. Eles são produzidos em resposta a alguma porção de assinatura do patógeno invasor (um antígeno do patógeno - antigenos aqui sendo definidos como qualquer substância estranha reconhecida pelo sistema imune) e são geralmente específicos para aquele patógeno. No entanto, se dois patógenos forem muito similares, ou pelo bO menos contiverem o mesmo antígeno, então os anticorpos produzidos contra um podem ser efetivos mesmo assim contra o outro (ele podem "reagir cruzados"). Isto explica porque inoculação com varíola bovina pode proteger contra varíola. E importante perceber que os anticorpos “reconhecem” somente uma porção pequena da molécula antigênica do patógeno em vez do 15 patógeno como um todo. Estas porções são denominadas epítopos.

As células T não possuem ou produzem anticorpos. Ao contrário, elas reconhecem fragmentos (isto é, epítopos) do antígeno estranho complexados com complexo de histocompatibilidade principal (MHC) (ou no caso de humanos, antígeno de leucócito humano (HLA)) via um receptor zO especializado conhecido como TCR (receptor de células T). As células T são, elas mesmas, divisíveis em subconjuntos que podem ter tanto uma função regulatória como uma função efetora. As células efetoras estão envolvidas com “efetuar” a remoção de substâncias estranhas. Por exemplo, as células T citotóxicas (CTL) são células efetoras que são capazes de exterminar células 25 infectadas, bem como outras espécies indesejadas como células de tumor. Células T regulatórias, por outro lado, desempenham um papel em auxiliar as células B e T a tomarem-se mais efetivas. Devido a esta função, as células T regulatórias são frequentemente denominadas células T “auxiliares”. Outras células T regulatórias, denominadas células T “supressoras”, inibem, como se pensa, as respostas imunes, mas estas são menos bem compreendidas. Células T regulatórias também podem interagir com componentes do sistema imune inato para reforçar sua atividade.

Em um indivíduo saudável normal, os linfócitos no sistema 5 imune permanecem em um estado “de repouso” inativo até uma resposta imune ser desencadeada. Quando se requer uma resposta imune, os linfócitos tomam-se ativados, proliferam e começam a realizar suas funções designadas. Por exemplo, qualquer célula T em repouso exibindo em sua superfície um TCR que reconhece um epítopo do patógeno invasor complexado com uma bO molécula de MHC é ativada, prolifera (isto sendo denominado expansão clonal) e os descendentes resultantes começam a realizar ativamente suas funções efetoras predeterminadas requeridas para combater os organismos invasores.

Quando é completada a resposta imune, (isto é, os patógenos 15 e/ou células infectadas foram eliminados) os linfócitos revertem em um estado de repouso mais uma vez. Este estado de repouso não é, no entanto, equivalente ao estado de repouso inativo inicial. Linfócitos ativados, mas em repouso, podem ser rapidamente recrutados e induzidos a proliferar em resposta a uma infecção pelo mesmo, ou patógeno intimamente relacionado, zO em um período posterior.

Esta capacidade de linfócitos em repouso ativados fornecerem uma resposta mais rápida e mais potente após um segundo encontro com um patógeno invasor efetivamente provê o sistema imune com “memória”. A exploração da memória do sistema imune é a base para todas os fármacos 25 imunoprofiláticos de longo prazo (por exemplo, vacinas) e permanece um alvo para o desenvolvimento de fármacos imunoterapêuticos de prazo bem mais longo.

A fim de que as células realizem suas funções dentro de sistemas complexos de um animal, as células necessitam ter “receptores” em to suas superfícies. Estes receptores são capazes de “reconhecer1’ substâncias específicas que controlam vários processos essenciais como ativação, proliferação e aderência a outras células ou substratos. Por exemplo, no caso do sistema imune, os receptores em células B e T permitem às mesmas não 5 somente reconhecerem antigeno mas também interagirem umas com as outras e, assim, regular suas atividades. Sem estes receptores, as células podem ser desprovidas de meios essenciais de comunicação e podem ser incapazes de agir efetivamente em comum acordo, que é essencial para o sistema imune de um organismo multicelular.

A fim de ser capaz de reconhecer e tratar especificamente com a ampla faixa de patógenos presentes no meio ambiente, o sistema imune desenvolveu dois tipos de receptores de antigeno altamente variáveis em linfócitos: anticorpos em receptores de células B e células T, ou TCRs, em células T.

Existem muitos receptores de antigeno possíveis, diferentes, presentes no corpo para permitir ao sistema imune reconhecer uma ampla variedade de patógenos invasores. De fato, existem aproximadamente IO12 receptores de células B e células T diferentes em um indivíduo. Cada célula B individual tem somente um tipo de receptor, e, assim, para tratar com um patógeno particular, uma célula B tendo o receptor “de melhor encaixe” para um antigeno desse patógeno deve ser selecionada. Este processo é denominado “seleção clonal”. Na teoria, somente um único clone pode responder (uma resposta monoclonal) ou vários (uma resposta oligoclonal) ou muitos (uma resposta policlonal) dependendo do número de antígenos/ epítopos demonstrados pelo patógeno, e da especificidade das várias células B selecionadas para estes antígenos/epítopos.

Existe uma diferença principal entre os tipos de antígenos que podem ser reconhecidos por células B e células T. Até onde se sabe, somente os receptores sobre a superfície de linfócitos B (isto é, anticorpos) são capazes de reconhecer diretamente antígenos tal como proteínas sobre vírus e bactérias, ou moléculas estranhas dissolvidas no fluido corporal. Os anticorpos também podem ser produzidos em uma forma solúvel pelas células B quando são ativados e se desenvolvem em células do plasma. Os anticorpos 5 também são denominados imunoglobulinas (abreviado para Ig). Os receptores de células T, por outro lado, reconhecem somente peptídeos curtos, também conhecidos como epítopos de células T, sobre a superfície de células do corpo. Estes epítopos de células T são produzidos por degradação de proteínas maiores que são tanto próprias (isto é, proteínas do corpo ocorrendo 0 naturalmente) como não próprias (isto é, derivadas de organismos estranhos infectando o corpo). Somente os derivados de proteínas estranhas, isto é, antígenos, são normalmente capazes de induzir uma resposta imune no corpo. Uma vez produzidos, estes epítopos são ligados a um tipo especial de molécula, o MHC (complexo de histocompatibilidade principal) e o complexo 15 resultante é então apresentado sobre a superfície das células para ligar o receptor de células T.

Deve estar claro que devido à natureza destrutiva da resposta imune, a resposta deve agir somente contra patógenos estranhos, não contra as próprias proteínas ou células do corpo. Assim, o sistema imune precisa distinguir entre “■próprio” e “não próprio”. Foi proposto que embora os clones de linfócitos reagindo contra os próprios sejam produzidos, eles são deletados antes que qualquer reação possa ocorrer. Este processo é denominado “deleção clonal”. Também foi proposto que quaisquer linfócitos de reação própria podem ser retidos, mas somente em um estado “desligado”. Este 25 mecanismo é denominado “anergia clonal”. Qualquer que seja o processo considerado, não é evidente qual é o mecanismo subjacente exato permitindo que os tecidos linfóides, como o timo, identifiquem clones de células T individuais reagindo contra próprios dentre o conjunto de linfócitos T reagindo somente contra não próprios. Os presentes inventores investigam agora mais totalmente o mecanismo de discriminação "próprio/não próprio", que levou ao desenvolvimento da presente invenção. Os inventores estabeleceram agora um método para prever a imunogenicidade de uma substância como peptídeo, que possibilitou a identificação mais rápida de seqüências de peptídeos imunogênicos em proteínas grandes.

Sabe-se há muitos anos que o complexo de histocompatibilidade principal (MHC) desempenha um papel chave no sistema imune de animais. As moléculas de MHC possibilitam às células T reconhecerem antígenos, como já discutido acima. Existem três tipos gerais de moléculas de MHC, classe I, classe II e classe III. As moléculas de MHC classe I e classe II são glicoproteínas que estão presentes sobre a superfície da célula, enquanto as de classe III são geralmente moléculas presentes no interior da célula. Existe um grande número de tipos diferentes de moléculas de MHC. Por exemplo, em humanos (onde MHC é denominado HLA, antígeno de leucócito humano) existem várias centenas de diferentes alelos de genes codificando moléculas de MHC, significando que, na população humana, existem muitos tipos diferentes de HLA. O MHC de espécies diferentes é tipicamente designado de acordo com convenções diferentes, assim MHC para camundongo é denominado H-2, para rato RT1 e para coelho RLA. As regiões de genes diferentes codificando diferentes moléculas de MHC em um indivíduo são geralmente designadas individualmente, como HLA-A, HLA-C, etc. em humanos.

A molécula de MHC é uma molécula do sistema imune crítica, uma vez que é esta molécula que apresenta os epítopos dos antígenos ao sistema imune. Por exemplo, se uma célula T deve responder a um patógeno particular, o patógeno deve ter pelo menos um antígeno (como uma proteína) que tem pelo menos um epítopo (como uma porção de peptídeo da proteína) que pode ligar-se a uma molécula de MHC sobre a superfície de uma célula e assim interagir com uma célula T que se liga ao complexo MHC-peptídeo.

Assim, a resposta imune depende da capacidade do MHC de se ligar a um epítopo. Se não existe nenhum epítopo ao qual o MHC irá se ligar, ou se não existe nenhuma célula T que irá se ligar ao complexo MHC-peptídeo, então não irá ocorrer qualquer resposta imune.

Com relação a proteínas "próprias”, no entanto, um dentre vários epítopos pode ser capaz de se ligar à molécula de MHC e, conseqüentemente, induzir potencialmente uma resposta imune. Nestas ocasiões, um “sinal” específico deve ser provido para os clones de linfócito de reação própria a ser deletado ou “desligado”.

Uma vez que, como indicado acima, ambos os peptídeos próprio e estranho (isto é, não próprio) podem ligar-se a moléculas de MHC, a ligação de vários peptídeos a moléculas de MHC recebeu um exame minucioso particular no campo de imunologia. Muitas investigações tem procurado calcular ou prever a resistência de ligação entre certos tipos de 15 MHC (particularmente HL A e H-2) e seqüências de peptídeos, para tentar calcular respostas imunes, ou a falta das mesmas (isto é, o “sinal” requerido para discriminação entre próprio e estranho). Exemplos destes Incluem os seguintes:

Altuvia Y, Schueler O, Margalit H. 1995. "Ranking potential 20 binding peptides to MHC molecules by a computational threading approach". J. Mol. Biol., 249:244-250.

Altuvia Y, Sette A, Sidney J, Southwood S, Margalit H. 1997. "A structure-based algorithm to predict potential binding peptides to MHC molecules with hydrophobic binding pockets". Hum. Immunol. 58:1-11. G.E. Meister, CG.P. Roberts, J.A. Berzofsky, A.S. De Groot, "Two novel T cell epitope prediction algorithms based on MHC-binding motifs; comparison of predicted and published epitopes from Mycobacterium tuberculosis and HIV protein sequences" Vaccine, 13:581-591, (1995). Gulukoia K, Sidney J, Sette A, DeLisi C. 1997. "Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules". J. Mol. Biol. 267:1258-1267.

Pamer EG, Harty JT, Bevan MJ. "Precise prediction of a dominant class I MHC-restricted epitope of Listeria monocytogenes". Nature 5 1991;353:852-855.

Parker K.C, Bednarek MA, Coligan JE. 1994. "Scheme for ranking potential HLA- A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains". J. Immunol. 152:163-175.

Rammensee HG, Friede T, Stevanoviic S. 1995. "MHC )θ ligands and peptide motifs: First listing", rmmunogenetics 41:178-228.

Ruppert J, Sidney J, Celis E, Kubo RT, Grey HM, Sette A. 1993. "Prominent role of secondary anchor resíduos in peptide binding to HLA-A2.1 molecules". Cell 74:929-937.

Schueler-Fuπnan O, Elber R, Margalit H. 1998. "Knowledge- 15 based structure prediction of MHC class I bound peptides: A study of 23 complexes". Fold Des. 3:549-564.

Sette A, Buus S, Appella E, Smith JA, Chesnut R, Miles C, Colon SM, Grey HM. 1989. "Prediction of major histocompatibility complex binding regions of protein antigens by sequence pattern analysis". Proc. Natl. 20 Acad. Sci. USA 86:3296-3300.

Sette A, Sidney J, del Guercio MF, Southwood S, Ruppert J, Dahlberg C, Grey HM3 Kubo RT. 1994a. "Peptide binding to the most frequent HLA-A class I alleles measured by quantitative molecular binding assays". Mol. Immunol. 31:813-822.

Sette A, Vitiello A, Reheraian B, Fowler P, Nayersina R, Kast WM, Melief CJM, Oseroff C, Yuan L, Ruppert J, et al. 1994b. "The relationship between class I binding affinity and immunogenicity of potential cytotoxic T cell epitopes". J. Immunol. 153:5586-5592. Stefan Stevanovic (2002): "Structural basis of immunogenicity", Transplant Immunology 10 133-136 Stumiolo T, Bono E, Ding J, Raddrizzani L, Tuereci O, Sabin U, Braxenthaler M, Gallazzi F, Protti MP, Sinigaglia F, Hammer J. 1999.

"Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using 5 DNA microarrays and virtual HLA class II matrices". Nat. Biotechnol. 17:555-561.

T. Sudo, N. Kamikawaji, A. Kimura, Y. Date, CJ. Savoie, H. Nakashima, E. Furuichi, S. Kuhara, and T. Sasazuki, "Differences in MHC Class I self peptide repertoires among HLA-A2 subtypes." J. Immunol.: 155: 0 4749-4756,(1995).

T. Tana, N. Kamikawaji, C J.Savoie, T. Sudo, Y. Kinoshita, T. Sasazuki, "A HLA binding motif-aided peptide epitope library: A novel library design for the screening of HLA-DR4- restricted antigenic peptides recognized by CD4+ T cells." J. Human Genet., 43:14-21 (1998).

K. Falk, et al. "Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules", Nature, Vol. 351, 290-297 (1991).

T Elliott et al. "Peptide-induced conformational change of the class I heavy chain", Nature, Vol. 351, 402-407, (1991). -0 P. Parham, "Deconstructing the MHC", Nature, Vol. 360, 300- 301,(1992).

Hwai-Chen Guo et al., "Different length peptides bind to HLA- Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle", Nature, Vol. 360, 364-367,(1992).

