BRPI0707640A2

BRPI0707640A2 - proteÍnas de fusço do rage e mÉtodos de uso

Info

Publication number: BRPI0707640A2
Application number: BRPI0707640-1A
Authority: BR
Inventors: Adnan M M Mjalli; Jeffrey C Webster; Robert Rothlein; Ye E Tian
Original assignee: Transtech Pharma Inc
Priority date: 2006-02-09
Filing date: 2007-01-23
Publication date: 2011-05-10
Also published as: TW200806690A; US20090004190A1; JP2007215543A; WO2007094926A3; AR059377A1; EP1989227A2; KR20080105066A; CA2638907A1; NL2000476A1; ZA200806288B; IL192581A0; AU2007215503A1; EA200870244A1; CN101410411A; AU2007215503A8; NZ569545A; EA015657B1; WO2007094926A2; NL2000476C2

Abstract

PROTEÍNAS DE FUSçO DO RAGE E MÉTODOS DE USO. Divulgadas são proteínas de fusão do RAGE compreendendo seqUências de polipeptídeo do RAGE ligadas a um segundo polipeptideo não RAGE. A proteína de fusão do RAGE pode utilizar um domínio de polípeptideo do RAGE compreendendo um sitio de ligação do lígante do RAGE e um ligador de interdomínio diretamente ligado a um domínio C~H~2 da imunoglobulína. Tais proteínas de fusão podem fornecer afinidade de ligação alta e específica aos ligantes do RAGE. Também divulgado é o uso das proteínas de fusão do RAGE como terapêutico para patologías mediadas por RAGE.

Description

"PROTEÍNAS DE FUSÃO DO RAGE E MÉTODOS DE USO"REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOSO presente pedido reivindica prioridade sob 35U.S.C. § 119(e) do Pedido de Patente Provisório U.S. SérieNs 60/771.619, depositado em 9 de Fevereiro de 2006. Adivulgação do Pedido de Patente Provisório U.S. 60/771.619 épor meio deste incorporada por referência aqui em suatotalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito à regulação doReceptor para Produtos Finais Glicados Avançados (RAGE).Mais particularmente, a presente invenção descreve proteínasde fusão compreendendo um polipeptideo do RAGE, métodos defabricar tais proteínas de fusão, e o uso de tais proteínaspara tratamento de distúrbios com base no RAGE.

FUNDAMENTOS

A incubação de proteínas ou lípideos com açúcaresaldose resulta em glicação não enzimática e oxidação degrupos amino em proteínas para formar adutos Amadori. Com opassar do tempo, os adutos sofrem recomposições adicionais,desidratações, e reticulação com outras proteínas paraformar complexos conhecido como Produtos Finais de GlicaçãoAvançada (AGEs). Os fatores que promovem a formação dos AGEsincluem modificação retardada da proteína (por exemplo, comonas amiloidoses), acúmulo de macromoléculas tendo teor delisina alto, e níveis de glicose no sangue altos (porexemplo, como no diabetes) (Hori et al., J Biol. Chem. 270:25752-761, (1995)). AGEs foram implicados em uma variedadede distúrbios incluindo complicações associadas com diabetese envelhecimento normal.

AGEs exibem ligação especifica e saturável aosreceptores de superfície celular em monócitos, macrófagos,células endoteliais da microvasculatura, células musculareslisas, células mesangiais, e neurônios. 0 Receptor paraProdutos Finais Glicados Avançados (RAGE) é um membro dafamília supergênica da imunoglobulina de moléculas. Odomínio extracelular (N-terminal) do RAGE inclui trêsregiões do tipo imunoglobulina: um domínio do tipo V(variável) seguido por dois domínios do tipo C (constante)(Keeper et al., J. Biol. Chem., 2 67:14 998-15004 (1992);Schmidt et al. , Circ. (Suppl.) 96#194 (1997)). Um domínio deabrangência da transmembrana simples e uma cauda citosólicaaltamente carregada, curta, seguem o domínio extracelular. 0domínio extracelular de N-terminal pode ser isolado porproteólise do RAGE ou por métodos biológicos molecularespara gerar RAGE solúvel (RAGEs) compreendido dos domínios V e C.

O RAGE é expressado em tipos celulares múltiplosincluindo leucócitos, neurônios, células microgliais eendotélio vascular (por exemplo, Hori et al., J. Biol.Chem., 270:25752-761 (1995)). Níveis aumentados do RAGEtambém são encontrados nos tecidos envelhecidos (Schleicheret alJ. Clin. Invest., 99 (3): 457-468 (1997)), e naretina diabética, vasculatura e rim (Schmidt et al. , NatureMed., 1:1002-1004 (1995)).

Além dos AGEs, outros compostos podem se ligar emodular o RAGE. 0 RAGE liga-se aos ligantes diversosfuncional e estruturalmente múltiplos incluindo betaamilóide (Ap)f soro amilóide A (SAA), Produtos Finais deGlicação Avançada (AGEs), SlOO (um membro pró-inflamatórioda família da Calgranulina), carboximetil lisina (CML),anfoterina e CDllb/CDl8 (Bucciarelli et al. , Cell Mot. LifeSci., 59:1117-128 (2002); Chavakis et al., Microbes Infect.,6:1219-1225 (2004); Kokkola et al., Scand. J. Immunol.,61:1-9 (2005); Schmidt et al., J. Clin. Invest., 108:949-955(2001); Rocken et al., Am. J. Pathol., 162:1213-1220(2003)).

A união de ligantes tais como AGEs,Sl00/calgranulina, β-amilóide, CML (Ne-Carboximetil lisina),e anfoterina ao RAGE foi mostrada para modificar a expressãode uma variedade de genes. Essas interações depois podeminiciar mecanismos de transdução de sinal incluindo ativaçãode p38, p21ras, cinases MAP, fosforilação da Erkl-2, e aativação do mediador transcricional de sinalizaçãoinflamatória, NF-κΒ (Yeh et al., Diabetes, 50:1495-1504(2001)). Por exemplo, em muitos tipos de células, ainteração entre RAGE e seus ligantes pode gerar tensãooxidativa, que desse modo resulta na ativação do fator detranscrição sensível ao radical livre NF-κΒ, e na ativaçãode genes regulados NF-κΒ, tais como as citocinas IL-Ιβ eTNF-α. Além disso, a expressão do RAGE é supra-regulada porintermédio de NF-κΒ e mostra expressão aumentada nos sítiosde inflamação ou tensão oxidativa (Tanaka et al., J. Biol.Chem., 275:25781-25790 (2000)). Assim, um espiral ascendentee freqüentemente prejudicial pode ser abastecido por um Ioopde retroalimentação positivo iniciado por união do ligante.

A ativação do RAGE em tecidos e órgãos diferentespode levar a várias conseqüências patofisiológicas. RAGE foiimplicado em uma variedade de condições incluindo:inflamação aguda e crônica (Hofmann et al., Cell 97:889-901(1999)), o desenvolvimento de complicações diabéticastardias tais como permeabilidade vascular aumentada (Wautieret al., J. .Clin. Invest., 97:238-243 (1995)), nefropatia(Teillet et al., J. Am. Soe. Nephrol., 11:1488-1497 (2000)),arteriosclerose (Vlassara et al., The Finnish MedicaiSociety DUODECIM; Ann. Med., 28:419-426 (1996)), eretinopatia (Hammes et al., Diabetologia, 42:603-607(1999)). 0 RAGE também foi implicado em doença de Alzheimer(Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996)), e na invasão detumor e metástase (Taguchi et al., Nature, 405:354-357 (2000)).

Não obstante da expressão ampla do RAGE e seupapel pleiotrópico aparente em modelos de doença diversosmúltiplos, RAGE não parece ser essencial ao desenvolvimentonormal. Por exemplo, camundongos nocauteados com RAGE estãosem um fenótipo anormal evidente, sugerindo que enquantoRAGE pode desempenhar um papel na patologia da doença quandoestimulado cronicamente, a inibição do RAGE não parececontribuir para qualquer fenótipo agudo indesejado(Liliensiek et al., J. Clin. Invest., 113:1641-50 (2004)).

A ligação antagonizante de ligantes fisiológicosao RAGE pode infra-regular as mudanças patofisiológicasrealizadas por concentrações excessivas de AGEs e outrosligantes do RAGE. Reduzindo-se a ligação de ligantesendógenos ao RAGE, sintomas associados com distúrbiosmediados por RAGE podem ser reduzidos. RAGE solúvel (RAGEs)é capaz de antagonizar efetivamente a união de ligantes doRAGE ao RAGE. Entretanto, RAGEs pode ter uma meia vidaquando administrado in vivo que pode ser muito curta paraser terapeuticamente útil para um ou mais distúrbios. Assim,existe uma necessidade para desenvolver compostos queantagonizem a ligação de AGEs e outros ligantes fisiológicosao receptor do RAGE onde o composto tem um perfilfarmacocinético desejável.

SUMÁRIO

As formas de realização da presente invençãocompreendem proteínas de fusão do RAGE e métodos de usartais proteínas. A presente invenção pode ser realizada emuma variedade de maneiras. Formas de realização da presenteinvenção podem compreender uma proteína de fusão do RAGEcompreendendo um polipeptídeo do RAGE ligado a um segundopolipeptídeo não RAGE. Em uma forma de realização, aproteína de fusão do RAGE compreende um sítio de ligação doligante do RAGE. A proteína de fusão do RAGE podecompreender ainda um polipeptídeo do RAGE diretamente ligadoa um polipeptídeo compreendendo o domínio CH2 de umaimunoglobulina, ou uma porção do domínio CH2.

A presente invenção também compreende um métodopara fabricar uma proteína de fusão do RAGE. Em uma forma derealização o método compreende ligar um polipeptídeo do RAGEa um segundo polipeptídeo não RAGE. Em uma forma derealização, o polipeptídeo do RAGE compreende um sítio deligação do ligante do RAGE. 0 método pode compreender ligarum polipeptídeo do RAGE diretamente a um polipeptídeocompreendendo o domínio CH2 de uma imunoglobulina ou umaporção do domínio CH2.

Em outras formas de realização, a presenteinvenção pode compreender métodos e composições para tratarum distúrbio mediado por RAGE em um paciente. 0 método podecompreender administrar uma proteína de fusão do RAGE dapresente invenção ao paciente. A composição pode compreenderuma proteína de fusão do RAGE da presente invenção em umcarregador farmaceuticamente aceitável.

Existem várias vantagens que podem ser associadascom formas de realização particulares da presente invenção.Em uma forma de realização, as proteínas de fusão do RAGE dapresente invenção podem ser metabolicamente estáveis quandoadministradas a um paciente. Também, as proteínas de fusãodo RAGE da presente invenção podem exibir ligação deafinidade alta para ligantes do RAGE. Em certas formas derealização, as proteínas de fusão do RAGE da presenteinvenção unem-se a ligantes do RAGE com afinidades na faixananomolar alta à micromolar baixa. Ligando-se com afinidadealta a ligantes do RAGE fisiológicos, as proteínas de fusãodo RAGE da presente invenção podem ser usadas para inibir aunião de ligantes endógenos ao RAGE, desse modo fornecendoum meio para melhorar doenças mediadas por RAGE.

Também, as proteínas de fusão do RAGE da presenteinvenção podem ser fornecidas na forma de proteína ou ácidonucléico. Em uma forma de realização de exemplo, a proteínade fusão do RAGE pode ser administrada sistemicamente epermanecer na vasculatura para potencialmente tratar doençasvasculares mediadas em parte por RAGE. Em uma outra forma derealização de exemplo, a proteína de fusão do RAGE pode seradministrada localmente para tratar doenças onde ligantes doRAGE contribuem para a patologia da doença.Alternativamente, uma construção de ácido nucléicocodificando a proteína de fusão do RAGE pode ser liberada aum sítio pelo uso de um carregador apropriado tal como umvírus ou DNA desprotegido onde expressão local transientepode localmente inibir a interação entre ligantes do RAGE ereceptores. Assim, a administração pode ser transiente (porexemplo, como quando a proteína de fusão do RAGE éadministrada) ou mais permanente em natureza (por exemplo,como quando a proteína de fusão do RAGE é administrada comoum DNA recombinante).

Existem características adicionais da invenção queserão descritas em seguida. Deve ser entendido que ainvenção não é limitada em sua aplicação aos detalhesapresentados nas reivindicações, descrição e figurasseguintes. A invenção é capaz de outras formas de realizaçãoe de ser praticada ou realizada de vários modos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Várias características, aspectos e vantagens dapresente invenção tornar-se-ão mais evidentes com referênciaàs figuras seguintes.A FIG. 1 mostra várias seqüências de RAGE eseqüências de imunoglobulina de acordo com formas derealização alternadas da presente invenção: Painel A, SEQ IDN-: 1, a seqüência de aminoácido para RAGE humano; e SEQ IDN2: 2, a seqüência de aminoácido para RAGE humano sem aseqüência de sinal de aminoácidos 1-22; Painel. B, SEQ IDN-: 3, a seqüência de aminoácido para RAGE humano sem aseqüência de sinal de aminoácidos 1-23; Painel C, SEQ ID N-:4, a seqüência de aminoácido de RAGEs humano; SEQ ID N2: 5,a seqüência de aminoácido de RAGEs humano sem a seqüência desinal de aminoácidos 1-22, e SEQ ID N2: 6, a seqüência deaminoácido de RAGEs humano sem a seqüência de sinal deaminoácidos 1-23; Painel D, SEQ ID N2: 7, uma seqüência deaminoácido compreendendo o domínio V de RAGE humano; SEQ IDN2: 8, uma seqüência de aminoácido alternada compreendendo odomínio V de RAGE humano; SEQ ID N2: 9, um fragmento N-terminal do domínio V de RAGE humano; SEQ ID N2: 10, umfragmento de N-terminal alternado do domínio V de RAGEhumano; SEQ ID N2: 11, a seqüência de aminoácido paraaminoácidos 124-221 de RAGE humano; SEQ ID N2: 12, aseqüência de aminoácido para aminoácidos 227-317 de RAGEhumano; SEQ ID N2: 13, a seqüência de aminoácido paraaminoácidos 23-123 de RAGE humano; Painel E, SEQ ID N2: 14,a seqüência de aminoácido para aminoácidos 24-123 de RAGEhumano; SEQ ID N2: 15, a seqüência de aminoácido paraaminoácidos 23-136 de RAGE humano; SEQ ID N2: 16, aseqüência de aminoácido para aminoácidos 24-136 de RAGEhumano; SEQ ID N2: 17, a seqüência de aminoácido paraaminoácidos 23-226 de RAGE humano; SEQ ID N-: 18, aseqüência de aminoácido para aminoácidos 24-226 de RAGEhumano; Painel F, SEQ ID N-: 19, a seqüência de aminoácidopara aminoácidos 23-251 de RAGE humano; SEQ ID N2: 20, aseqüência de aminoácido para aminoácidos 24-251 de RAGEhumano; SEQ ID N2: 21, um ligador de interdominio do RAGE;SEQ ID N2: 22, um segundo ligador de interdominio do RAGE;SEQ ID N2: 23, um terceiro ligador de interdominio do RAGE;SEQ ID N2: 24, um quarto ligador de interdominio do RAGE;Painel G, SEQ ID N2: 25, DNA codificando aminoácidos 1-118do RAGE humano; SEQ ID N2: 26, DNA codificando aminoácidos1-123 do RAGE humano; e SEQ ID N2: 27, DNA codificandoaminoácidos 1-136 do RAGE humano; Painel H, SEQ ID N2: 28,DNA codificando aminoácidos 1-230 do RAGE humano; e SEQ IDN2: 29, DNA codificando aminoácidos 1-251 do RAGE humano;Painel I, SEQ ID N2: 38, uma seqüência de aminoácido parcialpara os domínios CH2 e CH3 de IgG humana; SEQ ID N2: 39, DNAcodificando uma porção dos domínios CH2 e CH3 humanos de IgGhumana; SEQ ID N2: 40, uma seqüência de aminoácido para osdomínios CH2 e CH3 de IgG humana; Painel J, SEQ ID N2: 41, umDNA codificando os domínios CH2 e CH3 humanos de IgG humana;SEQ ID N2: 42, uma seqüência de aminoácido para o domínioCh2 de IgG humana; SEQ ID N2: 43, uma seqüência deaminoácido para o domínio CH3 de IgG humana; e SEQ ID N2:44, um quinto ligador de interdominio do RAGE.

A FIG. 2 mostra a seqüência de DNA (SEQ ID N2: 30)de uma primeira proteína de fusão do RAGE (TTP-4000)codificando a região de acordo com uma forma de realizaçãoda presente invenção. A seqüência de codificação 1-753destacada em negrito codifica a seqüência de proteína de N-terminal do RAGE considerando que a seqüência 754-1386codifica a seqüência de proteína IgG (yl) humana.

a FIG. 3 mostra a seqüência de DNA (SEQ ID N-: 31)de uma segunda proteína de fusão do RAGE (TTP-3000)codificando a região de acordo com uma forma de realizaçãoda presente invenção. A seqüência de codificação 1-408destacada em negrito codifica a seqüência de proteína Ν-terminal do RAGE, considerando que a seqüência 409-1041codifica a seqüência de proteína IgG (γΐ) humana.

A FIG. 4 mostra as seqüências de aminoácido, SEQID Ns: 32, SEQ ID N2: 33, e SEQ ID N2: 34, para que cada umacodifique uma proteína de fusão do RAGE de quatro domíniosde acordo com as formas de realização alternadas da presenteinvenção. A seqüência do RAGE é destacada com uma fonte emnegrito.

A FIG. 5 mostra as seqüências de aminoácido, SEQID Ns: 35, SEQ ID N5: 36, e SEQ ID N2: 37, para que cada umacodifique uma proteína de fusão do RAGE de três domínios deacordo com formas de realização alternadas da presenteinvenção. A seqüência do RAGE é destacada com uma fonte emnegrito.

A FIG. 6, Painel A, mostra uma comparação dosdomínios de proteína no RAGE humano e proteína humana Iggama-1 Fe, e pontos de clivagem usados para fabricar TTP-3000 (na posição 136) e TTP-4000 (na posição 251) de acordocom as formas de realização alternadas da presente invenção;e o Painel B mostra a estrutura de domínio para TTP-3000 eTTP-4000 de acordo com as formas de realização alternadas dapresente invenção.

A FIG. 7 mostra resultados de um ensaio de ligaçãoin vitro para RAGEs, e uma primeira proteína de fusão doRAGE TTP-4000 (TT4) e uma segunda proteína de fusão do RAGETTP-3000 (TT3), ao amilóide beta de ligantes do RAGE (A-beta), SlOOb (S100), e anfoterina (Ampho), de acordo com umaforma de realização da presente invenção.

A FIG. 8 mostra resultados de um ensaio de ligaçãoin vitro para uma primeira proteína de fusão do RAGE TTP-4000 (TT4) ("Proteína") ao amilóide beta quando comparados aum controle negativo apenas incluindo os reagentes deimunodetecção ("Complexo Sozinho"), e antagonismo de talligação por um antagonista do RAGE ("Ligante do RAGE") deacordo com uma forma de realização da presente invenção.

A FIG. 9 mostra resultados de um ensaio de ligaçãoin vitro para uma segunda proteína de fusão do RAGE TTP-3000(TT3) ("Proteína") ao amilóide beta quando comparados a umcontrole negativo apenas incluindo os reagentes deimunodetecção ("Complexo Sozinho"), e antagonismo de talligação por um antagonista do RAGE ("Ligante do RAGE") deacordo com uma forma de realização da presente invenção.

A FIG. 10 mostra resultados de um ensaio de basecelular medindo a inibição de produção induzida por SlOOb-RAGE de TNF-α por proteínas de fusão do RAGE TTP-3000 (TT3)e TTP-4000 (TT4), e RAGEs de acordo com uma forma derealização da presente invenção.A FIG. 11 mostra um perfil farmacocinético para aproteína de fusão do RAGE TTP-4000 de acordo com uma formade realização da presente invenção em que cada curvarepresenta um animal diferente sob as mesmas condiçõesexperimentais.

A FIG. 12 mostra níveis relativos de liberação deTNF-α das células THP-I devido à estimulação por proteína defusão do RAGE TTP-4000 e estimulação da IgG humana como umamedida de uma resposta inflamatória de acordo com uma formade realização da presente invenção.

A FIG. 13 mostra o uso de proteína de fusão doRAGE TTP-4000 para reduzir restenose em animais diabéticosde acordo com formas de realização alternadas da presenteinvenção, em que o painel A mostra que proteína de fusão doRAGE TTP-4000 reduziu a razão íntima/média quando comparadoa um controle negativo (IgG), e o painel B mostra queproteína de fusão do RAGE TTP-4000 reduziu a proliferaçãocelular muscular lisa vascular em uma maneira de resposta àdose.

A FIG. 14 mostra o uso de proteína de fusão doRAGE TTP-4000 para reduzir a formação amilóide e disfunçãocognitiva em animais com Doença de Alzheimer (AD) de acordocom formas de realização alternadas da presente invenção emque o painel A mostra que a proteína de fusão do RAGE TTP-4000 reduziu a carga amilóide no cérebro, e o painel Bmostra que a proteína de fusão do RAGE TTP-4000 melhorou afunção cognitiva.

A FIG. 15 mostra curvas de saturação-ligação comΤΤΡ-4 OOO para vários ligantes do RAGE conhecidos,imobilizados de acordo com uma forma de realização dapresente invenção.

A FIG. 16 mostra várias seqüências de RAGE eseqüências de imunoglobulina de acordo com formas derealização alternadas da presente invenção: Painel A, SEQ IDN2: 45, a seqüência de aminoácido de RAGEs humano sem aseqüência de sinal de aminoácidos 1-23 onde o resíduo deglutamina no N-terminal foi ciclizada para formar ácidopiroglutâmico, SEQ ID N-: 4 6, uma seqüência de aminoácidoalternada compreendendo o domínio V de RAGEs humano onde oresíduo de glutamina no N-terminal foi ciclizada para formarácido piroglutâmico, SEQ ID N2: 47, um fragmento N-terminalalternado do domínio V de RAGE humano onde o resíduo deglutamina no N-terminal foi ciclizada para formar ácidopiroglutâmico, SEQ ID N-: 48, a seqüência de aminoácido paraaminoácidos 24-123 de RAGE humano onde o resíduo deglutamina no N-terminal foi ciclizada para formar ácidopiroglutâmico; Painel B, SEQ ID N-: 49, a seqüência deaminoácido para aminoácidos 24-136 de RAGE humano onde oresíduo de glutamina no N-terminal foi ciclizada para formarácido piroglutâmico, SEQ ID N2: 50, a seqüência deaminoácido para aminoácidos 24-226 de RAGE humano onde oresíduo de glutamina no N-terminal foi ciclizada para formarácido piroglutâmico, SEQ ID N2: 51, a seqüência deaminoácido para aminoácidos 24-251 de RAGE humano onde oresíduo de glutamina no N-terminal foi ciclizada para formarácido piroglutâmico; Painel C, SEQ ID N2: 52, uma seqüênciade DNA alternada codificando uma porção dos domínios CH2 eCh3 humanos da IgG humana na SEQ ID N2: 38, SEQ ID N2: 53,uma seqüência de DNA alternada codificando os domínios CH2 eCh3 humanos da IgG humana na SEQ ID N-: 40.

A FIG. 17 mostra uma seqüência de DNA alternada(SEQ ID N-: 54) de uma primeira proteína de fusão do RAGE(TTP-4000) codificando a região de acordo com uma forma derealização da presente invenção. A seqüência de codificação1-753 destacada em negrito codifica a seqüência de proteínaN-terminal do RAGE e seqüência 754-1386 codifica a seqüênciade proteína IgG (γΐ) humana.

A FIG. 18 mostra uma seqüência de DNA alternada(SEQ ID N-: 55) de uma segunda proteína de fusão do RAGE(TTP-3000) codificando a região de acordo com uma forma derealização da presente invenção. A seqüência de codificação1-408 destacada em negrito codifica a seqüência de proteínaN-terminal do RAGE e a seqüência 409-1041 codifica aseqüência de proteína IgG (γΐ) humana.

A FIG. 19 mostra a seqüência de aminoácido SEQ IDN-: 56 que codifica uma proteína de fusão do RAGE de quatrodomínios de acordo com uma forma de realização alternada dapresente invenção. A seqüência do RAGE é destacada em fonteem negrito.

A FIG. 20 mostra a seqüência de aminoácido SEQ IDN-: 57 que codifica uma proteína de fusão do RAGE de trêsdomínios de acordo com uma forma de realização alternada dapresente invenção. A seqüência do RAGE é destacada em fonteem negrito.A FIG. 21 mostra o uso de proteína de fusão doRAGE TTP-4 000 para reduzir a rejeição de transplantes dacélula da ilhota pancreática alogênicos de acordo com formasde realização alternadas da presente invenção onde círculosabertos (não preenchidos) designam animais de controle nãotratados; círculos com incubação diagonal designam animaistratados com TTP-4000 em uma primeira dosagem; círculos comincubação ondulada designam animais tratados com TTP-4000 emuma segunda dosagem; círculos preenchidos com diamantedesignam animais tratados com PBS de controle; e círculossólidos designam animais tratados com IgG de controle.

A FIG. 22 mostra o uso de proteínas de fusão doRAGE TTP-4000 para reduzir a rejeição de transplantes dacélula da ilhota pancreática singênicos de acordo com formasde realização alternadas da presente invenção onde círculosabertos (não preenchidos) designam animais de controle nãotratados; e círculos sólidos designam animais tratados comTTP-4000.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Para os propósitos deste relatório descritivo, amenos que de 1 outro modo indicado, todos os númerosexpressando quantidades de ingredientes, condições dereação, e assim por diante, usados no relatório descritivodevem ser entendidos como sendo modificados em todos osexemplos pelo termo "cerca de." Consequentemente, a menosque indicado de outra forma, os parâmetros numéricosapresentados no relatório descritivo seguinte sãoaproximações que podem variar dependendo das propriedadesdesejadas buscadas para serem obtidas pela presenteinvenção. Ao menos, e não como uma tentativa para limitar aaplicação da doutrina de equivalentes ao escopo dasreivindicações, cada parâmetro numérico deve pelo menos serinterpretado na luz do número de dígitos significantesrelatados e aplicando-se técnicas de arredondamentohabituais.

Não obstante as faixas numéricas e parâmetrosapresentando o amplo escopo da invenção serem aproximações,os valores numéricos apresentados nos exemplos específicossão relatados tão precisamente quanto possível. Qualquervalor numérico, entretanto, inerentemente contém certoserros que resultam necessariamente do desvio de padrãoencontrado em suas respectivas medições de teste. Alémdisso, todas as faixas divulgadas aqui devem ser entendidaspara abranger quaisquer e todas as subfaixas incluídasnestas. Por exemplo, uma faixa estabelecida de "1 a 10" deveser considerada para incluir quaisquer e todas as subfaixasentre (e inclusive) o valor mínimo de 1 e o valor máximo de10; isto é, todas as subfaixas começando com um valor mínimode 1 ou mais, por exemplo, 1 a 6,1, e terminando com umvalor máximo de 10 ou menos, por exemplo, 5,5 a 10.Adicionalmente, qualquer referência referida como sendo"incorporada aqui" deve ser entendida como sendo incorporadaem sua totalidade.

Ainda é observado que, como usado neste relatóriodescritivo, as formas singulares "um," "uma," e "o(a)"incluem referências ao plural a menos que expressa einequivocamente limitadas a uma referência. 0 termo "ou" éusado permutavelmente com o termo "e/ou" a menos que ocontexto claramente indique de outro modo.

Também, os termos "porção" e "fragmento" sãousados permutavelmente para referirem-se às partes de umpolipeptídeo, ácido nucléico, ou outra construção molecular.

"Polipeptídeo" e "proteína" são usadospermutavelmente aqui para descrever moléculas de proteínaque podem compreender proteínas de tamanho parcial ou total.

Como é conhecido na técnica, "proteínas","peptídeos", "polipeptídeos" e "oligopeptídeos" são cadeiasde aminoácidos (tipicamente L-aminoácidos) cujos carbonosalfa são ligados através de ligações peptídicas formadas poruma reação de condensação entre o grupo carboxila do carbonoalfa de um aminoácido e o grupo amino do carbono alfa de umoutro aminoácido. Tipicamente, os aminoácidos compensandouma proteína são numerados em ordem, iniciando no resíduoamino terminal e aumentando em direção ao resíduo carbóxiterminal da proteína.

Como usado aqui, o termo "a montante" refere-se aum resíduo que é N-terminal a um segundo resíduo onde amolécula é uma proteína, ou 5' a um segundo resíduo onde amolécula é um ácido nucléico. Também como usado aqui, otermo "a jusante" refere-se a um resíduo que é C- terminal aum segundo resíduo onde a molécula é uma proteína, ou 3' aum segundo resíduo onde a molécula é um ácido nucléico.

A menos que definido de outro modo, todos ostermos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmosignificado como comumente entendido por aquele dehabilidade comum na técnica. Praticantes são particularmentedirigidos ao Current Protocols in Molecular Biology (ver porexemplo, Ausubel, F.M. et al., Short Protocols in MolecularBiology, 4- Ed., Capitulo 2, John Wiley & Sons, N.Y.) paradefinições e termos da técnica. Abreviações para resíduos deaminoácido são os códigos padrão de 3 letras e/ou 1 letrausados na técnica para referirem-se a um dos 20 L-aminoácidos comuns.

Um "ácido nucléico" é um polinucleotídeo tal comoácido desoxirribonucléico (DNA) ou ácido ribonucléico (RNA).O termo é usado para incluir ácidos nucléicos de filamentoúnico, ácidos nucléicos de filamento duplo, e RNA e DNAfabricados de análogos de nucleotídeo ou nucleosideo.o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácidonucléico que pode ser usada para transportar uma segundamolécula de ácido nucléico em uma célula. Em uma forma derealização, o vetor leva em consideração a replicação deseqüências de DNA inseridas no vetor. 0 vetor podecompreender um promotor para realçar a expressão da moléculade ácido nucléico em pelo menos algumas células hospedeiras.Os vetores podem replicar autonomamente (extra-cromossômico)ou podem ser integrados em um cromossomo de célulahospedeira. Em uma forma de realização, o vetor podecompreender um vetor de expressão capaz de produzir umaproteína derivada de pelo menos parte de uma seqüência deácido nucléico inserida no vetor.

Como é conhecido na técnica, condições parahibridizar as seqüências de ácido nucléico entre si podemser descritas como variando de estringência baixa a alta.Geralmente, condições de hibridização altamente severasreferem-se a lavagem de híbridos em tampão com baixo teor desal em temperaturas altas. A hibridização pode ser filtrar oDNA ligado usando soluções de hibridização padrão na técnicatais como 0,5 M de NaHPO4, 7 % de dodecil sulfato de sódio(SDS) , a 65° C, e lavagem em 0,25 M de NaHPO4, 3,5 % de SDSseguido por lavagem com 0,1 χ SSC/0,1 % de SDS em umatemperatura variando da temperatura ambiente a 68° Cdependendo do comprimento da sonda (Ausubel et al.) . Porexemplo, uma lavagem de alta estringência compreende lavagemem 6 χ SSC/0,05 % de pirofosfato de sódio a 37° C para umasonda de 14 oligonucleotideos de base, ou a 48° C para umasonda de 17 oligonucleotideos de base, ou a 55° C para umasonda de 20 oligonucleotideos de base, ou a 60° C para umasonda de 25 oligonucleotideos de base, ou a 65° C para umasonda de nucleotídeo de cerca de 250 nucleotídeos decomprimento. Sondas de ácido nucléico podem ser marcadas comradionucleotídeos por marcação final com, por exemplo, [γ-32P]ATP, ou incorporação de nucleotídeos radiomarcados taiscomo [(X-32P] dCTP por marcação de iniciador aleatória.Alternativamente, sondas podem ser marcadas por incorporaçãode nucleotídeos biotinilados ou marcados com fluoresceína, ea sonda detectada usando anticorpos de Estreptavidina ouanti-fluoresceína.

Como usado aqui, "moléculas orgânicas pequenas"são moléculas de peso molecular menor do que 2.000 Daltonsque contêm pelo menos um átomo de carbono.

O termo "proteína de fusão" refere-se a umaproteína ou polipeptídeo que tem uma seqüência de aminoácidoderivada de duas ou mais proteínas. A proteína de fusãotambém pode incluir regiões de ligação de aminoácidos entreporções de aminoácido derivadas de proteínas separadas.

