BRPI0707646A2 - vetor viral - Google Patents

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BRPI0707646A2
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BR
Brazil
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acnpv
promoter
gene
antigen
duai
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BRPI0707646-0A
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Inventor
Shigeto Yoshida
Yoshio Ohba
Norimitsu Hariguchi
Masami Mizukoshi
Masanori Kawasaki
Makoto Matsumoto
Yoshihiro Goto
Original Assignee
Educational Foundation Jichi Medical Univ
Otsuka Pharma Co Ltd
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Publication date
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Abstract

VETOR VIRAL. A presente invenção refere-se a um vetor de transferência recombinante capaz de expressar um gene estrangeiro fundido a um gene viral sob o controle de promotores duplos e um baculovírus recombinante, e métodos para produção do mesmo, bem como agentes farmacêuticos compreendendo o baculovírus recombinante como um ingrediente ativo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VETOR Vl-RAL".
Campo Técnico
A presente invenção refere-se a um novo vetor de transferência,um baculovírus recombinante obtido através de recombinação homóloga dovetor de transferência e um DNA de baculovírus e métodos para sua produ-ção.
A presente invenção refere-se, também, a agentes farmacêuti-cos (por exemplo, vacinas, fármacos preventivos ou terapêuticos para doen-ças infecciosas tal como malária e influenza) compreendendo o baculovírusrecombinante como um ingrediente ativo.
Técnica Antecedente
Baculovírus tem sido usado como um vetor para métodos deprodução industrial de uma proteína objeto usando células de inseto. Nosúltimos anos, foi constatado que o baculovírus pode introduzir um gene es-trangeiro não apenas nas células de inseto, mas também em células demamífero, e uma possibilidade do vetor onde um gene para terapia é intro-duzido foi encontrada. No Documento de patente 1, um vetor de expressãode baculovírus recombinante tendo promotores independentes múltiploscompostos de uma região de DNA compreendendo um gene codificandouma proteína não-estrutural viral no promotor derivado de um gene de ex-pressão precose do baculovírus e uma região de DNA compreendendo umgene codificando uma proteína estrutural viral no promotor derivado de umgene de expressão tardia foi descrito.
No Documento de patente 2, o método onde um vírus de DNAde não-mamífero compreendendo um promotor controlado de modo que umgene exógeno que é expresso de um vetor onde os genes exógenos deseja-dos foram ligados aos promotores independentes múltiplos é introduzido emuma célula e o gene exógeno é expresso na célula de mamífero foi descrito.
Ainda, no Documento de patente 3, o método de produção daproteína através de tecnologia de recombinação de gene usando o baculoví-rus foi descrito, e o método de produção da proteína através da expressãode um gene de fusão obtido através da ligação de um gene de gp64 do ba-culovírus a um gene codificando a proteína desejada, produzindo a proteínadesejada em uma forma onde a proteína desejada foi fundida a partículasvirais, coleta dás partículas virais fundidas com a proteína desejada e cliva-gem da proteína desejada das partículas virais para coletar a proteína dese-jada foi descrito.
No Documento de patente 4, para um sistema de expressão debaculovírus, um vetor de expressão de baculovírus recombinante tendopromotores independentes múltiplos compreendendo uma primeira seqüên-cia de ácido nucléico codificando um marcador de detecção ligado na formacapaz de funcionar para um primeiro promotor que é ativo em uma célulahospedeiro e é inativo em uma célula não-aceitável, e uma segunda se-qüência de ácido nucléico compreendendo uma seqüência de ácido nucléicoestranha ligada na forma capaz de funcionar para um segundo promotor queé ativo na célula não-aceitável foi descrito.
No Documento de patente 5, foi descrito que um vetor de bacu-lovírus recombinante expressando antígeno hemaglutinina (HA) do vírus in-fluenza ligado a um promotor CAG derivado de β actina de galinha é útil co-mo uma formulação de vacina porque o vetor tem um efeito preventivo sobreinfecção com vírus influenza.
No Documento de patente 6, o método de produção de um vetorde baculovírus compreendendo uma etapa de co-transfecção onde umplasmídeo onde genes codificando proteínas expressáveis na superfície ce-lular foram ligados ao promotor de baculovírus e o promotor derivado da cé-lula de mamífero, respectivamente, e um plasmídeo onde genes codificandoproteínas expressáveis na superfície celular foram ligados a dois promotoresde baculovírus, respectivamente, são co-transfectados na célula de inseto foidescrito.
E no Documento de patente 7, um estudo sobre atividade de umvírus antiinfluenza sobre infecção com vírus influenza usando o baculovírusrecombinante onde cDNA de HA do vírus influenza foi incorporado ao pro-motor CAG foi descrito, e foi descrito que não apenas o baculovírus recom-binante, mas também um baculovírus do tipo selvagem tem a atividade.
Deste modo, nos últimos anos, vários baculovírus recombinantesforam desenvolvidos, e desenvolvimento farmacêutico para mamíferos u-sando-os foi estudado utilizando o baculovírus recombinante como o ingre-diente ativo.
Na técnica relacionada, um vetor de baculovírus recombinantetendo uma nova estrutura e o desenvolvimento de uma formulação farma-cêutica, particularmente uma formulação de vacina usando o baculovírusrecombinante como o ingrediente ativo, que é eficaz para doenças infeccio-sas tal como malária e influenza, ou doenças tal como câncer, têm sido de-sejados.
Documento de Patente 1: Patente Japonesa No. 3366328, Multi-ple promoter baculovírus expression system and defect particle products.
Documento de Patente 2: W098/011243, "Non-mammalian DNAvírus having modified coating protein".
Documento de Patente 3: JP No. 2002-235236-A, "Methods ofproducing proteins".
Documento de Patente 4: JP No. 2003-284557-A, "Novel bacu-lovírus-transfecting vector and recombinant baculovírus for expression of fo-reign gene".
Documento de Patente 5: W002/062381, "Baculovírus vectorvaccine".
Documento de Patente 6: W004/029259, "Baculovírus vector,method of producing baculovírus vector and method of introducing gene".
Documento de Patente 7: "JP No. 2005-15346-A, Baculovirus-containing anti-viral agent".
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
PROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO
Um objetivo da presente invenção é prover um novo vetor detransferência recombinante, um baculovírus recombinante obtido através derecombinação homóloga do vetor de transferência recombinante e um DNAde baculovírus, e métodos para sua produção. Outro objetivo da presenteinvenção é prover um agente farmacêutico, particularmente uma formulaçãode vacina usando o baculovírus recombinante como um ingrediente ativo.
MEIOS PARA RESOLVER OS PROBLEMAS
Os presentes inventores encontraram um vetor de transferênciatendo uma nova estrutura capaz de expressar uma proteína tendo uma imu-nogenicidade desejada, ou uma proteína de fusão de uma proteína parcialou a proteína tendo a imunogenicidade com citocina em células de inseto ecélulas de vertebrados (particularmente mamífero, ave e peixe) que não cé-lulas de inseto, e um baculovírus recombinante obtido através de recombi-nação homóloga do vetor de transferência e um DNA de baculovírus. Atra-vés da provisão do baculovírus recombinante, o agente farmacêutico tendo obaculovírus recombinante como o ingrediente ativo tendo efeitos preventivose/ou terapêuticos sobre doenças infecciosas foi extensivamente estudado.Como resultado, os presentes inventores constataram recentemente que obaculovírus recombinante tem o efeito como o agente farmacêutico desejado.
E, de acordo com a presente invenção, o vetor de transferênciarecombinante tendo a nova estrutura, o baculovírus recombinante obtido a-través de recombinação homóloga do vetor de transferência e o DNA de ba-culovírus e os métodos para sua produção foram confirmados, e foi confir-mado que o próprio baculovírus recombinante era útil como o agente farma-cêutico capaz de expressão da proteína tendo a imunogenicidade desejadanas células-alvo e era útil como o agente farmacêutico preventivo para asdoenças infecciosas tal como malária e influenza, e aqui a presente inven-ção foi completada.
A presente invenção provê a invenção mostrada em [1] a [31]que segue
[1] Um método de produção de um vetor de transferência com-preendendo uma estrutura onde promotores duplos e um gene de fusão fo-ram incorporados, caracterizado pelo fato de que o gene de fusão compre-endendo pelo menos um gene codificando uma proteína capaz de ser umcomponente de uma partícula viral e pelo menos um gene estrangeiro imu-nogênico são ligados a jusante dos promotores virais ligando um promotorde vertebrado e outro promotor de baculovírus.
[2] O método de acordo com [1], onde o promotor de vertebradoé um promotor de mamífero.
[3] Método de acordo com [1] ou [2], caracterizado pelo fato deque o gene codificando pelo menos uma proteína capaz de ser o componen-te da partícula viral é qualquer um de um gene de gp64 de baculovírus, umgene da glicoproteína do vírus da estomatite vesicular, um gene de glicopro-teína do vírus da ímunodeficiência humana tipo I, um gene de glicoproteínada membrana dò vírus sincicial respiratório humano, um gene da proteínahemaglutinina do vírus influenza tipo A, gene de proteína hemaglutinina dovírus influenza tipo B, gene de glicoproteína do vírus herpes simplex e umgene da proteína S do vírus da hepatite murina.
[4] O método de acordo com [1] ou [2], onde o promotor de ver-tebrado é selecionado de qualquer um de um promotor de citòmegalovírus,um promotor de SV40, um promotor de retrovírus, um promotor de metaloti-oneína, um promotor de proteína de choque térmico, um promotor de CAG1um promotor de fator de alongamento 1a, um promotor de actina, um promo-tor de ubiquitina, um promotor de albumina e um promotor do MHC de clas-se II.
[5] O método de acordo com qualquer uma de [1] a [4], onde opromotor de baculovírus é selecionado de um promotor da poliedrina, umpromotor da p10, um promotor da IE1, um promotor da IE2, um promotor dap35, um promotor da p39 e um promotor da gp64.
[6] O método de acordo com qualquer um de [1] a [5], onde ogene estrangeiro imunogênico é selecionado de qualquer um de um antíge-no da malária, um antígeno da influenza, um antígeno da M. tuberculosis,um antígeno do vírus SARS, um antígeno do vírus da febre do Nilo Ociden-tal, um antígeno do vírus da febre do dengue, um antígeno de HIV1 um antí-geno de HCV, um antígeno da leishmania, um antígeno de tripanossoma,um antígeno de Ieucocytozoon sozinho ou um antígeno de fusão de pelomenos um selecionado desse grupo de gene de antígeno com uma citocina.[7] O método de acordo com qualquer um de [1] a [6], onde ovetor de transferência é qualquer um de pDual-Hsp65-gp64, pDual-PbCSP-gp64, pDual-H1 N1/HA1 -gp64, pDual-PbTRAMP-gp64, pDual-PbAMA1D123-gp64, pDual-PbMSP129-gp64, pDual-PfCSP-gp64, pDual-PfAMA1-gp64,pDual-Pfs25-gp64, pDual-H5N1/HA1-gp64, pDual-SARS/S-gp64, pCP-H1N1/HA1-gp64, pCAP-H1N1/HA1-gp64, pCU-H1N1/HA1-gp64, pDual-H1N1/NP-gp64, pDual-H1N1/M2-gp64, pDual-H1N1/NAe-gp64, pDual-M2e-gp64, pCP-HA1/NC99-gp64, pCP-H1N1/HA0-gp64, pCP-H1N1/HA2-gp64,pCP-H 1N1 /HA1 -vp39 e pCP-H 1N1 /N P-vp39.
[8] O método de produção de um baculovírus recombinante com-preendendo as etapas de produção de um vetor de transferência compreen-dendo uma estrutura onde promotores duplos e um gene de fusão foramincorporados, caracterizado pelo fato de que o gene de fusão compreenden-do pelo menos um gene codificando uma proteína capaz de ser um compo-nente de uma partícula viral e pelo menos um gene estrangeiro imunogênicosão ligados a jusante dos promotores duplos ligando um promotor de verte-brado e outro promotor de baculovírus; co-transfecção do vetor de transfe-rência e um DNA de baculovírus para uma célula hospedeiro de um inseto; eseparação do baculovírus recombinante.
[9] O método de acordo com [8], caracterizado pelo fato de que ogene codificando pelo menos uma proteína capaz de ser o componente dapartícula viral é qualquer um de um gene de gp64 de baculovírus, um genede glicoproteína do vírus da estomatite vesicular, um gene de glicoproteínado vírus da imunodeficiência humana tipo I, um gene de glicoproteína damembrana do vírus sincicial respiratório humano, um gene de proteína he-maglutinina do vírus influenza tipo A, um gene de proteína hemaglutinina dovírus influenza tipo B, um gene de glicoproteína do vírus herpes simplex eum gene de proteína S do vírus da hepatite murina.
[10] O método de acordo com [9], onde o promotor de vertebra-do é selecionado de qualquer um de um promotor de citomegalovírus, umpromotor de SV40, um promotor de retrovírus, um promotor de metalotioneí-na, um promotor de proteína de choque térmico, um promotor de CAG, umpromotor de fator de alongamento 1a, um promotor de actina, um promotorde ubiquitina, um promotor de albumina e um promotor do MHC de classe II.
[11] O método de acordo com qualquer uma de [8] a [10], onde opromotor de baculovírus é selecionado de um promotor de poliedrina, umpromotor de p10, um promotor de IE1, um promotor de p35, um promotor dep39 e um promotor de gp64.
[12] O método de acordo com qualquer um de [8] a [11], onde ogene estrangeiro imunogênico é selecionado de qualquer um de um antíge-no da malária, um antígeno da influenza, um antígeno da M. tuberculosis,um antígeno do vírus SARS, um antígeno do vírus da febre do Nilo Ociden-tal, um antígeno do vírus da febre do dengue, um antígeno de HIV, um antí-geno de HCV1 um antígeno da leishmania, um antígeno de tripanossoma,um antígeno de Ieucocytozoon sozinho ou um antígeno de fusão de um se-lecionado desse grupo de gene de antígeno com uma citocina.
[13] Método de acordo com qualquer um de [8] a [12], onde obaculovírus recombinante é qualquer um de AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-DuaI-PbCSP, AcNPV-DuaI-HI N1/HA1, AcNPV-DuaI-PbTRAMP, AcNPV-DuaI-PbAMAI D123, AcNPV-Dual-PbMSP129, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-DuaI-PfAMAI, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-DuaI-SARS/S, AcNPV-HI N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-DuaI-HI N1/NP, AcNPV-DuaI-HI N1/M2, AcNPV-DuaI-HI N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0,AcNPV-CP-HI N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 e AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39.
[14] Um vetor de transferência compreendendo uma estruturaonde um gene de fusão compreendendo pelo menos um gene codificandouma proteína capaz de ser um componente de uma partícula viral e pelomenos um gene estrangeiro imunogênico foram ligados a jusante dos pro-motores duplos ligando um promotor de vertebrado e outro promotor de ba-culovírus que foi incorporado.
[15] Vetor de transferência de acordo com [14] compreendendoa estrutura onde o gene de fusão compreendendo o gene codificando pelomenos uma proteína capaz de ser o componente da partícula viral e pelomenos um gene estrangeiro imunogênico foram ligados a jusante dos pro-motores duplos ligando um promotor de vertebrado e outro promotor de ba-culovírus que fói incorporado.
[16] Vetor de transferência de acordo com [14] ou [15], caracteri-zado pelo fato de que o gene codificando pelo menos uma proteína capaz deser o componente da partícula viral é qualquer um de um gene de gp64 debaculovírus, gene de glicoproteína do vírus da estomatite vesicular, gene daglicoproteína do vírus da imunodeficiência humana tipo I, um gene da glico-proteína da membrana do vírus sincicial respiratório humano, um gene daproteína hemaglutinina do vírus influenza tipo A, um gene da proteína hema-glutinina do vírus da influenza tipo B, um gene da glicoproteína do vírus her-pes simplex e um gene da proteína S do vírus da hepatite murina.
[17] O vetor de transferência de acordo com [15], onde o promo-tor de vertebrado é selecionado de qualquer um de um promotor de citome-galovírus, um promotor de SV40, um promotor de retrovírus, um promotor demetalotioneína, um promotor de proteína de choque térmico, um promotor deCAG, um promotor de fator de alongamento 1a, um promotor de actina, umpromotor de ubiquitina, um promotor de albumina e um promotor do MHC declasse II.
[18] O Vetor de transferência de acordo com qualquer um de [15]a [17], onde o promotor de baculovírus é selecionado de um promotor depoliedrina, um promotor de p10, um promotor de IE1, um promotor de p35,um promotor de p39 e um promotor de gp64.
[19] O vetor de transferência de acordo com qualquer um de [15]a [18], onde o gene estrangeiro imunogênico é selecionado de qualquer umde um antígeno da malária, um antígeno da influenza, um antígeno da M.tuberculosis, um antígeno do vírus SARS, um antígeno do vírus da febre doNilo Ocidental, um antígeno do vírus da febre do dengue, um antígeno deHIV, um antígeno de HCV, um antígeno da leishmania, um antígeno de tri-panossoma, um antígeno de Ieucocytozoon sozinho ou um antígeno de fu-são de um selecionado desse grupo de gene de antígeno com uma citocina.[20] O vetor de transferência de acordo com qualquer um de [15]a [19] que é qualquer um de pDual-Hsp65-gp64, pDual-PbCSP-gp64, pDual-H1N1/HA1-gp64, pDual-PbTRAMP-gp64, pDual-PbAMA1D123-gp64, pDual-PbMSPI 29, pDual-PfCSP-gp64, pDual-PfAMA1-gp64, pDual-Pfs25-gp64,pDual-H5N1/HA1-gp64, pDual-SARS/S-gp64, pCP-H1N1/HA1-gp64, pCAP-H1N1/HA1-gp64, pCU-H1N1/HA1-gp64, pDual-H1N1/NP-gp64, pDual-H1 N1/M2-gp64, pDual-H1N1/NAe-gp64, pDual-M2e-gp64, pCP-HA1/NC99-gp64, pCP-H1N1/HA0-gp64, pCP-H1N1/HA2-gp64, pCP-H1N1/HA1-vp39 epCP-H1 N1/NP-vp39.
[21] Um baculovírus recombinante produzido através do métodode produção do baculovírus recombinante de acordo com qualquer um de [8]a [13].
[22] O baculovírus recombinante de acordo com [21] que é qual-quer um de AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PbCSP, AcNPV-DuaI-Η1N1/HA1, AcNPV-Dual-PbTRAMP, AcNPV-DuaI-PbAMAI D123, AcNPV-DuaI-PbMSPI29, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-DuaI-PfAMAI, AcNPV-Dual-Pfs25,AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-HI N1/ HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-DuaI-HI N1/ NP, AcNPV-Dual-Hl N1/M2, AcNPV-DuaI-HI N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-HI N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 e AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39.
[23] Composição farmacêutica compreendendo o baculovírusrecombinante de acordo com [21] a [22].
[24] Composição farmacêutica de acordo com [23] compreen-dendo qualquer um de AcNPV-DuaI-HI N1/HA1, AcNPV-HI N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-DuaI-PfAMAI, AcNPV-DuaI-Pfs25, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-DuaI-HI N1/NP, AcNPV-DuaI-H1N1/M2, AcNPV-DuaI-HI N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-HI N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 e AcNPV-CP-HI N1/NP-vp39.
[25] Uma composição farmacêutica compreendendo o baculoví-rus recombinante de acordo com [21] ou [22], onde a composição é adminis-trada intramuscularmente, intranasalmente ou através de inalação.
[26] Uma vacina compreendendo qualquer um de AcNPV-DuaI-H1N1/HA1, AcNPV-HI N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-DuaI-PfCSP, AcNPV-DuaI-PfAMAI, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-CU-H1N1/HA1,AcNPV-DuaI-HI N1/NP, AcNPV-DuaI-HI N1/M2, AcNPV-DuaI-HI N1/NAe,AeNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 e AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39como um ingrediente ativo.
[27] A vacina de acordo com [26], onde a vacina é administradaintramuscularmente, intranasalmente ou através de inalação.
[28] Um agente terapêutico ou preventivo para infecção pelo ví-rus influenza compreendendo AcNPV-DuaI-HI N1/HA1, AcNPV-HI N1/HA1,AcNPV-CAP-HI N1/HA1, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-DuaI-PfAMAI,AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-DuaI-HIN1/NP, AcNPV-Dual-Hl N1/M2, AcNPV-DuaI-HI N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-HI N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39, AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39 como um ingrediente ativo.
[29] O agente terapêutico ou preventivo para infecção pelo vírusinfluenza de acordo com [28], onde o agente é administrado intramuscular-mente, intranasalmente ou através de inalação.
[30] Uma vacina para infecção pelo vírus influenza compreen-dendo qualquer um de AcNPV-DuaI-HIN1/HA1, AcNPV-HI N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-DuaI-PfAMAI, AcNPV-DuaI-Pfs25, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-DuaI-HIN1/NP, AcNPV-DuaI-HIN1/M2, AcNPV-DuaI-HI N1/NAel AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99,AcNPV-CP-HI N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AeNPV-CP-H1N1/HA1-vp39e AcNPV-CP-HI N1/NP-vp39 como um ingrediente ativo.
[31] A vacina para infecção pelo vírus influenza de acordo com[30], onde o agente é administrado intramuscularmente, intranasalmente ouatravés de inalação.
EFEITO DA INVENÇÃO
De acordo com a presente invenção, um novo vetor de transfe-rência recombinante, um baculovírus recombinante obtido através de re-combinação homóloga do vetor de transferência recombinante e um DNA debaculovírus e métodos para sua produção são providos. Agentes farmacêu-ticos compreendendo o baculovírus recombinante da presente invenção co-mo o ingrediente ativo são úteis como os fármacos terapêuticos ou preventi-vos para as doenças infecciosas tal como malária, influenza, tuberculose ehepatite, cânceres e doenças auto-imunes ou como medicina celular e for-mulações de vacina.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A figura 1 é uma vista mostrando efeito preventivo (título de in-fectividade do vírus) do baculovírus recombinante AcNPV-DuaI-Hl N1/HA1sobre infecção com vírus influenza;
a figura 2 é uma vista mostrando o efeito preventivo (período desobrevivência) do baculovírus recombinante AcNPV-DuaI-HI N1/HA1 sobreinfecção com vírus influenza;
a figura 3 são vistas mostrando análise Western blotting de ex-pressão de um produto de fusão em células de inseto infectada por baculoví-rus recombinante do gene HA do vírus influenza (H1N1/HA1), gene Hsp65de M. tuberculosis (Hsp65) ou o gene CSP do parasita da malária (PbCSP)produzido a partir do vetor de transferência.
