BRPI0707842B1 - Ácido nucleico capaz de se ligar à mcp-1, seus usos, seu método de detecção, bem como composição farmacêutica, complexo, método para a triagem de um antagonista de quimiocina ou um agonista de quimiocina e kit para a detecção de uma quimiocina - Google Patents

Ácido nucleico capaz de se ligar à mcp-1, seus usos, seu método de detecção, bem como composição farmacêutica, complexo, método para a triagem de um antagonista de quimiocina ou um agonista de quimiocina e kit para a detecção de uma quimiocina Download PDF

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Florian Jarosch
Dirk Eulberg
Sven Klussmann
Klaus Buchner
Christian Maasch
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Noxxon Pharma Ag.
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Abstract

ÁCIDOS NUCLÉICOS QUE SE LIGAM À MCP-1. A presente invenção refere-se a um ácido nucléico, preferivelmente que se liga à MCP-1, selecionado a partir do grupo que compreende os ácidos nucléicos do tipo 1 A, os ácidos nucléicos do tipo 1 B, os ácidos nucléicos do tipo 2, os ácidos nucléicos do tipo 3, os ácidos nucléicos do tipo 4 e os ácidos nucléicos tendo uma seqüência de ácidos nucléicos de acordo com quaisquer de SEQ. ID. N°: 87 a 115.

Description

[0001] A presente invenção refere-se aos ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1, e ao seu uso para a fabricação de um medicamento e um agente diagnóstico, respectivamente.
[0002] A MCP-1 humana (proteína quimiotática de monócitos 1; nomes alternativos, MCAF [fator quimiotático e ativador de monócitos]; CCL2; SMC-CF [célula do músculo liso-fator estimulador de colônia]; HC-11; LDCF; GDCF; TSG-8; SCYA2; A2; código de acesso do SwissProt, P13500) foi caracterizada por três grupos independentemente (Matsushima 1988; Rollins 1989; Yoshimura 1989). Ela consiste em 76 aminoácidos e caracteriza-se por um local de ligação à heparina como todas as quimiocinas. As duas ligações de dissulfeto intramoleculares conferem uma estrutura rígida, estável, à molécula. Além disso, a MCP-1 carrega um piroglutamato em sua extremidade de amino. Em Thr 71, está localizado um local de glicosilação ligado ao potencial O. Os membros adicionais da família de MCP existem tanto em seres humanos (MCP-2, -3, -4) quanto em camundongos (MCP-2, - 3, -5). As proteínas humanas são aproximadamente 70% homólogas à MCP-1 humana.
[0003] A estrutura da MCP-1 foi resolvida por RMN (Handel 1996) e raio X (Lubkowski 1997). O monômero de MCP-1 tem a dobra de quimiocina típica, em que as cisteínas amino terminais são seguidas por uma longa sequência que resulta em três folhas antiparalelas dobradas β em um motivo de estilo grego. A proteína termina em uma hélice α que sobrepõe as três folhas β (código de acesso de dados de PDB IDOK).
[0004] Embora a estrutura tridimensional das formas de MCP-1 de diferentes espécies de mamíferos geralmente tenha sido mantida, a sequência de aminoácidos não foi particularmente bem-conservada durante a evolução. Os resultados de alinhamento das sequências demonstram 55% de similaridade global das sequências entre a MCP-1 humana e de murino (também chamada JE) dentro dos primeiros 76 aminoácidos. Sem considerar a sequência de aminoácidos, a MCP-1 de murino difere da MCP-1 humana no tamanho molecular (125 aminoácidos) e no grau de glicosilação. A MCP-1 de murino contém um domínio carbóxi terminal de 49 aminoácidos que não está presente na MCP-1 humana e não é requerido para a bioatividade in vitro. A MCP-1 humana compartilha a seguinte porcentagem de aminoácidos idênticos com a MCP-1 de: a) MCP-1 de Macaca mulatta (macaco Rhesus) 97% MCP-1 de Sus scrofa (Porco) 79% Equus caballus (Cavalo) 78% MCP-1 de Canis familiaris (Cão) 76% MCP-1 de Oryctolagus cuniculus (Coelho) 75% Bos Taurus (Boi) 72% MCP-3 de Homo sapiens 71% Eotaxina de Homo sapiens 64% MCP-2 de Homo sapiens 62% MCP-1 de Mus musculus (Camundongo) 55% MCP-1 de Rattus norvegicus (Rato) 55%
[0005] Dado este alto grau de divergência, pode ser necessário gerar antagonistas de MCP-1 de rodentes para o desempenho bem- sucedido dos estudos farmacológicos em modelos de rodentes.
[0006] A MCP-1 é um atraente potente de monócitos/macrófagos, basófilos, células T ativadas, e células NK. Uma ampla variedade de tipos de células, tais como as células endoteliais, as células epiteliais, os fibroblastos, os ceratinócitos, as células sinoviais, as células mesangiais, os osteoblastos, as células do músculo liso, bem como uma grande quantidade de células de tumor, expressam a MCP-1 (Baggliolini 1994). A sua expressão é estimulada por diversos tipos de agentes pró- inflamatórios, tais como a IL-1β, o TNF-a, o IFN-y, o LPS (lipopolissacarídeo), e o GM-CSF.
[0007] Bastante incomum na rede desordenada de quimiocinas, a MCP-1 é altamente específica em seu uso de receptor, ligando-se somente ao receptor de quimiocina CCR2 com alta afinidade. Como todos os receptores de quimiocinas, o CCR2 é um GPCR (Dawson 2003). O CCR2 parece ser expresso em duas formas ligeiramente diferentes devido à emenda alternativa dos mRNA que codificam as regiões carbóxi terminais, CCR2a e CCR2b (Charo 1994). Estes receptores são expressos em monócitos, células precursoras mielóides e células T ativadas (Myeres 1995; Qin 1996). A constante de dissociação da MCP-1 para o receptor transfectado nas células HEK- 293 é 260 pM, que está em concordância com os valores medidos nos monócitos (Myers 1995; Van Riper 1993). A ativação do CCR2b nas células HEK-293 com a MCP-1 inibe a adenilil ciclase em uma concentração de 90 pM, e mobiliza o cálcio intracelular em concentrações ligeiramente mais elevadas, aparentemente independente da hidrólise de fosfatidil inositol. Os efeitos sobre a adenilil ciclase e a liberação de cálcio intracelular são fortemente inibidos pela toxina da coqueluche, implicando o envolvimento das proteínas G heterotriméricas do tipo Gi na transdução de sinal (Myers 1995).
[0008] A MCP-1 está envolvida no recrutamento de monócitos nos tecidos inflamados. Lá, os macrófagos residentes liberam quimiocinas, tais como a MCP-1 e outras, e citocinas como o TNF, a IL-1β e outros, que ativam as células endoteliais para expressar uma bateria de moléculas de adesão. O endotélio "grudento" resultante faz com que os monócitos no vaso sanguíneo rolem ao longo de sua superfície. Aqui, os monócitos encontram a MCP-1 apresentada sobre a superfície endotelial, que se liga ao CCR2 sobre os monócitos e os ativa. Isto finalmente resulta na retenção firme, no espalhamento dos monócitos ao longo do endotélio, e na transmigração para o tecido circundante, onde os monócitos diferenciam-se em macrófagos e migram para o local de concentração máxima de MCP-1.
[0009] A MCP-1 é um membro da família de quimiocinas, que é uma família de moléculas principalmente básicas e estruturalmente relacionadas, que se ligam à heparina, pequenas (cerca de 8-14 kDa). Elas são formadas predominantemente nos tecidos inflamados e regulam o recrutamento, a ativação, e a proliferação de células sanguíneas brancas (leucócitos) (Baggiolini 1994; Springer 1995; Schall 1994). As quimiocinas induzem seletivamente a quimiotaxia de neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monócitos, macrófagos, mastócitos, células T e B. Além de seu efeito quimiotático, elas podem exercer seletivamente outros efeitos em células responsivas, como alterações no formato da célula, aumento transiente na concentração de íons cálcio intracelulares livres, desgranulação, supra-regulação das integrinas, formação de lipídios bioativos, tais como leucotrienos, prostaglandinas, tromboxanos, ou explosão respiratória (liberação de espécie reativa de oxigênio para a destruição de organismos patogênicos ou células de tumor). Assim, pela provocação da liberação de mediadores pró- inflamatórios adicionais, da quimiotaxia e do extravasamento de leucócitos para os locais de infecção ou inflamação, as quimiocinas desencadeiam a escalada da resposta inflamatória.
[00010] Com base no arranjo dos primeiros dois de quatro resíduos de cisteína conservados, as quimiocinas são divididas em quatro classes: CC ou β-quimiocinas, em que as cisteínas estão em série, CXC ou α-quimiocinas, onde elas são separadas por um resíduo de aminoácido adicional, XC ou y quimiocinas, com a linfotactina como o único representante até o momento, que possuem somente uma ponte de dissulfeto, e quimiocinas CX3C, que se caracterizam por três resíduos de aminoácidos entre as cisteínas, com a fractalquina ligada à membrana como o único membro da classe conhecido até o momento (Bazan 1997).
[00011] As quimiocinas CXC atuam principalmente sobre os neutrófilos, em particular aquelas quimiocinas CXC que carregam a sequência de aminoácidos ELR sobre a sua extremidade de amino. Os exemplos de quimiocinas CXC que são ativas sobre os neutrófilos são a IL-8, as GROα, -β, e -y, a NAP-2, a ENA-78 e a GCP-2. As quimiocinas CC atuam sobre uma variedade maior de leucócitos, tais como monócitos, macrófagos, eosinófilos, basófilos, bem como linfócitos T e B (Oppenheim 1991, Baggiolini 1994; Miller 1992; Jose 1994; Ponath 1996a). Os exemplos destas são I-309; MCP-1, -2, -3, -4, MIP-1α e -β, RANTES, e eotaxina.
[00012] As quimiocinas atuam através de receptores que pertencem a uma superfamília de sete receptores acoplados à proteína G de transposição de transmembrana (GPCRs; Murphy 2000). Falando de um modo geral, as interações entre as quimiocinas e os receptores de quimiocinas tendem a ser desordenadas pelo fato que uma quimiocina pode ligar muitos receptores de quimiocinas e, inversamente, um único receptor de quimiocina pode interagir com diversas quimiocinas. Alguns receptores conhecidos para as quimiocinas CC incluem o CCR1, que liga a MIP-1α e a RANTES (Neote 1993; Gao 1993); o CCR2, que liga as quimiocinas que incluem as MCP-1, -2, -3, e -4 (Charo 1994; Myers 1995; Gong 1997; Garcia-Zepeda 1996); o CCR3, que liga as quimiocinas que incluem a eotaxina, a RANTES, e a MCP-3 (Ponath 1996b); o CCR4, que foi verificado sinalizar em resposta à MCP-1, à MIP-1α, e à RANTES (Power 1995); e o CCR5, que mostrou sinalizar em resposta às MIP-1α e -β, e à RANTES (Boring 1996; Raport 1996; Samson 1996).
[00013] Conforme acima mencionado, todos os quatro membros da família de MCP (1-4) se ligam ao CCR2, ao passo que a MCP-2, a MCP- 3, e a MCP-4 podem também interagir com o CCR1 e o CCR3 (Gong 1997; Heath 1997; Uguccioni 1997) e, no caso da MCP-2, o CCR5 (Ruffing 1998). Uma outra quimiocina CC que mostra alta homologia com a família de MCP é a eotaxina, que foi originalmente isolada do fluido de lavagem broncoalveolar retirado de porquinhos-da-índia sensibilizados, provocados com alérgenos (Jose 1994). Foi mostrado que a eotaxina é também capaz de ativar o CCR2 (Martinelli 2001).
[00014] O problema que é a base da presente invenção é proporcionar um meio que interaja especificamente com a MCP-1. Mais especificamente, o problema que fundamenta a presente invenção é proporcionar um meio baseado em ácido nucléico que interaja especificamente com a MCP-1.
[00015] Um problema adicional fundamentando a presente invenção é proporcionar um meio para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença humana ou não-humana, pelo que a doença é caracterizada pela MCP-1 estando direta ou indiretamente envolvida no mecanismo patogenético de tal doença.
[00016] Um problema ainda adicional que é a base da presente invenção é proporcionar um meio para a fabricação de um agente diagnóstico para o tratamento de uma doença, pelo que a doença é caracterizada pela MCP-1 estando direta ou indiretamente envolvida no mecanismo patogenético de tal doença.
[00017] Estes e outros problemas que fundamentam a presente invenção são resolvidos pelo assunto das reivindicações independentes em anexo. As modalidades preferidas podem ser consideradas a partir das reivindicações dependentes.
[00018] O problema que fundamenta a presente invenção é também resolvido, em um primeiro aspecto, por um ácido nucléico, preferivelmente que se liga à MCP-1, selecionado a partir do grupo que compreende os ácidos nucléicos do tipo 1A, os ácidos nucléicos do tipo 1B, os ácidos nucléicos do tipo 2, os ácidos nucléicos do tipo 3, os ácidos nucléicos do tipo 4 e os ácidos nucléicos tendo uma sequência de ácidos nucléicos de acordo com quaisquer de SEQ ID NO: 87 a 115.
[00019] Em um primeiro subaspecto do primeiro aspecto, o ácido nucléico do tipo 1A compreende, na direção 5'^3', uma primeira Caixa de extensão B1A, uma segunda Caixa de extensão B2, uma terceira Caixa de extensão B3, uma quarta Caixa de extensão B4, uma quinta Caixa de extensão B5, uma sexta Caixa de extensão B6 e uma sétima Caixa de extensão B1B, pelo que a primeira Caixa de extensão B1A e a sétima Caixa de extensão B1B opcionalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com a hibridização, forma-se uma estrutura de fita dupla, a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de AGCRUG, a segunda Caixa de extensão B2 compreende uma sequência de nucleotídeos de CCCGGW, a terceira Caixa de extensão B3 compreende uma sequência de nucleotídeos de GUR, a quarta Caixa de extensão B4 compreende uma sequência de nucleotídeos de RYA, a quinta Caixa de extensão B5 compreende uma sequência de nucleotídeos de GGGGGRCGCGAYC a sexta Caixa de extensão B6 compreende uma sequência de nucleotídeos de UGCAAUAAUG ou URYAWUUG, e a sétima Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de CRYGCU.
[00020] Em uma modalidade preferida do primeiro subaspecto a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de AGCGUG.
[00021] Em uma modalidade do primeiro subaspecto a segunda Caixa de extensão B2 compreende uma sequência de nucleotídeos de CCCGGU.
[00022] Em uma modalidade do primeiro subaspecto a terceira Caixa de extensão B3 compreende uma sequência de nucleotídeos de GUG.
[00023] Em uma modalidade do primeiro subaspecto a quarta Caixa de extensão B4 compreende uma sequência de nucleotídeos de GUA.
[00024] Em uma modalidade do primeiro subaspecto a quinta Caixa de extensão B5 compreende uma sequência de nucleotídeos de GGGGGGCGCGACC.
[00025] Em uma modalidade do primeiro subaspecto a sexta Caixa de extensão B6 compreende uma sequência de nucleotídeos de UACAUUUG.
[00026] Em uma modalidade do primeiro subaspecto a sétima Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de CACGCU.
[00027] Em uma modalidade do primeiro subaspecto, o ácido nucléico compreende uma sequência de ácidos nucléicos de acordo com SEQ ID NO: 21.
[00028] Em um segundo subaspecto do primeiro aspecto, o ácido nucléico do tipo 1B compreende, na direção 5'^3', uma primeira Caixa de extensão B1A, uma segunda Caixa de extensão B2, uma terceira Caixa de extensão B3, uma quarta Caixa de extensão B4, uma quinta Caixa de extensão B5, uma sexta Caixa de extensão B6 e uma sétima Caixa de extensão B1B, pelo que a primeira Caixa de extensão B1A e a sétima Caixa de extensão B1B opcionalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com a hibridização, forma-se uma estrutura de fita dupla, a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de AGYRUG, a segunda Caixa de extensão B2 compreende uma sequência de nucleotídeos de CCAGCU ou CCAGY, a terceira Caixa de extensão B3 compreende uma sequência de nucleotídeos de GUG, a quarta Caixa de extensão B4 compreende uma sequência de nucleotídeos de AUG, a quinta Caixa de extensão B5 compreende uma sequência de nucleotídeos de GGGGGGCGCGACC a sexta Caixa de extensão B6 compreende uma sequência de nucleotídeos de CAUUUUA ou CAUUUA, e a sétima Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de CAYRCU.
[00029] Em uma modalidade do segundo subaspecto a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de AGCGUG.
[00030] Em uma modalidade do segundo subaspecto a segunda Caixa de extensão B2 compreende uma sequência de nucleotídeos de CCAGU.
[00031] Em uma modalidade do segundo subaspecto a sexta Caixa de extensão B6 compreende uma sequência de nucleotídeos de CAUUUUA.
[00032] Em uma modalidade do segundo subaspecto
[00033] a sétima Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de CACGCU.
[00034] Em uma modalidade do segundo subaspecto, o ácido nucléico compreende uma sequência de ácidos nucléicos de acordo com SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 27.
[00035] Em um terceiro subaspecto do primeiro aspecto, o ácido nucléico do tipo 2 compreende, na direção 5’->3’, uma primeira Caixa de extensão B1A, uma segunda Caixa de extensão B2, e uma terceira Caixa de extensão B1B, pelo que a primeira Caixa de extensão B1A e a terceira Caixa de extensão B1B opcionalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com a hibridização, forma-se uma estrutura de fita dupla, a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende ACGCA, CGCA e GCA, a segunda Caixa de extensão B2 compreende uma sequência de nucleotídeos de CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGYGGCUC, e a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende UGCGU, UGCG e UGC.
[00036] Em uma modalidade do terceiro subaspecto a segunda Caixa de extensão B2 compreende uma sequência de nucleotídeos de CGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUC.
[00037] Em uma modalidade do terceiro subaspecto b) a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de ACGCA, e a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de UGCGU; ou c) a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de CGCA, e a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de UGCG; ou d) a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de GCA, e a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de UGC ou UGCG.
[00038] Em uma modalidade do terceiro subaspecto a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de GCA.
[00039] Em uma modalidade preferida do terceiro subaspecto a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de UGCG.
[00040] Em uma modalidade do terceiro subaspecto, o ácido nucléico compreende uma sequência de ácidos nucléicos de acordo com SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117 e SEQ ID NO: 278.
[00041] Em um quarto subaspecto do primeiro aspecto, o ácido nucléico do tipo 3 compreende, na direção 5’->3’, uma primeira Caixa de extensão B1A, uma segunda Caixa de extensão B2A, uma terceira Caixa de extensão B3, uma quarta Caixa de extensão B2B, uma quinta Caixa de extensão B4, uma sexta Caixa de extensão B5A, uma sétima Caixa de extensão B6, uma oitava Caixa de extensão B5B e uma nona Caixa de extensão B1B, pelo que a primeira Caixa de extensão B1A e a nona Caixa de extensão B1B opcionalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com a hibridização, forma-se uma estrutura de fita dupla, a segunda Caixa de extensão B2A e a quarta Caixa B2B opcionalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com a hibridização, forma-se uma estrutura de fita dupla, a sexta Caixa de extensão B5A e a oitava Caixa B5B opcionalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com a hibridização, forma-se uma estrutura de fita dupla, a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos que é selecionada a partir do grupo que compreende GURCUGC, GKSYGC, KBBSC e BNGC, a segunda Caixa de extensão B2A compreende uma sequência de nucleotídeos de GKMGU, a terceira Caixa de extensão B3 compreende uma sequência de nucleotídeos de KRRAR, a quarta Caixa de extensão B2B compreende uma sequência de nucleotídeos de ACKMC, a quinta Caixa de extensão B4 compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende CURYGA, CUWAUGA, CWRMGACW e UGCCAGUG, a sexta Caixa de extensão B5A compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende GGY e CWGC, a sétima Caixa de extensão B6 compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende YAGA, CKAAU e CCUUUAU, a oitava Caixa de extensão B5B compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende GCYR e GCWG, e a nona Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende GCAGCAC, GCRSMC, GSVVM e GCNV.
[00042] Em uma modalidade do quarto subaspecto a terceira Caixa de extensão B3 compreende uma sequência de nucleotídeos de GAGAA ou UAAAA
[00043] Em uma modalidade do quarto subaspecto a quinta Caixa de extensão B4 compreende uma sequência de nucleotídeos de CAGCGACU ou CAACGACU.
[00044] Em uma modalidade do quarto subaspecto a quinta Caixa de extensão B4 compreende uma sequência de nucleotídeos de CAGCGACU e a Caixa B3 compreende uma sequência de nucleotídeos de UAAAA.
[00045] Em uma modalidade do quarto subaspecto a quinta Caixa de extensão B4 compreende uma sequência de nucleotídeos de CAACGACU e a Caixa B3 compreende uma sequência de nucleotídeos de GAGAA.
[00046] Em uma modalidade do quarto subaspecto a sétima Caixa de extensão B6 compreende uma sequência de nucleotídeos de UAGA.
[00047] Em uma modalidade do quarto subaspecto e) a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de GURCUGC, e a nona Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de GCAGCAC; ou f) a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de GKSYGC, e a nona Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de GCRSMC; ou g) a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de KBBSC, e a nona Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de GSVVM; ou h) a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de BNGC, e a nona Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de GCNV.
[00048] Em uma modalidade preferida do quarto subaspecto i) a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de GUGCUGC, e a nona Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de GCAGCAC; ou j) a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de GUGCGC, e a nona Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de GCGCAC; ou k) a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de KKSSC, e a nona Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de GSSMM; ou l) a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de SNGC, e a nona Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de GCNS.
[00049] Em uma modalidade preferida adicional do quarto subaspecto a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de GGGC, e a nona Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de GCCC.
[00050] Em uma modalidade do quarto subaspecto, a segunda Caixa de extensão B2A compreende uma sequência de nucleotídeos de GKMGU e a quarta Caixa de extensão B2B compreende uma sequência de nucleotídeos de ACKMC.
[00051] Em uma modalidade preferida do quarto subaspecto, a segunda Caixa de extensão B2A compreende uma sequência de nucleotídeos de GUAGU e a quarta Caixa de extensão B2B compreende uma sequência de nucleotídeos de ACUAC.
[00052] Em uma modalidade do quarto subaspecto m) a sexta Caixa de extensão B5A compreende uma sequência de nucleotídeos de GGY, e a oitava Caixa de extensão B5B compreende uma sequência de nucleotídeos de GCYR; ou n) a sexta Caixa de extensão B5A compreende uma sequência de nucleotídeos de CWGC, e a oitava Caixa de extensão B5B compreende uma sequência de nucleotídeos de GCWG.
[00053] Em uma modalidade preferida do quarto subaspecto a sexta Caixa de extensão B5A compreende uma sequência de nucleotídeos de GGC, e a oitava Caixa de extensão B5B compreende uma sequência de nucleotídeos de GCCG.
[00054] Em uma modalidade mais preferida do quarto subaspecto, a sexta Caixa de extensão B5A hibridiza com os nucleotídeos GCY da oitava Caixa de extensão B5B.
[00055] Em uma modalidade do quarto subaspecto, o ácido nucléico compreende uma sequência de ácidos nucléicos de acordo com SEQ ID NO: 56.
[00056] Em uma modalidade do quarto subaspecto, o ácido nucléico compreende uma sequência de ácidos nucléicos selecionada a partir do grupo que compreende as sequências de ácidos nucléicos de acordo com SEQ ID NOs: 57 a 61, SEQ ID NOs: 67 a 71 e SEQ ID NOs: 73.
[00057] Em um quinto subaspecto do primeiro aspecto, o ácido nucléico do tipo 4 compreende, na direção 5’->3’, uma primeira Caixa de extensão B1A, uma segunda Caixa de extensão B2, uma terceira Caixa de extensão B1B, pelo que a primeira Caixa de extensão B1A e a terceira Caixa de extensão B1B opcionalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com a hibridização, forma-se uma estrutura de fita dupla, a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende AGCGUGDU, GCGCGAG, CSKSUU, GUGUU, e UGUU; a segunda Caixa de extensão B2 compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende AGNDRDGBKGGURGYARGUAAAG, AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG e CAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGA, e a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende GNCASGCU, CUCGCGUC, GRSMSG, GRCAC, e GGCA.
[00058] Em uma modalidade do quinto subaspecto o) a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de GUGUU, e a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de GRCAC; p) a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de GCGCGAG, e a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de CUCGCGUC; ou q) a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de CSKSUU, e a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de GRSMSG, ou r) a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de UGUU, e a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de GGCA, ou s) a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de AGCGUGDU, e a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de GNCASGCU.
[00059] Em uma modalidade preferida do quinto subaspecto, a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de CSKSUU e a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de GRSMSG.
[00060] Em uma modalidade mais preferida do quinto subaspecto, a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma sequência de nucleotídeos de CCGCUU e a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma sequência de nucleotídeos de GGGCGG.
[00061] Em uma modalidade do quinto subaspecto a segunda Caixa de extensão B2 compreende uma sequência de nucleotídeos de AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG.
[00062] Em uma modalidade do quinto subaspecto, o ácido nucléico compreende uma sequência de ácidos nucléicos de acordo com SEQ ID NO: 80.
[00063] Em uma modalidade do primeiro até o quinto subaspecto, o ácido nucléico é capaz de ligar a MCP-1, preferivelmente a MCP-1 humana.
[00064] Em uma modalidade do primeiro até o quinto subaspecto, o ácido nucléico é capaz de ligar uma quimiocina, pelo que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina, a MCP-1, a MCP-2 e a MCP-3.
[00065] Em uma modalidade do primeiro até o quinto subaspecto, o ácido nucléico é capaz de ligar uma quimiocina, pelo que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina humana, a MCP-1 humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
[00066] Em uma modalidade do primeiro até o quinto subaspecto, o ácido nucléico é capaz de ligar a MCP-1, pelo que a MCP-1 é preferivelmente selecionada a partir do grupo que compreende a MCP- 1 de macaco, a MCP-1 de cavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1 canina, a MCP-1 de porco e a MCP-1 humana.
[00067] Em uma modalidade do primeiro até o quinto subaspecto, o ácido nucléico é capaz de ligar a MCP-1 humana.
[00068] Em uma modalidade preferida do primeiro até o quinto subaspecto, a MCP-1 tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1.
[00069] O problema que fundamenta a presente invenção é resolvido em um segundo aspecto por um ácido nucléico, preferivelmente que se liga à MCP-1 de murino, pelo que o ácido nucléico compreende uma sequência de ácidos nucléicos de acordo com SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 253 e SEQ ID NO: 254.
[00070] O problema que é a base da presente invenção é resolvido em um terceiro aspecto por um ácido nucléico, preferivelmente que se liga à MCP-1 de murino, pelo que o ácido nucléico compreende uma sequência de ácidos nucléicos de acordo com SEQ ID NO: 127.
[00071] Em uma modalidade do segundo e do terceiro aspecto, a MCP-1 de murino compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 2.
[00072] Em uma modalidade do primeiro até o terceiro aspecto, o ácido nucléico compreende uma modificação, pelo que a modificação é preferivelmente uma porção de alto peso molecular e/ou pelo que a modificação preferivelmente permite modificar as características do ácido nucléico de acordo com qualquer do primeiro, do segundo e do terceiro aspecto em termos de tempo de residência no corpo do animal ou humano, preferivelmente no corpo humano.
[00073] Em uma modalidade preferida do primeiro até o terceiro aspecto, a modificação é selecionada a partir do grupo compreendendo uma porção HES e uma porção PEG.
[00074] Em uma modalidade mais preferida do primeiro até o terceiro aspecto, a modificação é uma porção PEG consistindo em um PEG reto ou ramificado, pelo que o peso molecular da porção PEG é preferivelmente de cerca de 20 a 120 kD, mais preferivelmente de cerca de 30 a 80 kD e mais preferivelmente ainda cerca de 40 kD.
[00075] Em uma modalidade mais preferida alternativa do primeiro até o terceiro aspecto, a modificação é uma porção HES, pelo que preferivelmente o peso molecular da porção HES é de cerca de 10 a 130 kD, mais preferivelmente de cerca de 30 a 130 kD e mais preferivelmente ainda cerca de 100 kD.
[00076] Em uma modalidade do primeiro até o terceiro aspecto, a modificação é acoplada ao ácido nucléico via um ligante.
[00077] Em uma modalidade do primeiro até o terceiro aspecto, a modificação é acoplada ao ácido nucléico em seu nucleotídeo 5'- terminal e/ou seu nucleotídeo 3'-terminal e/ou a um nucleotídeo do ácido nucléico entre o nucleotídeo 5'-terminal e o nucleotídeo 3'-terminal.
[00078] Em uma modalidade do primeiro até o terceiro aspecto, os nucleotídeos do, ou os nucleotídeos que formam o, ácido nucléico são L-nucleotídeos.
