BRPI0707848A2

BRPI0707848A2 - mÉtodos para selecionar pelo menos uma molÉcula, para produzir uma composiÇço, para incrementar degradaÇço de proteÍna extracelular e / ou eliminaÇço de proteÍna em um indivÍduo, para inibir, pelo menos em parte, efeitos mediados por proteÍna mal-dobrada e e/ou estrutura b cruzada, para prevenÇço pelo menos parcial e/ou tratamento de uma doenÇa, de um distérbio e/ou de uma infecÇço, para remover, pelo parcialmente, proteÍnas mal-dobradas, estruturas b cruzadas e/ou proteÍnas, para determinar se uma proteÍna mal-dobrada, e/ou uma proteÍna e/ou peptÍdeo compreendendo uma estrutura b cruzada estÁ presente em uma soluÇço aquosa, para reduzir e/ou prevenir efeitos secundÁrios indesejados de uma composiÇço farmacÊutica e/ou incrementar a atividade especÍfica por grama de proteÍna, para interferir na coagulaÇço do sangue, para determinar a quantidade de proteÍnas mal-dobradas e/ou estruturas b cruzadas em uma composiÇço, para determinar uma diferenÇa no teor de estrutura b cruzada, para determinar a identidade de uma proteÍna mal-dobrada, de uma estrutura b cruzada ou de uma proteÍna, e para tratar um sujeito que sofre de, ou em risco de sofrer de, uma doenÇa, um distérbio e/ou uma infecÇço, coleÇço de molÉculas de igiv, composiÇço, uso de uma coleÇço de molÉculas igiv e/ou de uma composiÇço, kit diagnàstico, dispositivo de separaÇço, composto, e, uso de um composto

Info

Publication number: BRPI0707848A2
Application number: BRPI0707848-0A
Authority: BR
Inventors: Martijn Frans Ben Gerard Gerbink; Barend Bouma
Original assignee: Crossebeta Biosciences B V
Priority date: 2002-02-16
Filing date: 2007-02-16
Publication date: 2011-05-10
Also published as: JP2009529657A; CA2642828A1; WO2007094668A1; US20090155254A1; CN101421304A; EP1820806A1; AU2007215621A1; EP1996620A1; ZA200807630B

Abstract

METODOS PARA SELECIONAR PELO MENOS UMA MOLÉCULA, PARA PRODUZIR UMA COMPOSIÇçO, PARA INCREMENTAR DEGRADAÇçO DE PROTEINA EXTRACELULAR E/OU ELIMINAÇçO DE PROTEINA EM UM INDIVIDUO, PARA INIBIR, PELO MENOS EM PARTE, EFEITOS MEDIADOS POR PROTEINA MAL-DOBRADA E/OU ESTRUTURA B CRUZADA, PARA PREVENÇçO PELO MENOS PARCIAL E/OU TRATAMENTO DE UMA DOENÇA, DE UM DISTURBIO E/OU DE UMA INFECÇçO, PARA REMOVER, PELO MENOS PARCIALMENTE, PROTEINAS MAL-DOBRADAS, ESTRUTURAS B CRUZADAS E/OU PROTEINAS, PARA DETERMINAR SE UMA PROTEINA MAL-DOBRADA, E/OU UMA PROTEINA E/OU PEPTÍDEO COMPREENDENDO UMA ESTRUTURA B CRUZADA ESTÁ PRESENTE EM UMA SOLUÇçO AQUOSA, PARA REDUZIR E/OU PREVENIR EFEITOS SECUNDARIOS INDESEJADOS DE UMA COMPOSIÇçO FARMACÊUTICA E/OU INCREMENTAR A ATIVIDADE ESPECÍFICA POR GRAMA DE PROTEINA, PARA INTERFERIR NA COAGULAÇçO DO SANGUE, PARA DETERMINAR A QUANTIDADE DE PROTEINAS MAL-DOBRADAS E/OU ESTRUTURAS B CRUZADAS EM UMA COMPOSIÇçO, PARA DETERMINAR UMA DIFERENÇA NO TEOR DE ESTRUTURA B CRUZADA, PARA DETERMINAR A IDENTIDADE DE UMA PROTEINA MAL-DOBRADA, DE UMA ESTRUTURA B CRUZADA OU DE UMA PROTEÍNA, E PARA TRATAR UM SUJEITO QUE SOFRE DE, OU EM RISCO DE SOFRER DE, UMA DOENÇA, UM DISTURBIO E/OU UMA INFECÇçO, COLEÇçO DE MOLÉCULAS DE IGIV, COMPOSIÇçO, USO DE UMA COLEÇçO DE MOLÉCULAS DE IGIV E/OU DE UMA COMPOSIÇçO, KIT DIAGNàSTICO, DISPOSITIVO DE SEPARAÇçO, COMPOSTO, E, USO DE UM COMPOSTO A presente invenção proporciona um Método para selecionar pelo menos uma molécula de IgJV, de uma coleção de moléculas de IgJV compreendendo uma região de afinidade que é capaz de interagir com uma proteína dobrada incorretamente e/ou com um epítopo de uma estrutura 13 cruzada e/ou com um epítopo de uma proteína compreendendo uma estrutura 13 cruzada, em que referido método compreende contactar uma coleção de moléculas de IgIV com uma proteína dobrada incorretamente e/ou com uma estrutura 13 cruzada e/ou com uma proteína compreendendo uma estrutura 13 cruzada, e coletar pelo menos uma molécula de IgJV compreendendo uma região de afinidade interagindo com referido epítopo e/ou proteína dobrada incorretamente.

Description

"MÉTODOS PARA SELECIONAR PELO MENOS UMA MOLÉCULA,PARA PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃO, PARA INCREMENTARDEGRADAÇÃO DE PROTEÍNA EXTRACELULAR E/OU ELIMINAÇÃODE PROTEÍNA EM UM INDIVÍDUO, PARA INIBIR, PELO MENOS EMPARTE, EFEITOS MEDIADOS POR PROTEÍNA MAL-DOBRADA E/OUESTRUTURA B CRUZADA, PARA PREVENÇÃO PELO MENOSPARCIAL E/OU TRATAMENTO DE UMA DOENÇA, DE UMDISTÚRBIO E/OU DE UMA INFECÇÃO, PARA REMOVER, PELOMENOS PARCIALMENTE, PROTEÍNAS MAL-DOBRADAS,ESTRUTURAS B CRUZADAS E/OU PROTEÍNAS, PARA DETERMINARSE UMA PROTEÍNA MAL-DOBRADA, E/OU UMA PROTEÍNA E/OUPEPTÍDEO COMPREENDENDO UMA ESTRUTURA B CRUZADAESTÁ PRESENTE EM UMA SOLUÇÃO AQUOSA, PARA REDUZIRE/OU PREVENIR EFEITOS SECUNDÁRIOS INDESEJADOS DE UMACOMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E/OU INCREMENTAR AATIVIDADE ESPECÍFICA POR GRAMA DE PROTEÍNA, PARAINTERFERIR NA COAGULAÇÃO DO SANGUE, PARA DETERMINARA QUANTIDADE DE PROTEÍNAS MAL-DOBRADAS E/OUESTRUTURAS B CRUZADAS EM UMA COMPOSIÇÃO, PARADETERMINAR UMA DIFERENÇA NO TEOR DE ESTRUTURA BCRUZADA, PARA DETERMINAR A IDENTIDADE DE UMAPROTEÍNA MAL-DOBRADA, DE UMA ESTRUTURA B CRUZADA OUDE UMA PROTEÍNA, E PARA TRATAR UM SUJEITO QUE SOFRE DE,OU EM RISCO DE SOFRER DE, UMA DOENÇA, UM DISTÚRBIO E/OUUMA INFECÇÃO, COLEÇÃO DE MOLÉCULAS DE IGIV,COMPOSIÇÃO, USO DE UMA COLEÇÃO DE MOLÉCULAS DE IGIVE/OU DE UMA COMPOSIÇÃO, KIT DIAGNÓSTICO, DISPOSITIVO DESEPARAÇÃO, COMPOSTO, E, USO DE UM COMPOSTO"

A invenção refere-se aos campos da bioquímica, biologiamolecular, biologia estrutural e medicina.

Imunoglobulina intravenosa (IgIV) consiste deimunoglobulinas de animais ou de humanos aparentemente saudáveis cujasimunoglobulinas são coletadas do soro ou do sangue. IgIV são prescritas aanimais e humanos que apresentam uma falta de anticorpos. A causa de faltade anticorpos pode ser uma doença que afeta o sistema imunológico, comopor exemplo AIDS, ou um erro inato que causa hipogamaglobulinemia ou a-gamaglobulinemia completa ou parcial, como, por exemplo, uma síndrome deimunodeficiência primária ou síndrome de imunodeficiência combinada grave(SCIDS, severe combined immunodeficiency syndromé). Imunoglobulinascoletadas de soro ou de sangue humano são comercialmente obteníveis sobmuitos nomes diferentes, como por exemplo, "imunoglobulinas humanasintravenosas" (IgIV [intravenous human immunoglobulines], ou IVIg). ComoIgIV foram introduzidas primeiramente em 1981 para a terapia de substituiçãode imunoglobulina de humanos imunodeficientes como descrito acima, elestambém foram aplicados off label/em forma ainda não aprovada pelo FDA* apacientes que sofrem de uma ampla variedade de doenças e em um grandenúmero de casos, tratamento experimental com IgIV mostrou ser bemsucedido.

Como o mecanismo de ação ainda não foi elucidado até aqui,muitos dos tratamentos realizados ainda sem aprovação do FDA com IgIVforam experimentos de tentativa e erro, e o resultado foi um tantoimpredizível.

O tratamento com IgIV não é isento de riscos. Desde 1981, aAdministração Federal de Drogas e Alimentos, FDA, Food and DrugAdministration) recebeu mais de 114 relatos de eventos adversos vindos domundo todo (aproximadamente 83 dos E.U.A.) de disfunção renal e/ou falharenal aguda associada com a administração destes produtos. Embora a falharenal aguda tenha sido controlada de maneira bem sucedida na maior partedos casos, reportou-se mortes em 17 pacientes por todo o mundo. Muitos dospacientes que morreram apresentavam graves condições subjacentes, comreferência a efeitos colaterais reportados adicionais relacionados com aadministração de IgIV em pacientes, ver Tabela 1.

Em conclusão, o tratamento de humanos com IgIV não éclaramente limitado a uma condição de doença específica, falta ainda umclaro entendimento do modo de ação, e o resultado de um tratamento comIgIV para uma nova entidade de doença é impredizível. A administração degrandes quantidades de IgIV envolve o risco de efeitos colaterais adversos.Assim, há uma necessidasde de melhoramento do tratamento com IgIVcorrente.

Constitui um objeto da presente invenção proporcionar meiose métodos para melhorar terapia com IgIV. Constitui um objeto adicionalproporcionar uma seleção e/ou purificação de um grupo de imunoglobulinasde um combinado de IgIV, e um modo alternativo de preparação deimunoglobulinas ou um equivalente funcional das mesmas para se obter umaimunoglobulina ou equivalente da mesma, vantajosa para tratamento de umadoença ou um grupo de doenças, com pelo menos uma propriedade melhoradaem comparação com IgIV, como por exemplo, um risco reduzido de efeitoscolaterais adversos e/ou uma ação terapêutica melhorada. Até aqui, umapessoa versada na arte não teria condições de saber como iniciar e que seleçãorealizar.

A presente invenção proporciona a compreensão de que umaseleção de IgIV que é enriquecida com moléculas de IgIV capazes de interagircom um epítopo de uma proteína dobrada incorretamente , um epítopo de umaestrutura beta cruzada e/ou com um epítopo de uma proteína compreendendouma estrutura β cruzada apresenta propriedades melhoradas em comparaçãocom IgIV correntemente usada. Referida seleção é preferida relativamente àIgIV correntemente usada, entre outras coisas, porque efeitos colateraisadversos são prevenidos, ao menos em parte, e/ou a ação terapêutica émelhorada.

Uma proteína dobrada incorretamente é definida aqui comouma proteína com uma estrutura diferente de uma estrutura não β cruzada,nativa, não-amilóide. Assim, uma proteína dobrada incorretamente é umaproteína apresentando uma estrutura tridimensional não-nativa, e/ou umaestrutura β cruzada, e/ou uma estrutura amilóide. O mal dobramento daproteína tem importância etiológica em um grande número de doenças,freqüentemente relacionadas com o envelhecimento (como doençasamilóides). Doenças de mal dobramento também são referidas como doençasconformacionais. Presentemente, descreveu-se como tais mais de 30 doençasde mal dobramento, incluindo, embora sem limitação, amiloidoses localizadase sistêmicas, como doença de Alzheimer e amiloidose relacionada comdiálise, mal de Parkinson, e doença de Huntington. Nós descrevemospreviamente que, adicionalmente a estas conhecidas doenças de maldobramento, muitas outras, dentre as quais uma variedade com etiologia aindaparcialmente ou grandemente desconhecida, incluindo doenças (auto-)imunese aterosclerose, estão associadas com mal dobramento de proteína (patenteWO 2004 004698 (EP1536778) e patentes relacionadas). Para muitas destasdoenças nenhum tratamento de cura encontra-se disponível. Nós tambémrevelamos que outros processos, dos quais vários podem ser relacionados comdoença, como a eliminação-do-corpo de proteínas obsoletas ao término de suameia-vida, coagulação do sangue, agregação de plaquetas e fibrinólise, estãoassociados com mal dobramento de proteínas.

Além do papel de proteínas dobradas incorretamente no inícioda doença e/ou progressão da doença, o mal dobramento de proteínas tambémé subjacente a complicações, como geração adversa de auto-anticorpos,respostas anafiláticas e outras reações inflamatórias de alérgicas, associadascom o uso de farmacêuticos de proteínas. Por esta razão, a mal dobramento deproteína suscita grande preocupação durante a produção, armazenamento euso de drogas à base de proteínas.

Finalmente, proteínas dobradas incorretamente contribuempara a indução de imunidade, e proteínas dobradas incorretamente podem serusadas para disparar e/ou potencializar uma resposta imune, por exemplo,para o uso em vacinas.

Proteínas dobradas incorretamente tendem a multimeriza epodem iniciar fibrilização. Isto pode resultar na formação de agregadosamorfos que podem variar muito de tamanho. Em determinados casos,proteínas dobradas incorretamente têm natureza mais regular e fibrilar. Otermo amilóide foi introduzido inicialmente para definir os fibrilos, que sãoformados de proteínas dobrada incorretamente s, e que são encontrados emórgãos e tecidos de pacientes com as diversas doenças de mal dobramentoconhecidas, denominadas coletivamente amiloidoses. Comumente, amilóideocorre como fibrilos de comprimento indefinido e com um diâmetro médio de10 nm, é depositado extracelularmente, mancha-se com corantes vermelhoCongo e Tioflavina T (ThT), apresenta bi-refringência verde característica sobluz polarizada quando vermelho Congo é ligado, compreende estruturasecundária β-sheet/*, e contém a conformação crossbeta/* característica (verabaixo) como determinado por meio de análise de difração de raios-X porfibras. No entanto, como se determinou que o mal dobramento de proteína éum fenômeno mais geral e, porque muitas características de proteínasdobradas incorretamente são compartilhadas com amilóide, o termo amilóidetem sido usado em um escopo mais amplo. Agora, o termo amilóide tambémé usado para definir fibrilos intracelulares e fibrilos formados in vitro. Ostermos similar a amilóide e amilog são usados para indicar proteínas dobradasincorretamente com propriedades compartilhadas com amilóides, mas que nãopreenchem todos os critérios para amilóide, como listado acima.

Em conclusão, proteínas dobradas incorretamente têm naturezaaltamente heterogênea, compreendendo desde proteínas dobradasincorretamente monoméricas, até espécies oligoméricas pequenas, referidasalgumas vezes como protofibrilos, agregados maiores com aspecto amorfo,até fibrilos grandes altamente ordenados, em que todos os seus aspectospodem compartilhar características estruturais reminiscentes de amilóide.Como usado aqui, o termo "misfoldome" compreende qualquer coleção deproteínas dobrada incorretamente s.

Proteínas dobradas incorretamente e amilóides que nãopreenchem todos os critérios para identificação como amilóides podemcompartilhar características estruturais e funcionais com amilóide e/ou comoutras proteínas dobrada incorretamente s. Estas características comuns sãocompartilhadas com várias proteínas dobrada incorretamente s,independentemente de suas seqüências variáveis de aminoácidos.Características estruturais compartilhadas incluem, por exemplo, a ligaçãocom determinados corantes, como vermelho Congo, ThT, Tioflavina S,acompanhadas de fluorescência incrementadas dos corantes, multimerização,e a ligação a determinadas proteínas, como ativador de plasminogênio de tipotissular (tPA [Tissue-type Plasminogen Activator], o receptor para produtosfinais de glicosamento avançado (RAGE, receptor for advanced glycationend-products) e guias, como proteína de choque de calor, como BiP (grp78 ouproteína de ligação de cadeia longa de imunoglobulina). Atividadesfuncionais compartilhadas incluem a ativação de tPA e a indução de respostascelulares, como respostas inflamatórias, e indução de toxicidade celular.

Uma característica única de um subconjunto de proteínasdobrada incorretamente s, como por exemplo, amilóide é a presença daconformação β cruzada ou uma forma precursora da conformação β cruzada.

Uma estrutura β cruzada é um elemento estrutural secundárioem peptídeos e proteínas. Uma estrutura β cruzada (também referida comouma estrutura "cross-$", uma "β cruzada" ou uma "estrutura β cruzada" ) édefinida como uma parte de uma proteína ou peptídeo, ou umaparticularmente de um conjunto de peptídeos e/ou proteínas, que compreendefilamentos β simples (estágio 1) e/ou um grupo (ordemadp) de filamentos β(estágio 2), e/ou, tipicamente, um grupo de filamentos β dispostos em umalâmina-β (estágio 3), e/ou, em particular, um grupo de lâminas-β empilhadas(estágio 4), também referida como um "amilóide". Uma estrutura β cruzadaforma-se após a formação de uma forma de precursor de estrutura β cruzadaquando do dobramento incorreto de proteína, como por exemplo,desnaturação, proteólise ou desdobramento de proteínas. Um precursor deestrutura β cruzada é definido como qualquer conformação de proteína queprecede a formação de qualquer um dos estágios estruturais previamenteindicados de uma estrutura β cruzada. Estes elementos estruturais presentesna estrutura β cruzada (precursor) estão tipicamente ausentes em regiõesglobulares de (partes nativas de) proteínas. A presença de estrutura β cruzadaé demonstrada, por exemplo, com difração de raios-X por fibras ou ligação deTioflavina T ou ligação de vermelho Congo, acompanhada de fluorescênciaincrementada dos corantes.

Uma forma típica de um precursor de estrutura β cruzada éuma proteína parcialmente ou completamente dobrada incorretamente . Umaforma típica de uma proteína dobrada incorretamente é uma proteínaparcialmente ou completamente não-dobrada, uma proteína parcialmenteredobrada, uma proteína parcialmente ou completamente agregada, umaproteína oligomerizada ou multimerizada, ou uma proteína parcialmente oucompletamente desnaturada. Uma estrutura β cruzada ou um precursor deestrutura β cruzada pode ocorrer como moléculas monoméricas, conjuntosdiméricos, triméricos até oligoméricos de moléculas, e pode ocorrer comoestruturas multiméricas e/ou conjuntos de moléculas.

(Precursor de) estrutura β cruzada em qualquer um dos estadospreviamente indicados em forma solúvel em soluções aquosas e/ou solventesorgânicos e/ou quaisquer outras soluções. (Precursores de) estrutura β cruzadatambém podem estar presentes como material em esatdo sólido em soluções,como por exemplo, agregados insolúveis, fibrilos, partículas, como porexemplo, uma suspensão, ou separados em uma fase sólida de estrutura βcruzada e uma fase de solvente.

Mal dobramento de proteína, formação de precursor deestrutura β cruzada, formação de agregados ou multímeros e/ou estrutura βcruzada pode ocorrer em qualquer composição compreendendo peptídeos,com pelo menos 2 aminoácidos, e/ou proteína(s). O termo "peptídeo" destina-se a incluir oligopeptídeos e também polipeptídeos, e o termo "proteína"inclui moléculas proteináceas incluindo peptídeos, com e sem modificaçõespós-tradução, como glicosilação e glicação. Ele também inclui lipoproteínas ecomplexos compreendendo uma parte proteinácea, como complexos deproteína-ácido nucleico (RNA e/ou DNA), complexos membrana-proteína,etc. Como usado aqui, o termo "proteína" também compreende moléculasproteináceas, peptídeos, oligopeptídeos e polipeptídeos. Conseqüentemente, ouso de "proteína" ou "proteína e/ou peptídeo" neste pedido têm o mesmosignificado.

Uma forma típica de lãminas-β empilhadas é uma estruturasimilar a fibrilos em que as lâminas-β são empilhadas no sentido do eixo dafibrila ou perpendicular ao sentido do eixo do fibrila. O sentido doempilhamento das lâminas-β em estruturas β cruzadas é perpendicular aosentido da fibra longa. Uma conformação de estrutura β cruzada é um sinalque dispara uma cascata de eventos que induz eliminação e degradação dopeptídeo ou proteína obsoleta. Quando a eliminação é inadequada, proteínase/ou peptídeos indesejados agregam-se e formam estruturas tóxicascompreendendo desde oligomeros solúveis até fibrilos precipitantes e placasamorfas. Referida conformação de estrutura β cruzada compreendendoagregados é subjacente a várias doenças, como para exemplo, doença de* Huntington's, doença de tipo amiloidose, aterosclerose, diabetes,sangramento, trombose, câncer, sépsis e outras doenças inflamatórias, artritereumatóide, encefalopatias espongiformes transmissíveis, como doença deCreutzfeldt-Jakob, esclerose múltipla, doenças auto-imunes, doençasassociadas com perda de memória, como doença de Alzheimer, mal deParkinson e outras doenças neuroniais (epilepsia), encefalopatia e amiloidosessistêmicas.

Uma estrutura β cruzada é formada, por exemplo, durante odesdobramento e redobramento de proteínas e peptídeos. O desdobramento depeptídeos e proteínas ocorrer regularmente em um organismo. Por exemplo,peptídeos e proteínas freqüentemente desdobram-se e redobram-seespontaneamente ao final de seu ciclo de vida. Além disso, o desdobramentoe/ou redobramento é induzido por fatores ambientais, como por exemplo, pH,glicação, estressse oxidativo, calor, irradiação, esforço mecânico, proteóliseetc. Como usado aqui, o termo "estrutura β cruzada" também compreendequalquer precursor de estrutura β cruzada e qualquer proteína dobradaincorretamente , muito embora uma proteína dobrada incorretamente nãocompreenda necessariamente uma estrutura β cruzada. O termo "molécula deligação β cruzada" ou "molécula capaz de ligar-se especificamente umaestrutura β cruzada" também compreende uma molécula capaz de ligar-seespecificamente a qualquer proteína dobrada incorretamente .

Os termos desdobramento, redobramento e dobramentoincorreto referem-se à estrutura tridimensional de uma proteína ou peptídeo.Desdobramento significa que uma proteína ou peptídeo perde pelo menosparte de sua estrutura tridimensional. O termo redobramento refere-se ao re-embobinamento no mesmo tipo de estrutura tridimensional. Por meio deredobramento, uma proteína ou peptídeo pode recuperar sua configuraçãonativa, ou pode ocorrer um redobramento incorreto. O termo "redobramentoincorreto" refere-se a uma situação quando se forma uma estruturatridimensional diferente de uma configuração nativa. Redobramento incorretotambém é denominado dobramento incorreto. Desdobramento e redobramentode proteínas e peptídeos envolve o risco de formação de estrutura β cruzada.A formação de estruturas β cruzadas ocorre algumas vezes diretamente após asíntese de proteína, sem um intermediário de proteína dobrado de formaincorreta.

Via β cruzada: resposta a proteínas dobrada incorretamente s

Nós revelamos previamente um mecanismo biológico quepercebe a ocorrência de proteínas dobrada incorretamente s, resultando emdegradação e eliminação das proteínas dobrada incorretamente s, denominadoa Via β cruzada (patente WO 2004 004698). Nós identificamosexperimentalmente uma quantidade de proteínas, incluindo tPA e o fator XIIde proteínas estreitamente relacionado, ativador de fator de crescimento dehepatócitos (HGFA, hepatocyte growth factor activator) e fibronectina, quereconhecem proteínas dobrada incorretamente s, com característicasestruturais comuns a proteínas compreendendo estrutura β cruzada ou formade um precursor de estrutura β cruzada. Nós também revelamos que, combase na análise da literatura, diversas proteínas adicionais, incluindoreceptores de superfície celular, estão implicados na resposta do corpo aproteínas dobrada incorretamente s, incluindo eliminação de proteínasdobrada incorretamente s, e, portanto, são parte da via β cruzada. Nósrevelamos que várias destas proteínas, como tPA e seus elementosrelacionados, são capazes de reconhecer diretamente proteínas dobradaincorretamente s. Referidas proteínas são conhecidas por ligarem-se a umagrande quantidade de ligantes que pareciam não-relacionados com respeito àestrutura 3D e/ou seqüência de aminoácidos. Estes ligantes de proteína estãofreqüentemente implicados em doenças, porém a presença de um modoestrutural comum ou seqüencial de reconheciento não foi identificadopreviamente. Coletivamente, tPA, seus elementos relacionados e outrasproteínas que reconhecem proteínas dobradas incorretamente são, portanto,parte de mecanismos que facilitam a eliminação de proteínas dobradaincorretamente s, i.e. a Via β cruzada. Exemplos de processos fisiológicos emque a Via β cruzada está envolvida são potencialização de longo prazo,imunidade inata, imunidade adaptativa, angiogênese, coagulação do sangue,formação de trombos e fibrinólise. O mal funcionamento da Via β cruzadaresultará em proteínas que formam perigosas proteínas dobradaincorretamente s, acompanhadas ou não por características estruturaiscomumente observadas no amilóide, como por exemplo, agregados ou fibrilosde conformação β cruzada. Como indicado acima e previamente no pedido depatente WO 2004 004698, proteínas dobradas incorretamente subjazem avários problemas de saúde e doenças, alguns dos quais estão previamenteassociados com mal dobramento de proteína e outros que ainda não foramassociados como tais. Estes problemas de saúde incluem doença deHuntington, amiloideoses localizadas, aterosclerose, diabetes, sangramento,trombose, câncer, sépsis, doenças inflamatórias, artrite reumatóide (RA),esclerose múltipla (MS), outras doenças auto-imunes, doenças associadas comperda de memória, como doença de Alzheimer (AD), mal de Parkinson eoutras doenças neuroniais, como por exemplo, epilepsia, encefalopatia,encefalite, catarata, amiloidoses sistêmicas, encefalopatias espongiformestransmissíveis, como doença de Creutzfeldt-Jakob, e amiloidose relacionadacom diálise com pacientes que sofrem de insuficiência renal. Em conclusão, aVia β cruzada compreende moléculas, algumas das quais se ligamdiretamente a proteínas dobrada incorretamente s, denominados de compostosde estrutura β cruzada ou compostos de ligação de β cruzada ou compostos deligação de proteína dobrada incorretamente , que contribuem para apercepção, a degradação e/ou a eliminação de proteínas dobradaincorretamente s. A Via β cruzada percebee qualquer dobragem em 3D não-nativa de uma proteína e responde de diversas maneiras. A Via β cruzadatambém compreende moléculas, como guias, que são capazes de interagircom proteínas dobradas incorretamente para auxiliar no dobramento e/ouredobramento, para prevenir o acúmulo de agregados, fibrilos, e/ouprecipitados de proteínas dobrada incorretamente s.

Por exemplo, tPA é uma serina protease que é ativada emresposta à ligação direta com proteínas dobrada incorretamente s. Umaproteína dobrada incorretamente do tipo referido é fibrina, presente em umcoágulo de sangue. Quando da ativação, tPA gera plasmina do plasminogêniode zimogênio. A plasmina protease plasmina, por sua vez, cliva muitossubstratos, como proenzimas, como procolagenases, e também proteínas dematriz extracelular, como fibrina. Como referida tPA inicia uma cascata deeventos para degradar agregados de proteínas dobrada incorretamente s, comocoágulos sangüíneos.

