BRPI0707645B1 - Métodos in vitro para detecção de câncer em um indivíduo e para avaliação de prognóstico de um indivíduo tendo, ou suspeito de ter, câncer ovariano - Google Patents

Abstract

detecção de câncer por níveis elevados de bcl-2. a presente invenção refere-se a um método para o diagnóstico, prognóstico e monitoração de câncer, tal como câncer ovariano de estágio precoce ou tardio, em um indivíduo por detecção de bcl-2 em uma amostra biológica a partir do indivíduo, de preferência uma amostra de urina ou de sangue. bcl-2 pode ser medido usando-se um agente que detecta ou se liga à proteína de bcl-2 ou a um agente que detecta ou se liga a ácidos nucléicos de codificação, tais anticorpos especificamente reativos com proteína de bcl-2 ou uma sua porção. a invenção ulteriormente refere-se a kits para a realização dos métodos da invenção. a invenção ulteriormente refere-se a um dispositivo para a detecção rápida de bcl-2 em um fluido corpóreo e métodos para rapidamente medir bci-2 em um fluido corpóreo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS IN VITRO PARA DETECÇÃO DE CÂNCER EM UM INDIVÍDUO E PARA AVALIAÇÃO DE PROGNÓSTICO DE UM INDIVÍDUO TENDO, OU SUSPEITO DE TER, CÂNCER OVARIANO.

Referência Cruzada a Pedido Relacionado [001] O presente pedido reivindica o benefício do pedido provisório U.S. N° de série 60/771.677, depositado em 9 de fevereiro de 2006, que é incorporado por referência aqui em sua totalidade, incluindo quaisquer figuras, tabelas, seqüências de ácidos nucléicos, seqüências de aminoácidos e desenhos.

Antecedentes da Invenção [002] Marcadores de câncer são substâncias que podem ser encontrados no corpo (usualmente no sangue ou na urina) quando câncer está presente. Eles podem ser produtos das próprias células de câncer ou do corpo em resposta a câncer ou outras condições. Por várias razões, os próprios marcadores de câncer não são usualmente suficientes para diagnosticar (ou excluir) um tipo específico de câncer. A maioria dos marcadores de câncer pode ser produzida por células normais bem como por células de câncer, ainda que em quantidades menores. Algumas vezes, doenças não cancerosas podem também levar níveis de certos marcadores de câncer a serem mais altos do que normais. Além disso, nem toda pessoa com câncer pode ter níveis mais altos de um marcador de câncer. Por essas razões, apenas uma pequena quantidade de marcadores de câncer é comumente usada pela maioria dos doutores. Quando um doutor examina o nível de um certo marcador de câncer, ele ou ela tipicamente considerará-lo(a) juntamente com os resultados do exame físico e da história do paciente, e outros testes de laboratório ou testes de formação de imagem.

[003] Triar refere-se procurar câncer em indivíduos os quais não têm nenhum sintoma da doença, enquanto detecção precoce é enconPetição 870180158704, de 05/12/2018, pág. 4/12

2/78 trar câncer a um estágio precoce da doença, quando é menos provável de ter se espalhado (e é mais provável ser tratado eficazmente). Embora marcadores de câncer fossem originalmente investigados e desenvolvidos para testar quanto a câncer em pessoas sem sintomas, muito poucos marcadores demonstraram ser úteis desse modo.

[004] Câncer ovariano tem a mortalidade mais alta entre os cânceres ginecológicos. A falta de sintomas precoce e da ausência de um teste de triagem confiável para detectar câncer ovariano resultam em acima de 70% de mulheres diagnosticadas depois que a doença se espalhou além do ovário de modo que o prognóstico é pobre com cerca de 12.000 mortes devido a câncer ovariano anualmente (sobrevivência de 5 anos não é melhor do que 37%). Atualmente, exame pélvico físico por um médico, ultra-som ou medição de níveis de sangue para CA125 são os únicos métodos-padrão disponíveis para a detecção de câncer ovariano. No entanto, nenhum desses métodos provê um um método exato e com confiança consistente para detectar câncer ovariano. Por exemplo, embora acima de 80% de mulheres com câncer ovariano tivessem níveis de CA125 elevados no sangue, níveis de CA125 no sangue são apenas cerca de 50% exatos para a detecção da doença no estágio precoce. O desenvolviento de um novo teste ou um teste alternativo para detectar com segurança e com exatidão todos os cânceres ovarianos é imperativo. Assim, o que é necessário é uma tecnologia que supere a falta corrente de um teste confiável, exato, seguro e de custo eficaz para câncer ovariano. Além do mais, o que é necessário é um tecnologia que exatamente detecte todos os cânceres ovarianos, muitos dos quais agora são não-detectados, bem como monitoram carga da doença através de todo o curso do câncer ovariano.

[005] Um teste exato, seguro, simples e confiável para diagnosticar câncer ovariano beneficiaria todas as mulheres, nos Estados UniPetição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 10/114

3/78 dos e no mundo todo, incluindo áreas geográficas de oferta medicalmente insuficientes e especialmente mulheres em alto risco para o desenvolvimento de câncer ovariano. Dado que cerca de 25.000 mulheres são diagnósticadas com câncer ovariano anualmente nos EUA, um biomarcador de câncer ovariano que é detectável tanto em estágios precoces quanto em estágios tardios de doença não apenas confirmaria o diagnósticos de câncer ovariano, mas poderia também potencialmente detectar milhares de cânceres ovarianos anteriormente não diagnosticados. Isso é especialmente importante para a detecção de câncer ovariano em estágios precoces onde a doença está confinada ao ovário, mas atualmente é responsável por menos do que 10% de cânceres ovarianos diagnosticados. Nessas situações, remoção cirúrgica do ovário doente aumenta a sobrevivência do paciente para acima de 90% e seria esperado reduzir os custos médicos. A capacidade de exatamente detectar e monitorar câncer ovariano em cada paciente através do curso de sua doença, não apenas serveria para diagnóstico de câncer ovariano inicial, mas também indicaria eficácia terapêutica e/ou doença recorrente. O desenvolvimento de um teste à base de ELISA aprovado pela FDA, por exemplo, poderia tornar padrão de ouro para diagnóstico clínico de câncer ovariano.

[006] Enquanto apoptose é um processo biológico essencial para desenvolvimento e manutenção normal de homeostase, está também envolvido em numerosas condições patológicas incluindo lesão de tecido, doenças degenerativas, doenças imunológicas, e câncer (Lowe, S.W. and Lin, A.W. Carcinogenesis, 2000, 21:485-495). Se ativado por morte de receptores ligados à membrana (Ashkenazi, A. e outros J. Clin. Invest., 1999, 104:155-162; Walczak, H. Krammer, P.H. Exp. Cell Res, 2000, 256:58-66) ou pela perturbação mitocondrial induzida por estresse com subseqüente liberação de citocromo c (Loeffler, M. and Kroemer, G. Exp. Cell Res., 2000, 256:19-26; Wernig, F. and Xu, Q.

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Prog. Biophys. Mol. Biol., 2002, 78:105-137; Takano, T. e outros Antiox. Redox. Signal, 2002, 4:533-541), ativação de caspases a jusante leva à destruição celular por etapas por rompimento do citoesqueleto, paralisação de replicação e reparo de DNA, degradação de DNA cromossomal, e, finalmente, desintegração da célula em corpos apoptóticos (Nagata, S. Exp. Cell Res., 2000, 256:12-18). Os reguladoreschave de apoptose incluem membros da família de proteína de bcl-2 (Farrow, S.N. and Brown, R. Curr. Opin. Gen. Dev., 1996, 6:45-49).

[007] A família de proteína de bcl-2 consiste em tanto membros da família de proteína pró- quanto antiapoptótica que agem a níveis diferentes da cascata apoptótica para regular apoptose. Os membros da família de bcl-2 contêm um domínio de homologia de Bcl-2 (BH) (Farrow, S.N. and Brown, R. Curr. Opin. Gen. Dev., 1996, 6:45-49). Embora todos os membros da família de bcl-2 demonstrem atividade de formação de canal de membrana, canais de Bcl-2 (o membro da família de bcl-2 original) são cátion (Ca⁺⁺) seletivo e, devido a sua exclusiva localização mitocondrial e ER (Thomenius, M.J. and Distelhorst, C.W. J. Cell Sci., 2003, 116:4493-4499), a função antiapoptótica de Bcl-2 é pelo menos parcialmente mediada por sua capacidade de evitar liberaçãode cálcio do ER e perturbação da membrana mitocondrial e liberação de citocromo c. Uma vez que Bcl-2 é ultra-expresso em muitos tipos de tumores incluindo câncer ovariano (Sharma, H. e outros Head Neck, 2004, 26:733-740; Hanaoka, T. e outros Intl. J. Clin. Oncol., 2002, 7:152-158; Trisciuoglio, D. e outros J. Cell Physiol., 2005, 205:414-421; Khalifeh, I. e outros Int. J. Gynecol. Pathol., 2004, 23:162-169; O'Neill, C.J. e outros Am. J. Surg. Pathol., 2005, 29:10341041), ele contribui para quimiorresistência por estabilização de membrana mitocondrial contra insultos apoptóticos. Atualmente, estudos pré-clínicos focalizam o desenvolvimento de agentes para inibir Bcl-2, incluindo oligonucleotídeos e anti-sentido tais como G3,139 (Acker

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5/78 mann, E.J. e outros J. Biol. Chem., 1999, 274:11245-11252), e inibidores moleculares de Bcl-2 (Lickliter, J.D. e outros Leukemia, 2003, 17:2074-2080). Embora tais estudos direcionem Bcl-2 para a intervenção terapêutica, quantificação de Bcl-2 urinário não foi anteriormente relatado na literatura.

[008] Seria vantajoso ter ensaios disponíveis que provêem métodos seguros, sensíveis, específicos e econômicos para a detecção de cânceres tal como câncer ovariano que beneficiaria mundialmente a sociedade.

Breve Sumário da Invenção [009] A presente invenção refere-se à triagem de câncer. Bcl-2 constitui um biomarcador para o prognóstico, diagnóstico e monitoração de câncer, tal como câncer reprodutivo. Por exemplo, Bcl-2 pode ser usado para diagnosticar e monitorar câncer ovariano de estágio precoce ou de estágio tardio. Bcl-2 pode ser usado como um biomarcador para câncer antes da cirurgia e depois da recaída. Bcl-2, e agentes que ligam polipeptídeos e polinucleotídeos de Bcl-2 podem ser usados para detectar e monitorar câncer ovariano, e outros canceres reprodutivos e não reprodutivos.

[0010] Assim, mais particularmente, essa invenção refere-se à detecção de câncer por triagem quanto a níveis elevados de Bcl-2 em amostras biológicas, tais como fluido de urina, sangue (por exemplo, plasma, soro ou sangue total), e ascites. Em uma concretização, o câncer é o câncer ovariano. Em uma outra concretização, o câncer é um tipo selecionado do grupo que consiste em mama, endometrial, cervical, pulmão, cólon, próstata, Melanoma gioblastoma, sarcoma, bexiga, cabeça e pescoço. Opcionalmente, o método ulteriormente compreende a verificação que o indivíduo está sofrendo do câncer detectado (por exemplo, por avaliação quanto a presença de um ou mais sintomas de câncer, detecção dos marcadores de câncer adicionais,

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6/78 detecção da presença do câncer através de uma modalidade de imagem tais como raios X, CT, imagem nuclear (PET e SPECT), ultrasom, MRI) e/ou tratamento do indivíduo para o câncer detectado (por exemplo, cirurgia, quimioterapia e/ou radiação).

[0011] A presente invenção refere-se a kits para a realização dos métodos da invenção.

[0012] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um dispositivo para a rápida detecção de Bcl-2 em um fluido de corpo tal como sangue ou urina. De preferência, o dispositivo é um dispositivo de fluxo lateral. Em uma concretização, o dispositivo compreende uma zona de aplicação para receber uma amostra de fluido do corpo tal como sangue ou urina; uma zona de marcação contendo um agente de ligação que se liga a Bcl-2 na amostra; e uma zona de detecção onde agente de ligação ligado a Bcl-2 é retido para dar um sinal, em que o sinal dado para uma mostra de um indivíduo com um nível de Bcl-2 mais baixo do que uma concentração limiar é diferente do sinal dado para uma amostra de um paciente com um nível de Bcl-2 igual a ou maior do que uma concentração limiar.

[0013] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um teste simples, rápido, confiável, exato e de custo eficaz para Bcl-2 em um fluido do corpo tal como sangue ou urina, similar a testes de gravidez feitos em casa atualmente disponíveis que poderiam ser usados por indivíduos em sua própria casa, em um consultório médico, ou em uma cabeceira do paciente.

[0014] Em uma concretização, o teste é um método para medição de Bcl-2 em um fluido de corpo compreendendo: (a) obtenção de uma amostra de fluido do corpo, tal como sangue ou urina, a partir de um indivíduo; (b) contato da amostra com um agente de ligação que se liga a qualquer Bcl-2 na amostra; separação da ligação Bcl-2 de agente de ligação (c); e (e) comparação do sinal detectado na etapa (d)

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7/78 com um sinal de referência que corresponde ao sinal dado por uma amostra de um indivíduo com um nível de Bcl-2 igual a uma concentração limiar. Em uma concretização, o fluido do corpo é urina e a concentração limiar está entre 0 ng/ml e 2,0 ng/ml. Em uma outra concretização, o fluido do corpo é urina, e a concentração limiar é de 1,8 ng/ml.

[0015] Para avaliar se níveis urinários de Bcl-2 poderiam ser usados para detectar câncer ovariano, urina foi coletada a partir de voluntários saudáveis normais, a partir de pacientes com câncer ovariano e foi medida quanto a Bcl-2 por ELISA. A quantidade média de Bcl-2 na urina de pacientes com câncer era em geral pelo menos 10x maior do que de controles saudáveis. Além disso, nenhuma das amostras de urina coletada a partir de 35 mulheres com doença ginecológica benigna (incluindo teratomas, cistos ovarianos, leiomiomas, doença de ovário policístico, adenofibroma ou cistadenomas) tinham níveis de Bcl-2 acima daquele encontrado em voluntários saudáveis, normais. Níveis urinários de Bcl-2 diminuiram até 100% em pacientes com câncer ovariano após cirurgia de remoção. A sensibilidade e especificidade para Bcl-2 urinário elevado associadas a câncer ovariano era quase 100% dos níveis de sangue total de CA125 > 35 U/ml apenas identificavam 68% dos pacientes com câncer ovariano. Comparação de parâmetros clínicos indicavam que níveis urinários de Bcl-2 se correlacionaram bem com grau e estágio de tumor. No entanto, níveis urinários de Bcl-2 não estavam realcionados com idade do paciente ou tamanho de tumor. Portanto quantificação de Bcl-2 urinário por ensaios à base de ELISA provê um método seguro, específico e econômico para detectar câncer ovariano, para monitorar câncer ovariano através de todo o curso de doença e prever o resultado terapêutico e de prognóstico. Breve Descrição dos Desenhos [0016] A Figura 1 é um histograma que mostra níveis urinários de

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Bcl-2. Níveis urinários de Bcl-2 são mais altos em pacientes com câncer ovariano em comparação com voluntários saudáveis normais. Urina foi coletada a partir de voluntários saudáveis normais e a partir de pacientes com câncer ovariano (incluindo subtipos histológicos serosos, que contém mucina) e câncer peritoneal. Cânceres ovarianos serosos foram ulteriormente subdivididos em estágio 1 (o primeiro três barras na esquerda no grupamento seroso), estágio 2 (o próximo oito barras nenhum grupamento seroso (isto é, barras de 4-11 oriundas da esquerda do grupamento seroso)) e o estágio 3 (as onze barras na seção à direta do grupamento seroso (isto é, barras de 12-22 oriundas da esquerda do grupamento seroso). A urina foi testada em triplicata para Bcl-2 por ELISA (kits ELISA oriundos de Bender MedSystems, catálogo N° BMS244/3) e os resultados expressos como a média de ng/ml de Bcl-2 ± S.E.. Os dados indicam níveis consistentemente elevados de Bcl-2 na urina de pacientes com câncer. Análise de teste t de Student revelaram uma diferença estatística entre amostras de câncer e normal a p < 0,00001.

[0017] A Figura 2 é um histograma que mostra níveis urinários de Bcl-2 em pacientes normais e com câncer. Amostras de urina adicionais foram coletadas a partir de voluntários saudáveis normais e a partir de pacientes com câncer ovariano (incluindo do endometróide, soro e mucina de subtipos histológicos) e câncer peritoneal. Cânceres ovarianos serosos foram ulteriormente subdivididos em estágio 1 (7 barras mais a esquerda no grupamento seroso), estágio 2 (barras de 8-17 da esquerda no grupamento seroso) e estágio 3 (12 barras mais a direita no grupamento seroso). A urina foi testada em triplicata para Bcl-2 por ELISA (kits ELISA oriundos de Bender Med Systems), os resultados expressos como a média de ng/ml Bcl-2 e representam todas as amostras de urina normais e com câncer pré-cirúrgico testadas até agora. De acordo com a Figura 1, os dados indicam níveis consisten

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9/78 temente elevados de Bcl-2 na urina de pacientes com câncer. Análise de teste t de Student revelam uma diferença estatística entre amostras de câncer e normal a p < 0,00001.

[0018] As Figuras 3A e 3B são histogramas que demonstram que Bcl-2 urinário está relacionado com estágio e grau de tumor, respectivamente. Níveis de Bcl-2 urinário foram representados graficamente contra tumor estágio a partir de todos os subtipos de câncer ovariano histológicos disponíveis (seroso, de endométrio, que contém mucina). Estágios I, II, III e V são representados por numerais Romanos com grupamentos de baixo. Embora ainda consideravelmente mais alto do que os controles normais, Figura 3A ilustra que níveis urinários de Bcl2 fossem mais baixos nos tumores de estágio I e II (média de ng/ml Bcl-2 = 2,2) onde a doença está localizada para dentro da cavidade ovariana e peritoneal, respectivamente. Níveis urinários de Bcl-2 eram maiores entre o estágio III e V (média de ng/ml Bcl-2 = 4,22) quando a doença espalhou bem além do ovário ou é doença recorrente, respectivamente.

[0019] As Figuras 4A e 4B são um par de histogramas que mostra a capacidade de Bcl-2 urinário (Figura 4A) em relação às medições de níveis de CA125 no plasma (Figura 4B) na detecção de câncer ovariano. Onde quer que possível, níveis de Bcl-2 urinário como anteriormente mostrados nas Figuras 1-3 eram em comparação com plasma níveis de CA125 dos mesmos voluntários saudáveis normais e pacientes com câncer. O último grupo incluia pacientes com câncer ovariano que contém mucina (Muc), câncer peritoneal primário (PP) e câncer ovariano seroso (Seroso). Níveis de CA125 foram determinados por ELISA (kits oriundos de Bio-Quant, San Diego, CA, Catálogo N° BQ1013T) em triplicata. Os dados são expressos como a média de ng/ml Bcl-2 (A) e média de U/ml CA125 (Figura 4B). A sensibiliade e especificidade para detectar câncer ovariano por níveis elevados de

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Bcl-2 urinário eram quase 100%. Em contraste com isso, níveis no sangue de CA125 > 35 U/ml, o padrão atual para a detecção de câncer ovariano, apenas corretamente identificou 68% de pacientes com câncer ovariano.