[00079] Em uma modalidade do primeiro até o terceiro aspecto, o ácido nucléico é um L-ácido nucléico.
[00080] Em uma modalidade do primeiro até o terceiro aspecto, a porção do ácido nucléico capaz de ligar a MCP-1 consiste em L- nucleotídeos.
[00081] O problema que fundamenta a presente invenção é resolvido em um quarto aspecto por uma composição farmacêutica compreendendo um ácido nucléico de acordo com o primeiro, o segundo e o terceiro aspecto e opcionalmente um constituinte adicional, pelo que o constituinte adicional é selecionado a partir do grupo que compreende excipientes farmaceuticamente aceitáveis, veículos farmaceuticamente aceitáveis e agentes farmaceuticamente ativos.
[00082] Em uma modalidade do quarto aspecto, a composição farmacêutica compreende um ácido nucléico de acordo com quaisquer do primeiro até o terceiro aspecto e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00083] O problema que é a base da presente invenção é resolvido em um quinto aspecto pelo uso de um ácido nucléico de acordo com o primeiro, o segundo e o terceiro aspecto, para a fabricação de um medicamento.
[00084] Em uma modalidade do quinto aspecto, o medicamento é para uso na medicina humana ou para uso na medicina veterinária.
[00085] O problema que fundamenta a presente invenção é resolvido em um sexto aspecto pelo uso de um ácido nucléico de acordo com o primeiro, o segundo e o terceiro aspecto, para a fabricação de um meio diagnóstico.
[00086] Em uma modalidade do quinto aspecto e em uma modalidade do sexto aspecto, o medicamento e o meio diagnóstico, respectivamente, são para o tratamento e/ou a prevenção e a diagnose, respectivamente, de uma doença ou distúrbio selecionado a partir do grupo que compreende doenças inflamatórias, doenças autoimunes, encefalomielite autoimune, acidente vascular cerebral, esclerose múltipla aguda e crônica, inflamação crônica, artrite reumatoide, doenças renais, reestenose, reestenose após angioplastia, reações alérgicas agudas e crônicas, reações imunológicas ou alérgicas primárias e secundárias, asma, conjuntivite, bronquite, câncer, aterosclerose, insuficiência cardíaca cardiovascular arteriosclerótica ou acidente vascular cerebral, psoríase, artrite psoriática, inflamação do sistema nervoso, dermatite atópica, colite, endometriose, uveíte, distúrbios da retina, incluindo a degeneração macular, o descolamento da retina, a retinopatia diabética, a retinopatia de prematuridade, a retinite pigmentosa, a vitreorretinopatia proliferativa, e a coriorretinopatia serosa central; fibrose pulmonar idiopática, sarcoidose, polimiosite, dermatomiosite, anulação da imunossupressão, reduzindo o risco de infecção, sepse, inflamação renal, glomerulonefrite, glomerulonefrite progressiva rápida, glomerulonefrite proliferativa, nefropatia diabética, nefropatia obstrutiva, necrose tubular aguda, e glomeruloesclerose difusa, lúpus eritematoso sistêmico, bronquite crônica, doença de Behcet, esclerose lateral amiotrófica (ALS), aterosclerose prematura após doença de Kawasaki, infarto do miocárdio, obesidade, doença crônica do fígado, doença de Peyronie, lesão do cordão espinhal aguda, transplante de pulmão ou rim, miocardite, mal de Alzheimer e neuropatia, carcinoma de mama, carcinoma gástrico, câncer de bexiga, câncer ovariano, hamartoma, carcinoma colorretal, adenoma colônico, pancreatite, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e doenças inflamatórias dos intestinos, tais como a doença de Crohn ou a colite ulcerativa.
[00087] Sem desejar ligar-se a qualquer teoria, a adequabilidade dos ácidos nucléicos da presente invenção para propósitos diagnósticos é principalmente baseada em um nível aumentado ou diminuído de quimiocina, pelo que tal quimiocina é selecionada a partir do grupo compreendendo a eotaxina, a MCP-1, a MCP-2 e a MCP-3, mais especificamente a MCP-1. Será reconhecido pela pessoa versada na técnica que a maioria das doenças antes mencionadas mostra tal nível aumentado ou diminuído de quimiocina.
[00088] O problema que é a base da presente invenção é resolvido em um sétimo aspecto por um complexo compreendendo uma quimiocina e um ácido nucléico de acordo com o primeiro, o segundo e o terceiro aspectos, pelo que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina, a MCP-1, a MCP-2 e a MCP-3, pelo que, de preferência, o complexo é um complexo cristalino.
[00089] Em uma modalidade do sétimo aspecto, a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina humana, a MCP-1 humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
[00090] Em uma modalidade do sétimo aspecto, a quimiocina é a MCP-1, pelo que a MCP-1 é preferivelmente selecionada a partir do grupo que compreende a MCP-1 humana, a MCP-1 de macaco, a MCP- 1 de cavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1 canina e a MCP-1 de porco, mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP-1 humana.
[00091] O problema que fundamenta a presente invenção é resolvido em um oitavo aspecto pelo uso de um ácido nucléico de acordo com o primeiro, o segundo e o terceiro aspectos, para a detecção de uma quimiocina, pelo que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina, a MCP-1, a MCP-2 e a MCP-3.
[00092] Em uma modalidade do oitavo aspecto, a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina humana, a MCP-1 humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
[00093] Em uma modalidade do oitavo aspecto, a quimiocina é a MCP-1, pelo que a MCP-1 é preferivelmente selecionada a partir do grupo que compreende a MCP-1 humana, a MCP-1 de macaco, a MCP- 1 de cavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1 canina e a MCP-1 de porco, mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP-1 humana.
[00094] O problema que é a base da presente invenção é resolvido em um nono aspecto por um método para a triagem de um antagonista de quimiocina ou um agonista de quimiocina, compreendendo as seguintes etapas: - proporcionar um antagonista de candidato à quimiocina e/ou um agonista de candidato à quimiocina, - proporcionar um ácido nucléico de acordo com o primeiro, o segundo ou o terceiro aspecto, - proporcionar um sistema de teste que proporcione um sinal na presença de um antagonista de quimiocina e/ou um agonista de quimiocina, e - determinar se o antagonista de candidato à quimiocina é um antagonista de quimiocina e/ou se o agonista de candidato à quimiocina é um agonista de quimiocina, pelo que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina, a MCP-1, a MCP-2 e a MCP-3.
[00095] Em uma modalidade do nono aspecto, a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina humana, a MCP-1 humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
[00096] Em uma modalidade do nono aspecto, a quimiocina é a MCP-1, pelo que a MCP-1 é preferivelmente selecionada a partir do grupo que compreende a MCP-1 humana, a MCP-1 de macaco, a MCP- 1 de cavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1 canina e a MCP-1 de porco, mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP-1 humana.
[00097] O problema que fundamenta a presente invenção é resolvido em um décimo aspecto, por um método para a triagem de um agonista de quimiocina e/ou um antagonista de quimiocina, compreendendo as seguintes etapas: - proporcionar uma quimiocina imobilizada a uma fase, preferivelmente uma fase sólida, - proporcionar um ácido nucléico de acordo com o primeiro, o segundo ou o terceiro aspecto, preferivelmente um ácido nucléico de acordo com o primeiro aspecto, o qual está marcado, - adicionar um agonista de candidato à quimiocina e/ou um antagonista de candidato à quimiocina, e - determinar se o agonista de candidato à quimiocina é um agonista de quimiocina e/ou se o antagonista de candidato à quimiocina é um antagonista de quimiocina, pelo que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina, a MCP-1, a MCP-2 e a MCP-3.
[00098] Em uma modalidade do décimo aspecto, a determinação é realizada de modo tal que seja avaliado se o ácido nucléico é substituído pelo agonista de candidato à quimiocina ou por um antagonista de candidato à quimiocina.
[00099] Em uma modalidade do décimo aspecto, a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina humana, a MCP-1 humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
[000100] Em uma modalidade do décimo aspecto, a quimiocina é a MCP-1, pelo que a MCP-1 é preferivelmente selecionada a partir do grupo que compreende a MCP-1 humana, a MCP-1 de macaco, a MCP- 1 de cavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1 canina e a MCP-1 de porco, mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP-1 humana.
[000101] O problema que fundamenta a presente invenção é resolvido em um décimo primeiro aspecto por um kit para a detecção de uma quimiocina, compreendendo um ácido nucléico de acordo com o primeiro, o segundo e o terceiro aspectos, pelo que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina, a MCP-1, a MCP-2 e a MCP-3.
[000102] Em uma modalidade do décimo primeiro aspecto, a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina humana, a MCP-1 humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
[000103] Em uma modalidade do décimo primeiro aspecto, a quimiocina é a MCP-1, pelo que a MCP-1 é preferivelmente selecionada a partir do grupo que compreende a MCP-1 humana, a MCP-1 de macaco, a MCP-1 de cavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1 canina e a MCP-1 de porco, mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP-1 humana.
[000104] O problema que fundamenta a presente invenção é resolvido em um décimo segundo aspecto por um antagonista de quimiocina, obtenível pelo método de acordo com o décimo aspecto ou o nono aspecto, pelo que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina, a MCP-1, a MCP-2 e a MCP-3.
[000105] Em uma modalidade do décimo segundo aspecto, a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina humana, a MCP-1 humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
[000106] Em uma modalidade do décimo segundo aspecto, a quimiocina é a MCP-1, pelo que a MCP-1 é preferivelmente selecionada a partir do grupo que compreende a MCP-1 humana, a MCP-1 de macaco, a MCP-1 de cavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1 canina e a MCP-1 de porco, mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP-1 humana.
[000107] O problema que fundamenta a presente invenção é resolvido em um décimo terceiro aspecto por um agonista de quimiocina, obtenível pelo método de acordo com o décimo aspecto ou o nono aspecto, pelo que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina, a MCP-1, a MCP-2 e a MCP-3.
[000108] Em uma modalidade do décimo terceiro aspecto, a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina humana, a MCP-1 humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
[000109] Em uma modalidade do décimo terceiro aspecto, a quimiocina é a MCP-1, pelo que a MCP-1 é preferivelmente selecionada a partir do grupo que compreende a MCP-1 humana, a MCP-1 de macaco, a MCP-1 de cavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1 canina e a MCP-1 de porco, mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP-1 humana.
[000110] Será reconhecido pela pessoa versada na técnica que um agonista de quimiocina e/ou um antagonista de quimiocina é preferivelmente um agonista e antagonista, respectivamente, abrangendo a respectiva quimiocina conforme especificada neste documento. Desse modo, o agonista de quimiocina e o antagonista de quimiocina são, por exemplo, um agonista de MCP-1 e antagonista de MCP-1, respectivamente.
[000111] O problema que se baseia a presente invenção é resolvido em um décimo quarto aspecto por um método para a detecção do ácido nucléico de acordo com qualquer do primeiro, segundo e terceiro aspecto, em uma amostra, pelo que o método compreende as etapas de: a) proporcionar uma amostra contendo o ácido nucléico de acordo com a presente invenção; b) proporcionar uma sonda de captura, pelo que a sonda de captura é pelo menos parcialmente complementar a uma primeira parte do ácido nucléico de acordo com qualquer do primeiro, segundo e terceiro aspecto, e uma sonda de detecção, pelo que a sonda de detecção é pelo menos parcialmente complementar a uma segunda parte do ácido nucléico de acordo com qualquer do primeiro, segundo e terceiro aspecto, ou, alternativamente, a sonda de captura é pelo menos parcialmente complementar a uma segunda parte do ácido nucléico de acordo com qualquer do primeiro, segundo e terceiro aspecto e a sonda de detecção é pelo menos parcialmente complementar à primeira parte do ácido nucléico de acordo com qualquer do primeiro, segundo e terceiro aspecto; c) deixar que a sonda de captura e a sonda de detecção reajam simultaneamente ou em qualquer ordem sequencialmente com o ácido nucléico de acordo com qualquer do primeiro, segundo e terceiro aspecto ou parte dele; d) opcionalmente detectar se a sonda de captura é hibridizada ou não com o ácido nucléico de acordo com o ácido nucléico de acordo com qualquer do primeiro, segundo e terceiro aspecto proporcionado na etapa a); e e) detectar o complexo formado na etapa c) consistindo no ácido nucléico de acordo com qualquer do primeiro, segundo e terceiro aspecto, e na sonda de captura e na sonda de detecção.
[000112] Em uma modalidade do décimo quarto aspecto, a sonda de detecção compreende um meio de detecção, e/ou pelo que a sonda de captura pode ser imobilizada a um suporte, preferivelmente um suporte sólido.
[000113] Em uma modalidade do décimo quarto aspecto, qualquer sonda de detecção que não seja parte do complexo é removida da reação, de modo que na etapa e) somente uma sonda de detecção que seja parte do complexo seja detectada.
[000114] Em uma modalidade do décimo quarto aspecto, a etapa e) compreende a etapa de comparar o sinal gerado pelo meio de detecção quando a sonda de captura e a sonda de detecção forem hibridizadas na presença do ácido nucléico de acordo com qualquer do primeiro, segundo ou terceiro aspecto ou parte dele, e na ausência do dito ácido nucléico ou parte dele.
[000115] Em uma modalidade do décimo quarto aspecto, o ácido nucléico a ser detectado é o ácido nucléico tendo uma sequência de ácidos nucléicos de acordo com as SEQ ID NOs: 37, 116, 117 ou 278, e a sonda de captura ou a sonda de detecção compreende uma sequência de ácidos nucléicos de acordo com a SEQ ID NO: 255 ou a SEQ ID NO: 256.
[000116] Em uma modalidade do décimo quarto aspecto, o ácido nucléico a ser detectado é o ácido nucléico tendo uma sequência de ácidos nucléicos de acordo com as SEQ ID NOs: 122, 253 ou 254, e a sonda de captura ou a sonda de detecção compreende uma sequência de ácidos nucléicos de acordo com a SEQ ID NO: 281 e a SEQ ID NO: 282.
[000117] O problema que fundamenta a presente invenção é também resolvido pelo assunto das reivindicações independentes anexadas. A modalidade preferida pode ser considerada a partir das reivindicações dependentes em anexo.
[000118] As características do ácido nucléico de acordo com a presente invenção, conforme descritas neste documento, podem ser entendidas em qualquer aspecto da presente invenção onde o ácido nucléico for usado, sozinho ou em qualquer combinação.
[000119] As MCP-1 humanas, bem como de murinos, são proteínas básicas tendo a sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente.
[000120] A descoberta que poderiam ser identificados ácidos nucléicos curtos que se ligam com alta afinidade à MCP-1 é, a tal ponto, surpreendente, visto que Eaton et al. (1997) observaram que a geração de aptâmeros, isto é, Ácidos nucléicos D que se ligam a uma molécula- alvo, dirigidos para uma proteína básica, é, em geral, muito difícil porque este tipo de alvo produz uma razão de sinal para ruído alta, porém não- específica. Esta razão alta de sinal para ruído resulta da alta afinidade não-específica mostrada pelos ácidos nucléicos pelos alvos básicos, tais como a MCP-1.
[000121] Conforme resumido em mais detalhe nas reivindicações e no exemplo 1, os presentes inventores puderam mais surpreendentemente identificar diversas moléculas de ácidos nucléicos que se ligam à MCP- 1, diferentes, pelo que a maioria dos ácidos nucléicos pôde ser caracterizada em termos de extensões de nucleotídeos, que são também referidas neste documento como Caixas. As diversas moléculas de ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 podem ser categorizadas com base nas ditas Caixas e em algumas características e elementos estruturais, respectivamente. As diversas categorias assim definidas são também referidas neste documento como tipos, e mais especificamente como tipo 1A, tipo 1B, tipo 2, tipo 3 e tipo 4.
[000122] Os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção também compreenderão ácidos nucléicos que são essencialmente homólogos às sequências particulares descritas neste documento. O termo substancialmente homólogos será entendido de modo tal que a homologia seja pelo menos 75%, preferivelmente 85%, mais preferivelmente 90% e mais preferivelmente ainda mais do que 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99%.
[000123] A porcentagem real de nucleotídeos homólogos presentes no ácido nucléico de acordo com a presente invenção dependerá do número total de nucleotídeos presentes no ácido nucléico. A porcentagem de modificação pode ser baseada no número total de nucleotídeos presentes no ácido nucléico.
[000124] A homologia pode ser determinada conforme sabido para a pessoa versada na técnica. Mais especificamente, um algoritmo de comparação de sequências então calcula a porcentagem de identidade de sequência para a(s) sequência(s) de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros designados do programa. A sequência de teste é preferivelmente a sequência ou a molécula de ácido nucléico que é dita para ser ou para ser testada, se ela for homóloga, e se for assim, até que proporção, a uma outra molécula de ácido nucléico, pelo que tal outra molécula de ácido nucléico é também referida como a sequência de referência. Em uma modalidade, a sequência de referência é uma molécula de ácido nucléico conforme descrita neste documento, mais preferivelmente uma molécula de ácido nucléico tendo uma sequência de acordo com qualquer de SEQ ID NOs: 10 a 129, 132 a 256 e 278 - 282. O alinhamento opcional das sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (Smith e Waterman, 1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970), pelo método de busca por similaridade de Pearson e Lipman (Pearson e Lipman, 1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de Softwares da Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis), ou por inspeção visual.
[000125] Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar a porcentagem de identidade de sequência é o algoritmo usado na ferramenta básica de busca de alinhamento local (doravante, "BLAST"), vide, por exemplo, Altschul et al. (Altschul et al. 1990 e Altschul et al., 1997). O software para efetuar as análises por BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (doravante, "NCBI"). Os parâmetros preestabelecidos usados na determinação da identidade de sequência, usando o software disponível do NCBI, por exemplo, BLASTN (para as sequências de nucleotídeos) e BLASTP (para as sequências de aminoácidos), são descritos em McGinnis et al. (McGinnis et al., 2004).
[000126] O termo ácido nucléico inventivo ou ácido nucléico de acordo com a presente invenção também compreenderá aqueles ácidos nucléicos compreendendo as sequências de ácidos nucléicos descritas neste documento ou parte delas, preferivelmente na medida em que os ácidos nucléicos ou as ditas partes estejam envolvidas na ligação à MCP-1. O termo ácido nucléico inventivo, conforme preferivelmente usado neste documento, também compreenderá em uma modalidade um ácido nucléico que seja adequado para ligar-se a qualquer molécula selecionada a partir do grupo compreendendo MCP-2, MCP-3, MCP-4, e eotaxina. Será reconhecido pelos versados na técnica que os ácidos nucléicos individuais de acordo com a presente invenção ligar-se-ão a uma ou a diversas de tais moléculas. Tal ácido nucléico é, em uma modalidade, uma das moléculas de ácido nucléico descritas neste documento, ou um derivado e/ou um metabólito dela, pelo que tal derivado e/ou metabólito são preferivelmente um ácido nucléico truncado, comparados às moléculas de ácidos nucléicos descritas neste documento. O truncamento pode estar relacionado a qualquer uma ou a ambas as extremidades dos ácidos nucléicos, conforme descrito neste documento. Também, o truncamento pode estar relacionado à sequência interna de nucleotídeos do ácido nucléico, isto é, ele pode estar relacionado ao(s) nucleotídeo(s) entre o nucleotídeo 5' e 3' terminal, respectivamente. Além disso, o truncamento compreenderá a remoção de tão pouco quanto um único nucleotídeo da sequência dos ácidos nucléicos descritos neste documento. O truncamento pode também estar relacionado a mais do que uma extensão do(s) ácido(s) nucléico(s) inventivo(s), pelo que a extensão pode ser tão pequena quanto um nucleotídeo de comprimento. A ligação do ácido nucléico de acordo com a presente invenção, preferivelmente a uma molécula selecionada a partir do grupo compreendendo a MCP-1, a MCP-2, a MCP-3, a MCP-4 e a eotaxina, pode ser determinada pelos versados na técnica, usando experimentos de rotina ou por utilização ou adoção de um método como descrito neste documento, preferivelmente conforme descrito neste documento na parte de exemplos. Está dentro de uma modalidade da presente invenção, a não ser que explicitamente indicado ao contrário, que sempre que for referido neste documento à ligação dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção à, ou com a, MCP-1, isto se aplica também à ligação dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção a, ou com, qualquer molécula selecionada a partir do grupo que compreende a MCP-1, a MCP-2, a MCP-3, a MCP-4 e a eotaxina.
[000127] Os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção podem ser Ácidos nucléicos D ou L-ácidos nucléicos. De preferência, os ácidos nucléicos inventivos são L-ácidos nucléicos. Além disso, é possível que uma ou diversas partes do ácido nucléico estejam presentes como Ácidos nucléicos D ou pelo menos uma ou diversas partes dos ácidos nucléicos sejam L-ácidos nucléicos. O termo "parte" dos ácidos nucléicos significará tão pouco quanto um nucleotídeo. Tais ácidos nucléicos são geralmente referidos neste documento como D- e L-ácidos nucléicos, respectivamente. Portanto, em uma modalidade particularmente preferida, os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção consistem em L-nucleotídeos e compreendem pelo menos um D-nucleotídeo. Tal D-nucleotídeo está preferivelmente ligado a uma parte diferente das extensões que definem os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção, preferivelmente aquelas partes dele onde esteja envolvida uma interação com as outras partes do ácido nucléico. De preferência, tal D-nucleotídeo está ligado em uma extremidade de quaisquer das extensões e de qualquer ácido nucléico de acordo com a presente invenção, respectivamente. Em uma modalidade adicional preferida, tais D-nucleotídeos podem atuar como um espaçador ou um ligante, preferivelmente unindo as modificações, tais como PEG e HES, aos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção.
[000128] Está também dentro de uma modalidade da presente invenção que cada uma e quaisquer das moléculas de ácidos nucléicos, descritas neste documento em sua totalidade em termos de sua(s) sequência(s) de ácidos nucléicos, estejam limitadas à(s) sequência(s) de nucleotídeos particular(es). Em outras palavras, os termos "compreendendo" ou "compreende(m)" serão interpretados em tal modalidade no significado de conter ou consistir em.
[000129] Está também dentro da presente invenção que os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção são parte de um ácido nucléico mais longo, pelo que este ácido nucléico mais longo compreende diversas partes, pelo que pelo menos tal parte é um ácido nucléico de acordo com a presente invenção, ou uma parte dele. A(s) outra(s) parte(s) destes ácidos nucléicos mais longos pode(m) ser um ou diversos Ácidos nucléicos D ou um ou diversos L-ácidos nucléicos. Qualquer combinação pode ser usada em conexão com a presente invenção. Esta(s) outra(s) parte(s) do ácido nucléico mais longo, sozinhas ou consideradas conjuntamente, em sua totalidade ou em uma combinação particular, pode(m) exibir uma função que seja diferente de ligação, preferivelmente de ligação à MCP-1. Uma função possível é permitir a interação com outras moléculas, pelo que tais outras moléculas preferivelmente são diferentes da MCP-1, tal como, por exemplo, para a imobilização, a reticulação, a detecção ou a amplificação. Em uma modalidade adicional da presente invenção, os ácidos nucléicos de acordo com a invenção compreendem, como porções individuais ou combinadas, diversos dos ácidos nucléicos da presente invenção. Tal ácido nucléico compreendendo diversos dos ácidos nucléicos da presente invenção também está incluído pelo termo ácido nucléico mais longo.
[000130] Os L-ácidos nucléicos como usados neste documento são ácidos nucléicos consistindo em L-nucleotídeos, de preferência consistindo completamente em L-nucleotídeos.
[000131] Os Ácidos nucléicos D como usados neste documento são ácidos nucléicos consistindo em D-nucleotídeos, de preferência consistindo completamente em D-nucleotídeos.
[000132] Os termos ácido nucléico e molécula de ácido nucléico são usados neste documento em um modo intercambiável, se não explicitamente indicado ao contrário.
[000133] Também, se não indicado ao contrário, qualquer sequência de nucleotídeos é apresentada neste documento na direção 5' ^ 3'.
[000134] Independente de se o ácido nucléico inventivo consiste em D-nucleotídeos, L-nucleotídeos ou uma combinação de ambos, com a combinação sendo, por exemplo, uma combinação aleatória ou uma sequência definida de extensões consistindo em pelo menos um L- nucleotídeo e pelo menos um Ácido nucléico D, o ácido nucléico pode consistir em desoxirribonucleotídeo(s), ribonucleotídeo(s) ou combinações deles.
[000135] Projetar os ácidos nucléicos inventivos como L-ácido nucléico é vantajoso por diversas razões. Os L-ácidos nucléicos são enantiômeros de ácidos nucléicos de ocorrência natural. Os Ácidos nucléicos D, entretanto, não são muito estáveis em soluções aquosas e, particularmente, em sistemas biológicos ou amostras biológicas, devido à ampla presença de nucleases. As nucleases de ocorrência natural, particularmente as nucleases de células animais, não são capazes de degradar os L-ácidos nucléicos. Por causa disto, a meia- vida biológica do L-ácido nucléico é significativamente aumentada em tal sistema, incluindo o corpo animal e humano. Devido à ausência de capacidade de degradar do L-ácido nucléico, nenhum produto de degradação da nuclease é gerado e, assim, nenhum efeito colateral que surja dele observado. Este aspecto delimita o L-ácido nucléico efetivamente de todos os outros compostos que são usados na terapia de doenças e/ou distúrbios que envolvam a presença de MCP-1. Os L- ácidos nucléicos que especificamente se ligam a uma molécula-alvo através de um mecanismo diferente do emparelhamento de bases de Watson Crick, ou os aptâmeros que consistem parcial ou completamente em L-nucleotídeos, particularmente com aquelas partes do aptâmero estando envolvidas na ligação do aptâmero à molécula- alvo, são também chamados "spiegelmeros".
[000136] Está também dentro da presente invenção que os ácidos nucléicos inventivos, também referidos neste documento como ácidos nucléicos de acordo com a invenção, independente se eles estão presentes como Ácidos nucléicos D, L-ácidos nucléicos ou D, L-ácidos nucléicos, ou se eles são o DNA ou o RNA, podem estar presentes como ácidos nucléicos de fita simples ou de fita dupla. Tipicamente, os ácidos nucléicos inventivos são ácidos nucléicos de fita simples, os quais exibem estruturas secundárias definidas, devidas à sequência primária e podem, assim, também formar estruturas terciárias. Os ácidos nucléicos inventivos, entretanto, podem também ser de fita dupla no significado que duas fitas, que são complementares ou parcialmente complementares uma a outra, são hibridizadas uma com a outra. Isto confere estabilidade ao ácido nucléico, o que, em particular, será vantajoso se o ácido nucléico estiver presente na forma D de ocorrência natural, em vez da forma L.
[000137] Os ácidos nucléicos inventivos podem ser modificados. Tais modificações podem estar relacionadas ao nucleotídeo individual do ácido nucléico e são bastante conhecidas na técnica. Os exemplos para tal modificação são descritos, entre outros, em Venkatesan (2003); Kusser (2000); Aurup (1994); Cummins (1995); Eaton (1995); Green (1995); Kawasaki (1993); Lesnik (1993); e Miller (1993). Tal modificação pode ser um átomo de H, um átomo de F ou o grupo O-CH3 ou o grupo NH2 na posição 2' do nucleotídeo individual do qual consiste o ácido nucléico. Também, o ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode compreender pelo menos um nucleotídeo de LNA. Em uma modalidade, o ácido nucléico de acordo com a presente invenção consiste nos nucleotídeos de LNA.
[000138] Em uma modalidade, os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção podem ser um ácido nucléico de múltiplas partes. Um ácido nucléico de múltiplas partes, conforme usado neste documento, é um ácido nucléico que consiste em pelo menos duas fitas de ácido nucléico. Estas pelo menos duas fitas de ácido nucléico formam uma unidade funcional, pelo que a unidade funcional é um ligante para uma molécula-alvo. As pelo menos duas fitas de ácido nucléico podem ser derivadas de quaisquer dos ácidos nucléicos inventivos, por clivagem do ácido nucléico para gerar duas fitas ou por síntese de um ácido nucléico correspondendo a uma primeira parte do ácido nucléico inventivo, isto é, global, e de um outro ácido nucléico correspondendo à segunda parte do ácido nucléico global. É para ser reconhecido que tanto a clivagem quanto a síntese podem ser aplicadas para gerar um ácido nucléico de múltiplas partes onde houver mais do que duas fitas, como exemplificado acima. Em outras palavras, as pelo menos duas fitas de ácido nucléico são tipicamente diferentes de duas fitas que são complementares e hibridizam uma com a outra, embora possa existir certo grau de complementaridade entre as diversas partes do ácido nucléico.
[000139] Finalmente, está também dentro da presente invenção que seja obtida uma estrutura inteiramente fechada, isto é, circular, para os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção, isto é, que os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção sejam fechados, preferivelmente através de uma ligação covalente, pelo que mais preferivelmente tal ligação covalente é feita entre a extremidade 5' e a extremidade 3' das sequências de ácidos nucléicos, como descritas neste documento.
