BRPI0707796A2 - formulaÇço, e, mÉtodo de tratamento - Google Patents

Abstract

FORMULAÇçO, E, METODO DE TRATAMENTO A presente invenção provê formulações e métodos para a estabilização de anticorpos. Em uma forma de realização, a invenção provê a formulação estável de anticorpos que são propensos à fragmentação não enzimática na região da articulação. Em uma outra forma de realização, a invenção provê métodos de estabilização de anticorpos compreendendo a liofihização de uma formulação aquosa de um anticorpo. As formulações podem ser liofilizadas para estabilizar os anticorpos durante o processamento e armazenamento, e então as formulações podem ser reconstituidas para administração farmacêutica. Em uma forma de realização, a presente invenção provê métodos de estabilização de anticorpos anti-VEGFR compreendendo a liofilização de uma formulação aquosa de um anticorpo anti-VEGFR. As formulações podem ser liofilizadas para estabilizar os anticorpos anti-VEGFR durante o processamento e armazenamento, e então as formulações podem ser reconstituidas para administração farmacêutica.

Description

"FORMULAÇÃO, Ε, MÉTODO DE TRATAMENTO"REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade para pedido US 60/774 101,depositado em 15 de fevereiro de 2006, que é incorporado aqui por referênciaem sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção é dirigida a formulações e métodos para aestabilização de anticorpos. Em uma forma de realização, a invenção provêformulações e métodos para estabilizar anticorpos que são propensos a umaclivagem não enzimática na região de gancho. Mais particularmente, estainvenção refere-se a uma formulação de anticorpos que são propensos a umaclivagem não enzimática na região de gancho com um tampão e umlioprotetor. Em outra forma de realização, a invenção provê métodos eformulações para a estabilização de anticorpos anti-VEGFR.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os anticorpos em formulações líquidas são suscetíveis a umavariedade de processos químicos e físicos incluindo hidrólise, agregação,oxidação, desamidação e fragmentação na região de gancho. Estafragmentação é um processo não enzimático que pode ser dependente detemperatura e/ou pH, e tipicamente ocorre na região de gancho de cadeiapesada próxima do sítio de clivagem de papaína. Estes processos podemalterar ou eliminar a eficácia clínica de anticorpos terapêuticos por diminuiçãoda disponibilidade de anticorpos funcionais e por redução ou eliminação desuas características de ligação de antígenos. A presente invenção dirige-se ànecessidade de formulações estáveis de anticorpos monoclonais,especialmente os que são propensos a clivagem não enzimática na região degancho e ainda prove um método e formulação para a liofilização destesanticorpos.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃOA presente invenção é dirigida a formulações e métodos para aestabilização de preparações de anticorpos. Além disso, a presente invenção édirigida também a formulações e métodos para a estabilização de anticorposque são propensos a clivagem não enzimática particularmente na região degancho.

Em uma forma de realização, a invenção provê umaformulação estável compreendendo um anticorpo que é propenso a clivagemnão enzimática, e um tampão. A formulação também pode conter um ou maisagentes estabilizantes.Além disso, a formulação pode conter um tensoativo.

Em outra forma de realização, a invenção provê umaformulação que é compatível com a liofilização e pode conter um lioprotetor.

Em outra forma de realização, a invenção provê umaformulação liofilizada compreendendo um anticorpo que é propenso àclivagem não enzimática, um tampão histidina, e um açúcar lioprotetor.

Em outra forma de realização, a presente invenção provêmétodos de estabilização de anticorpos que são propensos à clivagem nãoenzimática, compreendendo a formulação em um tampão histidina e umaçúcar lioprotetor. Além disso, a formulação pode conter um tensoativo. Asformulações podem ser liofilizadas para estabilizar os anticorpos durante oprocessamento e armazenamento, e então as formulações podem serreconstituídas para administração farmacêutica. Em outra forma de realização,os anticorpos reconstituídos podem ser usados em um formato de múltiplasdoses.

Em uma forma de realização, a invenção provê umaformulação liofilizada estável compreendendo um anticorpo anti-VEGFR, umtampão, e um lioprotetor. A formulação também pode conter um ou maisagentes estabilizantes. Além disso, a formulação pode conter um tensoativo.

Em outra forma de realização, a invenção provê umaformulação liofilizada estável compreendendo um anticorpo anti-VEGFR2,um tampão, e um lioprotetor. A formulação também pode conter um ou maisagentes estabilizantes. Além disso, a formulação pode conter um tensoativo

Em outra forma de realização, a invenção provê umaformulação liofilizada compreendendo um anticorpo anti-VEGFR2, umtampão histidina e um açúcar lioprotetor.

Em outra forma de realização, a presente invenção provêmétodos de estabilização de anticorpos anti-VEGFR compreendendo liofilizaruma formulação aquosa de um anticorpo anti-VEGFR. As formulaçõespodem ser liofilizadas para estabilizar os anticorpos anti-VEGFR durante oprocessamento e o armazenamento, e então as formulações podem serreconstituídas para administração farmacêutica.

Em outra forma de realização, a presente invenção provê ummétodo de inibir a atividade de VEGFR ao prover uma composição dapresente invenção. A presente invenção também provê um método de inibir avia VEGF em mamíferos, particularmente humanos, compreendendo aadministração de uma composição da presente invenção. A presente invençãotambém provê um método para tratar condições dependentes de VEGFRcompreendendo a administração de uma composição da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 mostra um cromatograma de cromatografia deexclusão de tamanho- cromatografia de líquido de desempenho elevado(SEC-HPLC) do anticorpo IMC-1121B em PBS após 3 meses de incubação a 40°C

Figura 2 mostra a seqüência de aminoácido para a cadeiapesada de IMC- 112 IB, e os sítios onde clivagem não enzimática ocorre.

Figura 3 mostra SDS-PAGE de IMC-112IB degradado e suasfrações de exclusão de tamanho.

Figura 4 mostra um gráfico de regressão para análise DSC deIMC-1121B.Figura 5 mostra um perfil de previsão para um estudo deagitação.

Figura 6 mostra um perfil de previsão de tempo real,estabilidade em temperatura acelerada de IMC-112IB a 40°C

Figura 7 mostra um perfil de previsão de real-time aceleradatemperatura estabilidade de IMC-112 IB a -20°C.

Figura 8 é cromatograma de SEC-HPLCof IMC-112IB apósincubação para 150 dias a 40°C e a temperatura ambiente em PBS e 10 mMtampão histidina (pH 6,0).

Figura 9 mostra a variação de porcentagem de monômero deIMC-112IB em PBS e 10 mM tampão histidina (pH 6,0) como uma função detempo de incubação a 40°C e temperatura ambiente.

Figura 10 mostra a variação de porcentagem de agregado deIMC-1121B em PBS e 10 mM tampão histidina (pH 6,0) como uma função detempo de incubação a 40°C e temperatura ambiente.

Figura 11 mostra a variação de porcentagem de agentedegradante de IMC- 1121 B em PBS e 10 mM tampão histidina (pH 6,0)como uma função de tempo de incubação a 40°C e temperatura ambiente.

Figura 12 é um cromatograma de SEC-HPLC de IMC-112IBapós 30 e 150 dias de incubação a RT e 40°C.

Figura 13 mostra SDS-PAGE redutor e não redutor de IMC-1121B em PBS e 10 mM tampão histidina (pH 6,0) após 150 dias deincubação a RT e 40°C.

Figura 14 mostra focalização isoelétrica de IMC-112 IB após150 dias de incubação a RT e 40°C

Figura 15 mostra o ciclo de secagem por congelamento paraprocesso de liofilização IMC-112 IB

Figura 16 mostra a porcentagem de monômeros restantes emprodutos liofilizados IMC-112IB após 100 dias de incubação a 40°C e 50°C.Figura 17 mostra a porcentagem de monômeros restantes emIMC-112IB em formulações liofilizadas e em solução como uma função detempo de incubação a 5O°C .