[0020] A Figura 5 é um histograma mostrando que Bcl-2 urinário não correlaciona com idade do paciente. Para examinar se níveis elevados urinários de Bcl-2 em pacientes com câncer correlacionados com idade do paciente, níveis de Bcl-2 urinário (como determinado anteriormente nas Figuras 1-3 e 4A-4B) eram em comparação contra a idade do paciente em anos. Embora a média de idade de voluntários saudáveis normais nesse estudo era um pouco mais baixa (54,8 anos) do que pacientes com câncer (66,2 anos), não há diferença estatística na idade entre os grupos devido à ampla faixa na idade (vide o inserto na Figura 5). Além disso, a média de idade de pacientes com câncer está de acordo com a literatura e dados clínicos indicando que câncer ovariano em geral direciona mulheres peri- e pós-menopausa. No entanto, não pareceu ser uma correlação entre níveis urinários de Bcl-2 com idade do paciente.

[0021] A Figura 6 é um histograma mostrando que Bcl-2 urinário não correlaciona com tamanho de tumor ovariano. Para examinar se níveis elevados urinários de Bcl-2 em pacientes com câncer correlacionados com tamanho de tumor, níveis de Bcl-2 urinário (como determinado anteriormente nas Figuras 1-3 e 4A-4B) estavam em comparação contra tamanho de tumor. Tumores foram agrupados como: 1= microscópico de tamanho; 3 = tumores menores do que 3 cm; 6 = tumores entre 3 e 6 cm; 10 = tumores maiores do que 6 cm e até 10 cm; 11 = tumores maiores do que 10 cm. Os dados indicam que não pareceu haver uma correlação entre níveis urinários de Bcl-2 com tamanho de tumor.

[0022] As Figuras 7A e 7B são um par de histogramas mostrando

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11/78 que Bcl-2 urinário diminui depois de cirurgia de remoção de câncer ovariano. Para ulteriormente testar a exatidão de Bcl-2 urinário para detectar câncer ovariano, níveis de Bcl-2 urinário em comparação naqueles pacientes de câncer ovariano disponíveis imediatamente antes de (barras pretas) e no período de 2 semanas após (barras cinzas) a cirurgia de remoção inicial (remoção de todo o tumor visível) (Figura 7A). Para aqueles 7 pacientes onde amostras de urina foram coletadas antes e depois da cirurgia inicial, níveis de Bcl-2 diminuiram até 100% após remoção cirúrgica de tumor. Esses dados, então, sugerem que o tumor é a fonte de Bcl-2 encontrada elevada na urina de pacientes com câncer ovariano e que níveis de Bcl-2 urinário são paralelos à presença de câncer ovariano. Além disso, amostras de urina foram coletadas a partir de 5 dos 7 pacientes na Figura 7A nas visitas clínicas de acompanhamento subsqüente variam de 7 a 11 meses após cirurgia inicial e mediam quanto a Bcl-2 (barras azuís) (Figura 7B). Níveis de Bcl-2 urinários permaneceram baixos em 3 pacientes de acompanhamento (N° 41,43, 54) e se tornaram elevados em 2 pacientes (N° 5, 27). Revisão de mapa prelimiar indicava que pacientes N° 41, 43, 54 estavam sofrendo quimioterapia na hora das visitas de acompanhamento e que sua doença de câncer ovariano disease estava sob controle. Em contraste com isso, revisão de mapa sugere que pacientes N° 5, 27 tinham doença recorrente (5B, 27B) e que paciente N° 27b sofria de cirurgia de remoção de tumor adicional. De acordo com a informação clínica, níveis de Bcl-2 urinário permaneceram reduzidos em pacientes que sofrem quimioterapia e os quais não tinham doença residual mínima ou aparente (N° 41, 43, 54). Do mesmo modo, níveis de Bcl-2 urinário elevados correlacionados com a presence de doença recorrente (N° 5b, 27B) e diminuiram com remoção de doença subseqüente (N° 27c).

[0023] As Figuras 8A e 8B mostram resultados de testagem de

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Bcl-2 em pacientes com doença ginecológica benigna. Amostras urinárias foram examinadas por ELISA quanto a Bcl-2 em pacientes com doença ginecológica benigna. Amostras foram examinadas em triplicata e os dados expressos como a média de ng/ml de Bcl-2 ± S.E. (Figura 8A). Amostras de doença ginecológica benigna foram subdivididas por tipo (teratoma cístico benigno, cisto simples, leiomioma, ovário policístico, adenofibroma, cistadenoma de mucina e seroso) com amostra de paciente com câncer ovariano N° 41 (barra branca) que serve como um controle positivo interno. Média de Bcl-2 urinário ng/ml ± S.E. entre doença benigna são indicadas abaixo de seu respectivo cabeçalho. Amostras oriundas da Figura 2 e da Figura 3A foram reapresentadas graficamente para mostrar a distribuição de expressão de Bcl-2 para esse grupo de estudo (n=92), mostradas na Figura 8B. Níveis de Bcl-2 em indivíduos com câncer, benigno e normais variavam de 0,1151,016 ng/ml, 1,12-9,8 ng/ml e 0-1,26 ng/ml e média 0,614 ng/ml, 3,4 ng/ml and 0,21 ng/ml, respectivamente.

[0024] A Figura 9 é um histograma mostrando que Bcl-2 pode ser secretado em meio condicionado de cultura de célula. Meio condicionado (CM) foi coletado a partir de linhas de células de câncer estabelecidas que repretam cânceres ovariano (OV2008, SKOV3, PA1), cervical (Hela), de próstata (LNCap, DU145, PC-3), de cabeça e pescoço (HN5a) e de linfoma (Raji) e foi examinado por ELISA quanto a presença de Bcl-2. Dados são expressos como a média de amostras em triplicatas. A presença de Bcl-2 no CM de culturas de células de câncer ovariano, cervical e de próstata sugere que essas células de câncer produzem e secretam Bcl-2.

[0025] A Figura 10 mostra que Bcl-2 é ultra-expresso em algumas células de câncer. Lisados de células oriundos de linhas de células de câncer estabelecidas que representam cânceres ovariano (SW626,

C13), de cabeça e pescoço (HN5a), cervical (Hela) e de próstata

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13/78 (DU145) eram western immunoblotted para Bcl-2. Actina serviu como um controle de carregamento e células de FHIOSE118 (células epiteliais de superfície ovariana humanas transfectadas com antígeno T grande de SV-40) serviam como células de controle epiteliais de superfície ovariana não maligna, normais. Após análise densitométrica, o nível de Bcl-2 foi normalizado para actina, observado abaixo das manchas. Células normais continham quantidades desprezíveis de bcl-2 enquanto células de câncer ovariano e cervical continham a quantidade maior de Bcl-2.

[0026] A Figura 11 mostra concentrações de proteína de Bcl-2 após a armazenagem. Amostras de urina oriundas de indivíduos saudáveis (N° 506, 508) e pacientes com câncer ovariano (N° 77, 97) foram originalmente testados quanto a Bcl-2 como parte desse estudo (controle) e após armazenagem por 4 dias ou a temperatura ambiente (25°C), em uma geladeira (4°C), em um freezer -20°C (-20°C) ou em um freezer -80°C (-80°C). Todas as amostras foram t estadas em duplicata para níveis urinários de Bcl-2 usando-se de kit ELISA (BenderMed Systems).

[0027] A Figura 12 mostra concentrações de proteína de Bcl-2 em meio condicionado (CM) de linhas de células de câncer após o tratamento com ácido lisofosfatídico (LPA), incluindo DU145, uma linha de célula de câncer de próstata. A figura mostra que tratamento com LPA, que freqüentemente retro-alimenta nas células de câncer do modo de um loop autócrino, estimula secreção de Bcl-2 no CM de alguns tipos de célula de câncer. Uma vez que essas linhas de células de câncer secretam Bcl-2 em seu CM, como fazem linhas de célula de câncer ovariano, os correspondentes de tumor in vivo de tais linhas de células potencialmente secretam Bcl-2 em fluidos biológicos tais como urina e/ou sangue e podem ser detectadas usando-se a presente invenção.

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Breve Descrição das Seqüências

SEQ ID NO: 1 é DNA de Bcl-2 humano (GenBank N° de acesso M14745); região de codificação (CDS): bases 32-751.

SEQ ID NO: 2 é proteína de Bcl-2 humana (GenBank N° de acesso AAA35591).

SEQ ID NO: 3 é DNA de Bcl-2 humano, variante de transcrito alfa (GenBank N° de acesso NM_000633); CDS: bases 494-1213.

SEQ ID NO: 4 é proteína de Bcl-2 humana, variante de transcrito alfa (GenBank N° de acesso NP_000624).

SEQ ID NO: 5 é DNA de Bcl-2 humano, variante de transcrito beta (GenBank N° de acesso NM_000657); CDS: bases 4941111.

SEQ ID NO: 6 é proteína de Bcl-2 humana, variante de transcrito beta (GenBank N° de acesso NP_000648).

Descrição Detalhada da Invenção [0028] Bcl-2 é um marcador molecular eficaz para câncer tal como câncer ovariano. Marcadores de câncer (também chamados de marcadores de tumor) são moléculas tais como hormônios, enzimas, e imunoglobulinas encontrados no corpo que estão associados a câncer e cuja medição ou identificação é útil em diagnóstico de paciente ou controle clínico. Eles podem ser produtos das próprias células de câncer, ou do corpo em resposta a câncer ou outras condições. A maioria dos marcadores de câncer são proteínas. Alguns marcadores de câncer são vistos apenas em um único tipo de câncer, enquanto outros podem ser detectados em vários tipos de câncer. Como com outros marcadores de câncer, Bcl-2 pode ser usado para uma variedade de finalidades, tal como: triagem de uma população saudável ou uma população de alto risco quanto a presença de câncer; produção de um diagnóstico de câncer ou de um tipo específico de câncer, tal como câncer ovariano; determinação do prognóstico de um indivíduo; e moPetição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 22/114

15/78 nitoração do curso em um indivíduo em remissão ou enquanto recebendo tratamento cirúrgico, radiação, quimioterapia ou outro tratamento de câncer.

[0029] Para avaliar se níveis urinários de Bcl-2 poderiam ser usados para detectar câncer ovariano, urina foi coletada a partir dos voluntários saudáveis normais (N = 21) e a partir de pacientes com câncer ovariano (N = 34) e peritoneal primário (N = 2) e mediam em triplicata para Bcl-2 usando-se kits ELISA comercialmente disponíveis (BenderMedSystems, católogo N° BMS244/3) de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados foram expressos como a média de ng/ml de Bcl-2 ± S.E.. A quantidade média de Bcl-2 na urina de voluntários saudáveis era de 0,204 ng/ml enquanto que oriundos de pacientes pré-cirúrgicos com câncer produziram em médio 3,12 ng/ml, em geral pelo menos 10X mais alta do que encontrada em controles normais. Análise de teste t de Student revelou uma diferença estatística entre amostras normais e de câncer a p< 0,00001. Comparação de parâmetros clínicos indicavam que níveis urinários de Bcl-2 correlacionavam bem com estágio e grau de tumor (figuras 3A e 3B).

[0030] Amostras no plasma oriundos desses mesmos indivíduos acima foram examinados em triplicata quanto a níveis de CA125 por ELISA comercialmente disponível (Bio-Quant, catálogo N° BQ1013T) de acordo com as instruções do fabricante. A sensibilidade e a especificidade para Bcl-2 urinário elevado associadas com detecção de câncer ovariano foi quase 100% enquanto níveis sangüíneos de CA125 >35 U/mL, o padrão atual para detecção de câncer ovariano, somente corretamente identificado 68% de pacientes com câncer ovariano, apenas corretamente identificavam 68% de pacientes com câncer ovariano.

[0031] Para ulteriormente testar a exatidão para níveis de Bcl-2 urinário para detectar câncer ovariano, níveis de Bcl-2 urinário foram

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16/78 comparados com aqueles pacientes de câncer ovariano disponíveis imediatamente antes de e no período de 2 semanas após a cirurgia de remoção inicial (remoção de todo o tumor visível). Para aqueles 7 pacientes onde amostras de urina foram coletadas antes e depois da cirurgia incial, níveis de Bcl-2 dimimuíram até 100% após a remoção cirúrgica de tumor. Esses dados, então, sugerem que o tumor é a fonte de Bcl-2 encontrado elevada na urina de pacientes com câncer ovariano. Além disso, amostras de urina foram coletados a partir de 5 desses 7 pacientes nas visitas clínicas de acompanhamento subseqüentes que variam de 7 a 11 meses após a cirurgia inicial e foram medidas quanto a Bcl-2. Níveis de Bcl-2 urinário permanceram baixo em 3 pacientes de acompanhamento (N° 41, 43, 54) e se tornaram elevados em 2 pacientes (N° 5, 27). Revisão de mapa prelimiar indicavam que pacientes N° 41, 43 e 54 estavam sofrendo quimioterapia na hora das visitas de acompanhamento e que sua doença de câncer ovariano estava sob controle. Em contrate com isso, revisão de mapa sugere que pacientes N° 5, 27 tinham doença recorrente e que o paciente N° 27 sofreu cirurgia de remoção de tumor adicional. De acordo com a informação clínica, níveis de Bcl-urinário permaneceram reduzidos em pacientes que sofrem quimioterapia e os quais não tinham doença residual mínima ou evidente (N° 41, 43, 54). Do mesmo modo, níveis de Bcl-2 urinário correlacionados com a presença de doença recorrente (N° 5, 27) e diminuíram com remoção da doença subseqüente (N° 27c).

[0032] Tomados juntos, esses dados indicam que quantificação de Bcl-2 urinário por ensaios à base de ELISA parece prover um método novo, sensível, específico e econômico para a detecção de câncer ovariano. Além disso, níveis urinários de Bcl-2 podem ser usados para monitorar a presença de câncer ovariano através de todo o curso da doença e pode prever resultados terapêuticos e prognósticos.

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17/78 [0033] Em um aspecto, a invenção inclui um método para a detecção de câncer em um indivíduo, compreendendo a detecção da presença de Bcl-2 em uma amostra biológica a partir do indivíduo, tal como urina, sangue, fluido peritoneal ou fluido de ascites, e em que um nível de Bcl-2 acima de um limiar predetrminado é indicativo de câncer no indivíduo. De preferência, a detecção não é realizada por um ensaio slot-blot qualitativo (tal como aquele comercialmente disponível da BioRad).

[0034] A detecção e/ou a monitoração de câncer usando os métodos, dispositivos e kits da invenção incluem mas não são limitados a, câncer de mama (por exemplo, infiltração (invasivo), pré-invasivo, inflamatório, doença de Paget, metastático ou recorrente); câncer gastrointestinal/digestivo (por exemplo, apêndice, duto biliar, cólon, esofageano, vesícula biliar, gástrico, intestinal, fígado, pancreático, retal e do estômago); câncer genitourinário/urinário (por exemplo, adrenal, bexiga, rim, pênis, próstata, testicular e urinário); câncer ginecológico (por exemplo, cervical, endomemtrial, tuba falopiano, ovariano, uterino, vaginal e vulvar); câncer de cabeça e de pescoço (por exemplo, olho, cabeça e pescoço, mandíbula, laríngeo, cavidade nasal, câncer oral, faríngeo, glândula salivar, sino, tiróide, língua e amígdala); câncer hematológico/sangüíneo (por exemplo, doença de Hodgkins, leucemia (leucemia linfocítica aguda, leucemia granulocítica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica), mieloma crônico, linfoma e nódulo linfático); câncer de músculo esquelético/ tecido mole (por exemplo, osteossarcoma, Melanoma pele (célula basal, célula escamosa), sarcoma (sarcoma de Ewing, sarcoma de Kaposi)); câncer neurológico (por exemplo, cérebro (atrocitoma, glioblastoma, glioma), glândula pituitária, medula espinhal)); e câncer respiratório/pulmão (por exemplo, pulmão (adenocarcinoma, célula em grão de aveia, célula não pequena, célula pequena, célula

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18/78 escamosa) e mesotelioma). Em uma concretização, o câncer é um câncer ovariano. Em uma outra concretização, o câncer é um tipo selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer endometrial, câncer cervical, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de próstata, Melanoma glioblastoma, sarcoma, câncer de bexiga e câncer de cabeça e pescoço.

[0035] Em uma concretização do método da invenção, a detecção compreende: (a) contato da amostra biológica com um agente de ligação que liga proteína Bcl-2 para formar um complexo; e (b) detecção do complexo; e correlação do complexo detectado com a quantidade de proteína de Bcl-2 na amostra, em que a presença de proteína de Bcl-2 elevada é indicativa de câncer. Em uma concretização específica, a detecção de (b) ulteriormente compreende a ligação ou incorporação de um rótulo sobre o agente, ou o uso de detecção imunoenzimática à base de ELISA.

[0036] Opcionalmente, os métodos da invenção ulteriormente compreendem a detecção de um biomarcador de câncer na mesma amostra biológica ou uma amostra biológica diferente obtida a partir do indivíduo, antes, durante ou depois da dita detecção de Bcl-2. Em uma concretização, o biomarcador de câncer é um biomarcador de câncer reprodutivo, tal como câncer ginecológico. Em uma outra concretização, o biomarcador é CA125 ou OVXI. O indivíduo pode ter nível de CA125 elevado no sangue na hora que a detecção de Bcl-2 é realizada, ou o indivíduo pode não ter um nível de CA125 elevado no sangue na hora que a detecção de Bcl-2 é realizada.

[0037] Em algumas concretizações, o indivíduo está sofrendo de câncer, tal como câncer ovariano, e a detecção é realizada em vários pontos de tempo em tempo, como parte de uma monitoração do indivíduo antes, durante ou depois do tratamento do câncer.

[0038] Opcionalmente, os métodos da invenção ulteriormente

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19/78 compreendem a comparação do nível de Bcl-2 na amostra biológica com o nível de Bcl-2 presente em uma amostra de controle normal, em que um nível mais alto de Bcl-2 na amostra biológica quando comparada com o nível na amostra de controle normal é indicativo de câncer tal como câncer ovariano.

[0039] Em algumas concretizações, o indivíduo não exibe nenhum sintoma de câncer na hora que a detecção de Bcl-2 é realizada. Em outras concretizações, o indivíduo exibe um ou mais sintomas de câncer na hora que a detecção de Bcl-2 é realizada. Por exemplo, com relação a câncer ginecológico (por exemplo, câncer ovariano), um ou mais sintomas de câncer ginecológico incluem aqueles selecionados do grupo que consiste em dor pélvica, sangramento vaginal anormal, inchamento ou intumescimento abdominal, dor nas costas persistentes, indisposição de estômago persistente, mudança em padrão de bexiga ou de intestino (tal como constipação, diarréia, sangue nas fezes, gás, fezes mais finas, freqüência ou urgência de urinação, constipação), dor durante a relação sexual, perda de peso não intencional de 4,53 kg ou mais (dez libras ou mais), anormalidade de vulva ou vaginal (tal como bolha, mudança na cor da pele ou descarga, mudança na mama (tal como um caroço, úlcera, saíde de líquido do mamilo, covinha, vermelhidão ou inchamento), fadiga.