Outro exemplo é RAGE. Este receptor está envolvido naligação de proteínas glicadas, amilóide e outros ligantes, que compreendempropriedades amilóides, e está implicado na patologia de muitas doenças,como amiloidose, diabetes e doenças auto-imunes. A administração de umaforma solúvel deste receptor possui efeitos benéficos em modelos animais devárias das doenças de mal dobramento de proteínas previamente indicadas.

Outro exemplo adicional de moléculas de ligação de proteínadobrada incorretamente que estão envolvidas na Via β cruzada são as guias,ou proteínas de choque de calor (HSPs), ou proteínas de estresse. O fato deque guias como, por exemplo, haptoglobina e clusterina, contribuem para aprevenção da formação de agregados de proteínas dobradas incorretamente deuma maneira independente de ATP tornam-nas candidatas a desempenharemum papel importante na Via β cruzada. É provável que uma série de proteínasque apresentam conformação de proteína atue em concerto. Entre estasproteínas que atuam em concerto na Via β cruzada encontram-se guias, comopor exemplo, HSP60, HSP90, DNAK, clusterina, haptoglobina, gp96, BiP,outras HSPs (localizadas extracelularmente), proteases, como por exemplo,HGFA, tPA, plasminogênio, fator XII, IVIg, e receptores de superfíciecelular. Receptores de superfície celular implicados na Via β cruzada incluemproteína relacionada com receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP,CD91) e elementos relacionados, CD36, receptor de aglutinador A, receptorde aglutinador B-I, RAGE, também referidos coletivamente na literaturacomo receptores de multi-ligantes.

Em resumo, a Via β cruzada é capaz de impedir que proteínasdobradas incorretamente formem estrutura tóxicas, como por exemplo,fibrilos e oligomeros de estrutura β cruzada amilóide, e é capaz de degradar eeliminar (agregados de) proteínas dobrada incorretamente s. Como parte daVia β cruzada, proteínas dobradas incorretamente ligam-se a receptores deligação de proteínas dobradas incorretamente de multi-ligantes, resultando emendocitose e subseqüente degradação proteolítica. Assim, a modulação da Viaβ cruzada proporciona oportunidades de tratamento para doenças de maldobramento de proteínas.

Doenças de mal dobramento

Como mencionado acima, doenças associadas com maldobramento de proteínas, denominadas doenças de dobramento incorreto deproteínas, doenças de proteína dobrada incorretamente , desordem dedobramento incorreto de proteína, doenças conformacionais, doençasassociadas e/ou relacionadas com proteínas dobrada incorretamente s, oudesordens de dobramento de proteínas, incluem amiloidoses, e dobramentoincorreto de proteína também está associado com muitas outras doenças eproblemas de saúde e processos fisiológicos, não necessariamente definidospelo termo amiloidose ou desordem de dobramento incorreto de proteína, dosquais vários são mencionados acima.

De acordo com a presente invenção, uma seleção de IgIV queé enriquecida com moléculas de IgIV capazes de interagir com uma proteínadobrada incorretamente e/ou com um epítopo de uma estrutura β cruzada e/oucom um epítopo de uma proteína compreendendo uma estrutura β cruzadaapresenta pelo menos uma propriedades aperfeiçoada em comparação comIgIV correntemente usada. A invenção proporciona, portanto, um método paraselecionar de uma coleção de moléculas de IgIY pelo menos uma molécula deIgIV capaz de interagir com uma proteína dobrada incorretamente e/ou comum epítopo de uma estrutura β cruzada e/ou com um epítopo de uma proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada. Isto é realizado, de preferência,contactando-se uma coleção de moléculas de IgIV com uma proteína dobradaincorretamente e/ou com uma estrutura β cruzada e/ou com uma proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada e coletando-se pelo menos umamolécula de IgIV compreendendo uma região de afinidade que interage comreferida proteína e/ou epítopo. Proporciona-se, portanto, um método paraselecionar de uma coleção de moléculas de IgIV, pelo menos uma moléculade IgIV compreendendo uma região de afinidade que é capaz de interagir comuma proteína dobrada incorretamente e/ou com um epítopo de uma estruturaβ cruzada e/ou com um epítopo de uma proteína compreendendo umaestrutura β cruzada, em que referido método compreende contactar umacoleção de moléculas de IgIV com uma proteína dobrada incorretamente e/oucom uma estrutura β cruzada e/ou uma proteína compreendendo umaestrutura β cruzada e coletar pelo menos uma molécula de IgIVcompreendendo uma região de afinidade que interage com referido epítopo.

Uma região de afinidade influencia a afinidade com que umaproteína ou peptídeo se liga a um epitope e é definida aqui como pelo menosparticularmente de um anticorpo que é capaz de ligar-se especificamente a umepítopo. Referida região de afinidade compreende, por exemplo, pelo menosparte de uma imunoglobulina (como em IgIV), pelo menos parte de umanticorpo monoclonal e/ou pelo menos parte de um anticorpo humanizado.Referida região de afinidade compreende, de preferência, pelo menos parte deuma cadeia pesada e/ou pelo menos parte de uma cadeia leve de umanticorpo. Em uma concretização, referida região de afinidade compreendeum fragmento Fab de forma dupla F(ab')2 ou simples.

Geralmente, regiões de afinidade ocorrem sobre a superfície decélulas, como células T ou células B ou outras células imunes, em que nestecaso eleas são freqüentemente parte de um receptor celular. Regiões deafinidade também ocorrem em forma sintética em bibliotecas de apresentaçãode fagos.

Uma concretização da invenção compreende contactar umacoleção de imunoglobulinas de uma solução de IgIV com uma coleção deproteínas dobradas incorretamente e/ou estruturas β cruzadas, de preferência,com uma dada estrutura β cruzada selecionada, e/ou com uma proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada, de preferência, uma dada proteínaselecionada compreendendo uma estrutura β cruzada. Um epítoporeconhecido por uma região de afinidade encontra-se localizado, em umaconcretização, em uma estrutura β cruzada propriamente dita. Assim, umaconcretização da invenção proporciona um método de acordo com a invençãopara selecionar de uma coleção de moléculas de IgIV, pelo menos umamolécula de IgIV compreendendo uma região de afinidade que é capaz deinteragir com um epítopo de uma estrutura β cruzada e/ou com um epítopo deuma proteína compreendendo uma estrutura β cruzada, em que referidoepítopo é pelo menos parte de uma estrutura β cruzada de uma proteína. Emoutra concretização, referido epítopo é exposto em referida proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada. Em que referido não se encontralocalizado necessariamente em referida estrutura β cruzada. De uma maneirageral, uma estrutura β cruzada induz um dobramento diferente de umaproteína, que freqüentemente resulta na indução e/ou revelação de epítoposaté aqui desconhecidos, ou a alteração ou deleção de epítopos conhecidos dereferida proteína. Assim, é possível que uma proteína em que uma estrutura βcruzada é formada durante o dobramento incorreto, apresenta um epitpo queestá relacionado com a presença de uma estrutura β cruzada. Em umaconcretização, seleciona-se uma molécula de IgIV capaz de ligar-seespecificamente com referido epítopo induzido e/ou revelado.

Como descrito acima, proteínas dobrada incorretamente s,proteínas com estruturas β cruzadas e/ou (dobrada incorretamente s)compreendendo uma estrutura β cruzada são uma causa subjacente desintomas de muitas doenças. Referidos sintomas de doença, relacionados coma presença de estruturas β cruzadas, são diminuídos, pelo menos em parte,pela administração de uma coleção de moléculas de IgIV de acordo com apresente invenção. Uma coleção de moléculas de IgIV de acordo com apresente invenção é particularmente vantajosa para se remover proteínasdobradas incorretamente e/ou proteínas ou peptídeos compreendendo umaestrutura β cruzada, de preferência, relacionada com e/ou associada com umadoença, de uma amostra, como por exemplo, um fluido corporal ou amostrade tecido, diminuindo com isso a quantidade de proteínas dobradasincorretamente e/ou proteínas ou peptídeos (circulantes) compreendendo umaestrutura β cruzada. Como usado aqui, o termo "remover uma proteínadobrada incorretamente e/ou proteína ou peptídeo compreendendo umaestrutura β cruzada" compreende separar referida proteína e/ou peptídeo deuma amostra, e também ligar, cobrir, blindar e/ou neutralizar uma proteínadobrada incorretamente e/ou a estrutura β cruzada e/ou qualquer outra partede uma proteína ou peptídeo compreendendo uma estrutura β cruzada,prevenindo com isso, pelo menos em parte, a interação de referida proteínadobrada incorretamente e/ou estrutura β cruzada e/ou proteína ou peptídeocompreendendo uma estrutura β cruzada com outras moléculas de ligação.Desta maneira, diminui-se, pelo menos em parte, efeitos adversosrelacionados com a presença de uma proteína dobrada incorretamente e/ouuma estrutura β cruzada e/ou com a presença de uma proteína ou peptídeocompreendendo uma estrutura β cruzada, como por exemplo, infecções e/ouinflamação na AIDS, e/ou sintomas de doenças de doenças dolorosas edevastadoras, como por exemplo, artrite reumatóide e esclerose múltipla. Omesmo princípio também é aplicável a condições inflamatórias em queproteínas são alteradas pela presença de uma estrutura β cruzada (seja umaestrutura β cruzada gerada pelo corpo ou gerada e/ou induzida por umpatógeno).

Em virtude da baixa concentração e da ampla variedade deanticorpos que reagem com uma proteína dobrada incorretamente e/ou umaestrutura β cruzada e/ou com uma proteína compreendendo uma estrutura βcruzada, seria necessário administrar quantidades relativamente grandes deIgIV para se obter um resultado positivo, o que aumenta o risco de efeitoscolaterais adversos. Adicionalmente, em tratamentos correntes de IgIV, ocorpo é desnecessariamente estressado pela administração de um lote deproteínas que não tem função para a doença para a qual estão sendoadministradas. Constitui, portanto, uma vantagem importante que uma seleçãoseja feita agora com um método de acordo com a invenção a partir docombinado de IgIV para moléculas de IgIV capazes de se ligaremespecificamente a uma proteína dobrada incorretamente e/ou uma estrutura βcruzada e/ou uma proteína compreendendo uma estrutura β cruzada.Preparações de IgIV de acordo com a invenção compreendendo fraçõesenriquecidas de imunoglobulinas capazes de se ligarem especificamente auma proteína dobrada incorretamente e/ou uma estrutura β cruzada e/ou umaproteína compreendendo uma estrutura β cruzada, são particularmentevantajosas para se administrar a um animal não-humano ou humano em riscode sofrer ou já sofrendo de uma doença relacionada com estrutura β cruzada.Devido, agora, a uma seleção enriquecida de IgIV que é administrada,compreendendo moléculas de IgIV capazes de reagir especificamente comuma proteína dobrada incorretamente e/ou uma estrutura β cruzada e/ou comuma proteína compreendendo uma estrutura β cruzada, tornou-se possívelusar uma concentração total de moléculas de IgIV que é inferior do que emtratamentos de IgIV correntes e que ainda exercem os mesmos efeitosterapêuticos, ou mesmo efeitos terapêuticos melhores do que com IgIVcorrentemente usada.

Uma molécula de IgIV compreendendo uma região deafinidade que é capaz de interagir com uma proteína dobrada incorretamentee/ou um epítopo de uma estrutura β cruzada e/ou com um epítopo de umaproteína compreendendo uma estrutura β cruzada é selecionado de umacoleção de moléculas de IgIV de diversas maneiras. Por exemplo, referidamolécula de IgIV é selecionada contactando-se um combinado de moléculasde IgIV com uma proteína dobrada incorretamente e/ou uma estrutura βcruzada e/ou com uma proteína compreendendo uma estrutura β cruzada.

Subseqüentemente, coleta-se moléculas de IgIV ligadas. Em umaconcretização referida estrutura β cruzada e/ou proteína compreendendo umaestrutura β cruzada é relacionada com uma doença. Por exemplo, mielina,proteína básica de mielina e/ou glicoproteína de oligodendrócito de mielina éusada, de preferência, para selecionar moléculas de IgIV para o uso, pelomenos em parte, no tratamento e/ou prevenção de esclerose múltipla. Damesma forma, usa-se, de preferência, fator de colágeno e/ou reumatismo paraselecionar moléculas de IgIV para o uso, pelo menos em parte, no tratamentoe/ou prevenção da artrite reumatóide. Encontram-se disponíveis na arte váriosmétodos alternativos para selecionar uma molécula de IgIV capaz de interagircom uma proteína dobrada incorretamente e/ou um epítopo de uma estruturaβ cruzada e/ou com um epítopo de uma proteína compreendendo umaestrutura β cruzada, e que são vantajosos para uso em um método de acordocom a invenção.

Em uma concretização preferida da presente invenção, umamolécula de IgIV capaz de interagir com qualquer dada proteína dobradaincorretamente de interesse e/ou com qualquer dado epítopo de estrutura βcruzada de interesse e/ou com qualquer dado epítopo de interesse de umaproteína compreendendo uma estrutura β cruzada, é selecionada usando-sequalquer tipo de proteína mal dobrada, epítopo de estrutura β cruzada e/ouepítopo de um proteína compreendendo uma estrutura β cruzada. De acordocom a presente invenção, com o uso de uma ou várias matrizes de afinidadecompreendendo proteínas dobradas incorretamente e/ou proteínascompreendendo estrutura β cruzada ou amilóide, regiões de afinidade sãoselecionadas de qualquer composição de regiões de afinidade, que sãocapazes de ligar-se, preferivelmente, seletivamente e com maior afinidade, aproteínas dobradas incorretamente e/ou proteínas compreendendo umaestrutura β cruzada, que não foram incluídas necessariamente no conjunto deregiões de afinidade usadas para a seleção. Os Exemplos demonstram que,com o uso de um suporte sólido com proteínas dobradas incorretamenteselecionadas imobilizadas, isola-se regiões de afinidade que apresentamafinidade por virtualmente qualquer proteína mal dobrada.

Adicionalmente, de acordo com a presente invenção, tantocom proteínas dobradas incorretamente com aspecto fibrilar, e também comoagregados de proteínas dobradas incorretamente não apresentandocaracterísticas fibrilares, seleciona-se regiões de afinidade que apresentamespecificidade de amplo espectro por proteínas dobradas incorretamente e/ouproteínas compreendendo estrutura β cruzada. Por exemplo, com matriz deafinidade por fibrilos Αβ é possível selecionar regiões de afinidade queapresentam afinidade por multímeros não-fibrilares de, por exemplo, BSA-AGE dobrada incorretamente , agregados de Αβ e dOVA. Por outro lado, como uso de matriz de HbAGE não-fibrilar ou com matriz de IgIV mal dobradanão-fibrilar, seleciona-se regiões de afinidade que se ligam eficientemente afibrilos Αβ.

Nos Exemplos, com o uso de uma matriz de AGE-albumina desoro bovino, foi possível selecionar regiões de afinidade com afinidade porAB humana, albumina humana e ovalbumina de frango. Com o uso de umamatriz Αβ humana, foi possível selecionar regiões de afinidade que sãocapazes de ligação com albumina de soro bovino glicado e ovalbumina defrango. Com uma matriz Hb humana glicada, foi possível selecionar regiõesde afinidade capazes de ligação com IgG de mouse mal dobrada.Conseqüentemente, de acordo com a presente invenção, com proteínasdobradas incorretamente que se originam de uma espécie, é possívelselecionar regiões de afinidade que têm afinidade por proteínas dobradasincorretamente que se originam de outras espécies.

Além disso, de acordo com a invenção, de uma coleção deregiões de afinidade de uma IgIV humana é possível selecionar uma seleçãode regiões de afinidade que se originam de pelo menos quatro diferentesclones de células B produzindo isotipos IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, queapresentam propriedades de ligação no sentido de uma ampla faixa deproteínas, em que referidas proteínas originam-se de várias espécies de nãoprecisam apresentar homologia substancial de seqüências de aminoácidos,tampouco comprimento similar de seqüências de aminoácidos, nem estrutura3 D similar ou congruente em sua dobra nativa, embora elas compartilhemuma característica comum a proteínas dobrada incorretamente s. As regiõesde afinidade selecionadas com especificidade para proteínas dobradasincorretamente e/ou proteínas compreendendo estrutura β cruzada são úteispara uma variedade de aplicações. Abaixo, delinea-se com mais detalheregiões de afinidade enriquecidas usadas para terapia contra doenças dedobramento incorreto de proteínas.

Os métodos de acordo com a invenção permitem a seleção,entre outras coisas, de regiões de afinidade que são aplicáveis na terapêuticae/ou diagnóstico de doenças associadas com mal dobramento de proteínas.Um sumário delineando concretizações preferidas de um método de acordocom a invenção é descrito na Figura 26. Qualquer proteína dobradaincorretamente de escol (mistura X e Y na Figura 26, representando oMísfoldome) é vantajosa para uso na seleção de regiões de afinidade, porém,de preferência, usa-se proteínas dobradas incorretamente (mistura A na Figura26) que estão associadas com doença. Como proteínas dobradasincorretamente compartilham características comuns, de uma forma geral,selecionar-se-á regiões de afinidade que se ligam a não mais que uma proteínamal dobrada particular. No entanto, como divulgado neste pedido, também épossível selecionar regiões de afinidade que se ligam, de preferência, a umsubconjunto ou mesmo a um tipo único de proteína mal dobrada. Combinandoum conjunto de colunas, uma pessoa versada na arte é capaz de selecionaraquelas regiões de afinidade de interesse que são aplicáveis para terapêuticase/ou diagnósticos de dobramento incorreto em geral, ou que são aplicáveis, depreferência, para uma doença particular ou para um conjunto de doenças emque a doença em particular está implicada, ou o conjunto de doenças em que aproteína dobrada incorretamente de escol está implicada. Como descrito naFigura 26, a aplicação de coluna I (mistura de proteínas dobradasincorretamente não necessariamente relacionadas com uma doença) resultaráem regiões de afinidade (preparação 1) com afinidade por proteínas dobradasincorretamente em geral, i.e. o Mísfoldome. Referidas regiões de afinidade sãovantajosas para diagnósticos e também para terapia. No entanto, o uso dereferidas regiões de afinidade para fins terapêuticos implica no risco potencialde efeitos colaterais, devido ao fato de que se introduz no paciente regiões deafinidade que não só se ligam à proteína dobrada incorretamente relacionadacom a doença (efeitos terapêuticos desejados), mas também a outras proteínasdobradas incorretamente presentes (efeitos colaterais impredizíveis daterapia). Combinando-se colunas I e III, e, mais preferivelmente, colunas II eIV, seleciona-se aquelas regiões de afinidade que interagem, de preferência,com proteínas dobradas incorretamente específicas para uma doença ou umconjunto de doenças. A coluna IV é usada para remover aquelas regiões deafinidade que interagem com proteínas dobradas incorretamente que não sãorelacionadas com a doença-alvo de escol. Conseqüentemente, preparações 3 e4 são selecionadas, de preferência, para fins terapêuticos específicos.

Conseqüentemente, para selecionar regiões de afinidadecapazes de ligar-se especificamente a proteínas dobradas incorretamenteassociadas com uma doença de interesse, usa-se, de preferência, duas colunas.Uma coluna ("a coluna geral") compreende proteínas dobradas incorretamenteque não são associadas necessariamente com referida doença. A outra coluna("a coluna específica") compreende mais proteínas dobradas incorretamenteque são associadas com referida doença, em comparação com a coluna geral.

De preferência, as proteínas dobradas incorretamente de referida colunaespecífica consistem substancialmente de proteínas dobradas incorretamenteassociadas com referida doença.

Em uma concretização, a coluna geral é usada primeiramente.

Nesta etapa, isola-se regiões de afinidade capazes de se ligaremespecificamente a qualquer proteína dobrada incorretamenteSubseqüentemente, de acordo com esta concretização, usa-se a colunaespecífica. Nesta etapa, a composição compreendendo as regiões de afinidadeé enriquecida em regiões de afinidade específicas para proteínas dobradasincorretamente associadas com uma doença de interesse.

Em outra concretização, as colunas indicadas acima são usadasna ordem invertida. Em primeiro lugar, a coluna específica é usada para isolarregiões de afinidade capazes de ligar-se especificamente a proteínas dobradasincorretamente associadas com uma doença de interesse. Na prática, acomposição resultante também compreende regiões de afinidade capazes dese ligarem especificamente a proteínas dobradas incorretamente que não estãoassociadas com referida doença de interesse. Portanto, usa-sesubseqüentemente uma coluna geral. Uma característica importante destasegunda coluna é que ela não compreende, ou só compreende em menor grau,proteínas dobradas incorretamente que estão associadas com referida doençade interesse. Referida segunda coluna ligará regiões de afinidade capazes dese ligar especificamente a proteínas dobradas incorretamente que não estãoassociadas com referida doença de interesse, porém não ligará, ou só ligaráem menor grau, regiões de afinidade que são específicas para proteínasdobradas incorretamente associadas com referida doença de interesse. Assim,o fluxo através da da fração é enriquecido em regiões de afinidade específicaspara proteínas dobradas incorretamente associadas com referida doença de interesse.

Em uma concretização, moléculas de IgIV selecionadas sãotestadas quanto a sua reatividade com uma dada proteína e/ou peptídeo deinteresse em uma amostra corporal de um humano ou animal que sofre dereferida doença. A capacidade de uma coleção de IgIV selecionada de acordocom a invenção ligar-se a uma proteína de interesse específica de umaamostra corporal é medida, por exemplo, com um teste de agregação deplaquetas sangüíneas, um teste de opsonofagocitose, e/ou um teste de inibiçãoou de ativação de complemento.

Uma concretização adicional proporciona um método deseleção de acordo com a invenção em que uma proteína dobradaincorretamente e/ou um epítopo, em que uma estrutura β cruzada ou umepítopo de uma proteína compreende uma estrutura β cruzada, é ligada a umsuporte, como por exemplo, esferas ou partículas ou pérolas ou lâminas oufilamentos de látex ou agarose ou Sefarose ou vidro ou plástico ou metal ouqualquer outra substância vantajosa ou composto ou material ou moléculavantajosa para acentuar a eficiência da seleção, como por exemplo pérolasmagnéticas. Portanto, a invenção proporciona um método como descrito aqui,em que referida proteína dobrada incorretamente e/ou referido epítopo éligado a um suporte sólido.A invenção proporciona adicionalmente uma coleção demoléculas de IgIV, enriquecidas em moléculas de IgIV compreendendo umaregião de afinidade que é capaz de interagir especificamente com umaproteína dobrada incorretamente e/ou com um epítopo de uma estrutura βcruzada e/ou com um epítopo de uma proteína compreendendo uma estruturaβ cruzada. Como explicado acima, referida coleção de moléculas de IgIVapresenta pelo menos uma propriedade aperfeiçoada em comparação comIgIV correntemente usada. Uma coleção de moléculas de IgIV de acordo coma invenção é selecionada, de preferência, de IgIV correntemente usada, comum método de seleção de acordo com a invenção. Com um método dainvenção, uma pessoa versada na arte é capaz de selecionar de uma grandecoleção de IgIV, uma seleção menor de moléculas de IgIV que é enriquecidacom moléculas de IgIV compreendendo regiões de afinidade capazes de seligarem especificamente a uma proteína dobrada incorretamente e/ou umepítopo sobre uma estrutura β cruzada e/ou um epítopo sobre uma proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada. Portanto, uma concretizaçãoproporciona uma coleção de moléculas de IgIV, enriquecida com moléculasde IgIV compreendendo uma região de afinidade capaz de interagir com umaproteína dobrada incorretamente e/ou um epítopo de uma estrutura β cruzadae/ou com um epítopo de uma proteína compreendendo uma estrutura βcruzada, selecionada por um método de acordo com a presente invenção. Umacoleção enriquecida de moléculas de IgIV de acordo com a invenção évantajosa para administrar a um paciente que necessita de referidomedicamento em uma quantidade menor do que preparações de IgIVcorrentemente usadas, devido ao aumento relativo de regiões de afinidade emreferida coleção enriquecida capaz de interagir com uma proteína dobradaincorretamente e/ou com um epítopo em uma estrutura β cruzada e/ou comum epítopo em uma proteína compreendendo uma estrutura β cruzada.

A invenção proporciona adicionalmente uma composiçãocompreendendo pelo menos 5 moléculas isoladas, sintéticas e/ourecombinantes compreendendo uma região de afinidade que é capaz deinteragir com uma proteína dobrada incorretamente e/ou um epítopo de umaestrutura β cruzada e/ou com um epítopo de uma proteína compreendendouma estrutura β cruzada. De preferência, referida composição compreendepelo menos 8, mais preferivelmente pelo menos 10 das moléculas isoladas,sintéticas e/ou recombinantes indicadas acima. Em uma concretizaçãopreferida, usa-se moléculas sintéticas e/ou recombinantes. Uma vantagem deuma composição de moléculas sintéticas e/ou recombinantes é o fato de que anecessidade de IgIV é eliminada. Isto é, entre outras coisas, vantajoso porqueos suprimentos de a disponibilidade de IgIV não são suficientes, e porque hádeterminados riscos na administração de produtos biológicos derivados desangue humano (como, por exemplo, o risco de infecção com doença depríons e com patógenos, como vírus da hepatite ou HIV). Agora que apresente invenção proporcionou uma seleção enriquecida de moléculas deIgIV de acordo com a invenção, tornou-se possível gerar moléculas sintéticase/ou recombinantes com pelo menos uma propridade similar à referidaseleção enriquecida de moléculas de IgIV, no que se refere ao tipo, nãonecessariamente à quantidade. Uma vez que se preparou uma seleçãoenriquecida de determinadas imunoglobulinas de IgIV, uma pessoa versada naarte é capaz de determinar, por meio de métodos conhecidos na arte (como,por exemplo, embora sem limitação, o método de Maldi-Toff) a seqüência deaminoácidos de referidas imunoglobulinas, ou pelo menos de uma região deafinidade de referidas imunoglobulinas. Referida seqüência de aminoácidos éentão usada, de preferência, para selecionar ou produzir moléculas sintéticasou parcialmente sintéticas que apresentam a mesma característica de ligaçãoem termos de tipo, não necessariamente de quantidade, que pelo menos umaregião de afinidade de uma molécula de IgIV selecionada de acordo com ainvenção. Um exemplo não-limitante de uma molécula sintética ouparcialmente sintética é um produto obtido por meio de síntese recombinanteou química de peptídeos, proteínas ou outras moléculas. E até mesmo possívelselecionar uma biblioteca de apresentação de fago com proteínas dobradasincorretamente e/ou com estruturas β cruzadas e/ou com proteínascompreendendo uma estrutura β cruzada, ou epítopos de referidas proteínas,para selecionar moléculas de ligação apresentando uma região de afinidadereagindo com referida proteína mal dobrada, estrutura β cruzada e/ou proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada. Portanto, uma concretizaçãoproporciona um método para produzir uma composição de acordo com ainvenção, compreendendo definir a seqüência de aminoácidos de uma regiãode afinidade de pelo menos uma molécula de IgIV capaz de interagir comuma proteína dobrada incorretamente , um epítopo de uma estrutura β cruzadae/ou com um epítopo de uma proteína compreendendo uma estrutura βcruzada, e produzir moléculas sintéticas ou recombinantes compreendendoreferida seqüência de aminoácidos. Em outra concretização, a invençãotambém proporciona uma molécula sintética ou recombinante compreendendouma região de afinidade que é capaz de interagir com uma proteína dobradaincorretamente , um epítopo de uma estrutura β cruzada e/ou com um epítopode uma proteína compreendendo uma estrutura β cruzada, em que referidamolécula produzida de acordo com um método como descrito acima.