[000140] Os presentes inventores descobriram que os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção exibem uma faixa de valores de KD muito favorável.
[000141] Uma possibilidade de determinar a constante de ligação é o uso do assim chamado dispositivo biacore, que é também conhecido para alguém versado na técnica. A afinidade, como usada neste documento, foi também medida pelo uso do "ensaio de co- imunoprecipitação", como descrito nos exemplos. Uma medida apropriada para expressar a intensidade da ligação entre o ácido nucléico de acordo com a presente invenção ao alvo, o qual é, no presente caso, a MCP-1, e o assim chamado valor de KD, o qual, como do mesmo modo também o método para a sua determinação, é conhecido para alguém versado na técnica.
[000142] Os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção são caracterizados por certo valor de KD. De preferência, o valor de KD mostrado pelos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção está abaixo de 1 μM. Um valor de KD de cerca de 1 μM é dito ser caracterizado por uma ligação não-específica de um ácido nucléico a um alvo. Conforme será reconhecido por alguém na técnica, o valor de KD de um grupo de compostos, tal como os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção, está dentro de certa faixa. O KD acima mencionado de cerca de 1 μM é um limite superior preferido para o valor de KD. O limite inferior preferido para o KD dos ácidos nucléicos que se ligam ao alvo pode ser cerca de 10 picomolares ou maior. Está dentro da presente invenção que os valores de KD dos ácidos nucléicos individuais que se ligam à MCP-1 estão preferivelmente dentro desta faixa. As faixas preferidas podem ser definidas escolhendo-se qualquer primeiro numero dentro desta faixa e qualquer segundo número dentro desta faixa. Os valores superiores preferidos são 250 nM e 100 nM, os valores inferiores preferidos são 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM e 10 pM.
[000143] As moléculas de ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção podem ter qualquer comprimento, desde que elas ainda sejam capazes de ligar-se à molécula-alvo. Será reconhecido na técnica que existem comprimentos preferidos dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção. Tipicamente, o comprimento é entre 15 e 120 nucleotídeos. Será reconhecido pelos versados na técnica que qualquer número inteiro entre 15 e 120 é um comprimento possível para os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção. As faixas mais preferidas para o comprimento dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção são os comprimentos de cerca de 20 a 100 nucleotídeos, cerca de 20 a 80 nucleotídeos, cerca de 20 a 60 nucleotídeos, cerca de 20 a 50 nucleotídeos e cerca de 30 a 50 nucleotídeos.
[000144] Está dentro da presente invenção que os ácidos nucléicos descritos neste documento compreendem uma porção que preferivelmente é uma porção de alto peso molecular e/ou que preferivelmente permite modificar as características do ácido nucléico em termos de, entre outros, tempo de residência no corpo do animal, preferivelmente no corpo humano. Uma modalidade particularmente preferida de tal modificação é a PEGuilação e a HESilação dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção. Conforme usado aqui, PEG significa poli(etileno glicol) e HES hidroxietil amido. A PEGuilação, como preferivelmente usada neste documento, é a modificação de um ácido nucléico de acordo com a presente invenção, pelo que tal modificação consiste em uma porção PEG que é unida a um ácido nucléico de acordo com a presente invenção. A HESilação, como preferivelmente usada neste documento, é a modificação de um ácido nucléico de acordo com a presente invenção, pelo que tal modificação consiste em uma porção HES que é unida a um ácido nucléico de acordo com a presente invenção. Estas modificações, bem como o processo de modificar um ácido nucléico usando tal modificação, são descritas no pedido de patente europeu EP 1 306 382, cuja descrição é incorporada com o presente em sua totalidade, por referência.
[000145] De preferência, o peso molecular de uma modificação consistindo em, ou compreendendo, uma porção de alto peso molecular é cerca de 2.000 a 200.000 Da, preferivelmente 20.000 a 120.000 Da, particularmente no caso do PEG sendo tal porção de alto peso molecular, e é preferivelmente cerca de 3.000 a 180.000 Da, mais preferivelmente de 5.000 a 130.000 Da, particularmente no caso do HES sendo tal porção de alto peso molecular. O processo de modificação com HES é, por exemplo, descrito no pedido de patente alemão DE 1 2004 006 249.8, cuja descrição é, com o presente, incorporada em sua totalidade, por referência.
[000146] Está dentro da presente invenção que um ou outro de PEG e HES possa ser usado como uma forma linear ou ramificada, como adicionalmente descrito nos pedidos de patentes WO2005074993 e PCT/EP02/11950. Tal modificação pode, em princípio, ser feita nas moléculas de ácidos nucléicos da presente invenção em qualquer posição delas. De preferência, tal modificação é feita no nucleotídeo 5' terminal, no nucleotídeo 3' terminal e/ou em qualquer nucleotídeo entre o nucleotídeo em 5' e o nucleotídeo em 3' da molécula de ácido nucléico.
[000147] A modificação, e preferivelmente a porção PEG e/ou de HES, pode ser unida à molécula de ácido nucléico da presente invenção diretamente ou através de um ligante. Está também dentro da presente invenção que a molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção compreende uma ou mais modificações, preferivelmente uma ou mais porções de PEG e/ou de HES. Em uma modalidade, a molécula ligadora individual une mais do que uma porção PEG ou porção HES a uma molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção. O ligante usado em conexão com a presente invenção pode, ele próprio, ser linear ou ramificado. Este tipo de ligantes é conhecido para aqueles versados na técnica e é adicionalmente descrito nos pedidos de patentes WO2005074993 e PCT/EP02/11950.
[000148] Sem desejar ligar-se a qualquer teoria, parece que pela modificação dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção com uma porção de alto peso molecular, tal como um polímero, e mais particularmente os polímeros descritos neste documento, os quais são, de preferência, fisiologicamente aceitáveis, a cinética de excreção é alterada. Mais particularmente, parece que devido ao peso molecular aumentado de tais ácidos nucléicos inventivos modificados e devido aos ácidos nucléicos não estarem sujeitos ao metabolismo, particularmente quando na forma L, a excreção de um corpo de animal, preferivelmente de um corpo de mamífero, e mais preferivelmente de um corpo humano, é aumentada. Como a excreção ocorre tipicamente via os rins, os presentes inventores assumem que a taxa de filtração glomerular do ácido nucléico assim modificado é significativamente reduzida, comparado aos ácidos nucléicos não tendo este tipo de modificação de alto peso molecular, o que resulta em um aumento no tempo de residência no corpo. Em conexão com isto, é particularmente notável que, apesar de tal modificação de alto peso molecular, a especificidade do ácido nucléico de acordo com a presente invenção não é afetada em um modo prejudicial. Até tal ponto, os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção têm características surpreendentes - o que normalmente não pode ser esperado dos compostos farmaceuticamente ativos - de modo que uma formulação farmacêutica que proporcione uma liberação continuada não é necessariamente requerida para proporcionar uma liberação continuada. De preferência, os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção, em sua forma modificada compreendendo uma porção de alto peso molecular, podem, como tais, já ser usados como uma formulação de liberação continuada. Até tal ponto, a(s) modificação(ões) das moléculas de ácidos nucléicos como descritas aqui e as moléculas de ácidos nucléicos assim modificadas e qualquer composição compreendendo as mesmas podem proporcionar uma farmacocinética e uma biodistribuição singular, preferivelmente controlada, delas. Isto também inclui o tempo de residência em circulação e a distribuição para os tecidos. Tais modificações são adicionalmente descritas no pedido de patente PCT/EP02/11950.
[000149] Entretanto, está também dentro da presente invenção que os ácidos nucléicos descritos neste documento não compreendem nenhuma modificação e particularmente nenhuma modificação de alto peso molecular, tal como a PEGuilação ou a HESilação. Tal modalidade é particularmente preferida quando o ácido nucléico mostrar distribuição preferencial para qualquer órgão ou tecido-alvo no corpo. Os agentes de ácidos nucléicos com tal perfil distributivo permitiriam o estabelecimento de concentrações locais efetivas no tecido-alvo, ao mesmo tempo mantendo a concentração sistêmica baixa. Isto permitiria o uso de baixas doses, o que não somente é benéfico a partir de um ponto de vista econômico, como também reduz a exposição desnecessária dos outros tecidos ao agente de ácido nucléico, assim reduzindo o risco potencial de efeitos colaterais.
[000150] Os ácidos nucléicos inventivos, os quais são também referidos neste documento como os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção, e/ou os antagonistas de acordo com a presente invenção podem ser usados para a geração ou a fabricação de um medicamento. Tal medicamento ou uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção contém pelo menos um dos ácidos nucléicos inventivos, opcionalmente junto com mais compostos farmaceuticamente ativos, pelo que o ácido nucléico inventivo preferivelmente atua como o composto farmaceuticamente ativo propriamente dito. Tais medicamentos compreendem, nas modalidades preferidas, pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal veículo pode ser, por exemplo, a água, o tampão, a PBS, a solução de glicose, preferivelmente uma solução balanceada de sal de glicose a 5%, o amido, o açúcar, a gelatina ou qualquer outra substância veículo aceitável. Tais veículos são geralmente conhecidos para alguém versado na técnica. Será reconhecido pela pessoa versada na técnica que quaisquer modalidades, uso e aspectos, ou relacionados ao, medicamento da presente invenção são também aplicáveis à composição farmacêutica da presente invenção e vice-versa.
[000151] A indicação, as doenças e os distúrbios para o tratamento e/ou a prevenção, dos quais os ácidos nucléicos, as composições farmacêuticas e os medicamentos de acordo com, ou preparados de acordo com, a presente invenção, resultam a partir do envolvimento, direto ou indireto, da MCP-1 no mecanismo patogenético respectivo. Entretanto, também aquelas indicações, doenças e distúrbios podem ser tratados e prevenidos no mecanismo patogenético do qual a MCP- 2, a MCP-3, a MCP-4 e/ou a eotaxina estão direta ou indiretamente envolvidas. É óbvio para aqueles versados na técnica que podem ser usados, até tal ponto, particularmente aqueles ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção, isto é, para as doenças que envolvam, no sentido mais amplo, a MCP-2, a MCP-3, a MCP-4 e a eotaxina, que interagem e se ligam, respectivamente, à ou com a MCP-2, a MCP-3, a MCP-4 e a eotaxina, respectivamente.
[000152] Mais especificamente, tais usos originam-se, entre outros, do padrão de expressão da MCP-1, o que sugere que ela desempenha funções nas doenças humanas que são caracterizadas por infiltração de células mononucleares. Tal infiltração de células está presente em muitas doenças inflamatórias e autoimunes. Em modelos de animais, a MCP-1 mostrou ser expressa no cérebro após isquemia focal (Kim 1995; Wang 1995) e durante a encefalomielite autoimune experimental (Hulkower 1993; Ransohoff 1993; Banisor 2005). A MCP-1 pode ser uma quimiocina importante que direciona as células mononucleares no processo da doença ilustrado por estes modelos de animais, tal como o acidente vascular cerebral e a esclerose múltipla.
[000153] Um grande corpo de evidência argumenta em favor de uma função única do eixo MCP-1/CCR2 na quimiotaxia de monócitos e, assim, na inflamação crônica: (i) os camundongos deficientes de MCP- 1 ou CCR2 mostram resposta quimiotática de macrófagos marcadamente reduzida, enquanto de outro modo pareceriam normais (Kuziel 1997; Kurihara 1997; Boring 1997; Lu 1998). (ii), apesar da redundância funcional com outras quimiocinas in vitro, a perda da função efetora da MCP-1 sozinha é suficiente para prejudicar o tráfego em diversos modelos inflamatórios (Lloyd 1997; Furuichi 2003; Egashira 2002; Galasso 2000; Ogata 1997; Kennedy 1998; Gonzalo 1998; Kitamoto 2003). (iii), os níveis de MCP-1 são elevados em muitas doenças inflamatórias. Na realidade, a MCP-1 é acreditada desempenhar uma função em muitas doenças com e sem um componente inflamatório óbvio, tais como a artrite reumatoide (Koch 1992; Hosaka 1994; Akahoshi 1993; Harigai 1993; Rollins 1996), a doença renal (Wada 1996; Viedt 2002), a reestenose após angioplastia (Economou 2001), a alergia e a asma (Alam 1996; Holgate 1997; Gonzalo 1998), o câncer (Salcedo 2000; Gordillo 2004), a aterosclerose (Nelken 1991; Yla-Herttuala 1991; Schwartz 1993; Takeya 1993; Boring 1998), a psoríase (Vestergaard 2004), a inflamação do sistema nervoso (Huang 2001), a dermatite atópica (Kaburagi 2001), a colite (Okuno 2002), a endometriose (Jolicoeur 2001), a uveíte (Tuaillon 2002), os distúrbios da retina (Nakazawa 2007), a fibrose pulmonar idiopática e a sarcoidose (Iyonaga 1994) e a polimiosite/dermatomiosite (De Bleecker 2002).
[000154] A intervenção terapêutica com os agentes anti-MCP-1 - ou os antagonistas de CCR2 - afetaria o tráfego em excesso de monócitos inflamatórios, porém pode escassear o tráfego basal de fagócitos, desse modo evitando a imunossupressão geral e o risco aumentado de infecções (Dawson 2003).
[000155] Adicionalmente, com base no conhecimento crescente sobre os mecanismos moleculares do processo inflamatório e da interação de mediadores da inflamação localmente secretados, identificaram-se novos alvos para a terapia das doenças renais (Holdsworth 2000; Segerer 2000). Um destes alvos, para os quais existem dados sólidos sobre a expressão e os estudos de intervenção com antagonistas específicos em modelos de animais apropriados, é a MCP-1. Esta proteína tem uma função amplamente não redundante para o recrutamento de células imunes para locais da inflamação renal. A infiltração de células imunes no rim é acreditada ser um mecanismo principal de dano renal estrutural e declínio da função renal no desenvolvimento de diversas formas de doença dos rins.
[000156] Todos os tipos de células renais podem expressar as quimiocinas, incluindo a MCP-1, com o estímulo in vitro (Segerer 2000); há uma longa lista de estímulos que desencadeiam a expressão da MCP-1 in vitro, incluindo as citocinas, os radicais de oxigênio, os complexos imunes, e os mediadores de lipídios.
[000157] Nos rins saudáveis de ratos e camundongos, a MCP-1 não é expressa, porém é prontamente supra-regulada durante o curso de modelos de rodentes agudos e crônicos de inflamação renal, incluindo a glomerulonefrite complexa imune, a glomerulonefrite progressiva rápida, a glomerulonefrite proliferativa, a nefropatia diabética, a nefropatia obstrutiva, ou a necrose tubular aguda (Segerer 2000; Anders 2003). Os dados de expressão para a MCP-1 de fato correlacionam-se bem com a expressão respectiva verificada nas biopsias renais humanas (Rovin 1994; Cockwell 1998, Wada 1999). Além disso, a expressão renal em rins humanos está associada com a atividade da doença e declina quando a terapia apropriada induziu a remissão da doença (Amann 2003).
[000158] A infiltração de células mononucleares glomerulares está associada com o desenvolvimento de uma glomeruloesclerose difusa em pacientes com nefropatia diabética. A MCP-1 desempenha uma função importante no recrutamento e no acúmulo de monócitos e linfócitos dentro do glomérulo (Banba 2000; Morii 2003).
[000159] A MCP-1 produzida localmente parece estar particularmente envolvida na iniciação e na progressão do dano tubulointersticial, conforme documentado em experimentos usando camundongos transgênicos com nefrite induzida por soro nefrotóxico (NSN). A MCP-1 foi principalmente detectada em células endoteliais vasculares, células epiteliais tubulares e células mononucleares infiltradas nas lesões intersticiais. A ativação mediada pela MCP-1 das células epiteliais tubulares está consistente com a noção que a MCP-1 contribui para a inflamação tubulointersticial, uma característica distintiva da doença renal progressiva (Wada 2001; Viedt 2002).
[000160] Devido à homologia entre a MCP-1, por um lado, e a MCP- 2, a MCP-3, a MCP-4 e a eotaxina, por outro lado, os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção, pelo menos aqueles deles que interagem com, ou se ligam à, a MCP-2, a MCP-3, a MCP-4 e eotaxina, respectivamente, podem tipicamente ser usados para o tratamento, a prevenção e/ou a diagnose de qualquer doença onde a MCP-2, a MCP- 3, a MCP-4 e a eotaxina, respectivamente, estejam, direta ou indiretamente, envolvidas. Envolvida, conforme preferivelmente usado neste documento, significa que se a molécula respectiva que está envolvida na doença for impedida de exercer uma, diversas ou todas as suas funções em conexão com o mecanismo patogenético que fundamenta a doença, a doença será curada ou o seu grau diminuído ou o seu surto impedido; pelo menos os sintomas ou qualquer indicador de tal doença serão aliviados e melhorados, respectivamente, de modo tal que os sintomas e o indicador, respectivamente, sejam idênticos ou próximos ao(s) observado(s) em um paciente que não sofre da doença ou não corre o risco de desenvolver tal doença.
[000161] Obviamente, porque os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção que se ligam à MCP-1 interagem com a, ou se ligam à, MCP-1 humana ou de murino, uma pessoa versada geralmente entenderá que os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção que se ligam à MCP-1 podem facilmente ser usados para o tratamento, a prevenção e/ou a diagnose de qualquer doença conforme descrita neste documento de seres humanos e animais.
[000162] Estes membros da família de proteína quimiotática de monócitos (MCP), isto é, a MCP-2, a MCP-3, a MCP-4 e a eotaxina, desse modo, compartilham um alto grau de similaridade de sequência com a MCP-1. Embora não exclusivamente, a eotaxina, as MCP-2, -3, e -4 interagem via o CCR3, o receptor de quimiocina característico sobre os eosinófilos humanos (Heath 1997). O receptor CCR3 é supra- regulado em condições neoplásticas, tais como o linfoma de células T cutâneo (Kleinhans 2003), o glioblastoma (Kouno 2004), ou o carcinoma de células renais (Johrer 2005).
[000163] Mais especificamente, os níveis aumentados de eotaxina estão diretamente associados com o diagnóstico de asma e a função do pulmão comprometida (Nakamura 1999). A expressão elevada da eotaxina em locais de inflamação alérgica foi observada em asmáticos tanto atópicos quanto não atópicos (Ying 1997; Ying 1999). Também, os mRNAs que codificam para as MCP-2 e -4 são constitutivamente expressos em uma variedade de tecidos; as suas funções fisiológicas nestes contextos, entretanto, são desconhecidas. Os níveis de MCP-2 no plasma são elevados na sepse juntamente com a MCP-1 (Bossink 1995); a expressão da MCP-3 ocorre em asmáticos (Humbert 1997). Finalmente, a MCP-4 pode ser encontrada na superfície luminal de vasos ateroscleróticos (Berkhout 1997).
[000164] Desse modo, a doença e/ou os distúrbios e/ou as condições de doença para o tratamento e/ou a prevenção dos quais pode ser usado o medicamento de acordo com a presente invenção incluem, porém não estão limitados às, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, encefalomielite autoimune, acidente vascular cerebral, esclerose múltipla aguda e crônica, inflamação crônica, artrite reumatoide, doenças renais, reestenose, reestenose após angioplastia, reações alérgicas agudas e crônicas, reações imunológicas ou alérgicas primárias e secundárias, asma, conjuntivite, bronquite, câncer, aterosclerose, insuficiência cardíaca cardiovascular arteriosclerótica ou acidente vascular cerebral, psoríase, artrite psoriática, inflamação do sistema nervoso, dermatite atópica, colite, endometriose, uveíte, distúrbios da retina, incluindo a degeneração macular, o descolamento da retina, a retinopatia diabética, a retinopatia de prematuridade, a retinite pigmentosa, a vitreorretinopatia proliferativa, e a coriorretinopatia serosa central; fibrose pulmonar idiopática, sarcoidose, polimiosite, dermatomiosite, anulação da imunossupressão, reduzindo o risco de infecção, sepse, inflamação renal, glomerulonefrite, glomerulonefrite progressiva rápida, glomerulonefrite proliferativa, nefropatia diabética, nefropatia obstrutiva, necrose tubular aguda, e glomeruloesclerose difusa, lúpus eritematoso sistêmico, bronquite crônica, doença de Behcet, esclerose lateral amiotrófica (ALS), aterosclerose prematura após doença de Kawasaki, infarto do miocárdio, obesidade, doença crônica do fígado, doença de Peyronie, lesão do cordão espinhal aguda, transplante de pulmão ou rim, miocardite, mal de Alzheimer, e neuropatia, carcinoma de mama, carcinoma gástrico, câncer de bexiga, câncer ovariano, hamartoma, carcinoma colorretal, adenoma colônico, pancreatite, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e doenças inflamatórias dos intestinos, tais como a doença de Crohn ou a colite ulcerativa.
[000165] Em uma modalidade adicional, o medicamento compreende um agente farmaceuticamente ativo adicional. Tais compostos farmaceuticamente ativos adicionais são, entre outros, porém não limitados a eles, aqueles sabidos controlar a pressão sanguínea e o diabete, tais como os inibidores da enzima conversora de angiotensina (ACE) e os bloqueadores do receptor de angiotensina. O composto farmaceuticamente ativo adicional pode ser, em uma modalidade adicional, também um daqueles compostos que reduzem a infiltração de células imunes em locais de inflamação crônica ou geralmente suprimem a resposta imune excessiva que está presente em indicações inflamatórias crônicas e que resulta no dano do tecido. Tais compostos podem ser, porém não estão limitados aos, esteróides e supressores imunes e são preferivelmente selecionados a partir do grupo que compreende os corticosteróides, como a prednisona, a metilprednisolona, a hidrocortisona, a dexametasona, e os imunossupressores gerais, tais como a ciclofosfamida, a ciclosporina, o clorambucil, a azatioprina, o tacrolimus ou o micofenolato mofetil. Adicionalmente, os bloqueadores mais específicos da co-estimulação das células T, por exemplo, os bloqueadores de CD154 ou CD40 ou CD28 ou CD86 ou CD80; ou os agentes de redução das células T e/ou B, como um agente anti-CD20, são úteis em modalidades adicionais. Finalmente, o agente farmaceuticamente ativo adicional pode ser um modulador da atividade de qualquer outra quimiocina, o qual pode ser um agonista ou antagonista de quimiocina ou um agonista ou antagonista de receptor de quimiocina. Alternativa, ou adicionalmente, tal agente farmaceuticamente ativo adicional é um ácido nucléico adicional de acordo com a presente invenção. Alternativamente, o medicamento compreende pelo menos um ácido nucléico que se liga a uma molécula-alvo diferente da MCP-1 ou exibe uma função que seja diferente daquela dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção.
[000166] Está dentro da presente invenção que o medicamento é alternativa ou adicionalmente usado, em princípio, para a prevenção de quaisquer das doenças descritas em conexão com o uso do medicamento para o tratamento das ditas doenças. Os marcadores respectivos, portanto, isto é, para as doenças respectivas, são conhecidos para aqueles versados na técnica. De preferência, o marcador respectivo é a MCP-1. Alternativa e/ou adicionalmente, o marcador respectivo é selecionado a partir do grupo que compreende a MCP-2, a MCP-3, a MCP-4 e a eotaxina. Ainda um grupo adicional de marcadores é selecionado a partir do grupo que compreende os anticorpos auto-reativos no plasma, tais como, por exemplo, os anticorpos anti-dsDNA ou o fator reumatoide.
[000167] Em uma modalidade do medicamento da presente invenção, tal medicamento é para uso em combinação com outros tratamentos para quaisquer das doenças descritas neste documento, particularmente aquelas para as quais o medicamento da presente invenção é para ser usado.
[000168] A "terapia de combinação" (ou "co-terapia") inclui a administração de um medicamento da invenção e pelo menos um segundo agente, como parte de um regime de tratamento específico pretendido para proporcionar o efeito benéfico a partir da ação em conjunto destes agentes terapêuticos, isto é, o medicamento da presente invenção e o dito segundo agente. O efeito benéfico da combinação inclui, porém não está limitado à ação farmacocinética ou farmacodinâmica em conjunto que resulta da combinação dos agentes terapêuticos. A administração destes agentes terapêuticos em combinação tipicamente é efetuada durante um período de tempo definido (normalmente minutos, horas, dias ou semanas, dependendo da combinação selecionada).
[000169] A "terapia de combinação" pode ser, porém geralmente não é, pretendida incluir a administração de dois ou mais destes agentes terapêuticos como parte de regimes separados de monoterapia que incidental e arbitrariamente resultam nas combinações da presente invenção. A "terapia de combinação" é pretendida incluir a administração destes agentes terapêuticos em um modo sequencial, ou seja, onde cada agente terapêutico é administrado em um tempo diferente, bem como a administração destes agentes terapêuticos, ou pelo menos dois dos agentes terapêuticos, em um modo substancialmente simultâneo. A administração substancialmente simultânea pode ser efetuada, por exemplo, através de administração a um paciente de uma cápsula individual tendo uma razão fixa de cada agente terapêutico, ou em cápsulas individuais, múltiplas, para cada um dos agentes terapêuticos.
[000170] A administração sequencial ou substancialmente simultânea de cada agente terapêutico pode ser efetuada por qualquer rota apropriada, incluindo, porém não limitada às rotas tópicas, rotas orais, rotas intravenosas, rotas intramusculares, e absorção direta através de tecidos da membrana mucosa. Os agentes terapêuticos podem ser administrados por rotas iguais ou por rotas diferentes. Por exemplo, um primeiro agente terapêutico da combinação selecionada pode ser administrado por injeção, enquanto os outros agentes terapêuticos da combinação podem ser administrados topicamente.
[000171] Alternativamente, por exemplo, todos os agentes terapêuticos podem ser administrados topicamente ou todos os agentes terapêuticos podem ser administrados por injeção. A sequência na qual são administrados os agentes terapêuticos não é estreitamente crítica, a não ser que de outro modo observado. A "terapia de combinação" também pode incluir a administração dos agentes terapêuticos conforme descritos acima em combinação adicional com outros ingredientes biologicamente ativos. Onde a terapia de combinação adicionalmente compreender um tratamento que não seja por fármaco, o tratamento que não é por fármaco pode ser conduzido em qualquer tempo adequado, desde que seja atingido um efeito benéfico a partir da ação em conjunto da combinação dos agentes terapêuticos e o tratamento que não é por fármaco. Por exemplo, nos casos apropriados, o efeito benéfico ainda é atingido quando o tratamento que não é por fármaco for removido de modo temporário da administração dos agentes terapêuticos, talvez por dias ou mesmo por semanas.
[000172] Conforme resumido em termos gerais acima, o medicamento de acordo com a presente invenção pode ser administrado, em princípio, em qualquer forma conhecida para aqueles versados na técnica. Uma rota preferida de administração é a administração sistêmica, mais preferivelmente a administração parenteral, preferivelmente por injeção. De modo alternativo, o medicamento pode ser administrado localmente. As outras rotas de administração compreendem a intramuscular, a intraperitoneal, e a subcutânea, a peroral, a intranasal, a intratraqueal ou a pulmonar, com preferência dada à rota de administração que seja menos invasiva, ao mesmo tempo assegurando a eficiência.
[000173] A administração parenteral é geralmente usada para as injeções e as infusões subcutâneas, intramusculares ou intravenosas. Adicionalmente, uma abordagem para a administração parenteral emprega a implantação de um sistema de liberação lenta ou de liberação continuada, o qual assegura que um nível constante de dosagem seja mantido, que é bastante conhecido para o versado na técnica.
[000174] Além disso, os medicamentos preferidos da presente invenção podem ser administrados na forma intranasal, via uso tópico de veículos, inalantes intranasais adequados, ou via rotas transdérmicas, usando aquelas formas de emplastros transdérmicos de pele bastante conhecidos para aqueles versados na técnica. Para ser administrada na forma de um sistema de distribuição transdérmica, a administração da dosagem, obviamente, será contínua, em vez de intermitente, por todo o regime de dosagem. As outras preparações tópicas preferidas incluem os cremes, os unguentos, as loções, os sprays de aerossóis e os géis, onde a concentração de ingrediente ativo tipicamente variaria de 0,01% a 15%, p/p ou p/v.
[000175] O medicamento da presente invenção geralmente compreenderá uma quantidade efetiva do(s) componente(s) ativo(s) da terapia, porém não limitado(s) a uma molécula de ácido nucléico da presente invenção, dissolvida ou dispersa em um meio farmaceuticamente aceitável. Os meios ou os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores da absorção e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias ativas farmacêuticas é bastante conhecido na técnica. Podem também ser incorporados ingredientes ativos suplementares no medicamento da presente invenção.