[0040] Em uma outra concretização, a invenção inclui um método para a avaliação de prognóstico de um indivíduo tendo ou suspeito de ter, câncer, compreendendo: a) determinação do nível de Bcl-2 em uma amostra biológica obtida a partir do indivíduo tal como fluido de ascites, sangue ou urina; b) comparação do nível determinado na etapa (a) com uma faixa de Bcl-2 conhecida como estando presente em uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo normal que não tem câncer; e c) determinação do prognóstico do indivíduo com base na comparação da etapa (b), em que um nível alto de Bcl-2 na etapa

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20/78 (a) indica uma forma agressiva de câncer e, portanto, um prognóstico pobre.

[0041] Os termos detecção ou detectar incluem analisar ou de outra maneira estabelecer a presença ou ausência do Bcl-2 alvo (seqüência de ácido nucléico de codificação de Bcl-2 ou produto de gene de Bcl-2 polipeptídeo)), suas subunidades, ou combinações de alvos ligados a agente e similares, ou analisar quanto a, interrogar, verificar, estabelecer ou de outra maneira determinar um ou mais características reais de câncer ginecológico, metástase, estágio ou condições similares. O termo inclui diagnóstico, prognóstico e aplicações por monitoração para Bcl-2 e outros biomarcadores de câncer. O termo inclui metodologias quantitativas, semiquantitativas e qualitativas. Em concretizações da invenção que envolvem a detecção de proteína de Bcl2 (em oposição a moléculas de ácido nucléico que codificam proteína de Bcl-2), o método de detecção é de preferência um método à base de ELISA. De preferência, nas várias concretização da invenção, o método de detecção provê uma saída (isto é leitura ou sinal) com a informação com relação a presença, a ausência ou a quantidade de Bcl-2 em uma amostra de um indivíduo. Por exemplo, a saínda pode ser qualitativa (por exemplo, positiva ou negativa), ou quantitativa (por exemplo, uma concentração tais como nanogramas por mililitro).

[0042] Em uma concretização, a invenção refere-se a um método para a detecção de câncer em um indivíduo por quantificação de proteína de Bcl-2 ou codificação de ácidos nucléicos (DNA ou RNA) em uma amostra biológica tal como urina oriunda do indivíduo, compreendendo (a) contato (reação) da amostra biológica com um anticorpo específico para Bcl-2, que está diretamente ou indiretamente marcada com uma substância detectável; e (b) detecção da substância detectável.

[0043] Em uma concretização, a invenção refere-se a um método

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21/78 para o diagnóstico e/ou a monitoração de câncer em um indivíduo por quantificação de Bcl-2 em uma amostra biológica, tal como urina ou sangue, oriundo de um indivíduo, compreendendo (a) reação da amostra biológica com um anticorpo específico para Bcl-2 que está diretamente ou indiretamente marcado com uma substância detectável; e (b) detecção da substância detectável.

[0044] Concretizações dos métodos da invenção envolvem (a) contato da amostra biológica a partir de um indivíduo com um anticorpo específico para Bcl-2 que está diretamente ou indiretamente marcado com uma enzima; (b) adição de um substrato para a enzima em que o substrato é selecionado de modo que o substrato, ou um produto de reação da enzima e do substrato, forme complexos fluorescentes; (c) quantificação de Bcl-2 na amostra por medição de fluorescência dos complexos fluorescentes; e (d) comparação dos níveis quantificados com aquele de um padrão.

[0045] Uma concretização preferida da invenção compreende as seguintes etapas:

(a) incubação de uma amostra biológica com um primeiro anticorpo específico para Bcl-2 que está diretamente ou indiretamente marcado com a substância detectável, e um segundo anticorpo específico para Bcl-2 que está imobilizado (b) separação do primeiro anticorpo do segundo anticorpo para prover uma primeira fase de anticorpo e uma segunda fase de anticorpo;

(c) detecção da substância detectável na primeira ou segunda fase de anticorpo desse modo quantificação de Bcl-2 na amostra biológica; e (d) comparação do Bcl-2 quantificado com um padrão.

[0046] Um padrão usado em um método da invenção pode corresponder a níveis de Bcl-2 obtidos para amostras de indivíduos de conPetição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 29/114

22/78 trole saudáveis, a partir de indivíduos com doença benigna (por exemplo, doença ginecológica benigna), indivíduos com câncer ginecológico de estágio tardio, ou a partir de outras amostras do indivíduo. Níveis aumentados de Bcl-2 quando comparados com o padrão pode ser indicativo de câncer, tal como câncer ovariano de estágio precoce ou tardio.

[0047] A invenção também contempla usando-se os métodos, dispositivos, e kits descritos aqui em combinação com um ou mais marcadores adicionais (biomarcadores) para câncer. Portanto, a invenção contempla um método para a análise de uma amostra biológica quanto a presença de Bcl-2 e análise da mesma amostra, ou uma outra amostra biológica oriunda do mesmo indivíduo, para outros marcadores que são indicadores específicos de um câncer. Um ou mais marcadores adicionais podem ser detectados antes, durante e/ou após a detecção de Bcl-2 ser realizada. Exemplos de marcadores incluem CA125, LPA, e OVXI. Em uma concretização preferida, os marcadores são Bcl-2 e CA125. Os métodos, dispositivos, e kits descritos aqui podem ser modificados por inclusão de agentes para detectar os marcadores adicionais, ou ácidos nucléicos que codificam os marcadores.

[0048] Marcadores de câncer que podem ser usados em combinação com a invenção incluem, mas não são limitados a: alfafetoproteína (AFP), por exemplo, para cânceres pancreático, rim, ovariano, cervical, e testicular; antígeno embriônico carcinogênico (CEA), por exemplo, para cânceres de pulmão, pancreático, rim, mama, uterino, de fígado, gástrico, e de colorretal; antígeno de carboidrato 15-3 (CA15-3), por exemplo, para cânceres de pulmão, pancreático, de mama, ovariano, e de fígado; antígeno de carboidrato 19-9 (CA19-9), por exemplo, para cânceres de pulmão, ovariano, uterino, fígado, gástrico, de colorretal, e de duto biliar; antígeno de câncer 125 (CA125), por exemplo, para cânceres de pulmão, de pâncreas, de mama, ovari

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23/78 ano, cervical, uterino, de fígado, gástrico, e colorretal; antígeno específico de próstata livre e antígeno-alfa(1) específico de próstata (PSA), para câncer de próstata; antígeno específico de próstata livre (PSAF), para cânceres de próstata e de colorretal; complexo de antiquimotripsina de antígeno-alfa(1) específico de próstata (PSAC), para câncer de próstata; fosfatase de ácido prostático (PAP), para câncer de próstata; tiroglobulina humana (hTG), para câncer de tiróide ou tumor de Wilm's; gonadaotropina beta coriônica humana (hCGb), por exemplo, para cânceres de pulmão, pancreático, de rim, ovariano, uterino, testicular, de fígado, colorretal, de bexiga, e de cérebro; ferritina (Ferr), por exemplo, para câncer de câncer, câncer testicular, câncer da laringe, linfoma de Burkitt's, neuroblastoma, e leucemia; enolase específica de neurônio (NSE), para câncer de pulmão, câncer de tiróide, tumor de Wilm's e neuroblastoma; interleucina 2 (IL-2), para câncer do rim e mieloma múltiplo; interleucina 6 (IL-6), para câncer de rim, câncer de mama, câncer ovariano, e mieloma múltiplo; microglobulina de beta 2 (B2M), para câncer de rim, câncer ovariano, câncer de próstata, leucemia, mieloma múltiplo, e linfoma; e microglobulina de alfa 2 (A2M), para câncer de próstata. A seleção de amostra biológica (tal como sangue ou urina) em que os marcadores de câncer acima mencionados são diagnósticos e/ou prognósticos podem ser prontamente determinados por aqueles versados na técnica.

[0049] Como indicado acima, a presente invenção provê um método para a monitoração, diagnóstico ou para o prognóstico de câncer, tal como câncer ovariano, em um indivíduo por detecção de Bcl-2 em uma amostra biológica oriunda do indivíduo. Em uma concretização, o método compreende contato da amostra com um anticorpo específico para Bcl-2 que está diretamente ou indiretamente marcado com a substância detectável, e detecção da substância detectável.

[0050] Os métodos da invenção podem ser usados para a detecPetição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 31/114

24/78 ção de ou uma ultra- ou uma subabundância de Bcl-2 em relação a um estado de não distúrbio ou a presença de um Bcl-2 modificado (por exemplo, menos do que o comprimento total) que se correlaciona com um estado de distúrbio (por exemplo, câncer ovariano), ou uma progressão em relação a um estado de distúrbio. Os métodos descritos aqui podem ser usados para avaliar a probabilidade da presença de célula malignas ou pré-maligas. Tais métodos podem ser usados para detectar tumores, quantificar seu crescimento e auxiliar no diagnóstico e prognóstico de câncer ginecológico. Os métodos podem ser usados para detectar a presença de metástase de câncer, bem como confirmar a ausência ou remoção de todos tecido de tumor após a cirurgia, terapia de radiação e/ou quimioterapia de câncer. Eles podem ulteriormente ser usados para monitorar quimioterapia de câncer e reaparecimento de tumor.

[0051] Os métodos da invenção são particularmente úteis no diagnóstico de câncer ovariano de estágio precoce (por exemplo, quando o indivíduo é assintomático) e para o prognóstico de progressão e mortalidade de doença de câncer ovariano. Como ilustrado aqui, níveis aumentados de Bcl-2 detectados em uma amostra (por exemplo, urina, soro, plasma, sangue total, ascites) em comparação com um padrão (por exemplo, níveis para distúrbios normal ou benigna) são indicativos de estágio de doença avançado, tipo histológico seroso, remoção subótima, tumor residual grande e/ou risco aumentado de progressão e mortalidade de doença.

[0052] Os termos amostra, amostra biológica e similares referem-se a um tipo de material conhecido como ou suspeito de expressar ou conter Bcl-2, tal como urina. A amostra de teste pode ser usada diretamente como obtida a partir da fonte ou após um prétratamento para modificar o caráter da amostra. A amostra pode ser derivada de qualquer fonte biológica, tais como tecidos ou extratos,

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25/78 incluindo células (por exemplo, células de tumor) e fluidos fisiológicos, tais como, por exemplo, sangue total, plasma, soro, fluido peritoneal, ascites e similares. A amostra pode ser obtida a partir de animais, de preferência mamífero, mais preferivelmente seres humanos. A amostra pode ser pré-tratada por qualquer método e/ou pode ser preparada de qualquer meio conveniente que não interfere com o ensaio. A amostra pode ser tratada antes do uso, tais como preparação de plasma a partir de sangue, diluição de fluidos viscosos, aplicação de um ou mais inibidores de protease a amostras tais como urina (por exemplo, fluoreto de 4-(2 aminoetil)-benzeno sulfonila, EDTA, leupeptina, e/ou pepstatina) e similares. Tratamento com amostra podem envolver filtração, destilação, extração, concentração, inativação de interferência dos componentes, a adição de reagentes e similares.

[0053] A presença de bcl-2 pode ser detectada em uma variedade de amostras biológicas, incluindo tecidos ou seus extratos. De preferência, Bcl-2 é detectado em urina humana.

[0054] Em concretizações da invenção, o método descrito aqui é adaptado para o diagnóstico e monitoração de câncer ginecológico por quantificação de Bcl-2 em amostras biológicas oriundas a indivíduo. De preferência, a quantidade de Bcl-2 quantificada em uma amostra oriunda de um indivíduo sendo testada está em comparação com níveis quantificados para uma outra amostra ou uma amostra inicial oriunda do indivíduo, os níveis quantificados para uma amostra de controle. Níveis para amostras de controle oriundas de indivíduos saudáveis podem ser estabelecidos por estudos estatísticos prospectivos e/ou retrospectivos. Indivíduos saudáveis os quais não têm anormalidades ou doenças clinicamente evidentes podem ser selecionados para estudos estatísticos. Diagnósticos podem ser feitos por uma constatação de níveis estatisticamente diferentes de Bcl-2 em comparação com uma amostra de controle ou níveis quantificados precoces para o

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26/78 mesmo indivíduo.

[0055] O termo Bcl-2 refere-se à proteína 2 de linfoma de célula B humana (também conhecida como célula B CLL/linfoma 2), uma proteína mitocondrial externa integral que bloqueia a morte apoptótica de algumas células tais como linfócitos (Cleary M.L. e outros, Cell, 1986, 47(1):19-28; Tsujimoto Y. and Croce C.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83:5214-5218, que são incorporados aqui por referência em sua totalidade). O termo Bcl-2 inclui seqüências de ácidos nucléicos (por exemplo, N° de acesso de GenBank M14745; SEQ ID NO: 1) que codifica o produto de gene de Bcl-2 (polipeptídeo), bem como o polipeptídeo de Bcl-2 (por exemplo, N° de acesso de GenBank AAA35591; SEQ ID NO: 2). O termo inclui todos os homólogos, variantes alélicas de ocorrência natural, isoformas e precursores de Bcl-2 de ser humano N°s de acesso de GenBank M14745 e AAA35591. Em geral, variantes alélicas de ocorrência antural de Bcl-2 humana partilharam homologia de seqüência significativa (70-90%) às seqüências mostradas nos N°s de acesso de GenBank M14745 e AAA35591. Variantes alélicas podem conter substituições de aminoácidos conservadores da seqüência de Bcl-2 ou conterão uma substituição de um aminoácido de uma posição correspondente em um homólogo de Bcl-2. Duas variantes de transcrito, alfa e beta, produzidas por união alternativa, diferem em suas extremidades C-terminais. A variante alfa (no. de acesso de GenBank NP_000624 (SEQ ID NO:4); e N° de acesso de GenBank NM_000633 (SEQ ID NO:3)) representa o transcrito mais longo e codifica o isoforma mais longa (alfa), e beta sendo mais curto (no. de acesso de GenBank NM_000648 (SEQ ID NO:6); N° de acesso de GenBank NP_000657 (SEQ ID NO:5). A variante beta difere na região de codificação e 3' UTR em comparação com a variante alfa, bem como a extremidade C-terminal. Em uma concretização particular, os métodos, dispositivos, e kits da invenção são específicos para Bcl-2

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27/78 (por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, e/ou 6), mas molécula de não ácido nucléico ou polipeptídeos conhecidos na técnica como moléculas de tipo Bcl-2 (por exemplo, empregando agentes de ligação específicos para (por exemplo, imunoreativo com) Bcl-2, mas não reativos com moléculas de tipo de Bcl-2), tais como aquelas descritas em Ruben e outros, no pedido de patente U.S. 2002/0106731 A1, publicado em 8 de agosto de 2002, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[0056] Os termos indivíduo e paciente são usados intercambeavelmente aqui para referir-se a um animal de sangue quente, tal como um mamífero, que pode ser afligido com câncer. Em alguns câncers, o indivíduo é uma fêmea de mamífero humana ou não humana. Em outros cânceres, o indivíduo é um macho de mamífero humano ou de não humano.

[0057] Agentes que são capazes de detectar Bcl-2 nas amostras biológicas de indivíduos são aqueles que interagem ou ligam com o polipeptído de Bcl-2 ou a molécula de ácido nucléico que codifica Bcl-

2. Exemplos de tais agentes (também chamado aqui de agentes de ligação) incluem, mas não são limitados a, anticorpos de Bcl-2 ou seus fragmentos que ligam Bcl-2, padrões de ligação de Bcl-2, e moléculas de ácido nucléico que hibridizam para dar moléculas de ácido nucléico que codificam polipeptídeos de Bcl-2. De preferência, o agente de ligação é marcado com uma substância detectável (por exemplo, uma porção detectável). O agente de ligação pode ele próprio funcionar como um rótulo.

Anticorpos de Bcl-2 [0058] Anticorpos específicos para Bcl-2 que são usados nos métodos da invenção podem ser obtidos a partir de fontes científicos ou comerciais. Alternativamente, Bcl-2 recombinante ou Bcl-2 nativo isolado pode ser utilizado para preparar anticorpos, anticorpos monocloPetição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 35/114

28/78 nais ou policlonais e fragmentos imunologicamente ativos (por exemplo, um fragmento de Fab ou de (Fab)2), uma cadeia pesada de anticorpo, uma cadeia leve de anticorpo, anticorpos humanizados, uma moléculas de Fv de cadeia simples geneticamente engenheirada (Ladne e outros, patente U.S. N° 4.946.778), ou um anticorpo quimérico, por exemplo, um anticorpo que contém a especificidade de ligação de um anticorpo de camundongo, mas em que as porções restantes são de origem humana. Anticorpos incluindo anticorpos monoclonais ou policlonais, fragmentos e quimeras, podem ser preparados usando-se métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. De preferência, anticorpos usados nos métodos da invenção são reativos contra Bcl-2 se eles se ligam com um K_a de mais do que ou igual a 10⁷ M. Em um imunoensaio tipo sanduíche da invenção, anticorpos policlonais de camundongo e anticorpos policlonais de coelho são utilizados.

[0059] A fim de produzir anticorpos monoclonais, um mamífero hospedeiro é inoculado com um peptídeo ou proteína de Bcl-2 e então é reforçado. Baços são coletados a partir de mamíferos inoculados alguns dias depois do reforço final. Suspensão de células oriundas dos baços são fundidas com uma célula de tumor de acordo com o método geral descrito por Kohler and Milstein (Nature, 1975, 256:495-497). A fim de ser útil, um fragmento de peptídeo pode conter resíduos de aminoácidos suficientes para definir o epitopo da molécula de Bcl-2 a ser detectado.

[0060] Se o fragmento for demasiadamente curto para ser imunogênico, ele pode ser conjugado com uma molécula de veículo. Algumas moléculas de veículo adequadas incluem hemocianina keyhole limpet e albumina de soro bovino. Conjugação pode ser realizada por métodos conhecidos na técnica. Um tal método é combinar um resíduo de cisteína do fragmento com um resíduo de cisteína na molécula de veículo. Os fragmentos de peptídeo podem ser sintetizados por métoPetição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 36/114

29/78 dos conhecidos na técnica. Alguns métodos adequados são descritos por Stuart and Young in Solid Phase Peptide Synthesis, segunda edição, Pierce Chemical Company (1984).

[0061] Purificação dos anticorpos ou fragmentos podem ser realizadas por uma variedade de métodos conhecidos por aqueles versados incluindo, precipitação por sulfato de amônio ou sulfato de sódio seguido por diálise contra solução salina, cromatografia de troca de íons, cromatografia por afinidade ou por imunoafinidade bem como filtração de gel, eletroforese de zona, etc. (Goding in, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2^a ed., pp. 104-126, Orlando, Fla., Academic Press). É preferível usar anticorpos purificados ou fragmentos purificados dos anticorpos tendo pelo menos uma porção de uma região de ligação de Bcl-2, incluindo tal como fragmento de Fab, Fv, F(ab')2 (Harlow and Lane, 1988, Antibody Cold Spring Harbor) para a detecção de Bcl-2 em fluidos de pacientes com câncer ginecológico ou aqueles em risco, de preferência na urina ou sangue de pacientes com câncer ovariano.