Conseqüentemente, regiões de afinidade análogas àquelasisoladas de IgIV são preparadas, por exemplo, recombinantemente ousinteticamente, por meio de aplicação de técnicas sintéticas, conhecidas poruma pessoa versada na arte, incluindo análise de seqüência de proteínas,clonagem de DNA e tecnologia de expressão. Uma concretização da invençãocompreende as seguintes etapas: (1) a seqüência de aminoácidos, pelo menosdas regiões variáveis das correntes pesada e leve, ou pelo menos das regiõesdeterminadoras de complementaridade de 1 a 3 (CDRs), ou pelo menos deCDR3 da cadeia pesada (HC, heavy chain) de regiões de afinidade isoladas, éobtida por meio de análise de seqüencia de proteínas. (2) Uma seqüência deácidos nucleicos, de preferência, uma seqüência de DNA, codificando aseqüência de aminoácidos identificada é preparada sinteticamente. Como umaalternativa para a seqüência exata determinada por meio de análise deproteína, é possível produzir uma seqüência em que uma ou mais mutaçõessão introduzidas, de preferência, na CDR3, e, ainda mais preferivelmente naCDR3 da cadeia pesada (HC), para produzir regiões de afinidade comespecificidade alterada, de preferência, afinidade incrementada e/ou afinidademais específica. (3) O ácido nucleico é clonado em um vetor de expressãoapropriado. Referido vetor já contém as seqüências que codificam as regiõesconstantes de imunoglobulinas do tipo desejado, como por exemplo, para seobter IgGl, IgG2a, IgG2b, IgM, IgA, IgE etc. (4) Referido vetor é transduzidode qualquer maneira em um sistema de expressão de escol, de preferência,uma célula mamífera. (5) Seleciona-se células expressando a região deafinidade. (6) Regiões de afinidade produzidas de forma recombinante sãopurificadas a partir de referidas células ou sobrenadante de cultura derivadode células. Caso se introduza mutações na seqüência original de região deafinidade para otimizar a afinidade, as regiões de afinidade recentementepreparadas são opcionalmente re-selecionadas, de preferência, usando-se ummétodo de acordo com a presente invenção. Referida geração de regiões deafinidade semissintéticas com um repertório ainda maior de regiões deafinidade, de preferência, nas regiões determinadoras de complementaridade,de preferência, na CDR3, ainda mais preferivelmente na CDR3 da HC, érealizada, de preferência, por meio de geração de uma biblioteca semi-sintética, como uma biblioteca de apresentação de fago (ver abaixo).

Além de uma coleção de imunoglobulinas humanas, comoIVIg obtida de sangue, também é possível obter uma biblioteca combinatorialde sangue, uma biblioteca combinatorial também pode ser obtida de qualqueroutro conjunto de regiões de afinidade, de preferência, um conjunto deregiões de afinidade recombinantes, como aquelas presentes em umabiblioteca de apresentação de fago (Winter et al. 1994; Hoogenboom, 1992,1997, 2000, 2002, 2005). De preferência, uma biblioteca do tipo referidoconstitui-se de seqüências relacionadas com regiões de afinidade mamíferas,de preferência, regiões de afinidade humanas, como imunoglobulinas. Emuma concretização preferida, uma biblioteca de apresentação de fago do tiporeferido compreendendo uma coleção de regiões de afinidade é preparadacomo a seguir (Winter et ai. 1994, de Kruif et ai. 1995a, 1995b):primeiramente, RNA é extraído de células B ou de um tecido compreendendocélulas B. Subseqüentemente, prepara-se cDNA. Em seguida, cDNA quecodifica as regiões variáveis é amplificado, clonado em um vetor defagomídeo apropriado e transformado em um hospedeiro apropriado, comopor exemplo, uma cepa de Escherichia coli. Desta maneira expressa-seregiões de afinidade, i.e. apresentadas por fagos, como proteínas de fusão nasuperfície de bacteriófagos filamentosos. Uma biblioteca de apresentação defago é preparada, por exemplo, a partir de células B obtidas de um mamíferosaudável, de preferência, um humano, camundongo, rato ou lhama, ou,alternativamente, de um mamífero imunizado com uma proteína dobradaincorretamente . Em uma concretização, prepara-se uma biblioteca deapresentação de fago a partir de células B de um mamífero, de preferência,um humano, que sofre de uma doença particular, de preferência, uma doençade mal dobramento, como por exemplo, RA. Desta maneira, prepara-se umacoleção de regiões de afinidade com um objetivo específico de compreenderaquelas regiões de afinidade específicas para proteínas dobradaincorretamente s. Por exemplo, em uma concretização, um camundongo éimunizado uma vez ou várias vezes com uma ou uma seleção de proteínasdobradas incorretamente (como no Exemplo 20), células B são isoladas dobaço e usadas para preparar uma biblioteca de apresentação de fago. Em outraconcretização, células B são isoladas de um humano com uma doençaparticular, por exemplo, artrite (reumatóide). cDNA preparado a partir destascélulas B é usado, então, de forma preferível para preparar uma biblioteca deapresentação dé fago. Desta maneira, prepara-se uma biblioteca deapresentação de fago compreendendo regiões de afinidade com especificidadepara proteínas dobradas incorretamente envolvidas na doença de maldobramento selecionada. Por exemplo, prepara-se uma biblioteca com regiõesde afinidade para o domínio Fc de Ig's, i.e. regiões de afinidade, como FatorReumatóide (RF, Rheumatoid Factor) (van Esch et ai. 2003, Clin Exp.Immunol.). Da forma descrita acima uma pessoa versada na arte é capaz deprojetar e preparar uma biblioteca de apresentação de fago com qualquercoleção de regiões de afinidade com ênfase numa aplicação ou doençaparticular.

Em uma concretização, prepara-se sinteticamente umabiblioteca de apresentação de fago com uma coleção de regiões de afinidadedo tipo referido com um repertório incrementado (Hoogenboom, 1992, 1997,2000, 2002, 2005; de Kruif et al. 1995a, 1995b). Desta maneira uma pessoaversada na arte é capaz de projetar uma biblioteca compreendendo regiões deafinidade de considerável diversidade adicional. De preferência,implementando-se seqüências adicionais nas regiões hipervariáveis, as CDRsque interagem com o antígeno, prepara-se regiões de afinidade adicionais,remodelando-se os domínios variáveis. Além das regiões de afinidade obtidasde seqüências humanas, uma coleção de regiões de afinidade é criada em umaconcretização de qualquer outra espécie, como lhama, camelo, alpaca oucamelídeo, para se obter regiões de afinidade, como anticorpos de lhama,também referidos como nanocorpos, com propriedades relacionadas comestas espécies. Assim, uma biblioteca de apresentação de fago e/ou umacoleção de regiões de afinidade é preparada de muitas maneiras, por exemplo,de um mamífero imunizado com uma ou com um conjunto de proteínasdobrada incorretamente s. Em uma concretização particularmente preferida,uma biblioteca de apresentação de fago e/ou uma coleção de regiões deafinidade é preparada de um mamífero com uma doença, de preferência, umadoença de mal dobramento. Regiões de afinidade específicas para proteínasdobradas incorretamente são selecionadas, de preferência, de uma bibliotecade apresentação de fago usando-se meios e métodos de acordo com ainvenção, de preferência, combinados com proecimentos convencionais paraisolar fagos. Da forma mais direta, em uma concretização preferida, proteínasdobradas incorretamente são preparadas e são imobilizadas, de preferência, deacordo com qualquer um dos procedimentos divulgados nesta aplicação, e,subseqüentemente, deixadas ligar-se a fagos. Após lavagem extensiva, fagosligados são recuperados e amplificados por meio de reinfecção do hospedeiro.Para permitir a recuperação apenas de fagos específicos, o procedimento deseleção é repetido, de preferência, por várias vezes. Finalmente, isola-seaqueles fagos que são capazes de ligar-se especificamente a alvos maldobrados. Em uma concretização particularmente preferida, proteínasdobradas incorretamente são isoladas de uma amostra de tecido obtida de umindivíduo ou de uma combinação de indivíduos com uma doença. Porexemplo, proteínas dobradas incorretamente são isoladas empregando-se umaproteína que é capaz de ligar-se especificamente a proteínas dobradasincorretamente compreendendo estrutura β cruzada, como tPA, RAGE ou umequivalente funcional do mesmo (ver a Tabela 4), de fluido sinovial de umpaciente com artrite (reumatóide). De forma análoga, é possível usar qualqueroutra amostra.

Empregando abordagens como descritas acima obtém-se porvia recombinante regiões de afinidade para proteínas dobrada incorretamentes.

Após seleção dos fagos apropriados, DNA codificando asregiões variáveis das regiões de afinidade isoladas são isoladas, depreferência, do DNA de fagomídeo de forma a gerar anticorpos plenos. Isto érealizado facilmente de acordo com procedimentos convencionais. O DNA éclonado, de preferência, em vetores que codificam as regiões constantes paraas cadeias pesada e leve. É possível usar qualquer vetor e qualquer tipodesejado de região constante. O vetor é transduzido, de preferência, dequalquer forma conhecida em um sistema de expressão de escol, depreferência, uma célula mamífera. Células expressando a região de afinidadesão selecionadas preferivelmente. Regiões de afinidade preparadas por viarecombinante são purificadas, de preferência, das células ou de sobrenadantede cultura derivado de células. Desta maneira, prepara-se qualquer região deafinidade de imunoglobulina para proteínas dobradas incorretamente(Bloemendal et al 2004; Huls et al 1999a, 1999b; Boel et al 2000).

Para uso em humanos, gera-se, de preferência, regiões deafinidade recombinantes "quiméricas" ou "humanizadas". Regiões deafinidade obtidas de outras espécies são modificadas, de preferência, de talforma que seqüências não-humanas sejam substituídas por seqüênciashumanas, onde possível, enquanto que as propriedades de ligação da região deafinidade de preferência não são influenciadas demais. Em umaconcretização, prepara-se regiões de afinidade durante estratégicas deimunização clássicas, de preferência, usando camundongos ou ratos, aindamais preferivelmente usando-se ratos transgênicos que codificamimunoglobulinas humanas. Após imunização, prepara-se, de preferência,linhas de células de hibridoma expressando anticorpos monoclonais viaprocedimentos convencionais, e/ou aplicando-se a tecnologia de apresentaçãode fagos descrita acima. Seleciona-se, de preferência, anticorpos monoclonaisque são capazes de interagir especificamente com proteínas dobradaincorretamente s. Versões "quiméricas" ou "humanizadas" de referidasregiões de afinidade, quando preparadas usando-se ratos ou camundongosnormais, são preparadas, por exemplo, substituindo-se regiões constantes não-humanas e as regiões variáveis não-humanas relevantes pelas regiõeshomólogas humanas relevantes (Morrison et al 1984; Jones et ai. 1986). Alémdisso, regiões constantes diferentes são introduzidas quando desejado.

Em uma concretização preferida uma composição de acordocom a invenção compreende uma parte funcional, derivado e/ou análogofuncional de pelo menos uma molécula de IgIV compreendendo uma regiãode afinidade capaz de interagir com uma proteína dobrada incorretamentee/ou um epítopo de uma estrutura β cruzada e/ou com um epítopo de umaproteína compreendendo uma estrutura β cruzada. Uma parte funcional deuma molécula de IgIV é definida como um composto que tem as mesmaspropriedades de ligação imunológicas no que se refere a tipo, nãonecessariamente a quantidade. Referida parte funcional é capaz de ligar-se auma proteína dobrada incorretamente e/ou uma estrutura β cruzada e/ouproteína compreendendo uma estrutura β cruzada, embora nãonecessariamente na mesma medida que referida molécula de IgIV. Umderivado funcional de uma molécula de IgIV é definido como uma moléculade IgIV que foi alterada de tal forma que a capacidade de ligação de umaproteína dobrada incorretamente e/ou um estrutura β cruzada e/ou umaproteína compreendendo uma estrutura β cruzada do composto resultante ésubstancialmente é o mesmo em termos de tipo, não necessariamente emtermos de quantidade. Um derivado é proporcionado de muitas maneiras, porexemplo por meio de substituição conservativa de aminoácidos, em que umradical de aminoácido é substituído por outro radical com propriedadesgeralmente similares (tamanho, hidrofobibidade, etc), de tal forma que ofuncionalmente global provavelmente não é seriamente afetado, ou mesmoaperfeiçoado.

Uma pessoa versada na arte é bem capaz de gerar compostosanálogos de uma molécula de IgIV. Isto pode ser realizado, por exemplo, pormeio de seleção de uma biblioteca de peptídeos. Um análogo do tipo referidoé capaz de ligar-se a uma proteína dobrada incorretamente e/ou uma estruturaβ cruzada e/ou proteína compreendendo uma estrutura β cruzada, apesar denão necessariamente no mesmo grau que referida molécula de IgIV.

Uma molécula de IgIV selecionada e/ou uma moléculasintética ou recombinante isolada compreendendo uma região de afinidadecapaz de ligar-se especificamente a uma proteína dobrada incorretamente e/ouum epítopo de uma estrutura β cruzada e/ou um epítopo de uma proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada é usada em uma concretização dainvenção para reagir e ligar-se a uma proteína dobrada incorretamente e/ouestruturas β cruzadas e/ou proteínas compreendendo estruturas β cruzadas invitro. Referida molécula é reagida, de preferência, com uma amostra de fluidocorporal ou de tecido, alimento, fluido, ou uma composição farmacêuticacompreendendo proteínas dobradas incorretamente e/ou uma estrutura βcruzada e/ou uma proteína compreendendo uma estrutura β cruzada, ematerial ligado é removido, de preferência. Outra aplicação de uma moléculade acordo com a invenção consiste em reação e ligação a proteínas dobradasincorretamente e/ou estruturas β cruzadas e/ou proteínas compreendendo umaestrutura β cruzada in vivo.

Uma concretização preferida proporciona uma composição deacordo com a invenção em que pelo menos uma de referidas moléculascompreende adicionalmente uma proteína dobrada incorretamente e/ou umcomposto de ligação de estrutura β cruzada. Uma proteína dobradaincorretamente e/ou composto de ligação de estrutura β cruzada é umcomposto capaz de ligar-se especificamente a uma proteína dobradaincorretamente e/ou uma estrutura β cruzada. Uma proteína dobradaincorretamente e/ou molécula de ligação de estrutura β cruzada é capaz deservir como uma molécula efetora incrementando-se a capacidade de umamolécula de uma composição de acordo com a invenção para ligar-seespecificamente a uma proteína dobrada incorretamente e/ou uma estrutura βcruzada ou uma proteína compreendendo uma estrutura β cruzada. Ligaçãoincrementada de uma proteína dobrada incorretamente e/ou uma estrutura βcruzada devida a referida molécula de ligação de estrutura β cruzada é, porexemplo, desejada para incrementar a formação e a remoção de complexos deproteína dobrada incorretamente e/ou estrutura β cruzada da circulação e/oudo corpo. Alternativamente, ou adicionalmente, o acúmulo local de umaproteína dobrada incorretamente e/ou estruturas β cruzadas, como presentesem placas amilóides é diminuído.

Exemplos não-limitantes de proteína dobrada incorretamentee/ou moléculas de ligação de estrutura β cruzada são um domínio de dedo(também referido como domínio de fibronectina de tipo I) de ativador deplasminogênio de tipo tissular (tPA [Tissue-type Plasminogen Activator],fator de crescimento de hepatócitos (HGFA, hepatocyte growth factoractivator), fator XII, ou fibronectina, ou membros da família de receptor demultiligantes, como receptor para receptor para produtos finais deglicosamento avançado (RAGE, receptor for advanced glycation end-products), ou proteína relacionada com lipoproteína de baixa densidade (LRP,Iow density lipoprotein receptor related protein) ou CD36. Uma proteínadobrada incorretamente e/ou moléculas de ligação de estruturas β cruzadas dotipo referido pode ser até mesmo uma molécula não-proteinácea, como porexemplo, um corante (vermelho Congo ou Tioflavina).

Em uma concretização, uma molécula efetora é oferecida auma molécula isolada, sintética e/ou recombinante da invenção e/ou a umaimunoglobulina IgIV selecionada da invenção. Proporciona-se, portanto,também uma composição e uma coleção de moléculas de IgIV de acordo coma invenção, em que pelo menos uma de referidas moléculas compreendeadicionalmente uma molécula efetora.

Em uma concretização preferida, referida molécula efetoracompreende um inibidor de dobramento incorreto, como por exemplo,vermelho Congo. Em outra concretização preferida, referido composto efetoré capaz de incrementar o sistema de complemento e/ou o sistema fagocíticode um animal (de preferência um humano) para incrementar a remoção de(proteínas compreendendo) estruturas β cruzadas indesejadas.

Conseqüentemente, em uma concretização preferida, referido composto efetorcompreende um fator de ativação de complemento, como por exemplo,embora sem limitação, qualquer proteína de complemento, uma citocinaativadora de complemento, proteína C reativa, componente de amilóide P dosoro, Pentraxina-3, uma região Fc de imunoglobulinas (ligante para Clq),uma proteína de controle de complemento, uma molécula capaz deincrementar a atividade ativadora de complemento de proteínas de controle decomplemento, e/ou moléculas capazes de inibir a atividade inibidora deproteínas de controle de complemento. Exemplos não-limitantes de proteínasde controle de complemento são inibidor de Cl, proteína de ligação de C4,fator H, fator I, properidina, proteína S, receptor de complemento de tipo I,proteína de cofator de membrana, fator acelerador de degradação, proteína deligação de C8 e CD59. Em uma concretização preferida adicional referidocomposto efetor é capaz de facilitar a degradação de uma proteína dobradaincorretamente e/ou uma estrutura β cruzada e/ou uma proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada. Outra propriedade preferida dereferido composto efetor é uma capacidade de facilitar absorção celular deuma proteína dobrada incorretamente e/ou uma estrutura β cruzada e/ou umaproteína compreendendo uma estrutura β cruzada. Uma concretizaçãoproporciona uma composição de acordo com a invenção, em que referidamolécula isolada, sintética e/ou recombinante, ou referida molécula de IgIVselecionada, compreende um composto efetor que é uma protease ou umaproteína dobrada incorretamente e/ou parte de ligação de estrutura β cruzada.Referido efetor é particularmente vantajoso para a ligação e/ou degradação deuma proteína dobrada incorretamente e/ou uma estrutura β cruzada e/ou umaproteína indesejada compreendendo uma estrutura β cruzada. Em umaconcretização preferida adicional, referido composto efetor compreende umcomposto imunopotencializador para incrementar uma resposta imunedirigida contra uma resposta dirigida contra uma proteína dobradaincorretamente e/ou uma estrutura β cruzada e/ou uma proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada. Referido compostoimunopotencializador compreende, de preferência, uma citocina.

Em uma concretização adicional referido composto efetorcompreende uma proteína dobrada incorretamente e/ou fator potencializadorde ligação de estrutura β cruzada. Este é um fator capaz de incrementar acapacidade de uma molécula de acordo com a invenção de ligação de umaproteína dobrada incorretamente e/ou estrutura β cruzada e/ou ligação de umaproteína compreendendo uma estrutura β cruzada. Exemplos não-limitantesde referidos fatores são Tioflavina T e Tioflavina S (ver por exemplo exemplo 4).

Em uma concretização adicional referido composto efetorcompreende um sinal de eliminação que auxilia na remoção do complexoresultante após uma molécula e/ou molécula de IgIV da invenção ter-se ligadoa uma proteína dobrada incorretamente e/ou uma estrutura β cruzada e/ouuma proteína compreendendo uma estrutura β cruzada. Sinais de eliminaçãosão bem conhecidos na arte. Um exemplo preferido de um sinal de eliminaçãoé, pelo menos parte, de uma região Fc, mais preferivelmente uma região Fcycapaz de interagir com um receptor Fc (de preferência com um receptor deFcyIIb). Referido sinal de eliminação é capaz de incrementar a remoção deum complexo compreendendo uma molécula de acordo com a invenção ligadaa uma proteína dobrada incorretamente e/ou um estrutura β cruzada ou a umaproteína compreendendo uma estrutura β cruzada da circulação e/ou do corpode um animal (de preferência, um humano).

A ativação do sistema de complemento resulta em uma cascatade reações, incluindo inflamação, destruição de células e danos ao tecido. Emalguns casos deseja-se neutralizar o sistema de complemento de forma aabafar efeitos colaterais adversos. Exemplos não-limitantes de referidascircunstâncias são situações com ativação excessiva e/ou descontrolada dosistema de complemento ou ativação (prolongada) do sistema decomplemento sem um mecanismo de feedback negativo funcionandoadequadamente ou superestimulação do sistema de complemento, porexemplo, devido aos níveis sustentados e/ou superexpressos de ativadores,como por exemplo, durante inflamação, amiloidoses e/ou artrite reumatóide.

Em uma concretização, usa-se, portanto, um composto efetor que é umcomposto supressor de inflamação, de preferência, um fator inibidor decomplemento, como por exemplo, uma imunoglobulina ou um compostocapaz de inibir ou bloquear, pelo menos parcialmente, importantefuncionamento de proteínas de complemento e/ou capaz de inibir ou bloquear,pelo menos parcialmente, importante funcionamento de qualquer proteína oucomposto que compreende capacidades estimuladoras de sistema decomplemento. Exemplos não-limitantes de fator inibidor de complementoscompreendem receptor de TNF solúvel, antagonistas de receptor de IL-I ecitocinas antiinflamatórias.

Em outra concretização adicional, referido composto efetorcompreende um composto opsonizador. Adicionalmente, ou alternativamente,referida molécula isolada, sintética e/ou recombinante da invenção é, por sisó, um composto opsonizador. Opsonização é definida aqui como umprocesso de induzir e/ou incrementar fagocitose de uma substância por meiode fagócitos, como macrófagos, células polimorfonucleares e análogos.

Algumas substâncias são capazes de resistir e/ou escapar à fagocitose, porexemplo, devido à natureza de sua superfície. Em tais casos, a fagocitose éinduzida e/ou incrementada, de preferência, por meio de opsonização decompostos de ligação, que, uma vez ligados a uma substância, facilitam aabsorção de referida substância por fagócitos, como macrófagos e célulaspolimorfonucleares e análogos.

Em uma concretização, determina-se se uma molécula de IgIVselecionada e/ou uma molécula isolada, sintética e/ou recombinante de acordocom a invenção apresenta uma capacidade opsonizadora, usando-se célulasfagocíticas. De acordo com esta concretização, uma vez que se hajaproporcionado uma seleção enriquecida de moléculas de IgIV de acordo coma invenção, referida coleção é incubada, de preferência, com uma proteínadobrada incorretamente e/ou uma estrutura β cruzada e/ou uma proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada, onde, após complexos de moléculasde IgIV ligados a uma proteína dobrada incorretamente e/ou uma estrutura βcruzada e/ou uma proteína compreendendo uma estrutura β cruzada teremsido contactados subseqüentemente com uma célula fagocítica para sedeterminar quais moléculas de IgIV são capazes de induzir e/ou incrementarfagocitose de referida proteína dobrada incorretamente e/ou estrutura βcruzada e/ou proteína compreendendo uma estrutura β cruzada.Evidentemente também é possível realizar o mesmo tipo de teste commoléculas sintéticas ou recombinantes isoladas de acordo com a invenção.Proporciona-se adicionalmente um método para selecionar dentre umacoleção de moléculas de IgIV de acordo com a invenção, ou de umacomposição de acordo com a invenção, uma molécula compreendendo umaregião de afinidade que é capaz, ao interagir com uma proteína dobradaincorretamente e/ou um epítopo de a estrutura β cruzada e/ou ao interagir comum epítopo de uma proteína compreendendo uma estrutura β cruzada, deinduzir opsonização de referida proteína dobrada incorretamente e/ouestrutura β cruzada e/ou uma proteína compreendendo uma estrutura βcruzada, por meio de uma célula fagocítica, em que referido métodocompreende:

- contactar uma coleção de moléculas de IgIV de acordo com ainvenção, e/ou uma composição de acordo com a invenção, com uma proteínadobrada incorretamente e/ou uma estrutura β cruzada e/ou com uma proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada;

- contactar qualquer complexo compreendendo uma proteínadobrada incorretamente e/ou uma estrutura β cruzada e/ou uma proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada, ligada a uma molécula de IgIV e/oua uma molécula sintética, e/ou recombinante isolada, com uma célulafagocítica; e

- coletar uma molécula de IgIV e/ou molécula isolada,sintética e/ou recombinante que é capaz de induzir ou incrementar fagocitose,por meio de uma célula fagocítica, de referida proteína dobradaincorretamente e/ou estrutura β cruzada e/ou uma proteína compreendendouma estrutura β cruzada.

Referido teste é realizado, de preferência, in vitro. Moléculasde IgIV selecionadas e/ou isoladas, moléculas sintéticas ou recombinantescapazes de induzir ou incrementar fagocitose são usadas, de preferência parapara induzir e/ou incrementar a opsonização de proteínas dobradasincorretamente e/ou estruturas β cruzadas e/ou proteínas compreendendo umaestrutura β cruzada que são capazes de resistir e/ou escapar da fagocitose.

Referidas proteínas dobradas incorretamente e/ou estruturas β cruzadas e/ouproteínas compreendendo uma estrutura β cruzada capazes de resistir e/ouescapar fagocitose, por exemplo, ocorrem em estados de doença em quemoléculas capazes de induzir ou incrementar fagocitose estão ausentes oupresentes em níveis reduzidos (funcionais), como por exemplo, na AIDS,SCIDS e α-gamaglobulinemia, e, por exemplo, em estados de doença em quea formação de proteínas dobradas incorretamente e/ou estruturas β cruzadase/ou proteínas compreendendo uma estrutura β cruzada é incrementada como,por exemplo, na encefalite espongiforme transmissível (TSE, transmissiblespongiform encephalopathy), amiloidoses, diabetes, trombose e inflamação.

Como descrito acima, proteínas dobradas incorretamente e/ouestruturas β cruzadas em proteínas estão freqüentemente relacionadas com,e/ou associadas com, um risco e/ou presença de doença, como por exemplo,doença de Huntington, doença de tipo amiloidose, aterosclerose, diabetes,sangramento, trombose, câncer, sépsis e outras doenças inflamatórias, artritereumatóide, encefalopatias espongiformes transmissíveis, como doença deCreutzfeldt-Jakob, esclerose múltipla, doenças autoimunes, doençasassociadas com perda de memória, como doença de Alzheimer, mal deParkinson e outras doenças neuroniais (epilepsia), encefalopatia e amiloidosessistêmicas. Uma coleção enriquecida de moléculas de IgIV de acordo com ainvenção e uma coleção de moléculas sintéticas ou recombinantes, isoladas,de acordo com a invenção, capazes de ligar-se especificamente a uma proteínadobrada incorretamente e/ou estruturas β cruzadas e/ou proteínascompreendendo uma estrutura β cruzada, são particularmente vantajosas paraprevenir e/ou tratar, pelo menos em parte, referidas doenças relacionadas e/ouassociadas com proteína dobrada incorretamente e/ou estrutura β cruzada.Assim, uma concretização proporciona uma coleção de moléculas de IgIV deacordo com a invenção e/ou uma composição de acordo com a invenção parauso como uma medicamento e/ou agente profilático. A invenção proporcionaadicionalmente um uso de uma coleção de moléculas de IgIV e/ou de umacomposição de acordo com a invenção para a preparação de umamedicamento e/ou agente profilático. Em que referida medicamento e/ouagente profilático é particularmente vantajoso para prevenir, tratar e/ouestabilizar, pelo menos parcialmente, doenças que estão relacionadas e/ouassociadas com a ocorrência de proteínas dobradas incorretamente e/ouestruturas β cruzadas, desordens da coagulação do sangue, sépsis, inflamação,e/ou uma infecção por um micróbio, patógeno, bactéria, parasita e/ou vírus.Proporciona-se adicionalmente um uso de uma coleção de moléculas de IgIVde acordo com a invenção e/ou uma composição de acordo com a invençãopara a fabricação de uma droga para a prevenção e/ou o tratamento, pelomenos parcial, de uma doença relacionada e/ou associada com proteínadobrada incorretamente e/ou estrutura β cruzada, uma desordem dacoagulação do sangue, sépsis, inflamação e/ou uma infecção pormicróbio/patógeno/parasita/bactéria/vírus. Proporciona-se aqui também ummétodo para a prevenção e/ou tratamento, pelo menos parcial, de uma doençarelacionada e/ou associada com proteína dobrada incorretamente e/ouestrutura β cruzada, uma desordem da coagulação do sangue, sépsis e/ou umainfecção por micróbio, patógeno, parasita, bactéria, vírus em um indivíduo,compreendendo administrar uma coleção de moléculas de IgIV de acordocom a invenção e/ou uma composição de acordo com a invenção a referidoindivíduo.

Em uma concretização preferida referida infecção pormicróbio/patógeno/parasita/bactéria/vírus compreende uma infecçãooportunista. Esta é uma infecção por um organismo, como por exemplo, umpatógeno e/ou vírus que, ordinariamente, não causa doença, mas que, emdeterminadas circunstâncias, (como um sistema imunológico prejudicado),torna-se patogênica. Um sistema imunológico prejudicado é causado, porexemplo, por medicação, como quimioterapia. Em uma concretizaçãoparticularmente preferida, referida infecção pormicróbio/patógeno/parasita/bactéria/vírus compreende uma infecçãooportunista relacionada com HIV.