Faixa 1: AcNPV-WT
Faixa 2: AcNPV-DuaI-HI N1/HA1
Faixa 3: AcNPV-WT
Faixa 4: AcNPV-Dual-Hsp65
Faixa 5: AcNPV-WT
Faixa 6: AcNPV-Dual-PbCSP;
a figura 4 é uma vista de tingimento marcado com fluorescênciaonde baculovírus recombinante produzido a partir de vetor de transferênciarecombinante em células de vertebrado expressou um produto de fusão dogene HSP65 de tuberculose e do gene de gp64;
(A): células HepG2 transduzidas com AcNPV-Dual-Hsp65;
(B): células HepG2 transduzidas com AcNPV-WT;a figura 5 é uma vista identificando através de imunoprecipitaçãoque o baculovírus recombinante produzido a partir do vetor de transferênciarecombinante nas células de animal de mamífero expressou uma proteínade fusão codificada por um gene de antígeno HA do vírus influenza e o genede gp64. Imunoprecipitação de células HepG2 introduzidas com baculovírusrecombinantes. Células HepG2 foram transduzidas com AnNPV-WT (faixa1), AcNPV-CMV-HA full (faixa 2) ou AcNPV-DuaI-HAIN (faixa 3). Em 3 horasapós transdução, as células foram radiorrotuladas com [35SJmetionina por 12horas. Lisatos de célula foram imunoprecipitados com soro de camundongosinfectados com vírus influenza H1N1;
a figura 6 é uma vista de análise Western blotting mostrando ex-pressão de fusão de um gene da CSP de parasita de malária e o gene dagp64 em partículas virais do baculovírus recombinante produzido a partir dovetor de transferência recombinante em células de inseto;
Faixa 1: AcNPV-WT
Faixa 2: AcNPV-CMV-PbCSP
Faixa 3: AcNPV-PbCSPsurf
Faixa 4: AcNPV-Dual-PbcSCP;
a figura 7 é uma vista mostrando resultados de RT-PCR identifi-cando que um baculovírus recombinante de antígeno HA1 obtido através detroca de um promotor de vertebrado expressou um produto de fusão de HA1e gp64 em células HeLa;
a figura 8 é uma vista mostrando produção de anticorpo IgG es-pecífico para antígeno PbCSP em soros de camundongos inoculados com obaculovírus recombinante;
a figura 9 é uma vista mostrando números de células produtorasde IFN-γ reativas a um epitopo de CTL de PbCSP em células de baço decamundongos inoculados com o baculovírus recombinante;
a figura 10 é uma vista mostrando efeitos preventivos (título deinfectividade de vírus) pelo baculovírus recombinante AcNPV-Dual-M2e so-bre infecção com vírus influenza;
a figura 11 é uma vista mostrando efeitos preventivos (título deinfectividade do vírus) pelo baculovírus recombinante AcNPV-DuaI-HaI/NC99 sobre infecção com vírus influenza;
a figura 12 é uma vista mostrando a produção de anticorpo IgGespecífico para vírus influenza em sangue, induzida pelo baculovírus recom-binante AcNPV-DuaI-HI N1/HA1 administrado através de quatro vias diferen-tes;
a figura 13 é uma vista mostrando a produção de anticorpo IgG eanticorpo IgA específicos para vírus influenza em lavagem nasal e lavagemalveolar, induzida pelo baculovírus recombinante AcNPV-DuaI-HI N1/HA1administrado através de quatro vias diferentes; e
a figura 14 é uma vista mostrando os efeitos preventivos (títulode infectividade de vírus) sobre vírus influenza na cavidade nasal pelo bacu-lovírus recombinante AcNPV-DuaI-HI N1/HA1 administrado através de qua-tro vias diferentes.
a figura 15 é uma vista mostrando os efeitos preventivos (títulode infectividade de vírus) sobre vírus influenza intrapulmonar pelo baculoví-rus recombinante AcNPV-DuaI-HI N1/H1 administrado através de quatro viasdiferentes.
MELHOR MODO DE REALIZAR A INVENÇÃO
Representação aqui por abreviações de aminoácidos, peptídios,seqüências de base e ácidos nucléicos está de acordo com IUPAC-IUBCommunication on Bioloaical Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138:9 (1984)definido pela IUPAC-IUB, "Guideline for preparing specifications comprisingbase sequences and amino acid sequences" (Patent Office) e notas geral-mente usadas na técnica.
Uma molécula de DNA aqui compreende não apenas DNA de fila-mento duplo, mas também DNA de filamento simples incluindo cadeias desentido e cadeias anti-sentido que os compõem, e não é limitado a um com-primento. Deste modo, o polinucleotídeo (molécula de DNA) codificando ogene estrangeiro imunogênico da presente invenção inclui o DNA de fila-mento duplo incluindo DNA genômico e o DNA de filamento simples (cadeiade sentido) incluindo cDNA e o DNA de filamento simples (cadeia de anti-sentido) tendo a seqüência complementar à cadeia de sentido e seus frag-mentos de DNA sintético a menos que de outro modo mencionado.
O polinucleotídeo ou a molécula de DNA aqui não é definido poruma região funcional, e pode incluir pelo menos um de uma região de su-pressão de expressão, uma região de codificação, uma seqüência líder, umexon e um íntron.
O polinucleotídeo também inclui RNA e DNA. O polipeptídiocomposto de certa seqüência de aminoácido e o polinucleotídeo compostoda certa seqüência de DNA incluem seus fragmentos homólogos, derivadose mutantes.
Os mutantes do polinucleotídeo, por exemplo, DNA mutante,incluem mutantes alélicos de ocorrência natural, mutantes de ocorrêncianão-natural e mutantes tendo deleção, substituição, adição e inserção. Mas,esses mutantes codificam o polipeptídio tendo substancialmente a mesmafunção que a função do polipeptídio codificado pelo polinucleotídeo antes damutação.
Na presente invenção, o vetor de transferência refere-se a umplasmídeo para produção do baculovírus recombinante, compreendendo aestrutura onde um gene de fusão ligando pelo menos um gene codificandouma proteína capaz de ser um componente de uma partícula viral a pelomenos um gene estrangeiro imunogênico foi incorporado a jusante de pro-motores duplos ligando dois promotores que são um promotor de vertebrado(promotor de mamífero, promotor de ave, promotor de peixe) e outro promo-tor de baculovírus.
Em uma da modalidade preferida da invenção, é preferível que ogene estrangeiro imunogênico esteja localizado a jusante dos promotoresduplos e a montante do gene codificando a proteína capaz de ser o compo-nente da partícula viral.
O baculovírus recombinante da presente invenção é usado paravertebrados como o ingrediente ativo dos agentes farmacêuticos ou vacinas.Como os vertebrados, mamíferos incluindo seres humanos, por exemplo,cavalos, suínos, ovelhas, cabras, macacos, camundongos, cachorros e ga-tos, aves tal como galinhas, codornas, gansos, marrecos, pombos, perus,pintados e papagaios, e peixes tal como caudas amarelas, caudas amarelasadultos, sea breams, arabaianas, "scads", "striped jacks", "striped pigfish",salmões, salmões do pacífico, carpas, carpas crucianas, trutas arco-íris, tru-tas brook e trutas amago podem ser exemplificados.
Em uma modalidade, a presente invenção provê o vetor detransferência compreendendo a nova estrutura onde o gene de fusão com-preendendo o gene codificando uma proteína de membrana viral expressá-vel na célula de inseto e um gene estrangeiro imunogênico foi incorporadosob o controle dos promotores duplos onde um promotor de vertebrado foiligado a outro promotor de baculovírus. Através da co-transfecção deste ve-tor de transferência junto com o DNA de baculovírus na célula de inseto parainduzir a recombinação homóloga, é possível se obter o baculovírus recom-binante onde o gene de fusão que está sob controle do promotor de baculo-vírus expressa na célula de inseto e pode produzir uma proteína de fusãocapaz de ser o componente da partícula viral que floresceu que foi incorpo-rada.
Na presente invenção, quando o baculovírus recombinante éadministrado a um vertebrado, a proteína de fusão da proteína capaz de sero componente da partícula viral que floresceu com a proteína imunogênicaprovavelmente funciona como uma vacina componente. O baculovírus re-combinante administrado ao vertebrado invade a célula do vertebrado, umantígeno de fusão com o antígeno estrangeiro imunogênico objeto do geno-ma viral é produzido na célula do vertebrado e funciona como uma vacina deDNA.
Deste modo, no caso do mamífero, através da administração dobaculovírus recombinante da presente invenção ao mamífero, a proteína defusão da proteína capaz de ser o componente da partícula viral com a prote-ína imunogênica é apresentada como o antígeno, a proteína de fusão daproteína capaz de ser o componente da partícula viral com a proteína imu-nogênica é produzida na célula do mamífero, e é pensada funcionar como oagente preventivo ou terapêutico para infecções com vírus, protozoários ebactérias devido à sua ação imunopotencial.
O DNA do baculovírus a ser co-transfectado com o vetor detransferência pode ser qualquer um de um tipo selvagem, um mutante e umDNA de baculovírus recombinante. Células-hospedeiro a serem co-trans-fectadas incluem, por exemplo, células do inseto tal como Spodoptera frugi-perda.
Na presente invenção, o gene codificando uma seqüência deaminoácido de uma proteína antigênica que é um imunógeno de imunotera-pia incluindo terapia de vacina para prevenção e tratamento de doenças in-fecciosas tal como malária, influenza e tuberculose, doença auto-imune ecânceres, por exemplo, o gene codificando a seqüência de aminoácido daproteína tal como antígeno de malária, antígeno do vírus influenza e antíge-no de M. tuberculosis é referido como o gene estrangeiro imunogênico.
Aqui, o gene "estrangeiro" significa o gene introduzido de fora,que corresponde ao gene "estrangeiro" mesmo se o mesmo gene estiverpresente na célula.
Na presente invenção, o gene codificando a seqüência de ami-noácido da proteína que é o imunógeno acima não é particularmente limita-do como o gene codificando a seqüência de aminoácido da proteína antigê-nica contanto que o gene seja o gene codificando a seqüência de aminoáci-do da proteína antigênica tendo a imunogenicidade contra uma substânciaque causa as doenças tal como doenças infecciosas, cânceres e doençasauto-imunes. Exemplos desses genes codificando a seqüência de aminoáci-do da proteína antigênica tendo a imunogenicidade incluem os que seguem.
Como o gene codificando a seqüência de aminoácido do antíge-no da malária, por exemplo, os genes codificando as seqüências de aminoá-cido das proteínas tal como uma CSP (Proteína Circumsporozoíta) de antí-geno de superfície de superfície esporozoíta de parasita da malária, MSP1(proteína 1 da superfície merozoíta) de uma proteína de membrana de su-perfície metrozoíta, um antígeno S da malária secretado de eritrócitos infec-tados com malária, proteína PfEMPI presente em botão do eritrócito infecta-do com malária, proteína SERA, proteína TRAMP e proteína AMA1 são e-xemplificados. Como o gene codificando a seqüência de aminoácido doantígeno de vírus influenza, os genes codificando as seqüências de aminoá-cido das proteínas tal como antígeno HA (antígeno hemaglutinina), antígenoNA (antígeno neuraminidase), antígeno M2 (antígeno de proteína de matriz)e antígeno NP (antígeno de nucleoproteína) podem ser exemplificados.
Como o gene codificando a seqüência de aminoácido da proteí-na antigênica para tuberculose, os genes codificando as seqüências de ami-noácido das proteínas tal como HSP65 (proteína de choque térmico de 65kDa), antígeno α (Antígeno85A, Antígeno85B, Antígeno85C), Mtb72f, MDP-1, ESAT-6, MPB51 m, Mtb8.8, Mtb9.9, Mtb32, Mtb39 e Mtbl 1.
Com relação aos genes de vertebrado, como os genes de mamí-fero, os genes codificando as seqüências de aminoácido das proteínas anti-gênicas das doenças infecciosas em seres humanos, gado, cavalos, suínos,ovelhas, macacos, camundongos, cachorros e gatos podem ser exemplifica-dos. Como os genes de ave, os genes de antígeno (por exemplo, antígeno Sda influenza de ave) das doenças infecciosas em galinhas, patos (dabblers),pombos, perus, pintados e papagaios podem ser exemplificados. Como osgenes de peixe, os genes de antígeno das doenças infecciosas em caudasamarelas, caudas amarelas adultos, "(sea breams)", arabianas, "scads","striped jacks", "stripped pigfish", salmões, salmões do pacífico, carpas, car-pas crucianas, trutas arco-íris, trutas brook e trutas amago são incluídos.
Genes de patógeno cuja associação com as doenças infeccio-sas nos mamíferos, aves e peixes acima foi relatada são facilmente disponí-veis das instituições onde dados públicos tal como GenBank registrando osgenes de patógeno foram armazenados.
Na presente invenção, para os genes estrangeiros imunogêni-cos, em adição aos antígenos imunes acima presentes fora do corpo huma-no, por exemplo, genes de citocina presentes dentro do corpo humano, porexemplo, um gene da IL-2, um gene da IL-6, um gene receptor da IL-6, umgene da IL-2, um gene da IL-8, um gene da IFN-γ e um gene da M-CSF, ougenes de fusão obtidos fundindo um dado antígeno tendo a imunogenicidadecom a proteína antigênica acima usando tecnologia de recombinação de ge-ne são também endereçados como os genes estrangeiros imunogênicos napresente invenção contanto que eles sejam introduzidos do exterior.
Na presente invenção, é possível prover o vetor de transferênciatendo esses genes estrangeiros imunogênicos e o baculovírus recorribinanteobtido através de recombinação homóloga dele, bem como prover umacomposição farmacêutica compreendendo o baculovírus recombinante tendoo gene estrangeiro como o ingrediente ativo e a formulação de vacina com-posta da composição farmacêutica.
O baculovírus usado para a presente invenção é um vírus depatógeno de inseto que causa a infecção no inseto e é um grupo (Baculoviri-daé) de vírus de DNA tendo um DNA de filamento duplo cíclico como o ge-ne. Dentre eles, um grupo dos vírus referidos como um vírus de poliedrosenuclear (NPV) faz uma inclusão referida como um poliedron em um núcleoem uma célula infectada na última fase da infecção. Mesmo se o gene es-trangeiro a ser expresso for inserido em lugar de um gene poliedron, o vírusinfecta, cresce e produz o produto de gene estrangeiro desejado em umagrande quantidade sem nenhum problema. Então, isto tem sido aplicado pra-ticamente para a produção da proteína desejada nos últimos anos.
Como o baculovírus usado para a presente invenção, Autogra-pha Californica Nuclear Polyhedorosis Virus: AcNPV, Bombyx mori NuclearPolyhedorosis Virus: BmNPV, Orgyia pseudotsugata, Nuclear PolyheterosisVirus: OpNPV e Lymantria disper Nuclear Polyhederosis Virus: LdNPV po-dem ser exemplificados.
O DNA do baculovírus pode ser qualquer DNA que possa reali-zar a recombinação homóloga com o vetor de transferência da presente in-venção. Especificamente, o gene viral do DNA de baculovírus que pode rea-lizar a recombinação homóloga com o vetor de transferência da presenteinvenção é 130 kpb que é grande, e o gene estrangeiro imunogênico de 15kpb ou mais pode ser inserido. O gene de baculovírus em si é dificilmenteexpresso nas células de vertebrado. Então, não há quase nenhuma necessi-dade de considerar sua citotoxidez, e, então, é imaginado que nenhuma res-posta imune prejudicial seja induzida.(1) Vetor de transferência e produção de vetor de transferência da presenteinvenção
Produção de DNA de aene estrangeiro imunoqênico
O DNA do gene estrangeiro imunogênico capaz de ser fundidoao gene viral, que é um dos componentes do vetor de transferência de bacu-lovírus pode ser facilmente produzido e adquirido através de sintetizaçãocom base em informação de seqüência de ácido nucléico do polinucleotídeocodificando a seqüência de aminoácido da proteína antigênica tendo a imu-nogenicidade objeto aqui descrita, ou diretamente sintetizando (método desíntese de DNA química) o DNA correspondendo à seqüência de ácido nu-cléico de uma região de codificação do gene estrangeiro imunogênico combase na informação de seqüência de ácido nucléico do gene estrangeiro i-munogênico. Técnicas de engenharia de gene gerais podem ser aplicadaspara esta produção (por exemplo, vide Molecular Cloning, 2- Ed., Cold S-pring Harbor Lab. Press (1989); Zoku Seikagaku Jikken Kouza, "IdenshiKenkyuho I, II, IN" editado pela Japanese Biochemistry Society, 1986).
Como os métodos de síntese do DNA, meios de síntese químicatal como método de triéster de fosfato e método amidita de fosfato (J. Am.Chem. Soc., 89, 4801(1967); ibid., 91, 3350 (1969); Science, 150,178(1968); Tetrahedron Lett., 22, 1859(1981); ibid.; 24, 245(1983)) e seus1 métodos de combinação podem ser exemplificados. Mais especificamente, oDNA pode ser também quimicamente sintetizado através de um método defosforamidita ou o método de triéster, e pode ser sintetizado usando um sin-tetizador de oligonucleotídeo automático comercialmente disponível. Umfragmento de filamento duplo pode ser obtido através da sintetização de umacadeia complementar e anelamento da cadeia complementar com um fila-mento simples quimicamente sintetizado sob uma condição apropriada ouadição da cadeia complementar com seqüências de iniciador apropriadas aofilamento simples quimicamente sintetizado usando uma polimerase deDNA.
Como específico um aspecto do DNA de gene estrangeiro imu-nogênico produzido na presente invenção, DNA composto da seqüência deDNA codificando a seqüência de aminoácido da proteína do antígeno de M.tuberculosis, a seqüência de DNA codificando a seqüência de aminoácido daproteína do antígeno da malária ou a seqüência de DNA codificando a se-qüência de aminoácido da proteína do antígeno do vírus influenza pode serexemplificado.
O DNA utilizado na presente invenção não é limitado à seqüên-cia de DNA de comprimento completo da seqüência de DNA codificando aseqüência de aminoácido do polipeptídio da proteína antigênica tendo imu-nogenicidade, e pode ser a seqüência de DNA codificando uma seqüênciaparcial contanto que a proteína da seqüência de aminoácido codificada pelaseqüência de DNA tenha imunogenicidade.
O DNA utilizado na presente invenção pode ser a seqüência deDNA obtida fundindo a seqüência de DNA codificando a seqüência de ami-noácido da proteína antigênica tendo a antigenicidade para o gene de citoci-na presente dentro do corpo humano, por exemplo, o gene da IL-2, o geneda IL-1, o gene da IL-6, o gene receptor da IL-6, o gene da IL-2, o gene daIL-8, o gene da IFN-α, o gene da IFN-β, o gene da IFN-γ, o gene da TNF, ogene da TGF-β, o gene da GM-CSF e o gene da M-CSF.
A seqüência de DNA fundida não é limitada ao comprimentocompleto da região de codificação da seqüência de DNA codificando a se-qüência de aminoácido do polipeptídio da proteína antigênica tendo a anti-genicidade e a seqüência de DNA do gene de citocina, e pode ser a seqüên-cia de DNA parcial.
O DNA do gene estrangeiro imunogênico usado para a presenteinvenção não é limitado à molécula de DNA tendo tal seqüência de DNA par-ticular, e pode também ter a seqüência de DNA obtida combinando e sele-cionando o códon ótimo para cada resíduo de aminoácido. A escolha do có-don pode ser realizada de acordo com métodos-padrão. Neste momento, porexemplo, é possível considerar uma freqüência de uso do códon no hospe-deiro utilizado (Nucleic Acids Res., 9, 43 (1981)).
O método de produção do DNA do gene estrangeiro imunogêni-co usado para a presente invenção através de técnicas de engenharia degene pode ser mais especificamente realizado preparando biblioteca de cD-NA a partir de uma origem apropriada que expressa o DNA do gene estran-geiro imunogênico de acordo com métodos-padrão e selecionando o clonedesejado da biblioteca usando uma sonda ou um anticorpo apropriado con-tra um produto expresso que é inerente ao gene estrangeiro imunogênico(vide Proc. NatL Acad. Sci., USA, 78, 6613 (1981); Science, 222, 778(1983)).
Acima, como a origem do DNA genômico, várias células, tecidose células culturadas derivadas deles que expressam o DNA do gene estran-geiro imunogênico podem ser exemplificados. Em particular, é preferível u-sar o extrato dos eritrócitos infectados com parasitas da malária, o extrato dacélula infectada com vírus influenza ou o extrato de M. tuberculosis como aorigem. A extração e separação de DNA e RNA totais da origem, a separa-ção e purificação de mRNA e a aquisição e clonagem de cDNA podem serrealizadas de acordo com os métodos-padrão.
A produção do DNA do gene estrangeiro imunogênico pode sertambém realizada extraindo mRNA de cada imunógeno, então adicionandopoli A ao RNA, coletando o RNA adicionado com poli A, produzindo cDNAusando uma transcriptase reversa, adicionando sítios de enzima de restriçãoa ambas as extremidades do cDNA e usando uma biblioteca de fago prepa-rada incorporando o cDNA ao fago, em adição à obtenção usando bibliotecade cDNA de cada imunógeno obtido através da extração, separação e purifi-cação de mRNA do tecido ou célula imunogênico usando o extrato como aorigem.
O método de avaliação do DNA do gene estrangeiro imunogêni-co da biblioteca de cDNA não é particularmente limitado, e pode ser realiza-do de acordo com métodos comuns. Como o método específico, por exem-plo, o método de seleção de um clone de cDNA correspondente através deavaliação imunológica usando um anticorpo específico (por exemplo, anti-corpo antimalária, anticorpo do vírus antiinfluenza, anticorpo anti-M tubercu-losis) contra a proteína produzida pelo cDNA; um método de hibridização emplaca usando uma sonda seletivamente se ligando à seqüência de DNA ob-jeto; um método de hibridização de colônia; e as suas combinações podemser exemplificados.
Como a sonda usada nos métodos de hibridização, fragmentosde DNA quimicàmente sintetizado com base na informação para a seqüênciade DNA do gene estrangeiro imunogênico são comuns. O gene estrangeiroimunogênico já adquirido e as seqüências de DNA de seus fragmentos po-dem ser vantajosamente utilizados como a sonda acima. Ainda, um iniciadorde sentido e um iniciador de anti-sentido criados com base na informação daseqüência de DNA do gene estrangeiro imunogênico podem ser tambémusados como a sonda para a avaliação acima.
O DNA (nucleotídeos) usado como a sonda é o DNA parcial (nu-cleotídeos) correspondendo à seqüência de DNA do gene estrangeiro imu-nogênico, e um tendo pelo menos 15 DNA consecutivos, de preferência 20DNA consecutivos e com mais preferência pelo menos 30 DNA consecuti-vos. Um próprio clone positivo para produção do DNA acima pode ser tam-bém usado como a sonda.
Quando o DNA do gene estrangeiro imunogênico é adquirido,um método de amplificação de DNA/RNA através de PCR (Science, 230,1350 (1985)) pode ser utilizado adequadamente. Em particular, quando umcDNA de comprimento completo é dificilmente obtido a partir da biblioteca,método RACE [fíapid amplification of cDNA ends; Jikken Igaku 12(6), 35(1994)], em particular, método 5' RACE [M.A. Frohman e outros, Proc. NatiAcad. Sci., USA, 8, 8998 (1988)] é adequadamente empregado.
O iniciador usado para a PCR pode ser criado com base na in-formação de seqüência de DNA do gene estrangeiro imunogênico, e sinteti-zado de acordo com os métodos-padrão. Como este iniciador, conformemostrado nos Exemplos descritos mais tarde, porções de DNA (iniciador pro-motor SP6 e iniciador terminador T7) adicionadas a ambas as extremidadesdo plasmídeo vetor onde o DNA do gene estrangeiro imunogênico foi incor-porado podem ser também usadas.
O isolamento/purificação do fragmento de DNA/RNA amplificadoatravés de PCR pode ser realizado de acordo com os métodos-padrão, porexemplo, eletroforese em gel.
Para o DNA do gene estrangeiro imunogênico obtido como aci-ma ou vários fragmentos de DNA1 suas seqüências de DNA podem ser de-terminadas de acordo com os métodos-padrão, por exemplo, método dide-sóxi (Proc. Nati Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)) ou método Maxam-Gilbert(Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)) ou simplesmente usando um kit deseqüenciamento comercialmente disponível.
O gene codificando os aminoácidos da proteína capaz de ser ocomponente das partículas virais pode ser qualquer um contanto que eleseja o gene codificando a proteína expressável como a proteína capaz déser o componente da partícula viral na célula de inseto e como a proteína defusão através da fusão do gene estrangeiro imunogênico na céluía objeto.
Gomo o gene codificando os aminoácidos da proteína capaz deser o componente da partícula viral, por exemplo, os genes de uma proteínagp64 (No. de Acesso no GenBank L22858), uma glicoproteína do vírus daestomatite vesicular (No. de Acesso no GenBank M21416), uma glicoproteí-na do vírus herpes simplex (KOS; (No. de Acesso no GenBank K01760),gp120 do vírus da imunodeficiência humana tipo I (No. de Acesso no Gen-Bank U47783), uma glicoproteína da membrana do vírus sincicial respiratóriohumano (No. de Acesso no GenBank M86651), uma proteína hemaglutininado vírus influenza tipo A (No. de Acesso no GenBank U38242) ou o genedas proteínas envelope de vírus intimamente relacionados com o baculoví-rus podem ser exemplificados. Na presente invenção, o gene de gp64 mos-trado nos Exemplos descritos mais tarde pode ser de preferência exemplifi-cado.
O DNA do gene codificando os aminoácidos da proteína capazde ser o componente da partícula viral pode ser facilmente produzido e ad-quirido através de sintetização com base na informação de seqüência deácido nucléico do polinucleotídeo codificando a seqüência de aminoácido dopolipeptídio do gene codificando os aminoácidos da proteína objeto capaz deser o componente da partícula viral, ou diretamente sintetizando o DNA cor-respondendo à seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de ami-noácido com base na informação de seqüência de aminoácido do gene codi-ficando os aminoácidos da proteína capaz de ser o componente da partículaviral (síntese de DNA química) como é o caso com a produção do DNA dogene estrangeiro imunogênico.