[0062] Para o uso em detecção e/ou monitoração de câncer, os anticorpos purificados podem ser covalentemente ligados, ou diretamente ou via ligador, a um composto que serve como um grupo repórter para permitir detecção da presença de Bcl-2. Uma variedade de diferentes tipos de substâncias pode servir como o grupo repórter, incluindo mas não limitado a enzimas, corantes, isótipos de metal radioativos, e de não metais, compostos fluorogênicos, compostos fluorescentes, etc. Métodos para a preparação de conjugados de anticorpo dos anticorpos (ou seus fragmentos) da invenção úteis para a detecção, monitoração são descritos nas patentes U.S. N°s 4.671.958; 4.741.900 e 4.867.973.

[0063] Em um aspecto da invenção, epitopos preferidos podem ser identificados de uma seqüência de genes Bcl-2 conhecida e sua sePetição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 37/114

30/78 qüência de aminoácidos codificada e usados para gerar anticorpos de Bcl-2 com alta afinidade de ligação. Também, identificação de epitopos de ligação no Bcl-2 pode ser usada no projeto e construção de anticorpos preferidos. Por exemplo, um DNA que codifica um epitopo preferido no Bcl-2 pode sr recombinantemente expresso e usado para selecionar um anticorpo que se liga seletivamente àquele epitopo. Os anticorpos selecionados então são expostos à amostra sob condições suficientes para permitir ligação específica do anticorpo ao epitopo de ligação específico no Bcl-2 e a quantidade de complexo formada então detectada. Metodologias de anticorpo específicas são bem-conhecidas e descritas na literatura. Uma descrição mais detalhada de sua preparação pode ser encontrada, por exemplo, em Practical Immunology, Butt, W. R., ed., Marcel Dekker, New York, 1984.

[0064] A presente invenção também contempla a detecção de anticorpos de Bcl-2. Bcl-2 é um marcador específico de câncer ginecológico. Assim, detecção de anticorpos de Bcl-2 em fluidos biológicos de um indivíduo pode permitir o diagnóstico de câncer ginecológico. Ensaios de proteína de ligação [0065] Anticorpos especificamente reativos com Bcl-2 ou derivados, tais como conjugados de enzima ou derivados marcados, podem ser usados para detectar Bcl-2 em várias amostras biológicas, por exemplo, eles podem ser usadas em quaisquer imunoensaios conhecidos que contam com a interação de ligação entre um determinante antigênico de uma proteína e os anticorpos. Exemplos de tais ensaios são radioimunoensaios, imunoensaio de enzima (por exemplo, ELISA), imunofluorescência, imunoprecipitação, aglutinação por látex, hemaglutinação e testes histoquímicos.

[0066] Um anticorpo específico para Bcl-2 pode ser marcado com uma substância detectável e localizado em amostras biológicas com base na presença da substância detectável. Exemplos de substâncias

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31/78 detectáveis incluem, mas não são limitadas aos radioistótopos (por exemplo, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ¹²⁵I, ¹³¹I), rótulos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantanídeo) rótulos luminescentes tal como luminol; rótulos enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rábano picante, beta-galactosidase, fosfatase alcalina, acetilcolinesterase), grupos biotinila (que podem ser detectados por avidina marcada, por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectada por métodos óticos ou calorimétricos), epitopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, seqüências de par de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, marcadores de epitopo). Métodos indiretos podem também ser empregados em que a reação de anticorpo-antígeno primário é ampliada pela introdução de um anticorpo secundário, tendo especificidade para o anticorpo reativo contra Bcl-2. A título de exemplo, se o anticorpo tendo especificidade contra Bcl-2 é um anticorpo de IgG de coelho, o segundo anticorpo pode ser gamaglobulina de anticoelho de cabra marcado com uma substância detectável como descrito aqui.

[0067] Métodos para a conjugação ou marcação dos anticorpos discutidos acima podem ser prontamente realizados por aquele versado na técnica. (Vide, por exemplo, Imman, Methods In Enzymology, Vol. 34, Affinity Techniques, Enzyme Purification: Part B, Jakoby and Wichek (eds.), Academic Press, New York, p. 30, 1974; and Wilchek and Bayer, The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications, Anal. Biochem. 171:1-32, 1988, em relação a métodos para a conjugação ou marcação dos anticorpos com uma enzima ou par de ligação de ligante).

[0068] Fluorometria resolvida no tempo pode ser usada para detectar um sinal. Por exemplo, o método descrito em Christopoulos T.K.

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32/78 and Diamandis E.P., Anal. Chem., 1992:64:342-346 pode ser usado com um fluorômetro resolvido no tempo convencional.

[0069] Portanto, de acordo com uma concretização da invenção, um método é provido em que um anticorpo de Bcl-2 é marcado com uma enzima, um substrato para a enzima é adicionado em que o substrato é selecionado de modo que o substrato ou um produto de reação da enzima e substrato, forme complexos fluorescentes com um metal de lantanídeo. Um metal de lantanídeo é adicionado e Bcl-2 é quantificado na amostra por medição de fluorescência dos complexos fluorescentes. Os anticorpos específicos para Bcl-2 podem ser diretamente ou indiretamente marcados com uma enzima. Enzimas são selecionados com base na capacidade de um substrato da enzima, ou um produto de reação da enzima e do substrato, para complexar com metais de lantanídeo tais como európio e térbio. Exemplos de enzimas adequadas incluem fosfatase alcalina e beta-glactosidase. De preferência, a enzima é fosfatase alcalina. Os anticorpos de Bcl-2 podem também ser indiretamente marcados com uma enzima. Por exemplo, os anticorpos podem ser conjugados com um par de um par de ligação de ligante, e a enzima pode ser acoplada com outro par do par de ligação de ligante. Exemplos representativos incluem avidina-biotina, e proteína de ligação de riboflavina-riboflavina. De preferência os anticorpos são biotinilados, e a enzima é acoplada à estreptavidina.

[0070] Em uma concretização do método, anticorpo ligado a Bcl-2 em uma amostra é detectado por adição de um substrato para a enzima. O substrato é selecionado de modo que na presença de um metal de lantanídeo (por exemplo, európio, térbio, samário, e disprósio, de preferência európio e térbio), o substrato ou um produto de reação da enzima e do substrato, forma um complexo fluorescente com o metal de lantanídeo. Exemplos de enzimas e substratos para enzimas que provêem tais complexos fluorescentes são descritos na patente U.S.

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N° 5.3112.922 pro Diamandis. A título de exemplo, quando o anticorpo é diretamente ou indiretamente marcado com fosfatase alcalina, o substrato empregado no método pode ser fosfato de 4metilumbeliferila ou fosfato de 5-fluorpsalicila. A intensidade de fluorescência dos complexos é tipicamente medida usando-se um fluorômetro resolvido no tempo, por exemplo, um Imunoanalisador CyberFluor 615 (Nordion International, Kanata Ontario).

[0071] A amostra, anticorpo específico para Bcl-2, ou Bcl-2, pode ser imobilizado em um veículo. Exemplos de veículos adequados são agarose, celulose, dextrano, Sephadex, Sepharose, lipossomas, carboximetil celulose poliestireno, papel de filtro, resina de troca de íon, película plástica, tubo plástico, contas de vidro, copolímero de ácido poliamina-metil éter vinil-maléico, copolímero de aminoácido, copolímero de ácido etileno-maléico, nylon, seda etc. O veículo pode estar na forma de, por exemplo, um tupo, placa de teste, cavidade, contas, disco, esfera, etc. O anticorpo imobilizado pode ser preparado por reação do material com um veículo insolúvel usando-se métodos químicos ou físicos, por exemplo, acoplamento de brometo de cianogênio.

[0072] De acordo com uma concretização, a presente invenção provê um modo para a determinação de Bcl-2 em uma amostra apropriada tal como urina por medição de Bcl-2 por imunoensaio. Será evidente por aquele versado que uma variedade de métodos de imunoensaio pode ser usada para medir Bcl-2. Em geral, um método de imunoensaio de Bcl-2 pode ser competitivo ou não competitivo. Métodos competitivos tipicamente empregam um anticorpo imobilizado ou imobilizável em Bcl-2 (anti-Bcl-2) e uma forma marcada de Bcl-2. Bcl-2 de amostra e Bcl-2 marcado competem para a ligação a anti-Bcl-2. Depois da separação do Bcl-2 marcado resultante que se tornou ligado a anti-Bcl-2 (fração ligada) daquilo que permaneceu não ligado (fração não ligada), a quantidade do rótulo ou fração ligada ou não ligada é

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34/78 medida e pode estar correlacionada com a quantidade de Bcl-2 na amostra biológica de qualquer modo, por exemplo, por comparação com uma curva-padrão.

[0073] De preferência, um método não competitivo é usado para a determinação de Bcl-2, com o método mais comum sendo o método de sanduíche. Nesse ensaio, dois anticorpos de anti-Bcl-2 são empregados. Um dos anticorpos de anti-Bcl-2 está diretamente ou indiretamente marcado (também chamado do anticorpo de detecção) e o outro é imobilizado ou imobilizável (também chamado do anticorpo de captura). Os anticorpos de captura e detecção podem ser postos em contato simultaneamente ou seqüencialmente com a amostra biológica. Métodos seqüenciais podem ser realizados por incubação do anticorpo de captura com a amostra, e adição do anticorpo de detecção a um tempo predeterminado depois disso (algumas vezes chamado do método avançado); ou anticorpo de detecção pode ser incubado com a amostra primeiramente e então o anticorpo de captura adicionado (algumas vezes chamado do método reverso). Depois que a(s) incubação(ões) necessária(s) ocorrereu(am), para completar o ensaio, o anticorpo de captura é separado da mistura de teste líquida, e o rótulo é medido em pelo menos uma porção da fase de anticorpo de captura separada ou o restante da mistura de teste líquida. Em geral, é medida na fase de anticorpo de captura uma vez que compreende Bcl-2 ligado pelos anticorpos de captura e deteção (entre intercalados).

[0074] Em um ensaio imunométrico de dois sítios para Bcl-2, um ou ambos dos anticorpos de captura e de detecção são anticorpos policlonais. O rótulo usado no anticorpo de detecção pode ser selecionado de qualquer um daquelee conhecidos convencionalmente na técnica. Como com outras concretizações do ensaio de detecção de proteína, o rótulo pode ser uma enzima ou uma porção quimioluminescente, por exemplo, um isótopo radioativo, uma fluorofora, um ligante detec

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35/78 tável (por exemplo, detectável por uma ligação secundária por um par de ligação marcado para o ligante) e similares. De preferência, o anticorpo é marcado com uma enzima que é detectada por adição de um substrato que é selecionado de modo que um produto de reação da enzima e do subrato forme complexos fluorescentes. O anticorpo de captura é selecionado de modo que ele proveja um modo para ser separado do restante da mistura de teste. Correspondentemente, o anticorpo de captura pode ser introduzido ao ensaio em uma forma já imobilizada ou insolúvel, ou pode estar em uma forma imobilizável, isto é, uma forma que permita que a imobilização seja realizada subseqüente a introdução do anticorpo de captura para dentro do ensaio. Um anticorpo de captura imobilizado pode compreender um anticorpo covalentemente ou não covalentemente ligado a uma fase sólida tal como uma partícula magnética, uma partícula de látex, um placa de múltiplas cavidades de microtítulo, uma conta, uma cubeta, ou outros recipientes de reação. Um exemplo de um anticorpo de captura imobilizável é um anticorpo que foi quimicamente modificado com uma porção de ligante, por exemplo, um hapteno, biotina ou similares, e que pode ser subsrefere-semente imobilizado por contato com uma forma imobilizada de um par de ligação para o ligante, por exemplo, um anticorpo, avidina ou similares. Em uma concretização, o anticorpo de captura pode ser imobilizado usando-se um anticorpo específico de espécie para o anticorpo de captura que está ligado à fase sólida.

[0075] Um método de imunoensaio de tipo sanduíche particular da invenção emprega dois anticorpos reativos contra Bcl-2, um segundo anticorpo tendo especificidade contra um anticorpo reativo contra Bcl-2 marcado com um rótulo enzimático, e um substrato fluorogênico para a enzima. Em uma concretização, a enzima é fosfatase alcalina (ALP) e o substrato é fosfato de 5-fluorossalicila. ALP cliva fosfato para fora do substrato fluorogênico, fosfato de 5-fluorossalicila, para produzir ácido

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5-fluorossalicílico (FSA). Ácido 5-fluorossalicílico pode então formar um complexo ternário altamente fluorescente da forma FSA-Tb(3+)EDTA, que pode ser quantificado por medir a fluorescência de Tb⁺³ em um modo resolvido no tempo. Intensidade de fluorescência é tipicamente medida usando-se uma fluorometria resolvida no tempo como descrito aqui.

[0076] Pretende-se que os métodos e formatos de imunoensaio descritos acima sejam exemplares e não sejam limitantes uma vez que, em geral, será entendido que qualquer formato ou método de imunoensaio pode ser usado na presente invenção.

[0077] Os métodos, dispositivos e kits de detecção de proteína da invenção podem utilizar tecnologia de sensor de nanocondutor (Zhen e outros, Nature Biotechnology, 2005, 23(10):1294-1301; Lieber e outros, Anal. Chem., 2006, 78(13):4260-4269, que são incorporados aqui por referência) ou tecnologia de microcantiléver (Lee e outros, Biosens. Bioelectron, 2005, 20(10):2157-2162; Wee e outros, Biosens. Bioelectron., 2005, 20(10):1932-1938; Campbell and Mutharasan, Biosens. Bioelectron., 2005, 21(3):462-473; Campbell and Mutharasan, Biosens. Bioelectron., 2005, 21(4):597-607; Hwang e outros, Lab Chip, 2004, 4(6):547-552; Mukhopadhyay e outros, Nano. Lett., 2005, 5(12):2835-2388, que são incorporados aqui por referência) para detecção de Bcl-2 em amostras. Além disso, Huang e outros descrevem um imunoensaio de antígeno específico para próstata em um biossensor de ressonância de plasmônio superficial comercialmente disponível (Biosens. Bioelectron., 2005, 21(3):483-490, que é incorporado aqui por referência) que pode ser adaptado para detecção de Bcl-2. Imunoensaios miniaturizados de alta sensibilidade podem também ser utilizados para detecção de Bcl-2 (Cesaro-Tadic e outros, Lab Chip, 2004, 4(6):563-569; Zimmerman e outros, Biomed. Microdevices, 2005, 7(2):99-110, que são incorporados aqui por referência).

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Ácidos nucléicos [0078] Ácidos nucléicos incluindo ácidos nucléicos de ocorrência natural, oligonucleotídeos, oligonucleotídeos anti-sentido e oligonucleotídeos sintéticos que hibridizam para dar o ácido nucléico que codifica Bcl-2, são úteis como agentes para detectar a presença de Bcl-2 nas amostras biológicas de pacientes com câncer de próstata ou aqueles em risco de câncer ginecológico, de preferência na urina de pacientes com câncer ovariano ou aqueles em risco de câncer ovariano. A presente invenção contempla o uso de seqüências de ácidos nucléicos que corresponde à seqüência de codificação de Bcl-2 e à sua seqüência complementar, bem como seqüências complementares às seqüências de transcrito de Bcl-2 que ocorrem ulteriormente a montante ou a jusante da seqüência de codificação (por exemplo, seqüências contidas em, ou estendendo para dentro das regiões não traduzidas 5'e 3') para o uso como agentes para a detecção da expressão de Bcl-2 nas amostras biológicas de pacientes com câncer ginecológico, ou aqueles em risco de câncer ginecológico, de preferência na urina de pacientes com câncer ovariano ou aqueles em risco de câncer ovariano.

[0079] Os oligonucleotídeos preferidos para a detecção da presença de Bcl-2 em amostras biológicas são aqueles que são complementares a pelo menos parte da seqüência de cDNA que codifica Bcl-

2. Essas seqüências complementares são também conhecidas na técnica como seqüências anti-sentido. Esses oligonucleotídeos podem ser oligonucleotídeos ou oligodesoxirribonucleotídeos. Além disso, oligonucleotídeos podem ser oligômeros naturais constituídos dos nucleotídeos biologicamente significativos, isto é, A (adenina), dA (desoxiadenina), G (guanina), dG (desoxiguanina), C (citosina), dC (desoxicitosina), T (timina) e U (uracila) ou espécie de oligonucleotídeos modificado, usando como substituto, por exemplo, um grupo metila ou um átomo de enxofre para um oxigênio de fosfato na ligação de fosodiésPetição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 45/114

38/78 ter de internucleotídeo. Adiconalmente, esses próprios nucleotídeos, e/ou as porções de ribose podem ser modificados.

[0080] Os oligonucleotídeos podem ser sintetizados quimicamente, usando-se qualquer um dos métodos de síntese de oligonucleotídeo químicas conhecidas bem-descritas na técnica. Por exemplo, os oligonucleotídeos podem ser preparados por uso de qualquer um dos sintetizadores de ácido nucléico automatizados, comercialmente disponíveis. Alternativamente, os oligonucleotídeos podem ser criados por técnicas de DNA recombinante padrão, por exemplo, indução da transcrição do filamento de não codificação. A seqüência de DNA que codifica Bcl-2 pode ser invertida em um sistema de DNA recombinante, por exemplo, inserida em orientação inversa a jusante de um promotor adequado, de modo que o filamento de não codificação agora seja transcrito.

[0081] Embora qualquer comprimento de oligonucleotídeo possa ser utilizado para hibridizar para dar ácido nucléico que codifica Bcl-2, oligonucleotídeos tipicamente dentro da faixa de 8-100 nucleotídeos são preferidos. Oligonucleotídeos mais preferíveis para o uso na detecção de Bcl-2 em amostra de urina são aqueles dentro da faixa de 15-20 nucleotídeos.

[0082] O oligonucleotídeo selecionado para hibridizar para molécula de ácido nucléico de Bcl-2, se sintetizado quimicamente ou por tecnologia de DNA recombinante, é então isolado e purificado usando-se técnicas-padrão e então de preferência é marcado (por exemplo, ³⁵S ou ³²P) usando-se protocolos de marcação padrão.

[0083] A presente invenção também contempla o uso de pares de oligonucleotídeos nas reações de cadeia polimerase (PCR) para detectar a expressão de Bcl-2 em amostras biológicas. Os pares de oligonucleotídeos incluem um inciador de Bcl-2 avante e um iniciador de

Bcl-2 reverso.

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39/78 [0084] A presença de Bcl-2 em uma amostra oriunda de um paciente pode ser determinada por hibridização do ácido nucléico, tal como, mas não limitada a análise de Northern blot, dot blotting, análise de Southern blot, hibridização in situ de fluorescência (FISH), e PCR. Cromatografia, de preferência HPLC, e outros ensaios conhecidos podem também ser usados para determinar níveis de RNA mensageiro de Bcl-2 em uma amostra.