[000176] Em um aspecto adicional, a presente invenção está relacionada a uma composição farmacêutica. Tal composição farmacêutica compreende pelo menos um dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção e preferivelmente um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal veículo pode ser qualquer veículo ou qualquer aglutinante usado e/ou conhecido na técnica. Mais particularmente, tal aglutinante ou veículo é qualquer aglutinante ou veículo conforme discutido em conexão com a fabricação do medicamento descrito neste documento. Em uma modalidade adicional, a composição farmacêutica compreende um agente farmaceuticamente ativo adicional.
[000177] A preparação de um medicamento e de uma composição farmacêutica será conhecida para aqueles versados na técnica levando em consideração a presente descrição. Tipicamente, tais composições podem ser preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, líquido antes da injeção; como comprimidos ou outros sólidos para a administração oral; como cápsulas de liberação com o tempo; ou em qualquer outra forma atualmente usada, incluindo os colírios, os cremes, as loções, as pomadas, os inalantes e similares. O uso de formulações estéreis, tais como as loções à base de solução salina, por cirurgiões, médicos ou profissionais da saúde, para tratar uma área particular no campo de operação, pode também ser particularmente útil. As composições podem também ser distribuídas via microdispositivo, micropartícula ou esponja.
[000178] Com a formulação, um medicamento será administrado em um modo compatível com a formulação de dosagem, e em tal quantidade conforme for farmaceuticamente efetiva. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagens, tais como o tipo de soluções injetáveis descritas acima, porém as cápsulas de liberação de fármacos e similares podem também ser empregadas.
[000179] Neste contexto, a quantidade de ingrediente ativo e o volume da composição a ser administrada dependem do indivíduo ou do paciente a ser tratado. As quantidades específicas de composto ativo requerido para a administração dependem do julgamento do profissional e são peculiares para cada indivíduo.
[000180] Tipicamente se utiliza um volume mínimo de um medicamento requerido para dispersar os compostos ativos. Os regimes adequados para a administração são também variáveis, porém seriam tipificados administrando inicialmente o composto e monitorando os resultados e então dando doses controladas adicionais em intervalos adicionais.
[000181] Por exemplo, para a administração oral na forma de um comprimido ou cápsula (por exemplo, uma cápsula gelatinosa), o componente de fármaco ativo, isto é, uma molécula de ácido nucléico da presente invenção e/ou qualquer agente farmaceuticamente ativo adicional, também referido neste documento como agente(s) terapêutico(s) ou composto(s) ativo(s), pode ser combinado com um veículo inerte, farmaceuticamente aceitável, não tóxico, oral, tal como o etanol, o glicerol, a água e similar. Além disso, quando desejado ou necessário, os aglutinantes, os lubrificantes, os agentes desintegrantes, e os agentes corantes adequados podem também ser incorporados na mistura. Os aglutinantes adequados incluem o amido, o silicato de magnésio alumínio, a pasta de amido, a gelatina, a metilcelulose, a carboximetilcelulose sódica e/ou a polivinilpirrolidona, os açúcares naturais, tais como a glicose ou a beta-lactose, os adoçantes de milho, as gomas naturais e sintéticas, tais como a acácia, o tragacanto ou o alginato de sódio, o polietileno glicol, as ceras, e similares. Os lubrificantes usados nestas formas de dosagens incluem o oleato de sódio, o estearato de sódio, o estearato de magnésio, o benzoato de sódio, o acetato de sódio, o cloreto de sódio, a sílica, o talco, o ácido esteárico, o seu sal de magnésio ou cálcio e/ou o polietileno glicol, e similares. Os desintegrantes incluem, sem limitação, o amido, a metil celulose, o ágar, a bentonita, os amidos de goma xantana, o ágar, o ácido algínico ou o seu sal sódico, ou as misturas efervescentes, e similares. Os diluentes incluem, por exemplo, a lactose, a dextrose, a sacarose, o manitol, o sorbitol, a celulose e/ou a glicina.
[000182] O medicamento da invenção pode também ser administrado em tais formas de dosagens orais como comprimidos ou cápsulas de liberação com o tempo e de liberação continuada, pílulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaropes e emulsões. Os supositórios são vantajosamente preparados a partir de emulsões ou suspensões graxas.
[000183] A composição farmacêutica ou o medicamento pode ser esterilizado e/ou conter adjuvantes, tais como agentes conservantes, estabilizantes, umidificantes ou emulsificantes, promotores de solução, sais para regular a pressão osmótica e/ou tampões. Além disso, eles podem também conter outras substâncias terapeuticamente valiosas. As composições são preparadas de acordo com métodos convencionais de mistura, granulação, ou revestimento, e tipicamente contêm cerca de 0,1% a 75%, preferivelmente cerca de 1% a 50%, do ingrediente ativo.
[000184] As composições líquidas, particularmente injetáveis, podem, por exemplo, ser preparadas por dissolução, dispersão, etc. O composto ativo é dissolvido em, ou misturado com, um solvente farmaceuticamente puro, tal como, por exemplo, a água, a solução salina, a dextrose aquosa, o glicerol, o etanol, e similares, para, desse modo, formar a solução ou a suspensão injetável. Adicionalmente, podem ser formuladas formas sólidas adequadas para dissolução em líquido antes da injeção.
[000185] Para as composições sólidas, os excipientes incluem os graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose, carbonato de magnésio, e similares. O composto ativo definido acima pode ser também formulado como supositórios, usando, por exemplo, os polialquileno glicóis, por exemplo, o propileno glicol, como o veículo. Em algumas modalidades, os supositórios são vantajosamente preparados a partir de emulsões ou suspensões graxas.
[000186] Os medicamentos e as moléculas de ácidos nucléicos, respectivamente, da presente invenção podem também ser administrados na forma de sistemas de distribuição de lipossomos, tais como as pequenas vesículas unilamelares, as grandes vesículas unilamelares e as vesículas multilamelares. Os lipossomos podem ser formados a partir de uma variedade de fosfolipídios, contendo colesterol, estearilamina ou fosfatidil colinas. Em algumas modalidades, um filme de componentes lipídicos é hidratado com uma solução aquosa do fármaco para formar a camada lipídica que encapsula o fármaco, o que é bem conhecido para o versado na técnica. Por exemplo, as moléculas de ácidos nucléicos descritas neste documento podem ser proporcionadas como um complexo com um composto lipofílico ou composto de alto peso molecular, não imunogênico, construído usando métodos conhecidos na técnica. Adicionalmente, os lipossomos podem conter tais moléculas de ácidos nucléicos sobre a sua superfície, para alvejar e carregar agentes citotóxicos internamente para mediar a morte celular. Um exemplo de complexos associados com ácidos nucléicos é proporcionado na Patente U.S. No 6.011.020.
[000187] Os medicamentos e as moléculas de ácidos nucléicos, respectivamente, da presente invenção podem também ser acoplados com polímeros solúveis como veículos de fármacos alvejáveis. Tais polímeros podem incluir a polivinilpirrolidona, o copolímero de pirano, o poliidroxipropil-metacrilamida-fenol, o poliidroxietilaspanamidafenol, ou a polietilenooxidopolilisina substituída com resíduos de palmitoíla. Além disso, os medicamentos e as moléculas de ácidos nucléicos, respectivamente, da presente invenção podem ser acoplados a uma classe de polímeros biodegradáveis, úteis em obter a liberação controlada de um fármaco, por exemplo, o poli(ácido láctico), a poliépsilon capro lactona, o poliidróxi ácido butírico, os poliortoésteres, os poliacetais, os polidiidropiranos, os policianoacrilatos e os copolímeros em blocos reticulados ou anfipáticos de hidrogéis.
[000188] Se desejado, a composição farmacêutica e o medicamento, respectivamente, a serem administrados podem também conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentes umidificantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento de pH, e outras substâncias, tais como, por exemplo, o acetato de sódio, e o oleato de trietanolamina.
[000189] O regime de dosagem que utiliza as moléculas de ácidos nucléicos e os medicamentos, respectivamente, da presente invenção é selecionado de acordo com uma variedade de fatores, incluindo o tipo, a espécie, a idade, o peso, o sexo e a condição médica do paciente; a gravidade da condição a ser tratada; a rota de administração, a função renal e hepática do paciente; e o aptâmero particular ou o seu sal empregado. Um médico ou veterinário comumente versado pode prontamente determinar e prescrever a quantidade efetiva do fármaco requerido para prevenir, deter ou parar o progresso da condição.
[000190] Os níveis efetivos no plasma do ácido nucléico de acordo com a presente invenção preferivelmente variam de 500 fM a 500 μM no tratamento de quaisquer das doenças descritas neste documento.
[000191] As moléculas de ácidos nucléicos e os medicamentos, respectivamente, da presente invenção podem preferivelmente ser administrados em uma única dose diária, de dois em dois ou de três em três dias, semanalmente, de duas em duas semanas, em uma dose única mensal ou de três em três meses.
[000192] Está dentro da presente invenção que o medicamento, conforme descrito neste documento, constitui a composição farmacêutica descrita neste documento.
[000193] Em um aspecto adicional, a presente invenção está relacionada a um método para o tratamento de um paciente que esteja necessitado de tal tratamento, pelo que o método compreende a administração de uma quantidade farmaceuticamente ativa de pelo menos um dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, o paciente sofre de uma doença ou corre o risco de desenvolver tal doença, pelo que a doença é quaisquer daquelas descritas neste documento, particularmente quaisquer daquelas doenças descritas em conexão com o uso de quaisquer dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção para a fabricação de um medicamento.
[000194] É para ser entendido que o ácido nucléico e também os antagonistas de acordo com a presente invenção podem ser usados não somente como um medicamento ou para a fabricação de um medicamento, porém também para propósitos cosméticos, particularmente em relação ao envolvimento da MCP-1 em lesões da pele regionais inflamadas. Portanto, uma condição ou doença adicional para o tratamento ou a prevenção da qual podem ser usados o ácido nucléico, o medicamento e/ou a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é as lesões da pele regionais inflamadas.
[000195] Conforme preferivelmente usado neste documento, um agente diagnóstico ou meio diagnóstico é adequado para detectar, direta ou indiretamente, a MCP-1, preferivelmente a MCP-1 conforme descrita neste documento, e mais preferivelmente a MCP-1 conforme descrita neste documento em conexão com os diversos distúrbios e doenças descritos neste documento. Entretanto, até o ponto em que as moléculas de ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção estão também se ligando a quaisquer, algumas ou todas de MCP-2, MCP-3, MCP-4 e eotaxina, tais moléculas de ácidos nucléicos podem também ser usadas para a diagnose de doenças e distúrbios, respectivamente, cujo mecanismo patogenético está direta ou indiretamente ligado ou associado com a superexpressão ou a superatividade com a MCP-2, a MCP-3, a MCP-4 e/ou a eotaxina. O diagnóstico é adequado para a detecção e/ou o acompanhamento de quaisquer dos distúrbios e doenças, respectivamente, descritos neste documento. Tal detecção é possível através da ligação dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção à MCP-1. Tal ligação pode ser direta ou indiretamente detectada. Os métodos e os meios respectivos são conhecidos para aqueles versados na técnica. Entre outros, os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção podem compreender um rótulo que permite a detecção dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção, preferivelmente do ácido nucléico ligado à MCP-1. Tal rótulo é preferivelmente selecionado a partir do grupo que compreende rótulos radioativos, enzimáticos e fluorescentes. Em princípio, todos os ensaios conhecidos desenvolvidos para anticorpos podem ser adotados para os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção, considerando que o anticorpo de ligação ao alvo é substituído por um ácido nucléico de ligação ao alvo. Nos ensaios de anticorpos usando anticorpos de ligação a alvos não marcados, a detecção é preferivelmente feita por um anticorpo secundário, o qual é modificado com rótulos radioativos, enzimáticos e fluorescentes e se liga ao anticorpo de ligação ao alvo em seu fragmento Fc. No caso de um ácido nucléico, preferivelmente um ácido nucléico de acordo com a presente invenção, o ácido nucléico é modificado com tal rótulo, pelo que preferivelmente tal rótulo é selecionado a partir do grupo que compreende biotina, Cy-3 e Cy-5, e tal rótulo é detectado por um anticorpo dirigido contra tal rótulo, por exemplo, um anticorpo antibiotina, um anticorpo anti-Cy3 ou um anticorpo anti-Cy5, ou - no caso que o rótulo é a biotina - o rótulo é detectado por estreptavidina ou avidina, que naturalmente se ligam à biotina. Tal anticorpo, estreptavidina ou avidina, por sua vez, é preferivelmente modificada com um rótulo respectiva, por exemplo, um rótulo radioativo, enzimático ou fluorescente (como um anticorpo secundário).
[000196] Em uma modalidade adicional, as moléculas de ácidos nucléicos de acordo com a invenção são detectadas ou analisadas por um segundo meio de detecção, onde o dito meio de detecção é um rótulo molecular. A metodologia de rótulo molecular é conhecida para as pessoas versadas na técnica. Em resumo, as sondas de ácidos nucléicos, que são também referidas como rótulos moleculares, são um complemento invertido para a amostra de ácidos nucléicos a ser detectada e hibridizam por causa disto com uma parte da amostra de ácido nucléico a ser detectada. Com a ligação à amostra de ácido nucléico, os grupos fluorfóricos do rótulo molecular são separados, o que resulta em uma alteração do sinal de fluorescência, preferivelmente uma alteração na intensidade. Esta alteração correlaciona-se com a quantidade de amostra de ácidos nucléicos presente.
[000197] Será reconhecido que a detecção da MCP-1 usando os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção particularmente permitirá a detecção da MCP-1 como definida neste documento.
[000198] Em conexão com a detecção da MCP-1, um método preferido compreende as seguintes etapas: a) ) proporcionar uma amostra que é para ser testada quanto à presença de MCP-1, b) proporcionar um ácido nucléico de acordo com a presente invenção, c) reagir a amostra com o ácido nucléico, preferivelmente em um vaso de reação pelo que a etapa (a) pode ser efetuada antes da etapa (b), ou a etapa (b) pode ser efetuada antes da etapa (a).
[000199] Em uma modalidade preferida, proporciona-se uma etapa d) adicional, a qual consiste na detecção da reação da amostra com o ácido nucléico. De preferência, o ácido nucléico da etapa b) é imobilizado a uma superfície. A superfície pode ser a superfície de um vaso de reação, tal como um tubo de reação, uma cavidade de uma placa, ou a superfície de um dispositivo contido em tal vaso de reação, tal como, por exemplo, uma conta. A imobilização do ácido nucléico à superfície pode ser feita por qualquer meio conhecido para aqueles versados na técnica, incluindo, porém não limitado às ligações não- covalentes ou covalentes. De preferência, a ligação é estabelecida via uma ligação química covalente entre a superfície e o ácido nucléico. Entretanto, está também dentro da presente invenção que o ácido nucléico seja indiretamente imobilizado a uma superfície, pelo que tal imobilização indireta envolve o uso de um componente adicional ou um par de pares de interação. Tal componente adicional é preferivelmente um composto que especificamente interage com o ácido nucléico a ser imobilizado, o qual é também referido como par de interação, e assim media a ligação do ácido nucléico à superfície. O par de interação é preferivelmente selecionado a partir do grupo que compreende ácidos nucléicos, polipeptídeos, proteínas e anticorpos. De preferência, o par de interação é um anticorpo, mais preferivelmente um anticorpo monoclonal. Alternativamente, o par de interação é um ácido nucléico, preferivelmente um ácido nucléico funcional. Mais preferivelmente, tal ácido nucléico funcional é selecionado a partir do grupo que compreende aptâmeros, "spiegelmeros", e ácidos nucléicos que sejam pelo menos parcialmente complementares ao ácido nucléico. Em uma modalidade alternativa adicional, a ligação do ácido nucléico à superfície é mediada por um par de interação de múltiplas partes. Tal par de interação de múltiplas partes é preferivelmente um par de pares de interação ou um par de interação consistindo em um primeiro membro e um segundo membro, pelo que o primeiro membro é compreendido pelo, ou está unido ao, ácido nucléico e o segundo membro está unido à, ou compreendido pela, superfície. O par de interação de múltiplas partes é preferivelmente selecionado a partir do grupo de pares de pares de interação compreendendo a biotina e a avidina, a biotina e a estreptavidina, e a biotina e a neutravidina. De preferência, o primeiro membro do par de pares de interação é a biotina.
[000200] Um resultado preferido de tal método é a formação de um complexo imobilizado de MCP-1 e o ácido nucléico, pelo que mais preferivelmente o dito complexo é detectado. Está dentro de uma modalidade que a MCP-1 é detectada a partir do complexo.
[000201] Um meio de detecção respectivo, o qual está de acordo com esta exigência, é, por exemplo, qualquer meio de detecção que seja específico para aquela(s) parte(s) da MCP-1. Um meio de detecção particularmente preferido é um meio de detecção que é selecionado a partir do grupo que compreende ácidos nucléicos, polipeptídeos, proteínas e anticorpos, cuja geração é conhecida para aqueles versados na técnica.
[000202] O método para a detecção da MCP-1 também compreende que a amostra é removida do vaso de reação, o qual tenha preferivelmente sido usado para efetuar a etapa c).
[000203] O método compreende, em uma modalidade adicional, também a etapa de imobilizar um par de interação da MCP-1 sobre uma superfície, preferivelmente uma superfície como definida acima, pelo que o par de interação é como definido neste documento, e preferivelmente como acima descrito em conexão com o método respectivo, e mais preferivelmente compreende os ácidos nucléicos, os polipeptídeos, as proteínas e os anticorpos em suas diversas modalidades. Nesta modalidade, um meio de detecção particularmente preferido é um ácido nucléico de acordo com a presente invenção, pelo que tal ácido nucléico pode preferivelmente estar marcado ou não- marcado. Caso tal ácido nucléico esteja marcado, ele pode direta ou indiretamente ser detectado. Tal detecção pode também envolver o uso de um segundo meio de detecção, o qual é, preferivelmente, também selecionado a partir do grupo que compreende os ácidos nucléicos, os polipeptídeos, as proteínas e as modalidades nas diversas modalidades descritas neste documento. Tais meios de detecção são preferivelmente específicos para o ácido nucléico de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade mais preferida, o segundo meio de detecção é um rótulo molecular. O ácido nucléico, ou o segundo meio de detecção, ou ambos podem compreender, em uma modalidade preferida, um rótulo de detecção. O rótulo de detecção é preferivelmente selecionada a partir do grupo que compreende a biotina, um rótulo de bromo-dessoxiuridina, um rótulo de digoxigenina, um rótulo de fluorescência, um rótulo de UV, um radiorrótulo, e uma molécula quelante. Alternativamente, o segundo meio de detecção interage com o rótulo de detecção, a qual está preferivelmente contida pelo, é compreendida pelo, ou está unida ao, ácido nucléico. As combinações particularmente preferidas são como se segue: o rótulo de detecção é a biotina e o segundo meio de detecção é um anticorpo dirigido contra a biotina, ou onde o rótulo de detecção é a biotina e o segundo meio de detecção é uma avidina ou uma molécula que carrega a avidina, ou onde o rótulo de detecção é a biotina e o segundo meio de detecção é uma estreptavidina ou uma molécula que carrega a estreptavidina, ou onde o rótulo de detecção é a biotina e o segundo meio de detecção é uma neutravidina ou uma molécula que carrega a neutravidina, ou onde o rótulo de detecção é uma bromo-dessoxiuridina e o segundo meio de detecção é um anticorpo dirigido contra a bromo- dessoxiuridina, ou onde o rótulo de detecção é uma digoxigenina e o segundo meio de detecção é um anticorpo dirigido contra a digoxigenina, ou onde o rótulo de detecção é um quelante e o segundo meio de detecção é um radionuclídeo, pelo que é preferido que o dito rótulo de detecção seja unido ao ácido nucléico. É para ser reconhecido que este tipo de combinação é também aplicável à modalidade onde o ácido nucléico está unido à superfície. Em tal modalidade, é preferido que o rótulo de detecção seja unido ao par de interação.
[000204] Finalmente, está também dentro da presente invenção que o segundo meio de interação é detectado usando um terceiro meio de detecção, preferivelmente o terceiro meio de detecção é uma enzima, mais preferivelmente mostrando uma reação enzimática na detecção do segundo meio de detecção, ou o terceiro meio de detecção é um meio para a detecção de radiação, mais preferivelmente radiação emitida por um radionuclídeo. De preferência, o terceiro meio de detecção está especificamente detectando e/ou interagindo com o segundo meio de detecção.
[000205] Também na modalidade com um par de interação da MCP- 1 sendo imobilizado sobre uma superfície e o ácido nucléico de acordo com a presente invenção sendo preferivelmente adicionado ao complexo formado entre o par de interação e a MCP-1, a amostra pode ser removida da reação, mais preferivelmente do vaso de reação onde a etapa c) e/ou a d) são efetuadas.
[000206] Em uma modalidade, o ácido nucléico de acordo com a presente invenção compreende uma porção de fluorescência e, pela qual, a fluorescência da porção de fluorescência é diferente da formação de complexo entre o ácido nucléico e a MCP-1 e a MCP-1 livre.
[000207] Em uma modalidade adicional, o ácido nucléico é um derivado do ácido nucléico de acordo com a presente invenção, pelo que o derivado do ácido nucléico compreende pelo menos um derivado fluorescente de adenosina substituindo a adenosina. Em uma modalidade preferida, o derivado fluorescente de adenosina é a etenoadenosina.
[000208] Em uma modalidade adicional, o complexo consistindo no derivado do ácido nucléico de acordo com a presente invenção e a MCP-1 é detectado usando fluorescência.
[000209] Em uma modalidade do método, cria-se um sinal na etapa (c) ou na etapa (d) e preferivelmente o sinal está correlacionado com a concentração de MCP-1 na amostra.
[000210] Em um aspecto preferido, os ensaios podem ser efetuados em placas de 96 cavidades, onde os componentes são imobilizados nos vasos de reação, conforme descrito acima, e as cavidades atuando como vasos de reação.
[000211] Será reconhecido pelos versados na técnica que o que tinha sido dito acima também se aplica à MCP-2, à MCP-3, à MCP-4 e/ou à eotaxina, pelo menos até o ponto em que os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção estão também se ligando à, ou com a, MCP- 2-, MCP-3, MCP-4 e/ou eotaxina.
[000212] O ácido nucléico inventivo pode adicionalmente ser usado como material de partida para o projeto de fármacos. Basicamente, existem duas abordagens possíveis. Uma abordagem é a triagem das bibliotecas de compostos, considerando que tais bibliotecas de compostos são preferivelmente bibliotecas de compostos de baixos pesos moleculares. Em uma modalidade, a triagem é uma triagem de altos rendimentos. De preferência, a triagem de altos rendimentos é a avaliação rápida, eficiente, de tentativas e erros, dos compostos em um ensaio baseado em alvo. No melhor caso, as análises são conduzidas por uma medição colorimétrica. As bibliotecas como usadas em conexão com isto são conhecidas para alguém versado na técnica.
[000213] Alternativamente, o ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode ser usado para o projeto racional de fármacos. De preferência, o projeto racional de fármacos é o projeto de uma estrutura farmacêutica de exemplo. Começando a partir da estrutura tridimensional do alvo, a qual é tipicamente identificada por métodos tais como a cristalografia de raios X ou a espectroscopia de ressonância magnética nuclear, usam-se programas de computador para buscar banco de dados contendo estruturas de muitos compostos químicos diferentes. A seleção é feita por um computador, os compostos identificados podem subsequentemente ser testados no laboratório.
[000214] O projeto racional de fármacos pode iniciar a partir de quaisquer dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção e envolve uma estrutura, preferivelmente uma estrutura tridimensional, a qual é similar à estrutura dos ácidos nucléicos inventivos ou idêntica às partes mediadoras de ligação da estrutura dos ácidos nucléicos inventivos. Em qualquer caso, tal estrutura ainda mostra uma característica de ligação igual ou similar aos ácidos nucléicos inventivos. Em uma etapa adicional ou como uma etapa alternativa no projeto racional de fármacos, a estrutura preferivelmente tridimensional destas partes dos ácidos nucléicos que se ligam ao neurotransmissor é imitada por grupos químicos que são diferentes dos nucleotídeos e dos ácidos nucléicos. Por este mimetismo, um composto diferente dos ácidos nucléicos pode ser projetado. Tal composto é preferivelmente uma pequena molécula ou um peptídeo.
[000215] No caso da triagem das bibliotecas de compostos, tal como por utilização de um ensaio competitivo, o qual é conhecido para alguém versado na técnica, podem ser encontrados análogos de MCP-1, agonistas de MCP-1 ou antagonistas de MCP-1 apropriados. Tais ensaios competitivos podem ser configurados como se segue. O ácido nucléico inventivo, preferivelmente um "spiegelmero", o qual é um L- ácido nucléico que se liga a um alvo, é acoplado a uma fase sólida. Para identificar os análogos de MCP-1, a MCP-1 rotulada pode ser adicionada ao ensaio. Um análogo potencial competiria com as moléculas de MCP-1 que se ligam ao "spiegelmero", o que acompanharia uma diminuição no sinal obtido pelo rótulo respectivo. A triagem por agonistas ou antagonistas pode envolver o uso de um ensaio de cultura de células, como conhecido para aqueles versados na técnica.
[000216] O kit de acordo com a presente invenção pode compreender pelo menos um ou diversos dos ácidos nucléicos inventivos. Adicionalmente, o kit pode compreender pelo menos um ou diversos controles positivos ou negativos. Um controle positivo pode, por exemplo, ser a MCP-1, particularmente aquela contra a qual o ácido nucléico inventivo é selecionado ou à qual ele se liga, preferivelmente, na forma líquida. Um controle negativo pode, por exemplo, ser um peptídeo, o qual é definido em termos de propriedades biofísicas similares á MCP-1, porém que não é reconhecido pelos ácidos nucléicos inventivos. Além disso, o dito kit pode compreender um ou diversos tampões. Os diversos ingredientes podem estar contidos no kit na forma secada ou liofilizada ou dissolvidos em um líquido. O kit pode compreender um ou diversos recipientes, os quais, por sua vez, contêm um ou diversos ingredientes do kit. Em uma modalidade adicional, o kit compreende uma instrução ou folheto de instrução que fornece ao usuário informação sobre como usar o kit e os seus diversos ingredientes.
[000217] A determinação farmacêutica e bioanalítica do ácido nucléico de acordo com a presente invenção é basicamente para a avaliação de seu perfil farmacocinético e biodinâmico em diversas singularidades, tecidos e órgãos do corpo humano e não humano. Para tal propósito, podem ser usados quaisquer dos métodos de detecção descritos neste documento e conhecidos para uma pessoa versada na técnica. Em um aspecto adicional da presente invenção, proporciona-se um ensaio de hibridização em sanduíche para a detecção do ácido nucléico de acordo com a presente invenção. Dentro do ensaio de detecção, usam-se uma sonda de captura e uma sonda de detecção. A sonda de captura é complementar à primeira parte e a sonda de detecção à segunda parte do ácido nucléico de acordo com a presente invenção. Ambas, a sonda de captura e de detecção, podem ser formadas por nucleotídeos de DNA, nucleotídeos de DNA modificados, nucleotídeos de RNA modificados, nucleotídeos de RNA, nucleotídeos de LNA e/ou nucleotídeos de PNA.
[000218] Portanto, a sonda de captura compreende uma extensão de sequência complementar à extremidade de 5' do ácido nucléico de acordo com a presente invenção e a sonda de detecção compreende uma extensão de sequência complementar à extremidade de 3' do ácido nucléico de acordo com a presente invenção. Neste caso, a sonda de captura é imobilizada a uma superfície ou matriz, via sua extremidade de 5', pelo que a sonda de captura pode ser imobilizada diretamente na sua extremidade de 5' ou via um ligante entre a sua extremidade de 5' e a superfície ou matriz. Entretanto, em princípio, o ligante pode ser ligado a cada nucleotídeo da sonda de captura. O ligante pode ser formado por ligantes hidrofílicos de versado na técnica ou por nucleotídeos de D-DNA, nucleotídeos de D-DNA modificados, nucleotídeos de D-RNA, nucleotídeos de D-RNA modificados, nucleotídeos de D-LNA, nucleotídeos de PNA, nucleotídeos de L-RNA, nucleotídeos de L-DNA, nucleotídeos de L-RNA modificados, nucleotídeos de L-DNA modificados e/ou nucleotídeos de L-LNA.
[000219] Alternativamente, a sonda de captura compreende uma extensão de sequência complementar à extremidade de 3' do ácido nucléico de acordo com a presente invenção e a sonda de detecção compreende uma extensão de sequência complementar à extremidade de 5' do ácido nucléico de acordo com a presente invenção. Neste caso, a sonda de captura é imobilizada a uma superfície ou matriz, via sua extremidade de 3', pelo que a sonda de captura pode ser imobilizada diretamente na sua extremidade de 3' ou via um ligante entre a sua extremidade de 3' e a superfície ou matriz. Entretanto, em princípio, o ligante pode ser ligado a cada nucleotídeo da extensão de sequência que é complementar ao ácido nucléico de acordo com a presente invenção. O ligante pode ser formado por ligantes hidrofílicos de versado na técnica ou por nucleotídeos de D-DNA, nucleotídeos de D- DNA modificados, nucleotídeos de D-RNA, nucleotídeos de D-RNA modificados, nucleotídeos de D-LNA, nucleotídeos de PNA, nucleotídeos de L-RNA, nucleotídeos de L-DNA, nucleotídeos de L-RNA modificados, nucleotídeos de L-DNA modificados e/ou nucleotídeos de L-LNA.