Y. Chen et al, "Naturally processed peptides longer than nine amino acid resíduos bind to the class 1 MHC molecule HLA-A2.1 with high affinity and in different conformations", J. Immunol., 152, 2874-2881, (1994).

D. F. Hunt et al. "Characterization of peptides bound to the class I MHC molecule HLA- A2.1 by mass spectrometry". Science, Vol. 255, 1263-1263, (1992).

Em geral, as tentativas da técnica anterior para prever a imunogenicidade de peptídeos particulares por cálculo da resistência de ligação entre o peptídeo e o ambiente de ligaçào conhecido de uma molécula de MHC particular. O ambiente de ligação envolve uma “bolsa” na molécula de MHC que é adaptada para aceitar um peptídeo de um certo comprimento (como 7-15 aminoácidos). A estrutura da bolsa já pode ser conhecida a partir de estudos cristalográficos de raios X prévios. Esta resistência pode ser calculada matematicamente usando algoritmos apropriados para interação atômica e molecular. Altemativamente, a técnica anterior pode tentar “classificar” a resistência de ligação de um peptídeo com base em motivos existentes no peptídeo, como aminoácidos particulares estando presentes em posições particulares em um peptídeo de determinado comprimento, por exemplo, uma prolina presente na posição três de uma ligação de peptídeo de 8 aminoácidos a uma molécula de HLA conhecida particular. Geral mente estas abordagens alcançaram sucesso limitado.

Os presentes inventores acreditam que melhoraram as teorias acima a partir de uma compreensão melhor de como células T reagindo contra substâncias próprias, como proteínas próprias, são identificadas antes de sua eliminação (deleção clonal) ou silenciamento (anergia clonal). Consequentemente, os inventores foram capazes de identificar sequências de peptídeos imunogênicos específicas que podem prover proteção contra patógenos específicos, e desenvolveram vacinas para estes patógenos, usando as sequências identificadas. No caso da presente invenção, os inventores desenvolveram peptídeos utilizáveis em vacinas para influenza elicitando uma resposta de células T.

Previamente, vacinas para influenza foram desenvolvidas identificando uma cepa de vírus de influenza existente e então produzindo uma vacina específica para o vírus. Geralmente, as vacinas são baseadas em uma resposta de células B (anticorpo), o anticorpo sendo reativo com os antígenos de superfície (isto é, hemaglutinina e neuraminidase) da cepa de vírus de influenza específica contra a qual ela está sendo desenvolvida. Tipicamente, as proteínas dc superfície compreendendo os antígenos são 5 variáveis de uma cepa de vírus de influenza para a próxima, uma vez que mutação do vírus para produzir um novo vírus tende a ocorrer nas proteínas de superfície. A consequência disto é que vacinas de influenza convencionais geralmente protegem somente contra uma cepa de vírus específica, e não irão proteger contra uma nova cepa que resulte de uma mutação. Assim, uma nova bo vacina é requerida para proteção contra uma cepa emergente. O problema claro com esta abordagem é que existe um período de tempo entre a emergência da nova cepa de vírus, e desenvolvimento da vacina, durante o qual não há nenhuma proteção disponível contra o vírus. Se o vírus for particularmente nocivo, isto pode levar a muitos milhões de mortes, como tem 15 ocorrido nas maiores pandemias de influenza do último século.

Conhece-se há algum tempo que linfócitos T citotóxicos podem prover uma resposta imune em cepas de vírus de influenza. Estudos recentes mostram que uma resposta de CTL em humanos pode ser dirigida - para epítopos múltiplos. Foi sugerido que existe uma resposta dominante para o epítopo M-l 58-66 restrito de HLA-A2. Estes estudos incluem A.C. Boon et al, J. Virol, janeiro de. 2002, 582-90; S. Tamura et al Jpn. J. Infect. Dis., dezembro de 2004, 236-47; G. Deliyannis et al J. Virol., maio de 2002, 4212- 21; C. Gianfrani et al Hum. Immunol, maio de 2000, 438-52; e J. Jameson et al J. Immunol., junho de 1999, 7578-83.

Também recentemente foi realizada uma investigação sobre peptídeos imunogênicos específicos que podem ser utilizáveis no desenvolvimento de uma vacina para influenza elicitando uma resposta de células T. Tipicamente, este trabalho envolve a investigação de resposta de CTL para testar peptídeos de influenza, por exemplo, em camundongos transgênicos. Os peptídeos testados tendem a ser sequências curtas que podem ser reativas em um tipo de MHC (ou HLA) e sào tomados de unia cepa de influenza de teste específica. Por exemplo, em Vaccine, 2005, 5231 -44, N. Hu et al. descrevem o teste de peptídeo Ml 58-66 do tipo selvagem em 5 camundongos Tg HLA expressando HLA-A2, -B7 ou -B27. Os resultados mostram que o peptídeo é um epítopo de influenza reconhecido por camundongos transgênicos expressando HLA-A2. Em Clin. Exp. Immunol., outubro de 2005, 45-52, A.C. Boon et al descrevem peptídeos de influenza A Ml 58-66 e NP 44-52 como epítopos reconhecidos em indivíduos HLA- ^0 A*0101 e HLA-A*0201. Em Cell Immunol., abril de 2005, 110-123, E. Cheuk et al descrevem peptídeo de influenza A NP 383-391 como um epítopo reconhecido em camundongos deficientes da classe I HLA-B27/H2. Usando programas de previsão de epítopos, os autores identificaram mais três epítopos de influenza A restritos a B27, BP-2 702-710, PB-1 57] 579 e PB-2 15 368-376. Em J. Immunol., fevereiro de 2004, 2453-60, A.C. Boon et al descrevem clones de CTL humanos específicos para variantes naturais do epítopo restrito a HLA-B*3501 em NP 418-426. Em J. Immunother., janeiro- fevereiro de 2003, 41-6, A; Trojan et al descrevem o RLEDVFAGK dc 9 meros, restrito a HLA-A3 que é capaz de induzir reatividade de CTL específica. O peptídeo G1LGFVFTL de matriz do vírus de influenza A restrito a HLA-A2 também é descrito. Em J. Gen. Virol., julho de 2001, 1749-55, S. Tourdot et al identificam um epítopo restrito D(k) de murino derivado da proteína PB-1 de A/PR/8/34 polimerase da cepa de vírus de influenza, correspondente a resíduos de aminoácidos 349-357 (ARLGKGYMF). Em J.

Immunol., abril de 2001, 4627-33, G.T. Belz et al identificam um peptídeo imunogênico (SSYRRPVGI) da proteína PB-1 polimerase de influenza, correspondente aos resíduos de aminoácidos 703-71 1 e um mimotopo (ISPLMVAYM) de PB-2 polimerase. PCT/US2005/002954 descreve epítopos de CTL compreendendo NP 265-273, tendo a seqüência ILRGSVAHK, e também epítopos compreendendo NP 305-313. Finalmente, US 6.740.325 descreve dois epítopos de CTL: NP 335-350, e NP 380-393. Outros estudos mostram que dados de camundongos transgênicos deram um modelo confiável para a investigação de respostas de 5 CTL em humanos. Em Tnt. Immunol. Abril de 1995, 597-605, S. Man et al mostram que o epítopo de influenza A dominante reconhecido por linfócitos T citotóxicos restritos a HLA-A2.1 de camundongos transgênicos HLA-A2.1 foi o epítopo do peptídeo (M-l) de proteína 1 de matriz que é imunodominante em respostas de CTL em humanos. Outros estudos nesta •0 área foram conduzidos por EJ. Bernhard et al (J. Exp. Med., setembro de 1998, 1157-62) e E. Cheuk et al (J. Immunol., novembro de 2002, 5571-80).

No entanto, apesar dos epítopos conhecidos serem estudados extensamente, nenhum se tomou ainda satisfatório para formar a base de uma vacina para influenza que é capaz de proteger contra mais do que uma única 15 cepa de vírus de influenza. Além disso, vacinas baseadas nestes epítopos únicos, mesmo se forem para prover alguma proteção, podem provavelmente ser específicas para um HLA particular, tomando as mesmas ineficazes em uma grande proporção da população humana.

Assim, um problema significativo com vacinas conhecidas, "_0 seja se baseando em uma resposta de células B ou células T, é que elas protegem somente contra uma cepa de vírus existente, e não provêem proteção contra possíveis cepas futuras que podem se desenvolver. Com a emergência da cepa H5N1 altamente perigosa na população aviária, a necessidade de uma vacina antes de uma pandemia humana baseada em uma 25 mutação subseqüente da cepa H5N1 toma-se mais aguda. Além disso, vacinas baseadas em peptídeos conhecidos elicitando respostas de células T podem não ser efetivas em grandes seções da população.

Consequentemente, é um objetivo da presente invenção resolver os problemas associados com a técnica anterior conhecida como descrito acima. É ainda outro objetivo da presente invenção prover um polipeptídeo que seja capaz de elicitar uma resposta imune de CTL em vertebrados contra um pluralidade de cepas de influenza e/ou em uma pluralidade de indivíduos expressando MHCs diferentes (HLAs). É ainda 5 outro objetivo da presente invenção prover uma vacina para influenza usando o polipeptídeo da invenção. Preferivelmente, a vacina é capaz de proteger contra uma pluralidade de cepas de influenza e/ou é efetiva em uma pluralidade de indivíduos expressando MHCs diferentes (HLAs).

Conseqüentemente, a presente invenção provê um polipeptídeo 0 não tendo mais do que J 00 aminoácidos, cujo polipeptídeo compreende uma ou mais sequências tendo pelo menos 60% de homologia com qualquer uma das SEQ ID: 1-16, ou compreende dois ou mais epítopos tendo 7 aminoácidos ou mais, cada epítopo tendo pelo menos 60% de homologia com uma sub- seqüência de qualquer uma das SEQ ID: 1-6 que têm o mesmo comprimento 15 como o epítopo: SEQ ID 1 DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVP SEQ ID 2 LLYCLMVMYLNPGNYSMQVKLGTLCALCEKQASHS SEQ ID 3 DL1FLARSALILRGSVAHKSC SEQ ID 4 PGIADIEDLTLLARSMVWRP 20 SEQ 1D 5 LLIDGTASLSPGMMMGMFNMLSTVLGVS1LNLGQ SEQ ID 6IIGILHLILWILDRLFFKCFYRLF em que o polipeptídeo é imunogênico em um vertebrado expressando um alelo do complexo de histocompatibilidade principal (MHC), e em que o polipeptídeo não é uma proteína do vírus de influenza completa.

Assim, o polipeptídeo é um que pode compreender o total de (ou pode compreender pelo menos 7 ou mais partes de resíduo) de qualquer uma das seqüências acima, mas não pode ter mais do que 100 resíduos de aminoácidos no total. O polipeptídeo também deve ser imunogênico em um vertebrado expressando um alelo de MHC (FILA em humanos). Um polipeptídeo imunogênico é compreendido no presente contexto como significando um polipeptídeo que elicita uma resposta imune em um vertebrado, como por ligação a um MHC de vertebrado e fazendo com o mesmo reagir com um linfócito de células T citotóxico. Um método para determinar se um polipeptídeo possui imunogenicidade é descrito na experimento 1 abaixo. No entanto, a presente invenção não está limitada a estes métodos, e o versado na técnica pode selecionar qualquer método conhecido para determinar a imunogenicidade, como desejado.

Como mencionado acima, o polipeptídeo pode ser um 0 compreendendo dois epítopos de 7 ou mais resíduos que reagem com um ou mais MHCs e, assim, elicitar uma resposta de CTL ampla. A resposta pode estar em um único indivíduo ou pode estar em pelo menos dois indivíduos diferentes (e os indivíduos podem ser da mesma espécie ou de espécies diferentes). Assim, o polipeptídeo pode compreender pelo menos dois 15 epítopos de 7 ou mais resíduos, cada um dos quais individualmente provê uma resposta a um indivíduo diferente. Um epítopo no contexto da presente invenção é uma parte de um polipeptídeo que é capaz de se ligar a um MHC de vertebrado em um vertebrado, preferivelmente elicitando uma resposta imune, como levando o complexo MHC-epítopo a reagir com um CTL. Um 20 método para determinar se um polipeptídeo é ou contém um epítopo é descrito no experimento 1 abaixo. No entanto, a presente invenção não está limitada a estes métodos, e o versado na técnica pode selecionar qualquer método conhecido para determinar se um polipeptídeo é ou contém um epítopo, como desejado. Os presentes inventores verificaram que as seqüências acima compreendem uma pluralidade de epítopos de CTL, que podem dar proteção contra influenza para uma ampla variedade de vertebrados em uma população. Além disso, os inventores analisaram todas as seqüências de cepas de vírus de influenza conhecidas através de todas as espécies, e verificaram Ji p- que as seqüências especificadas são notavelmente conservadas através de todas as cepas de vírus de influenza conhecidas. Como tais, estas seqüências são muito improváveis de ser significativamente alteradas em novas cepas resultantes de mutação de cepas existentes. Consequentemente, os epítopos 5 nestas seqüências que provêem proteção são altamente prováveis de estarem presentes na forma não alterada em novas cepas, uma vez que a mutação não ocorre normalmente nestas regiões. Conseqüentemente, estes epítopos provêem excelente oportunidade não somente para prover proteção contra cepas de influenza existentes (como a cepa H5N1 de “gripe aviária”), mas 0 também proteção contra cepas ainda desconhecidas (como uma forma mudada de H5N1 que pode passar facilmente de humano para humano e formar a base de uma pandemia).

Como discutido acima, as seqüências foram identificadas após análise de todas as seqüências de cepas de virus de influenza conhecidas 15 através de todas as espécies. As seqüências são, assim, seqüências de consenso desenvolvidas a partir da análise acima. A despeito de serem seqüências de consenso, as seqüências em alguns casos correspondem exatamente a seqüências naturais em algumas das cepas de vírus de influenza conhecidas. Devido à notável conservação nas seqüências através dos vírus zO em todas as espécies, as seqüências de consenso, mesmo quando diferindo das seqüências presentes, somente diferem em um pequeno número de resíduos, e assim contêm muitos epítopos pequenos (8 meros, 9 meros, 10 meros, etc.) para os quais não há nenhuma diferença das seqüências naturais. As seqüências de consenso acima, como um todo, contêm, assim, muitos 25 epítopos efetivos que são iguais aos epítopos naturais, bem como epítopos efetivos que diferem somente levemente de epítopos naturais. Será evidente ao versado na técnica que a invenção estende-se não somente às seqüências de consenso e seus epítopos, mas também às seqüências presentes correspondentes em quaisquer cepas de vírus de influenza. Assim, seqüências com alguma homologia com as seqüências de consenso também estão dentro do escopo da invenção. Esta homologia permite substituição, por exemplo, de até 3 aminoácidos em um epítopo de 8 meros (62,5% de homologia) ou em um epítopo de 9 meros, 10 meros ou 11 meros. Prefere-se que não mais que 5 10 destas substituições sejam identificáveis em uma sequência da invenção correspondente às seqüências totais de SEQ ID 1-6 (66,6% de homologia para uma de 30 meros). Estas substituições são preferivelmente substituições conservativas em linha com esquemas de substituição conhecidos.