Uma seqüência de DNA correspondendo a uma seqüência deácido nucléico codificando aminoácidos de uma proteína capaz de ser umcomponente de uma partícula viral não é limitada a um comprimento comple-to de uma região de codificação, e pode ser um DNA composto de uma se-qüência de DNA parcial.
Como é o caso com a produção da molécula de DNA do geneestrangeiro imunogênico, o DNA do gene codificando os aminoácidos daproteína capaz de ser o componente da partícula viral pode ser produzidoatravés de técnicas de engenharia de gene gerais (por exemplo, vide Mole-cular Cloning, Tr Ed., Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); Zoku SeikagakuJikken Kouza, "ldenshi Kenkyuho I, II, III" editado pela Japanese Biochemis-try Society, 1986).
Na presente invenção, o plasmídeo vetor comercialmente dispo-nível onde uma parte do promotor que controla a expressão do gene estran-geiro imunogênico descrito mais tarde já foi incorporada e o gene (porção)codificando os aminoácidos da proteína capaz de ser o componente da par-tícula viral foi previamente introduzido pode ser também usado.
Promotores de Vertebrado
Como o promotor de vertebrado (capaz de funcionar em verte-brados) que é um dos componentes do vetor de transferência usado para apresente invenção, os promotores tal como promotores de mamífero, promo-tores de ave e promotores de peixe podem ser exemplificados.
Promotores de Mamífero
Como o promotor de mamífero (capaz de funcionar em mamífe-ros) que é um dos componentes do vetor de transferência usado para a pre-sente invenção, um promotor de citomegalovírus, um promotor de SV40, umpromotor de retrovírus, um promotor de metalotioneína, um promotor de pro-teína de choque térmico, um promotor de CAG, um promotor de fator de a-Iongamento 1α, um promotor de actina, um promotor de ubiquitina, um pro-motor de albumina e um promotor da MHC de classe Il podem ser exemplifi-cados.
Promotores de Ave
Como os promotores de ave, o promotor da actina, o promotorda proteína de choque térmico, o promotor do fator de alongamento, o pro-motor da ubiquitina e o promotor da albumina podem ser exemplificados.Promotores de Peixe
Como os promotores de peixe, o promotor da actina, o promotorda proteína de choque térmico e o promotor de fator de alongamento podemser exemplificados.
Promotores de baculovírus
Gomo o promotor do baculovírus que é um dos componentes deum vetor de transferência de baculovírus usado para a presente invenção,um promotor da poliedrina, um promotor da p10, um promotor da IBI, umpromotor da p35, um promotor da p39 e um promotor da gp64 podem serexemplificados.
Produção de vetor de transferência recombinante
A presente invenção refere-se ao novo vetor de transferênciatendo a estrutura capaz de expressar o gene estrangeiro imunogênico objetocomo a proteína antigênica em ambas as célula de inseto e célula de verte-brado, particularmente a célula de mamífero. Na presente invenção, a estru-tura do novo vetor de transferência produzido é caracterizada pelo fato deque a seqüência de DNA codificando a seqüência de aminoácido da proteínaimunogênica desejada e a seqüência de DNA codificando a seqüência deaminoácido da proteína capaz de ser o componente da partícula viral sãoligadas a jusante dos promotores ligados que são um promotor de vertebra-do, particularmente o promotor de mamífero e outro promotor de baculoví-rus. Regiões de DNA compreendendo as seqüências dê DNA dos dois pro-motores que são um promotor de vertebrado, particularmente o promotor demamífero e outro promotor de baculovírus podem ser diretamente ligadas,ou uma seqüência de DNA interveniente pode estar presente entre as se-qüências de DNA dos dois promotores (mas, neste caso, promotores respec-tivos são necessários ter a atividade na célula de inseto e célula de verte-brado, particularmente célula de mamífero). Ou o promotor de vertebrado,particularmente o promotor de mamífero, ou o promotor de baculovírus a serligado pode ser disposto mais proximamente do gene a ser expresso em suaregião de promotor. Em exemplos descritos mais tarde, o baculovírus é dis-posto mais proximamente do gene a ser expresso do que o promotor demamífero.
Na estrutura, para o gene de fusão compreendendo o gene codi-ficando a proteína capaz de ser o componente da partícula viral e o geneestrangeiro imunogênico desejado, esses dois genes podem ser diretamentealinhados, ou a seqüência de DNA interveniente pode estar presente entreeles (mas, é necessário dispor o DNA para não causar nenhum frameshiff).É preferível que um antígeno apresentando região da proteína codificadapelo gene estrangeiro tendo a imunogenicidade desejada seja fundido à pro-teína capaz de ser o componente da partícula viral. Então, é necessário usarna forma fundida sem corte a proteína codificada pelo gene estrangeiro ten-do a imunogenicidade desejada da proteína capaz de ser o componente dapartícula viral.
Um gene de fusão compreendendo esses dois genes pode serformado previamente e este pode ser incorporado ao vetor. Alternativamen-te, qualquer gene pode ser incorporado ao vetor previamente, e subseqüen-temente o outro gene pode ser incorporado ao vetor para formar o gene defusão no vetor.
Para as manipulações acima, vetores de expressão comercial-mente disponíveis já tendo as regiões de promotor do promotor de vertebra-do acima, particularmente o promotor de mamífero e o promotor de baculoví-rus e as regiões de gene codificando a seqüência de aminoácido capaz deser o componente da partícula viral, que são porções dá constituição reque-rida como o vetor de transferência da presente invenção, podem ser usados.Utilizando-os, os componentes requeridos podem ser inseridos através dainserção da seqüência de DNA onde o gene estrangeiro imunogênico dese-jado foi fundido ao gene codificando a seqüência de aminoácido da proteínacapaz de ser o componente da partícula viral na região de clonagem do ve-tor opcionalmente cortando com enzimas de restrição ou incorporando emoutro vetor, ou inserindo o gene estrangeiro imunogênico desejado no ladoterminal N da região de DNA do gene codificando a seqüência de aminoáci-do da proteína capaz de ser o componente da partícula viral já incorporadano plasmídeo.
Para a detecção da proteína, um His-tag ou um HSV-tag podeser adicionado antes de um filamento poli A em um lado do terminal C daseqüência de DNA fundindo o gene estrangeiro imunogênico desejado aogene codificando a seqüência de aminoácido da proteína capaz de ser ocomponente da partícula viral. Alternativamente, para a expressão, a purifi-cação e a detecção da proteína de fusão recombinante, a seqüência de DNAcodificando uma seqüência FLAG composta de 8 aminoácidos pode ser in-serida como um tag de peptídio entre a região de promotor e a região onde ogene estrangeiro imunogênico desejado foi fundido ao gene codificando aseqüência de aminoácido da proteína capaz de ser o componente da partí-cula viral. Na presente invenção, o vetor plasmídeo tendo a estrutura capazde expressar a proteína estrangeira imunogênica desejada como a proteínaantigênica em ambas a célula de inseto e a célula de vertebrado, particular-mente a célula de mamífero, pode ser produzido usando o plasmídeo co-mercialmente disponível tendo a estrutura já satisfazendo a sua porção. Aseqüência de aminoácido do peptídio pode intervir para clivagem da proteínade fusão com a enzima na célula de vertebrado. No vetor de transferência dapresente invenção, um aumentador para aumentar uma atividade de trans-crição na célula de vertebrado, particularmente a célula de mamífero, podeser disposto a montante dos dois promotores, ou a seqüência de DNA codifi-cando a seqüência de aminoácido de um peptídio de sinal para facilitação dasecreção extracelular da proteína expressa no hospedeiro pode ser ligadaao gene a ser fundido e expresso. Uma região terminadora de vertebrado,por exemplo, um terminador de β globulina de coelho, que é eficaz na célulade vertebrado, pode ser disposta para terminação da transcrição a jusantedo gene a ser fundido e expresso.
Como acima, o vetor de transferência capaz de expressar o ge-ne de fusão do gene estrangeiro imunogênico capaz de expressar a imuno-genicidade desejada na partícula de baculovírus e o gene codificando a se-qüência de aminoácido da proteína capaz de ser o componente da partículaviral pode ser produzido.
Para exemplos específicos do vetor de transferência e o métodopara sua produção, conforme mostrado nos Exemplos descritos mais tarde,o vetor de transferência composto da estrutura onde o promotor de citome-galovírus (CMV)1 o promotor de CAG modificado do promotor de CMV, e opromotor de ubiquitina (UBB) fundido a aumentador de CMV como o promo-tor de vertebrado, particularmente o promotor de mamífero e promotor depoliedrina (PoIh) como o promotor de baculovírus foram ligados e a seqüên-cia de DNA onde o gene do antígeno do vírus influenza, o gene de antígenoda malária e o gene do antígeno de M. tuberculosis como os genes estran-geiros e o antígeno do gene de gp64 como o gene codificando a seqüênciade aminoácido da proteína capaz de ser o componente da partícula viral fo-ram fundidos que foi incorporado pode ser exemplificado como pDual-Hsp65-gp64, pDual-PbCSP-gp64, pDual-H1 N1/HA1-gp64, pDual-PbTRAMP-gp64, pDual-PbAMA1D123-gp64, pDual-PbMSP129-gp64, pDual-PfCSP-gp64, pDual-PfAMA1 -gp64, pDual-Pfs25-gp64, pDual-H5N1/HA1-gp64 andpDual-SARS/S-gp64, pCP-H1 N1/HA1-gp64, pCAP-H1N1/HA1-gp64, pCU-H1N1/HA1-gp64, pDual-H1N1/NP-gp64, pDual-HlNl/M2-gp64, pDual-H1N1/NAe-gp64, pDual-M2e-gp64, pCP-HA1/NC99-gp64, pCP-H1N1/HA0-gp64, pCP-H1N1/HA2-gp64, pCP-H1N1/HA1-vp39, pCP-H1N1/NP-vp39.(2) Produção de baculovírus recombinante
A presente invenção provê o método de produção do baculoví-rus recombinante compreendendo as etapas de produção do vetor de trans-ferência composto da estrutura onde gene de fusão compreendendo pelomenos um gene codificando a proteína capaz de ser o componente da partí-cula viral e pelo menos um gene estrangeiro imunogênico ligado a jusantedos promotores duplos ligando um promotor de vertebrado e outro promotorde baculovírus que foi incorporado, co-transfecção do vetor de transferênciae do DNA do baculovírus na célula hospedeiro e separação do baculovírusrecombinante.
No método acima de produção do baculovírus recombinante, osmétodos de introdução do DNA recombinante desejado (vetor de transferên-cia) no hospedeiro e métodos de transformação com este não são particu-larmente limitados, vários métodos que são bem-conhecidos e geralmenteusados podem ser empregados, e, por exemplo, podem ser realizados deacordo com a tecnologia de recombinação de gene comum (por exemplo,Science, 224, 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692(1985); Proc. Nati Acad. Sei. USA, 5990 (1983). O DNA recombinante (vetorde transferência) pode ser expresso e produzido com referência a Ohno eoutros, "Tanpakü Jikken Protocol 1 Functional analysis, Saibo Kogaku Bes-satu Jikken Protocol Series, 1997, Shujunsha". Para técnicas gerais de ma-nuseamento das células de inseto, recombinação e co-transfecção de gene,as mesmas técnicas que nos métodos bem-conhecidos de fabricação devírus recombinantes em células de inseto podem ser usadas (Zenji Matsuu-ra, Proteins, Nucleic acids and Enzymes, 37:211-222, 1992; Zenji Matsuura,Saibo 33(2):30-34, 2001).
O baculovírus recombinante resultante pode ser culturado deacordo com os métodos-padrão. Através da cultura, um produto de fusão(produto expresso) onde o DNA do gene estrangeiro imunogênico e o DNAcodificando a seqüência de aminoácido da proteína capaz de ser o compo-nente da partícula viral da presente invenção foram fundidos designado con-forme desejado é expresso, produzido (acumulado) e secretado dentro, foradas células ou sobre a membrana celular.
Como um meio usado para a cultura, vários meios geralmenteusados podem ser apropriadamente selecionados e usados dependendo dascélulas hospedeiro empregadas, e a cultura pode ser realizada sob a condi-ção adequada para crescimento das células hospedeiro.
O método de produção do baculovírus recombinante mais parti-cularmente compreende as etapas de preparação do DNA de baculovíruspara realização da recombinação homóloga com o vetor de transferênciaproduzido acima e co-transfecção do vetor de transferência e do DNA debaculovírus nas células de inseto tal como células Sf-9, células Sf-21 deriva-das de Spodoptera frugiperda, células Tn (células High Five fornecidas daInvitrogen) derivadas de Trichoplusia ni como as células hospedeiro.
O DNA do baculovírus produzido acima para realização da re-combinação homóloga com o vetor de transferência pode ser qualquer umde DNA do tipo selvagem, do mutante ou do baculovírus recombinante.
Um DNA do baculovírus pode aumentar a probabilidade de re-combinação homóloga contanto que ele tenha a estrutura do DNA homólogaao DNA derivado do DNA de baculovírus localizado a montante dos promo-tores duplos usados para o vetor de transferência de modo a produzir a re-combinação homóloga com o vetor de transferência da presente invenção,exceto pelo DNA derivado de um baculovírus que envolve um gene de fusão
DNA no qual na região de promotor duplo, o gene estrangeiro imunogênico eo gene codificando a proteína capaz de ser o componente da partícula viralforam fundidos.
Para induzir a recombinação homóloga, é melhor que o vetor detransferência e DNA do baculovírus sejam misturados em uma razão empeso de cerca de 1:1 a 10:1.
Após introdução na célula de inseto simultaneamente através daetapa de co-transfecção e cultura da célula, placas do vírus são feitas a par-tir do sobrenadante da cultura, então suspensas no meio, subseqüentemen-te o vírus é eluído do ágar através de vórtex para dar uma solução compre-endendo o vírus recombinante.
Acima, o DNA de baculovírus comercialmente disponível podeser usado e, por exemplo, é possível usar DNA BacVector 1000 e DNA Bac-Vector-2000 (fornecidos da Novagen) onde o gene de poliedrina foi removidodo AcNPV.
A co-transfecção do vetor de transferência e do DNA de baculo-vírus obtido acima na célula de inseto para a recombinação homóloga podeser realizada usando o Mde transfecção de vetor comercialmente disponíveldescrito acima (BacVector Transfection Kits fornecidos da Novagen) de a-cordo com instruções anexas ao kit de transfecção de vetor. Como acima, ovetor de transferência produzido acima pode ser co-transfeetado junto com oDNA de baculovírus na célula de inseto tal como células Sf-9 para dar o ba-culovírus recombinante.
Na presente invenção, de acordo com o método acima de pro-dução do baculovírus recombinante, os vetores de transferência tal comopDual-Hsp65-gp64, pDual-PbCSP-gp64, pDual-H1N1/HA1-gp64, pDual-PbTRAMP-gp64, pDual-PbAMA1D123-gp64, pDual-PbMSP129-gp64, pDu-al-PfCSP-gp64, pDual-PfAMA1-gp64, pDual-Pfs25-gp64, pDual-H5N1/HA1-gp64, pDual-SARS/S-gp64, pCP-H1N1/HA1-gp64, pCAP-H1N1/HA1-gp64,pCU-H1 N1/HA1 -gp64, pDual-H1N1/NP-gp64, pDual-H1N1/M2-gp64, pDual-H1N1/NAe-gp64, pDual-M2e-gp64, pCP-HA1/NC99-gp64, pCP-H1N1/HA0-gp64, pCP-H1 N1/HA2-gp64, pCP-H1N1/HA1-vp39, pCP-H1N1/NP-vp39 e oDNA de baculovírus foram usados e co-transfectados na célula de inseto Sf-9 para dar os baculovírus recombinantes tal como AcNPV-Dual-Hsp65,AcNPV-Dual-PbCSP, AcNPV-DuaI-HI N1/HA1, AcNPV-DuaI-PbTRAMP,AcNPV-DuaI-PbAMAI D123, AcNPV-Dual-PbMSP129, AcNPV-Dual-PfCSP,AcNPV-DuaI-PfAMAI, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-HI N1/HA1, AeNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-DuaI-HI N1/NP, AcNPV-DuaI-H1N1/M2, AcNPV-DuaI-HI N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HAI/NC99, AcNPV-CP-HI N1/HA0, AcNPV-CP-HI N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39, AcNPV-CP-HI N1/NP-vp39.
Também, os baculovírus recombinantes tal como AcNPV-DuaI-H5N1/Ha1 e AcNPV-Dual-SARS/S podem ser obtidos.
Em adição ao método acima de produção do baculovírus recom-binante, como o outro método de produção do baculovírus recombinante, épossível usar o método de inserção do gene estrangeiro eficientemente emEscherichia coli através da utilização de um transposon para um fagemídeo(bacmídeo) onde o genoma do baculovírus inteiro foi incorporado. De acordocom o método, o baculovírus recombinante pode ser facilmente produzido ecoletado através apenas da extração do bacmídeo carregando o gene viralde células microbianas e transferindo-o para a célula de inseto.
A purificação do baculovírus recombinante da presente invençãoobtido através do método acima de produção do baculovírus recombinantepode ser realizada usando o método de purificação de vírus conhecido pu-blicamente.
Para a purificação do baculovírus recombinante, por exemplo,0,5 a 1,0 mL do estoque viral (geralmente 1 χ 107"8 pfu/mL) obtido através dométodo acima de produção do baculovírus recombinante é inoculado para ascélulas de inseto (1 χ "IO7 células/placa de 10 cm) tal como células Sf-9, osobrenadante da cultura é coletado vários dias (4 dias) após a infecção, eum pélete viral obtido através da centrifugação é suspenso em tampão talcomo PBS. A suspensão resultante é aplicada em gradiente de sacarose de10 a 60%, que é então centrifugado (25.000 rpm, 60 minutos, 4°C) para cole-tar uma faixa de vírus. O vírus coletado é suspenso adicionalmente em PBS,subseqüentemente centrifugado (mesma condição que acima) e o pélete devírus recombinante purificado resultante é armazenado no tampão tal comoPBS a 4°C.
Um título de infectividade do vírus recombinante purificado resul-tante acima pode ser medido através de ensaio em placa (Fields VlROLOGYA- Edição, pg. 29-32, 2001) usando as células de inseto tal como células Sf-9.
No vírus recombinante exemplificado na presente invenção, oterminal N da proteína de baculovírus gp64 é exposto fora da partícula e seuterminal C é exposto dentro da partícula. Então, se a proteína codificada pe-lo gene estrangeiro imunogênico desejado for fundida ao terminal N da gp64,a sua entidade como o componente da partícula viral é exposto fora da par-tícula de proteína viral na célula de inseto, e então o antígeno é mais facil-mente apresentado, que é adequado para o objeto da formulação de vacinada presente invenção.
(3) Composição farmacêutica da presente invenção(agente farmacêutico compreendendo baculovírus recombinanteda presente invenção como ingrediente ativo)O baculovírus da presente invenção que é o ingrediente ativo nacomposição farmacêutica da presente invenção pode ser obtido através detécnicas de engenharia de gene mostradas em (2) acima.
É importante que a composição farmacêutica da presente inven-ção contenha como o ingrediente ativo o baculovírus recombinante obtidoatravés de recombinação homóloga do DNA de baculovírus e do vetor detransferência construído de modo que o gene de fusão fundido o gene es-trangeiro imunogênico da presente invenção ao gene codificando a seqüên-cia de aminoácido da proteína capaz de ser o componente da partícula viralpossa ser expresso nas células de inseto e nas células de vertebrado, parti-cularmente células de mamíferos incluindo ser humano.
Em particular, a presente invenção provê a composição farma-cêutica compreendendo qualquer um dos baculovírus recombinantes particu-lares, tal como AcNPV-DuaI-HIN1/HA1 , AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-DuaI-PfCSP1 AcNPV-DuaI-PfAMAI, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1,AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-HI N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-DuaI-HI N1/NP, AcNPV-DuaI-HI N1/M2, AcNPV-Dual-Hl N1/NAe, AeNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-HI N1/HA1-vp39 ou AcNPV-CP-H1 N1/NP-vp39 como o ingrediente ativo.
O baculovírus recombinante da presente invenção, tal comoAcNPV-DuaI-HI N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-DuaI-PfAMAI, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-DuaI-SARS/S, AcNPV-HI N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-HI N1/HA1, AcNPV-DuaI-HI N1/NP, AcNPV-DuaI-HI N1/M2, AcNPV-DuaI-HI N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0,AcNPV-CP-HI N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 e AcNPV-CP-HI N1/NP-vp39, que é o ingrediente ativo na composição farmacêutica da presenteinvenção, tem as ações que aumentam um efeito de prevenção de infecçãosobre o antígeno infeccioso e reduz o título de infectividade, e esta ação ouatividade pode ser utilizada para procedimentos das doenças associadascom a infecção das células-alvo ou tecido. Tais células-alvo afetadas pelainfecção incluem, por exemplo, células sangüíneas, e outras células-alvoincluem células hépáticas, células renais, células cerebrais, células pulmona-res, células epiteliais e células musculares. Os tecidos compreendendo es-sas células incluem pulmão, fígado, rim, veias arteriais e venosas, estôma-go, intestino, uretra, pele e músculo.
A composição farmacêutica aumenta o efeito de prevenção deinfecção sobre antígenos infecciosos tal como antígenos da malária, por e-xemplo, o antígeno de superfície CSP da superfície esporozoíta de parasitada malária, a MSP1 da proteína da membrana de superfície metrozoíta, oantígeno S da malária secretado de eritrócitos infectados com malária, a pro-teína PfEMPI presente no nó dos eritrócitos infectados com malária, a prote-ína SERA, a proteína TRAM e a proteína AMA1 bem como antígenos da in-fluenza, por exemplo, o antígeno HA, o antígeno NA, o antígeno M2 e o an-tígeno NP, e reduz o título de infectividade (por exemplo, título de infectivi-dade viral). Então, período de sobrevivência e taxa de sobrevivência dosanimais incluindo seres humanos administrados com a composição farma-cêutica da presente invenção são aumentados comparado com aqueles nãoadministrados. Deste modo, a composição farmacêutica da presente inven-ção é útil como o agente preventivo ou terapêutico para infecção com parti-cularmente vírus da malária e influenza.
A composição farmacêutica da presente invenção é útil como oagente preventivo ou terapêutico para doenças infecciosas causadas pelopatógeno e suas complicações, por exemplo, doenças virais causadas pelovírus influenza, papiloma vírus, herpes vírus, vírus da AIDS, vírus da hepatiteC, vírus SARS, vírus da Febre do Nilo ocidental e vírus da febre do dengue,doenças parasitas causadas por malária, parasitas tripanossoma e Ieishma-nia e doenças bacterianas causadas por bactérias, tal como desinteria, febreentérica, cólera, pneumococcus, MRSA, VRE1 Neisseria gonorrhoeae e C-hlamydia, sífilis e tuberculose utilizando as ações para aumentar o efeitopreventivo de infecção sobre o antígeno infeccioso e reduzir o título de infec-tividade.
Usando o gene estrangeiro imunogênico para o vertebrado quenão o ser humano no vetor de transferência para obtenção do baculovírusrecombinante que é o ingrediente ativo na composição farmacêutica da pre-sente invenção, é possível utilizar a composição farmacêutica da presenteinvenção para procedimentos das doenças associadas com a infecção dascélulas-alvo e dos tecidos como vacina para influenza da galinha, vacinapara tripanossoma bovino e vacina para a doença da água fria da truta Ja-ponesa utilizando suas ações para aumentar o efeito de prevenção de infec-ção sobre o antígeno infeccioso e reduzir o título de infectividade.
A composição farmacêutica da presente invenção pode ser pre-parada como a composição compreendendo a quantidade farmaceuticamen-te ativa do baculovírus recombinante e um veículo farmaceuticamente acei-tável.
Para o efeito de prevenção de infecção do baculovírus recombi-nante da presente invenção no vertebrado, particularmente, os mamíferosincluindo o ser humano ou nas células de mamífero, por exemplo, a compo-sição farmacêutica produzida pelo baculovírus recombinante da presenteinvenção e a composição capaz de ser adicionada para administração far-macêutica são administradas intramuscularmente, intranasalmente ou atra-vés de inalação no vertebrado, particularmente, o mamífero incluindo o serhumano, que é subseqüentemente imunizado com a composição farmacêu-tica compreendendo o baculovírus recombinante da presente invenção comoo ingrediente ativo múltiplas vezes. A composição farmacêutica da invençãoé administrada particularmente através de inalação.