[0085] As moléculas de ácido nucléico que codificam Bcl-2 concebivelmente podem ser encontradas nos fluidos biológicos dentro da célula de câncer positiva a Bcl que está sendo espalhada ou liberada no fluido sob investigação.

[0086] Em um aspecto, a presente invenção contempla o uso de ácidos nucléicos como agentes para a detecção de Bcl-2 em amostras biológicas de pacientes, em que os ácidos nucléicos são marcados. Os agentes nucléicos podem ser marcados com um rótulo radioativo, um rótulo fluorescente, uma enzima, um marcador quimioluminescente, um marcador colorimétrico ou outros rótulos ou marcadores que são discutidos acima ou que são conhecidas na técnica.

[0087] Em um outro aspecto, a presente invenção contempla o uso de análise de Northen blot para detectar a presença de mRNA de Bcl2 em uma amostra de fluido de corpo. A primeira etapa da análise envolve a separação de uma amostra contendo ácido nucléico de Bcl-2 por eletroforese de gel. Os ácidos nucléicos dispersos são então transferidos para um filtro de nitrocelulose ou um outro filtro. Subsqüentemente, o oligonucleotídeo marcado é exposto ao filtro sob condições de hibridização adequadas, por exemplo, 50% de formamida, 5 x SSPE, 2 x solução de Denhardt's, 0,1% de SDS a 42° C., como descrito em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis e outros (1982, CSH Laboratory). Outros procedimentos úteis conhecidos na técnica incluem hibridização de solução, hibridização de RNA de slot e

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40/78 dot, e microensaios com base em sonda. Medição da radioatividade de fragmentos hibridizados, usando-se procedimentos-padrão conhecidos na técnica quantifica a quantidade de ácido nucléico de Bcl-2 presente no fluido biológico de um paicente.

[0088] Dot blotting envolve a aplicação das amostras contendo o ácido nucléico de interesse a uma membrana. O ácido nucléico pode ser desnaturado antes ou depois da aplicação à membrana. A membrana é incubada com uma sonda rotulada. Procedimentos de Dot blot são bem-conhecidos pelo técnico versado e são descritos mais totalmente nas patentes U.S. N°s 4.582.789 e 4.617.261, cujas descrições são incorporados aqui por referência.

[0089] Reação de cadeia polimerase (PCR) é um processo para a ampliação de uma ou mais seqüências de ácidos nucléicos específicas presentes em uma amostra de ácido nucléico usando-se iniciadores e agentes para a polimerização e então a detecção da seqüência ampliada. O produto de extensão de um iniciador quando hibridizado para dar outro torna-se o modelo para a produção da seqüência de ácidos nucléicos específicos desejados, e vice-versa, e o processo é repetido tão freqüentemente quanto é necessário para produzir a quantidade desejada da seqüência. O técnico versado para detectar a presença da seqüência desejada (patente U.S. N° 4.683.195) rotineiramente usa reação de cadeia de polimerase.

[0090] Um exemplo específico de PCR que é rotineiramente realizado pelo técnico versado para detectar seqüências desejadas é PCR de transcrito reverso (RT-PCR; Saiki e outros, Science, 1985, 230:1350; Scharf e outros, Science, 1986, 233:1076). RT-PCR envolve o isolamento do RNA total do fluido biológico, desnaturação do RNA na presença de iniciadores que reconhecem a seqüência de ácidos nucléicos desejada, usando-se os iniciadores para gerar uma cópia de cDNA do RNA pela transcrição reversa, ampliação do cDNA por PCR

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41/78 usando-se iniciadores específicos, e detecção do cDNA ampliado por eletroforese ou outros métodos conhecidos pelo técnico versado.

[0091] Em uma concretização preferida, os métodos de detecção de ácido nucléico de Bcl-2 em fluidos biológicos por pacientes com câncer ginecológico ou aqueles em risco do mesmo, de preferência urina de pacientes com câncer ovariano ou aqueles em risco do mesmo, incluem análise de Northern blot, dot blotting, análise de Southern blot, FISH, e PCR.

Dispositivos [0092] Os métodos da invenção podem ser realizados em um suporte sólido. Os suportes sólidos podem ser aqueles que são convencionais para a finalidade de análise de um análito em uma amostra biológica, e são tipicamente construído de materiais tal como celulose, polissacarídeo tais como Sephadex e similares, e podem ser parcialmente envolvidos por uma cobertura para a proteção e/ou manipulação do suporte sólido. O suporte sólido pode ser rígido, semi-rígido, flexível, elástico (tendo memória de forma), etc. dependendo da aplicação desejada. Bcl-2 pode ser detectado em uma amostra in vivo ou in vitro (ex vivo). Quando, de acordo com uma concretização, a quantidade de Bcl-2 em uma amostra deve ser determinada sem remover a amostra do corpo (isto é, ex vivo), o suporte seriam um que é inofensivo ao indivíduo e pode estar em qualquer forma conveniente para a inserção para dentro da parte apropriada do corpo. Por exemplo, o suporte pode ser uma sonda produzida de politetrafluoroetileno, poliestireno ou outro material plástico inofensivo rígido e tendo um tamanho e forma para permitir que ele seja introduzido para dentro de um indivíduo. A seleção de um suporte de inserto apropriado está dentro da competência daqueles versados na técnica, como são suas dimensões para a finalidade pretendida.

[0093] Uma etapa de contato no ensaio (método) da invenção poPetição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 49/114

42/78 de envolver o contato, combinação ou misturação da amostra biológica e do suporte sólido, tal como um recipiente, microrecipiente, tubo, microtubo, cavidade, placa de múltiplas camadas ou outro suporte sólido de reação. Em uma concretização da invenção, o suporte sólido a ser posto em contato com a amostra biológica (por exemplo, urina) tem uma membrana ou almofada absorvente para fluxo lateral do meio líquido a ser analisado, tais como aquelas disponíveis de Millipore Corp. (Bedford, MA), incluindo mas não limitados a membranas Hi-Flow Plus® e cartões de membrana, e materiais de almofada SureWick®. [0094] O dispositivo de diagnóstico útil na realização dos métodos da invenção pode ser construído de qualquer forma adaptado para o uso pretendido. Assim, em uma concretização, o dispositivo da invenção pode ser construído como uma vareta ou tira de teste reusável ou descartável para ser posta em contato com uma amostra biológica tal como urina ou sangue para o qual o nível de Bcl-2 deve ser determinado. Em uma outra concretização, o dispositivo pode ser construído usando-se técnicas de fabricação em microescala reconhecidas na técnica para produzir concretizações de tipo agulha capaz de ser implantada ou injetada para dentro de um sítio anatômico, tal como a cavidade peritoneal, para intumescimento de aplicações de diagnóstico. Em outras concretizações, os dispositivos pretendidos para uso repetido pode ser construído na forma de uma sonda alongada.

[0095] Em concretizações preferidas, os dispositivos da invenção compreendem um suporte sólido (tal como um tira ou vareta de mergulhamento), com uma superfície que funcione como uma matriz de fluxo lateral definindo uma trajetória de fluxo para uma amostra biológica tais como urina, sangue total, soro, plasma, fluido peritoneal ou ascites.

[0096] Ensaios imunocromatográficos, também conhecidos como tiras de teste de fluxo lateral ou simplismente testes de tira, para a dePetição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 50/114

43/78 tecção de vários análitos de interesse, foram conhecidos por algum tempo, e podem ser usados para a detecção de Bcl-2. Os benefícios de testes de fluxo lateral incluem um formato favorável ao usuário, resultados rápidos, estabilidade de longo prazo sobre uma ampla faixa de climas e custo relativamente baixo para fabricar. Essas características produzem testes de fluxo lateral ideal para aplicações que envolvem testagem em casa, ponto rápido de testagem cuidadosa, e testagem no campo quanto a vários análitos. O pricípio por trás do teste é evidente. Essencialmente, qualquer ligante que possa ser ligado a um suporte sólido visualmente detectável, tais como microesferas tingidas, pode ser testado quanto a, qualitivamente, e em muitos casos ainda semiquantitivamente. Por exemplo, uma imunotira de fluxo lateral de uma etapa para a detecção de antígeno específico de próstata total e livre no soro é descrita em Fernandez-Sanchez e outros (J. Immuno. Methods, 2005, 307(1-2):1-12, que é incorporado aqui por referência) e pode ser adaptado para a detecção de Bcl-2 em uma amostra biológica tal como sangue ou urina.

[0097] Alguns dos ensaios imunocromatográficos mais comuns atualmente no mercado são testes para gravidez (como um kit de teste vendido no balcão (OTC)), garganta Strep, e Clamídia. Muitos novos testes para antígenos bem-conhecidos foram recentemente desenvolvidos usando-se o método de ensaio imunocromatográfico. Por exemplo, o antígeno para a causa mais comum de pneumonia adquirida na comunidade era conhecida desde 1917, mas um ensaio simples foi desenvolvido apenas recentemente, e isso foi feito usando-se essa método de tira de teste simples (Murdoch, D.R. e outros J Clin Microbiol, 2001, 39:3495-3498). Vírus da imunodeficiência humana (HIV) foi detectado rapidamente em sangue combinado usando-se um ensaio similar (Soroka, S.D. e outros J Clin Virol, 2003, 27:90-96). Um cartão de membrana de nitrocelulose também foi usado para diagnosticar es

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44/78 quistossomíase por detecção do movimento e ligação de nanopartículas de carbono (van Dam, G.J. e outros J Clin Microbiol, 2004, 42:5458-5461).

[0098] As duas abordagens comuns para o ensaio imunocromatográfico são os esquemas de reação não competitiva (ou direto) ou competitiva (ou inibição competitiva) (TechNote N° 303, Rev. N° 001, 1999, Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN). O formato direto (sanduíche de anticorpo duplo) é tipicamente usado quando testagem quanto a análitos maiores com sítios antigênicos múltiplos tais como hormônio de luteinização (LH), gonadotropina coriônica humana (hCG), e HIV. Nesse caso, menos do que um excesso de análito de amostra é desejado, de modo que algumas das microesferas não serão capturadas na linha de captura, e continuará fluir na direção da segunda linha de anticorpo imobilizados, a zona de controle. Essa linha de controle usa anticorpos de antiimunoglobulina específicos de espécie, específicos para os anticorpos conjugados nas microesferas. Antígeno livre, se presente, é introduzido sobre o dispositivo por adição de amostra (urina, soro, etc.) sobre uma almofada de adição de amostra. Antígeno livre então se liga a complexos de anticorpo-microesfera. Anticorpo 1, específico para epitopo 1 do antígeno da amostra, é acoplado a microesferas de corante e é seco sobre o dispositivo. Quando a amostra é adicionada, complexo de microesfera-anticorpo é reiidratado e é transportado para uma zona de captura e linhas de controle por líquido. Anticorpo 2, específico para um segundo sítio antigênico (epitopo 2) do antígeno de amostra, é seco sobre uma membrana na linha de captura. Anticorpo 3, um anticorpo de antiimunoglobulina, específico de espécie que reagirá com o anticorpo 1, é seco sobre uma membrana na linha de controle. Se antígeno estiver presente na amostra (isto é, um teste positivo), ligará por seus dois sítios antigênicos, a tanto anticorpo 1 (conjugado com microesferas) e anticorpo 2 (seco sobre a membraPetição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 52/114

45/78 na na linha de captura). Microesferas revestidas com anticorpo 1 são ligadas pelo anticorpo 3 na linha de controle, se antígeno está presente ou não. Se antígeno não estiver presente na amostra (um teste negativo), microesferas passam na linha de captura sem ficar aprisionadas mas são capturadas pela linha de controle.

[0099] O esquema de reação competitiva é tipicamente não usado quando testagem quanto a células pequenas com determinantes antigênicos simples, que não podem estar ligadas a dois anticorpos simultaneamente. Como com ensaio de tipo sanduíche de anticorpo duplo, livre de antígeno, se presente for introduzido sobre o dispositivo por adição de amostra sobre uma almofada de amostra. Antígeno livre presente na amostra se liga a um complexo de anticorpo-microesfera. Anticorpo 1 é específico para antígeno de amostra e acoplam às microesferas pigmentadas. Um conjugado de molécula de antígenoveículo (tipicamente BSA) é seco sobre uma membrana na linha de captura. Anticorpo 2 (Ab2) é seco sobre a membrana na linha de controle e é uma antiimunoglobulina específica de espécie que capturará as partículas de reagente e confirmam que o teste está completo. Se antígeno estiver presente na amostra (um teste positivo), anticorpo nas microesferas (Ab1) já saturado com antígeno a partir da amostra e, portanto, conjugado de antígeno ligado na linha de captura não se liga a ele. Quaisquer microesferas não capturadas pela molécula de veículo de antígeno podem ser capturadas pelo Ab2 na linha de controle. Se antígeno estiver presente na amostra (um teste negativo), microesferas secas revestidas com anticorpo são deixadas que sejam capturadas por cojugado de antígeno ligado na linha de captura.

[00100] Normalmente, as membranas usadas para manter os anticorpos no lugar nesses dispositivos são produzidas de materiais hidrofóbicos primários, tal como nitrocelulose. Tanto as microesferas usadas como os suportes de fase sólida quanto os anticorpos de conjugaPetição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 53/114

46/78 do são hidrofóbicos, e sua interação com a membrana permite-os que sejam eficamente secos sobre a membrana.

[00101] Amostras e/ou agentes de ligação específicos de Bcl-2 podem ser dispostos no suporte sólidos, ou múltiplos suportes podem ser utilizados, para análise ou detecção multíplex. Disposição refere-se à ação de organização ou disposição de membros de uma biblioteca (por exemplo, um conjunto de amostras diferentes ou um conjunto de dispositivos que direcionam as mesmas moléculas-alvo ou moléculasalvo diferentes), ou outras coleção, em um conjunto lógico ou físico. Assim, um conjunto refere-se a uma disposição física ou lógica de, por exemplo, amostras biológicas. Um conjunto físico pode ser qualquer formato espacial ou formato fisicalmente de grade em que manifestações físicas de membros de biblioteca correspondentes são dispostos de um modo ordenado, levando ele próprio a triagem combinatória. Por exemplo, amostras correspondentes a membros combinados ou individuais de uma biblioteca de amostra podem ser dispostas em uma série de fileiras e colunas, por exemplo, em uma placa de múltiplas cavidades. Similarmente, agentes de ligação podem ser laminados ou de outra maneira depositados em placas (ou bandejas) microtituladas, por exemplo, 96 cavidades, 384 cavidades ou 1536 cavidades. Opcionalmente, agentes de ligação específicos de Bcl-2 podem ser imobilizados no suporte sólido.

[00102] Detecção de Bcl-2 e biomarcadores de câncer e outros ensaios que devem ser realizados nas amostras, podem ser realizados simultaneamente ou seqüencialmente com a detecção de outras moléculas-alvo, e podem ser realizados em uma forma automática, em um formato de alta capacidade de produção.

[00103] Os agentes de ligação específicos de Bcl-2 podem ser depositados mas livres (não imobilizados) na zona de conjugado, e ser imobilizados na zona de captura de um suporte sólido. Os agentes de

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47/78 ligação específicos de Bcl-2 podem ser imobilizados por adsorção não específica sobre o suporte ou por ligação covalente ao suporte, por exemplo. Técnicas para a imobilização de agentes de ligação nos suportes são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, nas patentes U.S. N°s 4.399.217, 4.381.291, 4.357.311, 4.343.312 e 4.260.678, que são incorporados aqui por referência. Tais técnicas podem ser usadas para imobilizar os agentes de ligação na invenção. Quando o suporte sólido é politetrafluoroetileno, é possível acoplar anticorpos de hormônio sobre o suporte por ativação do suporte usandose sódio e amônia para aminá-los e ligação covalente do anticorpo ao suporte ativado por meio de uma reação de carbodiimida reaction (yon Klitzing, Schultek, Strasburger, Fricke and Wood in Radioimmunoassay and Related Procedures in Medicine 1982, International Atomic Energy Agency, Vienna (1982), pp. 57-62.).

[00104] O dispositivo de diagnóstico da invenção pode utilizar tecnologia de tira de fluxo lateral (LFS), que foi aplicada a numerosos sistemas de ensaio de tira rápidos, tais como tiras de teste de gravidez precoce vendidas no balcão com base em anticorpos a gonadotropina coriônica humana (hCG). Como com muitos outros dispositivos de diagnóstico, o dispositivo utiliza um agente de ligação para ligar a moléculaalvo (Bcl-2). O dispositivo tem uma zona de aplicação para receber uma amostra biológica tal como sangue ou urina, um rótulo contendo zona de marcação que se liga a Bcl-2 na amostra, e uma zona de detecção onde rótulo de Bcl-2 é retido.

[00105] Agente de ligação retido na zona de detecção dá um sinal, e o sinal difere dependendo de se níveis de Bcl-2 na amostra biológica são menores do que, iguais a, ou maiores do que uma dada concentração de limiar. Por exemplo, no caso de Bcl-2 urinário para a detecção de câncer ovariano, a concentração de limiar pode estar entre 0 ng/ml e 2,0 ng/ml. Em uma outra concretização, no caso de Bcl-2 uri

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48/78 nário para a detecção de câncer ovariano, a concentração limiar é de 1,8 ng/ml. Uma amostra oriunda de um indivíduo tendo um nível de Bcl-2 igual a ou maior do que a dada concentração de Bcl-2 de referência pode ser chamada de um nível de limiar ou quantidade de limiar ou amostra de limiar. A zona de aplicação no dispositivo é adequada para receber a amostra biológica a ser analisada. É tipicamente formada a partir de material absorvente tal como papel de blotting. A zona de marcação contém agente de ligação que se liga a qualquer Bcl-2 na amostra. Em uma concretização, o agente de ligação é um anticorpo (por exemplo, anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, fragmento de anticorpo). Para facilidade de detecção, o agente de ligação está de preferência em associação com um rótulo que provê um sinal que é visível ao olho nu, por exemplo, é marcado com um marcador fluorescente ou uma marcador colorido tal como ouro coloidal conjugado, que é visível como uma cor rosa.

[00106] A zona de detecção retém Bcl-2 ao qual o agente de ligação se ligou. Isso tipicamente será alcançado usando-se um agente de ligação imobilizado tal como um anticorpo imobilizado. Onde o agente de ligação na zona de marcação e a zona de detecção são ambos anticorpos, eles tipicamente reconhecerão diferentes epitopos na molécula-alvo (proteína de Bcl-2). Isso permite a formação de um sanduíche compreendendo anticorpo-Bcl-2-anticorpo.