Tendo em mente que a invenção estende-se da sequência de lO consenso às seqüências naturais correspondentes, então a invenção também provê um polipeptídeo tendo não mais do que 100 aminoácidos, cujo polipeptídeo compreende uma ou mais seqüências definidas pelos seguintes resíduos de aminoácidos de uma proteína de vírus de influenza, ou compreende dois ou mais epítopos tendo 7 aminoácidos ou mais de uma seqüência definida pelos seguintes resíduos de aminoácidos de uma proteína de vírus influenza: resíduos 36-75 influenza A) resíduos 124-158 influenza B ) resíduos 255-275 influenza A) resíduos 306-326 de uma proteína Ml de uma proteína Ml de uma proteína NP de uma proteína NP (preferivelmente (preferivelmente (preferivelmente (preferivelmente de uma cepa dc de uma cepa de de uma cepa de de uma cepa de influenza B ) resíduos 395-428 de uma proteína PB1 resíduos 3 2-55 de uma proteína M2 em que, o polipeptídeo é imunogênico em um vertebrado expressando um alelo do complexo de histocompatibilidade principal (MHC), e em que o polipeptídeo não é uma proteína de vírus de influenza completa.

A numeração da seqüência referida na presente invenção é definida de acordo com princípios bem reconhecidos. Assim, a numeração começa em 1 do códon de iniciação de tradução reconhecido (ATG). Isto corresponde a uma metionina (M), para o segmento do genoma de influenza codificando a proteína de interesse. Em outras palavras, ele começa em 1 com < relação a metionina mostrada como o primeiro aminoácido na seqüência da proteína de interesse como usado e definido pelas bases de dados em que as seqüências foram descritas (isto é, GenBank, SwissProt, etc.).

A presente invenção será descrita em maiores detalhes por meio de exemplo somente com referência às seguintes figuras, em que: As figuras IA a ÍF mostram a produção de IFN-y por culturas de esplenócitos primários de camundongos vacinados com Flu-v e NRP estimulados com Con A (10 pg/ml), lisozima solúvel (5 pg/ml), polipeptídeos solúveis purificados (Pl, figura IA); P2 (figura IB); P3 (figura 1C), P4 (figura 1D), P5 (figura IE) e P6 (figura F); 5 pg/ml) e TI alinhado a HLA (Tl) e células humanas JURKAT (Ju) desalinhadas, transfectadas tanto com lisozima, Pl, P2, P3, P4, P5, como P6 de acordo cora o protocolo descrito no exemplo 1 abaixo (a relação de esplenócito para célula transfectada é 10:1). A produção de IFN-y é representada como o diferencial entre o nível de z0 produção em resposta ao antígeno considerado menos o IFN-y produzido em resposta tanto a lisozima solúvel como a célula correspondente transfectada com lisozima. Os níveis de fundo da produção de IFN-y mediada por lisozima foram para 25 ± 10 pg/ml de antígeno solúvel, para antígeno em 316 ± 43 pg/ml de Tl, e para antígeno em 19 ± 6 pg/ml de Jurkat; A figura 2 mostra a produção de IFN-y por culturas de esplenócitos primários de camundongos vacinados com Flu-v e NRP estimulados com Con A (10 pg/ml), lisozima solúvel (5 pg/ml), preparação de polipeptídeo Flu-v solúvel purificado (Pl, P2, P3, P4, P5 e P", todos juntos em 5 pg/ml) e Tl alinhado a HLA (Tl) e células humanas JURKAT (Ju) desalinhadas tanto infectadas com cepas de influenza A/New_Caledonia/20/99, A/NYMC/X-147 ou B/Johannesburg/5/99 ou transfectadas com lisozima de acordo com o protocolo descrito no exemplo 1 abaixo (a relação de esplenócito para célula infectada/transfectada é 10:1). A 5 produção de IFN-y é representada como o diferencial entre o nível de produção em resposta ao antigeno considerado menos o IFN-y produzido em resposta tanto a lisozima solúvel como a célula correspondente transfectada com lisozima; os níveis de fundo da produção de IFN-y mediada por lisozima foram para 25+10 pg/ml de antigeno solúvel, para antigeno em 316 ± 43 0 pg/ml de Tl, e para antigeno em 19 + 6 pg/ml de Jurkat; e Figuras 3A e 3B mostram a sobrevivência dos animais após um desafio letal com Influenza A/PR/8/34; os animais foram imunizados subcutaneamente tanto com FLU-v como NRP-v nos dias 1 e 15 e no dia 20 todos foram desafiados intranasalmente com 45 pl do vírus (5x107 pfu por 15 dose) sob anestesia; os animais na figura 3 A foram inoculados intraperitonealmente com 100 pg de soro CD8 anti-camundongo de rato nos dias 19 e 22; os animais na figura 3B foram inoculados intraperitonealmente com um soro de rato irrelevante nos dias 19 e 22; a seta indica a data do desafio intranasal enquanto os diamantes indicam a data que os animais foram z0 inoculados com soro anti-CD8. O polipeptideo descrito acima compreende tipicamente um ou mais (preferivelmente dois ou mais) epítopos. Estes epítopos são preferivelmente epítopos de células T, como epítopos de linfócitos T citotóxicos (CTL). Geralmente, o polipeptideo é imunogênico em uma cepa 25 de vírus de influenza, e preferivelmente em uma pluralidade de cepas de vírus de influenza. No presente contexto, um polipeptideo imunogênico em uma cepa de vírus de influenza se destina a significar um polipeptideo que é parte de uma proteína de vírus de influenza e que elicita uma resposta do sistema imune, como demonstrando reatividade de CTL quando ligado a um MHC.

Um método para determinar se um polipeptídeo possui tal imunogenicidade é descrito no experimento 1 abaixo. No entanto, a presente invenção não está limitada a estes métodos, e o versado na técnica pode selecionar qualquer método conhecido para determinar imunogenicidade, como desejado.

Na presente invenção, o polipeptídeo compreende duas ou mais seqüências como descrito acima. Tipicamente, duas, três, quatro, cinco ou mais destas seqüências podem estar presentes no polipeptídeo, se desejado. Quanto mais os epítopos estão presentes, maior a amplitude de proteção dada dentro de uma população de indivíduos humanos e/ou de animais com HLAs 0 ou MHCs diferindo. O polipeptídeo de acordo com a presente invenção também pode compreender uma ou mais outras seqüências que não são epítopos, se desejado. Tipicamente, as outras seqüências são de uma ou mais proteínas de vírus de influenza. Estas seqüências podem estar situadas entre duas ou mais 15 das seqüências (os epítopos) descritas acima, ou podem estar situadas em uma ou ambas as extremidades do polipeptídeo. A presença destas outras seqüências não deve afetar a função do polipeptídeo, com a condição de que o polipeptídeo como um todo não se tome muito grande, interferindo com a apresentação dos epítopos no sistema imune de vertebrados. Nas formas de 20 realização específicas da invenção, quando o polipeptídeo é homólogo à SEQ ID 1, as outras seqüências são preferivelmente uma ou mais de uma proteína Ml de influenza (preferivelmente de uma cepa de influenza A), quando o polipeptídeo é homólogo à SEQ ID 2, as outras seqüências são preferivelmente uma ou mais de uma proteína Ml de influenza 25 (preferivelmente de uma cepa de influenza B), quando o polipeptídeo é homólogo à SEQ ID 3, as outras seqüências são preferivelmente uma ou mais de uma proteína NP de influenza (preferivelmente de uma cepa de influenza A), quando o polipeptídeo é homólogo à SEQ ID 4, as outras seqüências são preferivelmente uma ou mais de uma proteína NP de influenza (preferivelmente de uma cepa de influenza B), quando o polipeptídeo é homólogo à SEQ ID 5, as outras seqüências são preferivelmente uma ou mais de uma proteína de influenza PB1, e quando o polipeptídeo é homólogo à SEQ 1D 6, as outras seqüências são preferivelmente uma ou mais de uma 5 proteína M2de influenza.

Nas formas de realização mais preferidas, as outras seqüências das proteínas acima mencionadas são as dentro das seguintes seqüências de consenso, ou as tendo pelo menos 60% de homologia com uma seqüência dentre as seguintes seqüências de consenso:

A homologia referida acima com relaçào a estas seqüências é preferivelmente 75%, 85%, 95% ou substancialmente 100%.

Na presente invenção, a cepa de influenza não é especialmente limitada, e os polipeptídeos podem ser imunogênicos contra, e/ou derivados de, qualquer cepa de influenza conhecida. Preferivelmente, entretanto, a cepa relevante é uma cepa de Influenza A ou Influenza B. Cepas de influenza futuras apresentaram mutações de qualquer destas cepas existentes podem também ser algumas contra as quais os polipeptídeos são imunogênicos, ou das quais os 5 polipeptídeos são derivados.

As proteínas dentro das quais as seqüências definindo os polipeptídeos da presente invenção estão situadas são selecionadas dc proteínas de Ml, NP, PB e M2 de qualquer cepa de vírus da influenza (especialmente cepas de A e B) (cujas seqüências de consenso para todas as seqüências analisadas, ou 0 altemativamente cujas posições dentro da proteína, estão descritas acima). As proteínas específicas seguintes foram analisadas pelos inventores, e preferivelmente as proteínas de vírus da influenza que se referem à invenção são selecionadas dentre estas proteínas específicas, ou mutações dessas proteínas. Deste modo, as seqüências específicas homólogas a SEQ ID 1-6 descrita acima 15 são preferivelmente as seqüências nas posições apropriadas dentro das seguintes proteínas. Similarmente, as seqüências da presente invenção definidas pelas posições de resíduo dentro de proteínas de qualquer cepa de influenza, isto é resíduos 36-75 de proteína Ml (especialmente Ml de influenza A), resíduos 124- k 158 de proteína Ml (especialmente em Ml de influenza B), resíduos 255-275 de proteína NP (especialmente em NP de influenza A), resíduos 306-326 de proteína NP (especialmente em NP de influenza B), resíduos 395-428 de proteína PB1, e resíduos 32-55 de proteína M2, são preferivelmente aqueles dentro das proteínas específicas seguintes. A listagem está na forma [número de versão (número de gi)|identificação de banco de dados (por exemplo gb para GenBank)|Número de 25 acesso de NCBl|informação nova opcional (por exemplo o número de acesso da seqüência de nucleotídeo da qual a seqüência de proteína é derivada). As seqüências e cepas de influenza correspondentes das quais elas derivam podem todas ser encontradas do banco de dados público de proteínas NCB1, que pode ser acessado online no seguinte endereço de URLhttpV/wv^’xv.ncbi.nlm.nili.gov/entrez/queπ'/static/Tielp/lielpdoc.html^Protein. O banco de dados de proteína contém dados de seqüência das regiões de codificação traduzidas de Seqüências de DNA em GenBank, EMBL, e DDBJ bem como seqüências de proteínas submetidas Protein Information Resource (PIR), SWISS-PROT, Protein Research Foundation (PRF), e Protein Data Bank (PDB) (seqüências de estruturas resolvidas).

As cepas de influenza preferidas referidas na presente invenção, por exemplo contra as quais os presentes polipeptídeos podem imunogênicos, são as contendo estas proteínas específicas. O números de acesso acima especificam explicitamente a identidade da cepa em adição à 5 seqüência de proteína específica.

Em algumas formas de realização preferidas, o polipeptideo de acordo com a presente invenção pode compreender uma ou mais seqüências como descrito acima e tendo pelo menos 60% de homologia com uma seqüência de consenso com relação a cepas de vírus de influenza humana e 10 aviária conhecidas (ou dois ou mais epítopos de 7 aminoácidos ou mais tendo pelo menos 60% de homologia com tal seqüência). Em outras formas de realização preferidas o polipeptídeo pode compreender uma ou mais seqüências como descrito acima e tendo pelo menos 60% de homologia com uma seqüência de consenso sobre as cepas de vírus da influenza humana conhecidas (ou dois ou mais epítopos de 7 aminoácidos ou mais tendo pelo menos 60% de homologia com tal seqüência).

A homologia percentual de uma primeira seqüência de polipeptídeo para uma segunda seqüência de polipeptídeo, como referido no contexto da presente invenção, é definida como o número de resíduos de aminoácido na segunda seqüência que iguala, em ambas, posição e identidade, para aqueles na primeira seqüência, dividido pelo número total de resíduos de aminoácido no segundo polipeptídeo (tanto o primeiro como o segundo polipeptídeo deve ter o mesmo número de resíduos de aminoácido) e multiplicados por 100. Na presente invenção, prefere-se que a homologia de polipeptídeo para as seqüências definidas seja de 75% ou mais, 85% ou mais, 95% ou mais ou 100% (ou substancialmente 100%). Os epítopos dentro das seqüências definidas acima não são especialmente limitados, desde que eles contenham 7 resíduos de aminoácido ou mais. Preferivelmente os epítopos são de um comprimento que é apropriado para epítopos de CTL em espécies vertebradas particulares, tal como em um humano, tendo um MHC específico. Tipicamente os epítopos contêm 8, 9, 10, ou 11 resíduos de aminoácido, mas podem conter mais se desejado. Geralmente, um epítopo apropriado é um que é um epítopo de CTL em um vertebrado, tal como um humano.

Tipicamente, o polipeptídeo compreende entre 7 e 100 aminoácidos, e preferivelmente de 8-50 aminoácidos. O tamanho não deve ser tão grande que epítopos úteis sofram de competição com epítopos não protetores no sistema imune (por essa razão proteínas completas não estão incluídas), nem o tamanho deve ser tão pequeno que apenas uma faixa muito estreita de proteção seja oferecida. Faixas mais preferidas são de 8-40 aminoácidos, 15-40 aminoácidos e 15-35 aminoácidos. O comprimento mais preferido é de 20-35 resíduos de aminoácido. Prefere-se particularmente que o polipeptídeo consista de (ou substancialmente consista de) uma seqüência selecionada das seqüências nas posições definidas acima na listagem específica de proteínas acima definidas.

