BRPI0707755A2

BRPI0707755A2 - construções de ácido nucléico e métodos para produção de composições alteradas de óleo de sementes

Info

Publication number: BRPI0707755A2
Application number: BRPI0707755-6A
Authority: BR
Inventors: Toni Voelker; Joanne J Fillatti; Neal A Bringe; Tim Ulmasov
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2006-02-13
Filing date: 2007-02-12
Publication date: 2011-04-26
Also published as: RU2392795C2; MX2008010413A; JP2009526550A; RU2008136856A; JP5242418B2

Abstract

CONSTRUçõES DE áCIDO NUCLéICO E MéTODOS PARA PRODUçãO DE COMPOSIçõES ALTERADAS DE óLEO DESEMENTES A presente invenção pertence ao campo de genética vegetal eprovê moléculas, construções de ácido nucléico recombinante e outros a- gentes, associados com a manipulação coordenada de múltiplos genes navia da síntese de ácidos graxos. Em particular, os agentes da presente in-venção estão associados com a expressão simultânea melhorada de certosgenes na via da síntese de ácidos graxos, e expressão suprimida de certosoutros genes na mesma via. São providas também plantas incorporando es- tes agentes e, em particular, plantas que incorporam estas construções, emque as plantas exibem composições alteradas do óleo da semente.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONSTRUÇÕESDE ÁCIDO NUCLÉICO E MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE COMPOSIÇÕESALTERADAS DE ÓLEO DE SEMENTES".

Referência cruzada a pedidos de patentes correlatos

Este pedido de patente reivindica o benefício, de acordo com 35USC- § 119(e), do pedido U.S. Provisional Application No. 60/772 614, inti-tulado "Silenciamento Gênico Modificado" e depositado em 13 de fevereirode 2006, do pedido U.S. Provisional Application No. 60/781 519, intitulado"Composições de Semente e Óleo de Soja e Método de Produção das Mes-mas" e depositado em 10 de março de 2006, e do pedido U.S. ApplicationNo. 11/376 328, intitulado "Construções de Ácido Nucléico e Métodos deProdução de Composições Alteradas de Óleo de Sementes" e depositadoem 16 de março de 2006.

Incorporação de listagem de seqüências

Uma cópia em papel da Listagem de Seqüências e disquete pa-ra leitura por computador contendo o arquivo denominado "Omni2 AS Fl-LED.txt" da listagem de seqüência com tamanho de 60.690 bytes (medidoem MS-DOS), gravados em 25 de dezembro de 2003 e depositados junto aopedido U.S. Application No. 10/669 888, são aqui incorporados por referên-cia neste pedido. Uma cópia em papel da Listagem de Seqüências e disque-te para leitura por computador contendo o arquivo denominado "Omni-Child.txt" da listagem de seqüência com tamanho de 61.434 bytes (medidoem MS-DOS), gravados em 15 de março de 2003, são aqui incorporados porreferência neste pedido.

Campo da invenção

A presente invenção é dirigida para moléculas de ácido nucléico,construções e outros agentes associados com a manipulação coordenadade múltiplos genes na via da síntese de ácidos graxos. Em particular, os a-gentes da presente invenção estão associados à expressão simultânea in-tensificada de certos genes na via da síntese de ácidos graxos e a supressãoda expressão de certos outros genes na mesma via. A presente invenção édirigida também a plantas que incorporam estes agentes e, especialmente, aplantas que incorporam estas construções, em que as plantas exibem com-posições alteradas de óleo de sementes.Antecedentes

Óleos de plantas são utilizados em uma variedade de aplica-ções.

Há necessidade de novas composições de óleos vegetais e a-bordagens melhoradas para obtenção de composições de óleo, derivadas defonte vegetal biossintética ou natural. Dependendo do uso pretendido do ó-leo, várias composições diferentes de ácido graxo são desejadas. Plantas,especialmente de espécies que sintetizam quantidades grandes de óleos emsementes, são uma fonte importante de óleo de uso comestível e industrial.Óleos de sementes são compostos quase que inteiramente por triacilglice-róis, em que ácidos graxos são esterificados para os três grupos hidroxila doglicerol.

O óleo de soja contém aproximadamente 16-20% de ácidos gra-xos saturados: 13-16% de palmitato e 3-4% de estearato. Consultar, de mo-do geral, Gunstone et ai, The Lipid Handbook, Chapman & Hall, London(1994). Óleos de soja têm sido modificados por vários métodos de melhora-mento visando beneficiar mercados específicos. No entanto, não há óleo desoja disponível, cujos benefícios abranjam os principais usuários deste tipode óleo, como consumidores de óleo de salada, óleo de cozinha e óleo parafritura, e mercados industriais, como mercados de biodiesel e biolubrificante.Os óleos de soja anteriores eram muito custosos ou desprovidos de impor-tante qualidade alimentar, como estabilidade oxidativa, a de conferir ao ali-mento frio sabor e teor de gordura saturada bons, ou de importante proprie-dade de biodiesel, como emissões apropriadas de óxido nítrico ou tolerânciaa frio ou fluxo frio.

Plantas mais altas sintetizam ácidos graxos através de uma viametabólica comum — a via da sintetase de ácido graxo (FAS), localizada nosplastídios. β-cetoacil-ACP sintases são enzimas importantes que limitam opasso da FAS de células vegetais, existindo em várias versões. A β-cetoacil-ACP sintase I catalisa o alongamento da cadeia até palmitoil-ACP (C16:0),enquanto que a β-cetoacil-ACP sintase Il catalisa o alongamento da cadeiaaté estearoil-ACP (C18:0). A β-cetoacil-ACP sintase IV é uma variante da β-cetoacil-ACP sintase Il e pode catalizar também alongamento da cadeia até18:0-ACP. Na soja, os principais produtos da FAS são 16:0-ACP e 18:0-ACP. A dessaturação de 18:0-ACP para formar 18:1-ACP é catalisada poruma delta-9 dessaturase solúvel, localizada em plastídio (referida tambémcomo "estearoil-ACP dessaturase"). ConsuItaNoelker et al., 52 Annu. Rev.Plant Physiol. Plant Moi Biol. 335-61 (2001).

Os produtos da FAS e delta-9 dessaturase em plastídios, 16:0-ACP, 18:0-ACP e 18:1-ACP, são hidrolisados por tioesterase (FAT) específi-cas (FAT). As tioesterases de plantas podem ser classificadas em duas fa-mílias de genes baseado em homologia de seqüência e preferência porsubstrato. A primeira família, FATA, inclui acil-ACP tioesterases de cadeialonga com atividade primariamente sobre 18:1-ACP. As enzimas da segundafamília, FATB, utilizam comumente 16:0-ACP (palmitoil-ACP), 18:0-ACP (es-tearoil-ACP) e 18:1-ACP (oleoil-ACP). Estas tioesterases desempenham umpapel importante na determinação da extensão da cadeia durante a biossín-tese de novo de ácidos graxos em plantas e, por conseguinte, estas enzimaspodem ser utilizadas para várias modificações em composições de ácidosgraxos, especialmente em relação às proporções relativas de vários gruposde acil graxos, presentes em óleos armazenados em sementes.

Os produtos das reações da FATA e FATB, os ácidos graxoslivres, deixam os plastídios e são convertidos em seus respectivos acil-CoAésteres. AciI-CoAs são substratos para a via de biossíntese de lipídeos (Viade Kennedy), localizada no retículo endoplasmático (ER). Esta via é respon-sável pela formação da membrana lipídica, bem como pela biossíntese detriacilgliceróis que constituem o óleo da semente. No ER há outras dessatu-rases ligadas à membrana que podem ainda dessaturar 18:1 para ácidosgraxos poliinsaturados. Uma enzima delta-12 dessaturase (FAD2) catalisa ainserção de uma ligação dupla no 18:1, formando ácido linoléico (18:2). Umaenzima delta-15 dessaturase (FAD3) catalisa a inserção de uma ligação du-pla no 18:2, formando ácido linolênico (18:3).Muitas vias bioquímicas complexas têm sido manipuladas gene-ticamente no presente, geralmente por supressão ou superexpressão degenes isolados. Uma investigação mais profunda do potencial para manipu-lação genética de plantas exigirá manipulação coordenada de múltiplos ge-nes em uma via. Várias abordagens foram utilizadas para combinar transge-nes em uma planta - incluindo cruzamento sexual, re-transformação, co-transformação e o uso de transgenes ligados. Um transgene quimérico comseqüências de genes parcialmente ligados pode ser utilizado para suprimircoordenadamente inúmeros genes endógenos de plantas. Construções cujomodelo baseia-se em poliproteínas virais podem ser utilizadas simultanea-mente para introduzir genes codificadores múltiplos em células de plantas.Para revisão, consultar Halpin et ai, Plant Moi Biol. 47:295-310 (2001).

Portanto, um fenótipo vegetal desejado pode requerer a expres-são de um ou mais genes e a redução concomitante de expressão de outrogene ou genes. Existe, por conseguinte, necessidade para superexpressarsimultaneamente um ou mais genes e suprimir, ou regular negativamente, aexpressão de um outro gene ou genes em plantas, empregando uma únicaconstrução transgênica.

Resumo da invenção

A presente invenção provê uma molécula ou moléculas de ácidonucléico recombinante, as quais quando introduzidas em uma célula ou or-ganismo são capazes de suprimir, reduzir pelo menos parcialmente, reduzir,reduzir substancialmente ou efetivamente eliminar a expressão de, pelo me-nos, um ou mais RNAs de FAD2, FAD3 ou FATB endógenos, ao mesmotempo em que de co-expressar, co-expressar simultaneamente ou produzircoordenadamente um ou mais RNAs ou proteínas transcritas de um geneque codifica beta-cetoacil-ACP sintase I, beta-cetoacil-ACP sintase IV, delta-9 dessaturase ou GP4 EPSPS. A presente invenção provê também célulasvegetais e plantas transformadas com a mesma molécula ou moléculas deácido nucléico e sementes, óleo e outros produtos, derivados das plantastransformadas.

A presente invenção provê também uma molécula de ácido nu-cléico recombinante, compreendendo um primeiro conjunto de seqüênciasde DNA capaz de, quando expressado em célula hospedeira, suprimir a ex-pressão endógena de pelo menos um, de preferência, dois genes seleciona-dos do grupo constituído pelos genes FAD2, FAD3 e FATB] e um segundoconjunto de seqüências de DNA capaz de, quando expressado em célulahospedeira, aumentar a expressão endógena de, pelo menos, um gene se-lecionado do grupo constituído por um gene da beta-cetoacil-ACP sintase I,um gene da Beta-acil-ACP sintase IV, um gene da delta-9 dessaturase eCP4 EPSPS.

Ainda é provida, pela presente invenção, uma molécula de ácidonucléico recombinante, compreendendo um primeiro conjunto de seqüênciasde DNA capaz de, quando expressado em célula hospedeira, formar umaconstrução de dsRNA e de suprimir a expressão endógena de pelo menosum, de preferência, dois genes selecionados do grupo constituído por genesFAD2, FAD3 e FATB, em que o primeiro conjunto de seqüências de DNAcompreende uma primeira seqüência não codificadora que expressa umaprimeira seqüência de RNA que exibe, pelo menos, 90% de identidade emrelação a uma região não codificadora de um gene FAD2, uma primeira se-qüência antisense que expressa uma primeira seqüência antisense de RNA,capaz de formar uma molécula de RNA de fita dupla com a primeira seqüên-cia de RNA, uma segunda seqüência não codificadora que expressa umasegunda seqüência de RNA que exibe, pelo menos, 90% de identidade emrelação a uma região não codificadora de um gene FATB, e uma segundaseqüência antisense que expressa uma segunda seqüência antisense deRNA, capaz de formar uma molécula de RNA de fita dupla com a segundaseqüência de RNA; e um segundo conjunto de seqüências de DNA capazde, quando expressado em célula hospedeira, aumentar a expressão endó-gena de, pelo menos, um gene selecionado do grupo constituído por um ge-ne da beta-cetoacil-ACP sintase I, um gene da beta-acil-ACP sintase IV, umgene da delta-9 dessaturase e CP4 EPSPS.

A presente invenção provê métodos de transformação de plan-tas com estas moléculas de ácido nucléico recombinante. Os métodos inclu-em um método de produção de uma planta transformada com semente exi-bindo teor aumentado de ácido oléico, teor reduzido de ácido graxo saturadoe teor reduzido de ácido graxo poliinsaturado, compreendendo (A) transfor-mação de uma célula vegetal com uma molécula de ácido nucléico recombi-nante que compreende um primeiro conjunto de seqüências de DNA capazde, quando expressado em célula hospedeira, suprimir a expressão endóge-na de pelo menos um, de preferência, dois genes selecionados do grupoconstituído pelos genes FAD2, FAD3 e FATB, e um segundo conjunto deseqüências de DNA capaz de, quando expressado em célula hospedeira,aumentar a expressão endógena de, pelo menos, um gene selecionado dogrupo constituído por um gene da beta-cetoacil-ACP sintase I, um gene dabeta-cetoacil-ACP sintase IV, um gene da delta-9 dessaturase e CP4EPSPS; e (B) cultivo da planta transformada, em que a planta transformadaproduz semente com teor aumentado de ácido oléico, teor reduzido de ácidograxo saturado e teor reduzido de ácido graxo poliinsaturado em relação àsemente de uma planta de antecedente genético semelhante, porém des-provida da molécula de ácido nucléico recombinante.

São providos ainda métodos de transformação de células vege-tais com as moléculas de ácido nucléico recombinante. Os métodos incluemum método para se alterar a composição do óleo de uma célula de planta,compreendendo (A) transformação de uma célula vegetal com uma moléculade ácido nucléico recombinante que compreende um primeiro conjunto deseqüências de DNA capaz de, quando expressado em célula hospedeira,suprimir a expressão endógena de pelo menos um, de preferência, dois ge-nes selecionados do grupo constituído pelos genes FAD2, FAD3 e FATB, eum segundo conjunto de seqüências de DNA capaz de, quando expressadoem célula hospedeira, aumentar a expressão endógena de, pelo menos, umgene selecionado do grupo constituído por um gene da beta-cetoacil-ACPsintase I, um gene da beta-cetoacil-ACP sintase IV, um gene da delta-9 des-saturase e CP4 EPSPS; e (B) cultivo da célula vegetal sob condições emque a transcrição do primeiro conjunto de seqüências de DNA e do segundoconjunto de seqüências de DNA é iniciado, em que a composição do óleo éalterada em relação a células de uma planta com antecedente genético se-melhante, porém desprovida da molécula de ácido nucléico recombinante.

A presente invenção provê também uma planta transformadacompreendendo uma molécula de ácido nucléico recombinante, compreen-dendo um primeiro conjunto de seqüências de DNA capaz de, quando ex-pressado em célula hospedeira, suprimir a expressão endógena de pelo me-nos um, de preferência, dois genes selecionados do grupo constituído pelosgenes FAD2, FAD3 e FATB; e um segundo conjunto de seqüências de DNAcapaz de, quando expressado em célula hospedeira, aumentar a expressãoendógena de, pelo menos, um gene selecionado do grupo constituído porum gene da beta-cetoacil-ACP sintase I, um gene da beta-acil-acp sintaseIV, um gene da delta-9 dessaturase e CP4 EPSPS. Provida ainda pela pre-sente invenção uma planta transformada de soja com semente, em que asemente exibe uma composição de óleo que contém de 55 a 80% por pesode ácido oléico, de 10 a 40% por peso de ácido linoléico, 6% ou menos porpeso de ácido linolênico e de 2 a 8% por peso de ácidos graxos saturados, ematéria-prima, partes de plantas e semente derivadas da planta. Em outraconcretização, a presente invenção provê uma planta transformada de sojacom semente, em que a semente exibe uma composição de óleo compreen-dendo aproximadamente 65-80% de ácido oléico, aproximadamente 3-8%de saturados e aproximadamente 12-32% de poliinsaturados. Matéria-prima,partes da planta e semente derivadas desta planta são incluídas também.Em outra concretização, a presente invenção provê uma planta transformadade soja com semente, em que a semente exibe uma composição de óleocompreendendo aproximadamente 65-80% de ácido oléico, aproximadamen-te 2-3,5% de saturados e aproximadamente 16,5-33% de poliinsaturados.Matéria-prima, partes da planta e semente derivadas desta planta são incluí-das também.

A presente invenção provê uma semente de soja exibindo com-posição de óleo compreendendo de 55 a 80% por peso de ácido oléico, de10 a 40% por peso de ácido linoléico, 6% ou menos por peso de ácido lino-lênico e de 2 a 8% por peso de ácidos graxos saturados, e provê tambémuma semente de soja exibindo composição de óleo compreendendo de 65 a80% por peso de ácido oléico, de 10 a 30% por peso de ácido linoléico, 6%ou menos por peso de ácido linolênico e de 2 a 8% por peso de ácidos gra-xos saturados. Em outra concretização, a presente invenção provê uma se-mente de soja exibindo composição de óleo compreendendo aproximada-mente 65-80% de ácido oléico, aproximadamente 3-8% de saturados e a-proximadamente 12-32% de poliinsaturados. Em outra concretização, a pre-sente invenção provê uma semente de soja exibindo composição de óleocompreendendo aproximadamente 65-80% de ácido oléico, aproximadamen-te 2-3,5% de saturados e aproximadamente 16,5-33% de poliinsaturados.

São providos também pela invenção alimentos de soja comcomposição de óleo compreendendo de 69 a 73% por peso de ácido oléico,de 21 a 24% por peso de ácido linoléico, de 0,5 a 3% por peso de ácido lino-lênico e 2-3% por peso de ácidos graxos saturados.

O óleo de soja cru, provido pela invenção, exibe composição deóleo compreendendo de 55 a 80% por peso de ácido oléico, de 10 a 40%por peso de ácido linoléico, 6% ou menos por peso de ácido linolênico e de 2a 8% por peso de ácidos graxos saturados. Outro óleo de soja cru, providopela invenção, exibe composição de óleo compreendendo de 65 a 80% porpeso de ácido oléico, de 10 a 30% por peso de ácido linoléico, 6% ou menospor peso de ácido linolênico e de 2 a 8% por peso de ácidos graxos satura-dos. Em uma outra concretização, o óleo de soja cru, provido pela presenteinvenção, exibe uma composição de óleo compreendendo aproximadamente65-80% de ácido oléico, aproximadamente 3-8% de saturados e aproxima-damente 12-32% de poliinsaturados. Em uma outra concretização, o óleo desoja cru, provido pela presente invenção, exibe composição de óleo compre-endendo aproximadamente 65-80% de ácido oléico, aproximadamente 2-3,5% de saturados e aproximadamente 16,5-33% de poliinsaturados.

A presente invenção provê também uma semente de soja exi-bindo composição de óleo, contendo aproximadamente de 42% a aproxima-damente 85% por peso de óleo oléico e de aproximadamente 8% a aproxi-madamente 1,5% por peso de ácidos graxos saturados. Em outra concreti-zação, uma semente de soja da presente invenção exibe composição deóleo, contendo de aproximadamente 42% a aproximadamente 85% por pesode ácido oléico, de aproximadamente 8% a aproximadamente 1,5% por pesode ácidos graxos saturados, menos de 35% por peso de ácido linolênico, emque uma quantidade combinada do ácido oléico e do ácido linolênico é deaproximadamente 65% a aproximadamente 90% por peso da composiçãototal do óleo; e a semente possui uma molécula de ácido nucléico recombi-nante com uma seqüência de DNA que inclui um fragmento de intron deFAD2-1, cuja extensão possui entre aproximadamente 50 e aproximadamen-te 400 nucleotídeos contíguos, uma 3' UTR de FATB e uma 5' UTR deFATB, uma beta-cetoacil-ACP sintase IV heteróloga e uma delta-9 dessatu-rase heteróloga em célula hospedeira.

Uma semente de soja da presente invenção pode exibir umacomposição de óleo compreendendo de aproximadamente 50% a aproxima-damente 80% por peso de ácido oléico, de aproximadamente 8% a aproxi-madamente 1,5% por peso de ácidos graxos saturados, de aproximadamen-te 2% a aproximadamente 45% por peso de ácido linoléico, de aproximada-mente 4% a aproximadamente 14% por peso de ácido linolênico, em que aquantidade combinada do ácido oléico e do ácido linolênico é de aproxima-damente 65% a aproximadamente 90% por peso da composição total doóleo, e a semente compreende uma molécula de ácido nucléico recombinan-te, compreendendo uma seqüência de DNA que inclui um fragmento de in-tron de FAD2-1, cuja extensão possui entre aproximadamente 50 e aproxi-madamente 400 nucleotídeos contíguos, uma região codificadora de CTP deFATB e 42 nucleotídeos contíguos de uma 5* UTR de FATB. Em outra con-cretização, uma semente de soja pode compreender uma molécula de ácidonucléico recombinante, incluindo uma seqüência de DNA que suprime a ex-pressão endógena de FAD2 e FATB, em que a semente exibe composiçãode óleo, contendo de aproximadamente 46 a 75% por peso de ácido oléico,1,5 a 8.5% por peso de ácidos graxos saturados, 2,5 a 38% por peso de áci-do linoléico e 4,5 a 17,5% por peso de ácido linolênico.

A presente invenção inclui também um método de redução donível de supressão do gene FAD2 em relação ao nível de supressão do ge-ne de FAD2, obtida por expressão de uma construção de dsRNAi com umaseqüência de FAD2 recombinante, consistindo em um intron completo deFAD2 ou uma UTR completa de FAD2 por: i) expressão de uma seqüênciade FAD2 recombinante em uma célula vegetal, em que a seqüência deFAD2 recombinante é derivada dê um gene FAD2 endógeno em uma célulavegetal, e a seqüência de FAD2 recombinante consiste em um fragmento deintron de FAD2 ou um fragmento da UTR de FAD2, e ii) supressão de umgene FAD2 endógeno com a seqüência de FAD2 recombinante, em que onível de supressão do gene de FAD2 é menor do que o nível de expressãogênica, obtido pela expressão de uma construção de dsRNAi, incluindo umaseqüência de FAD2 recombinante com a extensão completa de um intron deFAD2 ou extensão completa de UTR de FAD2.

A presente invenção provê também métodos para se alterar acomposição do óleo de uma célula vegetal por: transformação de uma célulavegetal com uma seqüência de FAD2 recombinante, derivada de parte deum gene FAD2 endógeno. A seqüência de FAD2 recombinante consiste emum fragmento de intron de FAD2 ou fragmento de UTR de FAD2-, e desen-volvimento da célula vegetal sob condições em que a transcrição da se-qüência de FAD2 recombinante é iniciada e pelo qual a composição do óleoé alterada, em relação a uma célula vegetal com antecedente genético se-melhante, porém desprovida da seqüência de FAD2 recombinante. Em outraconcretização, um método de aumento do teor de ácido oléico e redução doteor de ácido graxo saturado, em semente de uma planta, por: i) encurta-mento da extensão de uma primeira seqüência de FAD2 recombinante atéque o nível de supressão do gene FAD2 de uma planta transformada com aprimeira seqüência de FAD2 recombinante seja, pelo menos, parcialmentereduzido em relação ao nível de supressão do gene FAD2, em uma célulavegetal com antecedente genético semelhante, e uma segunda seqüênciade FAD2 recombinante, em que a segunda seqüência de FAD2 recombinan-te é constituída por mais da seqüência do FAD2 endógeno do que a primeiraseqüência de FAD2 recombinante; ii) expressão de uma seqüência de FATBrecombinante capaz de, pelo menos, reduzir a expressão gênica de FATBem uma planta vegetal, em relação à supressão de FATB em uma célulavegetal com antecedente genético semelhante, porém sem a seqüência deFATB recombinante; iii) desenvolvimento de uma planta com uma moléculade ácido nucléico recombinante, compreendendo a primeira seqüência deFAD2 recombinante e a seqüência de FATB recombinante; e iv) cultivo deuma planta que produz semente com um teor reduzido de ácidos graxos sa-turados em relação à semente de uma planta com antecedente genéticosemelhante, porém desprovida da primeira seqüência de FAD2 recombinan-te e da seqüência de FATB recombinante.

Em ainda uma outra concretização, a presente invenção incluium método de produção de uma planta transformada com semente exibindoteor reduzido de ácidos graxos saturados por: transformação de uma célulavegetal com uma molécula de ácido nucléico recombinante que compreendeuma seqüência de DNA recombinante que suprime a expressão de FAD2 eFATB endógenos, em que a seqüência de DNA recombinante possui umaseqüência de ácido nucléico de FAD2 recombinante e FATB recombinante,em que a seqüência de FAD2 é constituída por menos do que a seqüênciacompleta de um intron de FAD2, e desenvolvimento da planta transformada,em que a planta transformada produz semente com teor reduzido de ácidosgraxos saturados, em relação à semente de uma planta com antecedentegenético semelhante, porém desprovida da seqüência de DNA recombinan-te.

Em outra concretização, a presente invenção é dirigida a um mé-todo de modulação da composição de ácidos graxos de óleo de uma semen-te de uma cultura de semente oleaginosa de clima temperado, por isolamen-to de material genético contando com, pelo menos, 40 nucleotídeos em ex-tensão e que seja capaz de suprimir a expressão de um gene endógeno navia da síntese de ácidos graxos; geração de mais de um fragmento encurta-do do material genético; introdução de cada um dos fragmentos encurtadosem uma célula vegetal da cultura da semente oleaginosa de clima tempera-do para produção de plantas transgênicas; e seleção de uma planta trans-gênica compreendendo um fragmento encurtado de extensão e seqüênciadeterminadas que altere do modo desejado a composição de ácidos graxosno óleo da semente.

A presente invenção inclui também uma semente de soja exibin-do composição de óleo com teor de ácidos graxos bastante reduzido e teorde ácido oléico moderadamente aumentado e seqüência de DNA que supri-ma a expressão de FAD2 em célula vegetal, em que a seqüência de DNApossui uma seqüência de FAD2 recombinante, consistindo em um fragmentode intron de FAD2. Outra concretização da presente invenção é uma molé-cuia de ácido nucléico, compreendendo uma seqüência de intron de FAD2-1A, em que o fragmento do intron de FAD2-1A possui entre aproximadamen-te 60 a aproximadamente 320 nucleotídeos contíguos. Em uma concretiza-ção alternativa, a presente invenção inclui também uma semente de sojacom uma primeira seqüência de DNA recombinante que suprime a expres-são de FAD2-1 endógena da soja, compreendendo um intron de FAD2-1 desoja, e uma segunda seqüência de DNA recombinante que expressa níveisaumentados de um gene selecionado do grupo constituído por KASI, delta-9dessaturase, KASIVe combinações destes.

A presente invenção inclui também uma célula vegetal de sojade uma semente de soja, cujo óleo exibe uma composição de ácidos graxoscompreendendo teor de ácido oléico de aproximadamente 42% a aproxima-damente 85% por peso dos ácidos graxos totais, e teor de ácidos graxossaturados inferior a 8% por peso dos ácidos graxos totais. A presente inven-ção inclui também uma célula vegetal de soja de uma semente de soja, cujoóleo exibe uma composição de ácidos graxos compreendendo teor de ácidooléico de aproximadamente 42% a aproximadamente 85% por peso dos áci-dos graxos totais, e teor de ácidos graxos saturados inferior a 3% por pesodos ácidos graxos totais.

A presente invenção inclui também uma molécula de ácido nu-cléico, compreendendo uma seqüência de intron de FAD2-1A, em que ofragmento do intron de FAD2-1A possui entre aproximadamente 60 a apro-ximadamente 320 nucleotídeos contíguos. É também incluída uma constru-ção de DNA recombinante, compreendendo um fragmento de intron deFAD2-1 de soja, cuja extensão é entre aproximadamente 20 e aproximada-mente 420 nucleotídeos contíguos, e um fragmento do gene FATB de soja,cuja extensão é entre aproximadamente 40 e aproximadamente 450 nucleo-tídeos contíguos. Uma outra concretização inclui uma molécula de ácido nu-cléico recombinante com uma primeira seqüência de DNA que suprime aexpressão endógena de FAD2-1 e FATB de soja, em que a primeira se-qüência de DNA recombinante inclui um fragmento de intron de FAD2-1, cu-ja extensão é entre aproximadamente 20 e aproximadamente 420 nucleotí-deos contíguos, uma 3' UTR de FATB de soja e uma 5' UTR de FATB desoja ou área de codificação de CTP, e uma segunda seqüência de DNA re-combinante que aumenta a expressão de, pelo menos, um dos genes sele-cionados do grupo constituído por beta-cetoacil-ACP sintase IV e delta-9dessaturase.

A presente invenção inclui também um óleo de soja sem misturacuja composição de ácidos graxos compreende um teor de ácido oléico deaproximadamente 42% a aproximadamente 85% por peso dos ácidos graxostotais e teor de ácidos graxos saturados de aproximadamente 1,5% a apro-ximadamente 8% por peso dos ácidos graxos totais; um óleo de soja semmistura cuja composição de ácidos graxos compreende um teor de ácidooléico de aproximadamente 42% a aproximadamente 85% por peso dos áci-dos graxos totais e teor de ácidos graxos saturados de aproximadamente8% ou menos por peso dos ácidos graxos totais; um óleo de soja sem mistu-ra cuja composição de ácidos graxos compreende um teor de ácido oléicode aproximadamente 42% a aproximadamente 85% por peso dos ácidosgraxos totais e teor de ácido linolênico abaixo de 3% por peso dos ácidosgraxos totais; um óleo de soja sem mistura cuja composição de ácidos gra-xos compreende um teor de ácido oléico de aproximadamente 42% a apro-ximadamente 85% por peso dos ácidos graxos totais, teor de ácidos graxossaturados de aproximadamente 8% ou menos por peso dos ácidos graxostotais e teor de ácido linolênico de aproximadamente 1,5% ou menos porpeso dos ácidos graxos totais.A presente invenção inclui também uma ração de soja, derivadade uma semente de soja, cujo óleo exibe uma composição de ácidos graxoscompreendendo teor de ácido oléico de aproximadamente 42% a aproxima-damente 85% por peso dos ácidos graxos totais, e teor de ácidos graxossaturados inferior a 8% por peso dos ácidos graxos totais. A presente inven-ção inclui também uma ração de soja de semente de soja, cujo óleo exibeuma composição de ácidos graxos compreendendo teor de ácido oléico deaproximadamente 42% a aproximadamente 85% por peso de ácidos graxostotais, e teor de ácido linolênico inferior a aproximadamente 3% por peso dosácidos graxos totais.

A presente invenção inclui também um método de redução donível de supressão do gene FAD2 em relação ao nível de supressão do ge-ne FAD2, obtido por expressão de uma construção de dsRNAi com uma se-qüência de FAD2 heterólogo, consistindo em um intron completo de FAD2ou UTR completa de FAD2, o método por: i) expressão de uma seqüênciado FAD2 heterólogo em uma célula vegetal, em que a seqüência de FAD2heterólogo é derivada de um gene FAD2 endógeno em uma célula vegetal econsiste em um fragmento de intron de FAD2 ou um fragmento de UTR deFAD2, e ii) supressão de um gene FAD2 endógeno com a seqüência deFAD2 heterólogo, em que o nível de supressão do gene FAD2 é menor doque o nível de expressão gênica, obtido pela expressão de uma seqüênciade FAD2 heterólogo, consistindo na extensão completa de um intron deFAD2 ou a extensão completa de uma UTR de FAD2.

A presente invenção inclui também um método para se alterar acomposição do óleo de uma célula vegetal pela transformação de uma célulavegetal com uma seqüência de FAD2 heterólogo, derivada de parte de umgene FAD2 endógeno, em que a seqüência de FAD2 heterólogo consiste emum fragmento de intron de FAD2 ou fragmento de UTR de FAD2; e desen-volvimento da célula vegetal sob condições em que a transcrição da se-qüência de FAD2 heterólogo é iniciada, e pelo qual a composição do óleo éalterada em relação a uma célula vegetal com antecedente genético seme-lhante, porém desprovida da seqüência de FAD2 heterólogo.A presente invenção inclui também um método para aumentar oteor de ácido oléico e reduzir o teor de ácidos graxos saturados na sementede uma planta, compreendendo i) encurtamento da extensão de uma primei-ra seqüência de FAD2 heterólogo até que o nível de supressão do geneFAD2 de uma planta transformada com a primeira seqüência de FAD2 hete-rólogo seja, pelo menos, parcialmente reduzido, em relação ao nível de su-pressão do gene FAD2 em uma célula vegetal compreendendo antecedentegenético semelhante, e uma segunda seqüência de FAD2 heterólogo, emque a segunda seqüência do FAD2 heterólogo consiste em mais da seqüên-cia do FAD2 endógeno do que a primeira seqüência do FAD2 heterólogo; ii)expressão de uma seqüência de FATB heteróloga capaz de, pelo menos,reduzir parcialmente a expressão gênica de FATB em uma célula vegetal,em relação à supressão de FATB em uma planta vegetal com antecedentegenético semelhante, porém sem a seqüência do FATB heterólogo; iii) de-senvolvimento de uma planta compreendendo um genoma com a primeiraseqüência do FAD2 heterólogo e a seqüência do FATB heterólogo; e iv) cul-tivo de uma planta que produz semente com teor reduzido de ácidos graxossaturados, em relação à semente de uma planta com antecedente genéticosemelhante, porém desprovida da primeira seqüência de FAD2 heterólogo ea seqüência de FA TB heterólogo.

A presente invenção inclui também um método de modulação dacomposição de ácido graxos de óleo derivado de semente de uma cultura desemente oleaginosa de clima temperado, compreendendo o isolamento deum fragmento de material genético cuja extensão inclui, pelo menos, 40 nu-cleotídeos e que seja capaz de suprimir a expressão de um gene endógenona via da síntese de ácidos graxos; introdução do material genético em umacélula vegetal da cultura de semente oleaginosa de clima temperado; produ-ção de uma planta transgênica; e seleção de uma semente da planta trans-gênica que inclua o material genético que modula a composição de ácidosgraxos do óleo da semente.

Em uma outra concretização, a presente invenção inclui tambémuma célula de semente de soja, cujo óleo exibe uma composição de ácidosgraxos compreendendo teor de ácido oléico de aproximadamente 42% aaproximadamente 85% por peso dos ácidos graxos totais, e teor de ácidosgraxos saturados inferior a 8% por peso dos ácidos graxos totais.

A presente invenção inclui também uma molécula de ácido nu-cléico heterólogo, compreendendo um fragmento de intron de FAD2-1 desoja, cuja extensão é entre aproximadamente 20 e aproximadamente 420nucleotídeos contíguos, e um fragmento do gene FATB de soja, cuja exten-são é entre aproximadamente 40 e aproximadamente 450 nucleotídeos con-tíguos. Em outra concretização, a presente invenção é dirigida a uma molé-cuia de ácido nucléico heterólogo, compreendendo uma seqüência de ácidonucléico com um fragmento de intron de FADE-1 de soja, cuja extensão éentre aproximadamente 20 e aproximadamente 420 nucleotídeos, um frag-mento do gene FATB de soja, cuja extensão é entre aproximadamente 40 aaproximadamente 450 nucleotídeos, e uma seqüência de ácido nucléico queaumenta a expressão de beta-cetoacil-ACP sintase IV ou delta-9 dessatura-se ou de ambas.

A presente invenção é dirigida também a um método de diminui-ção de teor de ácido linolênico de uma semente de soja por i) introdução emuma célula de soja de uma molécula de ácido nucléico heterólogo, compre-endendo uma seqüência de ácido nucléico, proveniente de pelo menos doismembros da família de genes FAD3\ ii) expressão de uma seqüência de áci-do nucléico, proveniente de um gene FAD3 capaz de, pelo menos, reduzirparcialmente a expressão gênica do FAD3 endógeno em uma célula vegetal;iii) desenvolvimento de uma célula vegetal compreendendo um genoma coma seqüência de ácido nucléico, proveniente de pelo menos dois membros dafamília de genes FAD3; e iv) cultivo da célula vegetal com teor reduzido deácido linolênico, em relação a uma célula vegetal com antecedente genéticosemelhante, porém desprovida dos, pelo menos, dois membros da família degenes FAD3. A presente invenção inclui também uma construção de DNArecombinante com fragmentos de DNA de pelo menos dois membros da fa-mília de genes FAD3.

A presente invenção inclui também um óleo de soja sem mistura,cuja composição de ácidos graxos compreende teor de ácido oléico de apro-ximadamente 42% a aproximadamente 85%, por peso dos ácidos graxostotais, teor de ácidos graxos saturados de aproximadamente 8% ou menos,por peso dos ácidos graxos totais e teor de ácido linolênico de aproximada-mente 1,5% ou menos por peso dos ácidos graxos totais.

Breve descrição dos desenhos

As Figuras 1-4 descrevem, cada uma, exemplos de configura-ções da molécula do ácido nucléico.

As Figuras 5(a)-(d) e 6(a)-(c) descrevem, cada uma, configura-ções ilustrativas de um primeiro conjunto de seqüências de DNA.

As Figuras 7- 20 descrevem, cada uma, moléculas de ácido nu-cléico da presente invenção.

A Figura 21 descreve a construção pMON68537.

A Figura 22 descreve a construção pMON68539.

Descrição detalhada da invenção

Descrição das seqüências de ácido nucléico

A SEQ ID NO: 1 é uma seqüência de ácido nucléico de um in-tron 1 de FAD2-1A.

A SEQ ID NO: 2 é uma seqüência de ácido nucléico de um in-tron 1 de FAD2-1B.

A SEQ ID NO: 3 é uma seqüência de ácido nucléico de um pro-motor de FAD2-1B.

A SEQ ID NO: 4 é uma seqüência de ácido nucléico de um clonegenômico de FAD2-1A.

As SEQ ID NO: 5 e 6 são seqüências de ácido nucléico de 3'UTR e de 5' UTR de FAD2-1A, respectivamente.

SEQ ID NO: 7-13 são seqüências de ácido nucléico dos introns1, 2, 3A, 4, 5, 3B e 3C, de FAD3-1A, respectivamente.

A SEQ ID NO: 14 é uma seqüência de ácido nucléico de um in-tron 4 de FAD3-1C.

A SEQ ID NO: 15 é uma seqüência de ácido nucléico de um clo-ne genômico parcial de FAD3-1A.As SEQ ID NO: 16 e 17 são seqüências de ácido nucléico de 3'UTR e de 5' UTR de FAD3-1A, respectivamente.

A SEQ ID NO: 18 é uma seqüência de ácido nucléico de um clo-ne genômico parcial de FAD3-1B.

As SEQ ID NO: 19-25 são seqüências de ácido nucléico dos in-trons 1, 2, 3A, 3B, 3C, 4 e 5 de FAD3-1B, respectivamente.

As SEQ ID NO: 26 e 27 são seqüências de ácido nucléico de 3'UTR e de 5' UTR de FAD3-1B, respectivamente.

A SEQ ID NO: 28 é uma seqüência de ácido nucléico de um clo-ne genômico de FATB-1.

A SEQ ID NO: 29-35 são seqüências de ácido nucléico dos in-trons I, II, III, IV, V, Vl e Vll de FATB-1, respectivamente.

As SEQ ID NO: 36 e 37 são seqüências de ácido nucléico de 3'UTR e de 5' UTR de FATB-1, respectivamente.

A SEQ ID NO: 38 é uma seqüência de ácido nucléico de um ge-ne KAS I de Cuphea pulcherrima.

A SEQ ID NO: 39 é uma seqüência de ácido nucléico de um ge-ne KASIVde Cuphea pulcherrima.

As SEQ ID NO: 40 e 41 são seqüências de ácido nucléico degenes de delta-9 dessaturase de Ricinus communis e Simmondsia chinen-sis.

A SEQ ID NO: 42 é uma seqüência de ácido nucléico de umcDNA de FATB-2.

A SEQ ID NO: 43 é uma seqüência de ácido nucléico de um clo-ne genômico de FATB-2.

As SEQ ID NO: 44-47 são seqüências de ácido nucléico dos in-trons I, II, Ill e IV de FATB-2, respectivamente.

As SEQ ID NO: 48-60 são seqüências de ácido nucléico de pri-mers PCR.

As SEQ ID NO: 61 e 62 são seqüências de ácido nucléico de 3'UTR e de 5' UTR de FAD3-1C de soja, respectivamente.Definições

"ACΡ" refere-se a uma proteína transportadora de grupamentoacila. "Composição alterada de óleo de semente" refere-se a uma composi-ção de óleo de semente, derivada de uma planta transgênica ou transforma-da da invenção, que possui níveis alterados ou modificados dos ácidos gra-xos na mesma, em relação a um óleo de semente, derivado de uma plantacom antecedente genético semelhante, porém que não foi transformada.

"Supressão antisense" refere-se silenciamento de gene específi-co, induzido pela introdução de uma molécula de RNA antisense.

"Co-expressão de mais de um agente, como mRNA ou proteína"refere-se à expressão simultânea de um agente em intervalos de tempo quese sobrepõem e na mesma célula ou tecido, como um outro agente. "Ex-pressão coordenada de mais de um agente" refere-se à co-expressão demais de um agente quando a produção de transcritos e proteínas destes a-gentes é conduzida utilizando um promotor compartilhado ou idêntico.

"Complemento" de uma seqüência de ácido nucléico refere-seao complemento da seqüência ao longo de sua extensão completa.

"Co-supressão" é a redução em níveis de expressão, geralmenteem nível de RNA, de um gene endógeno em particular ou família de genespela expressão de uma construção homóloga de sentido, capaz de transcre-ver mRNA com a mesma qualidade de fita do transcrito do gene endógeno.Napoli et ai, Plant Cell 2:279-289 (1990); van der Krol et ai, Plant Cell2:291-299(1990).

"Óleo de soja cru" refere-se a óleo de soja extraído de grãos desoja, porém que foi não refinado, processado ou misturado, embora possaser degomado.

"CTP" refere-se a peptídeo de trânsito cloroplástico, codificadopela "seqüência codificadora de peptídeo de trânsito cloroplástico".

Neste documento, quando se referir a proteínas e ácidos nucléi-cos, o termo "derivado" refere-se, quer diretamente (por exemplo, conside-rando-se a seqüência de uma proteína ou ácido nucléico conhecido e o pre-paro de uma proteína ou ácido nucléico com seqüência semelhante, pelomenos, em parte, à seqüência da proteína da proteína ou ácido nucléico co-nhecido) ou indiretamente (por exemplo, obtendo-se uma proteína ou ácidonucléico de um organismo relacionado a uma proteína ou ácido nucléico co-nhecido), à obtenção de uma proteína ou ácido nucléico de uma proteína ouácido nucléico conhecido. Outros métodos de "derivação" de uma proteínaou ácido nucléico de uma proteína ou ácido nucléico conhecido são conhe-cidos de qualquer técnico no assunto.

RNA de fita dupla ("dsRNA"), RNA interferente de fita dupla("dsRNAi") e RNA interferente ("RNAi"), referem-se todos a silenciamento degene específico, induzido pela introdução de uma construção capaz detranscrever, pelo menos parcialmente, uma molécula de RNA de fita dupla.Uma "molécula de dsRNA" e uma "molécula de RNAi", referem-se ambas auma região de uma molécula de RNA que contém segmentos com seqüên-cias complementares de nucleotídeos e que, por conseguinte, podem hibri-drizar-se entre si e formar RNA de fita dupla. Estas moléculas de RNA de fitadupla são capazes, quando introduzidas em uma célula ou organismo, dereduzir, pelo menos parcialmente, o nível de um tipo de mRNA presente emuma célula ou em uma célula de um organismo. Além disso, o dsRNA pode sercriado após montagem in vivo de fragmentos apropriados de DNA por meio derecombinação ilegítima e recombinação sítio-específico, conforme descritano pedido de patente International Application No. PCT/US2005/004681,depositado em 11 de fevereiro de 2005, cujo conteúdo é aqui incorporadoem sua totalidade, por referência neste pedido.

"Exon" refere-se ao sentido normal do termo, significando umsegmento de moléculas do ácido nucléico, geralmente DNA, que codificaparte ou toda uma proteína expressada.

"Ácido graxo" refere-se a ácidos graxos e grupos acila graxos.

"Gene" refere-se a uma seqüência de ácido nucléico que incluiuma região 5' promotora associada à expressão do produto gênico, quais-quer regiões intron e exon e regiões 3' e 5' não traduzidas, associadas coma expressão do produto gênico.