Figura 18 mostra a porcentagem de agregados para IMC- 1121B em formulações liofilizadas e em solução como uma função de tempo deincubação a 5O°C .

Figura 19 mostra a porcentagem de agentes degradantes paraBVIC-112IB em formulações liofilizadas e em solução como uma função detempo de incubação a 5O°C

Figura 20 mostra a porcentagem de monômeros restantes paraIMC-112 IB em formulações liofilizadas e em solução como uma função detempo de incubação a 40°C.

Figura 21 mostra a porcentagem de agregados para IMC-112IB em formulações liofilizadas e em solução como uma função de tempode incubação a 40°C.

Figura 22 mostra a porcentagem de agentes degradantes paraIMC-112 IB em formulações liofilizadas e em solução como uma função detempo de incubação a 40°C.

Figura 23 mostra a porcentagem de monômeros restantes paraIMC-112 IB liofilizado e formulado em solução após incubação a 50°C.

Figura 24 mostra a porcentagem de agregado para IMC-112IBliofilizado e formulado em solução após incubação a 5O°C .

Figura 25 mostra a porcentagem de agente degradante paraIMC-112IB liofilizado e formulado em solução após incubação a 50°C.

Figura 26 mostra a porcentagem de monômeros restantes paraIMC-112 IB liofilizado e formulado em solução após incubação a 40°C.

Figura 27 mostra a porcentagem de agregado para IMC-112IBincubado a 40°C em formulações em solução e secadas por congelamento.

Figura 28 mostra a porcentagem de agente degradante paraIMC-112IB liofilizado e formulado em solução após incubação a 40°C.

Figura 29 é cromatograma de SEC-HPLC de IMC- 1121 Bincubado para 3 meses a 40°C em formulações em solução e secadas porcongelamento.

Figura 30 mostra a porcentagem de monômeros restantes paraIMC-112 IB liofilizado e formulado em solução após temperatura ambienteincubação.

Figura 31 mostra a porcentagem de agregados para IMC-1121B liofilizado e formulado em solução após incubação em temperaturaambiente.

Figura 32 mostra a porcentagem de agentes degradantes para112IB liofilizado e formulado em solução após incubação em temperaturaambiente.

Figura 33 é um cromatograma de SEC-HPLC de IMC-112IBem formulações em solução e secadas por congelamento após incubação atemperatura ambiente para 3 meses.

Figura 34 mostra SDS-PAGE redutor de IMC-112IB emformulações em solução e secadas por congelamento após incubação atemperatura ambiente, 40°C e 50°C para 3 meses.

Figura 35 mostra SDS-PAGE não redutor de IMC-112IB emformulações em solução e secadas por congelamento após incubação atemperatura ambiente, 40°C e 50°C durante 3 meses.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção provê formulações para a secagem porcongelamento de anticorpos, incluindo fragmentos funcionais dos mesmos,que são propensos à clivagem não enzimática. As formulações podemcompreender elementos adicionais como agentes estabilizantes, tensoativos,agentes redutores, veículos, conservantes, aminoácidos e agentes quelantes. Apresente invenção também provê métodos de estabilizar uma composição deanticorpo compreendendo liofilizar uma formulação aquosa de um anticorpoem na presença de um lioprotetor. As formulações podem ser liofilizadas paraestabilizar os anticorpos durante processamento e armazenamento e entãoreconstituída antes da administração farmacêutica. Preferivelmente, oanticorpo substancialmente retém sua estabilidade física e química eintegridade da produção até a administração. Vários componentes deformulação podem ser apropriados para melhorar a estabilidade de acordocom a presente invenção, incluindo tampões, tensoativos, açúcares, álcoois deaçúcar, derivados de açúcar e aminoácidos. Várias propriedades daformulação podem ser apropriadas para melhorar a estabilidade de acordocom a presente invenção, incluindo pH e concentração de componentes daformulação.

De acordo com a presente invenção, um tampão pode serusado para manter o pH da formulação. O tampão minimiza flutuações em pHdevido a variações externas. As formulações da presente invenção contém umou mais tampões para prover as formulações em um pH apropriado,preferivelmente cerca de 5,5 a cerca de 6,5, e mais preferivelmente cerca de6,0. Exemplares tampões incluem, mas não são limitados a tampõesorgânicos, geralmente, como histidina, citrato, malato, tartarato, succinato, eacetato. Em uma forma de realização, a concentração do tampão é cerca de 5mM a cerca de 50 mM. Em forma de realização a concentração de tampão écerca de 10 mM.

As formulações da presente invenção podem conter um oumais agentes estabilizantes, que podem ajudar a evitar agregação edegradação de anticorpos. Os agentes estabilizantes apropriados incluem, masnão são limitados a açúcares poliídricos, álcoois de açúcar, derivados deaçúcar, e aminoácidos. Os agentes estabilizantes preferidos incluem, mas nãosão limitados a ácido aspártico, ácido lactobiônico, glicina, trealose, manitol,e sacarose.As formulações da presente invenção podem conter um oumais tensoativos. As soluções de anticorpo tem uma tensão superficialelevada na interface ar água. A fim de reduzir esta tensão superficial,anticorpos tendem a se agregar na interface ar - água. Um tensoativominimiza agregação de anticorpos na interface ar - água, assim ajudando amanter a atividade biologia do anticorpo em solução. Por exemplo, adição de0,01%. Tween 80 pode reduzir a agregação de anticorpo em solução. Quandoa formulação é liofilizada, o tensoativo pode também reduzir a formação departiculados na formulação reconstituída. Em uma formulação liofilizada dapresente invenção, o tensoativo pode ser adicionado a uma ou mais dasformulações pré-liofilizadas, a formulação liofilizada, e a formulaçãoreconstituída, mas preferivelmente a formulação pré-liofilizada. Por exemplo0,005% Tween 80 pode ser adicionado à solução de anticorpo antes daliofilização. Tensoativos incluem, mas não são limitados a Tween 20, Tween80, Pluronic. F-68, e sais de bile. Em forma de realização, a concentração detensoativos é de cerca de 0,001% a cerca de 1,0%.

O processo de liofilização pode gerar várias tensões quepodem desnaturar a proteínas ou polipeptídeos. Estas tensões incluemdiminuição da temperatura, formação de cristal de gelo, aumento daresistência iônica, mudanças de pH, separação de fase, remoção de envoltóriode hidratação, e mudanças na concentração. Os anticorpos que são sensíveisàs tensões do congelamento e/ou processo de secagem podem serestabilizados por adição de um ou mais lioprotetores. Um lioprotetor é umcomposto que protege contra as tensões associadas com liofilização. Assim,os lioprotetores como uma classe incluem crioprotetores, que apenasprotegem do processo de congelamento. Um ou mais lioprotetores podem serusados para proteger das tensões associadas com a liofilização e podem ser,por exemplo, um açúcar como sacarose, ou trealose; um aminoácido comoglutamato de monossódio ou histidina; a metilamina como betaína, um salliotrópico como sulfato de magnésio, um poliol como álcoois triídricos ou deaçúcar superior, por exemplo glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol,sorbitol, e manitol; propileno glicol; polietileno glicol; Pluronics; ecombinações dos mesmos. Exemplos de lioprotetores preferidos incluem, masnão são limitados a agentes estabilizantes e tensoativos como descrito acima.

A presente invenção provê formulações estabilizadas, quepodem ser preparadas através do processo de liofilização. Liofilização é umprocesso estabilizante em que uma substância é primeiro congelada e então aquantidade de solvente é reduzida, primeiro por sublimação (o processo desecagem primário) e então dessorção (processo de secagem secundário) emvalores que não irão mais suportar a atividade biológica ou as reaçõesquímicas. Em uma formulação liofilizada, as reações de hidrólise, desamidação, oxidação e fragmentação associadas com soluções podem serevitadas ou retardadas de modo significante. A formulação liofilizada podetambém evitar dano devido a flutuações de temperatura a curto prazo durantea expedição e permitir armazenamento em temperatura ambiente. Asformulações da presente invenção também podem ser secadas por outrosmétodos conhecidos na técnica como secagem por pulverização e secagempor borbulhamento. Salvo especificado em contrário, as formulações dapresente invenção são descritas em termos de suas concentrações decomponente como medido na formulação antes da liofilização.