Além dos polipeptídeos descritos acima, que não devem ser maiores que 100 resíduos de aminoácido em comprimento, a invenção também provê polipeptídeos imunogênicos de múltiplos epítopos compreendendo dois ou mais polipeptídeos da presente invenção. Estes polipeptídeos de múltiplos epítopos não são limitados em tamanho. Assim, eles se estendem não apenas para os polipeptídeos tendo de 7-100 resíduos de aminoácido como resumido acima, mas também para polipeptídeos extensos, desde que estes polipeptídeos extensos compreendam duas ou mais unidades, cada unidade consistindo de um polipeptídeo da invenção. Deste modo, um polipeptídeo tendo 100 unidades repetindo de um 7 meros, de acordo com a presente invenção, é englobado pela presente invenção, assim como é um polipeptídeo tendo, digamos, 52 unidades de um epítopo de 8 meros, e 23 unidades de um segundo epítopo de 10 meros. Polipeptídeos desse tipo não sofrerão dos problemas de competição associados com polipeptídeos de comprimento similar que compreendem apenas um ou dois epítopos. Para que não restem dúvidas, o polipeptídeo de múltiplos epítopos pode compreender múltiplas cópias do mesmo epítopo, ou cópias simples de uma pluralidade de epítopos diferentes, ou múltiplas cópias de 2 ou mais epítopos. Também a invenção provê uma composição de polipeptídeo compreendendo dois ou mais polipeptídeos diferentes como definido acima. Deste modo, a composição de polipeptídeo pode compreender qualquer número de polipeptídeos da presente invenção juntos na mesma mistura ou formulação. A presença de uma pluralidade de polipeptídeos juntos é útil uma vez que cada pode elicitar sua própria resposta imune, ampliando o efeito protetor da composição. Prefere-se particularmente que a composição contenha todas as seqüências de SEQ ID 1-6 quer cada em um peptídeo separado ou várias em um número menor de peptídeos (por exemplo 3 5 combinados em um peptídeo maior e os outros três 3 em outro peptídeo maior, etc.).

A invenção também provê uma construção de polipeptídeo, cuja construção compreende um polipeptídeo como definido acima e um veículo. A construção pode ser formada combinando dois ou mais epítopos 0 e/ou um polipeptídeo corno definido acima com o veículo. O veiculo pode ser uma molécula, tal como um adjuvante e/ou um excipiente. Combinação, neste contexto, significa quer misturando junto, ou fixando junto (por exemplo através de uma ligação covalente).

A presente invenção ainda provê um polipeptídeo como 15 definido acima para uso em medicina. Também é provida uma composição de vacina ou medicamento contra influenza, compreendendo um polipeptídeo como definido acima, e um ou mais excipientes apropriados e/ou adjuvantes, ou uma construção de polipeptídeo como definido acima e opcionalmente um ou mais excipientes apropriados e/ou adjuvantes (se parte do veículo da construção for, ela mesma, um excipiente ou adjuvante, então um novo excipiente ou adjuvante pode não ser necessário).O excipiente ou adjuvante não é especialmente limitado, e quaisquer excipientes ou adjuvantes usados em medicamentos e vacinas podem ser empregados. A composição de vacina ou medicamento pode ser produzida de acordo com qualquer método conhecido adaptado apropriadamente para a presente invenção, tal como misturando um polipeptídeo da invenção com um excipiente apropriado.

Um método para produzir um polipeptídeo como definido acima é também provido pelo invenção. O método não é especialmente limitado, e tipicamente compreende ligar dois ou mais epítopos para formar o polipeptídeo, O polipeptídeo pode, entretanto, ser sintetizado por síntese química direta (por exemplo incorporação de um aminoácido em um tempo até que o polipeptídeo completo seja formado) ou por métodos recombinantes. Tais métodos gerais são bem conhecidos para o versado e 5 podem ser adaptados para a presente invenção como desejado. Em alguns casos, o polipeptídeo da presente invenção pode compreender seqüências de aminoácido adicionais em um ou ambos términos para ajudar na síntese do polipeptídeo. Estas seqüências adicionais são preferivelmente de 1-5 aminoácidos de comprimento. Tipicamente 3 aminoácidos estão envolvidos. JO Por exemplo, em uma forma de realização preferida, SEQ 1D 6 compreende os aminoácidos AAS imediatamente anterior à parte de IIG da seqüência.

A invenção ainda provê uso de um polipeptídeo ou composição como definido acima, na fabricação de um medicamento ou vacina, efetivo no tratamento ou prevenção de influenza. Também provê-se 15 um método de tratar ou prevenir influenza, método que compreende administrar um polipeptídeo, um composição, um medicamento ou uma vacina como definido acima a um vertebrado. O método de administração não é especialmente limitado, e pode compreender administração subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, ou intranasal, ou pode ser 20 administrado oralmente (por exemplo na forma de uma pílula ou um preparação líquida), ou pode estar na forma de um supositório, se desejado. A forma de tais preparações de administração não é especialmente limitada, e formas conhecidas podem ser empregadas com modificações apropriadas que estarão aparentes para o versado. A dosagem não é especialmente limitada e 25 pode variar de 1 pg a 100 g do polipeptídeo por indivíduo, dependendo do tamanho, peso e espécie do indivíduo envolvido.

A invenção pode ser aplicada a qualquer vertebrado, uma vez que os sistemas imunes de vertebrados operam em uma maneira relacionada. Tipicamente, o vertebrado referido para o presente contexto é um mamífero, pássaro, um réptil ou um peixe. É especialmente preferido que o vertebrado seja um humano, um animal doméstico (tal como um cachorro ou um gato), um animal de criação (tal como um porco ou um cavalo); um animal bovino (tal como gado, ou uma vaca), ou aves (tal como um pássaro doméstico, um 5 pássaro de criação, ou uma ave para prática de jogos). Quando o vertebrado é um pássaro, é preferivelmente uma galinha, um peru, um pato, ou um ganso.