"Silenciamento de gene" refere-se à supressão da expressão dogene ou regulação negativa da expressão do gene.

Uma "família de genes" é dois ou mais genes em um organismoque codificam proteínas que exibem atributos funcionais semelhantes, e um"membro da família de genes" é qualquer gene da família de genes encon-trado no material genético da planta, por exemplo, um "membro da famíliade genes FAD2' é qualquer gene FAD2 encontrado no material genético daplanta. Um exemplo de dois membros de uma família de genes é FAD2-1 eFAD2-2. Uma família de genes pode ser classificada ainda pela semelhançadas seqüências do ácido nucléico. Um gene, FAD2, por exemplo, inclui ale-Ios naquele locus. De preferência, um membro da família de genes exibepelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivel-mente pelo menos 80% de identidade de seqüência de ácido nucléico naparte da seqüência codificadora do gene.

"Heterólogo" significa que não ocorre naturalmente junto.

Uma molécula de ácido nucléico é dita como sendo "introduzida"se for inserida na célula ou organismo, em resultado de manipulação huma-na, não importando o quanto indireto. Exemplos de moléculas de ácido nu-cléico introduzidas incluem, entre outros, ácidos nucléicos que foram intro-duzidos em células por transformação, transfecção, injeção e projeção, eaquelas que foram introduzidas em um organismo por métodos incluindo,entre outros, conjugação, endocitose e fagocitose."Intron" refere-se ao sentido normal do termo, significando umsegmento de moléculas de ácido nucléico, geralmente DNA, que não codifi-ca parte ou toda uma proteína expressada e que, em condições endógenas,é transcrito em moléculas de RNA, porém é separado do RNA endógeno,antes que o RNA seja transcrito em uma proteína. Uma "molécula de intronde dsRNA" e uma "molécula de intron de RNAi", referem-se ambas a umamolécula de RNA de fita dupla capaz de, quando introduzido em uma célulaou organismo, reduzir pelo menos parcialmente o nível de tipos de mRNApresentes em uma célula ou em célula de um organismo, quando a moléculade RNA de fita dupla exibir identidade suficiente, em relação a um intron deum gene presente na célula ou organismo, para reduzir o nível de um mRNAcontendo aquela seqüência de intron.

Uma composição de óleo "com baixo nível de saturados" contémentre 3,6 e 8 por cento de ácidos graxos saturados.

Uma "semente de soja com nível médio de ácido oléico" é umasemente com entre 50% e 85% de ácido oléico, presente na composição doóleo da semente.

Uma composição de óleo "com nível baixo de ácido linolênico"contém menos do que aproximadamente 3% de ácido linolênico, por pesodos ácidos graxos totais.

O termo "não codificadoras" refere-se a seqüências de molécu-las de ácido nucléico que não codificam parte ou toda uma proteína expres-sada. Seqüências não codificadoras incluem, entre outras, introns, regiõespromotoras, regiões 3' não traduzidas (3'UTRs) e regiões 5' não traduzidas(5'UTRs).

O termo "composição de óleo" refere-se a níveis de ácidos gra-xos.

Um promotor que está "operacionalmente ligado" a uma ou maisseqüências de ácido nucléico é capaz de direcionar a expressão de uma oumais seqüências de ácido nucléico, incluindo seqüências de ácido nucléicode codificação múltipla ou não codificadoras, arranjadas em configuraçãopolicistrônica.

Seqüências de ácido nucléico "fisicamente ligadas" são seqüên-cias de ácido nucléico encontradas em uma molécula de ácido nucléico iso-lada.

Uma "planta" inclui referência a plantas inteiras, órgãos de plan-tas (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes e células vegetais eprogênie da mesma.

O termo "célula vegetal" inclui, entre outras, culturas de semen-tes em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas,raízes, partes aéreas, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos.

"Promotores de plantas" incluem, entre outros, promotores viraisde plantas, promotores derivados de plantas e promotores sintéticos, capa-zes de funcionar em uma célula vegetal para promover a expressão de ummRNA.

Um "gene policistrônico" ou "mRNA policistrônico" é qualquergene ou mRNA que contém seqüências transcritas de ácido nucléico quecorrespondem a seqüências de ácido nucléico de mais de um gene direcio-nado para supressão ou expressão. Entende-se que estes genes ou mRNApolicistrônicos podem conter seqüências que correspondem a introns, 5'UTRs, 3' UTRs, seqüências codificadoras de peptídeo de trânsito, exons, oucombinações destes, e que um gene ou mRNA policistrônico recombinantepoderia, por exemplo, sem restrição, conter seqüências que correspondam auma ou mais UTRs de um gene e um ou mais introns de um segundo gene.

Um "promotor semente-específica" refere-se a um promotor queé ativo de preferência ou exclusivamente em uma semente. "Atividade prefe-rencial" refere-se à atividade de um promotor que é substancialmente maiorna semente do que em outros tecidos, órgãos ou organelas da planta. "Se-mente-específica" inclui, entre outras, atividade na camada de aleurona, en-dosperma e/ou embrião da semente.

"Supressão de intron sense" refere-se a silenciamento de gene,induzido pela introdução de um intron sense ou fragmento do mesmo. A su-pressão de intron sense é descrita, por exemplo, por Fillatti no PCT WO01/14538 A2.

"Expressão simultânea" de mais de um agente, como um mRNAou proteína, refere-se à expressão de um agente ao mesmo tempo em queum outro agente. Esta expressão pode ser sobreposta somente em parte epode ocorrer também em tecido diferente ou em níveis diferentes.

"Nível de óleo total" refere-se à quantidade total de todos os áci-dos graxos, sem consideração ao tipo de ácido graxo. Conforme utilizado nopresente, nível de óleo total não inclui a cadeia principal de glicerol.

"Transgene" refere-se a uma seqüência de ácido nucléico, asso-ciada à expressão de um gene introduzido em um organismo. Transgeneinclui, entre outros, um gene endógeno ou um gene que não ocorre natural-mente no organismo. "Planta transgênica" é qualquer planta que incorporaestavelmente um transgene de maneira que facilite a transmissão daqueletransgene de uma planta por qualquer método sexuado ou assexuado.

Uma composição de óleo "nível zero de saturados" contém entre3,6 e 8 por cento de ácidos graxos saturados.

Nesta exposição, quando referido a proteínas e ácidos nucléi-cos, o uso de letras maiúsculas, por exemplo, "FAD2", indica uma referênciaa uma enzima, proteína, polipeptídeo ou peptídeo, e letras em itálico, porexemplo, nFADZ são utilizadas para referências a ácidos nucléicos, incluin-do, entre outros, genes, cDNAs e mRNAs. Uma célula ou organismo podepossuir uma família de mais de um gene codificando uma enzima em parti-cular, e a letra maiúscula que se gene à terminologia do gene (A, B, C) éutilizada para designar o membro da família, ou seja, FAD2-1A e FAD2-1Bsão membros diferentes da mesma família.

Conforme é utilizado no presente, qualquer faixa definida incluios pontos finais da faixa, a não ser que declarado de outra forma.

A. Agentes

Os agentes da invenção serão, de preferência, "biologicamenteativos", a respeito de uma característica estrutural, como a capacidade deuma molécula de ácido nucléico hibridizar-se para outra molécula de ácidonucléico, ou a capacidade de uma proteína de ligar-se a um anticorpo (ou decompetir com outra molécula por esta ligação). Alternativamente, esta carac-terística pode ser catalítica e, dessa forma, envolver a capacidade do agentede mediar uma reação química ou resposta. Os agentes serão, de preferên-cia, "substancialmente purificados". O termo "substancialmente purificado",conforme utilizado nesta exposição, refere-se a uma molécula separadasubstancialmente de todas as outras moléculas normalmente associadas àmesma, em condições de seu ambiente nativo. Mais preferivelmente, umamolécula substancialmente purificada é o tipo predominante presente em umpreparado. Uma molécula substancialmente purificada pode estar mais doque 60% livre, mais do que 75% livre, de preferência, mais do que 90% livree, ainda mais preferivelmente, mais do que 95% livre das outras moléculas(excluindo o solvente), presente na mistura natural. O termo "substancial-mente purificado" não pretende incluir moléculas presentes em condições deseu ambiente nativo.

Os agentes da invenção podem ser também recombinantes.Conforme utilizado nesta exposição, o termo "recombinante" significa qual-quer agente (por exemplo, incluindo, entre outros, DNA ou peptídeo), deriva-do ou que resulte, não importando o quanto indiretamente, de manipulaçãohumana de uma molécula de ácido nucléico. Entende-se também que osagentes da invenção podem ser marcados com reagentes que facilitem adetecção do agente, por exemplo, marcações fluorescentes, marcaçõesquímicas e/ou bases modificadas.

Agentes da invenção incluem moléculas de DNA com seqüênciade nucleotídeo, capaz de ser transcrita em orientações sense e antisense, eque formam pelo menos uma molécula de RNA que seja, pelo menos emparte, de fita dupla. Em uma concretização preferida, um agente da invençãoé uma molécula de RNA de fita dupla com uma seqüência de nucleotídeoque é um fragmento de FAD2, FATB ou FAD2e FATB. Em outra concretiza-ção, um agente da presente invenção é uma molécula de DNA capaz de sertranscrita de forma a produzir orientações sense e antisense de uma se-qüência de nucleotídeos em uma célula hospedeira. Em outra concretização,uma molécula de ácido nucléico pode ter uma seqüência de nucleotídeo emorientação sense e em orientação antisense ou, em outra concretização,uma molécula de ácido nucléico pode ter uma seqüência de nucleotídeo emorientação sense ou em orientação antisense. Estas seqüências de nucleo-tídeos podem estar ligadas operacionalmente ao mesmo promotor, promoto-res diferentes, um único promotor ou mais de um promotor. Estas seqüên-cias de nucleotídeos podem ser uma única molécula de DNA ou mais deuma molécula de DNA.

Agentes da invenção incluem moléculas de ácido nucléico com-preendendo seqüência de DNA, pelo menos, 50%, 60%, ou 70% idêntica,em toda a sua extensão, a uma região codificadora ou não codificadora deuma planta, ou a uma seqüência de ácido nucléico complementar à regiãocodificadora ou não codificadora de uma planta. Seqüências de DNA maispreferidas são aquelas que, em toda a sua extensão, são, pelo menos, 80%idênticas; pelo menos, 85% idênticas; pelo menos, 90% idênticas; pelo me-nos, 95% idênticas; pelo menos, 97% idênticas; pelo menos, 98% idênticas;pelo menos, 99% idênticas; ou 100% idênticas a uma região codificadora ounão codificadora de uma planta, ou a uma seqüência de ácido nucléico com-plementar a uma região codificadora ou não codificadora de planta.

"Identidade", conforme bem entendido na técnica, e uma relaçãoentre duas ou mais seqüências de polipeptídeos ou duas ou mais moléculasde ácido nucléico, conforme determinado por comparação das seqüências.

Na técnica, "identidade" significa também o grau de relacionamento entreseqüências de polipeptídeo ou de moléculas de ácido nucléico, conformedeterminado pela combinação entre cadeias destas seqüências. A "identida-de" pode ser calculada rapidamente por métodos conhecidos, incluindo, en-tre outros, aqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, ed.,Oxford University Press, New York 1988; Biocomputing: Informatics and Ge-nome Projects, Smith, ed., Academic Press, New York 1993; Computer A-nalysis of Sequence Data, Part I, Griffin and Griffin, eds., Humana Press,New Jersey 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, Aca-demic Press 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov and Devereux, eds.,Stockton Press, New York 1991; and Carillo and Lipman, SIAM J. AppliedMath, 48:1073 1988.

Os métodos para determinação de identidade são criados parafornecer a maior combinação entre as seqüências testadas. Ademais, osmétodos para determinação de identidade são codificados em programas àdisposição no mercado. Programas de computador que podem ser utilizadospara determinar a identidade entre duas seqüências incluem, entre outros,GCG; uma série de cinco programas BLAST, três criados para pesquisarseqüências de nucleotídeos (BLASTN, BLASTX e TBLASTX) e dois criadospara pesquisar seqüências de proteínas (BLASTP e TBLASTN). O programaBLASTX é disponibilizado publicamente pelo NCBI e outras fontes, por exem-plo, BLAST Manual, Altschul et ai, NCBI NLM NIH, Bethesda, MD 20894; Alts-chul et al., J. Moi Biol. 215:403-410 (1990). O algoritmo bem conhecido deSmith Waterman pode ser utilizado também para determinar identidade.

Parâmetros para comparação entre seqüências de polipeptídeosincluem tipicamente o seguinte: Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol.Biol. 48:443-453 (1970); Matriz de comparação: BLOSSUM62 de Hentikoff eHentikoff, Proc. Nati Acad. Sei. USA 89:10915-10919 (1992); Penalidadepor Lacuna: 12; Penalidade por Extensão de Lacuna: 4. Um programa quepode ser utilizado com estes parâmetros está à disposição publicamentecomo o programa de "lacunas", fornecido pelo Genetics Computer Group("GCG"), Madison, Wisconsin. Os parâmetros acima, juntamente com au-sência de penalidade para lacuna final são os parâmetros padrões paracomparações entre peptídeos.

Parâmetros para comparação entre seqüências de moléculas deácido nucléico incluem os seguintes: Algoritmo: Needleman e Wunsch, J.Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Matriz de comparação: concordâncias - +10;15 discordâncias = 0; Penalidade por Lacuna: 50; Penalidade por Extensão deLacuna: 3. Conforme é utilizado nesta exposição, o "% de identidade" é de-terminado com os parâmetros acima, como os parâmetros padrões, paracomparações entre seqüências de moléculas de ácido nucléico e o progra-ma de "lacuna" do GCG, versão 10.2.

Subconjuntos das seqüências de ácido nucléico da presente in-venção incluem fragmentos de moléculas de ácido nucléico. "Fragmento demoléculas de ácido nucléico" refere-se a uma parte de uma molécula maiorde ácido nucléico e pode ser constituído de parte(s) significativa(s) ou, naverdade, a maior parte da molécula maior do ácido nucléico. O fragmento damolécula de ácido nucléico pode compreender um oligonucleotídeo menorcom aproximadamente 15 a aproximadamente 400 nucleotídeos contíguose, mais preferivelmente, aproximadamente 15 a aproximadamente 45 nucle-otídeos contíguos, aproximadamente 20 a aproximadamente 45 nucleotí-deos contíguos, aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleotídeoscontíguos , aproximadamente 21 a aproximadamente 30 nucleotídeos contí-guos, aproximadamente 21 a aproximadamente 25 nucleotídeos contíguos,aproximadamente 21 a aproximadamente 24 nucleotídeos contíguos, apro-ximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleotídeos contíguos ou aproxi-madamente 21 nucleotídeos contíguos. Fragmentos de moléculas de ácidonucléico podem ser constituídos por parte(s) significativa(s) de, ou de fato amaior parte, uma região codificadora ou não codificadora de uma planta ou,alternativamente, podem ser constituídos por oligonucleotídeos menores.

Em uma concretização preferida, um fragmento exibe 100% de identidadecom a região codificadora ou não codificadora da planta. Em outra concreti-zação preferida, um fragmento compreende uma parte de uma seqüênciamaior de ácido nucléico. Em uma outra característica, um fragmento de mo-lécula de ácido nucléico possui uma seqüência de ácido nucléico com, pelomenos, 15, 25, 50, 100, 200, 300 ou 400 nucleotídeos contíguos de uma mo-lécula de ácido nucléico da presente invenção. Em uma concretização prefe-rida, uma molécula de ácido nucléico possui uma seqüência de ácido nucléi-co com, pelo menos, 15, 25, 50, 100, 200, 300 ou 400 nucleotídeos contí-guos de uma região codificadora ou não codificadora de uma planta. Emuma das concretizações mais preferidas, uma molécula de ácido nucléicopossui uma seqüência de ácido nucléico com, pelo menos, 1, 2, 5, 10, 20,30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% dos nucleotídeos contíguos de uma regiãocodificadora ou não codificadora completa. Em uma concretização preferida,uma região codificadora ou não codificadora completa pode ser um elementogênico selecionado entre um gene completo, um único exon, um único in-tron, uma seqüência de sinalização ou uma região não traduzida (UTR). Umelemento gênico que não possui a seqüência completa de um elemento ge-nético completo pode ser um fragmento de um elemento gênico. Em umacaracterística preferida da presente invenção, a extensão de um elementogênico é constituída por, pelo menos, 40 nucleotídeos. Em uma característi-ca da presente invenção, um fragmento de um gene é uma parte do elemen-to gênico completo, e este fragmento contém aproximadamente 1, 2, 5, 10,20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% dos nucleotídeos contíguos do elementogênico completo. Em uma característica da presente invenção, um fragmen-to de molécula de ácido nucléico possui entre aproximadamente 5% - a a-proximadamente 80%, entre aproximadamente 10% - a aproximadamente70%, entre aproximadamente 10% - a aproximadamente 60%, entre aproxi-madamente 10% - a aproximadamente 50%, entre aproximadamente 25% -a aproximadamente 60%, entre aproximadamente 25% - a aproximadamente50%, entre aproximadamente 40% - a aproximadamente 60%, entre aproxi-madamente 40% - a aproximadamente 80%, entre aproximadamente 50% -a aproximadamente 90% da extensão de um elemento gênico completo.

Em uma concretização preferida, um fragmento de intron deFAD2-1 possui entre aproximadamente 20 e aproximadamente 420, aproxi-madamente 30 e aproximadamente 420, entre aproximadamente 40 e apro-ximadamente 320, entre aproximadamente 50 e aproximadamente 200, en-tre aproximadamente 50 e aproximadamente 400, entre aproximadamente50 e aproximadamente 420, entre aproximadamente 60 e aproximadamente320, aproximadamente 70 e aproximadamente 220, entre aproximadamente100 e aproximadamente 200, entre aproximadamente 100 e aproximada-mente 320, entre aproximadamente 150 e aproximadamente 200, entre a-proximadamente 150 e aproximadamente 220, entre aproximadamente 150e aproximadamente 400, entre aproximadamente 200 e aproximadamente300 ou entre aproximadamente 300 e aproximadamente 400 nucleotídeoscontíguos. Em uma outra concretização preferida, a extensão de um frag-mento de intron de FAD2-1 é a de aproximadamente 100, aproximadamente150, aproximadamente 200, aproximadamente 220, aproximadamente 250,aproximadamente 300, aproximadamente 320 ou aproximadamente 350 nu-cleotídeos contíguos. Em uma outra concretização preferida, a extensão deum fragmento de intron de FAD2-1 é menor em aproximadamente 20, apro-ximadamente 40, aproximadamente 60, aproximadamente 80, aproximada-mente 100, aproximadamente 120, aproximadamente 140, aproximadamen-te 160, aproximadamente 180, aproximadamente 200, aproximadamente220, aproximadamente 240, aproximadamente 260, aproximadamente 280,aproximadamente 290, aproximadamente 300, aproximadamente 320, apro-ximadamente 340, aproximadamente 360, aproximadamente 380, aproxima-damente 400 nucleotídeos contíguos, em comparação à extensão da SEQID NO: 1. Em relação a todos estes fragmentos de intron de FAD2-1, o trun-camento ou exclusão pode ter início na extremidade 5', na extremidade 3' ouser interna em relação a um intron de FAD2-1. Em relação a todos estesfragmentos de intron de FAD2-1, a seqüência de um intron de FAD2-1 podeser a SEQ ID NO: 1.

Em uma concretização preferida, um fragmento de um geneFATB possui aproximadamente 80 a aproximadamente 450, aproximada-mente 100 a aproximadamente 500, aproximadamente 70 a aproximada-mente 500, aproximadamente 200 a aproximadamente 400, aproximada-mente 150 a aproximadamente 300, aproximadamente 250 a aproximada-mente 350, aproximadamente 200 a aproximadamente 350 nucleotídeoscontíguos de um gene FATB. Em uma concretização preferida, um fragmen-to de FATB é derivado de uma metade dos nucleotídeos totais, presentes noFATB, iniciando na extremidade 5'. Em relação a todos estes fragmentos deFATB, o truncamento ou exclusão pode ter início na extremidade 5', na ex-tremidade 3' ou ser interna em relação ao de FATB. Em uma concretizaçãopreferida, um fragmento de FATB é derivado de uma metade de todos osnucleotídeos no FATB, iniciando na extremidade 5' do FATB, é derivado deum terço de todos os nucleotídeos mais próximos da extremidade 5', noFATB. Em uma concretização especialmente preferida, um fragmento deFATB contém uma seqüência codificadora de peptídeo de trânsito, a qualcodifica de preferência o peptídeo de trânsito cloroplástico. Em uma concre-tização especialmente preferida, um fragmento de FATB contém uma se-qüência codificadora de peptídeo de trânsito, a qual codifica de preferência opeptídeo de trânsito cloroplástico. Em outra concretização especialmentepreferida, um fragmento de FATB inclui ainda aproximadamente 20, aproxi-madamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, 38, 39, 40, 41,42, 43, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55 ouaproximadamente 60 nucleotídeos contíguos de uma 5' UTR de FATB. Emuma das concretizações mais preferidas, um fragmento inclui uma combina-ção de dois ou mais fragmentos descontínuos ou elementos gênicos sepa-rados, como uma 3' UTR de FATB 3' UTR fundida a uma 5' UTR de FATB.Agentes da invenção incluem moléculas de ácido nucléico. Por exemplo,entre outros, em uma característica da presente invenção, a molécula deácido nucléico da presente invenção compreende uma seqüência de intronda SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 25, 32, 33, 34, 35, 44, 45, 46 ou 47, oufragmentos ou complementos destas. Em uma outra característica da in-venção, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de ácidonucléico que, quando introduzida em uma célula ou organismo, é capaz desuprimir a produção de um RNA ou proteína, ao mesmo tempo em que ex-pressa simultaneamente, co-expressa ou expressa coordenadamente umoutro RNA ou proteína. Em uma característica da presente invenção, a mo-lécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de ácido nucléico, aqual, quando introduzida em uma célula ou organismo, é capaz de suprimir,reduzir pelo menos parcialmente, reduzir, reduzir substancialmente ou efeti-vamente eliminar a expressão do RNAs de FAD2, FAD3 ou FATB endóge-nos, ao mesmo tempo em que de co-expressar, co-expressar simultanea-mente ou produzir coordenadamente pelo menos um RNA de uma beta-cetoacil-ACP sintase I, beta-cetoacil-ACP sintase IV, delta-9 dessaturasee/ou CP4 EPSPS ou proteína.

Suprimindo-se, reduzindo pelo menos parcialmente, reduzindo,reduzindo substancialmente ou eliminando efetivamente a expressão de pelomenos um ou mais genes endógenos, a quantidade de FAD2 e/ou FAD3disponível em uma planta vegetal é diminuída, ou seja, os níveis em estadode equilíbrio da proteína são reduzidos, e um percentual menor de ácidosgraxos poliinsaturados, como Iinoleato (C18:2) e Iinolenato (C18:3) pode serfornecido. Modificações no poolde ácidos graxos, disponível para incorpora-ção em triacilgliceróis, podem afetar da mesma forma a composição de ó-Ieos na célula vegetal. Por conseguinte, uma diminuição na expressão deFAD2 e/ou FAD3 pode resultar em aumento da proporção de ácidos graxosmono-insaturados, como oleato (C18:1). Quando a quantidade de FATB di-minui em uma célula vegetal, uma quantidade diminuída de ácidos graxossaturados, como palmitato e estearato, pode ser fornecida. Por conseguinte,uma diminuição na expressão de FATB pode resultar em aumento da pro-porção de ácidos graxos insaturados, como oleato (C18:1). A supressão si-multânea da expressão de FAD2, FAD3 e FATB direciona, pelo mesmo, avia da FAS para aumento geral de ácidos graxos mono-insaturados com ca-deia de 18 carbonos, como o oleato (C18:1). Consultar a patente U.S. No. 5955 650.

Aumentando-se a quantidade de beta-cetoacil-ACP sintase I(KAS I) e/ou beta-cetoacil-ACP sintase IV (KAS IV), disponível em uma plan-ta vegetal, o percentual de 16:0-ACP pode ser diminuído, levando a um au-mento do percentual de 18:0-ACP. Uma quantidade maior de 18:0-ACP,combinada à supressão simultânea de um ou mais entre FAD2, FAD3 eFATB, ajuda, pelo mesmo, a direcionar a composição do óleo para um au-mento geral em oleato (C18:1). Aumentado a quantidade de delta-9 dessatu-rase, disponível em uma planta vegetal, pode-se aumentar o percentual deácidos graxos insaturados, resultando em diminuição geral de estearato esaturados totais.

Essas combinações de expressão aumentada ou diminuída deenzimas podem ser manipuladas para sejam produzidas composições deóleo, incluindo de ácidos graxos, com nível aumentado de oleato e níveisdiminuídos de linoleato, linolenato, estearato e/ou palmitato, além de diminu-ição do nível geral de saturados. A intensificação da expressão gênica emplantas pode ocorrer por meio da introdução de cópias extras de seqüênciascodificadoras dos genes na célula vegetal ou, de preferência, a incorporaçãode cópias extras de seqüências codificadoras do gene no genoma da planta.A superexpressão pode ocorrer também pelo aumento da ação dos meca-nismos reguladores que regulam a expressão de genes, ou seja, regulaçãopositiva da expressão gênica.

A produção de CP4 EPSPS na célula de uma planta proporcionaresistência ou tolerância à célula da planta a glifosato, fornecendo, pelomesmo, um método conveniente para identificação de transformantes bemsucedidos por meio de seleção por tolerância a glifosato.

A supressão de expressão gênica em plantas, também conheci-da como silenciamento gênico, ocorre tanto em nível transcricional como emnível pós-transcricional. Há vários métodos para a supressão de expressãode seqüências endógenas em uma célula hospedeira, incluindo, entre ou-tros, supressão antisense, co-supressão, ribozimas, combinações de sensee antisense (RNAi de fita dupla), silenciamento de promotor e proteínas quese ligam ao DNA, como proteínas dedo de zinco (zinc ίϊηςβή. (Consultar, porexemplo, WO 98/53083, WO 01/14538 e patente U.S. 5 759 829 (Shewma-ker)). Alguns destes mecanismos são associados à homologia de ácido nu-cléico em nível de DNA ou RNA. Esta homologia refere-se à semelhança emseqüências de DNA ou proteína dentro da mesma espécie ou entre espéciesdiferentes. O silenciamento gênico ocorre se a seqüência de DNA introduzi-da em uma célula hospedeira for suficientemente homóloga a um gene en-dógeno, de forma que a transcrição da seqüência introduzida de DNA induzasilenciamento gênico transcricional ou pós-transcricional do gene endógeno.

Homologia suficiente para supressão de níveis de expressão em estado deequilíbrio pode ser, pelo menos, 50%, aproximadamente 60% ou aproxima-damente 70% idêntica ao longo de toda a extensão da seqüência de DNAem relação a uma região codificadora ou não codificadora de uma planta, ouem relação a uma seqüência de ácido nucléico que seja complementar deuma região codificadora ou não codificadora de uma planta. As seqüênciasde DNA mais preferidas são aquelas que, ao longo de toda a sua extensão,são, pelo menos, 80% idênticas; pelo menos, 85% idênticas; pelo menos,90% idênticas; pelo menos, 95% idênticas; pelo menos, 97% idênticas; pelomenos, 98% idênticas; pelo menos, 99% idênticas; ou 100% idênticas a umaregião codificadora ou não codificadora de uma planta, ou a uma seqüênciade ácido nucléico complementar a uma região codificadora ou não codifica-dora de planta. Em plantas, moléculas de RNA de fita dupla podem induzirsilenciamento de seqüências específicas. Silenciamento gênico foi freqüen-temente referido como RNA de fita dupla RNA ("dsRNAi"), em plantas, comoRNA interferente ou RNAi, em Caenorhabditis elegans e em animais e comoquelling (submissão) em fungos.

Em uma concretização preferida, a molécula de ácido nucléicoda presente invenção compreende um primeiro conjunto de seqüências deDNA, cada uma exibindo homologia suficiente com uma ou mais seqüênciascodificadoras ou não codificadoras de um gene de planta, de forma que,quando este é expresso, ele é capaz eliminar efetivamente, reduzir substan-cialmente ou reduzir pelo menos parcialmente o nível de um transcrito demRNA ou proteína, codificados pelo gene do qual a seqüência da codificado-ra ou não codificadora derivou-se, ou qualquer gene que possua homologiacom a seqüência codificadora ou não codificadora visada.

Em uma concretização preferida, a molécula de ácido nucléicoda presente invenção compreende (a) um primeiro conjunto de seqüênciasde DNA, cada uma exibindo homologia suficiente com uma ou mais seqüên-cias codificadoras ou não codificadoras de um gene de planta, de forma que,quando este é expresso, é capaz de eliminar efetivamente, reduzir substan-cialmente ou reduzir pelo menos parcialmente o nível de um transcrito demRNA ou proteína, codificados pelo gene do qual a seqüência codificadoraou não codificadora derivou-se, ou qualquer gene que tenha homologia coma seqüência não codificadora visada, e (b) um segundo conjunto de seqüên-cias de DNA, cada uma exibindo homologia suficiente com um gene da plan-ta de forma que, quando este é expresso, ele é capaz de intensificar parci-almente, aumentar, intensificar, intensificar substancialmente o nível de umtranscrito de mRNA ou proteína, codificados pelo gene.

Conforme utilizado nesta exposição, "um conjunto" de seqüên-cias de DNA pode ser uma ou mais seqüências que codificam ou não umaproteína. Por exemplo, um primeiro conjunto de seqüências de DNA podeser composto por somente um promotor, uma região não codificadora e umterminador. Um segundo conjunto de seqüências de DNA pode ou não estarpresente após ou antes de um primeiro conjunto de seqüências de DNA.

Conforme utilizada nesta exposição, "uma redução" do nível ouquantidade de um agente, como uma proteína ou mRNA, significa que o ní-vel ou quantidade é reduzido em relação a uma célula ou organismo que nãopossua uma seqüência de DNA capaz de reduzir o agente. Por exemplo,"redução pelo menos parcial" refere-se a uma redução de, pelo menos, 25%,"redução substancial" refere-se a uma redução de, pelo menos, 75% e "eli-minação efetiva" refere-se a uma redução maior do que 95%, sendo todasestas reduções no nível ou quantidade do agente, relativas a uma célula ouorganismo que não possua uma seqüência de DNA capaz de reduzir o agen-te.

Conforme utilizado nesta exposição, nível ou quantidade "inten-sificado" ou "aumentado" de um agente, como uma proteína ou mRNA, signi-fica que o nível ou quantidade do agente presente em uma célula, tecido ouplanta com antecedente genético semelhante, porém desprovidos de umamolécula de ácido nucléico introduzida que codifique a proteína ou mRNA.Por exemplo, um nível "pelo menos parcialmente intensificado" refere-se aum aumento de, pelo menos, 25%, e um nível "substancialmente intensifica-do" refere-se a um aumento de, pelo menos, 100%, sendo todos estes au-mentos no nível ou quantidade de um agente, relativos ao nível ou quantida-de do agente presente em uma célula, tecido ou planta com antecedentegenético semelhante, porém desprovidos de uma molécula de ácido nucléicointroduzida que codifique a proteína ou mRNA. Em uma concretização prefe-rida, um aumento em expressão pode ser qualquer expressão em que a pro-teína é heteróloga em relação ao sistema. Por exemplo, qualquer expressãode CP4 EPSPS pode ser um aumento em expressão, se não houve expres-são na planta antes de a introdução de uma molécula de ácido nucléico quecodifica a proteína.

Quando níveis de um agente são comparados, esta comparaçãoé conduzida de preferência entre organismos com antecedente genético se-melhante. De preferência, um antecedente genético semelhante é aquele emque os organismos que estão sendo comparados compartilham 50% oumais, mais preferivelmente, 75% ou mais e, ainda mais preferivelmente, 90%ou mais de identidade de seqüência de material genético nuclear. Em outracaracterística preferida, um antecedente genético semelhante é aquele emque os organismos que estão sendo comparados são plantas, e as plantassão isogênicas, exceto por qualquer material genético originalmente introdu-zido empregando técnicas de transformação de plantas. A medição do nívelou quantidade de um agente pode ser conduzida por qualquer método ade-quado, sendo que exemplos não Iimitantes destes incluem comparação deníveis de transcrito de mRNA, proteínas ou de peptídeos e/ou fenótipo, es-pecialmente o teor de óleos. Conforme utilizados nesta exposição, transcri-tos de mRNA incluem transcritos processados e não processados de mRNA,e proteínas ou peptídeos incluem proteínas ou peptídeos com ou sem modi-ficação pós-traducional.

As seqüências de DNA do primeiro conjunto de seqüências deDNA podem ser seqüências codificadoras, seqüências de intron, seqüênciasde 3'UTR, seqüências de 5'UTR, seqüências de promotor, outras seqüên-cias não codificadoras ou qualquer combinação dos precedentes. O primeiroconjunto de seqüências de DNA codifica uma ou mais seqüências que,quando expressadas, são capazes de reduzir seletivamente qualquer um ouambos, a proteína e o transcrito codificado por um gene selecionado do gru-po constituído por FAD2, FAD3 e FATB. Em uma concretização preferida, oprimeiro conjunto de seqüências de DNA é capaz de expressar RNA anti-sense, em que cada uma das seqüências antisense pode ser ligada em umtranscrito ou pode ser não ligada em transcritos individuais. Em ainda umaoutra concretização preferida, o primeiro conjunto de seqüências de DNAsão seqüências fisicamente ligadas capazes de expressar uma única molé-cula de dsRNA. Em uma concretização diferente preferida, o primeiro con-junto de seqüências de DNA é capaz de expressar RNA de co-supressãosense, em que cada uma das seqüências sense pode ser ligada em umtranscrito ou pode ser não ligada em transcritos individuais. Exemplos deconcretizações do primeiro conjunto de seqüências de DNA são descritos naParte B da Descrição Detalhada e nos Exemplos.

O segundo conjunto de seqüências de DNA codifica uma oumais seqüências que, quando expressadas, são capazes de aumentar umou ambos, a proteína e o transcrito, codificados por um gene selecionado dogrupo constituído por beta-cetoacil-ACP sintase I (KAS I), beta-cetoacil-ACPsintase IV (KAS IV), delta-9 dessaturase e CP4 EPSPS. As seqüências deDNA do segundo conjunto de seqüências de DNA podem ser seqüênciasligadas fisicamente. Exemplos de concretizações do segundo conjunto deseqüências de DNA são descritos abaixo nas Partes C e D da DescriçãoDetalhada.

Dessa forma, a presente invenção provê métodos para alterar acomposição de ácidos graxos e de compostos contendo estes ácidos gra-xos, como óleos, ceras e gorduras. A presente invenção provê também mé-todos para a produção de ácidos graxos em particular em plantas de célulashospedeiras. Estes métodos empregam o uso dos cassetes de expressãodescritos nesta exposição para a modificação da via da FAS na célula hos-pedeira da planta.

B. Primeiro conjunto de seqüências de DNA

Em uma característica da presente invenção, uma molécula deácido nucléico compreende um primeiro conjunto de seqüências de DNA, oqual, quando introduzido em célula ou organismo, expressa uma ou maisseqüências capazes de eliminar efetivamente, reduzir substancialmente oureduzir pelo menos parcialmente os níveis de transcritos de mRNA ou prote-ínas, codificados por um ou mais genes. Características preferidas incluemcomo alvo um gene endógeno, um gene de planta e um gene não viral. Emuma característica da presente invenção, um gene é um gene FAD2, FAD3ou FATB.

Em uma característica, uma molécula de ácido nucléico da pre-sente invenção compreende uma seqüência de DNA que exibe homologiasuficiente com uma ou mais seqüências codificadoras ou não codificadorasde um gene de planta, a qual, quando introduzida em uma célula vegetal ouplanta e expressada, é capaz de eliminar efetivamente, reduzir substancial-mente ou reduzir pelo menos parcialmente o nível de um transcrito de mRNAou proteína, codificados pelo gene do qual a(s) seqüência(s) codificadora(s)ou não codificadora(s) derivou/derivaram. As seqüências de DNA do primei-ro conjunto de seqüências de DNA transcrevem seqüências de RNA oufragmentos de RNA que exibem pelo menos 90%, de preferência, pelo me-nos 95%, mais preferivelmente, pelo menos 98% ou, mais preferível, 100%de identidade em relação a uma região codificadora ou não codificadora,derivada do gene que deve ser suprimido. Este percentual de identidade po-de ser em comparação a qualquer outro fragmento de ácido nucléico.De preferência, a seqüência não codificadora é uma 3' UTR,5'UTR, uma fração de uma seqüência que codifica uma proteína ou um in-tron de um gene de planta. Mais preferivelmente, a seqüência não codifica-dora é uma seqüência de promotor, 3' UTR, 5'UTR ou um intron de um genede planta. O intron pode estar localizado entre exons ou no espaço entre 5'ou 3' de um gene de planta. A seqüência codificadora é, de preferência, umafração de uma estrutura que codifica uma proteína.

A(s) seqüência(s) do primeiro conjunto de seqüências de DNApode(m) ser criada(s) para produzir(em) dsRNA, um RNA de supressão sen-se ou um RNA antisense ou suprimir(em) qualquer outro transcrito para seatingir o efeito desejado quando introduzida(s) em uma célula vegetal ouplanta. Esta(s) seqüência(s) de DNA pode(m) ser fragmentos de moléculasde ácido nucléico.

Um intron de planta pode ser qualquer intron de planta, proveni-ente de um gene, quer endógeno ou introduzido. As seqüências de ácidonucléico destes introns de organismos podem ser obtidas ou derivadas deuma variedade de fontes, incluindo, entre outras, bancos de dados, comoEMBL e Genbank que podem ser encontrados na Internet, no endereço e-bi.ac.uk/swisprot/; expasy.ch/; embl-heidelberg.de/; e ncbi.nlm.nih.gov. Asseqüências de ácido nucléico destes introns podem ser derivadas também,entre outras, de fontes como o programa GENSCAN que pode ser encontra-do na Internet, no endereço genes.mit.edu/GENSCAN.html.

Introns adicionais podem ser obtidos também por métodos queincluem, entre outros, seleção em uma biblioteca genômica com uma sondade seqüências conhecidas de exon ou intron, comparando seqüência genô-mica com sua seqüência correspondente de cDNA, ou clonagem de um in-tron, como um cDNA de soja por alinhamento com uma seqüência genômicade outro organismo, como, por exemplo, Arabidopsis. Além disso, outrasseqüências de ácido nucléico de introns se tornarão aparentes para qualquertécnico no assunto. Os métodos descritos acima podem ser utilizados tam-bém para derivar e obter outras seqüências não codificadoras, incluindo,entre outras, seqüências de promotor, seqüências de 3'UTR e seqüênciasde 5'UTR.

Um gene"FAD2', "Δ12 dessaturase" ou "Omega-6 dessaturase"codifica uma enzima (FAD2) capaz de catalisar a inserção de uma fita duplaem um grupamento acil graxo na décima segunda posição, contada a partirda carboxila terminal. O termo "FAD2-1" é utilizado para referir um geneFAD2 expresso naturalmente de maneira específica no tecido da semente, eo termo "FAD2-2' é utilizado para referir um gene FAD2 que é (a) um genediferente de um gene FAD2-1 e (b) é expresso naturalmente em múltiplostecidos, inclusive a semente. Seqüências representativas de FAD2 incluem,entre outras, aqueles expostas no pedido de patente U.S. No. 10/176 149,depositado em 21 de junho de 2002, e nas SEQ ID NOs: 1-6.

Um gene" FAD3', "Δ15 dessaturase" ou "Omega-3 dessaturase"codifica uma enzima (FAD3) capaz de catalisar a inserção de uma fita duplaem um grupamento acil graxo na décima quinta posição, contada a partir dacarboxila terminal. Os termos "FAD3-1, FAD3-A, FAD3-B e FAD3-C' sãoutilizados para referir membros da família gênica FAD3 que são naturalmen-te expressos em múltiplos tecidos, incluindo a semente. Seqüências repre-sentativas de FAD3 incluem, entre outras, aqueles expostas no pedido depatente U.S. No. 10/176 149, depositado em 21 de junho de 2002, e nasSEQ ID NOs: 7-27.

Um gene "FATB' ou "palmitoil-ACP tioesterase" codifica umaenzima (FATB) capaz de catalisar a clivagem hidrolítica da ligação carbono-enxofre do tioéster no grupo pantoteno prostético do palmitoil-ACP, comosua reação preferida. A hidrólise de outros tioésteres de ACP-ácido graxospode ser também catalisada por esta enzima. Seqüências representativas deFATB-I incluem, entre outras, aquelas expostas no pedido de patente U.S.Provisional No. 60/390 185, depositado em 21 de junho de 2002; nas paten-tes U.S. Nos. 5 955 329; 5 723 761; 5 955 650 e 6 331 664; e SEQ ID NOs:28-37. Seqüências representativas de FATB-2 incluem, entre outras, aquelasexpostas nas SEQ ID NOs: 42-47.

C. Segundo conjunto de seqüências de DNA

Em uma característica da presente invenção, uma molécula deácido nucléico compreende um segundo conjunto de seqüências de DNA1 oqual, quando introduzido em célula ou organismo, é capaz de intensificarparcialmente, aumentar, intensificar ou intensificar substancialmente os ní-veis de transcritos de mRNA ou proteínas, codificados por um ou mais ge-nes. Em uma característica da presente invenção, um gene é um gene en-dógeno. Em uma característica da presente invenção, um gene é um geneendógeno. Em uma característica preferida, genes heterólogos e endógenospodem estar na mesma molécula de ácido nucléico. Em uma característicada presente invenção, um gene é um gene de planta. Em outra característicada presente invenção, um gene é um gene truncado em que o gene trunca-do é capaz de catalisar a reação catalisada pelo gene completo. Em umacaracterística da presente invenção, um gene é um gene da beta-cetoacil-ACP sintase I, gene da beta-cetoacil-ACP sintase IV, gene da delta-9 dessa-turase, gene da CP4 EPSPS, ou uma combinação destes genes.

Um gene da presente invenção pode ser qualquer gene, querendógeno ou introduzido. As seqüências de ácido nucléico destes genespodem ser derivadas de uma variedade de fontes, incluindo, entre outras,bancos de dados, como EMBL e Genbank que podem ser encontrados naInternet, no endereço ebi.ac.uk/swisprot/; expasy.ch/; embl-heidelberg.de/; encbi.nlm.nih.gov. As seqüências de ácido nucléico destes genes podem serderivadas também, entre outras, de fontes como o programa GENSCAN que. pode ser encontrado na Internet, no endereço genes.mit.edu/GENSCAN.html.

Genes adicionais podem ser obtidos também por método queincluem, entre outros, seleção em uma biblioteca genômica ou biblioteca deDNA com uma sonda de seqüências gênicas conhecidas, clonagem de umgene por alinhamento com um gene ou sonda de outro organismo, como,por exemplo, Arabidopsis. Além disso, outras seqüências de ácido nucléicoserão evidentes para qualquer técnico no assunto. Genes adicionais podem,por exemplo, sem restrição, serem amplificados por reação em cadeia dapolimerase (PCR) e utilizados em uma concretização da presente invenção.Adicionalmente, outras seqüências de ácido nucléico serão evidentes paraqualquer técnico no assunto.Sintetizadores automáticos de ácido nucléico podem ser empre-gados para essa finalidade e para criar uma molécula de ácido nucléico, cujaseqüência seja encontrada também em uma célula ou organismo. Em vezdessa síntese, moléculas de ácido nucléico podem ser utilizadas para definirum par de primers que possa ser utilizado com a PCR para amplificar e obterqualquer molécula desejada de ácido nucléico ou fragmento de um primeirogene.

Um gene "KAS Γ ou "beta-cetoacil-ACP sintase I" codifica umaenzima (KAS I) capaz de catalisar o alongamento de um grupamento de acilgraxo para palmitoil-ACP (C16:0). Seqüências representativas de KAS I in-cluem, entre outras, aquelas expostas na patente U.S. No. 5 475 099 e PCTPublication WO 94/10189, e na SEQ ID NO: 38.