[00107] A zona de detecção está a jusante da zona de aplicação, com a zona de marcação tipicamente localizada entre as duas. Uma amostra assim migrará da zona de aplicação para dentro da zona de marcação, onde qualquer uma na amostra se liga ao rótulo. Complexos de agente de ligação de Bcl-2 continuam a migrar para dentro da zona de detecção juntamente com excesso de agente de ligação. Quando o complexo de agente de ligação de Bcl-2 encontra o reagente de captura, o complexo é retido enquanto a amostra e excesso

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49/78 de agente de ligação continuam a migrar. Como níveis de Bcl-2 na amostra aumentam, a quantidade de agente de ligação (na forma de complexos de agente de ligação de Bcl-2) retida na zona de detecção aumenta proporcionalmente.

[00108] Em concretizações preferidas, o dispositivo da invenção tem a capacidade de distinguir entre amostras de acordo com a concentração limiar. Isso pode ser alcançado de vários modos.

[00109] Um tipo de dispositivo inclui uma zona de referência que inclui um sinal de intensidade fixa contra a qual a quantidade de agente de ligação retida na zona de detecção pode ser comparada quando o sinal da zona de detecção é igual ao sinal na zona de referência, a amostra é uma amostra de limiar; quando o sinal da zona de detecção é menos intenso do que a zona de referência, a amostra contém menos Bcl-2 do que uma amostra de limiar; quando o sinal na zona de detecção é mais intenso do que a zona de referência, a amostra contém mais Bcl-2 do que uma amostra de limiar.

[00110] Uma zona de referência adequada pode ser preparada e calibrada sem dificuldade. Por esse tipo de dispositivo, o agente de ligação em geral estará presente em excesso a Bcl-2 na amostra, e a zona de referência pode ser a montante ou, de preferência, a jusante da zona de detecção. O sinal na zona de referência será do mesmo tipo que o sinal na zona de detecção, isto é, elas tipicamente serão visíveis ao olho nu, por exemplo, elas usam o mesmo marcador. Uma zona de referência preferida em um dispositivo desse tipo compreende proteína imobilizada (por exemplo, albumina de soro bovino) que é marcada com ouro coloidal.

[00111] Em um outro dispositivo da invenção, a zona de referência está a jusante da zona de detecção e inclui um reagente que captura agente de ligação (por exemplo, anticorpo de agente de antiligação imobilizado). Agente de ligação que flui através do dispositivo não está

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50/78 presente em excesso, mas está a uma concentração tal que 50% dele está ligado por uma amostra tendo Bcl-2 na concentração limiar. Em uma amostra de limiar, portanto, 50% do agente de ligação serão retidos na zona de detecção e 50% na zona de referência. Se o nível de Bcl-2 na amostra for maior do que em uma amostra de limiar, menos do que 50% do agente de ligação alcançarão a zona de referência e a zona de detecção dará um sinal mais intenso do que a zona de referência; de modo inverso, se o nível de Bcl-2 na amostra for menor do que em uma amostra de limiar, menos do que 50% do agente de ligação reterão na zona de detecção e a zona de referência dará um sinal mais intenso do que a zona de detecção.

[00112] Em um outro dispositivo da invenção que opera de acordo com princípios similares, a zona de referência está a jusante da zona de detecção e inclui uma quantidade limitante de um reagente de captura agente de ligação (por exemplo, um anticorpo de agente de antiligação imobilizado). O reagente está presente a um nível tal que ele retém a mesma quantidade de rótulo que se ligaria à zona de detecção para uma amostra de limiar, com rótulo em excesso continuando a migrar além da zona de referência.

[00113] Nesses três tipos de dispositivo, portanto, uma comparação entre a zona de detecção e a zona de referência é usada para comparar a amostra com a concentração limiar. A razão de ligação de detecção: referência pode de preferência ser determinada pelo olho. Justaposição próxima da detecção e zonas de referência é preferida a fim de facilitar comparação visual das intensidades de sinal nas duas zonas.

[00114] Em um quarto tipo de dispositivo, nenhuma zona de referência é necessária, mas a zona de detecção é configurada tal que ela dê uma resposta essencial e intermitentemente, por exemplo, nenhum sinal é dado abaixo da concentração limiar mas, a ou acima do limiar,

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51/78 sinal é dado.

[00115] Em um quinto tipo de dispositivo, nenhuma zona de referência é necessária, mas uma referência externa é usada, a qual corresponde à concentração limiar. Essa pode tomar várias formas, por exemplo, um cartão impresso contra o qual o sinal na zona de detecção pode ser comparado, ou uma leitora de máqina que compara um valor absoluto medido na zona de detecção (por exemplo, um sinal calorimétrico) contra um valor de referência armazenado na máquina.

[00116] Em algumas concretizações da invenção, o dispositivo inclui uma zona de controle a jusante da zona de detecção. Esse em geral será usado para capturar agente de ligação em excesso que passa através das zonas de detecção e/ou de referência (por exemplo, usando-se atividade de agente de antiligação imobilizado). Quando o agente de ligação é retido na zona de controle, isso confirma que mobilização do agente de ligação e migração através do dispositivo têm ambos ocorridos. Será apreciado que essa função pode ser alcançada pela zona de referência.

[00117] Em uma concretização preferida, as zonas de detecção, de referência e de controle são de preferência formadas em um suporte de nitrocelulose.

[00118] Migração a partir da zona de aplicação à zona de detecção em geral será auxiliada por uma mecha a jusante da zona de detecção para auxiliar movimento capilar. Essa mecha é tipicamente formada a partir de material absorvente tal como papel de cromatografia ou blotting.

[00119] O dispositivo da invenção pode ser produzido de modo simples e econômico, conveniente na forma de uma vareta de mergulhamento. Além do mais, ele pode ser usado muito facilmente, por exemplo, pelo usuário doméstico. A invenção provê assim um dispositivo que pode ser usado em casa como uma triagem quanto a câncer,

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52/78 tal como câncer ovariano.

Kits para Diagnóstico ou Monitoramento do Câncer Ginecológico [00120] Em um aspecto, a presente invenção inclui kits compreendendo os elementos exigidos para o diagnóstico ou monitoração de câncer. De preferência, os kits compreendem um recipiente para a coleta de fluido biológico a partir de um paciente e um agente para a detecção da presença de Bcl-2 ou sua codificação de ácido nucléico no fluido. Os componentes dos kits podem ser embalados ou em meio aquoso ou em forma liofilizada.

[00121] Os métodos da invenção podem ser realizados usando-se um kit de diagnóstico para Bcl-2 de detecção qualitativa ou quantitativa em uma amostra tal como sangue ou urina. A título de exemplo, o kit pode conter agentes de ligação (por exemplo, anticorpos) específicos para Bcl-2, anticorpos contra os anticorpos marcados com uma enzima; e um substrato para a enzima. O kit pode também conter um suporte sólido tal como placas de múltiplas cavidades de microtítulo, padrões, diluente de ensaio, tampão de lavagem, coberturas de placa adesiva, e/ou instruções para a realização de um método da invenção usando-se o kit. Em uma concretização, o kit inclui um ou mais inibidores de protease (por exemplo, coquetel de inibidor de protease) a serem aplicados à amostra biológica a ser analisada (tal como urina ou sangue).

[00122] Kits para o diagnóstico ou monitoração de câncer ginecológico contendo um ou mais agentes que detectam a proteína de Bcl-2, tais como mas não limitados a anticorpos de Bcl-2, seus fragmentos ou padrões de ligação de Bcl-2, podem ser preparados. O(s) agente(s) pode(m) ser embalado(s) com um recipiente para a coleta do fluido biológico a partir de um paciente. Quando os anticorpos ou padrão ligação são usados nos kits na forma de conjugados em que um rótulo é ligado, tal como íon de metal radioativo ou uma porção, os compo

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53/78 nentes de tais conjugados podem ser fornecidos ou em forma totalmente conjugada, na forma de intermediários ou como porções separadas a serem conjugadas pelo usuário no kit.

[00123] Kits contendo um ou mais agentes que detectam ácido nucléico de Bcl-2, tais como mas não limitados ao ácido nucléico de Bcl2 de comprimento total, oligonucleotídeos de Bcl-2 e pares de iniciadores de Bcl-2 podem também ser preparados. O(s) agente(s) pode(m) ser embalado(s) com um recipiente para coleta de amostras biológicas a partir de um paciente. O ácido nucléico pode estar na forma marcada ou ser a forma marcada.

[00124] Outos componentes do kit podem incluir mas não são limitados a, meio para a coleta de amostras biológicas, meio para a marcação do agente de detecção (agente de ligação), membranas para a imobilização da proteína de Bcl-2 ou ácido nucléico de Bcl-2 na amostra biológica, meio para a aplicação da amostra biológica a uma membrana, meio para a ligação do agente a Bcl-2 na amostra biológica de um indivíduo, um segundo anticorpo, um meio para o isolamento de RNA total de um fluido biológico de um indivíduo, meio para a realização de eletroforese de gel, meio para a geração de cDNA a partir do RNA total isolado, meio para a realização de ensaios de hibridização e meio para a realização de PCR, etc.

[00125] Como usado aqui, o termo ELISA inclui um ensaio imunossorvente ligado a enzima que emprega um anticorpo ou um antígeno ligado a uma fase sólida e um conjugado de enzima-antígeno ou enzima-anticorpo para detectar e quantificar a quantidade de um antígeno (por exemplo, Bcl-2) ou anticorpo presente em uma amostra. Uma descrição da técnica ELISA é encontrada no capítulo 22 das 4^a ed. de Basic and Clinical Immunology by D.P. Sites e outros, 1982, publicado por Lange Medical Publications of Los Altos, Calif. e nas patentes U.S. N°s 3.654.090; 3.850.752; e 4.016.043, cujas descrições

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54/78 são aqui incorporadas por referência. ELISA é um ensaio que pode ser usado para quantificar a quantidade de antígeno, proteínas, ou outras moléculas de interesse em uma amostra. Em particular, ELISA pode ser realizado por ligação em um suporte sólido (por exemplo, cloreto de polivinila) de um anticorpo específico para um anticorpo ou proteína de interesse. Extrato de célula ou outra amostra de interesse tal como urina pode ser adicionado para a formação de um complexo de anticorpo-antígeno, e a amostra não ligada extra é removida por lavagem. Um anticorpo ligado a enzima, específico para um diferente sítio no antígeno é adicionado. O suporte é lavado para remover o segundo anticorpo ligado a enzima não ligada. O anticorpo ligado a enzima pode incluir, mas não é limitado a, fosfatase alcalina. A enzima no segundo anticorpo pode converter um substrato incolor adicionado em um produto colorido ou pode converter um substrato não fluorescente em um produto fluorescente. O método com base em ELISA provido aqui pode ser conduzido em uma câmara simples ou em um conjunto de câmaras e pode ser adaptado para processos automáticos.

[00126] Nessas concretizações exemplares, os anticorpos podem ser marcados com pares de corantes FRET, proteína de transferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET), combinações de corantes seqüestrantes de corante fluorescente, fragmentos de proteína de ensaios de complementação de beta-gal. Os anticorpos podem participar em FRET, BRET, tratamento por seqüestro de fluorescência ou complementação beta-gal para gerar sinais quimioluminescente aumentado (ECL), calorimétrico ou fluorescência, por exemplo. [00127] Esses métodos são rotineiramente empregados na detecção de respostas de anticorpo específicas de antígeno, e são bemdescritos em livros de texto de imunologia geral tais como Immunology by Ivan Roitt, Jonathan Brostoff and David Male (London: Mosby, c1998. 5th ed. e Immunobiology: Immune System in Health and Dis

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55/78 ease/Charles A. Janeway e Paul Travers. Oxford: Blackwell Sci. Pub., 1994), cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.

Definições [00128] Como usado aqui, os termos câncer e canceroso referem-se a ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento de célula desregulado, isto é, distúrbios proliferativos. Exemplos de tais distúrbios proliferativos incluem cânceres tais como carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia, bem como outros cânceres descritos aqui. Mais particularmente, exemplos de tais cânceres incluem câncer de mama, câncer de próstata, câncer de cólon, câncer de célula escamosa, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer cervical, câncer ovariano, câncer peritoneal, câncer de fígado, por exemplo, carcinoma hepático, câncer de bexiga, câncer de colorretal, carcinoma endometrial, câncer de rim e câncer de tiróide.

[00129] Outros exemplos não limitantes de cânceres são carcinoma de célula basal, câncer do trato biliar, câncer ósseo, câncer cerebral e de CNS; coriocarcinoma; câncer de tecido conectivo; câncer esofageano; câncer de olho; câncer da cabeça e do pescoço; câncer gástrico; neoplasma epitelial; câncer de laringe; linfoma incluindo linfoma de Hodgkin e de não-Hodgkin; melanoma; mieloma; neuroblastoma; câncer de cavidade oral (por exemplo, lábio, língua, boca e faringe); câncer pancreático, retinoblastoma; rabdomiossarcoma; câncer retal; câncer do sistema respiratório; sarcoma; câncer de pele; câncer de estômago; câncer testicular; câncer uterino; câncer do sistema urinário, bem como outros carcinomas e sarcomas. Exemplos de tipos de câncer são listados na tabela 1.

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Tabela 1 Exemplos de tipos de câncer

Leucemia linfoblástica aguda bo adulto Leucemia linfoblástica aguda na infância Leucemia mielóide aguda no adulto Leucemia mielóide aguda na infância Carcinoma Adrenocortical Carcinoma Adrenocortical na infância Cânceres relacionados com AIDS Linfoma relacionado com AIDS Câncer anal Astrocitoma Cerebelar na infância, Astrocitoma Carcinoma cerebral na infância de Célula Basal Câncer de duto biliar extraepático Câncer de bexiga Câncer de bexiga na infância Câncer ósseo, Osteossarcoma/ Histiocitoma fibroso maligno Glioma de tronco cerebral na infância Tumor cerebral no adulto Tumor cerebral, Glioma de troncocerebral na infância

Leucemia de célula pilosa Câncer de cabeça e pescoço Câncer hepatocelular (fígado)no adulto (Primário) Câncer hepatocelular (fígado) na infância (Primário) Linfoma de Hodgkin no adulto Linfoma de Hodgkin na infância Linfoma de Hodgkin durante a gravidez Câncer de hipofaríngeo Glioma hipotalâmico e Trajetória visual na infância Melanoma Intraocular Carcinoma de célula das ilhotas (Pâncreas endócrinos) Sarcoma de Kaposi Câncer de Rim (Célula Renal) Câncer de Rim na infância Câncer de laringe Câncer de laringe na infância Leucemia, Aguda Linfoblásticano adulto Leucemia, Aguda Linfoblástica na infância Leucemia Aguda Mielóideno adulto Leucemia, Aguda Mielóide na infância

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Tumor cerebral, Astrocitoma Cerebelar na infância Tumor cerebral, Astrocitoma Cerebral/Glioma maligno na infância Tumor cerebral, Ependimoma na infância Tumor cerebral, Meduloblastoma na infância Tumor cerebral, Suprassensorial Tumores neuroectodérmicos primitivos na infância Tumor cerebral, Trajetória visual e Glioma hipotalâmico na infância Tumor cerebral na infância Câncer de mama Câncer de mama na infância Câncer de mama masculino Adenomas bronquiais/Carcinóides, na infância Linfoma de Burkitt Tumor carcinóide na infância Tumor carcinóide, gastrointestinal Carcinoma Primário Desconhecido Linfoma do sistema nervoso central primário Astrocitoma cerebelar na infância Astrocitoma cerebral/Glioma maligno na infância Câncer cervical

Leucemia, Crônica Linfocítica Leucemia, Crônica Mielógena Leucemia, Célula pilosa Câncer de lábio e da cavidade oral Câncer de fígadono adulto (Primário) Câncer de fígado na infância (Primário) Câncer de pulmão, Célula não pequena Câncer de pulmão, Célula pequena Linfoma relacionado com AIDS Linfoma de Burkitt Linfoma de célula T cutâneo cutâneo, vide Micoses fungóides e síndrome de Sézary Linfoma de Hodgkinno no adulto Linfoma Hodgkin na infância Linfoma Hodgkin durante a gravidez Linfoma Não-Hodgkinno no adulto Linfoma Não-Hodgkin na infância Linfoma Não-Hodgkin Durante a gravidez Linfoma do Sistema nervoso central primário Macroglobulinemia, Waldenstrom

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Cânceres de Infância

Leucemia linfocítica crônica Leucemia mielógena crônica Distúrbios mieloproliferativos crônicos

Câncer de cólon

Câncer de colorretal na infância Linfoma de célula T cutânea, vide Fungóides de micose e Síndrome de Sézary

Câncer Endometrial Ependimoma na infância

Câncer esofageano

Câncer esofageano na infância Família de Ewing de Tumores Tumor de célula germinativa extracraniano na infância

Tumor de célula germinativa extragonadal

Câncer de duto biliar extranepático

Câncer de olho, Melanoma intraocular

Câncer de olho, Retinoblastoma

Câncer da vesícula biliar

Câncer gástrico (estômago) Câncer gástrico (estômago) na infância

Tumor carcinóide gastrointestinal Tumor de célula germinativa ex

Histiocitoma fibroso maligno de Osso/Osteosarcoma Meduloblastoma na infância Melanoma

Melanoma Intraocular (Olho) Carcinoma de célula de Merkel Mesotelioma Maligno de adulto Mesotelioma na infância Câncer de pescoço escamoso metastático com primário oculto Síndrome de neoplasia endócrina múltipla na infância Mieloma múltiplo/Neoplasma de célula de plasma Micose fungóides

Síndromes Mielodisplástica Doencás Mielodisplástica/Mieloproliferativas

Leucemia mielógena, Crônica Leucemia mielóideno adulto Aguda

Leucemia mielóide na infância Aguda

Mieloma, múltiplo Distúrbios mieloproliferativos, Crônicos

Câncer da cavidade nasal e do sino paranasal

Câncer nasofaríngeo Câncer nasofaríngeo na infância

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59/78 tracraniano, na infância

Tumor de célula germinativa extragonadal

Tumor de célula germinativa Ovariano

Tumor trofoblástico gestacional

Glioma no Adulto

Glioma de Tronco cerebral na infância

Glioma, Astrocitoma cerebral na infância

Glioma, Trajetória visual e hipotalâmica na infância

Câncer de pele (Melanoma) Carcinoma de pele, célula de Merkel

Câncer de pulmão de célula pequena

Câncer de intestino delgado Sarcoma de tecido mole no adulto Sarcoma de tecido mole na infância

Carcinoma de célula escamosa, vide Câncer de pele (não Melanoma)

Câncer de pescoço escamoso com metatástico primário oculto Câncer de estômago (gástrico)

Câncer de estômago (gástrico) na

Neuroblastoma

Linfoma de não Hodgkinno adulto Linfoma de não Hodgkin na infância

Linfoma de não Hodgkin Durante a gravidez

Célula não pequena Câncer de pulmão

Câncer oral na infância

Câncer da cavidade oral, lábio e

Câncer oreofaríngeo

Osteossarcoma/Fibroso maligno Histiocitoma de osso

Câncer ovariano na infância

Câncer epitelial ovariano

Tumor de célula germinativa Ovariana

Tumor potencialmente de baixa malignidade ovariano

Câncer pancreático

Câncer pancreático na infância Câncer pancreático, Célula das ilhotas

Câncer do sino Paranasal e da cavidade Nasal

Câncer de paratiróide

Câncer de pênis

Feocromocitoma

Tumores neuroectodérmicos primitivos

Petição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 67/114

60/78 infância

Tumores neuroectodérmicos primitivos, supratentoriais na infância

Linfoma de célula T cutâneas, vide Fungóides de micose e síndrome de Sézary

Câncer testicular

Timoma na infância

Carcinoma tímico e Timoma

Câncer de tiróide

Câncer de tiróide na infância

Câncer celular transitório da Pelve Renal e ureter

Tumor trofoblástico gestational Carcinoma de sítio primário desconhecido no adulto