Como usado aqui, um "polipeptídeo não RAGE" équalquer polipeptídeo que não é derivado de RAGE ou umfragmento deste. Tais polipeptídeos não RAGE incluempeptídeos de imunoglobulina, polipeptídeos de dimerização,polipeptídeos de estabilização, peptídeos anfifílicos, oupolipeptídeos compreendendo seqüências de aminoácido quefornecem "marcadores" para marcação ou purificação daproteína.

Como usado aqui, "peptídeos de imunoglobulina"podem compreender uma cadeia pesada de imunoglobulina ou umaporção desta. Em uma forma de realização, a porção da cadeiapesada pode ser o fragmento Fc ou uma porção deste. Comousado aqui, o fragmento Fc compreende o polipeptídeo dearticulação de cadeia pesada, e os domínios CH2 e CH3 dacadeia pesada de uma imunoglobulina, na forma monomérica oudimérica. Ou, o ChI e o fragmento Fc podem ser usados como opolipeptídeo da imunoglobulina. A cadeia pesada (ou porçãodesta) pode ser derivada de qualquer um dos isotipos decadeia pesada conhecidos: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE(α) , ou IgA (α) . Além disso, a cadeia pesada (ou porçãodesta) pode ser derivada de qualquer um dos subtipos decadeia pesada conhecidos: IgGl (γΐ) , IgG2 (γ2) , IgG3 (γ3),IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2 (α2), ou mutações destes isotiposou subtipos que alteram a atividade biológica. Um exemplo deatividade biológica que pode ser alterada inclui redução deuma capacidade do isotipo para ligar a alguns receptores Fccomo por exemplo, por modificação da região de articulação.

Os termos "identidade" ou "porcentagem idêntica"referem-se à identidade da seqüência entre duas seqüênciasde aminoácido ou entre duas seqüências de ácido nucléico. Aporcentagem de identidade pode ser determinada alinhando-seduas seqüências e refere-se ao número de resíduos idênticos(isto é, aminoácido ou nucleotídeo) nas posiçõescompartilhadas pelas seqüências comparadas. 0 alinhamento ecomparação da seqüência podem ser conduzidos usando osalgorítimos padrão na técnica (por exemplo, Smith andWaterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2 : 482; Needleman andWunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48 : 443; Pearson and Lipman,1988, Proc. Natl. Acad. Sci., USAr 85:2444) ou por versõescomputadorizadas destes algorítimos (Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575Science Drive, Madison, WI) publicamente disponíveis comoBLAST e FASTA. Também, ENTREZ, disponível através doNational Institutes of Health, Bethesda MD, pode ser usadopara comparação de seqüência. Em uma forma de realização, aporcentagem de identidade de duas seqüências pode serdeterminada usando GCG com um peso de intervalo de 1, talque cada intervalo de aminoácido é pesado como se ele fosseuma ligação imperfeita de aminoácido único entre as duasseqüências.Como usado aqui, o termo "resíduos conservados"refere-se a aminoácidos que são os mesmos entre umapluralidade de proteínas tendo a mesma estrutura e/oufunção. Uma região de resíduos conservados pode serimportante para a estrutura ou função da proteína. Assim,resíduos conservados contíguos conforme identificados em umaproteína tridimensional podem ser importantes para aestrutura ou função da proteína. Para encontrar resíduosconservados, ou regiões conservadas da estrutura 3-D, umacomparação de seqüências para as mesmas ou proteínassimilares de espécies diferentes, ou de indivíduos da mesmaespécie, pode ser feita.

Como usado aqui, o termo "homólogo" significa umpolipeptídeo tendo um grau de homologia com a seqüência deaminoácido do tipo selvagem. Comparações de homologia podemser conduzidas a olho nu, ou mais usualmente, com o auxíliode programas de comparação de seqüência prontamentedisponíveis. Estes programas de computador comercialmentedisponíveis podem calcular a porcentagem de homologia entreduas ou mais seqüências (por exemplo, Wilbur, W. J. andLipman, D. J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:726-730). Por exemplo, seqüências homólogas podem ser tomadaspara incluir seqüências de aminoácido que nas formas derealização alternadas são pelo menos 70 % idênticas, 75 %idênticas, 80 % idênticas, 85 % idênticas, 90 % idênticas,95 % idênticas, 97 % idênticas, ou 98 % idênticas, ou 99 %idênticas entre si.

Como usado aqui, o termo pelo menos 90 % idênticaa estas inclui seqüências que variam de 90 a 99,99 % deidentidade para as seqüências indicadas e inclui todas asfaixas no meio. Assim, o termo pelo menos 90 % idêntica aestas inclui seqüências que têm 91, 91, 5, 92, 92, 5, 93,93,5, 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99,99,5 de porcentagem idêntica para a seqüência indicada.Similarmente o termo "pelo menos 7 0 % idêntica" incluiseqüências que variam de 70 a 99,99 % idêntica, com todas asfaixas no meio. A determinação da identidade da porcentagemé determinada usando os algoritimos descritos aqui.

Como usado aqui, um "domínio" de polipeptídeo ouproteína compreende uma região ao longo de um polipeptídeoou proteína que compreende uma unidade independente. Osdomínios podem ser definidos em termos de estrutura,seqüência e/ou atividade biológica. Em uma forma derealização, um domínio de polipeptídeo pode compreender umaregião de uma proteína que dobra em uma maneira que ésubstancialmente independente do restante da proteína. Osdomínios podem ser identificados usando bases de dados dedomínio tais como, mas não limitadas a PFAM, PR0D0M,PROSITE, BLOCKS, PRINTS, SBASE, ISREC PERFILES, SAMRT, ePROCLASS.

Como usado aqui, "domínio da imunoglobulina" é umaseqüência de aminoácidos que é estruturalmente homóloga, ouidêntica a um domínio de uma imunoglobulina. 0 comprimentoda seqüência de aminoácidos de um domínio da imunoglobulinapode ser qualquer comprimento. Em uma forma de realização,um domínio da imunoglobulina pode ser menor do que 250aminoácidos. Em uma forma de realização de exemplo, umdomínio da imunoglobulina pode ter cerca de 80 a 150aminoácidos de comprimento. Por exemplo, a região variável,e as regiões ChI, CH2, e CH3 de uma IgG são cada uma domíniosda imunoglobulina. Em um outro exemplo, a variável, asregiões ChI, CH2, CH3 e CH4 de uma IgM são cada uma domíniosda imunoglobulina.

Como usado aqui, um "domínio da imunoglobulina doRAGE" é uma seqüência de aminoácidos da proteína do RAGE queé estruturalmente homóloga, ou idêntica a um domínio de umaimunoglobulina. Por exemplo, um domínio da imunoglobulina doRAGE pode compreender o domínio V do RAGE, o domínio do tipo1 de C2 semelhante à Ig do RAGE ("domínio Cl"), ou o domíniodo tipo 2 de C2 semelhante à Ig do RAGE ("domínio C2").

Como usado aqui, um "ligador de interdomínio"compreende um polipeptídeo que une dois domínios. Uma regiãode articulação de Fc é um exemplo de um ligador deinterdomínio em uma IgG.

Como usado aqui, "diretamente ligado" identificauma ligação covalente entre dois grupos diferentes (porexemplo, seqüências de ácido nucléico, polipeptídeos,domínios de polipeptídeo) que não têm quaisquer átomos deintervenção entre os dois grupos que estão sendo ligados.

Como usado aqui, "domínio de união do ligante"refere-se a um domínio de uma proteína responsável pelaligação de um ligante. 0 termo domínio de união do liganteinclui homológos de um domínio de união do ligante ouporções deste. Sob este aspecto, substituições de aminoácidodeliberadas podem ser feitas no sitio de ligação do ligantecom base na similaridade da polaridade, carga, solubilidade,hidrofobicidade, ou hidrofilicidade dos resíduos, contantoque a especificidade de ligação do domínio de união doligante seja retida.

Como usado aqui, um "sítio de ligação do ligante"compreende resíduos em uma proteína que interage diretamentecom um ligante, ou resíduos envolvidos no posicionamento doligante em proximidade àqueles resíduos que interagemdiretamente com o ligante. A interação de resíduos no sítiode ligação do ligante pode ser definida pela proximidadeespacial dos resíduos a um ligante no modelo ou estrutura. Otermo sítio de ligação do ligante inclui homológos de umsítio de ligação do ligante, ou porções deste. Sob esteaspecto, substituições de aminoácido deliberadas podem serfeitas no sítio de ligação do ligante com base nasimilaridade da polaridade, carga, solubilidade,hidrofobicidade, ou hidrofilicidade dos resíduos, contantoque a especificidade de ligação do sítio de ligação doligante seja retida. Um sítio de ligação do ligante podeexistir em um ou mais domínios de união do ligante de umaproteína ou polipeptídeo.

Como usado aqui, o termo "interage" refere-se auma condição de proximidade entre um ligante ou composto, ouporções ou fragmentos destes, e uma porção de uma segundamolécula de interesse. A interação pode ser não covalente,por exemplo, como um resultado de união do hidrogênio,interações de van der Waals, ou interações eletrostáticas ouhidrófobas, ou ela pode ser covalente.

Como usado aqui, um "ligante" refere-se a umamolécula ou composto ou entidade que interage com um sitiode ligação do ligante, incluindo substratos ou análogos oupartes destes. Como descrito aqui, o termo "ligante" podereferir-se a compostos que ligam à proteína de interesse. Umligante pode ser um agonista, um antagonista, ou ummodulador. Ou, um ligante pode não ter um efeito biológico.Ou, um ligante pode bloquear a ligação de outros ligantesdesse modo inibindo um efeito biológico. Ligantes podemincluir, mas não são limitados a, inibidores de moléculapequena. Estas moléculas pequenas podem incluir peptideos,peptidomiméticos, compostos orgânicos e semelhantes.Ligantes também podem incluir polipeptídeos e/ou proteínas.

Como usado aqui, um "composto modulador" refere-sea uma molécula que modifica ou altera a atividade biológicade uma molécula de interesse. Um composto modulador podeaumentar ou diminuir a atividade, ou mudar ascaracterísticas físicas ou químicas, ou propriedadesfuncionais ou imunológicas da molécula de interesse. ParaRAGE, um composto modulador pode aumentar ou diminuir aatividade, ou mudar as características, ou propriedadesfuncionais ou imunológicas do RAGE, ou uma porção deste. Umcomposto modulador pode incluir peptideos naturais e/ouquimicamente sintetizados ou artificiais, peptideosmodificados (por exemplo, fosfopeptídeos), anticorpos,carboidratos, monossacarídeos, oligossacarídeos,polissacarídeos, glicolipídeos, compostos heterocíclicos,nucleosideos ou nucleotídeos ou partes destes, e moléculasorgânicas ou inorgânicas pequenas. Um composto moduladorpode ser um composto fisiológico endógeno ou ele pode ser umcomposto natural ou sintético. Ou, o composto modulador podeser uma molécula orgânica pequena. 0 termo "compostomodulador" também inclui um ligante ou composto quimicamentemodificado, e inclui formas isômeras e racêmicas.

Um "agonista" compreende um composto que liga a umreceptor para formar um complexo que produz uma respostafarmacológica especifica para o receptor envolvido.

Um "antagonista" compreende um composto que liga aum agonista ou a um receptor para formar um complexo que nãodá origem a uma resposta farmacológica substancial e podeinibir a resposta biológica induzida por um agonista.

Os agonistas do RAGE podem portanto, ligar-se aoRAGE e estimular os processos celulares mediados por RAGE, eos antagonistas do RAGE podem inibir processos mediados porRAGE de serem estimulados por um agonista do RAGE. Porexemplo, em uma forma de realização, o processo celularestimulado por agonistas do RAGE compreende a ativação datranscrição gênica de TNF-a.

O termo "miméticos de peptideo" refere-se àsestruturas que servem como substitutos para peptideos eminterações entre moléculas (Morgan et al., 1989, Ann.Reports Med. Chem., 24:243- 252). Os miméticos de peptideopodem incluir estruturas sintéticas que podem ou não conterligações de aminoácidos e/ou peptidicas mas que retêm ascaracterísticas estruturais e funcionais de um peptideo, ouagonista, ou antagonista. Os miméticos de peptídeo tambémincluem peptóides, oligopeptóides (Simon et al., 1972, Proc.Natl. Acadr Sci., USA, 89:9367); e bibliotecas de peptideocontendo peptideos de um comprimento designado representandotodas as seqüências possíveis de aminoácidos correspondendoa um peptídeo, ou agonista ou antagonista da invenção.

0 termo "tratamento" ou "tratar" refere-se àmelhora de um sintoma de uma doença ou distúrbio e podecompreender a cura do distúrbio, substancialmente prevenindoo princípio do distúrbio, ou melhorando a condição dopaciente. 0 termo "tratamento" como usado aqui, refere-se aoamplo espectro de tratamentos para um distúrbio fornecido doqual o paciente está sofrendo, incluindo aliviar um sintomaou a maioria dos sintomas resultantes daquele distúrbio, umacura para o distúrbio particular, ou prevenção do princípiodo distúrbio.

Como usado aqui, o termo "EC50" é definido como aconcentração de um agente que resulta em 50 % de um efeitobiológico medido. Por exemplo, a EC50 de um agenteterapêutico tendo um efeito biológico mensurável podecompreender o valor em que o agente exibe 50 % do efeitobiológico.

Como usado aqui, o termo "IC50" é definido como aconcentração de um agente que resulta em 50 % de inibição deum efeito medido. Por exemplo, a IC50 de um antagonista daligação do RAGE pode compreender o valor em que oantagonista reduz a união do ligante ao sítio de ligação doligante do RAGE em 50 %.Como usado aqui, uma "quantidade eficaz" significaa quantidade de um agente que é eficaz para produzir umefeito desejado em um paciente. 0 termo "quantidadeterapeuticamente eficaz" denota que a quantidade de ummedicamento ou agente farmacêutico que evocará respostaterapêutica de um animal ou ser humano está sendo buscada. Adose real que compreende a quantidade eficaz pode dependerda via de administração, do tamanho e saúde do paciente, dodistúrbio sendo tratado, e semelhantes.

O termo "carregador farmaceuticamente aceitável"como usado aqui pode referir-se a compostos e composiçõesque são adequados para o uso em pacientes humanos ouanimais, como por exemplo, para composições terapêuticasadministradas para o tratamento de um distúrbio ou doençamediados por RAGE.

O termo "composição farmacêutica" é usado aquipara denotar uma composição que pode ser administrada a umhospedeiro mamífero, por exemplo, oral, parenteral,topicamente, por inalação, pulverização, intranasal ouretalmente, em formulações de dosagem unitária contendocarregadores não tóxicos convencionais, diluentes,adjuvantes, veículos e semelhantes.

O termo "parenteral" como usado aqui, incluiinjeções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, injeçãointracisternal, ou técnicas de infusão.

Como usado aqui "rejeição" refere-se à respostaimune ou inflamatória no tecido que leva à destruição decélulas, tecidos ou órgãos, ou que leva ao dano de células,tecidos, ou órgãos. As células, tecido, ou órgão rejeitadospodem ser derivados do mesmo paciente que está enquadrandona resposta à rejeição, ou podem ser transplantados de umpaciente diferente no paciente que está apresentadorejeição.

Como usado aqui, o termo "célula" refere-se àsunidades estruturais e funcionais de um sistema de vida domamífero das quais cada uma compreende um sistema de vidaindependente. Como é conhecido na técnica, células incluemum núcleo, citoplasma, organelas intracelulares, e umaparede celular que circunda a célula e permite que a célulaseja independente de outras células.

Como usado aqui, o termo "tecido" refere-se a umagregado de células que têm uma estrutura e funçãosimilares, ou que trabalham juntas para realizar uma funçãoparticular. Um tecido pode incluir um coleção de célulassimilares e as substâncias intercelulares que envolvem ascélulas. Os tecidos incluem, mas não são limitados a, tecidomuscular, tecido nervoso, e osso.

Como usado aqui um "órgão" refere-se a uma unidadeestrutural e funcional completamente diferenciada em umanimal que é especializado para alguma função específica. Umórgão pode compreender um grupo de tecidos que realiza umafunção específica ou grupo de funções. Os órgãos incluem,mas não são limitados ao coração, pulmões, cérebro, olho,estômago, baço, pâncreas, rins, fígado, intestinos, pele,útero, bexiga, e osso.Proteínas de fusão do RAGE

As formas de realização da presente invençãocompreendem proteínas de fusão do RAGE, métodos de fabricartais proteínas de fusão, e métodos de uso de tais proteínasde fusão. A presente invenção pode ser incorporada em umavariedade de modos.

Por exemplo, formas de realização da presenteinvenção fornecem proteínas de fusão do RAGE compreendendoum polipeptídeo do RAGE ligado a um segundo polipeptídeo nãoRAGE. Em uma forma de realização, a proteína de fusão doRAGE pode compreender um sítio de ligação do ligante doRAGE. Em uma forma de realização, o sítio de ligação doligante compreende a maior parte do domínio N-terminal daproteína de fusão do RAGE. O sítio de ligação do ligante doRAGE pode compreender o domínio V do RAGE, ou uma porçãodeste. Em uma forma de realização, o sítio de ligação doligante do RAGE compreende SEQ ID N2: 9 ou uma seqüênciapelo menos 90 % idêntica a esta, ou SEQ ID N-: 10 ou umaseqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, ou SEQ ID N2: 47ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta.

Em uma outra forma de realização, o sítio deligação do ligante pode compreender aminoácidos 23-53 da SEQID N-. 1. Em uma outra forma de realização, o sítio deligação do ligante pode compreender aminoácidos 24-52 da SEQID N-: 1. Em uma outra forma de realização, o sítio deligação do ligante pode compreender aminoácidos 31-52 da SEQID N2: 1. Em uma outra forma de realização, o sítio deligação do ligante pode compreender aminoácidos 31-116 daSEQ ID N-: 1. Em uma outra forma de realização, o sítio deligação do ligante pode compreender aminoácidos 19-52 da SEQID N5: 1.

Em uma forma de realização, o polipeptídeo do RAGEpode ser ligado a um polipeptídeo compreendendo um domínioda imunoglobulina ou uma porção (por exemplo, um fragmentodeste) de um domínio da imunoglobulina. Em uma forma derealização, o polipeptídeo compreendendo um domínio daimunoglobulina compreende pelo menos uma porção de pelomenos um dos domínios CH2 ou CH3 de uma IgG humana.

Uma proteína ou polipeptídeo do RAGE podecompreender proteína do RAGE humano de comprimento pleno(por exemplo, SEQ ID N2: 1), ou um fragmento de RAGE humano.

Como usado aqui, um fragmento de um polipeptídeo do RAGE tempelo menos 5 aminoácidos de comprimento, pode ser maior doque 30 aminoácidos de comprimento, mas é menor do que aseqüência de aminoácido plena. Em formas de realizaçãoalternadas das proteínas, métodos e composições da presenteinvenção, o polipeptídeo do RAGE pode compreender umaseqüência que é pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95%, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica ao RAGE humano, ou umfragmento deste. Por exemplo, em uma forma de realização, opolipeptídeo do RAGE pode compreender o RAGE humano, ou umfragmento deste, com Glicina como o primeiro resíduo aoinvés de uma Metionina (ver por exemplo, Neeper et al.,(1992)). Ou, o RAGE humano pode compreender RAGE decomprimento pleno com a seqüência de sinal removida (porexemplo, SEQ ID N2: 2 ou SEQ ID N5: 3) (FIGS. IA e 1B) ouuma porção dessa seqüência de aminoácido.

As proteínas de fusão do RAGE da presente invençãotambém podem compreender RAGEs (por exemplo, SEQ ID N2: 4),um polipeptideo pelo menos 90 % idêntico ao RAGEs, ou umfragmento do RAGEs. Como usado aqui, RAGEs é a proteína doRAGE que não inclui a região da transmembrana ou a caudacitoplásmica (Park et al., Nature Med., 4:1025-1031 (1998)).Por exemplo, o polipeptideo do RAGE pode compreender RAGEshumano, ou um fragmento deste, com Glicina como o primeiroresíduo ao invés de uma Metionina (Ver por exemplo, Neeperet al., (1992)). Ou, um polipeptideo do RAGE podecompreender RAGEs humano com a seqüência de sinal removida(Ver por exemplo, SEQ ID N-: 5 ou SEQ ID N-: 6 na FIG. IC ouSEQ ID N2: 45 na FIG. 16A) ou uma porção dessa seqüência deaminoácido.

Em outras formas de realização, a proteína do RAGEpode compreender um domínio V do RAGE (Ver por exemplo, SEQID N-: 7 ou SEQ ID N2: 8 na FIG. ID (Neeper et al., (1992);Schmidt et al. (1997) ou SEQ ID N2: 46 na FIG. 16A). Ou, umaseqüência pelo menos 90 % idêntica ao domínio V do RAGE ouum fragmento deste podem ser usados.

Ou, a proteína do RAGE pode compreender umfragmento do domínio V do RAGE (por exemplo, SEQ ID N2: 9 ouSEQ ID N2: 10 na FIG. ID ou SEQ ID N2: 47 na FIG. 16A) . Emuma forma de realização a proteína do RAGE pode compreenderum sítio de ligação do ligante. Em uma forma de realização,o sítio de ligação do ligante pode compreender a SEQ ID N2:9, ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, ou SEQID Ns: 10, ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta,ou SEQ ID N2: 47, ou uma seqüência pelo menos 90 % idênticaa esta. Ainda em uma outra forma de realização, o fragmentodo RAGE é um peptideo sintético.

Assim, o polipeptideo do RAGE usado nas proteínasde fusão do RAGE da presente invenção pode compreender umfragmento do RAGE de comprimento pleno. Como é conhecido natécnica, RAGE compreende três domínios de polipeptideosemelhantes à imunoglobulina, o domínio V, e os domínios Cle C2 cada um ligado entre si por um ligador de interdomínio.O RAGE de comprimento pleno também inclui um polipeptideo detransmembrana e uma cauda citoplásmica a jusante (C-terminal) do domínio C2, e ligado ao domínio C2.

Em uma forma de realização, o polipeptideo do RAGEnão inclui quaisquer resíduos de seqüência de sinal. Aseqüência de sinal do RAGE pode compreender resíduos 1-22 ouresíduos 1-23 do RAGE de comprimento pleno. Além disso, comoé conhecido na técnica, nas formas de realização onde o N-terminal da proteína de fusão é glutamina, (por exemplo, aseqüência de sinal compreende resíduos 1-23), a glutamina N-terminal (Q24) pode ciclizar para formar ácido piroglutâmico(pE). Construções de exemplo de tais moléculas são mostradascomo SEQ ID N^: 45, 46, 47, 48, 49, 50, e 51, assim comoproteínas de fusão do RAGE mostradas como 56 e 57.

Como reconhecido na técnica, a região CH3 daproteína de fusão do RAGE da presente invenção pode ter seuaminoácido C-terminal separado por clivagem através de umamodificação pós tradução quando expressado em certossistemas recombinantes. (Ver por exemplo, Li, et al.,BioProcessing J. 2005;4, 23-30). Em uma forma de realização,o aminoácido C-terminal separado por clivagem é lisina (K).

Assim, em várias formas de realização, opolipeptideo do RAGE pode compreender aminoácidos 23-116 doRAGE humano (SEQ ID Ns: 7) ou uma seqüência pelo menos 90 %idêntica a esta, ou aminoácidos 24-116 do RAGE humano (SEQID N-: 8) ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta,ou aminoácidos 24-116 do RAGE humano onde Q24 cicliza paraformar pE (SEQ ID N-: 46) ou uma seqüência pelo menos 90 %idêntica a esta, correspondendo ao domínio V do RAGE. Ou, opolipeptideo do RAGE pode compreender aminoácidos 124-221 doRAGE humano (SEQ ID N-: 11) ou uma seqüência pelo menos 90 %idêntica a esta, correspondendo ao domínio Cl do RAGE. Emuma outra forma de realização, o polipeptideo do RAGE podecompreender aminoácidos 227-317 do RAGE humano (SEQ ID N5:12) ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta,correspondendo ao domínio C2 do RAGE. Ou, o polipeptideo doRAGE pode compreender aminoácidos 23-123 do RAGE humano (SEQID N2: 13) ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta,ou aminoácidos 24-123 do RAGE humano (SEQ ID N2: 14) ou umaseqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, correspondendo aodomínio V do RAGE e um ligador de interdomínio a jusante.Ou, o polipeptideo do RAGE pode compreender aminoácidos 24-123 do RAGE humano onde Q24 cicliza para formar pE (SEQ IDN2: 48) ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta.Ou, o polipeptideo do RAGE pode compreender aminoácidos 23-226 do RAGE humano (SEQ ID N2: 17) ou uma seqüência pelomenos 90 % idêntica a esta, ou aminoácidos 24-226 do RAGEhumano (SEQ ID N2: 18) ou uma seqüência pelo menos 90 %idêntica a esta, correspondendo ao domínio V, o domínio Cl eo ligador de interdomínio ligando estes dois domínios. Ou, opolipeptídeo do RAGE pode compreender aminoácidos 24-226 doRAGE humano onde Q24 cicliza para formar pE (SEQ ID N2: 50),ou uma seqüência 90 % idêntica a esta. Ou, o polipeptídeo doRAGE pode compreender aminoácidos 23-339 do RAGE humano (SEQID N2: 5) ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta,ou 24-339 do RAGE humano (SEQ ID N2: 6) ou uma seqüênciapelo menos 90 % idêntica a esta, correspondendo ao RAGEs(isto é, codificando os domínios V, Cl, e C2 e ligadores deinterdomínio). Ou, o polipeptídeo do RAGE pode compreenderaminoácidos 24-339 do RAGE humano onde Q24 cicliza paraformar pE (SEQ ID N2: 45) ou uma seqüência pelo menos 90 %idêntica a esta. Ou, fragmentos de cada uma destasseqüências podem ser usados.

A proteína de fusão do RAGE pode incluir váriostipos de peptídeos que não são derivados do RAGE ou umfragmento deste. 0 segundo polipeptídeo da proteína de fusãodo RAGE pode compreender um polipeptídeo derivado de umaimunoglobulina. Em uma forma de realização, o polipeptídeoda imunoglobulina pode compreender uma cadeia pesada deimunoglobulina ou uma porção (isto é, fragmento) desta. Porexemplo, o fragmento da cadeia pesada pode compreender umpolipeptídeo derivado do fragmento Fc de uma imunoglobulina,em que o fragmento Fc compreende o polipeptídeo dearticulação de cadeia pesada, e os domínios CH2 e CH3 dacadeia pesada de imunoglobulina como um monômero. A cadeiapesada (ou porção desta) pode ser derivada de qualquer umdos isotipos de cadeia pesada conhecidos: IgG (γ), IgM (μ),IgD (δ) , IgE (ε) , OU IgA (α) . Além disso, a cadeia pesada(ou porção desta) pode ser derivada de qualquer um dossubtipos de cadeia pesada conhecidos: IgGl (γΐ) , IgG2 (γ2),IgG3 (γ3) , IgG4 (γ4), IgAl (αϊ), IgA2 (α2), ou mutaçõesdestes isotipos ou subtipos que alteram a atividadebiológica. O segundo polipeptídeo pode compreender osdomínios CH2 e CH3 de uma IgGl humana ou porções de qualquerum ou ambos estes domínios. Como formas de realização deexemplo, o polipeptídeo compreendendo os domínios CH2 e CH3de uma IgGl humana ou uma porção desta pode compreender aSEQ ID N-: 38 ou SEQ ID N2: 40. 0 peptídeo da imunoglobulinapode ser codificado pela seqüência de ácido nucléico da SEQID N-: 39 ou SEQ ID N-: 41. A seqüência da imunoglobulina naSEQ ID N2: 38 ou SEQ ID N2: 40 também pode ser codificadapela SEQ ID N-: 52 ou SEQ ID N-: 53, onde mutações de basesilenciosas para os códons que codificam para prolina (CCGpara CCC) e glicina (GGT para GGG) no C-terminal daseqüência removem um sítio de união de RNA críptico próximoao códon terminal.

A porção Fc da cadeia da imunoglobulina pode serpró-inflamatória in vivo. Assim, em uma forma de realização,a proteína de fusão do RAGE da presente invenção compreendeum ligador de interdomínio derivado do RAGE ao invés de umpolipeptídeo de articulação de interdomínio derivado de umaimunoglobulina.Assim, em uma forma de realização, a proteína defusão do RAGE pode compreender um polipeptídeo do RAGEdiretamente ligado a um polipeptídeo compreendendo umdomínio CH2 de uma imunoglobulina, ou um fragmento ou porçãodo domínio CH2 de uma imunoglobulina. Em uma forma derealização, o domínio CH2, ou um fragmento deste compreendea SEQ ID N-: 42. Em uma forma de realização, o fragmento daSEQ ID N2: 42 compreende a SEQ ID N-: 42 com os dezprimeiros aminoácidos removidos. Em uma forma de realização,o polipeptídeo do RAGE pode compreender um sítio de ligaçãodo ligante. O sítio de ligação do ligante do RAGE podecompreender o domínio V do RAGE, ou uma porção deste. Em umaforma de realização, o sítio de ligação do ligante do RAGEcompreende a SEQ ID N2: 9 ou uma seqüência pelo menos 90 %idêntica a esta, ou SEQ ID N2: 10 ou uma seqüência pelomenos 90 % idêntica a esta, ou SEQ ID N2: 47, ou umaseqüência pelo menos 90 % idêntica a esta.

O polipeptídeo do RAGE usado nas proteínas defusão do RAGE da presente invenção pode compreender umdomínio da imunoglobulina do RAGE. Adicional oualternativamente, o fragmento do RAGE pode compreender umligador de interdomínio. Ou, o polipeptídeo do RAGE podecompreender um domínio da imunoglobulina do RAGE ligado a umligador de interdomínio a montante (isto é, mais próximo aoN-terminal) ou a jusante (isto é, mais próximo ao C-terminal). Ainda em uma outra forma de realização, opolipeptídeo do RAGE pode compreender dois (ou mais)domínios da imunoglobulina do RAGE cada um ligado entre sipor um ligador de interdominio. 0 polipeptídeo do RAGE podecompreender ainda múltiplos domínios da imunoglobulina doRAGE ligados entre si por um ou mais ligadores deinterdominio e tendo um ligador de interdominio terminalligado ao domínio da imunoglobulina do RAGE N-terminal e/ouo domínio da imunoglobulina C-terminal. Combinaçõesadicionais de domínios da imunoglobulina do RAGE e ligadoresde interdominio estão dentro do escopo da presente invenção.

Em uma forma de realização, o polipeptídeo do RAGEcompreende um ligador de interdominio do RAGE ligado a umdomínio da imunoglobulina do RAGE tal que o aminoácido C-terminal do domínio da imunoglobulina do RAGE seja ligado aoaminoácido N-terminal do ligador de interdominio, e oaminoácido C-terminal do ligador de interdominio do RAGEseja diretamente ligado ao aminoácido N-terminal de umpolipeptídeo compreendendo um domínio CH2 de umaimunoglobulina, ou um fragmento deste. O polipeptídeocompreendendo um domínio CH2 de uma imunoglobulina podecompreender os domínios CH2 e CH3 de uma IgGl humana ou umaporção de qualquer um ou ambos estes domínios. Como umaforma de realização de exemplo, o polipeptídeo compreendendoos domínios CH2 e CH3, ou uma porção destes, de uma IgGlhumana pode compreender a SEQ ID N2: 38 ou a SEQ ID N2: 40.

Como descrito acima, a proteína de fusão do RAGEda presente invenção pode compreender um domínio único oudomínios múltiplos do RAGE. Também, o polipeptídeo do RAGEcompreendendo um ligador de interdominio ligado a um domíniode polipeptídeo do RAGE pode compreender um fragmento deproteína do RAGE de comprimento pleno. Por exemplo, opolipeptídeo do RAGE pode compreender aminoácidos 23-136 doRAGE humano (SEQ ID Ns: 15) ou uma seqüência pelo menos 90 %idêntica a esta ou aminoácidos 24-136 do RAGE humano (SEQ IDN-: 16) ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, ouaminoácidos 24-136 do RAGE humano onde Q24 cicliza paraformar pE (SEQ ID N-: 49) , ou uma seqüência pelo menos 90 %idêntica a esta, correspondendo ao domínio V do RAGE e umligador de interdomínio a jusante. Ou, o polipeptídeo doRAGE pode compreender aminoácidos 23-251 do RAGE humano (SEQID N-: 19) ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta,ou aminoácidos 24-251 do RAGE humano (SEQ ID N2: 20) ou umaseqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, ou aminoácidos24-251do RAGE humano onde Q24 cicliza para formar pE (SEQ IDN-: 51), ou uma seqüência pelo menos 90 %. idêntica a esta,correspondendo ao domínio V, ao domínio Cl, ao ligador deinterdomínio ligando estes dois domínios, e um segundoligador de interdomínio a jusante de Cl.