[000220] O número de nucleotídeos da sonda de captura e de detecção que podem hibridizar com o ácido nucléico de acordo com a presente invenção é variável e pode ser dependente do número de nucleotídeos da sonda de captura e/ou da de detecção e/ou do ácido nucléico de acordo com a presente invenção propriamente dito. O número total de nucleotídeos da sonda de captura e da de detecção que podem hibridizar com o ácido nucléico de acordo com a presente invenção deve ser o número máximo de nucleotídeos que é compreendido pelo ácido nucléico de acordo com a presente invenção. O número mínimo de nucleotídeos (2 a 10 nucleotídeos) da sonda de detecção e de captura deve permitir a hibridização com a extremidade de 5' ou a extremidade de 3', respectivamente, do ácido nucléico de acordo com a presente invenção. Para obter especificidade e seletividade altas entre o ácido nucléico de acordo com a presente invenção e os outros ácidos nucléicos que ocorrem nas amostras que são analisadas, o número total de nucleotídeos da sonda de captura e de detecção deve ser o número máximo de nucleotídeos que é compreendido pelo ácido nucléico de acordo com a presente invenção.
[000221] Além disso, a sonda de detecção preferivelmente carrega uma molécula de marcador ou rótulo que pode ser detectado conforme anteriormente descrito neste documento. O rótulo ou a molécula de marcador pode, em princípio, ser ligada a cada nucleotídeo da sonda de detecção. De preferência, o rótulo ou o marcador está localizado na extremidade de 5' ou na extremidade de 3' da sonda de detecção, pelo que pode ser inserido um ligante entre os nucleotídeos dentro da sonda de detecção que são complementares ao ácido nucléico de acordo com a presente invenção, e o rótulo. O ligante pode ser formado por ligantes hidrofílicos de versados na técnica ou por nucleotídeos de D-DNA, nucleotídeos de D-DNA modificados, nucleotídeos de D-RNA, nucleotídeos de D-RNA modificados, nucleotídeos de D-LNA, nucleotídeos de PNA, nucleotídeos de L-RNA, nucleotídeos de L-DNA, nucleotídeos de L-RNA modificados, nucleotídeos de L-DNA modificados e/ou nucleotídeos de L-LNA.
[000222] A detecção do ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode ser realizada como se segue: O ácido nucléico de acordo com a presente invenção hibridiza, com uma de suas extremidades, com a sonda de captura e, com a outra extremidade, com a sonda de detecção. Depois, a sonda de detecção não-ligada é removida, por exemplo, através de uma ou diversas etapas de lavagem. A quantidade de sonda de detecção ligada que preferivelmente carrega um rótulo ou molécula de marcador pode ser medida subsequentemente.
[000223] Conforme preferivelmente usado neste documento, o termo tratamento compreende, em uma modalidade preferida, adicional ou alternativamente, a prevenção e/ou o acompanhamento.
[000224] Conforme preferivelmente usados aqui, os termos doença e distúrbio serão usados em um modo intercambiável, se não indicado ao contrário.
[000225] Conforme usado aqui, o termo compreender é preferivelmente não pretendido para limitar o assunto seguido ou descrito por tal termo. Entretanto, em uma modalidade alternativa, o termo compreender será entendido no significado de conter e, desse modo, como limitando o assunto seguido ou descrito por tal termo.
[000226] As diversas SEQ.ID. Nos, a natureza química das moléculas de ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção e das moléculas-alvo MCP-1 como usadas neste documento, a sua sequência real e o número de referência interna são resumidos na tabela a seguir.
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[000227] A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelas figuras, pelos exemplos e pela listagem de sequências a partir dos quais podem ser consideradas características, modalidades e vantagens adicionais, onde
[000228] A Figura 1 mostra um alinhamento de sequências de ligantes de RNA relacionados que se ligam à MCP-1 humana, indicando o motivo de sequência ("Tipo 1A") que é, em uma modalidade preferida, em sua totalidade, essencial para a ligação à MCP-1 humana;
[000229] A Figura 2 mostra um alinhamento de sequências de ligantes de RNA relacionados que se ligam à MCP-1 humana, indicando o motivo de sequência ("Tipo 1B") que é, em uma modalidade preferida, em sua totalidade, essencial para a ligação à MCP-1 humana, e os derivados de ligantes de RNA 180-D1-002;
[000230] A Figura 3 mostra um alinhamento de sequências de ligantes de RNA relacionados que se ligam à MCP-1 humana, indicando o motivo de sequência ("Tipo 2") que é, em uma modalidade preferida, em sua totalidade, essencial para a ligação à MCP-1 humana;
[000231] A Figura 4 mostra um alinhamento de sequências de ligantes de RNA relacionados que se ligam à MCP-1 humana, indicando o motivo de sequência ("Tipo 3") que é, em uma modalidade preferida, em sua totalidade, essencial para a ligação à MCP-1 humana;
[000232] A Figura 5 mostra os derivados de ligantes de RNA 178D5 e 181-A2 (ligantes de RNA da MCP-1 humana de motivo de sequência "Tipo 3");
[000233] A Figura 6 mostra um alinhamento de sequências de ligantes de RNA relacionados que se ligam à MCP-1 humana, indicando o motivo de sequência ("Tipo 4") que é, em uma modalidade preferida, em sua totalidade, essencial para a ligação à MCP-1 humana (outras sequências);
[000234] A Figura 7 mostra uma tabela de sequências de diversos ligantes de RNA diferentes que se ligam à MCP-1 humana que não podem estar relacionados aos motivos de sequências de ligação à MCP-1 "Tipo 1A", "Tipo 1B", "Tipo 2", "Tipo 3" ou "Tipo 4";
[000235] A Figura 8 mostra os alinhamentos dos derivados do ligante de RNA 188-A3-001 e do 189-G7-001 que se ligam à MCP-1 de murino;
[000236] A Figura 9 mostra o resultado de uma análise da ligação do aptâmero D-NOX-E36 à D-MCP-1 humana biotinilada, na temperatura ambiente e a 37°C, representada como a ligação do aptâmero pela concentração de D-MCP-1 humana biotinilada;
[000237] A Figura 10 mostra o resultado de uma análise da ligação do aptâmero D-mNOX-E36 à D-MCP-1 de murino biotinilada, a 37°C, representada como a ligação do aptâmero pela concentração de D- MCP-1 de murino biotinilada;
[000238] A Figura 11 mostra a liberação de Ca++ induzida pela MCP- 1 em células THP-1, enquanto que a curva de resposta à dose para a MCP-1 humana era obtida, indicando uma concentração semi-efetiva (EC50) de aproximadamente 3 nM, representada como a diferença na fluorescência para o branco pela concentração de MCP-1 humana;
[000239] A Figura 12 mostra a eficácia do "spiegelmero" NOX-E36 em um ensaio de liberação de cálcio; as células foram estimuladas com 3 nM de MCP-1 humana, pré-incubada a 37°C com diversas quantidades do "spiegelmero" NOX-E36, representada como a porcentagem do controle pela concentração de NOX-E36;
[000240] A Figura 13 mostra a eficácia do "spiegelmero" mNOX-E36 em um ensaio de liberação de cálcio; as células foram estimuladas com 5 nM de MCP-1 de murino, pré-incubada a 37°C com diversas quantidades do "spiegelmero" mNOX-E36, representada como a porcentagem do controle pela concentração de mNOX-E36;
[000241] A Figura 14 mostra a quimiotaxia induzida pela MCP-1 humana das células THP-1, enquanto que, após 3 horas de migração das células THP-1 para diversas concentrações de MCP-1, obteve-se uma curva de resposta à dose para a MCP-1, representada como o aumento de X vezes comparado ao controle pela concentração de MCP- 1 humana;
[000242] A Figura 15 mostra a eficácia do "spiegelmero" NOX-E36 em um ensaio de quimiotaxia; as células foram deixadas migrar para 0,5 nM de MCP-1 humana, pré-incubada a 37°C com diversas quantidades do "spiegelmero" NOX-E36, representada como a porcentagem do controle pela concentração do "spiegelmero" NOX-E36;
[000243] A Figura 16 mostra a eficácia do "spiegelmero" mNOX-E36 em um ensaio de quimiotaxia; as células foram deixadas migrar para 0,5 nM de MCP-1 de murino, pré-incubada a 37°C com diversas quantidades do "spiegelmero" NOX-E36, representada como a porcentagem do controle pela concentração do "spiegelmero" mNOX- E36;
[000244] A Figura 17 mostra o sensorgrama Biacore 2000 indicando o valor de KD do "spiegelmero" NOX-E36 que se liga à MCP-1 humana, a qual foi imobilizada sobre um chip de sensor PioneerF1 por procedimento de acoplamento de amina, representada como a resposta (RU) pelo tempo;
[000245] A Figura 18 mostra o sensorgrama Biacore 2000 indicando a ligação do "spiegelmero" NOX-E36 às proteínas da família de MCP humana (huMCP-1, huMCP-2, huMCP-3) e à eotaxina humana, que foram imobilizadas por procedimento de acoplamento de amina sobre um chip de sensor PioneerF1 e um CM4, respectivamente, representada como a resposta (RU) pelo tempo;
[000246] A Figura 19 mostra o sensorgrama Biacore 2000 indicando a ligação do "spiegelmero" NOX-E36 à MCP-1 de diferentes espécies (MCP-1 canina, MCP-1 de macaco, MCP-1 humana, MCP-1 de porco, MCP-1 de coelho, MCP-1 de camundongo, MCP-1 de rato), considerando que as diferentes formas da MCP-1 foram imobilizadas por procedimento de acoplamento de amina sobre os chips de sensor PioneerF1 e CM4, respectivamente, representada como a resposta (RU) pelo tempo;
[000247] A Figura 20 mostra o sensorgrama Biacore 2000 indicando o valor de KD do "spiegelmero" 181-A2-018 que se liga à MCP-1 humana, a qual foi imobilizada sobre um chip de sensor CM4 por procedimento de acoplamento de amina, representada como a resposta (RU) pelo tempo;
[000248] A Figura 21 mostra o sensorgrama Biacore 2000 indicando a ligação do "spiegelmero" 181-A2-018 às proteínas da família de MCP humana (huMCP-1, huMCP-2, huMCP-3) e à eotaxina humana, que foram imobilizadas por procedimento de acoplamento de amina sobre um chip de sensor PioneerF1 e um CM4, respectivamente, representada como a resposta (RU) pelo tempo;
[000249] A Figura 22 mostra o sensorgrama Biacore 2000 indicando a ligação do "spiegelmero" 181-A2-018 à MCP-1 de diferentes espécies (MCP-1 canina, MCP-1 de macaco, MCP-1 humana, MCP-1 de porco, MCP-1 de coelho, MCP-1 de camundongo, MCP-1 de rato), considerando que as diferentes formas da MCP-1 foram imobilizadas por procedimento de acoplamento de amina sobre os chips de sensor PioneerF1 e CM4, respectivamente, representada como a resposta (RU) pelo tempo;
[000250] A Figura 23 mostra um alinhamento Clustal W da MCP-1 a partir de diferentes espécies de mamíferos, bem como da MCP-2 humana, da MCP-3, e da eotaxina (Posições 1-76 somente);
[000251] A Figura 24A mostra uma tabela resumindo a especificidade de ligação de NOX-E36 e 181-A2-018 com relação à MCP-1 de diferentes espécies de mamíferos, bem como MCP-2 humana, MCP-3, e eotaxina;
[000252] A Figura 24B mostra uma tabela resumindo a seletividade de NOX-E36, como determinada por análise de Biacore, pelo que o NOX- E36 biotinilado foi imobilizado sobre uma superfície do chip de sensor e a ligação de um painel de diversas quimiocinas CC e CXC ao NOX-E36 foi analisada;
[000253] A Figura 24C mostra a análise cinética de NOX-E36 interagindo com as quimiocinas, como determinada por análise de Biacore, pelo que as quimiocinas foram imobilizadas covalentemente sobre uma superfície do chip de sensor CM5 e diversas concentrações do NOX-E36 foram injetadas e o comportamento de ligação do NOX- E36 foi analisado usando o software BiaEvaluation;
[000254] A Figura 24D mostra a curva de resposta à dose da quimiotaxia do estímulo das células THP-1 com a MIP-1α com uma concentração semi-efetiva de cerca de 0,2 nM;
[000255] A Figura 24E mostra a Inibição da quimiotaxia induzida pela MIP-1α pelo NOX-E36. O NOX-E36 não teve nenhuma influência sobre a quimiotaxia induzida pela MIP1a das células THP-1;
[000256] A Figura 25 mostra a eficácia do "spiegelmero" NOX-E36- 3'-PEG em um ensaio de liberação de cálcio; as células foram estimuladas com 3 nM de MCP-1 humana, pré-incubada a 37°C com diversas quantidades de "spiegelmero" NOX-E36-3'-PEG, representada como a porcentagem do controle pela concentração do "spiegelmero" NOX-E36-3'-PEG;
[000257] A Figura 26 mostra a eficácia do "spiegelmero" NOX-E36- 3'-PEG em um ensaio de quimiotaxia; as células foram deixadas migrar para 0,5 nM de MCP-1 humana, pré-incubada a 37°C com diversas quantidades do "spiegelmero" NOX-E36-3'-PEG, representada como a porcentagem do controle pela concentração de NOX-E36-3'-PEG;
[000258] A Figura 27A mostra a eficácia do "spiegelmero" NOX-E36- 5'-PEG em um ensaio de liberação de cálcio; as células foram estimuladas com 3 nM de MCP-1 humana, pré-incubada a 37°C com diversas quantidades de "spiegelmero" NOX-E36-5'-PEG, representada como a porcentagem do controle pela concentração do "spiegelmero" NOX-E36-5'-PEG;
[000259] A Figura 27B mostra a eficácia do "spiegelmero" NOX-E36- 5'-PEG em um ensaio de quimiotaxia; as células foram deixadas migrar para 0,5 nM de MCP-1 humana, pré-incubada a 37°C com diversas quantidades do "spiegelmero" NOX-E36-5'-PEG, representada como a porcentagem do controle pela concentração do "spiegelmero" NOX- E36-5'-PEG;
[000260] A Figura 28 mostra a liberação de Ca++ induzida pela MCP- 1 de murino em células THP-1, enquanto que uma curva de resposta à dose para a MCP-1 de murino era obtida, indicando uma concentração semi-efetiva (EC50) de aproximadamente 5 nM, representada como a diferença na fluorescência para o branco pela concentração de MCP-1 de murino;
[000261] A Figura 29 mostra a eficácia do "spiegelmero" anti-MCP-1 de murino mNOX-E36-3'-PEG em um ensaio de liberação de cálcio; as células foram estimuladas com 3 nM de MCP-1 de murino, pré-incubada a 37°C com diversas quantidades do "spiegelmero" mNOX-E36-3'-PEG, representada como a porcentagem do controle pela concentração do "spiegelmero" mNOX-E36-3'-PEG;
[000262] A Figura 30 mostra a quimiotaxia induzida pela MCP-1 de murino das células THP-1, enquanto que, após 3 horas de migração das células THP-1 para diversas concentrações de mMCP-1, obteve-se uma curva de resposta à dose para a mMCP-1, representada como o aumento de X vezes comparado ao controle pela concentração de MCP- 1 de murino;
[000263] A Figura 31 mostra a eficácia do "spiegelmero" anti-MCP-1 de murino mNOX-E36-3'-PEG em um ensaio de quimiotaxia; as células foram deixadas migrar para 0,5 nM de MCP-1 de murino, pré-incubada a 37°C com diversas quantidades do "spiegelmero" mNOX-E36-3'-PEG, representada como a porcentagem do controle pela concentração do "spiegelmero" antimurino mNOX-E36-3'-PEG;
[000264] A Figura 32 mostra o sensorgrama Biacore 2000 indicando o valor de KD do aptâmero D-mNOX-E36 que se liga à D-MCP-1 de murino, a qual foi imobilizada sobre um chip de sensor PioneerF1 por procedimento de acoplamento de amina, representada como a resposta (RU) pelo tempo;
[000265] A Figura 33 mostra o sensorgrama Biacore 2000 indicando a ligação do aptâmero D-mNOX-E36 à D-MCP-1 humana e à D-MCP-1 de murino, considerando que as duas formas diferentes de D-MCP-1 foram imobilizadas por procedimento de acoplamento de amina sobre os chips de sensor PioneerF1 e CM4, respectivamente, representada como a resposta (RU) pelo tempo;
[000266] A Figura 34 mostra as seções renais de camundongos MRLlpr/lpr de 24 semanas de idade, coloridas com ácido periódico Schiff (PAS), anticorpos para Mac-2 (macrófagos) e CD3 (células T), conforme indicado; as imagens são representativas para 7-12 camundongos em cada grupo (ampliação do original PAS: x 100, insertos de PAS: x 400, Mac2: x 400, CD3: x 100);
[000267] A Figura 35 mostra uma tabela ilustrando os parâmetros de função renal e as verificações histológicas nos diferentes grupos de camundongos MRLlpr/lpr de 24 semanas de idade;
[000268] A Figura 36 mostra a quantificação das alterações histológicas por morfometria efetuada sobre seções coloridas com prata de camundongos de todos os grupos; A, o índice de volume intersticial; B, o índice de dilatação tubular, e C, o índice de dano de célula tubular foram calculados como a porcentagem de campo de alta energia e são expressos como a média ± SEM;
[000269] A Figura 37 mostra a sobrevivência dos camundongos MRLlpr/lpr dos diversos grupos de tratamento como calculada por análise de Kaplan-Meier;
[000270] A Figura 38 mostra a expressão de mRNA renal para as quimiocinas CC CCL2 e CCL5, como determinada por RT-PCR em tempo real, usando RNA renal total reunido de 5 camundongos de cada grupo, com o que os níveis de RNA para cada grupo de camundongos são expressos por expressão de rRNA de 18S respectiva;
[000271] A Figura 39 mostra a redução da patologia do pulmão por tratamento com mNOX-E36-3'PEG; o tecido do pulmão foi preparado a partir de todos os grupos em 24 semanas de idade e classificado de modo semiquantitativo; o tratamento com mNOX-E36 e mNOX-E36- 3'PEG reduziu a inflamação peribronquiolar nos camundongos MRLlpr/lpr; as imagens são representativas para 7-11 camundongos em cada grupo; ampliação do original x 100;
[000272] A Figura 40 mostra as manifestações de lúpus cutâneo dos camundongos MRLlpr/lpr em 24 semanas de idade, as quais tipicamente ocorreram na área facial ou do pescoço (camundongo da esquerda), as quais foram menos comuns nos camundongos tratados com "spiegelmero" anti-mCCL2 (camundongo da direita);
[000273] A Figura 41 mostra as verificações no soro e histológicas em camundongos MRLlpr/lpr em 24 semanas de idade;
[000274] A Figura 42 mostra a farmacocinética dos "spiegelmeros" anti-mCCL2 peguilados e não-peguilados no plasma, durante o estudo, indicada como a concentração do "spiegelmero" mNOX-E36 no plasma como uma função do tempo;
[000275] A Figura 43 mostra a citometria de fluxo para o CCR2 na medula óssea e no sangue periférico em camundongos MRLlpr/lpr de 24 semanas de idade, tratados com veículo ou com mNOX-E36-3'PEG; os dados são mostrados como a porcentagem média de células positivas para CCR2 ± SEM, na medula óssea ou no sangue periférico, em 5 camundongos de cada grupo;
[000276] A Figura 44 mostra os níveis de CCL2 no soro em camundongos 1K db/db tratados com PoC-PEG (barras brancas) e com mNOX-E36-3'PEG (mNOX-E36-P) (barras pretas), como determinados por ELISA em diferentes pontos de tempo, conforme indicados; os dados são a média ± SEM; *, p < 0,05 mNOX-E36-3'PEG (mNOX-E36- P) vs. PoC-PEG;
[000277] A Figura 45 mostra o número infiltrado de células positivas para Mac-2 e Ki-67 nos glomérulos e no interstício de camundongos db/db não tratados ou tratados com POC-PEG ou preferivelmente mNOX-E36- 3'PEG;
[000278] A Figura 46 mostra a glomeruloesclerose diabética em camundongos db/db de 6 meses; as seções renais dos camundongos dos diferentes grupos foram coloridas com ácido periódico Schiff e 15 glomérulos de cada secção renal foram classificados quanto à proporção de glomeruloesclerose; as imagens mostram os glomérulos representativos, graduados para as classificações respectivas, conforme indicadas, ampliação do original 400 x; o gráfico ilustra a porcentagem média de cada classificação ± SEM a partir de todos os camundongos em cada grupo (n = 7 - 10); *, p < 0,05 para os camundongos 1K db/db tratados com mNOX-E36-3'PEG (mNOX-E36- P) vs. PoC-PEG (PoC-P);
[000279] A Figura 47 mostra a taxa de filtração glomerular (GFR) nos camundongos 1K db/db de 6 meses de idade, tratados com mNOX-E36- 3'PEG (mNOX-E36-P) e com PoC-PEG (PoC-P); a GFR foi determinada por cinética de depuração de FITC-inulina nos grupos de camundongos 1K db/db tratados com PoC-PEG e mNOX-E36-3'PEG no final do estudo;
[000280] A Figura 48 mostra a atrofia tubular e o volume intersticial de camundongos db/db de 6 meses de idade; as imagens das seções renais coloridas com prata ilustram os rins representativos a partir dos respectivos grupos (ampliação do original 100x); os valores representam a média ± SEM do respectivo índice de análise morfométrica a partir de 7 - 10 camundongos em cada grupo; *, p < 0,05 para os camundongos 2K db/db vs. BKS do tipo selvagem; #, p < 0,05 para os camundongos db/db 1K vs. 2K;T , p < 0,05 para os camundongos 1K db/db tratados com mNOX-E36-3'PEG (mNOX-E36-PEG) vs. PoC- PEG;
[000281] A Figura 49 mostra a expressão do mRNA renal para CCL2 de camundongos db/db, como determinada por RT-PCR em tempo real usando o RNA renal total reunido de 6 - 10 camundongos de cada grupo; os níveis de mRNA para cada grupo de camundongos são expressos por expressão de rRNA de 18 S respectiva; e
[000282] A Figura 50 mostra a expressão de CCL2 em rins de camundongos db/db, como determinada por imunocoloração; as imagens ilustram as seções representativas dos rins de camundongos de 6 meses de idade dos grupos respectivos, como indicados (ampliação do original, 200 x).
Exemplo 1 - Ácidos nucléicos que ligam a MCP-1 humana
[000283] Usando a D-MCP-1 humana biotinilada como um alvo, diversos ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 humana puderam ser gerados, cujas sequências de nucleotídeos são representadas nas Figuras 1 até 7. Os ácidos nucléicos foram caracterizados no nível de aptâmero, isto é, Ácido nucléico D usando ensaios de co- imunoprecipitação competitiva ou direta com a D-MCP-1 humana biotinilada (Exemplo 4), ou no nível de "spiegelmero", isto é, L-ácido nucléico com a configuração natural da MCP-1 (L-McP) por medição da ressonância plasmônica de superfície usando um instrumento Biacore 2000 (Exemplo 7), um ensaio de liberação de Ca++em cultura de células in vitro (Exemplo 5), ou um ensaio de quimiotaxia in vitro (Exemplo 6).
[000284] As moléculas de ácidos nucléicos assim geradas exibem diferentes motivos de sequências, quatro tipos principais são definidos nas Figuras 1 e 2 (Tipo 1A / 1B), na Figura 3 (Tipo 2), nas Figuras 4 e 5 (Tipo 3), e na Figura 6 (Tipo 4). Os ácidos nucléicos adicionais que se ligam à MCP-1, os quais não podem estar relacionados um ao outro e aos motivos de sequências diferentes descritos neste documento, são listados na Figura 7. Para a definição dos motivos de sequências de nucleotídeos, usam-se as abreviações da IUPAC para os nucleotídeos ambíguos: S forte G ou C; W fraco A ou U; R purina G ou A; Y pirimidina C ou U; K ceto G ou U; M imino A ou C; B não A C ou U ou G; D não C A ou G ou U; H não G A ou C ou U; V não U A ou C ou G; N tudo A ou G ou C ou U
[000285] Se não indicado ao contrário, qualquer sequência de aminoácidos ou sequência de extensões e caixas, respectivamente, é indicada na direação 5' ^ 3'.
Ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 1A (Figura 1)
[000286] Conforme representado na Figura 1, todas as sequências de ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 1A compreendem diversas extensões ou caixas de sequências, pelo que as caixas B1A e B1B são as extensões 5' e 3' terminais que podem hibridizar uma com a outra. Entretanto, tal hibridização não é necessariamente dada na molécula conforme realmente presente sob condições fisiológicas. As caixas B2, B3, B4, |B5| e a caixa B6 são flanqueadas pela caixa B1A e pela caixa B1B
[000287] Os ácidos nucléicos foram caracterizados no nível de aptâmero usando ensaios de co-imunoprecipitação direta e competitiva com a D-MCP-1 humana biotinilada, para graduá-los com relação ao seu comportamento de ligação (Exemplo 4). As sequências selecionadas foram sintetizadas como "spiegelmero" (Exemplo 3) e foram testadas usando a configuração natural da MCP-1 (L-McP) em um ensaio de liberação de Ca++ em cultura de células in vitro (Exemplo 5).
[000288] As sequências das caixas definidas podem ser diferentes entre os ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 1A, o que influencia a afinidade de ligação à MCP-1. Com base na análise da ligação dos diferentes ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1, resumidos como ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 1A, as caixas |B1A|, B2, B3, B4, B5, B6 e |B1B| e as suas sequências de nucleotídeos, como descritas no que se segue, são individualmente, e mais preferivelmente, em sua totalidade, essenciais para a ligação à MCP-1: • as caixas B1A e B1B são as extensões 5' e 3' terminais que podem hibridizar uma com a outra; onde B1A é AGCRUG|, preferivelmente AGCGUGI; e onde |B1B| é |CRYGCU|, preferivelmente CACGCU; • caixa B2, a qual é CCCGGW, preferivelmente CCCGGU; • caixa B3, a qual é GUR, preferivelmente GUG; • caixa B4, a qual é RYA, preferivelmente GUA; • caixa B5, a qual é GGGGGRCGCGAYC, preferivelmente GGGGGGCGCGACC • caixa B6, a qual é UGCAAUAAUG ou URYAWUUG, preferivelmente UACAUUUG;
[000289] Conforme representado na Figura 1, a molécula de ácido nucléico referida como 176-E10trc tem a melhor afinidade de ligação à MCP-1 (como aptâmero no ensaio de co-imunoprecipitação com uma KD de 5 nM e também como "spiegelmero" com uma IC50 de 4 - 5 nM no ensaio de liberação de Ca++ em cultura de células in vitro) e, portanto, pode constituir a sequência otimizada e a combinação otimizada de elementos da sequência |B1A|, B2, B3, B4, B5, B6 e |B1B. Ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 1B (Figura 2)
[000290] Conforme representado na Figura 2, todas as sequências do Tipo 1B compreendem diversas extensões ou caixas de sequências, pelo que as caixas |B1A| e |B1B| são as extensões 5' e 3' terminais que podem hibridizar uma com a outra, e as caixas B2, B3, B4, B5 e a caixa B6 são flanqueadas pela caixa B1A e pela caixa |B1B|. Entretanto, tal hibridização não é necessariamente dada na molécula conforme realmente presente sob condições fisiológicas.
[000291] Os ácidos nucléicos foram caracterizados no nível de aptâmero usando os ensaios de co-imunoprecipitação direta e competitiva com a D-MCP-1 humana biotinilada, para graduá-los com relação ao seu comportamento de ligação (Exemplo 4). As sequências selecionadas foram sintetizadas como "spiegelmero" (Exemplo 3) e foram testadas usando a configuração natural da MCP-1 (L-McP) em um ensaio de liberação de Ca++ em cultura de células in vitro (Exemplo 5).