Em uma forma de realização, a presente invenção provêmétodos e formulações para estabilizar anticorpos que são propensos adegradação não enzimática, que pode ocorrer na região de gancho. Os fatoresque podem predispor um anticorpo a clivagem não enzimática incluemseqüência de aminoácidos, conformação e processamento pós-translacional. Adeterminação quem um anticorpo sofre clivagem não enzimática pode serobtida por incubação de anticorpo em uma solução aquosa. Tipicamente, aincubação é realizada em temperaturas elevadas para encurtar a duração doestudo. Por exemplo, incubação durante 3 meses a 40°C ou 50°C. Após aincubação, os produtos de degradação podem ser analisados usandocromatografia de exclusão de tamanho - cromatografia de líquido dedesempenho elevado (SEC-HPLC).

Várias técnicas analíticas conhecidas na técnica podem medira estabilidade do anticorpo de uma formulação liofilizada reconstituída. Estastécnicas incluem, por exemplo, determinar (i) estabilidade térmica usandocalorimetria de varredura diferencial (DSC) para determinar a temperatura defusão média (Tm); (ii) estabilidade mecânica usando agitação controlada atemperatura ambiente; (iii) estabilidade em temperatura acelerada isotérmicaem tempo real a temperaturas de cerca de -20°C, cerca de 4°C, temperaturaambiente (cerca de 23°C-27°C), cerca de 40°C, e cerca de 50°C; (iv)turvações da solução por monitoração da absorbância a cerca de 350 nm e (v)a quantidade de monômero, agregados e agentes degradantes usando SEC-HPLC. Estabilidade pode ser medida em uma temperatura selecionadadurante um período de tempo selecionado.

Em uma forma de realização, a formulação liofilizada provêuma concentração elevada do anticorpo na reconstituição. Em uma outraforma de realização, a formulação liofilizada estável é reconstituível com umlíquido para formar uma solução com uma concentração de anticorpo de cercade 1-10 vezes maior do que a concentração de anticorpo da formulação antesda liofilização. Por exemplo, em uma forma de realização, a formulaçãoliofilizada é reconstituída com 1 mL de água ou menos para obter umaformulação reconstituída isenta de partículas com uma concentração deanticorpo de cerca de 50 mg/mL a cerca de 200 mg/mL.

Os anticorpos de ocorrência natural tipicamente tem duascadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas, com cada cadeia levecovalentemente ligadas a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfetointercadeia. As ligações dissulfeto múltiplas ainda ligam as duas cadeiaspesadas uma na outra. As cadeias individuais podem dobrar em domíniostendo tamanhos similares (110-125 aminoácidos) e estruturas, mas diferentesfunções. A cadeia leve pode compreender um domínio variável (Vl) e^ou umdomínio constante (CL). A cadeia pesada também pode compreender umdomínio variável (Vh) e/ou, dependendo da classe ou isotipo de anticorpo, trêsou quatro domínios constantes (CHI, Ch 2, CH3 e CH4). Em humanos, osisotipos são IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, com IgA e IgG ainda subdivididos emsubclasses ou subtipos (IgA \.2 e IgGi_4).

Geralmente, os domínios variáveis mostram uma considerávelvariabilidade de seqüência de aminoácidos de um anticorpo para o próximo,particularmente no local do sítio de ligação a antígeno. Três regiões,chamadas regiões hipervariável ou de determinação da complementaridade(CDRs), são encontradas em cada um de Vl e VH, que são suportados emregiões menos variáveis chamadas regiões variáveis de armação.

A porção de um anticorpo consistindo de domínios Vl e Vh édesignada Fv (fragmento variável) e constitui o sítio de ligação a antígeno. Fvde cadeia única (scFv) é um fragmento de anticorpo contendo um domínio Vle um domínio Vh em uma cadeia de polipeptídeo, em que o término N de umdomínio e o término C de outro domínio são unidos por um ligador flexível(ver, por exemplo, Pat. U.S. No. 4.946.778 (Ladner et al.); WO 88/09344,(Huston et al.). WO 92/01047 (McCaferty et al.) descreve a exibição dosfragmentos de scFv sobre a superfície de pacotes de exibição genéticarecombinante solúvel, como bacteriófagos.

Anticorpos de cadeia única faltam alguns ou todos os domíniosconstantes de anticorpos completos, dos quais eles são derivados. Assim, elespodem superar alguns dos problemas associados com o uso de anticorposcomplexo. Por exemplo, anticorpos de cadeia única tendem a ser livres dealgumas interações indesejadas entre regiões constantes de cadeia pesada eoutras moléculas biológicas. Adicionalmente, anticorpos de cadeia única sãoconsideravelmente menores do que os anticorpos completos e podem ter umamaior permeabilidade do que anticorpos completos deixando os anticorpos decadeia única localizar e ligar para o sítio alvo de ligação a antígenos maiseficientemente. Além disso, o tamanho relativamente pequeno de anticorposde cadeia única torna os mesmo menos prováveis de provocar uma respostaimune indesejada em um recipiente do que os anticorpos completos.

Os anticorpos de cadeia única múltiplos, cada cadeia únicatendo um domínio Vh e um Vl covalentemente ligado por um primeiroligador de peptídeo, pode ser covalentemente ligado a pelo menos um ou maisligadores de peptídeo para formar um anticorpos multivalente de cadeia única,que pode ser monoespecífico ou multiespecífico. Cada cadeia de umanticorpo de cadeia única multivalente inclui um fragmento variável de cadeialeve e um fragmento variável de cadeia pesada, e é ligado por um ligador depeptídeo a pelo menos uma outra cadeia. O ligador de peptídeo é composto depelo menos quinze resíduos de aminoácido. O número máximo de resíduos deaminoácido é de cerca de uma centena.

Dois anticorpos de cadeia única podem ser combinados paraformar um diacorpo, também conhecido como um dímero bivalente.Diacorpos tem duas cadeias e dois sítios de ligação, e pode sermonoespecífico ou biespecífico. Cada cadeia de diacorpo inclui um domínioVh conectado a um domínio VL. Os domínios são conectados com ligadoresque são curtos o suficiente para evitar os pares entre domínios ma mesmacadeia, assim dirigindo a formação de pares entre domínios complementaresem diferentes cadeias para criar novamente os dois sítios de ligação aantígenos.

Três anticorpos de cadeia única podem ser combinados paraformar triacorpos, também conhecidos como trímeros trivalentes. Triacorpossão construídos com o término de aminoácido de um domínio Vl ou Vhdiretamente fundido ao término carboxila de um domínio Vl ou Vh, isto é,sem qualquer seqüência de ligador. O triacorpo têm três cabeças de Fv com ospolipeptídeos dispostos em um modo cíclico, cabeça -a- causa. Uma possívelconformação de triacorpo é planar com os três sítios de ligação localizadosem um plano em um ângulo de 120 graus um do outro. Triacorpos podem sermonoespecíficos, biespecíficos ou triespecíficos.

Fab (Fragmento, ligação a antígeno) refere-se aos fragmentosdos anticorpos consistindo de domínios Vl Cl Vh e CHI. Os gerados após adigestão com papaína simplesmente são referidos como Fab e não retém aregião de gancho de cadeia pesada. Após digestão com pepsina, vários Fabsretendo o gancho de cadeia pesada são gerados. Os fragmentos divalentescom as ligações de dissulfeto intercadeias intactas são referidos como F(ab')2,enquanto um Fab' monovalente resulta quando as ligações dissulfeto não sãoretidas. Os fragmentos F(ab')2 tem uma maior avidez para antígeno quefragmentos Fab monovalentes.