Como infecções oportunistas são a causa principal de morteem pacientes com HIV, é altamente desejáel proporcionar drogas e/ou agentesprofiláticos contra referidas infecções. Muitas infecções oportunistasenvolvem a presença de uma proteína dobrada incorretamente e/ou umaestrutura β cruzada. Por exemplo, estruturas amilóides ocorrem na superfíciede organismos microbianos, como fungos, leveduras e bactérias. Referidasestruturas similares a amilóide são denominadas, geralmente, hidrofobinas emfungos, chaplins em bactérias gram-positivas, e curli ou tafi ou fímbriasagregativas em bactérias gram-negativas. Como um coleção enriquecida demoléculas de IgIV de acordo com a invenção e uma coleção de moléculassintéticas ou recombinantes, isoladas, de acordo com a invenção sãoparticularmente vantajosas para ligação de referidas proteínas dobradasincorretamente e/ou estruturas β cruzadas e/ou proteínas compreendendo umaestrutura β cruzada, referidas coleções da invenção são particularmentevantajosas para neutralizar e/ou prevenir, pelo menos em parte, infecçõesoportunistas relacionadas com HIV. Portanto, a invenção proporciona ummétodo para a prevenção e ou tratamento pelo menos parcial de uma infecçãooportunista relacionada com HIV em um indivíduo, compreendendoadministrar uma coleção de moléculas de IgIV de acordo com a invenção e/ouuma composição de acordo com a invenção a referido indivíduo.

Uma composição compreendendo uma coleção de moléculasde IgIV de acordo com a invenção e/ou uma composição de acordo com ainvenção e um carreador, diluente e/ou excipiente vantajoso também éproporcionada aqui. Referida composição compreende, de preferência, umacomposição farmacêutica. Para ser capaz de administrar uma droga de acordocom a presente invenção a um paciente que necessita de tratamento, referidadroga precisa preencher as necessidades de uma formulaçãofarmaceuticamente aceitável. Isto significa que uma droga de acordo com ainvenção compreende uma coleção enriquecida de moléculas de IgIV deacordo com a invenção e/ou uma coleção de moléculas sintéticas ourecombinantes, isoladas, de acordo com a invenção que são de graufarmacêutico, fisioligamente aceitáveis e testadas quanto a agentes estranhos.

Proporciona-se também uma composição farmacêutica compreendendo umacoleção enriquecida de moléculas de IgIV de acordo com a invenção e/ouuma coleção de moléculas sintéticas ou recombinantes, isoladas, de acordocom a invenção e um carreador, diluente e/ou excipiente farmaceuticamenteaceitável. De preferência, referida composição compreende uma proteínadobrada incorretamente e/ou composto de ligação de estrutura β cruzada paraincrementar a interação de referida composição farmacêutica com umaproteína dobrada incorretamente e/ou uma estrutura β cruzada e/ou com umaproteína compreendendo uma estrutura β cruzada. Portanto, a invençãoproporciona um composição de acordo com a invenção compreendendoadicionalmente uma proteína dobrada incorretamente e/ou composto deligação de estrutura β cruzada. Em uma concretização preferida adicional dainvenção, a ligação de uma composição de acordo com a invenção a umaproteína dobrada incorretamente e/ou uma estrutura β cruzada e/ou a umaproteína compreendendo uma estrutura β cruzada é icrementada oupotencializada adicionalmente por meio da adição de um composto que éconhecido por suas características potencializadoras de proteína dobradaincorretamente e/ou de ligação de estrutura β cruzada, como por exemplo,moléculas de corante, como Tioflavina T ou Tioflavina S. Portanto, a presenteinvenção revela um composição de acordo com a invenção compreendendoadicionalmente uma proteína dobrada incorretamente e/ou composto depotencialização de ligação de estrutura β cruzada.

Em outra concretização preferida, a remoção de proteínasdobradas incorretamente e/ou estruturas β cruzadas e/ou proteínascompreendendo uma estrutura β cruzada de um corpo é incrementadamediante a adição, a uma composição de acordo com a invenção [de] sinaispotencializadores de complemento capazes de incrementar a ativação decomplemento. Portanto, a invenção proporciona uma composição de acordocom a invenção, compreendendo adicionalmente um compostopotencializador de complemento.

Como a ativação do sistema de complemento resultados numacascata de reações, incluindo inflamação, destruição de células e danotissular, por vezes deseja-se neutralizar, pelo menos em parte, a ativação decomplemento. Em alguns casos, a ativação do sistema de complemento comrelação à eliminação de proteínas dobradas incorretamente e/ou estruturas βcruzadas causa, por si só, doença. Em referidos casos, uma composição deacordo com a invenção compreende adicionalmente, e de preferência, um umcomposto inibidor de complemento. Em uma concretização, uma composiçãode acordo com a invenção compreende um composto supressor deinflamação.

A presente invenção proporciona adicionalmente meios emétodos para incrementar a degradação de proteína extracelular e/ou aeliminação de proteína em um indivíduo. Em uma situação natural, aformação de uma proteína dobrada incorretamente e/ou estruturas β cruzadasinicia e/ou participa de uma cascata de eventos fisiológicos, lidando com aremoção de moléculas indesejadas, como por exemplo, proteínas dobradaincorretamente s, células apoptóticas ou ainda patógenos. Esta via regula aremoção de biomoléculas indesejadas durante diversos processos, incluindodobramento incorreto de proteína durante a síntese no retículoendoplasmático, fibrinólise, formação de redes sinápticas neuroniais,eliminação de proteínas usadas, indesejadas e/ou destruídas (desnaturadas),indução de apoptose e eliminação de células apoptóticas, células necróticas,células envelhecidas e/ou patógenos. Como uma coleção de moléculas deIgIV de acordo com a invenção e uma composição de acordo com a invençãosão particularmente vantajosas para a ligação de proteínas dobradasincorretamente e/ou estruturas β cruzadas e proteínas compreendendoestruturas β cruzadas, aumenta-se a degradação de proteína extracelular e/ou aeliminação de proteína. Portanto, proporciona-se também um método paraincrementar a eliminação de proteína e/ou degradação de proteína extracelularem um indivíduo, compreendendo administrar uma coleção de moléculas deIgIV de acordo com a invenção e/ou uma composição de acordo com ainvenção a referido indivíduo.

Por meio de ligação e remoção de proteínas dobradasincorretamente e/ou estruturas β cruzadas e proteínas compreendendoestruturas β cruzadas, uma coleção de moléculas de IgIV de acordo com ainvenção e uma composição de acordo com a invenção é capaz neutralizar,pelo menos em parte, efeitos mediados por proteína dobrada incorretamentee/ou estrutura β cruzada em um indivíduo. Adicionalmente, proporciona-se,portanto, um método para inibir, pelo menos em parte, efeitos mediados porproteína dobrada incorretamente e/ou estrutura β cruzada em um indivíduo,compreendendo administrar uma quantidade efetiva de uma coleção demoléculas de IgIV de acordo com a invenção e/ou a composição de acordocom a invenção a um indivíduo.

Em uma concretização preferida, uma coleção de moléculas deIgIV de acordo com a invenção e/ou uma composição de acordo com ainvenção é usada para inibir a agregação de plaquetas que é induzida porproteínas dobradas incorretamente e/ou proteínas compreendendo umaestrutura β cruzada. Um exemplo de referido uso é mostrado no Exemplo 2,portanto, a invenção proporciona um uso de uma coleção de moléculas deIgIV de acordo com a invenção e/ou uma composição de acordo com ainvenção para para inibir a agregação de plaquetas no sangue induzida porproteína.

Em outra concretização preferida, uma coleção de moléculasde IgIV de acordo com a invenção e/ou uma composição de acordo com ainvenção é usada para a ligação competitiva do ativador de plasminogênio detipo tissular (tPA) de serina protease a uma proteína dobrada incorretamentee/ou uma estrutura β cruzada e/ou a uma proteína compreendendo umaestrutura β cruzada. tPA induz a formação de plasmina através da clivagemdo plasminogênio. A plasmina cliva fibrina e isto ocorre durante a Iise de umcoágulo sangüíneo. Embora não essencial para a fibrinólise em camundongos,tPA tem sido reconhecido por seu papel na fibrinólise durante um longoperíodo. A ativação de plasminogênio por tPA é estimulada pela fibrina oufragmentos de fibrina, mas não por seu precursor, o fibrinogênio. tPA é umaproteína dobrada incorretamente e proteína de ligação de estrutura β cruzada,um receptor de multi-ligantes e um membro da via de estrutura β cruzada.tPA media uma toxicidade celular e/ou disfunção celular induzida porproteína dobrada incorretamente e/ou estrutura β cruzada. tPA média, pelomenos em parte, a toxicidade e/ou a disfunção celular por meio da ativação deplasminogênio. Os efeitos dependentes de plasminogênio são inibidos poruma coleção de moléculas de IgIV de acordo com a invenção e/ou umacomposição de acordo com a invenção. A ativação de plasminogênio/tPAdescontrolada ou excessiva durante um estado de doença é tratada destamaneira. Exemplos não-limitantes de referidos estados de doença são doençade Alzheimer, infecções, pré-eclâmpsia, angina pectoris, doençasinflamatórias e não-inflamatórias das juntas, e diabetes.

Uma concretização preferida proporciona um uso de umacoleção de moléculas de IgIV e/ou de uma composição de acordo com ainvenção para a remoção, pelo menos parcial, de uma proteína dobradaincorretamente e/ou estruturas β cruzadas e/ou proteínas compreendendo umaestrutura β cruzada de uma amostra. A remoção de uma proteína dobradaincorretamente e/ou estruturas β cruzadas e/ou proteínas compreendendo umaestrutura β cruzada é desejada em uma variedade de aplicações. Por exemplo,se um indivíduo estiver sofrendo de, ou em risco de sofrer de, um distúrbiorelacionado com e/ou associada com a presença de uma proteína dobradaincorretamente e/ou uma estrutura β cruzada, a remoção de referida proteínadobrada incorretamente e/ou estrutura β cruzada do corpo é benéfica paraneutralizar referido distúrbio e/ou para aliviar efeitos colaterais adversos.Além disso, é vantajoso remover proteínas dobradas incorretamente e/ouestruturas β cruzadas e/ou proteínas compreendendo uma estrutura β cruzadade produtos destinados ao consumo (humano) para evitar, pelo menos emparte, a absorção de proteínas dobradas incorretamente e/ou estruturas βcruzadas. Assim, uma concretização proporciona um método para remover,pelo menos parcialmente, proteínas dobradas incorretamente e/ou estruturas βcruzadas e/ou proteínas compreendendo uma estrutura β cruzada de umaamostra, em que referido método compreende contactar uma amostra comuma coleção de moléculas de IgIV de acordo com a invenção e/ou umacomposição de acordo com a invenção, e remover de referida amostraquaisquer complexos de uma proteína dobrada incorretamente e/ou estruturasβ cruzadas, e/ou proteínas compreendendo uma estrutura β cruzada, ligada auma molécula de IgIV e/ou uma molécula isolada, sintética e/ourecombinante. Referida amostra compreende, de preferência, uma amostra defluido. Em uma concretização, referido fluido compreende uma substânciaalimentícia.

Em uma concretização preferida, referida amostra compreendeum fluido corporal. Esta concretização é particularmente vantajosa paraprevenir e/ou tratar, pelo menos em parte, um distúrbio relacionado e/ouassociado com uma proteína dobrada incorretamente e/ou estrutura β cruzada,de um animal, de preferência, de um indivíduo humano. Em umaconcretização preferida aplica-se diálise extracorpórea. Por exemplo, umpaciente que sofre de uma desordem associada e/ou relacionada com umaproteína dobrada incorretamente e/ou estrutura β cruzada é submetido àdiálise de seu sangue. Uma coleção de moléculas de IgIV e/ou umacomposição de acordo com a invenção é acoplada, por exemplo, a umcarreador ou suporte e/ou no interior de um tubo usado para diálise. Destamaneira, proteínas dobradas incorretamente e/ou estruturas β cruzadas eproteínas compreendendo uma estrutura β cruzada serão removidas do fluxosangüíneo de referido paciente, aliviando com isto, pelo menos me parte,referido paciente de efeitos negativos relacionados com, e/ou associados com,referidas proteínas dobradas incorretamente e/ou estruturas β cruzadas e/ouproteínas compreendendo uma estrutura β cruzada. Como outro exemplo,referido uso é aplicado na hemodiálise de pacientes com problema de rim.Proporciona-se também um dispositivo de separação para realizar um métodode acordo com a invenção. Assim, uma concretização proporciona umdispositivo de separação para realizar um método de acordo com a invenção,em que referido dispostivo compreende um sistema para transportar fluidos(circulantes), em que referido sistema é dotado com meios para conectar-se aum fluido em estado de fluxo, de preferência, à circulação de um circulação,meios para entrada de fluido no referido sistema, e retorno do fluido doreferido sistema, de preferência, à circulação do referido indivíduo, referidosistema compreende adicionalmente uma fase sólida, em que referida fasesólida compreende uma coleção de moléculas de IgIV de acordo com ainvenção e/ou uma composição de acordo com a invenção. Referidodispositivo de separação compreende, de preferência, um aparelho de diálise.

Outra concretização preferida proporciona o uso de umacoleção de moléculas de IgIV e uma composição de acordo com a invençãopara a remoção, pelo menos parcial, de proteínas dobradas incorretamentee/ou estruturas β cruzadas e/ou proteínas compreendendo uma estrutura βcruzada de um farmacêutica ou qualquer de seus constituintes. Categoriasimportantes de composições farmacêuticas hodiernas compreendendo umaproteína ou um composto proteináceo como uma substância ativa incluem,embora sem limitação, hormônios, enzimas, vacinas e antígenos, citocinas eanticorpos. Adicionalmente às composições farmacêuticas de proteínaindicadas acima, é possível fabricar um grande número de composiçõesfarmacêuticas com o auxilio de uma etapa de produção e/ou purificaçãocompreendendo proteínas. Por exemplo, muitas composições farmacêuticascompreendem uma ou mais proteínas como um agente estabilizador.Problemas de saúde relacionados com o uso de composições farmacêuticassão relacionadas, por exemplo, com os campos da hematologia, fibrinólise eimunologia. Uma lista incompleta efeitos colaterais observados após aadministração de composições farmacêuticas compreende, por exemplo,febre, respostas anafiláticas, respostas (auto)imunes, perturbação dahemóstase, inflamação, problemas fibrinolíticos, incluindo sépsis ecoagulação intravascular disseminada (DIC disseminated intravascularcoagulation), que pode ser fatal. Referidos efeitos colaterais são causados, porexemplo, ou por uma alteração de uma proteína ou um composto de proteínapresente em referida pharmaceutical composição, ou por adição de diluentesou de substâncias-carreador de referida composição farmacêutica. Alteraçãode um composto de proteína de uma composição farmacêutica compreende,por exemplo, desnaturação, multimerização, proteólise, acetilação, glicação,oxidação, desdobramento ou dobramento incorreto de proteínas.

Desdobramento ou dobramento incorreto de proteínas nativas dobradasinicialmente de forma apropriada leva à formação de estruturas tóxicas emreferidas proteínas. Estruturas tóxicas de composições farmacêuticasfreqüentemente compreendem proteínas dobradas incorretamente e/ouestruturas β cruzadas. Referidas estruturas tóxicas são removidas, pelo menosem parte, com uma coleção de moléculas de IgIV e/ou uma composição deacordo com a invenção.

Proporciona-se aqui, portanto, um método para remover umaproteína dobrada incorretamente e/ou uma estrutura β cruzada e/ou proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada de uma composição farmacêutica ouqualquer um de seus constituintes compreendendo uma proteína, em quereferido método compreende:

- contactar referida composição farmacêutica ou qualquer umde seus constituintes compreendendo uma proteína com uma coleção demoléculas de IgIV de acordo com a invenção e/ou com uma composição deacordo com a invenção;

- permitir a ligação de referida proteína dobradaincorretamente e/ou estrutura β cruzada e/ou proteína compreendendo umaestrutura β cruzada a referida coleção de moléculas de IgIV e/ou composição;e

- separar proteína dobrada incorretamente e/ou estrutura βcruzada ligada e/ou proteína ligada compreendendo uma estrutura β cruzadade referida composição farmacêutica ou qualquer um de seus constituintescompreendendo uma proteína.

Por meio de remoção de uma proteína dobrada incorretamentee/ou uma estrutura β cruzada e/ou uma proteína compreendendo umaestrutura β cruzada de uma composição farmacêutica, efeitos colateraisindesejados são, pelo menos em parte, reduzidos e/ou evitados. Portanto,proporciona-se também um método para reduzir e/ou prevenir efeitoscolaterais indesejados de uma composição farmacêutica e/ou incrementar aatividade específica por grama de proteína, em que referido métodocompreende remover uma proteína não-dobrada, um peptídeo não-dobrado,uma proteína dobrada incorretamente , uma proteína desnaturada, umaproteína agregada, um peptídeo agregado, uma proteína multimerizada e/ouum peptídeo multimerizado, e/ou um peptídeo compreendendo uma estruturaβ cruzada, de referida composição farmacêutica ou qualquer um de seusconstituintes, usando-se um método de acordo com a invenção.

Proporciona-se também uma composição farmacêutica ouqualquer um de seus constituintes compreendendo uma proteína, obtenívelpor meio de um método de acordo com a invenção. Referida composiçãofarmacêutica envolve um risco reduzido de efeitos colaterais indesejados, emcomparação com composições farmacêuticas não-tratadas.

Em uma concretização, uma proteína dobrada incorretamentee/ou uma estrutura β cruzada e/ou proteína compreendendo uma estrutura βcruzada é removida de uma amostra usando-se uma coleção de moléculas deIgIV e/ou uma composição de moléculas sintéticas ou recombinantes,isoladas, de acordo com a invenção, em que referida coleção e/ou composiçãoé ligado a um suporte sólido. Isto proporciona a vantagem de tornar possívelum processo contínuo, em que referido suporte sólido é incubado com umaamostra. Subseqüentemente, referida amostra e referido suporte sólido sãofacilmente separados um do outro, em que referido suporte sólidocompreende proteínas dobradas incorretamente e/ou estruturas β cruzadase/ou proteínas compreendendo uma estrutura β cruzada que são ligados(indiretamente), enquanto que a amostra resultante apresenta umaconcentração menor de proteínas dobradas incorretamente e/ou estruturas βcruzadas e/ou proteínas compreendendo uma estrutura β cruzada.

Em outra concretização adicional, uma imunoglobulina IgIVselecionada e/ou uma molécula isolada, sintética e/ou recombinante de acordocom a invenção é usada para preparar um kit de diagnóstico. Referido kit dediagnóstico é particularmente vantajoso para o diagnóstico de uma doençaque é relacionada e/ou associada com a presença de proteínas dobradasincorretamente e/ou estruturas β cruzadas. Referido kit compreende, depreferência, pelo menos uma região de afinidade de uma coleção demoléculas de IgIV de acordo com a invenção, e/ou pelo menos uma região deafinidade de uma composição de acordo com a invenção, capaz de interagircom uma proteína dobrada incorretamente e/ou uma estrutura β cruzada e/oucom uma proteína compreendendo uma estrutura β cruzada, e um modo devisualização de uma interação de referida proteína dobrada incorretamentee/ou estrutura β cruzada e/ou referida proteína com referida região deafinidade.

Com referido kit de diagnóstico, é possível diagnosticar não sódoenças que são geralmente relacionadas e/ou associadas com a presença deproteínas dobradas incorretamente e/ou estruturas β cruzadas, mas também épossível um diagnóstico mais definido, dependendo da especificidade dasregiões de afinidade no kit. Um kit de diagnóstico capaz de diagnosticarespecificamente um tipo de desordem é gerado, por exemplo, dotando-sereferido kit com regiões de afinidade que são capazes de se ligaremespecificamente a uma dada proteína dobrada incorretamente e/ou estrutura βcruzada e/ou uma dada proteína compreendendo uma estrutura β cruzada queé específica para referido um tipo de desordem, como por exemplo, proteínasrelacionadas com artrite reumatóide, SLE ou outras doenças autoimunes, oureações inflamatórias. Portanto, em uma concretização, a invençãoproporciona um kit de diagnóstico como descrito acima, em que referidaproteína dobrada incorretamente e/ou estrutura β cruzada é uma proteínadobrada incorretamente e/ou estrutura β cruzada relacioanda com doença.

Como proteínas dobradas incorretamente e/ou estruturas βcruzadas e proteínas compreendendo uma estrutura β cruzada são ligadasefetivamente a uma coleção de moléculas de IgIV de acordo com a invençãoe/ou a uma composição de acordo com a invenção, elas são separadas e/ouisoladas efetivamente de uma amostra e/ou do corpo de um animal ou humanoe subseqüentemente identificadas. Assim, em outra concretização adicional,usa-se uma imunoglobulina IgIV selecionada e/ou uma molécula isolada,sintética e/ou recombinante de acordo com a invenção para isolar proteínasdobradas incorretamente e/ou estruturas β cruzadas e/ou proteínascompreendendo uma estrutura β cruzada. De preferência, identifica-seproteínas dobradas incorretamente e/ou estruturas β cruzadas e/ou proteínascompreendendo uma estrutura β cruzada presentes em um fluido corporal,como por exemplo, sangue, soro, plasma, fluido cérebro-espinhal, fluidosinovial, saliva e/ou urina. Por exemplo, a presença e/ou identidade de umaproteína dobrada incorretamente e/ou de uma estrutura β cruzada, e/ouproteína compreendendo uma estrutura β cruzada, de indivíduos saudáveis écomparada com a presença e/ou identidade de uma proteína dobradaincorretamente e/ou uma estrutura β cruzada, e/ou proteína compreendendouma estrutura β cruzada, de indivíduos com uma doença relacionada e/ouassociada com uma proteína dobrada incorretamente e/ou uma estrutura βcruzada e/ou uma proteína compreendendo uma estrutura β cruzada. Aidentidade e a concentração relativa de uma proteína dobrada incorretamentee/ou uma estrutura β cruzada e/ou proteína compreendendo uma estrutura βcruzada é determinada usando-se qualquer método conhecida a uma pessoaversada na arte, como por exemplo, mas sem limitação, eletroforese em gel2D e/ou análises espectrométricas de massa. De preferência, compara-se osresultados de uma amostra que se origina de um indivíduo saudável e umaamostra que se origina de um paciente. Desta forma obtém-se informação, porexemplo acerca da identidade e/ou suscetibilidade de proteínas propensas adobramento incorreto e/ou a adotarem conformação de estrutura β cruzadadurante estados de doença definidos. Esta informação obtida servesubseqüentemente como uma ferramenta de diagnóstico, por exemplo, paramonitorar estado de doença, para monitorar a efetividade da terapia, paramonitorar a ocorrência de doença, e proporciona valiosas pistas para odesenvolvimento de terapêuticos objetivados a proteínas dobradasincorretamente e/ou estruturas β cruzadas e/ou proteína(s) compreendendouma estrutura β cruzada que, de preferência, são específicos para uma doençadefinida.

Assim, a invenção proporciona um método para adeterminação da identidade de uma proteína dobrada incorretamente e/ou umaestrutura β cruzada ou uma proteína compreendendo uma estrutura β cruzadaem uma amostra compreendendo uma proteína, em que referido métodocompreende:

- contactar referida amostra com uma coleção de moléculas deIgIV de acordo com a invenção, e/ou uma composição de acordo com ainvenção, resultando em proteínas dobradas incorretamente ligadas e/ouestruturas β cruzadas e/ou proteína(s) ligadas compreendendo uma estrutura βcruzada, e

- identificar uma proteína dobrada incorretamente e/ouestrutura β cruzada ligada e/ou uma proteína ligada compreendendo umaestrutura β cruzada. Referida proteína dobrada incorretamente ligada e/ouestrutura β cruzada e/ou proteína ligada compreendendo uma estrutura βcruzada é identificada, de preferência, analisando-se pelo menos parte daseqüência de aminoácidos de referida proteína dobrada incorretamente e/ouestrutura β cruzada e/ou proteína usando-se qualquer método conhecido naarte. Referida amostra compreende, de preferência, uma solução aquosa, maispreferivelmente um fluido corporal. Em uma concretização preferida, fluidoscorporais que se originam de indivíduos saudáveis (de preferência, humanos)e fluidos corporais que se originam de indivíduos que sofrer de, ou quesuspeita sofrerem de, uma doença relacionada e/ou associada com a presençade uma proteína dobrada incorretamente e/ou uma estrutura β cruzada, sãousados para comparar um estado saudável com um estado de doença (ou umestado em que o risco de doença é incrementado).

Como a presente invenção proporciona uma maneira deselecionar dentre uma coleção de IgIV aquelas imunoglobulinas queapresentam regiões de afinidade capazes de interagir com uma proteínadobrada incorretamente e/ou uma estrutura β cruzada e/ou com uma proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada, uma pessoa versada na arte agoratambém será capaz de usar referida IgIV selecionada, e/ou moléculassintéticas ou recombinantes, isoladas, de acordo com a invenção, paradeterminar se uma proteína ou peptídeo que é dobrado incorretamente e/ouque compreende uma estrutura β cruzada está presente em uma amostra.Proporciona-se, portanto, um método para determinar se uma proteínadobrada incorretamente e/ou uma proteína e/ou peptídeo compreendendo umaestrutura β cruzada está presente em uma solução aquosa compreendendouma proteína, em que referido método compreende:

- contactar referida solução aquosa com uma coleção demoléculas de IgIV de acordo com a invenção, e/ou uma composição deacordo com a invenção, e

- detectar se proteína dobrada incorretamente ligada e/ouproteína e/ou peptídeo ligado compreendendo uma estrutura β cruzada estápresente. Referida proteína e/ou peptídeo é detectado, de preferência, em umasolução aquosa contactando-se referida solução aquosa com uma coleção e/oucomposição da invenção e detectando-se peptídeos e/ou proteínas ligadas.

Assim, proporciona-se um método para detectar uma proteína dobradaincorretamente e/ou uma proteína e/ou peptídeo compreendendo umaestrutura β cruzada em uma solução aquosa compreendendo uma proteína, emque referido método compreende contactar referida solução aquosa com umacoleção de moléculas de IgIV de acordo com a invenção, e/ou umacomposição de acordo com a invenção, resultando em proteína dobradaincorretamente ligada e/ou uma proteína e/ou peptídeo ligado compreendendouma estrutura β cruzada, e detectar proteína dobrada incorretamente ligadae/ou proteína e/ou peptídeo ligado compreendendo uma estrutura β cruzada.

A ligação de referida coleção e/ou composição da invenção a uma proteínadobrada incorretamente e/ou uma estrutura β cruzada é detectada, depreferência, por meio de uma reação de visualização como, por exemplo,manchamento fluorescente ou uma detecção enzimática ou colorimétrica, oupor meio de qualquer outro sistema de visualização disponível a uma pessoaversada na arte.

Referida solução aquosa compreende, de preferência, umdetergente, um produto alimentício, um suplemento alimentar, um meio decultura de células, uma solução de proteína comercialmente obtenível usadapara fins de pesquisa, sangue, um produto de sangue, um fluido corporal,como por exemplo, urina, fluido cérebro-espinhal, fluido sinovial, fluidolinfático e/ou saliva, um produto cosmético, uma célula, uma composiçãofarmacêutica ou qualquer um de seus constituintes compreendendo umaproteína, ou uma combinação de qualquer um destes.Um uso de uma coleção de moléculas de IgIV de acordo com ainvenção, e/ou uma composição de acordo com a invenção, para determinar apresença de proteína dobrada incorretamente e/ou proteínas com umaestrutura β cruzada depositadas acumuladas, também é proporcionado aqui.

De preferência, detecta-se a presença de uma proteína dobrada incorretamenteenvolvida em uma doença conformacional. Uma doença conformacional édefinida como uma doença que é causada, relacionada e/ou associada comdobramento incorreto de proteínas e/ou modificação conformacional deproteínas.