Por exemplo, em uma forma de realização, aproteína de fusão do RAGE pode compreender dois domínios daimunoglobulina derivados da proteína do RAGE e dois domíniosda imunoglobulina derivados de um polipeptídeo Fc humano. Aproteína de fusão do RAGE pode compreender um primeirodomínio da imunoglobulina do RAGE e um primeiro ligador deinterdomínio do RAGE ligado a um segundo domínio daimunoglobulina do RAGE e um segundo ligador de interdomíniodo RAGE, tal que o aminoácido N-terminal do primeiro ligadorde interdomínio seja ligado ao aminoácido C-terminal doprimeiro domínio da imunoglobulina do RAGE, o aminoácido N-terminal do segundo domínio da imunoglobulina do RAGE sejaligado ao aminoácido C-terminal do primeiro ligador deinterdomínio, o aminoácido N-terminal do segundo ligador deinterdomínio seja ligado ao aminoácido C-terminal do segundodomínio da imunoglobulina do RAGE, e o aminoácido C-terminaldo segundo ligador de interdomínio do RAGE seja diretamenteligado ao aminoácido N-terminal do domínio CH2 daimunoglobulina. Em uma forma de realização, uma proteína defusão do RAGE de quatro domínios pode compreender SEQ ID N-:32. Nas formas de realização alternadas, uma proteína defusão do RAGE de quatro domínios compreende SEQ ID N-: 33,SEQ ID NO: 34, ou SEQ ID N2: 56.

Alternativamente, uma proteína de fusão do RAGE detrês domínios pode compreender um domínio da imunoglobulinaderivado do RAGE e dois domínios da imunoglobulina derivadosde um polipeptídeo de Fc humano. Por exemplo, a proteína defusão do RAGE pode compreender um domínio da imunoglobulinado RAGE único ligado por intermédio de um ligador deinterdomínio do RAGE ao aminoácido N-terminal de um domínioCh2 da imunoglobulina ou uma porção de um domínio CH2 daimunoglobulina. Em uma forma de realização, uma proteína defusão do RAGE de três domínios pode compreender SEQ ID N2:

35. Nas formas de realização alternadas, uma proteína defusão do RAGE de três domínios pode compreender SEQ ID N2:36, SEQ ID N2: 37, ou SEQ ID N2: 57.

Um fragmento do ligador de interdomínio do RAGEpode compreender uma seqüência de peptídeo que estánaturalmente a jusante de, e assim, ligada a, um domínio daimunoglobulina do RAGE. Por exemplo, para o domínio V doRAGE, o ligador de interdomínio pode compreender seqüênciasde aminoácido que estão naturalmente a jusante do domínio V.Em uma forma de realização, o ligador pode compreender SEQID N-: 21, correspondendo aos aminoácidos 117-123 do RAGE decomprimento pleno. Ou, o ligador pode compreender umpeptídeo tendo porções adicionais da seqüência natural doRAGE. Por exemplo, um ligador de interdomínio compreendendovários aminoácidos (por exemplo, 1-3, 1-5, ou 1-10, ou 1-15aminoácidos) a montante e a jusante da SEQ ID N2: 21 podeser usado. Assim, em uma forma de realização, o ligador deinterdomínio compreende SEQ ID N2: 23 compreendendoaminoácidos 117-136 do RAGE de comprimento pleno. Ou,fragmentos da SEQ ID N2: 21 deletando, por exemplo, 1, 2, ou3, aminoácidos de qualquer uma extremidade do ligador podemser usados. Nas formas de realização alternadas, o ligadorpode compreender um peptídeo que é pelo menos 70 % idêntico,75 % idêntico, 80 % idêntico, 85 % idêntico, 90 % idêntico,95 % idêntico, 97 % idêntico, 98 % idêntico, ou 99 %idêntico à SEQ ID N-: 21 ou SEQ ID N2: 23.

Para o domínio Cl do RAGE, o ligador podecompreender seqüência de peptídeo que está naturalmente ajusante do domínio Cl. Em uma forma de realização, o ligadorpode compreender SEQ ID N2: 22, correspondendo aosaminoácidos 222-251 do RAGE de comprimento pleno. Ou, oligador pode compreender um peptídeo tendo porçõesadicionais da seqüência natural do RAGE. Por exemplo, umligador compreendendo vários (1-3, 1-5, ou 1-10, ou 1-15aminoácidos) aminoácidos a montante e a jusante da SEQ IDN-: 22 pode ser usado. Ou, fragmentos da SEQ ID N-: 22 podemser usados, deletando por exemplo, 1-3, 1-5, ou 1-10, ou 1-15 aminoácidos de qualquer uma extremidade do ligador. Porexemplo, em uma forma de realização, um ligador deinterdominio do RAGE pode compreender SEQ ID N-: 24,correspondendo aos aminoácidos 222-226. Ou um ligador deinterdominio pode compreender SEQ ID N2: 44, correspondendoaos aminoácidos do RAGE 318-342.

Além disso, uma pessoa de habilidade reconheceráque substituições, eliminações ou adições individuais quealteram, adicionam ou deletam um aminoácido único ou umapequena porcentagem de aminoácidos (tipicamente menos do quecerca de 5 %, mais tipicamente menos do que cerca de 1 %) emuma seqüência codificada são de forma conservadora variaçõesmodificadas onde o resultado das alterações na substituiçãode um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar.Tabelas de substituição conservativ-a fornecendo aminoácidosfuncionalmente similares são bem conhecidas na técnica. Osgrupos de exemplo seguintes cada um contêm aminoácidos quesão substituições conservativas entre si:

1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucine (L), Metionina (M),Valina (V); e6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).Uma substituição conservativa é uma substituiçãoem que o aminoácido substituinte (que ocorre naturalmente oumodificado) é estruturalmente relacionado ao aminoácidosendo substituído, isto é, tem cerca do mesmo tamanho epropriedades eletrônicas como o aminoácido sendosubstituído. Assim, o aminoácido substituinte teria o mesmoou um grupo funcional similar na cadeia lateral como oaminoácido original. Uma "substituição conservativa" tambémrefere-se à utilização de um aminoácido substituinte que éidêntico ao aminoácido sendo substituído a menos que umgrupo funcional na cadeia lateral seja protegido com umgrupo de proteção adequado.

Como é conhecido na técnica, aminoácidos podemtornar-se quimicamente modificados de sua estrutura natural,por mecanismos de reação enzimáticos ou não enzimáticos. Porexemplo, em uma forma de realização, um ácido glutâmico ouglutamina N-terminal pode ciclizar, com perda de água, paraformar ácido piroglutâmico (piroE ou pE) (Chelius et al.,Anal. Chem, 78: 2370-2376 (2006) e Burstein et al, Proc.National Acad. Sci., 73:2604-2608 (1976)). Além disso, umaproteína de fusão do RAGE da SEQ ID N2: 56 podepotencialmente ser acessada através de uma seqüência deácido nucléico codificando para ácido glutâmico no resíduo24 ao invés de uma glutamina no resíduo 24 (com base nanumeração do RAGE de comprimento pleno).

Métodos de Produzir Proteínas de Fusão do RAGEA presente invenção também compreende um métodopara fabricar uma proteína de fusão do RAGE. Assim, em umaforma de realização, a presente invenção compreende ummétodo de fabricar uma proteína de fusão do RAGEcompreendendo a etapa de covalentemente ligar umpolipeptídeo do RAGE ligado a um segundo, polipeptídeo nãoRAGE em que o polipeptídeo do RAGE compreende um sítio deligação do ligante do RAGE. Por exemplo, o polipeptídeo doRAGE ligado e o segundo, polipeptídeo não RAGE podem sercodificados por uma construção de DNA recombinante. 0 métodopode compreender ainda a etapa da incorporação de construçãodo DNA em um vetor de expressão. Também, o método podecompreender a etapa da introdução do vetor de expressão emuma célula hospedeira.

Por exemplo, formas de realização da presenteinvenção fornecem proteínas de fusão do RAGE compreendendoum polipeptídeo do RAGE ligado a um segundo, polipeptídeonão RAGE. Em uma forma de realização, a proteína de fusão doRAGE pode compreender um sítio de ligação do ligante doRAGE. Em uma forma de realização, o sítio de ligação doligante compreende a maior parte do domínio N-terminal daproteína de fusão do RAGE. O sítio de ligação do ligante doRAGE pode compreender o domínio V do RAGE, ou uma porçãodeste. Em uma forma de realização, o sítio de ligação doligante do RAGE compreende SEQ ID N2: 9 ou uma seqüênciapelo menos 90 % idêntica a esta, ou SEQ ID N2: 10 ou umaseqüência pelo menos 90 % idêntica a esta; ou SEQ ID N2: 47,ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta.

Em uma forma de realização, o polipeptídeo do RAGEpode ser ligado a um polipeptideo compreendendo um domínioda imunoglobulina ou uma porção (por exemplo, um fragmentodesta) de um domínio da imunoglobulina. Em uma forma derealização, o polipeptideo compreendendo um domínio daimunoglobulina compreende pelo menos uma porção de pelomenos um dos domínios CH2 ou CH3 de uma IgG humana.

A proteína de fusão do RAGE pode ser engendradapor técnicas de DNA recombinante. Por exemplo, em uma formade realização, a presente invenção pode compreender umaseqüência de ácido nucléico isolada compreendendo,complementar ou ter identidade significante com umaseqüência de polinucleotídeo que codifica para umpolipeptideo do RAGE ligado a um segundo, polipeptideo nãoRAGE. Em uma forma de realização, o polipeptideo do RAGEpode compreender um sítio de ligação do ligante do RAGE.

A proteína ou polipeptideo do RAGE podecompreender RAGE humano de comprimento pleno (por exemplo,SEQ ID N-: 1), ou um fragmento do RAGE humano. Em uma formade realização, o polipeptideo do RAGE não inclui quaisquerresíduos de seqüência de sinal. A seqüência de sinal do RAGEpode compreender os resíduos 1-22 ou os resíduos 1-23 doRAGE de comprimento pleno (SEQ ID N2: 1) . Nas formas derealização alternadas, o polipeptideo do RAGE podecompreender uma seqüência que é pelo menos 70 %, 75 %, 80 %,85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica ao RAGEhumano, ou um fragmento desta. Por exemplo, em uma forma derealização, o polipeptideo do RAGE pode compreender RAGEhumano, ou um fragmento deste, com Glicina como o primeiroresíduo ao invés de uma Metionina (ver por exemplo, Neeperet al., (1992)). Ou, o RAGE humano pode compreender RAGE decomprimento pleno com a seqüência de sinal removida (porexemplo, SEQ ID N2: 2 ou SEQ ID N2: 3) (FIGS. IA e 1B) ouuma porção dessa seqüência de aminoácido. As proteínas defusão do RAGE da presente invenção também podem compreenderRAGEs (por exemplo, SEQ ID N2: 4), um polipeptídeo pelomenos 90 % idêntico ao RAGEs, ou um fragmento do RAGEs. Porexemplo, o polipeptídeo do RAGE pode compreender RAGEshumano, ou um fragmento deste, com Glicina como o primeiroresíduo ao invés de uma Metionina (ver por exemplo, Neeperet al., (1992)). Ou, o RAGE humano pode compreender RAGEscom a seqüência de sinal removida (Ver por exemplo, SEQ IDN-: 5 ou SEQ ID N-: 6 na FIG. IC ou SEQ ID N-: 45 na FIG.16A) ou uma porção dessa seqüência de aminoácido. Em outrasformas de realização, a proteína do RAGE pode compreender umdomínio V ( Ver por exemplo, SEQ ID N2: 7 ou SEQ ID N2: 8 naFIG. ID ou SEQ ID N2: 46 na FIG. 16A) . Ou, uma seqüênciapelo menos 90 % idêntica ao domínio V ou um fragmento destapode ser usado. Ou, a proteína do RAGE pode compreender umfragmento do RAGE compreendendo uma porção do domínio V (Verpor exemplo, SEQ ID N2: 9 ou SEQ ID N2: 10 na FIG. ID ou SEQID N2: 47 na FIG. 16A) . Em uma forma de realização, o sítiode ligação do ligante pode compreender SEQ ID N2: 9, ou umaseqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, ou SEQ ID N2: 10,ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, ou SEQ IDN2: 47, ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta.Ainda em uma outra forma de realização, o fragmento do RAGEé um peptídeo sintético.

Em uma forma de realização, a seqüência de ácidonucléico compreende SEQ ID N2: 25 para codificar aminoácidos1-118 do RAGE humano ou um fragmento deste. Por exemplo, umaseqüência compreendendo nucleotideos 1-348 da SEQ ID N-: 25podem ser usadas para codificar aminoácidos 1-116 do RAGEhumano. Ou, o ácido nucléico pode compreender SEQ ID N2: 26para codificar aminoácidos 1-123 do RAGE humano. Ou, o ácidonucléico pode compreender SEQ ID N-: 27 para codificaraminoácidos 1-136 do RAGE humano. Ou, o ácido nucléico podecompreender SEQ ID N-: 28 para codificar aminoácidos 1-230do RAGE humano. Ou, o ácido nucléico pode compreender SEQ IDN-: 29 para codificar aminoácidos 1-251 do RAGE humano. Oufragmentos destas seqüências de ácido nucléico podem serusados para codificar fragmentos de polipeptideo do RAGE.

A proteína de fusão do RAGE pode incluir váriostipos de peptídeos que não são derivados do RAGE ou umfragmento deste. 0 segundo polipeptideo da proteína de fusãodo RAGE pode compreender um polipeptideo derivado de umaimunoglobulina. A cadeia pesada (ou porção desta) pode serderivada de qualquer um dos isotipos de cadeia pesadaconhecidos: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε), ou IgA (α).Além disso, a cadeia pesada (ou porção desta) pode serderivada de qualquer um dos subtipos de cadeia pesadaconhecidos: IgGl (γ1) , IgG2 (γ2), IgG3 (γ3) , IgG4 (γ4), IgA,(α1), IgA2 (α2), ou mutações destes isotipos ou subtipos quealteram a atividade biológica. O segundo polipeptideo podecompreender os domínios CH2 e CH3 de uma IgGl humana ou umaporção de qualquer um ou ambos estes domínios. Como formasde realização de exemplo, o polipeptídeo compreendendo osdomínios CH2 e CH3 de uma IgGl humana ou uma porção destepode compreender SEQ ID N2: 38 ou SEQ ID N2: 40. O peptídeoda imunoglobulina pode ser codificado pela seqüência deácido nucléico da SEQ ID N2: 39 ou SEQ ID N2: 41. Nas formasde realização alternadas, a seqüência da imunoglobulina naSEQ ID N-: 38 ou na SEQ ID N2: 40 também pode ser codificadapela SEQ ID N2: 52 ou SEQ ID N2: 53, respectivamente.

A porção Fc da cadeia da imunoglobulina pode serpró-inflamatória in vivo. Assim, a proteína de fusão do RAGEda presente invenção pode compreender um ligador deinterdomínio derivado do RAGE ao invés de um polipeptideo.dearticulação de interdomínio derivado de uma imunoglobulina.Por exemplo, em uma forma de realização, a proteína de fusãodo RAGE pode ser codificada por uma construção de DNArecombinante. Também, o método pode compreender a etapa daincorporação da construção de DNA em um vetor de expressão.Também, o método pode compreender a transferência do vetorde expressão em uma célula hospedeira.

Assim, em uma forma de realização, a presenteinvenção compreende um método de fabricar uma proteína defusão do RAGE compreendendo a etapa de covalentemente ligarum polipeptídeo do RAGE a um polipeptídeo compreendendo umdomínio CH2 de uma imunoglobulina ou uma porção de umdomínio CH2 de uma ' imunoglobulina. Em uma forma derealização, a proteína de fusão do RAGE pode compreender umsítio de ligação do ligante do RAGE. 0 sítio de ligação doligante do RAGE pode compreender o domínio V do RAGE, ou umaporção deste. Em uma forma de realização, o sítio de ligaçãodo ligante do RAGE compreende SEQ ID N2: 9 ou uma seqüênciapelo menos 90 % idêntica a esta, ou SEQ ID N-: 10 ou umaseqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, ou SEQ ID N2: 47,ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta.

Por exemplo, em uma forma de realização, apresente invenção compreende um ácido nucléico codificandoum polipeptídeo do RAGE diretamente ligado a um polipeptídeocompreendendo um domínio CH2 de uma imunoglobulina, ou umfragmento deste. Em uma forma de realização, o domínio CH2,ou um fragmento deste, compreende SEQ ID N2: 42. Em umaforma de realização, o fragmento da SEQ N2: 42 compreendeSEQ ID N2: 42 com os dez primeiros aminoácidos removidos. Osegundo polipeptídeo pode compreender os domínios CH2 e CH3de uma IgGl humana. Como uma forma de realização de exemplo,o polipeptídeo compreendendo os domínios CH2 e CH3 de umaigGl humana pode compreender SEQ ID N2: 38 ou SEQ ID N2: 40.0 peptídeo da imunoglobulina pode ser codificado pelaseqüência de ácido nucléico da SEQ ID N2: 39 ou SEQ ID N2:41. A seqüência da imunoglobulina na SEQ ID N2: 38 ou na SEQID N2: 40 também pode ser codificada pela SEQ ID N2: 52 ouSEQ ID N2: 53, onde mutações de base silenciosas para oscódons que codificam para prolina (CCG para CCC) e glicina(GGT para GGG) no C-terminal da seqüência removem um sítiode união de RNA críptico próximo ao códon terminal.

Em uma forma de realização, o polipeptídeo do RAGEpode compreender um ligador de interdomínio do RAGE ligado aum domínio da imunoglobulina do RAGE tal que o aminoácido C-terminal do domínio da imunoglobulina do RAGE é ligado aoaminoácido N-terminal do ligador de interdomínio, e oaminoácido C-terminal do ligador de interdomínio do RAGE édiretamente ligado ao aminoácido N-terminal de umpolipeptídeo compreendendo um domínio CH2 de umaimunoglobulina, ou um fragmento deste. 0 polipeptídeocompreendendo um domínio CH2 de uma imunoglobulina, ou umporção deste, pode compreender um polipeptídeo compreendendoos domínios CH2 e CH3 de uma IgGl humana ou uma porção dequalquer um ou ambos estes domínios. Como uma forma derealização de exemplo, o polipeptídeo compreendendo osdomínios CH2 e CH3 de uma IgGl humana, ou uma porção destes,pode compreender SEQ ID N2: 38 ou SEQ ID N-: 40.

A proteína de fusão do RAGE da presente invençãopode compreender um domínio único ou domínios múltiplos doRAGE. Também, o polipeptídeo do RAGE compreendendo umligador de interdomínio ligado a um domínio daimunoglobulina do RAGE pode compreender um fragmento de umproteína do RAGE de comprimento pleno. Por exemplo, em umaforma de realização, a proteína de fusão do RAGE podecompreender dois domínios da imunoglobulina derivados daproteína do RAGE e dois domínios da imunoglobulina derivadosde um polipeptídeo Fc humano. A proteína de fusão do RAGEpode compreender um primeiro domínio da imunoglobulina doRAGE e um primeiro ligador de interdomínio ligado a umsegundo domínio da imunoglobulina do RAGE e um segundoligador de interdomínio do RAGE, tal que o aminoácido N-terminal do primeiro ligador de interdominio é ligado aoaminoácido C-terminal do primeiro domínio da imunoglobulinado RAGE, o aminoácido N-terminal do segundo domínio daimunoglobulina do RAGE é ligado ao aminoácido C-terminal doprimeiro ligador de interdominio, o aminoácido N-terminal dosegundo ligador de interdominio é ligado ao aminoácido C-terminal do segundo domínio da imunoglobulina do RAGE, e oaminoácido C-terminal do segundo ligador de interdominio doRAGE é diretamente ligado ao aminoácido N-terminal dopolipeptídeo compreendendo um domínio da imunoglobulina CH2ou fragmento deste. Por exemplo, o polipeptídeo do RAGE podecompreender aminoácidos 23-251 do RAGE humano (SEQ ID N-:19) ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, ouaminoácidos 24-251 do RAGE humano (SEQ ID N2: 20) ou umaseqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, ou aminoácidos24-251 do RAGE humano onde Q24 cicliza para formar pE (SEQID N2: 51) ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta,correspondendo ao domínio V, ao domínio Cl, ao ligador deinterdominio ligando estes dois domínios, e um segundoligador de interdominio a jusante de Cl. Em uma forma derealização, uma construção de ácido nucléico compreendendoSEQ ID N-: 30 ou um fragmento desta pode codificar para umaproteína de fusão do RAGE de quatro domínios. Em uma outraforma de realização, a construção de ácido nucléicocompreendendo SEQ ID N2: 54 pode codificar para uma proteínade fusão do RAGE de quatro domínios, onde mutações de basesilenciosas para os códons que codificam para prolina (CCGpara CCC) e glicina (GGT para GGG) no C-terminal daseqüência são penetradas para remover um sítio de união deRNA criptico próximo ao códon terminal.

Alternativamente, uma proteína de fusão do RAGE detrês domínios pode compreender um domínio da imunoglobulinaderivado do RAGE e dois domínios da imunoglobulina derivadosde um polipeptídeo Fc humano. Por exemplo, a proteína defusão do RAGE pode compreender um domínio da imunoglobulinado RAGE único ligado por intermédio de um ligador deinterdomínio do RAGE ao aminoácido N-terminal dopolipeptídeo compreendendo um domínio da imunoglobulina CH2ou um fragmento deste. Por exemplo, o polipeptídeo do RAGEpode compreender aminoácidos 23-136 do RAGE humano (SEQ IDN-: 15) ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta ouaminoácidos 24-136 do RAGE humano (SEQ ID N-: 16) ou umaseqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, ou aminoácidos24-136 do RAGE humano onde Q24 cicliza para formar pE (SEQID N-: 49) ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta,correspondendo ao domínio V do RAGE e um ligador deinterdomínio a jusante. Em uma forma de realização, umaconstrução de ácido nucléico compreendendo SEQ ID N-: 31 ouum fragmento desta pode codificar para uma proteína de fusãodo RAGE de três domínios. Em uma outra forma de realização,a construção de ácido nucléico compreendendo SEQ ID N2: 55pode codificar para uma proteína de fusão do RAGE de trêsdomínios, onde mutações de base silenciosas para os códonsque codificam para prolina (CCG para CCC) e glicina (GGTpara GGG) no C-terminal da seqüência removem um sítio deunião de RNA criptico próximo ao códon terminal.Um fragmento do ligador de interdomínio do RAGEpode compreender uma seqüência de peptídeo que estánaturalmente a jusante de, e assim, ligada a, um domínio daimunoglobulina do RAGE. Por exemplo, para o domínio V doRAGE, o ligador de interdomínio pode compreender seqüênciasde aminoácido que estão naturalmente a jusante do domínio V.Em uma forma de realização, o ligador pode compreender SEQID N2: 21, correspondendo aos aminoácidos 117-123 do RAGE decomprimento pleno. Ou, o ligador pode compreender umpeptídeo tendo porções adicionais da seqüência natural doRAGE. Por exemplo, um ligador de interdomínio compreendendovários aminoácidos (por exemplo, 1-3, 1-5, ou 1-10, ou 1-15aminoácidos) a montante e a jusante da SEQ ID N£: 21 podeser usado. Assim, em uma forma de realização, o ligador deinterdomínio compreende SEQ ID N-: 23 compreendendoaminoácidos 117-136 do RAGE de comprimento pleno. Ou,fragmentos da SEQ ID N-: 21 deletando, por exemplo, 1, 2, ou3, aminoácidos de qualquer uma extremidade do ligador podemser usados. Nas formas de realização alternadas, o ligadorpode compreender uma seqüência que é pelo menos 70 %idêntica, ou 80 % idêntica, ou 90 % idêntica à SEQ ID N-: 21ou à SEQ ID N-: 23.

Para o domínio Cl do RAGE, o ligador podecompreender uma seqüência de peptídeo que está naturalmentea jusante do domínio Cl. Em uma forma de realização, oligador pode compreender SEQ ID N2: 22, correspondendo aosaminoácidos 222-251 do RAGE de comprimento pleno. Ou, oligador pode compreender um peptídeo tendo porçõesadicionais da seqüência natural do RAGE. Por exemplo, umligador compreendendo vários (1-3, 1-5, ou 1-10, ou 1-15aminoácidos) aminoácidos a montante e a jusante da SEQ IDN-: 22 pode ser usado. Ou, fragmentos da SEQ ID N2: 22 podemser usados, deletando por exemplo, 1-3, 1-5, ou 1-10, ou 1-15 aminoácidos de qualquer uma extremidade do ligador. Porexemplo, em uma forma de realização, um ligador deinterdominio do RAGE pode compreender SEQ ID N2: 24,correspondendo aos aminoácidos 222-226. Ou um ligador deinterdominio pode compreender SEQ ID N-: 44, correspondendoaos aminoácidos do RAGE 318-342.

O método pode compreender ainda a etapa deincorporação da construção do DNA em um vetor de expressão.Assim, em uma forma de realização, a presente invençãocompreende um vetor de expressão que codifica para umaproteína de fusão do RAGE compreendendo um polipeptídeo doRAGE diretamente ligado a um polipeptídeo compreendendo umdomínio CH2 de uma imunoglobulina ou uma porção de umdomínio CH2 de uma imunoglobulina. Em uma forma derealização, o polipeptídeo do RAGE compreende construções,tais como aquelas descritas aqui, tendo um ligador deinterdominio do RAGE ligado a um domínio da imunoglobulinado RAGE tal que o aminoácido C-terminal do domínio daimunoglobulina do RAGE é ligado ao aminoácido N-terminal doligador de interdominio, e o aminoácido C-terminal doligador de interdominio do RAGE é diretamente ligado aoaminoácido N-terminal de um polipeptídeo compreendendo umdomínio CH2 de uma imunoglobulina, ou uma porção deste. Porexemplo, o vetor de expressão usado para transfectar ascélulas pode compreender a seqüência de ácido nucléico SEQID N2: 30, ou um fragmento desta, SEQ ID N-: 54, ou umfragmento desta, SEQ ID N-: 31, ou um fragmento desta, ouSEQ ID N-: 55, ou um fragmento desta.

O método pode compreender ainda a etapa detransfectar uma célula com o vetor de expressão da presenteinvenção. Assim, em uma forma de realização, a presenteinvenção compreende uma célula transfectada com o vetor deexpressão que expressou a proteína de fusão do RAGE dapresente invenção, tal que a célula expressa uma proteína defusão do RAGE compreendendo um polipeptídeo do RAGEdiretamente ligado a um polipeptídeo compreendendo umdomínio CH2 de uma imunoglobulina ou uma porção de umdomínio CH2 de uma imunoglobulina. Em uma forma derealização, o polipeptídeo do RAGE compreende construções,tais como aquelas descritas aqui, tendo um ligador deinterdomínio do RAGE ligado a um domínio da imunoglobulinado RAGE tal que o aminoácido C-terminal do domínio daimunoglobulina do RAGE é ligado ao aminoácido N-terminal doligador de interdomínio, e o aminoácido C-terminal doligador de interdomínio do RAGE é diretamente ligado aoaminoácido N-terminal de um polipeptídeo compreendendo umdomínio CH2 de uma imunoglobulina, ou uma porção deste. Porexemplo, o vetor de expressão pode compreender a seqüênciade ácido nucléico SEQ ID N-: 30, ou um fragmento desta, SEQID N-: 54, ou um fragmento desta, SEQ ID N-: 31, ou umfragmento desta, ou SEQ ID N2: 55, ou um fragmento desta.Por exemplo, os plasmídeos podem ser construídospara expressar proteínas de fusão RAGE-IgG por fusão dediferente comprimentos de uma seqüência de DNAc 5' do RAGEhumano com uma seqüência de DNA 3' da IgGl humana (γΐ) . Asseqüências do cassette de expressão podem ser inseridas emum vetor de expressão tal como vetor de expressão pcDNA3.1(Invitrogen, CA) usando técnicas recombinantes padrão.

Também, o método pode compreender transfectar ovetor de expressão em uma célula hospedeira. Proteínas defusão do RAGE podem ser expressadas em sistemas de expressãode mamífero, incluindo sistemas em que as construções deexpressão são introduzidas nas células do mamífero usandovírus tais como retrovírus ou adenovírus. Linhagens decélulas de mamífero disponíveis como hospedeiras para aexpressão são bem conhecidas na técnica e incluem muitaslinhagens de células imortalizadas disponíveis da AmericanType Culture Collection (ATCC). Estas incluem, inter alia,células de ovário de hamster chinês (CHO), NSO, células SP2,células HeLa, células renais de filhote de hamster (BHK),células renais de macaco (COS), células de carcinomahepatocelular humanas (por exemplo, Hep G2), células A549, evárias outras linhagens de células. As linhagens de célulaspodem ser selecionadas através da determinação de quelinhagens de células têm níveis de expressão altos de umaproteína de fusão do RAGE. Outras linhagens de células quepodem ser usadas são linhagens de células de inseto, taiscomo células Sf 9. Células hospedeiras de plantas incluem,por exemplo, Nicotiana, Arabidopsis, lentilha d'água, milho,trigo, batata, etc. Células hospedeiras bacterianas incluemespécies E. coli e Streptomyces. Células hospedeiras delevedura incluem Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyeeseerevisiae e Piehia pastoris. Quando vetores de expressãorecombinantes codificando genes de proteína de fusão do RAGEsão introduzidos em células hospedeiras do mamífero, asproteínas de fusão do RAGE são produzidas por cultura dascélulas hospedeiras durante um período de tempo suficientepara levar em consideração a expressão da proteína de fusãodo RAGE nas células hospedeiras ou segregação da proteína defusão do RAGE no meio da cultura em que as célulashospedeiras são cultivadas. Proteínas de fusão do RAGE podemser recuperadas do meio da cultura usando métodos depurificação de proteína padrão.

Moléculas de ácido nucléico codificando proteínasde fusão do RAGE e vetores de expressão compreendendo estasmoléculas de ácido nucléico podem ser usados paratransfecção de uma célula hospedeira de mamífero, planta,bacteriana ou de levedura adequada. A transformação pode serpor qualquer método conhecido para introduzirpolinucleotídeos em uma célula hospedeira. Métodos paraintrodução de polinucleotídeos heterólogos em células domamífero são bem conhecidos na técnica e incluem transfecçãomediada por dextrano, precipitação de fosfato de cálcio,transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplasta,eletroporação, encapsulamento do(s) polinucleotídeo(s) emlipossomas, e microinjeção direta do DNA nos núcleos. Alémdisso, moléculas de ácido nucléico podem ser introduzidas emcélulas do mamífero por vetores virais. Métodos detransformação de células de planta são bem conhecidos natécnica, incluindo, por exemplo, transformação mediada porAgrobacterium, transformação biolística, injeção direta,eletroporação e transformação viral. Métodos detransformação de células bacterianas e de levedura tambémsão bem conhecidas na técnica.

Um vetor de expressão também pode ser liberado aum sistema de expressão usando biolísticas de DNA, em que oplasmídeo é precipitado em partículas microscópicas,preferivelmente ouro, e as partículas são impulsionadas emuma célula alvo ou sistema de expressão. técnicasbiolísticas de DNA são bem conhecidas na técnica edispositivos, por exemplo, uma "arma genética", sãocomercialmente disponíveis para a liberação dasmicropartícuias em uma célula (por exemplo, Helios Gene Gun,Bio-Rad Labs., Hercules, CA) e na pele (PMED Device,PowderMed Ltd., Oxford, UK).

A expressão de proteínas de fusão do RAGE delinhagens de células de produção pode ser realçada usandovárias técnicas conhecidas. Por exemplo, o sistema deexpressão genética da glutamina sintetase (o sistema GS) e osistema de resistência à neomicina codificado por plasma sãométodos comuns para realçar a expressão sob certascondições.

As proteínas de fusão do RAGE expressadas porlinhagens de células diferentes podem ter padrões deglicosilação diferentes entre si. Entretanto, todas asproteínas de fusão do RAGE codificadas pelas moléculas deácido nucléico fornecidas aqui, ou compreendendo asseqüências de aminoácido fornecidas aqui são parte dapresente invenção, não obstante a glicosilação da proteínade fusão do RAGE.

Em uma forma de realização, um vetor de expressãorecombinante pode ser transfectado em células de Ovário deHamster Chinês (CHO) e expressão otimizada. Nas formas derealização alternadas, as células podem produzir 0,1 a 20gramas/litro, ou 0,5 a 10 gramas/litro, ou cerca de 1 a 2gramas/litro.