Ε, o efeito preventivo sobre a infecção pode ser avaliado apósimunização com a composição farmacêutica da presente invenção múltiplasvezes, administrando o patógeno a ser sujeitado ao vertebrado, particular-mente, o mamífero incluindo o ser humano, e após passagem de um certoperíodo, comparando a taxa de sobrevivência dos vertebrados, particular-mente, os mamíferos incluindo os seres humanos administrados com o ba-culovírus recombinante que é o ingrediente ativo na composição farmacêuti-ca da presente invenção com aqueles não administrados com ele.
(4) Vacina da presente invençãoO baculovírus recombinante, tal como AcNPV-DuaI-HI N1/HA1,AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-DuaI-PfAMAI, AcNPV-Dual-Pfs25, AeNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-HI N1/HA1, AeNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-DuaI-H1N1/NP, AcNPV-DuaI-HI N1/M2, AcNPV-DuaI-HI N1/NAe, AcNPV-DuaI-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AeNPV-CP-H1N1/HA0, AcN PV-C P-H1N1/HA2,AeNPV-CP-H1N1 /HA1 -vp39 ou AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39 que é o ingredi-ente ativo da composição farmacêutica da presente invenção é purificadocomo a partícula viral florescida da célula de inseto, compreendendo umproduto expresso da fusão da seqüência de DNA fundindo o gene codifican-do a seqüência de aminoácido da proteína capaz de ser o componente dapartícula viral ao gene estrangeiro imunogênico da presente invenção tendoa imunogenicidade desejada para aumentar o efeito preventivo sobre a in-fecção com o patógeno e exibe a ação para reduzir o título de infectividade.Então, é pensado que a proteína de antígeno estrangeiro que se torna ocomponente da partícula viral facilite a imunidade adquirida (imunidade hu-moral e imunidade celular) através da administração da composição farma-cêutica na forma da partícula viral ao vertebrado, particularmente, os mamí-feros incluindo o ser humano, e ainda a proteína antigênica que é o produtoexpresso da fusão da seqüência de DNA facilita mais a imunidade adquirida(imunidade humoral e imunidade celular) nas células de vertebrado, particu-larmente, as células nos mamíferos incluindo o ser humano. Então, o bacu-lovírus recombinante da presente invenção é útil como a vacina.
Em particular, a presente invenção provê a vacina compreen-dendo qualquer um dos baculovírus recombinantes particulares tal comoAcNPV-DuaI-HI N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-DuaI-PfAMAI, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-DuaI-SARS/S, AcNPV-HI N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AeNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-DuaI-HI N1/NP, AcNPV-DuaI-HI N1/M2, AcNPV-DuaI-HI N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0,AcNPV-CP-HIN1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39, AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39 como o ingrediente ativo.Como é o caso com a composição farmacêutica de (3) acima, avacina aumenta o efeito preventivo sobre infecção e reduz o título de infecti-vidade (por exemplo, título de infectividade viral) para organismos patogêni-cos tal como antígenos da malária, por exemplo, o antígeno de superfície(CSP) de superfície esporozoíta do parasita da malária, a MSP1 de uma pro-teína de membrana da superfície metrozoíta, o antígeno S da malária secre-tado de eritrócitos infectados com malária, a proteína PfEMPI presente nonó dos eritrócitos infectados com malária, a proteína SERA, a proteínaTRAMP e a proteína AMA1 ou o antígeno HA do vírus influenza, o antígenoNA do vírus influenza, o antígeno M2 do vírus influenza e o antígeno NP dovírus influenza. Deste modo, comparando o período de sobrevivência e ataxa de sobrevivência nos mamíferos infectados incluindo seres humanoscom aqueles não administrados com a composição farmacêutica da presen-te invenção, a vacina é particularmente útil como o agente preventivo ou te-rapêutico para a infecção com malária e vírus influenza.
A vacina da presente invenção é útil como o agente preventivoou terapêutico para doenças infecciosas causadas pelo patógeno e suascomplicações, por exemplo, as doenças virais causadas pelo vírus influenza,papiloma vírus, herpes vírus, vírus da AIDS, vírus da hepatite C, vírus SARS,vírus da Febre do Nilo Ocidental e vírus da febre do dengue, as doenças deparasita causadas pela malária, parasitas tripanossoma e leishmania, e do-enças bacterianas causadas por bactérias da desinteria, febre entérica, cóle-ra, pneumococcus, MRSA, VRE, Neisseria gonorrhoeae e Chlamydia, sífilise tuberculose, utilizando as ações para aumentar o efeito preventivo de in-fecção sobre o antígeno infeccioso e reduzir o título de infectividade.
Usando o gene estrangeiro imunogênico para o vertebrado quenão o ser humano no vetor de transferência para obtenção do baculovírusrecombinante que é o ingrediente ativo na vacina da presente invenção, épossível utilizar a composição farmacêutica da presente invenção para pro-cedimentos das doenças associadas com a infecção das células-alvo e dostecidos como vacina para influenza da galinha, vacina para tripanossomabovino e vacina para a doença da água fria da truta Japonesa utilizando su-as ações para aumentar o efeito de prevenção de infecção sobre o antígenoinfeccioso e reduzir o título de infectividade.
O baculovírus recombinante, tal como AcNPV-DuaI-HI N1/HA1,AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-DuaI-PfAMAI, AcNPV-Dual Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-HI N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-DuaI-H1N1/NP, AcNPV-DuaI-HI N1/M2, AcNPV-DuaI-HI N1/NAe, AcNPV-DuaI-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H 1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2,AcNPV-CP-H1N1/HA1 -vp39, AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39 da presente inven-ção, que é o ingrediente ativo na vacina da presente invenção, tem as açõesque aumentam um efeito de prevenção de infecção sobre o antígeno infec-cioso e reduz o título de infectividade, e esta ação ou atividade pode ser uti-lizada para procedimentos das doenças associadas com a infecção das cé-lulas-alvo ou tecidos. Tais células-alvo afetadas pela infecção incluem, porexemplo, células sangüíneas, e outras células-alvo incluem células hepáti-cas, células renais, células cerebrais, células pulmonares, células epiteliais ecélulas musculares. Os tecidos compreendendo essas células incluem pul-mão, fígado, rim, veias arteriais e venosas, estômago, intestino, uretra, pelee músculo.
A vacina da presente invenção como a composição farmacêuticaem (3) acima pode ser preparada como a composição compreendendo aquantidade farmaceuticamente eficaz do baculovírus recombinante (AcNPV-Dual-Hl N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-DuaI-PfAMAI, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-DuaI-SARS/S, AcNPV-HI N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-DuaI-HI N1/NP, AcNPV-DuaI-HI N1/M2, AcNPV-DuaI-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-HI N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39, AcNPV-CP-H1 N1/NP-vp39) e o veículo farmaceuticamente aceitável.
A vacina pode ser preparada em uma forma de composição far-macêutica utilizando o aceitável como o agente farmacêutico como com acomposição farmacêutica em (3) acima de acordo com métodos-padrão. Oveículo pode incluir, por exemplo, soluções fisiologicamente aceitáveis talcomo solução salina estéril e solução salina tamponada estéril.
A vacina (daqui em diante, a formulação é a mesma que nacomposição farmacêutica) pode ser preparada como uma formulação delipossoma compreendendo o baculovírus recombinante (AcNPV-DuaI-Η1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-DuaI-PfAMAI,AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-HI N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-DuaI-H1N1/NP, AcNPV-DuaI-HI N1/M2, AcNPV-DuaI-HI N1/NAe, AcNPV-DuaI-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-HIN1/HA0, AcNPV-CP-HIN1/HA2,AcNPV-CP-H 1N1 /ΗΑ1 -vp39, AcNPV-CP-HI N1/NP-vp39) como o ingredienteativo, e pode ser combinada com um adjuvante. Exemplos específicos davacina (composição farmacêutica) da presente invenção podem incluir aformulação de lipossoma. A formulação de Iipossoma pode ser uma onde obaculovírus recombinante da presente invenção foi retido no lipossoma u-sando fosfolipídio ácido como um componente de membrana ou usando fos-folipídio neutro e fosfolipídio ácido como o componente de membrana.
O fosfolipídio neutro e fosfolipídio ácido usados como o compo-nente de membrana não são particularmente limitados, e vários lipídios ge-ralmente usados para a formulação de lipossoma podem ser usados sozi-nhos ou em mistura de dois ou mais.
Uma membrana de lipossoma é formada de acordo com os mé-todos-padrão usando o fosfolipídio ácido sozinho ou combinação do fosfoli-pídio neutro e o fosfolipídio ácido. No caso da combinação do fosfolipídioneutro, a taxa do fosfolipídio ácido a ser combinado pode ser cerca de 0,1 a100% em mol, de preferência 1 a 90% em mol e com mais preferência cercade 10 a 50% em mol nos componentes da membrana de lipossoma.
Quando o lipossoma acima é preparado, por exemplo, colesterolpode ser adicionado. Isto pode controlar a fluidez do fosfolipídio e tornar apreparação do lipossoma mais fácil. O colesterol é tipicamente adicionadona quantidade equivalente àquela do fosfolipídio, e de preferência é preferi-do adicionar e combinar na quantidade 0,5 vez equivalente àquela do fosfo-lipídio.
Para a taxa do ingrediente ativo e do fosfolipídio ácido na formu-lação de lipossoma, a taxa do fosfolipídio ácido é cerca de 0,5 a 100 equiva-lentes, de preférência cerca de 1 a 60 equivalentes e com mais preferênciacerca de 1,5 a 20 equivalentes com relação ao ingrediente ativo.
A quantidade do baculovírus recombinante da presente invençãoque é o ingrediente ativo a ser usado pode ser vários % em mol a várias de-zenas de % em mol, de preferência cerca de 5 a 10% em mol e tipicamenteem torno de 5% em mol.
A produção, concentração e controle de diâmetro de partícula daformulação de lipossoma acima podem ser realizados de acordo com os mé-todos-padrão. Vários aditivos descritos acima podem ser também combina-dos com a formulação de lipossoma se desejado. Ácido graxo (por exemplo,ácido beênico, ácido esteárico, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido oléico),grupo alquila, grupo colesterila e similar podem ser também ligados a ela eusados. A produção da formulação de lipossoma preparada ligando-os podeser também realizada de acordo com os métodos-padrão (vide Long Circula-tion Liposomes: old drugs, New therapeutics, M.C. Woodle, G. Storm, Eds.:Springer-Verlad Berlin (1998)).
A vacina (composição farmacêutica) da presente invenção podeser de preferência usada como uma composição de vacina. Quando ela éusada, é preferido para aumento de um efeito antiinfecção (antimalária ouantiinfluenza) ser combinada com o adjuvante em quantidade farmaceutica-mente eficaz.
Como o adjuvante, qualquer um geralmente usado para este tipode vacina pode ser usado sem limitação. Como um exemplo, adjuvantecompleto de Freund, muramil dipeptídio, hidróxido de alumínio, BCG, IL-12,N-acetilmuramino-L-alanil-D-isoglutamina, timosina α1 e QS-21 podem serexemplificados. A quantidade do adjuvante a ser combinado pode ser apro-priadamente determinada dependendo do amolecimento, eritema de pele,febre, cefaléia e dor muscular que são provavelmente expressos como umaparte da resposta imune nos seres humanos ou nos animais após a sua ad-ministração. A vacina (composição farmacêutica) da presente invenção podeser combinada com outros artigos farmacêuticos publicamente conhecidostal como peptídio de facilitação de resposta imune e agentes antibacterianos(agentes antibacterianos sintéticos).
Fármacos e aditivos opcionais podem estar ainda contidos navacina (composição farmacêutica). Como seus exemplos, o fármaço, tal co-mo íon de cálcio que auxilia na absorção intracelular do baculovírus recom-binante da presente invenção, pode ser exemplificado. Os fármacos e aditi-vos, por exemplo, o lipossoma, e, por exemplo, emulsificante de fluocarbono,cocleado, túbulo, partículas de ouro, microesfera biodegradável e polímeroscatiônicos que tornam a transfecção fácil podem ser usados.
A quantidade do ingrediente ativo contido na vacina (composiçãofarmacêutica) (formulação) da presente invenção não é particularmente limi-tada e pode ser selecionada da ampla faixa contanto que ela seja a quanti-dade farmaceuticamente eficaz. A dosagem da vacina (composição farma-cêutica) não é particularmente limitada, e pode ser apropriadamente selecio-nada da ampla faixa dependendo do efeito terapêutico desejado, do métodode administração (via de administração), do período terapêutico, idade e se-xo do paciente, e outras condições.
Quando o baculovírus recombinante que é o ingrediente ativo davacina (composição) da presente invenção é administrado ao ser humano,em termos de PFU do vírus recombinante, o baculovírus recombinante cor-respondendo a 102 a 1012 PFU, de preferência 105 a 1010 PFU e com maispreferência 106 a 109 PFU por paciente é administrado.
A dosagem do baculovírus recombinante (AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-DuaI-PfAMAI,AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-HI N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-DuaI-H1N1/NP, AcNPV-DuaI-HI N1/M2, AcNPV-DuaI-HIN1/NAe, AcNPV-DuaI-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-HÍN1/HA2,AcNPV-CP-H 1N1 /HA1 -vp39, AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39) que é o ingredien-te ativo da vacina (composição farmacêutica) da presente invenção é sele-cionada da faixa muito ampla como a quantidade de DNA expressável intro-duzido no hospedeiro da vacina ou a quantidade de RNA transcrito. Suasquantidades também dependem da resistência de promotores de transcriçãoe tradução usados para o vetor de transferência.
A vacina (composição farmacêutica) da presente invenção éadministrada diretamente injetando uma suspensão de baculovírus recombi-nante onde o vetor foi suspenso em PBS (solução salina tamponada comfosfato) ou solução salina em um sítio local (por exemplo, em tecido de pul-mão, em fígado, em músculo ou em cérebro), inalando através do nariz ouvia aérea ou administrando em vaso sangüíneo (por exemplo, intra-arterial,intravenosa e na veia portal). A vacina da invenção é de preferência adminis-trada através de inalação.
É preferido que a vacina (composição farmacêutica) da presenteinvenção seja administrada não apenas uma vez, mas uma vez a múltiplasvezes observando o estado após a administração inicial e administrando a(s)vacina(s) adicional(ais). Isto torna possível aumentar o efeito desejado. Épossível adicionalmente imunizar com a composição farmacêutica compostado baculovírus recombinante (AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65,AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-DuaI-PfAMAI, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-HI N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-HI N1/HA1, AcNPV-DuaI-HIN1/NP, AcNPV-DuaI-H1N1/M2, AcNPV-DuaI-HI N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HAI/NC99, AcNPV-CP-H1 N1/HA0, AcNPV-CP-HI N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1 -vp39, AcNPV-CP-HI N1/NP-vp39) da presente invenção após adminis-tração da vacina (composição farmacêutica). A combinação dos vários fár-macos acima a ser combinada também tem a possibilidade de aumentar oefeito terapêutico através da administração da vacina (composição farma-cêutica).
Em uma modalidade da vacina (composição farmacêutica) dapresente invenção, o baculovírus recombinante que é um do ingrediente ati-vo da vacina (composição farmacêutica) da presente invenção pode ser for-mulado misturando o baculovírus recombinante obtido através de recombi-nação homóloga do vetor de transferência onde o gene de fusão obtido atra-vés da fusão do gene estrangeiro imunogênico desejado e do gene codifi-cando a proteína capaz de ser o componente da partícula viral foi introduzidocom o DNA de baculovírus na forma capaz de injetar uma dose unitária (so-lução, suspensão ou emulsão) com o veículo farmaceuticamente aceitável(isto é, não-tóxico para os vertebrados incluindo os seres humanos na dosa-gem e na concentração a serem administradas, e compatível com outrosingredientes na formulação). Por exemplo, a formulação de preferência nãocontém nenhum oxidante e quaisquer outros compostos publicamente co-nhecidos como sendo prejudiciais para o baculovírus recombinante.
O veículo contém apropriadamente os aditivos em pequenasquantidades, tal como substâncias que aumentam a propriedade isotônica ea estabilidade química. Tais substâncias são não-tóxicas para os mamíferosincluindo os seres humanos na dosagem e na concentração a serem admi-nistradas, e podem incluir tampões tal como ácido fosfórico, ácido cítrico,ácido succínico, ácido acético e outros ácidos orgânicos ou seus sais, antio-xidantes tal como ácido ascórbico, polipeptídios de baixo peso molecular(por exemplo, menos do que cerca de 10 resíduos) (por exemplo, poliargini-na ou tripeptídio) proteínas (por exemplo, albumina de soro, gelatina ou imu-noglobulina), aminoácidos (por exemplo, glicina, ácido glutâmico, ácido as-pártico ou arginina), monossacarídeos, dissacarídeos ou outros carboidratos(incluindo celulose ou seus derivados, glicose, manose ou dextrina), agentesde quelação (por exemplo, EDTA), álcoois de açúcar (por exemplo, manitolou sorbitol), contra-íons (por exemplo, sódio) e/ou tensoativos (por exemplo,polissorbato, poloxâmero).
A vacina farmacêutica (composição) compreendendo o baculoví-rus recombinante pode ser armazenada representativamente em um recipi-ente de dose unitária ou múltipla, por exemplo, uma ampola vedada ou umfrasco como uma solução aquosa ou um produto liofilizâdo.
A composição farmacêutica compreendendo a vacina (composi-ção) da presente invenção é administrada em um modo idêntico ao GoodMedicai Practice com consideração de uma condição clínica (por exemplo,condição a ser prevenida ou tratada) de um paciente individual, um sítio apli-cado da vacina (composição) compreendendo o baculovírus recombinante,um tecido direcionado, o método de administração, um regime e outros fato-res publicamente conhecidos daqueles versados na técnica. Deste modo, adosagem apropriada da vacina (composição) aqui é determinada em consi-deração ao acima.
EXEMPLOS
A presente invenção será descrita abaixo em mais detalhes comreferência aos Exemplos. Esses Exemplos são exemplificações apenas enão limitam a presente invenção.
[Exemplo 1] Plasmídeo vetor de transferência e método para suaprodução da presente invenção
(1) Construção do plasmídeo vetor de transferência pTriEx-Hsp65-gp64 da presente invenção
(1.1) Construção de plasmídeo pBACsurf-CSP
Um plasmídeo pcDNA-CS87 foi feito obtendo-se um fragmentode Nhel-Notl compreendendo a seqüência fundindo DNA genômico da cepaANKA de Plasmodium berghei, uma seqüência de sinal de secreção de Igkde murino e uma seqüência FLAG de acordo com o método de Yoshida eoutros (Yoshida, S. e outros, B.B.R.C., 271, 107-115 (2000) e inserção do1 fragmento de Nhel-Notl em um sítio de Nhel-Notl de pcDNA3.1 (fornecidopela invitrogen).
Uma amostra de sangue foi coletada de camundongo BALB/cinfectado com parasita da malária P. berghei ANKA, e DNA genômico de P.berghei foi extraído usando QIAamp DNA Midi Kit (fornecido da Qiagen).Subseqüentemente, o DNA genômico de P. berghei foi amplificado atravésde PCR usando um iniciador pbCSPI:
5'- GGAGGGCTAGC/4 TGGAGACAGACACACTCCTGCTA TGGGTACTGCTGCTCTGnr:TTnnAnnTTrnAnTfíGTnAnGC,GGATCCACTGCAGGACTACAAGGACGTAGACAAGGGATATGGACAAAATAAAGCATCCAAGCCC-3 (SEQ ID NO:1)(um sítio de Nhel recém-feito é representado por um sublinhado, a seqüên-cia de sinal de secreção de Igk de murino é representada em Itálico e a se-qüência FLAG é representada por um sublinhado duplo) e PbCSP-RI:GGAGGGCGGCCGCATCCCGGGTTTTCTTATTTGAACCTTTTCGTTTTCTAACTCTTATACCAGAACC-3' (SEQ ID NO:2) (um sítio de Notl recém-feito érepresentado pelo sublinhado). A PCR foi realizada usando polimerase dePfuDNA (fornecida da Stratagene) por 30 ciclos (desnaturação a 949 C por30 segundos, anelamento a 55e C por um minuto e extensão a 72e C por 2minutos). O produto de PCR não tem âncora de glicosil fosfatidil inositol(GPI) e codifica PbCSP fundido à seqüência de sinal de secreção de Igk demurino no lugar de sua seqüência de sinal original.
O produto de PCR foi purificado, clivado com enzimas de restri-ção Nhel/Notl, que foi então inserido nos sítios de Nhel/Notl de pcDNA3.1(fornecido da Invitrogen), e um plasmídeo resultante foi designado pcDNA-CS87. O plasmídeo pcDNA-CS87 contém um promotor de CMV, a seqüên-cia de sinal da secreção de Igk de murino, uma proteína (correspondendo a21 a 299 aminoácidos) codificada pelo gene PbCSP, um sinal de poli A deri-vado de um gene de hormônio de crescimento bovino e uma seqüência poli A.
Um fragmento de gene codificando uma seqüência de aminoáci-do nas posições 21 a 306 de um peptídio de PbCSP foi obtido através declivagem do pcDNA-CS87 com as enzimas de restrição Pstl e Smal, o frag-mento de DNA foi inserido nos sítios de Pstl e Smal de pBACsurf (fornecidoda Novagen) e o plasmídeo construído foi chamado pBACsurf-CSP.
(1.2) Construção de plasmídeo pBACsurf-Hsp65
Um gene Hsp65 foi obtido através da extração do DNA genômi-co da cepa H37Rv de M. tuberculosis usando QIAamp DNA Midi Kit (forneci-do da Qiagen) e clonagem através de PCR. Isto é, o DNA genômico extraídoda cepa H37R de M. tuberculosis foi amplificado através de PCR usando uminiciador, phsp65-F1:
5'-AATAATAGATCTAATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGA-3 (SEQ IDNO:3) (um sítio Bglll é representado pelo sublinhado) e phsp65-R1 :
AATCCAATGCGGCCGCGGGAATTCGATTCCTGCAGGTCAGAAATCCATGCCACCCATGTCGCC -3 (SEQ ID NO:4) (o sítio Notl é representado pelosublinhado).
O produto de PCR foi purificado, clivado com as enzimas de res-trição Bglll/Notl, ligado aos sítios de BamHI/Notl em pcDNA3.1 (fornecido daInvitrogen) e o plasmídeo resultante foi designado pcDNA-hsp65.
O plasmídeo pcDNA-hsp65 é um construto onde a seqüência desinal de secreção de Igk de murino foi fundida ao gene hsp65.
A PCR foi realizada com pcDNA-hsp65 como um molde usandoo iniciador phsp-65-F2:
<:ACC(^TGCAGGACTACMGGACGACGATGACMGG/\fiJJCATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGAGGCC -3' (SEQ ID NO:5) (Sse8387l, sítios deEcoRI são representados por sublinhados e a seqüência FLAG é represen-tada em Itálico) e phsp65-R2:
(5'-CCCGGGCGAAATCCATGCCACCCATGTCGCCGCCACC-3' (SEQ ID NO:6) (um sítio de Cfr9l é representado pelo sublinhado). O fragmento de DNAdo gene Hsp65 (cerca de 1660 pb) foi clonado em pENTR/D-TOPO (forneci-do da Invitrogen), subseqüentemente clivado com Sse8387l/Cfr9l, que foientão inserido nos sítios de Pstl/Cfr9l de pBACsurf-CSP (Yoshida e outros,Virology 316:161 -70, 2003) obtido acima.
O plasmídeo construído como o acima foi chamado pBACsurf-Hsp65.
(1.3) Construção de plasmídeo pENTR-gp64
A PCR foi realizada com pBACgus-1 (fornecido da Novagen)como o molde usando o iniciador pPolh-F2:
-CACCCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAG-3'(SEQ ID NO:7) (um sítio de Rsrll é representado pelo sublinhado), e pgp64-R2: 5'-GGTACCATATTGTCTATTACGGTTTCTAATCATAC-3' (SEQ ID NO:8) (um sítio de Kpnl é representado pelo sublinhado). O fragmento de DNAdo gene gp64 resultante (cerca de 1700 pb) foi inserido em pENTR/D-TOPOpara construir o plasmídeo pENTR-gp64.
O plasmídeo construído como o acima foi chamado pENTR-gp64.
(1.4) Construção do vetor de transferência pDual-Hsp65-gp64 dapresente invenção
pDUal-Hsp65-gp64 foi clivado com Pstl/Cfr9l, e o fragmento deDNA do gene hsp65 (cerca de 1660 pb) foi inserido nos sítios de Pstl/Cfr9lde pENTR-gp64 para construir o plasmídeo pENTR-Hsp65-gp64.