Fc (cristalização de fragmento) é a designação para a porçãoou fragmento de anticorpo que compreende domínios constantes de pesadacadeia formados em pares. Em um anticorpo IgG5 por exemplo, o Fccompreende domínios CH2 e CH3. O Fc de anticorpo IgA ou IgM aindacompreende um domínio Cm- O Fc é associado com receptor de ligação Fc,ativação de citotoxicidade mediada por complemento, e citoxicidade celulardependente de anticorpo (ADCC). para anticorpos como IgA e IgM, que sãocomplexos de proteínas de tipo IgG múltiplas, formação do complexo requerdomínios constantes de Fc.

Finalmente, a região de gancho separa as porções Fab e Fc dosanticorpo, provendo mobilidade de Fabs relativos um a cada outro e relativosa Fc, assim como incluindo ligações múltiplas dissulfeto para ligaçãocovalente das duas cadeias pesadas.

Assim, anticorpos da invenção incluem, mas não são limitadosa, anticorpos de ocorrência natural, fragmentos bivalentes como (Fab')2>fragmentos monovalentes como Fab, anticorpos de cadeia única, Fv de cadeiaúnica (scFv), anticorpos de domínio único, anticorpos multivalentes de cadeiaúnica, diacorpos, triacorpos, e semelhantes que ligam especificamente comantígenos.

Anticorpos, ou fragmentos dos mesmos, da presente invenção,por exemplo, podem ser monoespecíficos ou biespecíficos. Anticorposbiespecíficos (BsAbs) são anticorpos que tem diferentes especificidades ousítios de ligação a antígeno. Onde um anticorpo tem mais do que umaespecificidade, os epítopos reconhecidos pode estar associados com umantígeno único ou com mais do que um antígeno. Assim, a presente invençãoprovê anticorpos biespecíficos, ou fragmentos dos mesmos, que ligam a doisdiferentes antígenos.

Especificidade de anticorpos, ou fragmentos dos mesmos,pode ser determinada com base em afinidade/avidez. Afinidade, representadapela constante de equilíbrio para a dissociação de um antígeno com umanticorpo (K,/), mede a resistência da ligação entre um determinanteantigênico e um sítio de ligação a anticorpo. Avidez é a medida da resistênciada ligação entre um anticorpo com seu antígeno. Avidez é relacionada comtanto a afinidade entre um epítopo com sua ligação ao sítio do antígeno noanticorpo, e a valência dos anticorpos, que refere-se ao número de sítios deligação a antígeno de um epítopo particular. Anticorpos tipicamente ligamcom uma constante de dissociação (KJ) de IO"5 to IO"11 litros/mol. QualquerKrf menor do que IO"4 litros/mol é geralmente considerado para indicar umaligação não específico. Quanto menor o índice de Kd, mais forte a resistênciada ligação entre um determinante antigênico e o sítio de ligação de anticorpo.

Como usado aqui, "anticorpos" e " fragmentos de anticorpo "incluem modificações que retém a especificidade para um antígenoespecífico. Estas modificações incluem, mas não são limitadas a, conjugaçãoa uma molécula de efetor como um agente quimioterapêutico (por exemplo,cisplatina, taxol, doxorubicina) ou citotoxina (por exemplo, um agentequimioterapêutico orgânico de proteína, ou um não proteína). Os anticorpospodem ser modificado por conjugação a porções repórter detectáveis.Também estão incluídos os anticorpos com alterações que afetam ascaracterísticas de não ligação como meia-vida (por exemplo, peguilação).

Os agentes de proteínas e não proteína podem ser conjugadosaos anticorpos por métodos que são conhecidos na técnica. Os métodos deconjugação incluem ligação direta, ligação via ligadores covalentementefixados, e membros de pares de ligação específica (por exemplo, avidina-biotina). Estes métodos incluem, por exemplo, os descritos por Greenfield etal., Câncer Research 50, 6600-6607 (1990) para a conjugação dedoxorubicina e os descritos por Arnon et al., Adv. Exp. Med. Biol. 303, 79-90(1991) e por Kiseleva et al., Mol. Biol. (USSR)25, 508-514 (1991) para aconjugação de compostos platina.

Anticorpos da presente invenção ainda incluem os em que ascaracterísticas de ligação foram melhoradas por uma mutação direta, métodosde maturação por afinidade, exibição de fagos ou embaralhamento de cadeias.Afinidade e especificidade pode ser modificadas ou melhoradas por mutaçãode CDRs e triagem para sítios de ligação a antígeno tendo as desejadascaracterísticas (ver, por exemplo, Yang et al., J. Mol. Biol., 254: 392-403(1995)). CDRs são mudados em uma variedade de modo. Um modo é tornaraleatórios resíduos individuais ou combinações de resíduos de modo que emuma população de sítios de ligação a antígeno de outra forma idênticos, todosos vinte aminoácidos são encontrados em posições particulares.Alternativamente, mutações são induzidas em uma faixa de resíduos de CDRpor métodos PCR passíveis de erro, (ver, por exemplo, Hawkins et al., J. Mol.Biol., 226: 889- 896 (1992)). Por exemplo, vetores de exibição de fagoscontendo genes de região variável cadeia pesada e leve podem ser propagadosem cepas mutator de E. coli (ver, por exemplo, Low et al., J. Mol. Biol., 250:359-368 (1996)). Estes métodos de mutagênese são ilustrativos de muitosmétodos conhecidos do versado na técnica.

Cada domínio dos anticorpos desta invenção pode ser umdomínio de imunoglobulina completo (por exemplo, um domínio constante ouvariável de cadeia pesada ou leve), ou pode ser um equivalente funcional ouum mutante ou derivado de um domínio de ocorrência natural, ou um domíniosintético construído, por exemplo, in vitro usando uma técnica como umdescrito em WO 93/11236 (Grifiths et al.). Por exemplo, é possível unirjuntos os domínios correspondendo a domínios variáveis de anticorpo, em queestão faltando pelo menos um aminoácido. O aspecto caracterizanteimportante dos anticorpos é a presença de um sítio de ligação a antígeno. Otermos fragmento variável de cadeia pesada e leve não deve ser construídopara excluir as variantes que não tem um efeito material sobre aespecificidade.

Anticorpos e fragmentos de anticorpos da presente invençãopodem ser obtidos, por exemplo, de anticorpos ocorrência natural, ou debibliotecas de exibição de fagos Fab ou scFv. Deve-se entender que, parafazer um anticorpo de domínio único a partir de um anticorpo compreendendoum domínio VHea VL, algumas substituições de aminoácido fora dos CDRspodem ser desejadas para melhorar a ligação, expressão ou solubilidade. Porexemplo, pode ser desejável modificar os resíduos de aminoácido que seriamde outra forma colocados na interface Vh-Vl.

Além disso, anticorpos e fragmentos de anticorpo da invençãopodem ser obtidos por tecnologia de hibridoma padrão (Harlow & Lane, ed.,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 211-213 (1998), queé incorporado por referência aqui) usando camundongos transgênicos (porexemplo, camundongos KM de Medarex, San Jose, Calif.) que produz cadeiasleves kappa e cadeias pesadas gama de imunoglobulina gama humana. Emformas de realização preferidas, uma porção substancial do genomaproduzindo anticorpo humano é inserida no genoma do camundongo e étornada deficiente na produção de anticorpos de murinos endógenos. Estescamundongos podem ser imunizados subcutaneamente (s.c.) com parte outoda a molécula alvo em adjuvante completo de Freund.

A presente invenção também provê um método de tratamentocompreendendo a administração de uma formulação reconstituída. Aformulações reconstituídas são preparadas por reconstituição de umaformulação liofilizada da presente invenção, por exemplo com 1 mL água. Otempo de reconstituição é preferivelmente menor do que 1 minuto. Aformulação reconstituída concentrada permite uma flexibilidade naadministração. Por exemplo, a formulação reconstituída pode ser administradaem uma forma diluída intravenosamente, ou pode ser administrada em umaforma mais concentrada por injeção. A formulação reconstituída concentradada presente invenção pode ser diluída em uma concentração que é adequadasob medida ao indivíduo em particular e/ou a via particular de administração.