[000292] As sequências das caixas definidas podem ser diferentes entre os ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 1B, o que influencia a afinidade de ligação à MCP-1. Com base na análise da ligação dos diferentes ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1, resumidos como ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 1B, as caixas |B1A|, B2, B3, B4, B5, B6 e |B1B| e as suas sequências de nucleotídeos, como descritas no que se segue, são individualmente, e mais preferivelmente, em sua totalidade, essenciais para a ligação à MCP-1: • as caixas B1A e B1B que podem hibridizar uma com a outra; onde B1A é AGYRUG, preferivelmente AGCGUG; e onde B1B é CAYRCU, preferivelmente CACGCU; • caixa B2, a qual é CCAGCU ou CCAGY, preferivelmente CCAGU; • caixa B3, a qual é GUG; • caixa B4, a qual é AUG; • caixa B5, a qual é GGGGGGCGCGACC|; • caixa B6, a qual é CAUUUUA ou CAUUUA, preferivelmente CAUUUUA;
[000293] Conforme representado na Figura 2, o ácido nucléico referido como 176-C9trc tem a melhor afinidade de ligação à MCP-1 (como aptâmero no ensaio de co-imunoprecipitação com uma KD de 5 nM e também como "spiegelmero" com uma IC50 de 4 - 5 nM no ensaio de liberação de Ca++ em cultura de células in vitro) e, portanto, pode constituir a sequência otimizada e a combinação otimizada de elementos da sequência |B1A|, B2, B3, B4, |B5,| B6 e B1B. Ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 2 (Figura 3)
[000294] Conforme representado na Figura 3, todas as sequências do Tipo 2 compreendem diversas extensões ou caixas de sequências, pelo que as caixas |B1A| e |B1B| são as extensões 5' e 3' terminais que podem hibridizar uma com a outra, e a caixa B2 é o elemento de sequência central. Entretanto, tal hibridização não é necessariamente dada na molécula conforme realmente presente sob condições fisiológicas.
[000295] Os ácidos nucléicos foram caracterizados no nível de aptâmero usando os ensaios de co-imunoprecipitação direta e competitiva com a D-MCP-1 humana biotinilada, para graduá-los com relação ao seu comportamento de ligação (Exemplo 4). As sequências selecionadas foram sintetizadas como "spiegelmero" (Exemplo 3) e foram testadas usando a configuração natural da MCP-1 (L-McP) nos ensaios de liberação de Ca++ em cultura de células in vitro (Exemplo 5) ou de quimiotaxia in vitro (Exemplo 6).
[000296] As sequências das caixas definidas podem ser diferentes entre os ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 3, o que influencia a afinidade de ligação à MCP-1. Com base na análise da ligação dos diferentes ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1, resumidos como ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 2, as caixas B1A|, B2, e |B1B| e as suas sequências de nucleotídeos, como descritas no que se segue, são individualmente, e mais preferivelmente, em sua totalidade, essenciais para a ligação à MCP-1: • caixas B1A e |B1B|, extensões 5' e 3' terminais que podem hibridizar uma com a outra; onde B1A é ACGCA e B1B é UGCGU, ou B1A é CGCA e B1B é UGCG, ou B1A é GCA e B1B é UGCG ou UGC|; preferivelmente B1A é GCA e |B1B| é |UGCG; • caixa B2, CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCG- YGGCUC, preferivelmente CGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCC- GUGGCUC
[000297] Conforme representado na Figura 3, o ácido nucléico referido como 180-D1-002, bem como os derivados de 180-D1-002, como o 180-D1-011, o 180-D1-012, o 180-D1-035, e o 180-D1-036 (= NOX-E36), têm a melhor afinidade de ligação à MCP-1 como aptâmero no ensaio de co-imunoprecipitação direta ou competitiva, com uma KD de < 1 nM e, portanto, pode constituir a sequência otimizada e a combinação otimizada dos elementos da sequência |B1A, B2, e |B1B.
[000298] Para a molécula de ácido nucléico D-NOX-E36 (D-180-D1- 036; SEQ.ID NO: 159), uma constante de dissociação (KD) de 890 ± 65 pM, na temperatura ambiente (TA), e de 146 ±13 pM, a 37°C, foi determinada (Exemplo 4; Figura 9). O "spiegelmero" respectivo NOX- E36 (180-D1-036; SEQ.ID NO: 37) exibiu uma concentração inibitória (IC50) de 3 - 4 nM em um ensaio de liberação de Ca++ in vitro (Exemplo 5; Figura 12) e de cerca de 0,5 nM em um ensaio de quimiotaxia in vitro (Exemplo 6; Figura 15). Para os derivados PEGuilados de NOX-E36, NOX-E36-3'PEG e NOX-E36-5'PEG, as IC50s de cerca de 3 nM foram determinadas no ensaio de liberação de Ca++ (Exemplo 5, Figura 25 e Figura 27A) e < 1 nM no ensaio de quimiotaxia (Exemplo 6; Figura 26 e Figura 27B). Ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 3 (Figuras 4+5)
[000299] Conforme representado nas Figuras 4 e 5, todas as sequências do Tipo 3 compreendem diversas extensões ou caixas de sequências, pelo que três pares de caixas são característicos para os ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 3. Ambas as caixas B1A| e |B1B|, bem como as caixas B2A e B2B, bem como as caixas B5A e B5B contêm a capacidade de hibridizar uma com a outra. Entretanto, tal hibridização não é necessariamente dada na molécula conforme realmente presente sob condições fisiológicas. Os nucleotídos de não- hibridização estão localizados entre estes elementos de sequência potencialmente hibridizados, definidos como caixa B3, caixa B4 e caixa B6.
[000300] Os ácidos nucléicos foram caracterizados no nível de aptâmero usando os ensaios de co-imunoprecipitação direta e competitiva com a D-MCP-1 humana biotinilada, para graduá-los com relação ao seu comportamento de ligação (Exemplo 4). As sequências selecionadas foram sintetizadas como "spiegelmero" (Exemplo 3) e foram testadas usando a configuração natural da MCP-1 (L-McP) nos ensaios de quimiotaxia in vitro (Exemplo 6) ou via medições por Biacore (Exemplo 7).
[000301] As sequências das caixas definidas podem ser diferentes entre os ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 3, o que influencia a afinidade de ligação à MCP-1. Com base na análise da ligação dos diferentes ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1, resumidos como ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 3, as caixas B1A, B2A, B3, B2B, B4, B5A, B6, B5B, B1B e as suas sequências de nucleotídeos, como descritas no que se segue, são individualmente, e mais preferivelmente, em sua totalidade, essenciais para a ligação à MCP-1: • caixas B1A e B1B, extensões 5' e 3' terminais que podem hibridizar uma com a outra; onde B1A é GURCUGC e B1B é GCAGCAC; preferivelmente |B1A| é |GUGCUGC| e |B1B| é GCAGCAC; ou |B1A| é GKSYGC e |B1B| é GCRSMC; preferivelmente B1A é GUGCGC e B1B é GCGCAC; ou |B1A| é |KBBSC| e |B1B| é |GSVVM|; preferivelmente |B1A| é KKSSC e B1B é GSSMM; ou |B1A| é |BNGC| e |B1B| é |GCNV|; preferivelmente |B1A| é B1B| é |GCNS|; mais preferivelmente |B1A é |GGGC| e |B1B| é GCCC; • caixas B2A e B2B, extensões que podem hibridizar uma com a outra; onde B2A é GKMGU e B2B é ACKMC; preferivelmente B2A é GUAGU e B2B é ACUAC; • caixa B3, a qual é KRRAR, preferivelmente UAAAA ou GAGAA; • caixa B4, a qual é CURYGA ou CUWAUGA ou CWRMGACW ou UGCCAGUG, preferivelmente CAGCGACU ou CAACGACU; • B5A e B5B, extensões que podem hibridizar uma com a outra; onde B5A é GGY e B5B é GCYR, considerando que GCY pode hibridizar com os nucleotídeos de B5A; ou B5A é CWGC e B5B é GCWG; preferivelmente B5A é GGC e B5B é GCCG; • caixa B6, a qual é: YAGA ou CKAAU] ou CCUUUAU, preferivelmente |UAGA|.
[000302] Conforme representado nas Figuras 4 e 5, o ácido nucléico referido como 178-D5 e o seu derivado 178-D5-030, e também 181-A2 com os seus derivados 181-A2-002, 181-A2-004, 181-A2-005, 181-A2- 006, 181-A2-007, 181-A2-017, 181-A2-018, 181-A2-019, 181-A2-020, 181-A2-021, e 181-A2-023 têm a melhor afinidade de ligação à MCP-1. 178-D5 e 178-D5-030 foram avaliados como aptâmeros nos ensaios de co-imunoprecipitação direta ou competitiva (Exemplo 4) com uma KD de aproximadamente 500 pM. Na mesma configuração experimental, 181- A2 foi determinado com uma KD de aproximadamente 100 pM. Através de análise por Biacore (Exemplo 7), a KD de 181-A2 e de seus derivados para a MCP-1 foi determinada ser 200 - 300 pM. Nos ensaios de liberação de Ca++ e de quimiotaxia com as culturas de células (Exemplos 5 e 6, respectivamente), para ambos 178-D5 e 181-A2, mediu-se uma IC50 de aproximadamente 500 pM. Portanto, 178-D5 e também 181-A2 e os seus derivados podem constituir a sequência otimizada e a combinação otimizada de elementos da sequência |B1A|, B2A, B3, B2B, B4, B5A, B6, B5B e BIB. Ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 4 (Figura 6)
[000303] Conforme representado na Figura 6, todas as sequências do Tipo 4 compreendem diversas sequências, extensões ou caixas, pelo que as caixas |B1A| e |B1B| são as extensões 5' e 3' terminais que podem hibridizar uma com a outra, e a caixa B2 é o elemento de sequência central.
[000304] Os ácidos nucléicos foram caracterizados no nível de aptâmero usando os ensaios de co-imunoprecipitação direta com a D- MCP-1 humana biotinilada, para graduá-los com relação ao seu comportamento de ligação (Exemplo 4). As sequências selecionadas foram sintetizadas como "spiegelmero" (Exemplo 3) e foram testadas usando a configuração natural da MCP-1 (L-McP) em um ensaio de liberação de Ca++ em cultura de células in vitro (Exemplo 5) e/ou ensaio de quimiotaxia (Exemplo 6).
[000305] As sequências das caixas definidas podem diferir entre os ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 4, o que influencia a afinidade de ligação à MCP-1. Com base na análise da ligação dos diferentes ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1, resumidos como ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 4, as caixas B1A, B2, e |B1B| e as suas sequências de nucleotídeos, como descritas no que se segue, são individualmente, e mais preferivelmente, em sua totalidade, essenciais para a ligação à MCP-1: • caixas |B1A| e |B1B|, extensões 5' e 3' terminais que podem hibridizar uma com a outra; onde |B1A| é AGCGUGDU| e |B1B| é GNCASGCU; ou B1A é GCGCGAG e B1B é CUCGCGUC; ou B1A é CSKSUU e B1B é GRSMSG; ou B1A é GUGUU e B1B é GRCAC; ou B1A| é |UGUU| e |B1B| é |GGCA|; preferivelmente |B1A| é |CSKSUU| e B1B é GRSMSG; mais preferido B1A é |CCGCUU|e |BIB|é GGGCGG; e • caixa B2, a qual é AGNDRDGBKGGURGYARGUAAAG ou AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG ou CAGGUGGGUGGUAGA- AUGUAAAGA, preferivelmente AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG
[000306] Conforme representado na Figura 6., o ácido nucléico referido como 174-D4-004 e 166-A4-002 tem a melhor afinidade de ligação à MCP-1 (como "spiegelmero" com uma IC50 de 2 - 5 nM no ensaio de liberação de Ca++ em cultura de células in vitro) e pode, portanto, constituir a sequência otimizada e a combinação otimizada dos elementos da sequência |B1A, B2, e B1B
[000307] Adicionalmente, 29 outros ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 foram identificados, os quais não podem ser descritos por uma combinação de elementos da sequência de nucleotídeos, como foi mostrado para os Tipos 1 - 4 dos ácidos nucléicos que se ligam à MCP- 1. Estas sequências são listadas na Figura 7.
[000308] É para ser entendido que quaisquer das sequências mostradas nas Figuras 1 até 7 são ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção, incluindo aquelas formas truncadas deles, porém também incluindo aquelas formas estendidas deles, sob a condição, entretanto, que as moléculas de ácidos nucléicos assim truncadas e estendidas, respectivamente, ainda sejam capazes de ligar-se ao alvo. Exemplo 2: Ácidos nucléicos que ligam a MCP-1 de murino
[000309] Utilizando a D-MCP-1 de murino biotinilada como um alvo, puderam ser geradas diversas moléculas de ácidos nucléicos que se ligam a ela. O resultado de uma análise da sequência destas moléculas de ácidos nucléicos pode ser inferido a partir da Figura 8.
[000310] Os ácidos nucléicos foram caracterizados no nível de aptâmero usando o ensaio de co-imunoprecipitação utilizando a D- MCP-1 de murino biotinilada, para graduá-los com relação ao seu comportamento de ligação (Exemplo 4). As sequências selecionadas foram sintetizadas como "spiegelmero" (Exemplo 3) e foram testadas usando a configuração natural da MCP-1 (L-McP) em um ensaio de liberação de Ca++ em cultura de células in vitro (Exemplo 5) e de quimiotaxia (Exemplo 6).
[000311] Conforme representado na Figura 8, o D-188-A3-001 e o D- 189-G7-001 e os seus derivados ligam a D-MCP-1 com KD subnanomolar no ensaio de co-imunoprecipitação (Figura 8).
[000312] Para o D-mNOX-E36 (= D-188-A3-007; SEQ.ID NO: 244), uma constante de dissociação (KD) de 0,1 - 0,2 nM, a 37°C, foi determinada (Exemplo 4; Figura 10). O "spiegelmero" respectivo mNOX-E36 (188-A3-007; SEQ.ID NO: 122) exibiu uma concentração inibitória (IC50) de aproximadamente 12 nM em um ensaio de liberação de Ca++ in vitro (Exemplo 5; Figura 13) e de aproximadamente 7 nM em um ensaio de quimiotaxia in vitro (Exemplo 6; Figura 16). Para o derivado PEGuilado de mNOX-E36, mNOX-E36-3’PEG (SEQ.ID NO: 254), as IC50's de aproximadamente 8 nM foram determinadas no ensaio de liberação de Ca++ (Exemplo 5, Figura 29) e aproximadamente 3 nM no ensaio de quimiotaxia (Exemplo 6; Figura 31).
[000313] É para ser entendido que quaisquer das sequências mostradas nas Figuras 1 até 7 são ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção, incluindo aquelas formas truncadas deles, porém também incluindo aquelas formas estendidas deles, sob a condição, entretanto, que as moléculas de ácidos nucléicos assim truncadas e estendidas, respectivamente, ainda sejam capazes de ligar-se ao alvo. Exemplo 3: Síntese e derivação de Aptâmeros e "spiegelmeros" Síntese em pequena escala
[000314] Os Aptâmeros e os "spiegelmeros" foram produzidos por síntese em fase sólida com um sintetizador ABI 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), usando a química de 2’TBDMS RNA fosforamidita (M.J. Damha, K.K. Ogilvie, Methods in Molecular Biology, Vol. 20 Protocols for oligonucleotides and analogs, ed. S. Agrawal, páginas 81-114, Humana Press Inc. 1993). As rA(N-Bz)-, rC(Ac)-, rG(N- ibu)-, e rU- fosforamiditas na configuração D e L foram adquiridas da ChemGenes, Wilmington, MA. Os Aptâmeros e os "spiegelmeros" foram purificados por eletroforese em gel.
Síntese em grande escala mais modificação
[000315] O "spiegelmero" NOX-E36 foi produzido por síntese em fase sólida com um sintetizador ÃktaPilotWO (Amersham Biosciences; General Electric Healthcare, Freiburg), usando a química de 2’TBDMS RNA fosforamidita (M.J. Damha, K.K. Ogilvie, Methods in Molecular Biology, Vol. 20 Protocols for oligonucleotides and analogs, ed. S. Agrawal, páginas 81-114, Humana Press Inc. 1993). As L-rA(N-Bz)-, L- rC(Ac)-, L-rG(N-ibu)-, e L-rU- fosforamiditas foram adquiridas da ChemGenes, Wilmington, MA. O 5’-amino-modificador foi adquirido da American International Chemicals Inc. (Framingham, MA, EUA). A síntese do "spiegelmero" não modificado foi iniciada sobre o tamanho de poro de CPG modificado com L-riboG 1000 Â (Link Technology, Glasgow, UK); para o "spiegelmero" modificado com 3'-NH2, usou-se 3'- Aminomodificador-CPG, 1000 Â (ChemGenes, Wilmington, MA). Para o acoplamento (15 min. por ciclo), usou-se 0,3 M de benziltiotetrazol (CMS-Chemicals, Abingdon, UK) em acetonitrila, e 3,5 equivalentes da solução a 0,1 M de fosforamidita respectiva em acetonitrila. Usou-se um ciclo de oxidação-capeamento. Os solventes e os reagentes padrões adicionais para a síntese de oligonucleotídeos foram adquiridos da Biosolve (Valkenswaard, NL). O "spiegelmero" foi sintetizado DMT-ON; após a desproteção, ele foi purificado via RP-HPLC preparativa (Wincott F. et al. (1995) Nucleic Acids Res 23:2677), usando o meio Source15RPC (Amersham). O grupo 5'DMT foi removido com ácido acético a 80% (30 min. na TA). Subsequentemente, a solução aquosa a 2 M de NaOAc foi adicionada e o "spiegelmero" foi dessalinizado por filtração de fluxo tangencial usando uma membrana de celulose regenerada de 5 K (Millipore, Bedford, MA).
PEGuilação de NOX-E36
[000316] Para prolongar o tempo de residência no plasma do "spiegelmero" in vivo, o "spiegelmero" NOX-E36 foi acoplado covalentemente a uma porção de polietileno glicol (PEG) de 40 kDa na extremidade de 3' ou na extremidade de 5'. 3'-PEGuilação de NOX-E36
[000317] Para a PEGuilação (quanto a detalhes técnicos do método para a PEGuilação, vide o pedido de patente europeu EP 1 306 382), o "spiegelmero" modificado com 3'-amino purificado foi dissolvido em uma mistura de H2O (2,5 ml), DMF (5 ml), e tampão A (5 ml: preparado por mistura de ácido cítrico • H2O [7 g], ácido bórico [3,54 g], ácido fosfórico [2,26 ml], e NaOH a 1 M [343 ml] e adição de H2O até um volume final de 1 l; o pH = 8,4 foi ajustado com HCl a 1 M).
[000318] O pH da solução de "spiegelmero" foi levado para 8,4 com NaOH a 1 M. Então, o éster de PEG-NHS de 40 kDa (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL) foi adicionado, a 37°C, a cada 30 min., em quatro porções de 0,6 equivalente, até um rendimento máximo de 75 a 85% ser atingido. O pH da mistura de reação foi mantido a 8 - 8,5 com NaOH a 1 M durante a adição do éster de PEG-NHS.
[000319] A mistura de reação foi combinada com 4 ml de solução de uréia (8 M), 4 ml de tampão A, e 4 ml de tampão B (acetato de trietilamônio a 0,1 M em H2O) e aquecida para 95°C por 15 min.. O "spiegelmero" PEGuilado foi então purificado por RP-HPLC com o meio Source 15RPC (Amersham), usando um gradiente de acetonitrila (tampão B; tampão C: acetato de trietilamônio a 0,1 M em acetonitrila). O PEG em excesso eluiu em 5% de tampão C, o "spiegelmero" PEGuilado em 10 - 15% de tampão C. As frações de produto com uma pureza de >95% (como avaliada por HPLC) foram combinadas e misturadas com 40 ml de NaOAc a 3 M. O "spiegelmero" PEGuilado foi dessalinizado por filtração de fluxo tangencial (membrana de celulose regenerada de 5 K, Millipore, Bedford, MA). 5'-PEGuilação de NOX-E36
[000320] Para a PEGuilação (quanto a detalhes técnicos do método para a PEGuilação, vide o pedido de patente europeu EP 1 306 382), o "spiegelmero" modificado com 5'-amino purificado foi dissolvido em uma mistura de H2O (2,5 ml), DMF (5 ml), e tampão A (5 ml: preparado por mistura de ácido cítrico • H2O [7 g], ácido bórico [3,54 g], ácido fosfórico [2,26 ml], e NaOH a 1 M [343 ml] e adição de água até um volume final de 1 l; o pH = 8,4 foi ajustado com HCl a 1 M).
[000321] O pH da solução de "spiegelmero" foi levado para 8,4 com NaOH a 1 M. Então, o éster de PEG-NHS de 40 kDa (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL) foi adicionado, a 37°C, a cada 30 min., em seis porções de 0,25 equivalente, até um rendimento máximo de 75 a 85% ser atingido. O pH da mistura de reação foi mantido a 8 - 8,5 com NaOH a 1 M durante a adição do éster de PEG-NHS.
[000322] A mistura de reação foi combinada com 4 ml de solução de uréia (8 M), e 4 ml de tampão B (acetato de trietilamônio a 0,1 M em H2O) e aquecida para 95°C por 15 min.. O "spiegelmero" PEGuilado foi então purificado por RP-HPLC com o meio Source 15RPC (Amersham), usando um gradiente de acetonitrila (tampão B; tampão C: acetato de trietilamônio a 0,1 M em acetonitrila). O PEG em excesso eluiu em 5% de tampão C, o "spiegelmero" PEGuilado em 10 - 15% de tampão C. As frações de produto com uma pureza de >95% (como avaliada por HPLC) foram combinadas e misturadas com 40 ml de NaOAc a 3 M. O "spiegelmero" PEGuilado foi dessalinizado por filtração de fluxo tangencial (membrana de celulose regenerada de 5 K, Millipore, Bedford, MA).
Exemplo 4: Determinação das Constantes de Ligação (Ensaio de Co-Imunoprecipitação) Ensaio de co-imunoprecipitação direta
[000323] A afinidade dos aptâmeros pela D-MCP-1 foi medida em um formato de ensaio de co-imunoprecipitação, a 20 ou 37°C, respectivamente. Os aptâmeros foram marcados com 5'-fosfato pela T4 polinucleotídeo cinase (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha), usando o ATP marcado com [y-32P] (Hartmann Analytic, Braunschweig, Alemanha). A radioatividade específica dos aptâmeros marcados era 200.000 - 800.000 cpm/pmol. Os aptâmeros foram incubados após a des- e a renaturação em concentração de 20 pM, a 37°C, em tampão de seleção (Tris-HCl a 20 mM pH 7,4; NaCl a 137 mM; KCl a 5 mM; MgCl2 a 1 mM; CaCl2 a 1 mM; 0,1% [p/vol] de Tween-20), juntamente com quantidades variadas de D-MCP-1 biotinilada, por 4 - 12 horas, para atingir o equilíbrio em baixas concentrações. O tampão de seleção foi suplementado com 10 μg/ml de soro albumina humana (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha), e 10 μg/ml de RNA de levedura (Ambion, Austin, EUA), para impedir a adsorção de pares de ligação com as superfícies dos artigos plásticos usados ou da matriz de imobilização. A faixa de concentrações da D-MCP-1 biotinilada foi ajustada de 8 pM até 100 nM; o volume total de reação era 1 ml. O peptídeo e os complexos de peptídeo-aptâmero foram imobilizados sobre 1,5 μl de partículas de Estreptatvidina Ultralink Plus (Pierce Biotechnology, Rockford, EUA) que tinham sido pré-equilibradas com tampão de seleção e ressuspensas novamente em um volume total de 6 μl. As partículas foram mantidas em suspensão por 30 min., na temperatura respectiva, em um termomisturador. A radioatividade imobilizada foi quantificada em um contador de cintilação após remoção do sobrenadante e lavagem apropriada. A porcentagem de ligação foi representada graficamente contra a concentração de D-MCP-1 biotinilada e as constantes de dissociação foram obtidas usando os algoritmos de softwares (GRAFIT; Software Erithacus; Surrey U.K.) assumindo uma estequiometria de 1:1.
Ensaio de co-imunoprecipitação competitiva
[000324] Para comparar os diferentes aptâmeros que se ligam à D- MCP-1, efetuou-se um ensaio de classificação competitiva. Para este propósito, o aptâmero mais afim foi marcado radioativamente (vide acima) e serviu como referência. Após a des- e a renaturação, ele foi incubado a 37°C com D-MCP-1 biotinilada, em 1 ml de tampão de seleção, em condições que resultaram em aproximadamente 5 - 10% de ligação ao peptídeo, após imobilização e lavagem sobre agarose de NeutrAvidina ou Estreptavidina Ultralink Plus (ambas da Pierce), sem competição. Um excesso das variantes de aptâmeros de D-RNA não marcados, des- e renaturados, foi adicionado a diferentes concentrações (por exemplo, 2, 10, e 50 nM), com o aptâmero de referência marcado, para correr paralelamente às reações de ligação. Os aptâmeros a serem testados competiram com o aptâmero de referência pela ligação ao alvo, assim diminuindo o sinal de ligação em dependência de suas características de ligação. O aptâmero que foi verificado ser o mais efetivo neste ensaio pôde então servir como uma nova referência para a análise comparativa de mais variantes de aptâmeros.
Exemplo 5: Determinação da Concentração Inibitória em um Ensaio de Liberação de Ca++
[000325] As células THP-1 (DSMZ, Braunschweig) foram cultivadas durante a noite, em uma densidade de células de 0,3 x 106/ml, a 37°C e 5% de CO2, em meio RPMI 1640, com GlutaMAX (Invitrogen), que continha, além disso, 10% de soro de bezerro fetal, 50 unidades/ml de penicilina, 50 μg/ml de estreptomicina e 50 μM de β-mercaptoetanol.
[000326] Os "spiegelmeros" foram incubados juntamente com a MCP- 1 humana recombinante (Bachem) em solução de sal balanceada de Hanks (HBSS), contendo 1 mg/ml de soro albumina bovina, 5 mM de probenecid e 20 mM de HEPES (HBSS+), por 15 a 60 min., a 37°C, em uma placa de 96 tubos, de baixo contorno, de 0,2 ml ("solução de estimulação").
[000327] Para a carga com o corante indicador de cálcio, as células foram centrifugadas a 300 x g por 5 min., suspensas novamente em 4 ml de solução de corante indicador (10 μM de fluo-4 [Molecular Probes], 0,08% de pluronic 127 [Molecular Probes] em HBSS+) e incubadas por 60 min., a 37°C. Após isso, 11 ml de HBSS+ foram adicionados e as células foram centrifugadas conforme acima descrito, lavadas uma vez com 15 ml de HBSS+ e então suspensas novamente em HBSS+ para dar uma densidade de células de 1,1 x 106/ml. 90 μl desta suspensão de células foram adicionados a cada cavidade de uma placa de 96 cavidades, preta.
[000328] A medição dos sinais de fluorescência foi feita em um comprimento de ondas de excitação de 485 nm e um comprimento de ondas de emissão de 520 nm, em uma leitora de placas de multidetecção Fluostar Optima (BMG). Para a medição em paralelo das diversas amostras, as cavidades de uma fileira (perpendicular) de uma placa de 96 cavidades foram registrados juntos. As primeiras três leituras, com uma defasagem de 4 s, foram feitas para a determinação da linha de base. Então, o registro foi interrompido e a placa foi movida do instrumento. Usando uma pipeta de múltiplos canais, 10 μl da solução de estimulação foram adicionados aas cavidades, então a placa foi movida para o instrumento novamente e a medição foi continuada. No total, foram efetuados 20 registros com intervalos de tempo de 4 segundos.
[000329] Para cada cavidade, a diferença entre a fluorescência máxima e o valor de linha de base foi determinada e representada graficamente contra a concentração de MCP-1 ou, nos experimentos sobre a inibição da liberação de cálcio pelos "spiegelmeros", contra a concentração de "spiegelmero".
Determinação da concentração semi-efetiva máxima (EC50) para a MCP-1 humana
[000330] Após a estimulação das células THP-1 com as diversas concentrações de hMCP-1 e a representação gráfica da diferença entre os sinais máximos e da linha de base, uma curva de resposta à dose para a MCP-1 humana foi obtida, indicando uma concentração semi- efetiva (EC50) de cerca de 2 - 4 nM (Figura 11). Esta concentração foi usada para os experimentos adicionais sobre a inibição da liberação de Ca++ pelos "spiegelmeros".
Determinação da concentração semi-efetiva máxima (EC50) para a MCP-1 de murino
[000331] Após a estimulação das células THP-1 com as diversas concentrações de mMCP-1 e a representação gráfica da diferença entre os sinais máximos e da linha de base, uma curva de resposta à dose para a MCP-1 de murino foi obtida, indicando uma concentração semi- efetiva (EC50) de cerca de 5 nM (Figura 28). Esta concentração foi usada para os experimentos adicionais sobre a inibição da liberação de Ca++ pelos "spiegelmeros".