Uma concretização compreende adicionalmente a detecção daquantidade de uma proteína dobrada incorretamente e/ou uma estrutura βcruzada e/ou uma proteína compreendendo uma estrutura β cruzada em umacomposição. Isto é realizado, por exemplo, de forma a determinar o curso deuma doença. Adicionalmente, proporciona-se um método para determinar aquantidade de uma proteína dobrada incorretamente e/ou uma estrutura βcruzada e/ou proteína compreendendo uma estrutura β cruzada em umacomposição, de preferência, em uma droga e/ou vacina, compreendendocontactar referida composição com uma coleção de moléculas de IgIV deacordo com a invenção, e/ou com uma composição de acordo com a invenção,e relacionar a quantidade de proteína dobrada incorretamente ligada e/ouestruturas β cruzadas e/ou proteínas compreendendo uma estrutura β cruzadaà quantidade de estruturas β cruzadas e/ou proteínas compreendendo umaestrutura β cruzada presentes em referida composição.

Como proteínas dobradas incorretamente e/ou proteínascompreendendo uma estrutura β cruzada são ligadas efetivamente a umacoleção de moléculas de IgIV de acordo com a invenção e a uma composiçãode acordo com a invenção, elas são removidas efetivamente de uma amostrae/ou do corpo de um animal (dep, grupo um corpo humano). Desta maneira, oacúmulo de proteínas dobradas incorretamente é diminuído. Assim,proporciona-se adicionalmente um uso de uma coleção de moléculas de IgIVde acordo com a invenção, e/ou uma composição de acordo com a invenção,para diminuir o acúmulo de proteína dobrada incorretamente e/ou proteínascompreendendo uma estrutura β cruzada. Referida proteína dobradaincorretamente e/ou proteínas compreendendo uma estrutura β cruzada estãoenvolvidas, de preferência, e uma doença conformacional. A diminuição doacúmulo de referidas proteínas resulta no alívio de sintomas de referidadoença conformacional e/ou pelo menos tratamento e/ou prevenção parcial docurso da doença. Referida doença conformacional compreende, depreferência, uma doença de tipo amiloidose, aterosclerose, diabetes,sangramento, trombose, câncer, sépsis e outras doenças inflamatórias, artritereumatóide, encefalopatias espongiformes transmissíveis, esclerose múltipla,doenças auto-imunes, doença associada com perda de memória ou mal deParkinson e outras doença neuroniais (epilepsia), encefalopatia, e/oureumatismo.

A coagulação do sangue e a formação de coágulos sangüíneostambém envolvem a presença de uma proteína dobrada incorretamente e/ouestruturas β cruzadas. Exemplos do papel de proteínas dobradasincorretamente e/ou proteínas (dobrada incorretamente s) compreendendoestruturas β cruzadas compreendem a ativação de plaquetas e a indução daagregação de plaquetas e aglutinação, ativação do endotélio resultando emexpressão de fator de tecido e exposição a sangue, resultando em coagulaçãodo sangue, e ativação do sistema de contato da coagulação do sangue viaativação de fator XII. Adicionalmente, durante a coagulação do sangueformam-se polímeros de fibrina com conformação de estrutura β cruzada. Obloco construtivo de estrutura β cruzada de uma rede de fibrina servesubseqüentemente como o sítio de ligação para tPA para localizar tPA no sítioem que se requer a atividade fibrinolítica. Como a coleção e composição deacordo com a invenção são capazes de ligar especificamente e/ou removerproteínas dobradas incorretamente e/ou estruturas β cruzadas e/ou proteínascompreendendo estruturas β cruzadas, em que referida coleção e composiçãosão particularmente vantajosas para interferir na coagulação do sangue e/ouna formação de coágulos e/ou ativação de fator de tecido. Proporciona-seadicionalmente um método para interferir na coagulação do sangue e/ou naformação de coágulos compreendendo dotar o sangue com uma coleção demoléculas de IgIV de acordo com ã invenção, e/ou uma composição deacordo com a invenção.

Proporciona-se também um método para determinar umadiferença no teor de estrutura β cruzada de uma proteína em uma amostra dereferência, em comparação com o teor de estrutura β cruzada de referidaproteína em uma amostra de teste, em que referida amostra de teste foisubmetida a um tratamento que se espera exercer um efeito sobre o teor deestrutura β cruzada de referida proteína, em que o método compreende:

- determinar em uma amostra de referência o teor de estruturaβ cruzada de uma proteína ussando-se uma coleção de moléculas de IgIV deacordo com a invenção e/ou uma composição de acordo com a invenção;

- submeter referida proteína a um tratamento que se esperaexercer um efeito sobre o teor de estrutura β cruzada de referida proteína,obtendo-se uma amostra de teste;

- determinar na amostra de teste obtida o teor de estrutura βcruzada de referida proteína usando-se uma coleção de moléculas de IgIV deacordo com a invenção, e/ou uma composição de acordo com a invenção; e

- determinar se o teor de estrutura β cruzada de referidaproteína em referida amostra de referência é significamente diferente do teorda estrutura β cruzada de referida proteína em referida amostra de teste.

Esta concretização é particularmente vantajosa para determinarse uma determinada circunstância e/ou tratamento tem um efeito sobre o teorde estrutura β cruzada de uma proteína. Uma vez isto determinado, é possívelselecionar uma circunstância e/ou tratamento que apresenta uam baixacapacidade de induzir e/ou incrementar a conformação de estrutura β cruzada.

Evidentemente, também é possível selecionar uma circunstância e/outratamento que é bem capaz de induzir e/ou incrementar conformação deestrutura β cruzada, dependendo de uma aplicação particular.

A invenção é explicada adicionalmente com os exemplos aseguir, sem restringir-se aos mesmos.

EXEMPLOS

Materiais e métodos

Materiais

Usou-se anticorpos de imunoglobulina G (IgG) humana deamplo espectro, referidos como 'Ig intravenosa' ('IVIg1 ou 'IgIV'),'gamaglobulina', 'globulina imune intravenosa', 'imunoglobulina intravenosa'ou de outra forma, foram obtidos do departamento de farmácia da UniversityMedicai Center Utrecht local. Octagam da Octapharma (OctapharmaInternational Services N.V., Brussel, Bélgica; dosagem de 2,5 g em 50 ml,lote 4270568431, exp. 05-2006, referido a seguir como 'fabricante Γ de IgIV,ou IgIV (I) ou IgIV-I) e Hyland Immuno Gammagard S/D IVIg de Baxter(Baxter B.V., Utrecht, Países Baixos; dosagem de 5 g com 96 ml de soluçãode reconstituição, lote LE08E044AL, exp. 04-2007, referido a seguir como'fabricante II' de IgIV, IgIV (II) ou IgIV-II). Gammagard foi reconstituído emcondições estéreis por meio de adição dos 96 ml de H2O fornecidos edeixando-se a solução durante 30 minutos em um dispositivo de rolamento àtemperatura ambiente (concentração final de IgG de 52 mg/ml. Obteve-seuma solução transparente sem formação de espuma. A solução reconstituídafoi repartida e armazenada a -20°C. Após reconstituição, a solução deGammagard contém 0,06 g de albumina humana pasteurizada, 0,45 g deglicina, 0,175 g de NaCl, 0,43 g de monoidrato de glucose e 0,04 g depolietileno glicol 3.350. Octagam é fornecido como uma solução de pronto-emprego compreendendo 50 mg/ml de IgIV. Outros componentes são 100mg/ml de maltose e menos de 5 μg/ml de Triton X-100 e menos de 1 μg/ml defosfato de tri-n-butila. Devem ser armazenados a 4°C. De acordo com ofabricante, Octagam consiste principalmente de IgG's (>95%), com umafração menor de IgA (>0,4%). A distribuição sobre os quatro isotipos de IgGé a seguinte: IgGl, 62,6%; IgG2, 30,1%; IgG3, 6,1%; IgG4, 1,2%.Gammagard e Octagam são usados à temperatura ambiente. Soluções forammantidas à temperatura ambiente durante pelo menos 30 minutos antes douso. Frações congeladas de Gammagard foram descongeladas rapidamente deinício a aproximadamente 0°C e, depois, deixadas à temperatura ambiente.Uma terceira fonte de imunoglobulinas humanas consistiu de plasma citradocombinado normal de 40 doadores aparentemente saudáveis, preparado naUniversity Medicai Center Utreeht. Este plasma foi misturado diretamenteapós o sangue ser coletado, e repartido diretamente e congelado a -80°C.Antes do uso, uma fração foi descongelada durante 10 minutos em um banhode água a 37°C e mantida à temperatura ambiente durante 30 minutos. Oplasma foi misturado por meio de rotação e/ou ressuspendendo-se com umapipeta; evitou-se agitação com vórtice, como foi feito com as preparações deIgIV e usou-se todas as outras soluções de proteína.

Para ELISA usou-se placas de alta ligação Microlon (GreinerBio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha; número de catálogo 655092, lote05130103, exp. 03- 2009). Anticorpos usados foram fosfatase alcalina de IgGanti-humana de cabra (Biosource Int., Camarillo, CA, E.U.A.; número decatálogo AHI0305, lote 7602), fosfatase alcalina de IgM anti-humana decabra (Biosource Int.; número de catálogo AHI0605, lote 3903),imunoglobulinas anti-camundongo de coelho conjugadas com peroxidase(RAMPO, número de catálogo P0260, DAKOCytomation, Glostrup,Dinamarca), imunoglobulinas anti-coelho de porco acopladas com peroxidase(SWARPO, número de catálogo P0217, DAKOCytomation), anticorpo dealbumina anti-humana policlonal de coelho A-OOOl (DAKOCytomation),anticorpo de hemoglobina anti-humana policlonal de coelho A-Ol 18(DAKOCytomation; lote 122(021)), anticorpo de amilóide-6 anti-humanomonoclonal de camundongo M0872 (DAKOCytomation; clone 6F/3D, lote00003503, exp. 08-2006), anticorpo de fibrinogênio anti-humano policlonalde coelho A0080 (DAKOCytomation; lote 097(701), exp. 08-2006) eanticorpo de fibronectina humana glicada anti-glicose-6-fosfato de hibridomamonoclonal murino 4B5 (lote 2, código 100901 BB, ref. (Bouma et al.,2003)). Em ELISAs, avaliou-se a ligação de anticorpos conjugados comfosfatase alcalina usando-se p-nitrofenil fosfato dissódico 6*H20 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, E.U.A.; substrato de fosfatase número de catálogo104, lote 120K6008), e ligação de anticorpos conjugados com peroxidase foiavaliado usando 1,2-fenilenodiamina ('OPD', Merck, Darmstadt, Alemanha;número de catálogo 1.07243.0050, lote L937543-844).

Estudos de inibição usando uma montagem ELISA foramrealizados usando-se séries de concentrações de vermelho Congo (Aldrich,Milwaukee, WI, E.U.A.; número de catálogo 86,095-6), Tioflavina T (Sigma,St. Louis, MO, E.U.A.; número de catálogo T3516, lote 80K3444), TioflavinaS (Sigma; número de catálogo Tl892), ativador de plasminogênio de tipotissular (tPA, Actilyse, Boehringer-Ingelheim, Alkmaar, Países Baixos), ouuma forma trancada de tPA (K2P tPA, Rapilisina, Boehringer- Ingelheim,Alkmaar, Países Baixos) carecendo de três domínios amino terminaisincluindo o domínio de fibronectina de tipo I, ou denominadoalternativamente domínio de dedo (F,finger).

Antígenos usados em ELISAs de ligação de IgIV foram opeptídeo de fibrina humana sintético 148-KRLEVDIDIGIRS-160 (SEQ-ID1), com uma mutação K157G, peptídeo amilóide β humano sintético 1-DAEFRJHDSGYEVHHQKXVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV-40 (SEQ-ID 2) (Αβ(1-40), tipo Holandês Ap(l-40)E22Q humano sintético 1-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAQDVGSNKGAIIGLMVGGW-40 (SEQ-ED 3) {Peptide facility, Dutch Câncer Institute, Amsterdam, Países Baixos),albumina do soro bovina (BSA, fração V, número de catálogo A-7906,fracionamento inicial por meio de choque com calor, pureza > 98%(eletroforese), restante em sua maior parte de globulinas, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, E.U.A.), hemoglobina humana (Hb, Sigma-Aldrich; número decatálogo H7379), e suas contrapartes BSA-AGE e Hb-AGE modificadas comprodutos acabados glicados avançados (ver abaixo).

Métodos

Glicação de proteínas

A glicação de albumina e Hb foi realizada como a seguir. Paraa preparação de BSA-AGE, 100 mg ml-1 de albumina foram incubados comsolução salina tamponada com fosfato (PBS, 140 mM de cloreto de sódio, 2,7mM de cloreto de potássio, 10 mM de hidrogênio fosfato dissódico, 1,8 mMde diidrogênio fosfato de potássio, pH 7,3) contendo 1 M de hidrato de saldissódico de D-glucose-6-fosfato (anidra) (g6p, ICN, Aurora, Ohio, E.U.A.) e0,05% m/v de NaN3, a 37°C no escuro. A solução foi glicosada durante 70semanas. Hb humana a 10 mg/ml foi incubada durante 75 semanas a 37°Ccom PBS contendo 1 M de g6p e 0,05% m/v de NaN3. Após as incubações,soluções de albumina e Hb foram dialisadas extensivamente contra águadestilada e, subseqüentemente, repartidas e armazenadas a -20°C.Concentrações de proteína foram determinadas com reagente de ensaio deproteína Advanced ADVOl (Cytoskeleton, Denver, CO, E.U.A.).

Preparação de proteínas desnaturadas com calor

Proteínas dobradas incorretamente desnaturadas com calorforam preparadas como a seguir. Um mg/ml de Endostatina (fragmento XVIIIde colágeno produzido recombinantemente, EntreMed, Inc., Rockville, MD;solução), BSA (Sigma-Aldrich; liofilizada, número de catálogo A7906),albumina do soro murina (MSA, Calbiochem, EMD Biosciences, Inc., SanDiego, CA; liofilizada, número de catálogo 126674), lisozima de clara deovos de galinha (ICN, Irvine, CA, E.U.A.; liofilizada, número de catálogo100831), glucagônio humano (Glucagen, Novo Nordisk, Copenhagen,Dinamarca; liofilizado, número de catálogo PW60126), ovalbumina de frangopurificada (OVA, Sigma; número de catálogo A7641, lote 071k7094) ou 62-glicoproteína I humana (62gpi, purificada na própria empresa, de plasmafresco, ref. (Horbach et al., 1996)) em 67 mM de tamponador NaPi pH 7,0,100 mM de NaCl, foi aquecido durante cinco ciclos em copos de PCR em umciclizador térmico PTC-200 (MJ Research, Inc., Waltham, MA, E.U.A.). Emcada ciclo, proteínas foram aquecidas de 30 a 85°C a uma taxa de 5°C/min.

Adicionalmente, endostatina, MSA, ovalbumina e lisozima foramdesnaturadas com calor a 1 mg/ml de uma maneira similar, usando apenas umciclo de incubação com calor. A endostatina a 7,9 mg/ml foi diluída em H2O a1 mg/ml, MSA e ovalbumina a 1 mg/ml foram em PBS pH 7,4, lisozima foidissolvida em PBS com adição de 10 μΜ de HCl, concentração de 1 mg/ml.

Proteínas de controle não são submetidas ao procedimento de ciclizaçãotérmico. Para confirmar o dobramento incorreto das proteínas em estruturassimilares a amilóide, avaliou-se o incremento de Tioflavina T (ThT) comproteínas tratadas com calor e também com proteínas de controle. Afluorescência de adutos de peptídeo/proteína similar a amilóide - ThT foimedida como a seguir. Soluções de 25 μg ml-1 de preparações de proteína oupeptídeo foram preparadas em tamponador de glicina 50 mM pH 9,0 com 25μΜ de ThT. A fluorescência foi medida a 485 nm com excitação a 435 nm.Sinais de fundo do tamponador, tamponador com ThT e solução deproteína/peptídeo sem ThT foram subtraídos das medições correspondentescom solução de proteína incubada com ThT. De uma forma regular, usou-se afluorescência de Αβ como um controle positivo, e fluorescência de fragmentode fibrina humana sintética FPlO (148-KRLEVDIDIK-157 (SEQ-ID 4);Peptide facility, Dutch Câncer Institute, Amsterdam, Países Baixos), umfragmento de fibrina não-amilóide (Kranenburg et al., 2002), e tamponadorforam usados como um controle negativo. A fluorescência foi medida emtriplicata em um espectrofotômetro de fluorescência Hitachi F-4500 (Hitachi,Ltd., Tokyo, Japão). Alternativamente, analisou-se a fluorescência dovermelho Congo de uma maneira similar. Agora, os comprimentos deexcitação e emissão foram de 550 e 590 nm. Novamente, analisou-se 25μg/ml de proteínas de teste, em soluções de vermelho Congo 25 μΜ.

Alternativamente, preparou-se um peptídeo de amilóidedesnaturado com calor como a seguir. Peptídeo de fibrina humana NH2-IDIKIR-COOH (SEQ-ID 6, FP6) foi dissolvido a aproximadamente 10 mg/mlem uma relação volumétrica de 1:1 de 1,1,1,3,3,3- hexafluoro-2-propanol eácido trifluoroacético. Os solventes orgânicos foram vaporizados sob umfluxo de ar. FP6 foi dissolvido em água destilada a uma concentração final de1 mg/ml e mantido a 37°C durante 72 h. A solução foi armazenadasubseqüentemente à temperatura ambiente. A presença de conformação deestrutura β cruzada foi confirmada medindo-se o incremento de fluorescênciade corantes ThT e vermelho Congo específicos para amilóide e por meio deanálise de difração de raios-X com fibras (comunicação pessoal, L. Kroon-Batenburg, Bijvoet Center for Biomolecular Research, Dept. of Crystal &Structural Chemistry, University of Utrecht, Países Baixos) (dados nãomostrados aqui). Além disso, a propriedade de soluções de FP6 de ativar tPAem um ensaio de conversão de plasminogênio/plasmina/substratocromogênico foi avaliada e verificou-se que é positiva (dados mostradosalhures).

Preparação de oligomeros de peptídeo de príon de levedura com umaconformação similar a amilóide

O fragmento de peptídeo NH2-GNNQQNY-COOH da proteínade prion de levedura (SEQ-ID 5) foi adquirido da Peptide Facility of theNetherlands Câncer Institute (H. Hilkmann, NKI -Amsterdam, Países Baixos;lote 5LKB1-2081). A pureza do peptídeo foi analisada realizando-se HPLCde fase invertida e foi de -90%. O peptídeo foi dissolvido a concentraçõesfinais de 1 e 10 mg/ml em H2O. As soluções transparentes foram incubadasdurante 72 h a 4°C em uma banca de rolamento ou durante 5 h à temperaturaambiente sem movimento. O incremento da fluorescência do vermelho Congofoi determianda como uma medida da presença de conformação similara aamilóide (ver acima). Adicionalmente, a formação de estrutura β cruzada comeste batelada de peptídeo foi confirmada com análise de difração de raios-Xde fibras usando-se uma solução de 10 mg/ml em H2O (comunicação pessoal,L. Kroon-Batenburg, Bijvoet Center for Biomolecular Research, Dept. ofCrystal & Structural Chemistry, University of Utrecht, Países Baixos) (dadosnão mostrados aqui).

Preparação de proteínas oxidadas

A oxidação de proteínas foi realizada usando-se exposiçãoprolongada de proteínas em solução a CuSO4. Proteínas usadas foram plasmacitrato combinado normal humano de pessoas aparentemente saudáveis,endostatina formulada (EntreMed, Inc., Rockville, MD; solução a 7,9 mg/ml),lisozima de clara de ovos de galinha (ICN, número de catálogo 100831, lote98032), hemoglobina humana (Sigma-Aldrich, número de catálogo H7379,lote 039H7605), glucagônio humano (Glucagen from NovoNordisk FarmaB.V., lote RW 60038), albumina bovina (Sigma-Aldrich, A7906, lote8IKl813), γ-globulinas humanas (Sigma-Aldrich, G4386, lote 21K7600),ovalbumina de clara de ovos de galinha (Sigma-Aldrich, A7641, lote071K7094). Proteínas liofilizadas foram dissolvidas a 2 mg/ml em PBS,plasma foi diluído 40 vezes e endostatina foi diluída a 2 mg/ml em PBS.Adicionou-se solução de consumo de NaN3 a 2% m/v a uma concentraçãofinal 0,02%. Solução de consumo de CuSO4 de 1 M em H2O foi adicionada auma concentração final de 10 mM. Em soluções de proteína de controleadicionou-se H2O em lugar de CuSO4. Todas as soluções de proteína forammisturadas com rotação, evitando-se agitação com vórtice. Soluções forammantidas a 4°C em uma banca de rolamento durante 72 h. Mediu-se oincremento de ThT (ver acima).

Alternativamente, proteínas foram oxidadas introduzindo-se10 μΜ de CuSO4 nas soluções. Desta maneira, ovalbumina, albumina,endostatina, lisozima, γ-globulinas, todas a 2,5 mg/ml, e glucagônio a 1mg/ml foram incubadas durante 144 h a 37°C em PB S. Em soluções deproteína de controle omitiu-se o CuSO4. Mediu-se a fluorescência detioflavina T como uma medida da presença de proteínas dobradasincorretamente com uma conformação de estrutura β cruzada. Soluções deproteína que apresentaram fluorescência incrementada de ThT foramdialisadas contra PBS, e também seus controles não-oxidados.

Lipoproteínas de baixa densidade (LDL) foram isoladas deplasma humano fresco (<24 h) que foi mantido a 10°C, obtido do banco desangue dos Países Baixos. LDL foram isoladas substancialmente comodescrito previamente (4). Plasma foi centrifugado em uma ultracentrífugadurante três ciclos subseqüentes. A fração de LDL foi isolada e armazenadasob N2, a 4°C. Antes dos experimentos, LDL nativo (nLDL) foi dialisado deum dia para o outro a 4°C contra 0,9% peso/volume de NaCl. Para obter LDLoxidada (oxLDL) com graus variáveis de oxidação, LDL nativa foi dialisadaprimeiramente contra solução 0,15 M de NaCl contendo 1 mM de NaNO3, deum dia para o outro a 4°C. Em seguida, nLDL foi diluído a de 3 a 5 mg/ml, ese adicionou CuSO4 a uma concentração final 25 μΜ e incubado a 37°C. Deuma maneira similar, o LDL foi oxidado usando-se FeSO4 em lugar deCuSO4. Oxidação com FeSO4 também foi precedida pela etapa de diálise. Emseguida, LDL foi dialisada contra 5 μΜ de FeSO4 em PBS com mais 150 mMde NaCl e 1 mM de NaNe, pH 7,2. O grau de oxidação é controladaselecionando-se um determinado número de ciclos de reciclagem detamponador de oxidação. Quanto mais vezes o FeSO4 no tamponador forreciclado a cada 10-12 h, tanto maior será o grau de oxidação. Parainterromper a oxidação, a amostra de LDL é dialisada contra um tamponadorde 150 mM de NaCl, 1 mM de NaN3, 1 mM de EDTA durante 4 h a 4°C. Ograu de oxidação foi seguido de medição de formação de dieno a λ = 234 nm(Ultrospec 3000 Spectrophotometer (Pharmacia Biotech)). Para interromper areação de oxidação, LDL foi dialisado contra 0,15 M de NaCl, 1 mM deNaNO3 e 1 mM de EDTA. Soluções de LDL foram armazenadas a 4°C sobN2. A presença de conformação de estrutura β cruzada na porção de proteínaApoB de LDL foi analisada usando-se um ensaio de fluorescência deTioflavina T (ver acima).

Preparação de proteínas dobradas incorretamente usando superfíciesdesnaturadoras

Para preparar proteínas dobradas incorretamente comexposição a superfícies constituídas de moléculas multiméricas, CpG-ODN(Coley Pharmaceutical Group, MA, E.U.A.) a 21,4 μg/ml oulipopolissacarídio (LPS, de sorotipo de Escherichia coli 011:B4, 2630, lote104K4109, Sigma-Aldrich) a 600 μg/ml foram misturados com 1 mg/ml delisozima de clara de ovos de galinha (liofilizada, Fluka, Sigma-Aldrich;número de catálogo 62971), BSA, endostatina e ovalbumina, e incubadas deum dia para o outro a 4°C, ou durante 1 h à temperatura ambiente, em umabanca de rolamento. Para tal fim, proteínas liofilizadas foram dissolvidas emsaline tamponada com HEPES (HBS, 10 mM de HEPES, 4 mM de KCl, 137mM de NaCl, pH 7,2) a uma concentração final de 2 mg/ml, e endostatina a7,9 mg/ml foram diluídas a 2 mg/ml em HBS. Proteínas foram dissolvidas25 cuidadosamente em uma banca de rolamento à temperatura ambiente durante10 min, a 37°C e à temperatura ambiente durante 10 min. As soluções deproteína a 2 mg/ml foram então ultracentrifugadas durante 1 h a 100.000*gantes do uso, e subseqüentemente diluídas a 1:1 em HBS com 42,9 μg/ml deCpG-ODN ou com 1200 μg/ml de LPS. Avaliou-se a formação de estrutura βcruzada similar-a-amilóide medindo-se o incremento da fluorescência deTioflavina T com relação às soluções de proteína de controle em que assuperfícies desnaturadoras foram omitidas. Para tal fim, proteínas foramdiluídas a 25 μ|*/ηι1 e incubadas com tamponador de ensaio ou com 25 μΜ deTioflavina T em tamponador de ensaio (ver acima para detalhes de ensaio).

Alternativamente, proteínas dobradas incorretamente sãoobtidas após exposição de proteínas a moléculas desnaturadoras, como(fosfo)lipídios (carrgados negativamente), como fosfatidil serina ecardiolipina, sulfato de dextrano (500.000 Da), alume, ácido elágico, vidro oucaulim. Estas proteínas dobradas incorretamente são incluídas em testesconduzidos para revelar o mecanismo de trabalho da ação da IgIV.Ensaio imunossorvente ligado a enzima para teste de ligação de IgIV aproteínas dobrada incorretamente s

A ligação de IgIV ou de imunoglobulinas em plasmacombinado normal foi determinada usando-se uma montagem de ensaioimunossorvente ligado a enzima (ELISA). Para este fim, 50 μΐ/poço deligantes potenciais em concentrações indicadas ou tamponador derevestimento apenas para fins de medição de controle e de fundo, foramrevestidos de um dia para o outro a 4°C, com movimento, em 50 mM deNaHCO3 pH 9,6. Albumina glicosada e Hb (BSA-AGE e Hb-AGE), BSA decontrole e Hb de controle foram revestidos a 5 μg/ml. AB e FP13 foramrevestidos a 25 μg/ml. Os controles de BSA e Hb foram preparadosrecentemente por meio de dissolução das proteínas liofilizadas a 1 mg/ml emPBS quando da ressuspensão por meio de pipetagem, seguido de um períodode 30 minutos na banca de rolamento, à temperatura ambiente. As soluções deproteína foram centrifugadas durante 10 minutos a 16.000*g e diluídas emtamponador de revestimento. Controles de revestimento foram realizados comanticorpo anti-proteína glicosada, anticorpo anti-albumina, anticorpo anti-Hbe anticorpo anti-AB. FP13 não foi reconhecido por um anticorpo anti-fibrinogênio policlonal. Os anticorpos de Ig anti-humana conjugados comfosfatase alcalina foram controlados por meio de revestimento das IgIVs esobrepondo-se os mesmos com os anticorpos secundários. Após orevestimento, as placas foram lavadas duas vezes com 50 mM de Tris-HCl pH7,3, 150 mM de NaCl, 0,1% v/v de Tween20, e bloqueadas com 175 μΐ/poçode reagente de bloqueio (Roche Diagnostics, Almere, Países Baixos; númerode catálogo 11112589001), durante 1 h à temperatura ambiente, commovimento. Placas foram lavadas duas vezes e incubadas em triplicata comséries de diluição de anticorpos indicados, séries de diluição de plasma oucontroles, incluindo tamponador de ligação apenas, na ausência ou presençade inibidores putativos, em tamponador de ligação; PBS/0,1% v/v deTween20, a 50 μΐ/poço, durante 1 h à temperatura ambiente, com movimentoconstante. Após quatro ciclos de lavagem, adicionou-se anticorpossecundários nos poços, a 50 μΐ/poço, durante 45 minutos à temperaturaambiente, com movimento. Usou-se RAMPO e SWARPO a uma diluição de2000 vezes, anticorpos de IgG anti-humanos de cabra foram diluídos 3000vezes, anticorpos de IgM anti-humanos de cabra foram diluídos 1000 vezes.