Como é conhecido na técnica, tais construções deácido nucléico podem ser modificadas por mutação, como porexemplo, por ampliação de PCR de um modelo de ácido nucléicocom iniciadores compreendendo a mutação de interesse. Destamaneira, polipeptídeos compreendendo variar a afinidade paraligantes do RAGE podem ser designados. Em uma forma derealização, as seqüências mutantes podem ser 90 % ou maisidênticas ao DNA de partida. Como tal, variantes podemincluir seqüências de nucleotídeo que hibridizam sobcondições severas (isto é, equivalente a cerca de 20 a 21° Cabaixo da temperatura de fusão (TM) do DNA duplo em sal de 1molar).

A seqüência de codificação pode ser expressada portransfecção do vetor de expressão em um hospedeiroapropriado. Por exemplo, os vetores recombinantes podem serestavelmente transfectados em células de Ovário de HamsterChinês (CHO), e células expressando a proteína de fusão doRAGE selecionadas e clonadas. Em uma forma de realização,células expressando a construção recombinante sãoselecionadas quanto a resistência à neomicina codificada porplasmideo aplicando-se antibiótico G418. Clones individuaispodem ser selecionados e clones expressando niveis altos deproteína recombinante como detectado pela análise de WesternBlot do sobrenadante da célula podem ser expandidos, e oproduto genético purificado por cromatografia de afinidadeusando colunas da Proteína A.

Formas de realização de amostra de ácidosnucléicos recombinantes que codificam as proteínas de fusãodo RAGE da presente invenção são mostradas nas FIGS. 2 a 5 eFIGS. 17 a 20. Por exemplo, como descrito acima, a proteínade fusão do RAGE produzida pela construção de DNArecombinante pode compreender um polipeptídeo do RAGE ligadoa um segundo polipeptídeo não RAGE. A proteína de fusão doRAGE pode compreender dois domínios derivados da proteína doRAGE e dois domínios derivados de uma imunoglobulina.. Umaconstrução de ácido nucléico de exemplo codificando umaproteína de fusão do RAGE, TTP-4000 (TT4), tendo este tipode estrutura é mostrada na FIG. 2 (SEQ ID N2: 30) e FIG. 17(SEQ ID N2: 54). Como mostrado na FIG. 2 e FIG. 17, aseqüência de codificação 1-753 (destacada em negrito)codifica a seqüência de proteína N-terminal do RAGE ao passoque a seqüência de 754-1386 codifica a seqüência de proteína IgG.

Quando derivada da SEQ ID N-: 30 ou SEQ ID N-: 54,ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, a proteínade fusão do RAGE pode compreender a seqüência de aminoácidode quatro domínios da SEQ ID N2: 32, ou o polipeptídeo com aseqüência de sinal removida (Ver por exemplo, SEQ ID N2: 33ou SEQ ID N2: 34 na FIG. 4 ou SEQ ID N2: 56 na FIG. 19. NaFIG. 4 e na FIG. 19, a seqüência de aminoácido do RAGE édestacada com fonte em negrito. A seqüência daimunoglobulina é os domínios CH2 e CH3 da imunoglobulina daIgG. Como mostrado na FIG. 6B, os primeiros 251 aminoácidosda proteína de fusão do RAGE TTP-4 000 de comprimento plenocontêm como a seqüência de polipeptídeo do RAGE, umaseqüência de sinal compreendendo aminoácidos 1-22/23, odomínio V da imunoglobulina (incluindo o sítio de ligação doligante) compreendendo aminoácidos 23/24-116, um ligador deinterdomínio compreendendo aminoácidos 117 a 123, um segundodomínio da imunoglobulina (Cl) compreendendo aminoácidos124-221, e um ligador de interdomínio a jusantecompreendendo aminoácidos 222-251.

Em uma forma de realização, a proteína de fusão doRAGE pode compreender, não necessariamente, o segundodomínio da imunoglobulina do RAGE. Por exemplo, a proteínade fusão do RAGE pode compreender um domínio daimunoglobulina derivado do RAGE e dois domínios daimunoglobulina derivados de um polipeptídeo Fc humano. Umaconstrução de ácido nucléico de exemplo codificando estetipo de proteína de fusão do RAGE é mostrada na FIG. 3 (SEQID N2: 31) e na FIG. 18 (SEQ ID N2: 55) . Como mostrado naFIG. 3 e FIG. 18, a seqüência de codificação de nucleotídeos1 a 408 (destacada em negrito) codifica a seqüência deproteína N-terminal do RAGE, ao passo que a seqüência de409-1041 codifica a seqüência de proteína da IgGl (γ1) .

Quando derivada da SEQ ID N2: 31 ou SEQ ID N5: 55,ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, a proteínade fusão do RAGE pode compreender a seqüência de aminoácidode três domínios da SEQ ID N2: 35, ou o polipeptídeo com aseqüência de sinal removida (Ver por exemplo, SEQ ID N2: 36ou SEQ ID N2: 37 na FIG. 5 ou SEQ ID N2: 57 na FIG. 20). NaFIG. 5 e na FIG. 20, a seqüência de aminoácido do RAGE édestacada com fonte em negrito. Como mostrado na FIG. 6B, osprimeiros 136 aminoácidos da proteína de fusão do RAGE TTP-3000 de comprimento pleno contêm como o polipeptídeo do RAGEuma seqüência de sinal compreendendo aminoácidos 1-22/23, odomínio V da imunoglobulina (incluindo o sítio de ligação doligante) compreendendo aminoácidos 23/24-116, e um ligadorde interdomínio compreendendo aminoácidos 117 a 136. Aseqüência de 137 a 34 6 inclui os domínios da imunoglobulinaCh2 e Ch3 da IgG.

As proteínas de fusão do RAGE da presente invençãopodem compreender estabilidade in vivo melhorada sobrepolipeptídeos do RAGE não compreendendo um segundopolipeptídeo. A proteína de fusão do RAGE pode ser aindamodificada para aumentar a estabilidade, eficácia, potênciae biodisponibilidade. Assim, as proteínas de fusão do RAGEda presente invenção podem ser modificadas por processamentopós tradução ou por modificação química. Por exemplo, aproteína de fusão do RAGE pode ser sinteticamente preparadapara incluir aminoácidos L-, D-, ou não naturais,aminoácidos alfa-dissubstituidos, ou aminoácidos N-alquila.Adicionalmente, as proteínas podem ser modificadas poracetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, anexação delipideos tais como fosfatidiinositol, formação de ligaçõesde dissulfeto, e semelhantes. Além disso, polietileno glicolpode ser adicionado para aumentar a estabilidade biológicada proteína de fusão do RAGE.

Ligação dos Antagonistas do RAGE às proteínas defusão do RAGE

As proteínas de fusão do RAGE da presente invençãopodem compreender várias aplicações. Por exemplo, a proteínade fusão do RAGE da presente invenção podem ser usadas em umensaio de ligação para identificar ligantes do RAGE, taiscomo agonistas, antagonistas, ou moduladores do RAGE.

Por exemplo, em uma forma de realização, apresente invenção fornece um método para a detecção demoduladores do RAGE compreendendo: (a) fornecer uma proteínade fusão do RAGE compreendendo um polipeptídeo do RAGEligado a um segundo, polipeptídeo não RAGE, onde opolipeptídeo do RAGE compreende um sítio de ligação doligante; (b) misturar um composto de interesse e um ligantetendo uma afinidade de ligação conhecida para o RAGE com aproteína de fusão do RAGE; e (c) medir a ligação do ligantedo RAGE conhecido à proteína de fusão do RAGE na presença docomposto de interesse. Em uma forma de realização, o sítiode ligação do ligante compreende a maior parte do domínio N-terminal da proteína de fusão do RAGE.

As proteínas de fusão do RAGE também podemfornecer kits para a detecção de moduladores do RAGE.. Porexemplo, em uma forma de realização, um kit da presenteinvenção pode compreender (a) um composto tendo afinidade deligação conhecida ao RAGE como um controle positivo; (b) umaproteína de fusão do RAGE compreendendo um polipeptídeo doRAGE ligado a um segundo polipeptídeo não RAGE, em que opolipeptídeo do RAGE compreende um sítio de ligação doligante do RAGE; e (c) instruções para o uso. Em uma formade realização, o sítio de ligação do ligante compreende amaior parte do domínio N-terminal da proteína de fusão doRAGE.

Por exemplo, a proteína de fusão do RAGE podem serusadas em um ensaio de ligação para identificar ligantes doRAGE potenciais. Em uma forma de realização de exemplo de umtal ensaio de ligação, um ligante do RAGE conhecido pode serrevestido em um substrato sólido (por exemplo, placasMaxisorb) em uma concentração de cerca de 5 microgramas porreservatório, onde cada reservatório contém um volume totalde cerca de 100 microlitros (μΐ,) . As placas podem serincubadas a 4o C durante a noite para permitir que o liganteseja absorvido. Alternativamente, períodos de incubação maiscurtos em temperatura mais alta (por exemplo, temperaturaambiente) podem ser usados. Depois de um período de tempopara levar em consideração que o ligante seja ligado aosubstrato, os reservatórios de ensaio podem ser aspirados eum tampão de bloqueio (por exemplo, 1 % de BSA em 50 mM detampão imidizol, pH 7,2) pode ser adicionado à ligação nãoespecífica de bloqueio. Por exemplo, o tampão de bloqueiopode ser adicionado às placas durante 1 hora na temperaturaambiente. As placas depois podem ser aspiradas e/ou lavadascom um tampão de lavagem. Em uma forma de realização, umtampão compreendendo 20 mM de Imidizol, 150 mM de NaCl, 0,05% de Tween-20, 5 mM de CaCl2 e 5mM de MgCl2, pH 7,2 pode serusado como um tampão de lavagem. A proteína de fusão do RAGEdepois pode ser adicionada em diluições crescentes para osreservatórios de ensaio. A proteína de fusão do RAGE depoispode ser deixada incubar com o ligante imobilizado noreservatório de ensaio tal que a ligação possa atingir oequilíbrio. Em uma forma de realização, a proteína de fusãodo RAGE é deixada incubar com o ligante imobilizado durantecerca de uma hora a 37° C. Nas formas de realizaçãoalternadas, períodos de incubação mais longos emtemperaturas mais baixas podem ser usados. Depois que aproteína de fusão do RAGE e o ligante imobilizado foramincubados, a placa pode ser lavada para remover qualquerproteína de fusão do RAGE livre. A proteína de fusão do RAGEligada ao ligante imobilizado pode ser detectada em umavariedade de modos. Em uma forma de realização, a detecçãoutiliza um ELISA. Assim, em uma forma de realização, umcomplexo de imunodetecção contendo uma IgGl anti-humana decamundongo monoclonal, IgG anti-camundongo de cabrabiotinilada, e uma avidina a ligada fosfatase alcalina podeser adicionada à proteína de fusão do RAGE imobilizada noreservatório de ensaio. O complexo de imunodetecção pode serdeixado para ligar à proteína de fusão do RAGE imobilizadatal que a ligação entre a proteína de fusão do RAGE e ocomplexo de imunodetecção atinja o equilíbrio. Por exemplo,o complexo pode ser deixado para ligar à proteína de fusãodo RAGE durante uma hora na temperatura ambiente. Naqueleponto, qualquer complexo livre pode ser removido lavando-seo reservatório de ensaio com tampão de lavagem. O complexoligado pode ser detectado adicionando-se o substrato defosfatase alcalina, para-nitrofenilfosfato (PNPP), emedindo-se a conversão de PNPP para para-nitrofenol (PNP)como um aumento na absorvência a 4 05 nm.

Em uma forma de realização, ligante do RAGE liga-se à proteína de fusão do RAGE com afinidade nanomolar (nM)ou micromolar (μΜ). Um experimento ilustrando a ligação deligantes do RAGE à proteínas de fusão do RAGE da presenteinvenção é mostrado na FIG. 7. As soluções de TTP-3000 (TT3)e TTP-4000 (TT4) tendo concentrações iniciais de 1,082mg/mL, e 370 μg/mL, respectivamente, foram preparadas. Comomostrado na FIG. 7, em várias diluições, as proteínas defusão do RAGE TTP-3000 e TTP-4000 são capazes de ligarem-sea ligantes do RAGE imobilizados Amilóide beta (Abeta)(Amiloyd beta (1-40) da Biosource), S100b (S100), eanfoterina (Ampho), resultando em um aumento na absorvência.Na ausência de ligante (isto é, revestimento apenas com BSA)não houve aumento na absorvência.

O ensaio de ligação da presente invenção pode serusado para quantificar a união do ligante ao RAGE. Nasformas de realização alternadas, ligantes do RAGE podemligar-se à proteína de fusão do RAGE da presente invençãocom afinidades de ligação variando de 0,1 a 1000 nanomolar(nM), ou de 1 a 500 nM, ou de 10 a 80 nM.

A proteína de fusão do RAGE da presente invençãotambém podem ser usadas para identificar compostos tendo acapacidade de ligarem-se ao RAGE. Como mostrado nas FIGS. 8e 9, respectivamente, um ligante do RAGE pode ser avaliadoquanto a sua capacidade de competir com o beta amilóideimobilizado para ligar às proteínas de fusão do RAGE TTP-4000 (TT4) ou TTP-3000 (TT3). Assim, pode ser observado queum ligante do RAGE em uma concentração de ensaio final (FAC)de 10 μΜ pode substituir a ligação de proteína de fusão doRAGE para o beta-amilóide em concentrações de 1:3, 1:10,1:30, e 1:100 da solução de TTP-4000 inicial (FIG. 8) ouTTP-3000 (FIG. 9).

Modulação de Efetores Celulares

Formas de realização das proteínas de fusão doRAGE da presente invenção podem ser usadas para modular umaresposta biológica mediada por RAGE. Por exemplo, asproteínas de fusão do RAGE podem ser designadas para modularaumentos induzidos por RAGE na expressão gênica. Assim, emuma forma de realização, proteínas de fusão do RAGE dapresente invenção podem ser usadas para modular a função deenzimas biológicas. Por exemplo, a interação entre RAGE eseus ligantes pode gerar tensão oxidativa e ativação de NF-KB, e genes regulados de NF-KB, tais como as citocinas IL-1β, TNF-α, e semelhantes. Além disso, vários outras viasreguladoras, tais como aquelas envolvendo p21ras, cinasesMAP, ERKl, e ERK2, foram mostradas ser ativadas por ligaçãode AGEs e outros ligantes ao RAGE.O uso das proteínas de fusão do RAGE da presenteinvenção para modular a expressão do efetor celular TNF-α émostrado na FIG. 10. As células mielóides de THP-I podem sercultivadas em 1640 meios de RPMI suplementados com 10 % deFBS e induzidas para segregar TNF-α por intermédio deestimulação do RAGE com SlOOb. Quando tais estimulaçãoocorrem na presença de uma proteína de fusão do RAGE, aindução de TNF-α por SlOOb ligando ao RAGE pode ser inibida.Assim, como mostrado na FIG. 10, a adição de 10 μg deproteína de fusão do RAGE TTP-3000 (TT3) ou TTP-4000 (TT4)reduz a indução por SlOOb de TNF-α por cerca de 50 % a 75 %.A proteína de fusão do RAGE TTP-4000 pode ser pelo menos tãoeficaz no bloqueio da indução por SlOOb de TNF-α como éRAGEs (FIG. 10). A especificidade da inibição para asseqüências do RAGE de TTP-4000 e TTP-3000 é mostrada peloexperimento em que IgG sozinho foi adicionado a célulasestimuladas por SlOOb. A adição de IgG e SlOOb ao ensaiomostra os mesmos níveis de TNF-α como SlOOb sozinha.

Características Fisiológicas das Proteínas deFusão do RAGE

Embora o RAGEs possa ter um benefício terapêuticona modulação de doenças mediadas por RAGE, RAGEs humano podeter limitações como uma resistência terapêutica sozinha combase na meia vida relativamente curta do RAGEs no plasma.Por exemplo, ao passo que RAGEs de roedor tem uma meia vidaem ratos normais e diabéticos de aproximadamente 20 horas,RAGEs humano tem uma meia vida de menos do que 2 horasquando avaliado por retenção de RAGEs de imunorreatividade(Renard et al., J. Pharmacol. Exp. Therr 290:1458-1466(1999)).

Para gerar um RAGE terapêutico que temcaracterísticas de ligação similares como RAGEs, mas umperfil farmacocinético mais estável, uma proteína de fusãodo RAGE compreendendo um sítio de ligação do ligante do RAGEligado a um ou mais domínios da imunoglobulina humana podemser usadas. Como é conhecido na técnica, os domínios daimunoglobulina podem incluir a porção Fc da cadeia pesada daimunoglobulina.

A porção Fc de imunoglobulina pode conferir váriosatributos a uma proteína de fusão do RAGE. Por exemplo, aproteína de fusão Fc pode aumentar a meia vida do soro detais proteínas de fusão, freqüentemente de horas a váriosdias. O aumento na estabilidade farmacocinética é geralmenteum resultado da interação do ligador entre as regiões CH2 eCh3 do fragmento de Fc com o receptor FcRn (Wines et al., J.Immunol., 164:5313-5318 (2000)).

Embora as proteínas de fusão compreendendo umpolipeptídeo Fc da imunoglobulina possam fornecer a vantagemde estabilidade aumentada, proteínas de fusão daimunoglobulina podem evocar uma resposta inflamatória quandointroduzidas em um hospedeiro. A resposta inflamatória podeser devido, em grande parte, à porção Fc da imunoglobulinada proteína de fusão. A resposta pró inflamatória pode seruma característica desejável se o alvo for expressado em umtipo de célula doente que necessita ser eliminada (porexemplo, uma célula cancerígena, uma ou a população delinfócitos causando uma doença autoimune). A resposta próinflamatória pode ser uma característica neutra se o alvofor uma proteína solúvel, como a maioria das proteínassolúveis não ativam imunoglobulinas. Entretanto, a respostapró inflamatória pode ser uma característica negativa se oalvo for expressado em tipos de célula cuja destruiçãolevaria a efeitos colaterais desagradáveis. Também, aresposta pró inflamatória pode ser uma característicanegativa se uma cascata inflamatória for estabilizada nosítio de uma proteína de fusão ligando a um tecido alvo,visto que muitos mediadores de inflamação podem serprejudiciais ao tecido adjacente, e/ou podem causar efeitossistêmicos.

O sítio pró inflamatório primário nos fragmentosFc da imunoglobulina reside na região de articulação entre oCH1 e CH2. Esta região de articulação interage com o FcRl-3em várias leucócitos e ativa estas células para atacar oalvo. (Wines et al, J. Immunol, 164;5313-5318 (2000)).

Como terapêuticos para doenças mediadas por RAGE,proteínas de fusão do RAGE podem não requerer a geração deuma resposta inflamatória. Assim, formas de realização dasproteínas de fusão do RAGE da presente invenção podemcompreender uma proteína de fusão do RAGE compreendendo umpolipeptídeo do RAGE ligado a um domínio(s) daimunoglobulina onde a região de articulação Fc daimunoglobulina é removida e substituída com um polipeptídeodo RAGE. Desta maneira, a interação entre a proteína defusão do RAGE e receptores Fc nas células inflamatórias podeser minimizada. Pode ser importante, entretanto, manterempilhamento apropriado e outras interações estruturaistridimensionais entre os vários domínios da imunoglobulinada proteína de fusão do RAGE. Assim, formas de realizaçãodas proteínas de fusão do RAGE da presente invenção podemsubstituir o ligador de interdomínio do RAGE biologicamenteinerte, mas estruturalmente similar que separa os domínios Ve Cl do RAGE, ou o ligador que separa os domínios Cl e C2 doRAGE, in Iieu da região de articulação normal da cadeiapesada da imunoglobulina. Assim, o polipeptídeo do RAGE daproteína de fusão do RAGE pode compreender um seqüência doligador de interdomínio que é naturalmente encontrada ajusante de um domínio da imunoglobulina do RAGE para formarum fragmento do domínio/ligador da imunglobulina do RAGE.Desta maneira, as três interações dimensionais entre osdomínios da imunoglobulina contribuídos pelo RAGE ou aimunoglobulina podem ser mantidas.

Em uma forma de realização, uma proteína de fusãodo RAGE da presente invenção pode compreender um aumentosubstancial na estabilidade farmacocinética quando comparadaao RAGEs. Por exemplo, a FIG. 11 mostra que uma vez que aproteína de fusão do RAGE TTP-4000 tenha saturado seusligantes, ela pode reter uma meia vida de maios do que 300horas. Isto pode ser contrastado com a meia vida para RAGEsde apenas algumas horas em plasma humano.

Assim, em uma forma de realização, as proteínas defusão do RAGE da presente invenção podem ser usada paraantagonizar a ligação de ligantes fisiológicos ao RAGE comoum meio para tratar doenças mediadas por RAGE sem gerar umaquantidade inaceitável de inflamação. As proteínas de fusãodo RAGE da presente invenção podem exibir uma diminuiçãosubstancial na geração de uma resposta pró inflamatóriaquando comparadas à IgG. Por exemplo, como mostrado na FIG.12, a proteína de fusão do RAGE TTP-4000 não estimula aliberação de TNF-α das células sob condições onde aestimulação da IgG humana da liberação de TNF-α é detectada.

Tratamento da Doença com Proteínas de Fusão doRAGE

A presente invenção também pode compreendermétodos para o tratamento de distúrbio mediado por RAGE emum paciente humano. Em uma forma de realização, o métodopode compreender administrar a um paciente uma proteína defusão do RAGE compreendendo um polipeptídeo do RAGEcompreendendo um sítio de ligação do ligante do RAGE ligadoa um segundo polipeptídeo não RAGE.

Em uma forma de realização, uma proteína de fusãodo RAGE da presente invenção pode ser administrada porvárias vias. A administração da proteína de fusão do RAGE dapresente invenção pode utilizar injeção intraperitoneal(IP). Alternativamente, a proteína de fusão do RAGE pode seradministrada oral e intranasalmente, ou como um aerossol. Emuma outra forma de realização, a administração é intravenosa(IV) . A proteína de fusão do RAGE também pode ser injetadasubcutaneamente. Em uma outra forma de realização, aadministração da proteína de fusão do RAGE é infra-arterial.Em uma outra forma de realização, a administração ésublingual. Também, a administração pode utilizar um cápsulade liberação com o tempo. Ainda em uma outra forma derealização, a administração pode ser transretal, como por umsupositório ou semelhantes. Por exemplo, a administraçãosubcutânea pode ser útil para tratar distúrbios crônicosquando a auto-administração é desejável.

Uma variedade de modelos animais foi usada paravalidar o uso de compostos que modulam RAGE comoterapêuticos. Exemplos destes modelos são como seguem:

a) RAGEs inibiu formação neointima em um modelo derato com restenose a seguir de lesão arterial tanto em ratosdiabéticos quanto normais inibindo-se a ativação endotelial,muscular lisa e de macrófago por intermédio do RAGE (Zhou etal., Circulation 107:2238-2243 (2003));

b) Inibição de interações do RAGE/ligante, usandoRAGEs ou um anticorpo anti-RAGE, reduziu formação de placaamilóide em um modelo de camundongo de amiloidose sistêmica(Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000)). Acompanhando aredução em placas amilóide foi uma redução nas citocinasinflamatórias, interleucina-6 (IL-6) e fator de estimulaçãode colônia de macrófago (M-CSF) assim como ativação reduzidade NF-kB nos animais tratados;

c) Camundongos transgênicos com RAGE(superexpressadores do RAGE e expressadores negativosdominantes do RAGE) exibem formação de placa e déficitscognitivos em um modelo de camundongo de AD (Arancio et al,EMBOJ., 23:4096-4105 (2004));

d) Tratamento de ratos diabéticos com RAGEsreduziu a permeabilidade vascular (Bonnardel-Phu et al,Diabetes, 48:2052-2058 (1999));

e) Tratamento com RAGEs reduziu lesõesateroscleróticas em camundongos diabéticos comapolipoproteína Ε-nula e preveniu os Índices funcionais emorfológicos de nefropatia diabética em camundongos db/db(Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003));e

f) RAGEs atenuou a severidade da inflamação em ummodelo de camundongo com artrite induzida por colágeno(Hofmann et al, Genes Immunol., 3:123-135 (2002)), um modelode camundongo com encefalomielite alérgica experimental (Yanet al, Nat. Med. 9:28-293 (2003)) e um modelo de camundongocom doença inflamatória intestinal (Hofmann et al., Cell,97:889-901 (1999)).

Assim, em uma forma de realização, as proteínas defusão do RAGE da presente invenção podem ser usadas paratratar um sintoma de diabetes e/ou complicações resultantesde diabetes mediado por RAGE. Nas formas de realizaçãoalternadas, o sintoma de diabetes ou complicações diabéticastardias pode compreender nefropatia diabética, retinopatiadiabética, uma úlcera do pé diabético, uma complicaçãocardiovascular de diabetes, ou neuropatia diabética.

Originalmente identificado como um receptor paramoléculas cuja expressão é associada com a patologia dediabetes, RAGE por si só é essencial à patofisiologia decomplicações diabéticas. A inibição da interação do RAGE, invivo, com seu(s) ligante(s) foi mostrada ser terapêutica emmodelos múltiplos de complicações diabéticas e inflamação(Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)).Por exemplo, um tratamento de dois meses com anticorposanti-RAGE normalizou função do rim e reduziu ahistopatologia renal anormal em camundongos diabéticos(Flyvbjerg et al, Diabetes 53:166-172 (2004)). Além disso, otratamento com uma forma solúvel do RAGE (RAGEs) que ligaaos ligantes do RAGE e inibe interações RAGE/ligante,reduziu lesões ateroscleróticas em camundongos Ε-nulo deapolipoproteina diabéticos e atenuou a patologia funcional emorfológica de nefropatia diabética em camundongos db/db(Bucciarelli et al., Circulation 106:2827-2835 (2002)).

Também, foi mostrado que a glicoxidação nãoenzimática de macromoléculas finalmente resultando naformação de produtos finais de glicação avançada (AGEs) érealçada em sitios de inflamação, na falência renal, napresença de hiperglicemia e outras condições associadas comtensão oxidante sistêmica ou local (Dyer et al., J. Clin.Invest., 91:2463-2469 (1993); Reddy et al., Biochem.,34:10872-10878 (1995); Dyer et al., J. Biol. Chem.,266:11654-11660 (1991); Degenhardt et al, Cell Mol. Biol.,44:1139-1145 (1998)). 0 acúmulo de AGEs na vasculatura podeocorrer de modo focai, como na junção amilóide composta deAGE-p2-microglobulina encontrada em pacientes com amiloidoserelacionada à diálise (Miyata et al, J. Clin. Invest.,92:1243-1252 (1993); Miyata et al., J. Clin. Invest.,98:1088-1094 (1996)), ou geralmente, como exemplificado pelavasculatura e tecidos de pacientes com diabetes (Schmidt etal, Nature Med., 1;1002-1004 (1995)). O acúmulo progressivode AGEs com o passar do tempo em pacientes com diabetessugere que mecanismos de liberação do endógeno não sãocapazes de funcionar eficazmente em sítios de deposição doAGE. Tais AGEs acumulados têm a capacidade de alterarpropriedades celulares por vários mecanismos. Embora RAGEseja expressado em níveis baixos nos tecidos e vasculaturanormais, em um ambiente onde os ligantes do receptor seacumulam, foi mostrado que RAGE torna-se supra-regulado (Liet al, J. Biol. Chem., 272:164 98-16506 (1997); Li et al, J.Biol. Chem., 273:30870-30878 (1998); Tanaka et alJ. Biol.Chem., 275:25781-25790 (2000)). A expressão do RAGE éaumentada no endotélio, células musculares lisas einfiltração dos fagócitos mononucleares na vasculaturadiabética. Também, os estudos em cultura celular têmdemonstrado que a interação AGE-RAGE causa mudanças empropriedades celulares importantes na homeostase vascular.

O uso das proteínas de fusão do RAGE no tratamentode patologia relacionada à diabetes é ilustrado na FIG. 13.A proteína de fusão do RAGE TTP-4000 foi avaliada em ummodelo de rato diabético com restenose que envolveu mediçãode proliferação muscular lisa e expansão íntima a seguir delesão vascular. Como ilustrado na FIG. 13, tratamento comTTP-4000 pode significantemente reduzir a razão intima/média(I/M) (FIG. 13A; Tabela 1) na restenose associada comdiabetes em uma maneira de resposta à dose. Também, otratamento com TTP-4000 pode reduzir significantemente aproliferação de célula muscular lisa vascular associada comrestenose em uma maneira de resposta à dose.

Tabela 1

Efeito de TTP-4000 em Modelo de Rato com Restenose

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*P<0,05; ** Tanto para dose alta quanto baixa, umadose de carregamento de 3 mg/animal foi usada.

Em outras formas de realização, as proteínas defusão do RAGE da presente invenção também podem ser usadaspara tratar ou reverter amiloidoses e doença de Alzheimer. 0RAGE é um receptor para beta amilóide (Αβ) assim como outrasproteínas amiloidogênicas incluindo SAA e amilina (Yan etal, Naturer 382:685-691 (1996); Yan et al, Proc. Natl. Acad.Sci., USA, 94:5296-5301 (1997); Yan et al. , Nat. Med.,6:643-651 (2000); Sousa et al, Lab Invest., 80:1101-1110(2000)). Também, os ligantes do RAGE, incluindo AGEs, SlOObe proteínas Αβ, são encontrados no tecido adjacente à placasenil no ser humano (Luth et al., Cereb. Cortex 15:211-220(2005); Petzold et al, Neurosci. Lett.., 336:167-170 (2003);Sasaki et al, Brian Res., 12:256-262 (2001; Yan et al,Reston Neurol Neruosci., 12:167-173 (1998)). Foi mostradoque RAGE liga o material fibrilar da β-folha não obstante dacomposição das subunidades (peptideo amilóide-β, amilina,soro amilóide A, peptideo derivado de prion) (Van et al.,Nature, 382:685-691 (1996); Yan et al., Nat. Med., 6:643-651(2000)). Além disso, a deposição de amilóide foi mostradapara resultar na expressão realçada do RAGE. Por exemplo,nos cérebros de pacientes com doença de Alzheimer (AD) , aexpressão do RAGE aumenta em neurônios e neuróglia (Yan, etal., Nature 382:685-691 (1996)). Concorrente com a expressãode ligantes do RAGE, o RAGE é supra-regulado em astrócitos ecélulas microgliais no hipocampo de indivíduos com AD masnão é supra-regulado em indivíduos que não têm AD (Lue etal, Exp. Neurol., 171:29-45 (2001)). Essas descobertassugerem que células expressando RAGE sejam ativadas porintermédio de interações do ligante do RAGE/RAGE naadjacência da placa senil. Também, in vitro, a ativaçãomediada por Αβ de células microgliais pode ser bloqueada comanticorpos dirigidos contra o domínio de ligação do ligantedo RAGE (Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:5296-5301 (1997)). Também foi demonstrado que RAGE pode servircomo um ponto focai para conjunto da fibrila (Deane et al.,Nat. Med. 9:907-913 (2003)).

Também, a inibição in vivo de interações doRAGE/ligante usando RAGEs ou um anticorpo anti-RAGE podereduzir a formação de placa amilóide em um modelo decamundongo de amiloidose sistêmica (Yan et al, Nat. Med.,6:643-651 (2000)). Camundongos transgênicos duplos quesuperexpressam RAGE humano e proteína precursora amilóidehumana (APP) com as mutações Suecas e Londrinas (mutantehAPP) em neurônios desenvolvem défcits de aprendizagem eanormalidades neuropatológicas precocemente em relação assuas contrapartes transgênicas de hAPP mutante únicas. Aocontrário, camundongos transgênicos duplos com capacidade desinalização de Αβ diminuída devido a neurônios expressandouma forma negativa dominante do RAGE nos mesmos fundamentosde hAPP mutante, mostram um princípio retardado deanormalidades neuropatológicas e de aprendizagem comparadasa sua contraparte transgênica de APP única (Arancio et al.,EMBOJ., 23:4096-4105 (2004)).

Além disso, a inibição da interação RAGE-amilóidefoi mostrada para diminuir a expressão de RAGE celular emarcadores de tensão celular (assim como ativação de NF-κβ) ,e diminuir a deposição amilóide (Yan et al, Nat. Med.,6:643-651 (2000)) sugerindo um papel para a interação RAGE-amilóide tanto na perturbação de propriedades celulares emum ambiente enriquecido com amilóide (mesmo em estágiosprecoces) assim como em acúmulo de amilóide.