Exemplo 6: Determinação da Concentração Inibitória em um Ensaio de Quimiotaxia
[000332] As células THP-1, desenvolvidas conforme descrito acima, foram centrifugadas, lavadas uma vez em HBH (HBSS, contendo 1 mg/ml de soro albumina bovina e 20 mM de HEPES) e suspensas novamente a 3 x 106 células/ml. 100 μl desta suspensão foram adicionados aos insertos Transwell com poros de 5 μm (Corning, no 3421). Nos compartimentos inferiores, a MCP-1 foi pré-incubada juntamente com os "spiegelmeros" em diversas concentrações, em 600 μl de HBH, a 37°C, por 20 a 30 min., antes da adição das células. As células foram deixadas migrar a 37°C por 3 horas. Após isso, os insertos foram removidos e 60 μl de resazurina a 440 μM (Sigma) em solução salina tamponada com fosfato foram adicionados aos compartimentos inferiores. Após incubação a 37°C por 2,5 horas, a fluorescência foi medida em um comprimento de ondas de excitação de 544 nm e um comprimento de ondas de emissão de 590 nm, em uma leitora de placas de multidetecção Fluostar Optima (BMG).
Determinação da concentração semi-efetiva máxima (EC50) para a MCP-1 humana
[000333] Após 3 horas de migração das células THP-1 para as diversas concentrações de MCP-1 humana, obteve-se uma curva de resposta à dose para a MCP-1 humana, indicando uma concentração efetiva máxima de cerca de 1 nM e ativação reduzida nas concentrações mais elevadas (Figura 14). Para os experimentos adicionais sobre a inibição da quimiotaxia pelos "spiegelmeros", utilizou-se uma concentração de MCP-1 de 0,5 nM.
Determinação da concentração semi-efetiva máxima (EC50) para a MCP-1 de murino
[000334] Após 3 horas de migração das células THP-1 para as diversas concentrações de MCP-1 de murino, obteve-se uma curva de resposta à dose para a MCP-1 de murino, indicando uma concentração efetiva máxima de cerca de 1 - 3 nM e ativação reduzida nas concentrações mais elevadas (Figura 30). Para os experimentos adicionais sobre a inibição da quimiotaxia pelos "spiegelmeros", utilizou- se uma concentração de MCP-1 de murino de 0,5 nM.
Exemplo 7: Análise da Ligação por Medição da Ressonância Plasmônica de Superfície 7.1 Avaliação da especificidade de NOX-E36, 181-A2-018 e mNOX-E36
[000335] O instrumento Biacore 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suécia) foi usado para analisar a ligação dos ácidos nucléicos à MCP-1 humana e proteínas relacionadas. Quando o acoplamento era para ser atingido via grupos amina, as proteínas foram dialisadas contra a água, por 1 - 2 h (ésteres de celulose mistos VSWP da Millipore; tamanho do poro, 0,025 μM), para remover as aminas interferentes. Os chips de sensor PioneerF1 ou CM4 (Biacore AB) foram ativados antes do acoplamento da proteína por uma injeção de 35 μl de uma diluição a 1:1 de NHS a 0,4 M e EDC a 0,1 M, em um fluxo de 5 μl/min.. A quimiocina foi então injetada em concentrações de 0,1 - 1,5 μg/ml, em um fluxo de 2 μl/min., até que a resposta do instrumento estivesse na faixa de 1000 - 2000 RU (unidades relativas). Os ésteres de NHS não-reagidos foram desativados por injeção de 35 μl de solução de cloridrato de etanolamina (pH 8,5), em um fluxo de 5 μl/min. O chip de sensor foi iniciado duas vezes com tampão de ligação e equilibrado a 10 μl/min., por 1 - 2 horas, até que a linha de base parecesse estável. Para todas as proteínas, os parâmetros cinéticos e as constantes de dissociação foram avaliados por uma série de injeções de "spiegelmeros", em concentrações de 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, e 0 nM em tampão de seleção (Tris- HCl, 20 mM; NaCl, 137 mM; KCl, 5 mM; CaCl2, 1 mM; MgCl2, 1 mM; Tween20, 0,1% [p/v]; pH 7,4). Em todos os experimentos, a análise foi efetuada a 37°C, usando o comando Kinject que define um tempo de associação de 180 e um tempo de dissociação de 360 segundos, em um fluxo de 10 μl/min.. A análise dos dados e o cálculo das constantes de dissociação (KD) foram feitos com o software BIAevaluation 3.0 (BIACORE AP, Uppsala, Suécia), usando o algoritmo de adaptação estequiométrica Langmuir 1:1. 7.1.1 NOX-E36 e 181-A2-018 (ácidos nucléicos específicos para a MCP-1 humana)
[000336] Somente para a MCP-1 humana, todos os sensorgramas são representados (Figuras 17 e 20, respectivamente); para as outras proteínas; somente o sensorgrama obtido com a concentração de "spiegelmero" de 125 nM é mostrado no interesse de clareza (Figuras 18/19 e 21/22).
[000337] Análise da interação entre NOX-E36*hMCP-1: a MCP-1 humana recombinante foi imobilizada sobre um chip de sensor PioneerF1, seguindo as recomendações do fabricante (procedimento de acoplamento de amina), até que uma resposta do instrumento de 1381 RU (unidades relativas) fosse estabelecida. A constante de dissociação (KD) determinada para a ligação do NOX-E36 à MCP-1 humana foi cerca de 890 pM (Figura 17).
[000338] Análise da interação entre 181-A2-018*hMCP-1: a MCP-1 humana recombinante foi imobilizada sobre um chip de sensor CM4, seguindo as recomendações do fabricante (procedimento de acoplamento de amina), até que uma resposta do instrumento de 3111 RU (unidades relativas) fosse estabelecida. A constante de dissociação (KD) determinada para a ligação do 181-A2-018 à MCP-1 humana foi cerca de 370 pM (Figura 20).
[000339] Para determinar a especificidade do NOX-E36 e do 181-A2- 018, diversas proteínas da família de MCP-1 humana e também a eotaxina humana foram imobilizadas sobre um chip de sensor PioneerF1 e um CM4 (hMCP-1, 1754 RU; hMCP-2, 1558 RU; hMCP-3, 1290 RU; eotaxina, 1523 RU). A análise cinética revelou que o NOX- E36 se liga à eotaxina e à hMCP-2 com constantes de dissociação (KD) de 5 - 10 nM; a hMCP-3 não foi reconhecida (Figuras 18 e 24A). O 181- A2-018, em contraste, liga a eotaxina, a hMCP-2 e a hMCP-3, porém com afinidade ligeiramente menor (10 - 20 nM; Figuras 21 e 24A).
[000340] A reatividade cruzada entre as espécies de NOX-E36 e 181- A2-018 foi avaliada usando MCP-1 imobilizada por acoplamento de amino de ser humano (1460 RU), macaco (1218 RU), porco (1428 RU), cão (1224 RU), coelho (1244 RU), rato (1267 RU), e camundongo (1361 RU), sobre um chip de sensor PioneerF1 e um CM4. A análise cinética revelou que o NOX-E36 liga-se à MCP-1 humana, de macaco, de porco, e de cão com constantes de dissociação (KD) comparáveis de 0,89 - 1,2 nM, enquanto que a MCP-1 de camundongo, de rato e de coelho não foi reconhecida (Figuras 19 e 24A). O 181-A2-018 se liga à MCP-1 humana e de macaco com constantes de dissociação (KD) comparáveis de 0,5-0,6 nM, enquanto que a MCP-1 de porco, de coelho e de cão é ligada com afinidade muito menor. A MCP-1 de rato e de camundongo não foi reconhecida pelo NOX-A2-018 (Figuras 22 e 24A).
[000341] As sequências e também o grau de homologia em por cento de aminoácidos idênticos entre a proteína MCP-1 de diferentes espécies e as proteínas humanas estreitamente relacionadas são representados na Figura 23; os valores de KD calculados para o NOX- E36 e o 181-A2-018 são mostrados no formato de tabelas, na Figura 24A. 7.1.2 mNOX-E36 (ácido nucléico específico para a MCP-1 de murino)
[000342] Para analisar o comportamento de ligação do mNOX-E36, 3759 RU da D-MCP-1 de murina biotinilada sintética (célula de fluxo 3) e 3326 RU de D-MCP-1 humana biotinilada (célula de fluxo 4) foram imobilizados sobre um chip de sensor conjugado à Estreptavidina (Biacore AB, Freiburg, Alemanha), respectivamente. As soluções de aptâmero mNOX-E36 (D-RNA) de 500, 250, 125, 62,5, 31,25, e 0 nM foram injetadas usando o comando Kinject que define um tempo de associação de 180 s e um tempo de dissociação de 360 s. A célula de fluxo 1 foi usada como tampão e controle de matriz de dextrana (Biacore superfície de SA-Chip), enquanto que sobre a célula de fluxo 2, um D- peptídeo não-específico foi imobilizado para determinar a ligação não- específica do aptâmero. A Figura 32 mostra um sensorgrama da cinética de D-NOX-E36 para a ligação à D-MCP-1 de murino com uma constante de dissociação (KD) calculada de 200 - 300 pM. O mNOX-E36 não liga a D-MCP-1 humana (Figura 33); no interesse de clareza, somente o sensorgrama obtido com 125 nM de "spiegelmero" é mostrado. 7.2 Avaliação da seletividade do NOX-E36
[000343] A seletividade do NOX-E36 foi avaliada por análise de ressonância plasmônica de superfície, através de imobilização do NOX- E36 5'biotinilado sobre uma Estreptavidina (SA-Chip). 352 RU de NOX- E36 sobre a célula de fluxo (FC) 1 e uma quantidade igual de "spiegelmero" de controle não-funcional, biotinilado, 5' terminal (POC) sobre a FC 2 foram imobilizados por ligação de estreptavidina/biotina. A FC3 foi usada como controle de superfície para determinar a ligação não-específica à superfície do sensor de dextrana-SA.
[000344] 100 nM de um painel de quimiocinas humanas a partir de todos os quatro subgrupos (CC, CXC, CX3C, e XC) foram injetados por 360 s e os complexos foram deixados dissociar por 360 s, em um fluxo de 10 μl/min. e 37°C. As unidades de resposta após a associação (Resp. 1; grau de interação) e após a dissociação (Resp. 2, afinidade de interação) foram representadas graficamente. Após cada injeção, a superfície do chip foi regenerada com uns 240 s de cloreto de sódio a 1 M com 0,1% de Tween; os "spiegelmeros" imobilizados foram subsequentemente deixados redobrar por 2 minutos em condições fisiológicas (tampão de corrida). A injeção de cada quimiocina foi repetida 3 vezes. A CXCL1, a CXCL2, a CXCL6 e a CXCL9 mostraram ligação não-específica aos ácidos ribonucléicos e à superfície de dextrana do chip. A ligação específica com alta afinidade ao NOX-E36 imobilizado somente pôde ser detectada para CCL2/MCP-1, CCL8/MCP-2, CCL11/eotaxina, CCL3/MIP1α, e CXCL7/NAP-2 (Figura 24B). A verificação que a MCP-2 e a eotaxina estão ligadas pelo NOX- E36 não é surpreendente, devido à homologia relativamente alta entre estas quimiocinas e a MCP-1 de 62 e 70%, para os positivos inesperados CCL3/MIP-1α e CXCL7/NAP-2, os testes in vitro quanto à inibição funcional foram efetuados ou estão atualmente sendo estabelecidos, respectivamente.
[000345] Finalmente, os parâmetros cinéticos da interação entre NOX- E36 e CCL2/MCP-1, CCL8/MCP-2, CCL11/eotaxina, CCL3/MIP1α, CXCL7/NAP-2, CCL7/MCP-3 e CCL13/MCP-4 foram determinados no sistema "invertido". Aqui, as quimiocinas foram imobilizadas e o NOX- E36 livre foi injetado (quanto ao protocolo detalhado, vide 7.1). Os dados cinéticos são resumidos na Figura 24C. 7.3 Avaliação da Funcionalidade anti-MIP-1α in vitro
[000346] As medições por Biacore mostraram reatividade cruzada do NOX-E36 com a MIP-1α. Empregando-se um ensaio in vitro à base de cultura de células, funcional, deve ser checado se a mera ligação por Biacore do NOX-E36 à MIP-1α também se traduz em funcionalidade, por exemplo, antagonismo.
[000347] Para obter isto, os experimentos de quimiotaxia com as células THP-1 foram efetuados, que podem ser estimulados por MIP- 1α. As células THP-1, desenvolvidas conforme descrito acima, foram centrifugadas, lavadas uma vez em HBH (HBSS, contendo 1 mg/ml de soro albumina bovina e 20 mM de HEPES) e suspensas novamente a 3 x 106 células/ml. 100 μl desta suspensão foram adicionados aos insertos Transwell com poros de 5 μm (Corning, no 3421). Nos compartimentos inferiores, a MIP-1a foi pré-incubada juntamente com os "spiegelmeros" em diversas concentrações, em 600 μl de HBH, a 37°C, por 20 a 30 min., antes da adição das células. As células foram deixadas migrar a 37°C por 3 horas. Após isso, os insertos foram removidos e 60 μl de resazurina a 440 μM (Sigma) em solução salina tamponada com fosfato foram adicionados aos compartimentos inferiores. Após incubação a 37°C por 2,5 horas, a fluorescência foi medida em um comprimento de ondas de excitação de 544 nm e um comprimento de ondas de emissão de 590 nm, em uma leitora de placas de multidetecção Fluostar Optima (BMG).
[000348] Após 3 horas de migração das células THP-1 para as diversas concentrações de MIP-1a humana, obteve-se uma curva de resposta à dose para a MIP-1a humana, indicando uma concentração semi-efetiva máxima de cerca de 1 nM e ativação reduzida nas concentrações mais elevadas (Figura 24D). Para os experimentos adicionais sobre a inibição da quimiotaxia pelos "spiegelmeros", utilizou- se uma concentração de MIP-1 α de 0,5 nM.
[000349] Os experimentos para a determinação da inibição da quimiotaxia pelo NOX-E36 foram efetuados com um estímulo de 0,5 nM de MIP-1α. Pôde ser claramente mostrado que o NOX-E36 não inibe a quimiotaxia induzida pela MIP-1a até a concentração mais alta testada de 1 μM de MIP-1a. Como controle positivo, o experimento respectivo com a MCP-1 como estímulo foi efetuado em paralelo (Figura 24E).
Exemplo 8: Terapia da doença similar ao lúpus em camundongos MRLlpr/lpr com o "spiegelmero" anti-mMCP-1
[000350] O bloqueio dos mediadores pró-inflamatórios tornou-se uma abordagem bem-sucedida para o tratamento de inflamação crônica (Steinman 2004). Além do TNF e das interleucinas, as quimiocinas CC são candidatas importantes para o antagonismo específico, porque as quimiocinas CC mediam o recrutamento de leucócitos a partir do espaço intravascular para os locais de inflamação (Baggiolini 1998, Luster 2005). Há uma evidência muito forte que a MCP-1 (= CCL2) e o seu receptor de quimiocina respectivo CCR2 desempenham uma função crucial na lesão do tecido autoimune, tal como as manifestações clínicas de lúpus eritematoso sistêmico (Gerard e Rollins 2001). Por exemplo, os camundongos MRLlpr/lpr deficientes para o gene Ccl2 ou o Ccr2 são protegidos da auto-imunidade similar ao lúpus (Perez de Lema 2005, Tesch 1999). Portanto, o eixo CCL2/CCR2 pode representar um alvo terapêutico promissor, por exemplo, a nefrite por lúpus. Na realidade, a terapia de gene retardada ou a transferência de células transfectadas, ambas resultando na produção in situ de uma MCP-1 truncada com NH2, marcadamente reduziram a lesão ao tecido autoimune nos camundongos MRLlpr/lpr. Entretanto, tais abordagens experimentais não podem ser usadas em seres humanos por causa da produção de antagonista irreprimível e da formação de tumor (Hasegawa 2003, Shimizu 2004). Portanto, permanece necessário desenvolver novos antagonistas de CCL2 com perfis favoráveis de farmacocinética in vivo. Neste exemplo, mostra-se que o bloqueio da CCL2 de murino com o "spiegelmero" anti-mCCL2 mNOX-E36 ou mNOX-E36-3'PEG seria adequado para a o tratamento de nefrite por lúpus e outras manifestações de doença de lúpus eritematoso sistêmico. O início tardio da terapia com o "spiegelmero" mCCL2 efetivamente melhora a nefrite por lúpus, a peribronquite autoimune, e a doença da pele similar ao lúpus em camundongos MRLlpr/lpr, independente de qualquer problema anterior associado com o bloqueio de CCL2/CCR2 terapêutico. Animais e Protocolo Experimental
[000351] Os camundongos MRLlpr/lpr fêmeos de dez semanas de idade foram obtidos de Harlan Winkelmann (Borchen, Alemanha) e mantidos sob condições normais de alojamento em um ciclo de luz e escuridão de 12 horas. Água e comida padrão (Ssniff, Soest, Alemanha) estavam disponíveis ad libitum. Na idade de 14 semanas, os grupos de 12 camundongos receberam injeções subcutâneas dos "spiegelmeros" em 5 % de glicose (volume de injeção, 4 ml/kg), três vezes por semana, como se segue: mNOX-E36, 1,5 μmol/kg; mNOX-E36-3'PEG, 0,9 μmol/kg; "spiegelmero" de controle não-funcional PoC (5’- UAAGGAAACUCGGUCUGAUGCGGU AGCGCUGUGCAGAGCU-3’), 1,9 μmol/kg; PoC-PEG, 0,9 μmol/kg; veículo (5 % de glicose). Os níveis no plasma de mNOX-E36 e mNOX-E36-3'PEG foram determinados a partir das amostras de sangue retiradas semanalmente do seio retroorbital, 3 ou 24 horas após a injeção, respectivamente. Os níveis de "spiegelmero" nas amostras de plasmas foram determinados por uma modificação do método de hibridização em sanduíche conforme descrito no Exemplo 8. Os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical no final de 24 semanas de idade. Avaliação do lúpus sistêmico
[000352] As lesões da pele foram registradas por um escore semiquantitativo (Schwarting 2005). A razão em peso de baço e o volume dos linfonodos mesentéricos para o peso total do corpo foram calculados como marcadores da síndrome linfoproliferativa associada ao lúpus. As amostras de sangue e urina foram coletadas de cada animal, no final do período de estudo, por sangramento do plexo venoso retroorbital, sob anestesia geral com éter inalado. As amostras de sangue e urina foram coletadas de cada animal no final do estudo e a razão de albumina/creatina e os títulos de isótipos de IgG de auto- anticorpos paraa dsDNA no soro foram determinados conforme anteriormente descrito (Pawar 2006). A taxa de filtração glomerular (GFR) foi determinada em 24 semanas pela cinética de depuração de FITC-inulina no plasma (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha), 5, 10, 15, 20, 35, 60, e 90 minutos após uma única injeção de bolo (Qi 2004). A fluorescência foi determinada com excitação a 485 nm e leitura em emissão a 535 nm. A GFR foi calculada com base em um modelo de dois compartimentos, usando um software de adaptação à curva de regressão não-linear (GraphPad Prism, GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Os níveis de citocinas no soro foram determinados usando kits comerciais de ELISA para IL-6, IL-12p40 (OptEiA, BD Pharmingen), e IFN-α (PBL Biomedical Labs, EUA). A partir de todos os camundongos, os rins e os pulmões foram fixados em formalina tamponada a 10%, processados, e incrustados em parafina. As seções de 5 μm para as colorações com prata e ácido periódico-Schiff foram preparadas seguindo protocolos de rotina (Anders 2002). A gravidade das lesões renais foi graduada usando os índices para atividade e cronicidade, conforme descritos para a nefrite por lúpus humana (Austin 1984), e a morfometria da lesão intersticial renal foi conduzida conforme anteriormente descrito (Anders 2002). A gravidade da inflamação peribronquial foi graduada de modo semiquantitativo de 0-4. Para a imunocoloração, as seções de tecidos fixados em formalina e incrustados em parafina foram removidas da cera e hidratadas novamente. A peroxidase endógena foi bloqueada por peróxido de hidrogênio a 3 % e a recuperação do antígeno foi efetuada em Solução de Recuperação de Antígeno (Vector, Burlingame, CA) em um forno de autoclave. A biotina foi bloqueada usando o Kit de bloqueio de Avidina/Biotina (Vector). As lâminas foram incubadas com os anticorpos primários por uma hora, seguidos pelos anticorpos secundários biotinilados (anti-IgG de rato, Vector), e o reagente ABC (Vector). As lâminas foram lavadas em solução salina tamponada com fosfato entre as etapas de incubação. A 3'3'Diaminobenzidina (DAB, Sigma, Taufkirchen, Alemanha) com reforço de metal foi usada como sistema de detecção, resultando em um produto de cor preta. O verde de metila foi usado como um contracorante, as lâminas foram desidratadas e montadas em Histomount (Zymed Laboratories, San Francisco, CA). Os seguintes anticorpos primários foram usados: anti-Mac2 em rato (macrófagos, Cederlane, Ontario, Canadá, 1:50), anti-CD3 de camundongo (1:100, clone 500A2, BD), anti-IgG1 de camundongo (1:100, M32015, Caltag Laboratories, Burlingame, CA, EUA), anti-IgG2a de camundongo (1:100, M32215, Caltag), anti-C3 de camundongo (1:200, GAM/C3c/FITC, Nordic Immunological Laboratories, Tilburg, Países Baixos). Os controles negativos incluíram a incubação com um anticorpo de isótipo respectivo. Para a análise quantitativa, as células glomerulares foram contadas em 15 glomérulos corticais por secção. Os depósitos de Ig e C3c glomerulares foram classificados de 0-3 sobre as 15 seções glomerulares corticais. Preparação do RNA e RT-PCR quantitativa em tempo real (TaqMan)
[000353] O tecido renal de cada camundongo foi congelado rapidamente em nitrogênio líquido e armazenado a -80°C. A partir de cada animal, a preparação de RNA renal total e a transcrição reversa foram efetuadas conforme descrito (Anders 2002). O iniciadores e as sondas eram da PE Biosystems, Weiterstadt, Alemanha. Os iniciadores usados (300 nM), usados para a detecção de rRNA de Ccl2, Ccl5 e18S, eram o reagente do ensaio TaqMan pré-desenvolvido da PE Biosystems. Citometria de fluxo
[000354] As amostras totais de sangue e medula óssea foram obtidas a partir dos camundongos de todos os grupos, no final do estudo. A citometria de fluxo foi efetuada usando uma máquina FACScalibur e o anticorpo anti-mCCR2 MC21 anteriormente caracterizado (Mack 2001). O anticorpo anti-IgG de rato biotinilado (BD Biosciences) foi usado para a detecção. Uma IgG2b de rato (BD Biosciences) foi usada como um controle de isótipo. Análise estatística
[000355] Os dados foram expressos como a média ± erro padrão da média (SEM). A comparação entre os grupos foi efetuada usando ANOVA de apenas uma variável. A correção de Posthoc Bonferroni foi usada para comparações múltiplas. Um valor de p < 0,05 foi considerado indicar significado estatístico. Ensaio de Hibridização em Sanduíche
[000356] A quantidade de "spiegelmero" nas amostras foi quantificada por um ensaio de hibridização em sanduíche, com base em um ensaio como descrito por Drolet et al. 2000 (Pharm Res 17:1503). As amostras de sangue foram coletadas em paralelo para acompanhar a depuração de NOX-E36 no plasma. Os tecidos selecionados foram preparados para determinar as concentrações de "spiegelmero". Preparação da placa de hibridização
[000357] O "spiegelmero" mNOX-E36 foi quantificado usando um ensaio de hibridização em sanduíche não-validado. Resumidamente, a sonda de captura de mNOX-E36 (Seq.ID.: 281) foi imobilizada em placas de 96 cavidades DNA-BIND brancas (Corning Costar, Wiesbaden, Alemanha), a 0,75 mM, em fosfato de sódio a 0,5 M, EDTA a 1 mM, pH 8,5, durante a noite, a 4°C. As cavidades foram lavados duas vezes e bloqueados com 0,5% p/v de BSA em fosfato de sódio a 0,25 M, EDTA a 1 mM, pH 8,5, por 3 h, a 37°C, lavados novamente e armazenados a 4°C até o uso. Antes da hibridização, as cavidades foram pré-aquecidos para 37°C e lavados duas vezes com tampão de lavagem pré-aquecido (3xSSC, 0,5% [p/v] de dodecil sarcosinato de sódio, pH 7,0; antecipadamente um estoque de 20x [NaCl a 3 M, Na3Citrato a 0,3 M] é preparado sem a lauroilsarcosina de sódio e diluído de forma correspondente). Preparação da amostra
[000358] Todas as amostras foram testadas em duplicata. As amostras plasmáticas foram descongeladas sobre gelo, redemoinhadas e giradas brevemente em uma centrífuga de tampo de mesa esfriada. Os homogeneizados de tecido foram congelados na TA e centrifugados 5 min. em uma velocidade máxima e na TA. Somente 5 μl de cada amostra foram removidos para o ensaio, e mais tarde retornados para o freezer para a armazenagem. As amostras foram diluídas com tampão de hibridização (sonda de detecção de mNOX-E36 a 8 nM [Seq.ID:282] em tampão de lavagem), na TA, de acordo com o seguinte esquema: 1:30 5 μl de amostra + 145 μl de tampão de hibridização 1:300 20 μl 1:30 + 180 μl de tampão de hibridização 1:3000 20 μl 1:300 + 180 μl de tampão de hibridização 1:30000 20 μl 1:3000 + 180 μl de tampão de hibridização
[000359] Todas as diluições da amostra foram testadas. O padrão de mNOX-E36 foi diluído em série até uma curva de calibração de ponto 8, alcançando a faixa de 0-4 nM. Nenhuma amostra de QC foi preparada e testada. O padrão de calibração era idêntico àquele das amostras em estudo. Hibridização e detecção
[000360] As amostras foram aquecidas por 10 min. a 95°C e esfriadas para 37°C. Os complexos de "spiegelmero"/sonda de detecção foram anelados às sondas de captura imobilizadas, por 30 min., a 37°C. Os "spiegelmeros" não-ligados foram removidos por lavagem duas vezes com tampão de lavagem e 1x TBST (Tris-Cl a 20 mM, NaCI a 137 mM, 0,1% Tween 20, pH 7,5), respectivamente. Os complexos hibridizados foram detectados por estreptavidina fosfatase alcalina diluídas 1:5000 em 1x TBST, por 1 h, na temperatura ambiente. Para remover o conjugado não-ligado, as cavidades foram lavados novamente com 1 x TBST e Tris-Cl a 20 mM, MgCl2 a 1 mM, pH 9,8 (duas vezes cada). As cavidades foram finalmente enchidos com 100 ml de substrato de CSDP (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemanha) e incubados por 45 min. na temperatura ambiente. A quimioluminescência foi medida sobre uma leitora de microplacas FLUOstar Optima (BMG Labtechnologies, Offenburg, Alemanha).
Análise dos dados
[000361] Foram usadas as seguintes diluições das amostras testadas para a análise quantitativa de dados: plasma de EDTA de rato 1:2000
[000362] O dado obtido a partir do grupo de veículo (não foi administrado nenhum "spiegelmero") foi subtraído como sinal de fundo.