Exemplos de MHCs humanos (HLAs) que podem ser empregados com a presente invenção incluem os seguintes: HLA-A A*010101, A*010102, A*010103, A*0102, A*0103, A*0104N, A*0106, A*0107, A*0108, A*0109, A*0110, A*02010101, A*02010L02L, A*O20102, A*020103, A*020104, A*O2O1O5, A*020106, A*020107, A*020108, A*020109, A*020110, A*020111, A*0202, A*020301, A*020302, A*0204, A*0205, A*020601, A*020602, A*020603, A*0207, A*O2O8, A’0209, A*0210, A*0211, A*0212, A*0213, A*0214, A*0215N, A*0216, A*021701, A*021702, A*02t8, A*02l9, A*02200l, A*022002, A*0221, A*0222, A*0224, A*0225, A*0226, A*0227, A*0228, A*0229, A*0230, A*0231, A*0232N, A*0233, A*0234, A*023501, A*023502. A*0236, A*0237, A*0238, A*0239, A*0240, A*0241, A*0242, A*0243N, A*0244, A*0245, A*0246, A*0247, A*0248, A*0249, A*0250, A*0251, A*0252, A*0253NT, A*0254, A*0255, A*0256, A*0257, A*0258, A*0259, A*0260, A*0261, A*0262, A*0263, A*0264, A*0265, A*0266, A*0267, A*0268, A*0269, A*0270, A*0271, A*0272, A*0273, A*03010101, A*03010102N, A*O3O1O1O3, A*030102, A*030103, A*O3O2, A*O3O3N, A*0304, A*0305, A*0306, A*0307, A*O3O8, A*0309, A*0310, A*0311N, A ♦0312, A*O313, A*0314, A*11010I, A*llQ102, A*1102, A*U03, A*1104, A*1105, A*1106, A* 1107, A*1108, A*ll09, A*I110, A*llll, A*1112, A*ll 13, A*1114, A*1115, A*1116, A*1117, A*1118, A*H19, A*230L A*2302, A*2303, A*2304, A*2305, A*2306, A*2307N, A*2308N, A*2309, A*2310, A*2311N, A*2312, A*24020101, A*24020102L, A*240202, A*240203, A*24O204, A*240205, A*240206, A*24030l, A*240302, A*2404, A*2405, A*2406, A*2407, A*2408, A*2409N, A*2410, A*2411N, A*2413, A*2414, A*2415, A*2417, A*2418, A*2419, A*2420, A*2421, A*2422, A*2423, A*2424, A*2425, A*2426, A*2427, A*2428, A*2429, A*2430, A*2431, A*2432, A*2433, A*2434, A*2435, A*2436N, A*2437, A*2438, A*2439, A*2440N, A*2441, A*2442, A*2443, A*2444, A*2445N, A*2446, A*250101, A*250l02, A*2502, A*2503, A*2504, A*2601. A *2602, A*26O3, A*2604; A*2605, A*2606, A*260701, A*2607O2, A»2608, A*2609, A’2610, A*2611N, A*2612, A*2613, A*2614, A*2615, A*2616, A*2617, A*261S, A*2619, A*2620, A*262l, A*2622, A*2623, A*29010101, A*29C10102N, A*290201, A*290202, A*290203, A*2903, A *2904, A*2905, A*2906, A*29O7, A*2908N, A*2909, A*2910, A*291J, A*300101, A*300102, A*300201, A*300202, A*3003, A’3004, A*3006, A*3OO7, A*3008, A*3009, A*3010, A*3O11, A*3012, A*310102, A*3102, A*3103, A*3104, A*3105, A*3106, A*31O7, A*3108, A*3109, A*3110, A*32O1, A*3202, A*3203, A*3204, A*3205, A*3206, A*3207, A*3208, A*3301, A*330301, A*330302, A»3304, A*3305, A*3306, A*3307, A*340l, A*3402, A*3403, A*3404, A*34O5, A*3406, A+3601, A*3602, A*3603, A*3604, A*43O1, A*6601, A*66O2, A*66Q3, A*6604, A*680101, A*680102, A*680103, A*6802, A*68030l, A*680302, A*68O4} A*6805, A*6806, A*6807, A*6808, A*68O9, A*6810, A*6811N, A*6812, A*6813, A*6814, A*6815, A*6816, A*6817, A*6S18N, A*6819, A*6820, A*6821, A*6822, A*6823, A*6824, A*6825, A*6826, A*6827, A*6901, A*7401, A*7402, A*7403, A*7404, A*7405, A*7406, A*74O7, A*7408, A*7409, A*741O. A*8001. HLA-B B*070201. B*070202, B*070203, B*070204, B*0703, B*0704, B*0705, B*0706, B*0707, B*0708, B*0709, B*0710, B*0711, B*0712, B*O713, B*0714, B*0715, B*0716, B*0717, B*O718, B*0719, B*0720, B*0721, B*0722, B*0723, B*0724, B*0725, B*0726, B*O727, B*O728, B*0729, B*O730, B*O731, B*0732, B*0733, B*0734, 8*0735, B*0736, B*0737, B*O738, B*0801, B*0802, B*0803, B*0804, B*O8O5, B*0806, B*0807, B*0808N, B*0809, B*0810, B*0811, B*0812, B*0813, B*0814, B*0815, B*0816, B*08l7, B*0818, B*0819N, B*0820, B*0821, B*O822, B*130I, BM302, B*1303t B*1304, B*1306, B*l307N, B*1308, B*1309, B*1310, B*1311, B*1312, B*1313, B*1401, B*1402, B*1403, B*1404, B*1405, B*140601, B*140602, 8*15010101, B*15010102N, B*150102, 8*150103, B*150104, B* 150105, B*I502, B*1503, B*1504, B*1505, B*1506, B*1507, B*15O8, B*l509, B*1510, 8*151101, B* 151102, 8*1512, B*I513, B*1514, 8*1515, B*I516, B*15170I01, B*15170102, B*1518, B*I519, B*1520, B*1521, B*1523, B*1524, B*1525, B*1526N, B*1527, 8*1528, B*1529. B*1530, B*1531, B*1532, 8*1533, B*1534, B*1535, 8*1536, B*1537, B*1538, 8*1539, B*1540. B*1542, B*1543, B*1544, B*1545, B*1546, B*1547, B*1548, 8*1549, 8*1550, 8*1551, B*1552, B*1553, B*1554, 8*1555, B*1556, B*1557, B*1558, B*1560, 8*1561, B*1562, B*1563, B*1564, B*1565, B*1566, B*1567, B*1568, B*1569, B*1570, B*1571, B*1572, B*I573, B*1574, B*1575, B*1576, B*1577, B*1578. B*1579N, B*1580, B*1581, B*1582, B*1583, B*I5S4, B*1585, 6*1586, 8*1587, B’1588, B*15S9, 8*1590, B*1591, B*1592, B*1593, B*1594N, B*180101, B*1SO1O2, B*1SO2, B*1SO3, B*18O4, B*1805, B*1806, B*1807, B*1808, B*18O9, 8*1810, B*1811, B*1812, B*1813, B*1814, B*1815, B*1817N, B*1818, 8*1819, B*1820, B*2701, B*2702, B*2703, B*2704, B*270502, B’270503, B*270504, B*270505, B*270506, B*270507, B*2706, B*2707, B*2708. B*2709, B*2710. B*2711, B*2712, B*2713, B*2714, 8*2715, B*2716, B*2717,8*2718, B*2719, B*2720, B*2721, B*2723, B*2724, B*2725, B*2726, B*350101, B*350102, B*3502, B*3503, B*3504, B*3505, B*35O6, B*3507, B*3508, B*350901, B*350902, B*35L0, B*3511, B*3512, B*3513, B*35140l, B*351402, B*3515, B*3516, B*3517, 8*3518, B*3519, B*3520, B*3521, B*3522, B*3523, B*3524, B*3525, 8*3526, B*3527, B*3528, B*3529, B*3530, B*3531, B*3532, B*3533, B*3534, B*3535, B*3536s 8*3537, B*3538, 8*3539, B*3540N, 8*3541, B*3542, B*3543, B*3544, B*3545, B*3546, B*3547, B*3548, B*3549, B*355O, B*3551, B*3552, B*3553N, B*3701, B*3702, B*3703N, B*3704, B*3705, B*3706, B*3707, B*38O1, B*380201, B*380202, 8*3803, B*3804, B*3805, B*3806, B*3S07, B*3808, 8*3809, B*3810, B*390101, B*390103, B*390L04, B*390201, B*390202, B*3903, B*3904, B*3905, B*390601, B*390602, B*3907, 8*3908, B*3909, B*3910, B*391l, B*3912, 8*3913, B*3914, B*3915, B*3916, B*3917, B*3918, B*3919, B*3920, B*3922, B*3923, B*3924, B*3925N, B*3926, B*3927, B*3928, B*3929, 8*3930, B*393l, 8*3932, B*400101, B*400102, B*400103, B*400104, B*400105, B*400201, B*400202, B*4003, B*4004, B*4005, B*40060101. B*40060102, B*4007, B*4008, B*4009, B*4010, B*4011, B*4012, B*4013, B*401401, B*401402, B*401403, B*4015, B*4016, B”4018, B*4019, B*4020, B*4O21, B*4022N, B*4023, B*4024, B*4025, B*4026, B*4027, B*4028, 8*4029, B*4030, B*403l, 8*4032, 8*4033, B*4034, B*4035, B*4036, B*4037, B*4038, B*4039, B*4040, B*4042, B*4043, B*4044, B*4045, B*4046, B*4047, B*4048, B*4049, B*4050, B*4051, B*4O52, B*4053, 8*4054, 8*4055, B*4056, B*4057, B*4101, B*4102, B*4103, B*4I04, B*4105, B*4106, 8*4201, 8*4202, B*4204, B*420501, B*420502, B*42O6, B*44020101, B*44020102S, B*440202, B*440203, 8*440301, B*440302, B*4404, B*4405, B*4406, B*4407, B*4408, B*44O9, B*4410, B*4411, B*4412, B*4413, B*4414, B*4415, B*4416, B*4417, B*4418, B*4419N, B*4420,13*4421, B*4422, B*4423N, 3*4424, B’4425, B*4426, B*4427, B*4428, B*4429, B*4430, B*4431, B*4432, B*4433, B*4434, B*4435, B*4436, B*4437, B*4438, B*4439, B*4440, B*4501, B*4502, B*4503, B*4504, B*4505, B*4506, B*4507, B*4601, B*4602, B*4603, B*4604, B*47OIO1O1, R*470l0102, B*4702, B*4703, B*4704, B*4705, B*4801, B*4802, B*4803, B*4804, B*4805, 3*4806, B*4S07, B*4808, B*4809, B*48l0, B*4901, B*4902, B*4903, B*5001, B*5002, B*5004, B*510101, B*51O1O2, B*510103, B*510104, B*51U105, B*510201, B*510202, B*5103, B*5104, B*51O5, B*5106, B*5I07, B*5108, B*5109, B*5110, B*5111N, B*5112, B*51130I, B*511302, B*5114, B*5115, B*5116, B*5117, B*5118, B*5119, B“512O, B*5121, B*5122, B*5123, B*5124, B*5126, B*5127N, B*5128, B*5129, B*5130, 3*5131, B*5L32, B*5133, B*5134, B*5135, 3*5136, B*520101, B*520102, B*520103, B*520104, B*5202, B*5203, B*5204, B*5205, B*5206, B’530101, B*530102, B*5302, B*5303, B*5304, B*5305, B*5306, B*5307, B*5308, B*53O9, B*5401, B*5402, B*55O1, B*5502, B*5503, B*5504, B*5505, B*5507, B*5508, B*5509, B*551O, B*5511, B*5512, B*5513, B*5514, B*55I5, B*5516, B*5601, B*5602, B*5603, B*5604, B*560501, B*560502, B*5606, B*5607, B*5608, B*56O9, B*561O, B*5611, B*5612, B*5613, B*5614, B»570101, B*570102, B*5702, B*570301, B*570302, B*5704, B*5705, B*S706, B*57O7, B*5708, B*5709, B*5801, B*5802, B*5804, B*5805. B*5806, B*58O7, 3*5808, B*5809, B*5810N, B*590l, B*670101, B*670102, B*6702, B*7301, B*7801, B*780201, B*780202, B*7803, B*7804, B*7805, B*8101, B*8102, B*820I, B*82O2> B*8301. HLA-C Cw*0I0201, Cw*010202, Cw*0103, Cw*0104, Cw*0105, Cw*0106, Cw*0107, Cw*0108, Cw*0109, C\v*0I10, Cw*020201, Cw*020202» Cw*020203, Cw*020204, Cw*020205, Cw*O2O3, Cw’0204, Cw*0205, Cw*0206, Cw*0207, Cw*0208, Cw*0209, Cw*030201, Cw*030202, Cw*030301, Cw*030302, Cw*030303, Cw*030304, Cw*030401, Cw*030402, Cw*030403, Cw*O3O5, C\v*0306, Cw*O3O7, Cw*O3Q8, Cw*0309, Cw*0310, Cw*0311, Cw*0312, Cw*0313, Cw*0314, Cw*0315, Cw*0316, 0*0317, 0*0318, 0*04010101, Cw*04010102, Cw*040102, 0*0403, 0*040401, 0*040402, 0*0405, Cw*0406, 0*0407, Cw*0408, Cw*0409N, 0*0410, 0*0411, 0*0412, Cw*0413, Cw*0414, 0*0415, 0*050101, 0*050102, 0*0502, 0*0503, Cw*0504, 0*0505, 0*0506, 0*0507N, 0<*0508, 0*0509, 0*0510, 0*0602, 0*0603, 0*0604, 0*0605, 0*0606, 0*0607, Cw*Q6QS, 0*0609, 0*0610, 0*0611, 0*070101. 0*070102, 0*070103, 0*07020101, 0*07020102, 0*07020103, 0*0703, 0*070401, 0*070402, Cw*0705, 0*0706, 0*0707, 0*0708, 0*0709, 0*0710, 0*0711, 0*0712, 0*0713, 0*0714, 0*0715, 0*0716, Cw*0717, 0*0718, 0*0719, 0*0720, 0*0721, 0*0722, Cw*0723, 0*0724, 0*0725, 0*0726, O’*0727, 0*0728, 0*0729, 0*080101, 0*080102, 0*0802, 0*0803, 0*0804, 0*0805, 0*0806, Cw*0807. Cw*0808, 0*0809, 0*0810, 0*0811, 0*0812, 0*120201, 0*120202, 0*120203, 0*120301, 0*120302,0*120303, 0*120401, 0*120402, Cw*12O5, Cw*1206, Cw*12O7, 0*1208, 0*1209, 0*1210, 0*1211, 0*1212, 0*1213, 0*1214, 0*1215, 0*140201, 0*140202, Cw*140203, 0*1403, 0*1404, Cw*1405, 0*150201, 0*150202, 0*1503, 0*1504, 0*150501, 0*150502, 0*150503, 0*150504, 0*1506, 0*1507, 0*1508, 0*1509, 0*1510, 0*1511, 0*1512, 0*1601, 0*1602, 0*160401, 0*1606, 0*1701, 0*1702, 0*1703,0*1801, 0*1802. HLA-E E*0101, E*010301, E*010302, E*010303, E*0104. HLA-F F*010101, F*010102. HLA-G G*010101, G*010102, G*010103, G*010104, G*010105, G*010106, G*010107, G*010108, G*0I02, G*0103, G*01040J, G*010402, G*010403, G*0105N, G*0106. HLA-DRA DRA*0101, DRA*010201, DRA*010202. HLA-DRB1 DRBl*010101, DRB1*010102, DRB1*O1O1O3, DRB1*010201, DRBl*010202, DRB1*010203, DRBl*010204, DRBl*0103, DRB1*0104, DRBl*0105. DRBl*0106, DRB1*O1O7, DRB 1*0108, DRB1*O1O9,- DRB1*OL1O, DRBI*OL11, DRB1*030101, DRB1*030102-DRB1*030201, DRB1*030202, DRBl*0303, DRB1*O3O4, DRBl*030501, DRBl*030502r DRBl*0306, DRJ3l*0307, DRJ3l*0308, DRBl*0309, DRB1*O31O, DRBl*0311, DRBÍ*0312, DRB1*O313, 'DRB1*O314, DRB1*O315, DRBP0316, DRB1*O317, DRB 1*0318, DRB1*O319, DRBl*0320, DRB1*O321, DRB1*O322, DRB1*O323, DRBl’0324, DRB1*O325, DRB1*O326, DRB1*O327, DRB1*O328, DRBP040101, DRB1*040102V DRB1*0402, DRB1*040301, DRBl*040302, DRBl*0404, DRBl*0405.01, DRBl*040502j DRB1*040503, DRBl’040504, DRBl*0406, DRBl*040701; DRB1*040702, DRB 1*040703, DRB1*0408, DRBl*0409, DRBl*0410, DRB 1*0411, ■DRB1*O412, DRB] *0413’, DRBl’0414, DRB1*O415, DRBPO416, DRBl*0417, .DRBPO418, . DRB1*O419,' DRB.l*0420, DRB 1*0421, DRB1*O422, DRBl*0423, ’ DRB 1*0424, DRBP0425, DRBP0426, DRB 1*0427, DRB 1*0428, DRB1*O429, DRB 1*0430, DRB 1*0431, DRB I *0432, DRB 1*0433, DRB 1*0434, DRBl*O435, DRBl*043ó, DRB1*O437,- DRBP0438, DRB 1*0439, DRB 1*0440, DRBl*0441, DRB 1*0442, DRB1*O443, DRB 1*0444, DRB1*O445, DRBl*0446, DRS1+O447. DRB1*O448, DRB1*O449, DRBl*0450, DRBi*07010i, DRBl*070l02, DRB1*O7()3, DRBl*07G4, DRBl*0705, DRBl*0706, DRBl*0707, DRBl*0708, DRB1*080101, DRBl*080102, DRBl*080201, DRB1*080202, DRBl*080203, DRB1*080302, DRBl*080401, DRB1*080402, DRB1*080403, DRBl*080404, DRB1*0805, DRB1*0806, DRBl*0807, DRBl*0808, DRB1*O8O9, DRBl*0810, DRBl*0811, DRB1*O812, DRBl*0813, DRBl*0814, DRB1*O815, DRB1*O816, DRB1*O817, DRB1*O818, DRB1*O819, DRB1*0820, DRB1*O821, DRB1*O822, DRB1*O823, DRB1*O824, DRB1*O825, DRBl*0826, DRB1*O827, DRBl*0828, DRB1*OS29, DRB]*090102, DRB1*090103, DRBl*0902, DRBl*0903, DRBl*100101, DRBl*100102, DRB1*11010I, DRBl*110102, DRB1*110103, DRB1*110104, DRBl*110105j DRB1*11O2, DRBP1103, DRBP110401, DRB1*HO4O2, DRBl*1105, DRBl*I10601, DRB1*I 10602, DRBl*1107, DRBP1W80I, DRB 1*110802, DRB1*11O9, DRBl*1110, DRBI’llll, DRBl*111201, DRB1*1112O2, DRBP1113, DRB1*11I4, DRB1*H15, DRB1*1116, DRB1+1117, DRB1*1118, DRB1*1119, DRB1*I12O, DRB1*1121, DRB1*1122, DRB1*1123, DRB1*1124, DRB1*1125, DRB1*1126, DRBl*11270i; DRB1*1127O2, DRB1*1128, DRB1*1129, DRB1*113O, DRBPI131, DRB1*1132, DRB1*1133, ’ DRB1*1134, DRB1*1135, DRB1*1136, DRB1+1137, DRB 1*1'13 8, DRB 1*1139, DRB1*114O, DRB1*1141, DRB1*1142, DRBl* 1143, DRB 1*1144, DRB1*1145, DRB 1*1146, DRB1*1147, DRBl* 1148, DRBP1149, DRB I *1150, DRBl* 1151, DRB!*1152, DRB1*1153, DRB1*1154, DRBl*120101, DRBl‘120102, DRB 1*120201, DRBl*120202, DRB 1*120302, DRB1*12O4, DRBD1205, DRβl‘1206, DRBl *1207, DRBl*1208, DRB1*12O9, DRB1*121O, DRB 1*130101, DRB1*13O1O2, DRBP13O1O3, DRB1*13O2O1, DRBl*130202, DRB1*130301, DRB1*13O3O2, DRBl-* 1304, DRB1*13O5, DRBl*1306, DRB1*13O7O1, DRBl* 130702, DRB1*13O8, DRB1*13O9, DRBl*1310, DRBP1311, DRBI*1312, DRBI*1313, DRBl‘131401, DRB1*1314O2, DRB1*1315, DRB1*1316, DRBP1317, . DRB1*1318, DRB1*1319, DRB1*132O, DRB 1*1321, DRB1*1322, DRB] *1323, DRB 1*1324, DRB1*1325, DRB1*1326, DRB1*1327, DRB1*1328, DRB1*1329, DRB 1*1330, DRB1*1331, DRB1*1332, DRB 1*1333, DRBP1334, DRB 1*1335, DRB1*1336, DRB1*1337, DRB1*1338, DRB1*1339, DRB 1*1340, DRBl*1341_. DRB1*1342, DRB1*1343, DRB 1*1344, DRB1*1345, DRBP1346, DRBl*1347, DRB1*1348, DRB I *1349, DRB 1*1350, DRBl*135l, DRB1*1352, DRB1*1353, DRB1*1354, DRB 1*1355, DRB1*1356, DRB I *1357, DRB1*1358, DRB1*1359, DRB1*136O, DRB1*1361, DRB1*1362, DRB1*1363, DRB1*1364, DRB1*1365, DRBP140101, DRBl*140102, DRB1*14O2, DRBl*14030l, DRBl *140302, DRBl *1404, DRB1*I40501, DRBP140502, DRB1*14O6, DRBl’140701, DRBl*140702, DRB1*14O8, DRBl*1409, DRB1*141O, DRB1/1411, DRBP1412, DRB1*1413, DRB1* 1414, DRB1*1415, DRB1*1416, DRB 1*1417, DRBPU18, DRBl’1419, DRBl* 1420, DRB1*1421, DRBP1422, DRB1*1423, DRB 1*1424, DRB1*I425, DRB1* 1426, DRBl *1427, DRB 1*1428, DRB I *1429, DRBPI430, DRB I *1431, DRBl* 1432, DRB1*1433, DRB 1*1434, DRB 1*1435, DRB1*1436, DRB1*1437, DRBl* 1438, DRBl *1439, DRB 1*1440, DRB1*1441, DRB 1*1442, DRB1*1443, DRBl* 1444, DRB1*1445, DRB1*1446, DRB1*1447, DRB1*1448, DRB1*15O1O1, DRBl*150102, DRBl*150103, DRBl*150104, DRB1*15OIO5, DRB1*15O2O1, DRB1*150202, DRBl*150203, DRB1M503, DRB1*15O4, DRB1*I5O5, DRB1*15O6, DRBl*1507, DRB1*15O8, DRB1*15O9, DRB1*I5IO, DRB1*1511, DRBI*1512, DRJBP1513, DRB1*1514, DRB1*1515, DRB1*I516, DRBl*160101, DRB1* 160102, DRB1 *160201, DRB 1*160202, DRB1 * 1603, DRB 1*1604, DRB 1 * 160501, DRB 1 * 160502, DRB I * 1607, DRB 1*1608. HLA-DRB2-9 DRB2*010l-, DRB3*01010l, DRB3*01010201, DRB3*01010202, DRB3*010103, DRB3*010Í04, DRB3*0102, DRB3*0103, DRB3*0104, DRB3*0105, DRB3*0106, DRB3*O1O7, DRB3*0108, DRB3*0109,. DRB3*0110, DRB3*0111, DRB3*0201, DRB3*020201, DRB3*O2O2O2, DRB3*020203, DRB3*020204, DRB3*0203, DRB3*0204, DRB3*O2Ü5, DRB3*0206, DRB3*0207, DRB3*0208, DRB3*0209, DRB3*0210, DRB3*0211, DRB3*O212, DRB3*0213, DRB3*0214, DRB3*Q215, DRB3*0216, DRB3*0217, DRB3*0218, DRB3*0219, DRB3*030101, DRB3*030102, DRB3*0302, DRB3*0303, DRB4*01010101, DRB4*0102, DRB4*01030101, DRB4*01030102N, DRB4*010302, DRB4*010303, DRB4*010304, DRB4*0104, DRB4*0105, DRB4*0106, DRB4*0107, DRB4*0201N. DRB4*0301N, DRB5*010101, DRB5*010102, DRB5*0102, DRB5*0103, DRB5*0104, DRB5*01O5, DRB5*010ó, DRB5*O1O7, DRB5*O1O8N, DRB5*O1O9, DRB5*0ll0N, DRB5*0111, DRB5*0U2. DRB5*O113, DRB5*0202, DRB5*0203, DRB5*O2O4, DRB5*0205, DRB6*0101, DRB6*0201, DRB6*0202, DRB7*010101, DRB7*010102, DRB8«0101, DRB9*0101. HLA-DQA1 DQAP010101, DQA1*010102, DQAlfe010201, DQA1*010202, DQA1*O1O3, DQA1*010401, DQAl’010402, DQAl*0105, DQA1*0106, DQA1*O1O7, DQAl*0201, DQA1*030101, DQAl*0302, DQAV0303, DQA1*O4O1O1, DQAl*040102. DQA1*0402, DQAI*0403N, DQAl*0404, DQAP050101, DQAP050102, DQAl*0502, DQAl*0503, DQAP0504, DQA1 *0505, DQA1 *060101, DQAl*060102, DQA1*0602. HLA-DQB1 DQBI*020101, DQBP020L02, DQB1*O2O2, DQBl*0203s DQBP030101, DQB1*030102, DQBl*0S0201, DQBP030202, DQBl*030302, DQB1 *030303, DQBl*0304, DQB1 *030501, DQB1*030502, DQB1 *030503, DQB1*O3O6, DQBJ*0307, DQB1*O3O8, DQB1*0309, DQBl*03I0, DQBP0311, DQBP0312, DQBl*0313, DQB1*0401, DQBl*0402, DQB1*050101, DQBI*050102, DQB1*05020I, DQBI*050202, DQBl*050301, DQB1*050302, DQB1*0504, DQBl*060101, DQBl*060102, DQBl*060103, DQBl*0602, DQBl*0603, DQB1 *060401, DQB1*060402, DQB1*06050I, DQBI*060502, DQBl*0606, DQBP0607, DQBP0608, DQB1*0609, DQBl*0610, DQB1*O6HO1, DQBl*061102, DQBP06I2, DQB1*O613, DQB1*O614, DQB1*O615, DQB1*O616, DQB1*O617, DQB1*O618, DQBI*O619, DQBi*0620, DQB1*O621, DQB1 *0622, DQI31*0623. HLA-DPA1 DPAI *010301, DPAl*010302, DPAP010303, DPAl*0104, DPAl*0105, DPA1*0106, DPAl’0107, DPAP0108, DPA1*020101, DPAl*020102, DPA1*020103, DPAl*020104, DPAI *020105, DPA1’020I06, DPA1 *020201, DPAI *020202, DPAI *020203, DPAI *0203, DPAI *0301, DPA1*O3O2, DPA1*O3O3, DPA1*O4O1. ELLA-DPB1 DPBl*010101, DPBl*010102, DPB1*010103, DPBP0102, DPBl*020102, DPB1*020103, DPB1*020104, DPBl*020105, DPBl*020106, DPB1*0202, DPBl*0203, DPBl*030101, DPB1 *030102, DPBl*0302, DPBt*040101, DPBl*040102, DPBl*0402, DPB1*0501, DPB 1*0601, DPBl*0801, DPBl*0901, DPB1*1001, DPBl*110101, DPB1*110102, DPB1*13O1, DPB1*14O1, DPBP1501, DPBD1601, DPB1*17O1, DPBl*180l, DPB1*19O1, DPB1*200101 , DPBD200102, DPBl*210l, DPB 1*2201, DPB 1*2301, DPBl*2401, DPB 1*2501, DPBl*260101, DPB 1*260102, DPB 1*2701, DPB1*28O1, DPBl*2901, DPB I *3001, DPBl*3101, DPB 1*3201, DPB1*33O1, DPB1*3401, DPB1*35O1, DPBl*3601, DPB 1*3701, DPB1*38O1, DPB1*39O1, DPB 1*4001, DPB 1*4101, DPB I *4401, DPB I *4501, DPB 1*4601, DPB 1*4701, DPBl*4801, DPB1*49O1, DPBP5001, DPBl*5101, DPB 1*5201, DPB1*53O1, DPB1*54O1, DPB1*55O1, DPB 1*5601, DPB 1*5701, DPBl*5801, DPB I *5901, DPBl*6001, DPB1*61O1N, , DPBl*6201. , DPBl»6301, DPBP6401N, DPB1*65O1, DPBl*6601, DPB 1*6701, DPB1*68O1, DPBP6901, DPB 1*7001, DPBl*710l, DPB1*72O1, DPB1*73O1, DPB1*74O1, DPBP7501, DPB1*76O1, DPB1*77O1, DPBl*7801, DPB I *7901, DPBl*8001, DPBl*8101, DPB 1 *8201, DPBl*830l, DPB1*S4O1, DPB 1*8501, DPB 1*8601, DPB1*87O1, DPB 1*8801, DPB1*89O1, DPB1*9001, DPB1*91OJ, DPB 1*9201, DPB 1*9301, DPB 1*9401, DPB 1*9501, DPB 1*9601, DPB1 *9701, DPBl*9S01, DPB 1*9901. HLA-DMA DMA*OIO1, DMA*0102, DMA*0l03, DMA*0104.- HLA-DMB DMB*0101,DMB*0102, DMB*0103, DMB*0104, DMB*0I05, DMB*0106. HLA-DOA DOA*010101, DOA*01010201, DOA*0l010202, DW01010203, DOA*010103, DOA*01D1040L DOA*D1010402, DOA*010105. HLA-DOB DOB*01010101, DOB*OW10102, DOB*0KH02, DOB*010201, DOB*010202, DOB*0103, DOB*01040101, DOB*01040102. MHC Class I H-2Db, H-2Dd, H-2Dk, H-2Dq, H-2Kb, H-2Kd, H-2Kk, H-2Ld, H-2M3, H-2Ad, H-2Ag7, H-2Ak, H2-Ab, H-2Ed, H-2Ek, H2Bxk, H-2F, H-2I.H-2P, H-2R, H-2S, H-2Sxd, H-2T4, H- 2U. MHC Class II I-Ab, I-Ad, 1-Ag7,L-Ak, I-Ap, LAq, I-Ar, I-As, I-Au, I-Av, I-Ea, I-Eb, I-Ed, l-Ek, I-Es, I-Bu, H-2Q, H-2Qa-2,H-2Qa-2a, Qa-la, Qa-lb. A invenção não é limitada para tais moléculas de MHC e HLA, e pode ser adaptada para tais moléculas recém descobertas, se desejado, simplesmente estabelecendo a reatividade de substâncias tal como peptídeos com as moléculas. Isso pode ser prontamente realizado usando técnicas 5 conhecidas que são o padrão no campo. Os alelos de FILA particularmente preferidos para uso com a presente invenção incluem os seguintes: HLAClasseI HLA A IJLAB HLACw A*6802 B*5S0I Cw*1701 A*6801 B*5701 Cw*1601 A*6601 B*5501 Cw*15O2 A*3303 B*5201 Cw*1402 A*3301 B*5101 Cw*1203 A*3201 B*5001 Cw*0802 A*310102 B*4901 Cw*0801 A*3002 B*4501 Cw*0704 A*3001 B*4403 Cw*0703 A*2902 B*4402 Cw*0702 A*2608 B*4101 Cw*0701 A*2601 B*4002 Cw*0602 A*2501 B*4001 Cw*0501 A*2402 B*390l Cw*040l A*2301 B*3801 Cw*0304 A*1101 B*3701 Cw*0303 A*0302 B*3503 Cw*0202 A*0301 B*3501 Cw*0102 A*0205 B*2705 A*0201 B*1801 A’0101 B*1501 B*1402 B*1401 B*1302 B*0S01 B*0705 B*0702 HL A Classe fl HLA DPB HLA DQA HLA DOB DPB1*17O1 DPBl*1301 DPBP1001 DPB 1*0601 DPB 1*0501 DPB 1*0402 DPB1*O4O1 DPB 1*0301 DPB I *0201 DPB1*O1O1 DQA 1*0505 DQA 1*0501 DQAP04O1 DQA 1*0303 DQAP0302 DQA 1*0301 DQAl*0201 DQAP0104 DQA1*O1O3 DQA 1*0102 DQAP01O1 DQB 1*0604 DQB1*0603 DQB1*0602 DQB 1*0503 DQB 1*0502 DQB1*O5O1 DQB 1*0402 DQB 1*0303 DQB 1*0302 DQB 1*0301 DQB 1*0202 DQB 1*0201 HLA DRB DRB1*16O1 DRBl*1501 DRB 1*1401 DRB1*13O2 DRB1*13O1 DRBIH201 DRB1*11O4 DRB1H101 DRB 1*0801 DRB 1*0701 DRBl*0404 DRB 1*0401 DRB 1*0301 DRBl*0103 DRBl*0102 DRBl*0101 Os alelos mais preferidos de acordo com a invenção são os seguintes: HLA-A*0201, HL A-A*0205, HLA-A*0301, HLA-A*1101, HLA-A*24O2, HLA-A*3401, HLA-B*0702, HLA-B*0801, HLA-B*130], HLA-B*27, I-ILA-B*4002, HLA-B*51O1, HLA-Cw*03, HLA-cW*07 HLA-DRB 1*0301, HLA-DRB1*O4O1, HLA-DRB1*0701, HLADRB1 *1501, HLA- DRB1*1104, HLA-DRBl*H01, HLA-DRB4*010l HLA-DQAl*01, HLA-DQA1*O2, HLA-DQAl*05 HLA-DQB1 *03, HLA-DQB1 *04, HLA-DQB 1 *05, HLA-DQB1 *06 HLA-DPA1*O1, HLA-DPA1*O2 HLA-DPB1*O2, HLA-DPBP04 A invenção será agora descrita a título de exemplo apenas, com referência às seguintes formas de realização específicas.