Ainda, pENTR-hsp65-gp64 foi clivado com Rsrll/Kpnl, e um frag-mento de DNA (cerca de 3360 pb) composto de um promotor de poliedrina eo gene hsp65gp64 foi inserido em Rsrll/Kpnl de TriEx-3 (fornecido da Nova-gen) para construir o plasmídeo vetor de transferência pDual-Hsp65-gp64onde a expressão foi controlada pelos promotores duplos desejado.
(2) construção de vetor de transferência pDual-PbCSP-gp64 dapresente invenção
O plasmídeo pBACsurf-CSP obtido em (1.1.1) foi clivado comPstl/Cfr9l, e um fragmento de DNA do gene PbCSP (cerca de 890 pb) foiinserido nos sítios de Pstl/Cfr9l de pDual-Hsp65-gp64 para construir o plas-mídeo pDual-PbCSP-gp64.
(3) Construção do vetor de transferência pDual-H1N1/Ha1-gp64da presente invenção
RNA foi extraído de um sobrenadante de cultura de células MDKinfectadas com cepa PR8/34 do vírus influenza usando QIAamp MiIiEIuteVirus Spin Kit (QIAGEN) e amplificado através de RT-PCR usando o inici-ador HA-f: 5'-CCTGCAGGTATGAAGGCAAACCTACTGGTC-3' (SEQ IDNO:9) (um sítio de Sbfl é representado pelo sublinhado) e HA-r: 5'-GCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3 (SEQ ID NO: 10) (um sítio de Sbfl érepresentado pelo sublinhado). O fragmento do gene HA do vírus influenzaresultante com comprimento completo de 1700 pb foi clonado em pCR-BluntII-TOPO (fornecido da Invitrogen).
O plasmídeo resultante foi chamado PCR-Blunt-HA. A PCR foirealizada com o PCR-Blunt-HA como o molde usando o iniciador pHA-F1: 5'-CACCGAATTCGACACAATATGTATAGGCTACCATGCG-3'(SEQ ID NO:11)(um sítio de EcoRI é representado pelo sublinhado) e pHA-R1: 5'-ÇÇÇGGGCACCTCTGGATTGGATGGACGGAATG-3' (SEQ ID NO: 12) (umsítio de Cfr9l é representado pelo sublinhado). O fragmento de DNA do geneH1N1/Ha1 resultante (cerca de 1000 pb) foi clonado em pENTR/D-TOPO(fornecido da Invitrogen), subseqüentemente clivado com EcoRI/Cfr9l, quefoi então inserido nos sítios de EcoRI/Cfr9l de pDual-Hsp65-gp64 para cons-truir o plasmídéo pDual-H1 N1/Ha1 -gp64.
(4) Construto de vetor de transferência pDual-PbTRAMP-gp64da presente invenção
A amostra de sangue foi coletada de um camundongo BALB/cinfectado com parasita da malária P. berghei ANKA e DNA genômico de P.berghei ío\ extraído usando QIAamp DNA Midi Kit (fornecido da Qiagen).
Um gene PbTRAMP foi clonado através de PCR com este DNAgenômico como molde de acordo com o método que segue. Isto é, a PCR foirealizada usando o iniciador pTRAMP-F1: 5'-CACCGAATTCAAAATTGATACGAAAAAAAATGAAG-3' (SEQ ID NO:13) (o sítio de EcoRI é representadopelo sublinhado) e pTRAMP-R1:
CCCGGGCTTTTAATTTTGAGGAGTCTTTATTTTC-3' (SEQ ID NO: 14) (osítio de Cfr9l é representado pelo sublinhado). O fragmento de DNA de Pb-TRAMP resultante (cerca de 800 pb) foi clonado em pENTR/D-TOPO (forne-cido da Invitrogen), subseqüentemente clivado com EcoRI/Cfr9l, que foi en-tão inserido nos sítios de EcoRI/Cfr9l de pBACsurf-Hsp65. O plasmídéoconstruído foi chamado pBACsurf-PbTRAMP.
Subseqüentemente, o pBACsurf-PbTRAMP foi clivado com E-coRI/Cfr9l, e o fragmento do DNA do gene PbTRAMP (cerca de 860 pb) foiinserido nos sítios de EcoRI/Cfr9l de pDual-Hsp65-gp64 para construir oplasmídéo pDual-PbTRAMP-gp64.
(5) Construção do vetor de transferência pDual-PbAMA1D123-gp64 da presente invenção
A amostra sangüínea foi coletada de camundongo BALB/c infec-tado com parasita da malária P. berghei ANKA, e o DNA genômico de P.berghei fio extraído usando QIAamp DNA Midi Kit (fornecido da Qiagen).
O domínio 123 do gene PbAMAI (D123) foi clonado através dePCR com este DNA genômico como o molde de acordo com o método quesegue. Isto é, a PCR foi realizada usando o iniciador pAMA-F1: 5'-CACCGAATTCAATCCATGGGAAAAGTATACGGAAAAATAT-3' (SEQ ID N0:15)(o sítio de EcoRI é representado pelo sublinhado) e pAMA-R1: 5'-CCCGGGCTTCTCTGGTTTGATGGGCTTTCATATGCAC-3' (SEQ ID N0:16)(o sítio de Cfr9l é representado pelo sublinhado). O fragmento de DNA dePbAMAI D123 resultante (cerca de 1280 pb) foi clonado em pENTR/D-TOPO(fornecido da Invitrogen), subseqüentemente clivado com EcoRI/Çfr9l, quefoi então inserido nos sítios de EcoRI/Cfr9l de pBACsurf-Hsp65. O plasmí-deo construído foi chamado pBACsurf-PbAMAI D123.
Subseqüentemente, o pBACsurf-PbAMA1D123 foi clivado comEcoRI/Cfr9l, e o fragmento de DNA do gene PbAMAI D123 (cerca de 1280pb) foi inserido nos sítios de EcoRI/Cfr9l de pDual-Hsp65-gp64 obtido em(1.4) acima para construir o plasmídeo pDual-PbAMA1 D123-gp-64.(6) Construção do vetor de transferência pDual-PbMSP119-gp64 da presen-te invenção
A amostra de sangue foi coletada de camundongo BALB/c infec-tado com parasita da malária P. berghei ANKA, e o DNA genômico de P.berghei\o\ extraído usando QIAamp DNA Midi Kit (fornecido da Qiagen).
Um gene PbMSP119 foi clonado através de PCR com este DNAgenômico como o molde de acordo com o método que segue. Isto é, a PCRfoi realizada usando o iniciador: pMsp1-F1: 5'-CACCCTGCAGGACTACAAGGACGACGATGACAAGCACATAGCCTCAATAGCTTTAAATAACTTAAATAAATCTGG-3' (SEQ ID NO: 17) (o sítio de Pstl é representado pelo sublinha-do) e pMsp1-R1: 5'-CCCGGGTTCCCATAAAGCTGGAAGAGCTACAGAATACACC-3' (SEQ ID NO: 18) (o sítio de Cfr9l é representado pelo sublinha-do). O fragmento de DNA PbMSP119 (cerca de 450 pb) foi clonado empENTR/D-TOPO (fornecido da Invitrogen), subseqüentemente foi clivadocom Pstl/Cfr9l, que foi então inserido nos sítios de Pstl/Cfr9l de pBACsurf-Hsp65. O plasmídeo construído foi chamado pBACsurf-PbMSP119.
Subseqüentemente, o pBACsurf-PbMSP119 foi clivado com Ps-tl/Cfr9l, e o fragmento de DNA do gene PbMSP-119 (cerca de 450 pb) foiinserido nos sítios de Pstl/Cfrl de pDual-Hsp65-gp64 para construir o plas-mídeo pDual-PbMSP-119-gp64.(7) Construção do vetor de transferência pDual-PfCSP-gp64 dapresente invenção
O DNA genômico do parasita da malária falciparum, P. falcipa-rum, foi extraído de eritrócitos humanos infectados com a cepa 3D7 de P.falciparum usando QIAamp DNA Midi Kit (Qiagen). Um gene PfCSP foi clo-nado através de PCR com este DNA genômico como o molde de acordocom o método que segue. Isto é, a PCR foi realizada usando o iniciadorpPfCSP-F1: 5'-CACCGAATTCTTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAGT-3' (SEQ ID NO: 19) (o sítio de EcoRI é representado pelo sublinhado) epPfCSP-R1: 5'-CCCGGGCTTTTTCCATTTTACAAA I I I I I I I I IC-3' (SEQID N0:20) (o sítio de Cfr9l é representado pelo sublinhado). O fragmento deDNA de PfCSP resultante (cerca de 1100 pb) foi clonado em pENTR/D-TOPO (fornecido da Invitrogen), subseqüentemente clivado com Eco-Rl/Cfr9l, que foi então inserido nos sítios de EcoRI/Cfr9l de pDual-PbAMAI D123-gp64. O plasmídeo construído foi chamado pDual-PfCSP-gp64.
(8) Construção de vetor de transferência pDual-PfAMA-gp64 dapresente invenção
O DNA genômico do parasita da malária falciparum, P. falcipa-rum, foi extraído de eritrócitos humanos infectados com a cepa 3D7 de P.falciparum usando QIAamp Midi Kit (QIAGEN). O gene PfAMAI foi clonadoatravés de PCR com este DNA genômico como o molde de acordo com ométodo que segue. Isto é, a PCR foi realizada usando o iniciador pPfAMAI -F1:
5'-C ACCCTGC AGG ACTACAAGGACGACGA TGACAAGCAG AATTATTGGGAACATCCATATCAAAATAGTGATGTG-3' (SEQ ID NO:21) (o sítio de Pstl érepresentado pelo sublinhado a seqüência FLAG representada por Itálico) epPfAMA1-R1: 5'-CCCGGGCTTTCATTTTATCATAAGTTGGTTTATG-3' (SEQID NO:22) (o sítio de Cfr9l é representado pelo sublinhado). O fragmento deDNA de PfAMAI resultante (cerca de 3500 pb) foi clonado em pENTR/D-TOPO (fornecido da Invitrogen), subseqüentemente clivado com Pstl/Cfr9l,que foi então inserido nos sítios Pstl/Cfr9l de PbAMAI D 123-gp64. O plasmí-deo construído foi chamado pDual-PfAMa1-gp64.
(9) Construção do vetor de transferência pDual-Pfs25-gp64 dapresente invenção
O DNA genômico do parasita da malária falciparum, P. falcipa-rum, foi extraído de eritrócitos humanos infectados com a cepa 3D7 de P.falciparum usando QIAamp DNA Midi Kit (QlAGΕΝ). O gene Pfs25 foi clona-do através de PCR com este DNA genômico como o molde de acordo com ométodo que segue. Isto é, a PCR foi realizada usando o iniciador pPfs25-F1:5'-CACCGAATTCAAAGTTACCGTGGATACTGTATGCAAAAGAGGA-3'(SEQ ID NO:22) (o sítio de EcoRI é representado pelo sublinhado) e pPfs25-R1: 5'-CCCGGGCAGTACATATAGAGCTTTCATTATCTAT-3' (SEQ ID NO:24) (o sítio de Cfr9l é representado pelo sublinhado). O fragmento de DNAde Pfs25 resultante (cerca de 530 pb) foi clonado em pENTR/D-TOPO (for-necido da Invitrogen), subseqüentemente clivado com EcoRI/Cfr9l, que foientão inserido nos sítios de EcoRI/Cfr9l de PbAMAI D123-gp64. O plasmí-deo construído foi chamado pDual-Pfs25-gp64.
(10) Construção de vetor de transferência pDual-H5N1/HA1-gp64 da presente invenção
Um gene HA1 é sintetizado do vírus influenza de ave H5N1 einserido nos sítios de EcoRI/Cfr9l de pDual-Hsp65-gp64 para construir oplasmídeo pDual-H5N1/HA1-gp64.
(11) Construção de vetor de transferência pDual-SARS/S-gp64da presente invenção
Um gene S do vírus SARS é sintetizado e inserido nos sítios deEcoRl/Cfr91 de pDual-Hsp65-gp64 para construir o plasmídeo pDual-SARS/S-gp64.
(12) Construção de vetor de transferência pCP-H1N1/HA1-gp64da presente invenção
A PCR foi realizada com PCR-BIunt-HA como o molde usandoPolh-f Rsrll (5'-GGGCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCG-3':SEQ ID NO:25) (o sítio de Rsrll é representado pelo sublinhado) e GP64-rDralll (5'-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3': SEQ IDΝΟ:26) (ο sítio de Dralll é representado pelo sublinhado). Um fragmento deDNA resultante de 2700 pb foi ligado a um vetor obtido através da digestãode pDual-H 1N1 /HA1 -gp64 com as enzimas de restrição Rsrll e Dralll paraconstruir pCP-H1 N1/HA1 -gp64.
(13) Construção de vetor de transferência pCAP-H1N1/HA1-gp64 da presente invenção
HA1 obtido através da clivagem de pCP-H1 N1/HA1 -gp64 com asenzimas de restrição Rsrll e Dralll e um fragmento do gene gp64 foram inse-ridos no vetor obtido através da clivagem de pTriEx-1.1 (fornecido da Nova-gen) com as enzimas de restrição Rsrll e Dralll para construir um plasmídeopCAP-H1 N1/HA1 -gp64.
(14) Construção de vetor de transferência pCU-H1N1/HA1-gp64da presente invenção
A PCR foi realizada com pTriEx3.1 como o molde usando CM-Venh-f Fsel (5'-GGGGGCCGGCCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTAC-3':SEQ ID NO:27) (o sítio de Fsel é representado pelo sublinhado) e CMVenh-r Kpnl (5'-GGGGGTAÇÇCATGGTAATAGCGATGACTAATACG -3': SEQ IDNO:28) (o sítio de Kpnl é representado pelo sublinhado) para amplificar umaregião intensificador de CMV. Ainda, a PCR foi realizada com DNA genômi-co humano como o molde usando UBBp-f Kpnl (5'-GGGGGTACCTCGAGGAAGGTTTCTTCAACTC-3':SEQ ID NO:29) (o sítio de Kpnl é representadopelo sublinhado) e UBBp-r Rsrll (5'-GGGCGGTCCGGACCTAGTTTAAAAGTAAAACATAAG-3': SEQ ID N0:30) (o sítio de Rsrll é representado pelosublinhado) para amplificar uma região promotora de UBB. Dois fragmentosresultantes foram ligados ao vetor obtido através da digestão de pCP-H1N1/HA1-gp64 com as enzimas de .restrição Fsel e Rsrll para construirpCU-H1 N1/HA1 -gp64.
(15) Construção de vetor de transferência pDual-H1N1/Np-gp64da presente invenção
A RT-PCR foi realizada com RNA genômico da cepa PR8/34 dovírus infIuenza como o molde usando NP-f EcoRI (5'-ACGGAATTCCATTCAATTCAAACTGGA-3': SEQ ID NO:31 (o sítio de EcoRI é representado pelosublinhado) e NP-r Cfr9l(5'-GATCCCGGGCCTTGTCAATGCTGAATGGCAA-3': SEQ ID NO:32) (o sítio de Cfr9l é representado pelo sublinhado). Umfragmento resultante foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e Cfr9l,e inserido em pCP-H1N1/HA1-gp64 digerido com as enzimas de restriçãoEcoRI e Cfr9l para fazer pDual-H1 N1/NAe-gp64.
(16) Construção de vetor de transferência pDual-HTN1/M2-gp64da presente invenção
A RT-PCR foi realizada com RNA genômico da cepa PR8/34 dovírus influenza como o molde usando M2-f EcoRI (5'-CGGAATTCATGAGTCTTCTAACCGAGG-3': SEQ ID NO:33) (o sítio de EcoRI é representadopelo sublinhado) e M2-r Cfr9l (5'-GATCCCGGGCCTCCAGCTCTATGCTGAC-3':SEQ ID NO:34)(o sítio de Cfr9l é representado pelo sublinhado). Umfragmento resultante foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e Cfr9l,e inserido em pCP-H1N1/HA1-gp64 digerido com as enzimas de restriçãoEcoRI e Cfr9l para fazer pDual-H1 N 1/M2-gp64.
(17) Construção de vetor de transferência pDual-H1N1/NAe-gp64 da presente invenção
A RT-PCR foi realizada com RNA genômico da cepa PR8/34 dovírus influenza como o molde usando NAe-f EcoRI (5'-ACGGAATTCCATTCAATTCAAACTGGA-3': SEQ ID NO:35) (o sítio de EcoRI é representadopelo sublinhado) e NAe-r Cfr9l (5'-GATCCCGGGCCTTGTCAATGCTGAATGGCAA-3': SEQ ID NO:36) (o sítio de Cfr9l é representado pelo sublinhado).Um fragmento resultante foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI eCfr9l, e inserido em pCP-H1N1/HA1-gp64 digerido com as enzimas de res-trição EcoRI e Cfr9l para fazer pDual-H1 N1/Nae-gp64.
(18) Construção de vetor de transferência pDual-M2e-gp64 dapresente invenção
A PCR foi realizada com pDual-H1N1/M2-gp64 como o moldeusando M2-f EcoRl (5'-CGGAATTCATGAGTCTTCTAACCGAGG-3': SEQ IDNO:37) (o sítio de EcoRI é representado pelo sublinhado) e M2e-r Cfr9l (5'-GATCCCGGGCATCACTTGAACCGTTGCA-3': SEQ ID NO: 38) (o sítio deCfr9l é representado pelo sublinhado). Um fragmento resultante foi digeridocom as enzimas de restrição EcoRI e Cfr9l, e inserido em pCP-H1N1/HA1-gp64 digerido com as enzimas de restrição EcoRI e Cfr9l para fazer pDual-M2e-gp64.
(19) Construção de vetor de transferência pCP-HA1/NC99-gp64da presente invenção
RNA foi extraído de um estoque congelado de vírus influenzaNewCaledonia99/20 (NC99) usando QIAamp MiniEIute Virus Spin Kit (QIA-GEN) e a RT-PCR foi realizada usando iniciadors HA1-f EcoRI (5'-GATGAATTCGACACAATATGTATAGGCTACC-3': SEQ ID NO:39) (o sítio de EcoRIé representado pelo sublinhado) e HA1-r CFr9l (NC99) (5'-GATCCCGGGCTCTGGATTGAATGGATGGGATG-3': SEQ ID N0:4Ò) (o sítio de Cfr9l é re-presentado pelo sublinhado) para amplificar um fragmento do gene HA1. Umfragmento resultante e pCP-H1 N1/HA1 -gp64 foram tratados com as enzimasde restrição EcoRI e Cfr9l para recém-inserir o fragmento do gene HA1 deri-vado de NC99 em uma região de introdução de HA1 de pCP-H1N1/HA1-gp64. Um plasmídeo resultante foi designado pCP-HA1/NC99-gp64.
(20) Construção de vetor de transferência pCP-H1N1/HA0-gp64da presente invenção
A PCR foi realizada com PCR-BIunt-HA como o molde usandoHAO-f EcoRI (5'-GGGGAATTCATGAAGGCAAACCTACTGG-3':SEQ ID NO:41) (o sítio de EcoRI é representado pelo sublinhado) e HA2-r Cfr9l(5'-GATCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3':SEQ ID NO:42) (o sítio de Cfr9l érepresentado pelo sublinhado) para amplificar um gene HA de comprimentocompleto. Um fragmento resultante e pCP-H1N1/HA1-gp64 foram tratadoscom as enzimas de restrição EcoRI e Cfr9l para recém-inserir o fragmentodo gene HAO na região de introdução de HA1 de pCP-H1N1/HA1-gp64. Umplasmídeo resultante foi chamado pCP-H1N1/HA0-gp64.
(21) Construção de vetor de transferência pCP-H1N1/HA2-gp64da presente invenção
A PCR foi realizada com PCR-BIunt-HA como o molde usandoHA2-f EcoRI (5'-GATGAATTCATATTTGGAGCCATTGCCG-3': SEQ ID NO:43) (o sítio de EcoRI é representado pelo sublinhado) e HA2-r Cfr9l (5'-GATCCCGGGCGATGCATATTCTGCΑ-3':SEQ ID ΝΟ:44) (ο sítio de Cfr9l érepresentado pelo sublinhado) para amplificar o gene HA de comprimentocompleto. Um fragmento resultante e pCP-H1N1/HA1-gp64 foram tratadoscom as enzimas de restrição EcoRI e Cfr9l para recém-inserir o fragmentodo gene HA2 na região de introdução de HA1 de pCP-H1N1/HA1-gp64. Umplasmídeo resultante foi chamado pCP-H1N1/HA2-gp64.
(22) Construção de vetor de transferência pCP-H1N1/Ha1-vp39da presente invenção
A PCR foi realizada com DNA de baculovírus anexado ao Bac-Vector-2000 Tránsfection Kit (Novagen) como o molde usando vp39-f (5'-CTTAÇTAGTATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGfiMnQGGCGGCGGCGGCTCGGCGCTAGTGCCCGTGGGT-3':SEQ ID NO:45) (o sítio deSpel é representado pelo sublinhado e o sítio de EcoRI é representado pelosublinhado duplo) e vp39-r (5'-CTTCACTTAGTGATGGTGATGATGGTGGTGCCCGGGGCTTTAAAGCTTGACGGCTATTCCTCCACC-3': SEQ ID NO:46)(o sítio de Dralll é representado pelo sublinhado e o Smal é representadopelo sublinhado duplo) para amplificar uma região de gene vp39. Um frag-mento amplificado e pDual-H1N1/HA1-gp64 foram clivados com as enzimasde restrição Spel e Dralll e ligados um ao outro para construir pDual-vp39.Ainda, a PCR foi realizada com pDual-H1N1/HA1-gp64 como o molde usan-do Polh-Sl (5' GCTAACCATGTTCATGCC-3':SEQ ID NO:47) e HA1-r EcoRI(5'-GGGGAATTCACCTCTGGATTGGATGGAC-3':SEQ ID NO:48) (o sítio deEcoRI é representado pelo sublinhado). Um fragmento resultante foi digeridocom EcoRI para preparar o gene HA1. O fragmento resultante foi inseridoem pDual-vp39 digerido com EcoRI para construir pCP-H1N1/HA1-vp39.
(23) Construção de vetor de transferência pCP-H1N1/NP-vp39da presente invenção
A PCR foi realizada com pDual-H1N1/NP-gp64 como o moldeusando NP-f 5EcoRI (5'-ACGGAATTCATGGCGTCCCAAGGCACC-3': SEQID NO:49) (o sítio de EcoRI é representado pelo sublinhado) e NP-r EcoRI(5'-ACGGAATTÇATTGTCGTACTCCTCTGCATTG-3':SEQ ID N0:50) (o sítiode EcoRI é representado pelo sublinhado). Um fragmento resultante foi dige-rido com EcoRI. Um fragmento resultante foi inserido em pDual-vp39 digeri-do com EcoRI para construir pCP1-H1N1/NP-vp39.[Exemplo de Referência 1] Construção de pBACgus-CMV-PbCSP
(1.1) Construção de pcDNA-GL3 (Iuc)
Promotor-pGL3 foi clivado com as enzimas de restrição Hindll-l/Xbal, um fragmento de DNA do gene da Iuciferase (cerca de 1690 pb) foiligado aos sítios de Hindlll/Xbal de pcDNA3.1 (fornecido da Invitrogen) e oplasmídeo resultante foi chamado pcDNA-GL3 (luc).
(1.2) Construto de pBACgus-CMV-lgHsp65pcDNA-hsp65 obtido no Exemplo 1 acima (1.2) foi clivado comas enzimas de restrição BamHI/Notl e inserido nos sítios de BamHI/Notl paraproduzir pcDNA-lghsp65. O plasmídeo resultante foi chamado pcDNA-lgHsp65.
Subseqüentemente, o pcDNA-lgHsp65 foi clivado comBg1 ll/Sphl e um cassete de gene (cerca de 2850 pb) composto do promotorde CMV, o gene Hsp65 carregando a seqüência de sinal de Igk de murino eo sinal de poli A derivado do hormônio de crescimento bovino foi inseridonos sítios de Bg1 ll/Sphl de pBACgus-1 (Novagen). O plasmídeo construídofoi chamado pBACgus-CMV-Hsp65.
(1.3) Construção de pBACgus-CMV-GL3
O plasmídeo pcDNA-GL3 (Luc) obtido acima foi clivado com asenzimas dé restrição Nhel/Xbal, o fragmento de DNA do gene da Iuciferase(cerca de 1690 pb) foi· inserido nos sítios de Nhel/Xbal do plasmídeo pBAC-gus-CMV-Hsp65, e o plasmídeo resultante foi chamado pBACgus-CMV-GL3.