Um gene "KAS IV ou "beta-cetoacil-ACP sintase IV" codificauma enzima (KAS IV) capaz de catalisar a condensação da acil-ACPs decadeia média e intensificar a produção de 18:0-ACP. Seqüências represen-tativas de KAS IV incluem, entre outras, aquelas expostas na PCT Publicati-on WO 98/46776, e na SEQ ID NO: 39.

Um gene "delta-9 dessaturase" ou 'estearoil-ACP dessaturase"ou "Omega-9 dessaturase" codifica uma enzima capaz de catalisar a inser-ção de uma fita dupla em um grupamento acil graxo na nona posição, conta-da a partir da carboxila terminal. Uma delta-9 dessaturase da presente in-venção é aquela de uma planta ou cianobactéria e, mais preferivelmente,uma delta-9 dessaturase encontrada também em um organismo selecionadodo grupo constituído por Cartharmus tinctorius, Ricinus communis, Simmon-sia chinensis e Brassica campestris. Seqüências representativas de delta-9dessaturase incluem, entre outras, aquelas expostas na patente U.S. No. 5723 595 e SEQ ID NOs: 40-41.

Um gene "CP4 EPSPS' ou "CP4 5-enolpiruvyishikimato-3-fosfato sintase" codifica uma enzima (CP4 EPSPS) capaz de conferir grauconsiderável de resistência a glifosato às células vegetais e plantas geradasdas mesmas. A seqüência do CP4 EPSPS pode ser uma seqüência de CP4EPSPS derivada de CP4 ou uma variante ou forma sintética deste de Agro-bacterium tumefaciens sp., conforme descrito na patente U.S. No. 5 633 435.Seqüências representativas de CP4 EPSPS incluem, entre outras, aquelasexpostas nas patentes U.S. Nos- 5 627 061 e 5 633 435.

D. Vetores e construções recombinantes

Na transformação ou transfecção de plantas podem ser utiliza-

das uma ou mais construções de ácido nucléico da invenção. Os níveis deprodutos, como transcritos ou proteínas, podem ser aumentados ou diminuí-dos em todo um organismo, como uma planta, ou localizados em um oumais órgãos ou tecidos específicos do organismo. Por exemplo, os níveis deprodutos podem ser aumentados em um ou mais tecidos e órgãos de umaplanta, incluindo, entre outros: raízes, tubérculos, hastes, folhas, caules, fru-ta, grãos, nozes, casca, vagens, sementes e flores. Um órgão preferido ésemente. Por exemplo, material genético exógeno pode ser transferido parauma célula vegetal e esta se regenerar em planta completa fértil ou estéril ouparte de planta.

"Material genético exógeno" é qualquer material genético, querocorrendo naturalmente ou não, derivado de qualquer fonte, capaz de serinserido em qualquer organismo. Este material genético exógeno inclui, entreoutros, moléculas e construções de ácido nucléico da presente invenção. Omaterial genético exógeno pode ser transferido para uma célula hospedeirapor meio de um vetor ou construção de DNA, criado para essa finalidade.Igualmente, um vírus pode transferir material genético exógeno para umacélula hospedeira. O material genético exógeno pode possuir seqüência deDNA idêntica ao do gene endógeno, porém ter sido re-introduzido na célulahospedeira por meio de um vetor ou construção de DNA a fim de suprimir aexpressão do gene endógeno. O desenho de um vetor desse tipo é incluído,de modo geral, na técnica (Consultar, por exemplo, PlantMolecuIarBioIogy:A Laboratory Manual, Clark (ed.), Springer, New York (1997)). Em uma con-cretização preferida, o material genético exógeno é DNA recombinante.

Uma construção ou vetor pode incluir um promotor que atue emcélula vegetal, ou um promotor de planta, para expressar uma molécula deácido nucléico escolhida. Alguns promotores com ação em células vegetaisforam descritos na literatura, e os promotores CaMV 35S e FMV são preferi-dos para uso em plantas. Outros exemplos de promotores preferidos incluemarcelina de feijão e 7S alfa. Outros promotores preferidos são versões inten-sificadas ou duplicadas dos promotores CaMV 35S e FMV 35S. Odell et ai,Nature 313: 810-812 (1985); patente U.S. No. 5 378 619. Promotores adicio-nais que podem ser utilizados são expostos, por exemplo, nas patentes U.S.5 378 619; 5 391 725; 5 428 147; 5 447 858; 5 608 144; 5 608 144; 5 614399; 5 633 441; 5 633 435 e 4 633 436. Ademais, pode ser utilizado um in-tensificador específico de tecido.

Promotores especialmente preferidos podem ser utilizados tam-bém para expressar uma molécula de ácido nucléico da presente invençãoem sementes ou frutos. De fato, em uma concretização preferida, o promotorutilizado é um promotor específico de semente. Exemplos destes promotoresincluem as regiões reguladoras 5' de genes como de napina (Kridl et ai, Se-ed Sei. Res. 1:209-219 (1991)), faseolina, estearoil-ACP dessaturase, 7Soc,7soc' (Chen et ai, Proc. Nati Acad. Sci., 83:8560-8564 (1986)), USP, arceli-na e oleosina. Promotores preferidos para expressão na semente são ospromotores de 7Soc, 7Soc\ napina e FAD2-1A.

Construções ou vetores podem incluir também outros elementosgenéticos, incluindo, entre outros, terminadores transcricionais 3', seqüên-cias de sinalização de poliadenilação 3', outras seqüências de ácido nucléiconão traduzidas, marcadores de seleção ou investigação, promotores, intensi-ficadores e operadores. Construções ou vetores podem conter também umgene sem promotor que pode utilizar um promotor endógeno na inserção.

Moléculas de ácido nucléico que podem ser utilizadas em trans-formação ou transfecção de plantas podem ser qualquer uma das moléculasde ácido nucléico da presente invenção. As concretizações ilustradas nãopretendem restringir a presente invenção. Exemplos de moléculas de ácidonucléico foram expostos na Parte A da Descrição Detalhada; e outros exem-pios não Iimitantes de moléculas de ácido nucléico são descritos abaixo eilustrados nas FIGS. 1-4 e nos Exemplos.

Fazendo referência agora aos desenhos, concretizações da mo-lécula de ácido nucléico da presente invenção são apresentadas nas FIGS.1-4. Conforme foi exposto acima, a molécula de ácido nucléico compreende(a) um primeiro conjunto de seqüências de DNA e (b) um segundo conjuntode seqüências de DNA1 localizadas em uma ou mais do T-DNA1 cada umadas quais flanqueadas por uma borda direita e uma borda esquerda. Dentrodas regiões do T-DNA, a direção da transcrição é mostrada por setas. Asseqüências de DNA das moléculas de ácido nucléico podem ser arranjadasem configurações monocistrônica ou policistrônica. Configurações preferidasincluem aquela em que o primeiro conjunto de seqüências de DNA e o se-gundo conjunto de seqüência de DNA estão localizados em uma única regi-ão do T-DNA.

Em cada uma das concretizações ilustradas, o primeiro conjuntode seqüências de DNA compreende uma ou mais seqüências que, quandoexpressadas, são capazes de reduzir seletivamente uma, duas ou todas asproteínas e transcritos, codificados por um gene selecionado do grupo cons-tituído por FAD2, FAD3 e FATB. De preferência, cada seqüência no primeiroconjunto de seqüências de DNA é capaz, quando expressada, de suprimir aexpressão de um gene diferente, incluindo, entre outros, membros diferentesda família gênica. As seqüências podem incluir seqüências codificadoras,seqüências de intron, seqüências de 3' UTR, seqüências de 5' UTR1 outrasseqüências não codificadoras ou qualquer combinação das precedentes. Oprimeiro conjunto de seqüências de DNA pode ser expresso em qualquerforma adequada, incluindo como de construção de dsRNA, construção deco-supressão sense ou construção antisense. O primeiro conjunto de se-qüências de DNA está ligado operacionalmente a pelo menos um promotorque direciona a expressão das seqüências, o qual pode ser qualquer promo-tor funcional em planta ou qualquer promotor de planta. Promotores preferi-dos incluem, entre outros, um promotor de napina, promotor de 7Sa, promo-tor de 7Sa', promotor de arcelina ou um promotor de FAD2-1A.

O segundo conjunto de seqüências de DNA compreende se-qüências codificadoras, cada uma das quais uma seqüência de DNA quecodifica uma seqüência que, quando expressa, é capaz de aumentar a pro-teína ou transcrito, ou ambos, codificados por um gene selecionado do grupoconstituído por KAS I, KAS IV, delta-9 dessaturase e CP4 EPSPS. Cada se-qüência codificadora está associada a um promotor, o qual pode ser qual-quer promotor funcional em uma planta ou qualquer promotor de planta.

Promotores preferidos para uso no segundo conjunto de seqüências de DNAsão um promotor FMV e/ou promotores específicos de semente. Promotoresespecialmente preferidos incluem, entre outros, um promotor de napina,promotor de 7Sa, promotor de 7Sa', promotor de arcelina, um promotor dedelta-9 dessaturase ou um promotor de FAD2-1A.

Nas concretizações retratadas nas FIGS. 1 e 2, o primeiro con-junto de seqüências de DNA, quando expresso, é capaz de formar uma mo-lécula de dsRNA que é capaz de suprimir a expressão da proteína ou trans-crito, ou de ambos, codificados ou transcritos de um gene selecionado dogrupo constituído por FAD2, FAD3 e FATB. O primeiro conjunto de seqüên-cias de DNA, retratado na FIG. 1, compreende seqüências não codificado-ras, cada uma expressando uma seqüência de RNA (não mostrada) que e-xibe identidade com uma região não codificadora de um gene selecionadodo grupo constituído pelos genes FAD2, FAD3 e FATB. As seqüências nãocodificadoras expressam, cada uma, uma seqüência de RNA que exibe, pelomenos, 90% de identidade com uma região não codificadora de um geneselecionado do grupo constituído pelos genes FAD2, FAD3 e FATB. O pri-meiro conjunto de seqüências de DNA compreende também três seqüênciasantisense, cada uma das quais expressando uma seqüência de RNA anti-sense (não mostrada), capaz de formar uma molécula de RNA de fita duplacom a sua respectiva seqüência de RNA correspondente (conforme expres-sa pelas seqüências não codificadoras).

As seqüências não codificadoras podem ser separadas das se-qüências antisense por uma seqüência espaçadora, de preferência uma quepromova a formação de uma molécula de dsRNA. Exemplos destas seqüên-cias espaçadoras incluem aquelas expostas em Wesley et al., Plant J.,27(6):581-90 (2001) e Hamilton et al., PIantJ., 75:737-746 (1988). Em umacaracterística preferida, a seqüência espaçadora é capaz de formar uma es-trutura em forma de grampo (hairpin), conforme ilustrada em Wesley et ai,supra. Seqüências espaçadoras especialmente preferidas, nesse contexto,são introns de plantas ou partes destes. Um intron de planta especialmentepreferido é um intron auto-removível (spliceable) Introns spliceable incluem,entre outros, um intron selecionado do grupo constituído por intron PDK, in-tron #5 de FAD3-1A FAD3-1B, intron #1 de FAD3, intron #3A de FAD3, in-tron #3B de FAD3, intron #3C de FAD3, intron #4 de FAD3, intron #5 deFAD3, intron #1 de FAD2 e intron de FAD2-2. Introns spliceable preferidosincluem, entre outros, um intron selecionado do grupo constituído por intron#1 de FAD3, intron #3A de FAD3, intron #3B de FAD3, intron #3C de FAD3 eintron #5 de FAD3. Outros introns spliceable preferidos incluem, entre ou-tros, um intron cuja extensão seja de aproximadamente 0,75 kb a aproxima-damente 1,1 kb e que seja capaz de facilitar uma estrutura em harpin noRNA. O intron #5 de FAD3 é um dos exemplos especialmente preferidos deintron spliceable.

As moléculas não codificadoras em orientação sense podem seropcionalmente separadas das moléculas correspondentes em orientaçãoantisense por um segmento espaçador de DNA. O segmento espaçador po-de ser um fragmento de gene ou DNA artificial. O segmento espaçador podeser curto para facilitar a formação de dsRNA em hairpin, ou longo para facili-tar a formação de dsRNA sem estrutura em hairpin. O espaçador pode serprovido, aumentando-se a extensão de uma das moléculas, sense ou anti-sense, conforme exposto em US 2005/0176670 A1. Alternativamente, umaseqüência borda-direita-borda-direita ("RB-RB") pode ser criada, após inser-ção no genoma da planta, conforme exposto no pedido de patente U.S.2005/0183170.

Fazendo referência agora à FIG.1, a molécula de ácido nucléicocompreende duas regiões do T-DNA, cada uma das quais flanqueadas poruma borda direita e uma borda esquerda. A primeira região do T-DNA com-preende o primeiro conjunto de seqüências de DNA que está ligado opera-cionalmente a um promotor, e a primeira região do T-DNA compreende ain-da uma primeira parte do segundo conjunto de seqüências de DNA quecompreende um primeiro promotor ligado operacionalmente a uma primeiraseqüência codificadora, e um segundo promotor ligado operacionalmente auma segunda seqüência codificadora. A segunda região do T-DNA compre-ende uma segunda parte do segundo conjunto de seqüências de DNA quecompreende um terceiro promotor ligado operacionalmente a uma terceiraseqüência codificadora. Em uma concretização preferida, retratada na FIG.2, a molécula de ácido nucléico compreende uma única região do T-DNA,flanqueada por uma borda direita e uma borda esquerda. O primeiro e o se-gundo conjunto de seqüências de DNA estão os dois localizados na únicaregião do T-DNA.

Nas concretizações que expressam dsRNA, mostradas nasFlGS. 1 e 2, a ordem das seqüências pode ser alterada daquela ilustrada edescrita, contudo, as seqüências não codificadoras e as seqüências antisen-se são arranjadas, de preferência, em torno da seqüência espaçadora deforma que, quando expressadas, a primeira seqüência não codificadora po-de hibridizar-se com a primeira seqüência antisense, a segunda seqüêncianão codificadora pode hibridizar-se com a segunda seqüência antisense e aterceira seqüência não codificadora pode hibridizar-se com a terceira se-qüência antisense para que somente uma única molécula de dsRNA possaser formada. De preferência, as seqüências não codificadoras estão em ori-entação sense e as seqüências antisense, em orientação antisense, em re-lação ao promotor. O número de seqüências não codificadoras, antisense ecodificadoras, e as várias posições relativas das mesmas na(s) região(ões)do T-DNA podem ser alteradas de maneira adequada para se atingir os ob-jetivos da presente invenção.

Fazendo referência agora às FIGS. 3 e 4, a molécula de ácidonucléico ilustrada compreende uma região do T-DNA flanqueada por umaborda direita e uma borda direita, sobre a qual estão localizados o primeiro eo segundo conjunto de seqüências de DNA. O primeiro conjunto de seqüên-cias de DNA é ligado operacionalmente a um promotor e a um sinal de ter-minação transcricional. O segundo conjunto de seqüências de DNA compre-ende um primeiro promotor ligado operacionalmente a uma primeira seqüên-cia codificadora, um segundo promotor ligado operacionalmente a uma se-gunda seqüência codificadora e um terceiro promotor ligado operacional-mente a uma terceira seqüência codificadora. O sinal de terminação trans-cricional pode ser qualquer um funcional em uma planta ou qualquer sinal determinação transcricional de planta. Sinais preferidos de terminação transcri-cional incluem, entre outros, uma seqüência E9 3' de ervilha Rubisco, umaseqüência 3' de napina de Brassica, uma seqüência 3' de tml e uma se-qüência 3' de nos.

Na concretização retratada na FIG. 3 , o primeiro conjunto deseqüências de DNA, quando expresso, é capaz de formar uma construçãode co-supressão sense, capaz de suprimir a expressão da proteína ou trans-crito, ou de ambos, codificados ou transcritos de um gene selecionado dogrupo constituído por FAD2, FAD3 e FATB. O primeiro conjunto de seqüên-cias de DNA compreende três seqüências não codificadoras, cada uma ex-pressando uma seqüência de RNA (não mostrada) que exibe identidade comuma ou mais regiões não codificadoras de um gene selecionado do grupoconstituído pelos genes FAD2, FAD3 e FATB. As seqüências não codificado-ras expressam, cada uma, uma seqüência de RNA que exibe, pelo menos,90% de identidade com uma ou mais regiões não codificadoras de um geneselecionado do grupo constituído pelos genes FAD2, FAD3 e FATB. A or-dem das seqüências não codificadoras, no primeiro conjunto de seqüênciasde DNA, pode ser alterada daquela ilustrada e descrita nesta exposição, po-rém as seqüências não codificadoras são arranjadas em orientação sense,em relação ao promotor.

A FIG. 4 retrata uma concretização em que o primeiro conjuntode seqüências de DNA, quando expresso, é capaz de formar uma constru-ção antisense, capaz de suprimir a expressão de uma ou mais proteínas outranscritos, codificados ou derivados de um gene selecionado do grupoconstituído por FAD2, FAD3 e FATB. O primeiro conjunto de seqüências deDNA compreende três seqüências antisense, cada uma expressando umaseqüência de RNA (não mostrada) que exibe identidade com uma ou maisregiões não codificadoras de um gene selecionado do grupo constituído pe-Ios genes FAD2, FAD3 e FATB. As seqüências antisense expressam, cadauma, uma seqüência de RNA antisense que exibe, pelo menos, 90% de i-dentidade com uma ou mais regiões não codificadoras de um gene selecio-nado do grupo constituído pelos genes FAD2, FAD3 e FATB. A ordem dasseqüências antisense, no primeiro conjunto de seqüências de DNA, pode seralterada daquela ilustrada e descrita nesta exposição, porém as seqüênciasantisense são arranjadas em orientação antisense, em relação ao promotor.

As moléculas de ácido nucléico acima descritas são concretiza-ções preferidas que atingem o objeto, aspectos e vantagens da presenteinvenção. As concretizações ilustradas não pretendem restringir a presenteinvenção. O arranjo das seqüências no primeiro e no segundo conjunto deseqüências de DNA, na molécula de ácido nucléico, não se limita aos arran-jos ilustrados e descritos e pode ser alterado em qualquer maneira adequa-da para que os objetos, aspectos e vantagens da presente invenção, con-forme descritos e ilustrados nos desenhos anexos, sejam atingidos.E. Orga-nismos transgênicos e métodos de produção dos mesmos

Quaisquer das moléculas e construções de ácido nucléico dainvenção podem ser introduzidas em uma planta ou célula vegetal de manei-ra permanente ou transitória. Moléculas e construções preferidas de ácidonucléico da presente invenção são descritas acima, nas Partes A a D daDescrição Detalhada, e nos Exemplos. Uma outra concretização da inven-ção é dirigida a um método de produção de plantas transgênicas, o qualcompreende geralmente as etapas de seleção de uma planta ou célula vege-tal adequada, transformação da planta ou célula vegetal com um vetor re-combinante e obtenção de uma célula hospedeira transformada.

Em uma concretização preferida, a planta ou célula é uma plan-ta, ou derivada desta, envolvida na produção de óleos vegetais para uso emalimentação e industrial. Culturas de semente oleaginosas de clima tempe-rado são especialmente preferidas. As plantas de interesse incluem, entreoutras, colza (canola e variedades Ricas em Ácido Erúcico), milho, soja,crambe, mostarda, mamona, amendoim, gergelim, algodão, linhaça, açafrão,palma oleaginosa, linho, girassol e coco. A invenção aplica-se igualmente aespécies monocotiledôneas e dicotiledôneas, e poderá ser imediatamenteaplicada em novas técnicas e/ou melhoradas de transformação e regulado-ras.

Métodos e tecnologia para introdução de DNA em células vege-tais são bem conhecidos de especialistas na técnica, e o uso virtualmente dequalquer método, pelo qual moléculas de ácido nucléico podem ser introdu-zidas em uma célula, é adequado na presente invenção. Exemplos não Iimi-tantes de métodos adequados incluem: Métodos químicos; métodos físicos,como microinjeção, eIetroporação, biobalística (gene gun), bombardeamentode micropartículas e infiltração a vácuo; vetores virais e mecanismos media-dos por receptor. Outros métodos de transformação de células podem serutilizados também e incluem, entre outros, introdução de DNA em plantaspor transferência direta de DNA em pólen, injeção direta de DNA em órgãosreprodutores de uma planta ou injeção direta de DNA nas células de embri-ões imaturos, seguida pela re-hidratação de embriões dessecados.

Transferência mediada por Agrobacterium é um sistema que po-de ser aplicado em amplo espectro para introdução de genes em célulasvegetais. Consultar, por exemplo, Fraley et al., Bio/Technology 3:629-635(1985); Rogers et al., Methods Enzymol. 753:253-277 (1987). A região deDNA a ser transferida é definida pelas seqüências de borda e o DNA inter-veniente é geralmente inserido no genoma da planta. Spielmann et ai, MoLGeri. Genet. 205:34 (1986). Vetores de transformação modernos Agrobacte-rium são capazes de se replicarem em E. coli, bem como em Agrobacterium,possibilitando manipulações convenientes. Klee et al., In: Plant DNA Infecti-ous Agents, Hohn and Schell (eds.), Springer-Verlag, New York, pp. 179-203(1985).

A regeneração, desenvolvimento e cultivo de plantas, derivadasde transformantes de um único de protoplasto de plantas ou de vários ex-plantes transformados, são bens conhecidos na técnica. Consultar, de modogeral, Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring HarborPress (1995); Weissbach and Weissbach, In: Methods for Plant MolecularBiology, Aeademic Press, San Diego, CA (1988). As plantas da presente in-venção podem ser parte ou geradas de um programa de melhoramento, epodem ser também reproduzidas por apomixia. Métodos para a produção deplantas apomíticas são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, apatente U.S. 5 811 636.

Em uma concretização preferida, uma planta da presente inven-ção que inclui seqüências de ácido nucléico que, quando expressadas, sãocapazes de reduzir seletivamente o nível de uma proteína FAD2, FAD3 e/ouFATB e/ou um transcrito de FAD2, FAD3 e/ou FATB, é cruzada com outraplanta da presente invenção que inclui seqüências de ácido nucléico que,quando expressadas, são capazes de superexpressar outra enzima. De pre-ferência, a outra enzima é selecionada do grupo constituído por beta-cetoacil-ACP sintase I, beta-cetoacil-ACP sintase IV, delta-9 dessaturase eCP4 EPSPS.

Em outra característica, uma planta da presente invenção podeser cruzada com outra planta, transgênica ou não. Uma planta da presenteinvenção pode ser cruzada com outra planta que possua composição de ó-Ieo contendo níveis modificados de ácidos graxos, por exemplo, entre ou-tras, uma variedade com composição de óleo com nível mais baixo de ácidolinolênico. Em uma concretização preferida, uma planta da presente inven-ção é cruzada com uma variedade com menos do que 3% por peso de ácidolinolênico, ou em outra concretização, uma planta da presente invenção écruzada com outra planta com mais do que 20% por peso de ácido esteári-co. Estas plantas, contendo níveis modificados de ácidos graxos, são co-nhecidas na técnica, e descritas, por exemplo, em Hawkins e Kridl (1998)Plant Journal 13(6):743-752 e na patente U.S. No. 6 365 802.F. Produtos da presente invenção

As plantas da presente invenção podem ser utilizadas no todoou em parte. Partes preferidas das plantas incluem partes reprodutoras oude depósito. O termo "partes de plantas", conforme utilizado nesta exposi-ção, inclui entre outros, semente, endosperma, óvulo, pólen, raízes, tubércu-los, hastes, folhas, caules, fruta, grãos, nozes, casca, vagens, sementes eflores. Em uma concretização especialmente preferida da presente invenção,parte da planta é uma semente.

Qualquer planta ou partes da mesma da presente invenção po-dem ser processadas para produzir ração, alimento, proteína ou preparadode óleo. Em uma concretização preferida da presente invenção, uma plantapode ser aquela cujo óleo tenha composição de ácido graxo da presenteinvenção. Uma parte da planta especialmente preferida para essa finalidadeé uma semente. Em uma concretização preferida, a ração, alimento, proteí-na ou preparado de óleo é criado para animais domésticos, peixe ou sereshumanos, ou qualquer combinação. Métodos para produzir ração, alimento,proteína ou preparados de óleo são conhecidos na técnica. Consultar, porexemplo, as patentes U.S. 4 957 748, 5 100 679, 5 219 596, 5 936 069, 6005 076, 6 146 669 e 6 156 227. Em uma concretização preferida, o prepa-rado de proteína é rico em proteína. Este preparado rico em proteína possui,de preferência, teor protéico acima de 5% p/v, mais preferivelmente de 10%p/v e ainda mais preferivelmente de 15% p/v.

Em um preparado preferido de óleo, o preparado de óleo é ricoem óleo com teor de óleo, derivado de uma planta ou parte desta da presen-te invenção, acima de 5% p/v, mais preferivelmente, de 10% p/v e aindamais preferível de 15% p/v. Em uma concretização preferida, o preparado deóleo é líquido e com volume maior do que 1, 5, 10 ou 50 litros. A presenteinvenção provê um óleo, produzido a partir de plantas da presente invençãoou gerado por um método da presente invenção. Este óleo pode exibir esta-bilidade oxidativa intensificada. Além disso, este óleo pode ser um dos prin-cipais componentes ou um secundário de qualquer produto resultante.

Ademais, este óleo pode ser misturado com outros óleos. Emuma concretização preferida, o óleo, produzido de plantas da presente in-venção ou gerado por um método da presente invenção, constitui mais de0,5%, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ou 90% por volume ou peso do com-ponente óleo de qualquer produto. Em outra concretização, o preparado doóleo pode ser misturado e constituir mais de 10%, 25%, 35%, 50% ou 75%da mistura por volume. O óleo produzido de uma planta da invenção podeser misturado com um ou mais solventes orgânicos ou destilados depetróleo.

As sementes das plantas podem ser colocadas em um recipien-te. Recipiente, conforme utilizado nesta exposição, é qualquer objeto capazde conter estas sementes. Um recipiente contém, de preferência, acima deaproximadamente 500, 1.000, 5.000 ou 25.000 sementes, em que, pelo me-nos, aproximadamente 10%, 25%, 50%, 75% ou 100% das sementes sãoderivadas de uma planta da presente invenção. A presente invenção, provêtambém um recipiente de mais de aproximadamente 10.000, mais preferi-velmente, aproximadamente 20.000 e, ainda mais preferivelmente, aproxi-madamente 40.000 sementes, em que mais de aproximadamente 10%, maispreferivelmente, aproximadamente 25%, mais preferivelmente, 50% e, aindamais preferivelmente, aproximadamente 75% ou 90% das sementes sãosementes derivadas de uma planta da presente invenção. A presente inven-ção, provê também um recipiente de mais de aproximadamente 10 kg, maispreferivelmente, aproximadamente 25 kg e, ainda mais preferivelmente, a-proximadamente de 50 kg de sementes, em que mais de aproximadamente10%, mais preferivelmente, aproximadamente 25%, mais preferivelmente,50% e, ainda mais preferivelmente, aproximadamente 75% ou 90% das se-mentes são sementes derivadas de uma planta da presente invenção.

F. Composições de óleo

Para muitas aplicações com óleo, os níveis de ácido graxos sa-turados são, de preferência, menores do que 8% por peso e, ainda mais pre-ferivelmente, aproximadamente 2-3% por peso. Ácidos graxos saturadospossuem pontos de fusão altos, indesejáveis em muitas aplicações. Quandoutilizados como matéria-prima ou combustível, ácidos graxos saturados pro-vocam turvamento em baixas temperaturas e conferem propriedades desfa-voráveis de fluxo frio, como ponto de fluidez e pontos de entupimento de fil-tro a frio ao combustível. Consumidores e a indústria de alimentos podempreferir produtos de óleo contendo níveis baixos de ácidos graxos porqueestes são considerados mais saudáveis e/ou porque ser identificados como"livres de gordura saturada", de acordo com as diretrizes da FDA. Além dis-so, óleos com níveis baixos de saturados reduzem ou eliminam a necessi-dade de serem adaptados para aplicações em alimentos, como óleos parasaladas. Em aplicações para biodiesel e lubrificantes, óleos com níveis bai-xos de ácidos graxos saturados conferem propriedades melhoradas de fluxofrio e não turvam em temperaturas baixas.

Os fatores que controlam as propriedades físicas de um óleo emparticular são complexos. O ácido palmítico, ácido esteárico e outros ácidosgraxos saturados são tipicamente sólidos em temperatura ambiente, ao con-trário dos ácidos graxos não saturados que permanecem líquidos. Como osácidos graxos saturados não possuem ligações duplas na cadeia acila, elespermanecem estáveis à oxidação em temperaturas elevadas. Ácidos graxossaturados são componentes importantes em margarinas e fórmulas comchocolate, porém para muitas aplicações em alimentação, níveis reduzidosde ácidos graxos saturados são desejados.

O ácido oléico possui uma ligação dupla, porém é ainda relati-vãmente estável em temperaturas altas, e óleo com níveis altos de ácidooléico são adequados para cozimento e outros processos que requerem a-quecimento. Recentemente, foi recomendado o aumento de consumo deóleos ricos em ácido oléico porque o ácido oléico parece diminuir níveis san-güíneos de liproproteínas de baixa densidade ("LDLs"), sem afetar níveis delipoproteínas de alta densidade ("HDLs")· No entanto, pode ser desejadoalgum limite em níveis de ácido oléico, porque, quando este é degradado emtemperaturas altas, ele cria compostos com sabor desagradável e diminui ossabores agradáveis criados pela oxidação de ácido linoléico. Neff et ai, JA-OCS1 77 :1303-1313 (2000); Warner et ai, J. Agric. Food Chem. 49:899-905(2001). Óleos preferidos possuem níveis de ácido oléico de 65-85% ou me-nos por peso, visando limitar a liberação de sabores em aplicações em ali-mentos, como em óleo para fritura e alimento frito. Em outros óleos preferi-dos, os níveis de ácido oléico são acima de 55% por peso para melhorar aestabilidade oxidativa.

O ácido linoléico é um dos principais ácidos graxos poliinsatura-dos em alimentos e é um nutriente essencial para seres humanos. Ele é umcomponente desejado de muitas aplicações em alimento porque é um pre-cursor importante de substâncias que conferem sabor a alimento frito, como2,4 decadienal, que torna alimentos fritos saborosos. No entanto, a estabili-dade do ácido linoléico é limitada quando aquecida. Óleos preferidos paraalimento possuem níveis de ácido linoléico de 10% ou mais por peso paraaumentar a formação de substâncias desejadas que confiram sabor ao ali-mento frito, e também de 25% menos por peso para reduzir a formação desabores desagradáveis. O ácido linoléico possui também propriedades quediminuem o colesterol, embora o excesso em dieta possa reduzir a capaci-dade das células humanas de se protegerem contra lesão oxidativa, aumen-tando, pelo mesmo, o risco de doença cardiovascular. Toborek et al., Am J.Clin. J. 75:119-125 (2002). Consultar, de modo geral, Flavor Chemistry ofLipid Foods, editors D.B. Min & T.H. Smouse, Am Oil Chem. Soc., Cham-paign, IL (1989).

O ácido linoléico com ponto de fusão mais baixo do que o doácido oléico contribui ainda para melhores propriedades de fluxo frio, dese-jáveis em aplicativos de biodiesel e biolubrificantes. Os níveis de ácido lino-léico dos óleos preferidos para a maioria das aplicações são de 30% ou me-nos por peso porque a oxidação do ácido linoléico limita o tempo de validadepara armazenamento ou uso do óleo para fritura, alimento, ração, combustí-vel e lubrificante produzidos. Consultar, de modo geral, Physical Propertiesof Fatsl Oilsl and Emulsifiers,-eô. N. Widlak, AOCS Press (1999); Erhan &Asadauskas, Lubricant Basestocks from Vegetable Oils, Industrial Crops andProducts, 11:277-282 (2000). Ademais, níveis altos de ácido linoléico emração de gado podem levar a níveis altos indesejáveis de ácido linoléico noleite do gado de leite e, por conseguinte, estabilidade oxidativa deficiente esabor desagradável. Timmons et al., J. Dairy Sei. 84:2440-2449 (2001). Umacomposição de óleo de uso extenso possui níveis de ácido linoléico de 10-25% por peso.

O ácido linolênico é também um componente importante da dietahumana. Ele é utilizado para sintetizar a família ω-3 de ácidos graxos de ca-deia longa e as prostaglandinas derivadas destes. No entanto, as suas liga-ções duplas são altamente susceptíveis à oxidação, de forma que óleos comníveis altos de ácido linolênico deterioram rapidamente quando expostos aoar, especialmente em altas temperaturas. A hidrogenação parcial destes ó-Ieos é muitas vezes necessária antes que eles possam ser utilizados emprodutos alimentícios, para retardar a formação de sabores desagradáveis ede mau cheiro quando o óleo é aquecido, porém a hidrogenação cria ácidosgraxos trans nocivos que podem contribuir para doença cardiovascular. Paraque melhor estabilidade oxidativa seja atingida e reduzir a necessidade dehidrogenar o óleo, os níveis de ácido linolênico de óleos preferidos são 8%ou menos por peso, 6% ou menos, 4% ou menos, menos do queaproximadamente 3% e, mais preferivelmente, 0,5-2% por peso dos ácidosgraxos totais, no óleo da presente invenção.

O óleo de soja da presente invenção pode ser utilizado tambémcomo matéria-prima para mistura na produção de óleo misturado. Matéria-prima para mistura significa que o óleo derivado de soja da presente inven-ção pode ser misturado com outros óleos vegetais para melhorar as caracte-rísticas, como composição de ácidos graxos, sabor e estabilidade oxidativados outros óleos. A quantidade de óleo de soja da presente invenção quepode ser utilizada dependerá das propriedades desejadas, pretendidas noproduto final resultante do óleo. Exemplos de óleos compostos produzidosincluem, entre outros, margarinas, gordura vegetal, óleos para fritura, óleosde salada, etc. O óleo de soja da presente invenção pode ser um óleo com-posto, óleo sintetizado ou, em uma concretização preferida, um óleo geradode uma semente oleaginosa cuja composição é a apropriada. Um óleo gera-do diretamente de uma semente oleaginosa é um óleo sem mistura. Em umaoutra característica, um óleo é derivado diretamente de uma semente olea-ginosa madura. Nesta característica, semente madura é definida como aque-la colhida no campo para atividades comerciais agrícolas, como venda pararação. Em uma concretização preferida, o óleo é óleo de soja. O óleo podeser cru, como óleo de soja cru, ou pode ser processado, por exemplo, podeser refinado, descorado, desodorizado e/ou preparado para inverno. "Refi-no", conforme utilizado nesta exposição, refere-se a um processo de trata-mento de gordura ou óleo natural ou processado para remover impurezas, epode ser realizado por tratamento com soda cáustica da gordura ou óleo,com soda cáustica, seguido por centrífugação, lavagem com água e aqueci-mento sob vácuo. "Descoramento" refere-se a um processo de tratamentode gordura ou óleo para retirada ou redução dos níveis de materiais corantesna gordura ou óleo. O descoramento pode ser realizado pelo tratamento dagordura ou óleo com carvão ativado ou terra de Fullers (diatomita). "Desodo-rização" refere-se a um processo de retirada de componentes de gordura ouóleo que contribuem com sabores ou odores desagradáveis no produto final,e pode ser realizada por lavagem em alto vácuo ou com vapor superaqueci-do. "Preparação para inverno" refere-se a um processo de retirada de glice-rídeos saturados de um óleo, e pode ser realizada por resfriamento e retira-da de partes solidificadas de gordura de um óleo.

Um óleo preferido da presente invenção possui composição comnível baixo de saturados ou composição com nível zero de saturados. Emoutras concretizações preferidas, óleos da presente invenção possuem ní-veis aumentados de ácido oléico, níveis reduzidos de ácidos graxos satura-dos e níveis reduzidos de ácidos graxos poliinsaturados. Em ainda outrasconcretizações preferidas, óleos da presente invenção possuem níveis au-mentados de ácido oléico e níveis reduzidos de ácidos graxos saturados. Emuma concretização preferida, o óleo é óleo de soja. Os percentuais do teorde ácidos graxos, ou níveis de ácidos graxos, conforme utilizados nesta ex-posição, referem-se a percentuais por peso.

Em uma primeira concretização, um óleo da presente invençãopossui, de preferência, uma composição com 55 a 80% de ácido oléico, deaproximadamente 12 a 43% de poliinsaturados e de 2 a 8% de ácidos gra-xos saturados; mais preferivelmente, uma composição com 55 a 80% deácido oléico, de aproximadamente 14 a 42% de poliinsaturados e de 3 a 6%de ácidos graxos saturados; e, ainda mais preferivelmente, possui umacomposição com 55 a 80% de ácido oléico, de aproximadamente 16,5 a 43%de poliinsaturados e de 2 a 3,6% de ácidos graxos saturados.

Em uma segunda concretização, um óleo da presente invençãopossui, de preferência, uma composição com 65 a 80% de ácido oléico, deaproximadamente 12 a 33% de poliinsaturados e de 2 a 8% de ácidos gra-xos saturados; mais preferivelmente, uma composição com 65 a 80% deácido oléico, de aproximadamente 14 a 32% de poliinsaturados e de 3 a 6%de ácidos graxos saturados; e, ainda mais preferivelmente, possui umacomposição com 65 a 80% de ácido oléico, de aproximadamente 16,5 a 33%de poliinsaturados e de 2 a 3,6% de ácidos graxos saturados.

Em uma terceira concretização, um óleo da presente invençãopossui, de preferência, uma composição com aproximadamente 42 a apro-ximadamente 85% de ácido oléico e com aproximadamente 8% a aproxima-damente 1,5% de ácidos graxos saturados; mais preferivelmente a composi-ção do óleo possui uma quantidade combinada de ácido oléico e ácido Iino-lênico equivalente a aproximadamente 65% a aproximadamente 95% porpeso da composição total do óleo. Ainda mais preferivelmente, a composi-ção do óleo da presente invenção possui uma quantidade combinada de á-cido oléico e ácido linolênico equivalente de aproximadamente 75% a apro-ximadamente 90%, aproximadamente 75% a aproximadamente 95%, apro-ximadamente 75% a aproximadamente 85%, aproximadamente 65% a apro-ximadamente 90%, aproximadamente 70% a aproximadamente 90% porpeso da composição total do óleo.

Em uma quarta concretização, um óleo da presente invençãopossui composição com aproximadamente 42 a aproximadamente 85% deácido oléico, aproximadamente 8% a aproximadamente 1.5% de ácidos gra-xos saturados e aproximadamente 6% a aproximadamente 15% por peso deácido linolênico; mais preferivelmente, a composição do óleo é de aproxima-damente 42 a aproximadamente 85% de ácido oléico, aproximadamente 8%a aproximadamente 1,5% de ácidos graxos saturados e menos do que 35%por peso de ácido linolênico; e ainda mais preferivelmente, a composição doóleo é aproximadamente 42 a aproximadamente 85% de ácido oléico, apro-ximadamente 8% a aproximadamente 1,5% de ácidos graxos saturados eaproximadamente 9% por peso de ácido linolênico.

Em uma quinta concretização, um óleo da presente invençãopossui composição de óleo de aproximadamente 50% a aproximadamente85% de ácido oléico e aproximadamente 8% a aproximadamente 1,5% deácidos graxos saturados; mais preferivelmente, de aproximadamente 50% a•aproximadamente 85% de ácido oléico, de aproximadamente 8% a aproxi-madamente 1,5% de ácidos graxos saturados e de aproximadamente 4% aaproximadamente 14% por peso de ácido linolênico; mais preferivelmente,possui composição de óleo de aproximadamente 50% a aproximadamente85% de ácido oléico, aproximadamente 8% a aproximadamente 1,5% deácidos graxos saturados e menos do que 35% por peso de ácido linolênico;e ainda mais preferivelmente, uma composição de óleo de aproximadamente42 a aproximadamente 85% de ácido oléico, de aproximadamente 8% a a-proximadamente 1,5% de ácidos graxos saturados e de aproximadamente2% a aproximadamente 45% por peso de ácido linolênico.

Em outra concretização, um óleo da presente invenção possuicomposição com aproximadamente 65-80% de ácido oléico, aproximada-mente 3-8% de saturados e aproximadamente 12-32% de poliinsaturados.Em outra concretização, um óleo da presente invenção possui composiçãocom aproximadamente 65-80% de ácido oléico, aproximadamente 2-3,5% desaturados e aproximadamente 16,5-33% de poliinsaturados.

Em uma concretização especialmente preferida, um óleo da pre-sente invenção possui composição com aproximadamente 47- 83% de ácidooléico e aproximadamente 5% de saturados; aproximadamente 60-80% deácido oléico e aproximadamente 5% de saturados; aproximadamente 50-85% de ácido oléico e aproximadamente 2-7% de saturados; aproximada-mente 55-85% de ácido oléico e aproximadamente 2.5-7% de saturados;aproximadamente 47-88% de ácido oléico e aproximadamente 3-7% de sa-turados; aproximadamente 43-85% de ácido oléico e aproximadamente 5-7% de saturados; aproximadamente 81-85% de ácido oléico e aproximada-mente 5% de saturados; aproximadamente 74-83% de ácido oléico e apro-ximadamente 6% de saturados; aproximadamente 65-87% de ácido oléico eaproximadamente 6% de saturados; aproximadamente 66-80% de ácido o-léico e aproximadamente 6% de saturados; aproximadamente 42-77% deácido oléico e aproximadamente 5-8% de saturados; aproximadamente 60-77% de ácido oléico e aproximadamente 6% de saturados; aproximadamen-te 70-81% de ácido oléico e aproximadamente 5-7% de saturados; aproxi-madamente 52-71% de ácido oléico e aproximadamente 5-7% de saturados;aproximadamente 44-71% de ácido oléico e aproximadamente 6% de satu-rados; aproximadamente 61 -71 % de ácido oléico e aproximadamente 8% desaturados; aproximadamente 57-71% de ácido oléico e aproximadamente7% de saturados; aproximadamente 23-58% de ácido oléico e aproximada-mente 8-14% de saturados; aproximadamente 20-70% de ácido oléico e a-proximadamente 6% de saturados; aproximadamente 21-35% de ácido oléi-co e aproximadamente 5-6% de saturados; ou aproximadamente 19-28% deácido oléico e aproximadamente 5% de saturados.

Em outras concretizações o percentual de ácido oléico é 50% oumaior; 55% ou maior; 60% ou maior; 65% ou maior; 70% ou maior; 75% oumaior; ou 80% ou maior; ou em um intervalo de 50 a 80%; 55 a 80%; 55 a75%; 55 a 65%; 60 a 85%; 60 a 80%; 60 a 75%; 60 a 70%; 65 a 85%; 65 a80%; 65 a 75%; 65 a 70%; ou de 69 a 73%. Intervalos percentuais adequa-dos para teor de ácido oléico em óleos da presente invenção, incluem tam-bém aqueles em que o limite inferior é selecionado entre os seguintes per-centuais: 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ou 80 por cento; e o limite supe-rior é selecionado entre os seguintes percentuais: 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66,67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86,87, 88, 89 ou 90 por cento.

Nestas outras concretizações, o percentual de ácido linoléico emum óleo da presente invenção varia de 10 a 40%; 10 a 39%; 10 a 30%; 10 a29%; 10 a 28%; 10 a 25%; 10 a 21%; 10 a 20%; 11 a 30%; 12 a 30%; 15 a25%; 20 a 25%; 20 a 30% ou de 21 a 24%. Intervalos percentuais adequa-dos para teor de ácido linoléico em óleos da presente invenção, incluemtambém aqueles em que o limite inferior é selecionado entre os seguintespercentuais: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,27, 28, 29 ou 30 por cento; e o limite superior é selecionado entre os seguin-tes percentuais: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,36, 37, 38, 39 ou 40 por cento.