Assim, a presente invenção provê métodos de tratamento compreendendo aadministração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo aomamífero, particularmente um humano, em necessidade do mesmo. O termoadministração como usado aqui significa liberar a composição de anticorpo dapresente invenção a um mamífero por qualquer método que pode alcançar oresultado procurado. A formulação reconstituída pode ser administrada, porexemplo, intravenosamente ou intramuscularmente. Em uma forma derealização, uma formulação reconstituída concentrada é administrada porinjeção.

Anticorpos da presente invenção são preferivelmentehumanos. Em um forma de realização a composição da presente invençãopode ser usada para tratar doenças neoplásicas, incluindo tumores sólidos enão sólidos e para tratamento de distúrbios hiperproliferativos.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz significa umaquantidade de anticorpo da presente invenção que, quando administrada a ummamífero, é eficaz para produzir o efeito terapêutico desejado, como reduçãoou neutralização da atividade de VEGFR, inibição de crescimento de tumor,ou tratamento de uma doença hiperproliferativa não cancerosa. Administraçãodos anticorpos como descrito acima pode ser combinada com administraçãode outros anticorpos ou qualquer agente de tratamento convencional, comoum agente anti-neoplásico.

Em um forma de realização da invenção, a composição podeser administrada em combinação com um ou mais agentes anti-neoplásicos.Qualquer agente anti-neoplásico apropriado pode ser usado, como um agentequimioterapêutico, radiação ou combinações dos mesmos. Os agentes anti-neoplásicos podem ser um agente alquilante ou um anti-metabólito. Exemplosde agentes alquilantes incluem, mas não são limitados a, cisplatina,ciclofosfamida, melfalan, e dacarbazina. Exemplos de anti-metabólitosincluem, mas não são limitados a, doxorubicina, daunorubicina, paclitaxel,irinotecan (CPT-11), e topotecan. Quando o agente anti-neoplásico é radiação,a fonte da radiação pode ser ou externa (terapia externa de radiação de feixes -EBRT) ou interna (braquiterapia - BT) ao paciente sendo tratado. A dose deagente anti-neoplásico administrada depende de numerosos fatores, incluindo,por exemplo, o tipo de agente, o tipo e severidade de tumor sendo tratado e avia de administração do agente. Deve ser enfatizado, no entanto, que apresente invenção não é limitada a qualquer dose particular.

Anticorpos da presente invenção podem ser, mas não sãolimitados a, anticorpos para VEGFR, IGF-IR, EGFR e PDGFR.

Em um forma de realização, os anticorpos, ou fragmentos dosmesmos, da presente invenção são específicos para VEGFR. Em outra formade realização, a presente invenção provê anticorpos biespecíficos, oufragmentos dos mesmos, que ligam a dois diferentes antígenos, com pelomenos uma especificidade para VEGFR. VEGFR refere-se à família dereceptores de VEGF humanos, incluindo VEGFR-I (FLT1), VEGFR-2 (KDR),VEGFR-3 (FLT4).

O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é ummediador chave de angiogênese. Em humanos saudáveis, VEGF promoveangiogênese no embrião em desenvolvimento, em cicatrização de feridas, edurante os ciclos reprodutivos femininos. No entanto, VEGF mediaangiogênese em tumores quando é regulado de modo positivo por expressãodo oncogene, fatores do crescimento, e hipoxia. Angiogênese é essencial paracrescimento do tumor além de um determinado tamanho pela difusão limitadade nutrientes e oxigênio.

Assim, em uma forma de realização, o anticorpo anti-VEGFRliga VEGFR e bloqueia a ligação de um ligando, como VEGF. Este bloqueiopode resulta em inibição de crescimento de tumor, que inclui a inibição deinvasão de tumor, metástase, reparo celular, e angiogênese, por interferênciacom os efeitos da ativação de VEGFR.

Em uma forma de realização, o anticorpo é um anticorpo anti-VEGFR-2 (KDR), IMC-I 12IB (IgGl), que é descrito em WO 03/07840(PCT/US03/06459). A seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos de Vhpara IMC-112IB é representada em SEQ ID NOS 1 e 2, respectivamente. Aseqüência de nucleotídeos e de aminoácidos de Vl para IMC- 112 IB érepresentada em SEQ ID NOS 3 e 4, respectivamente.

Equivalentes dos anticorpos, ou fragmentos dos mesmos, dapresente invenção também incluem polipeptídeos com seqüência deaminoácidos substancialmente iguais que as seqüências de aminoácidos deregiões variáveis ou hipervariáveis de anticorpo anti- VEGFR decomprimento completo provido aqui. Substancialmente a mesma seqüência deaminoácidos é definida aqui como uma seqüência com pelo menos cerca de70%, preferivelmente pelo menos cerca de 80%, e mais preferivelmente pelomenos cerca de 90% homologia, como determinado por método de buscaFASTA de acordo com Pearson e Lipman (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85,2444-8 (1988)).

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos ainda ilustram a invenção, mas nãodevem ser construídos para limitar o escopo da invenção de qualquer modo.As descrições detalhadas de métodos convencionais, como os empregados naanálise de proteínas podem ser obtidas de várias publicações como CurrentProtocols in Immunology (publicado por John Wiley & Sons). Todas asreferências mencionadas aqui são incorporadas em sua totalidade.

Exemplo 1. Fragmentação de anticorpo anti-VEGFR-2. IMC-1121B.

IMC-112IB a 5 mg/mL em solução salina tamponada comfosfato (PBS) foi incubado a 40°C durante 3 meses. Após esta incubação,SEC-HPLC e sequenciamento N-terminal foram usados para analisar osprodutos de degradação. O cromatograma de SEC-HPLC de IMC-112 IBdegradado em PBS é mostrado em Figura 1. O produto degradado tem doispicos de agente degradante (frações 2 e 3) além de picos de agregado (fração1) e monômero. As frações foram coletadas usando um coletor de fração paraanálise da seqüência N-terminal. A seqüência de cDNA para cadeia pesada deIMC-112 IB é mostrada em Figura 2. Seqüência de sinal, regiões variáveis eregiões constantes são mostrados com texto sublinhado, sublinhado duplo, esimples, respectivamente. A análise do sequenciamento N-terminal daamostra degradada e frações 2 e 3 mostrou dois sítios de fragmentação nacadeia pesada (texto marcado com verde na figura 2). O sítio no 156° resíduodo N-términos resultas em dois fragmentos de cadeia pesada detectados emSDS-PAGE reduzido (Figura 3) como bandas de cerca de 40 KD e cerca de15 KD. O outro sítio de fragmentação na região de gancho no 220° resíduo doN-término resulta em bandas de cerca de 33 KD e cerca de 27 KD em SDS-PAGE reduzido (Figura 3).

Exemplo 2. Otimização de Formulação de TampãoA formulação secada por congelamento para IMC-112IB foidesenvolvida em dois estágios. No primeiro estágio, o tampão solvente foiotimizado usando um projeto de abordagem de experimento (DOE) commodelagem fracional fatorial, como descrito na Tabela 1. Os fatores triadosneste processo de otimização foram tampão, pH, sal, aminoácidos, açúcarestensoativos, e derivados de açúcar. Otimização de solvente foi realizada auma concentração de 112 IB de 5 mg/mL. A agitação controlada a 300 rpm atemperatura ambiente foi usada para testar estabilidade mecânica. Aestabilidade térmica foi testada usando DSC e temperaturas aceleradas. Asprevisões de DOE foram confirmadas usando metodologia de um fator a cadavez. A análise de regressão linear foi usada para determinar a significânciados resultados.