Assim, as proteínas de fusão do RAGE da presenteinvenção também podem ser usadas para tratar a redução deamiloidose e para reduzir as placas amilóide e disfunçãocognitiva associadas com Doença de Alzheimer (AD) . Comodescrito acima, RAGEs foi mostrado para reduzir tanto aformação de placa amilóide no cérebro quanto o aumentosubseqüente nos marcadores inflamatórios em um modelo animalde AD. As FIGS. 14A e 14B mostram que camundongos que têmAD, e são tratados durante 3 meses com TTP-4000 ou RAGEs decamundongo tiveram poucas placas beta amilóide (Αβ) e menosdisfunção cognitiva do que animais que receberam um veiculoou um controle negativo da IgG humana (IgGl). Semelhante aRAGEs, TTP-4 OOO também pode reduzir as citocinasinflamatórias IL-I e TNF-α (dados não mostrados) associadoscom AD.

Também, proteínas de fusão do RAGE da presenteinvenção podem ser usadas para tratar aterosclerose e outrosdistúrbios cardiovasculares. Assim, foi mostrado quecardiopatia isquêmica é particularmente alta em pacientescom diabetes (Robertson, et al, Lab Invest., 18:538-551(1968); Kannel et al, J. Am. Med. Assoc., 241:2035-2038(1979); Kannel et al., Diab. Care, 2:120-126 (1979)). Alémdisso, estudos mostraram que aterosclerose em pacientes comdiabetes é mais acelerada e extensiva do que em pacientesnão sofrendo de diabetes (ver por exemplo, Waller et al, Am.J. Med., 69:498-506 (1980); Crall et al, Am. J. Med. 64:221-230 (1978); Hamby et al., Chest, 2:251-257 (1976); e Pyoralaet ' al., Diab. Metab. Rev., 3:463-524 (1978)), Embora asrazões para aterosclerose acelerada no ajuste de diabetessejam muitas, foi mostrado que a redução de AGEs podereduzir a formação de placa.

Por exemplo, as proteínas de fusão do RAGE dapresente invenção também podem ser usadas para trataracidente vascular cerebral. Quando TTP-4000 foi comparado aoRAGEs em um modelo animal com doença relevante de acidentevascular cerebral, TTP-4000 foi encontrado para fornecer umaredução significantemente maior no volume de infarto. Nestemodelo, a artéria carótida mediana de um camundongo é ligadae depois reperfusada para formar um infarto. Para avaliar aeficácia de proteínas de fusão do RAGE para tratar ouprevenir acidente vascular cerebral, camundongos foramtratados com RAGEs ou TTP-4000 ou controle de imunoglobulinaexatamente antes da reperfusão. Como pode ser observado naTabela 2, TTP-4000 foi mais eficaz do que RAGEs em limitar aárea de infarto nestes animais sugerindo que TTP-4000, porcausa de sua meia vida superior no plasma, foi capaz demanter mais proteção do que RAGEs.

Tabela 2

Redução do Infarto no Acidente Vascular Cerebral

<table>table see original document page 83</column></row><table>

*Significante para p<0,001; **Comparado à soluçãosalina

Em uma outra forma de realização, as proteínas defusão do RAGE da presente invenção podem ser usadas paratratar câncer. Em uma forma de realização, o câncer tratadousando as proteínas de fusão do RAGE da presente invençãocompreende células cancerígenas que expressam RAGE. Porexemplo, cânceres que podem ser tratados com a proteína defusão do RAGE da presente invenção incluem alguns cânceresde pulmão, alguns gliomas, alguns papilomas, e semelhantes.Anfoterina é uma proteína de ligação do DNA cromossômico nãohistona do grupo I de alta mobilidade (Rauvala et al., J.Biol. Chem., 2 62:16625-16635 (1987); Parkikinen et al, J.Biol. Chem. 268:19726-19738 (1993)) que foi mostrada parainteragir com RAGE. Foi mostrado que anfoterina promovecrescimento do neurito, assim como serve uma superfície paraa reunião de complexos de protease no sistema fibrinolitico(também conhecido para contribuir para mobilidade dacélula). Além disso, um efeito inibitório de crescimento detumor local do RAGE de bloqueio foi observado em um modelode tumor primário (glioma C6) , o modelo de metástase dopulmão de Lewis (Taguchi et alNature 405:354-360 (2000)),e espontaneamente surgindo de papilomas em camundongosexpressando o transgene v-Ha-ras (Leder et al, Proc. Natl.Acad. Sci., 87:9178-9182 (1990)).

Ainda em uma outra forma de realização, asproteínas de fusão do RAGE da presente invenção podem serusadas para tratar inflamação. Nas formas de realizaçãoalternadas, as proteínas de fusão do RAGE da presenteinvenção podem ser usadas para tratar inflamação associadacom doença inflamatória intestinal, inflamação associada comartrite reumatóide, inflamação associada com psoríase,inflamação associada com esclerose múltipla, inflamaçãoassociada com hipoxia, inflamação associada com acidentevascular cerebral, inflamação associada com ataque cardíaco,inflamação associada com choque hemorrágico, inflamaçãoassociada com sepsia, inflamação associada com transplantede órgão, inflamação associada com cura do ferimentoprejudicada, ou inflamação associada com rejeição decélulas, tecido, ou órgãos auto-suficientes (por exemplo,autoimunes) ou não auto-suficientes (por exemplo,transplantados).

Por exemplo, a seguir do tratamento trombolítico,células inflamatórias tais como granulócitos infiltram notecido isquêmico e produzem radicais de oxigênio que podemdestruir mais células do que foram exterminadas pelahipoxia. A inibição do receptor no neutrófilo responsávelpelos neutrófilos que são capazes de infiltrar no tecido comanticorpos ou outros antagonistas de proteína foi mostradapara melhorar a resposta. Visto que RAGE é um ligante paraseu receptor de neutrófilo, uma proteína de fusão do RAGEcontendo um fragmento do RAGE pode agir como umdescodificador e prevenir que o neutrófilo se movimente parao sítio reperfusado e assim, prevenir ainda destruição dotecido. O papel do RAGE na prevenção da inflamação pode serindicado por estudos mostrando que RAGEs inibiu expansãoneoíntima em um modelo de rato com restenose a seguir dalesão arterial tanto em ratos diabéticos quanto normais,presumidamente inibindo-se proliferação celular muscularlisa endotelial e ativação do macrófago por intermédio deRAGE (Thou et al., Circulationf 107:2238-2243 (2003)). Alémdisso, RAGEs inibiu modelos de inflamação incluindohipersensibilidade do tipo retardada, encefalite autoimuneexperimental e doença inflamatória intestinal (Flofman etal., Cellf 97:889-901 (1999)).

Em uma forma de realização, as proteínas de fusãodo RAGE da presente invenção podem ser usadas para tratardistúrbios com base em autoimunidade. Por exemplo, em umaforma de realização, as proteínas de fusão do RAGE dapresente invenção podem ser usadas para tratar falênciarenal. Assim, as proteínas de fusão do RAGE da presenteinvenção podem ser usadas para tratar nefrite do lúpussistêmica ou nefrite do lúpus inflamatória. Por exemplo, asSlOO/calgranulinas foram mostradas compreender uma famíliade polipeptídeos de ligação de cálcio intimamenterelacionada caracterizada por duas regiões EF-hand ligadaspor um peptídeo de conexão (Schafer et al., TIBSr 21:134-140(1996); Zimmer et al, Brain Res. Bull., 37:417-429 (1995);Rammes et al., J. Biol. Chem., 272:9496-9502 (1997);Lugering et al., Eur. Clin. Invest., 25:659-664 (1995)).Embora eles precisem de peptídeos de sinal, há muito foiconhecido que SlOO/calgranulinas ganham acesso ao espaçoextracelular, especialmente em sítios de respostasimunes/inflamatórias crônicas, como em fibrose cística eartrite reumatóide. O RAGE é um receptor para muitos membrosda família SlOO/calgranulina, mediando seus efeitos pró-inflamatórios em células tais como linfócitos e fagócitosmononucleares. Também, estudos de resposta dehipersensibilidade do tipo retardada, nos modelos de coliteem camundongos IL-IO nulo, artrite induzida por colágeno, eencefalite autoimune experimental sugerem que interação doRAGE-ligante (presumivelmente com S-100/calgranulinas) temum papel proximal na cascata inflamatória.

Diabetes Tipo I é um distúrbio autoimune que podeser prevenido ou melhorado por tratamento com as proteínasde fusão do RAGE da presente invenção. Por exemplo, foimostrado que RAGEs pode levar em consideração atransferência de esplenócitos de camundongos diabéticos nãoobesos (NOD) para camundongos NOD com severasimunodeficiências combinadas (camundongos NOD-scid).Camundongos NOD-scid não exibem diabetes espontaneamente,mas requerem a presença de imunocitos capazes de destruircélulas das ilhotas tais que diabetes depois é induzida. Foidescoberto que receptores de NOD-scid tratados com RAGEsexibiram principio reduzido de diabetes induzidos poresplenócitos transferidos de um camundongo diabético (NOD)quando comparados a receptores de NOD-scid não tratados comRAGEs (Publicação da Patente U.S. 2002/0122799). Comoestabelecido pelos inventores nesta publicação de patente,os resultados experimentais usando RAGEs neste modelo sãorelevantes à doença humana tais como colocações clinicas emque terapias de imunidade futuras e transplante de ilhotaspossam ocorrer.

Assim, em uma forma de realização, uma proteína defusão do RAGE da presente invenção pode ser usada paratratar inflamação associada com transplante de pelo menos umde um órgão, um tecido, ou uma pluralidade de células de umprimeiro sítio a um segundo sítio. O primeiro e segundosítios podem estar em pacientes diferentes, ou no mesmopaciente. Nas formas de realização alternadas, as células,tecido ou órgão transplantados compreendem células de umpâncreas, pele, fígado, rim, coração, pulmão, medula óssea,sangue, osso, músculo, células endoteliais, artéria, veia,cartilagem, tireóide, sistema nervoso, ou células tronco.Por exemplo, a administração das proteínas de fusão do RAGEda presente invenção podem ser usadas para facilitar atransplantação de células da ilhota de um primeiro pacientenão diabético a um segundo paciente diabético.

Em uma outra forma de realização, a presenteinvenção pode fornecer um método de tratar osteoporoseadministrando-se a um paciente uma quantidadeterapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão do RAGE dapresente invenção. (Zhou et al., J. Exp. Med., 203:1067 -1080 (2006)). Em uma forma de realização, o método de tratarosteoporose pode compreender ainda a etapa de aumentar adensidade do osso do paciente ou reduzir a taxa dediminuição na densidade do osso de um paciente.

Assim, em várias formas de realizaçãoselecionadas, a presente invenção pode fornecer um métodopara inibir a interação de um AGE com RAGE em um pacienteadministrando-se ao paciente uma quantidade terapeuticamenteeficaz de uma proteína de fusão do RAGE da presenteinvenção. O paciente tratado usando as proteínas de fusão doRAGE da presente invenção pode ser um animal. Em uma formade realização, o paciente é um ser humano. 0 paciente podeestar sofrendo de uma doença relacionada ao AGE tal comodiabetes, complicações diabéticas tais como nefropatia,neuropatia, retinopatia, úlcera do pé, amiloidoses, oufalência renal, e inflamação. Ou, o paciente pode ser umindivíduo com doença de Alzheimer. Em uma forma derealização alternativa, o paciente pode ser um indivíduo comcâncer. Ainda em outras formas de realização, o pacientepode estar sofrendo de lúpus eritematoso sistêmico ounefrite do lúpus inflamatório. Outras doenças podem sermediadas por RAGE e assim, podem ser tratadas usando asproteínas de fusão do RAGE da presente invenção. Assim, emformas de realização alternativas adicionais da presenteinvenção, as proteínas de fusão do RAGE podem ser usadaspara tratamento de doença de Crohn, artrite, vasculite,nefropatias, retinopatias, e neuropatias em pacienteshumanos ou animais. Em outras formas de realização,inflamação envolvendo tanto respostas autoimunes (porexemplo, rejeição de auto-suficiência) e respostas nãoautoimunes (por exemplo, rejeição de não auto-suficiência)pode ser mediada por RAGE e assim, pode ser tratada usandoas proteínas de fusão do RAGE da presente invenção.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz podecompreender uma quantidade que é capaz de prevenir ainteração do RAGE com um AGE ou outros tipos de ligantesendógenos do RAGE em um paciente. Consequentemente, aquantidade variará de acordo o paciente sendo tratado. Aadministração do composto pode ser de hora em hora,diariamente, semanalmente, mensalmente, anualmente, ou comoum evento único. Em várias formas de realizaçãoalternativas, a quantidade eficaz da proteína de fusão doRAGE pode variar de cerca de 1 mg/kg de peso corpóreo acerca de 100 mg/kg de peso corpóreo, ou de cerca de 10 ug/kgde peso corpóreo a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo, ou decerca de 100 μg/kg de peso corpóreo a cerca de 20 mg/kg depeso corpóreo. A quantidade eficaz real pode serestabilizada por ensaios de dose/resposta usando métodospadrão na técnica (Johnson et al., Diabetes. 42: 1179,(1993)) . Assim, como é conhecido àqueles habilitados natécnica, a quantidade eficaz pode depender dabiodisponibilidade, bioatividade, e biodegradabilidade docomposto.

Composições

A presente invenção pode compreender umacomposição compreendendo uma proteína de fusão do RAGE dapresente invenção misturada com um carregadorfarmaceuticamente aceitável. A proteína de fusão do RAGEpode compreender um polipeptídeo do RAGE ligado a um segundopolipeptídeo não RAGE. Em uma forma de realização, aproteína de fusão do RAGE pode compreender um sítio deligação do ligante do RAGE. Em uma forma de realização, osítio de ligação do ligante compreende a maior parte dodomínio N-terminal da proteína de fusão do RAGE. O sítio deligação do ligante do RAGE pode compreender o domínio V doRAGE, ou uma porção deste. Em uma forma de realização, osítio de ligação do ligante do RAGE compreende SEQ ID N-: 9ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, ou SEQ IDN2: 10 ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, ouSEQ ID N2: 47 ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica aesta.

Em uma outra forma de realização, o sítio deligação do ligante pode compreender aminoácidos 22-51 da SEQID N2: 1. Em uma outra forma de realização, o sítio deligação do ligante pode compreender aminoácidos 23-51 da SEQID N2: 1. Em uma outra forma de realização, o sitio deligação do ligante pode compreender aminoácidos 31-51 da SEQID N-: 1. Em uma outra forma de realização, o sitio deligação do ligante pode compreender aminoácidos 31-116 daSEQ ID N-: 1.

Em uma forma de realização, o polipeptideo do RAGEpode ser ligado a um polipeptideo compreendendo um domínioda imunoglobulina ou uma porção (por exemplo, um fragmentodeste) de um domínio da imunoglobulina. Em uma forma derealização, o polipeptideo compreendendo um domínio daimunoglobulina compreende pelo menos uma porção de pelomenos um dos domínios CH2 ou CH3 de uma IgG humana.

A proteína do RAGE ou polipeptideo podecompreender RAGE humano de comprimento pleno (por exemplo,SEQ ID N2: 1), ou um fragmento do RAGE humano. Em uma formade realização, o polipeptideo do RAGE não inclui quaisquerresíduos de seqüência de sinal. A seqüência de sinal do RAGEpode compreender resíduos 1-22 ou resíduos 1-23 do RAGE decomprimento pleno (SEQ ID N2: 1). Nas formas de realizaçãoalternadas, o polipeptideo do RAGE pode compreender umaseqüência que é pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95%, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica ao RAGE humano, ou umfragmento deste. Por exemplo, em uma forma de realização, opolipeptideo do RAGE pode compreender RAGE humano, ou umfragmento deste, com Glicina como o primeiro resíduo aoinvés de um Metionina (ver por exemplo, Neeper et al.r(1992)). Ou, o RAGE humano pode compreender RAGE decomprimento pleno com a seqüência de sinal removida (porexemplo, SEQ ID N2: 2 ou SEQ ID N2: 3) (FIGS. IA e 1B) ouuma porção daquela seqüência de aminoácido.

As proteínas de fusão do RAGE da presente invençãotambém pode compreender RAGEs (por exemplo, SEQ ID N-: 4),um polipeptídeo pelo menos 90 % idêntico ao RAGEs, ou umfragmento do RAGEs. Por exemplo, o polipeptídeo do RAGE podecompreender RAGEs humano, ou um fragmento deste, com Glicinacomo o primeiro resíduo ao invés de uma Metionina (ver porexemplo, Neeper et al. , (1992)). Ou, o RAGE humano podecompreender RAGEs com a seqüência de sinal removida (Ver porexemplo, SEQ ID N2: 5 ou SEQ ID Ns: 6 na FIG. IC ou SEQ IDN2: 45 na FIG. 16A) ou uma porção daquela seqüência deaminoácido. Em outras formas de realização, a proteína doRAGE pode compreender um domínio V (Ver por exemplo, SEQ IDN-: 7 ou SEQ ID N2: 8 na FIG. ID ou SEQ ID N2: 46 na FIG.16A) . Ou, uma seqüência pelo menos 90 % idêntica ao domínioV ou um fragmento deste pode ser usada. Ou, a proteína doRAGE pode compreender um fragmento do RAGE compreendendo umaporção do domínio V (Ver por exemplo, SEQ ID N2: 9 ou SEQ IDN2: 10 na FIG. ID ou SEQ ID N2: 47 na FIG. 16A) . Em umaforma de realização, o sítio de ligação do ligante podecompreender SEQ ID N2: 9, ou uma seqüência pelo menos 90 %idêntica a esta, ou SEQ ID N2: 10, ou uma seqüência pelomenos 90 % idêntica a esta, ou SEQ ID N2: 47, ou umaseqüência pelo menos 90 % idêntica a esta. Ainda em umaoutra forma de realização, o fragmento do RAGE é um peptídeosintético.Por exemplo, o polipeptídeo do RAGE podecompreender aminoácidos 23-116 do RAGE humano (SEQ ID N2: 7)ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, ouaminoácidos 24-116 do RAGE humano (SEQ ID N2: 8) ou umaseqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, ou aminoácidos24-116 do RAGE humano onde Q24 cicliza para formar pE (SEQID N-: 46), ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica aesta, correspondendo ao dominio V do RAGE. Ou, opolipeptídeo do RAGE pode compreender aminoácidos 124-221 doRAGE humano (SEQ ID N-: 11) ou uma seqüência pelo menos 90 %idêntica a esta, correspondendo ao domínio Cl do RAGE. Emuma outra forma de realização, o polipeptídeo do RAGE podecompreender aminoácidos 227-317 do RAGE humano (SEQ ID N2:12) ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta,correspondendo ao domínio C2 do RAGE. Ou, o polipeptídeo doRAGE pode compreender aminoácidos 23-123 do RAGE humano (SEQID N2: 13) ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta,ou aminoácidos 24-123 do RAGE humano (SEQ ID N2: 14) ou umaseqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, correspondendo aodomínio V do RAGE e um ligador de interdomínio a jusante.Ou, o polipeptídeo do RAGE pode compreender aminoácidos 24-123 do RAGE humano onde Q24 cicliza para formar pE (SEQ IDN2: 48), ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta.Ou, o polipeptídeo do RAGE pode compreender aminoácidos 23-226 do RAGE humano (SEQ ID N2: 17) ou uma seqüência pelomenos 90 % idêntica a esta, ou aminoácidos 24-226 do RAGEhumano (SEQ ID N2: 18) ou uma seqüência pelo menos 90 %idêntica a esta, correspondendo ao domínio V, o domínio Cl eo ligador de interdomínio ligando estes dois domínios. Ou, opolipeptídeo do RAGE pode compreender aminoácidos 24-226 doRAGE humano onde Q24 cicliza para formar pE (SEQ ID N-: 50),ou uma seqüência 90 % idêntica a esta. Ou, o polipeptídeo doRAGE pode compreender aminoácidos 23-339 do RAGE humano (SEQID N-: 5) ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta,ou 24-339 do RAGE humano (SEQ ID N-: 6) ou uma seqüênciapelo menos 90 % idêntica a esta, correspondendo ao RAGEs(isto é, codificando os domínios V, Cl, e C2 e ligadores deinterdomínio) . Ou, o polipeptídeo do RAGE pode compreenderaminoácidos 24-339 do RAGE humano onde Q24 cicliza paraformar pE (SEQ ID N-: 45) , ou uma seqüência pelo menos 90 %idêntica a esta. Ou, fragmentos de cada uma destasseqüências podem ser usados.

A proteína de fusão do RAGE pode incluir váriostipos de peptídeos que não são derivados de RAGE ou umfragmento deste. 0 segundo polipeptídeo da proteína de fusãodo RAGE pode compreender um polipeptídeo derivado de umaimunoglobulina. A cadeia pesada (ou porção desta) pode serderivada de qualquer um dos isotipos de cadeia pesadaconhecidos: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε), ou IgA (α).Além disso, a cadeia pesada (ou porção desta) pode serderivada de qualquer um dos subtipos de cadeia pesadaconhecidos: IgGl (γΐ), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3) , IgG4 (γ4), IgAl(αϊ), IgA2 (α2), ou mutações destes isotipos ou subtipos quealteram a atividade biológica. 0 segundo polipeptídeo podecompreender os domínios CH2 e CH3 de uma IgGl humana ou umaporção de qualquer um ou ambos estes domínios. Como umaforma de realização de exemplo, o polipeptideo compreendendoos domínios CH2 e CH3 de uma IgGl humana ou uma porção destepode compreender SEQ ID N2: 38 ou SEQ ID N2: 40. 0 peptídeoda imunoglobulina pode ser codificado pela seqüência deácido nucléico da SEQ ID N2: 39 ou SEQ ID N2: 41. Aseqüência da imunoglobulina na SEQ ID N-: 38 ou SEQ ID N-:40 também pode ser codificada pela SEQ ID N-: 52 ou SEQ ID N2: 53.

A porção Fc da cadeia da imunoglobulina pode serpró-inflamatória in vivo. Assim, em uma forma de realização,a proteína de fusão do RAGE da presente invenção compreendeum ligador de interdomínio derivado de RAGE ao invés de umpolipeptideo de articulação de interdomínio derivado de umaimunoglobulina.

Assim, em uma forma de realização, a proteína defusão do RAGE pode compreender ainda um polipeptideo do RAGEligado diretamente a um polipeptideo compreendendo umdomínio CH2 de uma imunoglobulina, ou um fragmento deste. Emuma forma de realização, o domínio CH2, ou um fragmentodeste compreende SEQ ID N2: 42. Em uma forma de realização,o fragmento da SEQ ID N2: 42 compreende SEQ ID N2: 42 com osdez primeiros aminoácidos removidos.

Em uma forma de realização, o polipeptideo do RAGEcompreende um ligador de interdomínio do RAGE ligado a umdomínio da imunoglobulina do RAGE tal que o aminoácido C-terminal do domínio da imunoglobulina do RAGE é ligado aoaminoácido N-terminal do ligador de interdomínio, e oaminoácido C-terminal do ligador de interdomínio do RAGE éligado diretamente ao aminoácido N-terminal de umpolipeptideo compreendendo um domínio CH2 de umaimunoglobulina, ou um fragmento deste. O polipeptideocompreendendo um domínio CH2 de uma imunoglobulina, ou umaporção deste, pode compreender os domínios CH2 e CH3 de umaIgGl humana, ou uma porção de qualquer um ou ambos estesdomínios. Como uma forma de realização de exemplo, opolipeptideo compreendendo os domínios CH2 e CH3 de uma IgGlhumana, ou uma porção deste, pode compreender SEQ ID N2: 38ou SEQ ID N-: 40.

A proteína de fusão do RAGE da presente invençãopode compreender um domínio único ou domínios múltiplos deRAGE. Também, o polipeptideo do RAGE compreendendo umligador de interdomínio ligado a um domínio daimunoglobulina do RAGE pode compreender um fragmento de umaproteína do RAGE de comprimento pleno. Por exemplo, em umaforma de realização, a proteína de fusão do RAGE podecompreender dois domínios da imunoglobulina derivados daproteína do RAGE e dois domínios da imunoglobulina derivadosde um polipeptideo Fc humano. A proteína de fusão do RAGEpode compreender um primeiro domínio da imunoglobulina doRAGE e um primeiro ligador de interdomínio ligado a umsegundo domínio da imunoglobulina do RAGE e um segundoligador de interdomínio do RAGE, tal que o aminoácido N-terminal do primeiro ligador de interdomínio é ligado aoaminoácido C-terminal do primeiro domínio da imunoglobulinado RAGE, o aminoácido N-terminal do segundo domínio daimunoglobulina do RAGE é ligado ao aminoácido C-terminal doprimeiro ligador de interdominio, o aminoácido N-terminal dosegundo ligador de interdominio é ligado ao aminoácido C-terminal do segundo domínio da imunoglobulina do RAGE, e oaminoácido C-terminal do segundo ligador de interdominio doRAGE é ligado diretamente ao aminoácido N-terminal dopolipeptídeo compreendendo um domínio da imunoglobulina deCh2 ou fragmento deste. Por exemplo, o polipeptídeo do RAGEpode compreender aminoácidos 23-251 do RAGE humano (SEQ IDN-: 19) ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, ouaminoácidos 24-251 do RAGE humano (SEQ ID N-: 20) ou umaseqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, ou aminoácidos24-251 do RAGE humano onde Q24 cicliza para formar pE, ouuma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta (SEQ ID N2:51), correspondendo ao domínio V, o domínio Cl, o ligador deinterdominio ligando estes dois domínios, e um segundoligador de interdominio a jusante de Cl. Em uma forma derealização, uma construção de ácido nucléico compreendendoSEQ ID N-: 30 ou um fragmento deste pode codificar para umaproteína de fusão do RAGE de quatro domínios. Em uma outraforma de realização, construção de ácido nucléicocompreendendo SEQ ID N2: 54 pode codificar para uma proteínade fusão do RAGE de quatro domínios, onde mutações de basesilenciosas para os códons que codificam para prolina (CCGpara CCC) e glicina (GGT para GGG) no C-terminal daseqüência são penetradas para remover um sítio de união deRNA críptico próximo ao códon terminal.

Alternativamente, uma proteína de fusão do RAGE detrês domínios pode compreender um domínio da imunoglobulinaderivado de RAGE e dois domínios da imunoglobulina derivadosde um polipeptídeo Fc humano. Por exemplo, a proteína defusão do RAGE pode compreender um domínio da imunoglobulinado RAGE único ligado por intermédio de um ligador deinterdomínio do RAGE ao aminoácido N-terminal dopolipeptídeo compreendendo um domínio da imunoglobulina deCh2 ou um fragmento deste. Por exemplo, o polipeptídeo doRAGE pode compreender aminoácidos 23-136 do RAGE humano (SEQID N2: 15) ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a estaou aminoácidos 24-13 6 do RAGE humano (SEQ ID N-: 16) ou umaseqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, ou aminoácidos24-136 do RAGE humano onde Q24 cicliza para formar pE, ouuma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta (SEQ ID N-:49), correspondendo ao domínio V do RAGE e um ligador deinterdomínio a jusante. Em uma forma de realização, umaconstrução de ácido nucléico compreendendo SEQ ID N2: 31 ouum fragmento deste pode codificar para uma proteína de fusãodo RAGE de três domínios. Em uma outra forma de realização,construção de ácido nucléico compreendendo SEQ ID N-: 55pode codificar para uma proteína de fusão do RAGE de trêsdomínios, onde mutações de base silenciosas para os códonsque codificam para prolina (CCG para CCC) e glicina (GGTpara GGG) no C-terminal da seqüência são penetradas pararemover um sítio de união de RNA críptico próximo ao códonterminal.

Um fragmento do ligador de interdomínio do RAGEpode compreender uma seqüência de peptídeo que énaturalmente a jusante de, e assim, ligada a um domínio daimunoglobulina do RAGE. Por exemplo, para o domínio V doRAGE, o ligador de interdominio pode compreender seqüênciasde aminoácido que são naturalmente a jusante do domínio V.

Em uma forma de realização, o ligador pode compreender SEQID N-: 21, correspondendo aos aminoácidos 117-123 do RAGE decomprimento pleno. Ou, o ligador pode compreender umpeptídeo tendo porções adicionais da seqüência natural doRAGE. Por exemplo, um ligador de interdominio compreendendovários aminoácidos (por exemplo, 1-3, 1-5, ou 1-10, ou 1-15aminoácidos) a montante e a jusante da SEQ ID N-: 21 podeser usado. Assim, em uma forma de realização, o ligador deinterdominio compreende SEQ ID N2: 23 compreendendoaminoácidos 117-136 do RAGE de comprimento pleno. Ou,fragmentos da SEQ ID N2: 21 deletando, por exemplo, 1, 2, ou3, aminoácidos de cada uma extremidade do ligador podem serusados. Nas formas de realização alternadas, o ligador podecompreender uma seqüência que é pelo menos 70 % idêntica, ou80 % idêntica, ou 90 % idêntica à SEQ ID N2: 21 ou SEQ ID N2: 23.

Para o domínio Cl do RAGE, o ligador podecompreender uma seqüência de peptídeo que é naturalmente ajusante do domínio Cl. Em uma forma de realização, o ligadorpode compreender SEQ ID N2: 22, correspondendo aosaminoácidos 222-251 do RAGE de comprimento pleno. Ou, oligador pode compreender um peptídeo tendo porçõesadicionais da seqüência natural do RAGE. Por exemplo, umligador compreendendo vários (1-3, 1-5, ou 1-10, ou 1-15aminoácidos) aminoácidos a montante e a jusante da SEQ IDN5: 22 pode ser usado. Ou, fragmentos da SEQ ID N-: 22 podeser usados, deletando por exemplo, 1-3, 1-5, ou 1-10, ou 1-15 aminoácidos de cada uma extremidade do ligador. Porexemplo, em uma forma de realização, um ligador deinterdominio do RAGE pode compreender SEQ ID N-: 24,correspondendo aos aminoácidos 222-226. Ou um ligador deinterdominio pode compreender SEQ ID N2: 44, correspondendoaos aminoácidos 318-342 do RAGE.

Carregadores farmaceuticamente aceitáveis podemcompreender qualquer um dos carregadores farmaceuticamenteaceitos padrão conhecidos na técnica. Em uma forma derealização, o carregador farmacêutico pode ser um liquido ea proteína de fusão do RAGE ou construção de ácido nucléicopode estar na forma de uma solução. Em uma outra forma derealização, o carregador farmaceuticamente aceitável podeser um sólido na forma de um pó, um pó liofilizado, ou umtablete. Ou, o carregador farmacêutico pode ser um gel,supositório, ou creme. Nas formas de realização alternadas,o carregador pode compreender um lipossoma, umamicrocápsula, uma célula encapsulada de polímero, ou umvírus. Assim, o termo carregador farmaceuticamente aceitávelabrange, mas não é limitado a, qualquer um dos carregadoresfarmaceuticamente aceitos padrão, tais como água, álcoois,solução salina tamponada com fosfato, açúcares (por exemplo,sacarose ou manitol), óleos ou emulsões tais como emulsõesde óleo/água ou uma emulsão de trigicerídeo, vários tipos deagentes umectantes, tabletes, tabletes revestidos ecápsulas.A administração das proteínas de fusão do RAGE dapresente invenção pode utilizar várias vias. Assim, aadministração da proteína de fusão do RAGE da presenteinvenção pode utilizar injeção intraperitoneal (IP) .

Alternativamente, a proteína de fusão do RAGE pode seradministrada oralmente, intranasalmente ou como um aerossol.Em uma outra forma de realização, administração éintravenosa (IV) . A proteína de fusão do RAGE também podeser injetada subcutaneamente. Em uma outra forma derealização, administração da proteína de fusão do RAGE éintra-arterial. Em uma outra forma de realização, aadministração é sublingual. Também, a administração podeutilizar uma cápsula de liberação com o tempo. Por exemplo,administração subcutânea pode ser útil para tratardistúrbios crônicos quando a auto-administração é desejável.

As composições farmacêuticas podem estar na formade uma solução injetável estéril em um solvente ou veículoparenteralmente não tóxico aceitável. Entre os veículosaceitáveis e solventes que podem ser utilizados estão água,solução de Ringer, 3-butanodiol, solução isotônica decloreto de sódio, ou tampões aquosos, como por exemplo,citrato, acetato, glicina, histidina, fosfato, tampões detris ou succinato fisiologicamente aceitáveis. A soluçãoinjetável pode conter estabilizadores para proteger contradegradação química e formação de agregado. Osestabilizadores podem incluir antioxidantes tais comohidróxi anisol butilado (BHA), e hidróxi tolueno butilado(BHT), tampões (citratos, glicina, histidina) ou tensoativos(polissorbato 80, poloxâmeros). A solução também pode conterpreservantes antimicrobianos, tais como álcool benzílico eparabenos. A solução também pode conter tensoativos parareduzir agregação, tais como Polissorbato 80, poloxômero, ououtros tensoativos conhecidos na técnica. A solução tambémpode conter outro aditivos, tais como açúcar(es) ou soluçãosalina, para ajustar a pressão osmótica da composição paraser similar ao sangue humano.