EXEMPLOS EXPERIMENTO 1 - Reatividade de polipeptídeos contra antígenos de influenza

O propósito do estudo foi demonstrar a reatividade dos polipeptídeos de influenza acima descritos e sua capacidade para induzir uma resposta de citoquina de tipo Thl contra proteínas de influenza naturalmente processadas e apresentadas no contexto de HLA humano (HLA A*0201).

Como base de fundo para os experimentos, é útil entender que respostas de Thl e Th2 são definidas pelo padrão de citoquinas produzidas pelas células auxiliares T envolvidas nas mesmas. Isto, entretanto, não significa que os linfócitos restantes (células T e B) envolvidos naquelas respostas específicas não produzem também citoquinas que ajudam a dirigir o padrão característico de resposta em que eles estão envolvidos. Desta forma, uma resposta de tipo Thl é caracterizada pela produção de IFN-y e 1L-2, conduzindo a estimulação de uma resposta CTL. de CD8+ e uma resposta de anticorpo de IgG2a associada (em camundongos). A resposta de TFN-y pode ser produzida tanto pelas células auxiliares 1 de T CD4+ bem como pelas células T CD8+ que também formam parte disso. Nesse caso o componente de IFN-y da resposta produzida pelas células T CD8+ foi investigado. Isto é porque o experimento estava investigando primariamente epítopos de células T CD8+ sendo assim desejável provar que a resposta vista foi causada por estas células. Uma vez que células T CD8+ reagem a epítopos apenas nas moléculas de classe I de MHC, células humanas que compartilham com o camundongo transgênico apenas uma molécula de classe I de MHC (isto é HLA-A*0201) foram usadas. Uma resposta de tipo Th2 é caracterizada pela produção de TL-4 e IL-10, conduzindo à estimulação de uma resposta de anticorpo de IgGE, IgGl e (em camundongos) IgG2b. Ambas as respostas são antagonist!cas com IFN-y e IL-10 regulando de modo negativo a produção de cada uma.

Todos os experimentos descritos abaixo foram realizados em duplicata.

Materiais e métodos Peptídeos e proteínas recombinantes

Todos os polipeptídeos usados neste estudo (isto é Pl: Aminoácido de MIA (aa) 36 a 75 (SEQ ID 1); P2: M1B aa 124 a 158 (SEQ ID 2); P3: NPA aa 255 a 275 (SEQ ID 3); P4: NPB aa 306 a 326 (SEQ ID 4); P5: PB1 aa 395 a 428 (SEQ ID 5); P6: M2 aa 32 a 55 (SEQ 1D 6) e NRP: polipeptídeo não relevante de controle) foram sintetizados por química Fmoc e recolocados novamente em suspensão em 10% DMSO em PBS.