Tabela 1. Proieto dematriz de experimentoJDOE)

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Estudo de calorimetria de varredura diferencial (DSC): Atemperatura de fusão, ou transição, (Tm) foi medida usando um MicroCalVP-DSC. A concentração da proteína foi fixada a 5 mg/mL e a rampa desubida de temperatura foi de 5°C a 95°C em uma taxa de varredura del,5°C/min. As curvas de fusão térmica de IMC-1121 B em várias formulações(Tabela 1) foram coletadas. As temperaturas de fusão correspondendo ao picode transição principal (50% das moléculas são desnaturadas) foramconfiguradas em um modelo de regressão linear para estimar o efeito devariáveis testadas em Tm. O modelo foi estatisticamente significante com ump=0,0006. Os fatores significantes (p<0,05) foram pH e tipo de tampão. Ográfico de regressão para a variação Tm com tipo de tampão e pH é mostradoem Figura 4. O pH ótimo foi de aproximadamente 6,0 para os tampõeshistidina, citrato e acetato, que foram superiores a tampão fosfato a pH 6,0.Outras variáveis não tem um efeito estatisticamente significante em Tm.

Estudo de agitação: Soluções de anticorpo foram agitadas emum agitador de plataforma a 300 rpm a temperatura ambiente. Cinco mL deIMC-112IB a 5 mg/mL em um frasco de vidro de 20 mL foram agitados emvárias formulações (Tabela 1) durante até 84 horas. Turvação da solução,porcentagem de monômero, porcentagem de agregado, e porcentagem deagente degradante foram determinados como a seguir. Turvação das soluçõesfoi medida por absorbância a 350 nm usando espectrofotômetro biospecShimatzu 1601 Porcentagem de monômero, porcentagem de agregado, eporcentagem de agente degradante foram medidas usando SEC-HPLCrealizado em um Agilent 1100 Série LC usando coluna Tosoph Biosep TSK3000 com fosfato de sódio 10 mM, 0,5M CsCl, a pH 7,0 como a fase móvel.

O efeito de variáveis testadas em turvação, porcentagens de monômero,agregado e agente degradante foram estimadas por configuração de ummodelo de regressão linear usando programa JMP (SAS Institute, NC). Oíndice ρ para gráfico real por previsto <0,002. Os efeitos das variáveissignificantes pH, Tween 80, NaCl e tempo em turvação, porcentagens demonômero, agregado e agente degradante são mostrados em Figura 5.

Estabilidade em temperatura acelerada e tempo real., a 40°C: ODVlC- 1121Β a 5 mg/mL em várias formulações (Tabela 1) foi incubado a40°C durante até 14 dias. A turvação da solução, porcentagens de monômero,agregado e agente degradante foram determinados como descrito acima. Oefeito de variáveis testadas em turvação, porcentagens de monômero,agregado e agente degradante foi estimado por configuração de um modelo deregressão linear usando software JMP. O índice ρ para Gráficos real porprevisto foram <0,001. O efeito de variáveis significantes em turvação,porcentagens de monômero, agregado e agente degradante são mostrados emFigura 6. O tampão ótimo é histidina a pH 6,0. Sal reduziu o monômero eaumentou a agregação. Mas não afetou a degradação. Glicina não teve efeitoem monômero, agregado ou agente degradante.

Estabilidade em temperatura de congelamento em tempo real a-20°C: O anticorpo IMC- 112 IB a 5 mg/mL em várias formulações (Tabela1) foi incubado a -20°C durante até 16 dias. A turvação da solução,porcentagens de monômero, agregado e agente degradante foram estimadoscomo descrito acima. O efeito de variáveis testadas em turvação,porcentagens de monômero, agregado e agente degradante foramdeterminados por configuração em modelo de regressão linear usandosoftware JMP. O índice ρ para gráfico real por previsto foi <0,001. O efeitode variáveis significantes em turvação, porcentagens de monômero, agregadoe agente degradante são mostrados em Figura 7. O pH ótimo foi 6,0. Acidoaspártico aumentou monômero e diminuiu agregação com a efeitonegligenciável na degradação. NaCl e glicina teve um efeito negligenciávelem turvação, monômero, agregado e agente degradante.Exemplo 3. Comparação de Estabilidade de IMC-112IB em Formulações dePBS e Tampão histidina 10 mM (pH 6,0).

Os estudos de triagem de DOE previram que o anticorpo IMC-112IB tinha uma estabilidade significantemente melhor em uma formulaçãode 10 mM tampão histidina (pH 6,0) do que em PBS. Neste estudo, aestabilidade de IMC-112IB a concentração de 5 mg/mL em histidina 10 mMpH 6,0 e PBS foi examinada por várias técnicas para confirmar a previsão de DOE.

Estudo de calorimetria de varredura diferencial (DSC): Aestabilidade térmica de formulações IMC-112 EB em PBS e 10 mM tampãohistidina (pH 6,0) foi examinada de acordo com o procedimento descrito emMétodos. As temperaturas de fusão para a transição principal foram 70,0 e76,6°C para IMC-1121B em PBS e 10 mM tampão histidina (pH 6,0),respectivamente.

Estabilidade em temperatura acelerada em tempo real a 40°C etemperatura ambiente: O IMC-112IB a 5 mg/mL foi incubado a 40°C etemperatura ambiente (RT) durante até 150 dias em formulações de PBS e 10mM tampão histidina (pH 6,0). Após incubação, as amostras foram analisadaspor SEC-HPLC, IEC-HPLC, SDS-PAGE e IEF como descrito abaixo.

Análise de SEC-HPLC: A análise de SEC-HPLC de IMC-1121B em PBS ou 10 mM tampão histidina (pH 6,0) após 150 dias deincubação a 40°C e temperatura ambiente foi realizada de acordo com oprocedimento descrito acima. Os cromatogramas de HPLC são mostrados emFigura 8. A porcentagem total de agregado em amostras de controle, RT e40°C foi 0,90, 1,49 e 3,90 para PBS e 0,80, 0,82 e 0,75 para 10 mM tampãohistidina (pH 6,0), respectivamente. A porcentagem total de agentedegradante em amostras de controle, RT e 40°C foi 1,32, 2,56 e 12,54respectivamente, para formulações de PBS e 1,23, 2,09 e 9,00 para 10 mMtampão histidina pH 6,0, respectivamente. As mudanças em porcentagem demonômero, porcentagem de agregado, e porcentagem de agente degradantecomo uma função de tempo de incubações são mostradas em Figuras 9, 10 e11, respectivamente. Porcentagem de monômero diminuiu e porcentagem deagregado e porcentagem de agente degradante aumentaram em uma taxa maisrápida em formulação PBS do que em histidina 10 mM (pH 6,0). O 10 mMtampão histidina (pH 6,0) provê um meio superior para manutenção doanticorpo IMC-1121B.

Análise IEC-HPLC: Cromatografia de troca iônica de IMC-112IB após 30 e 150 dias de incubação a 40°C e temperatura ambiente foirealizada em um Agilent 1100 Série LC usando uma coluna analítica DionexProPac WCX-10. As amostras foram eluídas com um gradiente linear defosfato 10 mM (pH 7,0), 20 mM NaCl a Fosfato 10 mM (pH 7,0), 100 mMNaCl em 32 minutos. Os cromatogramas DEC-HPLC são mostrados em Figura12. Incubação a temperatura ambiente e 40°C, levou os picos a se deslocarespara um tempo de retenção menor (isto é para pH ácido) em ambas asformulações. No entanto, os deslocamentos foram consideravelmente maioresna formulação PBS do que em formulação de 10 mM tampão histidina (pH 6,0).

Análise SDS-PAGE: O anticorpo IMC-1121 B (a 5 mg/mL)em PBS ou 10 mM tampão histidina (pH 6,0) foi incubado a temperaturaambiente ou 40°C durante 150 dias antes da análise por SDS-PAGE redutor enão redutor (4-20% gel gradiente tris-glicina) de acordo com os protocolospadrões. As amostras incubadas em PBS tinham maiores quantidades deprodutos de degradação do que as amostras incubadas em histidina 10 mM(pH 6,0) como medido pela intensidade das bandas (Figura 13).