(1.4) Construção de pBACgus-CMV-PbCSP
Um fragmento de gene codificando a seqüência de aminoácidocorrespondendo às posições 21 a 306 do peptídio de PbCSP foi fornecidoatravés de clivagem do plasmídeo pBACsurf-CSP com as enzimas de restri-ção Pstl e Smal, o fragmento de DNA (cerca de 858 pb) foi inserido nos sí-tios de Pstl e Smal de pBACgus-CMV-GL3 obtido acima, e o plasmídeo re-sultante foi chamado pBACgus-CMV-PbCSP.
(1.5) Construção de pBACgus-CMV-HA-"full"PCR-BIunt-HA foi clivado com BamHI/Sse8387l e um fragmentode DNA do gene HA (cerca de 1750 pb) foi inserido no sítio de BamHI/Pstlde pBiuescript Il (KS-) para construir o plasmídeo pBluescript-HA.
Ainda, o pBluescript-HA foi clivado com Hindlll/Xbal, e um frag-mento de DNA do gene HA (cerca de 1800 pb) foi inserido nos sítios de Hin-dlll/Xbal de pBACgus-CMV-GL3 obtido em (1.3) para construir o plasmídeopBACgus-CMV-HA-full.
[Exemplo 2] Baculovírus recombinante e método para sua pro-dução da presente invenção
(1) O baculovírus recombinante foi feito usando o kit (BacVec-tor-2000 Transfection Kit fornecido da Novagen) para fabricação do baculoví-rus recombinante, através de co-transfecção do DNA de BacVector-2000com cada um dos vetores de transferência: pDual-Hsp65-gp64, pDual-PbCSP-gp64, pDual-H1N1/HA1-gp64, pDual-PbTRAMP-gp64, pDual-PbAMAI D123-gp64, pDual-PbMSP-119-gp64, pDual-PfCSP-gp64, pDual-PfAMAI-gp64, pDual-Pfs25-gp64, pCP-H1N1/HA1-gp64, pCAP-H1N1/HA1-gp64, pCU-H1 N1/HA1 -gp64, pDual-H1 N1/NP-gp64, pDual-H1N1/M2-gp64,pDual-H1 N1/NAe-gp64, pDual-M2e-gp64, pCP-HA1/NC99-gp64, pCP-H1N1/HA0-gp64, pCP-H1N1/HA2-gp64, pCP-H1N1/HA1-vp39, pCP-H1N1/NP-vp39 construído no Exemplo 1 acima e os plasmídeos pBACgus-CMV-PbCSP e pBACgus-CMV-HA-full obtidos no Exemplo de Referência 1em células Sf-9.
Os baculovírus recombinantes feitos foram chamados AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PbCSP, AcNPV-DuaI-HI N1/HA1, AcNPV-DuaI-PbTRAMP1 AcNPV-DuaI-PbAMAI D123, AcNPV-Dual-PbMSP-119, AcNPV-CMV-PbCSP, AcNPV-CMV-HA-full, AcNPV-HI N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-HI N1/HA1, AcNPV-DuaI-HI N1/NP, AcNPV-DuaI-H1N1/M2, AcNPV-DuaI-HI N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-HI N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-HI N1/HA1 -vp39 e AcNPV-CP-HI N1/NP-vp39, respectivamente.
As células Sf-9 foram culturadas de modo a se tornarem 2 χ 107células por placa de 150 mm para cultura (sumilon fornecida da Akita Sumi-tomo Bakelite Co., Ltd.) e cada baculovírus descrito acima foi infectado emuma multiplicidade de infecção de cerca de 5. Após 5 a 6 dias, o meio foicentrifugado a 10.000 xg a 4Q C por 25 minutos para coletar um sobrenadan-te, que foi centrifugado mais usando uma ultracentrífuga Beckman (rotor tiposwing SW28) a 25.000 rpm a 4e C por 90 minutos para dar partículas virais.
(2) O baculovírus recombinante pode ser feito usando o kit (Bac-Vector-2000 Transfection Kit fornecido da Novagen) para fabricação do ba-culovírus recombinante, através de co-transfecção do DNA do BacVector-2000 com cada um dos vetores de transferência: pDual-H5N1/HA1-gp64 epDual/SARS/S-gp64 construído no Exemplo 1 acima em células Sf-9. Osbaculovírus recombinantes a serem feitos são chamados AnNPV-H5N1/HA1e AcNPV-Dual-SARS/S, respectivamente.
As células Sf-9 foram culturadas de modo a se tornarem 2 χ 107células por placa de 150 mm para cultura (sumilon fornecida da Akita Sumi-tomo Bakelite, Co., Ltd.) e cada baculovírus descrito acima foi infectado emuma multiplicidade de infecção de cerca de 5. Após 5 a 6 dias, o meio podeser centrifugado a 10.000 xg a 4°C 25 minutos para coletar o sobrenadante,que pode ser centrifugado mais usando a ultracentrífuga (rotor tipo swingSW28) a 25.000 rpm a 4°C por 90 minutos para dar partículas virais.
[Exemplo 3] Teste do efeito farmacológico de baculovírus re-combinante da presente invenção
(Teste de efeito farmacológico como vacina para malária)(Teste de prevenção de infecção por malária)3. Métodos experimentais
3.1 Inoculacão de vacina
Uma solução de vírus recombinante para vacina foi inoculadapara camundongos-fêmea BALB/c três vezes em intervalos de três sema-nas. No caso de injeção no músculo da coxa, a quantidade foi 0,2 mL/corpo,e a solução de vírus foi preparada de modo que a quantidade de vírus era 5χ 106 pfu/corpo.
3.2 Infecção de camundonqos com malária
Os camundongos em cada grupo foram anestesiados com umasolução de anestesia para camundongos, 3 semanas após a terceira inocu-iação da vacina, e infectados com malária fazendo com que cepa DAS 500de Anopheles stephensis infectada com clone de Plasmodium berghei ANKA2.34 mordesse os camundongos.
3.3 Cálculo da taxa de sobrevivência de camundonao em cadagrupo
Após a infecção com malária, casos de morte em cada grupoforam contados, e a taxa de sobrevivência dos camundongos em cada grupofoi calculada.
3.4 Para o efeito de prevenção de infeccão por malária da com-posição farmacêutica da presente invenção como a vacina, os resultados doteste de efeito farmacolóaico são mostrados na Tabela 1. A taxa de sobrevi-vência em cada grupo foi mostrada nas colunas da direita na Tabela 1.
Conforme mostrado na Tabela 1, todos os camundongos ondeos eritrócitos infectados com malária no sangue periférico tinham sido identi-ficados estavam mortos dentro de 38 dias após a infecção. Dentre o vírusrecombinante onde o gene de antígeno (CSP) na fase esporozoíta tinha sidoinserido, no grupo (grupo No. 4) onde o baculovírus recombinante (Exemplo1 (2)) contendo o vetor de transferência: AcNPV-Dual-PbCSP) obtido no E-xemplo 2 tinha sido inoculado intramuscularmente, 100% do efeito de pre-venção de infecção foram observados.
No baculovírus do tipo selvagem (grupo No. 2), nenhuma dife-rença do grupo controle (grupo No. 1) foi observada. No grupo (grupo No. 3)onde o baculovírus recombinante obtido no Exemplo 2 usando o promotor demamífero (AcNPV-CMV-PbCSP, incluindo o vetor no Exemplo de Referência1) tinha sido incluído, a taxa de sobrevivência ligeiramente maior foi obser-vada comparado com o grupo controle, sugerindo a probabilidade de que oefeito pela inoculação do vírus apareceu embora fosse fraco.Tabela 1Taxas de sobrevivência de camundongos em cada grupo
<table>table see original document page 61</column></row><table>[Exemplo 4] Teste de efeito farmacológico de baculovírus re-combinante da presente invenção(Teste de efeito farmacológico como vacina do vírus influenza)
(Teste de prevenção de infecção pelo vírus influenza)
4. Métodos experimentais
4.1 Vacina
Uma solução de vírus para vacina foi inoculada duas vezes emintervalos de 2 semanas. O vírus da vacina foi injetado a 1065 pfu por ca-mundongo no músculo da coxa usando uma seringa com 26G para injeçãode insulina.
4.2 Preparação de solução de vírus para provocação
No dia da infecção com vírus influenza, uma solução de vírusarmazenada da cepa A/PR/8/34 do vírus influenza foi naturalmente descon-gelada em temperatura ambiente. A solução de vírus armazenada descon-gelada foi diluída para 1000 TCID50/0,05 mL para infecção do trato respirató-rio inferior e 1000 TCID5o/0,005 mL para infecção do trato respiratório supe-rior usando Solução Salina Tamponada de Fosfato da Dulbecco: (D-PBS)contendo 10% de BSA estéril: albumina de soro bovino para fazer a soluçãode vírus para provocação.
4.3 Inoculacão intranasal de solução de vírus
Duas semanas após a segunda inoculação de vacina, os ca-mundongos foram anestesiados através da administração intramuscular de0,05 mL da solução de anestesia para camundongos. A solução de vírusinfluenza feita em 4.2 foi inoculada no nariz dos camundongos a 0,005 mLpara a infecção do trato respiratório superior ou 0,05 mL para a infecção dotrato respiratório inferior.4.4 Amostragem de pulmão
Três dias após a inoculação do vírus, 0,1 ml_ por camundongoda solução de anestesia para camundongos foi intramuscularmente adminis-trado a 4 camundongos em cada grupo, e eutanizados através de hemorra-gia da aorta abdominalis sob a anestesia. Subseqüentemente, os camun-dongos foram anatomizados e o pulmão foi esterilmente removido.
4.5 Registros de taxa de sobrevivência dos camundongos apósa inoculação de vírus influenza
Até 11 dias após a inoculação de vírus influenza, a taxa de so-brevivência dos camundongos foi confirmada e registrada uma vez por dia.
4.6 Preparação de homooenato pulmonar e solução de diluição
Um homogenato pulmonar foi feito adicionando 3 mL de BSA a0,1%, HEPES a 10 mM, Meio Essencial Mínimo (MEM, GIBCO) contendoantibióticos e homogeneização usando um homogeneizador polytron. O ho-mogenato pulmonar foi dispensado em criotubos e armazenado em um con-gelador de temperatura ultrabaixa.
Uma série de diluição de 10 vezes ou 100,5 vezes foi feita usandoo meio MEM ao qual os antibióticos acima e tripsina (SIGMA, T-4549, 2mg/mL) tinham sido adicionados.
4.7 Preparação de meio para crescimento celular
O meio para crescimento celular (MEM + FEBS a 10%) foi pre-parado adicionando 50 mL de soro bovino fetal: FBS a 500 ml de MEM earmazenado em um refrigerador até uso.
4.8 Cultura de MDCK (rim canino Madin-Darbv) derivada de rimcanino
As células MDCK congeladas e armazenadas foram rapidamen-te descongeladas em água morna, então suspensas em 10 mL do meio paracrescimento celular, e o sobrenadante foi removido através de centrifugação(1000 rpm, 5 minutos, 4°C). Um pélete de célula coletado através de centri-fugação foi suspenso no meio para crescimento celular. As células foramsemeadas em um frasco de cultura, e culturadas em uma incubadora comCO2 a 5% a 37°C. Após o início da cultura, morfologia e crescimento dascélulas foram observados sob um microscópio, um pouco antes das célulasMDCK se tornarem confluentes, as células foram lavadas com D-PBS(-), otratamento com tripsina foi dado às células para dispersar e as células foramsuspensas no meio para crescimento celular. A suspensão celular foi seme-ada no frasco de cultura, e o meio fresco para crescimento celular foi adicio-nado para fazer passagem celular.
4.9 Preparação de meio para crescimento viral (meio de manu-tenção)
O meio onde BSA a 0,1% tinha sido adicionado a 500 mL deMEM (tampão HEPES a 10 mM foi adicionado) foi tornado o meio para cres-cimento de vírus (MEM + BSA a 0,1%) e foi armazenado no refrigerador a-pós a preparação até uso. O antibiótico foi adicionado em uso.
4.10 Medição de título de infectividade viral (Efeito Citopático,método CPE)
Um pouco antes das células MDCK no frasco de cultura se tor-narem confluentes, o tratamento com tripsina foi dado às células para dis-persar as células, o número de células foi contado, e a suspensão de célulasMDCK a 6 χ 105 células/mL foi preparada usando o meio de manutenção.Este foi dispensado em 0,05 mL em cada cavidade de uma placa de 96 ca-vidades, e culturado da noite para o dia na incubadora de CO2 com CO2 a5% a 37°C.
No dia subseqüente, foi confirmado que as células aderiram, ecada diluição de homogenato de pulmão feita previamente foi dispensadaem 0,05 mL em cada cavidade para 6 cavidades na placa de 96 cavidades,que foi então culturada na incubadora de CO2 com CO2 a 5% a 37°C por 3dias.
No 3g dia da cultura, foi confirmado que as células na cavidadeeram desnaturadas, então uma solução de violeta cristal contendo formalinaa 30% foi dispensada em 0,05 mL em cada cavidade na placa de 96 cavida-des para fixar e tingir as células, e o título de infectividade do vírus no pul-mão foi calculado através do método Reed-Münch.
4.11 Efeitos de cada grupo de vacina sobre o título de infectivi-dade de vírus in vivo no camundongo
Os títulos de infectividade nos homogenatos de pulmão de muri-no no grupo controle (inoculado com AcNPV) e os grupos de teste (inocula-dos com o baculovírus recombinante [incluindo o vetor de transferência:AcNPV-DuaI-HI N1/HA1 obtido no Exemplo 1(3)] e o baculovírus recombi-nante [contendo o vetor: AcNPV-CMV-H1N1/HA-full obtido no Exemplo deReferência 1]) foram comparados. Cada título de infectividade viral foi con-vertido em logaritmo. O efeito terapêutico entre os grupos foi analisado atra-vés do teste Tukey (Release 8.1, SAS Institute Japan Ltd.) considerando suamultiplicidade).
Os resultados são mostrados na figura 1.Efeito de cada vacina sobre período de sobrevivência após ainfecção com vírus influenza
Os períodos de sobrevivência no grupo controle (inoculado comAcNPV) e os grupos de vacina (inoculados com AcNPV-DuaI-HI N1/HA1 ouAcNPV-CMV-HI N1/HA-full) foram comparados usando o teste Iog rank, e osresultados são mostrados na figura 2.
Análise estatística foi realizada usando sistema SAS (SAS Insti-tute Japan, R.8.1). Um nível significante era 5%.4.12 Título de infectividade de vírus em pulmão
No grupo onde AcNPV-DuaI-HI N1/HA1 tinha sido inoculado in-tramuscularmente, o título de infectividade do vírus em pulmão no dia 6 apósa infecção foi significantemente inibido (p=0,0009) comparado com o grupocontrole (inoculado com AcNPV). Nesse ínterim, no grupo onde AnNPV-Dual-Hl N1/HA1 tinha sido inoculado intramuscularmente, o título de infecti-vidade do vírus no pulmão no dia 6 após a infecção foi significantementeinibido (p=0,0094) comparado com o grupo onde AcNPV-CMV-H1N1/HA-fulltinha sido inoculado.
4.13 Período de sobrevivênciaNo grupo onde AcNPV-DuaI-HI N1/HA1 tinha sido inoculado in-tramuscularmente, o período de sobrevivência foi significantemente prolon-gado (p=0,0031) comparado com o grupo controle (inoculado com AcNPV).Neste ínterim, o período de sobrevivência no grupo onde AcNPV-CMV-H1N1/HA-full tinha sido inoculado não foi significantemente diferente(p=0,7851) daquele no grupo controle (inoculado com AcNPV). O período desobrevivência no grupo onde AcNPV-DuaI-HI N1/HA1 tinha sido inoculadointramuscularmente foi significantemente prolongado (p=0,0031) comparadocom o grupo onde AcNPV-CMV-HI N1/HA-full tinha sido inoculado.
Neste sistema de avaliação, o camundongo faz pneumonia pelovírus influenza e morre. Então, pode ser especulado que crescimento do ví-rus em pulmão foi inibido para reduzir a morte de camundongo de pneumo-nia através da inoculação de AcNPV-DuaI-HI N1/HA1 intramuscularmente.
[Exemplo 5] Teste de expressão de antígeno de vacina de bacu-lovírus recombinante da presente invenção em células de inseto
As células Sf-9 foram culturadas a 3 χ 106 células por cavidadeem uma placa de 12 cavidades, e partículas de baculovírus de AcNPV-DuaI-PbCSP, AcNPV-Dual-HSP65 ou AcNPV-DuaI-HI N1/HA1 obtido no Exemplo2 ou o baculovírus do tipo selvagem, AcNPV-WT como o controle foram in-fectadas em multiplicidade de infecção de cerca de 5. Após 3 a 4 dias, o so-brenadante da cultura foi removido, a placa foi enxaguada três vezes comPBS e então 0,2 mL por cavidade de solução Leamuli (Tris-cloridrato pH 6,8,SDS a 2%, glicerol a 10%, azul de bromofenol a 0,1%) contendo-2-mercaptoetanol a 2% foi adicionado para Iisar completamente as células. Aamostra foi fervida a 95°C por 5 minutos e eletroforada em SDS-PAGE. A-pós a eletroforese, a proteína foi transferida para uma membrana PVDF(Immobilon-P fornecido da Millipore) e bloqueio foi realizado através de i-mersão da membrana em "block ace" (fornecido da Dai Nippon Pharmaceu-tical Co., Ltd.) a 4°C por 12 horas. Western blotting foi realizado através doprocedimento que segue. A membrana para a qual as proteínas das célulasSf-9 infectadas com cada baculovírus tinham sido transferidas foi incubadacom um anticorpo monoclonal anti-FLAG de camundongo (fornecido daSIGMA) como o anticorpo primário, e então incubada com um anticorpo IgG(H+L) anticamundongo de cabra marcado com biotina como o segundo anti-corpo (fornecido da Vector). Ainda, uma fosfatase alcalina marcada com avi-dina (fornecida da GIBCO-BRL) foi adicionada e uma cor foi desenvolvidacom NBT/BCIP (fornecido da GIBCO-BRL) para detectar faixas da proteína.
Os resultados são mostrados na figura 3.
A figura 3 mostra análise Western blotting mostrando a expres-são do antígeno de fusão do gene HA do vírus influenza, do gene Hsp65 deM. tuberculosis e do gene CSP do parasita da malária do vetor de transfe-rência recombinante no baculovírus recombinante nas células de inseto. Nafigura, a faixa 1 mostra as faixas do baculovírus do tipo selvagem (AcNPV-WT), a faixa 2 mostra faixas do baculovírus recombinante (AcNPV-DuaI-H1N1/HA1) onde o gene HA do vírus influenza foi inserido sob os promoto-res duplos da presente invenção, a faixa 3 mostra as faixas do baculovírusdo tipo selvagem (AcNPV-WT), a faixa 4 mostra as faixas do baculovírusrecombinante (AcNPV-Dual-Hsp65) onde o gene Hsp65 de M. tuberculosisfoi inserido sob os promotores duplos da presente invenção, a faixa 5 mostraas faixas do baculovírus do tipo selvagem (AcNPV-WT) e a faixa 6 mostra asfaixas do baculovírus recombinante (AcNPV-Dual-PbCSP) onde o gene CSPdo parasita da malária foi inserido sob os promotores duplos da presenteinvenção.
Conforme mostrado nas faixas 2, 4 e 6 na figura, a faixa corres-pondendo ao produto de fusão expresso do gene de antígeno estrangeiroimunogênico e o gene gp64 é observada no baculovírus recombinante ondecada gene de antígeno e o gene gp64 foram fundidos e expressos sob ospromotores duplos da presente invenção.
A partir disto, foi identificado que o gene de antígeno estrangeiroimunogênico e o gene gp64 podem ser fundidos e expressos nas células deinseto.
[Exemplo 6] Teste de expressão de antígeno de vacina a partirde baculovírus recombinante da presente invenção em mamífero
Células HepG2 foram infectadas com AcNPV-Dual-Hsp65, ouAcNPV-WT como o controle em uma multiplicidade de infecção de cerca de1. Após 24 horas, o sobrenadante da cultura foi removido, a placa foi enxa-guada três vezes com PBS, e então uma solução de acetona etanol (7:3)esfriada para -20°C foi adicionada para fixar as células a -20°C por 5 minu-tos. O bloqueio foi realizado em temperatura ambiente através da adição desoro de cabra normal a 5% (fornecido da Sigma). Subseqüentemente, umanticorpo anti-Hsp65 de camundongo (Yoshida e outros, Vaccine 2005) co-mo o anticorpo primário e então o IgG anticamundongo de cabra marcadocom FITC (H+L) foram adicionados e incubados. As células reagidas foramdetectadas sob um microscópio de fluorescência.
Células HepG2 foram também culturadas 1 χ 107 células por pla-ca de 100 mm para cultura de célula e infectadas com as partículas de bacu-lovírus, AcNPV-DuaI-HI N1/HA1 ou AcNPV-CMV-H1N1/HA-full ou AcNPV-WT como o controle em uma multiplicidade de infecção de 5. Após 2 horas,o sobrenadante da cultura foi removido, a placa foi enxaguada três vezescom PBS e então as células foram culturadas no meio não contendo metio-nina e cisterna (meio onde FBA a 10% dialisado contra PBS foi adicionado ameio Eagle Modificado da Dulbecco (Invitrogen) por 3 horas. Uma soluçãode metionina e cisteína marcada com isótopo (TRANS35S-LABEL MP Bio-medicals, Inc.) foi adicionada em uma concentração final 5 pCi/mL. Após 12horas, o sobrenadante da cultura foi removido, a placa foi enxaguada trêsvezes com PBS, e então as células foram Iisadas com 0,5 mL de tampãoRIPA (desoxicolato de sódio a 1 %, Triton X-100 a 1 %, SDS a 0,1%, Tris-HCIa 10 mM [pH 7,5]) para fazer uma amostra. A amostra foi adicionada ao veí-culo Protein A-Sepharose CL-4B (Pharmacia) ao qual o soro do camundon-go infectado com vírus influenza tinha sido absorvido previamente, e incuba-da em gelo por 2 horas. O veículo foi lavado 5 vezes com tampão RIPA, so-lução Leamuli contendo 2-mercaptoetanol a 2% foi adicionada, a amostra foifervida a 95°C por 5 minutos e eletroforada em SDS-PAGE a 6%. Após aeleteroforese, o gel foi seco e a proteína reagida com o anticorpo foi detec-tada através de auto-radiografia.
Os resultados são mostrados nas figuras 4 e 5.
A figura 4 (A) mostra as células tingidas com o anticorpo marca-do com fluorescência mostrando a expressão do gene Hsp65 de M. tubercu-Iosis no baculovírus recombinante em células HepG2.A figura 4 (B) mostra o caso onde o baculovírus do tipo selva-gem foi adicionado a células HepG2.
Como é evidente de (A) na figura, é constatado que o baculoví-rus recombinante usando o vetor de transferência com os promotores duplosda presente invenção pode expressar o antígeno objeto nas células de ma-mífero.
Isto sugere que quando administrado ao mamífero incluindo se-res humanos, o baculovírus recombinante produzido a partir do vetor detransferência recombinante da presente invenção invade as células de ma·mífero, o promotor de mamífero é operado, e o gene de antígeno estrangeiroobjeto e o gene gp64 são fundidos nas células de mamífero para induzir aimunidade adquirida.
A figura 5 mostra análise de imunoprecipitação da expressão doantígeno de fusão no baculovírus recombinante onde o gene do antígeno HAdo vírus influenza foi incorporado sob os promotores duplos nas células demamífero. Na figura, a faixa 1 mostra um baculovírus do tipo selvagem(AcNPV-WT), a faixa 2 mostra o baculovírus recombinante (AcNPV-CMV-H1N1/HA-full) onde o gene do antígeno HA do vírus influenza foi incorporadosob o promotor de CMV e a faixa 3 mostra o baculovírus recombinante(AcNPV-DuaI-HI N1/HA1) onde o gene do antígeno HA do vírus influenza foiincorporado para fundir com o gene gp64 e expressar sob o promotor duplo.