Nestas outras concretizações, o percentual de ácido linolênicoem um óleo da presente invenção é 10% ou menos; 9% ou menos; 8% oumenos; 7% ou menos; 6% ou menos; 5% ou menos; 4,5% ou menos; 4% oumenos; 3,5% ou menos; 3% ou menos; 3,0% ou menos; 2,5% ou menos; ou2% ou menos; ou varia de 0,5 a 2%; 0,5 a 3%; 0,5 a 4,5%; 0,5% a 6%; 3 a5%; 3 a 6%; 3 a 8%; 1 a 2%; 1 a 3%; ou de 1 a 4%. Nestas outras concreti-zações, o percentual de ácidos graxos saturados, em uma composição deóleo da presente invenção, é 15% ou menos; 14% ou menos; 13% ou me-nos; 12% ou menos, 11% ou menos; 10% ou menos; 9% ou menos; 8% oumenos; 7% ou menos; 6% ou menos; 5% ou menos; 4% ou menos; ou 3,6%ou menos; ou varia de 2 a 3%; 2 a 3,6%; 2 a 4%; 2 a 8%; 3 a 15%; 3 a 10%;3 a 8%; 3 a 6%; 3,6 a 7%; 5 a 8%; 7 a 10%; ou de 10 a 15%.

Em outras concretizações, os ácidos graxos saturados em umóleo da presente invenção incluem a combinação do ácido graxo palmítico eo esteárico. Em uma concretização, o percentual de ácidos graxos saturadosvaria de aproximadamente 10% a menos; aproximadamente 9% a menos;aproximadamente 8% a menos; aproximadamente 7% a menos; aproxima-damente 6% a menos; aproximadamente 5% a menos; aproximadamente4,5% a menos; aproximadamente 4% a menos; aproximadamente 3,5% amenos; aproximadamente 3% a menos; aproximadamente 3,0% a menos;aproximadamente 2,5% a menos; ou de aproximadamente 2% a menos; ouestá em um intervalo de 0,5 a 2%; 0,5 a 3%; 0,5 a 4,5%; 0,5 a 6%; 0,5 a 7%;0,5 a 8%; 0,5 a 9%; 1 a 4%; 1 a 5%; 1 a 6%; 1 a 7%; 1 a 8%; 1 a 9%; 1,5 a5%; 1,5 a 6%; 1,5 a 7%; 1,5 a 8%; 1,5 a 9%; 2 a 5%; 2 a 6%; 2 a 7%; 2 a8%; 2 a 9%; 3 a 5%; 3 a 6%; 3 a 7%; 3 a 8%; 3 a 9%; 4 a 7%; 4 a 8%; 4 a9%; 5 a 7%; 5 a 8%; e de 5 a 9%. Nestas concretizações, intervalos percen-tuais adequados para teor de ácidos graxos saturados em óleos da presenteinvenção, incluem também aqueles em que o limite inferior é selecionadoentre os seguintes percentuais: 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6 ou6,5 por cento; e o limite superior é selecionado entre os seguintes percentu-ais: 11; 10; 9; 8; 7; 6; 5; 4,5; 4; 3,5; 3; 2,5; 2; 1,5; 1 ou 0,5 por cento.Em outras concretizações, o percentual do ácido graxo palmíticoem uma composição de um óleo da presente invenção varia de 6% a menos;5% a menos; 4,5% a menos; 4% a menos; 3,5% a menos; 3% a menos;3,0% a menos; 2,5% a menos; ou de 2% a menos; ou está em um intervalode 0,5 a 2%; 0,5 a 3%; 0,5 a 4,5%; 0,5 a 6%; 1 a 3%; 1 a 4%; 1 a 5%; 1 a6%; 1,5 a 2%; 1,5 a 3%; 1,5 a 4%; 1,5 a 4,5%; 1,5 a 5%; 1,5 a 5,5%; 1,5 a6%; 1,5 a 6,5%; 1,5 a 7%; 2 a 3%; 2 a 3,5%; 2 a 4%; 2 a 4,5%; 2 a 5%; 2 a6%; 2 a 7%; 2 a 8%; 3 a 5%; 3 a 6%; 3 a 7%; 3 a 8%; 3 a 9%. Nestas con-cretizações, intervalos percentuais adequados para teor de ácido linoléicoem óleos da presente invenção, incluem também aqueles em que o limiteinferior é selecionado entre os seguintes percentuais: 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3;3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7 ou 7,5 por cento; e o limite superior é selecionadoentre os seguintes percentuais: 11; 10; 9; 8; 7; 6; 5; 4,5; 4; 3,5; 3 ou 2 porcento.

Em outras concretizações, o percentual do ácido graxo esteáricona composição de um óleo da presente invenção varia de 3% a menos;3,0% a menos; 2,5% a menos; ou de 2% a menos; ou está em um intervalode 0,5 a 1%; 0,5 a 1,5%; 0,5 a 2%; 0,5 a 2,5%; 0,5 a 3%; 0,5 a 4%; 1 a 2%;1 a 3%; 1 a 4%; 1,5 a 2%; 1,5 a 3%; ou de 1,5 a 4%. Nestas concretizações,intervalos percentuais adequados para teor de ácido linoléico em óleos dapresente invenção, incluem também aqueles em que o limite inferior é sele-cionado entre os seguintes percentuais: 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 ou 3,5; e o limitesuperior é selecionado entre os seguintes percentuais: 3,5; 3; 2,5; 2 ou 1,5porcento.

Um óleo da presente invenção é especialmente adequado paraser utilizado como óleo de cozinha ou para fritura. Por causa de seu teor re-duzido de ácidos graxos poliinsaturados, o óleo da presente invenção nãorequer o processamento extenso de óleos convencionais, em virtude de umnúmero menor de compostos com odor ou cor desagradáveis estar presente.

Além disso, o baixo teor de ácidos graxos saturados deste óleo melhora aspropriedades de fluxo frio do óleo, e evita a necessidade de aquecer o óleoarmazenado para impedir que ele cristalize ou solidifique-se. Fluxo frio me-Ihorado possibilita também melhor drenagem de óleo do alimento frito, umavez este removido do óleo para tritura, resultando, pelo menos, em um pro-duto com menor teor de gordura. Consultar, Bouchon et ai, J. Food Science66: 918-923 (2001). Os níveis baixos de ácido linolênico neste óleo são es-pecialmente vantajosos na tritura para reduzir sabores desagradáveis.

Este óleo é também bastante adequado para uso como óleo desalada (um óleo que mantém a clareza em temperaturas refrigeradas de 40-50 graus Fahrenheit). A sua clareza melhorada em temperaturas refrigera-das, decorrente do baixo teor de ácidos graxos saturados e teor moderadode ácido linoléico, reduz ou elimina a necessidade de preparação para in-verno do óleo, antes de uso como óleo de salada.

Além disso, o teor moderado de ácido linoléico e baixo do ácidolinolênico deste óleo tornam este óleo bastante adequado para produção degordura vegetal, margarina e outras gorduras vegetais semi-sólidas, utiliza-das em produtos para alimentação. A produção destas gorduras envolvetipicamente hidrogenação de óleos não saturados, como óleo de soja, óleode milho ou óleo de canola. A estabilidade oxidativa e de sabor melhoradadeste óleo significa que ele não precisa ser hidrogenado, na medida que ouso do óleo vegetal típico for para margarina e gordura vegetal, reduzindo,pelo mesmo, custos de processamento e a produção de isômeros trans no-civos à saúde.

Um óleo da presente invenção é adequado também para usocomo matéria-prima para produção de biodiesel, especialmente porque bio-diesel feito deste óleo possui melhor fluxo frio, melhor qualidade de ignição(número de cetanos), melhor estabilidade oxidativa e emissões reduzidas deóxido nítrico. O biodiesel é um combustível alternativo de diesel, compostotipicamente de metil ésteres de ácidos graxos Ci6-C22 saturados, mono-insaturados e poliinsaturados. O número de cetanos é uma medida de quali-dade de ignição - quanto mais curto o tempo de atraso de ignição do com-bustível no motor, maior o número de cetanos. A especificação padrão doASTM, para combustível biodiesel (D 6751-02) requer número mínimo decetanos de 47.O uso de biodiesel em motores convencionais a diesel resultaem reduções substanciais de poluentes como sulfatos, monóxido de carbonoe particulados, em comparação ao combustível diesel derivado de petróleo,e o uso em ônibus escolares reduz bastante a exposição de crianças à e-xaustão de diesel tóxico. Uma limitação ao uso de 100% de biodiesel con-vencional como combustível é o ponto alto de névoa de biodiesel convencio-nal derivado de soja (2 graus C) , em comparação ao diesel número 2 (-16graus C). Dunn et ai, Recent. Res. Devei, in Oil Chem., 1:31-56 (1997). Bio-diesel feito do óleo da presente invenção possui ponto de névoa melhorado(reduzido) e ponto de entupimento de filtro a fio, e pode ser utilizado tambémem misturas para melhorar as propriedades de temperatura fria do biodieselfeito a partir de fontes baratas, porém altamente saturadas de gordura, comogordura animal (cera, gordura animal, gordura de galinha) e óleo de palma.

O biodiesel pode ser também misturado com diesel derivado de petróleo, emqualquer nível.

O biodiesel é obtido tipicamente por extração, filtração e refinode óleo de soja para remoção de gorduras livres e fosfolipídios e, em segui-da, transesterificação do óleo com metanol para formar metil ésteres dosácidos graxos. Consultar, por exemplo, a patente U.S. No. 5 891 203. Osmetil ésteres de soja resultantes são referidos comumente como "biodiesel".

O óleo da presente invenção pode ser utilizado também como combustíveldiesel, sem a formação de metil ésteres, como, por exemplo, pela mistura deacetais co o óleo. Consultar, por exemplo, a patente U.S. No. 6 013 114.Graças às suas propriedades melhoras de fluxo frio e estabilidade oxidativa,o óleo da presente invenção pode ser utilizado também como lubrificante eaditivo de combustível diesel. Consultar, por exemplo, as patentes U.S. Nos.5 888 947, 5 454 842 e 4 557 734.

O uso de grãos e óleos de soja da presente invenção é adequa-do também em uma variedade de alimentos de soja, feitos a partir de grãosinteiros de soja, como leite de soja, manteiga de grão de soja, natto e tem-peh, e alimentos de soja, feitos de soja processada e óleo de soja, incluindo,alimento de soja, farinha de soja, concentrado protéico de soja, isolados pro-téicos de soja, concentrado protéico com textura de soja, proteína de sojahidrolisada, nata, óleo de cozinha, óleo de sala, gordura e lecitina. Grãosinteiros de soja são comestíveis também, sendo tipicamente vendidos paraconsumidores crus, torrados ou sob a forma de edamamé. Leite de soja, tipi-camente produzido por imersão e trituração de grãos inteiros de soja, podeser consumido no estado, em pó ou processado para formar iogurte de soja,queijo de soja, tofu ou yuba. Esta soja ou óleo pode ser utilizado vantajosa-mente nestes e em outros alimentos de soja, graças à sua estabilidade oxi-dativa melhorada, a redução de precursores de sabores desagradáveis e oseu nível baixo de ácidos graxos saturados.G. Modulação ou supressão

Outra concretização da invenção é dirigida a um método de mo-dulação de níveis de supressão gênica. A modulação de supressão gênicapode resultar em mais ou menos supressão do gene. A supressão de umproduto gênico pode resultar da inserção de uma construção da presenteinvenção no genoma de uma planta. Da mesma forma, a modulação da su-pressão gênica pode resultar da inserção de uma construção da presenteinvenção no genoma de uma planta. Outros exemplos de métodos para mo-dular supressão gênica incluem, entre outros, técnicas antisense, co-supressão, RNA interferente (dsRNAi), animais transgênicos, híbridos e ri-bozimas empregando uma construção da presente invenção. Os exemplos aseguir são fornecidos a título de ilustração e não pretendem limitar a presen-te invenção.

A supressão de um gene pode ser modulada alterando-se a ex-tensão do DNA a ser transcrito e empregado para supressão, cuja seqüênciaé derivada do gene visado para supressão. Muitos métodos podem ser utili-zados para suprimir um gene, empregando mecanismos de silenciamento degene pós-transcricional. Sem limitar-se pela teoria, estes métodos suposta-mente possuem em comum a expressão de uma molécula de RNA que hi-bridiza para outra molécula de RNA. Surpreendentemente, pode ser vantajo-so empregar uma molécula de RNA de extensões especificadas para modu-lar ou moderar a supressão dos níveis de expressão, em estado de equilí-brio, de um gene endógeno visado.

A supressão gênica de FAD2-1 leva a níveis elevados de ácidooléico e redução de níveis de ácido linoléico. Quando FAD2-1 é fortementesuprimido, os níveis de ácido oléico podem ser maiores do que 65%, provo-cando redução dos níveis de ácido palmítico e ácido linolênico. Por exemplo,quando FAD2-1 é suprimido, os níveis de ácido oléico podem atingir 85%, eos níveis combinados de ácido palmítico e esteárico são reduzidos para a-proximadamente 10%. Da mesma forma, a regulação negativa de FATB re-sulta em níveis diminuídos de ácidos graxos saturados, primariamente, pal-mitato. Quando FAD2 e FATB são suprimidos de forma que os níveis de áci-do oléico sejam de 85%, os níveis de saturados são de aproximadamente10%. Quando FAD2 e FATB são suprimidos de forma que os níveis de ácidooléico sejam acima de 85%, os níveis de saturados podem decrescer paraabaixo de 10%.

Á luz da presente invenção, níveis de saturados podem ser re-duzidos para menos do que 10%, sem o aumento de ácido oléico para acimade 85%. Em uma concretização, a supressão de FAD2 é modulada pela re-dução da extensão do intron de FAD2-1, introduzido na planta. Menos su-pressão de FAD2 resulta em níveis moderados de ácido oléico, aproxima-damente 40-85%. A supressão de FAD2 é reduzida à medida que a exten-são do fragmento do intron do FAD2-1 é reduzida. Por exemplo, um intronde FAD2-1 cuja extensão tenha sido reduzida em, pelo menos, 100 nucleotí-deos contíguos pode reduzir a supressão de FAD2 e o aumento correspon-dente em níveis de ácido oléico e diminuição nos de ácido linoléico.

A relação entre a diminuição em supressão de gene endógeno eo aumento em extensão de DNA homólogo pode ser determinada empirica-mente pela introdução de extensões diferentes de DNA. Por exemplo, o nívelde redução em supressão a ser obtido por redução da extensão do DNAhomólogo introduzido pode ser determinado pela exclusão de partes cres-centes do DNA homólogo que está sendo introduzido, e análise de expres-são do gene visado.

A presente invenção inclui um método para moderação da su-pressão de FAD2, ao mesmo tempo ainda em que reduzindo acentuada-mente níveis de saturados em uma planta. Nestas plantas, os níveis de áci-do oléico podem variar de 40-80%. Da mesma forma, supressão inferior àtotal de FATB ocorre quando regiões 3' e 5' não traduzidas são introduzidas,em comparação a quando o gene completo FATB é introduzido em uma cé-lula hospedeira. De maneira semelhante, níveis de supressão de FATB sãoreduzidos quando a porção 5' da cadeia de leitura aberta que codifica a mai-or parte do peptídeo de trânsito cloroplástico é introduzida em uma célulahospedeira. Em células com FAD2 e FATB suprimidos, por métodos de a-cordo com a invenção, os níveis de ácido oléico podem ser de 40-85%, en-quanto que níveis de saturados podem ser entre 1 e 9 por cento.

Em uma concretização, a presente invenção é dirigida a um mé-todo de modulação de supressão gênica para reduzir a supressão em rela-ção à supressão de um elemento gênico completo, em que o elemento gêni-co completo pode ser um gene completo, um exon completo, um intron com-pleto, uma seqüência de sinalização completa ou uma UTR completa, econstruindo-se, em seguida, uma molécula de ácido nucléico recombinantecompreendendo um fragmento da seqüência endógena do elemento gênico;iniciando-se a expressão da molécula de ácido nucléico recombinante emuma célula hospedeira e suprimindo-se o gene endógeno com a molécula deácido nucléico recombinante. O gene a ser suprimido pode ser qualquer ge-ne, incluindo FAD2 e FATB. Em uma concretização, a presente invenção édirigida a um método de modulação da expressão de FAD2 ou FATB, com-preendendo: a expressão de uma seqüência parcial de elemento gênico deFAD2 ou FATB em uma célula hospedeira, em que o elemento gênico deFAD2 ou FATB é proveniente de um gene endógeno FAD2 ou FATB na cé-lula hospedeira, e a seqüência de um elemento gênico de FAD2 ou FATBpode ser um gene FAD2ou FATB, um exon de FAD2ou FATB, um intron deFAD2 ou FATB, uma região codificadora de peptídeo de trânsito de FAD2ouFATB ou uma UTR de FAD2 ou FATB; e a seqüência parcial do elementogênico de FAD2 ou FATB é menor do que a seqüência completa do elemen-to gênico de FAD2 ou FATB; e a supressão de FAD2 ou FATB endógenacom a seqüência parcial do elemento gênico de FAD2 ou FATBi em que osníveis de supressão do gene endógeno de FAD2 ou FATB na célula hospe-deira são menores do que níveis de supressão do gene endógeno de FAD2ou FATB em uma célula hospedeira com antecedente genético semelhante,e uma segunda seqüência de ácido nucléico de FAD2 ou FATB compreen-dendo a seqüência completa do elemento gênico de FAD2 ou FATB do ele-mento gênico de FAD2ou FATB.

Em outra concretização, a presente invenção é dirigida a um mé-todo para se alterar a composição do óleo de uma planta pela transformaçãode uma célula vegetal com uma molécula de ácido nucléico recombinanteque compreende uma seqüência de DNA que suprime a expressão endóge-na de FAD2, FATB ou FAD2 e FATB, em que a seqüência de DNA compre-ende uma seqüência de ácido nucléico de FAD2, FATB ou FAD2 e FATBmais curta do que a seqüência completa de um elemento gênico completo,selecionado entre gene, exon, intron, região codificadora de peptídeo detrânsito, 3' UTR, 5' UTR e uma cadeia de leitura aberta; e desenvolvimentode uma célula vegetal sob condições em que a transcrição da referida se-qüência de DNA é iniciada, pela qual a composição do óleo é alterada, emrelação a uma célula vegetal com antecedente genético semelhante, porémdesprovida da molécula de ácido nucléico recombinante. A extensão de umelemento gênico de FAD2 ou FATB pode ser encurtada em 50, 75, 100, 150,175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 800, 1000, 2000, 3000 ou 4000nucleotídeos. A extensão de um elemento gênico de FAD2 ou FATB podeser encurtada em 50, 75, 100, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500,550, 600, 800, ou 1000 nucleotídeos.

Em outra concretização, a presente invenção é dirigida a um mé-todo de aumento do teor de ácido oléico e redução do teor de ácido graxosaturado, em semente de uma planta, por: i) encurtamento da extensão deuma seqüência de DNA de FAD2 exógeno em uma célula hospedeira atéque o nível de supressão da expressão de FAD2 de uma planta transforma-da seja reduzida pelo menos parcialmente, em relação à supressão da ex-pressão de FAD2 em uma célula hospedeira com antecedente genético se-melhante e uma seqüência de DNA do gene FAD2 exógeno; e ii) desenvol-vimento de uma planta com uma molécula de ácido nucléico compreenden-do a seqüência encurtada de DNA de FAD2, em que a seqüência encurtadade DNA de FAD2 suprime pelo menos parcialmente a expressão endógenade FAD2; e iii) cultivo de uma planta que produz semente com teor reduzidode ácidos graxos saturados, em relação à semente de uma planta com ante-cedente genético semelhante, porém desprovida da seqüência encurtada deDNA de FAD2. A quantidade que a seqüência de DNA de FAD2 exógeno éencurtada para reduzir pelo menos parcialmente a supressão da FAD2 en-dógena pode ser determinada empiricamente pela introdução de extensõesdiferentes de DNA. Por exemplo, o nível de redução em supressão a ser ob-tido por redução da extensão do DNA homólogo introduzido pode ser deter-minado pela exclusão de partes crescentes do DNA homólogo que está sen-do introduzido, e análise de expressão do gene visado. O nível de supressãoda expressão de FAD2 pode ser obtido como uma média de três ou mais,seis ou mais, dez ou mais, quinze ou mais, ou vinte ou mais sementes deuma planta.

Em outra concretização, a presente invenção é dirigida a um mé-todo de produção de uma planta transformada com semente exibindo teorreduzido de ácidos graxos saturados pela transformação de uma célula ve-getal com uma molécula de ácido nucléico recombinante, compreendendouma seqüência de DNA que suprime a expressão endógena de FAD2 eFATB, em que a seqüência de DNA compreende uma seqüência de ácidonucléico de FAD2 mais curta do que toda a seqüência de um elemento gêni-co completo, selecionado entre gene, exon, intron, região codificadora depeptídeo de trânsito e UTR; e desenvolvimento da planta transformada, emque a planta transformada produz semente com teor reduzido de ácidos gra-xos, em relação à semente de uma planta com antecedente genético seme-lhante, porém desprovida da referida molécula de ácido nucléico recombi-nante.

Em outra concretização, a presente invenção é dirigida a um mé-todo de modulação da composição de ácidos graxos do óleo de uma semen-te de um grão oleaginoso de clima temperado, por isolamento de elementogênico contando com, pelo menos, 40 nucleotídeos em extensão que sejacapaz de suprimir a expressão de um gene endógeno na via da síntese deácidos graxos; geração de mais de um fragmento encurtado do elementogênico; introdução de cada um dos fragmentos encurtados em uma célulavegetal do grão de oleaginosa de clima temperado para produção de plantastransgênicas; e seleção de uma planta transgênica compreendendo umfragmento encurtado de extensão e seqüência determinadas que altere domodo desejado a composição de ácidos graxos no óleo da semente. Emuma concretização preferida, o método acima inclui também a construção deum DNA recombinante com, pelo menos, dois fragmentos encurtados dedois genes endógenos diferentes que efetuam as modificações diferentesdesejadas na composição de ácidos graxos do óleo da semente; introduçãoda construção do DNA recombinante em uma célula vegetal da cultura desemente oleaginosa de clima temperatura para produzir plantas transgêni-cas; e seleção de uma planta transgênica compreendendo, pelo menos, osdois fragmentos encurtados e uma composição de ácidos graxos no óleo deuma semente com mais de uma modificação desejada, efetuada por, pelomenos, os dois fragmentos encurtados.

Em outra concretização, a presente invenção é dirigida a umasemente de soja, exibindo composição de óleo com teor de ácidos graxossaturados fortemente reduzido e teor de ácido oléico moderadamente au-mentado, com uma seqüência de DNA que suprime a expressão endógenade FAD2 em uma célula hospedeira, em que a seqüência de DNA possuiuma seqüência de ácido nucléico de FAD2 mais curta do que a toda se-qüência de um elemento gênico completo, selecionado entre gene, exon,intron, região codificadora de peptídeo de trânsito e UTR.

Os exemplos seguintes são ilustrativos e não pretendem, demaneira alguma, serem restritivos.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patente, mencio-nados nesta exposição, são aqui incorporados por referência neste pedido,na mesma extensão em que seriam se cada publicação, patente ou pedidode patente tivesse sido específica e individualmente indicado para ser incor-porado por referência.Exemplos

Exemplo 1 - Isolamento de seqüências de FATB-2

Tecido de folha é obtido da variedade A3244 Asgrow de soja,triturado em nitrogênio líquido e armazenado a -80 2C até ser utilizado. Seisml de tampão de Extração SDS (650 ml de ddH20 estéril, 100 ml de Tris-Cl a1 M, pH 8, 100 ml de EDTA a 0,25 M, 50 ml de SDS a 20%, 100 ml de NaCIa 5 M, 4 μΙ de beta-mercaptoetanol) são adicionados a 2 ml de tecido de fo-lha congelado/triturado e a mistura é incubada a 65 0C por 45 minutos. Aamostra é agitada a cada 15 minutos. 2 ml de acetato de potássio a 5 M ge-lado são adicionados à amostra que é agitada e incubada, em seguida, por20 minutos. 3 ml de CHCI3 são adicionados à amostra que é agitada por 10minutos.

A amostra é centrifugada a 10.000 rpm por 20 minutos e o so-brenadante é coletado. 2 ml de isopropanol são adicionados ao sobrenadan-te e misturados. A amostra é centrifugada, em seguida, a 10.000 rpm por 20minutos e o sobrenadante é drenado. O pellet é ressuspendido em 200 μΙ deRNase e incubado a 65 0C por 20 minutos. 300 μΙ de acetato de amô-nia/isopropanol (1:7) são adicionados e misturados. A amostra é centrifuga-da, em seguida, a 10.000 rpm por 15 minutos e o sobrenadante é descarta-do. O pellet é lavado com 500 μΙ de etanol a 80% e deixado para secar peloar. O pellet de DNA genômico é ressuspendido, em seguida, em 200 μΙ deT10E1 (Tris a 10 mM:EDTA a 1 mM).

Uma seqüência contig de cDNA de FATB-2 de soja (SEQ ID NO:42) é utilizada para criar treze oligonucleotídeos que incluem o gene: F1SEQ ID NO: 48), F2 (SEQ ID NO: 49), F3 (SEQ ID NO: 50), F4 (SEQ ID NO:51), F5 (SEQ ID NO: 52), F6 (SEQ ID NO: 53), F7 (SEQ ID NO: 54), R1(SEQ ID NO: 55), R2 (SEQ ID NO: 56), R3 (SEQ ID NO: 57), R4 (SEQ IDNO: 58), R5 (SEQ ID NO: 59), e R6 (SEQ ID NO: 60). Os oligonucleotídeossão usados em pares para amplificação por PCR do DNA genômico de sojaisolado: par 1 (F1 + R1), par 2 (F2 + R1), par 3 (F3 + R2), par 4 (F4 + R3),par 5 (F5 + R4), par 6 (F6 + R5) e par 7 (F7 + R6). A amplificação por PCRdo par 5 é conduzida da forma como segue: 1 ciclo, 95 0C por 10 minutos;30 ciclos, 95 0C por 15 segundos, 43 0C por 30 segundos, 72 0C por 45 se-gundos, 1 ciclo, 72 0C por 7 minutos. Para todos os outros pares de oligo, asamplificações por PCR são conduzidas dá forma como segue: 1 ciclo, 95 0Cpor 10 minutos; 30 ciclos, 95 0C por 15 segundos, 48 0C por 30 segundos,72 0C por 45 segundos, 1 ciclo, 72 0C por 7 minutos. Fragmentos positivossão obtidos dos pares 1, 2, 4, 5, 6 e 7 de primers. Cada fragmento é clonadono vetor pCR2.1 (Invitrogen). Os fragmentos 2, 4, 5 e 6 são confirmados eseqüenciados. Estas quatro seqüências são alinhadas para formar uma se-qüência genômica para o gene FATB-2 (SEQ ID NO: 43).

Quatro introns são identificados no gene FATB-2 de soja porcomparação da seqüência genômica com a seqüência de cDNA: intron 1(SEQ ID NO: inclui da base 119 a base 1333 da seqüência genômica (SEQID NO: 43) e possui 1215 bp em extensão; intron Il (SEQ ID NO: 45) incluida base 2231 à base 2568 da seqüência genômica (SEQ ID NO: 43) e pos-sui 338 bp em extensão; intron Ill (SEQ ID NO: 46) inclui da base 2702 àbase 3342 da seqüência genômica (SEQ ID NO: 43) e possui 641 bp emextensão; intron IV (SEQ ID NO: 47) inclui da base 3457 à base 3823 da se-qüência genômica (SEQ ID NO: 43) e possui 367 bp em extensão.Exemplo 2 - Construções de supressão2A. - Construções de FAD2-1

O intron #1 do FAD2-1A (SEQ ID NO: 1) é clonado no cassetede expressão, pCGN3892, em orientações sense e antisense. O vetorpCGN3892 contém o promotor 7S de soja e rbcS 3' de ervilha. Ambas asfusões de genes são ligadas, em seguida, separadamente no pCGN9372,um vetor que contém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV. Asconstruções resultantes de expressão (pCGN5469 sense e pCGN5471 anti-sense) são utilizada para transformação de soja.

O intron do FAD2-1B (SEQ ID NO: 2) é fundido na extremidade3' do intron #1 do FAD2-1A no plasmídeo pCGN5468 (contém o promotor 7Sde soja, fundido ao intron de FAD2-1A (sense) e um rbcS 3' de ervilha) oupCGN5470 (contém o promotor 7S de soja fundido ao intron de FAD2-1A(antisense) e uma rbcS 3' de ervilha) em orientação sense e antisense, res-pectivamente. As fusões resultantes da combinação de introns são ligadas,em seguida, separadamente no pCGN9372, um vetor que contém o geneCP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV. As construções de expressãoresultantes (pCGN5485, intron sense de FAD2-1A e FAD2-1Be pCGN5486,intron antisense de FAD2-1A e FAD2-1B) são utilizadas para transformaçãode soja.

2B. - Construções de FAD3-1

Os introns #1, #2, #4 e #5 de FAD3-1A (SEQ ID NOs: 7, 8, 10 e11, respectivamente), e introns #3C (SEQ ID NO: 23), e #4 (SEQ ID NO: 24)do FAD3-1A, são todos ligados separadamente no pCGN3892, em orienta-ção sense ou antisense. O pCGN3892 contém o promotor 7S de soja e rbcS3' de ervilha. Estas fusões são ligadas no pCGN9372, um vetor que contémo gene CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV, para transformação emsoja. As construções de expressão resultantes (pCGN5455, intron #4 sensede FAD3-1A, pCGN5459, intron #4 antisense de FAD3-1A] pCGN5456, in-tron #5 sense de FAD3\ pCGN5460, intron #5 antisense de FAD3-1A]pCGN5466, intron #2 antisense de FAD3-1A, pCGN5473, intron #1 antisen-se de FAD3-1A) são utilizadas para transformação de soja.

2C. - Construções de FATB

A seqüência do intron Il de FATB-I de soja (SEQ ID NO: 30) éamplificada por PCR, empregando um clone genômico parcial de FATB-1como modelo. A amplificação por PCR é conduzida da forma como segue: 1ciclo, 95 0C por 10 min; 25 ciclos, 95 0C por 30 segundos, 62 0C por 30 se-gundos, 72 0C por 30 segundos; 1 ciclo, 72 0C por 7 min. A amplificação porPCR resulta em um produto com comprimento de 854 bp, incluindo sítios derestrição reconstruídos, em ambas as extremidades. O produto da PCR éclonado diretamente no cassete de expressão pCGN3892 em orientaçãosense, por meio de sítios de Xho\, construídos nas extremidades 5' dos pri-mers PCR, para formar o pMON70674. O vetor pCGN3892 contém o promo-tor 7S de soja e rbcS 3' de ervilha. O pMON7Q674 é cortado, em seguida,com NotI e ligado no pMON41164, um vetor que contém o gene CP4EPSPS, regulado pelo promotor FMV. A construção resultante de expressãogênica, pMON70678, é utilizada para transformação de soja, empregandométodos com Agrobacterium.

Duas outras construções de expressão, contendo a seqüênciado intron Il de FATB-1 de soja (SEQ ID NO: 30) são criadas. O pMON70674é cortado com NotI e ligado no pMON70675 que contém o gene CP4EPSPS, regulado pelo promotor FMV, e o gene KAS IV, regulado pelo promo-tor napina, resultando em pMON70680. O vetor de expressão pMON70680 écortado, em seguida, com SnaBI e ligado com um gene de fusão do genedelta-9 dessaturase de jojoba (SEQ ID NO: 41) em orientação sense, regu-lado pelo promotor 7S. As construções de expressão pMON70680 epMON70681 são utilizadas para transformação de soja, empregando méto-dos com Agrobacterium.

2D - Construções combinadas

São produzidas construções de expressão, contendo váriaspermutações de um primeiro conjunto de seqüências de DNA. O primeiroconjunto de seqüências de DNA inclui qualquer uma das seqüências descri-tas ou ilustradas nas FIGS. 5 e 6, ou qualquer outro conjunto de seqüênciasde DNA que contenha várias combinações de regiões não codificadoras oucodificadoras, sense, antisense ou sense e antisense de FAD2, FAD3 eFATB, de forma que sejam capazes de formar construções de dsRNA, cons-truções de co-supressão sense, construções antisense ou várias combina-ções das precedentes.

As Figuras 5(a)-(c) retratam vários primeiros conjuntos de se-qüências de DNA, capazes de expressar construções de co-supressão sen-se ou construções antisense, de acordo com a presente invenção, cujas se-qüências não codificadoras estão descritas nas Tabelas 1 e 2 abaixo. Asseqüências não codificadoras podem ser seqüências únicas, combinaçõesde seqüências (por exemplo, a 5'UTR ligada à 3'UTR), ou qualquer combi-nação das precedentes. Para expressar uma construção de co-supressãosense, todas as seqüências não codificadoras são seqüências sense, e paraexpressar construção antisense, todas as seqüências não codificadoras sãoseqüências antisense. A FIG. 5(d) retrata um primeiro conjunto de seqüên-cias de DNA1 capaz de expressar construções sense e antisense, de acordocom a presente invenção.

As Figuras 6(a)-(c) retratam vários primeiros conjuntos de se-qüências de DNA1 capazes de expressar construções de dsRNA, de acordocom a presente invenção, cujas seqüências não codificadoras estão descri-tas nas Tabelas 1 e 2 abaixo. O primeiro conjunto de seqüências de DNA,retratado na FIG. 6, compreende pares de seqüências sense e antisenserelacionadas, arranjadas de maneira que, por exemplo, o RNA expressadopela primeira seqüência sense é capaz de formar um RNA de fita dupla como RNA antisense expressado pela primeira seqüência antisense. Por exem-plo, em referência à FIG. 6(a) e combinação ilustrativa N5 1 (da Tabela 1), oprimeiro conjunto de seqüências de DNA compreende uma seqüência sensede FAD2-1, uma seqüência sense de FAD3-1, uma seqüência antisense deFAD2-1 e uma seqüência antisense de FAD3-1. As duas seqüências anti-sense correspondem às seqüências sense, de forma que os produtos daexpressão do primeiro conjunto de seqüências de DNA são capazes de for-mar entre si um RNA de fita dupla. As seqüências sense podem ser separa-das das seqüências antisense por uma seqüência espaçadora, de preferên-cia uma que promova a formação de uma molécula de dsRNA. Exemplosdestas seqüências espaçadoras incluem aquelas expostas em Wesley et ai.,supra e Hamilton et ai, PiantJ., 75:737-746 (1988). O promotor é qualquerum funcional em uma planta ou qualquer promotor de planta. Exemplos nãorestritivos de promotores adequados são descritos na Parte D da DescriçãoDetalhada.

O primeiro conjunto de seqüências de DNA é inserido em umaconstrução de expressão, em orientação sense ou antisense, empregandouma variedade de técnicas de manipulação de DNA. Se sítios de restriçãoconvenientes estiverem presentes nas seqüências de DNA, eles são inseri-dos na construção de expressão por digestão com as endonucleases de res-trição e ligação na construção que foi digerida, em um ou mais dos sítios declonagem disponíveis. Se não houver sítios convenientes de restrição dispo-níveis nas seqüências de DNA1 o DNA da construção ou das seqüências deDNA é modificado, em uma variedade de maneiras, para facilitar a clonagemdas seqüências de DNA na construção. Exemplos de métodos para modifi-car o DNA incluem por PCR1 Iigador sintético ou ligação com adaptador, mu-fagênese in vitro sítio-dirigida, substituição ou recorte de extremidades 5' ou3' em ressalto e assemelhados. Estes e outros métodos de manipulação deDNA são bem conhecidos de qualquer técnico no assunto.

O pMON97552 contém um promotor 7Sa' de soja ligado opera-cionalmente a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), o qual é re-duzido em 140 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 3', ligado ope-racionalmente a 42 nucleotídeos contíguos de uma 5' UTR de FATB-1, se-guido por uma região codificadora de CTP de FATB-1 a, ligada operacional-mente a 70 nucleotídeos do intron 4 do FAD3-1 A, ligada operacionalmente auma região codificadora de CTP de FATB-1 A, em orientação antisense, se-guido por 42 nucleotídeos contíguos de uma 5' UTR de FATB-1 A, em orien-tação antisense, seguido por um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO:1), reduzido em 140 nucleotídeos contíguos, desde a extremidade 3' e emorientação antisense, ligado operacionalmente a um segmento de poliadeni-lação H6 3' com um gene CP4 EPSPS, ligado operacionalmente a um pro-motor EFMV e seqüência de terminação 3' de ervilha Rubisco E9, todos es-tes flanqueados por uma RB (borda direita) e uma LB (borda esquerda). Aconstrução resultante de expressão gênica é utilizada para transformação,empregados métodos conforme descritos nesta exposição.O pMON93758 contém um promotor 7Sa' de soja ligado opera-cionalmente a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em160 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 5' e ligado a uma 3' UTRde FATB-1 a, seguido por uma 5' UTR de FATB-1 a, ligada operacionalmentea 70 nucleotídeos do intron 4 de FAD3-1A, ligado operacionalmente a um 5'UTR de FATB-1 em orientação antisense, seguido por uma 3' UTR deFATB-1 A, em orientação antisense, seguido por um intron 1 de FAD2-1A desoja (SEQ ID NO: 1), reduzido em 160 nucleotídeos contíguos desde a ex-tremidade 5' e em orientação antisense, ligado operacionalmente a um seg-mento de poliadenilação H6 3' com um gene CP4 EPSPS, ligado operacio-nalmente a um promotor EFMV e seqüência de terminação 3' da ervilha Ru-bisco E9, todos flanqueados por RB e LB na mesma molécula de DNA. Aconstrução resultante de expressão gênica é utilizada para transformaçãoempregando os métodos descritos nesta exposição.

O pMON97553 contém um promotor 7Sa' de soja ligado opera-cionalmente a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), o qual é re-duzido em 200 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 3', ligado ope-racionalmente a 42 nucleotídeos contíguos de uma 5' UTR de FATB-1, se-guido por uma região codificadora de CTP de FATB-1 a, ligada operacional-mente a 70 nucleotídeos do intron 4 do FAD3-1A, ligada operacionalmente auma região codificadora de CTP de FATB-1 A, em orientação antisense, se-guido por 42 nucleotídeos contíguos de uma 5' UTR de FATB-1 A, em orien-tação antisense, seguido por um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO:1), reduzido em 200 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 3' e emorientação antisense, ligado operacionalmente a um segmento de poliadeni-lação H6 3' com um gene CP4 EPSPS, ligado operacionalmente a um pro-motor EFMV e seqüência de terminação 3' da ervilha Rubisco E9, todosflanqueados por RB e LB na mesma molécula de DNA. A construção resul-tante de expressão gênica é utilizada para transformação empregando osmétodos descritos nesta exposição.

O pMON93770 contém um promotor 7Scc' de soja ligado opera-cionalmente a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em240 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 3' e ligado a uma 3' UTRde FATB-1a, seguido por uma 5' UTR de FATB-1 a, ligada operacionalmentea 70 nucleotídeos desde o intron 4 de FAD3-1A, ligado operacionalmente aum 5' UTR de FATB-1 a, em orientação antisense, seguido por uma 3' UTRde FATB-la, em orientação antisense, seguido por um intron 1 de FAD2-1Ade soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em 240 nucleotídeos contíguos desde aextremidade 3' e em orientação antisense, ligado operacionalmente a umsegmento de poliadenilação H6 3' com um gene CP4 EPSPS, ligado opera-cionalmente a um promotor EFMV e seqüência de terminação 3' da ervilhaRubisco E9, todos flanqueados por RB e LB na mesma molécula de DNA. Aconstrução resultante de expressão gênica é utilizada para transformaçãoempregando os métodos descritos nesta exposição.

O pMON93759 contém um promotor 7Sa' de soja ligado opera-cionalmente ã um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em240 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 5' e ligado a uma 3' UTRde FATB-1a, seguido por uma 5' UTR de FATB-1a, ligada operacionalmentea 70 nucleotídeos desde o intron 4 de FAD3-1A, ligado operacionalmente aum 5' UTR de FATB-Ia, em orientação antisense, seguido por uma 3' UTRde FATB-1A, em orientação antisense, seguido por um intron 1 de FAD2-1Ade soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em 240 nucleotídeos contíguos desde aextremidade 5' e em orientação antisense, ligado operacionalmente a umsegmento de poliadenilação H6 3' com um gene CP4 EPSPS, ligado opera-cionalmente a um promotor EFMV e seqüência de terminação 3' da ervilhaRubisco E9, todos flanqueados por RB e LB na mesma molécula de DNA. Aconstrução resultante de expressão gênica é utilizada para transformaçãoempregando os métodos descritos nesta exposição.

O pMON97554 contém um promotor 7Sa' de soja ligado opera-cionalmente a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), o qual é re-duzido em 260 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 3', ligado ope-racionalmente a 42 nucleotídeos contíguos de uma 5' UTR de FATB- 1a,^se-guido por uma região codificadora de CTP de FATB-la, ligada operacional-mente a 70 nucleotídeos desde o intron 4 de FAD3-1A, ligada operacional-mente a uma região codificadora de CTP de FATB-1A, em orientação anti-sense, seguido por 42 nucleotídeos contíguos de uma 5' UTR de FATB-la,em orientação antisense, seguido por um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQID NO: 1), reduzido em 260 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 3'e em orientação antisense, ligado operacionalmente a um segmento de poli-adenilação H6 3' com um gene CP4 EPSPS, ligado operacionalmente a umpromotor EFMV e seqüência de terminação 3' da ervilha Rubisco E9, todosflanqueados por RB e LB na mesma molécula de DNA. A construção resul-tante de expressão gênica é utilizada para transformação empregando osmétodos descritos nesta exposição.

O pMON93771 contém um promotor 7Sa' de soja ligado opera-cionalmente a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em300 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 3' e ligado a uma 3' UTRde FATB-1 a, seguido por uma 5' UTR de FATB-1a, ligada operacionalmentea 70 nucleotídeos desde o intron 4 de FAD3-1A, ligado operacionalmente aum 5' UTR de FATB-1 a, em orientação antisense, seguido por uma 3' UTRde FATB-1 a, em orientação antisense, seguido por um intron 1 de FAD2-1Ade soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em 300 nucleotídeos contíguos desde aextremidade 3' e em orientação antisense, ligado operacionalmente a umsegmento de poliadenilação H6 3' com um gene CP4 EPSPS, ligado opera-cionalmente a um promotor EFMV e seqüência de terminação 3' da ervilhaRubisco E9, todos flanqueados por RB e LB na mesma molécula de DNA. Aconstrução resultante de expressão gênica é utilizada para transformaçãoempregando os métodos descritos nesta exposição.

O pMON97555 contém um promotor 7Soc' de soja ligado opera-cionalmente a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), o qual é re-duzido em 320 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 3', ligado ope-racionalmente a 42 nucleotídeos contíguos de uma 5' UTR de FATB-1 a, se-guido por uma região codificadora de CTP de FATB-1 a, ligada operacional-mente a 70 nucleotídeos desde o intron 4 de FAD3-1A, ligada operacional-mente a uma região codificadora de CTP de FATB-1 A, em orientação anti-sense, seguido por 42 nucleotídeos contíguos de uma 5' UTR de FATB-1 a,em orientação antisense, seguido por um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQID NO: 1), reduzido em 320 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 3'e em orientação antisense, ligado operacionalmente a um segmento de poli-adenilação H6 3' com um gene CP4 EPSPS, ligado operacionalmente a umpromotor EFMV e seqüência de terminação 3' da ervilha Rubisco E9, todosflanqueados por RB e LB na mesma molécula de DNA. A construção resul-tante de expressão gênica é utilizada para transformação empregando osmétodos descritos nesta exposição.O ρΜΟΝ937ΘΟ contém um promotor 7Sa' de soja ligado opera-cionalmente a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em320 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 5' e ligado a uma 3' UTRde FATB-1a, seguido por uma 5' UTR de FATB-la, ligada operacionalmentea 70 nucleotídeos desde o intron 4 de FAD3-1A, ligado operacionalmente aum 5' UTR de FATB-la, em orientação antisense, seguido por uma 3' UTRde FATB-1A, em orientação antisense, seguido por um intron 1 de FAD2-1Ade soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em 320 nucleotídeos contíguos desde aextremidade 5' e em orientação antisense, ligado operacionalmente a umsegmento de poliadenilação H6 3' com um gene CP4 EPSPS, ligado opera-cionalmente a um promotor EFMV e seqüência de terminação 3' da ervilhaRubisco E9, todos flanqueados por RB e LB na mesma molécula de DNA. Aconstrução resultante de expressão gênica é utilizada para transformaçãoempregando os métodos descritos nesta exposição.