As composições farmacêuticas podem estar na formade um pó liofilizado estéril para injeção na reconstituiçãocom um diluente. O diluente pode ser água para injeção, águabacteriostática para injeção, ou solução salina estéril. Opó liofilizado pode ser produzido por liofilização de umasolução da proteína de fusão para produzir a proteína naforma seca. Como é conhecido na técnica, a proteínaliofilizada geralmente tem estabilidade aumentada e uma vidaem prateleira mais longa do que uma solução líquida daproteína. O pó liofilizado (torta) pode conter um tampãopara ajustar o pH, como por exemplo citrato, acetato,glicina, histidina, fosfato, tampão de tris ou succinatofisiologicamente aceitáveis. O pó liofilizado também podeconter lioprotetores para manter sua estabilidade física equímica. Os lioprotetores comumente usados são açúcares denão redução e dissacarídeos tais como sacarose, manitol, outrealose. O pó liofilizado pode conter estabilizadores paraproteger contra degradação química e formação de agregado.Estabilizadores podem incluir, mas não são limitados aantioxidantes (BHA, BHT), tampões (citratos, glicina,histidina), ou tensoativos (polissorbato 80, poloxâmeros). Opó liofilizado também pode conter preservantesantimicrobianos, tais como álcool benzilico e parabenos. Opó liofilizado também pode conter tensoativos para reduziragregação, tais como, mas não limitados a, Polissorbato 80 epoloxômero. O pó liofilizado também pode conter aditivos(por exemplo, açúcares ou solução salina) para ajustar apressão osmótica para ser similar ao sangue humano nareconstituição do pó. O pó liofilizado também pode conteragentes encorpantes, tais como açúcares e dissacarideos.

As composições farmacêuticas para injeção tambémpodem estar na forma de uma suspensão oleaginosa. Estasuspensão pode ser formulada de acordo com os métodosconhecidos usando agentes dispersantes ou umectantesadequados e agentes de suspensão descritos acima. Alémdisso, óleos estéreis, fixos são convenientemente utilizadoscomo solvente ou meio de suspensão. Para este propósito,qualquer óleo fixo suave pode ser utilizado usando mono- oudiglicerideos sintéticos. Também, suspensões oleosas podemser formuladas suspendendo-se o ingrediente ativo em um óleovegetal, por exemplo óleo de amendoim, óleo de oliva, óleode gergelim ou óleo de coco, ou em um óleo mineral tal comouma parafina liquida. Por exemplo, ácidos graxos tais comoácido oléico encontram uso na preparação de injetáveis. Assuspensões oleosas podem conter um agente espessante, porexemplo cera de abelha, parafina dura ou álcool cetilico.Estas composições podem ser preservadas pela adição de umantioxidante tal como ácido ascórbico.As composições farmacêuticas da presente invençãotambém podem estar na forma de emulsões de óleo-em-água oususpensões aquosas. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal,por exemplo, óleo de oliva ou óleo de amendoim, ou um óleomineral, por exemplo uma parafina liquida, ou uma misturadestes. Agentes emulsificantes adequados podem ser gomas queocorrem naturalmente, por exemplo goma acácia ou gomatragacanto, fosfatideos que ocorrem naturalmente, porexemplo soja, lecitina, e ésteres ou ésteres parciaisderivados de ácidos graxos e anidridos hexitol, por exemplomonooleato de sorbitano, e produtos de condensação dos ditosésteres parciais com óxido de etileno, por exemplopolioxietileno sorbitano.

Suspensões aquosas também podem conter oscompostos ativos em mistura com excipientes. Taisexcipientes podem incluir agentes de suspensão, por exemplocarboximetilcelulose de sódio, metilcelulose,hidroxipropilmetilcelulose, alginato de sódio,polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma acácia; agentesdispersantes ou umectantes, tais como um fosfatideoocorrendo naturalmente tais como lecitina, ou produtos decondensação de um óxido de alquileno com ácidos graxos, porexemplo estearato de polioxietileno, ou produtos decondensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos decadeia longa, por exemplo, heptadecaetil-eneoxicetanol, ouprodutos de condensação de óxido de etileno com ésteresparciais derivados de ácidos graxos e um hexitol tais comomonooleato de polioxietileno sorbitol, ou produtos decondensação de óxido de etileno com ésteres parciaisderivados de ácidos graxos e anidridos hexitol, por exemplomonooleato de polietileno sorbitano.

Pós dispersáveis e grânulos adequados parapreparação de uma suspensão aquosa pela adição de água podemfornecer o composto ativo em mistura com um agentedispersante, agente de suspensão, e um ou mais preservantes.Preservantes, agentes dispersantes, e agentes de suspensãoadequados são descritos acima.

As composições também podem estar na forma desupositórios para administração retal dos compostos dainvenção. Estas composições podem ser preparadas misturando-se o medicamento com um excipiente não irritante adequadoque é sólido em temperaturas habituais mas liquido natemperatura retal e assim, fundirá no reto para liberar omedicamento. Tais materiais incluem manteiga de cacau epolietileno glicóis, por exemplo.

Para uso tópico, cremes, ungüentos, geléias,soluções ou suspensões contendo os compostos da invençãopodem ser usados. Aplicações tópicas também podem incluircolutórios e gargarejos. Preservantes e antioxidantesadequados tais como BHA e BHT, dispersantes, tensoativos, outampões podem ser usados.

Os compostos da presente invenção também podem seradministrados na forma de sistemas de liberação delipossoma, tais como vesiculas unilamelares pequenas,vesiculas unilamelares grandes, e vesiculas multilamelares.Lipossomas podem ser formados de uma variedade defosfolipídeos, tais como colesterol, estearilamina, oufosfatidilcolinas.

Em certas formas de realização, os compostos dapresente invenção podem ser modificados para reparar ainda aliberação da circulação por enzimas metabólicas. Em umaforma de realização, os compostos podem ser modificados pelaligação covalente de polímeros solúveis em água tais comopolietileno glicol (PEG), copolímeros de PEG e polipropilenogilcol, polivinilpirrolidona ou poliprolina, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinilico, e semelhantes. Taismodificações também podem aumentar a solubilidade docomposto em solução aquosa. Polímeros tais como PEG podemser covalentemente ligados a um ou mais resíduos de aminoreativos, resíduos de sulfidrila ou resíduos de carboxila.Numerosas formas ativadas de PEG foram descritas, incluindoésteres ativos de ácido carboxílico ou derivados decarbonato, particularmente aqueles em que os grupos departida são N-hidroxissuccinimida, p-nitrofenol, imdazol oul-hidróxi-2-nitrobenzeno-3 sulfona para reação com gruposamino, derivados de multimodo ou de halo acetila para reaçãocom grupos sulfidrila, e derivados de amino hidrazina ou dehidrazida para reação com grupos carboidrato.

Métodos adicionais para preparação de formulaçõesde proteína que podem ser usadas com as proteínas de fusãoda presente invenção são descritos nas Patentes U.S. N—6.267.958, e 5.567.677.

Em um outro aspecto da presente invenção, asproteínas de fusão do RAGE da invenção podem ser utilizadasem tratamentos terapêuticos adjuvantes ou terapêuticos decombinação com outros agentes terapêuticos conhecidos. Aseguinte é uma listagem não exaustiva de adjuvantes eagentes terapêuticos adicionais que podem ser utilizados emcombinação com os moduladores de proteína de fusão do RAGEda presente invenção:

Classificações farmacológicas de agentesanticâncer:

1.Agentes alquilantes: Ciclofosfamida,nitrosouréias, carboplatina, cisplatina, procarbazina

2.Antibióticos: Bleomicina, Daunorrubicina,Doxorrubicina

3.Antimetabólitos: Metotrexato, Citarabina,Fluorouracila, Azatioprina, 6-Mercaptopurina, e agentesquimioterápicos do câncer citotóxicos

4.Alcalóides de plantas: Vinblastina, Vincristina,Etoposida, Paclitaxel,

5.Hormônios: Tamoxifeno, Acetato de octreotida,Finasterida, Flutamida

6.Modificadores de resposta biológica:Interferons, Interleucinas

Classificações farmacológicas de tratamento paraArtrite Reumatóide

1.Analgésicos: Aspirina

2.NSAIDs (medicamentos anti-inflamatórios nãoesteroidais): Ibuprofeno, Naproxeno, Diclofenaco

3.DMARDs (Medicamentos anti-reumáticos quemodificam a doença): Metotrexato, preparações de ouro,hidroxicloroquina, sulfasalazina

4. Modificadores de resposta biológica, DMARDs:Etanercept, Infliximab, Glucocorticóides, tais comobeclometasona, metilprednisolona, betametasona, prednisona,dexametasona, e hidrocortisona

Classificações farmacológicas de tratamento paraDiabetes Melito

1.Sulfoniluréias: Tolbutamida, Tolazamida,Gliburida, Glipizida

2.Biguanidas: Metformina

3.Agentes orais diversos: Acarbose, Troglitazona

4.Insulina

Classificações farmacológicas de "tratamento paraDoença de Alzheimer

1.Inibidor Colinesterase: Tacrina, Donepezila

2. Antipsicóticos: Haloperidol, Tioridazina

3. Antidepressivos: Desipramina, Fluoxetina,Trazodona, Paroxetina

4. Anticonvulsivos: Carbamazepina, Ácido valpróico

Em uma forma de realização, as composições dapresente invenção podem compreender uma quantidadeterapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão do RAGE emcombinação com um único ou múltiplos agentes terapêuticosadicionais. Além dos agentes descritos até aqui, osseguintes agentes terapêuticos podem ser usados emcombinação com as proteínas de fusão do RAGE da presenteinvenção: imunossupressores, tais como ciclosporina,tacrolimus, rapamicina e outros imunossupressores do tipoFK-506.

Em uma forma de realização, a presente invençãopode fornecer portanto um método de tratar doenças mediadaspor RAGE, o método compreende administrar a um paciente emnecessidade deste, uma quantidade terapeuticamente eficaz deuma proteína de fusão do RAGE em combinação com agentesterapêuticos selecionados do grupo que consiste de agentesalquilantes, antimetabólitos, alcalóides de planta,antibióticos, hormônios, modificadores de respostabiológica, analgésicos, NSAIDs, DMARDs, modificadores deresposta biológica (por exemplo, glucocorticóides),sulfoniluréias, biguanidas, insulina, inibidores decolinesterase, antipsicóticos, antidepressivos,anticonvulsivos, e imunossupressores, tais comociclosporina, tacrolimus, rapamicina e outrosimunossupressores do tipo FK-506. Em uma outra forma derealização, a presente invenção fornece a composiçãofarmacêutica, da invenção como descrito acima, compreendendoainda um ou mais agentes terapêuticos selecionados do grupoque consiste de agentes alquilantes, antimetabólitos,alcalóides de planta, antibióticos, hormônios, modificadoresde resposta biológica, analgésicos, NSAIDs, DMARDs,modificadores de resposta biológica (por exemplo,glucocorticóides), sulfoniluréias, biguanidas, insulina,inibidores de colinesterase, antipsicóticos,antidepressivos, anticonvulsivos, e imunossupressores, taiscomo ciclosporina, tacrolimus, rapamicina e outrosimunossupressores do tipo FK-506.EXEMPLOS

Características e vantagens do conceito inventivocoberto pela presente invenção são ainda ilustrados nosexemplos que seguem.

Exemplo IA: Produção de Proteínas de Fusão do RAGEDois plasmídios foram construídos para expressarproteínas de fusão RAGE-IgG. Ambos plasmídios foramconstruídos ligando-se comprimentos diferentes de umaseqüência 5' de DNAc do RAGE humano com o mesma seqüência 3'de DNAc da IgG humana (γΐ) . Estas seqüências de expressão(isto é, produtos de ligação) depois foram inseridas novetor de expressão pcDNA3,l (Invitrogen, CA). As seqüênciasde ácido nucléico que codificam a proteína de fusão do RAGEcodificando a região são mostradas nas FIGS. 2 e 3. Paraproteína de fusão do RAGE TTP-4000, a seqüência de ácidonucléico de 1 a 753 (destacada em negrito) codifica aseqüência de proteína N-terminal do RAGE, ao passo que aseqüência de ácido nucléico de 754 a 1386 codifica aseqüência de proteína da IgG (FIG. 2) . Para TTP-3000, aseqüência de ácido nucléico de 1 a 408 (destacada emnegrito) codifica a seqüência de proteína N-terminal doRAGE, ao passo que a seqüência de ácido nucléico de 409 a1041 codifica a seqüência de proteína da IgG (FIG. 3).

Para produzir as proteínas de fusão do RAGE, osvetores de expressão compreendendo as seqüências de ácidonucléico da SEQ ID N-: 30 ou SEQ ID N2: 31 foramestavelmente transfectados nas células de CHO.Transformantes positivos foram selecionados para resistênciaà neomicina conferida pelo plasmidio e clonados. Clones dealta produção como detectados por análise Western Blot desobrenadante foram expandidos e o produto gênico foipurificado por cromatografia de afinidade usando colunas daProteína A. A expressão foi otimizada de modo que célulasproduziram TTP-4000 recombinante em níveis de cerca de 1,3gramas por litro.

Exemplo IB: Produção de Proteínas de Fusão do RAGE

Um plasmidio foi construído para expressarproteínas de fusão RAGE-IgG. 0 plasmidio foi construídoligando-se uma seqüência 5' de DNAc do RAGE humano com umaseqüência 3' de DNAc da IgG humana (γΐ) . PCR foi usada paraampliar o DNAc. Além disso, na extremidade 5', o iniciadorda PCR adicionou um sítio de enzima de restrição de Eco RI apartir da clonagem e uma seqüência de iniciação de traduçãode consenso Kozak. Na extremidade 3', o iniciador da PCRadicionou uma restrição de Xho I exatamente antes do códonterminal. Na extremidade 3', o iniciador da PCR tambémincluiu duas mutações de base silenciosas que removem umsítio de união de RNA críptico na porção da imunoglobulinapróximas ao códon terminal. 0 códon codificando para prolina(resíduo 409 com base na numeração da seqüência de proteínana SEQ ID N-: 32) foi modificado de CCG para CCC, e o códoncodificando para glicina (resíduo 410 com base na numeraçãoda seqüência de proteína na SEQ ID N2: 32) foi modificado deGGT para GGG. 0 fragmento da PCR foi digerido com Eco RI eXho I e depois inserido em um plasmidio retrovetor (pCNS-newMCS-WPRE (new ori), disponível da Gala, Inc.) que foidigerido com Mfe I ^para formar uma extremidade comparável àextremidade com Eco RI) e digerido com Xho I. Á porçãoinserida do plasmidio clonado e junções de clonagem foramseqüenciadas para garantir que mutações não ocorressemdurante a clonagem.

Para produzir a proteína de fusão do RAGE-IgG, ovetor de expressão compreendendo a seqüência de ácidonucléico SEQ ID N2: 54 foi estavelmente transfectada emcélulas de CHO.

A seqüência da proteína de fusão do RAGE TTP-4000isolada expressada pelas células transfectadas foiconfirmada por vários estudos de caracterização como SEQ DDN-: 34 ou SEQ ID N2: 56, ou tanto SEQ ID N-: 34 quanto SEQ IDN2: 56. Assim, a seqüência de sinal codificada pelosprimeiros 23 aminoácidos da SEQ ID N-: 32 foi clivada e oresíduo N-terminal foi glutamina (Q) ou ácido piroglutâmico(pE) ou uma mistura destes. Estudos de caracterização tambémmostraram sítios de glicosilação em N2 e N288 (com base nanumeração da SEQ ID N-: 34 ou SEQ ID N-: 56) e mostraram quea região CH3 da proteína de fusão do RAGE pode ter seuresíduo C-terminal separado por clivagem através de umamodificação pós tradução quando expressado neste sistemarecombinante.

Exemplo 2: Método para testar a atividade de umaproteína de fusão do RAGE-IgGl

A.União do ligante in vitro:

Ligantes do RAGE conhecidos foram revestidos nasuperfície de placas Maxisorb em uma concentração de 5microgramas por reservatório. Placas foram incubadas a 4o Cdurante a noite. A seguir da incubação do ligante, placasforam aspiradas e um tampão de bloqueio de 1 % de BSA em 50mM de tampão de imidizol (pH 7,2) foi adicionado às placasdurante 1 hora na temperatura ambiente. As placas depoisforam aspiradas e/ou lavadas com tampão de lavagem (20 mM deImidizol, 150 mM de NaCl, 0,05 % de Tween-20, 5 mM de CaCl2e 5 mM de MgCl2, pH 7,2). Uma solução de TTP-3000 (TT3) emuma concentração inicial de 1,082 mg/mL e uma solução deTTP-4000 (TT4) em uma concentração inicial de 370 μg/mLforam preparadas. A proteína de fusão do RAGE foi adicionadaem diluições crescentes da amostra inicial. A proteína defusão do RAGE foi deixada incubar com o ligante imobilizadoa 37° C durante uma hora depois que a placa foi lavada eavaliada para a ligação da proteína de fusão do RAGE.Ligação foi detectada pela adição de um complexo deimunodetecção contendo uma IgGl humana anti-camundongomonoclonal diluída a 1:11,000 a uma concentração de ensaiofinal (FAC) de 21 ng/100 \iL, uma IgG anti-camundongo decabra biotinilada diluída a 1:500, para um FAC de 500 ng/gL,e uma fosfatase alcalina ligada por avidina. O complexo foiincubado com a proteína de fusão do RAGE imobilizada duranteuma hora na temperatura ambiente depois que a placa foilavada e o substrato de fosfatase alcalina para-nitrofenilfosfato (PNPP) foi adicionado. Ligação do complexoà proteína de fusão do RAGE imobilizada foi quantificadamedindo-se a conversão de PNPP em para-nitrofenol (PNP) quefoi medido espectrofotometricamente a 405 nm.Como ilustrado na FIG. 7, as proteínas de fusão doRAGE TTP-4 000 (TT4) e TTP-3000 (TT3) especificamenteinteragem com ligantes do RAGE conhecidos como beta amilóide(Abeta), SlOOb (S100), e anfoterina (Ampho). Na ausência deligante, isto é, revestimento de BSA sozinho (BSA ou BSA +lavagem) não houve aumento na absorvência em níveisatribuíveis para ligação não específica do complexo deimunodetecção. Onde beta amilóide é usado como o ligantemarcado, pode ser necessário pré-incubar o beta amilóideantes do ensaio. Pré-incubação pode permitir que o betaamilóide se auto-agregue na forma de folha dobrada, comobeta amilóide pode preferencialmente ligar ao RAGE na formade uma folha dobrada.

Evidência adicional para uma interação específicaentre proteínas de fusão do RAGE TTP-4000 e TTP-3000 comligantes do RAGE é exemplificada nos estudos mostrando queum ligante do RAGE é capaz de competir eficazmente com umligante do RAGE conhecido para ligar às proteínas de fusãodo RAGE. Nestes estudos, beta amilóide (Α-beta) foiimobilizado em uma placa Maxisorb e a proteína de fusão doRAGE adicionada como descrito acima. Além disso, um ligantedo RAGE foi adicionado a alguns dos reservatórios ao mesmotempo como a proteína de fusão do RAGE.

Foi descoberto que o ligante do RAGE pode bloqueara ligação de TTP-4000 (TT4) em cerca de 25 % a 30 % ondeTTP-4000 estava presente a 123 μg/mL (diluição de 1:3, FIG.8). Quando a solução inicial de TTP-4000 foi diluída por umfator de 10 ou 30 (1:10 ou 1:30), a ligação da proteína defusão do RAGE ao ligante imobilizado foi completamenteinibida pelo ligante do RAGE. Similarmente, o ligante doRAGE bloqueou a ligação de TTP-3000 (TT3) em cerca de 50 %onde TTP-3000 estava presente a 360 μg/mL (diluição de 1:3,FIG. 9) . Quando a solução inicial de TTP-3000 foi diluídapor um fator de 10 (1:10), a ligação da proteína de fusão doRAGE ao ligante imobilizado foi completamente inibida peloligante do RAGE. Assim, a especificidade de ligação daproteína de fusão do RAGE ao ligante do RAGE dependeu dadose. Também, como mostrado nas FIGS. 8 e 9, não houveessencialmente ligação detectada na ausência de proteína defusão do RAGE,usando apenas o complexo de imunodetecção("Complexo sozinho").

B.Efeito das proteínas de fusão do RAGE em ensaioscom base celular

O trabalho anterior tem mostrado que as célulasTHP-I mielóides podem secretar TNF-α em resposta aosligantes do RAGE. Neste ensaio, células THP-I foramcultivadas em meio RPM-1640 suplementado com 10 % de FBSusando um protocolo provido por ATCC. As células foraminduzidas para secretar TNF-α por intermédio de estimulaçãodo RAGE com 0,1 mg/ml de SlOOb tanto na ausência quanto napresença das proteínas de fusão do RAGE TTP-3000 (TT3) ouTTP-4000 (TT4) (10 μg), RAGEs (10 μς) , e uma IgG humana (10μς) (isto é, como um controle negativo) . A quantidade deTNF-α secretada pelas células THP-I foi medida 24 horasdepois da adição das proteínas à cultura da célula usando umkit ELISA comercialmente disponível para TNF-α. (R&DSystems, Minneapolis, MN) . Os resultados na FIG. 10demonstram que as proteínas de fusão do RAGE inibem aprodução induzida por SlOOb/RAGE de TNF-α nestas células.Como mostrado na FIG. 10, na adição de 10 μς da proteína defusão do RAGE TTP-3000 ou TTP-4000, a indução de TNF-α porSlOOb (0,1 mg/ml FAC) foi reduzida em cerca de 45 % a 70 %,respectivamente. A proteína de fusão TTP-4000 pode ser pelomenos tão eficaz em indução de bloqueio por SlOOb de TNF-αquanto é RAGEs (FIG. 10). Especificidade da inibição para asseqüências de RAGE de TTP-4000 e TTP-3000 é mostrada peloexperimento em que IgG sozinha foi adicionada às célulasestimuladas por SlOOb. Adição de IgG e SlOOb ao ensaiomostra os mesmos níveis de TNF-α como SlOOb sozinho.Especificidade da inibição de TNF-α indução por TTP-4000 eTTP-3000 para seqüências de RAGE da proteína de fusão doRAGE é mostrada por um experimento em que IgG sozinha foiadicionada às células estimuladas por SlOOb. Pode serobservado que a adição de IgG, isto é, IgG humana sem aseqüência do RAGE (IgG humana Sigma adicionada a 10μς/reservatório) , e SlOOb ao ensaio mostra os mesmos níveisde TNF-α como SlOOb sozinho.

Exemplo 3: Perfil Farmacocinético de TTP-4000

Para determinar se TTP-4000 teria um perfilfarmacocinético superior quando comparado ao RAGEs humano,ratos e primatas não humanos receberam uma injeçãointravenosa (IV) de TTP-4000 (5 mg/kg) e depois o plasma foiavaliado quanto a presença de TTP-4000. Nestes experimentos,dois macacos machos puros receberam uma dose única de TTP-4000 do bolo IV (5 mg/ml/kg) em uma veia periférica seguidopor um fluxo de solução salina de 1,0 mililitro (mL)aproximado. Amostras de sangue (aproximadamente 1,0 mL)foram coletadas na pré-dose (isto é, antes da injeção deTTP-4000), ou a 0,083, 0,25, 0,5, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72,96, 120, 168, 240, 288, e 336 horas após a dose em tuboscontendo heparina de litio. Seguindo a coleta, os tubosforam colocados em gelo úmido (máximo de 30 minutos) até acentrifugação sob resfriamento (em 2 a 8o C) em 1500 χ gdurante 15 minutos. Cada amostra de plasma colhida depoisfoi armazenada congelada (-70° C ± 10° C) até ser avaliadapara polipeptideo do RAGE usando um ELISA em vários pontosno tempo a seguir da injeção, como descrito no Exemplo 6.

O perfil cinético mostrado na FIG. 11 revela queuma vez que TTF-4000 tenha saturado seus ligantes comoevidenciado pela inclinação ligeiramente acentuada da fasealfa em 2 animais, ele retém uma meia vida terminal de maisdo que 300 horas. Esta meia vida é significantemente maiordo que a meia vida do RAGEs humano no plasma (geralmentecerca de 2 horas) e fornece uma oportunidade de injeçõesúnicas para indicações agudas e semi-crônicas. Na FIG. 11cada curva representa um animal diferente sob as mesmascondições experimentais.

Exemplo 4: Ativação de TTP-4000 Fc

Experimentos foram realizados para medir aativação do receptor Fc por proteína de fusão do RAGE TTP-4000 quando comparados à IgG humana. Ativação do receptor Fcfoi medida medindo-se a segregação de TNF-α das células THP-1 que expressam o receptor de Fc. Nestes experimentos, umaplaca de 96 reservatórios foi revestida com 10μς/reservatório de TTP-4000 ou IgG humana. A estimulação deFc resulta na segregação de TNF-α. A quantidade de TNF-α foimedida por um Ensaio Imunoabsorvente Ligado a Enzima(ELISA).

Assim, neste ensaio, a linhagem de célulamielóide, THP-I (ATTC # TIB-202) foi mantida no meio RPMI-1640 suplementado com 10 % de soro bovino fetal de acordocom as instruções da ATCC. Tipicamente, 40.000 a 80.000células por reservatório foram induzidas para secretar TNF-alfa por intermédio da estimulação do receptor Fc por pré-revestimento do reservatório com 10 ^g/reservatório de caloragregado (63° C durante 30 min) TTP-4000 ou IgGl humana. Aquantidade de TNF-alfa secretada pelas células THP-I foimedida nos sobrenadantes coletados de culturas de 24 horasde células nos reservatórios tratados usando um kit TNFELISA comercialmente disponível (R&D Systems, Minneapolis,MN # DTA00C) de acordo com as instruções.

Resultados são mostrados na FIG. 12 onde pode serobservado que TTP-4000 gera menos do que 2 ng/reservatóriode TNF e IgG gerou mais do que 40 ng/reservatório.

Exemplo 5: Atividade in vivo de TTF-4000A atividade de TTP-4000 foi comparada a RAGEs emvários modelos in vivo de doença humana.

A.TTP-4000 em um modelo animal com restenoseA proteína de fusão do RAGE TTP-4000 foi avaliadaem um modelo de rato diabético com restenose que envolveumedir a proliferação muscular lisa e expansão intima de 21dias a seguir da lesão vascular. Nestes experimentos, lesãopor balão da artéria carótida comum esquerda foi realizadaem ratos diabéticos e não diabéticos Zucker usandoprocedimento padrão. Uma dose de carga (3 mg/rato) de IgG,TTP-4000 ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) foiadministrada intraperitonealmente (IP) um dia antes dalesão. Uma dose de manutenção foi liberada em diasalternados até o Ί- dia depois da lesão (isto é, no 1, 3, 5e 7 dia depois da lesão). A dose de manutenção foi alta = 1mg/animal para um grupo, ou baixa = 0,3 mg/animal para osegundo grupo. Para medir a proliferação da célula muscularlisa vascular (VSMC), animais foram sacrificados no 4- e 21-dia depois da lesão.

Para a medição da proliferação celular, animais no4- dia receberam injeção intraperitoneal debromodeoxiuridina (BrDdU) de 50 mg/kg em 18, 12, e 2 horasantes da eutanásia. Depois do sacrifício, as artériascarótidas esquerda e direita inteiras foram colhidas.

Espécimes foram armazenados em Histochoice durante pelomenos 24 horas antes da inclusão. Avaliação da proliferaçãode VSMC foi realizada usando anticorpo monoclonal anti-BrdUde camundongo. Um anticorpo secundário anti-camundongo decabra marcado com fluorescência foi aplicado. 0 número denúcleos de BrdU positivos por seção foi contado por doisobservadores que desconheciam os regimes de tratamento.

Os ratos remanescentes foram sacrificados em 21dias para análise morfométrica. Análises morfométricas foramrealizadas por um observador alheio aos grupos de estudo,usando software de planimetria microscópica digitalcomputadorizada Image-Pro Plus em seções em série, (5 mmseparados), artérias carótidas coloridas por coloração deVan Gieson. Todos os dados foram expressados como médio ±SD. Análise estatística foi realizada com uso do softwareSPSS. Variáveis continuas foram comparadas usando testes tnão emparelhados. Um valor de P < 0,05 foi considerado serestatisticamente significante.

Como observado nas FIGS. 13A e 13B, tratamento comTTP-4 000 significantemente reduziu a razão intima/meio eproliferação celular muscular lisa vascular em uma forma dedose responsiva. Na FIG. 13B, o eixo y representa o númerode células proliferativas de BrdU.

B.TTP4000 em um modelo animal de AD

Experimentos foram realizados para avaliar se TTP-4000 pode afetar a formação amilóide e disfunção cognitivaem um modelo de camundongo de AD. Os experimentos utilizaramcamundongos transgênicos expressando a proteína precursoraamilóide mutante Swedish humana (APP) sob o controle dopromotor de cadeia PDGF-B. Com o passar do tempo, estescamundongos geraram níveis altos do ligante do RAGE, betaamilóide (Αβ). Previamente, tratamento do RAGEs durante 3meses foi mostrado para reduzir tanto a formação de placaamilóide no cérebro quanto o aumento associado nosmarcadores inflamatórios neste modelo.

Os camundongos APP (macho) usados nesteexperimento foram designados por microinjeção do gene APPhumano (com as mutações de Swedish e London) em óvulos decamundongo sob o controle do promotor gênico de cadeia dofator B de crescimento derivado da plaqueta (PDGF-B) . Oscamundongos foram gerados em uma base C57BL/6 e foramdesenvolvidos por Molecular Terapeutics Inc. Animais foramalimentados à vontade e mantidos por emparceiramento irmão-irmã. Os camundongos gerados desta construção desenvolvemdepósitos amilóide a partir dos 6 meses de idade. Animaisforam envelhecidos durante 6 meses e depois mantidos durante90 dias e sacrificados para quantificação de amilóide.

Camundongos transgênicos APP administraram oveiculo ou TTP4000 em dias intercalados [qod (i.p.)] durante90 dias a partir dos 6 meses de idade. No final doexperimento, animais foram sacrificados e examinados quantoà carga da placa Αβ no cérebro (isto é, número de placa). Umgrupo APP de controle de 6 meses foi usado para determinar ovalor de referência de depósitos de amilóide. Além disso, nofinal do estudo, os animais foram submetidos a análisecomportamental (labirinto de água Morris). Os investigadoresdesconheciam os compostos do estudo. Amostras foramfornecidas aos camundongos a 0,25 ml/camundongo/em diasintercalados. Além disso, a um grupo de camundongos foramfornecidos 200 μg/dia do RAGEs humano.

1.Deposição de Beta Amilóide

Para examinação histológica, os animais foramanestesiados com uma injeção intraperitoneal (IP) depentobarbital de sódio (50 mg/kg). Os animais foramtranscardialmente perfusados com 4o C de solução salinatamponada de fosfato (PBS) seguido por 4 % deparaformaldeído. Os cérebros foram removidos e colocados em4 % de paraformaldeído durante a noite. Os cérebros foramprocessados quanto à parafina e embebidos. Dez seções emsérie de 30 μπι de espessura através do cérebro foramobtidas. Seções foram submetidas ao anticorpo primáriodurante a noite a 4°C (anticorpo de peptídeo Αβ) de modo adetectar os depósitos de amilóide no cérebro dos animaistransgênicos (Guo et al., J. Neurosci., 22:5900-5909(2002)). Seções foram lavadas em solução salina tamponadacom Tris (TBS) e anticorpo secundário foi adicionado eincubado durante 1 hora na temperatura ambiente. Depois dalavagem, as seções foram incubadas como instruído no kitVector ABC Elite (Vector Laboratories) e coloridas com ácidodiaminobenzóico (DAB). As reações foram interrompidas emágua e revestidas depois do tratamento com xileno. A áreaamilóide em cada seção foi determinada com um sistema deanálise de imagem auxiliado por computador, que consiste deum computador Power Macintosh equipado com uma câmeraHitachi CCD de cartão de captura de quadro Quick Capture,montada em um microscópio Olympus e suporte de câmera.Software de Análise de Imagem NIH, v. 1,55 foi usado. Asimagens foram capturadas e a área total de amilóide foideterminada nas dez seções. Um único operador quedesconhecia o estado do tratamento realizou todas asmedições. A soma dos volumes de amilóide das seções e adivisão pelo número total de seções foram feitas paracalcular o volume de amilóide.Para análise quantitativa, um ensaioimunossorvente ligado a enzima (ELISA) foi usado para mediros níveis de Αβ, AptotaI e Αβχ-42 totais humanos nos cérebrosde camundongos transgênicos APP (Biosource International,Camarillo, CA) . Aptotai e Αβι-42 foram extraídas de cérebros decamundongo por cloridreto de guanidina e quantificadas comodescrito pelo fabricante. Este ensaio extrai o peptídeo Αβtotal do cérebro (tanto solúvel quanto agregado).