Linhagens celulares e vírus

As linhagens celulares de Tl e JURKAT são linhagens de linfoblastóides humanos derivados de indivíduos contendo e não contendo HLA-A*0201 respectivamente. Tl foi mantida em meio de cultura de IMDM (Invitrogen) enquanto JURKAT foi mantida em Meio de cultura RPMI-1640 (Sigma) contendo 10 mM de HEPES e 1 mM de piruvato de sódio. Ambos meios de cultura foram suplementados com 50 IU/50 mg/ml de penicilina/estreptomicina (Sigma) e, como meio de cultura completo, 10 % FCS. Culturas celulares foram mantidas a 37 °C em uma atmosfera umedecida de 5 % de CO2.

Esplenócitos primários foram mantidos em meio de cultura IMDM (Invitrogen) suplementados com 0,02 niM de β mercaptoetanol (Sigma), 50 IU/50 mg/ml de penicilina/estreptomicina (Sigma) e 10 % FCS (Sigma) a 37°C em uma atmosfera umedecida de 5 % de CO2.

Cepas de influenza A New_Caledonia/20/99, NYMC/X-147 e cepa de influenza B Johannesburg/5/99 foram obtidas de NIBSC como lotes liofilizados e usadas para a infecção de linhagens celulares humanas singenéicas (TI) e alogenêicas (JURKAT).

Preparação de células alvo para análise de citoquina

Culturas celulares em fase exponencial foram colhidas por centrifugação (250 g, 5 min) e recolocadas novamente em suspensão a uma densidade de 10° células/ml em meio de cultura livre de soro. Alíquotas das suspensões celulares foram transfectadas com uma faixa de antígenos de polipeptídeo em uma concentração de 5 pg por 106 células usando Lipofectina (Invitrogen) de acordo com instruções dos fabricantes e incubadas em meio de cultura completo por 8-10 horas antes de tratamento de Mitomicina C (MMC). Altemativamente, alíquotas das suspensões celulares foram infectadas com uma faixa de vírus da influenza vivo (MOÍ de 5-10) por uma hora, lavadas duas vezes em meio de cultura livre de soro e incubadas em meio de cultura completo por 24 horas antes de tratamento de MMC.

Para tratamento de MMC, células foram colhidas por centrifugação (250 g, 5 min) e recolocadas novamente em suspensão em meio de cultura de IMDM livre de soro contendo 50 pg/ml de Mitomicina C (Sigma). Após incubação de 45 min a 37°C, as suspensões celulares foram lavadas quatro vezes em meio de cultura de IMDM livre de soro (250 g, 5 min) e finalmente colocadas novamente em suspensão em meio de cultura de IMDM completo. Imunizações Camundongos C57BL/6-Tg(HLA-A2.1)lEnge/J de sete a dez semanas de idade (HLA-A*0201 transgênicos em um fundo de C57/BL6, Jackson Labs) foram imunizados subcutaneamente com uma dose de 200 gl da preparação de antígeno por camundongo. No grupo de teste, cada dose da preparação de antígeno continha 60 nmol de uma mistura equimolar de todos seis peptídeos (10 nmol cada) preparados em 1FA (Sigma) de acordo com as instruções do fabricante (preparação de FLU-v). No grupo de controle, cada dose da preparação de antígeno continha uma dose equivalente do polipeptídeo não relevante preparados em IF A (Sigma) de acordo com as instruções do fabricante (preparação de NRP). No dia 14 após imunização, todos animais receberam uma imunização de reforço usando as mesmas doses e via de entrega como usado originalmente. Finalmente, no dia 21 ou 22, todos animais foram separados e seus baços coletados.

O protocolo de imunização pode ser representado esquematicamente como a seguir: Esquema 1 – Inoculação

FLU-v= combinação de Pl P2 P3 P4 P5 e P6 Imunizar camundongo com FLU-v Coletar os esplenócitos após 21 ou 22 dias - qualquer reação imune terá causado amplificação nas células T do camundongo reativas para epítopos apresentados corretamente dentro de Pl - P6, que irão se tomar ativados e/ou proliferar. Se peptídeos estão corretamente apresentados por ambos, MHC de camundongo e HLA de humano, células T reativas para epítopos apresentados em cada destes contextos podem estar presentes (células apresentando antígeno, APCs, nos camundongos transgênicos irão expressar tanto MHC de camundongo como HLA de humano). Os esplenócitos coletados podem compreender quantidades significantes de células T ativadas'proliferadas, junto com quantidades menores de outras células, tais como células apresentando antígeno (APCs) Obter esplenócitos contendo: 1 células T de camundongo 2 células apresentando antígeno de camundongo (a) células T HLA em quantidades amplificadas, reativas a APC(HLA>P1 (ou APC(HLA)-P2 etc.) (b) células T de MHC, não reativas a APC(HLA)-P1 (ou APC(HLA>P2 etc.) (a) APC(HLA)- (b) APC(MHC)-

Análise estatística

Diferenças estatisticamente significantes na resposta de IFN-y para diferentes antígenos entre animais vacinados com FLU-v e NRP foram estabelecidas através de análise de Mann-Whitney não paramétrica das amostras. Diferenças foram consideradas estatisticamente significantes se o valor de p estava abaixo de 0,05.

ELISA de citoquinas

Baços de camundongo pertencendo ao mesmo grupo experimental foram agrupadas, suavemente pressionadas através de coadores de células e células vermelhas de sangue removidas por tratamento com tampão de lise de células vermelhas (nove partes 0,16M de NH4C1 e uma parte de 0,17M de Tris, pFI 7,2). Suspensões de esplenócito de cada grupo experimental foram laminadas em placas de 24 cavidades em uma densidade de 4 x 106 células/cavidade contendo uma faixa de antígenos de polipeptideo (5 pg/ml) ou, altemativamente, Linhagens celulares tratadas com MMC (relação de esplenócitos para células (S:C) 10:1) ou transfectadas com antígenos de polipeptideo ou infectadas com diferente vírus da influenza vivo como descrito acima.

Após incubação de 4 dias a 37 °C, o sobrenadante foi coletado e analisado para IFN-y e IL-4 por um ELISA de citoquina sanduíche de acordo com o protocolo do fabricante (Pharmingen). Os limites de detecção mais baixos para o teste foram 9,77 pg/ml para IL-4 e 39,06 pg/ml para JJFN- Y-

Resultados

Cada peptídeo de polipeptideo de indivíduo descrito neste pedido de patente (incluindo Pl, P2, P3, P4, P5 e P6 testados neste exemplo) tem sido definido como contendo epítopos de célula T reativos em moléculas múltiplas de HLA humano, entre eles FILA-A* 0201. O objetivo deste estudo é, conseqüentemente, avaliar a habilidade dos polipeptídeos acima descritos para induzir uma resposta imune específica de tipo Thl de múltiplos antígenos (isto é mediada por IFN-y) bem como a habilidade dessa resposta para reagir especificamente a antígenos de influenza naturalmente processados e apresentados de várias cepas não relacionadas patogênicas a humanos no contexto de células contendo HL A - A*0201 humano infectado.

Reatividade de peptídeo 1

Após processamento interno do polipeptídeo pelas células apresentando antígeno (APCs) dos camundongos transgênicos, epítopos específicos de células T CD8+ contidos devem ser apresentados na superfície de APC em associação com as moléculas HLA- A*0201 onde elas iriam proceder para ativar células T CD8+ nativas e induzir uma resposta imune de tipo Thl específica de Pl.

Para confirmar isso, linhagens celulares de humano contendo HLA - A*0201 (Tl) e não contendo (JURKAT) foram intracelularmente carregadas com Pl por meio de um veículo de lipídio (Lipofectina, INVITROGEN). Esplenócitos de animais imunizados com a preparação de polipeptídeo de influenza (FLU-v) foram verificados como produzindo níveis significativamente aumentados de IFN-y comparados a esplenócitos de animais imunizados como NRP quando co-cultivados com células humanas contendo HLA - A*0201 tratadas com MMC (Tl) transfectadas com Pl, mas não quando co-cultivadas com células humanas não contendo HLA - A*0201 (JURKAT) tratadas do mesmo modo (ver Figura IA, cujos dados são apresentados na Tabela 1 abaixo).

Nota: "Lys" significa o fundo de controle negativo sobre o qual todos os valores são calculados. "Sol" significa peptídeo solúvel apresentado para a população primária de esplenócitos. "Pro"significa que o peptídeo está sendo apresentado complexado com as moléculas de HLA das células seguindo processamento interno e carga dos epítopos resultantes sobre as moléculas de MHC. Valores representam erro padrão ± médio de Δ IFN-y 5 para Lys (pg/ml). O experimento pode ser esquematicamente representado como segue: Esquema 2 - teste de controle para TI e JERK A T

Esquema 3 - Resultados de teste de FLU-v de Tl e JURKA T

Como os camundongos transgênicos usados nestes experimentos não contém qualquer outro HLA humano e a habilidade de suas células T CD8T- de especificamente reconhecer epítopos derivados de Pl no 5 contexto de outros HLA humanos que eles nunca encontraram é baixa, estes resultados claramente mostraram que a resposta de IFN-y observada é especificamente causada por epítopos derivados de Pl reconhecendo células T CD8+ iniciados em associação com moléculas HLA - A*0201.

Também é importante notar que nenhuma resposta de IL-4 foi 10 detectada contra as células transfectadas de Pl em ou FLU-v ou animais imunizados com NRP (dados não mostrados). Lima vez que a produção de IL- 4 é antagonistic^ para a produção de IFN-y e por conseguinte para a criação de respostas de células T CD8+ específicas de antígeno, a necessidade de produção de IL-4 em ambos os grupos claramente mostra que a imunização com FLU-v induz uma resposta de tipo Thl específica para o componente de Pl da preparação.

Uni nível significantemente aumentado em produção de IFN-y é também observado em FLU-v comparado a grupos imunizados de NRP quando antígeno de Pl solúvel é simplesmente adicionado à cultura de esplenócitos (na ausência de células de Tl ou JURKAT). No entanto, o nível global dessa resposta de IFN-y é menor do que aquele observado quando o antígeno foi apresentado através das células de Tl contendo HLA - A*0201. A explicação para essa observação é que Pl foi definido na base de conter epítopos que são primariamente reativos no contexto de HLAs de humano não de camundongo. Os camundongos transgênicos aqui usados contêm um complemento completo de moléculas de MHC de camundongo em adição às moléculas HLA - A*0201, conseqüentemente o Pl solúvel capturado pela população de APC presente nas culturas primárias de esplenócitos podem também ser processadas nas vias de Classe I e II de MHC de camundongo (Peachman KK, Rao M, Alving CR, Palmer DR, Sun W, Rothwell SW.

"Human dendritic cells and macrophages exhibit different intracellular processing pathways for soluble and liposome-encapsulated antigens." Immunobiology. 2005;210(5):321-33), que mediam as respostas de células T CD8+ e CD4-V restritas a H-2D respectivamente. Como um resultado, se Pl contém epítopos de murino múltiplos, seria esperado que a resposta de IFN-y para PI solúvel seria igual ou maior àquela observada para o caso de apresentação mediada por célula humana pois um conjunto muito maior de células T CD4+ e CD8+ estaria apto a reagir aos estímulos. Como isso não é observado e o nível de uma resposta imune in vitro é primariamente determinado pela disponibilidade de antígeno, segue-se claramente que os linfócitos T CD8+ específicos de Pl detectados nos experimentos de co- cultura de TI seriam simplesmente incapazes de responder no mesmo nível devido à quantidade reduzida de antigeno sendo apresentado aos mesmos no contexto HLA - A*0201 correto.

Reatividade de peptídeo 2

Esplenócitos de animais imunizados com FLU-v foram verificados como produzindo níveis significantemente aumentados de IFN-y comparados a esplenócitos de animais imunizados com NRP quando co- cultivados com células humanas contendo HLA - A*0201 tratadas com MMC |0 (Tl) transfectadas com P2, mas não quando co-cultivadas com células humanas não contendo HLA - A*0201 (JURKAT) tratadas do mesmo modo (ver Figura 1B, os dados para isto são especificados na Tabela 2 abaixo). Como foi o caso para Pl, esses resultados mostraram claramente que a resposta de IFN-y observada é especificamente causada por células T CD8+ 15 reconhecendo epítopos derivados de P2 em associação com moléculas HLA - A*0201. Similarmente, como a produção de IL-4 é antagonística à produção de IFN-y e consequentemente ao desenvolvimento de células T CD8+, a falta de uma resposta de IL-4 contra células transfectadas de P2 em ou animais imunizados com FLU-v ou com NRP (dados não mostrados) claramente 20 mostra que a imunização de FLU-v induz uma resposta de tipo Thl específica de P2.

Nota: "Lys" significa o fundo de controle negativo sobre o qual todos valores são calculados. "Sol" significa peptídeo solúvel apresentado para a população primária de esplenócitos. "Pro"significa que o peptídeo está sendo apresentado complexado com as moléculas de HLA das células seguindo processamento interno e carga dos epítopos resultantes nas moléculas de MHC. Valores representam erro padrão ± médio do Δ IFN-y para Lys (pg/ml).

Uma produção de IFN-y significantemente aumentada foi também observada em grupos imunizados com FLU-V comparados aos com NRP quando P2 foi simplesmente adicionado à cultura de esplenócitos. Em contraste a Pl, entretanto, o nível global da resposta de IFN-y foi maior para o antígeno solúvel que para aquele apresentado pelas células contendo HLA - A*0201. Essa observação indica que P2 abriga não apenas epítopos HLA - A*0201 fortes mas também epítopos fortes de camundongo (H-2D).

Reatividade de peptídeos 3, 4 e 5

Como foi o caso para P2, produção de IFN-y significantemente aumentada pode ser observada entre grupos imunizados com FLU-v e NRP quando P3, P4 e P5 são simplesmente adicionados à cultura bem como quando eles são apresentados através de linhagens de células humanas transfectadas alinhadas a HLA (Tl). mas não quando elas estão apresentadas através de linhagens celulares humanas desalinhadas com HLA (JURKAT) (ver Figuras 1C, ID e 1E, cujos dados são especificados nas Tabelas 3-5 abaixo). Em todos três casos, o incremento na produção de IFN-y é maior quando esplenócitos são co-cultivados com células humanas transfectadas em vez de quando antígeno solúvel é simplesmente adicionado ao meio de cultura. Estes resultados, devido aos mesmos argumentos desenvolvidos para o caso de P2s indicam que P3, P4 e P5 contêm um número de epítopos fortes de células T de camundongo além das dos humanos.