O pMON93772 contém um promotor 7Sa' de soja ligado opera-cionalmente a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em360 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 3' e ligado a uma 3' UTRde FATB-la, seguido por uma 5' UTR de FATB-la, ligada operacionalmentea 70 nucleotídeos desde o intron 4 de FAD3-1 A, ligado operacionalmente aum 5' UTR de FATB-la, em orientação antisense, seguido por uma 3' UTRde FATB-la, em orientação antisense, seguido por um intron 1 de FAD2-1Ade soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em 360 nucleotídeos contíguos desde aextremidade 3' e em orientação antisense, ligado operacionalmente a umsegmento de poliadenilação H6 3' com um gene CP4 EPSPS, ligado opera-cionalmente a um promotor EFMV e seqüência de terminação 3' da ervilhaRubisco E9, todos flanqueados por RB e LB na mesma molécula de DNA. Aconstrução resultante de expressão gênica é utilizada para transformaçãoempregando os métodos descritos nesta exposição.

O pMON97556 contém um promotor 7Sa' de soja ligado opera-cionalmente a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), o qual é re-duzido em 380 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 3', ligado ope-racionalmente a 42 nucleotídeos contíguos de uma 5' UTR de FATB-la, se-guido por uma região codificadora de CTP de FATB-1a, ligada operacional-mente a 70 nucleotídeos desde o intron 4 de FAD3-1A, ligada operacional-mente a uma região codificadora de CTP de FATB-1A, em orientação anti-sense, seguido por 42 nucleotídeos contíguos de uma 5' UTR de FATB-Ia1em orientação antisense, seguido por um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQID NO: 1), reduzido em 380 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 3'e em orientação antisense, ligado operacionalmente a um segmento de poli-adenilação H6 3' com um gene CP4 EPSPS, ligado operacionalmente a umpromotor EFMV e seqüência de terminação 3' da ervilha Rubisco E9, todosflanqueados por RB e LB na mesma molécula de DNA. A construção resul-tante de expressão gênica é utilizada para transformação empregando osmétodos descritos nesta exposição.

O pMON93764 contém um promotor 7Sa' de soja ligado opera-cionalmente a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em400 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 3' e ligado a uma regiãocodificadora de CTP de FATB-Ia, seguido por uma região codificadora deCTP de FATB-2a, ligada operacionalmente a 70 nucleotídeos desde o intron4 de FAD3-1A, ligado operacionalmente a uma região codificadora de CTPde FATB-2a, em orientação antisense, seguido por uma região codificadorade CTP de FATB-1a, em orientação antisense, seguido por um intron 1 deFAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em 400 nucleotídeos contíguosdesde a extremidade 3' e em orientação antisense, ligado operacionalmentea uma região codificadora de CTP de FATB-2a em orientação antisense,seguido por 42 nucleotídeos contíguos de uma 5' UTR de FATB-2a 5', emH6 3' com um gene CP4 EPSPS, ligado operacionalmente a um pro-motor EFMV e uma seqüência de terminação 3' de ervilha Rubisco E9, todosflanqueados por RB e LB na mesma molécula de DNA. A construção resul-tante de expressão gênica é utilizada para transformação empregando osmétodos descritos nesta exposição.<table>table see original document page 83</column></row><table><table>table see original document page 84</column></row><table><table>table see original document page 85</column></row><table><table>table see original document page 86</column></row><table><table>table see original document page 87</column></row><table>Exemplo 3 - Construções combinadas

Nas Figuras 7-15, os promotores são indicados por setas, se-qüências de codificação (codificadoras e não codificadoras), por pentágonosque apontam na direção da transcrição, seqüências sense são identificadasem texto normal e seqüências antisense, em texto invertido. As abreviaçõesutilizadas nestas Figuras incluem: 7Sa = promotor 7Sa; 7Sa' = promotor7Sa'; Br napina = promotor napina de Brassica; FMV = promotor FMV; ARC= promotor arcelina; RBC E9 3' = sinal de terminação de Rubisco E9; Nos 3'= sinal nos de terminação; TML 3' = sinal tml de terminação; napina 3' = si-nal de terminação napina; '3 (na mesma caixa que FAD ou FAT) = 3' UTR; 5'(na mesma caixa que FAD ou FAT) = 5'UTR; Cr = Cuphea puicherrima-, Gm= Glicina máx; Rc = Ricinus communis; FAB2 = alelo de FAB2 de um genedelta 9 estearoil-dessaturase; e Intr ou Int = intron.

3A. Construções de dsRNA

As Figuras 7-9 retratam moléculas de ácido nucléico da presenteinvenção, nas quais os primeiros conjuntos de seqüências de DNA são ca-pazes de expressar construções de dsRNA. O primeiro conjunto de seqüên-cias de DNA, retratado nas FIGS. 7-9, compreende pares de seqüênciassense e antisense relacionadas, arranjadas de maneira que, por exemplo, oRNA expressado pela primeira seqüência sense é capaz de formar um RNAde fita dupla com o RNA antisense expressado pela primeira seqüência anti-sense. As seqüências sense podem ser adjacentes às seqüências antisenseou separadas destas por uma seqüência espaçadora, conforme apresentadona FIG. 9.

O segundo conjunto de seqüências de DNA compreende se-qüências codificadoras, cada uma das quais uma seqüência de DNA quecodifica uma seqüência que, quando expressa, é capaz de aumentar a pro-teína ou transcrito, ou ambos, codificados por um gene selecionado do grupoconstituído por KAS I, KAS IV, delta-9 dessaturase e CP4 EPSPS. Cada se-qüência codificadora é associada a um promotor, o qual pode ser qualquerpromotor funcional em uma planta ou qualquer promotor de planta, podendoser um promotor FMV, um promotor napina, um promotor 7S (7Sα ou 7Sα'),um promotor arcelina, um promotor delta-9 dessaturase ou um promotor deFAD2-1A.

Em referência agora à FIG. 7, as seqüências do intron 1 deFAD2-1 (SEQ ID NO: 1 ou 2), 3' UTR de FAD3-1A (SEQ ID NO: 16) e da 3'UTR de FATB-jI de soja (SEQ ID NO: 36) são amplificadas por PCR paraque resultem produtos que incluam sítios de restrição reconstruídos em am-bas as extremidades. Os produtos da PCR são clonados diretamente, emorientações sense e antisense, separados por um intron 5 spliceable deFAD3-1A de soja (SEQ ID NO: 11), em um vetor contendo o promotor 7Soc'de soja e seqüência de terminação tml 3', por intermédio dos sítios de Xho\,construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. O vetor é cortado, emseguida, com NotI e ligados no pMON41164, um vetor que contém o geneCP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüência de terminação3' da ervilha Rubisco E9. Vetores contendo um gene KAS IV de C. pulcher-rima (SEQ ID NO: 39), regulado por promotor napina de Brassica e uma se-qüência de terminação 3' de Brassica, e um gene delta-9 dessaturase(FAB2) de R. communis (SEQ ID NO: 40), regulado por um promotor deFAD2 de soja e uma seqüência de terminação 3' nos, são cortados com en-zimas apropriadas de restrição e ligados no pMON41164. A construção re-sultante de expressão gênica, pMON68539, é retratada na FIG. 7 e utilizadapara transformação, empregando os métodos conforme descritos nesta ex-posição.

As seqüências do intron 1 de FAD2-1 (SEQ ID NO: 1 ou 2), in-tron 4 de FAD3-1A (SEQ ID NO: 10) e do intron Il de FATB-1 de soja (SEQID NO: 30) são amplificadas por PCR para que resultem produtos que inclu-am sítios de restrição reconstruídos em ambas as extremidades. Os produ-tos da PCR são clonados diretamente, em orientações sense e antisense,separados por um intron 5 spliceable de FAD3-1A de soja (SEQ ID NO: 11),em um vetor contendo o promotor 7Sa' de soja e seqüência de terminaçãotml 3', por intermédio dos sítios de Xho\, construídos nas extremidades 5'dos primers PCR. O vetor é cortado, em seguida, com Notí e ligados nopMON41164, um vetor que contém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo pro-motor FMV e uma seqüência de terminação 3' da ervilha Rubisco E9. Aconstrução resultante de expressão gênica, pMON68540, é retratada naFlG. 7 e utilizada para transformação, empregando os métodos conformedescritos nesta exposição.

As seqüências do intron 1 de FAD2-1 (SEQ ID NO: 1 ou 2), in-tron 4 de FAD3-1A (SEQ ID NO: 10) e do intron Il de FATB-1 de soja (SEQID NO: 30) são amplificadas por PCR para que resultem produtos que inclu-am sítios de restrição reconstruídos em ambas as extremidades. Os produ-tos da PCR são clonados diretamente, em orientações sense e antisense,separados por um intron 5 spliceable de FAD3-1A de soja (SEQ ID NO: 11),em um vetor contendo o promotor 7Soc' de soja e seqüência de terminaçãotml 3', por intermédio dos sítios de Xho\, construídos nas extremidades 5'dos primers PCR. O vetor é cortado, em seguida, com NotI e ligados nopMON41164, um vetor que contém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo pro-motor FMV e uma seqüência de terminação 3' da ervilha Rubisco E9. Umvetor contendo um gene KAS IV de C. pulcherrima (SEQ ID NO: 39), regula-do por um promotor napina de Brassica e uma seqüência de terminação 3'napina de Brassica, é cortado com enzimas apropriadas de restrição e ligadono pMON41164. A construção resultante de expressão gênica, pMON68544,é retratada na FIG. 7 e utilizada para transformação, empregando os méto-dos conforme descritos nesta exposição.

As seqüências do intron 1 de FAD2-1 (SEQ ID NO: 1 ou 2), in-tron 4 de FAD3-1A (SEQ ID NO: 10), intron Il de FATB-1 (SEQ ID NO: 30), edo intron 4 de FAD3-1B de soja (SEQ ID NO: 24) são amplificadas por PCRpara que resultem produtos que incluam sítios de restrição reconstruídos emambas as extremidades. Os produtos da PCR são clonados diretamente, emorientações sense e antisense, separados por um intron 5 spliceable deFAD3-1A de soja (SEQ ID NO: 11), em um vetor contendo o promotor 7Sa'de soja e seqüência de terminação tml 3', por intermédio dos sítios de Xho\,construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. O vetor é cortado, emseguida, com Noft e ligados no pMON41164, um vetor que contém o geneCP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüência de terminação3' da ervilha Rubisco E9. A construção resultante de expressão gênica,pMON68546, é retratada na FIG. 7 e utilizada para transformação, empre-gando os métodos conforme descritos nesta exposição.

Em referência agora à FIG.7, as seqüências do intron 1 deFAD2-1 (SEQ ID NO: 1 ou 2), 3' UTR de FAD3-1A (SEQ ID NO: 16) e da 3'UTR de FATB-1 de soja (SEQ ID NO: 36) são amplificadas por PCR paraque resultem produtos que incluam sítios de restrição reconstruídos em am-bas as extremidades. Os produtos da PCR são clonados diretamente, emorientações sense e antisense, separados por um intron 5 spliceable deFAD3-1A de soja (SEQ ID NO: 11), em um vetor contendo o promotor 7Soc'de soja e seqüência de terminação tml 3', por intermédio dos sítios de Xho\,construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. O vetor é cortado, emseguida, com Λ/ofl e ligados no pMON41164, um vetor que contém o geneCP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüência de terminação3' da ervilha Rubisco E9. A construção resultante de expressão gênica,pMON68536, é retratada na FIG. 8 e utilizada para transformação, empre-gando os métodos conforme descritos nesta exposição.

As seqüências do intron 1 de FAD2-1 (SEQ ID NO: 1 ou 2), 3'UTR de FAD3-1A (SEQ ID NO: 16) e da 3' UTR de FATB-1 de soja (SEQ IDNO: 36) são amplificadas por PCR para que resultem produtos que incluamsítios de restrição reconstruídos em ambas as extremidades. Os produtos daPCR são clonados diretamente, em orientações sense e antisense, separa-dos por um intron 5 spliceable de FAD3-1A de soja (SEQ ID NO: 11), em umvetor contendo o promotor 7Sa' de soja e seqüência de terminação tml 3',por intermédio dos sítios de Xho\, construídos nas extremidades 5' dos pri-mers PCR. Um vetor contendo um gene delta-9 dessaturase (FAB2) de R.communis (SEQ ID NO: 40), regulado por um promotor de FAD2 de soja euma seqüência de terminação 3' nos, são cortados com enzimas apropria-das de restrição e ligados imediatamente depois, em sentido ascendente, daseqüência de terminação 3' tml. O vetor é cortado, em seguida, com NotI eligados no pMON41164, um vetor que contém o gene CP4 EPSPS, reguladopelo promotor FMV e uma seqüência de terminação 3' da ervilha RubiscoΕ9. A construção resultante de expressão gênica, pMON68537, é retratadana FIG. 8 e utilizada para transformação, empregando os métodos conformedescritos nesta exposição.

As seqüências do intron 1 de FAD2-1 (SEQ ID NO: 1 ou 2), 3'UTR de FAD3-1A (SEQ ID NO: 16) e da 3' UTR de FATB-1 de soja (SEQ IDNO: 36) são amplificadas por PCR para que resultem produtos que incluamsítios de restrição reconstruídos em ambas as extremidades. Os produtos daPCR são clonados diretamente, em orientações sense e antisense, separa-dos por um intron 5 spliceable de FAD3-1A de soja (SEQ ID NO: 11), em umvetor contendo o promotor 7Sa' de soja e seqüência de terminação tml 3',por intermédio dos sítios de Xho\, construídos nas extremidades 5' dos pri-mers PCR. O vetor é cortado, em seguida, com NotI e ligados nopMON41164, um vetor que contém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo pro-motor FMV e uma seqüência de terminação 3' da ervilha Rubisco E9. Umvetor contendo um gene KAS IV de C. pulcherrima (SEQ ID NO: 39), regula-do por promotor napina de Brassica e seqüência de terminação 3' napina deBrassica, é cortado com enzimas apropriadas de restrição e ligado nopMON41164. A construção resultante de expressão gênica, pMON68538, éretratada na FIG. 8 e utilizada para transformação, empregando os métodosconforme descritos nesta exposição.

Em referência agora à FIG.7, as seqüências da 3' UTR deFAD2-1 (SEQ ID NO: 5), 3' UTR àe FATB-1 (SEQ ID NO: 36), 3' UTR deFAD3-1A (SEQ ID NO: 16), e da 3' UTR de FAD3-1B de soja (SEQ ID NO:26) são amplificadas por PCR para que resultem produtos que incluam sítiosde restrição reconstruídos em ambas as extremidades. Os produtos da PCRsão clonados diretamente, em orientações sense e antisense, separados porum intron 5 spliceable de FAD3-1A de soja (SEQ ID NO: 11), em um vetorcontendo o promotor 7Sa' de soja e seqüência de terminação tml 3', por in-termédio dos sítios de Xho\, construídos nas extremidades 5' dos primersPCR. O vetor é cortado, em seguida, com NotI e ligados no pMON41164, umvetor que contém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e umaseqüência de terminação 3' da ervilha Rubisco E9. A construção resultantede expressão gênica, pMON80622, é retratada na FIG. 9 e utilizada paratransformação, empregando os métodos conforme descritos nesta exposi-ção.

As seqüências da 3' UTR de FAD2-1 (SEQ ID NO: 5), 3' UTR deFATB-1 (SEQ ID NO: 36) e da 3' UTR àe FAD3-1A de soja (SEQ ID NO: 16)são amplificadas por PCR para que resultem produtos que incluam sítios derestrição reconstruídos em ambas as extremidades. Os produtos da PCRsão clonados diretamente, em orientações sense e antisense, separados porum intron 5 spliceable de FAD3-1A de soja (SEQ ID NO: 11), em um vetorcontendo o promotor 7Sa' de soja e seqüência de terminação tml 3\ por in-termédio dos sítios de Xho\, construídos nas extremidades 5' dos primersPCR. O vetor é cortado, em seguida, com NotI e ligados no pMON41164, umvetor que contém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e umaseqüência de terminação 3' da ervilha Rubisco E9. A construção resultantede expressão gênica, pMON80623, é retratada na FIG. 9 e utilizada paratransformação, empregando os métodos conforme descritos nesta exposi-ção.

As seqüências da 5' UTR-3' UTR de FAD2-1 (SEQ ID NO: 6 e 5,unidas), 5'UTR-3'UTR de FAJB-I (SEQ ID NOs: 37 e 36, unidas), 3' UTR deFAD3-1A (SEQ ID NO: 16) e da 5' UTR-3' UTR do FAD3-1B de soja (SEQ IDNO: 27 e 26, unidas) são amplificadas por PCR para que resultem produtosque incluam sítios de restrição reconstruídos em ambas as extremidades. Osprodutos da PCR são clonados diretamente, em orientações sense e anti-sense, em um vetor contendo o promotor 7Sa' de soja e seqüência de ter-minação tml 3', por intermédio dos sítios de Xho\, construídos nas extremi-dades 5' dos primers PCR. O vetor é cortado, em seguida, com NoÜ e liga-dos no pMON41164, um vetor que contém o gene CP4 EPSPS, reguladopelo promotor FMV e uma seqüência de terminação 3' da ervilha RubiscoE9. A construção resultante de expressão gênica, 05, é retratada na FIG. 9 eutilizada para transformação, empregando os métodos conforme descritosnesta exposição.

As seqüências da 5' UTR-3' UTR de FAD2-1 (SEQ ID NO: 6 e 5,unidas), 5'UTR-3'UTR de FATB-1 (SEQ ID NOs: 37 e 36, unidas) e da 3'UTR de FAD3-1A de soja (SEQ ID NO: 16) são amplificadas por PCR paraque resultem produtos que incluam sítios de restrição reconstruídos em am-bas as extremidades. Os produtos da PCR são clonados diretamente, emorientações sense e antisense, em um vetor contendo o promotor 7Sa' desoja e seqüência de terminação tml 3', por intermédio dos sítios de Xho\,construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. O vetor é cortado, emseguida, com NotI e ligados no pMON41164, um vetor que contém o geneCP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüência de terminação3' da ervilha Rubisco E9. Um vetor contendo um gene KAS IV de C. pulcher-rima (SEQ ID NO: 39), regulado por um promotor napina de Brassica e umaseqüência de terminação 3' napina de Brassica, é cortado com enzimas a-propriadas de restrição e ligado no pMON41164. A construção de expressãogênica resultante, 06, é retratada na FIG. 9 e utilizada para transformação,empregando os métodos conforme descritos nesta exposição.

3B. - Construções de co-suoressão sense

As Figuras 10-13 e 19-20 retratam moléculas de ácido nucléicoda presente invenção, nas quais os primeiros conjuntos de seqüências deDNA são capazes de expressar construções de co-supressão sense. O se-gundo conjunto de seqüências de DNA compreende seqüências codificado-ras, cada uma destas, uma seqüência de DNA que codifica uma seqüênciaque, quando expressa, é capaz de aumentar a proteína ou transcrito, ouambos, codificados por um gene selecionado do grupo constituído por KASI,KAS IV, delta-9 dessaturase e CP4 EPSPS. Cada seqüência codificadora éassociada a um promotor, o qual pode ser qualquer promotor funcional emuma planta ou qualquer promotor de planta, podendo ser um promotor FMV,um promotor napina, um promotor 7S (7Sa ou 7Sa'), um promotor arcelina,um promotor delta-9 dessaturase ou um promotor de FAD2-1A.

Em referência agora à FIG. 10, as seqüências do intron 1 deFAD2-1 (SEQ ID NO: 1 ou 2), intron 4 de FAD3-1C (SEQ ID NO: 14), intronIl de FATB-1 (SEQ ID NO: 30), intron 4 de FAD3-1A (SEQ ID NO: 10) e dointron 4 de FAD3-1B de soja (SEQ ID NO: 24) são amplificadas por PCRpara que resultem produtos que incluam sítios de restrição reconstruídos emambas as extremidades. Os produtos da PCR são clonados diretamente, emorientação sense, em um vetor contendo o promotor 7Soc' de soja e seqüên-cia de terminação 3' de ervilha Rubisco E9, por intermédio dos sítios deXho\, construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. O vetor é cortado,em seguida, com Notí e ligados no pM0N41164, um vetor que contém o ge-ne CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüência de termina-ção 3' da ervilha Rubisco E9. A construção resultante de expressão gênica,pMON68522, é retratada na FIG. 10 e utilizada para transformação, empre-gando os métodos conforme descritos nesta exposição.

As seqüências do intron 1 de FAD2-1 (SEQ ID NO: 1 ou 2), in-tron 4 de FAD3-1A (SEQ ID NO: 10), intron 4 de FAD3-1B (SEQ ID NO: 24)e do intron Il de FATB-1 de soja (SEQ ID NO: 30) são amplificadas por PCRpara que resultem produtos que incluam sítios de restrição reconstruídos emambas as extremidades. Os produtos da PCR são clonados diretamente, emorientação sense, em um vetor contendo o promotor 7Sa' de soja e seqüên-cia de terminação tml 3', por intermédio dos sítios de Xho\, construídos nasextremidades 5' dos primers PCR. O vetor é cortado, em seguida, com /Vofle ligados no pMON41164, um vetor que contém o gene CP4 EPSPS, regu-lado pelo promotor FMV e uma seqüência de terminação 3' da ervilha Rubis-co E9. Vetores contendo um gene KAS IV de C. pulcherrima (SEQ ID NO:39), regulado por promotor napina de Brassica e uma seqüência de termina-ção 3' de Brassica, e um gene delta-9 dessaturase (FAB2) de fí. communis(SEQ ID NO: 40), regulado por um promotor de FAD2 de soja e uma se-qüência de terminação 3' nos, são cortados com enzimas apropriadas derestrição e ligados no pMON41164. A construção resultante de expressãogênica, pMON80614, é retratada na FIG. 10 e utilizada para transformação,empregando os métodos conforme descritos nesta exposição.

As seqüências do intron 1 de FAD2-1 (SEQ ID NO: 1 ou 2), 3'UTR de FAD3-1A (SEQ ID NO: 16) e da 3' UTR de FATB-1 de soja (SEQ IDNO: 36) são amplificadas por PCR para que resultem produtos que incluamsítios de restrição reconstruídos em ambas as extremidades. Os produtos daPCR são clonados diretamente, em orientação sense, em um vetor contendoo promotor 7Sa' de soja e seqüência de terminação tml 3', por intermédiodos sítios de Xho\, construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. O ve-tor é cortado, em seguida, com Not1 e ligados no pMON41164, um vetor quecontém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüênciade terminação 3' da ervilha Rubisco E9. A construção resultante de expres-são gênica, pMON68531, é retratada na FIG. 10 e utilizada para transforma-ção, empregando os métodos conforme descritos nesta exposição.

As seqüências do intron 1 de FAD2-1 (SEQ ID NO: 1 ou 2), 3'UTR de FAD3-1A (SEQ ID NO: 16) e da 3' UTR de FATB-1 de soja (SEQ IDNO: 36) são amplificadas por PCR para que resultem produtos que incluamsítios de restrição reconstruídos em ambas as extremidades. Os produtos daPCR são clonados diretamente, em orientação sense, em um vetor contendoo promotor 7Sa' de soja e seqüência de terminação tml 3', por intermédiodos sítios de Xho\, construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. O ve-tor é cortado, em seguida, com Not\ e ligados no pMON41164, um vetor quecontém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüênciade terminação 3' da ervilha Rubisco E9. Vetores contendo um gene KAS IVde C. pulcherrima (SEQ ID NO: 39), regulado por promotor napina de Bras-sica e uma seqüência de terminação 3' de Brassica, e um gene delta-9 des-saturase (FAB2) de R. communis (SEQ ID NO: 40), regulado por um promo-tor de FAD2 de soja e uma seqüência de terminação 3' nos, são cortadoscom enzimas apropriadas de restrição e ligados no pMON41164. A constru-ção resultante de expressão gênica, pMON68534, é retratada na FIG. 10 eutilizada para transformação, empregando os métodos conforme descritosnesta exposição.

As seqüências do intron 1 àe FAD2-1 (SEQ ID NO: 1 ou 2), 3'UTR de FAD3-1A (SEQ ID NO: 16) e da 3' UTR de FATB-1 de soja (SEQ IDNO: 36) são amplificadas por PCR para que resultem produtos que incluamsítios de restrição reconstruídos em ambas as extremidades. Os produtos daPCR são clonados diretamente, em orientação sense, em um vetor contendoo promotor 7Scc' de soja e seqüência de terminação tml 3', por intermédiodos sítios de Xftol1 construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. O ve-tor é cortado, em seguida, com Λ/ofl e ligados no pM0N41164, um vetor quecontém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüênciade terminação 3' da ervilha Rubisco E9. Um vetor contendo um gene delta-9dessaturase (FAB2) de R. communis (SEQ ID NO: 40), regulado por umpromotor de FAD2 de soja e uma seqüência de terminação 3' nos, são cor-tados com enzimas apropriadas de restrição e ligados no pMON41164. Aconstrução resultante de expressão gênica, pMON68535, é retratada naFIG. 10 e utilizada para transformação, empregando os métodos conformedescritos nesta exposição.

Em referência agora à FIG. 11, as seqüências da 3' UTR deFAD2-1 (SEQ ID NO: 5), 3' UTR de FAD3-1A (SEQ ID NO: 16) e da 3' UTRde FATB-1 de soja (SEQ ID NO: 36) são amplificadas por PCR para que re-sultem produtos que incluam sítios de restrição reconstruídos em ambas asextremidades. Os produtos da PCR são clonados diretamente, em orienta-ção sense, em um vetor contendo o promotor 7Sa' de soja e seqüência determinação tml 3', por intermédio dos sítios de Xho\, construídos nas extre-midades 5' dos primers PCR. O vetor é cortado, em seguida, com NoÜ e li-gados no pMON41164, um vetor que contém o gene CP4 EPSPS, reguladopelo promotor FMV e uma seqüência de terminação 3' da ervilha RubiscoE9. A construção resultante de expressão gênica, pMON80605, é retratadana FIG. 11 e utilizada para transformação, empregando os métodos confor-me descritos nesta exposição.

As seqüências da 3' UTR de FAD2-1 (SEQ ID NO: 5), 3' UTR deFAD3-1A (SEQ ID NO: 16) e da 3' UTR de FATB-I de soja (SEQ ID NO: 36)são amplificadas por PCR para que resultem produtos que incluam sítios derestrição reconstruídos em ambas as extremidades. Os produtos da PCRsão clonados diretamente, em orientação sense, em um vetor contendo opromotor 7Soc' de soja e seqüência de terminação tml 3', por intermédio dossítios de Xho\, construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. O vetor écortado, em seguida, com NoÜ e ligados no pMON41164, um vetor que con-tém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüência determinação 3' da ervilha Rubisco E9. Um vetor contendo um gene KAS IV deC. pulcherrima (SEQ ID NO: 39), regulado por um promotor napina de Bras-sica e uma seqüência de terminação 3' napina de Brassica, é cortado comenzimas apropriadas de restrição e ligado no pMON41164. A construçãoresultante de expressão gênica, pMC>N80606, é retratada na FIG. 11 e utili-zada para transformação, empregando os métodos conforme descritos nestaexposição.

As seqüências da 3' UTR de FAD2-1 (SEQ ID NO: 5), 3' UTR deFAD3-1A (SEQ ID NO: 16) e da 3' UTR de FATB-1 de soja (SEQ ID NO: 36)são amplificadas por PCR para que resultem produtos que incluam sítios derestrição reconstruídos em ambas as extremidades. Os produtos da PCRsão clonados diretamente, em orientação sense, em um vetor contendo opromotor 7Soc' de soja e seqüência de terminação tml 3', por intermédio dossítios de Xho\, construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. O vetor écortado, em seguida, com Noft e ligados no pM0N41164, um vetor que con-tém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüência determinação 3' da ervilha Rubisco E9. Um vetor contendo um gene delta-9dessaturase {FAB2) de R. communis (SEQ ID NO: 40), regulado por umpromotor de FAD2 de soja e uma seqüência de terminação 3' nos, são cor-tados com enzimas apropriadas de restrição e ligados no pMON41164. Aconstrução resultante de expressão gênica, pMON80607, é retratada naFIG. 11 e utilizada para transformação, empregando os métodos conformedescritos nesta exposição.

As seqüências da 3' UTR de FAD2-1 (SEQ ID NO: 5), 3' UTR deFAD3-1A (SEQ ID NO: 16) e da 3' UTR de FATB-1 de soja (SEQ ID NO: 36)são amplificadas por PCR para que resultem produtos que incluam sítios derestrição reconstruídos em ambas as extremidades. Os produtos da PCRsão clonados diretamente, em orientação sense, em um vetor contendo opromotor 7Sa' de soja e seqüência de terminação tml 3', por intermédio dossítios de Xho\, construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. O vetor écortado, em seguida, com Noft e ligados no pMON41164, um vetor que con-tém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüência determinação 3' da ervilha Rubisco E9. Vetores contendo um gene KAS IV deC. pulcherrima (SEQ ID NO: 39), regulado por promotor napina de Brassicae uma seqüência de terminação 3' de Brassica, e um gene delta-9 dessatu-rase (FAB2) de R. communis (SEQ ID NO: 40), regulado por um promotor deFAD2 de soja e uma seqüência de terminação 3' nos, são cortados com en-zimas apropriadas de restrição e ligados no pMON41164. A construção re-sultante de expressão gênica, pMON80614, é retratada na FIG. 11 e utiliza-da para transformação, empregando os métodos conforme descritos nestaexposição.

Em referência agora à FIG. 12, as seqüências da 3' UTR deFAD2-1 (SEQ ID NO: 5), 3' UTR de FATB-I (SEQ ID NO: 36) e da 3' UTR deFAD3-1A de soja (SEQ ID NO: 16) são amplificadas por PCR para que resul-tem produtos que incluam sítios de restrição reconstruídos em ambas asextremidades. Os produtos da PCR são clonados diretamente, em orienta-ção sense, em um vetor contendo o promotor 7Soc de soja e seqüência determinação tml 3', por intermédio dos sítios de Xho\, construídos nas extre-midades 5' dos primers PCR. O vetor é cortado, em seguida, com Not\ e li-gados no pMON41164, um vetor que contém o gene CP4 EPSPS, reguladopelo promotor FMV e uma seqüência de terminação 3' da ervilha RubiscoE9. A construção resultante de expressão gênica, pMON80629, é retratadana FIG. 12 e utilizada para transformação, empregando os métodos confor-me descritos nesta exposição.

As seqüências do intron 1 de FAD2-1 (SEQ ID NO: 1 ou 2), in-tron 4 de FAD3-1A (SEQ ID NO: 10), intron Il de FATB-1 (SEQ ID NO: 30) edo intron 4 de FAD3-1A de soja (SEQ ID NO: 10) são amplificadas por PCRpara que resultem produtos que incluam sítios de restrição reconstruídos emambas as extremidades. Os produtos da PCR são clonados diretamente, emorientação sense, em um vetor contendo o promotor 7Soc de soja e seqüên-cia de terminação tml 3', por intermédio dos sítios de Xho\, construídos nasextremidades 5' dos primers PCR. O vetor é cortado, em seguida, com NotIe ligados no pMON41164, um vetor que contém o gene CP4 EPSPS, regu-lado pelo promotor FMV e uma seqüência de terminação 3' da ervilha Rubis-co Ε9. A construção resultante de expressão gênica, pMON81902, é retrata-da na FIG. 12 e utilizada para transformação, empregando os métodos con-forme descritos nesta exposição.

As seqüências da 5' UTR-3' UTR de FAD2-1 (SEQ ID NO: 6 e 5,unidas), 5'UTR-3'UTR de FATB-1 (SEQ ID NOs: 17 e 16, unidas, ou 27 e 26,unidas), e 5'UTR-3'UTR de FATB-1 de soja (SEQ ID NOs: 37 e 36, unidas)são amplificadas por PCR para que resultem produtos que incluam sítios derestrição reconstruídos em ambas as extremidades. O produto da PCR deFAD2-1 é clonado diretamente, em orientação sense, em um vetor contendoo promotor 7Sa' de soja e seqüência de terminação tml 3', por intermédiodos sítios de Xho\, construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. Damesma forma, o produto da PCR de FAD3-1 é clonado diretamente, em ori-entação sense, em um vetor contendo o promotor 7Sa de soja e seqüênciade terminação tml 3', por intermédio dos sítios de Xho\, construídos nas ex-tremidades 5' dos primers PCR. O produto da PCR de FATB-1 é clonadodiretamente, em orientação sense, em um vetor contendo o promotor arceli-na e seqüência de terminação tml 3', por intermédio dos sítios de Xho\, cons-truídos nas extremidades 5' dos primers PCR. Estes vetores são cortados,em seguida, com Nofi e ligados no pMON41164, um vetor que contém o ge-ne CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüência de termina-ção 3' da ervilha Rubisco E9. A construção de expressão gênica resultante,01, é retratada na FIG. 12 e utilizada para transformação, empregando osmétodos conforme descritos nesta exposição.

As seqüências da 5' UTR-3' UTR de FAD2-1 (SEQ ID NO: 6 e 5,unidas), 5'UTR-3'UTR de FATB-1 (SEQ ID NOs: 17 e 16, unidas, ou 27 e 26,unidas), e 5'UTR-3'UTR de FATB-1 de soja (SEQ ID NOs: 37 e 36, unidas)são amplificadas por PCR para que resultem produtos que incluam sítios derestrição reconstruídos em ambas as extremidades. O produto da PCR deFAD2-1 é clonado diretamente, em orientação sense, em um vetor contendoo promotor 7Sa' de soja e seqüência de terminação tml 3', por intermédiodos sítios de Xftol1 construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. Damesma forma, o produto da PCR de FAD3-1 é clonado diretamente, em ori-entação sense, em um vetor contendo o promotor 7Soc de soja e seqüênciade terminação tml 3', por intermédio dos sítios de Xho\, construídos nas ex-tremidades 5' dos primers PCR. O produto da PCR de FATB-1 é clonadodiretamente, em orientação sense, em um vetor contendo o promotor arceli-na e seqüência de terminação tml3', por intermédio dos sítios de Xho\, cons-truídos nas extremidades 5' dos primers PCR. Estes vetores são cortados,em seguida, com NotI e ligados no pMON41164, um vetor que contém o ge-ne CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüência de termina-ção 3' da ervilha Rubisco E9. Um vetor contendo um gene KAS IV de C. pul-cherrima (SEQ ID NO: 39), regulado por um promotor napina de Brassica euma seqüência de terminação 3' napina de Brassica, é cortado com enzimasapropriadas de restrição e ligado no pMON41164. A construção de expres-são gênica resultante, 02, é retratada na FIG. 12 e utilizada para transforma-ção, empregando os métodos conforme descritos nesta exposição.

Em referência agora à FIG. 13, as seqüências da 5' UTR deFAD2-1 (SEQ ID NO: 6 e 5, unidas), 5'UTR-3'UTR de FATB-1 (SEQ ID NOs:37 e 36, unidas), 3' UTR de FAD3-1A (SEQ ID NO: 16) e da 5' UTR-3' UTRde FAD3-1B de soja (SEQ ID NO: 27 e 26, unidas) são amplificadas porPCR para que resultem produtos que incluam sítios de restrição reconstruí-dos em ambas as extremidades. Os produtos da PCR são clonados direta-mente, em orientação sense, em um vetor contendo o promotor 7Sa' de sojae seqüência de terminação tml3', por intermédio dos sítios de Xho\, constru-ídos nas extremidades 5' dos primers PCR. Os vetores são cortados, emseguida, com NotI e ligados no pMON41164, um vetor que contém o geneCP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüência de terminação3' da ervilha Rubisco E9. Um vetor contendo um gene KAS IV de C. pulcher-rima (SEQ ID NO: 39), regulado por um promotor napina de Brassica e umaseqüência de terminação 3' napina de Brassica, é cortado com enzimas a-propriadas de restrição e ligado no pMON41164. A construção de expressãogênica resultante, 07, é retratada na FIG. 13 e utilizada para transformação,empregando os métodos conforme descritos nesta exposição.

O intron 1 de FAD2-1 de soja (SEQ ID NO: 1) é amplificado porPCR e resulta em produtos que incluem sítios de restrição reconstruídos emambas as extremidades. Os produtos da PCR são clonados diretamente, emorientação sense, em um vetor contendo o promotor 7Sa' de soja e seqüên-cia de terminação tml 3', por intermédio dos sítios de Xho\, construídos nasextremidades 5' dos primers PCR. As seqüências da 5' UTR-3' UTR deFATB-I (SEQ ID NO: 37 e 36, unidas), 3' UTR de FAD3-1A (SEQ ID NO: 16)e da 5' UTR-3' UTR de FAD3-1B de soja (SEQ ID NO: 27 e 26, unidas) sãoamplificadas por PCR para que resultem produtos que incluam sítios de res-trição reconstruídos em ambas as extremidades. Os produtos da PCR sãoclonados diretamente, em orientação sense, em um vetor contendo o promo-tor 7Scc de soja e seqüência de terminação nos 3', por intermédio dos sítiosde Xho\, construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. Os vetores sãocortados, em seguida, com Nofi e ligados no pMON41164, um vetor quecontém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüênciade terminação 3' da ervilha Rubisco E9. Um vetor contendo um gene KAS IVde C. pulcherrima (SEQ ID NO: 39), regulado por um promotor napina deBrassica e uma seqüência de terminação 3' napina de Brassica, é cortadocom enzimas apropriadas de restrição e ligado no pMON41164. A constru-ção de expressão gênica resultante, 09, é retratada na FIG. 13 e utilizadapara transformação, empregando os métodos conforme descritos nesta ex-posição.

Em referência agora à FIG. 19, as seqüências não codificadorasde FATB-2 (SEQ ID NO: 44-47), seqüências não codificadoras de FAD2-1(SEQ ID NOs: 1 e 5-6) e seqüências não codificadoras de FATB-1 de soja(SEQ ID NOs: 29-37) são amplificadas por PCR para que resultem produtosque incluam sítios de restrição reconstruídos em ambas as extremidades. Osprodutos da PCR são clonados diretamente, em orientação sense, em umvetor contendo o promotor 7Sa' de soja e seqüência de terminação tml 3',por intermédio dos sítios de XhcA, construídos nas extremidades 5' dos pri-mers PCR. Os vetores são cortados, em seguida, com Nofi e ligados nopMON80612, um vetor que contém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo pro-motor FMV e uma seqüência de terminação 3' da ervilha Rubisco E9. Aconstrução de expressão gênica resultante é retratada na FIG. 19-A e utili-zada para transformação, empregando os métodos conforme descritos nestaexposição.

Uma seqüência de DNA, contendo um delta-9 dessaturase, re-guiada por um promotor 7S alfa e uma seqüência de terminação TML 3', écortada empregando as enzimas apropriadas de restrição e ligada na cons-trução de expressão acima. A construção de expressão gênica resultante éretratada na FIG. 19-B e utilizada para transformação, empregando os mé-todos conforme descritos nesta exposição.

Um vetor contendo um gene KAS IV de C. pulcherrima (SEQ IDNO: 39), regulado por um promotor arcelina de feijão e uma seqüência determinação 3' napina, é cortado com enzimas apropriadas de restrição e li-gado na construção de expressão acima. A construção de expressão gênicaresultante é retratada na FIG. 19-C e utilizada para transformação, empre-gando os métodos conforme descritos nesta exposição.

Em referência agora à FIG. 20, as seqüências não codificadorasde FATB-2 (SEQ ID NO: 44-47), seqüências não codificadoras de FAD2-1(SEQ ID NOs: 1 e 5-6), seqüências não codificadoras de FATB-I (SEQ IDNOs: 29-37), seqüências não codificadoras de FAD3-1A (SEQ ID NOs: 7-13e -16-17) e seqüências não codificadoras de FAD3-1 de soja (SEQ ID NOs:19-27) são amplificadas por PCR para que resultem produtos que incluamsítios de restrição reconstruídos em ambas as extremidades. Os produtos daPCR são clonados diretamente, em orientação sense, em um vetor contendoo promotor 7Sa' de soja e seqüência de terminação tml 3', por intermédiodos sítios de Xho\, construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. Osvetores são cortados, em seguida, com Notí e ligados no pMON80612, umvetor que contém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e umaseqüência de terminação 3' da ervilha Rubisco E9. A construção de expres-são gênica resultante é retratada na FIG. 20-A e utilizada para transforma-ção, empregando os métodos conforme descritos nesta exposição.

Uma seqüência de DNA, contendo um delta-9 dessaturase, re-gulada por um promotor 7S alfa e uma seqüência de terminação TML 3', écortada empregando as enzimas apropriadas de restrição e ligada na cons-trução de expressão acima. A construção de expressão gênica resultante éretratada na FIG. 20-B e utilizada para transformação, empregando os mé-todos conforme descritos nesta exposição.

Um vetor contendo um gene KAS IV de C. pulcherrima (SEQ IDNO: 39), regulado por um promotor arcelina de feijão Brassica e uma se-qüência de terminação 3' napina, é cortado com enzimas apropriadas derestrição e ligado na construção de expressão acima. A construção de ex-pressão gênica resultante é retratada na FIG. 20-C e utilizada para transfor-mação, empregando os métodos conforme descritos nesta exposição.

O pMON93501 contém um intron 1 de FAD2-1A soja (SEQ IDNO: 1), ligado operacionalmente a um promotor 7Sa' de soja e uma seqüên-cia de terminação H6 3', um gene KAS IV de C. pulcherrima KAS IV gene(SEQ ID NO: 39), ligado operacionalmente um promotor napina de Brassicae uma seqüência de terminação 3' napina de Brassica, o gene delta 9 dessa-turase de Ricinus communis (Publicação do Pedido de Patente U.S. No.2003/00229918 A1), ligado operacionalmente a um promotor 7SA de soja euma seqüência de terminação nos 3' e um gene CP4 EPSPS, ligado opera-cionalmente a um promotor EFMV (promotor constitutivo, derivado do vírusdo mosaico da escrofulária) e uma seqüência de terminação 3' de ervilhaRubisco E9, todos flanqueados por elementos de borda de T-DNA de Agro-bacterium T-DNA, ou seja, um DNA de borda direita (RB) e DNA de bordaesquerda (LB). A construção resultante de expressão gênica é utilizada paratransformação empregando os métodos descritos nesta exposição.3C - Construções antisense

A FIG. 14 retrata moléculas de ácido nucléico da presente in-venção, nas quais os primeiros conjuntos de seqüências de DNA são capa-zes de expressar construções antisense, e as FIGs. 15 a 18 retratam molé-culas de ácido nucléico da presente invenção, nas quais os primeiros con-juntos de seqüências de DNA são capazes de expressar combinações deconstruções sense e antisense. O segundo conjunto de seqüências de DNAcompreende seqüências codificadoras, cada uma destas, uma seqüência deDNA que codifica uma seqüência que, quando expressa, é capaz de aumen-tar a proteína ou transcrito, ou ambos, codificados por um gene selecionadodo grupo constituído por KAS I, KAS IV, delta-9 dessaturase e CP4 EPSPS.Cada seqüência codificadora é associada a um promotor, o qual pode serqualquer promotor funcional em uma planta ou qualquer promotor de planta,podendo ser um promotor FMV, um promotor napina, um promotor 7S (7Saou 7Soc'), um promotor arcelina, um promotor delta-9 dessaturase ou umpromotor de FAD2-1A.

Em referência agora à FIG. 14, as seqüências da 3' UTR deFAD2-1 (SEQ ID NO: 5), 3' UTR de FATB-1 (SEQ ID NO: 36) e da 3' UTR deFAD3-1A de soja (SEQ ID NO: 16) são amplificadas por PCR para resulta-rem produtos que incluam sítios de restrição reconstruídos em ambas asextremidades. Os produtos da PCR são clonados diretamente, em orienta-ção antisense, em um vetor contendo o promotor 7Sa' de soja e seqüênciade terminação tml 3', por intermédio dos sítios de Xho\, construídos nas ex-tremidades 5' dos primers PCR. O vetor é cortado, em seguida, com Not\ eligado no pMON41164, um vetor que contém o gene CP4 EPSPS, reguladopelo promotor FMV e uma seqüência de terminação 3' da ervilha RubiscoE9. A construção resultante de expressão gênica, pMON80615, é retratadana FIG. 14 e utilizada para transformação, empregando os métodos confor-me descritos nesta exposição.