Após 5 lavagens com tamponador de lavagem, seguido de duas lavagens comPBS, avaliou-se a ligação de anticorpos. Para anticorpos secundáriosconjugados com fosfatase alcalina, usou-se fosfato de p-nitrofenila (600μg/ml) em tamponador de DEA pH 9,8 (10% v/v de dietanolamina em H2O,com 240 μΜ de MgCl2,6H20, pH ajustado com HCl), a 100 μΐ/poço, durante~5 minutos. A reação foi interrompida adicionando-se 50 μΐ/poço de 2,4 M deNaOH em H2O. Após 5 minutos efetuou-se a leitura da absorbância a 405 nm.

Para SWARPO e RAMPO conjugado com peroxidase, usou-se OPD (1,3mg/ml) em 50 mM de ácido cítrico/100 mM de Na2HPO4ZO,06% v/v de H2O2pH 5, à base de 100 μΐ/poço, durante ~5 minutos. A reação foi interrompidapor meio de adição de 50 μΐ/poço de 2 M de H2SO4 em H2O. Após 5', aabsorbância foi lida a 490 nm. Cada experimento foi realizado pelo menosduas vezes. Para testar se os compostos de ligação de estrutura β cruzadasimilar a amilóide, e controles (ver ref. (Bouma et ai., 2003) e pedido depatente P57716EP00) interferem com a ligação de IgIV aos ligantes deestrutura β cruzada, séries de concentrações dos inibidores em potencialforam testadas na presença de uma concentração de IgIV sub-ótima. Para talfim usou-se soluções de consumo de tPA, K2P tPA, vermelho Congo,Tioflavina S (ThS) e Tioflavina T (ThT) foram de 3,7 mg/ml, 1,1 mg/ml, 10mM, 10 mM e 10 mM, respectivamente. A influencia de tPA e K2P tPA foitestadas na presença de 10 mM de ácido ε-amino capróico, para evitar aligação do domínio kringle2 de tPA e K2P tPA a radicais lisina e arginina(ligação de tPA estruturas similares a amilóide é mediada por seu domínio dededo [finger], que não apresenta K2P tPA truncado; o domínio kringle2 liga-se as cadeias laterais expostas de lisinas e argininas). O tamponador deligação de K2P tPA servem como controles negativos nestes estudos deinibição. Separadamente, realizou-se estudos de inibição similares com Αβimobilizado ou BSA-AGE, uma concentração sub-ótima de tPA (ver ref.(Bouma et al., 2003; Kranenburg et al., 2002)) e séries de concentrações devermelho Congo ou ThT. A redução dos dados foi realizada como a seguir.Calculou-se as médias de triplicatas e os desvios-padrão. Sinais de fundoobtidos com poços revestidos com tamponador foram subtraídos (ligação deanticorpo primário a poços vazios), e também como sinais de fundo obtidosde poços em que os anticorpos primários foram omitidos (ligação deanticorpo secundário a ligantes revestidos).

Em uma série separada de experimentos, peptídeo de príon delevedura NH2-GNNQQNY-COOH (SEQ-ID 5) foi revestido sobre as placasde ELISA a uma concentração de 25 μg/ml. Usou-se as soluções de consumode 1 mg/ml que foram incubadas a 4°C durante 73 h. Em poços de controle,revestiu-se 5 μg/ml de Hb-AGE ou tamponador de revestimento. A ligação deuma série de diluições de IgIV (I) foi analisada e comparada com a ligação deséries de concentrações de tPA e K2P tPA. Adicionalmente, uma mistura decinco anticorpos monoclonais que apresentam afinidade por proteínas dobradaincorretamente s, também foi testada quanto à ligação com os ligantesimobilizados (ver abaixo para detalhes monoclonais). Para este fim, preparou-se em PBS uma mistura compreendendo 336 μg/ml de cada um dos cincoanticorpos, resultando em uma solução de consumo de 1,83 mg/ml deanticorpo total.

Preparação anticorpos anti-proteínas dobradas incorretamentemonoclonais murinos

As imunizações foram realizadas pela instalação ABC-Hybridoma (P. van Kooten & M. Smits, Utrecht University, Países Baixos).Um camundongo (Balb/c) foi imunizado com 100 μg de AB em 100 μΐ deH2O e 100 μΐ de adjuvante de Freund completo. Após três semanas, realizou-se um primeiro reforço de 50 μg de Αβ em H2O-Specol (ID-DLO, Lelystad,Países Baixos), seguido de um segundo reforço 30 dias após o primeiroreforço. Trinta e seis e 37 dias após o segundo reforço, o camundongorecebeu dois reforços adicionais com 50 μg de Αβ em PBS(intravenosamente). Entre aproximadamente a semana 44 e a semana 48 apóso início da imunização com ΑΒ, o camundongo adoeceu, mas recuperou-se.Quarenta e nove semanas mais tarde, o mouse foi imunizado com 50 μg deamilóide A de soro de frango recombinante em H2O-SpecoL Este antígeno foium presente gentil do Dr H. Toussaint (Dept. of Veterinary Medicine,University of Utrecht, Países Baixos). Quatro semanas mais tarde, ocamundongo foi imunizado com 50 μg de Hb-AGE. Finalmente, 31 e 32 diasmais tarde, o camundongo recebeu reforços duas vezes intravenosamente com50 μg de FP6 (SEQ-ID 6) em PBS. Três dias após o reforço final, ocamundongo foi sacrificado e o baçõ foi usado para preparar hibridomas. Omeio de fusão foi enriquecido com PEG4000 (Merck, número de catálogo9727). O baço compreendia um número excepcionalmente alto de células, i.e.7*10 células, com uma abundância relativamente alta de fibroblastosinfiltrados. 2* IO8 células foram misturadas com 4* IO7 de Sp2/0 células deplasmacitoma para a fusão. Após a fusão, usou-se meio de cultura dehibridoma seletivo consistindo de OptiMEM I com 10% de Fetalclonel(Hyclone), 4 μΜ de Aminopterina e 1% de Glutamax I. Após um tempo deincubação para permitir a fusão das células B de baço e as células deplasmacitoma, células foram transferidas à base de 1 célula por poço paraplacas de 96 poços, usando-se um aparelho FacsYantage com programaAccudrop. ApósO aproximadamente duas semanas, hibridomas foramselecionados quanto à produção putativa de anticorpos anti-estrutura βcruzada. Primeiramente, 768 clones em placas de 96 poços foramselecionados quanto à presença de anticorpos que se ligam a γ-globulinasamilóides e amilóides FP13 K157G imobilizados. Para tal fim, FP 13 K157Ge γ-globulinas amilóides foram diluídas em conjunto em H2O a 5 μg ml-1 decada polipeptídeo. Placas ELISA de alta ligação Microlon (Greiner, Bio-OneGmbH, Frickenhausen, Alemanha) foram enchidas com 50 μΐ desta solução esecadas ao ar de um dia para o outro a 37°C. Placas foram bloqueadas comreagente de bloqueio (n° de catálogo 11112589001, Roche Applied Science,Basel, Suiça) e lavadas com água potável. Cem μΐ de sobrenadantes de culturade células de hibridoma contendo 10% v/v de soro de bezerro fetal foramtransferidas para as placas revestidas, e incubadas durante 1 h à temperaturaambiente (RT) enquanto se agitava. Placas foram lavadas com solução salinatamponada com Tris pH 7,3 (TBS, 50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl)com 0,1% de Tween-20 (tamponador de lavagem), e subseqüentementesobrepostas com imunoglobulinas anti-mouse de coelho acopladas comperoxidase diluídas 2000x (RAMPO, 0260, DAKO, Dinamarca) emPBS/0,1% de Tween-20, durante 30 minutos à temperatura ambienteenquanto se agitava. Após lavagem extensiva, RAMPO ligado foi visualizadocom tetramethilbenzidina (TMB, 5.01.20, /5,014,01, Biosource, Nivelles,Bélgica). A reação foi interrompida após 5 minutos com 1% de H2SO4 emH2O. Placas foram lidas a 450 nm. Clones foram incluídos em ensaios deseleção adicionais quando sinais atingiram níveis de fundo de pelo menosl,5x. Novamente, a presença de anticorpos anti-estrutura β cruzada putativosfoi analisada com γ-globulinas amilóides e FP13 K157G imobilizados. Então,35 clones permaneceram positivos. Estes clones foram transferidos parafrascos de cultura de células e submetidos a análises adicionais. Para tal fim,novamente FP13 K157G e γ-globulinas amilóides, agora separadamente, etambém Αβ e Hb-AGE foram imobilizados sobre placas ELISA.

Adicionalmente, Αβ recentemente dissolvido, FP13 K157G, Hb e γ-globulinas foram revestidos sobre placas Immobilizer (Exiqon, Vedbaek,Dinamarca). Estes controles recentemente dissolvidos foram revestidos a 20,12,5, 50 e 50 μg ml-1, respectivamente, em PBS, durante 1 h à temperaturaambiente enquanto se agitava. Soluções de consumo de Αβ, FP 13 K157G,Hb e γ-globulinas de 20, 12,5, 50 e 50 μg ml-1, respectivamente, foramcentrifugadas primeiramente durante 30 min. a 238* IO3Xg para removeragregados insolúveis que poderiam estar presentes. Tamponador foi revestidosobre placas Greiner (H2O) e sobre placas Exiqon (PBS) como controlenegativo adicional. Placas Greiner não foram bloqueadas durante seleeçõesiniciais com 768 clones. Dez% de FCS no meio de cultura de células é umbloqueador eficiente durante a incubação de sobrenadante de células nasplacas ELISA. Dez μΐ de PBS/1% de Tween-20 foram adicionadis nos poçosdas placas Exiqon, antes de se adicionar sobrenadantes de células. Tween-20a uma concentração de 0,1% é um bloqueador instantâneo efetivo para placasImmobilizer. Cem μΐ dos sobrenadantes de hibridoma foram transferidos paraas placas. Usou-se meio de cultura como controle negativo. Sinais foramcalculados como múltiplos dos sinais obtidos com meio de cultura fresco com10% de FCS incubado nos diversos controles e antígenos imobilizados. Sinaisforam considerados positivos quando excedendo 2,Ox os vaslores de fundoobtidos com meio de cultura fresco. Seleção subseqüente de 21 de 35 clonesfoi realizada em placas Greiner, preparadas como descrito acima. Agora asplacas foram bloqueadas primeiramente com reagente de bloqueio e lavadas.Cinqüenta μl de cada clone de hibridoma foram testados em duplicata quantoà presença de anticorpos independentes de seqüência, porém específicos paraestrutura, meio de cultura fresco foi testado em quadruplicata como controle.Dois dos 21 clones originais, seis foram selecionados quanto a subclonagemadicional de células simples para obter hibridomas monoclonais. Os seisclones foram semeados à base de uma célula por poço da placa de cultura de96 poços e cultivados em meio enriquecido com 10% v/v de FCS. Todos osclones foram testadso quanto à ligação com dois amilóides revestidos. Paracada um dos seis clones, identificou-se cinco sub-clones que se ligaram aosdois amilóides, para cultivo subseqüente em frascos de cultura de 25 cm2. Aisotipificação dos trinta subclones, usando anticorpos específicos para isótipomarcados fluorescentemente havia sido realizada na instalação da ABC-Hybridoma (M. Smits) de acordo com as recomendações do fabricante(Luminex, Austin, TX, E.U.A.). Os anticorpos foram purificados de meio decultura de células usando-se tecnologia convencional de purificaçãocromatográfica. Amostras foram submetidas a cromatografia tiofílica usando-se matriz de gel AFFI-T (KemEnTEC, Biozym, Landgraaf, Países Baixos) emuma coluna Econo (Biorad, Veenendaal, Países Baixos). Anticorpospurificados foram armazenados a-20°C em PBS.

Para se obter anticorpos monoclonais, um camundongo foiimunizado seqüencialmente com amilóide humano Αβ(1-40) E22Q, amilóideA de soro de frango recombinante e hemoglobina humana glicada compropriedades similares a amilóide, seguido de um reforço final com peptídeode fibrina humana amilóide FP6. Formaram-se hibridomas e seussobrenadantes de cultura de células foram selecionados quanto à presença deanticorpos que reconhecem especificamente um epítopo que só é reconhecidoquando a conformação de estrutura β cruzada está presente em qualquerpolipeptídeo com uma composição de aminoácidos que não é relacionada comantígenos usados para imunização. De 768 clones, selecionou-se seis clones,sei 2E2, 4F4, 7H1, 7H2, 7H9 e 8F2, para uma faixa mais ampla de agregadossimilares a amilóide, diferentes dos antígenos usados para a imunização. Apósvários ciclos de seleção e subclonagem, finalmente os cinco anticorposmonoclonais a seguir apresentaram ligação consistente com proteínasdobradas incorretamente com uma conformação de estrutura β cruzada:2E2B3D12, 7H2H2, 7H1C6A7, 7H9B9, 8F2G7H7. O clone 7H2H2 liga-seespecificamente apenas a várias formas dobradas incorretamente deimunoglobulinas, que nos deixam tipificar este clone como um 'anticorposimilar a fator de reumatismo'. Preparou-se uma mistura dos cinco anticorposmonoclonais listados, em que as concentrações finais dos anticorposindividuais foram de 1,5, 0,37, 0,4, 0,45 e 0,47 mg/ml para 2E2B3D12, 7H2H2, 7H1C6A7, 7H9B9 e 8F2G7H7, respectivamente, dando umaconcentração de anticorpos global de 3,2 mg/ml. Alternativamente, todos osanticorpos foram diluídos em PBS a 1,83 mg/ml e combinados a 1:1:1:1:1resultando em uma concentração total de anticorpos de 1,83 mg/ml com 336μg/ml dos anticorpos individuais. Estas misturas de anticorpos anti-proteínadobrada incorretamente murinos foram usados como soluções de consumopara ensaios adicionais de agregação de plaquetas do sangue (ver Exemplo).

Agregação de plaquetas

A influência da IgIV sobre a agregação de plaquetas do sangueinduzida por agregados de Hb glicada dobrada incorretamente com umaconformação de estrutura β cruzada similar a amilóide foi testada complaquetas lavadas em um ensaio agregométrico. Sangue humano isento deaspirina, recentemente colhido, foi misturado cuidadosamente comtamponador de citrato para evitar coagulação. O sangue foi centrifugadodurante 15 minutos a 150*g a 20°C e coletou-se o sobrenadante; Plasma ricoem plaquetas (PRP, platelet rich plasma). Tamponador com 2,5% de citratotrissódico, 1,5% de ácido cítrico e 2% de glucose, pH 6,5, foi adicionado auma relação volumétrica final de 1:10 (tamponador-PRP). Após deposição deplaquetas mediante centrifugação durante 15 minutos a 330*g a 20°C, o pelletfoi ressuspenso em tamponador HEPES-Tyrode pH 6,5. Adicionou-seprostaciclina a uma concentração final de 10 ng/ml, e a solução foicentrifugada durante 15 minutos a 330*g a 20°C, com uma frenagem suave.

O pellet foi ressuspenso em tamponador HEPES-Tyrode pH 7,2 de uma formaque o número final de plaquetas foi ajustado em 200.000-250.000plaquetas/μl. Plaquetas foram mantidas a 37°C durante pelo menos 30minutos, antes do uso nos ensaios, para assegurar que se encontravam noestado de descanso. Plaquetas de cinco doadores foram isoladasseparadamente em três dias diferentes (2, 2, 1).

Para os ensaios agregométricos adicionou-se solução de 270,280 ou 300 μl de plaquetas em um tubo de vidro e pré-aquecido a 37°C.Adicionou-se um ímã de agitação e ajustou-se a rotação em 900 rpm, e oaparelho (agregômetro de sangue integral, Chrono-log, Havertown, PA,E.U.A.) foi neutralizado. Adicionou-se um volume final de 30, 30 ou 33,3 μl,contendo o agonista de interesse e/ou o antagonista de interesse pré-misturado, pré-diluído em tamponador HEPES-Tyrode pH 7,2. A agregaçãofoi acompanhada ao longo do tempo medindo-se a absorbância da solução,que diminuirá ao longo do tempo durante a agregação de plaquetas. Como umcontrole positivo, usou-se 10 μg/ml de colágeno (Kollagenreagens Horm,NYCOMED Pharma GmbH, Linz, Áustria; lote 502940), ou 5 μΜ depeptídeo ativador de receptor de trombina sintética TRAP (Nh2-SFLLRN-COOH5 SEQ-ID 7). A agregação foi registrada durante 15 minutos e expressacomo o percentual da luz transmitida (de 0 a 100%).

Preparação de uma matriz de afinidade de estrutura β cruzada paracapturar proteínas que se ligam a proteínas dobrada incorretamente sPara poder investigar adicionalmente se um subconjunto dasIg's na IgIV se liga a proteínas dobrada incorretamente s, nós preparamos umamatriz de afinidade com proteína dobrada incorretamente ligada. Para tal fim,nós acoplamos Hb glicada a CNBr- Sepharose (GE Healthcare-Amersham,Roosendaal, Países Baixos) de acordo com as recomendações do fabricante.

Para acoplamento de um dia para o outro a 4°C em uma banca de rolamento,250 μg de pérolas aspiradas, lavadas com HCl e tamponador de acoplamento(peso seco) foram incubados apenas com 125 μΐ de tamponador deacoplamento (pérolas de controle) (100 mM de NaHCO3, pH 8,3, 500 mM deNaCl) ou com tamponador de acoplamento com 3,33 mg/ml de Hb-AGE.

Após lavagem extensiva, nós determinamos se Hb-AGE estava acoplado àSepharose e se a matriz de afinidade preparada foi efetivamente capaz decapturar proteínas que apresentam afinidade por proteínas dobradasincorretamente com uma conformação de estrutura β cruzada. A eficiência deacoplamento foi determinada comparando-se a concentração do material departida de Hb-AGE com o sobrenadante de Hb-AGE após a reação deacoplamento. Preparou-se séries de diluição em manchador de proteínaADVOl (Cytoskeleton) e a absorbância foi lida a 590 nm. Comparação dossinais de absorbância revelaram que 50% do Hb-AGE foram ligados àSepharose, i.e. aproximadamente 200 μg de Hb-AGE a 250 μg de pérolas(peso seco).

Previamente, nós estabelecemos que o ativador deplasminogênio de tipo tissular é uma enzima com afinidade por proteínasdobradas incorretamente com uma conformação de estrutura β cruzada,incluindo proteínas glicadas (Bouma et ai, 2003; Kranenburg et al., 2002).

Para testar a capacidade da matriz de afinidade Hb-AGE de ligar-se a tPA, 20μΐ de uma suspensão a 1:1 de Hb-AGE Sepharose ou Sepharose de controleem HBS foram incubdos com 6 μΜ de tPA (concentração otimizada apóstestes em uma série de concentrações de 0 de 10 μΜ) por meio de incubaçãode um dia para o outro a 4°C em uma banca de rolamento, em duplicatas.Após 2 minutos de centrifugação a 8.000*g e descartando-se o sobrenadante,pérolas foram lavadas cinco vezes com HB S. tPA ligado foi eluídoincubando-se a matriz durante 1 h à temperatura ambiente com 20 μΐ detamponador de eluição (10 mM de HEPES pH 7,4, 1140 mM de NaCl, 10mM de ácido ε-amino capróico, 4,5 mM de CaCl2, 0,005% de Tween20). Oeluado foi analisado quanto ao teor de tPA e isto foi comparado com o teor detPA da mistura de incubação antes e após o contato da Hb-AGE Sepharose ouSepharose de controle. Determinou-se concentrações relativas de tPA usandoum substrato cromogênico de tPA S2765 (Chromogenix, InstrumentationLaboratory SpA, Milano, Itália). Para tal fim, de 1 a 5 μΐ de amostras detestador (soluções de partida de tPA, sobrenadante após contato da Hb-AGESepharose, eluado após incubação de Hb-AGE Sepharose com tamponador deeluição) foram misturados com 10 μΐ de S2765 5 mM e 5 μΐ de uma soluçãode consumo de 10 vezes HBS, e isto foi ajustado com H2O a um volume finalde 50 μΐ. A conversão do substrato por meio de tPA, de um agente incolor auma substância amarela, foi registrada ao longo do tempo, em um leitor deabsorbância de placas cinética de 96 poços, a 37°C.

Em seguida, 120 μΐ ou 20 μΐ da matriz de afinidade de Hb-AGE Sepharose ou 120 μΐ ou 20 μΐ da Sepharose de controle sem proteínaacoplada foram incubados com 200 μΐ da solução de consumo de IgIV a 50mg/ml (Octagam) (4 h à temperatura ambiente). Em seguida determinou-se aconcentração da IgIV restante em solução e a quantidade de IgIV ligada àmatriz após lavagem extensiva com tamponador de incubação. Determinou-seas concentrações de proteína medindo-se a absorbância a 280 nm, usando umasérie de diluição padrão de IgIV, e comparando-se a absorbância a 590 nm deamostras de IgIV após manchamento com ADVOl (Cytoskeleton), commanchamento de uma série de diluição padrão de IgIV. IgIV ligado aSepharose Hb-AGE ou a Sepharose de controle foi lavado seis vezes comaproximadamente dois volumes de HBS (tamponador de ligação). Emseguida, IgIV ligada foi eluída com 200 μΐ de HBS com 1 M de NaCl e 10mM de ácido ε-amino capróico (30 minutos à temperatura ambiente, comagitação). A ligação a Hb-AGE imobilizada em uma placa de ELISA foianalisada com séries de diluições de IgIV não-tratada, IgIV após contato deHb-AGE — Sepharose, IgIV após contato com Sepharose de controle, IgIVeluída de Hb-AGE — Sepharose, IgIV eluída de Sepharose de controle. Paratal fim, 5 μg/ml de Hb-AGE ou de BSA desnaturado com calor foramrevestidos durante 1 h à temperatura ambiente, com agitação (placa de altaligação Greiner Microlon). Placas foram bloqueadas com Reagente deBloqueio (Eoche). A liqüefação de séries de diluição das preparações de IgIVfoi avaliada como descrito acima. A quantidade relativa de IgIV em IgIVeluída de Hb-AGE - Sepharose e em IgIV eluída de Sepharose de controle foicalculada com relação ao estoque de IgIV. Para tal fim preparou-se umacurva-padrão de uma série de diluição de IgIV ligada a Hb-AGE ou ligado aBSA desnaturada com calor. O enriquecimento da IgIV eluída de Hb-AGE —Sepharose com relação à ligação com revestimento de Hb-AGE foi avaliadousando-se IgIV que foi incubada com 120 μl de Sepharose. O enriquecimentocom relação à ligação com BSA desnaturada com calor foi avaliado com IgIVincubada com 20 μl de Sepharose.

Manchamento imuno-histoquímico de seções de cérebro de pacientes comdoença de Creutzfeldt-Jakob já falecidos, com IgIV e uma mistura deanticorpos anti-proteína dobrada incorretamente monoclonais.

Para manchamentos imuno-histoquímicos de seções de cérebrode pacientes de doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD) já falecidos, com CJDesporádica ou CJD variante nova, preparou-se seções de parafina (Dept. ofPathology, University Medicai Center Utrecht, Países Baixos). As seçõesforam submetidas a um procedimento de manchamento padrãocompreendendo as seguintes etapas: 1. seções fixas foram bloqueadas comtamponador de bloqueio, 2. incubadas com IgIV ou anticorpos monoclonaiscom afinidade por proteínas dobradas incorretamente com uma conformaçãode estrutura β cruzada, diluídas em tamponador de ligação, 3. lavadas, 4.incubadas com um anticorpo de IgG anti-humano e anticorpos IgG/IgM anti-murinos, respectivamente, 5. lavadas, 6. incubadas com Powervision, 7.lavadas, 8. manchadas com DAB, e 9. encerradas e montadas,decontaminadas por meio de um tratamento com ácido, antes da análisemicroscópica e classificação. O procedimento foi realizado por pessoalqualificadao no laboratório de categoria III autorizado, equipado para trabalhocom materiais contaminados com TSE, localizado na UMC Utrecht, PaísesBaixos). Como controle, seções foram incubadas consecutivamente com tPA,um anticorpo anti-tPA monoclonal murino e Powervision, seguido demanchamento com DAB. Como um controle para o procedimento demanchamento, seções de cérebro de um paciente de doença de Alzheimer jáfalecido também foram incubadas com IgIV ou tPA, de acordo com o mesmoprocedimento indicado acima.

Resultados e discussão

Exemplo 1: IgIV (anticorpos de IgG de imunoglobulina humana) liga-sea proteínas dobradas incorretamente compreendendo conformação deestrutura β cruzada

Modificação não-enzimática de proteínas por carboidratos, umprocesso denominado glicação induz dobramento incorreto de proteínaaccompanhado de formaçao de estrutura β cruzada amilóide (Bouma et al.,2003). A ligação de IgIV a proteínas glicosadas imobilizadas Hb-AGE eBSA-AGE e não-glicosadas Hb e BSA foi estabelecida usando-se umamontagem ELISA (Figura 1A-C). A ligação de IgIV foi detectada usando-seanticorpos de IgM ou IgG anti-humanos marcados com fosfatase alcalina.

Ambas, IgIV (I) e IgIV (II), ligadas com alta afinidade a proteínas glicadascompreendendo estrutura β cruzada, enquanto que elas se ligam fracamente aalbumina nativa imobilizada e hemoglobina nativa (Figura IA-C). A afinidadede IgIV (I) por proteína imobilizada foi maior do que de IgIV (II). Aafinidade de IgIV (I) por Hb-AGE foi maior do que por BSA-AGE.

Dependendo da preparação de albumina ou hemoglobina, uma quantidadeligeiramente variante de IgIV ligada a estas proteínas 'nativas', o maisprovavelmente devido a quantidades variáveis de moléculas com umaconformação não-nativa, expondo o sítio de ligação a anticorpos de IgIV comafinidade por proteínas dobrada incorretamente s. Ativador de plasminogêniode tipo tissular é uma serina protease contendo um módulo, denominado odomínio de dedo [finger], que interage especificamente com proteínasdobradas incorretamente compreendendo estrutura β cruzada (Kranenburg etal., 2002; Gebbink et aL, 2005). A ligação de IgIV (I) na concentração sub-ótima de 15 μg/ml a proteínas glicosadas revestidas é diminuída efetivamentecom uma série de concentrações de tPA, enquanto que K2P tPA truncada nãotem influência sobre a ligação de IgIV (I) (Figura ID). É de conhecimentogeral que tPA se liga com afinidade relativamente elevada (kD deaproximadamente 500 pM) a proteínas glicadas e, com uma afinidade umtanto menor, a muitas outras proteínas dobradas incorretamente com com umaconformação de proteína similar a amilóide compreendendo estrutura βcruzada, o mais provavelmente via seu domínio de fibronectina de tipo I, quefalta em K2P tPA. De maneira similar a tPA, também o corante vermelhoCongo específico para amilóide bloqueia efetivamente a ligação de 15 μg/mlde IgIV (I) à proteína glicada revestida (Figura 4A).

Para avaliar se a IgIV possui especificidade de faixa ampplapor quaisquer proteínas dobrada incorretamente s, sem limitações à seqüênciade aminoácidos da proteína com estrutura β cruzada, MSA desnaturada comcalor, ovalbumina, e glucagônio foram analisados quanto à ligação de IgIV, etambém como ovalbumina oxidada, glucagônio, hemoglobina e LDL, e ascontrapartes de controle não-oxidadas e não-desnaturadas com calor. Para talfim, todas as proteínas foram imobilizadas sobre uma placa de alta ligaçãoGreiner microlon a uma concentração de 25 μ§/πι1 em 50 mM de NaHCO3(glucagônio: 12,5 μg/ml), e recoberta com uma série de concentrações deIgIV (I), 0/1/3/9/27/81/243/729 ng/ml em PBS/0,1% v/v Tween20.

Em conclusão, estes resultados demonstram que IgIV liga-se aproteínas dobradas incorretamente imobilizadas que compreendemconformação de estrutura β cruzada. Para substanciar adicionalmente estasverificações, avalia-se a ligação a uma série de proteínas dobradaincorretamente s. Por exemplo, avalia-se a ligação de IgIV a proteínasoxidadas, proteínas desnaturadas com calor, proteínas desnaturadas medianteexposição a superfícies (biocompatíveis), p. ex. em dispositivos de circulaçãofora do corpo, a proteínas dobradas incorretamente relacionadas com doença(p. ex. amilóide-β (doença de Alzheimer); 62-microglobulina (diálise)).