[000363] O ensaio de hibridização em sanduíche, conforme descrito neste documento, também funciona em um modo similar para os "spiegelmeros" NOX-36, NOX-E36-5'-PEG e NOX-E36-3'-PEG, pelo que a sonda de captura de NOX-E36 respectiva (Seq.ID:255) e a sonda de detecção de NOX-E36 respectiva (Seq.ID:256) têm de ser usadas (dados não mostrados). Resultados O mNOX-E36-3'PEG melhora a sobrevivência e a doença do rim em camundongos MRLlpr/lpr
[000364] Os camundongos MRLlpr/lpr fêmeos desenvolveram e subsequentemente morreram de glomerulonefrite proliferativa de complexo imune com similaridades impressionantes à nefrite por lúpus proliferativa difusa em seres humanos. Neste projeto de estudo terapêutico, os camundongos MRLlpr/lpr tratados foram tratados com "spiegelmero" anti-mCCL2 peguilado e não-peguilado, "spiegelmero" de controle ("PoC") peguilado e não-peguilado ou veículo a partir da semana 14 até 24 de idade. Neste ponto de tempo, os camundongos MRLlpr/lpr tratados com veículo, PoC ou PoC-PEG mostraram glomerulonefrite proliferativa difusa, caracterizada por infiltração de macrófagos glomerulares e um infiltrado misto de células inflamatórias periglomerulares e intersticiais consistindo em macrófagos positivos para Mac2 glomerulares e intersticiais e linfócitos positivos para CD3 intersticiais (Figuras 34 e 35). O mNOX-E36-3'PEG melhorou o índice de atividade e cronicidade da nefrite por lúpus e também os marcadores antes mencionados da inflamação renal (Figura 35). A molécula não- peguilada mNOX-E36 foi menos efetiva sobre o índice de cronicidade e as contagens de macrófagos e células T intersticiais (Figura 35). A doença do rim crônica avançada foi adicionalmente ilustrada por atrofia tubular e áreas confluentes de fibrose intersticial nos camundongos tratados com veículo, PoC, e PoC-PEG (Figura 34). Aplicando-se a morfometria para quantificar estas alterações, verificou-se que o mNOX- E36 peguilado e não-peguilado reduziu o volume intersticial, o dano da célula tubular, e a dilatação tubular, todos sendo marcadores da gravidade e do prognóstico de doença de rim crônica (Figura 36). O mNOX-E36-3'PEG, porém não o mNOX-E36 não-peguilado, melhorou a mortalidade em 50% (Figura 37). Assim, o mNOX-E36-3'PEG pode reduzir o número de infiltrados de macrófagos e células T renais e melhorar a nefrite por lúpus e a sobrevivência (renal) dos camundongos MRLlpr/lpr. Para estudar se o tratamento com mNOX-E36 e mNOX-E36- 3'PEG afeta a inflamação intra-renal nos camundongos MRLlpr/lpr, a RT- PCR em tempo real foi efetuada para avaliar os níveis de expressão das quimiocinas pró-inflamatórias CCL2 e CCL5, as quais foram anteriormente mostradas serem progressivamente supra-reguladas nos rins dos camundongos MRLlpr/lpr durante a progressão da doença renal (Perez de Lema 2001). O tratamento com mNOX-E36 e mNOX-E36- 3'PEG a partir da semana 14 até 24 de idade reduziu a expressão renal do mRNA de CCL2 e CCL5, comparado aos controles tratados com veículo (Figura 38). Os "spiegelmeros" anti-CCL2 reduzem a lesão do tecido autoimune extra-renal nos camundongos MRLlpr/lpr
[000365] A pele e os pulmões são também comumente afetados de lesão do tecido autoimune nos camundongos MRLlpr/lpr. Nos camundongos tratados com veículo, a doença do pulmão autoimune foi caracterizada por infiltrados de células inflamatórias peribroquiolares e perivasculares moderados e as lesões da pele foram observadas em 60% dos camundongos (Figuras 39, 40 e 35). O mNOX-E36 e o mNOX- E36-3'PEG ambos reduziram a inflamação peribronquial e a doença da pele, comparados aos camundongos MRLlpr/lpr tratados com veículo, PoC, e PoC-PEG, respectivamente (Figuras 39, 40 e 35). Portanto, os efeitos dos "spiegelmeros" específicos para CCL2 não estão limitados à nefrite por lúpus, porém estendem-se até outras manifestações de lesão do tecido autoimune nos camundongos MRLlpr/lpr. mNOX-E36 e a síndrome linfoproliferativa, auto-anticorpos para dsDNA, e níveis de citocina no soro nos camundongos MRLlpr/lpr
[000366] Os camundongos MRLlpr/lpr fêmeos desenvolvem uma síndrome linfoproliferativa caracterizada por forte esplenomegalia e volumes de linfonodos cervicais, axilares, inguinais, e mesentéricos. O mNOX-E36 e o mNOX-E36-3'PEG ambos não tiveram nenhum efeito sobre o peso dos baços e dos linfonodos nos camundongos MRLlpr/lpr (Figura 41). A auto-imunidade nos camundongos MRLlpr/lpr é caracterizada pela produção de auto-anticorpos contra múltiplos antígenos nucleares, incluindo o dsDNA. Nos camundongos MRLlpr/lpr de 24 semanas de idade, os auto-anticorpos de IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b para dsDNA no soro estavam presentes em altos níveis. O mNOX-E36 e o mNOX-E36-3'PEG ambos não tiveram nenhum efeito sobre cada um destes auto-anticorpos para DNA (Figura 41). A doença similar ao lúpus nos camundongos MRLlpr/lpr tratados com veículo foi caracterizada por níveis elevados no soro de IFN-α, IL-12p40, e IL-6. O mNOX-E36 e o mNOX-E36-3'PEG ambos não tiveram nenhum efeito sobre cada um destes mediadores inflamatórios (Figura 41). Assim, ambas as variantes de mNOX-E36 não afetam a linfoproliferação, a produção de IgG anti- dsDNA, e os níveis de citocinas no soro nos camundongos MRLlpr/lpr. Níveis de mNOX-E36 e mNOX-E36-3'PEG no plasma em camundongos MRLlpr/lpr
[000367] Os níveis de mNOX-E36 e mNOX-E36-3'PEG no plasma foram determinados em intervalos semanais, para monitorar a exposição ao fármaco durante a doença do rim progressiva dos camundongos MRLlpr/lpr. Os níveis médios no plasma de mNOX-E36 3 h após a injeção e de mNOX-E36-3'PEG 24 h após a injeção eram aproximadamente 300 nM e 1 μM por todo o estudo, respectivamente (Figura 42). Assim, a peguilação aumentou os níveis de mNOX-E36 no plasma e a doença do rim progressiva nos camundongos MRLlpr/lpr não modulou a farmacocinética de ambos os "spiegelmeros". O mNOX-E36-3'PEG bloqueia a emigração de monócitos a partir da medula óssea
[000368] A emigração de monócitos a partir da medula óssea durante a infecção bacteriana foi mostrada envolver o receptor de quimiocina CCR2 (Serbina 2006), porém a função da CCL2 no contexto de auto- imunidade permanece hipotética. Portanto, examinou-se a população de monócitos positivos para CCR2 no sangue periférico e nas medulas ósseas em camundongos de grupos tratados com mNOX-E36-3'PEG e veículo de camundongos MRLlpr/lpr de 24 semanas de idade. O tratamento com mNOX-E36-3'PEG aumentou a porcentagem de células positivas para CCR2 na medula óssea de 13% para 26%, enquanto que ele reduziu esta população no sangue periférico de 26 % para 11 % (Figura 43). Estes dados suportam uma função da CCL2 para a evasão de células positivas para CCR2 a partir da medula óssea, durante a doença autoimune dos camundongos MRLlpr/lpr.
Sumário
[000369] Aplicando-se a tecnologia de "spiegelmeros", criou-se um antagonista de mCCL2 novo e específico, o qual bloqueia potentemente a mCCL2 in vitro e in vivo. Na realidade, o início tardio do tratamento com o "spiegelmero" de CCL2 melhorou marcadamente a lesão avançada do tecido autoimune similar ao lúpus nos camundongos MRLlpr/lpr. Estes dados suportam uma função central para a CCL2 no dano do tecido inflamatório crônico e identificam os "spiegelmeros" de CCL2 como uma nova substância terapêutica para a lesão do tecido autoimune.
Exemplo 9: Terapia da nefropatia diabética em camundongos diabéticos nefrectomizados unilateralmente com o "spiegelmero" anti-mMCP-1
[000370] A nefropatia diabética permanece uma causa principal de doença renal em estágio final, porque o alvejamento dos patomecanismos dependentes de angiotensina nem sempre impede a progressão da doença (Zimmet 2001; Ritz 1999; United States Renal Data System 2004; Svensson 2003). Portanto, são requeridas outras estratégias de tratamento a acrescentar ao armamento terapêutico para a nefropatia diabética.
[000371] Os dados de estudos experimentais recentes relacionam a progressão da nefropatia diabética à inflamação intra-renal (Galkina 2006; Mora 2005; Meyer 2003; Tuttle 2005). Por exemplo, o micofenolato mofetil, o metotrexato ou a irradiação reduz a excreção urinária de albumina, e a glomeruloesclerose em ratos com nefropatia diabética induzida por estreptozotocina (Yozai 2005; Utimura 2003). Mesmo assim, os mecanismos moleculares e celulares da inflamação intra-renal na nefropatia diabética permanecem insatisfatoriamente caracterizados. Os pacientes com nefropatia diabética têm níveis aumentados no soro de marcadores de fase aguda da inflamação, porém isto pode não representar a inflamação intra-renal (Dalla Vestra 2005; Navarro 2003). Os pacientes com nefropatia diabética excretam altos níveis da proteína quimiotática de monócitos 1 quimiocina CC (MCP-1/CCL2) na urina, o que pode ser mais específico para a inflamação intra-renal (Morii 2003; Tashiro 2002; Takebayashi 2006). Na realidade, a MCP-1/CCL2 é expressa pelas células mesangiais humanas, expostas a altas concentrações de glicose ou aos produtos finais de glicação avançada (Ihm 1998; Yamagishi 2002). A CCL2 está envolvida no processo complexo de múltiplas etapas de recrutamentos de leucócitos a partir dos compartimentos intravasculares para extravasculares, isto é, glomérulos e o interstício renal (Baggiolini 1998). Na realidade, os infiltrados de macrófagos são uma verificação comum em glomeruloesclerose diabética e lesão tubulointersticial humanas e experimentais (Bohle 1991; Furuta 1993; Chow 2007). Os camundongos diabéticos do tipo 1 ou do tipo 2 deficientes de Ccl2 têm contagens menores de macrófagos glomerulares, o que está associado em menos lesão glomerular (Chow 2004; Chow 2006). Nestes estudos, demonstrou-se também o papel funcional da CCL2 para a patologia glomerular de nefropatia diabética do tipo 1 e do tipo 2. Portanto, a CCL2 pode representar um alvo terapêutico potencial para a nefropatia diabética, e os antagonistas de CCL2 adequados, com perfis farmacocinéticos favoráveis, devem ser validados neste contexto da doença. Neste exemplo, nós relatamos os efeitos do "spiegelmero" anti- CCL2 PEGuilado mNOX-E36-3'PEG em camundongos db/db diabéticos do tipo 2 com nefropatia diabética avançada. Nós mostramos que um "spiegelmero" anti-CCL2 seria adequado para o tratamento de nefropatia diabética. Animais e Protocolo Experimental
[000372] Os camundongos machos de 5 semanas de idade, C57BLKS db/db ou C57BLKS do tipo selvagem, foram obtidos de Taconic (Ry, Dinamarca) e alojados em gaiolas de topo de filtro com um ciclo de escuridão/luz de 12 horas e acesso não limitado ao alimento e à água pela duração do estudo. As gaiolas, a fundação, os pequenos ninhos, o alimento, e a água foram esterilizados por autoclave antes do uso. Na idade de 6 semanas, a uninefrectomia (camundongos "1K") ou a cirurgia simulada (camundongos "2K") foi efetuada através de uma incisão de 1 cm no flanco, conforme anteriormente descrito em camundongos db/db e do tipo selvagem (Bower 1980). Nos camundongos dos grupos de cirurgia simulada, o rim foi deixado in situ. 10 semanas mais tarde, na idade de 4 meses, os camundongos db/db 1K foram divididos em dois grupos que receberam, três vezes por semana, injeções subcutâneas com mNOX-E36-3'PEG ou PoC-PEG em 5% de glicose (dose, 0,9 μmol/kg; volume de injeção, 1 ml/kg). O tratamento foi continuado por 8 semanas (até a idade de 6 meses), quando os animais foram sacrificados e os tecidos foram obtidos para a avaliação histopatológica. Todos os procedimentos experimentais tinham sido aprovados pelas autoridades de governo locais. Avaliação da nefropatia diabética
[000373] Todos os estudos imunoistológicos foram efetuados sobre seções incrustadas em parafina, conforme descrito (Anders 2002). Os seguintes anticorpos foram usados como anticorpos primários: anti- Mac2 em rato (macrófagos glomerulares, Cederlane, Ontário, Canadá, 1:50), anti-Ki-67 (proliferação de células, Dianova, Hamburg, Alemanha, 1:25). Para a avaliação histopatológica, a partir de cada camundongo, as partes dos rins foram fixadas em 10% de formalina em solução salina tamponada com fosfato e incrustadas em parafina. As seções de 3 μm foram coloridas com reagente de ácido periódico-Schiff ou prata seguindo as instruções do fornecedor (Bio-Optica, Milano, Itália). As lesões escleróticas glomerulares foram avaliadas usando um escore semiquantitativo, por um observador às cegas, como se segue: 0 = nenhuma lesão, 1 = < 25 % esclerótica, 2 = 25-49% esclerótica, 3 = 5074 % esclerótica, 4 = 75-100% esclerótica, respectivamente. 15 glomérulos foram analisados por secção. Os índices para o volume intersticial e a dilatação tubular foram determinados por sobreposição de uma grade de 100 pontos sobre 10 campos corticais de não- sobreposição, conforme descrito anteriormente (Anders 2002). As contagens de células intersticiais foram determinadas em 15 campos de alta energia (hpf, 400 x) por um observador às cegas. A preparação de RNA e a RT-PCR quantitativa (TaqMan) em tempo real foram feitas a partir de glomérulos desparafinizados. Após incubação em tampão de lise (Tris-HCl a 10 mM, EDTA a 0,1 mM, 2 % de SDS e 20 μg/ml de proteinase K), por 16 h, a 60°C, efetuou-se a extração de RNA à base de fenoL-clorofórmio. O RNA glomerular foi dissolvido em 10 μl de água sem RNAse. A transcrição reversa e a RT-PCR em tempo real a partir do RNA total do órgão e glomerular foram efetuadas conforme descrito (Anders 2002, Cohen 2002). Os controles consistindo em ddH2O eram negativos para os genes-alvo e de manutenção. O iniciador de oligonucleotídeo (300 nM) e as sondas (100 nM) para o rRNA de mCcl2, Gapdh, e 18 S eram reagentes do ensaio TaqMan pré-desenvolvidos da PE. Os iniciadores e as sondas eram da ABI Biosystems, Weiterstadt, Alemanha. A taxa de filtração glomerular (GFR) foi determinada por cinética de depuração de FITC-inulina no plasma (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha), 5, 10, 15, 20, 35, 60, e 90 minutos após uma única injeção de bolo (Qi 2004). A fluorescência foi determinada com excitação a 485 nm e leitura em emissão a 535 nm. A GFR foi calculada com base em um modelo de dois compartimentos, usando um software de adaptação à curva de regressão não-linear (GraphPad Prism, GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Todos os dados são apresentados como a média ± SEM. A comparação dos grupos foi efetuada usando ANOVA e a correção de post-hoc Bonferroni foi usada para múltiplas comparações. Um valor de p < 0,05 foi considerado indicar significado estatístico. Resultados O mNOX-E36-3'PEG reduz as contagens de macrófagos glomerulares e a glomeruloesclerose global em camundongos db/db nefrectomizados unilateralmente
[000374] Quando a ausência de CCL2 funcional estiver associada com o recrutamento diminuído de macrófagos glomerulares nos camundongos db/db (Chow 2007) e o mNOX-E36-3'PEG for capaz de bloquear o recrutamento de macrófagos mediado pela CCL2 in vitro e in vivo, o mNOX-E36-3'PEG deve prejudicar o recrutamento de macrófagos renal nos camundongos db/db com nefropatia diabética do tipo 2 avançada. Para testar esta hipótese, foram iniciadas injeções subcutâneas com mNOX-E36-3'PEG ou PoC-PEG na idade de 4 meses em camundongos db/db unilateralmente nefrectomizados ("1K"). O tratamento foi continuado por 8 semanas, quando os tecidos foram coletados para a avaliação da nefropatia diabética. Durante este período, o tratamento com mNOX-E36-3'PEG não afetou significativamente as contagens de sangue branco ou plaquetas, os níveis de glicose no sangue ou o peso do corpo, que eram ambos marcadamente elevados em todos os grupos de camundongos db/db em comparação com os camundongos BLKS não-diabéticos (dados não mostrados). De modo interessante, o mNOX-E36-3'PEG aumentou os níveis no soro de CCL2 nos camundongos 1K db/db, indicando que o antagonista de CCL2 mantém a CCL2 na circulação (Figura 44). Consistente com nossa hipótese, o mNOX-E36-3'PEG reduziu significativamente o número de macrófagos glomerulares em 40%, comparado aos camundongos db/db tratados com PoC-PEG ou veículo, associado com menores números de células que se proliferam positivas para Ki-67 dentro do glomérulo nos camundongos db/db tratados com mNOX-E36-3'PEG (Figura 45). Estas verificações estavam associadas com uma melhora significativa da glomeruloesclerose diabética global nos camundongos 1K db/db (Figura 46). Na realidade, o tratamento com mNOX-E36-3'PEG reduziu a glomeruloesclerose diabética nos camundongos 1K db/db até o grau de glomeruloesclerose presente nos camundongos db/db não- nefrectomizados ("2K"), de idade correspondente (Figura 46). Estas verificações mostram que o bloqueio retardado do recrutamento de macrófagos glomerulares dependente de CCL2 com o mNOX-E36- 3'PEG impede a glomeruloesclerose diabética global nos camundongos db/db diabéticos do tipo 2. O mNOX-E36-3'PEG melhora a GFR nos camundongos 1K db/db
[000375] Os efeitos benéficos do tratamento com mNOX-E36-3'PEG sobre a glomeruloesclerose diabética nos camundongos 1K db/db devem estar associados com uma GFR melhor. Foi analisada a cinética de depuração de FITC-inulina como um marcador da GFR em camundongos db/db (Qi 2004). Em comparação com uma GFR normal de cerca de 250 ml/min. nos camundongos db/db (Qi 2004), foi verificado uma GFR reduzida de 112 ± 23 ml/min. nos camundongos 1K db/db de 6 meses de idade, injetados com PoC-PEG (Figura 47). O tratamento com mNOX-E36-3'PEG melhorou significativamente a GFR para 231 ± 30 ml/min. nos camundongos 1K db/db (p < 0,001), sugerindo que o bloqueio do recrutamento de macrófagos glomerulares dependente da CCL2 pode também melhorar a função renal nos camundongos diabéticos do tipo 2. O mNOX-E36-3'PEG reduz as contagens de macrófagos intersticiais e a lesão tubulointersticial em camundongos 1K db/db
[000376] A nefropatia diabética avançada em seres humanos está associada com números significativos de macrófagos intersticiais e lesão tubulointersticial (Bohle 1991). Nos camundongos 2K db/db, os infiltrados de macrófagos intersticiais e a lesão tubulointersticial significativa não ocorrem antes de 8 meses de idade (Chow 2007). A uninefrectomia antecipada acelera o desenvolvimento de patologia tubulointersticial nos camundongos db/db (Ninichuk 2005), assim nós quantificamos os macrófagos intersticiais, a dilatação tubular e o volume intersticial como marcadores do dano tubulointersticial em camundongos de todos os grupos, em 6 meses de idade. Neste ponto de tempo, os camundongos 1K db/db revelaram números aumentados de macrófagos intersticiais e elevações significativas de dilatação tubular e volume intersticial, comparados aos camundongos 2K db/db (Figura 45, Figura 48). O tratamento com mNOX-E36-3'PEG reduziu os números de macrófagos intersticiais em 53 % e também a dilatação tubular e o volume intersticial nos camundongos 1K db/db (Figura 45, Figura 48). Assim, o bloqueio do recrutamento de macrófagos renais dependente da CCL2 também impede a lesão tubulointersticial nos camundongos db/db diabéticos do tipo 2. O mNOX-E36-3'PEG reduz a expressão renal de Ccl2 nos camundongos 1K db/db
[000377] Os infiltrados de macrófagos aumentam as respostas inflamatórias na lesão do tecido, por exemplo, a expressão local da CCL2. Foi, portanto, formulada uma hipótese que a diminuição relacionada ao mNOX-E36-3'PEG nos macrófagos renais estaria associada com menos expressão da CCL2 renal. Foi usada a RT-PCR em tempo real para quantificar a expressão do mRNA da CCL2 nos camundongos db/db. O mNOX-E36-3'PEG reduziu os níveis de mRNA da CCL2 nos rins dos camundongos 1K db/db de 6 meses de idade, comparados aos camundongos tratados com PoC-PEG de idade correspondente (Figura 49). Para avaliar adicionalmente a expressão espacial da CCL2, foi efetuada a imunocoloração para a proteína CCL2 sobre as seções renais. Nos camundongos 1K db/db, a expressão da CCL2 foi marcadamente aumentada nos glomérulos, túbulos, e células intersticiais, comparados aos camundongos 2K db/db ou 2K do tipo selvagem (Figura 50). O mNOX-E36-3'PEG reduziu marcadamente a coloração para a CCL2 em todos estes compartimentos, em comparação com os camundongos 1K db/db tratados com veículo ou PoC-PEG. Estes dados indicam que o bloqueio do recrutamento de macrófagos renais dependente da CCL2 com o mNOX-E36-3'PEG reduz a expressão local da CCL2 nos camundongos 1K db/db.
Sumário
[000378] O conceito que a inflamação contribui para a progressão da nefropatia diabética humana torna-se cada vez mais aceito (Tuttle 2005), levando a MCP-1/CCL2 como um alvo potencial para tratar esta doença no foco. Neste exemplo, foi mostrado que o tratamento de camundongos diabéticos nefrectomizados unilateralmente com o mNOX-E36-3'PEG reduziu os números de macrófagos glomerulares (e intersticiais) em 6 meses de idade, associados com menos células glomerulares que se proliferam. Além disso, a expressão renal/glomerular do mRNA da CCL2 foi marcadamente reduzida com o tratamento por mNOX-E36-3'PEG. Ademais, os números mais baixos de macrófagos glomerulares e células glomerulares que se proliferam no grupo de terapia estavam associados com a proteção da glomeruloesclerose global e com uma melhora significativa da taxa de filtração glomerular. Os efeitos benéficos do mNOX-E36-3'PEG sobre a patologia glomerular e a função renal nos camundongos diabéticos estão consistentes com aqueles estudos que usaram outros antagonistas de CCL2 em outros modelos de lesão glomerular (Lloyd 1997, Hasegawa 2003, Tang 1996, Wenzel 1997, Fujinaka 1997, Schneider 1999). Notadamente, o início retardado do bloqueio da CCL2 também reduziu os números de macrófagos intersticiais estando associados com menos patologia tubulointersticial nos camundongos 1K db/db.
[000379] Juntos, estes dados validam a CCL2 como um alvo terapêutico promissor para a nefropatia diabética e sugerem que iniciar o bloqueio da CCL2 com um "spiegelmero" - mesmo em um estágio avançado da doença - pode ainda ser protetor.
Referências
[000380] O dado bibliográfico completo dos documentos descritos aqui, cuja descrição é incorporada por referência, se não indicado ao contrário, é como se segue. Akahoshi T, Wada C, Endo H, Hirota K, Hosaka S, Takagishi K, Kondo H, Kashiwazaki S, Matsushima K (1993). Expression of monocyte chemotactic and activating factor in rheumatoid arthritis. Regulation of its production in synovial cells by interleukin-1 and tumor necrosis factor. Arthritis Rheum. 36:762 Alam R, York J, Moyars M, Stafford S, Grant JA, Lee J, Forsythe P, Sim T, Ida N (1996). Increased MCP-1, RANTES, and MIP- 1α in bronchoalveolar lavage fluid of allergic asthmatic patients. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153:1398 Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990), Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215(3):403-10. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. 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[000381] As características da presente invenção, descritas no relatório descritivo, nas reivindicações e/ou nos desenhos, podem tanto separadamente quanto em qualquer combinação delas ser importantes para a realização da invenção nas suas diversas formas.

Claims (23)

1. Ácido nucléico capaz de se ligar a MCP-1 humana, caracterizado pelo fato de que compreende, na direção 5'^3', uma primeira Caixa de extensão B1A, uma segunda Caixa de extensão B2, uma terceira Caixa de extensão B1B, em que a primeira Caixa de extensão B1A consiste em uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que compreende ACGCA, CGCA e GCA, a segunda Caixa de extensão B2 consiste em uma sequência de nucleotídeos de CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGYGGCUC, e a terceira Caixa de extensão B1B consiste em uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que compreende UGCGU, UGCG e UGC.
2. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a segunda Caixa de extensão B2 consiste em uma sequência de nucleotídeos de CGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUC.
3. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a) a primeira Caixa de extensão B1A consiste em uma sequência de nucleotídeos de ACGCA, e a terceira Caixa de extensão B1B consiste em uma sequência de nucleotídeos de UGCGU; ou b) a primeira Caixa de extensão B1A consiste em uma sequência de nucleotídeos de CGCA, e a terceira Caixa de extensão B1B consiste em uma sequência de nucleotídeos de UGCG; ou c) a primeira Caixa de extensão B1A consiste em uma sequência de nucleotídeos de GCA, e a terceira Caixa de extensão B1B consiste em uma sequência de nucleotídeos de UGC ou UGCG.
4. Ácido nucléico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a primeira Caixa de extensão B1A c consiste em uma sequência de nucleotídeos de GCA.
5. Ácido nucléico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e preferivelmente a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a terceira Caixa de extensão B1B consiste em uma sequência de nucleotídeos de UGCG.
6. Ácido nucléico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o ácido nucléico consiste em uma sequência de ácidos nucléicos de acordo com SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117 e SEQ ID NO: 278.
7. Ácido nucléico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o ácido nucléico compreende uma modificação selecionada a partir do grupo consistindo em uma porção HES e uma porção PEG, em que a modificação preferivelmente permite modificar as características do ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em termos de tempo de residência no corpo animal ou humano, preferivelmente no corpo humano.
8. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a modificação é uma porção PEG consistindo em um PEG reto ou ramificado, em que o peso molecular da porção PEG é preferivelmente de 20 a 120 kD, mais preferivelmente de 30 a 80 kD e mais preferivelmente ainda 40 kD.
9. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a modificação é uma porção HES, em que preferivelmente o peso molecular da porção HES é de 10 a 130 kD, mais preferivelmente de 30 a 130 kD e mais preferivelmente ainda 100 kD.
10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e opcionalmente um constituinte adicional, em que o constituinte adicional é selecionado a partir do grupo que compreende excipientes farmaceuticamente aceitáveis, veículos farmaceuticamente aceitáveis e agentes farmaceuticamente ativos.
11. Uso de um ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença; em que a doença é selecionada a partir do grupo consistindo em nefropatia diabética e lúpus.
12. Uso de um ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um meio diagnóstico.
13. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que lúpus é lúpus eritematoso sistêmico.
14. Complexo compreendendo uma quimiocina e um ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende eotaxina, MCP-1, MCP-2 e MCP-3, em que, de preferência, o complexo é um complexo cristalino.
15. Uso de um ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para a detecção in vitro de uma quimiocina, em que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende eotaxina, MCP-1, MCP-2 e MCP-3.
16. Método para a triagem de um antagonista de quimiocina ou um agonista de quimiocina, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: - fornecer um candidato à antagonista de quimiocina e/ou um candidato à agonista de quimiocina, - fornecer um ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, - fornecer um sistema de teste que proporcione um sinal na presença de um antagonista de quimiocina e/ou um agonista de quimiocina, e - determinar se o candidato à antagonista de quimiocina é um antagonista de quimiocina e/ou se o candidato à agonista de quimiocina é um agonista de quimiocina, em que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende eotaxina, MCP-1, MCP-2 e MCP-3.
17. Método para a triagem de um agonista de quimiocina e/ou um antagonista de quimiocina, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: - fornecer uma quimiocina imobilizada a uma fase, preferivelmente uma fase sólida, - fornecer um ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, preferivelmente um ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, o qual está marcado, - adicionar um candidato à agonista de quimiocina e/ou um candidato à antagonista de quimiocina, e - determinar se o candidato à agonista de quimiocina é um agonista de quimiocina e/ou se o candidato à antagonista de quimiocina é um antagonista de quimiocina, em que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende eotaxina, MCP-1, MCP-2 e MCP-3.
18. Kit para a detecção de uma quimiocina, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende eotaxina, MCP-1, MCP- 2 e MCP-3.
19. Método para a detecção do ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) fornecer uma amostra contendo o ácido nucléico de acordo com a presente invenção; b) fornecer uma sonda de captura, em que a sonda de captura é pelo menos parcialmente complementar a uma primeira parte do ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e uma sonda de detecção, em que a sonda de detecção é pelo menos parcialmente complementar a uma segunda parte do ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou, alternativamente, a sonda de captura é pelo menos parcialmente complementar a uma segunda parte do ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e a sonda de detecção é pelo menos parcialmente complementar à primeira parte do ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9; c) permitir que a sonda de captura e a sonda de detecção reajam simultaneamente ou em qualquer ordem sequencialmente com o ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou parte dele; d) opcionalmente detectar se a sonda de captura é hibridizada ou não com o ácido nucléico de acordo com o ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, fornecido na etapa a); e e) detectar o complexo formado na etapa c) consistindo no ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e na sonda de captura e na sonda de detecção.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a sonda de detecção compreende um meio de detecção, e/ou em que a sonda de captura pode ser imobilizada a um suporte, preferivelmente um suporte sólido.
21. Método de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que qualquer sonda de detecção que não seja parte do complexo é removida da reação, de modo que na etapa e) somente uma sonda de detecção que seja parte do complexo é detectada.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que a etapa e) compreende a etapa de comparar o sinal gerado pelo meio de detecção quando a sonda de captura e a sonda de detecção forem hibridizadas na presença do ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou parte dele, e na ausência do dito ácido nucléico ou parte dele.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizado pelo fato de que o ácido nucléico a ser detectado é o ácido nucléico tendo uma sequência de ácidos nucléicos de acordo com as SEQ ID NOs: 37, 116, 117 ou 278, e a sonda de captura ou a sonda de detecção compreende uma sequência de ácidos nucléicos de acordo com a SEQ ID NO: 255 ou a SEQ ID NO: 256.
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