As seqüências da 3' UTR de FAD2-1 (SEQ ID NO: 5), 3' UTR deFATB-1 (SEQ ID NO: 36) e da 3' UTR de FAD3-1A de soja (SEQ ID NO: 16)são amplificadas por PCR para resultarem produtos que incluam sítios derestrição reconstruídos em ambas as extremidades. Os produtos da PCRsão clonados diretamente, em orientação antisense, em um vetor contendo opromotor 7Scc' de soja e seqüência de terminação tml 3', por intermédio dossítios de Xho\, construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. O vetor écortado, em seguida, com NotI e ligado no pMON41164, um vetor que con-tém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüência determinação 3' da ervilha Rubisco E9. Um vetor contendo um gene KAS IV deC. pulcherrima (SEQ ID NO: 39), regulado por um promotor napina de Bras-sica e uma seqüência de terminação 3' napina de Brassica, é cortado comenzimas apropriadas de restrição e ligado no pMON41164. A construçãoresultante de expressão gênica, pMON80616, é retratada na FIG. 14 e utili-zada para transformação, empregando os métodos conforme descritos nestaexposição.

As seqüências da 3' UTR de FAD2-1 (SEQ ID NO: 5), 3' UTR deFATB-1 (SEQ ID NO: 36) e da 3' UTR de FAD3-1A de soja (SEQ ID NO: 16)são amplificadas por PCR para resultarem produtos que incluam sítios derestrição reconstruídos em ambas as extremidades. Os produtos da PCRsão clonados diretamente, em orientação antisense, em um vetor contendo opromotor 7Soc' de soja e seqüência de terminação tml 3', por intermédio dossítios de Xho\, construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. O vetor écortado, em seguida, com NotI e ligado no pMON41164, um vetor que con-tém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüência determinação 3' da ervilha Rubisco E9. Um vetor contendo um gene delta-9dessaturase (FAB2) de R. communis (SEQ ID NO: 40), regulado por umpromotor de FAD2 de soja e uma seqüência de terminação 3' nos, é cortadocom enzimas apropriadas de restrição e ligado no pMON41164. A constru-ção resultante de expressão gênica, pMON80617, é retratada na FIG. 14 eutilizada para transformação, empregando os métodos conforme descritosnesta exposição.

As seqüências da 3' UTR de FAD2-1 (SEQ ID NO: 5), 3' UTR deFATB-I (SEQ ID NO: 36) e da 3' UTR de FAD3-1A de soja (SEQ ID NO: 16)são amplificadas por PCR para resultarem produtos que incluam sítios derestrição reconstruídos em ambas as extremidades. Os produtos da PCRsão clonados diretamente, em orientação antisense, em um vetor contendo opromotor 7Sa de soja e seqüência de terminação tml 3', por intermédio dossítios de Xho\, construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. O vetor écortado, em seguida, com NotI e ligado no pMON41164, um vetor que con-tém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüência determinação 3' da ervilha Rubisco E9. A construção resultante de expressãogênica, pMQN80630, é retratada na FIG. 14 e utilizada para transformação,empregando os métodos conforme descritos nesta exposição.

As seqüências da 5' UTR-3' UTR de FAD2-1 (SEQ ID NO: 6 e 5,unidas), 5'UTR-3'UTR de FATB-1 (SEQ ID NOs: 37 e 36, unidas), 3' UTR deFAD3-1A (SEQ ID NO: 16) e da 5' UTR-3' UTR de FAD3-1B de soja (SEQ IDNO: 27 e 26, unidas) são amplificadas pór PCR para que resultem produtosque incluam sítios de restrição reconstruídos em ambas as extremidades. Osprodutos da PCR são clonados diretamente, em orientação antisense, emum vetor contendo o promotor 7Sa' de soja e seqüência de terminação tml3', por intermédio dos sítios de Xho\, construídos nas extremidades 5' dosprimers PCR. O vetor é cortado, em seguida, com Λ/ofl e ligado nopMON41164, um vetor que contém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo pro-motor FMV e uma seqüência de terminação 3' da ervilha Rubisco E9. Umvetor contendo um gene KAS IV de C. pulcherrima (SEQ ID NO: 39), regula-do por um promotor napina de Brassica e uma seqüência de terminação 3'napina de Brassica, é cortado com enzimas apropriadas de restrição e ligadono pM0N41164. A construção de expressão gênica resultante, 08, é retrata-da na FIG. 14 e utilizada para transformação, empregando os métodos con-forme descritos nesta exposição.

Em referência agora à FIG. 15, as seqüências da 5' UTR deFAD2-1 (SEQ ID NO: 6 e 5, unidas), 5'UTR-3'UTR de FAD3-1 (SEQ ID NOs:17 e 16, unidas), 5'UTR-3'UTR de FATB-1 (SEQ ID NOs: 37 e 36, unidas)são amplificadas por PCR para que resultem produtos que incluam sítios derestrição reconstruídos em ambas as extremidades. Os produtos da PCRsão clonados diretamente, em orientação sense e antisense, em um vetorcontendo o promotor 7Soc' de soja e seqüência de terminação tml 3', com umpromotor adicional 7Sa, localizado entre as seqüências sense e antisense,por intermédio dos sítios de Xho\, construídos nas extremidades 5' dos pri-mers PCR. O vetor é cortado, em seguida, com Noti e ligado nopMON41164, um vetor que contém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo pro-motor FMV e uma seqüência de terminação 3' da ervilha Rubisco E9. Aconstrução de expressão gênica resultante, 03, é retratada na FIG. 15 e utili-zada para transformação, empregando os métodos conforme descritos nestaexposição.

As seqüências da 5' UTR-3' UTR de FAD2-1 (SEQ ID NO: 6 e 5,unidas), 5'UTR-3'UTR de FAD3-1A (SEQ ID NOs: 27 e 26, unidas), 5'UTR-3'UTR de FATB-1 (SEQ ID NOs: 37 e 36, unidas) são amplificadas por PCRpara que resultem produtos que incluam sítios de restrição reconstruídos emambas as extremidades. Os produtos da PCR são clonados diretamente, emorientação sense e antisense, em um vetor contendo o promotor 7Sa' desoja e seqüência de terminação tml 3', com um promotor adicional 7Sa, lo-calizado entre as seqüências sense e antisense, por intermédio dos sítios deXho\, construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. O vetor é cortado,em seguida, com NotI e ligado no pMON41164, um vetor que contém o geneCP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüência de terminação3' da ervilha Rubisco E9. Um vetor contendo um gene KAS IV de C. pulcher-rima (SEQ ID NO: 39), regulado por um promotor napina de Brassica e umaseqüência de terminação 3' napina de Brassica, é cortado com enzimas a-propriadas de restrição e ligado no pMON41164. A construção de expressãogênica resultante, 04, é retratada na FIG. 15 e utilizada para transformação,empregando os métodos conforme descritos nesta exposição.

Em referência agora à FIG. 16, as seqüências não codificadorasde FATB-2 (SEQ ID NO: 44-47), seqüências não codificadoras de FATB-1(SEQ ID NOs: 29-37), e as seqüências não codificadoras de FAD2-1 de soja(SEQ ID NOs: 1 e 5-6) são amplificadas por PCR para que resultem produ-tos que incluam sítios de restrição reconstruídos em ambas as extremida-des. Os produtos da PCR são clonados diretamente em orientação sense eantisense em um vetor contendo o promotor 7Sa' de soja e uma seqüênciade terminação tml 3'. O vetor é cortado, em seguida, com uma endonucleasede restrição apropriada e ligado no pMON80612, um vetor que contém o ge-ne CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüência de termina-ção 3' da ervilha Rubisco E9. A construção de expressão gênica resultante éretratada na FIG. 16-A e utilizada para transformação, empregando os mé-todos conforme descritos nesta exposição.

Uma seqüência de DNA1 contendo um delta-9 dessaturase, re-guiada por um promotor 7S alfa e uma seqüência de terminação TML 3\ écortada empregando as enzimas apropriadas de restrição e ligada na cons-trução de expressão acima. A construção de expressão gênica resultante éretratada na FIG. 16-B e utilizada para transformação, empregando os mé-todos conforme descritos nesta exposição.

Um vetor contendo um gene KAS IV de C. pulcherrima (SEQ IDNO: 39), regulado por um promotor arcelina de feijão e uma seqüência determinação 3' napina, é cortado com enzimas apropriadas de restrição e li-gado na construção de expressão acima. A construção de expressão gênicaresultante é retratada na FIG. 16-C e utilizada para transformação, empre-gando os métodos conforme descritos nesta exposição.

Em referência agora à FIG. 17, as seqüências não codificadorasde FATB-2 (SEQ ID NO: 44-47), seqüências não codificadoras de FATB-1(SEQ ID NOs: 29-37), seqüências não codificadoras de FAD2-1 (SEQ IDNOs: 1 e 5-6) e seqüências não codificadoras de FAD3-1A de soja (SEQ IDNOs: 7-13 e 16-17) são amplificadas por PCR para que resultem produtosque incluam sítios de restrição reconstruídos em ambas as extremidades. Osprodutos da PCR são clonados diretamente em orientação sense e antisen-se em um vetor contendo o promotor 7Sa' de soja e uma seqüência de ter-minação tml 3'. O vetor é cortado, em seguida, com uma endonuclease derestrição apropriada e ligado no pMON80612, um vetor que contém o geneCP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüência de terminação3' da ervilha Rubisco E9. A construção de expressão gênica resultante é re-tratada na FIG. 17-A e utilizada para transformação, empregando os méto-dos conforme descritos nesta exposição.

Uma seqüência de DNA, contendo um delta-9 dessaturase, re-gulada por um promotor 7S alfa e uma seqüência de terminação TML 3', écortada empregando as enzimas apropriadas de restrição e ligada na cons-trução de expressão acima. A construção de expressão gênica resultante éretratada na FIG. 17-B e utilizada para transformação, empregando os mé-todos conforme descritos nesta exposição.

Um vetor contendo um gene KAS IV de C. pulcherrima (SEQ IDNO: 39), regulado por um promotor arcelina de feijão e uma seqüência determinação 3' napina, é cortado com enzimas apropriadas de restrição e li-gado na construção de expressão acima. A construção de expressão gênicaresultante é retratada na FIG. 17-C e utilizada para transformação, empre-gando os métodos conforme descritos nesta exposição.

Em referência agora à FIG. 18, as seqüências não codificadorasde FATB-2 (SEQ ID NO: 44-47), seqüências não codificadoras de FATB-1(SEQ ID NOs: 29-37), seqüências não codificadoras de FAD2-1 (SEQ IDNOs: 1 e 5-6) e seqüências não codificadoras de FAD3-1A de soja (SEQ IDNOs: 7-13 e -16-17) e seqüências não codificadoras de FAD3-1B de soja(SEQ ID NOs: 19-27) são amplificadas por PCR para que resultem produtosque incluam sítios de restrição reconstruídos em ambas as extremidades. Osprodutos da PCR são clonados diretamente em orientação sense e antisen-se em um vetor contendo o promotor 7Soc' de soja e uma seqüência de ter-minação tml 3'. O vetor é cortado, em seguida, com uma endonuclease derestrição apropriada e ligado no pMON80612, um vetor que contém o geneCP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma seqüência de terminação3' da ervilha Rubisco E9. A construção de expressão gênica resultante é re-tratada na FIG. 18-A e utilizada para transformação, empregando os méto-dos conforme descritos nesta exposição.

Uma seqüência de DNA, contendo um delta-9 dessaturase, re-gulada por um promotor 7S alfa e uma seqüência de terminação TML 3', écortada empregando as enzimas apropriadas de restrição e ligada na cons-trução de expressão acima. A construção de expressão gênica resultante éretratada na FIG. 18-B e utilizada para transformação, empregando os mé-todos conforme descritos nesta exposição.

Um vetor contendo um gene KAS IV de C. pulcherrima (SEQ IDNO: 39), regulado por um promotor arcelina de feijão e uma seqüência determinação 3' napina, é cortado com enzimas apropriadas de restrição e Ii-gado na construção de expressão acima. A construção de expressão gênicaé retratada na FIG. 18-C e utilizada para transformação, empregando os mé-todos conforme descritos nesta exposição. As moléculas de ácido nucléicodescritas acima são concretizações preferidas com as quais os objetos, as-pectos e vantagens da presente invenção são atingidos. As concretizaçõesilustradas não pretendem restringir a presente invenção. O arranjo das se-qüências, no primeiro e segundo conjunto de seqüências de DNA na molé-cuia de ácido nucléico, não se limita aos arranjos ilustrados e descritos epode ser alterado em qualquer maneira adequada para que os objetos, as-pectos e vantagens da presente invenção sejam atingidos, conforme aquidescritos, ilustrados nos desenhos anexos e abrangidos pelas reivindica-ções.

3D.- Montagem in vivo

Uma característica da presente invenção inclui uma construçãode DNA que é montada em uma unidade de transcrição recombinante emum cromossomo vegetal in planta, capaz de formar RNA de fita dupla. Amontagem destas construções e os métodos de montagem in vivo de umaunidade de transcrição recombinante para supressão gênica são expostosno Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2005/00681, aqui incorpora-do em sua totalidade por referência neste pedido.

O pMON93505 é uma construção utilizada para montagem invivo e possui dois segmentos T-DNA, cada um flanqueado por elementos daborda de T-DNA de Agrobacterium, ou DNA de borda direita (RB) e DNA deborda esquerda (LB). O primeiro segmento T-DNA contém um promotor 7Sa'de soja ligado operacionalmente a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ IDNO: 1), reduzido em 100 nucleotídeos contíguos a partir da extremidade 3' eligado a 3' UTR de FATB-la, seguido por uma 5' UTR de FATB-Ia, um geneKAS IV de C. puicherrima (SEQ ID NO: 39), ligado operacionalmente a umpromotor napina de Brassica e uma seqüência de terminação 3' napina deBrassica, o gene delta 9 dessaturase de Ricinus communis (Publicação doPedido de Patente U.S. No. 2003/00229918 A1), ligado operacionalmente aum promotor 7SA de soja e uma seqüência de terminação nos 3', e um geneCP4 EPSPS, ligado operacionalmente a um promotor EFMV e uma seqüên-cia de terminação 3' de ervilha Rubisco E9, todos flanqueados por elemen-tos de borda de T-DNA de Agrobacterium, ou seja, um DNA de borda direita(RB) e DNA de borda esquerda (LB). Na mesma construção, no segundosegmento de T-DNA, flanqueado por outra RB e LB1 há uma seqüência determinação H6 3\ ligada operacionalmente a um intron 1 de FAD2-1A desoja (SEQ ID NO: 1), reduzido em 100 nucleotídeos contíguos a partir daextremidade 3' e ligado a 3' UTR de FATB-Ia, seguido por uma 5' UTR deFATB-Ia. A construção resultante de expressão gênica é utilizada paratransformação empregando os métodos descritos nesta exposição.

Quando os dois segmentos de T-DNA da construção acima sãoinseridos em um único Iocus do cromossomo de um organismo hospedeiro,em orientação de RB a RB, a unidade de transcrição montada possui umpromotor 7Soc' de soja, ligado operacionalmente, em orientação sense e an-tisense, a fragmentos de DNA do intron 1 de FAD2-1A e de FATB-Ia de so-ja. Quando transcritas, as seqüências de RNA em orientação sense e anti-sense, ligadas operacionalmente, são capazes de formar RNA de fita dupla,efetivo para supressão de FAD2-1A e FATB.

O pMON93506 é uma construção utilizada para montagem invivo e possui dois segmentos T-DNA, cada um flanqueado por elementos daborda de T-DNA de Agrobacterium, ou DNA de borda direita (RB) e DNA deborda esquerda (LB). O primeiro segmento de T-DNA contém um promotor7Sa' de soja ligado operacionalmente a um intron 1 de FAD2-1A de soja(SEQ ID NO: 1), reduzido em 100 nucleotídeos contíguos a partir da extre-midade 3' e ligado a 3' UTR de FATB-la, seguido por uma 5' UTR de FATB-1a, um gene delta 9 dessaturase de Ricinus communis (Publicação do Pedi-do de Patente U.S. No. 2003/00229918 A1), ligado operacionalmente a umpromotor 7SA de soja e uma seqüência de terminação 3' nos, e um geneCP4 EPSPS, ligado operacionalmente a um promotor eFMV e uma seqüên-cia de terminação 3' de ervilha Rubisco E9, todos flanqueados por LB e RB.No mesmo vetor, no segundo segmento de T-DNA, há uma seqüência determinação H6 3', ligada operacionalmente a um intron 1 de FAD2-1A desoja (SEQ ID NO: 1), reduzido em 100 nucleotídeos contíguos desde a ex-tremidade 3' e ligado à 3' UTR de FATB-la, seguido por uma 5' UTR deFATB-la, flanqueado por outra RB e LB. A construção de expressão gênicaresultante é utilizada para transformação, empregando os métodos conformedescritos nesta exposição.

Quando os dois segmentos de T-DNA da construção acima sãoinseridos em um único Iocus do cromossomo de um organismo hospedeiro,em orientação de RB a RB, a unidade de transcrição montada possui umpromotor 7Sa' de soja, ligado operacionalmente, em orientação sense e an-tisense, a fragmentos de DNA do intron 1 de FAD2-1A e de FATB-Ia de so-ja. Quando transcritas, as seqüências de RNA em orientação sense e anti-sense, ligadas operacionalmente, são capazes de formar RNA de fita dupla,efetivo para supressão de FAD2-1A e FATB.

O pMON93829 é uma construção utilizada para montagem invivo e possui dois segmentos T-DNA, cada um flanqueado por elementos daborda de T-DNA de Agrobacterium, ou seja, DNA de borda direita (RB) eDNA de borda esquerda (LB). O primeiro segmento de T-DNA contém umpromotor 7Sa' de soja ligado operacionalmente a um intron 1 de FAD2-1Ade soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em 100 nucleotídeos contíguos a partir daextremidade 3' e ligado a 42 nucleotídeos contíguos de uma 5' UTR deFATB-la, seguido pela região codificadora do peptídeo de trânsito cloroplás-tico ("CTP") do FATB-Ia e um gene CP4 EPSPS, ligado operacionalmente aum promotor EFMV e uma seqüência de terminação 3' de ervilha RubiscoE9, todos flanqueados por elementos de borda de T-DNA de Agrobacterium,ou seja, DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda (LB). No mes-mo vetor, no segundo segmento de T-DNA, flanqueado por outra RB e LB,há uma seqüência de terminação H6 3', ligada operacionalmente a um intron1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em 100 nucleotídeos contí-guos desde a extremidade 3' e ligado a 42 nucleotídeos contíguos de uma 5'UTR de FATB-la, seguido pela região codificadora do peptídeo de trânsitocloroplástico ("CTP") do FATB-la. A construção resultante de expressão gê-nica é utilizada para transformação empregando os métodos descritos nestaexposição.

Quando os dois segmentos de T-DNA da construção acima sãoinseridos em um único Iocus do cromossomo de um organismo hospedeiro,em orientação de RB a RB1 a unidade de transcrição montada possui umpromotor 7Sa' de soja, ligado operacionalmente, em orientação sense e an-tisense, a fragmentos de DNA do intron 1 de FAD2-1A e de FATB-Ia de so-ja. Quando transcritas, as seqüências de RNA em orientação sense e anti-sense, ligadas operacionalmente, são capazes de formar RNA de fita dupla,efetivo para supressão de FAD2-1A e FATB.

O pMON97595 é uma construção utilizada para montagem invivo e possui dois segmentos T-DNA, cada um flanqueado por elementos daborda de T-DNA de Agrobacterium, ou seja, DNA de borda direita (RB) eDNA de borda esquerda (LB). O primeiro segmento T-DNA contém um pro-motor 7Soc' de soja ligado operacionalmente a um intron 1 de FAD2-1A desoja (SEQ ID NO: 1), reduzido em 320 nucleotídeos contíguos a partir daextremidade 3' e ligado a 42 nucleotídeos contíguos de uma 5' UTR deFATB-la, seguido pela região codificadora do peptídeo de trânsito cloroplás-tico ("CTP") do FATB-Ia e um gene CP4 EPSPS, ligado operacionalmente aum promotor EFMV e uma seqüência de terminação 3' de ervilha RubiscoE9, todos flanqueados por elementos de borda de T-DNA de Agrobacterium,ou seja, DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda (LB). No se-gundo segmento do T-DNA, flanqueado por outra RB e LB, há uma seqüên-cia de terminação H6 3', ligada operacionalmente a um intron 1 de FAD2-1Ade soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em 320 nucleotídeos contíguos desde aextremidade 3' e ligado a 42 nucleotídeos contíguos de uma 5' UTR deFATB-la, seguido pela região codificadora do CTP do FATB-la. A constru-ção resultante de expressão gênica é utilizada para transformação empre-gando os métodos descritos nesta exposição.

Quando os dois segmentos de T-DNA da construção acima sãoinseridos em um único Iocus do cromossomo de um organismo hospedeiro,em orientação de RB a RB, a unidade de transcrição montada possui umpromotor 7Sa' de soja, ligado operacionalmente, em orientação sense e an-tisense, a fragmentos de DNA do intron 1 de FAD2-1A e de FATB-la de so-ja. Quando transcritas, as seqüências de RNA em orientação sense e anti-sense, ligadas operacionalmente, são capazes de formar RNA de fita dupla,efetivo para supressão de FAD2-1A e FATB.

O pMON97581 é uma construção utilizada para montagem invivo e possui dois segmentos T-DNA1 cada um flanqueado por elementos daborda de T-DNA de Agrobacterium, ou seja, DNA de borda direita (RB) eDNA de borda esquerda (LB). O primeiro segmento T-DNA contém um pro-motor 7Sa' de soja ligado operacionalmente a um intron 1 de FAD2-1A desoja (SEQ ID NO: 1), reduzido em 320 nucleotídeos contíguos a partir daextremidade 3' e ligado à região codificadora do peptídeo de trânsito cloro-plástico (mCTPd) do FATB-Ia e um gene CP4 EPSPS, ligado operacional- mente a um promotor EFMV e uma seqüência de terminação 3' de ervilhaRubisco E9, todos flanqueados por elementos de borda de T-DNA de Agro-bacterium, ou seja, DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda(LB). Na mesma construção, no segundo segmento de T-DNA1 flanqueadopor outra RB e LB1 há uma seqüência de terminação H6 3', ligada operacio-nalmente a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em320 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 3' e ligado à região codifi-cadora do CTP ao FATB-1 a. A construção resultante de expressão gênica éutilizada para transformação empregando os métodos descritos nesta expo-sição.

O pMON97596 é uma construção utilizada para montagem invivo e possui dois segmentos T-DNA, cada um flanqueado por elementos daborda de T-DNA de Agrobacterium, ou seja, DNA de borda direita (RB) eDNA de borda esquerda (LB). O primeiro segmento T-DNA contém um pro-motor 7Soc' de soja ligado operacionalmente a um intron 1 de FAD2-1A desoja (SEQ ID NO: 1), reduzido em 320 nucleotídeos contíguos a partir daextremidade 3' e ligado aos 180 bp da 5' da região codificadora do peptídeode trânsito cloroplástico ("CTP") do FATB-la, e um gene CP4 EPSPS, ligadooperacionalmente a um promotor EFMV e uma seqüência de terminação 3'de ervilha Rubisco E9, todos flanqueados por elementos de borda de T-DNAde Agrobacterium, ou seja, DNA de borda direita (RB) e DNA de borda es-querda (LB). Na mesma construção, no segundo segmento de T-DNA, flan-queado por outra RB e LB1 há uma seqüência de terminação H6 3', ligadaoperacionalmente a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), redu-zido em 320 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 3' e ligado aos180 bp da 5' da região codificadora do CTP do FATB-la. A construção resul-tante de expressão gênica é utilizada para transformação empregando osmétodos descritos nesta exposição.

O pMON97597 é uma construção utilizada para montagem invivo e possui dois segmentos T-DNA, cada um flanqueado por elementos daborda de T-DNA de Agrobacterium, ou seja, DNA de borda direita (RB) eDNA de borda esquerda (LB). O primeiro segmento T-DNA contém um pro-motor 7Soc' de soja ligado operacionalmente a um intron 1 de FAD2-1A desoja (SEQ ID NO: 1), reduzido em 320 nucleotídeos contíguos a partir daextremidade 3' e ligado aos 120 bp da 5' da região codificadora do peptídeode trânsito cloroplástico ("CTP") do FATB-la, e um gene CP4 EPSPS, ligadooperacionalmente a um promotor EFMV e uma seqüência de terminação 3'de ervilha Rubisco E9, todos flanqueados por elementos de borda de T-DNAde Agrobacterium, ou seja, DNA de borda direita (RB) e DNA de borda es-querda (LB). Na mesma construção, no segundo segmento de T-DNA1 flan-queado por outra RB e LB, há uma seqüência de terminação H6 3', ligadaoperacionalmente a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), redu-zido em 320 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 3' e ligado aos120 bp da 5' da região codificadora do CTP do FATB-1a. A construção resul-tante de expressão gênica é utilizada para transformação empregando osmétodos descritos nesta exposição.

O pMON97598 é uma construção utilizada para montagem invivo e possui dois segmentos T-DNA, cada um flanqueado por elementos daborda de T-DNA de Agrobacterium, ou seja, DNA de borda direita (RB) eDNA de borda esquerda (LB). O primeiro segmento T-DNA contém um pro-motor 7Soc' de soja ligado operacionalmente a um intron 1 de FAD2-1A desoja (SEQ ID NO: 1), reduzido em 340 nucleotídeos contíguos a partir daextremidade 3' e ligado à região codificadora do peptídeo de trânsito cloro-plástico ("CTP") do FATB-Ia e um gene CP4 EPSPS, ligado operacional-mente a um promotor EFMV e uma seqüência de terminação 3' de ervilhaRubisco E9, todos flanqueados por elementos de borda de T-DNA de Agro-bacterium, ou seja, DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda(LB). Na mesma construção, no segundo segmento de T-DNA, flanqueadopor outra RB e LB, há uma seqüência de terminação H6 3', ligada operacio-nalmente a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em340 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 3' e ligado à região codifi-cadora do CTP do FATB-Ia. A construção resultante de expressão gênica éutilizada para transformação empregando os métodos descritos nesta expo-sição.

Exemplo 4 - Transformação de planta e análise

As construções dos Exemplos 2 e 3 são introduzidas estavel-mente na soja (por exemplo, variedade A4922 Asgrow ou variedade A3244Asgrow ou variedade A3525 Asgrow), pelos métodos descritos anteriormen-te, incluindo os métodos de McCabe et ai, Bio/Technology, 6:923-926(1988), ou transformação mediada por Agrobacterium. As plantas transfor-madas de soja são identificadas por seleção em meio contendo glifosato. Aanálise de composições de ácidos graxos de sementes de linhagens de sojatransformadas com as construções é efetuada por cromatografia gasosa.Além disso, qualquer uma das construções pode conter outras seqüênciasde interesse, bem como combinações diferentes de promotores.

Para algumas aplicações, composições modificadas de ácidosgraxos são detectadas em sementes em desenvolvimento, enquanto que emoutras circunstâncias, como para análise de perfil de óleo, detecção de mo-dificações de ácidos graxos ocorridas posteriormente na via da FAS, ou paradetecção de modificações mínimas à composição de ácidos graxos, a análi-se de ácido graxo ou óleo de sementes maduras é a preferida. Ademais, aanálise de teor de óleo e/ou ácidos graxos de sementes individuais pode serdesejada, especialmente na detecção de modificação do óleo em popula-ções de semente Ri diferenciadas. Geração R0, conforme utilizada nestaexposição, indica a planta surgida de protocolos de transforma-ção/regeneração descritos nesta exposição, a geração R1 indica sementes,desenvolvidas na planta transgênica R0 auto-fecundada. Plantas R1 são de-senvolvidas a partir das sementes R1.

As composições de ácidos graxos são determinadas pra a se-mente de linhagens de soja transformadas com as construções do Exemplo3. Uma a dez sementes de cada linhagem de soja, transgênica e de contro-Iel são trituradas individualmente, empregando um homogeneizador de teci-do (Pro Scientific) para extração de óleo. O óleo de semente triturada de so-ja é extraído durante a noite em 1,5 ml de heptano, contendo triheptadeca-noina (0,50 mg/ml). Alíquotas de 200 μΙ do óleo extraído são derivados parametil ésteres com a adição de 500 μΙ de metóxido de sódio em metanol ab-soluto. É deixado que a reação de derivação progrida por 20 minutos a 50°C. A reação é interrompida pela adição simultânea de 500 μΙ de cloreto desódio a 10% (p/v) e 400 μΙ de heptano. Os metil ésteres resultantes de áci-dos graxos, extraídos em hexano, são determinados por cromatografia ga-sosa (GC) em um modelo da Hewlett-Packard 6890 GC (Paio Alto, CA). AGC foi equipada com uma coluna Supelcowax 250 (30 m; 0,25 mm id; 0,25de espessura de microfilme) (Supelco, Bellefonte, PA). A temperatura dacoluna é de 175 0C na injeção, e a temperatura programada de 175 0C a 2450C a 175 0C em 40 °C/min. As temperaturas do injetor e detector são 250 0Ce 270 °C, respectivamente.

Exemplo 5 - Óleo combustível sintetizado com propriedades melhoradas debiodiesel

Uma composição de ácidos graxos de óleo combustível sintéticoé preparada com as seguintes misturas de metil ésteres de ácidos graxos:73,3% de ácido oléico, 21,4% de ácido linoléico, 2,2% de ácido palmítico,2,1% de ácido linolênico e 1,0% de ácido esteárico (todos por peso). Metilésteres de ácidos graxos purificados são obtidos de Nu-Chek Prep, Inc., Ely-sian, MN, EUA. O número de cetano e demora na ignição desta composiçãoé determinada pelo Instituto de Pesquisa com um Aparelho de Teste deQualidade de Ignição ("IQT") 613 (Southwest Research lnstitute, San Anto-nio, Texas, EUA).

Um IQT é constituído por um compartimento de combustão devolume constante, aquecido eletricamente, um sistema de injeção de com-bustível e um computador que controla o experimento, registra os dados efornece a interpretação dos dados. O sistema de injeção de combustível in-clui um bocal injetor de combustível que forma uma entrada para o compar-timento de combustão. Um sensor levanta uma agulha no bocal injetor decombustível, detectando o fluxo de combustível para o interior do comparti-mento de combustão. Um transdutor de pressão, fixado ao compartimentode combustão, mede a pressão do cilindro, a pressão no interior do compar-timento de combustão. O conceito básico de u IQT é a medição do tempodesde o início da injeção de combustível no compartimento de combustãoaté o início da combustão. As condições termodinâmicas no compartimentode combustão são controladas precisamente para que a medição do tempode demora na ignição seja consistente.

Para um número de cetano e teste de demora na ignição, ocombustível em teste é filtrado com um filtro de 5 micron. O reservatório decombustível, o tubo de injeção e bocal são purgados com nitrogênio pressu-rizado. O reservatório de combustível é limpo, em seguida, com um panosem fiapos. Uma parte do combustível em teste é esguichada no reservató-rio de combustível, tubo de injeção e no bocal. O reservatório é preenchidocom o combustível em teste e todo ar é retirado do sistema. O reservatório épressurizado para 50 psig. O método consiste basicamente em injetar umaquantidade medida precisamente do combustível em teste, sob alta pressão,no compartimento de combustão, carregado com ar até a pressão e tempe-ratura desejadas. A medição consiste em determinar o tempo desde o inícioda injeção até o aparecimento da combustão, geralmente referido como otempo de demora na ignição, Esta determinação é baseada nas pressõesmedidas de levantamento de agulha e no compartimento de combustão. Oprocedimento normal de classificação de cetanos exige o estabelecimentoda temperatura cutânea em 567,5 sC e a pressão atmosférica em 2,1 MPa.

Um combustível de demora de injeção conhecida é testado nabomba de combustão do IQT no início do dia para assegurar que a unidadeestá operando dentro dos parâmetros normais. O sintético em teste é execu-tado em seguida. O combustível conhecido é testado de novo para verificarse o sistema não foi alterado. Uma vez re-conectado o reservatório do com-bustível com a bomba de injeção de combustível, o procedimento do teste éiniciado no controlador de PC. O computador controla todo o procedimento,incluindo a carga atmosférica, injeção de combustível e eventos de exaus-tão. São empreendidos 32 eventos de repetição de combustão.

A demora da ignição é o tempo desde o início da injeção até oinício da ignição. Ele é determinado a partir dos dados de levantamento deagulha e pressão do cilindro. A elevação da agulha de injeção sinaliza o iní-cio da injeção. A pressão do cilindro cai ligeiramente/em decorrência de oefeito de resfriamento da vaporização do combustível. O início da combustãoé definido como o tempo de recuperação da pressão do cilindro - aumentosdecorrentes de combustão para pressão imediatamente antes da injeção docombustível.

Os tempos medidos de demora na ignição são utilizados, emseguida, para o número de cetanos, com base em curva de calibração que éincorporada na aquisição de dados e software de redução. A curva de cali-bração, consistindo em número de cetano em função de tempo de demorana ignição, é gerada empregando misturas dos combustíveis primários dereferência e os combustíveis de verificação NEG. No caso de combustíveisem teste que são líquidos em condições ambientes, a curva de calibração éverificada diariamente, empregando pelo menos um combustível de verifica-ção de número conhecido de cetanos (Ryan, "Correlation of Physical andChemical Ignition Delay to Cetane Numbef, SAE Paper 852103 (1985);Ryan, "Diesel Fuel Ignition Quality as Determined in a Constant VolumeCombustion Bombn, SAE Paper 870586 (1986); Ryan, "Development of aPortable Fuel Cetane Quality MonitorBelvoir Fuels and Lubricants Resear-ch Facility Report No. 277, Maio (1992); Ryan, "Engine and Constant VolumeBomb Studies of Diesel Ignition and Combustion", SAE Paper 881616(1988); e Allard et ai, "Diesel Fuel Ignition Quality as Determined in the Igni-tion Quality Tester ("IQT")", SAE Paper 961182 (1996)). Conforme apresen-tado na Tabela 3, a composição do óleo sintetizado exibe números de ceta-no e demoras de ignição, cujo uso é adequado, por exemplo, entre outros,como um óleo biodiesel.

Tabela 3

<table>table see original document page 122</column></row><table>

O combustível denominado "Check-High" é um combustível decalibração. O seu número de cetanos de deve ser de 49,3 ± 0,5. A unidade éverificada com a calibração antes e depois de circular o combustível sintéticoem teste.

É efetuada a determinação de densidade (ASTM D-4052), pontode névoa (ASTM D-2500), ponto de fluidez (ASTM D-97) e ponto de entupi-mento de filtro a frio (IP 309/ASTM D-6371) para o óleo sintetizado, empre-gando protocolos ASTM D. Os protocolos ASTM D são obtidos da ASTM,100 Barr Harbor Drive, West Conshohocken, PA, EUA. Os resultados destestestes são apresentados na Tabela 4. Conforme é mostrado na Tabela 4, acomposição do óleo sintetizado exibe números adequados para uso como,por exemplo, entre outros, óleo biodiesel.Tabela 4

<table>table see original document page 123</column></row><table>

Níveis de emissão de oxido nítrico são estimados por avaliaçãodos níveis de insaturação de um combustível biológico, por medição da den-sidade do combustível e calculando-se indiretamente os níveis estimados deemissões, ou por medição direta. Há também à disposição protocolos pa-drões para medir diretamente níveis de emissões de óxido nítrico. Estima-seque o óleo sintetizado apresente níveis de emissões mais baixos de óxidonítrico do que metil ésteres de ácidos graxos, feitos de óleo de soja conven-cional, com base em uma avaliação do nível global de insaturação no óleosintetizado. Óleos contendo números maiores de ligações duplas, ou seja,com nível mais alto de insaturação, tendem a produzir emissões mais altasde óxido nítrico. O óleo possui, no total, 123 ligações duplas, em compara-ção com o total de 153 ligações duplas do óleo de soja convencional, con-forme apresentado na Tabela 5.

Tabela 5

<table>table see original document page 123</column></row><table>Conforme relatado pelo Relatório Final do Contrato Ns ACG-8-17106-02 do National Renewable Energy Laboratory, The Effect OfBiodieseIComposition On Engine Emissions From A DDC Series 60 Diesel Engine,(Junho de 2000), as emissões de ácido nítrico de composições de biodieselsão previstas pela fórmula y = 46,959 χ - 36,388, em que y é a emissão deóxido em gramas/horas de potência efetiva; e χ é a densidade do biodiesel.

A fórmula baseia-se em uma análise de regressão de dados de emissão deácido nítrico em um teste envolvendo 16 combustíveis biodiesel. O teste fazuso de um motor de calibração de 1991, número de produção 60, modelo daDetroit Diesel Corporation.

A densidade do óleo sintetizado é determinada pelo SouthwestResearch Institute com o método ASTM D4052. O resultado apresentado naTabela 4 é utilizado na equação acima para prever um valor de emissão deóxido nítrico de 4,89 g/bhp-h. Este resultado é comparado ao de um produtocontrole de soja. O relatório do National Renewable Energy Laboratory for-nece a densidade e emissões de óxido nítrico de um biodiesel de controle àbase de soja (metil éster de soja IGT). A densidade do biodiesel de controleé de 0,8877 g/ml, fornecendo uma emissão calculada de óxido nítrico de5,30 g/bhp-h. Esse valor calculado de emissões é semelhante ao valor expe-rimental para emissão de óxido nítrico de 5,32 g/bhp-h. A composição doóleo sintetizado exibe números melhores comparados ao controle e é ade-quado para uso, por exemplo, entre outros, como óleo biodiesel.

Exemplo 6 - Composição ótima de ácidos graxos para níveis saudáveis delipídeos sé ricos

As propriedades de redução de colesterol de composições vege-tais são determinadas para identificar composições de ácidos graxos comefeito mais favorável sobre níveis de lipídeos séricos do que óleo de sojaconvencional (isto é, colesterol-LDL mais baixo e HDL-colesterol mais alto).Equações publicadas com base em 27 estudos clínicos (Mensink, R.P. eKatan, M.B. Arteriosclerosis and Thrombosis, 12:911-919 (1992)) são utiliza-das para comparar os efeitos sobre níveis de lipídeos séricos em seres hu-manos de novas composições de sementes oleaginosas com aqueles deóleo de soja normal.

A Tabela 6 abaixo apresenta os resultados da alteração, em ní-veis de lipídeos séricos, em que 30% da energia na dieta, proveniente decarboidrato, são substituídos por lipídeos. Os resultados mostram que o óleode soja já possui efeitos favoráveis sobre lipídeos séricos quando substituicarboidratos na dieta. Melhoras nesta composição são possíveis pela redu-ção de níveis de gordura saturada e obtendo-se um nível de ácido linoléicoentre 10-30% dos ácidos graxos totais, de preferência, aproximadamente 15-25% dos ácidos graxos totais. Quando a proporção de ácido linoléico é me-nor do que 10% dos ácidos graxos totais, a nova composição eleva o LDO-colesterol, em comparação ao óleo de soja de controle, mesmo se o teor degordura saturada é diminuída para 5% dos ácidos graxos totais. Quando aproporção de ácido linoléico é aumentada, a capacidade da composição deelevar níveis séricos de HDL é reduzida. Por conseguinte, a composição pre-ferida de ácido linoléico é determinada como sendo de aproximadamente 15-25% dos ácidos graxos totais.<table>table see original document page 126</column></row><table><table>table see original document page 127</column></row><table><table>table see original document page 128</column></row><table>Exemplo 7

As seguintes quatorze etapas ilustram a construção do vetorpMON68537, criado para transformação de plantas, para suprimir os genesFAD2, FAD3 e FATB e superexpressar delta-9 dessaturase em soja. Emparticular, a construção compreende um promotor 7S alfa, ligado operacio-nalmente a intron e 3' UTRs de soja em orientação sense, ou seja, intron #1de FAD2-1A, 3' UTR de FAD3-1A, 3'UTR de FATB-1, intron spliceable for-mador de alça em grampo e uma série complementar de intron e 3' UTRs desoja em orientação antisense, ou seja, 3' UTR de FATB-1, 3' UTR de FAD3-1A e intron #1 de FAD2-1A e o promotor FAUl de soja, impulsionando a del-ta 9-dessaturase.

Etapa 1 - o intron #5 de FAD3-1A de soja, que serve como aparte de intron spliceable da construção de dsRNAi, é amplificado por PCRempregando DNA genômicó de soja como modelo, com os seguintes pri-mers:

5' primer = 19037 = ACTAGTATATTGAGCTCATATTCCACTGCAGTGGA-TATT

GTTTAAACATAGCTAGCATATTACGCGTATATTATACAAGCTTATATTCCCGGGATATTGTCGACATATTAGCGGTACATTTTATTGCTTATTCAC3' primer = 19045 = ACTAGTATATTGAGCTCATATTCCTGCAGGA-TATTCTCGAGATATTCACGGTAGTAATCTCCAAGAACTGGTTTTGCTGCTTGTGTCTGCAGTGAATC.

Estes primers adicionam sítios de clonagem às extremidades 5'e 3'. Para a extremidade 5': Spel, Saci, BstXI, Pmel, Nhel, MIul, Hindlll,Xmal, Smal, Sall. Para a extremidade 3': Spel, Saci, Sse8387l, XhoL O pro-duto por PCR do intron #5 de FAD3-1A de soja é clonado no pCR2.1, resul-tando em KAWHIT03.0065. O KAWHIT03.0065 é digerido em seguida comSpel e as extremidades são preenchidas com Pfu polimerase, epMON68526 (vetor vazio resistente a cloranfenicol (doravante CM)) é digeri-do com Hindlll e as extremidades são preenchidas com Pfu polimerase.KAWHIT03.0065 e pMON68526 são ligados, em seguida, para criar opMON68541 (intron #5 de FADQAtK de soja com múltiplos sítios de clona-gem em vetor resistente a Amp).

Etapa 2 - A 3' UTR de FATB-I de soja é amplificada com os se-guintes primers: 18662= TTTTAATTACAATGAGAATGAGATTTACTGC (adi-cionando Bsp120l à extremidade 5') e 18661= GGGCCCGATTTGAA-ATGGTTAACG. O produto por PCR é ligado, em seguida no pCR2.1 paraproduzir KAWHIT03.0036.

Etapa 3 - KAWHIT03.0036 é digerido, em seguida, com Bsp120le EcoRI e clonado depois no KAWHIT03.0032 (vetor vazio resistente a CMcom sítio múltiplo de clonagem) para produzir o KAWHIT03.0037 (3' UTR deFATB-1 em vetor vazio resistente a CM).

Etapa 4 - A 3' UTR de FAD3-1 de soja é amplificada com os se-guintes primers: 18639= GGGCCCGTTTCAAACl l l l iGG (adicionandoBsp120l à extremidade 5') e 18549= TGAAACTGACAATTCAA. O produtopor PCR é ligado, em seguida, no pCR2.1 para produzir KAWHIT03.0034.

Etapa 5 - KAWHIT03.0034 é digerido, em seguida, com Bsp120le EcoRI e clonado depois no KAWHIT03.0032 (vetor vazio resistente a CMcom sítio múltiplo de clonagem) para produzir o KAWHIT03.0035 (3' UTR deFATB-1 em vetor vazio resistente a CM).

Etapa 6-0 intron #1 de FAD 2-1A de soja é amplificado por

PCR, empregando DNA genômico de soja como modelo, com os seguintesprimers: 5" primer = 18663 = GGGCCCGGTAAATTAAATTGTGC (Adiciona-do sítio de Bsp120l à extremidade 5'); e 3' primer = 18664 = CTGTGTCAA-AGTATAAACAAGTTCAG. The produto resultante por PCR é clonado empCR 2.1, criando KAWHIT03.0038.