2.Função Cognitiva

O teste de labirinto de água Morris foi realizadocomo segue: Todos os camundongos foram testados uma vez noteste de labirinto de água Morris no final do experimento.Camundongos foram treinados em um labirinto de água de campoaberto de 1,2 m. O tanque foi enchido com uma profundidadede 30 cm com água e mantido a 25° C. A plataforma de saída(10 cm quadrados) foi colocada 1 cm abaixo da superfície daágua. Durante as experiências, a plataforma foi removida dotanque. O teste condicionado foi realizado no tanquecircundado com cortinas brancas para esconder quaisquercondicionamentos extra labirinto. Todos os animais sofrerampré-treinamento não espacial (NSP) durante três diasconsecutivos. Estas experiências são para preparar osanimais para o teste comportamental final para determinar aretenção de memória para encontrar a plataforma. Estasexperiências não foram registradas, mas foram apenas parapropósitos de treinamento. Para os estudos de treinamento eaprendizagem, as cortinas foram removidas paracondicionamentos extra labirinto (isto permitiu aidentificação de animais com dificuldades para nadar). No 1-dia, os camundongos foram colocados na plataforma encobertadurante 20 segundos (experiência 1), para as experiências 2a 3 animais foram liberados na água em uma distância de 10cm da plataforma condicionada ou plataforma encoberta(experiência 4) e deixados nadar na plataforma. No segundodia de experiências, a plataforma encoberta foi movidaaleatoriamente entre o centro do tanque ou o centro de cadaquadrante. Os animais foram liberados no tanque,aleatoriamente diante da parede e foram permitidos 60segundos para atingir a plataforma (3 experiências). Naterceira experiência, animais passaram por trêsexperiências, duas com uma plataforma encoberta e uma comuma plataforma condicionada. Dois dias após o NSP, animaisforam submetidos às experiências comportamentais finais(teste de labirinto de água Morris). Para estas experiências(3 por animal), a plataforma foi colocada no centro de umquadrante do tanque e os animais liberados diante da paredeem uma forma aleatória. Ao animal foi permitido encontrar aplataforma ou nadar durante 60 segundos (período delatência, o tempo que ele leva para encontrar a plataforma).Todos os animais foram testados dentro de 4 a 6 horas dedosagem e foram aleatoriamente selecionados para teste porum operador que desconhecia o grupo de teste.

Os resultados são expressados como a média ±desvios padrão (SD) . A significância das diferenças nosestudos de amilóide e comportamental foram analisados usandoum teste t. Comparações foram feitas entre o grupo decontrole APP de 6 meses de idade e os animais tratados comTTP-4000, assim como, o grupo tratado com veiculo de APP de9 meses de idade e os animais tratados com TTP-4000. Asdiferenças abaixo de 0,05 foram consideradas significantes.

Alterações percentuais em amilóide e comportamento foramdeterminados tomando-se a soma dos dados em cada grupo edivisão pela comparação (isto é, 1, i.ρ./controle de seismeses = % de alteração).

As FIGS. 14A e 14B mostram que camundongostratados durante 3 meses com TTP-4000 ou RAGEs de camundongotiveram poucas placas Αβ e menos disfunção cognitiva do queo veiculo e os animais tratados com IgGl humana (IgGl) decontrole negativo. Estes dados indicam que TTP-4000 é eficazem reduzir patologia de AD em um modelo de camundongotransgênico. Também foi descoberto que como RAGEs, TTP-4000pode reduzir as citocinas inflamatórias IL-I e TNF-α (dadosnão mostrados).

C.Eficácia de TTP-4000 em um modelo animal deacidente vascular cerebral

TTP-4000 foi também comparado ao RAGEs em umadoença relevante do modelo animal de acidente vascularcerebral. Neste modelo, a artéria carótida mediana de umcamundongo foi ligada durante 1 hora seguido por 23 horas dereperfusão no ponto em que camundongos foram sacrificados ea área do infarto no cérebro foi avaliada. Camundongos foramtratados com RAGEs ou TTP-4000 ou imunoglobulina de controleexatamente antes da reperfusão.

Nestes experimentos, machos C57BL/6 foraminjetados com veículo a 250 μΐ/camundongo ou artigos deteste de TTP (TTP-3000, TTP-4000 a 250 μΐ/camundongo).Camundongos receberam injeções intraperitoneais, 1 horadepois da iniciação da isquemia. Camundongos foramsubmetidos a uma hora de isquemia cerebral seguido por 24horas de reperfusão. Para induzir isquemia, cada camundongofoi anestesiado e a temperatura corpórea foi mantida em 36 a37° C por aquecimento externo. A artéria carótida comumesquerda (CCA) foi exposta através de uma incisão mediana nopescoço. Um grampo microcirúrgico foi colocado em torno daorigem da artéria carótida interna (ICA). A extremidadedistai de ECA foi ligada com seda e transectada. UM fio deseda 6-0 foi passado frouxamente em torno do toco da ECA. Aextremidade polida em quente de uma sutura de náilon foisuavemente inserida no toco da ECA. 0 laço da seda 6-0 foiapertado em torno do toco e a sutura de náilon foi avançadaem e através da artéria carótida interna (ICA), até repousarna artéria cerebral anterior, desse modo ocluindo acomunicação anterior e as artérias cerebrais medianas.

Depois que a sutura de náilon foi colocada no lugar durante1 hora, o animal foi reanestesiado, a temperatura retal foiregistrada e a sutura foi removida e a incisão fechada.

0 volume do infarto foi determinado por anestesiados animais com uma injeção intraperitoneal de pentobarbitalsódio (50 mg/kg) e depois removidos os cérebros. Os cérebrosdepois foram seccionados em quatro seções de 2 mm através daregião infratada e colocados em 2 % de cloreto detrifeniltetrazólio (TTC) durante 30 minutos. Depois a asseções foram colocadas em 4 % de paraformaldeído durante anoite. A área de infarto em cada seção foi determinada comum sistema de análise de imagem auxiliado por computador,que consiste de uma computador Power Macintosh equipado comuma câmera Hitachi CCD de cartão de captura de quadro QuickCapture, montada em um suporte de câmera. NIH Image AnalysisSoftware, v. 1,55 foi usado. As imagens foram capturadas e aárea total do infarto foi determinada nas seções. Umoperador único que desconhecia o estado do tratamentorealizou todas as medições. A soma dos volumes do infartodas seções calculou o volume total do infarto. Os resultadossão expressados como a média ± desvio padrão (SD) . Asignificância da diferença nos dados do volume do infartofoi analisada usando um teste t.

Como ilustrado pelos dados na Tabela 2, TTP-4000foi mais eficaz do que RAGEs em limitar a área de infartonestes animais sugerindo que TTP-4000, por causa de sua meiavida útil no plasma, seja capaz de manter maior proteçãonestes camundongos.

Exemplo 6: Detecção de Proteína de Fusão RAGE porELISA

Inicialmente, 50 uL do anticorpo monoclonalespecífico do RAGE IHBlOl em uma concentração de 10 ug/mL em1 X PBS pH 7,3 foram revestido em placas por intermédio deincubação durante a noite. Quando prontas para o uso, asplacas foram lavadas três vezes com 300 uL de tampão delavagem 1 χ Imidazol-Tween e bloqueadas com 1 % de BSA. Asamostras (diluídas) e diluições padrão de diluições de TTP-4000 conhecidas são adicionadas a um volume final de 100 uL.As amostras são deixadas incubar na temperatura ambientedurante uma hora. Depois da incubação, as placas são lavadastrês vezes. Um conjugado da IgGl 1 (Sigma A3312) AP Anti-humana de cabra em IXPBS com 1 % de BSA é adicionado edeixado incubar na temperatura ambiente durante 1 hora. Asplacas são lavadas três vezes. Cor foi elucidada comparanitrofenilfosfato.

Exemplo 7: Quantificação da União do ligante doRAGE à Proteína de Fusão do RAGE

A Figura 15 mostra curvas de saturação-ligação comTTP-4 000 para vários ligantes do RAGE conhecidosimobilizados. Os ligantes são imobilizados em uma placamicrotituladora e incubados na presença de aumentos nasconcentrações da proteína de fusão do RAGE de 0 a 360 nM. Ainteração proteína-ligante de fusão do RAGE é detectadausando um anticorpo policlonal conjugado com fosfatasealcalina que é específico para a porção IgG da quimera defusão. Kds relativos foram calculados usando softwareGraphpad Prizm e comparados com valores da literaturaestabelecidos de valores do ligante RAGE-RAGE. HMGlB =Anfoterina, CML= Carboximetil Lisina, A beta = Beta amilóide1-40.

Exemplo 8: Uso da Proteína de Fusão do RAGE paraPrevenir Rejeição ao Transplante Alogênico

O bloqueio do RAGE pode ser esperado para bloquearrejeição ao transplante alogênico. Estes experimentos seriamexplorados se o bloqueio das interações ligante-RAGE usandouma proteína de fusão do RAGE da invenção atenuar a rejeiçãode células das ilhotas que foram transplantadas de um doadorsaudável em um animal diabético como medido pelo comprimentode tempo que os animais transplantados mantiveram um nívelde glicose no sangue abaixo de uma concentração alvo. Comodebatido aqui, foi descoberto que a administração de umaproteína de fusão do RAGE (por exemplo, TTP-4000) a animaisdiabéticos que receberam transplantes de célula da ilhotasignificantemente retardou a recaída de hiperglicemia eassim, a rejeição de células das ilhotas transplantadas(alogênica e singênica) em dois modelos animais detransplante.

A. Transplantação de Ilhotas Alogênicas emCamundongos

0 primeiro conjunto de experimentos foi testadopara a administração de uma proteína de fusão do RAGE (TTP-4000) modular a rejeição alogênica de células das ilhotastransplantadas e a recaída de diabetes em um modelo decamundongo C57BL/6J (B6) de diabetes.

Modelo Animal de Diabetes

Camundongos C57BL/6J (6 a 8 semanas de idade) (B6)foram feitos diabéticos por uma injeção intravenosa única deestreptozotocina (STZ) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)em 200 mg/kg. Camundongos BALB/cJ (6 a 8 semanas de idade)(BALB) serviram como doadores para transplantação da ilhota,assim, fornecendo uma alo-ligação imperfeita paratransplantes das ilhotas.

Isolamento da IlhotaCamundongos (BALB/c) foram anestesiados comsolução de HCl quetamina /HCl xilazina (Sigma, St. LouisMO). Depois da injeção intraductal de 3 ml de solução salinabalanceada de Hank fria (HBSS, Gibco, Grand Island NY)contendo 1,5 mg/ml de colagenase P (Roche Diagnostics,Branchburg, NJ), pancreata foram cirurgicamente procuradas edigeridas a 37° C durante 20 mins. Ilhotas foram lavadas comHBSS e purificadas por centrifugação de gradientedescontínua usando Polysucrose 400 (Cellgro, Herndon VA)tendo quatro densidades diferentes (26 %, 23 %, 20 %, e 11%). Os fragmentos de tecido na interface das camadas de 20 %e 23 % foram coletados, lavados e recolocados em suspensãoem HBSS. Ilhotas individuais, livres de tecidos acinares,vasculares e ductais ligados foram escolhidas sob ummicroscópio invertido, produzindo ilhotas altamentepurificadas para transplantação.

Transplantação da ilhota

Camundongos diabéticos induzidos porEstreptozotocina C57BL/6 (B6) receberam enxertos de ilhotasdentro de 2 dias da diagnose de diabetes. CamundongosBALB/cJ (6a 8 semanas de idade) (BALB) serviram comodoadores para transplantação da ilhota alogênica. Para atransplantação, 500 a 600 ilhotas recém isoladas (isto é,aproximadamente 550 ilhotas equivalentes) de camundongosdoadores foram acumuladas com um conjunto de infusão etransplantadas no espaço subcapular do rim direito de umreceptor.

Tratamento Com Compostos de TesteCompostos de teste foram administrados assim queas ilhotas foram transplantadas; a administração continuoudurante cerca de 60 dias, -dependendo de como o animal decontrole se comportou. Camundongos foram injetados com 0,25ml de solução salina tamponada de fosfato (PBS), TIP-4000 emPBS, ou IgG em PBS de acordo com o regime abaixo (Tabela 3).

Tabela 3

<table>table see original document page 131</column></row><table><table>table see original document page 132</column></row><table>

Monitoramento da Função de Enxerto da Ilhota

A função de enxerto da ilhota foi monitorada pormedições de glicose no sangue seriadas diariamente duranteas primeiras 2 semanas depois da transplantação da ilhota,seguido por dias alternados desde então. Reversão dediabetes foi definida como nivel de glicose no sangue demenos do que 200 mg/dl em duas medições consecutivas. Perdade enxerto foi determinada quando a glicose no sangueexcedeu a 250 mg/dl em duas medições consecutivas. Osresultados são mostrados na Tabela 4.

Tabela 4

Efeitos de TTP-4000 no Transplante da Ilhota deAloenxerto*

<table>table see original document page 133</column></row><table>

* Valores refletem o dia de perda de enxerto paracada animal como definido por recaída de níveis de glicoseno sangue aumentados.

Os efeitos da administração de TTP-4000 narejeição de aloenxerto para ilhotas BALB/c em 136camundongos são mostrados como um Gráfico de SobrevivênciaCumulativa de Kaplan-Meier na FIG. 21. Pode ser observadoque existe um aumento no tempo antes da detecção de falha deenxerto para animais tratados com TTP-4000 (Grupos 1 e 3)como oposto a animais que não são tratados em todos(Controle) ou animais tratados com o veiculo (PBS) ou (IgGlhumana). Usando uma variedade de análises estatísticas(Mantel-Cox Logrank, Breslow-Gehan-Wilcoxon; Tarone-Ware,Peto-Peto-Wilcoxiη; e Harrington-Fleming), as diferençasentre o Controle e TTP-4000 (Grupos 1 e 3) foramsignificantes (Tabela 5).

Tabela 5

<table>table see original document page 134</column></row><table>

*Graus de imunidade

B. Transplantação da Ilhota em Camundongos NOD comoum Modelo de Doença Autoimune

0 segundo conjunto de experimentos testados se aadministração proteína de fusão do RAGE (isto é TTP-4000 ouTTP-3000) modulasse o curso de diabetes recorrente emcamundongos NOD, usando um modelo de transplante NODsingênico.

Modelo Animal de Diabetes

Camundongos diabéticos não obesos autoimunesespontâneos (NOD/LtJ) (12 a 25 semanas de idade) serviramcomo receptores para células das ilhotas, enquantocamundongos NOD/LtJ pré diabéticos jovens (6 a 7 semanas deidade) serviram como doadores em transplantação da ilhotasingênica. As ilhotas para transplantação foram isoladascomo descrito acima na Seção A (Transplantação da IlhotaAlogênica).

Transplantação da Ilhota

Camundongos NOD/LtJ diabéticos receberam enxertosde ilhotas dentro de 2 dias da diagnose de diabetes. 500 a600 ilhotas recém isoladas (aproximadamente 550 ilhotasequivalentes) de camundongos doadores foram acumuladas comum conjunto de infusão e transplantadas no espaço subcapulardo rim direito.

Tratamento Com Compostos de Teste

Compostos de teste foram administrados assim queas ilhotas foram transplantadas e continuaram duranteaproximadamente 8 semanas. Camundongos foram injetados com0,25 ml de PBS, TTP-4000 em PBS, ou TTP-3000 em PBS deacordo com o regime abaixo (Tabela 6).Tabela β

<table>table see original document page 136</column></row><table>

Monitoramento da Função de Enxerto da Ilhota

A função de enxerto da ilhota foi monitorada pormedições de glicose do sangue seriadas diariamente duranteas primeiras 2 semanas depois da transplantação da ilhota,seguido por dias alternados desde então. A reversão dediabetes foi definida como glicose no sangue menor do que200 mg/dl em duas medições consecutivas. A perda de enxertoem porcentagem foi determinada quando glicose no sangueexcedeu 250 mg/dl em duas medições consecutivas. Osresultados são mostrados na Tabela 7.

Tabela 7

Efeitos de TTP-4000 e TTP-3000 em DiabetesRecorrente Em Transplantes das Ilhotas Singênicos EmCamundongos NOD *

<table>table see original document page 137</column></row><table><table>table see original document page 138</column></row><table>

Os efeitos de administrar TTP-4000 na rejeição deilhotas transplantadas singênicas em camundongos NODdiabéticos são mostrados como um Gráfico de SobrevivênciaCumulativa de Kaplan-Meier na FIG. 22. Como mostrado nosdados da Tabela 7, houve um aumento no tempo antes dadetecção de falha de enxerto para animais tratados com TTP-4000 (Grupo 1) e TTP-3000 (Grupo 2) como oposto aos animaisque não são tratados em todos (Controle). A FIG. 22 mostra oaumento em tempo antes da detecção de falha de enxerto paraanimais tratados com TTP-4000 (Grupo 1) e animais que nãosão tratados em todos. Usando uma variedade de análisesestatísticas (Mantel-Cox Logrank, Breslow-Gehan-Wilcoxon;Tarone-Ware, Peto-Peto-Wilcoxin; Harrington-Fleming), asdiferenças entre o Controle e TTP 4000 (Grupo I) e oControle e TTP-3000 (Grupo 2) foram significantes (Tabela

Tabela 8

<table>table see original document page 138</column></row><table><table>table see original document page 139</column></row><table>

*Graus de Imunidade

O precedente é considerado como ilustrativo apenasda principal da invenção. Visto que modificações numerosas ealterações ocorrerão prontamente àqueles habilitados natécnica, não é intencionado para limitar a invenção àsformas de realização exatas mostradas e descritas, e todasas modificações adequadas e equivalentes caindo dentro doescopo das reivindicações anexas são consideradas dentro dopresente conceito inventivo.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> TransTech Pharma, Inc.Mjallir Adnan M.M.Rothlein, RobertWebster, Jeffrey C.Tian, Ye Edward

<120> Proteínas de Fusão do RAGE e Métodos de Uso<130> 57739-339019

<150> US 60/771.619<151> 2006-02-09

<160> 57

<170> Patente na Versão 3.3

<210> 1

<211> 404

<212> PRT

<213> Horao sapiens

<400> 1

Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu15 10 15

Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30

Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu50 55 60

Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro65 70 75 80. .

Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile85 90 95

Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn100 105 110

Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp115 120 125

Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys130 135 140Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp145 150 "155 160

Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln165 170 175

Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu180 185 190

Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys195 200 205

Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro210 215 220

Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu225 230 235 240

Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr245 250 255

Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met260 265 270

Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu275 280 285

Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr290 295 300

His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile305 310 315 320

Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser325 330 335

Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly340 345 350

Thr Ala Ala Leu Leu Ile Gly Val Ile Leu Trp Gln Arg Arg Gln Arg355 360 365

Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu370 375 380Arg Ala Glu Leu Asn Gln Ser Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser385 390 395 400

Thr Gly Gly Pro

<210> 2

<211> 382

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys15 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu50 55 60

Pxo Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr85 90 95

Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr100 105 110

Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr115 120 125

Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro130 135 140

Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu145 150 155 160

Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pxo Ala Arg165 170 175

Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu180 185 190Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr195 200

Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val210 215

Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr225 230

Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His245

Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trpâ05

Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly220

Val Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro235 240

Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu250 255

Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu Pro Glu Ile Gly Pro Gln260 265 270

Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro275 280 285

Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile Ile Glu Pro Gly Glu Glu. 290 295 300

Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly Leu Gly Thr Leu Ala305 310 315 320

Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly Thr Ala Ala Leu Leu Ile325 330 335

Gly Val Ile Leu Trp Gln Arg Arg Gln Arg Arg Gly Glu Glu Arg Lys340 345 350

Ala Pro Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu Arg Ala Glu Leu Asn Gln355 ' 360 365

Ser Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser Thr Gly Gly Pro370 375 380

<210> 3

<211> 381

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys1 5 10 15Gly Ala Pro Lys 'Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr20 25 30

Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro35 40 45

Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro50 55 60

Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn65 70 75 80

Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln85 90 95

Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ua Ser Glu Leu Thr Ala100 105 110

Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro115 ' 120 125

Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn130 135 140

Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu Thr145 150 155 160

Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly165 170 175

Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro180 185 190

Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu195 200 -205

Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly210 215' 220

Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala225 230 235 240

Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro245 250 255Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Xle Leu Pro Glu Xle Gly Pro Gln Asp260 265 270

Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro Gln275 280 285

Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly290 295 300

Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu305 310 315 320

Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly Thr Ala Ala Leu Leu Ila Gly325 330 335

Val Ile Leu Trp Gln Arg Arg Gln Arg Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala340 345 350

Pro Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu Arg Ala Glu Leu Asn Gln Ser355 360 365

Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser Thr Gly Gly Pro370 375 380

<210> 4

<211> 339

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu1 5 10 15

Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Ash Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30

Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu50 55 60

Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro. Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro65 70 75 80

Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile85 90 95Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn100 105 110

Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln.Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp115 120 125

Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys130 135 140

Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro- Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp145 150 155 160

Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln165 170 175

Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu. Leu180 185 190

Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys195 200 205

Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro210 215 220

Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu225 230 235 240

Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr245 250 255

Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met260 265 270

Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Bro Ser Pro Val Leu Ile Leu275 280 285

Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr290 295 300

His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile305 310 315 320

Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser325 330 335Gly Leu Gly

<210> 5

<211> 317

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Ala Gln Asn Xle Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys1 5 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 '40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu50 55 60

Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr85 90 95

Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr100 105 110

Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr115 120 · 125

Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro130 135" 140

Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Ar.g His Pro Glu145 150 155 160

Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg165 * 170 175

Gly Gly Asp Pro Arg 'Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu180 185 190Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp195 200 205

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Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro225 230 235 240

Ala Glri Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu245 250 255

Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu Pro Glu Ile Gly Pro Gln260 265 270

Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro275 280 285

Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile Ile Glu Pro Gly Glu Glu290 295 300

Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly Leu Gly305 310 315

<210> 6

<211> 316

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys15 10 15

Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr20 25 30

Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro35 40 45

Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro50 55 60

Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn

65 70 75 80

Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln85 90 95Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala100 105 110

Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro115 120 125

Ala Gly Thr Leu Ser Trp His' Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn130 135 140

Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu Thr145 150 155 160

Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly165 170 175

Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro180 185 190

Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val- Trp Glu195 200 205

Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly210 215 220

Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr' Val Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala225 230 235 240

Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro245 250 255

Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp260 265 270

Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro Gln275 280 285

Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly290 295 300

Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly Leu Gly305 310 315

<210> 7<211> 94<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 7

Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys1 5 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg. Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu50 55 60

Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg85 90

<210> 8

<211> 93

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys1 5 10 15

Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr20 -25 30

Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro,35 40 45

Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro50 55 60

Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Mst Asn65 70 75 80

Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg85 90

<210> 9<211> 30<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys1 5 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys20 25 30

<210> 10

<211> 29

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys1 5 10 15

Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys20 25

<210> 11

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn1 5 10 15

Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu20 25 30

Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val35 40 45

Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr50 55 60

Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg65 70 75 80

Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala85 90 95

Leu Arg<210> 12

<211> 91

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val1 5 10 15

Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr20 25 30

Cys Glu Val Pro Alá Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met Lys Asp35 40 45

Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu Pro Glu50 55 60

Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser65 70 75 80

Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser85 90

<210> 13

<211> 101

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys1 5 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg- Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu50 55 60

Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met65 70 75 80Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr85 90 95

Gln Ile Pro Gly Lys100

<210> 14

<211> 100

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys1 5 10 15

Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr20 25 30

Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro35 40 45

Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro50 55 60

Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn65 70 75 90

Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln85 90 95

Ile Pro Gly Lys100

<210> 15

<211> 114

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys15 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30

Thr Gly .Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 45Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val leu Pro Asn Gly Sfer Leu Phe Leu50 55 60

Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr85 90 95

Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr100 105 HO

Ala Gly

<210> 16

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

I

Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys1 5 10 15

Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr20 25 30

Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro35 40 45

Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro50 55 ' 60

Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn65 · 70 75 80

Arg Asn Gly Lys Glu Thi Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln85 90 95

Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala100 105 HO

Gly

<210> 17<211> 204<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 17

TVla Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys1 5 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu50 55 60

Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr85 90 95

Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr100 105 110

Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr115 120 125

Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro130 135 140

Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu145 150 155 160

Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg165 170 175

Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu180 185 190

Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln195 200

18

203

PRT

<210><211><212><213> Homo sapiens<400> 18

Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys1 5 10 15

Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr20 25 30

Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro35 40 45

Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro50 55 60

Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn65 70 75 80

Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Vall Arg Val Tyr Gln85 90 95

Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala100 105 110

Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro115 120 125

Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn

130 135 140

Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu Thr

145 150 155 160

Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly165 < 170 175

Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro180 185 190

Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln195 200

<210> 19

<211> 229

<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 19

Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys15 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu50 >55 60

Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met

65 "70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr85 90 95

Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr100 105 HO

Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr115' 120 125

Pro Ala Gly .Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro130 135 140

Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu145 150 155 160

Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg165 170 175

Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu180 185 190

Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp195 200 205

Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly210 215 220

Gly Ala Val Ala Pro225<210> 20

<211> 228

<212> PRT

<213> Homosapiens

<400> 20

Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys1 5 10 15

Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr20 25 30

Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro35 40 45

Trp Asp Ser Val Ala Arg Val' Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro50 55 60

Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn65 70 75 80

Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln85 90 95

Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala

100 105 HO

Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro

115 120 125

Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn

130 135 140

Glu Lys Gly Val Ser Val Lys' Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu Thr

145 150 155 160

Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly

165 170 175

Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro

180 185 190

Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu195 200' 205Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly210 215 220

Ala Val Ala Pro225

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys1 5

<210> 22

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu1 5 10 15

Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro20 25 30

<210> 23

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>. 23

Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu1 5 10 15

Leu Thr Ala Gly20

<210> 24

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Thr Ala Pro Ile Gln1 5

<210> 25<211> 354<212> DNA<213> Homo sapiens

<400> 25

atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60

gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120

gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180

tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtocttccc 240

aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atcoaggatg aggggatttt ccggtgccag 300

gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctac 354

<210> 26

<211> 369

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 26

atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60

gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120

gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180

tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240

aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgcoag 300

gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360

cctgggaag 369

<210> 27 '

<211> 408

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 27

atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60

gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120

gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180

tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240

aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300

gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360

cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggt 408

<210> 28<211> 690 <212> DNA <213> Homo çapiens <400> 28 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtgt tcccaataag 420gtggggacat gtgtgtcaga ggggagctac cctgcaggga ctcttagctg gcacttggat 480gggaagcccc tggtgcctaa tgagaaggga gtatctgtga aggaacagac caggagacac 540cctgagacag ggctcttcac actgcagtcg gagctaatgg tgaccccagc ccggggagga 600gatccccgtc ccaccttctc ctgtagcttc agcccaggcc ttccccgaca ccgggccttg 660cgcacagccc ccatccagcc ccgtgtctgg 690

<210> 29

<211> 753

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 29

atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtgt tcccaataag 420gtggggacat gtgtgtcaga ggggagctac cctgcaggga ctcttagctg gcacttggat. 480gggaagcccc' tggtgcctaa tgagaaggga gtatctgtga aggaacagac caggágacac 540cctgagacag ggctcttcac actgcagtcg gagctaatgg tgaccccagc ccggggagga 600gatccccgtc ccaccttctc ctgtagcttc agcccaggcc ttccccgaca ccgggccttg 660cgcacagccc ccatccagcc ccgtgtctgg gagcctgtgc ctctggagga ggtccaattg 720gtggtggagc cagaaggtgg agcagtagct cct 753<210> 30<21Χ> 1386<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> Homo sapiens<400> 30

atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagtá 60

gtaggtgçtc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120

gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180

tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240

aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ocggtgccag 300

gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360

cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtgt tcccaataag 420

gtggggacat gtgtgtcaga ggggagctac cctgcaggga ctcttagctg gcacttggat 480

gggaagcccc tggtgcctaa tgagaaggga gtatctgtga aggaacagac caggagacac 540

cctgagacag ggctcttcac actgcagtcg gagctaatgg tgaccccagc ccggggagga 600

gatccccgtc ccaccttctc ctgtagcttc agcccaggcc ttccccgaca ccgggccttg 660

cgcacagccc ccatccagcc ccgtgtctgg gagcctgtgc ctctggagga ggtccaattg 720

gtggtggagc cagaaggtgg agcagtagct cctccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 780

I

cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca oatgcgtggt ggtggacgtg 840

agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900

gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 960

accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020

gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1080

caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 114 0

tgcctggtca aaggcttcta tcocagcgac atcgccgtgg· agtgggagag caatgggcag 1200

ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1260

tacagcaago tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctco 1320

gtgatgcatg aggctctgca caaccaotac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1380

aaatga 138 6

<210> 31<211> 1041

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Homo sapiens

<400> 31

atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtcc gtcagtcttc 420ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 480gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 540gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 600gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 660aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 720cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 780caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 840gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 900ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 960gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1020tccctgtctc cgggtaaatg a 1041

<210> 32

<211> "461

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Homo sapiens

<400> 32

Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu1 · 5 10 15

Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Aan Xle Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 ' 30Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Sln Arg35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn. Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu50 55 60

Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro65 70 75 80

Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile

85 90 95

Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn100 105 HO

Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp115 120 125

Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys130 135 140

Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp145 150 155 160

Glv Lvs Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln165 170 175

Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu180 185 190

Met Val Thr Pro Ala Ar^ Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys195 200 205

Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro210 215 220

Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu225 230 235 240

Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Pro Ser Val Phe Leu245 250 255

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu260 265 270Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys275 280 285

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys290 295- 300

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu305 310 315 320

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys325 330 335

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro' Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys340 345 350

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser355 360 365

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys370 375 380

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln385 390 395 400

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly405 410 415

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln420 425 430

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys' Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn435 440 445

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys450 455 460

<210> 33<211> 439<212> PRT<213> Artificial<220> <223> Homo sapiens<400> 33

Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys1 5 10 . 15Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu50 55 60

Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Gys Gln Ala Met65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Sfer Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr85 90 95

Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr100 105 HO ·

Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr115 , 120 125

Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro130 ' 135 140

Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu145 150 155 160

Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg165 170 175

Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu180 185 190

Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp195 . 200 205

Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly210 215 220

Gly Ala Val Ala Pro Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val245 250 255Asp Val Ser Hls Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr27-5 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu305 310' 315 320

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg325 330 335.