No baculovírus recombinante (AcNPV-CMV-H1N1/HA-full) ondeo antígeno HA do vírus influenza foi incorporado sob o promotor de CMV eno baculovírus recombinante (AcNPV-Dual-H1N1/HA1) onde o gene do antí-geno HA do vírus influenza foi incorporado para fundir com o gene gp64 eexpressar sob os promotores duplos, é evidente que a proteína que especifi-camente reage com o soro infectado com o vírus influenza, isto é, a proteínaincluindo o antígeno HA foi recém-sintetizada em células HepG2.
A partir disto, é pensado que o baculovírus recombinante da pre-sente invenção expressa a proteína de antígeno codificada pelo gene deantígeno estrangeiro imunogênico desejado mesmo nas células de mamífe-ro, e que quando o vírus recombinante é administrado aos mamíferos inclu-indo seres humanos, com a expressão do antígeno de fusão em células hu-manas, a imunidade adquirida específica para o antígeno pode ser induzida.
[Exemplo 7] Teste de identificação de antígeno de fusão em an-tígeno de vacina apresentado em partícula viral (virion) de baculovírus re-combinante da presente invenção
A 0,005 ml_ de cada solução de concentração de vírus das partí-culas de baculovírus, ÀcNPV-WT, AcNPV-CMV-PbCSP, AcNPV-PbCSPsurfou AcNPV-Dual-PbCSP coletado através de ultracentrífuga, 0,005 mL desolução Leamuli (2x) foi adicionado, que foi então fervido a 95°C por 5 minu-tos, e eletroforado em SDS-PAGE a 6%. Após a eletroforese, as proteínasforam transferidas para a membrana de PVDF (Immobilon-P fornecida daMillipore) e bloqueio foi realizado através de imersão da membrana em"blockace" (fornecido da Daí Nippon Pharmaceutical, Co., Ltd.) a 4°C por 12horas. O Western blotting foi realizado através do procedimento que segue.
A membrana à qual as proteínas de partícula viral foram transferidas foi in-cubada com o anticorpo monoclonal anti-FLAG (fornecido da SIGMA) comoanticorpo primário, e então incubada com o anticorpo IgG anticamundongode cabra marcado com biotina (H+L) como o segundo anticorpo (fornecidoda Vector). Ainda, fosfatase alcalina marcada com avidina (fornecido daGIBCO-BRL) foi adicionada e a cor foi desenvolvida com NBT/BCIP (forne-cido da GIBCO-BRL) para detectar faixas da proteína.
Os resultados são mostrados na figura 6.A figura 6. mostra análise Western blotting mostrando a expres-são do gene CSP da malária (PbCSP) nas partículas virais do baculovírusrecombinante feito do vetor de transferência recombinante. Na figura, a faixamostra o baculovírus do tipo selvagem, a faixa 2 mostra o baculovírus re-combinante feito do vetor de transferência onde o gene do antígeno PbCSPfoi inserido sob o controle do promotor de mamífero, a faixa 3 mostra o bacu-lovírus recombinante feito do vetor de transferência onde o gene do antígenoPbCSP foi inserido para fundir com o gene gp64 e expressar sob o controledo promotor de poliedrina do baculovírus e a faixa 4 mostra o baculovírusrecombinante feito do vetor de transferência onde o gene do antígenoPbCSP foi inserido para fundir com o gene gp64 e expressar sob o controledos promotores duplos. Os baculovírus foram eletroforados e o produto deexpressão do gene PbCSP e o gene gp64 fundidos foi identificado.
Conforme mostrado nas faixas 3 e 4, para AcNPV-PbCSPsurf eAcNPV-Dual-PcCSP, a faixa forte que indicou a presença do antígeno defusão foi identificada nas partículas virais recombinantes.
Deste modo, do Exemplo 7, é constatado que no baculovírusrecombinante produzido a partir do vetor de transferência recombinante dapresente invenção, o produto de expressão do gene gp64 fundido ao geneestrangeiro imuriogênico desejado pode estar presente nas partículas viraisrecombinantes.
Exemplo 8: Expressão de gene sustentada por troca de promotor
1) Expressão de gene sustentada por troca de promotorA fim de identificar se o vírus recombinante sustenta a expres-são do antígeno em células culturadas, células HeLa foram infectadas comAcNPV-CP-HI N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1 ou AcNPV-CU-H1N1/HA1, ea expressão do antígeno foi identificada. As células foram semeadas emuma placa de 24 cavidades a 1,0 χ 104 células/cavidade, e então infectadascom o vírus em MOI = 10, 20 100, que foi aderido por uma hora. Subseqüen-temente o vírus foi removido de um sobrenadante de cultura de célula, e ascélulas foram culturadas em uma incubadora. As células foram coletadascom o tempo, e RNA foi extraído. RT-PCR foi realizada com o RNA extraídocomo o molde usando o iniciador HA1_F01 (5'-GAGCTGAGGGAGCAATTGAG-3' (seqüência: SEQ ID NO: 51) e o iniciador HA1_R01 (5'-GGGTGATGAATACCCCACAG-3'(seqüência: SEQ ID NO: 52). O DNA amplificado foianalisado em eletroforese.
Como um resultado, a expressão foi identificada em todos ostrês tipos, confirmando que o promotor de CMV pode ser convertido em ou-tro promotor eucariótico com relação ao baculovírus recombinante da pre-sente invenção.
A figura 7 mostra os resultados de detecção da expressão degene em células HeLa através de RT-PCR. M representa marcadores deDNA para eletroforese. Amostras são como segue.
1. RNA de células infectadas com vírus do tipo selvagem em MOI=I 0;
2. RNA de células infectadas com vírus do tipo selvagem em M0l=20;
3. RNA de células infectadas com vírus do tipo selvagem em MOI=IOO;
4. RNA de células infectadas com AcNPV-CP-H1N1/HA1 em MOI=I 0;
5. RNA de células infectadas com AcNPV-CP-H1N1/HA1 em M0l=20;
6. RNA de células infectadas com AcNPV-CP-H1N1/HA1 em MOI=IOO;
7. RNA de células infectadas com AcNPV-CU-HI N1/HA1 em MOI=I0;
8. RNA de células infectadas com AcNPV-CU-H1N1/HA1 em M0l=20;
9. RNA de células infectadas com AcNPV-CU-HI N1/HA1 em MOI=I 00;
10. RNA de células infectadas com AcNPV-CAP-HI N1/HA1 em MOI=IO;
11. RNA de células infectadas com AcNPV-CAP-HI N1/HA1 em M0l=20;
e
12. RNA de células infectadas com AcNPV-CAP-H1N1/HA1 em MOI=IOO;
A amostra foi coletada com o tempo 0 hora, um dia, 4 dias e 7dias após a infecção, foi amplificada através de RT-PCR e DNA amplificadofoi eletroforado.
Exemplo 9: Título de anticorpo e imunidade celular induzida porvírus recombinante de antíaeno PbCSP
1. Inoculacão de vacina
Uma solução do vírus recombinante para vacinação foi inocula-da em carriundongos fêmea BALB/c três vezes em intervalos de três sema-nas. Uma dose de inoculação foi preparada a 0,2 mUcorpo correspondendoa 1 χ 108 pfu/corpo de uma quantidade de vírus para injeção intramuscularem um músculo da coxa. O vírus do tipo selvagem (AcNPV-WT), AcNPV-PbCSPsurf (Yoshida e outros, Virology 316:161-70, 2003) ou AcNPV-DuaI-PbCSP foi injetado como a vacina.
2. Anatomia do camundonao
O camundongo foi eutanizado três semanas após a última imu-nização, e soro e baço foram removidos do camundongo. O soro foi usadopara medição do título de anticorpo específico e o baço foi usado para en-saio ELISPOT.3. Medição de títulos de anticorpo
O título de anticorpo foi medido através de ELISA usando umaplaca onde uma proteína recombinante PbCSP forçadamente expressa emEscherichia coli e purificada/recuperada foi imobilizada. O ELISA foi realiza-do de acordo com os métodos-padrão. Como um resultado, embora nenhumaumento do título de anticorpo fosse identificado em grupos onde nenhumvírus tinha sido inoculado ou o vírus do tipo selvagem tinha sido inoculado, oaumento do título de anticorpo específico pôde ser identificado no grupo on-de AcNPV-PbCSPsurf tinha sido inoculado e o grupo onde AcNPV-DuaI-PbCSP tinha sido inoculado.
Na figura 8, títulos de anticorpo IgG específicos para PbCSP nogrupo de não-inoculação, no grupo de inoculação do vírus do tipo selvagem,no grupo de inoculação de AcNPV-PbCSPsurf e no grupo de inoculação deAcNPV-Dual-PbCSP são mostrados.
4. Avaliação de imunidade celular usando ensaio ELISPOT
Ensaio ELISPOT foi realizado usando células de baço de ca-mundongos imunizados. As células do baço do camundongo foram prepara-das e um número apropriado das células foi adicionado a MuItiScreen-IP(Millipore). Um peptídio (seqüência de aminoácido: SYIPSAEKI SEQ IDNO:53) conhecido como um .epitopo CD 8 de PbCSP foi adicionado a elas,que foram então culturadas da noite para o dia. Subseqüentemente a reaçãofoi realizada usando ELISPOT Mouse IFN-ySet (BD Sciences), e uma cor foidesenvolvida usando "AEC substrate set" (BD Science). O número de célulaque tinha respondido especificamente para o antígeno foi identificado me-dindo pontos coloridos. Como resultado, nenhuma célula específica de antí-geno poderia ser identificada no grupo onde nenhum vírus, o vírus do tiposelvagem ou AcNPV-PbCSPsurf tinha sido inoculado, mas cerca de 350 cé-lulas reagidas por 106 células de baço foram identificadas no grupo ondeAcNPV-Dual-PbCSP tinha sido inoculado. Isto demonstrou que AcNPV-DuaI-PbCSP pode mais significantemente induzir a imunidade celular do queAcNPV-PbCSPsurf.
Na figura 9, os números de células produzindo IFN-γ específicaspara o epitopo de CTL de PbCSP no grupo de não-inoculação, no grupo deinoculação de vírus do tipo selvagem, no grupo de inoculação de AcNPV-PbCSPsurf e no grupo de inoculação de AcNPV-Dual-PbCSP são mostra-dos.
Exemplo 10: Teste para confirmação de efeitos de antivírus devacina compreendendo um baculovírus recombinante como um ingredienteativo (Teste para confirmação de efeitos de baculovírus recombinante M2e)
O baculovírus recombinante M2e (AcNPV-Dual-M2e) em umaquantidade de 3,4 χ 108 Pfu por camundongo foi inoculado no músculo dacoxa duas vezes em intervalo de duas semanas. Os camundongos foraminfectados com vírus influenza A/PR8/34 através de inoculação de 0,005 mLde solução contendo 1000 TCID50 do vírus intranasalmente duas semanasapós a inoculação da vacina final. Em 6 dias após a infecção, os camundon-gos foram eutanizados, o pulmão foi removido e a quantidade de vírus nopulmão foi detectada usando células MDCK. Como resultado, nenhum vírusinfluenza pôde ser detectado em todos os camundongos inoculados comAcNPV-Dual-M2e. Ao mesmo tempo, este foi o mesmo efeito que no grupoonde a vacina de baculovírus recombinante HA1 (AcNPV-Dual-H1N1/HA1)(1,0 χ 107 PFU por camundongo) tinha sido inoculada no músculo da coxa.
Na figura 10, quantidades de vírus intrapulmonar 6 dias após ainfecção com vírus influenza no grupo PBS, no grupo de inoculação deAcNPV-Duàl-M2e e no grupo de inoculação de AcNPV-DuaI-HI N1/HA1 sãomostradas.
Exemplo 11. Estudo para identificação de efeito preventivo deagente farmacêutico contendo baculovírus recombinante HA1/NC99 comocomponente ativo
Baculovírus recombinante HA1/NC99 (AcNPV-Dual-HA1/NC99)a 1,0 χ 108 PFU por camundongo foi inoculado em músculo da coxa duasvezes com um intervalo de duas semanas. Duas semanas após a inoculaçãofinal, o camundongo foi infectado com vírus influenza A/NewCaledonia/20/99através da inoculação de 0,05 mL de uma solução contendo o vírus a10OOTCID50 em uma cavidade intranasal. Três dias após a infecção, o ca-mundongo foi eutanizado, pulmão foi removido e a quantidade de vírus in-trapulmonar foi detectada usando células MDCK. Como um resultado, ne-nhum vírus influenza pôde ser detectado em três de quatro camundongosinoculados com AcNPV-DuaI-HI N1/NC99.
Na figura 11, as quantidades de vírus intrapulmonar 3 dias apósa infecção com o vírus influenza no grupo PBS, no grupo de inoculação dovírus do tipo selvagem (AcNPV-WT) e no grupo de inoculação de AcNPV-DuaI-HAI/NC99 são mostradas.
As SEQ ID NOS:25 e 26 representam os iniciadors para identifi-cação da expressão de AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1 eAcNPV-CU-HI N1/HA1.
A SEQ ID NO:27 representa um peptídio conhecido como umepitopo CD8 de PbCSP.
Exemplo 12. Estudo para identificação de anticorpo específicodependendo das vias de administração de composição farmacêutica conten-do baculovírus recombinante como componente ativo
Baculovírus recombinante HA1 (AcNPV-Dual-H1N1/HA1) a 2,0 χ107 PFU por camundongo foi inoculado duas vezes com um intervalo de du-as semanas por inoculação de 0,005 mL da solução de vírus em ambos na-rizes (gota nasal), inoculando 0,05 mL da solução de vírus do nariz (rinova-cinação), inoculação de 0,05 mL da solução de vírus a partir de um tratorespiratório (através do trato respiratório) e inoculação de 0,05 mL da solu-ção de vírus em músculo da coxa (injeção muscular). Duas semanas após ainoculação final, uma lavagem nasal, uma lavagem alveolar e soro foramcoletados, e a expressão do anticorpo específico para o vírus influenza foiidentificada. O título do anticorpo foi medido através de ELISA usando umaplaca à qual um extrato de células MDCK infectadas com vírus influenzaA/PR/8/341 tinha sido imobilizado. O ELISA foi realizado de acordo com mé-todos-padrão. Como resultado, o anticorpo IgG específico foi identificado emsangue do grupo de rinovacinação, do grupo de vacinação intratraqueal e dogrupo de vacinação intramuscular. Em particular, o anticorpo foi identificadoser fortemente induzido no grupo de vacinação intratraqueal. Da mesmamaneira, o anticorpo IgG específico de antígeno foi também identificado nalavagem nasal e na lavagem alveolar, e, em particular, o anticorpo foi forte-mente induzido no grupo de vacinação intratraqueal. Ainda, no grupo de va-cinação intratraqueal, a produção de anticorpo IgA específico de antígeno foitambém identificada na lavagem alveolar.
Na figura 12, os resultados de ELISA medindo o anticorpo IgG,específico para vírus influenza no sangue no grupo de gota nasal, no grupode rinovacinação, no grupo de vacinação intratraqueal e no grupo de vacina-ção intramuscular são mostrados.
Na figura 13, os resultados de ELISA medindo os anticorpos IgGe IgA específicos para vírus influenza na lavagem nasal e na lavagem alveo-lar no grupo de gota nasal, no grupo de rinovacinação, no grupo de vacina-ção intratraqueal e no grupo de vacinação intramusulcar são mostrados.
Exemplo 13. Estudo para identificação de efeitos dependendodas vias de administração da composição farmacêutica contendo baculoví-rus recombinante como componente ativo
Baculovírus recombinante HA1 (AcNPV-Dual-H1N1/HA1) a 1,0 χ107 PFU por camundongo foi inoculado duas vezes com um intervalo de du-as semanas através da via de administração de gota nasal, rinovacinação,através do trato respiratório ou injeção muscular. Duas semanas após a ino-culação final, o camundongo foi infectado com vírus influenza A/PR/8/34 a-través da inoculação de 0,005 mL de uma solução contendo o vírus a10OOTCID50 na cavidade nasal. Três dias após a infecção, a lavagem nasalfoi coletada, 6 dias após a infecção, o pulmão foi removido e a quantidadede vírus pulmonar foi detectada usando células MDCK. Como resultado, aquantidade de vírus na cavidade intranasal 3 dias após a infecção foi acen-tuadamente reduzida no grupo de rinovacinação e no grupo de vacinaçãointratraqueal. Ainda, no grupo de vacinação intratraqueal, a quantidade devírus intrapulmonar 6 dias após a infecção foi reduzida para um limite de de-tecção ou menor bem como no grupo de vacinação intramuscular.
Na figura 14, as quantidades de vírus na lavagem intranasal 3dias após a infecção com vírus influenza no grupo de gota nasal, no grupode rinovacinação, no grupo de vacinação intratraqueal e no grupo de vacina-ção intramuscular são mostradas.
Na figura 15, as quantidades de vírus intrapulmonar 6 dias apósa infecção com vírus influenza no grupo de gota nasal, no grupo de rinovaci-nação, no grupo de vacinação intratraqueal e no grupo de vacinação intra-muscular são mostradas.
TEXTO LIVRE DA LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
SEQ ID NOS: 1 e 2 são as seqüências de iniciadors PbCSP-F ePbCSP-RI para PCR de DNA genômico de cepa ANKA de P. bergher,
SEG ID NOS: 3 e 4 são as seqüências de iniciadors phsp65-F1e phsp65-R1 para PCR de DNA genômico de H37Rv de M. tubercuíosis;
SEQ ID NOS: 5 e 6 são as seqüências de iniciadors phsp65-F2e phsp65-R2 para PCR com pcDNA como um molde;
SEQ ID NOS: 7 e 8 são as seqüências de iniciadors pPolh-F2 epgp64-R2 para PCR com pBACgus-1 (fornecido da Novagen) como o moldepara obtenção de um fragmento de DNA do gene gp64;
SEQ ID NOS: 9 e 10 são as seqüências de iniciadors HA-f e HA-r para PCR para produção de um fragmento de gene HA do vírus influenza;e
SEQ ID NOS: 11 e 12 são as seqüências de iniciadors pHA-F1 epHA-R1 para PCR com pCR-Blunt-HA como o molde.
SEQ ID NOS: 13 e 14 são as seqüências de iniciadors pTRAMP-F1 e pTRAMP-R1 para PCR de gene PbTRAMP.
SEQ ID NOS: 15 e 16 são as seqüências de iniciadors pAMA-F1e pAMA-R1 para PCR de domínio 123 do gene PbAMAI (D123).
SEQ ID NOS: 17 e 18 são as seqüências de iniciadors pMsp-F1e pMsp-R1 para PCR de gene PbMSP119.
SEQ ID NOS: 19 e 20 são as seqüências de iniciadors pPfCSP-F1 e pPfCSP-R1 para PCR de gene PfCSP.
SEQ ID NOS: 21 e 22 são as seqüências de iniciadors pPfA-MA1-F1 e ρPfAMAI-R1 para PCR de gene PfCSP de cepa de parasita damalária 3D7 de P. falciparum 3D7.SEQ ID NOS: 23 e 24 são as seqüências de iniciadors pPfs25-F1 e pPfs25-R1 para PCR de gene PfCSP de parasita da malária falciparum3D7.
SEQ ID NOS: 25 e 26 são as seqüências de iniciadors Polh-fRsrll e GP64-r Dralll para PCR com pCR-Blunt-HA como o molde.
SEQ ID NOS: 27 e 28 são as seqüências de iniciadors CMVenh-f Fsel e CMVenh-r Kpnl para PCR de região intensificador de CMV.
SEQ ID NOS: 29 e 30 são as seqüências de iniciadors UBBp-fKpnl e UBBp-r Rsrll para PCR da região de promotor UBB.
SEQ ID NOS: 31 e 32 são as seqüências de iniciadors NP-f E-coRI e NP-r Cfr9l para RT-PCR de RNA genômico de cepa PR8/34 do vírusinfluenza;
SEQ ID NOS: 33 e 34 são as seqüências de iniciadors M2-f E-coRI e M2-r Cfr9l para RT-PCR de RNA genômico da cepa PR8/34 do vírusinfluenza;
SEQ ID NOS: 35 e 36 são as seqüências de iniciadors NAe-fEcoRI e NAe-r Cfr9l para RT-PCR de RNA genômico da cepa PR8/34 dovírus influenza;
SEQ ID NOS: 37 e 38 são as seqüências de iniciadors M2-f E-coRI e M2e-r Cfr9l para PCR com pDual-H1 N1/M2-gp64 como um molde;
SEQ ID NOS: 39 e 40 são as seqüências de iniciadors HA1-fEcoRI e HA1-r CFr9l(NC99) para RT-PCR de RNA genômico de NewCaIe-donia99/20(NC99);
SEQ ID NOS: 41 e 42 são as seqüências de iniciadors HAO-fEcoRI e HA2-r Cfr9l para PCR com pCR-Blunt-HA como um molde;
SEQ ID NOS: 43 e 44 são as seqüências de iniciadors HA2-fEcoRI e HA2-r Cfr9l para PCR com pCR-Blunt-HA como um molde;
SEQ ID NOS: 45 e 46 são as seqüências de iniciadors vp39-f evp39-r para PCR da região do gene vp39.
SEQ ID NOS: 47 e 48 são as seqüências de iniciadors Polh-Sl eHA1 -r EcoRI para PCR de fragmento de gene HA1.
SEQ ID NOS: 49 e 50 são as seqüências de iniciadors NP-f 5EcoRI e NP-r EcoRI paraPCR com pDual-H1N1/NP-gp64 como um molde;
SEQ ID NOS: 51 e 52 são as seqüências de iniciadors para detec-ção de expressão de AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1 eAcNPV-CU-HI N1/HA1.