Etapa 7-0 produto por PCR do intron #1 de FAD 2-1A de sojaem KAWHIT03.0038 é clonado em KAWHIT03.0032 (vetor vazio resistente aCM com sítio múltiplo de clonagem), empregando os sítios de restriçãoBsp120l e Eco RI. O plasmídeo resultante é o KAWHIT03.0039 (intron #1 deFAD 2-1A de soja em vetor vazio resistente a CM).

Etapa 8 - KAWHIT03.0039 é digerido com Ascl e Hindlll, e opMON68541 (vetor básico resistente a AMP e intron #5 de FAD3-1A de ds-RNAi) é digerido com Mlul e Hindlll. O intron #1 de FAD 2-1A de soja é clo-nado, em seguida, direcionalmente no pMON68541 para gerar KA-WHIT03.0071 (intron #1 de FAD2-1A de soja com intron #5 de FAD3-1A desoja).

Etapa 9 - KAWHIT03.0035 (3' UTR de FAD3-1A em vetor resis-tente a CM) é digerido com Ascl e Hindlll, e KAWHIT03.0071 (intron deFAD2-1A e vetor básico resistente a AMP e intron #5 de FAD3-1A de dsR-NAi) é digerido com Mlul e Hindlll. A 3' UTR de FAD 3-1A de soja é clonado,em seguida, direcionalmente no KAWHIT03.0071 para gerar KA-WHIT03.0072 (intron #1 de FAD2-1A de soja e 3' UTR de FAD3-1A de sojacom intron #5 de FAD3-1A de soja).

Etapa 10 - KAWHIT03.0037 (3' UTR de ΡΛ7Β-1 em vetor resis-tente a CM) é digerido com Ascl e Hindlll, e KAWHIT03.0072 é digerido comMlul e Hindlll. A 3' UTR de FATB-I é clonada, em seguida, direcionalmenteno KAWHIT03.0072 para produzir KAWHIT03.0073 (intron de FAD2-1A desoja, 3' UTR de FAD3-1A, 3' UTR de FATB-1 de soja com intron #5 deFAD3-1A).

Etapa 11 - KAWHIT03.0073 é digerido com BstXI e Sall, e ofragmento contendo intron de FADZ-1ã, 3' UTR de F4D3-1A e 3'UTR deF/47B-1 é purificado em gel. Em um tubo diferente, KAWHIT03.0073 é dige-rido com Xhol e Sse8387l. O fragmento de intron/3'UTR é clonado de novoem KAWHIT03.0073 na orientação oposta, no outro sítio do intron #5 deFAD3-1A de soja para criar KAWHIT03.0074 (intron #1 sense de FAD2-1Ade soja, 3' UTR sense de FAD3-1A de soja, 3'UTR sense de FATB-I de so-ja, intron #5 spliceable de FAD3-1A de soja, 3' UTR antisense de FATB-I desoja, 3' UTR antisense de FAD3-1A de soja, intron #1 antisense de FAD2-1Ade soja).

Etapa 12 - Para ligar a construção de dsRNAi ao promotor 7Salfa' e a TML 3',o KAWHIT03.0074 e pMON68527 (cassete 7Sa'/TML3') sãodigeridos com Sacl e unidos para produzir pMON68563 (promotor 7S alfa'-intron #1 sense de FAD2-1A, 3' UTR sense de FAD3-1A de soja, 3' UTRsense de FATB-I de soja, 3' UTR antisense spliceable de FATB-1 de soja, 3'UTR antisense de FAD3-1A de soja, intron #1 antisense de FAD2-1A de soja- TML3').

Etapa 13 - Para introduzir a construção montada de dsRNAi nopMON70682, o pMON68563 e pMON70682 são digeridos com Notl e unidospara formar o pMON68536, compreendendo um promotor 7S alfa', ligadooperacionalmente à construção formadora de RNA de fita dupla (intron #1sense de FAD2-1a, 3' UTR sense de FAD3-1A de soja, 3' UTR sense deFATB-1 de soja, intron #5 spliceable de FAD3-1A de soja, 3' UTR antisensede FATB-1 de soja, 3' UTR antisense de FAD3-1A de soja, intron #1 anti-sense de FAD2-1A de soja e terminador TML3').

Etapa 14-0 pMON68536 é digerida em seguida com Ascl eRsrll, e o pMON68529 (que contém o marcador selecionável CP4, fundidoao promotor FMV e o RBCS 3', e o promotor de FAD2 de soja impulsionandoa delta 9 dessaturase) é digerido com SanDI e Ascl. A porção do dsRNAi nopMON68536 é, em seguida, clonada direcionalmente no pMON68529 paracriar o pMON68537 (promotor 7S alfa', ligado operacionalmente à constru-ção formadora de RNA de fita dupla (intron #1 sense de FAD2-1A, 3' UTRsense de FAD3-1A de soja, 3' UTR sense de FATB-1 de soja, intron #5 spli-ceable de FAD3-1A de soja, 3' UTR antisense de FATB-1 de soja, 3' UTRantisense de FAD3-1A de soja, intron #1 antisense de FAD2-1A de soja eterminador TML3' e promotor de FAD2 de soja, impulsionando a delta 9 des-saturase).Exemplo 8

As seguintes quinze etapas ilustram a construção do vetorpMON68539 (Figura 22), criado para transformação de plantas, para supri-mir os genes FAD2, FAD3 e FATB e superexpressar delta-9 dessaturase e aenzima KASIV em soja. Em particular, a construção compreende um promo-tor 7S alfa, ligado operacionalmente a intron e 3' UTRs de soja em orienta-ção sense, ou seja, intron #1 de FAD2-1A, 3' UTR de FAD3-1A, 3'UTR deFATB-1, intron spliceable formador de alça em grampo e uma série comple-mentar de intron e 3' UTRs de soja em orientação antisense, ou seja, 3' UTRde FATB-1, 3' UTR de FAD3-1A e intron #1 de FAD2-1A e o promotor FAUlde soja, impulsionando a delta 9-dessaturase e o promotor Napina impulsio-nando KASIV.

Etapa 1 - O intron #5 de FAD3-1A de soja, que serve como aparte de intron spliceable da construção de dsRNAi, é amplificado por PCRempregando DNA genômico como modelo, com os seguintes parâmetros:5' primer = 19037 = ACTAGTATATTGAGCTCATATTCCACTGCAGTGGA-TATTG

TTTAAACATAGCTAGCATATTACGCGTATATTATACAAGCTTATATTCCCGGGATATTGTCGACATATTAGCGGTACATTTTATTGCTTATTCAC3' primer = 19045 = ACTAGTATATTGAGCTCATATTCCTGCAGGA-TATTCTCGAG

ATATTCACGGTAGTAATCTCCAAGAACTGGTTTTGCTGCTTGTGTCTGCAGTGAATC.

Estes primers adicionam sítios de clonagem às extremidades 5'e 3'. Para a extremidade 5': Spel, Saci, BstXI, Pmel, Nhel, Mlul, Hindlll,Xmal, Smal1 Sall. Para a extremidade 3': Spel, Saci, Sse8387l, Xhol. O pro-duto por PCR do intron #5 de FAD3-1A de soja é clonado no pCR2.1, resul-tando em KAWHIT03.0065. O KAWHIT03.0065 é digerido em seguida comSpel e as extremidades são preenchidas com Pfu polimerase, epMON68526 (vetor vazio resistente a CM é digerido com Hindlll e as extre-midades são preenchidas com Pfu polimerase. KAWHIT03.0065 epMON68526 são ligados, em seguida, para criar o pMON68541 (intron #5 deF/AD3-1A de soja com múltiplos sítios de clonagem em vetor resistente aAmp).

Etapa 2 - A 3' UTR de FATB-1 de soja é amplificada com os se-guintes primers: 18662= TTTTAATTACAATGAGAATGAGATTTACTGC (adi-cionando Bsp120l à extremidade 5') e 18661= GGGCCCGATTTGAA-ATGGTTAACG. O produto por PCR é ligado, em seguida no pCR2.1 paraproduzir KAWHIT03.0036.

Etapa 4 - A 3' UTR de FAD3-1 de soja é amplificada com os se-guintes primers: 18639= GGGCCCGTTTCAAACTTTTTGG (adicionandoBsp120l à extremidade 5') e 18549= TGAAACTGACAATTCAA. O produtopor PCR é ligado, em seguida, no pCR2.1 para produzir KAWHIT03.0034.

Etapa 6-0 intron #1 de FAD 2-1A de soja é amplificado porPCR, empregando DNA genômico de soja como modelo, com os seguintesprimers: 5' primer = 18663 = GGGCCCGGTAAATTAAATTGTGC (Adiciona-do sítio de Bsp120l à extremidade 5'); e 3' primer = 18664 = CTGTGTCAA-AGTATAAACAAGTTCAG. The produto resultante por PCR é clonado empCR 2.1, criando KAWHIT03.0038.

Etapa 7-0 produto por PCR do intron #1 de FAD 2-1A de sojaem KAWHIT03.0038 é clonado em KAWHIT03.0032 (vetor vazio resistente aCM com sítio múltiplo de clonagem), empregando os sítios de restriçãoBsp120l e EcoRI. O plasmídeo resultante é o KAWHIT03.0039 (intron #1 deFAD 2- 1A de soja em vetor vazio resistente a CM).

Etapa 8 - KAWHIT03.0039 é digerido com Ascl e Hindlll, e opMON68541 (vetor básico resistente a AMP e intron #5 de FAD3-1A de ds-RNAi) é digerido com Mlul e Hindlll. O intron #1 de FAD 2-1A de soja é clo-nado direcionalmente no pMON68541 (intron #5 de F/ID3-1A em vetor resis-25 tente a Amp com múltiplos sítios de clonagem) para gerar KAWHIT03.0071(intron #1 de FAD2-1A de soja com intron #5 de FAD3-1A de soja).

Etapa 9 - KAWHIT03.0035 (3' UTR de FAD3-1A em vetor resis-tente a CM) é digerido com Ascl e Hindlll, e KAWHIT03.0071 (intron deFAD2-1A e vetor básico resistente a AMP e intron #5 de FAD3-1A de dsR-NAi) é digerido com Mlul e Hindlll. A 3' UTR de FAD 3-1A de soja é clonada,em seguida, direcionalmente no KAWHIT03.0071 para gerar KA-WHIT03.0072 (intron #1 de FAD2-1A de soja e 3' UTR de FAD3-1A de sojacom intron #5 de FAD3-1A de soja).

Etapa 10 - KAWHIT03.0037 (3' UTR de FATBA em vetor resis-tente a CM) é digerido com Ascl e Hindlll, e KAWHIT03.0072 é digerido comMlul e Hindlll. A 3' UTR de FATB-I é clonada, em seguida, direcionalmenteno KAWHIT03.0072 para produzir KAWHIT03.0073 (intron de FAD2-1A desoja, 3' UTR de FAD3-1A, 3' UTR de FATB-1 de soja com intron #5 deFAD3-1A).

Etapa 11 - KAWHIT03.0073 é digerido com BstXI e Sall1 e ofragmento contendo intron de F.ADIAA, 3' UTR de FAÜÒAk e 3'UTR deFATBA é purificado em gel. Em um tubo diferente, KAWHIT03.0073 é dige-rido com Xhol e Sse8387l. O fragmento de intron/3'UTR é clonado de novoem KAWHIT03.0073 na orientação oposta, no outro sítio do intron #5 deFAD3-1A de soja para criar KAWHIT03.0074 (intron #1 sense de FAD2-1Ade soja, 3' UTR sense de FAD3-1A de soja, 3'UTR sense de FATB-1 de so-ja, intron #5 spliceable de FAD3-1A de soja, 3' UTR antisense de FATB-1 desoja, 3' UTR antisense de FAD3-1A de soja, intron #1 antisense de FAD2-1Ade soja).

Etapa 12 - Para ligar a construção de dsRNAi ao promotor 7Salfa' e a TML 3',o KAWHIT03.0074 e pMON68527 (cassete 7Sa7TML3') sãodigeridos com Sacl e unidos para produzir pMON68563 (promotor 7S alfa'-intron #1 sense de FAD2-1A, 3' UTR sense de FAD3-1A de soja, 3' UTRsense de FATB-1 de soja, 3' UTR antisense spliceable de FATB-1 de soja, 3'UTR antisense de FAD3-1A de soja, intron #1 antisense de FAD2-1A de soja-TML3').

Etapa 13 - Para introduzir a construção montada de dsRNAi nopMON70682, o pMON68563 e pMON70682 são digeridos com Notl e unidospara formar o pMON68536, compreendendo um promotor 7S alfa', ligadooperacionalmente à construção formadora de RNA de fita dupla (intron #1sense de FAD2- 1a, 3' UTR sense de FAD3-1A de soja, 3' UTR sense deFATB-1 de soja, intron #5 spliceable de FAD3-1A de soja, 3' UTR antisensede FATB-1 de soja, 3' UTR antisense de FAD3-1A de soja, intron #1 anti-sense de FAD2-1A de soja e terminador TML3').Etapa 14-0 pMON68536 é digerida em seguida com Ascl eRsrlI, e o pMON68529 (que contém o marcador selecionável CP4, fundidoao promotor FMV e o RBCS 3', e o promotor de FAUl de soja impulsionandoa delta 9 dessaturase) é digerido com SanDI e Ascl. A porção do dsRNAi nopMON68536 é, em seguida, clonada direcionalmente no pMON68529 paracriar o pMON68537 (promotor 7S alfa', ligado operacionalmente à constru-ção formadora de RNA de fita dupla (intron #1 sense de FAD2-1A, 3' UTRsense de FAD3-1A de soja, 3' UTR sense de FATB-1 de soja, intron #5 spli-ceable de FAD3-1A de soja, 3' UTR antisense de FATB-1 àe soja, 3' UTRantisense de FAD3-1A de soja, intron #1 antisense de FAD2-1A de soja eterminador TML3' e promotor de FAD2 de soja, impulsionando a delta 9 des-saturase).

Etapa 15 - pMON68537 é digerido, em seguida, com SanDI eAscl, e o pMON70683 (Napina impulsionando KaslV) é digerido com Ascl eRsrlI. O fragmento Napina/KaslV é, em seguida, clonado direcionalmente nopMON68537 para criar o pMON68539 (promotor 7S alfa', ligado operacio-nalmente à construção formadora de RNA de fita dupla (intron #1 sense deFAD2-1A, 3' UTR sense de FAD3-1A de soja, 3' UTR sense de FATB-1 desoja, intron #5 spliceable de FAD3-1A de soja, 3' UTR antisense de FATB-1de soja, 3' UTR antisense de FAD3-1A de soja, intron #1 antisense deFAD2-1A de soja e terminador TML3', promotor de FAD2 de soja, impulsio-nando a delta 9 dessaturase, e o promotor Napina impulsionando KaslV).

Exemplo 9

Este exemplo ilustra a transformação de plantas para produçãode plantas de soja com genes suprimidos.

Um vetor de transformação, pMON68537, conforme preparadono Exemplo 7, é utilizado para introduzir uma construção formadora de RNAde fita dupla de intron/3'UTR na soja, para supressão dos genes Δ12 dessa-turase, Δ15 dessaturase e FATB. O vetor pMON68537 contém também osgenes delta-9 dessaturase (FAB2) e the CP4. O vetor é introduzido estavel-mente na soja (variedade A4922 Asgrow) por intermédio da cepa ABI da A-grobacterium tumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6 384 301). O marca-dor selecionável CP4 permite que as plantas transformadas de soja sejamidentificadas por seleção em meio contendo herbicida com glifosato.

A análise de composições de ácidos graxos de sementes de li-nhagens de soja transformadas com as construções de expressão intron/3'UTR de dsRNAi é efetuada por cromatografia gasosa. Composições de se-mentes reunidas Ri e de óleo de uma única semente Ri demonstram que ascomposições de ácidos graxos mono e poliinsaturados são alteradas no óleode sementes de linhagens de soja transgênica, em comparação com aque-las da semente de soja não transformada (Consultar a Tabela 7). Por exem-pio, a supressão de FAD2 fornece plantas com quantidade aumentada decompostos de éster de ácido oléico; a supressão de FAD3 fornece plantascom compostos diminuídos de éster de ácido linolênico e a supressão deFATB fornece plantas com compostos reduzidos de ésteres graxos satura-dos, por exemplo, palmitatos e estearatos. Seleções podem ser feitas entreestas linhagens, dependendo da composição relativa desejada de ácidosgraxos. A análise de composições de ácidos graxos de sementes de linha-gens de soja transformadas com as construções é efetuada por cromatogra-fia gasosa.

Exemplo 10

Um vetor de transformação, pMON68539, conforme preparadono Exemplo 3, é utilizado para introduzir uma construção formadora de RNAde fita dupla de intron/3'UTR na soja, para supressão dos genes Δ12 dessa-turase, Δ15 dessaturase e FATB. O vetor pMON68539 contém também osgenes KasIVe o CP4. O vetor é introduzido estavelmente na soja (variedadeA4922 Asgrow) por intermédio da cepa ABI da Agrobacterium tumefaciens(Martinell, Patente U.S. No. 6 384 301). O marcador selecionável CP4 permi-te que as plantas transformadas de soja sejam identificadas por seleção emmeio contendo herbicida com glifosato.

A análise de composições de ácidos graxos de sementes de li-nhagens de soja transformadas com as construções de expressão intron/3'UTR de dsRNAi é efetuada por cromatografia gasosa. Composições de se-mentes reunidas Ri e de óleo de uma única semente Ri demonstram que ascomposições de ácidos graxos mono e poliinsaturados são alteradas no óleode sementes de linhagens de soja transgênica, em comparação com aque-las da semente de soja não transformada (Consultar a Tabela 8). Por exem-plo, a supressão de FAD2 fornece plantas com quantidade aumentada decompostos de éster de ácido oléico; a supressão de FAD3 fornece plantascom compostos diminuídos de éster de ácido linolênico e a supressão deFATB fornece plantas com compostos reduzidos de ésteres graxos satura-dos, por exemplo, palmitatos e estearatos. Seleções podem ser feitas entreestas linhagens, dependendo da composição relativa desejada de ácidosgraxos. A análise de composições de ácidos graxos de sementes de linha-gens de soja transformadas com as construções é efetuada por cromatogra-fia gasosa.

Tabela 7. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, resul-tantes de Eventos do pMON68537

<table>table see original document page 138</column></row><table>Construção Evento 18:1 18:3 16:0 18:0 18:2PMON68537 GM. .A36306 17,41 8,88 13,35 3,85 55,63PMON68537 GM. .A36307 77,22 3,71 6,8 2,77 8,5PMON68537 GM. .A36307 76,79 3,65 6,76 2,85 8,75PMON68537 GM. .A36307 71,44 4,54 7,2 3,58 12,17PMON68537 GM. .A36307 18,83 8,62 13,94 4,02 53,61PMON68537 GM. .A36307 18,81 8,38 13,27 3,7 54,97PMON68537 GM. .A36307 15,68 9,97 14,06 4,55 54,79PMON68537 GM. _A36307 15,28 10,64 14,68 4,43 53,97PMON68537 GM. .A36307 14,08 9,36 14,39 4,31 56,89PMON68537 GM. _A36309 78,67 3,53 6,09 2,5 8,18PMON68537 GM. .A36309 75,43 3,96 6,7 2,53 10,3PMON68537 GM. .A36309 71,41 4,19 6,92 2,74 13,67PMON68537 GM. _A36309 70,51 4,14 6,85 3,16 14,33PMON68537 GM. _A36309 67,51 5,01 7,45 3,15 15,69PMON68537 GM. _A36309 66,99 4,92 7,15 3,9 15,79PMON68537 GM. _A36309 20,09 8,46 12,41 5 52,97PMON68537 GM. _A36309 15,15 9,73 14,61 3,85 55,79PMON68537 GM. _A36310 74,28 4,77 7,31 1,85 10,9PMON68537 GM. _A36310 74,03 5,43 8,23 1,63 9,66PMON68537 GM. _A36310 73,07 5,09 7,37 1,76 11,75PMON68537 GM. _A36310 71,83 5,04 7,78 1,86 12,54PMON68537 GM. _A36310 68,01 6,26 9,8 1,97 13,13PMON68537 GM. _A36310 67,22 6,28 8,71 3,28 13,45PMON68537 GM. _A36310 65,37 6,87 10,01 1,94 14,9PMON68537 GM. _A36310 15,76 10,09 13,4 4,28 55,52PMON68537 GM. _A36311 77,87 3,56 5,9 2,46 9,05PMON68537 GM. _A36311 75,8 3,87 5,91 2,93 10,22PMON68537 GM. _A36311 75,61 3,71 6,21 2,56 10,75PMON68537 GM. _A36311 73,68 4,06 6 3,09 11,98PMON68537 GM. _A36311 72,66 4,11 6,41 3,14 12,48ΡΜ0Ν68537 GM. _A36311 70,89 4,39 6,52 3,11 13,93Construção Evento 18:1 18:3 16:0 18:0 18:2PMON68537 GM_ A36311 70,82 3,97 6,52 3,18 14,29PMON68537 GM_ A36311 16,67 9,39 13,65 4,44 54,77PMON68537 GM_ A36312 78,32 4,3 6,36 1,79 8,16PMON68537 GM_ A36312 77,55 4,46 6,51 2,13 8,23PMON68537 GM_ .A36312 77,43 4,17 6,31 1,81 9,24PMON68537 GM_ A36312 76,98 4,29 6,25 2,27 9,05PMON68537 GM_ A36312 76,43 4,55 6,82 2,16 8,96PMON68537 GM_ A36312 76,38 4,5 6,46 2,04 9,54PMON68537 GM. A36312 75,25 4,27 6,41 1,97 11,06PMON68537 GM_ .A36312 18,24 9,43 13,6 3,07 54,75PMON68537 GM. .A36313 80,18 4,07 6,17 2,59 5,85PMON68537 GM_ .A36313 79,96 4,16 6,03 2,59 6,11PMON68537 GM_ .A36313 78,88 3,9 5,6 2,8 7,65PMON68537 GM_ .Α36313 78,76 3,92 5,44 2,91 7,82PMON68537 GM_ _A36313 77,64 4,22 5,88 2,9 8,25PMON68537 GM. _A36313 76,15 4,14 6,06 3,13 9,42PMON68537 GM. .A36313 19,05 8,87 13,45 3,71 54,03PMON68537 GM. _A36313 18,47 8,46 13,13 3,63 55,41PMON68537 GM. _A36314 80,27 3,17 5,77 3,4 6,03PMON68537 GM. _A36314 79,66 3,24 5,72 3,19 6,91PMON68537 GM. _A36314 79,5 3,45 5,83 3,23 6,74PMON68537 GM. _A36314 77,42 3,52 5,76 3,57 8,42PMON68537 GM. _A36314 77,33 3,71 6,36 3,34 8,01PMON68537 GM. _A36314 76,83 3,71 6,38 3,24 8,59PMON68537 GM. _A36314 16,6 9,3 12,63 4,43 55,99PMON68537 GM. _A36314 15,26 8,59 13,71 4,54 56,84PMON68537 GM. _A36315 20,21 8,25 13,61 3,59 53,37PMON68537 GM. _A36315 17,47 9,22 13,46 3,35 55,57PMON68537 GM. _A36315 16,75 9,3 13,61 3,66 55,75PMON68537 GM. _A36315 16,54 9,18 13,54 3,88 55,9PMON68537 GM. _A36315 16,06 10,07 13,44 4,01 55,42Construção Evento 18:1 18:3 16:0 18:0 18:2PMON68537 GM. _A36315 16,05 9,58 12,82 4,25 56,29PMON68537 GM. _A36315 15,95 10,42 13,12 3,63 55,91PMON68537 GM. _A36315 15,5 10,22 13,25 3,78 56,3PMON68537 GM. _A36316 79,61 3,56 5,79 2,94 6,87PMON68537 GM. .A36316 75,11 4,01 6,45 3,44 9,76PMON68537 GM. _A36316 75,07 4,25 6,74 3,09 9,64PMON68537 GM. _A36316 73,92 3,97 6,53 3,56 10,75PMON68537 GM. _A36316 17,26 9,59 13,1 4,26 54,78PMON68537 GM. _A36316 17,15 9,03 12,81 4,04 55,97PMON68537 GM. _A36316 16,62 9,2 13,15 3,99 56,03PMON68537 GM. _A36316 16,6 9,44 13,19 3,95 55,84PMON68537 GM. _A36317 18,96 7,55 13,2 3,75 55,51PMON68537 GM. _A36317 16,19 9,43 13,33 3,96 56,04PMON68537 GM. _A36317 16,05 9,1 14,02 3,94 55,91PMON68537 GM. _A36317 15,33 9,4 13,91 4,22 56,11PMON68537 GM. _A36317 15,28 9,2 13,87 4,27 56,36PMON68537 GM. .A36317 14,58 10,15 13,74 4,38 56,15PMON68537 GM. _A36317 13,95 9,47 13,98 4,76 56,79PMON68537 GM. _A36317 13,91 9,88 14,26 4,62 56,25PMON68537 GM. .A36318 78,82 3,64 5,7 2,77 7,87PMON68537 GM. .A36318 77,94 3,73 5,9 2,94 8,29PMON68537 GM. .A36318 75,18 4,11 6,08 3,48 9,95PMON68537 GM. .A36318 75,1 3,93 6,02 3,04 10,75PMON68537 GM_ .A36318 75,01 4,22 6,57 3,29 9,72PMON68537 GM_ _A36318 74,17 4,2 6,51 3,27 10,68PMON68537 GM. .A36318 73,47 4,27 6,7 3,22 11,16PMON68537 GM_ .A36318 30,57 10,54 14,83 5,55 36,92PMON68537 GM. _A36319 80 3,65 5,83 2,31 7,02PMON68537 GM. .A36319 79,89 3,65 5,64 2,35 7,26PMON68537 GM. _A36319 79,4 3,59 5,73 1,76 8,46PMON68537 GM. .A36319 78 3,87 6,11 2,35 8,5Construção Evento 18:1 18:3 16:0 18:0 18:2PMON68537 GM. .A36319 76,08 4,22 6,5 2,35 9,74PMON68537 GM_ .A36319 75,56 3,89 6,41 1,78 11,3PMON68537 GM_ .A36319 75,26 4,27 6,47 2,37 10,5PMON68537 GM_ .A36319 75,16 4,1 6,48 2,49 10,66PMON68537 GM_ .A36320 81,27 3,19 5,84 2,4 6,09PMON68537 GM_ _A36320 80,21 3,27 5,18 2,44 7,76PMON68537 GM. .A36320 79,64 3,38 5,5 2,67 7,63PMON68537 GM_ .A36320 79,46 3,38 5,82 2,67 7,42PMON68537 GM. .A36320 78,5 3,59 6,24 2,49 8PMON68537 GM_ .A36320 73,83 3,79 6,72 2,78 11,74PMON68537 GM_ .A36320 73,1 3,95 6,9 2,39 12,48ΡΜ0Ν68537 GM. _A36320 22,99 8,03 12,19 4,81 50,89PMON68537 GM. .A36324 75,93 3,77 6,58 2,76 9,76PMON68537 GM. _A36324 75,1 4,05 7,01 2,83 9,8PMON68537 GM. .A36324 17,83 8,79 12,78 4,11 55,49PMON68537 GM. .A36324 16,46 8,88 12,84 4,48 56,29PMON68537 GM. _A36324 16,35 9,25 13,51 4,17 55,66PMON68537 GM. .A36324 15,25 8,99 13,73 4,28 56,69PMON68537 GM. .A36324 14,16 10,17 13,95 4,11 56,58PMON68537 GM. _A36324 13,59 9,87 14,61 4,5 56,33PMON68537 GM. _A36357 80,19 3,03 5,59 3,2 6,62PMON68537 GM. _A36357 79,78 3,19 5,51 3,24 6,89PMON68537 GM. .A36357 78,5 3,55 5,75 3,17 7,71PMON68537 GM. _A36357 77,48 3,68 5,71 3,55 8,23PMON68537 GM. _A36357 77,28 3,79 5,66 3,48 8,46PMON68537 GM. _A36357 77,1 3,51 5,43 3,65 8,99PMON68537 GM. _A36357 71,9 4,24 6,47 3,67 12,39PMON68537 GM. _A36357 17,66 9,32 13,26 4,21 54,51PMON68537 GM. _A36359 77,91 3,35 5,67 3,24 8,53PMON68537 GM. _A36359 77,85 3,29 5,42 3,29 8,87PMON68537 GM. _A36359 76,71 3,65 6,07 3,35 8,95Construção Evento 18:1 18:3 16:0 18:0 18:2PMON68537 GM_ .A36359 71,73 4,01 6,79 3,49 12,68PMON68537 GM_ .A36359 69,32 4,51 6,99 3,66 14,13PMON68537 GM. .A36359 68,63 4,44 6,91 3,76 14,89PMON68537 GM. .A36359 18,87 8,03 13,38 3,86 54,81PMON68537 GM_ .A36359 16,81 9,83 13,08 4,68 54,55PMON68537 GM. .A36360 79,34 3,29 5,99 3,15 6,88PMON68537 GM_ .A36360 75,42 3,47 6,47 3,08 10,26PMON68537 GM_ _A36360 75,3 3,86 6,69 3,2 9,64PMON68537 GM. .A36360 74,51 3,8 6,39 3,32 10,67PMON68537 GM_ .A36360 21,49 6,95 13,07 3,92 53,46PMON68537 GM. .A36360 20,05 7,4 13,09 3,83 54,57PMON68537 GM_ _A36360 16,08 9,14 13,02 4,64 56,03PMON68537 GM. .A36360 15,86 9,07 13,44 4,49 56,04PMON68537 GM_ .A36361 82,13 2,83 5,67 3,13 4,81PMON68537 GM_ .A36361 80,99 3,2 5,79 3,01 5,64PMON68537 GM_ .A36361 74,39 3,85 6,33 3,5 10,59PMON68537 GM. .A36361 18,01 8,46 13,18 3,92 55,41PMON68537 GM. _A36361 17,99 8,11 13,05 4,09 55,7PMON68537 GM_ _A36361 17,35 8,31 13,4 4 55,88PMON68537 GM. .A36361 16,81 10,2 12,9 4,32 54,87PMON68537 GM_ .A36361. 16,55 8,5 13,21 4,22 56,45PMON68537 GM_ .A36362 78,05 3,89 6,29 2,81 7,76PMON68537 GM. _A36362 76,89 3,69 6,32 3,12 8,76PMON68537 GM. _A36362 76,1 4 6,57 3,02 9,24PMON68537 GM_ .A36362 76,01 4,08 6,24 3,03 9,48PMON68537 GM. .A36362 75,86 3,76 5,68 3,56 9,95PMON68537 GM. .A36362 75,79 4,07 6,43 3,15 9,34PMON68537 GM_ _A36362 74,89 4,14 6,63 3,11 10,07PMON68537 GM. _A36362 17,22 8,8 13,75 3,77 55,54PMON68537 GM. .A36363 79,15 3,57 6,2 3,03 6,84PMON68537 GM. .A36363 75,69 3,83 7,07 2,73 9,53Construção Evento 18:1 18:3 16:0 18:0 18:2PMON68537 GM. _A36363 73,97 4,22 6,82 3,39 10,33PMON68537 GM. _A36363 72,53 4,31 6,64 3,7 11,59PMON68537 GM. _A36363 68,42 4,5 7,05 3,95 14,79PMON68537 GM. _A36363 18,39 8,7 13,61 4,1 54,28PMON68537 GM. _A36363 17,54 8,87 14,08 4,07 54,56PMON68537 GM. _A36363 15,87 9,66 14,56 4,2 54,69PMON68537 GM. _A36365 78,79 3,11 5,87 1,27 9,9PMON68537 GM. _A36365 76,76 3,86 5,79 1,66 10,91PMON68537 GM. _A36365 75,41 3,49 6,06 1,83 12,15PMON68537 GM. ^A36365 73,57 3,65 6,11 1,5 14,19PMON68537 GM. _A36365 71,55 3,56 6,62 1,24 16,08PMON68537 GM. _A36365 70,41 4 6,07 2,15 16,33PMON68537 GM. _A36365 66,66 3,9 6,84 1,5 20,21PMON68537 GM. _A36365 63,96 4,22 7,08 2,27 21,52PMON68537 GM. _A36366 75,44 4,33 6,49 3,21 9,32ΡΜ0Ν68537 GM. .A36366 74,75 4,21 6,87 2,71 10,33PMON68537 GM. _A36366 74,69 4,65 6,91 3,06 9,65PMON68537 GM. _A36366 73,23 4,89 7,23 2,99 10,52PMON68537 GM. _A36366 72,53 4,76 7,42 3,26 10,85PMON68537 GM. _A36366 67,15 5,05 7,47 3,33 15,87PMON68537 GM. .A36366 65,81 5,6 7,9 3,37 16,09PMON68537 GM. _A36366 62,31 6,19 8,71 3,22 18,55PMON68537 GM. _A36367 80,56 3,3 6,07 2,58 6,34PMON68537 GM. _A36367 77,78 3,58 6,47 2,66 8,45PMON68537 GM. _A36367 77,78 3,46 6,25 2,84 8,51PMON68537 GM_ .A36367 77,39 3,81 6,71 2,86 8,11PMON68537 GM_ _A36367 77,32 3,74 6,17 3,12 8,47PMON68537 GM. .A36367 75,93 3,97 6,23 3,43 9,29PMON68537 GM .A36367 72,82 4,09 6,85 3,25 11,88PMON68537 GM. .A36367 19,31 7,58 13,7 3,59 55PMON68537 GM_ .A36410 21,67 7,62 13,38 3,43 53,1Construção Evento 18:1 18:3 16:0 18:0 18:2PMON68537 GM_A36410 20,9 8,33 12,93 3,64 53,33PMON68537 GM_A36410 20,21 8,04 13,28 3,86 53,66PMON68537 GM_A36410 20,02 8,71 12,79 3,71 53,87PMON68537 GM_A36410 18,96 8,95 13,3 3,77 54,15PMON68537 GM_A36410 18,18 8,98 13,56 3,74 54,66PMON68537 GM_A36410 17,61 9,29 12,93 4,12 55,13PMON68537 GM_A36410 16,78 9,8 13,78 3,92 54,83PMON68537 GM_A36411 75,06 4,33 6,49 2,93 10,08PMON68537 GM_A36411 74,32 4,46 6,76 2,96 10,38PMON68537 GM_A36411 73,41 4,76 6,91 3,11 10,78PMON68537 GM_A36411 73,24 4,87 7,28 2,89 10,67PMON68537 GM_A36411 22,38 8,17 13,47 3,6 51,51PMON68537 GM_A36411 18,26 9,07 14,14 3,81 54,02PMON68537 GM_A36411 17,52 10,1 13,1 4,03 54,36PMON68537 GM_A36411 17,02 9,71 13,45 4,02 54,89A3244 A3244 18,29 7,79 13,69 4,15 55,08A3244 A3244 17,54 8,19 13,32 4,32 55,57A3244 A3244 17,13 8,13 13,21 4,46 56,04A3244 A3244 15,47 9,56 13,04 4,43 56,46A3244 A3244 15,17 8,95 13,79 4,3 56,78A3244 A3244 15,05 9,03 14,16 4,01 56,8A3244 A3244 13,51 10,07 12,95 5,07 57,3A3244 A3244 13,49 9,91 13,31 4,56 57,67

Tabela 8. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, resul-tantes de Eventos do pMON68539

Construção Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3PMON68539 GM_A36448 4,51 2,65 79,64 8,66 3,55PMON68539 GM_A36448 4,62 2,64 78,35 9,99 3,77PMON68539 GM_A36448 5,89 2,65 76,86 9,79 3,84ΡΜ0Ν68539 GM_A36448 4,92 2,62 72,61 14,61 4,01PMON68539 GM_A36448 5,48 2,86 71,07 15,63 4,16Construção Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3PMON68539 GM_A36448 13,5 4,2 16,28 56,86 8,29PMON68539 GM_A36448 14,49 4,67 14,88 56,56 9,07PMON68539 GM_A36449 5,16 2,42 81,91 6,54 3,12PMON68539 GM_A36449 4,26 2,41 79,99 8,4 3,94PMON68539 GM_A36449 4,26 2,72 79,07 9,32 3,38PMON68539 GM_A36449 5,01 2,54 75,71 11,94 3,9PMON68539 GM_A36449 4,34 2,76 75,07 12,75 4,16PMON68539 GM_A36449 11,57 3,52 44,08 35,22 4,98PMON68539 GM_A36449 13,42 3,84 21,35 52,38 8,17PMON68539 GM_A36449 13,25 3,99 15,3 57,6 9,04PMON68539 GM_A36450 3,28 2,6 82,21 7,26 3,95ΡΜ0Ν68539 GM_A36450 4,16 2,51 80,93 7,72 3,76PMON68539 GM_A36450 4,3 3,42 78,78 8,43 4,22PMON68539 GM_A36450 4,84 3,16 77,07 9,6 4,22PMON68539 GM_A36450 5,11 3,1 75,21 10,98 4,49PMON68539 GM_A36450 13,74 4,26 17,31 54,32 10,11PMON68539 GM_A36450 13,82 4,34 17,13 54,96 9,47PMON68539 GM_A36450 13,56 3,83 17,06 56,7 8,6PMON68539 GM_A36705 9,73 1,83 75,04 8,23 4,27PMON68539 GM_A36705 10,85 1,74 72,89 9,29 4,53PMON68539 GM_A36705 10,05 1,78 72,68 9,83 4,48PMON68539 GM_A36705 10,02 1,77 72,57 10,04 4,36PMON68539 GM_A36705 10,75 1,75 72,37 9,68 4,77PMON68539 GM_A36705 10,58 1,78 70,35 11,64 4,43PMON68539 GM_A36705 7,69 5,63 16,21 60,39 8,85PMON68539 GM_A36705 8,02 5,69 15,58 60,65 8,86 A3244 13,03 4,31 21,23 52,61 7,77 A3244 12,69 3,98 20,71 55,12 6,53 A3244 15,2 5,02 19,83 49,96 8,83 A3244 12,63 4,84 19,55 53,18 8,66 A3244 13,27 4,48 18,28 54,4 8,5Construção

Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3A3244 13,22 4,91 17,38 54,73 8,63A3244 13,44 4,81 15,46 56,49 8,91

Exemplo 11

A construção pMON95829, conforme descrita no Exemplo 3D, éutilizada para introduzir uma construção formadora de RNA de fita dupla deintron de FAD2-1 na soja, para supressão do gene Fad2. O vetor é introdu-zido estavelmente na soja (variedade A4922 Asgrow) por intermédio da cepaABI da Agrobacterium tumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6 384 301).O marcador selecionável CP4 permite que as plantas transformadas de sojasejam identificadas por seleção em meio contendo herbicida com glifosato.Subseqüentemente, os genomas de plantas transformadas são selecionadospara inserção tandem concomitante do primeiro T-DNA e do segundo T-DNA, ou seja, o conjunto de "borda direita para borda direita". A seleção érealizada com métodos de mapeamento de hibridização pela técnica Sou-thern. Plantas transformadas de soja contendo a configuração preferida emseu genoma são transferidas para uma estufa para produção de sementes.

Por exemplo, tecido de folha foi retirado de plantas R0, transfor-madas com a construção pMON95829 e a análise pela técnica Southern érealizada. Sondas e material digerido por enzimas de restrição são escolhidospara identificar eventos, contendo uma montagem borda-direita-borda-direia("RB-RB") dos dois T-DNAs. Tipicamente, aproximadamente 25% de todosos transformantes possuem T-DNAs RB-RB adequadamente montados.

As composições de ácidos graxos são analisadas de sementede linhagens de soja, transformadas com uma construção pMON95829, comcromatografia gasosa conforme descrita no Exemplo 4, visando identificarmetil ésteres de compostos de ácidos graxos extraídos de sementes. Inici-25 almente, seis sementes R1, coletadas de plantas de soja transformadas coma construção pMON95829, são colhidas e a composição de ácidos graxosde cada semente é determinada. As plantas Ri de cada evento são separa-das quanto aos transgenes e produzem, por conseguinte, sementes comcomposição convencional de soja, bem como versões modificadas. As se-mentes positivas são reunidas e é feito cálculo da média para cada evento.

As médias de positivos reunidos demonstram que as composições de ácidosgraxos mono e poliinsaturados são alteradas no óleo de sementes de linha-gens de soja transgênica, em comparação com aquelas da semente de sojanão transformada (Consultar a Tabela 9). Por exemplo, a supressão deFAD2 fornece plantas com quantidade aumentada de compostos de éster deácido oléico.

Tabela 9. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, resul-tantes de Eventos do pMON95829

<table>table see original document page 148</column></row><table>

Exemplo 12

A construção pMON935C>5, conforme descrita no Exemplo 3D, éutilizada para introduzir uma construção formadora de RNA de fita dupla deintron de FAD2-1 na soja, para supressão do gene Fad2. O vetor é introdu-zido estavelmente na soja (variedade A4922 Asgrow) por intermédio da cepaABI da Agrobacterium tumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6 384 301).O marcador selecionável CP4 permite que as plantas transformadas de sojasejam identificadas por seleção em meio contendo herbicida com glifosato.Subseqüentemente, os genomas de plantas transformadas são selecionadospara inserção tandem concomitante do primeiro T-DNA e do segundo T-DNA, ou seja, o conjunto de "borda direita para borda direita". A seleção érealizada com métodos de mapeamento de hibridização pela técnica Sou-thern. Plantas transformadas de soja contendo a configuração preferida emseu genoma são transferidas para uma estufa para produção de sementes.

Por exemplo, tecido de folha foi retirado de plantas R0, transfor-madas com a construção pMON93505 e a análise pela técnica Southern érealizada. Sondas e material digerido por enzimas de restrição são escolhi-dos para identificar eventos, contendo uma montagem borda-direita-borda-direia ("RB-RB") dos dois T-DNAs. Tipicamente, aproximadamente 25% detodos os transformantes possuem T-DNAs RB-RB adequadamente monta-dos.

As composições de ácidos graxos são analisadas de sementede linhagens de soja, transformadas com uma construção pMON93505, comcromatografia gasosa conforme descrita no Exemplo 4, visando identificarmetil ésteres de compostos de ácidos graxos extraídos de sementes. Inici-almente, seis sementes Ri, coletadas de plantas de soja transformadas coma construção pMON93505, são colhidas e a composição de ácidos graxosde cada semente é determinada. As plantas Ri de cada evento são separa-das quanto aos transgenes e produzem, por conseguinte, sementes comcomposição convencional de soja, bem como versões modificadas. As se-mentes positivas são reunidas e é feito cálculo da média para cada evento.As médias de positivos reunidos demonstram que as composições de ácidosgraxos mono e poliinsaturados são alteradas no óleo de sementes de linha-gens de soja transgênica, em comparação com aquelas da semente de sojanão transformada (Consultar a Tabela 10). Por exemplo, a supressão deFAD2 fornece plantas com quantidade aumentada de compostos de éster deácido oléico.

Tabela 10. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, re-sultantes de Eventos do pMON935Q5

<table>table see original document page 150</column></row><table>

Exemplo 13

A construção pMON93506, conforme descrita no Exemplo 3D, éutilizada para introduzir uma construção formadora de RNA de fita dupla deintron de FAD2-1 na soja, para supressão do gene FAD2. O vetor é introdu-zido estavelmente na soja (variedade A4922 Asgrow) por intermédio da cepaABI da Agrobacterium tumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6 384 301).O marcador selecionável CP4 permite que as plantas transformadas de sojasejam identificadas por seleção em meio contendo herbicida com glifosato.

Subseqüentemente, os genomas de plantas transformadas são selecionadospara inserção tandem concomitante do primeiro T-DNA e do segundo T-DNA, ou seja, o conjunto de "borda direita para borda direita". A seleção érealizada com métodos de mapeamento de hibridização pela técnica Sou-thern. Plantas transformadas de soja contendo a configuração preferida emseu genoma são transferidas para uma estufa para produção de sementes.

Por exemplo, tecido de folha foi retirado de plantas R0, transfor-madas com a construção pMQN93506 e a análise pela técnica Southern érealizada. Sondas e material digerido por enzimas de restrição são escolhi-dos para identificar eventos, contendo uma montagem borda-direita-borda-direia ("RB-RB") dos dois T-DNAs. Tipicamente, aproximadamente 25% detodos os transformantes possuem T-DNAs RB-RB adequadamente montados.