S

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Len Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp355 } 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser385 390 395 400

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Cvs Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser420 425 430

Leu Ser Leu "Ser Pro Gly Lys435

<210> 34

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Homo sapiens<400> 34

Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys1 5 10 15Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr20 25 30

Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro35 40 45

Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro50 55 SO

Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn65 70 75 80

Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln85 90 95

Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala100 105 110

Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro115 120 125

Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn130 135 140

Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu Thr

145 150 155 160

Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly165 170 175

Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro180 185 190

Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu195 200 205

Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly CSly210 215 220

Ala Val Ala Pro Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp225 230 235 240

Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp245 250 255Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr20 25 30

Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro35 40 45

Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro50 55 60

Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn65 70 75 80

Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln85 90 95

Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala100 105 HO

Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro115 120 125

Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn130 135 140

Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu Thr145 150 155 160

Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly165 170 175

Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro

180 185 190

Arg His Arg Ala Leu Arg Thr TVla Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu195 200 205

Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly210 215 220

Ala Val Ala Pro Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp225 230 235 240

Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp245 250 255Trp Gly Ala Val Val Gly Ala" Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30

Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu50 55 60

Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro65 70 75 80

Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile85 90 95

Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn

100 105 110

Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp115 120 125

Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro130 135 I40

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys145 150 I55

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp165 17O I75

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu* ------195 190

180

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu195 200 205

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn210 215 220

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys· Gly225 230 235

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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn275 280 285

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe290 295 300

Leu Tvr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn305 310 315 320

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr325 330 335

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys340 345

<210> 36

<211> 324

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Homo sapiens<400> 36

Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys1 5 10 15

Lvs Glv Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu50 55 60

Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr85 90 95

Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr

100 105 HOAla Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu115 120 125 ·

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser130 135 140

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu145 150 155 160

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr165 170 175

Tvr Ara Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn180 185 190

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln210 215 220

Val Tvr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val245 250 255

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro260 265 270

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr275 280 285

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val290 295 300

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

Met

305 310

Ser Pro Gly Lys

315 320

<210> 37<211> 323<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Homo sapiens<400> 37

Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys LysI 5 10 15

Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr20 25 30

Glv Arα Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro35 40 45

Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro50 55 60

Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn65 70 75 80

Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln85 90 95

Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala100 105 HO

Glv Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met115 120 125

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His130 135 140

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val145 150 155 160

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr165 170 175

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

180 I85 190

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile195 200 205

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val210 215 220Tvr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser225 230 235 240

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu245 250 255

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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val275 280 285

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met290 295 300

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser305 310 315 320

Pro Gly Lys

<210> 38

<211> 210

<212> PRT

<213> Hoxiio sapiens

<400> 38

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile1 5 10 15

Ser Ara Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu20 25 30

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His35 40 45

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg50 55 60

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys65 70 75 80

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu85 90 95Lvs Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr100 105 HO

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu115 120 125

Thr Cvs Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp130 135 140

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val145 150 155 160

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp165 I7O I75

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His180 185 I90

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro195 200 205

Gly Lys210

<210> 39

<211> 633

<212> DNA

<213> Homo sapiens

ccgtcagtct tcctcttcco cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 60

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc oacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 120tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgco aagacaaagc cgogggagga gcagtacaacagcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaaggagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctccaaagccaaag ggcagocccg agaaccacag gtgtacaccc tgoccccatc ccgggatgagctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gottctatcc cagcgacatcgccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtgctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ocgtggacaa gagcaggtggcagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacgcagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga

180240300360420480540600633<210> 40

<211> 220

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

Pro Cvs Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe1 5 10 15

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro .Glu Val20 25 30

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe35 40 . 45 .

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro50 55 60

Arq Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr65 70 75 80

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val85 90 95

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Xle Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala100 105 HO

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg115 Ι20 125

Asd Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly130 135 140

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro145 150 155 160

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser165 170 17S

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln180 185 19°

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His195 200 205

Tvr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys210 215 220<210> 41

<211> 663

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 41 cri

ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 6ü

aaggacaccc tcatgatctc ccggaccoot gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 120cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgccaâgacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcaccgtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagccctcocagccc ocatcgagaa aaccatctco aaagccaaag ggcagccccg agaaccacaggtgtacacco tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacotgcctggtcaaag gcttctatcc cagcgacato gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccggagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctacagcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgotccgtgatgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaatga

<210> 42<211> 113<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 42

Pro Cvs Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe1 5 10 15

Pro Pro Lya Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val20 25 3°

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe35 «O 45

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro50 55 60

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr65 70 75 80

180240300360420480540600660663Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val85 90 95

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala100 105 HO

Lys

<210> 43

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp1 5 10 I5

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe20 25 30

Tvr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro. Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys100 105

<210> 44

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 44

Ile Ser Ile Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val5 10 15

Gly Gly Ser Gly Leu Gly Thr Leu Ala20 25<210> 45

<211> 317

<212> PtlT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_CABACTERÍ STICA

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = ácido piroglutâmico

<400> 45

Xaa Glu Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys

1 5 10 15

Lvs Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu50 -55 60 "

Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr85 90 95

Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr100 105 HO

Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr115 120 . 125

Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro130 135 140

Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu145 150 155 160

Thr Glv Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg165 170 175

Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu180 185 190Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp195 200 205

Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly210 215 .220

Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro

225 230 235

Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu245 250 255

Pro Leu .Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu Pro Glu Ile Gly Pro Gln260 265 270

Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys" Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro275 280 285

Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile Ile Glu Pro Gly Glu Glu290 295

Gly305

Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly Leu Gly310 315

<210> 46

<211> 94

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (1) . . (1)

<223> Xaa = ácido piroglutâmico

<400> 4 6

Xaa Glu Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys1 5 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 4i>

Pro

Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu

50 55Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg85 90

<210> 47

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (l)-.(l)

<223> Xaa = ácido piroglutâmico<400> 47

Xaa Glu Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys15 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys20 25 30

<210> 48

<211> 101

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MIS C_CARAC TERÍSTICA<222> (I)--(I)

<223> Xaa = ácido piroglutâmico<400> 48

Xaa Glu Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys15 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu50 55 60

Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met65 70 75 80Gln Ile Pro Gly Lys100

<210> 4 9

<211> 114

<212> PRT

<213> Homo sapiens

MISC_CARACTERÍSTICA(1)..(1)

Xaa = ácido piroglutâmico49

Xaa Glu Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys1 5 10 15

Lvs Glv Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 45

<220><221><222><223>

<400>

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu50 55 60

Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr85 90 95

Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr100 105 11°

Ala Gly

<210> 50

<211> 204

<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> MISC_CARACTERÍSTICA

<222> (1)..<1)

<223> Xaa — ácido piroglutâmico

<400> 50

Xaa Glu Aan Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys1 5 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu50 55 60

Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met

65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr85 90 95

Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr100 105 HO

Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr115 120 125

Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro130 135 140

Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu145 150 155 160

Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg165 170 175

Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu180 185 190

Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln195 200

<210> 51<211> 229<212> PRT

<213> Homo sapiens

<22Ό>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = ácido piroglutâmico

<400> 51

Xaa Glu Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys

1 5 10 15

Lvs Glv Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu50 55 60

Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met

65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr85 90 95

Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr100 105 HO

Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr115 120 125

Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro130 135 140

Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu145 150 155 160

Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg165 170 175

Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu180 185 190

Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp195 200 205Glu Pxo Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly210 215 220

Gly Ala Val Ala Pro225

<210> <211> <212> <213> 52 633 DNA Artificial <220> <223> Homo sapiens <400> 52 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 60gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 120taegtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 180agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 240gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccatjccc ccatcgagaa aaccatctcc 300aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 360ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 420gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 480ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 540cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 600cagaagagcc tctccctgtc tcccgggaaa tga 633

<210> 53

<211> 663

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Homo sapiens

<400> 53

cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 60tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 120ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 180cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 240aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 300ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 360gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 420ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 480gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 540agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 600atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tcccgggaaa 660tga 663

<210> 54

<211> 1386

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Homo sapiens

<400> 54 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtgt tcccaataag 420gtggggacat gtgtgtcaga ggggagctac cctgcaggga ctcttagctg gcacttggat 480gggaagcccc tggtgcctaa tgagaaggga gtatctgtga aggaacagac caggagacac 540cctgagacag ggctcttcac actgcagtcg gagctaatgg tgaccccagc ccggggagga 600gatccccgtc ccaccttctc ctgtagcttc agcccaggcc ttccccgaca ccgggccttg 660cgcacagccc ccatccagcc ccgtgtctgg gagcctgtgc ctctggagga ggtccaattg 720gtggtggagc cagaaggtgg agcagtagct cctccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 780cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 840agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 960accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt etccaacaaa 1020gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1080caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgace 1140tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1200

ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1260

tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1320

gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg 1380

aaatga 1386

<210> 55<211> 1041<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> Komo sapiens<400> 55

atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60

gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120

gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180

tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaça gtgtggctcg tgtccttccc 240

aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300

gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360

cctgggaago cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtcc gtcagtcttc 420

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 480

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 540

600660

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgtgtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgcaaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 720cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 780caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgggagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgacggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaacgtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaaca actacacgca gaagagcctc 1020tccctgtctc ccgggaaatg a 1041

<210> 56<211> 439<212> PRT

840900960<213> Artificial<220>

<223> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_CARACTERÍSTICA

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = ácido piroglutâmico

<400> 56

Xaa Glu Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys1 5 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu50 55 60

Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr85 90 95

Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr100 105 110

Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr115 120 125

Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro130 135 140

Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu145 150 155 160

Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg165 170 175

Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly210 215 220

Gly Ala Val Ala Pro Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val245 250 255

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lya Val Ser Asn Lys Ala Leu305 310 315 320

Pro Ala Pro He Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser385 390 395 400

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser420 425 430Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys435

<210> 57

<211> 324

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Homo sapiens

<220>

<221> MIS C_CARACTERÍ STICA

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = ácido piroglutâmico

<400> 57

Xaa Glu Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys

1 5 10 15

Lys Gly Ala Pro Lya Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu50 55 60

Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met

65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr85 .90 95

Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr100 105 HO

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu115 120 125

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser130 135 140

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

145 150 155 160Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr165 170 175

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn180 185 190

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln210 215 220

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val245 250 255

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro260 265 270

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr275 280 285

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val290 295 300

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu305 310 315 320

Ser Pro Gly Lys

Claims

1. Proteína de fusão, CARACTERIZADA pelo fato deque compreende um polipeptídeo do RAGE diretamente ligado aum polipeptídeo compreendendo um domínio CH2 de umaimunoglobulina ou uma porção de um domínio CH2 de umaimunoglobulina.

2. Proteína de fusão, de acordo com areivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que opolipeptídeo do RAGE compreende um ligador de interdomíniodo RAGE ligado a um domínio da imunoglobulina do RAGE talque o aminoácido C-terminal do domínio da imunoglobulina doRAGE é ligado ao aminoácido N-terminal do ligador deinterdomínio, e o aminoácido C-terminal do ligador deinterdomínio do RAGE é diretamente ligado ao aminoácido N-terminal de um polipeptídeo compreendendo um domínio CH2 deuma imunoglobulina, ou uma porção deste.

3. Proteína de fusão, de acordo com areivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que opolipeptídeo do RAGE compreende um sítio de ligação doligante.

4. Proteína de fusão, de acordo com areivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que o sítio deligação do ligante do ElAGE compreende SEQ ID N-: 9 ou umaseqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, ou SEQ ID N-: 10ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta.

5. Proteína de fusão, de acordo com areivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que opolipeptídeo do RAGE compreende um ligador de interdomínioligado a um domínio da imunoglobulina do RAGE que compreendeum fragmento de uma proteína do RAGE de comprimento pleno.

6. Proteína de fusão, de acordo com areivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que compreendeainda um primeiro domínio da imunoglobulina do RAGE e umprimeiro ligador de interdomínio do RAGE ligado a um segundodomínio da imunoglobulina do RAGE e um segundo ligador deinterdomínio do RAGE, tal que o aminoácido N-terminal doprimeiro ligador de interdomínio é ligado ao aminoácido Ο-terminal do primeiro domínio da imunoglobulina do RAGE, oaminoácido N-terminal do segundo domínio da imunoglobulinado RAGE é ligado ao aminoácido C-terminal do primeiroligador de interdomínio, o aminoácido N-terminal do segundoligador de interdomínio é ligado ao aminoácido C-terminal dosegundo domínio da imunoglobulina do RAGE, e o aminoácido C-terminal do segundo ligador de interdomínio do RAGE édiretamente ligado ao aminoácido N-terminal do domínio daimunoglobulina CH2 ou uma porção de um domínio CH2 de umaimunoglobulina.

7. Proteína de fusão, de acordo com areivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende aseqüência de aminoácido SEQ ID N2: 32, SEQ ID N2: 33, SEQ IDN-: 34, ou SEQ ID N2: 56.

8. Proteína de fusão, de acordo com areivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende aseqüência de aminoácido SEQ ID N2: 33 sem o resíduo doaminoácido lisina C-terminal, SEQ ID N2: 34 sem o resíduo doaminoácido lisina C-terminal, ou SEQ ID N2: 56 sem o resíduodo aminoácido lisina C-terminal.

9. Proteína de fusão, de acordo com areivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o ligador deinterdominio do RAGE diretamente ligado ao domínio CH2 daimunoglobulina ou uma porção deste compreende SEQ ID N2: 22ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta, ou SEQ ID№: 24, ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica a esta.

10. Proteína de fusão, de acordo com areivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que compreendeum domínio da imunoglobulina do RAGE único ligado porintermédio de um ligador de interdominio do RAGE aoaminoácido N-terminal de um polipeptídeo compreendendo umdomínio da imunoglobulina CH2 ou uma porção de um domínioCh2 de uma imunoglobulina.

11. Proteína de fusão, de acordo com areivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que compreendea seqüência de aminoácido SEQ ID N2: 35, SEQ ID N2: 36, SEQID N2: 37, ou SEQ ID N2: 57.

12. Proteína de fusão, de acordo com areivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que compreendea seqüência de aminoácido SEQ ID N2: 36 sem o resíduo doaminoácido lisina C-terminal, SEQ ID N2: 37 sem o resíduo doaminoácido lisina C-terminal, ou SEQ ID N2: 57 sem o resíduodo aminoácido lisina C-terminal.

13. Proteína de fusão, de acordo com areivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o ligadordo RAGE diretamente ligado à imunoglobulina CH2 compreendeSEQ ID N-: 21 ou uma seqüência pelo menos 90 % idêntica aesta ou SEQ ID N2: 23 ou uma seqüência pelo menos 90 %idêntica a esta.

14. Seqüência de ácido nucléico isolada,CARACTERIZADA pelo fato de que codifica a proteína de fusãode acordo com a reivindicação 1.

15. Seqüência de ácido nucléico isolada, de acordocom a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que opolipeptídeo do RAGE compreende um ligador de interdomíniodo RAGE ligado a um domínio da imunoglobulina do RAGE talque o aminoácido C-terminal do domínio da imunoglobulina doRAGE é ligado ao aminoácido N-terminal do ligador deinterdomínio, e o aminoácido C-terminal do ligador deinterdomínio do RAGE é diretamente ligado ao aminoácido N-terminal de um polipeptídeo compreendendo um domínio CH2 deuma imunoglobulina, ou uma porção deste.

16. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-15, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a seqüência daSEQ ID N-: 30, ou um fragmento desta, ou a seqüência da SEQID N-: 31, ou um fragmento desta, a seqüência da SEQ IDN-: 54, ou ura fragmento desta, ou a seqüência da SEQ ID N-:-55, ou um fragmento desta.

17. Vetor de expressão, CARACTERIZADO pelo fato deque codifica para a proteína de fusão do RAGE de acordo coma reivindicação 1.

18. Vetor de expressão, de acordo com areivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que opolipeptídeo do RAGE compreende um ligador de interdomíniodo RAGE ligado a um domínio da imunoglobulina do RAGE talque o aminoácido C-terminal do domínio da imunoglobulina doRAGE é ligado ao aminoácido N-terminal do ligador deinterdomínio, e o aminoácido C-terminal do ligador deinterdomínio do RAGE é diretamente ligado ao aminoácido N-terminal de um polipeptídeo compreendendo um domínio CH2 deuma imunoglobulina, ou uma porção deste.

19. Vetor de expressão, de acordo com areivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que compreendea seqüência SEQ ID Ns: 30, ou um fragmento desta, ou SEQ IDN-: 31, ou um fragmento desta, SEQ ID N-: 54, ou umfragmento desta, ou SEQ ID N-: 55, ou um fragmento desta.

20. Célula transfectada com o vetor de expressão,de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato deque a célula expressa uma proteína de fusão compreendendo umpolipeptídeo do RAGE diretamente ligado a um polipeptídeocompreendendo um domínio CH2 de uma imunoglobulina ou umaporção de um domínio CH2 de uma imunoglobulina.

21. Célula transfectada com o vetor de expressão,de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato deque a célula expressa uma proteína de fusão do RAGEcompreendendo a seqüência de aminoácido como apresentado naSEQ ID N-: 32, SEQ ID N^: 33, SEQ ID N^: 34, SEQ ID N^: 35,SEQ ID N-: 36, SEQ ID N^: 37, SEQ ID N5: 56, ou SEQ ID N^: 57 .

22. Célula transfectada com o vetor de expressão,de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato deque a célula expressa uma proteína de fusão do RAGEcompreendendo a seqüência de aminoácido SEQ ID N-: 33 sem oresíduo do aminoácido lisina C-terminal, SEQ ID N2: 34 sem oresíduo do aminoácido lisina C-terminal, SEQ ID N5: 36 sem oresíduo do aminoácido lisina C-terminal, SEQ ID N2: 37 sem oresíduo do aminoácido lisina C-terminal, SEQ ID N2: 56 sem oresíduo do aminoácido lisina C-terminal, ou SEQ ID N2: 57sem o resíduo do aminoácido lisina C-terminal.

23. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de quecompreende uma quantidade terapeuticamente eficaz daproteína de fusão do RAGE de acordo com a reivindicação 1.

24. Composição, de acordo com a reivindicação 23,CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo do RAGEcompreende um ligador de interdomínio do RAGE ligado a umdomínio da imunoglobulina do RAGE tal que o aminoácido C-terminal do domínio da imunoglobulina do RAGE é ligado aoaminoácido N-terminal do ligador de interdomínio, e oaminoácido C-terminal do ligador de interdomínio do RAGE édiretamente ligado ao aminoácido N-terminal de umpolipeptídeo compreendendo um domínio CH2 de umaimunoglobulina, ou uma porção deste.

25. Composição, de acordo com a reivindicação 23,CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo do RAGEcompreende um sítio de ligação do ligante.

26. Composição, de acordo com a reivindicação 25,CARACTERIZADA pelo fato de que o sítio de ligação do ligantedo RAGE compreende SEQ ID N2: 9 ou uma seqüência pelo menos-90 % idêntica a esta, ou SEQ ID N2: 10 ou uma seqüência pelomenos 90 % idêntica a esta.

27. Composição, de acordo com a reivindicação 24,CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo do RAGEcompreendendo um ligador de interdomínio ligado a um domínioda imunoglobulina do RAGE compreende um fragmento de umaproteína do RAGE de comprimento pleno.

28. Composição, de acordo com a reivindicação 23,CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo do RAGEcompreende um primeiro domínio da imunoglobulina do RAGE eum primeiro ligador de interdomínio do RAGE ligado a umsegundo domínio da imunoglobulina do RAGE e um segundoligador de interdomínio do RAGE, tal que o aminoácido N-terminal do primeiro ligador de interdomínio é ligado aoaminoácido C-terminal do primeiro domínio da imunoglobulinado RAGE, o aminoácido N-terminal do segundo domínio daimunoglobulina do RAGE é ligado ao aminoácido C-terminal doprimeiro ligador de interdomínio, o aminoácido N-terminal dosegundo ligador de interdomínio é ligado ao aminoácido C-terminal do segundo domínio da imunoglobulina do RAGE, e oaminoácido C-terminal do segundo ligador de interdomínio doRAGE é diretamente ligado ao aminoácido N-terminal dodomínio da imunoglobulina CH2 ou uma porção de um domínioCh2 de uma imunoglobulina.

29. Composição, de acordo com a reivindicação 28,CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão do RAGEcompreende a seqüência de aminoácido SEQ ID N2: 32, SEQ IDN2: 33, SEQ ID N-: 34, ou SEQ ID N2: 56.

30. Composição, de acordo com a reivindicação 28,CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão do RAGEcompreende a seqüência de aminoácido SEQ ID N2: 33 sem oresíduo do aminoácido lisina C-terminal, SEQ ID N2: 34 sem oresíduo do aminoácido lisina C-terminal, ou SEQ ID N2: 56sem o resíduo do aminoácido lisina C-terminal.

31. Composição, de acordo com a reivindicação 27,CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusãocompreende um domínio da imunoglobulina do RAGE único ligadopor intermédio de um ligador de interdomínio do RAGE aoaminoácido N-terminal de um polipeptídeo compreendendo umdomínio da imunoglobulina CH2 ou uma porção de um domínioCh2 de uma imunoglobulina.

32. Composição, de acordo com a reivindicação 31,CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão do RAGEcompreende a seqüência de aminoácido SEQ ID N2: 35, SEQ IDN2: 36, SEQ ID N2: 37, ou SEQ ID N2: 57.

33. Composição, de acordo com a reivindicação 31,CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão do RAGEcompreende a seqüência de aminoácido SEQ ID N2: 36 sem oresíduo do aminoácido lisina C-terminal, SEQ ID N2: 37 sem oresíduo do aminoácido lisina C-terminal, ou SEQ ID N2: 57sem o resíduo do aminoácido lisina C-terminal.

34. Composição, de acordo com a reivindicação 23,CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão do RAGE éformulada como uma solução injetável.

35. Composição, de acordo com a reivindicação 23,CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão do RAGE éformulada como um pó liofilizado estéril.

36. Método de fabricar a proteína de fusão doRAGE, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelofato de que compreende a etapa de covalentemente ligar umpolipeptídeo do RAGE a um polipeptídeo compreendendo umdomínio CH2 de uma imunoglobulina ou uma porção de umdomínio CH2 de uma imunoglobulina.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36,CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo do RAGEcompreende um' ligador de interdomínio do RAGE ligado a umdomínio da imunoglobulina do RAGE tal que o aminoácido C-terminal do domínio da imunoglobulina do RAGE é ligado aoaminoácido N-terminal do ligador de interdomínio, e oaminoácido C-terminal do ligador de interdomínio do RAGE édiretamente ligado ao aminoácido N-terminal de umpolipeptídeo compreendendo um domínio CH2 de umaimunoglobulina, ou uma porção deste.

38. Método, de acordo com a reivindicação 36,CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo do RAGEcompreende um sítio de ligação do ligante.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38,CARACTERIZADO pelo fato de que o sítio de ligação do ligantedo RAGE compreende SEQ ID N2: 9 ou uma seqüência pelo menos-90 % idêntica a esta, ou SEQ ID N-: 10 ou uma seqüência pelomenos 90 % idêntica a esta.

40. Método, de acordo com a reivindicação 37,CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo do RAGEcompreende um ligador de interdomínio ligado a um domínio daimunoglobulina do RAGE que compreende um fragmento de umaproteína do RAGE de comprimento pleno.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40,CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo do RAGEcompreende um primeiro domínio da imunoglobulina do RAGE eum primeiro ligador de interdomínio do RAGE ligado a umsegundo domínio da imunoglobulina do RAGE e um segundoligador de interdomínio do RAGE, tal que o aminoácido N-terminal do primeiro ligador de interdomínio é ligado aoaminoácido C-terminal do primeiro domínio da imunoglobulinado RAGE, o aminoácido N-terminal do segundo domínio daimunoglobulina do RAGE é ligado ao aminoácido C-terminal doprimeiro ligador de interdomínio, o aminoácido N-terminal dosegundo ligador de interdomínio é ligado ao aminoácido C-terminal do segundo domínio da imunoglobulina do RAGE, e oaminoácido C-terminal do segundo ligador de interdomínio doRAGE é diretamente ligado ao aminoácido N-terminal dodomínio da imunoglobulina CH2 ou uma porção de um domínioCh2 de uma imunoglobulina.

42. Método, de acordo com a reivindicação 40,CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo do RAGEcompreende um domínio da imuglobulina do RAGE único ligadopor intermédio de um ligador de interdomínio do RAGE aoaminoácido N-terminal de um polipeptídeo compreendendo umdomínio da imunoglobulina CH2 ou uma porção de um domínioCh2 de uma imunoglobulina.

43. Método, de acordo com a reivindicação 36,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão écodificada por uma construção de DNA recombinante.

44. Método, de acordo com a reivindicação 36,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda a etapa deincorporar a construção de DNA em um vetor de expressão.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda transfectaro vetor de expressão em uma célula hospedeira.

46. Método de produzir a proteína de fusão doRAGE, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelofato de que compreende expressar a proteína de fusão do RAGEem uma célula em que a célula compreende uma seqüência deácido nucléico que codifica para a proteína de fusão do RAGE.

47. Método, de acordo com a reivindicação 4 6,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão do RAGEexpressada compreende a seqüência de aminoácido da SEQ IDN-: 32, SEQ ID N2: 33, SEQ ID N2: 34, SEQ ID N2: 35, SEQ IDN2: 36, SEQ ID N2: 37, SEQ ID N5: 56, SEQ ID N2: 57.

48. Método, de acordo com a reivindicação 46,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão do RAGEexpressada compreende a seqüência do aminoácido da SEQ IDN2: 33 sem o resíduo do aminoácido lisina C-terminal, SEQ IDN2: 34 sem o resíduo do aminoácido lisina C-terminal, SEQ IDN2: 36 sem o resíduo do aminoácido lisina C-terminal, SEQ IDN2: 37 sem o resíduo do aminoácido lisina C-terminal, SEQ IDN2: 56 sem o resíduo do aminoácido lisina C-terminal, ou SEQID N2: 57 sem o resíduo do aminoácido lisina C-terminal.

49. Método para produzir uma proteína de fusão doRAGE, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende umpolipeptídeo do RAGE diretamente ligado a um polipeptídeocompreendendo um domínio CH2 de uma imunoglobulina ou umaporção de um domínio CH2 de uma proteína de fusão do RAGE daimunoglobulina, o método compreendendo expressar a proteínade fusão do RAGE codificada pelo ácido nucléico de acordocom a reivindicação 16 em uma célula.

50. Método, de acordo com a reivindicação 49,CARACTERIZADO pelo fato de que a célula é uma célula demamífero.

51. Método, de acordo com a reivindicação 49,CARACTERIZADO pelo fato de que a célula é selecionada dogrupo que consiste de uma célula de CHO, uma célula de NSO,uma célula de HeLa, uma célula de COS, e uma célula de SP2.

52. Método, de acordo com a reivindicação 51,CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende aindacultivar a célula e recuperar a proteína desta.

53. Método de tratar um distúrbio mediado por RAGEem um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de que compreendeadministrar a um paciente a proteína de fusão do RAGE deacordo com a reivindicação 1.

54. Método, de acordo com a reivindicação 53,CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo do RAGEcompreende um ligador de interdomínio do RAGE ligado a umdomínio da imunoglobulina do RAGE tal que o aminoácido C-terminal do domínio da imunoglobulina do RAGE é ligado aoaminoácido N-terminal do ligador de interdomínio, e oaminoácido C-terminal do ligador de interdomínio do RAGE édiretamente ligado ao aminoácido N-terminal de umpolipeptídeo compreendendo um domínio CH2 de umaimunoglobulina, ou uma porção deste.

55. Método, de acordo com a reivindicação 53,CARACTERIZADO pelo fato de que o sitio de ligação do ligantedo RAGE compreende SEQ ID N-: 9 ou uma seqüência pelo menos 90% idêntica a esta, ou SEQ ID N-: 10 ou uma seqüência pelomenos 90 % idêntica a esta.

56. Método, de acordo com a reivindicação 54,CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptideo do RAGEcompreende um ligador de interdominio ligado a um domínio daimunoglobulina do RAGE que compreende um fragmento de umaproteína do RAGE de comprimento pleno.

57. Método, de acordo com a reivindicação 56,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda um primeirodomínio da imunoglobulina do RAGE e um primeiro ligador deinterdominio do RAGE ligado a um segundo domínio daimunoglobulina do RAGE e um segundo ligador de interdominiodo RAGE, tal que o aminoácido N-terminal do primeiro ligadorde interdominio é ligado ao aminoácido C-terminal doprimeiro domínio da imunoglobulina do RAGE, o aminoácido N-terminal do segundo domínio da imunoglobulina do RAGE éligado ao aminoácido C-terminal do primeiro ligador deinterdominio, o aminoácido N-terminal do segundo ligador deinterdominio é ligado ao aminoácido C-terminal do segundodomínio da imunoglobulina do RAGE, e o aminoácido C-terminaldo segundo ligador de interdominio do RAGE é diretamenteligado ao aminoácido N-terminal do domínio da imunoglobulinaCh2 ou uma porção de um domínio CH2 de uma imunoglobulina.

58. Método, de acordo com a reivindicação 57,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão do RAGEcompreende a seqüência de aminoácido SEQ ID N2: 33, SEQ IDN2: 34, ou SEQ ID N2: 56.

59. Método, de acordo com a reivindicação 57,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão do RAGEcompreende a seqüência de aminoácido SEQ ID N2: 33 sem oresíduo do aminoácido lisina C-terminal, SEQ ID N2: 34 sem oresíduo do aminoácido lisina C-terminal, ou SEQ ID N2: 56sem o resíduo do aminoácido lisina C-terminal.

60. Método, de acordo com a reivindicação 57,CARACTERIZADO pelo fato de que o ligador de interdomínio doRAGE diretamente ligado ao domínio CH2 da imunoglobulina ouuma porção deste, compreende SEQ ID N2: 22 ou uma seqüênciapelo menos 90 % idêntica a esta, ou SEQ ID N2: 24 ou umaseqüência pelo menos 90 % idêntica a esta.

61. Método, de acordo com a reivindicação 56,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um domínio daimuglobulina do RAGE único ligado por intermédio de umligador de interdomínio do RAGE ao aminoácido N-terminal deum polipeptídeo compreendendo um domínio da imunoglobulinaCh2 ou uma porção de um domínio CH2 de uma imunoglobulina.

62. Método, de acordo com a reivindicação 61,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão do RAGEcompreende a seqüência de aminoácido SEQ ID N2: 36, SEQ IDN2: 37, ou SEQ ID N2: 57.

63. Método, de acordo com a reivindicação 61,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão do RAGEcompreende a seqüência de aminoácido SEQ ID N2: 36 sem oresíduo do aminoácido lisina C-terminal, SEQ ID N2: 37 sem oresíduo do aminoácido lisina C-terminal, ou SEQ ID N2: 57sem o resíduo do aminoácido lisina C-terminal.

64. Método, de acordo com a reivindicação 61,CARACTERIZADO pelo fato de que o ligador de interdomínio doRAGE diretamente ligado à imunoglobulina CH2 ou uma porçãodeste, compreende SEQ ID N-: 21 ou uma seqüência pelo menos 90% idêntica a esta, ou SEQ ID Ns: 23 ou uma seqüência pelomenos 90 % idêntica a esta.

65. Método, de acordo com a reivindicação 53,CARACTERIZADO pelo fato de que o método de administraçãocompreende pelo menos um de administração intravenosa,administração intraperitoneal ou administração subcutânea daproteína de fusão do RAGE ao paciente.

66. Método, de acordo com a reivindicação 53,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão é usadapara tratar um sintoma de diabetes ou um sintoma decomplicações diabéticas tardias.

67. Método, de acordo com a reivindicação 66,CARACTERIZADO pelo fato de que o sintoma de diabetes oucomplicações diabéticas tardias compreende pelo menos um denefropatia diabética, retinopatia diabética, uma úlcera dopé diabético, uma complicação cardiovascular, ou neuropatiadiabética.

68. Método, de acordo com a reivindicação 53,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão é usadapara tratar pelo menos um de amiloidose ou doença deAlzheimer.

69. Método, de acordo com a reivindicação 53,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão é usadapara tratar câncer.

70. Método, de acordo com a reivindicação 53,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão é usadapara tratar inflamação.

71. Método, de acordo com a reivindicação 53,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão é usadapara tratar inflamação associada com pelo menos um deautoimunidade, doença inflamatória intestinal, artritereumatóide, psoríase, esclerose múltipla, hipoxia, acidentevascular cerebral, ataque cardíaco, choque hemorrágico,sepsia, ou cura do ferimento prejudicada.

72. Método, de acordo com a reivindicação 71,CARACTERIZADO pelo fato de que a autoimunidade compreenderejeição de pelo menos uma de células da pele, célulaspancreáticas, células do nervo, células do músculo, célulasendoteliais, células do coração, células do fígado, célulasrenais, coração, células da medula óssea, osso, célulassangüíneas, células arteriais, células da veia, células dacartilagem, células da tireóide, ou células tronco.

73. Método, de acordo com a reivindicação 53,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão é usadapara tratar falência renal.

74. Método, de acordo com a reivindicação 53,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão é usadapara tratar inflamação e/ou rejeição associada comtransplantação de pelo menos um de um órgão, um tecido, ouuma pluralidade de células de um primeiro sítio a um segundositio.

75. Método, de acordo com a reivindicação 74,CARACTERIZADO pelo fato de que os primeiro e os segundossítios estão em pacientes diferentes.

76. Método, de acordo com a reivindicação 74,CARACTERIZADO pelo fato de que os primeiros e os segundossítios estão no mesmo paciente.

77. Método, de acordo com a reivindicação 74,CARACTERIZADO pelo fato de que as células, tecido, ou órgãotransplantados compreendem uma célula, tecido ou órgão de umpâncreas, pele, fígado, rim, coração, medula óssea, sangue,osso, músculo, artéria, veia, cartilagem, tireóide, sistemanervoso, ou células tronco.

78. Método de prevenir rejeição do transplante deuma célula, tecido ou órgão, o método CARACTERIZADO pelofato de que compreende administrar uma quantidadeterapeuticamente eficaz da proteína de fusão do RAGE deacordo com a reivindicação 1.