Câncer de sítio primário desconhecido na infância

Cânceres incomuns na infância

Câncer celular transitório de

Ureter e pelve renal

Câncer uretral

Câncer uterino endometrial

Sarcoma uterino

Câncer vaginal

Trajetória visual e Glioma hipotalâmico na infância

Câncer vulvar

Macroglobulinemia de WaldensSupratentoriais e Pineoblastoma na infância

Tumor Pituitário

Neoplasma de célula de plasma/Mieloma múltiplo

Blastoma Pleuropulmonar Gravidez e Câncer de mama Gravidez e Linfoma de Hodgkin Gravidez e Linfoma de não Hodgkin

Linfoma do sistema nervoso central

Primário

Câncer de próstata

Câncer Retal

Câncer de célula renal (rim) Câncer de célula renal (rim) na infância

Câncer celular transitório, Renal Pelvis e Ureter,

Retinoblastoma Rabdomiossarcoma na infância Câncer de glândula salivar

Câncer de glândula salivar na infância

Sarcoma, família de Ewing de Tumores

Sarcoma de Kaposi

Sarcoma de tecido moleno adulto Sarcoma de tecido mole na infânPetição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 68/114

61/78

trom Tumor de Wilms

cia Sarcoma de Uterino Síndrome de Sezary Câncer de pele (não Melanoma) Câncer de pele na infância

[00130] Como usado aqui, o termo tumor refere-se a todo o crescimento e proliferação de célula neoplásica, se maligno ou benigno, e todas as células cancerosas e pré-cancerosas e tecidos. Por exemplo, um câncer particular pode ser caracterizado por um tumor de massa sólida. A massa de tumor sólida, se presente, pode ser uma massa de tumor primária. Uma massa de tumor primária refere-se a um crescimento de células de câncer em um tecido resultante da transformação de uma célula normal daquele tecido. Na maioria dos casos, a massa de tumor primária é identificada pela presença de um cisto, que pode ser encontrado através de métodos visuais ou palpação ou por irregularidade na forma, na textura ou peso do tecido. No entanto, alguns tumores primários não são palpáveis e podem ser detectados apenas através das técnicas de imagem médica tais como os raios X (por exemplo, mamografia), utrassom, CT, e MRI, ou por aspirações de agulha. O uso dessas últimas técnicas é mais comum na detecção precoce. Análise molecular e fenotípica de células de câncer dentro de um tecido usualmente confirma se o câncer é endógeno ao tecido ou se a lesão é devido à metástase oriunda de um outro sítio.

[00131] Uma amostra (amostra biológica) pode ser qualquer composição de material de interesse de um indivíduo humano ou não humano, em qualquer estado físico (por exemplo, sólido, líquido, semisólido, vapor) e de qualquer complexidade. A amostra pode ser qualquer composição razoavelmente suspeita de conter Bcl-2 que pode ser analisada pelos métodos, dispositivos e kits da invenção. De preferência, a amostra é um fluido (fluido biológico). Amostras podem incluir

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62/78 amostras humanas ou de animais. A amostra pode ser contida dentro do tubo de teste, recipiente de cultura, placa de múltiplas cavidades, ou qualquer outro recipiente ou substrato de suporte. A amostra pode ser, por exemplo, uma cultura de célula, tecido humano ou de animal. Homogeneizados de fluido de tecidos celulares são fluidos biológicos que podem conter Bcl-2 para a detecção da invenção.

[00132] A complexidade de uma amostra refere-se ao número relativo de diferentes espécies moleculares que estão presentes na amostra.

[00133] Os termos fluido de corpo e fluido corpóreo, como usado aqui, referem-se a uma composição obtida a partir de um indivíduo humano ou de animal. Fluidos corpóreos incluem, mas não são limitados a, urina, sangue total, plasma de sangue, soro, lágrimas, sêmen, saliva, escarro, respiração exalada, secreções nasais, exudatos faríngeos, lavagem broncoalveolar, aspirações de traquéia, fluido intersticial, fluido de linfa, fluido de meninge, fluido amnióitico, fluido glandular, fezes, transpiração, muco, secreção vaginal ou uretral, fluido cerebroespinhal e exudato transdérmico. Fluido corpóreo também inclui frações experimentalmente separadas de todas as soluções e misturas precedentes contendo material sólido homogeneizado, tais como fezes, tecidos e amostras de biopsia.

[00134] O termo ex vivo, como usado aqui, refere-se a um ambiente externo de um indivíduo. Correspondentemente, uma amostra de fluido corpóreo coletada a partir de um indivíduo é uma amostra ex vivo do fluido corpóreo como contemplado pela presente invenção. Modalidades na residência do método e dispositivo da invenção obtêm amostras in vivo.

[00135] Como usado aqui, o termo conjugado refere-se a um composto compreendendo duas ou mais moléculas ligadas entre si, opcionalmente através de um grupo de ligação, para formar uma estruPetição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 70/114

63/78 tura única. A ligação pode ser produzida por uma ligação direta (por exemplo, uma ligação química) entre as moléculas ou por uso de um grupo de ligação.

[00136] Como usado aqui, os termos suporte, substrato e superfície sólidos referem-se a uma fase sólida que é um material insolúvel em água poroso ou não poroso que pode ter qualquer de numerosas formas, tal como tira, vareta, partícula, contas ou placas de múltiplas cavidades. Em algumas concretizações, o suporte tem uma matriz de suporte organizacional que de preferência funciona como uma matriz de organização, tal como uma bandeja de microtítulo. Materiais de suporte sólidos incluem, mas não são limitados a, celulose, polissacarídeo tal como Sephadex, vidro, poliacriloilmorfolídeo, sílica, vidro de poro controlado (CPG), poliestireno, poliestireno/látex, polietileno tal como polietileno de peso molecular ultra-alto (UPE), poliamida, fluoreto de polivinilidina (PVDF), politetrafluoroetileno (PTFE; TEFLON), teflon modificado por carboxila, nylon, nitrocelulose e metais e ligas tais como ouro, platina e paládio. O suporte sólido pode ser biológico, não biológio, orgânico, inorgânico ou uma combinação de qualquer uma dessas, existindo como partículas, filamentos, precipitados, géis, folhas, almofadas, cartões, tiras, varas, tiras de teste, cano, esferas, recipientes, capilares, almofadas, fatias, películas, placas, lâminas, etc., dependendo da aplicação particular. De preferência, o suporte sólido é de forma planar, para facilitar o contato com uma amostra biológica tal como urina, sangue total, plasma, soro, fluido peritoneal ou fluido de ascites. Outros materiais de suporte sólidos adequados serão prontamente evidentes àqueles versados na técnica. O suporte sólido pode ser uma membrana, com ou sem um apoio (por exemplo, apoio de cartão poliéster ou poliestireno), tal como aqueles disponíveis de Millipore Corp. (Bedford, MA), por exemplo, Hi-Flow® mais cartões de membrana. A superfície do suporte sólido pode conter grupos reativos, tais

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64/78 como carboxila, amino, hidroxila, tiol ou similares para a ligação de ácidos nucléicos, proteínas etc. Superfícies no suporte sólido algumas vezes, embora nem sempre, serão constituídas do mesmo material que o suporte. Assim, a superfície pode ser constituída de qualquer uma de uma variedade de materiais, tais como polímeros, plásticos, resinas, polissacarídeos, sílica, ou materiais à base de sílica, carbono, metais, vidros orgânicos, membranas, ou qualquer um dos materiais de suporte acima mencionados (por exemplo, como uma camada ou um revestimento).

[00137] Como usado aqui, os termos rótulo e marcador referemse a substâncias que podem conferir um sinal detectável e incluem, mas não são limitadas a, enzimas tais como fosfatase alcalina, glicose-6-fosfato desidrogenase, e peroxidase de rábano silvestre, ribozima, um substrato para uma replicase tal como replicase de QB, promotores, corantes, fluorescedores, tais como fluoresceína, isotiocianato, compostos de rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, oftaldeído e fluorescamina, quimioluminescedores tais como isoluminol, sensibilizadores, coenzimas, substratos de enzima, radiorrótulos, partículas tais como partículas de carbono ou látex, lipossomas, células etc, que podem ser ulteriormente marcadas com um corante, catalisador ou outro grupo detectável.

[00138] Como usado aqui, os termos receptor e proteína de receptor são usados aqui para indicar uma molécula proteinácea biologicamente ativa que especificamente se liga a (ou com) outras moléculas tal como Bcl-2.

[00139] Como usado aqui, o termo ligante refere-se a uma molécula que contém uma porção estrutural que está ligada por interação específica com uma proteína de receptor particular.

[00140] Como usado aqui, o termo anticorpo refere-se a moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas (fragmentos)

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65/78 de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um paratopo ou sítio de combinação de anticorpo. O termo é inclusive de anticorpos monoclonais e anticorpos policlonais.

[00141] Como usado aqui, os termos anticorpo monoclonal ou composição de anticorpo monoclonal referem-se a uma molécula de anticorpo que contém apenas uma espécie de sítio de combinação de anticorpo de imunorreação com um antígeno particular. Uma composição de anticorpo monoclonal assim tipicamente exibe uma afinidade de ligação simples para qualquer antígeno com o qual ele reage. Uma composição de anticorpo monoclonal é tipicamente constituído de anticorpos produzidos por clones de uma única célula chamada de um hibridoma que secreta (produz) apenas um tipo de molécula de anticorpo. A célula de hibridoma é formada por fusão de uma célula produtora de anticorpo e um mieloma ou outra linha de célula de autoperpetuação. Tais anticorpo foram primeiramente descritos por Kohler and Milstein, Nature, 1975, 256:495-497, cuja descrição é incorporada por referência. Uma tecnologia de hibridoma exemplar é descrita por Niman e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1983, 80:4949-4953. Outros métodos de produção de anticorpos monoclonais, uma célula de hibridoma, ou uma cultura de célula de hibridoma são também bemconhecidos. Vide, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e outros, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; ou o método de isolamento de anticorpos monoclonais de um reportório imunológico como descrito por Sasatry, e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:5728-5732; e Huse e outros, Science, 1981, 246:1275-1281. As referências citadas são aqui incorporadas aqui por referência.

[00142] Como usado aqui, uma membrana semi-permeável referese a um material biocompatível que é impermeável a líquidos e capaz de permitir a transferência de gases através dele. Tais gases incluem, mas não são limitados a, oxigênio, vapor de água, e dióxido de carboPetição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 73/114

66/78 no. Membranas semi-permeáveis são um exemplo de um material que pode ser usado para formar pelo menos uma porção de um recinto que define uma cavidade da câmara de fluxo. A membrana semipermeável pode ser capaz de excluir a contaminação microbiana (por exemplo, o tamanho de poro é caracteristicamente pequeno o suficiente para excluir a passagem de micróbios que podem contaminar o análito, tal como células). Em um aspecto particular, uma membrana semipermeável pode ter uma transparência ótica e claridade suficiente para permitir observação de um análito, tal como células, quanto a cor, crescimento, tamanho, morfologia, imagem e outras finalidades bemconhecidas na técnica.

[00143] Como usado aqui, o termo ligação refere-se a qualquer ligação física ou associação próxima, que pode ser permanente ou temporária. A ligação pode resultar de ligação de hidrogênio, forças hidrofóbicas, forças de van der Waals, covalente, ou ligação iônica, por exemplo.

[00144] Como usado aqui, o termo partícula inclui materiais insolúveis de qualquer configuração, incluindo, mas não limitados a, formas esféricas, de tipo de filamento, de tipo escova e irregulares. Partículas podem ser porosas com canais regulares ou aleatórios dentro. Partículas podem ser magnéticas. Exemplos de partículas, incluem, mas não são limitadas a, sílica, celulose, contas de Sepharose, contas de poliestireno (sólidas, porosas, derivatizadas), vidro de poro controlado (protozoários, bactérias, levedura, vírus e outros agentes infecciosos), micelas, lipossomas, ciclodextrinas e outros materiais insolúveis.

[00145] Uma seqüência de codificação ou região de codificação é uma seqüência de polinucleotídeos que é transcrita em mRNA e/ou traduzida em um polipeptídeo. Por exemplo, uma seqüência de codificação pode codificar um polipeptídeo de interesse. Os limites da sePetição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 74/114

67/78 qüência de codificação são determinados por uma tradução de códon inicial no terminal 5' e uma tradução de códon de parada no terminal 3'. Uma seqüência de codificação pode incluir, mas não é limitada a, mRNA, cDNA, e seqüências de polinucleotídeos recombinantes.

[00146] Como usado aqui, o termo polipeptídeo refere-se a qualquer polímero compreendendo qualquer número de dois ou mais aminoácidos, e é usado intercambeavelmente aqui com os termos proteína, produto de gene e peptídeo.

[00147] Como usado aqui, o termo nucleosídeo refere-se a uma molécula tendo uma base de purina ou de pirimidina covalentemente ligada a um açúcar de desoxirribose ou ribose. Nucleosídeos exemplares incluem adenosina, guanosina, citidina, uridina e timidina.

[00148] O termo nucleotídeo refere-se a um nucleosídeo tendo um ou mais grupos fosfato unidos em ligações de éster à porção de açúcar. Nucleotídeos exemplares incluem monofosfatos, difosfato e trifosfatos de nucleosídeo.

[00149] Os termos polinucleotídeo, molécula de ácido nucléico e molécula de nucleotídeo são usados intercambeavelmente aqui e referem-se a um polímero de nucleotídeos unidos entre si por uma ligação de fosfodiéster entre átomos de carbono 5' e 3'. Polinucleotídeos podem codificar um polipeptídeo tal como polipeptídeo de Bcl-2 (se expresso ou não expresso), ou podem ser RNA de interferência curto (siRNA), ácidos nucléicos de anti-sentido (oligonucleotídeos de anti-sentido), aptâmeros, ribozimas (RNA catalítico), ou oligonucleotídeos formação triplex (isto é, antígeno), por exemplo.

[00150] Como usado aqui, o termo RNA ou molécula de RNA ou molécula de ácido ribonucléico refere-se em geral a um polímero ou ribonucleotídeos. O termo DNA ou molécula de DNA ou molécula de ácido desoxirribonucléico refere-se em geral a um polímero de desoxirribonucleotídeos. Moléculas de DNA e de RNA podem ser sintetiPetição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 75/114

68/78 zadas naturalmente (por exemplo, replicação de DNA ou transcrição de DNA, respectivamente). Moléculas de RNA podem ser póstranscritivamente modificadas. Moléculas de DNA e RNA podem também ser quimicamente sintetizadas. Moléculas de DNA e RNA podem ser de filamento único (isto é, ssRNA e ssDNA, respectivamente) ou de múltiplos filamentos (por exemplo, de filamento duplo, dsRNA e dsDNA, respectivamente). Com base na natureza da invenção, no entanto, o termo RNA ou molécula de RNA ou molécula de ácido ribonucléico pode também referir-se a um polímero compreendendo principalmente ribonucleotídeos (isto é, maior do que 80% ou, de preferência maior do que 90%) mas opcionalmente incluindo pelo menos uma molécula de não ribonucleotídeo, por exemplo, pelo menos desoxirribonucleotídeo e/ou pelo menos um análogo de nucleotídeo.

[00151] Como usado aqui, o termo análogo de nucleotídeo ou análogo de ácido nucléico, também chamado aqui de ácido nucléico/nucleotídeo alterado ou ácido nucléico/nucleotídeo modificado, refere-se a um nucleotídeo não padrão, incluindo desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos de ocorrência não natural. Análogos de nucleotídeos preferidos são modificados a qualquer posição de modo a alterar certas propriedades químicas do nucleotídeo ainda retêm a capacidade do análogo de nucleotídeo para realizar sua função pretendida. Por exemplo, ácidos nucléicos fechados (LNA) são uma classe de análogos de nucleotídeo que possuem excelente especificidade e afinidade muito alta em relação a DNA e RNA complementar. Oligonucleotídeos de LNA foram ampliados como moléculas de anti-sentido tanto in vitro quanto in vivo (Jepsen J.S. e outros, Oligonucleotides, 2004, 14(2):130-146).

[00152] Como usado aqui, o termo análogo de RNA refere-se a um polinucleotídeo (por exemplo, um polinucleotídeo quimicamente sintetizado) tendo pelo menos um nucleotídeo alterado ou modificado

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69/78 quando comparado com RNA não modificado ou não alterado correspondente mas retendo a mesma ou natureza similar ou fração que o RNA não alterado ou não modificado correspondente. Como discutido acima, os oligonucleotídeos podem ser ligados, que resulta em uma taxa mais baixa de hidrólise do análogo de RNA quando comparado com uma molécula de RNA com ligações de fosfodiéster. Análogos de RNA exemplares incluem desoxirribonucleotídeos e/ou ribonucleotídeos modificados pelo açúcar e/ou cadeia principal. Tais alterações ou modificações podem ulteriormente incluir adição de material não nucleotídeo, tal como a(s) extremidade(s) do RNA ou internamente (a um ou mais nucleotídeos da RNA).

[00153] Os termos compreendendo, que consiste em e que consiste essencialmente em são definidos de acordo com seu meio padrão. Os termos podem ser usados como substitutos de um com outro através de todo o presente pedido a fim de ligar o meio específico associado a cada termo.

[00154] Os termos isolado ou biologicamente puro referem-se a material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes os quais normalmente acompanham o material como é encontrado no seu estado nativo.

[00155] Como usado nesse relatório, as formas singulares um, uma, a e o incluem referência em plural a não ser que o contexto claramente dite de outra maneira. Assim, por exemplo, uma referência a um anticorpo inclui mais do que um tal anticorpo. Uma referência a uma molécula inclui mais do que uma tal molécula, e assim por diante.

[00156] A prática da presente invenção pode empregar, a não ser que de outra maneira indicada, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, tecnologia de DNA recombinante, eletrofisiologia e farmacologia que estão dentro da habilidade da técnica. Tais técniPetição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 77/114

70/78 cas são explicadas totalmente na literatura (vide, por exemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover Ed. 1985); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan Eds., Academic Press, Inc.); Transcription and Translation (Hames e outros Eds. 1984); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller e outros Eds. (1987) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (2nd ed., Springer-Verlag); and PCR: A Practical Approach (McPherson e outros Eds. (1991) IRL Press)), cada um dos quais são incorporados aqui por referência em sua totalidade.

[00157] O que se segue são exemplos que ilustram materiais, métodos e procedimentos para a prática da invenção. Os exemplos são ilustrativos e não seriam interpretados como limitantes.