As composições de ácidos graxos são analisadas de sementede linhagens de soja, transformadas com uma construção pMON93506, comcromatografia gasosa conforme descrita no Exemplo 4, visando identificarmetil ésteres de compostos de ácidos graxos extraídos de sementes. Inici-almente, seis sementes R1, coletadas de plantas de soja transformadas coma construção pMON93506, são colhidas e a composição de ácidos graxosde cada semente é determinada. As plantas Ri de cada evento são separa-das quanto aos transgenes e produzem, por conseguinte, sementes comcomposição convencional de soja, bem como versões modificadas. As se-mentes positivas são reunidas e é feito cálculo da média para cada evento.

As médias de positivos reunidos demonstram que as composições de ácidosgraxos mono e poliinsaturados são alteradas no óleo de sementes de Iinha-gens de soja transgênica, em comparação com aquelas da semente de sojanão transformada (Consultar a Tabela 11). Por exemplo, a supressão deFAD2 fornece plantas com quantidade aumentada de compostos de éster deácido oléico.

Tabela 11. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, re-sultantes de Eventos do pMQN93506

<table>table see original document page 151</column></row><table><table>table see original document page 152</column></row><table>

Exemplo 14

A construção pMON93501, conforme descrita no Exemplo 3D, éutilizada para introduzir uma construção formadora de RNA de fita dupla deintron de FAD2-1 na soja, para supressão do gene FAD2. O vetor é introdu-zido estavelmente na soja (variedade A4922 Asgrow) por intermédio da cepaABI da Agrobacterium tumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6 384 301).O marcador selecionável CP4 permite que as plantas transformadas de sojasejam identificadas por seleção em meio contendo herbicida com glifosato.

As composições de ácidos graxos são analisadas de sementede linhagens de soja, transformadas com uma construção pMON93501, comcromatografia gasosa conforme descrita no Exemplo 4, visando identificarmetil ésteres de compostos de ácidos graxos extraídos de sementes. Inici-almente, seis sementes R1, coletadas de plantas de soja transformadas coma construção pMON93501, são colhidas e a composição de ácidos graxosde cada semente é determinada. As plantas Ri de cada evento são separa-das quanto aos transgenes e produzem, por conseguinte, sementes comcomposição convencional de soja, bem como versões modificadas. As se-mentes positivas são reunidas e é feito cálculo da média para cada evento.

As médias de positivos reunidos demonstram que as composições de ácidosgraxos mono e poliinsaturados são alteradas no óleo de sementes de Iinha-gens de soja transgênica, em comparação com aquelas da semente de sojanão transformada (Consultar a Tabela 12). Por exemplo, a supressão deFAD2 fornece plantas com quantidade aumentada de compostos de éster deácido oléico.

Tabela 12. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, re-sultantes de eventos do pMQN93501

<table>table see original document page 153</column></row><table><table>table see original document page 154</column></row><table>

Exemplo 15

A construção pMON97552, conforme descrita no Exemplo 2D, éutilizada para introduzir uma construção formadora de RNA de fita dupla deintron de FAD2-1 na soja, para supressão do gene FAD2. O vetor é introdu-zido estavelmente na soja (variedade A4922 Asgrow) por intermédio da cepaABI da Agrobacterium tumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6 384 301).O marcador selecionável CP4 permite que as plantas transformadas de sojasejam identificadas por seleção em meio contendo herbicida com glifosato.

As composições de ácidos graxos são analisadas de sementede linhagens de soja, transformadas com uma construção pMON97552, comcromatografia gasosa conforme descrita no Exemplo 4, visando identificarmetil ésteres de compostos de ácidos graxos extraídos de sementes. Inici-almente, seis sementes Ri, coletadas de plantas de soja transformadas coma construção pMON97552, são colhidas e a composição de ácidos graxosde cada semente é determinada. As plantas Ri de cada evento são separa-das quanto aos transgenes e produzem, por conseguinte, sementes comcomposição convencional de soja, bem como versões modificadas. As se-mentes positivas são reunidas e é feito cálculo da média para cada evento.As médias de positivos reunidos demonstram que as composições de ácidosgraxos mono e poliinsaturados são alteradas no óleo de sementes de linha-gens de soja transgênica, em comparação com aquelas da semente de sojanão transformada (Consultar a Tabela 13). Por exemplo, a supressão deFAD2 fornece plantas com quantidade aumentada de compostos de éster deácido oléico.

Tabela 13. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, re-sultantes de eventos do pMON97552

Exemplo 16

A construção pMON93758, conforme descrita no Exemplo 2D, éutilizada para introduzir uma construção formadora de RNA de fita dupla deintron de FAD2-1 na soja, para supressão do gene FAD2. O vetor é introdu-zido estavelmente na soja (variedade A4922 Asgrow) por intermédio da cepaABI da Agrobacterium tumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6 384 301).O marcador selecionável CP4 permite que as plantas transformadas de sojasejam identificadas por seleção em meio contendo herbicida com glifosato.

As composições de ácidos graxos são analisadas de sementede linhagens de soja, transformadas com uma construção pMON93758, comcromatografia gasosa conforme descrita no Exemplo 4, visando identificarmetil ésteres de compostos de ácidos graxos extraídos de sementes. Inici-almente, seis sementes Ri, coletadas de plantas de soja transformadas coma construção pMON93758, são colhidas e a composição de ácidos graxosde cada semente é determinada. As plantas Ri de cada evento são separa-das quanto aos transgenes e produzem, por conseguinte, sementes comcomposição convencional de soja, bem como versões modificadas. As se-mentes positivas são reunidas e é feito cálculo da média para cada evento.As médias de positivos reunidos demonstram que as composições de ácidosgraxos mono e poliinsaturados são alteradas no óleo de sementes de linha-gens de soja transgênica, em comparação com aquelas da semente de sojanão transformada (Consultar a Tabela 14). Por exemplo, a supressão deFAD2 fornece plantas com quantidade aumentada de compostos de éster deácido oléico.Tabela 14. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, re-sultantes de eventos do pMON93758

<table>table see original document page 156</column></row><table>

Exemplo 17

A construção pMON97553, conforme descrita no Exemplo 2D, éutilizada para introduzir uma construção formadora de RNA de fita dupla deintron de FAD2-1 na soja, para supressão do gene FAD2. O vetor é introdu-zido estavelmente na soja (variedade A4922 Asgrow) por intermédio da cepaABI da Agrobacterium tumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6 384 301).O marcador selecionável CP4 permite que as plantas transformadas de sojasejam identificadas por seleção em meio contendo herbicida com glifosato.

As composições de ácidos graxos são analisadas de sementede linhagens de soja, transformadas com uma construção pMON97553, comcromatografia gasosa conforme descrita no Exemplo 4, visando identificarmetil ésteres de compostos de ácidos graxos extraídos de sementes. Inici-almente, seis sementes Ri, coletadas de plantas de soja transformadas coma construção pMON97553, são colhidas e a composição de ácidos graxosde cada semente é determinada. As plantas Ri de cada evento são separa-das quanto aos transgenes e produzem, por conseguinte, sementes comcomposição convencional de soja, bem como versões modificadas. As se-mentes positivas são reunidas e é feito cálculo da média para cada evento.As médias de positivos reunidos demonstram que as composições de ácidosgraxos mono e poliinsaturados são alteradas no óleo de sementes de linha-gens de soja transgênica, em comparação com aquelas da semente de sojanão transformada (Consultar a Tabela 15). Por exemplo, a supressão deFAD2 fornece plantas com quantidade aumentada de compostos de éster deácido oléico.

Tabela 15. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, re-sultantes de eventos do pMON97553

<table>table see original document page 157</column></row><table><table>table see original document page 158</column></row><table>

Exemplo 18

A construção pMON93770, conforme descrita no Exemplo 2D, éutilizada para introduzir uma construção formadora de RNA de fita dupla deintron de FAD2-1 na soja, para supressão do gene FAD2. O vetor é introdu-zido estavelmente na soja (variedade A4922 Asgrow) por intermédio da cepaABI da Agrobacterium tumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6 384 301).O marcador selecionável CP4 permite que as plantas transformadas de sojasejam identificadas por seleção em meio contendo herbicida com glifosato.

As composições de ácidos graxos são analisadas de sementede linhagens de soja, transformadas com uma construção pMON93770, comcromatografia gasosa conforme descrita no Exemplo 4, visando identificarmetil ésteres de compostos de ácidos graxos extraídos de sementes. Inici-almente, seis sementes R1, coletadas de plantas de soja transformadas coma construção pMC)N93770, são colhidas e a composição de ácidos graxosde cada semente é determinada. As plantas Ri de cada evento são separa-das quanto aos transgenes e produzem, por conseguinte, sementes comcomposição convencional de soja, bem como versões modificadas. As se-mentes positivas são reunidas e é feito cálculo da média para cada evento.As médias de positivos reunidos demonstram que as composições de ácidosgraxos mono e poliinsaturados são alteradas no óleo de sementes de linha-gens de soja transgênica, em comparação com aquelas da semente de sojanão transformada (Consultar a Tabela 16). Por exemplo, a supressão deFAD2 fornece plantas com quantidade aumentada de compostos de éster deácido oléico.

Tabela 16. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, re-sultantes de eventos do pMQN93770

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Exemplo 19

A construção pMON93759, conforme descrita no Exemplo 2D, éutilizada para introduzir uma construção formadora de RNA de fita dupla deintron de FAD2-1 na soja, para supressão do gene FAD2. O vetor é introdu-zido estavelmente na soja (variedade A4922 Asgrow) por intermédio da cepaABI da Agrobacterium tumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6 384 301).

O marcador selecionável CP4 permite que as plantas transformadas de sojasejam identificadas por seleção em meio contendo herbicida com glifosato.

As composições de ácidos graxos são analisadas de sementede linhagens de soja, transformadas com uma construção pMON93759, comcromatografia gasosa conforme descrita no Exemplo 4, visando identificarmetil ésteres de compostos de ácidos graxos extraídos de sementes. Inici-almente, seis sementes Ri, coletadas de plantas de soja transformadas coma construção pMON93759, são colhidas e a composição de ácidos graxosde cada semente é determinada. As plantas Ri de cada evento são separa-das quanto aos transgenes e produzem, por conseguinte, sementes comcomposição convencional de soja, bem como versões modificadas. As se-mentes positivas são reunidas e é feito cálculo da média para cada evento.As médias de positivos reunidos demonstram que as composições de ácidosgraxos mono e poliinsaturados são alteradas no óleo de sementes de linha-gens de soja transgênica, em comparação com aquelas da semente de sojanão transformada (Consultar a Tabela 17). Por exemplo, a supressão deFAD2 fornece plantas com quantidade aumentada de compostos de éster deácido oléico.

Tabela 17. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, re-sultantes de eventos do pMON93759

<table>table see original document page 160</column></row><table>Exemplo 20

A construção pMON97554, conforme descrita no Exemplo 2D, éutilizada para introduzir uma construção formadora de RNA de fita dupla deintron de FAD2-1 na soja, para supressão do gene FAD2. O vetor é introdu-zido estavelmente na soja (variedade A4922 Asgrow) por intermédio da cepaABI da Agrobacterium tumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6 384 301).O marcador selecionável CP4 permite que as plantas transformadas de sojasejam identificadas por seleção em meio contendo herbicida com glifosato.

As composições de ácidos graxos são analisadas de sementede linhagens de soja, transformadas com uma construção pMON97554, comcromatografia gasosa conforme descrita no Exemplo 4, visando identificarmetil ésteres de compostos de ácidos graxos extraídos de sementes. Inici-almente, seis sementes R1, coletadas de plantas de soja transformadas coma construção pMON97554, são colhidas e a composição de ácidos graxosde cada semente é determinada. As plantas Ri de cada evento são separa-das quanto aos transgenes e produzem, por conseguinte, sementes comcomposição convencional de soja, bem como versões modificadas. As se-mentes positivas são reunidas e é feito cálculo da média para cada evento.As médias de positivos reunidos demonstram que as composições de ácidosgraxos mono e poliinsaturados são alteradas no óleo de sementes de linha-gens de soja transgênica, em comparação com aquelas da semente de sojanão transformada (Consultar a Tabela 18). Por exemplo, a supressão deFAD2 fornece plantas com quantidade aumentada de compostos de éster deácido oléico.

Tabela 18. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, re-sultantes de eventos do pMON97554

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Exemplo 21

A construção pMON93771, conforme descrita no Exemplo 2D, éutilizada para introduzir uma construção formadora de RNA de fita dupla deintron de FAD2-1 na soja, para supressão do gene FAD2. O vetor é introdu-zido estavelmente na soja (variedade A4922 Asgrow) por intermédio da cepaABI da Agrobacterium tumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6 384 301).

As composições de ácidos graxos são analisadas de sementede linhagens de soja, transformadas com uma construção pMON93771, comcromatografia gasosa conforme descrita no Exemplo 4, visando identificarmetil ésteres de compostos de ácidos graxos extraídos de sementes. Inici-almente, seis sementes Ri, coletadas de plantas de soja transformadas coma construção pMON93771, são colhidas e a composição de ácidos graxosde cada semente é determinada. As plantas Ri de cada evento são separa-das quanto aos transgenes e produzem, por conseguinte, sementes comcomposição convencional de soja, bem como versões modificadas. As se-mentes positivas são reunidas e é feito cálculo da média para cada evento.

As médias de positivos reunidos demonstram que as composições de ácidosgraxos mono e poliinsaturados são alteradas no óleo de sementes de linha-gens de soja transgênica, em comparação com aquelas da semente de sojanão transformada (Consultar a Tabela 19). Por exemplo, a supressão deFAD2 fornece plantas com quantidade aumentada de compostos de éster deácido oléico.

Tabela 19. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, re-sultantes de eventos do pMON93771

<table>table see original document page 162</column></row><table><table>table see original document page 163</column></row><table>

Exemplo 22

A construção pMON97555, conforme descrita no Exemplo 2D, éutilizada para introduzir uma construção formadora de RNA de fita dupla deintron de FAD2-1 na soja, para supressão do gene FAD2. O vetor é introdu-zido estavelmente na soja (variedade A4922 Asgrow) por intermédio da cepaABI da Agrobacterium tumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6 384 301).O marcador selecionável CP4 permite que as plantas transformadas de sojasejam identificadas por seleção em meio contendo herbicida com glifosato.

As composições de ácidos graxos são analisadas de sementede linhagens de soja, transformadas com uma construção pMON97555, comcromatografia gasosa conforme descrita no Exemplo 4, visando identificarmetil ésteres de compostos de ácidos graxos extraídos de sementes. Inici-almente, seis sementes Ri, coletadas de plantas de soja transformadas coma construção pMON97555, são colhidas e a composição de ácidos graxosde cada semente é determinada. As plantas Ri de cada evento são separa-das quanto aos transgenes e produzem, por conseguinte, sementes comcomposição convencional de soja, bem como versões modificadas. As se-mentes positivas são reunidas e é feito cálculo da média para cada evento.As médias de positivos reunidos demonstram que as composições de ácidosgraxos mono e poliinsaturados são alteradas no óleo de sementes de linha-gens de soja transgênica, em comparação com aquelas da semente de sojanão transformada (Consultar a Tabela 20). Por exemplo, a supressão deFAD2 fornece plantas com quantidade aumentada de compostos de éster deácido oléico.Tabela 20. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, re-sultantes de eventos do pMON97555

<table>table see original document page 164</column></row><table>

Exemplo 23

A construção pMON93760, conforme descrita no Exemplo 2D, éutilizada para introduzir uma construção formadora de RNA de fita dupla deintron de FAD2-1 na soja, para supressão do gene FAD2. O vetor é introdu-zido estavelmente na soja (variedade A4922 Asgrow) por intermédio da cepaABI da Agrobacterium tumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6 384 301).O marcador selecionável CP4 permite que as plantas transformadas de sojasejam identificadas por seleção em meio contendo herbicida com glifosato.

As composições de ácidos graxos são analisadas de sementede linhagens de soja, transformadas com uma construção pMON93760, comcromatografia gasosa conforme descrita no Exemplo 4, visando identificarmetil ésteres de compostos de ácidos graxos extraídos de sementes. Inici-almente, seis sementes Ri, coletadas de plantas de soja transformadas coma construção pMON93760, são colhidas e a composição de ácidos graxosde cada semente é determinada. As plantas Ri de cada evento são separa-das quanto aos transgenes e produzem, por conseguinte, sementes comcomposição convencional de soja, bem como versões modificadas. As se-mentes positivas são reunidas e é feito cálculo da média para cada evento.

As médias de positivos reunidos demonstram que as composições de ácidosgraxos mono e poliinsaturados são alteradas no óleo de sementes de linha-gens de soja transgênica, em comparação com aquelas da semente de sojanão transformada (Consultar a Tabela 21). Por exemplo, intron de FAD2-1com extensão reduzida em 320 nucleotídeos contíguos, a partir da extremi-dade 5' da (SEQ ID NO:1) e capaz de formar dsRNA, suprime pelo menosparcialmente FAD2.

Tabela 21. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, re-sultantes de eventos do pMQN93760

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Exemplo 24

A construção pMON93772, conforme descrita no Exemplo 2D, éutilizada para introduzir uma construção formadora de RNA de fita dupla deintron de FAD2-1 na soja, para supressão do gene FAD2. O vetor é introdu-zido estavelmente na soja (variedade A4922 Asgrow) por intermédio da cepaABI da Agrobacterium tumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6 384 301).O marcador selecionável CP4 permite que as plantas transformadas de sojasejam identificadas por seleção em meio contendo herbicida com glifosato.

As composições de ácidos graxos são analisadas de sementede linhagens de soja, transformadas com uma construção pMON93772, comcromatografia gasosa conforme descrita no Exemplo 4, visando identificarmetil ésteres de compostos de ácidos graxos extraídos de sementes. Inici-almente, seis sementes Ri, coletadas de plantas de soja transformadas coma construção pMON93772, são colhidas e a composição de ácidos graxosde cada semente é determinada. As plantas Ri de cada evento são separa-das quanto aos transgenes e produzem, por conseguinte, sementes comcomposição convencional de soja, bem como versões modificadas. As se-mentes positivas são reunidas e é feito cálculo da média para cada evento.As médias de positivos reunidos demonstram que as composições de ácidosgraxos mono e poliinsaturados são alteradas no óleo de sementes de linha-gens de soja transgênica, em comparação com aquelas da semente de sojanão transformada (Consultar a Tabela 22). Por exemplo, intron de FAD2-1com extensão reduzida em 360 nucleotídeos contíguos a partir da extremi-dade 3' da (SEQ ID NO:1) e capaz de formar dsRNA, suprime pelo menosparcialmente FAD2 de alguns eventos.

Tabela 22. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, re-sultantes de eventos do pMON93772

<table>table see original document page 19</column></row><table><table>table see original document page 167</column></row><table>

Exemplo 25

A construção pMON97556, conforme descrita no Exemplo 2D, éutilizada para introduzir uma construção formadora de RNA de fita dupla deintron de FAD2-1 na soja, para supressão do gene FAD2. O vetor é introdu-zido estavelmente na soja (variedade A4922 Asgrow) por intermédio da cepaABI da Agrobacterium tumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6 384 301).O marcador selecionável CP4 permite que as plantas transformadas de sojasejam identificadas por seleção em meio contendo herbicida com glifosato.

As composições de ácidos graxos são analisadas de sementede linhagens de soja, transformadas com uma construção pMON97556, comcromatografia gasosa conforme descrita no Exemplo 4, visando identificarmetil ésteres de compostos de ácidos graxos extraídos de sementes. Inici-almente, seis sementes Ri, coletadas de plantas de soja transformadas coma construção pMON97556, são colhidas e a composição de ácidos graxosde cada semente é determinada. As plantas R1. de cada evento são separa-das quanto aos transgenes e produzem, por conseguinte, sementes comcomposição convencional de soja, bem como versões modificadas. As se-mentes positivas são reunidas e é feito cálculo da média para cada evento.As médias de positivos reunidos demonstram que as composições de ácidosgraxos mono e poliinsaturados são alteradas no óleo de sementes de linha-gens de soja transgênica, em comparação com aquelas da semente de sojanão transformada (Consultar a Tabela 23). Por exemplo, intron de FAD2-1com extensão reduzida em 200 nucleotídeos contíguos a partir da extremi-dade 3' da (SEQ ID NO:1) e capaz de formar dsRNA, suprime pelo menosparcialmente FAD2 de alguns eventos.

Tabela 23. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, re-sultantes de eventos do pMON97556

<table>table see original document page 168</column></row><table>

Exemplo 26

A construção pMON93764, conforme descrita no Exemplo 2D, éutilizada para introduzir uma construção formadora de RNA de fita dupla deintron de FAD2-1 na soja, para supressão do gene FAD2. O vetor é introdu-zido estavelmente na soja (variedade A4922 Asgrow) por intermédio da cepaABI da Agrobacterium tumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6 384 301).O marcador selecionável CP4 permite que as plantas transformadas de sojasejam identificadas por seleção em meio contendo herbicida com glifosato.

As composições de ácidos graxos são analisadas de sementede linhagens de soja, transformadas com uma construção pMON93764, comcromatografia gasosa conforme descrita no Exemplo 4, visando identificarmetil ésteres de compostos de ácidos graxos extraídos de sementes. Inici-almente, seis sementes R1, coletadas de plantas de soja transformadas coma construção pMON93764, são colhidas e a composição de ácidos graxosde cada semente é determinada. As plantas Ri de cada evento são separa-das quanto aos transgenes e produzem, por conseguinte, sementes comcomposição convencional de soja, bem como versões modificadas. As se-mentes positivas são reunidas e é feito cálculo da média para cada evento.As médias de positivos reunidos demonstram que as composições de ácidosgraxos mono e poliinsaturados são alteradas no óleo de sementes de Iinha-gens de soja transgênica, em comparação com aquelas da semente de sojanão transformada (Consultar a Tabela 24). Por exemplo, intron de FAD2-1com extensão reduzida em 400 nucleotídeos contíguos a partir da extremi-dade 3' da (SEQ ID NO:1) e capaz de formar dsRNA, suprime pelo menosparcialmente FAD2 de alguns eventos.

Tabela 24. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, re-sultantes de eventos do pMON93764

<table>table see original document page 169</column></row><table>Exemplo 27

TaqMan é um ensaio que quantifica ácidos nucléicos por amplifi-cação seletiva e medições de fluorescência em tempo real (também deno-minada PCR em tempo real). Este procedimento é utilizado para determinara extensão da supressão do transcrito visado em sementes transgênicas emdesenvolvimento. Para determinar os níveis absolutos de transcritos do mR-NA-alvo em uma amostra, uma curva-padrão é estabelecida para cada expe-rimento, pela técnica TaqMan. Para essa finalidade, quantidades diferentesde seqüência clonada do gene de soja visado, diluídas em 20 ng de RNAtotal de canola, são amplificadas em paralelo com as amostras de quantida-des alvo desconhecidas. A precisão do número de cópias de transcrito, de-terminada nessa maneira, possui uma margem de erro de 25%.

Para material de modelo, RNA total é extraído com ABI 6100Nucleic Acid Prep Station, e 20 ng são utilizados por amostra de TaqMan. Asamostras são analisadas em um aparelho de Detecção de Seqüência ABI700, empregando ABI Prism-One Step de Química da Mistura Máxima deRT-PCR. Os valores de Contagem de TaqMan (Ct) do final da reação dePCR por TaqMan, são lançados em gráfico contra a quantidade conhecidade seqüência sintética-alvo para calcular uma regressão linear, de forma quea quantidade de DNA alvo de FAD2-1 em uma amostra desconhecida podeser determinado a partir dos valores da Ct de TaqMan no final de cada rea-ção de PCR por TaqMan.

As plantas foram transformadas com pMON68540, pMON68546ou pMON80623, todos os quais suprimem FAD2-1A (consultar a Seção 3A eFigura 7 para descrições das construções).

RNA total é obtido a partir de plantas nulas e transformadas,empregando ABI 6100 Nucleic Acid Prep Station. As plantas transformadassão de terceira geração homozigótica e possuem níveis de ácido oléico aci-ma de 50%. Primers de FAD2-1A, primers de FAD2-1B ou primers de FAD2-2Α são adicionados em amostras separadas de TaqMan, para o RNA total,de cada planta a ser testada. As amostras são analisadas em um aparelhode Detecção de Seqüência ABI 700, empregando ABI Prism-One Step deQuímica da Mistura Máxima de RT-PCR.

Todas as plantas transgênicas suprimem substancialmente ní-veis de transcrito de FAD2-1A e FAD2-1B. Nenhuma das plantas transgêni-cas reduziu até mesmo parcialmente níveis de FAD2-2A ou FAD2-2B.

As comparações entre plantas de níveis de transcrito de FAD2-1A, em plantas nulas, determinam a variação natural entre as plantas. OmRNA de FAD2-1A de sementes em desenvolvimento é analisado empre-gando primers de PCR, os quais produzem a seqüência da Sonda em múlti-plas plantas. Sementes, cujo tamanho é de 0,2 g de peso fresco, são retira-das de quatro plantas separadas nulas de R2 de uma linhagem diferente.Pools de sementes R2 da mesma classe de tamanho e de quatro grupos se-parados diferentes nulos são testados. As reações da PCR são efetuadasem triplicata e os resultados, normalizados em comparação com a quantida-de RNA de 18S em cada amostra. A variabilidade biológica entre plantas emtermos de transcritos de FAD2-1A, é baixa. Três das quatro amostras pos-suem valor normalizado de Contagem de TaqMan (Ct) de aproximadamente65, e uma das amostras possui valor normalizado de TaqMan Ct de aproxi-madamente 50.

Exemplo 28

Um fragmento da seqüência com 200 nucleotídeos contíguos dointron 1 de FAD2-1 (SEQ ID NO: 1) é amplificada por PCR para que resul-tem produtos por PCR que incluam os primeiros 200 nucleotídeos da SEQID NO: 1, iniciando na extremidade 5' da SEQ ID NO: 1. Os produtos daPCR são clonados diretamente, em orientação sense, em um vetor contendoo promotor 7Soc' de soja e seqüência de terminação tml 3', por intermédiodos sítios de Xho\, construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. O ve-tor é cortado, em seguida, com uma enzima de restrição e ligado em um ve-tor que contém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e uma se-qüência de terminação 3' da ervilha Rubisco E9. A construção resultante deexpressão gênica é utilizada para transformação empregando os métodosdescritos nesta exposição.

As composições de ácidos graxos são analisadas de sementede linhagens de soja, transformadas com esta construção, com cromatogra-fia gasosa conforme descrita no Exemplo 4, visando identificar metil ésteresde compostos de ácidos graxos extraídos de sementes. Inicialmente, seissementes R1, coletadas de plantas de soja transformadas com esta constru-ção, são colhidas e a composição de ácidos graxos de cada semente é de-terminada. As plantas Ri de cada evento são separadas quanto aos trans-genes e produzem, por conseguinte, sementes com composição convencio-nal de soja, bem como versões modificadas. As sementes positivas são reu-nidas e é feito cálculo da média para cada evento. As médias de positivosreunidos demonstram que as composições de ácidos graxos saturados sãoalteradas no óleo de sementes de linhagens de soja transgênica, em compa-ração com aquelas da semente de soja não transformada.

Exemplo 29

Um fragmento da seqüência com 180 nucleotídeos contíguos dointron 1 de FAD2-1 (SEQ ID NO: 1) é amplificada por PCR para que resul-tem produtos por PCR que incluam os primeiros 180 nucleotídeos da SEQID NO: 1, iniciando na extremidade 3' da SEQ ID NO: 1. Os produtos daPCR são clonados diretamente, em orientação sense, em um vetor contendoo promotor 7Soc' de soja e seqüência de terminação tml 3', por intermédiodos sítios de restrição, construídos nas extremidades 5' dos primers PCR. Ovetor é cortado, em seguida, com uma enzima de restrição e ligado em umvetor que contém o gene CP4 EPSPS, regulado pelo promotor FMV e umaseqüência de terminação 3' da ervilha Rubisco E9. A construção resultantede expressão gênica é utilizada para transformação empregando os méto-dos descritos nesta exposição.

Exemplo 30

O pMON97562 contém um promotor 7Sa' de soja ligado opera-cionalmente a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em100 nucleotídeos contíguos a partir da extremidade 3' e ligado a uma 5' UTRde FAD3-1A, seguido por uma 3' UTR de FAD3-1A, ligado a uma 5'UTR deFAD3-1B, seguido por uma 3' UTR de FAD3-1B, seguido por uma 5' UTR deFATB-la, seguido por uma 3' UTR de FATB-la, ligada operacionalmente a70 nucleotídeos do intron 4 de FAD3-1A, ligado operacionalmente a uma 3'UTR de FATB-la em orientação antisense, seguida seguida por uma 5' UTRem orientação antisense de FATB-la, ligada a uma 3' UTR de FAD3-1B emantisense, seguida por uma 5' UTR de FAD3-1B em antisense, ligada a uma3' UTR de FAD3-1A em antisense, seguida por uma 5' UTR de FAD3-1A emantisense, seguido por um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), re-duzido em 100 nucleotídeos contíguos desde a extremidade 3' e em orienta-ção antisense, ligado operacionalmente a um segmento de poliadenilaçãoH6 3' com um gene CP4 EPSPS, ligado operacionalmente a um promotorEFMV e seqüência de terminação 3' da ervilha Rubisco E9, todos flanquea-dos por RB e LB na mesma molécula de DNA. A construção resultante deexpressão gênica é utilizada para transformação de soja, empregando osmétodos descritos nesta exposição. As composições de ácidos graxos sãodeterminadas a partir da semente de linhagens de soja transformadas comesta construção, empregando cromatografia gasosa, conforme descrita noExemplo 5. A Tabela 25 fornece composições de sementes representativas.O nível de 18:3 é reduzido em aproximadamente 1%.

Tabela 25. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, re-sultantes de eventos do pMON97562

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Exemplo 31

O pMON97563 contém um promotor 7Scx' de soja ligado opera-cionalmente a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em100 nucleotídeos contíguos a partir da extremidade 3' e ligado a uma 5' UTRde FAD3-1A, seguida por uma 3' UTR de FAD3-1A, ligada a uma 5' UTR deFAD3-1B, seguida por uma 3' UTR de FAD3-1B, ligada a uma 5' UTR deFAD3-1C, seguida por uma 3' UTR de FAD3-1C, seguida por uma regiãocodificadora de CTP de FATB-1a, seguida por uma região codificadora deCTP de FATB-2a, ligada operacionalmente a 70 nucleotídeos do intron 4 deFAD3-1A, ligado operacionalmente a uma região codificadora de CTP deFATB-2a em orientação antisense, seguida por uma região codificadora deCTP de FATB-Ia em orientação antisense, ligada a uma 3' UTR em antisen-se de FAD3-1C, seguida por uma 5' UTR em antisense de FAD3-1C, ligadaa uma 3' UTR em antisense de FAD3-1B, seguida por uma 5' UTR em anti-sense de FAD3-1B, ligada a uma 3' UTR em antisense de FAD3-1A, seguidapor uma 5' UTR em antisense de FAD3-1A, seguida por intron 1 de FAD2-1Ade soja (SEQ ID NO: 1), reduzido em 100 nucleotídeos contíguos desde aextremidade 3' e em orientação antisense, ligado operacionalmente a umsegmento de poliadenilação H6 3' com um gene CP4 EPSPS, ligado opera-cionalmente a um promotor EFMV e seqüência de terminação 3' da ervilhaRubisco E9, todos flanqueados por RB e LB na mesma molécula de DNA. Aconstrução resultante de expressão gênica é utilizada para transformação deplantas, empregando os métodos descritos nesta exposição. As composi-ções de ácidos graxos são determinadas a partir da semente de linhagensde soja transformadas com esta construção, empregando cromatografia ga-sosa, conforme descrita no Exemplo 5. A Tabela 26 fornece composições desementes representativas. O nível de 18:3 é reduzido em aproximadamente 1%.

Tabela 26. Composição de ácidos graxos de sementes isoladas de R1, re-sultantes de eventos do pMON97563

<table>table see original document page 175</column></row><table>

Todas as composições e/ou métodos expostos e reivindicadosneste pedido podem ser feitas e executadas sem experimentação indevida,a lúz da presente exposição. Embora as composições e métodos desta in-venção tenham sido descritos em termos de concretizações preferidas, setornará evidente para especialistas na técnica que variações poderão seraplicadas às composições e/ou métodos e nas etapas ou na seqüência deetapas do método aqui descrit, sem que se distanciam do conceito, espírito ealcance da invenção. Mais especificamente, se tornará evidente que certosagentes que são química e fisiologicamente relacionados, podem ser substi-tuídos pelos agentes aqui descritos, enquanto os mesmos e semelhantesresultados seriam atingidos. Todas estas substituições e modificações seme-lhantes, evidentes para especialistas na técnica, são consideradas incluídasno espírito, alcance e conceito da invenção, conforme definidos pelas reivin-dicações anexadas.

Claims

1. Semente de soja exibindo uma composição de ácidos graxoscujo óleo da semente compreende teor de ácido oléico de aproximadamente 42% a aproximadamente 85% por peso dos ácidos graxos totais, e teor deácidos graxos saturados inferior a 8% por peso dos ácidos graxos totais.

2. A semente de soja da reivindicação 1, em que a referida se-mente compreende ainda um genoma com uma seqüência de ácido nucléicoque suprime a expressão de FAD2-1 e FATB endógeno de soja, em que areferida seqüência de ácido nucléico compreende um fragmento de intron deFAD2-1 de soja, cuja extensão inclui entre aproximadamente 20 e aproxima-damente 420 nucleotídeos, e um fragmento de gene FATB de soja, cuja ex-tensão inclui entre aproximadamente 40 a aproximadamente 450 nucleotí-deos; e o referido genoma compreende ainda uma seqüência de ácido nu-cléico que aumenta a expressão de beta-cetoacil-ACP sintase IV ou de del-ta-9 dessaturase, ou de ambas.

3. A semente de soja da reivindicação 2, em que o referidofragmento de intron de FAD2-1 de soja e o referido fragmento de FATB desoja são, cada um, transcrito em orientações sense e antisense, resultandoem RNA, pelo menos, em parte de dupla fita.

4. A semente de soja da reivindicação 2, em que a referida se-qüência de ácido nucléico que suprime a expressão de FAD2-1 e FATB en-dógeno de soja é montada como uma unidade funcional de transcrição, apósinserção em um cromossomo de planta.

5. A semente de soja da reivindicação 1, em que a referida se-mente compreende ainda um genoma com seqüência de ácido nucléico in-cluindo um fragmento de intron de FAD2-1 de soja, cuja extensão é entreaproximadamente 20 e aproximadamente 420 nucleotídeos contíguos, e umfragmento do gene de FATB de soja, cuja extensão é entre aproximadamen-te 40 a aproximadamente 450 nucleotídeos contíguos.

6. A semente de soja da reivindicação 5, em que o referidofragmento de intron de FAD2-1 de soja e o referido fragmento de FATB desoja são, cada um, transcrito em orientações sense e antisense, resultandoem RNA1 pelo menos, em parte de dupla fita.

7. A semente de soja da reivindicação 5, em que a referida se-qüência de ácido nucléico é montada como uma unidade funcional de trans-crição, após inserção em um cromossomo de planta.

8. A semente de soja da reivindicação 1, em que a referida se-mente compreende ainda um genoma com uma seqüência de ácido nucléicoque suprime a expressão de FAD2-1 endógeno de soja, compreendendo umfragmento de intron de FAD2-1 de soja, cuja extensão é entre aproximada-mente 20 e aproximadamente 420 nucleotídeos; e o referido genoma com-preende ainda uma seqüência de ácido nucléico que aumenta a expressãode beta-cetoacil-ACP sintase IV ou delta-9 dessaturase, de ambas.

9. Método de redução do nível de supressão do gene FAD2 emrelação ao nível de supressão do gene FAD2, obtida por expressão de umaconstrução de dsRNAi com uma seqüência de FAD2 heteróloga, consistindoem um intron completo de FAD2 ou uma UTR completa de FAD2, o métodopor:i) expressão de uma seqüência de FAD2 heterólogo em umacélula vegetal, em que a referida seqüência de FAD2 heterólogo é derivadade um gene FAD2 endógeno em célula vegetal e consiste em um fragmentode intron de FAD2 ou um fragmento de UTR de FAD2, e ii) supressão de umgene FAD2 endógeno com a referida seqüência de FAD2 heterólogo, emque o nível de supressão do gene FAD2 é menor do que o nível de expres-são do gene, obtida por expressão de uma seqüência de FAD2 heterólogo,consistindo na extensão completa de um intron de FAD2 ou a extensãocompleta de uma UTR de FAD2.

10. Ó método da reivindicação 9, em que o referido fragmentode intron de FAD2 possui entre aproximadamente 40 e 320 nucleotídeoscontíguos de um intron 1 completo de FAD2 e o referido fragmento de UTRde FAD2 possui de aproximadamente 100 a aproximadamente 140 nucleotí-deos contíguos de toda 3' UTR de FAD2.

11. Método para se alterar a composição do óleo de uma plantavegetal, compreendendo:transformação de uma célula vegetal com uma seqüência deFAD2 heterólogo, derivado de parte de um gene FAD2 endógeno, em que areferida seqüência de FAD2 heterólogo consiste em um fragmento de intronde FAD2 ou fragmento de UTR de FAD2, e desenvolvimento da referida cé-lula vegetal, sob condições em que a transcrição da referida seqüência deFAD2 heterólogo é iniciada, pela qual a referida composição do óleo é alte-rada, em relação a uma célula vegetal com antecedente genético semelhan-te, porém desprovida da referida seqüência de FAD2 heterólogo.

12. Método para aumentar o teor de ácido oléico e reduzir o teorde ácidos graxos saturados em uma semente de planta, compreendendo:i) encurtamento da extensão de uma primeira seqüência deFAD2 heteróloga até que o nível de supressão do gene FAD2 de uma plantatransformada com a referida primeira seqüência de FAD2 heteróloga seja,pelo menos, parcialmente reduzida em relação ao nível de supressão dogene FAD2, em uma célula vegetal com antecedente genético semelhante, euma segunda seqüência de FAD2 heteróloga, em que a referida segundaseqüência de FAD2 heteróloga consiste em mais seqüência do FAD2 endó-geno do que a referida primeira seqüência de FAD2 heteróloga; ii) expressãode uma seqüência de FATB heteróloga capaz de, pelo menos, reduzir a ex-pressão do gene da FATB em uma planta vegetal, em relação à supressãode FATB em uma célula vegetal com antecedente genético semelhante, po-rém sem a referida seqüência de FATB heteróloga; iii) desenvolvimento deuma planta com um genoma contendo a referida primeira seqüência deFAD2 heteróloga e a referida seqüência de FATB heterólogo; e iv) cultivo deuma planta que produz semente com um teor reduzido de ácidos graxos sa-turados em relação à semente de uma planta com antecedente genéticosemelhante, porém desprovida da referida primeira seqüência de FAD2 he-teróloga e da referida seqüência de FATB heteróloga.

13. Método de modular a composição de ácidos graxos do óleode uma semente de cultura de semente oleaginosa de clima temperado,compreendendo o isolamento de um fragmento de elemento genético de,pelo menos, 40 nucleotídeos em extensão, capaz de suprimir a expressãode um gene endógeno na via da síntese de ácidos graxos; introdução doreferido elemento genético em uma célula vegetal da referida cultura de se-mente oleaginosa de clima temperado; produção de uma planta transgênica;e seleção de uma semente de planta transgênica, compreendendo o referidoelemento genético que modula a composição de ácidos graxos do óleo dareferida semente.

14. O método da reivindicação 13, em que o referido gene endó-geno é dois ou mais genes endógenos na via da síntese de ácidos graxos.

15. O método da reivindicação 13, em que o referido elementogenético é selecionado do grupo constituído por intron, exon, seqüência deDNA de codificação de peptídeo de trânsito, 3'UTR, 5' UTR, cadeia de leituraaberta ou transcrito do referido gene endógeno na via da síntese de ácidosgraxos.

16. O método da reivindicação 13, em que o referido gene endó-geno é selecionado do grupo constituído por FAD2-1, FAD3, FATB e combi-nações destes.

17. O método da reivindicação 13, em que a referida cultura desemente oleaginosa de clima temperado é selecionada do grupo constituídopor soja, canola, girassol, amendoim, milho e algodão.

18. Célula de uma semente de soja exibindo uma composiçãode ácidos graxos cujo óleo da semente compreende teor de ácido oléico deaproximadamente 42% a aproximadamente 85% por peso dos ácidos graxostotais, e teor de ácidos graxos saturados inferior a 8% por peso dos ácidosgraxos totais.

19. Molécula de ácido nucléico recombinante, compreendendoum fragmento de intron de FAD2-1 de soja, cuja extensão é entre aproxima-damente 20 e aproximadamente 420 nucleotídeos contíguos, e um fragmen-to do gene FATB de soja, cuja extensão é entre aproximadamente 40 e a-proximadamente 450 nucleotídeos contíguos.

20. Molécula de ácido nucléico recombinante, compreendendouma seqüência de ácido nucléico com um fragmento de intron de FAD2-1 desoja, cuja extensão é entre aproximadamente 20 e aproximadamente 420nucleotídeos, um fragmento do gene FA TB de soja, cuja extensão é entreaproximadamente 40 a aproximadamente 450 nucleotídeos, e uma seqüên-cia de ácido nucléico que aumenta a expressão de beta-cetoacil-ACP sinta-se IV ou delta-9 dessaturase ou de ambas.

21. Óleo sem mistura de semente de soja com composição deácidos graxos compreendendo teor de ácido oléico de aproximadamente 42% a aproximadamente 85% por peso dos ácidos graxos totais, e teor deácidos graxos saturados inferior a 8% por peso dos ácidos graxos totais.

22. Alimento de soja, derivado de uma semente de soja exibindouma composição de ácidos graxos cujo óleo da semente compreende teorde ácido oléico de aproximadamente 42% a aproximadamente 85% por pesodos ácidos graxos totais, e teor de ácidos graxos saturados inferior a 8% porpeso dos ácidos graxos totais.

23. Método de diminuição de teor de ácido linolênico de umasemente de soja, compreendendo:i) introdução em uma célula de soja de uma molécula de á-cido nucléico heteróloga, compreendendo uma seqüência de ácido nucléicocom, pelo menos, dois membros da família do gene FAD3\ii) expressão de uma seqüência de ácido nucléico de umgene FAD3, capaz de reduzir, pelo menos, parcialmente a expressão gênicade FAD3 endógeno em uma célula vegetal;iii) desenvolvimento de uma célula vegetal, compreendendoum genoma com a referida seqüência de ácido nucléico de, pelo menos,dois membros da referida família do gene FAD3\ eiv) cultivo da referida célula vegetal com teor reduzido deácido linolênco, em relação a uma célula vegetal com antecedente genéticosemelhante, porém desprovida dos referidos, pelo menos, dois membros dareferida família do gene FAD3.

24. O método da reivindicação 23, em que a referida família dogene FAD3 é selecionado do grupo constituído por FAD3-1A, FAD3-1B eFAD3-1C.

25. O método da reivindicação 23, em que os referidos fragmen-tos de DNA são a 5' ou 3'-UTR de uma região transcrita do FAD3.

26. Uma construção de DNA recombinante, compreendendofragmentos de DNA de, pelo menos, dois membros da família do geneFAD3.

27. A construção do DNA recombinante da reivindicação 26,compreendendo ainda um fragmento de intron de FAD2-1 de soja, cuja ex-tensão é entre aproximadamente 20 e aproximadamente 420 nucleotídeoscontíguos, e um fragmento do gene FATB de soja, cuja extensão é entreaproximadamente 40 e aproximadamente 450 nucleotídeos contíguos.

28. Óleo sem mistura de semente de soja com composição deácidos graxos compreendendo teor de ácido oléico de aproximadamente-42% a aproximadamente 85% por peso dos ácidos graxos totais, e teor deácidos graxos saturados inferior a 8% por peso dos ácidos graxos totais, eteor de ácido linolênico de aproximadamente 1,5% ou menos por peso dosácidos graxos totais.

29. Semente de soja compreendendo a construção de DNA re-combinante da reivindicação 26.

30. Alimento de soja derivado da semente de soja da reivindica-ção 29.