Exemplo 2: A agregação de plaquetas do sangue é induzida por proteínadobrada incorretamente similar a amilóide e é inibida por anticorposmonoclonais murinos e de IgIV humana

Plaquetas isoladas de sangue citrado recentemente coletado devoluntários humanos aparentemente saudáveis agregam-se facilmente quandoexpostas a proteínas glicadas dobrada incorretamente s, como mostrado paraplaquetas de três indivíduos diferentes (doador 1A', 'B1, 'C') com Hb-AGE(Figura 2). Quando a proteína dobrada incorretamente Hb-AGE ou BSA-AGEé pré-incubada com IgIV (I) (Figura 2A, C) ou com uma mistura de cincoanticorpos monoclonais (2E2B3D12, 7H2H2, 7H1C6A7, 7H9B9, 8F2G7H7)com afinidade por proteínas dobradas incorretamente compreendendoconformação de estrutura β cruzada (Figura 2E, F), inibe-se a agregação deplaquetas. A indução de agregação de plaquetas por colágeno ou TRAP quasenão é influenciada por IgIV (I) ou anticorpos monoclonais mistos (Figura 2B,D), indicando que os anticorpos monoclonais inibem especificamente osefeitos mediados por proteínas compreendendo estrutura β cruzada.Em uma série separada de experimentos usando plaquetas dedoadores humanos D e E, a agregação de plaquetas foi induzida com 50 μg/mlde Αβ (Figura 3). A influência de 2,5 mg/ml de IgIV (I) ou da mistura deanticorpos monoclonais sobre a agregação induzida com amilóide foi avaliada(Figura 3). Tanto IgIV (I) e também a mistura monoclonal inibem agregaçãode plaquetas induzida com amilóide com plaquetas de dois doadoresdiferentes (D e E). Doador D apresenta um% de agregação final que é maiordoque no caso do doador E mediante estimulação com Αβ. No caso de ambosos doadores, IgIV (I) retarda o início da agregação de plaquetas emaproximadamente 2 minutos. Plaquetas do doador D que são incubadas tantocom Αβ como também com IgIV agregam-se finalmente em um grau similarquando comparado com incubação com Αβ. Com plaquetas do doador E, aadição de IgIV a Αβ resulta em uma inibição mais forte de agregação deplaquetas. Aplicou-se 4 μΜ de TRAP como um controle positivo. Emexperimentos de controle, a influência de IgIV ou de anticorpos monoclonaissobre a ativação de TRAP de plaquetas foi analisada por meio de pré-incubação do estoque de TRAP com a mistura de anticorpos monoclonais.Estes experimentos de agregação mostraram que a IgIV ou os anticorposmonoclonais não influenciam a agregação induzida com TRAP (nãomostrado).

Estes resultados mostram que a IgIV humana contémanticorpos que inibem a agregação de plaquetas induzida por proteínasglicadas e Αβ compreendendo estrutura β cruzada. A mistura de anticorposanti-proteína dobrada incorretamente monoclonais apresenta uma atividadeinibidora similar que é indicativa da presença de anticorpos anti-proteínadobrada incorretamente na solução terapêutica de IgIV humana. Uma amplavariedade de proteínas dobradas incorretamente está sendo testada agoraquanto a sua capacidade de induzir agregação de plaquetas.Subseqüentemente, avalia-se a influência da IgIV humana ou anticorpos anti-proteína dobrada incorretamente murina para substanciar as presentesverificações. Proteínas dobradas incorretamente usadas para induzir aagregação de plaquetas são, embora sem limitação, proteínas oxidadas,proteínas desnaturadas (com calor), proteínas glicadas, proteínas expostas asuperfícies desnaturadoras ou a moléculas desnaturadoras, p. ex. CpG-ODN,lipopolissacarídios, sulfato de dextrano, caulim, vidro, lipídeos, ou peptídeosamilóides, p. ex. FP6, amilóide-β, FPl3.

Exemplo 3: Potencialização de ligação de IgIV e tPA a proteína dobradaincorretamente , por Tioflavina T e Tioflavina S

Dois corantes específicos para amilóide, Tiofiavina T eTiofiavina S, inibem a interação de proteína glicada - IgIV até certo grau, emconcentrações de corante relativamente baixas, enquanto que, emconcentrações de corante relativamente elevadas, ambos os corantes parecemfacilitar a ligação de IgIV a proteína dobrada incorretamente imobilizada(Figura 4B, C). Isto é explicado pelo fato de que a ligação de um coranteespecífico para amilóide a uma proteína dobrada incorretamente facilita asubseqüent ligação de uma proteína com afinidade por ligação a proteínasdobrada incorretamente s. A ligação de Tiofiavina T e Tioflavina S estabilizaas moléculas circundantes ou parte das moléculas com uma conformação deestrutura β cruzada em um estado relativamente fixo que representa um sítiode ligação para IgIV. Em concentrações baixas de corante, estas forças aindasão muito fracas para provocar fixação em um sítio de ligação de IgIV maisuniforme expondo estrutura β cruzada. Agora, a ligação de corante competediretamente pelos sítios de ligação de IgIV. A concentrações mais altas decorante, moléculas de corante ligadas exercem suas forças estabilizadorassobre a estrutura β cruzada circundante, de maneira concertada, criando comisso sítios de ligação facilmente acessíveis para IgIV. Efeitos similares devermelho Congo e Tioflavina T são observados quando se considera a ligaçãode uma concentração sub-ótima de tPA para imobilizar BSA-AGE ou Αβ(Figura 4D-G). A observação de que a ligação de uma molécula específicapara amilóide a estrutura β cruzada em determinadas condições facilita aligação de outra molécula com especificidade por proteínas dobradaincorretamente s, é usada para aperfeiçoar a eficácia de drogas, comoanticorpos, e para tratar doenças de dobramento incorreto de proteínas, comoamiloidose.

Exemplo 4: Matriz de afinidade de Sepharose-proteína dobradaincorretamente para proteínas de ligação com afinidade por ligantes comuma conformação de estrutura β cruzada similar a amilóide

A imobilização de hemoglobina extensivamente glicada comglucose-6-fosfato, Hb-AGE, na matriz de CNBr-Sepharose resultou em umamatriz de afinidade eficiente para capturar tPA da solução (Figura 5). É deconhecimento gerral que tPA se liga especificamente à proteína dobradaincorretamente matriz de afinidade (Figura 5A). Isto é descritoadicionalmente analisando-se o teor de tPA do tamponador de lavagem apósincubação deste tamponador com matriz de afinidade de Sepharose proteínadobrada incorretamente Hb-AGE incubada com tPA ou matriz de controleincubada com tPA sem proteína acoplada (Figura 5B). Quase nenhumaatividade de serina protease de tPA é recuperada no tamponador de lavagemapós lavagem de Hb-AGE Sepharose, e observa-se alguma atividade de tPAno tamponador de lavagem após a lavagem de pérolas de controla incubadascom tPA. Após incubação de matriz de afinidade incubada com tPA e matrizde controle com tamponador de eluição, análise da recuperação da atividadede tPA no tamponador de eluição mostra que a Hb-AGE Sepharose é umamatriz de afinidade eficiente e seletiva para tPA (Figura 5C).

Em uma série seguinte de experimentos, a matriz de afinidadede Hb-AGE Sepharose para proteínas que se ligam a proteínas dobradaincorretamente s, foi usada para capturar a fração de IgIV que se ligaespecificamente a proteínas dobrada incorretamente s. IgIV que se ligouespecificamente a Hb-AGE — Sepharose foi testadas quanto à ligação comHb-AGE imobilizada e BSA desnaturada com calor, em um ELISA. Emprimeiro lugar, preparou-se uma curva padrão de uma série de diluições doestoque de IgIV usando-se manchador de proteína ADVOl (Figura 5D).

Determinou-se concentrações de IgIV após contactar a matriz de afinidade eapós eluição de proteína ligada da matriz de afinidade usando-se a curvapadrão de IgIV. De uma maneira similar, preparou-se curvas padrão para aligação de séries de diluições de estoque de IgIV a Hb-AGE imobilizada ouBSA desnaturada com calor (Figura 5E, H). Concentrações relativas de IgIVem IgIV após contactar matriz de afinidade ou matriz de controle e noseluados foi determinada calculando-se concentrações de IgIV usando ascurvas padrão. Estas concentrações de IgIV calculadas foram comparadascom concentrações de IgIV que foram determinadas diretamente usando-semanchador ADVO1. Com estes números, calcula-se um fator deenriquecimento para ligação específica de IgIV a proteínas dobradaincorretamente s. Na Figura 5F, mostra-se a ligação de estoque de IgIVdiluído 1000 vezes (50 μg/ml) e IgIV contactada com Hb-AGE — Sepharoseou Sepharose de controle a Hb-AGE revestida. A ligação de Hb-AGE éreduzida em aproximadamente 50% após contactar IgIV com matriz de Hb-AGE, enquanto que não se observa diminuição de sinal após contato de IgIVcom matriz de controle. As concentrações totais de proteína após contato damatriz de Hb-AGE ou matriz de controle foram de 55 e 60 mg/ml. Estesdesvios do valor esperado como máximo, de 50 mg/ml (material de partida)resultam da não-linearidade da curva padrão. Nas frações de IgIV eluídas deHb-AGE - Sepharose e matriz de controle, estavam presentes 120 e 7 μg/mlde IgIV, respectivamente, como determinado com manchador de proteínaADVO1. Quando se avaliou a ligação dos eluados diluídos 100 vezes a Hb-AGE imobilizada, os sinais observados corresponderam a sinais obtidos apósa ligação de aproximadamente 75 e 0,3 mg/ml de estoque de IgIV (Figura5G). Portanto, em conclusão, 120 μ^ηιΐ de IgIV enriquecida com matriz deafinidade de Hb-AGE — Sepharose liga-se a Hb-AGE com uma potênciacorrespondente a aproximadamente 75 mg/ml do estoque original de IgIV.Isto corresponde a um fator de enriquecimento de aproximadamente75.000/120 = 600 vezes. Na Figura I descreve-se que contactando IgIV comHb- AGE — Sepharose ou matriz de controle não se reduz o sinais obtidosapós avaliação da ligação de IgIV a BSA imobilizada desnaturada com calor,quando se compara com o material de partida. No entanto, quando se testouos 120 μg/ml de IgIV que foram eluídos da matriz de Hb-AGE quanto àligação com BSA desnaturada com calor, sinais corresponderam a sinaisobtidos após a ligação de 1,7 mg/ml de material de partida (estoque originalde IgIV) (Figura 5J). Isto mostra o contato de IgIV com matriz de afinidadede proteína dobrada incorretamente aumenta a especificidade por BSAdesnaturada com calor em aproximadamente 1700/120 = 14 vezes.

Alternativamente a Hb-AGE, outras proteínas dobradasincorretamente são imobilizadas em uma matriz para aperfeiçoar aseletividade, afinidade, capacidade e/ou estabilidade da matriz de afinidade.Proteínas dobradas incorretamente alternativas que são imobilizadas são,embora sem limitação, proteínas oxidadas, proteínas desnaturadas (comcalor), proteínas glicadas, proteínas expostas a superfícies desnaturadoras oumoléculas desnaturadoras, p. ex. CpG-ODN, lipopolissacarídios, sulfato dedextrano, caulim, vidro, lipídeos, ou peptídeos amilóides, p. ex. FP6,amilóide-β, FP13. Alternativamente à CNBr-Sepharose, aplica-se outrasmatrizes ou suportes sólidos para imobilização do ligante de proteína dobradaincorretamente . De preferência, o suporte sólido é produzido em condiçõesde boa prática de fabricação (GMP, good manufacturer practice), e, depreferência, a matriz é designada como um 'Meio de bioprocesso', referindo aaspectos de segurança da matriz que são compatíveis com o uso médico parahumanos. Outras matrizes/suportes sólidos compreendem, embora semlimitação, NHS-Sepharose, Streptavidina-Sepharose, pérolas de látex,esuporte sólido ativado com epóxi, p. ex. polimetacrilato reticulado,Sepharose de tiol ativado, Carboxylink, epóxido Profinity.

Prepara-se uma matriz de afinidade usando uma proteínadobrada incorretamente que contribui para uma doença específica. Com estamatriz de afinidade, aquelas Ig's que se ligam a proteína dobradaincorretamente com uma conformação de estrutura β cruzada associada comdoença, são isoladas seletivamente. Após a recuperação desta fração de Ig,obtém-se uma IgIV específica para doença com resultado benéfico específicomais elevado quando usado como terapia para a doença de mal dobramento.Aplica-se neste procedimento não só IgIV compreendendo apenas IgG's, mascada fração de Ig é testada quanto à presença de um subconjunto deanticorpos benéfico, p. ex. anticorpos da subclasse de IgM. Alguns poucosexemplos de proteínas dobradas incorretamente que são associados com umestado de doença e que são aplicados para a preparação da matriz de afinidadede enriquecimento de IgIV são amilóide-β (doença de Alzheimer), proteínasglicadas (diálise, diabetes), 62-microglobulina (diálise), transtiretina(amiloidose sistêmica). Ver as Tabelas 4 e 5 para exemplos adicionais deproteínas que formam moléculas ricas em estrutura β cruzada dobradaincorretamente e que são usadas para o procedimento de enriquecimentoespecífico para doença.

Novas construções que combinam alta especifidade e afinidade porproteínas dobradas incorretamente com um sinal de eliminação: quimerade proteína de ligação de proteína dobrada incorretamente com domíniosFc de Igs.

Com base nas verificações de que moléculas de IgG na IgIV eanticorpos de IgGl/IgM/IgG2a monoclonais murinos se ligam a proteínasdobradas incorretamente com uma conformação de estrutura β cruzada,projeta-se uma nova molécula com especificidade e/ou afinidade ainda maiorpor proteínas dobrada incorretamente s, combinado com a capacidade de serpropensa à eliminação via interação com receptores de Fc. Para tal fim,domínio de dedo [finger] (F) ou qualquer outro domínio de proteína comafinidade por estrutura β cruzada, p. ex. um domínio de Ig de receptor paraprodutos acabados avançados de glicação, um domínio de (aglomerado II,aglomerado IV de) proteína relacionada com receptor de lipoproteína de baixadensidade, um domínio dos receptores de aglutinador A, -B-I ou CD36, éfundido no nível do DNA ou no nível do aminoácido com uma porção Fc deuma molécula de Ig. Efetivamente, qualquer uma das proteínas que temafinidade por proteínas dobradas incorretamente proporciona um domíniovantajoso para introduzir especificidade para estrutura β cruzada naconstrução complexa com o domínio Fc (Tabela 4, 5). Domínios de dedo[finger] de tPA, fator XII, ativador de fator de crescimento de hepatócitos efibronectina ligam-se, todos, a proteínas dobradas incorretamente com umaconformação de estrutura β cruzada, e, portanto, todos são usados para oprojeto de construções quiméricas. Qualquer tipo de combinação de domíniosde dedo [finger] ou extensões de múltiplos domínios de dedo ou combinaçõesde domínio(s) de dedo e outros domínios de ligação de proteína dobradaincorretamente , também pode ser aplicado para o desenvolvimento de umaconstrução quimérica com um domínio Fe. O gene de quimera é fundido epreparado sinteticamente e é clonado em um vetor de expressão apropriadopara fins de expressão em, por exemplo, células de levedura, células deplantas, bactérias, células eucarióticas, p. ex. células de rim embrionáriohumano, células de rim de bebê de hâmster. Após a purificação, por exemplo,da proteína quimérica F-Fc recombinante, esta foi applicada como um agenteterapêutico para qualquer uma das doenças para as quais a IgIV tem sidousada. Alternativamente, regiões de afinidade ou moléculas sintéticas ouqualquer (porção de uma) proteína com afinidade por estrutura β cruzada oupor uma proteína compreendendo estrutura β cruzada, são fundidas, porexemplo, a regiões Fc por meio de qualquer método conhecido por umapessoa versada na arte para acoplamento (não)covalente de (fragmentos de)proteína. Além disso, moléculas não-proteináceas com afinidade por estruturaβ cruzada e/ou moléculas compreendendo estrutura β cruzada (Tabela 3) sãofundidas a regiões de Fc de uma maneira similar.

Exemplo 5

Modelos para testar os efeitos protetores e/ou benéficos da administraçãode IgIV, IgIV enriquecida purificada por afinidade ou estruturasquiméricas de uma molécula ou proteína de ligação de proteína dobradaincorretamente e um domínio Fc

Para testar um efeito benéfico da IgIV, ou de uma fração deIgIV enriquecida após purificação por afinidade com uma matriz comproteína dobrada incorretamente acoplada, anticorpos anti-proteína dobradaincorretamente (humanizados), ou uma estrutura quimérica de, por exemplo,um domínio de dedo [finger] e um domínio Fc de uma molécula de IgG5aplica-se vários modelos baseados em células in vitro para estados de doença,e também em modelos animais ou humanos in vivo, para determinar sereferidas modalidades apresentam um efeito benéfico mais pronunciado doque a administração de IgIV total ou do que terapia convencional corrente.

Ensaio de células dendríticas murinas in vitro

A (auto)imunidade é dependente da apresentação de(auto)antígenos por células apresentadoras de antígeno, como célulasdendríticas. Células dendríticas (DCs, dendritic cells) murinas cultivadas sãoaplicadas, portanto, como um modelo para a (auto)imunogenicidade. Para talfim, DCs são isoladas das pernas traseiras de, por exemplo, camundongosBlack-6 com de 8 a 12 semanas de vida. Ossos são isolados e enxaguados emetanol a 70%, enxaguados em meio RPMI-1640 com 25 mM de HEPES, com10% de soro de bezerro fetal, penicilina e estreptomicina. Então o osso éenxaguado com este tamponador, em ambas as direções. Os eluados sãolivrados dos eritrócitos por meio de adição de tamponador de Iise específicopara eritrócitos (obtido da UMC Utrecht Pharmacy Dept. local, número decatálogo 97932329). Eluados são analisados para determinar as célulasviáveis por meio de cultura das mesmas em placas de cultura de células. Nesteestágio, o meio é enriquecido com 10 ng/ml de GM-CSF. Crescimento deDCs em suspensão ou numa camada de células de macrófagos. Usando-se umFACS e anticorpos específicos, determina-se se as DCs estão presentes eativadas. De preferência, os níveis de assim-chamadas moléculas co-estimuladoras, como B7.1, B7.2, MHC classe II, CD40, CD80, CD86 sãodeterminados, de preferência, em células positivas para CDl lc.Alternativamente, a ativação de NF-κΒ e/ou a expressão de citocinas é usadacomo indicadores de ativação de células envolvidas na imunogenicidade,como APC e DC. De preferência, quantifica-se as citocinas a seguir: TNFa,IL-1, IL-2, IL-6, e/ou IFNy. De preferência, os níveis de citocinas sãoquantificados com ELISA. Alternativamente, quantifica-se os níveis demRNA. Para uma pessoa versada na arte é evidente que a função de APC eDC também é testada.

Alternativamente, usa-se uma linha de DC estável, célulasdendríticas cultivadas obtidas de monócitos coletados de sangue humano ououtras células apresentadoras de antígeno, para testar efeitos benéficos daesgotamento ou neutralização de proteínas dobradas incorretamente comestrutura β cruzada (Citterio et ai., 1999).

Experimentos adicionais que são realizados com DCs são aexposição das células a lipopolissacarídio (LPS), seguido de leitura dos níveisdos marcadores de ativação indicados acima. Testa-se também o efeito de pré-e/ou co-incubações de LPS com IgIV (enriquecida) e/ou outras regiões deafinidade antes ou durante a exposição dos LPS a DCs. Estes experimentossão observados como um modelo para infecção bacteriana e sépsis emhumanos.Ensaio de células endoteliais de veia umbilical humana in vitro

Proteínas glicadas compreendendo estrutura β cruzada induzemresposta inflamatória, que se acredita contribuem para a patogênese dedeterminadas doenças incluindo nefropatia diabética. De uma forma geral,proteínas dobradas incorretamente induzem disfiinção celular com expressãoincrementada ou ativação de sinais inflamatórios. O efeito de proteínas dobradasincorretamente sobre a (dis)função de células endoteliais é medida, por exemplo,determinando-se os níveis de espécies de oxigênio reativo em resposta aproteínas dobrada incorretamente s. Usa-se células endoteliais de veia umbilicalhumana que são isoladas e cultivadas, de acordo com protocolos convencionais,ou então outras células endoteliais, como células endoteliais bEnd.3. Os níveisde espécies de oxigênio reativo (ROS, reactive oxygen species) são monitoradoscom o uso de sondas fluorescentes, como CM-H2DCF-DA. Alternativamente,monitora-se a viabilidade das células com um ensaio de MTT. As célulasprimárias cultivadas proporcionam a oportunidade de realizar ensaios de célulasin vitro que são aceitos na comunidade de pesquisa como sistemas-modelo paradeterminados estados de doença. Novamente, aplica-se nestes sistemas acapacidade de IgIV, frações isoladas das mesmas, um equivalente funcional ounossos anticorpos anti-β cruzada.

Modelo murino in vivo de coagulação intravascular disseminada

Estrutura β cruzada induz coagulação intravasculardisseminada (DIC, disseminated intravascular coagulatiori). Como ummodelo para a DIC em camundongos C57B1/6 fêmeas elicita-se a reaçãogeneralizada de Shwartzman. Para tal fim, camundongos recebem injeçõescom 5 μg de lipopolissacarídio (LPS) na planta do pé no dia = 0 e com 300 μgde LPS intravenosamente a t = 24 h. Monitora-se a sobrevida ao longo dotempo, juntamente com diversos níveis plasmáticos de proteínas, p. ex.citocinas.

Modelo de encefalomielite autoimune experimental em camundongo/ratoin vivo

Para testar se anticorpos anti-proteína dobrada incorretamenteproporcionam um efeito benéfico durante um recidiva de esclerose múltipla(MS, multiple sclerosis), usa-se um modelo de camundongo in vivo para MS,o modelo experimental de encefalomielite autoimune (ou alérgica). Para talfim, proteína básica de mielina (MBP, myelin basic protein) ou peptídeo deglicoproteína de oligodendrócito de mielina 35-55 (MOG35-55) éemulsificado em Adjuvante de Freund Incompleto (IFA, Incomplete Freund'sAdjuvant) com micobactéria. A presença de proteínas dobradasincorretamente é determinada usando-se ensaios de fluorescência deTioflavina T e vermelho Congo, e também ensaios de ativação e ligação detPA. Avalia-se a ligação de IgIV ou de uma fração enriquecida de IgIV apóspurificação por afinidade, à MBP emulsificada ou MOG35-55. Para induzirEAE em camundongos ou ratos, a MBP emulsificada ou MOG35-55 éinjetado, por exemplo, na almofada da pata traseira. Em camundongos, umaquantidade injetada subcutaneamente de MOG35-55 é acompanhada, depreferência, de uma injeção intraperitoneal de toxina de Bordetella pertussis,que é repetida após 48 h. Por exemplo, usa-se ratos Lewis fêmeas, oucamundongos Balb/c fêmeas. Medidas para doença clinica são classificadas,por exemplo, como a seguir: 0, normal; 1, cauda caída; 2, reflexo deendireitamento prejudicado; 3, paresia dos membros traseiros; 4, paralisiacompleta dos membros traseiros; 5, morte. O efeito de qualquer preparação deanticorpos (quiméricos) é analisado administrando-se a droga em um ou maismomentos após indução de EAE. Uma das preparações testada é a IgIV que épurificada por afinidade em uma matriz de afinidade com MOG35-55 ouMBP dobrada incorretamente ou desnaturada imobilizada, dependendo dequal das duas proteínas é usada para induzir a doença.

Modelo de artrite induzida com colágeno in vivo

No modelo de artrite induzida com colágeno in vivo, ratosrecebem injeções intradérmicas na base da causa e no dorso acima de cadaperna com colágeno de tipo II (bovino), dissolvido em ácido acético eemulsificado em EFA. Os ratos são examinados diariamente em busca desinais de doença mediante monitoramento do inchaço e eritema. Uma daspreparações testadas é IgIV que é purificada por afinidade em uma matriz deafinidade com colágeno dobrado incorretamente /desnaturado imobilizado em IFA.

Modelo de sépsis de camundongo in vivo

Sépsis é mediada por estrutura β cruzada. Um dos modelos desépsis em camundongo in vivo que é aplicado para testar efeitos da IgIV5anticorpos monoclonais ou drogas relacionadas, é o modelo de 'ligação cecale punção'. Para este modelo, mice BALB/c fêmeas são anestesiados antes dese realizar uma incisão abdominal para retirar o ceco do abdome. Após opuncionamento do ceco, uma quantidade do conteúdo luminal é transferidapara fora através das punções, antes que o ceco seja recolocado no abdome eo camundongo fechado. A progressão da infecção é monitorada medindo-se atemperatura do corpo e classificando-se a mobilidade dos camundongos.Considera-se os camundongos infectados letalmente quando eles semostrarem hipotérmicos (T < 33°C) e quando os camundongos se mostraremincapazes de se endireitarem por si sós. Efeitos da administração deanticorpos com afinidade por proteínas dobradas incorretamente com umaconformação de estrutura β cruzada após o puncionamento do ceco sãoavaliados monitorando-se um grupo de camundongos não-tratados e umgrupo de camundongos que recebeu uma IgIV (enriquecida), anticorposmonoclonais ou uma construção quimérica.

Modelo de sépsis de rato in vivo

Como uma alternativa para o modelo de sépsis decamundongo, usa-se o modelo de sépsis de rato. Por exemplo, induz-sechoque endotóxico em ratos Fischer com pesos de aproximadamente 150 gpor meio de injeção intravenosa de 15 mg/kg de endotoxina de Escherichiacoli. Como uma medida para a progressão de doença, monitora-se, nosELISAs, os níveis de fator de necrose de tecido e interleucina-1 no sangue.Desta maneira avalia-se os efeitos do tratamento com qualquer preparação deIgIV ou anticorpo ou construção quimérica com afinidade por proteína não-dobrada.

Modelo de artrite induzida por parede celular de Streptococcus reativadode camundongo in vivo

Em um modelo de camundongo in vivo de artrite induzida porparede celular de Streptococcus reativado, mice C57BL/6 são induzidos poruma injeção intraarticular nas juntas dos joelhos com paredes celulares deorganismos de Streptococcus pyogenes Tl2. A injeção é repetida cinco vezescom intervalos de 1 semana. A progressão da doença é acompanhada, porexemplo, durante cerca de 40 dias por meio de medição do inchaço de juntasdos joelhos que receberam injeções. Após eutanizar os camundongos,classifica-se a gravidade macroscopicamente da artrite após remover a peledas juntas dos joelhos. Os efeitos da administração de anticorpos anti-estrutura β cruzada ou quimera são comparados com controles que nãoreceberam terapêutico e com camundongos de controle que foram injetadoscom tamponador.

Modelo de artrite reumatóide experimental de camundongo in vivo

Em um modelo de camundongo in vivo para artrite reumatóideexperimental induzida com colágeno, por exemplo, camundongos machos dacepa DBA/1 e/ou camundongos machos da cepa C57BL/6 são expostos acolágeno bovino nativo de tipo II. Artrite é induzida injetando-se colágenoemulsificado em adjuvante de Freund completo com Mycobacteriumtuberculosis, subcutaneamente na base da cauda. Camundongos recebemreforços no dia 21 com colágeno emulsificado em IFA. Camundongos sãomonitorados para determinar a evidência de artrite, e classifica-se a gravidadeda doença, usando-se um procedimento de classificação convencional. Oefeito de uma terapia à base de anticorpos é avaliado comparando-secamundongos de controle com artrite e camundongos de controle quereceberam injeções duas vezes apenas com tamponador, com camundongostratados com IgI V/anticorpo monoclonal/construção quimérica após induçãoda artrite.

Modelo de imunogenicidade/inflamação humana in vivo: administraçãode proteína glicosada +/- IgIV

Proteínas glicosadas compreendendo estrutura β cruzadainduzem uma resposta inflamatória, contribuindo para a patogênese dedeterminadas doenças incluindo nefropatia diabética. De uma forma geral,proteínas dobradas incorretamente induzem disfunção celular com expressãoincrementada ou ativação de sinais inflamatórios. Os efeitos inflamatórios deproteínas dobradas incorretamente e reagentes anti-estrutura β cruzada, comoIgIV5 frações da mesma, ou equivalentes funcionais de inflamação sãoestudados em camundongos e humanos. Proteínas compreendendo estrutura βcruzada são infundidas por meio de administração intravenosa. Mediu-se emdiferentes intervalos de tempo o efeito sobre o nível de proteínas de faseaguda, como proteína C-reativa, amilóide do soro A (SAA, Serum AmyloidA), componente P do amilóide do soro (SAP, Serum amyloid P-component)ou fator de complemento 3 (C3). Alternativamente, determina-se o efeitosobre outros marcadores dos níveis de inflamação, como IL-6, IL-8, dímero Dou protombina F1+2. Finalmente, determina-se os níveis de formação de(auto)anticorpos por meio de ELISA.