SEQ ID NO: 53 é um polipeptídio que é conhecido como epitopoCD8 de PbCSP.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTDEDUCATIONAL FOUNDATION JICHI MEDICAL UNIVERSITY
<120> VETOR VIRAL
<130> P07-20
<140> PCT/JP2007/052195
<141> 2007-02-08
<150> JP 2006-032863
<151> 2006-02-09
<160> 53
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 140
<212> DNA
<213> iniciador
<40Ó> 1
ggagggctag catggagaca gacacactcc tgctatgggt actgctgctc tgggttccag 60
gttccactgg tgacgcggat ccactgcagg actacaagga cgtagacaag ggatatggac 120
aaaataaagc atccaagccc 140
<210> 2
<211> 67
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 2
ggagggcggc cgcatcccgg gttttcttat ttgaaccttt tcgttttcta actcttatac 60
cagaacc 67
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 3
aataatagat ctaatggcca agacaattgc gtacgacgaa ga 42
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 4
aatccaatgc ggccgcggga attcgattcc tgcaggtcag aaatccatgc cacccatgtc 60
gcc 63
<210> 5
<211> 74
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 5
cacccctgca ggactacaag gacgacgatg acaaggaatt catggccaag acaattgcgt 60
acgacgaaga ggcc 74
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 6
cccgggcgaa atccatgcca cccatgtcgc cgccacc
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> iniciador79
<400> 7
cacccggacc ggataattaa aatgataacc atctcgcaaa taaataag 48
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 8
ggtaccatat tgtctattac ggtttctaat catac 35
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 9
cctgcaggta tgaaggcaaa cctactggtc 30
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 10
gcccgggcga tgcatattct gca 23
<210> 11<211> 37<212> DNA<213> iniciador<400> 11
caccgaattc gacacaatat gtataggcta ccatgcg 37
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 12
cccgggcacc tctggattgg atggacggaa tg 32
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 13
caccgaattc aaaattgata cgaaaaaaaa tgaag 35
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 14
cccgggcttt taattttgag gagtctttat tttc 34
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 15
caccgaattc aatccatggg aaaagtatac ggaaaaatat 40
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 16
cccgggcttc tctggtttga tgggctttca tatgcac 37
<210> 17
<211> 75
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 17
caccctgcag gactacaagg acgacgatga caagcacata gcctcaatag ctttaaataa 60
cttaaataaa tctgg 75
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> iniciador<400> 18
cccgggttcc cataaagctg gaagagctac agaatacacc 40
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 19
caccgaattc ttattccagg aataccagtg ctatggaagt 40
<21Ó> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 20
cccgggcttt ttccatttta cáaatttttt tttc 34
<210> 21
<211> 73
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 21
cacçctgcag gactacaagg acgacgatga caagcagaat tattgggaac atccatatca 60
aaatagtgat gtg 73
<210> 22<211> 34<212> DNA<213> iniciador<400> 22
cccgggcttt cattttatca taagttggtt tatg 34
<210> 23
<211> 43
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 23
caccgaattc aaagttaccg tggatactgt atgcaaaaga gga 43
<210> 24
<211> 34
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 24
cccgggcagt acatatagag ctttcattat ctat 34
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 25
gggcggaccg gataattaaa atgataacca tctcg 35
<210> 26<211> 37<212> DNA<213> iniciador<400> 26
gggcacttag tgatattgtc tattacggtt tctaatc 37
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> iniciador
<400>. 27
gggggccggc cctagttatt aatagtaatc aattac 36
<210> 28<211> 34<212> DNA<213> iniciador<400> 28
gggggtaccc atggtaatag cgatgactaa tacg 34
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> iniciador<400> 29
gggggtacct cgaggaaggt ttcttcaact c 31
<210> 30
<211> 36
<212> DNA
<2.13> iniciador
<400> 30
gggcggtccg gacctagttt aaaagtaaaa cataag 36
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 31
acggaattcc attcaattca aactgga 27
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 32
gatcccgggc cttgtcaatg ctgaatggca a 31
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 33
cggaattcat gagtcttcta accgagg 27
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 34
gatcccgggc ctccagctct atgctgac 28
<210> 35
<211> 27
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 35
acggaattcc attcaattca aactgga 27
<210> 36
<211> 31
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 36
gatcccgggc cttgtcaatg ctgaatggca a 31
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 37
cggaattcat gagtcttcta accgagg 27
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 38
gatcccgggc atcacttgaa ccgttgca 28
<210> 39
<211> 31
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 39
gatgaattcg acacaatatg tataggctac c 31
<210> 40
<211> 32
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 40gatcccgggc tctggattga atggatggga tg
<210> 41
<211> 28
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 41
ggggaattca tgaaggcaaa cctactgg
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 42
gatcccgggc gatgcatatt ctgca
<210> 43
<211> 28
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 43
gatgaattca tatttggagc cattgccg
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 44
gatcccgggc gatgcatatt ctgca
<210> 45
<211> 75
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 45
cttactagta tggactacaa ggacgacgat gacaaggaat tcggcggcgg cggctcggcgctagtgcccg tgggt
<210> 46 <211> 66 <212> DNA <213> iniciador <400> 46 cttcacttag tgatggtgat gatggtggtg cccggggctt taaagcttga cggctattcctccacc <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> iniciador <400> 47 . gctaaccatg ttcatgcc <210> 48 <211> 28 <212> DNA <213> iniciador <400> 48 ggggaattca cctctggatt ggatggac<210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> iniciador <400> 49 acggaattca tggcgtccca aggcacc<210> 50 <211> 31 <212> DNA <213> iniciador <400> 50 acggaattca ttgtcgtact cctctgcatt g<210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> iniciador<400> 51
gagctgaggg agcaattgag 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> iniciador
<400> 52
gggtgatgaa taccccacag<210> 53<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência artificial<400> 53
Ser Tyr Ile Pro Ser Ala Glu Lys Ile1 5 9

Claims (31)

1. Método de produção de um vetor de transferência compreen-dendo uma estrutura na qual um promotor duplo e um gene de fusão foramincorporados, caracterizado pelo fato de que o gene de fusão compreenden-do pelo menos um gene codificando uma proteína capaz de ser um compo-nente de uma partícula viral e pelo menos um gene estrangeiro imunogênicosão ligados a jusante do promotor duplo ligando um promotor de vertebradoe outro promotor de baculovírus.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o promotorde vertebrado é um promotor de mamífero.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o gene codificando pelo menos uma proteína capaz de ser ocomponente da partícula viral é qualquer um de um gene gp64 de baculoví-rus, um gene de glicoproteína do vírus da estomatite vesicular, um gene deglicoproteína do vírus da imunodeficiência humana do tipo I, um gene deglicoproteína da membrana do vírus sincicial respiratório, um gene de prote-ína hemaglutinina do vírus influenza tipo A, um gene de proteína hemagluti-nina do vírus influenza tipo B, um gene de glicoproteína do vírus herpes sim-plex e um gene de proteína do vírus S de hepatite murina.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o promotorde vertebrado é selecionado de qualquer um de um promotor de citomegalo-vírus, um promotor de SV40, um promotor de retrovírus, um promotor demetalotioneína, um promotor de proteína de choque térmico, um promotor deCAG, um promotor de fator de alongamento 1a, um promotor de actina, umpromotor de ubiquitina, um promotor de albumina e um promotor do MHC declasse II.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o promotorde baculovírus é selecionado de um promotor da poliedrina, um promotor dap10, um promotor da IE1, um promotor da IE2, um promotor da p35, umpromotor da p39 e um promotor da gp64.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o gene es-trangeiro imunogênico é selecionado de qualquer um de um antígeno da ma-lária, um antígeno da influenza, um antígeno da M. tuberculosis, um antíge-no do vírus SARS1 um antígeno do vírus da febre do Nilo Ocidental, um antí-geno do vírus da febre do dengue, um antígeno de HIV, um antígeno deHCV, um antígeno da leishmania, um antígeno de tripanossoma, um antíge-no de Ieucocytozoon sozinho ou um antígeno de fusão de pelo menos umselecionado desse grupo de gene de antígeno com uma citocina.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o vetor detransferência é qualquer um de pDual-Hsp65-gp64, pDual-PbCSP-gp64,pDual-H1 N1/HA1 -gp64, pDual-PbTRAMP-gp64, pDual-PbAMA1D123-gp64,pDual-PbMSP129-gp64, pDual-PfCSP-gp64, pDual-PfAMA1-gp64, pDual-Pfs25-gp64, pDual-H5N1/HA1-gp64, pDual-SARS/S-gp64, pCP-H1N1/HA1-gp64, pCAP-H1N1/HA1-gp64, pCU-H1N1/HA1-gp64DpDual-H1N1/NP-gp64,pDual-H1 N1/M2-gp64, pDual-H1 N1/NAe-gp64, pDual-M2e-gp64, pGP-HA1/NC99-gp64, pCP-H1 N1/HA0-gp64, pCP-H1N1/HA2-gp64, pCP-H1N1/HA1-vp39 e pCP-H1N1/NP-vp39.
8. Método de produção de um baculovírus recombinante com-preendendo as etapas de produção de um vetor de transferência compreen-dendo uma estrutura na qual um promotor duplo e um gene de fusão foramincorporados, caracterizado pelo fato de que o gene de fusão compreenden-do pelo menos um gene codificando uma proteína capaz de ser um compo-nente de uma partícula viral e pelo menos um gene estrangeiro imunogênicosão ligados a jusante do promotor duplo ligando um promotor de vertebradoe outro promotor de baculovírus; co-transfecção do vetor de transferência eum DNA de baculovírus para uma célula hospedeiro de um inseto; e separa-ção do baculovírus recombinante.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que o gene codificando pelo menos uma proteína capaz de ser ocomponente da partícula viral é qualquer um de um gene da gp64 de bacu-lovírus, um gene de glicoproteína do vírus da estomatitè vesicular, um genede glicoproteína do vírus da imunodeficiência humana tipo I, um gene deglicoproteína da membrana do vírus sincicial respiratório humano, um genede proteína hemaglutinina do vírus influenza tipo A, um gene de proteínahemaglutinina do vírus influenza tipo B, um gene de glicoproteína do vírusherpes simplex e um gene de proteína S do vírus da hepatite murina.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o promotorde vertebrado é selecionado de qualquer um de um promotor de citomegalo-vírus, um promotor de SV40, um promotor de retrovírus, um promotor demetalotioneína, um promotor de proteína de choque térmico, um promotor deCAG, um promotor de fator de alongamento 1a, um promotor de actina, umpromotor de ubiquitina, um promotor de albumina e um promotor do MHC declasse II.
11. Método de acordo com a reivindicação 8, em qué o promotorde baculovírus é selecionado de um promotor de poliedrina, um promotor dep10, um promotor de IEI, um promotor de p35, um promotor de p39 e umpromotor de gp64.
12. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o gene es-trangeiro imunogênico é selecionado de qualquer um de um antígeno da ma-lária, um antígeno da influenza, um antígeno da M tuberculosis, um antíge-no do vírus SARS, um antígeno do vírus da febre do Nilo Ocidental, um antí-geno do vírus da febre do dengue, um antígeno de HIV, um antígeno deHCV, um antígeno da leishmania, um antígeno de tripanossoma, um antíge-no de Ieucocytozoon sozinho ou um antígeno de fusão de um selecionadodesse grupo de gene de antígeno com uma citocina.
13. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o baculoví-rus recombinante é qualquer um de AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-DuaI-PbCSP, AcNPV-DuaI-HI N1/HA1, AcNPV-DuaI-PbTRAMP, AcNPV-DuaI-PbAMAI D123, AcNPV-Dual-PbMSP129, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-DuaI-PfAMAI, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S,AcNPV-HI N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-HlN1/NP, AcNPV-DuaI-HI N1/M2, AcNPV-DuaI-HIN1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-HI N1/HA0, AcNPV-CP-Η1N1/HA2, AcNPV-CP-HI N1/HA1 -vp39 e AcNPV-CP-HI N1/NP-vp39.
14. Vetor de transferência compreendendo uma estrutura naqual um gene de fusão compreendendo pelo menos um gene codificandouma proteína capaz de ser um componente de uma partícula viral e pelomenos um gene estrangeiro imunogênico foram ligados a jusante do promo-tor duplo ligando um promotor de vertebrado e outro promotor de baculovírusque foi incorporado.
15. Vetor de transferência de acordo com a reivindicação 14,compreendendo a estrutura na qual o gene de fusão compreendendo o genecodificando pelo menos uma proteína capaz de ser o componente da partí-cula viral e pelo menos um gene estrangeiro imunogênico foram ligados ajusante do promotor duplo ligando um promotor de vertebrado e outro pro-motor de baculovírus que foi incorporado.
16. Vetor de transferência de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o gene codificando pelo menos uma proteínacapaz de ser o componente da partícula viral é qualquer um de um gene degp64 de baculovírus, um gene de glicoproteína do vírus da estomatite vesi-cular, um gene da glicoproteína do vírus da imunodeficiência humana tipo I,um gene da glicoproteína da membrana do vírus sincicial respiratório huma-no, um gene da proteína hemaglutinina do vírus infIuenza tipo A, um gene daproteína hemaglutinina do vírus da influenza tipo B, um gene da glicoproteí-na do vírus herpes simplex e um gene da proteína S do vírus da hepatitemurina.
17. Vetor de transferência de acordo com a reivindicação 15, emque o promotor de vertebrado é selecionado de qualquer um de um promotorde citomegalovírus, um promotor de SV40, um promotor de retrovírus, umpromotor de metalotioneína, um promotor de proteína de choque térmico, umpromotor de CAG1 um promotor de fator de alongamento 1a, um promotorde actina, um promotor de ubiquitina, um promotor de albumina e um promo-tor do MHC de classe II.
18. Vetor de transferência de acordo com a reivindicação 15, emque o promotor de baculovírus é selecionado de um promotor de poliedrina,um promotor de p10, um promotor de IE1, um promotor de p35, um promotorde p39 e um promotor de gp64.
19. Vetor de transferência de acordo com a reivindicação 15, emque o gene estrangeiro imunogênico é selecionado de qualquer um de umantígeno da malária, um antígeno da influenza, um antígeno da M. tubercu-losis, um antígeno do vírus SARS, um antígeno do vírus da febre do NiloOcidental, um antígeno do vírus da febre do dengue, um antígeno de HIV,um antígeno de HCV, um antígeno da leishmania, um antígeno de tripanos-soma, um antígeno de Ieucocytozoon sozinho ou um antígeno de fusão deum selecionado desse grupo de gene de antígeno com uma citocina.
20. Vetor de transferência de acordo com a reivindicação 15 queé qualquer um de pDual-Hsp65-gp64, pDual-PbCSP-gp64, pDual-H1 N1/HA1-gp64, pDual-PbTRAMP-gp64, pDual-PbAMA1D123-gp64, pDual-PbMSPI29, pDual-PfCSP-gp64, pDual-PfAMA1-gp64, pDual-Pfs25-gp64,pDual-H5N1/HA1-gp64, pDual-SARS/S-gp64, pCP-H1 N1/HA1-gp64, pCAP-H1N1/HA1-gp64, pCU-H1N1/HA1-gp64, pDual-H1N1/NP-gp64, pDual-H1N1/M2-gp64, pDual-H1N1/NAe-gp64, pDual-M2e-gp64, pCP-HA1/NC99-gp64,pCP-H1 N1/HA0-gp64, pCP-H1N1/HA2-gp64, pCP-H1N1/HA1-vp39 e pCP-H1N1/NP-vp39.
21. Baculovírus recombinante produzido através do método deprodução do baculovírus recombinante como definido em qualquer uma dasreivindicações 8 a 13.
22. Baculovírus recombinante de acordo com a reivindicação 21,que é qualquer um de AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PbCSP, AcNPV-Dual-Hl N1/HA1, AcNPV-DuaI-PbTRAMP, AcNPV-DuaI-PbAMAI D123, AcNPV-DuaI-PbMSPI 29, AeNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-DuaI-PfAMAI, AcNPV-DuaI-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-HI N1/HA1,AcNPV-CAP-HI Ν1/ΗΑ1, AeNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-DuaI-HI N1/NP,AcNPV-DuaI-HIN1/M2, AcNPV-DuaI-HIN1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 e AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39.
23. Composição farmacêutica compreendendo o baculovírusrecombinante como definido na reivindicação 21 ou 22.
24. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 23compreendendo qualquer um de AcNPV-DuaI-HI N1/HA1, AcNPV-HIN1/ΗΑ1, AcNPV-CAP-HI Ν1/ΗΑ1, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-DuaI-PfAMAI,AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-DuaI-HI N1/NP, AcNPV-Dual-Hl N1/M2, AcNPV-DuaI-HI N1/NAe, AeNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AeNPV-CP-H1 N1/HA2, AcNPV-CP-H1 N1/HA1-vp39 e AeNPV-CP-H1N1/NP-vp39.
25. Composição farmacêutica compreendendo o baculovírusrecombinante como definido na reivindicação 21 ou 22, em que a composi-ção é administrada intramuscularmente, intranasalmente ou através de inalação.
26. Vacina compreendendo qualquer um de AcNPV-DuaI-H1N1/HA1, AcNPV-HI N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-DuaI-PfCSP1 AcNPV-DuaI-PfAMAI, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-CU-H1N1/HA1,AcNPV-DuaI-HI N1/NP, AcNPV-DuaI-HI N1/M2, AcNPV-DuaI-HI N1/NAe,AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 e AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39como um ingrediente ativo.
27. Vacina de acordo com a reivindicação 26, em que a vacina éadministrada intramuscularmente, intranasalmente ou através de inalação.
28. Agente terapêutico ou preventivo para infecção pelo vírusinfluenza compreendendo AcNPV-DuaI-HI N1/HA1, AcNPV-HI N1/HA1,AcNPV-CAP-HI N1/HA1, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-DuaI-PfAMAI, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-DuaI-HI N1/NP, AcNPV-DuaI-H1N1/M2, AcNPV-DuaI-HI N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-HI N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39, AcNPV-CP-H1 N1/NP-vp39 como um ingrediente ativo.
29. Agente terapêutico ou preventivo para infecção pelo vírusinfluenza de acordo com a reivindicação 28, em que o agente é administradointramuscularmente, intranasalmente ou através de inalação.
30. Vacina para infecção pelo vírus influenza compreendendoqualquer um de AcNPV-DuaI-HIN1/HAÍ, AcNPV-HI N1/HA1, AcNPV-CAP-HI N1/HA1, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-DuaI-PfAMAI, AcNPV-Dual-Pfs25,AcNPV-CU-HI N1/HA1, AcNPV-DuaI-HI N1/NP, AcNPV-DuaI-HI N1/M2, AeNPV-Dual-Hl N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-HI N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 e AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39 como um ingrediente ativo.
31. Vacina para infecção pelo vírus influenza de acordo com areivindicação 30, em que o agente é administrado intramuscularmente, intra-nasalmente ou através de inalação.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9333249B2 (en) 2006-02-09 2016-05-10 Educational Foundation Jichi Medical University Recombinant baculovirus vaccine
TWI477602B (zh) 2006-02-09 2015-03-21 Educational Foundation Jichi Medical Univ Novel viral vector
MX2010001499A (es) * 2007-08-07 2010-03-15 Otsuka Pharma Co Ltd Vectores de baculovirus con un promotor dual de vertebrado y baculovirus que controla un gen de fusion inmunogenico.
US8871207B2 (en) 2008-07-25 2014-10-28 Humabs, LLC Neutralizing anti-influenza A virus antibodies and uses thereof
CA2733218A1 (en) 2008-07-25 2010-01-28 Institute For Research In Biomedicine Neutralizing anti-influenza a virus antibodies and uses thereof
US20110201086A1 (en) 2010-02-12 2011-08-18 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Method for producing recombinant virus
CN102234646B (zh) * 2010-04-23 2014-10-22 深圳华大基因科技有限公司 一种启动子SbUbi1、其制备方法及用途
KR20130100267A (ko) * 2010-08-09 2013-09-10 시박스, 인크. 질환을 예방하기 위한 방법 및 조성물
EP3418300B1 (en) 2011-07-18 2020-10-28 Institute for Research in Biomedicine Neutralizing anti-influenza a virus antibodies and uses thereof
US9982239B2 (en) * 2012-06-12 2018-05-29 Alternative Gene Expression S.L. Baculoviral DNA elements for the expression of recombinant proteins in a host cell
WO2016059911A1 (ja) * 2014-10-17 2016-04-21 国立大学法人金沢大学 マラリアワクチン
CL2014003146A1 (es) * 2014-11-20 2015-06-12 Univ Santiago Chile Método para producir virus arn monocatenario negativo; plásmido recombinante funcional en células animales, que consta de un esqueleto pss-urg; método de obtención de partículas virales; y uso para expresar arn, proteínas autógenas o exógenas al virus.
MA40737A (fr) 2014-11-21 2017-07-04 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Déterminants de la réponse d'un cancer à une immunothérapie par blocage de pd-1
RU2626590C2 (ru) * 2015-12-18 2017-07-28 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ) Генетическая конструкция для экспрессии генов в клетках насекомого polypedilum vanderplanki
CN105779499B (zh) * 2016-03-23 2019-11-19 江苏科技大学 重组杆状病毒和其应用及构建该重组杆状病毒的载体
CN110484657A (zh) * 2019-09-06 2019-11-22 广东省农业科学院植物保护研究所 检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式pcr引物、试剂盒及其方法
JP7649504B2 (ja) * 2022-02-18 2025-03-21 国立大学法人金沢大学 マラリアワクチン及びマラリア予防・治療方法
CN117305365B (zh) * 2023-11-28 2024-03-19 中国科学院生物物理研究所 昆虫细胞—哺乳动物细胞表达穿梭载体SmartBM-1及其应用

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4879236A (en) 1984-05-16 1989-11-07 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
CA1339413C (en) 1988-06-24 1997-09-02 Junichi Miyazaki Exogenous gene expression vector containing chick .beta.-actin gene promoter
US5169784A (en) 1990-09-17 1992-12-08 The Texas A & M University System Baculovirus dual promoter expression vector
US5762939A (en) 1993-09-13 1998-06-09 Mg-Pmc, Llc Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus
US6485729B1 (en) 1993-09-13 2002-11-26 Protein Sciences Corporation Neuraminidase-supplemented compositions
US5976552A (en) 1995-04-28 1999-11-02 Protein Sciences Corporation Virus vaccines
ES2370937T3 (es) 1993-09-13 2011-12-23 Protein Sciences Corporation Un método para producir vacunas antigripales polivalentes a base de hemaglutinina.
JP3090586B2 (ja) 1994-03-15 2000-09-25 片倉工業株式会社 システインプロテアーゼ遺伝子欠損バキュロウイルスおよびその製造法並びにこれを利用する有用タンパク質の製造法
GB9406492D0 (en) 1994-03-31 1994-05-25 Isis Innovation Malaria peptides
AU4340397A (en) 1996-09-11 1998-04-02 Biogen, Inc. Non-mammalian dna virus having an altered coat protein
US6183993B1 (en) 1996-09-11 2001-02-06 The General Hospital Corporation Complement-resistant non-mammalian DNA viruses and uses thereof
AU7126998A (en) 1997-04-16 1998-11-11 Connaught Laboratories Inc. Anti-influenza compositions supplemented with neuraminidase
GB9711578D0 (en) 1997-06-04 1997-07-30 Oxford Biomedica Ltd Novel retroviral vector production systems
GB9711957D0 (en) 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
US6716823B1 (en) 1997-08-13 2004-04-06 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof
US20030125278A1 (en) 1997-08-13 2003-07-03 Tang De-Chu C. Immunization of animals by topical applications of a salmonella-based vector
US20030045492A1 (en) 1997-08-13 2003-03-06 Tang De-Chu C. Vaccination by topical application of recombinant vectors
DE19735593C2 (de) 1997-08-15 1999-08-26 Hepavec Ag Fuer Gentherapie Hüllprotein-modifizierter Baculovirus-Vektor für die Gentherapie
US6103526A (en) 1998-10-08 2000-08-15 Protein Sciences Corporation Spodoptera frugiperda single cell suspension cell line in serum-free media, methods of producing and using
EP1181057B1 (en) 1999-05-03 2012-08-01 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof
US20040009936A1 (en) 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
US6793926B1 (en) 1999-05-27 2004-09-21 Genovo, Inc. Methods for production of a recombinant adeno-associated virus
AU783672B2 (en) 1999-05-27 2005-11-24 Genovo, Incorporated Compositions and methods for production of recombinant virus using a carrier vector derived from a nonmammalian virus
US6589783B2 (en) * 2000-04-13 2003-07-08 Novagen, Inc. Multiple host expression vector
WO2002014527A2 (en) 2000-08-11 2002-02-21 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Gp64-null baculoviruses pseudotyped with heterologous envelope proteins
JP2002235236A (ja) 2000-12-05 2002-08-23 Kuraray Co Ltd ポリビニルアルコール系水溶性繊維
US20040071733A1 (en) 2001-02-05 2004-04-15 Hiroshi Takaku Baculovirus vector vaccine
JP4655388B2 (ja) 2001-03-05 2011-03-23 富士レビオ株式会社 タンパク質の生産方法
WO2003016450A1 (en) 2001-08-14 2003-02-27 Lonza Inc. Laundry sanitizer containing partially halogenated hydantoins
GB0119852D0 (en) 2001-08-15 2001-10-10 Univ York Baculovirus
WO2003020322A1 (de) 2001-09-04 2003-03-13 DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung Vektor zur induktion einer immunantwort
JP2003284557A (ja) 2002-03-25 2003-10-07 Alarvita Biolife Corp 新規バクロウィルス移入ベクターおよび外来遺伝子発現用の組換えバクロウィルス
AU2003266628A1 (en) 2002-09-25 2004-04-19 Osaka Industrial Promotion Organization Baculovirus vector, method of constructing baculovirus vector and gene transfer method
US7416890B2 (en) 2002-09-25 2008-08-26 Osaka Industrial Promotion Organization Baculovirus vector, method of producing thereof and method of gene transfer
GB0225788D0 (en) * 2002-11-05 2002-12-11 Glaxo Group Ltd Vaccine
JP2005015346A (ja) 2003-06-23 2005-01-20 Hiroshi Takaku バキュロウイルス含有抗ウイルス剤
WO2005040388A2 (en) 2003-08-22 2005-05-06 Nucleonics Inc. Eukariotic expression systems for expression of inhibitory rna in multiple intracellular compartments
US7527967B2 (en) * 2003-11-25 2009-05-05 Academia Sinica Recombinant baculovirus and virus-like particle
GB0425739D0 (en) 2004-11-23 2004-12-22 Procure Therapeutics Ltd Humanised baculovirus 2
AU2006284756B2 (en) 2005-08-31 2012-06-07 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based malaria vaccines
JP2009001493A (ja) * 2005-09-27 2009-01-08 Nationa Hospital Organization Ｄｎａワクチン組成物
AP2008004448A0 (en) 2005-09-30 2008-04-30 Seattle Biomedical Res Inst Plasmodium liver stage antigens
TWI477602B (zh) 2006-02-09 2015-03-21 Educational Foundation Jichi Medical Univ Novel viral vector

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Publication number Publication date
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US9023365B2 (en) 2015-05-05
IL192681A0 (en) 2009-02-11
NO20083376L (no) 2008-11-07
EP1983047A1 (en) 2008-10-22

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HK1142629B (en) Baculoviral vectors with a dual vertebrate and baculovirus promoter controlling an immunogenic fusion gene

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