Materiais e Métodos [00158] Coorte de paciente. Com aprovação institucional anterior, amostras de urina e de sangue foram coletadas a partir de voluntários de controle saudáveis normais (N = 21), mulheres com distúrbios ginecológicos benignos (N = 35) e pacientes com câncer ovariano (N = 34) no H. Lee Moffitt Cancer Center. Todas exceto 8 amostras foram coletadas antes da cirurgia de de Debulk inicial, enquanto as últimas 8 amostras apresentavam com doença recorrente na hora do protocolo no estudo. Blocos de parafina foram identificados, onde possível, e as lâminas revistas para confirmar o diagnóstico histológico de acordo com as classificações de FIGO. Os registros médicos dessas mulheres foram também revistos e informação em relação a idade do paciente, tipo de tumor, estágio, grau, tamanho e tratamento cirúrgico abstraído onde disponível.

[00159] Preparação de amostra. Com paciente conciente informaPetição 870180066666, de 01/08/2018, pág. 78/114

71/78 do, amostras de urina e de sangue foram coletadas a partir dos pacientes, foram tornados anônimos e foram codificados para proteger a identidade do paciente, e foram liberados a partir de H. Lee Moffitt Cancer Center para esse protocolo de pesquisa. Todas as amostras foram mantidas em gelo. Amostras de urina foram tratadas com um coquetel de inibidor de protease padrão (de 80 pg/ml de fluoreto de 4(2-aminoetil)-benzeno sulfonila, 200 pg/ml de EDTA, 0,2 pg/ml de leupeptina, de 0,2 pg/ml de pepstatina, Sigma Scientific, St. Louis, MI) e foram centrifugadas a 3000 x g. Sobrenadantes de urinae amostras de plasma foram então dividas em alíquotas e foram armazenadas a 20^oC.

Ensaio de imunossorvente ligado a enzima [00160] Para medir níveis de Bcl-2 em urina de pacientes, amostras foram analisadas usando-se ensaio imunossorvente ligado a enzima de tipo sanduíche quantitativa (ELISA; R&D Systems, Minneapolis, MN) de acordo com as instruções do fabricante. Para medir níveis de CA125 em plasma do indivíduo, amostras foram analisadas por ELISA (Bio-Quant, San Diego, CA) de acordo com as instruções do fabricante. As reações enzimáticas foram detectadas a 450 nm usando-se uma leitora de placa de Dynex MRX (Dynex Technologies, Chantilly, VA) e resultados de Bcl-2 expressos como a absorbância média de amostras em triplicata ± S.E. enquanto resultados de CA125 fossem expressos como a média de amostras em duplicata.

[00161] Análise estatística. Amostras para ELISA de Bcl-2 foram realizadas em triplicata e os dados foram submetidos ao teste de Kruskal-Wallis quanto a distribuição normal. Dados foram então analisados por teste U de Mann-Whitney para determinar a significância estatística entre amostras de controles normais, pacientes com doença benigna e pacientes com câncer ovariano. Do mesmo modo, análises de determinação usando-se o sistema de SAS foram empregadas para

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72/78 determinar associação apropriada em cada grupo (normal vs benigno vs câncer).

Exemplo 1 Níveis de Bcl-2 urinário são elevados em pacientes com câncer ovariano [00162] Urina e sangue foram coletados a partir de 90 indivíduos com amostras coletadas a partir de controles normais (N=21), mulheres com doença benigna (N = 35) e mulheres com câncer ovariano (N = 34). A última categoria consistia em mulheres diagnosticadas com endometrióide (N = 1), mucina (N = 7) bem como câncer ovariano seroso (N = 24) e câncer peritoneal primário, que está freqüentemente relacionado com câncer ovariano, (N = 2). As amostras coletadas a partir de mulheres com doença ginecológica benigna consistia em mulheres com teratomas císticos benignos (N = 2), cistos simples (N = 10), leiomiomas (N = 8), doença ovariana policísticas (N = 1), adenofibromas ovarianos (N = 4), cistadenomas mucinoso(N = 2) e cistadenomas serosas (N = 8). Embora essa coorte compreenda um estudo piloto pequeno, ele é representativo de uma prática clínica típica com relação a distribuição de estágio, grau e histologia.

[00163] Para determinar a adequabilidade potencial de níveis de Bcl-2 urinário como um novo marcador molecular para câncer ovariano, amostras de urina oriunda de controles normais, mulheres com doença ginecológica benigna e pacientes com amostras de câncer ovariano foram triados por análise de ELISA (figura 1). A quantidade de Bcl-2 urinário era em geral desprezível (0,21 ng/ml médio) em amostras de controle normais. Em contraste com isso, Bcl-2 urinário associado a câncer peritoneal primário ou ovariano era em geral >10x (3,4 ng/ml) foram encontrados em amostras de controle normais (Figura 1A). Nenhuma amostra de urina normal continha Bcl-2 >1,8 ng/ml, equanto apenas duas das amostras de câncer exibiam Bcl-2 menos do que 1,8 ng/ml (de 1,12 ng/ml e 1,78 ng/ml). Uma vez que carcinoma

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73/78 seroso representa a maioria de cânceres ovarianos epiteliais, níveis de Bcl-2 urinário em pacientes com adenocarcinoma seroso foram examinados por grau (Figura 1A) e estágio (Figura 1B) da doença. Embora haja uma tendência para níveis de Bcl-2 elevados com aumento de grau e estágio de tumor, a diferença em níveis de Bcl-2 entre estágio e grau de tumor não era estatisticamente significativo. Do mesmo modo, creatinina do soro foi medida na hora da coleta de urina e indicava que níveis de Bcl-2 urinários não estavam relacionados com disfunção renal (dados não mostrados). Notavelmente, um único paciente (N° 77) demonstrou níveis de Bcl-2 urinário extremamente elevados (>9 ng/ml) na ausência de outros sintomas clínicos notáveis.

[00164] Tabela 2 sumariza os resultados apresentados nas figuras 1 e 2 para níveis médios de Bcl-2 na amostra de urina. Números entre parênteses indicam o número de amostras em cada grupo respectivo. Adicionalmente, os dados são agrupados para mostrar níveis de Bcl-2 médios (ng/ml) entre indivíduos normais e subtipos histológicos de câncer ovariano, grau de tumor e estágio de tumor. Os dados mostram que enquanto o nível médio de Bcl-2 na urina de voluntários saudáveis é de 0,204 ng/ml, que de todos os pacientes com câncer é em geral 10X maior (3,12 ng/ml). Além disso, níveis de Bcl-2 urinário parecem fortemente relacionados com estágio de tumor e moderadamente relacionados com grau de tumor entre cânceres ovarianos serosos (o tipo de ocorrência mais freqüente de câncer ovariano).

Tabela 2. Níveis de Bcl-2 urinários em normal e câncer ovariano

Amostra		Bcl-2 (ng/ml)
Normal (21)		0,204
Endometrióide (1)		3,168
mucina (4)		2,35
Peritoneal (2)		1,78
Seroso (29)	Grau 1 (7)	2,76

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74/78

	Grau 2 (10)	3,98
	Grau 3 (12)	3,94
	Estágio 1 (3)	1,92
	Estágio 2 (4)	3,23
	Estágio 3 (14)	4,07
	Estágio 5 (8)	4,04

Exemplo 2- Bcl-2 urinário em pacientes com doença ginecológica benigna não é elevado [00165] Medição de ELISA de Bcl-2 urinário de 35 mulheres com doença ginecológica benigna (urina coletada exatamente antes do tratamento do paciente) indicava níveis médios de Bcl-2 de 0,02 ng/ml como nenhuma amostra >1,8 ng/ml de Bcl-2, como mostrado na figura 8A. Essas doenças benignas incluíam teratomas benignos, cistos simples, leiomiomas, ovário poliestrônico, fibromas, e adenomas. Esses valores eram similares a controles normais, mas significativamente menores do que amostras de câncer ovariano sugerindo que níveis de Bcl-2 urinário elevados maiores do que 1,8 ng/ml estavam associados a câncer ovariano.

[00166] O teste de Kruskal-Wallis foi usado para testar a distribuição normal dos dados. Uma vez que o grupo normal falhou para satisfazer distribuição, provavelmente devido a pequeno número de amostra, as diferenças entre grupos foram analisados pelo teste U de Mann-Whitney. Os resultados indicavam nenhuma diferença significativa entre grupos normal e benigno (p<0,5), mas p<0,001 entre normal e câncer ou benigno e câncer. Um sumário de nível de Bcl-2 urinário para este grupo de estudo é apresentado na Figura 8B. Do mesmo modo, análises de discriminação usando-se os sistemas de SAS revelaram que a probabilidade de associação apropriada no grupo normal/benigno ou câncer foi >90%.

Exemplo 3 - Bcl-2 urinário não correlaciona com idade do paciente ou

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75/78 tamanho do tumor [00167] Comparação de parâmetros clínicos sugeriu que níveis de Bcl-2 urinário não relacionam com a idade do paciente (vide a Figura 5). Embora a faixa de idade e idade média dos controles normais (de 29-81 anos, 48,5 ± D.P. 12,7 anos em média) e mulheres com doença ginecológica benigna (de 28-84 anos, 55,9 ± D.P 13,9 anos em média) era um pouco mais baixo que das mulheres com câncer ovariano (de 26-92 anos, 62,2 ± D.P. 13,8 anos em média), as diferenças não foram estatisticamente significativas nesse estudo. Similarmente, níveis de Bcl-2 urinário não se correlacionam com tamanho de tumor medido na cirurgia de remoção (Figura 6), variando de microscópico até >10 cm e pode refletir variação biológica entre indivíduos ou variação de composição de tumor.

Exemplo 4- Bcl-2 urinário detecta câncer ovariano mais exatamente do que CA125 no sangue [00168] Para explicar se Bcl-2 urinário elevado é um indicador de diagnóstico melhor para câncer ovariano do que antígeno de câncer 125 (CA125), Bcl-2 urinário foi comparado com níveis de CA125 em 12 controles normais e 23 pacientes com câncer ovariano (Figuras 4A e 4B). Dos pacientes examinados, Bcl-2 urinário elevado associado com detecção de câncer ovariano era quase 100%. Bcl-2 urinário elevado (>1,8 ng/ml) identificava 17/17 pacientes com adenocarcinoma seroso, 4/4 pacientes com câncer ovariano de mucina e 1/2 pacientes com câncer peritoneal primário como positivo para câncer ovariano (Figura 4A). Nenhum dos controles normais tinham níveis de Bcl-2 urinário >1,8 ng/ml e foram, então, corretamente classificados como negativo para câncer. Em contraste com isso, níveis de sangue de CA125 >35 U/ml, o padrão corrente para detecção de câncer ovariano, identificavam 13/17 ou 76% de pacientes com adenocarcinoma seroso (Figura 4B). Do mesmo modo, análises de CA125 identificavam 3/4 ou 75% de

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76/78 pacientes com câncer ovariano de mucina, embora níveis de CA125 nesses pacientes variassem entre 41-43 U/ml, e 1/2 ou 50% odef pacientes com câncer peritoneal primário como positivo para câncer. Níveis CA125 elevados também incorretamente identificavam 2/12 ou 16% de indivíduos saudáveis como positivo para câncer sugerindo que Bcl-2 urinário elevado parece detectar câncer ovariano mais exatamente do que CA125.

Exemplo 5- Bcl-2 urinário diminui depois da cirurgia de remoção [00169] Para ulteriormente testar a exatidão para níveis altos de Bcl-2 urinário para detectar câncer ovariano, níveis de Bcl-2 urinário foram comparados em 7 pacientes com câncer ovariano imediatamente antes do (Figuras 7A e 7B, barras pretas) e no período de 2 semanas após a cirurgia de remoção inicial para a remoção de todo o tumor visível (barras brancas). Para aqueles pacientes onde amostras de urina foram coletadas antes e depois da cirurgia inicial, níveis de Bcl-2 diminuíram até 100% após a remoção cirúrgica do tumor sugerindo que a presença de tumor se correlaciona bem com Bcl-2 urinário elevado em pacientes com câncer ovariano.

[00170] Atualmente, estudos pré-clínicos foram no desenvolvimento de agentes para inibir Bcl-2, incluindo oligonucleotídeo de anti-sentido e inibidores moleculares pequenos de Bcl-2. Embora tais estudos direcionam Bcl-2 para a intervenção terapêutica, os presentes dados indicam que a quantificação de Bcl-2 urinário por ensaios com base em ELISA podem prover método novo, seguro, sensível, específico e econômico para a detecção de câncer ovariano que beneficiaria todas as mulheres não apenas nos Estados Unidos, mas mundialmente, incluindo áreas geográficas de oferta medicalmente insuficiente e especialmente mulheres em alto risco para desenvolver câncer ovariano. Além disso, dado que cerca de 25.000 mulheres são diagnosticadas com câncer ovariano anualmente nos EUA, detecção de Bcl-2 urinário

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77/78 de câncer ovariano tanto em estágios precoces quanto tardios de doenças não confirmariam o diagnóstico de câncer ovariano, mas poderia também potencialmente detectar milhares de cânceres ovarianos anteriormente não diagnosticados. Isso é especialmente importante para a detecção de câncer ovariano em estágios precoces que explicam menos do que 10% de cânceres ovarianos diagnosticados, mas onde remoção cirúrgica do ovário doente aumenta sobrevivência de paciente para mais de 90% e seria esperado reduzir custos médicos para uma vida longa. Finalmente, além de servindo uma nova função de diagnóstico, níveis de Bcl-2 urinário podem ser usados para monitorar a presença de câncer ovariano através do curso da doença que pode impactar resultado terapêutico e prognóstico. Claramente, estudos de população maiores são justicados para verificar o potencial para níveis de Bcl-2 urinário para servir como um biomarcador para câncer ovariano bem como investigações no(s) mecanismo(s) molecular(es) responsável(áveis) para Bcl-2 urinário elevado em câncer ovariano. No entanto, uma vez que não há relatos que empregam tanto detecção urinária ou Bcl-2 como um biomarcador para câncer ovariano, esse estudo de diagrama sugere que a medição de Bcl-2 urinário por ELISA pode prover um método simples, inovador para detectar todos os cânceres ovarianos e, possivelmente, reduzir a mortalidade de uma doença insidiosas que mata milhares de mulheres anualmente.

Exemplo 6- Condições de armazenagem de urina para testagem de Bcl-2 [00171] Estudos que examinam a estabilidade de armazenagem de bcl-2 urinário indicam que quando amostras são preparadas com a adição de coquetel de inibidores de protease essas amostras de urina podem ser armazenadas por período de 1 ano a -20^oC sem perda da detecção de bcl-2 (vide 'Control' & '-20°C' na Figu ra 11). Isso seria benéfico para indivíduos onde pode ser desejável retestar amostras ante

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78/78 riores com aquelas atuais. Altemativamente, essas amostras podem também ser armazenadas a 4^oC por até 4 dias sem adversamente afetar detecção de Bcl-2 urinário. Esses são resultados importantes uma vez que eles indicam que o tempo possivelmente exigido para transportar amostras de urina do paciente (das áreas geográficas potencialmente distantes) para um laboratório para testagem de Bcl-2 não adversamente afetaria o resultado de detecção de bcl-2 urinária se inibidores de protease forem adicionados às amostras de urina e as amostras de urina são mantidas frias. No entanto, Bcl-2 reduzido foi medido nas amostras armazenadas a temperatura ambiente por 4 dias e Bcl-2 não poderia ser detectado em amostras de urina armazenadas a 80^oC; portanto, parece proibitivo armazenar amostras urinárias para a detecção de Bcl-2 ou a temperatura ambiente ou a -80^oC.

[00172] Todas as patentes, pedidos de patentes, pedidos provisórios e publicações mencionados ou citados aqui, supra ou infra, são incorporados por referência em sua totalidade, incluindo todas as figuras e tabelas, na medida de que elas não são inconsistentes com os ensinamentos explícitos desse relatório.

[00173] Será entendido que os exemplos e concretizações descritos aqui são apenas para as finalidades ilustrativas e que várias modificações ou mudanças à sua luz serão sugeridas por pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e campo de ação desse pedido.

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método in vitro para detecção de câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção da presença de Bcl-2 em uma amostra biológica de urina a partir do indivíduo utilizando detecção imunoenzinática baseada em ELISA, em que um nível de Bcl2 acima de um limiar predeterminado é indicativo de câncer ovariano no indivíduo.
2. 2. Método in vitro de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita detecção compreende:

   (a) contato da amostra de urina com um agente de ligação que se liga à proteína de Bcl-2 para formar um complexo;

   (b) detecção do complexo; e correlação do complexo detectado com a quantidade de proteína de Bcl-2 na amostra de urina, em que a presença de proteína de Bcl-2 elevada é indicativa de câncer ovariano.
3. 3. Método in vitro de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação é imobilizado em um suporte.
4. 4. Método in vitro de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação é um anticorpo monoclonal ou policlonal.
5. 5. Método in vitro de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita detecção de (b) ulteriormente compreende a ligação ou incorporação de uma marcação sobre o agente de ligação.
6. 6. Método in vitro de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ulteriormente compreende a detecção de um CA125 na mesma amostra de urina ou uma amostra biológica diferente obtida a partir do indivíduo, antes, durante ou depois da dita detecção de Bcl-2.

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7. 7. Método in vitro de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo está sofrendo de câncer ovariano, e em que a dita detecção é realizada em vários pontos de tempo em intervalos, como parte de uma monitoração do indivíduo antes, durante ou depois do tratamento do câncer ovariano.
8. 8. Método in vitro de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo não está apresentando qualquer sintoma de câncer na hora que a dita detecção é realizada.
9. 9. Método in vitro de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo está apresentando um ou mais sintomas de câncer na hora que a dita detecção é realizada.
10. 10. Método in vitro de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo está apresentando um ou mais dos sintomas selecionados do grupo que consiste em dor pélvica, sangramento vaginal anormal, inchamento ou intumescimento abdominal, dor nas costas persistente, indisposição persistente de estômago, mudança em padrão de bexiga ou de intestino, dor durante a relação sexual, perda de peso não intencional de dez ou mais libras (1 L = 0,454 kg), anormalidade na vulva ou na vagina, mudança na mama, e fadiga.
11. 11. Método in vitro de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem um nível de CA125 elevado no sangue na hora da dita detecção.
12. 12. Método in vitro de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo não tem um nível de CA125 elevado no sangue na hora da dita detecção.
13. 13. Método in vitro para a avaliação de prognóstico de um indivíduo tendo, ou suspeito de ter, câncer ovariano, caracterizado pelo fato de que compreende: a) determinação do nível de Bcl-2 em uma amostra de urina obtida a partir do indivíduo; b) comparação do nível

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    3/3 determinado na etapa (a) com uma faixa de Bcl-2 conhecida como estando presente em uma amostra de urina obtida a partir de um indivíduo normal que não tem câncer ovariano; e c) determinação do prognóstico do indivíduo baseado na comparação da etapa (b), em que um alto nível de Bcl-2 na etapa (a) indica uma forma agressiva de câncer ovariano e, portanto, um prognóstico pobre.