Análise de focalização isoelétrica (IEF): IMC-1121B a 5mg/mL em formulações PBS e histidina 10 mM (pH 6,0) após 150 dias deincubação a RT e 40°C foi analisado por IEF (faixa de pH 6,0-10,5). A análisede focalização isoelétrica foi realizada em placas IsoGel® Agarose IEF comuma faixa de pH de 6,0 a 10,5. As bandas resultantes migraram para o pHácido em ambas as formulações PBS e histidina. No entanto, o deslocamentofoi maior para a formulação PBS do que para formulação de histidina 10 mM(pH 6,0) (Figura 14).

Exemplo 4. Triagem da formulação de secagem por congelamento.No segundo estágio de otimização, agentes de volume e crio-elio-protetores foram otimizados a uma concentração de anticorpo fixa de 20mg/mL em 10 mM tampão histidina (pH 6,0). Os aditivos testados forammanitol, glicina, sacarose e trealose como mostrados no projeto da matriz doexperimento (Tabela 2). Como controles, anticorpo IMC-112 IB naconcentração de 5 mg/mL em formulações de solução (sem secagem porcongelamento) com tampão PBS (pH 6,0) ou 10 mM tampão histidina (pH6,0) foi analisado.

Tabela 2: Matriz DOE para triagem de formulação secada por congelamento

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Processo de secagem por congelamento: Os produtos foramliofilizados usando um secador por congelamento Liostar II. A bandeja deliofilização foi carregada com amostra a temperatura ambiente. Produtosforam embebidos a -5O0C durante 2 horas. A secagem primária foi realizada a-3O0C durante 10 horas seguido por uma secagem secundária a 20°C durantemais 10 horas. As taxas de resfriamento e de aquecimento foram 0,5°C/min.

A pressão na câmara durante a secagem primária e secundária foi 50 mT.

Uma vez completada a liofilização, a câmara de amostra foi retro-carregadacom N2 e tampada. O processo de liofilização foi completado em cerca de 24horas. A temperatura fixada na prateleira e temperatura dos produtos comouma função de tempo de ciclo é mostrada em Figura 15. O processo deliofilização foi considerado completado quando a temperatura do produtoalcançou (ou cruzou ) a temperatura fixada na prateleira.

Estabilidade em temperatura acelerada: As formulaçõesliofilizadas de anticorpos foram incubadas durante 100 dias ou a 40°C ou50°C. Após o período de incubação, produtos foram reconstituídos em 5mg/mL com 10 mM tampão histidina (pH 6,0). O tempo de reconstituição foimenor do que 1 min. A porcentagem de monômeros permanecendo apósincubação é mostrada na Figura 16. As formulações secadas porcongelamento com 4% sacarose ou 4% trealose retiveram a maiorpercentagem de monômero após as incubações de 100 dias a 40°C e 50°C.

Comparação da estabilidade em temperatura acelerada entreformulações secadas por congelamento e em solução: As formulações secadaspor congelamento: (1) 20 mg/mL IMC-1121B5 4% sacarose, 10 mM tampãohistidina (pH 6,0), e (2) 20 mg/mL IMC-1121B, 4% trealose, 10 mM tampãohistidina (pH 6,0), foram comparadas com formulações em solução (1) 5mg/mL IMC-1121B em PBS (pH 7,2) e (2) 5 mg/mL IMC-1121B em 10 mMtampão histidina (pH 6,0). As amostras foram incubadas a 40°C ou 50°Cdurante até 100 dias. Após o período de incubação, os produtos liofilizadosforam reconstituídos em 5 mg/mL com 10 mM tampão histidina (pH 6,0). Asamostras liofilizadas reconstituídas e amostras de solução foram analisadaspor SEC-HPLC. A variação de porcentagens de monômero, agregado e agentedegradante como uma função de tempo de incubação a 40°C ou 50°C é dadaem Figuras 17 através 23. Porcentagens de degradação aumentaram comtempo tanto nas formulações em solução mas permaneceram inalteradas emformulações liofilizadas (Figuras 19 e 22).

Exemplo 5. Formulação de secagem por congelamento para anticorpo deconcentração elevada

Os resultados anteriores demonstraram que dentre oscompostos testado, 4% sacarose ou 4% trealose proveram a maiorestabilidade para formulações secadas por congelamento de anticorpo JLMC-1121B a concentrações de 20 mg/mL. Neste estudo, os requerentes elevaramconcentração de IMC- 112 IB de 20 mg/mL a 50 mg/mL e alteraram aconcentração de sacarose de 4% a 8% com o objetivo de formular um IMC-112 IB a uma concentração de 50 mg/mL. Como um controle, EMC-1121 B a20 mg/mL na presença de 4% sacarose foi também liofilizado. Os produtosliofilizados e formulação de solução de controle foram incubados atemperatura ambiente, 40°C e 5O0C durante até 3 meses. A formulação desolução de controle consistia da presente formulação de solução recomendadaotimizada, para o anticorpo HMC-112 IB (5 mg/mL em histidinalO mM,Glicinal33 mM, NaC175 mM, 0,01% Tween 80). Após o período deincubação, produtos liofilizados foram reconstituídos em 5 mg/mL com 10mM tampão histidina (pH 6,0) e então analisados por SEC-HPLC, IEC-HPLC, e SDS-PAGE redutor e não redutor.

Análise SEC-HPLC de IMC- 112IB liofílizado e formuladoem solução após incubacão a 50°C: SEC-HPLC foi realizado em amostrasantes e após liofilização e após incubações de um mês e 3 meses a 50°C. Apósa incubação, os produtos liofilizados foram reconstituídos com histidina 10mM (pH 6,0). Variação nas porcentagens de monômero, agregado e agentedegradante é mostrada em Figuras 23, 24 e 25, respectivamente. Aporcentagem de monômeros foi a maior e de agregado foi a menor paraamostra a 8% sacarose. Amostras liofilizadas continham significantementemenos agentes degradantes do que as amostras formuladas em solução.

Análise SEC-HPLC e IEC-HPLC de IMC-112IB liofílizado eformulado em solução após incubação a temperatura ambiente e a 40°C: SEC-HPLC e IEC-HPLC foram realizados nas amostras antes e após liofilização eapós incubações de um mês e 3 meses a temperatura ambiente e 40°C. Após aincubação, os produtos liofilizados foram reconstituídos com 10 mM tampãohistidina (pH 6,0). Variação de porcentagens de monômero, agregado eagente degradante é mostrada em Figuras 26, 27 e 28, respectivamente, paraamostras incubadas a 40°C, e em Figuras 30, 31 e 32, respectivamente, paraamostras incubadas a temperatura ambiente. Amostras liofilizadas continhamsignificaiitemente menos agentes degradantes do que as amostras formuladasem solução. Cromatogramas de SEC-HPLC de IMC-112 IB incubado 3 mesesem solução, ou secado por congelamento contendo 8% sacarose sãomostrados em Figura 29 (incubações a 40°C) e Figura 33 (incubações atemperatura ambiente). A amostra IMC-112IB de referência foi incluída paracomparação. O cromatograma da amostra secada por congelamento é similarao de BVIC-112IB de referência, mas o cromatograma para IMC-112 IBformulado em solução foi deslocado para pH ácido.

Análise SDS-PAGE de IMC-1121B liofilizado e formuladoem solução após a 3 meses incubação: Os produtos liofilizados foramreconstituídos em 10 mM tampão histidina (pH 6,0). Amostras de IMC-112IB mantido em solução, e IMC-112 IB secado por congelamentoreconstituído em 10 mM tampão histidina (pH 6,0) foram analisadas com umSDS-PAGE redutor a 4-20% (Figuras 34) e a 4-20% SDS-PAGE não redutor(Figura 35) após uma incubação de três meses. As formulações liofilizadas,20 mg/ml anticorpo com 4% sacarose e 50 mg/ml anticorpo com 8% sacarose,exibiram uma degradação de cadeia pesada significantemente reduzida emcomparação com a formulação não liofilizada.

Claims (68)

1. Formulação estável, caracterizada pelo fato de compreenderum anticorpo e um tampão em que a fragmentação não enzimática doanticorpo é substancialmente reduzida.

2. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o anticorpo é um anticorpo anti-VEGFR.

3. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o anticorpo é um anticorpo anti-VEGFR2.

4. Formulação de acordo com a reivindicação 3, caracterizadapelo fato de que o anticorpo VEGFR2 é IMC-1121B.

5. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a concentração de anticorpo é cerca de 50 a cerca de 200mg/ml.

6. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o tampão compreende um tampão histidina.

7. Formulação de acordo com a reivindicação 6, caracterizadapelo fato de que a concentração de tampão histidina é cerca de 5 mM a cercade 50 mM.

8. Formulação de acordo com a reivindicação 6, caracterizadapelo fato de que a concentração de tampão histidina é cerca de 10 mM.

9. Formulação de acordo com a reivindicação 6, caracterizadapelo fato de que o pH do tampão histidina é cerca de 5,5 a cerca de 6,5.

10. Formulação de acordo com a reivindicação 6, caracterizadapelo fato de que o pH do tampão histidina é cerca de 6,0.

11. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o tampão compreende um tampão citrato.

12. Formulação de acordo com a reivindicação 11,caracterizada pelo fato de que o pH do tampão citrato é cerca de 5,5 a cercade 6,5.

13. Formulação de acordo com a reivindicação 11,caracterizada pelo fato de que o pH do tampão citrato é cerca de 6,0.

14. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o tampão compreende um tampão acetato.

15. Formulação de acordo com a reivindicação 14,caracterizada pelo fato de que o pH do tampão acetato é cerca de 5,5 a cercade 6,5.

16. Formulação de acordo com a reivindicação 14,caracterizada pelo fato de que o pH do tampão acetato é cerca de 6,0.

17. Formulação liofilizada estável, caracterizada pelo fato decompreender:um anticorpo,um tampão, eum lioprotetor,em que a fragmentação não enzimática do anticorpo é substancialmentereduzida.

18. Formulação de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo anti-VEGFR.

19. Formulação de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo anti-VEGFR2.

20. Formulação de acordo com a reivindicação 19,caracterizada pelo fato de que o anticorpo VEGFR2 é IMC-1121B.

21. Formulação de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de que a concentração de anticorpo é cerca de 50 acerca de 200 mg/ml.

22. Formulação de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de que o tampão compreende um tampão histidina.

23. Formulação de acordo com a reivindicação 22,caracterizada pelo fato de que a concentração de tampão histidina é cerca de 5mM a cerca de 50 mM.

24. Formulação de acordo com a reivindicação 22,caracterizada pelo fato de que a concentração de tampão histidina é cerca de10 mM.

25. Formulação de acordo com a reivindicação 22,caracterizada pelo fato de que o pH do tampão histidina é cerca de 5,5 a cercade 6,5.

26. Formulação de acordo com a reivindicação 22,caracterizada pelo fato de que o pH do tampão histidina é cerca de 6,0.

27. Formulação de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de que o tampão compreende um tampão citrato.

28. Formulação de acordo com a reivindicação 27,caracterizada pelo fato de que o pH do tampão citrato é cerca de 5,5 a cercade 6,5.

29. Formulação de acordo com a reivindicação 27,caracterizada pelo fato de que o pH do tampão citrato é cerca de 6,0.

30. Formulação de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de que o tampão compreende um tampão acetato.

31. Formulação de acordo com a reivindicação 30,caracterizada pelo fato de que o pH do tampão acetato é cerca de 5,5 a cercade 6,5.

32. Formulação de acordo com a reivindicação 30,caracterizada pelo fato de que o pH do tampão acetato é cerca de 6,0.

33. Formulação de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de que o lioprotetor é um açúcar.

34. Formulação de acordo com a reivindicação 33,caracterizada pelo fato de que o lioprotetor é sacarose.

35. Formulação de acordo com a reivindicação 33,caracterizada pelo fato de que o lioprotetor é trealose.

36. Formulação de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de ainda compreender um tensoativo.

37. Formulação de acordo com a reivindicação 36,caracterizada pelo fato de que o tensoativo é Tween 80.

38. Formulação de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de ainda compreender um agente estabilizante.

39. Formulação de acordo com a reivindicação 38,caracterizada pelo fato de que o agente estabilizante é ácido aspártico.

40. Formulação liofilizada, caracterizada pelo fato decompreender:um anticorpo anti-VEGFR,um tampão, eum lioprotetor.

41. Formulação de acordo com a reivindicação 40,caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo VEGFR2.

42. Formulação de acordo com a reivindicação 41,caracterizada pelo fato de que o anticorpo VEGFR2 é IMC-1121B.

43. Formulação de acordo com a reivindicação 42,caracterizada pelo fato de que a concentração de anticorpo é cerca de 5 acerca de 50 mg/ml.

44. Formulação de acordo com a reivindicação 40,caracterizada pelo fato de que o tampão compreende um tampão histidina.

45. Formulação de acordo com a reivindicação 44,caracterizada pelo fato de que a concentração do tampão histidina é cerca de 5mM a cerca de 50 mM.

46. Formulação de acordo com a reivindicação 44,caracterizada pelo fato de que a concentração de tampão histidina é cerca de 10 mM.

47. Formulação de acordo com a reivindicação 44,caracterizada pelo fato de que o pH do tampão histidina é cerca de 5,5 a cercade 6,5.

48. Formulação de acordo com a reivindicação 44,caracterizada pelo fato de que o pH do tampão histidina é cerca de 6,0.

49. Formulação de acordo com a reivindicação 40,caracterizada pelo fato de que o tampão compreende um tampão citrato.

50. Formulação de acordo com a reivindicação 40,caracterizada pelo fato de que o tampão compreende um tampão acetato.

51. Formulação de acordo com a reivindicação 40,caracterizada pelo fato de que o lioprotetor é um açúcar.

52. Formulação de acordo com a reivindicação 51,caracterizada pelo fato de que o lioprotetor é sacarose.

53. Formulação de acordo com a reivindicação 51,caracterizada pelo fato de que o lioprotetor é trealose.

54. Formulação de acordo com a reivindicação 40,caracterizada pelo fato de ainda compreender um tensoativo.

55. Formulação de acordo com a reivindicação 54,caracterizada pelo fato de que o tensoativo é Tween 80.

56. Formulação de acordo com a reivindicação 40,caracterizada pelo fato de ainda compreender um agente estabilizante.

57. Formulação de acordo com a reivindicação 56,caracterizada pelo fato de que o agente estabilizante é ácido aspártico.

58. Formulação liofilizada, caracterizada pelo fato decompreender:um anticorpo anti-VEGFR2,um tampão histidina, eum açúcar lioprotetor.

59. Formulação de acordo com a reivindicação 58,caracterizada pelo fato de que o anticorpo VEGFR2 é IMC-1121B.

60. Formulação de acordo com a reivindicação 58,caracterizada pelo fato de que o pH do tampão histidina é cerca de 5,5 a cercade 6,5.

61. Formulação de acordo com a reivindicação 58,caracterizada pelo fato de que o pH do tampão histidina é cerca de 6,0.

62. Formulação de acordo com a reivindicação 58,caracterizada pelo fato de que o lioprotetor é sacarose.

63. Formulação de acordo com a reivindicação 58,caracterizada pelo fato de que o lioprotetor é trealose.

64. Formulação de acordo com a reivindicação 58,caracterizada pelo fato de ainda compreender um tensoativo.

65. Formulação de acordo com a reivindicação 64,caracterizada pelo fato de que o tensoativo é Tween 80.

66. Formulação de acordo com a reivindicação 58,caracterizada pelo fato de ainda compreender um agente estabilizante.

67. Formulação de acordo com a reivindicação 66,caracterizada pelo fato de que o agente estabilizante é ácido aspártico.

68. Método de tratamento, caracterizado pelo fato decompreender a administração de uma formulação reconstituída,compreendendo:um anticorpo anti-VEGFR,um tampão,e um lioprotetor.