Nota: "Lys" significa o fundo de controle negativo sobre o qual todos valores são calculados. "Sol" significa peptídeo solúvel apresentado para a população primária de esplenócitos. "Pro"significa que o peptídeo está sendo apresentado complexado com as moléculas de HLA das células seguindo processamento interno e carga dos epítopos resultantes nas moléculas de MHC. Valores representam erro padrão ±médio do Δ IFN-y para Lys (pg/ml).

Finalmente, como todos os três peptídeos deixam de induzir a produção de IL-4 (dados não mostrados), está claro que a resposta imune induzida por vacinação com a preparação de FLU-v induz uma resposta de tipo Thl para cada desses três polipeptídeos.

Reatividade de peptídeo 6

Como foi o caso de Pl, produção de IFN-y significantemente aumentada pode ser observada entre grupos imunizados com FLU-v e NRP quando P6 é simplesmente adicionado à cultura bem como quando é apresentado através de linhagens de células humanas transfectadas alinhadas com HLA (Tl), mas não quando é apresentado através de linhagens celulares humanas desalinhadas com HLA (JURKAT) (ver Figura 1F, cujos dados são especificados na Tabela 6 abaixo). De novo como para Pl, a maior resposta é observada para o antígeno solúvel, indicando que P6 não contém epítopos de H-2D fortes. Como as caudas para essas observações já foram explicadas para o caso de Pl elas nào devem mais ser desenvolvidas aqui devendo-se fazer referência para a seção anterior.

"Lys" significa o fundo de controle negativo sobre o qual todos valores são calculados. "Sol" significa peptídeo solúvel apresentado para a população de esplenócito primária. "Pro"significa que o peptídeo está sendo apresentado complexado com as moléculas de HLA das células seguindo processamento interno e carga dos epítopos resultantes nas moléculas de MHC. Valores representam erro padrão ± médio do Δ IFN-y para Lys (pg/ml).

A falha de estimulação com P6 para induzir qualquer produção de IL-4 (dados não mostrados), claramente mostrou que a resposta imune induzida por vacinação com FLU-v induz uma resposta de tipo Thl para P6.

Reatividade de FLU-vpara cepas de influenza não relacionadas

Os experimentos descritos até este ponto claramente mostraram que imunização com FLU-v induz uma resposta de IFN-y de células T CD8+ específica contra cada um dos seis polipeptídeos constituintes. No entanto, como estes polipeptídeos foram definidos como contendo epítopos de célula T CD8+ reativos sujeitos a um nível baixo de variabilidade de seqüência dentro da população de vírus de influenza analisada, foi também desejável estabelecer se camundongos vacinados com FLU-v foram capazes de reconhecer, e consequentemente induzir uma resposta imune de tipo Thl específica, epítopos de células T naturalmente processaram e apresentaram seguinte infecção com diferentes cepas de influenza não relacionadas. Tal análise provê uma indicação clara da eficácia potencial da mistura de polipeptídeos de FLU-v como uma vacina para influenza que, devido à marcação de epítopos de células T de variabilidade de seqüência baixa em toda a população de influenza humana e animal, iria . 5 prover proteção contra todas as cepas presentes, bem como aqueles que poderiam surgir no futuro a partir de uma recombinação espontânea entre cepas de animais altamente patogênicas com cepas de humanos presentes.

Para esta análise, culturas de esplenócitos primárias de animais transgênicos imunizados com FLU-v ou NRP foram co-cultivados com várias 0 células humanas contendo HLA-A*020I (Tl) e não contendo (JURKAT) infectadas por influenza. As três cepas de influenza usadas para (A/New_Caledonia/20/99, A/NYMC/X-147 e B/Johannesburg/5/99) são todas patogênicas para humanos e foram obtidas do repositório WHO de Influenza, baseado em NIBSC (UK). Como um controle positivo específico de antígeno 15 uma preparação solúvel equimolar dos seis polipeptídeos adicionados à preparação de esplenócito primária foi usada.

Esplenócitos de animais vacinados com FLU-v produziram um nível significantemente maior de IFN-y comparado aqueles de animais vacinados com NRP quando co-cultivados com células humanas contendo 20 HLA - A*0201 infectadas com influenza tratadas de MMC (Tl) transfectadas, mas não quando co-cultivados com células humanas não contendo HLA - A*0201 (JURKAT) tratadas do mesmo modo (ver Figura 2, cujos dados são especificados na Tabela 7 abaixo). Nenhuma resposta de IL-4 foi detectada em quaisquer dos camundongos vacinados contra ou o antígeno de 25 polipeptídeo solúvel ou as células infectadas com influenza (dados não mostrados). Estes resultados claramente mostraram que a resposta de IFN-y observada é especificamente causada por epítopos reconhecendo células T CD8+ iniciadas contidas na preparação de FLU-v e que também são naturalmente processadas e apresentadas em associação com moléculas HLA - A*0201 em células humanas infectadas com influenza.

Nota: "Lys" significa o fundo de controle negativo sobre o qual todos valores são calculados. "Sol" significa peptídeo solúvel apresentado para a população de esplenócito primária. "Pro"significa que o peptídeo está sendo apresentado complexado com as moléculas de HLA das células seguindo processamento interno e carga dos epítopos resultantes nas moléculas de MHC. Tl é a Linhagem celular humana contendo HLA - A*0201. "Ju" refere-se a JURKAT que é a linhagem celular humana não contendo HLA - A*0201. A/NC/20/99 (isto é A/New Caledonia/20/99), A/NYMC/X-147 e B/Johannesburg/5/99 são, respectivamente, as duas cepas de influenza A e uma influenza B usadas para infecção das linhagens celulares humanas. Valores representam erro padrão ±médio do Δ IFN-y para Lys (pg/ml).

De maneira interessante, a produção de fundo de IFN-y para todos os grupos infectados com influenza foi maior que a observada quando análises similares foram efetuadas usando antígeno de polipeptídeo purificado. Esta observação, entretanto, mais provavelmente reflete a incapacidade de tratamento com MMC para desativar completamente o vírus presente na preparação celular. Isso, por sua vez, resultaria em vírus de influenza viável infectando células de camundongos suscetíveis nas culturas primárias de esplenócitos, deste modo conduzindo a uma resposta primária in vitro. Esta interpretação é apoiada pela observação que as cepas de vírus da influenza as mais usadas induziram o mesmo nível de resposta de IFN-y de fundo independentemente da linhagem celular humana infectada e o grupo vacinado considerado. A única exceção para essa regra é a produção de IFN-y de fundo muito reduzida observada em células JURKAT infectadas com 5 B/Johannesburg/5/99. No entanto, como ainda neste caso, a produção de IFN- y para ambos os animais vacinados com FLU-v e com NRP, é equivalente, será notado que a diferença observada é causada mais pela suscetibilidade reduzida de células de JURKAT à infecção por influenza B/Johannesburg/5/99, do que por qualquer outra causa intrinsecamente associada para os diferentes regimes de vacinação. Seja qual for o caso, esta observação, não detrai do fato evidente de que a vacinação com FLU-v leva ao reconhecimento específico de epítopos de influenza processados naturalmente apresentados em associação com moléculas HLA - A*0201 após a infecção de células humanas com várias cepas não relacionadas de vírus de 15 influenza infecciosos. Assim, FLU-v constitui uma preparação de vacina candidata efetiva para proteção contra cepas múltiplas de influenza, deste modo diminuindo a necessidade para os protocolos de re-vacinação presentes anualmente.

EXPERIMENTO 2 -Efeito protetor de polipeptídeos em camundongos

A finalidade deste estudo foi demonstrar que a imunização de dose baixa com os peptídeos de polipeptideo de células T conservados de influenza identificados (FLU-v) induzem proteção, mediada por células T CD8+, contra desafio letal com o vims de influenza.

Materiais e métodos Peptídeos, anti soros e vírus:

A preparação de vacina candidata (FLU-v) testada neste estudo é composta de vários peptídeos (isto é Pl: Aminoácido de M1A (aa) 36 a 75 (SEQ ID 1); P2: M1B aa 124 a 158 (SEQ TD 2); P3: NPA aa 255 a 275 (SEQ 1D 3); P4: NPB aa 306 a 326 (SEQ ID 4); P5: PB1 aa 395 a 428 (SEQ DD 5); P6: M2 aa 32 a 55 (SEQ ID 6)) que foram todos sintetizados por química Fmoc e colocadas novamente em suspensão em DMSO em PBS (a concentração de DMSO na preparação final foi menor do que 5%). Lisozima (Sigma) desnaturada por ebulição foi usada como a preparação não relevante de controle (NRP-v). IgG2a de CD8 anti-camundongo de rato purificado (clone YTS 169,4) foi obtido de AbD Serotec (LJK) enquanto vírus infeccioso de influenza A/PR/8/34 foi obtido de MBSC como lote de padrão liofilizado.

Imunizações

No dia 1, camundongos C57BL/6-Tg(HLA-A2.1)lEnge/J de sete a dez semanas de idade (Transgênico HLA - A*0201 em um fundo de C57/BL6, Jackson Labs) foram imunizados subcutaneamente na base do rabo com uma dose de 200 pl da preparação de antígeno emulsificada em IFA (Sigma). No grupo de teste (n = 14), cada dose da preparação de antígeno continha 60 nmol de uma mistura equimolar de todos seis peptídeos (10 nmol cada) enquanto no grupo de controle (n = 14), cada dose da preparação de antígeno continha uma dose equivalente do polipeptídeo não relevante.

No dia 15, todos os animais receberam uma imunização de reforço usando as mesmas doses vias de liberação, como usado originalmente. No dia 16, ambos os grupos, de teste e controle, foram divididos em dois subgrupos iguais (n = 7 cada; isto é Controle-1, Controle-2, Teste-1 e Teste-2).

No dia 19, todos os animais nos grupos Controle-1 e Teste-1 receberam uma injeção intraperitoneal de 200 pl de soros de CD8 de anti- camundongo de rato (100 pg) enquanto todos os animais nos grupos de Controle-2 e Teste-2 receberam uma injeção equivalente de soros não relacionados.

O dia seguinte (Dia 20), todos os grupos foram desafiados intranasalmente sob anestesia com uma dose letal grande (aproximadamente 1,5x10' pfu) de Influenza A/PR/8/34.

No dia 22, foram de novo intraperitonealmente injetados com quer soros de CD8 anti-camuπdongo de rato ou não soros não relacionados, como descrito acima.

Do dia 20, todos animais foram monitorados diariamente para sintomas de influenza (por exemplo espirros e pirexia) bem como perda de peso.

Todos animais ainda vivos no dia 27 foram abatidos e o estudo foi terminado.

Resultados

A fim de avaliar a eficácia da preparação de FLU-v como uma vacina para influenza candidata foi desejável estabelecer um estudo de desafio em animais imunizados com NRP-v e FLU-v usando a cepa de influenza A/PR/8/34. Tipicamente, uma dose intranasal de 1.5x10 pfu irá matar os camundongos C57BL/6-Tg(HLA-A2.1)lEnge/J não imunizados no dia 4 ou 5 após desafio (dados não mostrados).

Como mostrado na Fig. 3A, a maior parte de animais imunizados com ou as preparações de peptídeos de FLU-v ou NRP-v, mas sujeitos à depleção de CD8, sucumbiram à infecção por Influenza A/PR/8/34 em 7 dias após desafio intranasal (71% versus 100% respectivamente). Em contraste, como mostrado na Fig. 3B e na ausência de depleção de CD8, animais imunizados com a preparação de FLU-v mostraram uma redução significante (p < 0,05) em seu índice de mortalidade comparados a animais imunizados com a preparação de NRP-v (28% versus 100%).

Os resultados deste estudo indicam claramente que a vacinação com a preparação de peptídeo de FLU-v, mesmo a uma dose de nível baixo de cada um de seus peptídeos ativos constituintes (10 nmol), induz um nível de proteção significante contra desafio letal com Influenza. Estes peptídeos, como indicado anteriormente, foram identificados in silico primariamente por sua reatividade de células T dentro do contexto de HLA classe I humano. Os resultados corroboraram o fato que as células T CD8+ estimuladas por vacinação com a preparação de peptídeo de FLU-v desempenham um papel significativo em conferir proteção contra infecção 5 por influenza.

Claims (14)

1. Composição de polipeptídeo compreendendo um transportador apropriado, excipiente e/ou adjuvante e um polipeptídeo de SEQ ID NO:1 , a referida composição sendo caracterizada pelo fato de ser imunogênica a uma ou mais cepas de influenza em um vertebrado que expressa um alelo do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) , e em que um ou mais polipeptídeos isolados não são uma proteína completa do vírus da influenza.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender ainda um polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, um polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 ou um polipeptídeo de SEQ ID NO: 6.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender ainda um polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, um polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 e um polipeptídeo de SEQ ID NO: 6.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de compreender ainda um polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou um polipeptídeo de SEQ ID NO: 5.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de compreender ainda um polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e um polipeptídeo de SEQ ID NO: 5.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender um polipeptideo de SEQ ID NO: 1, um polipeptideo de SEQ ID NO: 3, um polipeptideo de SEQ ID NO: 4 e um polipeptideo de SEQ ID NO: 6.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender um polipeptideo de SEQ ID NO: 1, um polipeptideo de SEQ ID NO: 2, um polipeptideo de SEQ ID NO: 3, um polipeptideo de SEQ ID NO : 4, um polipeptideo de SEQ ID NO: 5 e um polipeptideo de SEQ ID NO: 6.

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que cada um dos um ou mais polipeptídeos isolados está em uma quantidade de Ipg a 100g.

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que ser imunogênica a uma linhagem de virus influenza.

10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que ser imunogênica a uma pluralidade de cepas de virus influenza.

11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que uma ou mais cepas de influenza compreendem uma cepa de influenza A, uma cepa de influenza B ou ambas, uma cepa de influenza A e uma cepa de influenza B.

12. Uso de uma composição de polipeptídeo, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de ser para fabricação de um medicamento ou vacina, efetivo no tratamento ou prevenção de influenza.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que influenza compreende uma ou mais cepas de influenza.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13 caracterizado pelo fato de que uma ou mais cepas de influenza compreendem uma cepa de influenza A, uma cepa de influenza B ou ambas, uma cepa de influenza A e uma cepa de influenza B.

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