Ensaio com sangue integral para a determinação da naturezainflamatória ou imunogênica de compostos

Uma maneira de avaliar se a ativação de células do sistemaimunológico por proteínas com uma conformação de estrutura β cruzada ébloqueada usando compostos de ligação de estrutura β cruzada, p. ex. IgIV,anticorpos anti-estrutura β cruzada monoclonais, construções quiméricas, épor meio do uso de um ensaio de 'sangue integral'. Para este fim, no dia 1adiciona-se sangue humano recentemente colhido com EDTA numa relaçãode 1:1 para meio RPMI-1640 (tamponado com HEPES, com L-glutamina,Gibco, Invitrogen, Breda, Países Baixos), que é pré-aquecido a 37°C.Subseqüentemente, adiciona-se proteínas compreendendo conformaçaõ deestrutura β cruzada, com ou sem compostos de ligação de estrutura β cruzada.De preferência, inclui-se um controle positivo, de preferência, LPS. Uminibidor que é usado para LPS é Polimixina B, a uma concentração final de 5μg ml-1. Polipeptídeos ricos em conformação de estrutura β cruzadaconvencional que são testados compreendem Αβ, γ-globulinas amilóides,proteínas glicadas, FP13, OVA desnaturada com calor, BSA desnaturada comcalor, MSA desnaturada com calor, lisozima desnaturada com calor, e β2gpiexposto a cardiolipina. Controles negativos são γ-globulinas nativas, albuminanativa, Hb nativa, Αβ recentementee dissolvida ou FP13, OVA nativa, outrasproteínas nativas. Como um controle, todas as amostras de proteína sãotestadas na ausência ou na presença de 5 μg ml-1 de Polimixina B para excluirefeitos observados devido a contaminações de endotoxina putativa.Adicionalmente, proteínas nativas sozinhas ou pré- expostas a adjuvantesdesnaturadores, p. ex. LPS, e CpG-ODN, ou outros compostos desnaturadoresou condições desnaturadoras (p. ex. oxidação de Cu2+), são testadas quanto àatividade imunogênica. Todos os compostos testadores são testados naausência e na presença de uma série de concentrações de um inibidorpotencial da resposta inflamatória ou imunogênica, p. ex. IgIV, anticorposanti-β cruzada monoclonais. O volume final de ativadores, controles e deinibidores potenciais adicionados à mistura de sangue-meio é deaproximadamente 1/200 do volume total. É possível obter concentraçõesmaiores de ativadores e de inibidores putativos por meio do uso de meioRPMI-1640 concentrado para etapas de pré-diluição (pó de meio RPMI-1640,Gibco, Invitrogen; número de catálogo 51800-035). O sangue e o meio sãomisturados cuidadosamente e incubados de um dia para o outro em umincubador de CO2 com tampas que permitem a entrada de CO2. No dia 2,coleta-se o meio após 10 minutos de centrifugação a 1.000*g, à temperaturaambiente. O pellet de células é armazenado em estado congelado. O meio écentrifugado novamente durante 20 minutos a 2.000*g, à temperaturaambiente. O sobrenadante é analisado com o uso de ELISAs em busca deconcentrações de marcadores de uma resposta imune, p. ex. fator de necrosede tecido α (TNFa, tissue necrosis factor-a), citocinas, quimiocinas. Porexemplo, níveis de TNFa após exposição de sangue integral a compostos deteste são avaliados por meio do uso de ELISA TNF-alfa/TNFSFIAcomercialmente obtenível (R&D Systems, Minneapolis, MN, E.U.A.; HumanTNF-alfa Quantikine HS PharmPak). Quando se estabelece controlespositivos e negativos, e também uma curva de titulação confiável, testa-sequalquer solução quanto à carga de estrutura β cruzada com relação aconcentrações de marcadores para imunogenicidade. Além disso, testa-seinibidores putativos da resposta imune. Por exemplo, IgIV e anticorpos anti-βcruzada monoclonais previnem uma resposta imune quando da adição asoluções de proteína dobrada incorretamente.

Fagocitose de porções compreendendo estrutura β cruzada.

A captação de proteínas compreendendo estrutura β cruzada,polipeptídeos e/ou peptídeos e também células ou partículas celulares, e oefeito de IgIV ou de um equivalente funcional do mesmo são estudados invitro usando-se células cultivadas, de preferência, monócitos, célulasdendríticas, ou macrófagos ou células similares, por exemplo, células U937ou THP-1. De preferência, moléculas compreendendo estrutura β cruzada sãomarcadas, de preferência, com 1251 ou um marcador fluorescente, depreferência, FITC, ligados covalentemente à molécula por meio de umamolécula ligante, de preferência, ULS ou outro método de acoplamentosimilar. Células são marcadas, de preferência, com mepacrina ou outrosmarcadores fluorescentes, como rodamina. Células fagocíticas são incubadasna presença de células ou moléculas compreendendo estrutura β cruzadamarcadas na presença ou ausência de um composto de ligação de estrutura βcruzada, como IgIV ou seus equivalentes funcionais. Após incubação, depreferência, durante várias horas, mede-se a absorção de células ou moléculasmarcadas, de preferência, usando um contador de cintilação (para 1251) oupor meio de análise de FACS (com sondas fluorescentes) ou microscopiaimunofluorescente. A absorção de células também é contada sob ummicroscópio iluminado com manchamento visual das células.

Exemplos de 6 a 20

Materiais e métodos gerais para os Exemplos de 6 a 20

Preparação de proteínas dobradas incorretamente com estrutura βcruzada

Dobramento incorreto o IgIV humana

IgIV Gammagard RF (IgIV RF)

IgIV Gammagard (IgIV nativa) foi dobrada incorretamente deacordo com um procedimento usado para preparar antígeno para fatorreumatóide (RF, rheumatoid factor). IgIV Gammagard foi dissolvida emcondições estéreis a 1 mg/ml em tamponador de glicina (100 mM de glicina,17 mM de NaCl pH 8,2). Isto foi aquecido durante 5 minutos a 65°C earmazenado o -80°C.

Desnaturação com calor de IgIV Gammagard (IgIV 65, IgIV 69, IgIV 76,etc.)

IgIV Gammagard foi dissolvida em condições estéreis a 5mg/ml em 20 mM de fosfato de sódio pH 5,0, e desnaturada com calor de25°C até temperaturas indicadas com etapas de temperatura de 5°C/minuto.Temperaturas finais foram de 65°C, 69°C, 76°C, 80°C, 83°C e 86°C. Apósdesnaturação com calor, proteínas foram armazenadas imediatamente a-80°Ce sua estrutura foi analisada empregando-se diversos ensaios como descritoabaixo. Como controle nativo, IgIV Gammagard recentemente dissolvida, auma concentração de 5 mg/ml em 20 mM de fosfato de sódio pH 5,0 foimantida à temperatura ambiente durante 10 minutos, e armazenada a -80°C.Desnaturação de IgIV Gammagard com HFIP/TFA (IgIV HFIP/TFA)

IgIV Gammagard foi dissolvida em condições estéreis a 5mg/ml em uma mistura a 1:1 (v:v) de l,l,l,3,3,3-hexafluoro-2-propanol(HFIP) e ácido trifluoroacético (TFA). Subseqüentemente, isto foi misturadocuidadosamente durante 5 minutos em um vórtice, à temperatura ambiente. Osolvente orgânico foi evaporado sob gás de N2 e o terceiro material foidissolvido a 1 mg/ml em H2O e incubado durante 7 dias a 37°C, earmazenado a -20°C.

Desnaturação com ácido ou base, de IgIV Gammagard (IgIV Ácido, IgIVbase)

IgIV Gammagard foi dissolvido a 5 mg/ml em PBS e incubadoà temperatura ambiente em um dispositivo de rolamento durante 10 minutos.Em seguida, o pH foi diminuído a pH 2 por meio de adição de um volume deuma solução de consumo de HCl a 15% em H2O (desnaturação com ácido),ou foi elevado a pH 11 com um volume de uma solução de consumo deNaOH 5 M em H2O (desnaturação com base), e isto foi incubado a 37°Cdurante 30 minutos. Em seguida, o pH foi ajustada a seu valor inicial,fisiológico, por meio da adição de 5 M de NaOH ou 15% de HCl,respectivamente, e isto foi armazenado a -80°C.

Dobramento incorreto de Octagam IgIV

Usou-se IgIV Octagam (Octapharma, Brussel, Bélgica, lote5024018434, exp. 12/2006). A concentração de endotoxina na IgIV foi baixa,i.e. de 0,13 E.U./ml no estoque a 50 mg/ml de Octagam, conformedeterminado usando-se um ensaio padronizado Limulus Amebocyte Lysate(LAL) (Cambrex). IgIV foi diluída em 10 mM de tamponador de NaPi (pH8,1) a 1, 2,5, 5, 10 e 20 mg/ml e aquecida em etapas (0,5°C/minuto) de 25°C a65°C, mantida à temperatura ambiente durante 1 hora e 40 minutos earmazenada subseqüentemente a -80°C. Alternativamente, IgIV foi diluídaem 10 mM de HCl, pH 2,0, e incubada a 65°C durante 6 horas. Após estaincubação, o pH foi ajustado em 7,3 com NaOH.

Desnaturação com ácido ou com base de uma composição de IgGs decamundongo (dmlgG ácida, dmlgG básica)

IgGs de camundongo (my-globulinas, da fração de Cohn II, IIIaprox. 99%, Sigma, lote 090k7680) foram dissolvidas a 1 mg/ml em PBS eincubadas à temperatura ambiente em um dispositivo de rolamento durante 20minutos. As IgGs foram dobradas incorretamente de acordo com o métododescrito acima para IgIV ácida e IgIV básica. As my-globulinas dobradasincorretamente são referidas como dmlgG ou dmy-globulinas.

Dobramento incorreto de IgG de camundongo por meio de calor (dmlgG85°C)

Composição de IgG de camundongo foi dissolvida a 1 mg/mlem PBS e incubada à temperatura ambiente em um dispositivo de rolamentodurante 20 minutos. Em seguida, ela foi aquecida em etapas de 50C porminuto de 25°C a 85°C e armazenada subseqüentemente a -80°C.

Dobramento incorreto de uma composição de IgGs humanas

IgGs humanas (γ-globulinas, Sigma, G4386) foram dissolvidasa 5 mg/ml em tamponador HEPES (20 mM de HEPES, 137 mM de NaCl, 4mM de KCl, 3 mM de CaCl2). Em seguida, o pH foi incrementado por meiode adição de um estoque de NaOH 5 M e mantido durante 40 minutos a 37°C.

Em seguida, adicionou-se uma quantidade igual de umasolução de consumo de HCl 5 M para ajustar o pH a seu valor inicial, e istofoi armazenado a -80°C. Observou-se visualmente grandes agregados.

Desnaturação com ácido e com calor de Apoliproteína A-I

Apoliproteína A-I (ApoA-I, 2,15 mg/ml, de plasma humano,Sigma, A0722, lote 116K1408) em 10 mM de NH4HCO3 e HCl adicionado a100 mM, foi desnaturadas por meio de aquecimento durante 30 minutos a37°C, 75°C ou 100°C. Subseqüentemente, adicionou-se uma quantidadeequivalente de NaOH (concentração final de 100 mM) para alterar os valoresiniciais de pH.

Apoliproteína A-I desnaturada com base e com calor

Novamente, 2,15 mg/ml de apoliproteína A-I em 10 mM deNH4HCO3, agora com adição de NaOH a 100 mM, foram desnaturados pormeio de aquecimento durante 30 minutos a 37°C, 75°C ou 100°C.Subseqüentemente, adicionou-se uma quantidade equivalente de HCl(concentração final de 100 mM) para alterar o pH a seus valores iniciais.

Apoliproteína A-I desnaturada com calor

A solução de consumo de Apoliproteína A-I (ApoA-I) a 2,15mg/ml em 10 mM de NH4HCO3 foi desnaturada com calor durante 30minutos a 75°C ou 100°C.

Desnaturação com calor, de ovalbumina (dOVA std)

Ovalbumina (OVA, de clara de ovos de galinha, Sigma,A5503 classe V, lote 07147094) foi dissolvida em PBS a uma concentraçãode 1 mg/ml, e aquecida de 30°C a 85°C durante 5 ciclos em uma máquina dePCR com etapas de temperatura de 50C por minuto. Esta OVA dobradaincorretamente é referida como dOVA ou dOVA standard (std).

Preparação de beta amilóide fibrilar 1-42 (ίΑβ42)

Peptídeo β-amilóide humano sintético liofilizado (1-42)(D AEFRHDSGYE VHHQKL VFF AED VGSNKGAIIGLMVGGVVIA; NKIAmsterdam, Países Baixos; SEQ-ID 9) (Αβ1-42) foi monomerizado primeirodissolvendo-se a 1 mM em HFIP e repartido em tubos de microcentrífugaestéreis. HFIP foi removido com gás de nitrogênio, e a película de peptídeofoi ressuspensa em sulfóxido de dimetila (DMSO, Pierce, 20684) a umaconcentração de 5 mM, congelado subitamente em nitrogênio líquido earmazenada a -80°C (solução de consumo de Αβ1-42 monomerizado). Oestoque de Αβ1-42 monomerizado descongelado, em DMSO, foi dissolvidoem 10 mM de HCl a uma concentração final de 400 μg/ml, e incubado a 37°Cdurante 24 h, e armazenado subseqüentemente a -80°C.

ΑβΙ-42 dissolvido em PBS e congelado diretamente a-80°C em t = 0(Αβ42t=0)

Estoque de ΑβΙ-42 monomerizado descongelado, em DMSO,foi dissolvido em PBS, esterilizado por meio de filtração (0,22 μm), a umaconcentração de 100 μΜ, e armazenado a-80°C.

ΑβΙ-42 dissolvido em HBS e incubado durante 24 h a 4°C (Αβ42ΗΒ8)

Estoque de ΑβΙ-42 monomerizado descongelado, em DMSO,foi dissolvido em HBS (solução salina tamponada com HEPES, 137 mM deNaCl, 4 mM de KCl, 10 mM de HEPES, pH 7,3) a uma concentração de 100μΜ. Tamponador é filtrado através de um filtro de seringa de 0,22 μπι antesdo uso. Amostras foram armazenadas a -80°C após a preparação.

Preparação de beta amilóide fibrilar 1-40 (ίΑβ40)

De forma identida a ΑβΙ-42, um estoque de peptídeo Αβ1-40humano sintético monomerizado (DAEFRHDSGYEVHH QKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW, NKI Amsterdam, Países Baixos) foi preparado earmazenado a -80°C. Αβ1-40 monomerizado descongelado, em DMSO, foidissolvido em PBS a uma concentração de 100 μΜ, e incubado durante 168 hà temperatura ambiente, e armazenado subseqüentemente a -80°C.

Αβ1-40 dissolvido em PBS e congelado diretamente a-80°C em t=0(Αβ40ί=0)

Αβ1-40 monomerizado descongelado, em DMSO, foidissolvido em PBS a uma concentração de 100 μΜ, e armazenadodiretamente a -80°C.

Αβ1-40 dissolvido em 10 mM de HCl e incubado durante 24 h a 37°C(Αβ40ΗΟ)Αβ1-40 monomerizado descongelado, em DMSO, foidissolvido em 10 mM de HCl a uma concentração de 100 μΜ, e incubadodurante 24 h a 37°C. Subseqüentemente, isto foi neutralizado com excesso dePBSl (140 mM de NaCl, 10 mM de Na2HPO4, 1,8 mM de KH2PO4, pH 7,4.PBSl é filtrado usando-se um filtro de seringa de 0,22 μπι antes do uso) earmazenado a -80°C.

Dobramento incorreto de albumina de soro humano (HSA [HumanSerum Albumine], Cealb, Sanquin, Países BaixosrIote 05C2 9H120A)

HSA, a 1, 2,5, 5, 10 e 20 mg/ml, pH 2 (diminuído com umvolume de uma solução de consumo de 5 M de HCl) foi aquecida a 650Cdurante 6 h, seguido de neutralização com um volume de uma solução deconsumo de 5 M de NaOH, e armazenada subseqüentemente a -80°C.Microscopia eletrônica de transmissão (TEM, transmission electronmicroscopy)

Imagens de TEM foram coletadas usando um microscópioeletrônico de transmissão Jeol 1200 EX (Jeol Ltd., Tokyo, Japão) a umavoltagem de excitação de 80 kV. Para cada amostra, o formvar e ladorevestido com carbono de uma grade de níquel ou de cobre de 100 mesh foiposicionada em uma gota de 5 μΐ de solução de proteína durante 5 minutos.Em seguida, isto foi posicionado em uma gota de 100 μΐ de PBS durante 2minutos, seguido de três incubações de 2 minutos com uma gota de 100 μΐ deágua destilada. Em seguida, as grades foram manchadas durante 2 mintuoscom uma gota de 100 μΐ de 2% (m/v) de metilcelulose com 0,4% de acetatode uranila pH 4. O excesso de fluido foi removido por meio de aplicação defiletes do lado das grades sobre papel filtrado, e as grades foram secadassubseqüentemente sob uma lâmpada. Amostras foram analisadas com umaumento de 10K.

Ensaio de fluorescência de vermelho Congo (CR)

O aumento da fluorescência do vermelho Congo é umacaracterística de proteínas dobradas incorretamente que compreendemcaracterísticas estruturais comuns a proteínas com uma conformação βcruzada. Fluorescência de vermelho Congo (CR) (Aldrich ChemicalCompany, Inc., Milwaukee, WI, E.U.A., 86,095-6) foi medida em duplo emum fluorímetro de microplaca Thermo Fluoroskan Ascent 2.5 (Vantaa,Finlândia) em placas pretas de 96 poços a um comprimento de emissão de590 nm e um comprimento de excitação de 544 nm. Estoques de proteína epeptídeo foram diluídos a 100 μg/ml para amostras de dOVA e IgIV e 40μg/ml para amostras de AB em 25 μΜ de CR em PBS, e incubadas durante 5minutos à temperatura ambiente. A fluorescência de fundo da solução detamponador e de proteína sem CR e de CR em tamponador foi subtraída demedições correspondentes de solução de proteína incubada com CR. Controlepositivo para as medições foi de 100 μg/ml dOVA (dOVA std).

Ensaio de aumento de fluorescência de Tioflavina T (ThT)

O aumento da fluorescência de ThT é uma característica deproteínas dobradas incorretamente que compreendem característicasestruturais comuns a proteínas dobradas incorretamente com conformação βcruzada. A fluorescência de Tioflavina T (ThT) (Sigma, St. Louis, MO,E.U.A., T-3516) foi medida de maneira análoga ao procedimento descritopara CR. O comprimento de onda de emissão foi, agora, de 485 nm e ocomprimento de onda de excitação foi de 435 nm. Estoques de proteína epeptídeo foram diluídos em 25 μΜ de ThT em 50 mM de tamponador deglicina, pH 9,0.

Ensaio de fluorescência com ácido 8-anilino-l-naftaIenosulfônico (ANS)

A fluorescência de ANS é acentuada quando ligado aaglomerados de radicais amino-acila hidrofóbicos. Quando da ligação aregiões hidrofóbicas de proteínas expostas a solvente, o comprimento de ondade emissão (λΕΜ) desvia-se de 514 nm para 460 nm quando excitado comum comprimento de onda de 380 nm (λΕΧ), acompanhado de um aumentodrástico da intensidade da fluorescência. A fluorescência do ANS (Sigma,A1028) foi medida a um comprimento de onda de emissão de 460 nm e umcomprimento de onda de excitação de 380 nm. As diversas soluções deconsumo de peptídeo e proteína de teste foram dissolvidas em 40 μΜ de ANSem PBS e incubadas durante 5 minutos à temperatura ambiente. Afluorescência de fundo da solução de. tamponador e proteína sem ANS, e doANS em tamponador foram subtraídas das medições correspondentes desolução de proteína incubadas com ANS. O controle positivo para asmedições foi de 100 μg/ml de dOVA (dOVA std).

Ensaio de aumento de fluorescência do sal de di-potássio de ácido 4,4'-dianilio-l,1'-binaftil-5,5, dissulfônico (Bis-ANS)

De forma similar a CR, ThT e ANS, mediu-se o aumento dafluorescência de Bis-ANS (Sigma). O comprimento de onda de emissão foi de485 nm e o comprimento de onda de excitação foi de 435 nm. Estoques deproteína e peptídeo foram diluídos em 25 μΜ de Bis-ANS em PBS.

Ensaio de aumento de fluorescência de Tioflavina S (ThS)

O aumento da fluorescência de ThS é uma característica deproteínas dobradas incorretamente que compreendem característicasestruturais comuns a proteínas com conformação com uma conformação βcruzada. A fluorescência de ThS (Sigma, 033kl076) foi medida de acordocom o procedimento descrito para CR e ThT. O comprimento de onda deemissão foi de 542 nm e o comprimento de onda de excitação foi de 435 nm.Estoques de proteína e peptídeo foram diluídos em 25 μΜ de 4ThS em PBS.

Ensaio de fluorescência intrínseca de triptofano

Medições de fluorescência intrínseca de triptofano (Trp) foramrealizadas em um Gemini Spectramax XPS, (Molecular Devices) usandoprograma [software] pro v5.01, com amostras de 100 μΐ, em placas pretas de96, a um comprimento de onda de excitação de 283 nm. Os espectros deemissão foram coletados à temperatura ambiente na faixa de 360 - 850 nm.Uma proteína dobrada nativamente apresenta fluorescência aumentada oudiminuída em comparação com sua contraparte dobrada incorretamente. Osvalores absolutos da intensidade de fluorescência de TrP não é muitoinformativa. No entanto, alterações na magnitude servem como um parâmetrode sondagem para a monitoração de perturbações da dobra de proteína. Umdesvio do comprimento de onda de emissão da fluorescência é uma indicaçãomelhor de alterações locais no ambiente do fluoróforo Trp. Radicais de Trpexpostos a solvente apresentam fluorescência máxima a 340-350 nm,enquanto que radicais totalmente embutidos fluorescem a cerca de 330 nm.

Ensaio de ativação de tPA/plasminogênio

O aumento da atividade de tPA/plasminogênio quando daexposição das duas serina proteases a proteínas dobradas incorretamente foideterminado usando-se um ensaio cromogênico padronizado (ver, porexemplo, pedido de patente W02006101387, parágrafo [0195], e Kranenburget al., 2002, Curr. Biology 12(22), pp.1833). Ambos, tPA e plasminogênio,atuam na Via β cruzada (ver Tabela 4).0 aumento da atividade das proteasesde ligação β cruzada é uma medida da presença de proteínas dobradasincorretamente compreendendo estrutura β cruzada.

Domínios de dedo [finger] de fibronectina recombinante que se ligam aproteínas dobrada incorretamente s

Para uma descrição da clonagem, expressão e purificação dedomínios de dedo de fibronectina humana recombinante 4-5 (Fn F4-5), agoracom um marcador His e marcador FLAG na ponta C, ver pedido de patenteW02006101387 (parágrafo [0137]-[0165] e [0192-0194]). A expressão deproteína em células de rim embrionário humano e a purificação foramrealizados com o auxílio da instalação de expressão de ABC (University ofUtrecht, Países Baixos). Fn F4-5 purificado, a 288 μg/ml em PBS contendo5% de glicerol, é armazenado a -80 °C.

ELISA de tPA e dedo 4-5 de fibronectinaPara análise da liqüefação de Fn F4-5 e tPA às diversaspreparações de ApoA-I de plasma humano, aplicou-se ELISAs convencionaiscomo descrito acima. Para a análise da ligação de tPA incluiu-se 10 mM deácido ε-amino capróico no tamponador de ligação (PBS/0,1% de Tween20).A ligação de Fn F4-5-FLAG-His foi determinada usando-se anticorpo anti-FLAG (anticorpo de camundongo], M2, conjugado de peroxidase; Sigma, A-8592).

Resultados

Análise de TEM de dOVA standard

Análise de TEM de ovalbumina desnaturada com calor, usadacomo uma proteína dobrada incorretamente convencional em ensaiosindicados (dOVA std.), mostra que a proteína dobrada incorretamente seagrega em multímeros não-fibrilares (não mostrado). Para todos os ensaios deaumento de fluorescência descritos acima, e também para o ensaio de ativaçãode tPA/plasminogênio, identificou-se a concentração de dOVA std. queresulta em máximo aumento de fluorescência, ou máxima ativação detPA/plasminogênio, respectivamente. Para o ensaio de aumento defluorescência, esta concentração foi ajustada em 100 μg/ml. Para o ensaio deativação de tPA/plasminogênio, usa-se 40 μg/ml dOVA std. como umareferência. Quando apropriado, o aumento de fluorescência e a ativação detPA/plasminogênio induzida por dOVA std. foi ajustado arbitrariamente comosendo de 100% para fins de comparação.

Análise de TEM de Hb e BSA glicosada

A Figura 6 descreve que o dobramento incorreto of BSA ehemoglobina por meio de glicação induz agregados amorfos não-fibrilares.

Octagrama de IgIV

A Figura 7 mostra que a desnaturação de IgIV Octagam induzestrutura β cruzada. Observa-se que várias condições de dobramento incorretoresultam em proteínas dobradas incorretamente com características variáveisde TEM e Tioflavina T. Não se observou fibrilos. Calcula-se que, aconcentrações relativamente elevadas de IgIV durante o dobramentoincorreto, o tamanho dos conjuntos de moléculas de IgIV aumenta. Isto não secorrelaciona com a fluorescência de ThT.

IgIV Gammagard

Observou-se aumento da fluorescência de Tioflavina T,vermelho Congo, ANS5 Bis-ANS e Tioflavina S com as diversas amostras deIgIV Gammagard dobradas incorretamente em comparação com IgIV nativa(Figura 8A-E). De uma forma geral, observa-se um aumento da fluorescênciacom os diversos corantes fluorescentes que é proporcional ao aumento datemperatura durante a desnaturação. Observou-se características similaresquando se mediu a fluorescência de Trp (Figura 8F). Observa-se tambémelevada fluorescência no caso de IgIV Gammagard desnaturada com base ecom ácido, em comparação com IgIV Gammagard nativa. Observa-se quecondições para a preparação de epítopos para RF na IgG introduzem umaumento relativamente pequeno de marcadores β cruzada. No caso de hlgG-BASE-37°C, mediu-se a fluorescência de ThT, CR e Trp. O aumento dafluorescência de Tht é moderado, porém o aumento da fluorescência de CR eTrp é elevado, em comparação com IgIV nativa e em comparação com IgGdobrada incorretamente após tratamentos alternativos.

Imagens de TEM a um aumento de IOK mostramque IgIVGammagard nativa meramente abriga quaisquer agregados, e os agregadospresentes são amorfos e de tamanho pequeno (Figura 9). Quando atemperatura de desnaturação aumenta, aumentam também o tamanho daagregação e a abundância dos agregados. O aparecimento de IgIVGammagard desnaturada com ácido em uma imagem de TEM apresentamuitas similaridades com IgIV Gammagard desnaturada com calor a umatemperatura de 76°C. IgIV Gammagard desnaturada com base apresentaagregados amorfos com um tamanho médio de 500 nm (Figura 9J). IgIVHFIP/TFA dobrada incorretamente e γ-globulinas humanas desnaturadas combase aparecem como agregados com características similares como asobservadas para IgIV BASE (Figura 9K, L). No entanto, o número deagregados é maior, e o tamanho médio dos conjuntos multiméricos é um tantomaior, em comparação com IgIV BASE. Particularmente no caso de γ-globulinas desnaturadas com base (hIgG-BASE-37°C), o tamanho médio dosmultímeros é de aproximadamente dobrado quando comparado com IgIVBASE. IgIV RF parece como conjuntos pequenos densos e soltos (Figura 9B).

A potência das preparações dobradas incorretamente de IgIVGammagard para ativar tPA/plasminogênio em um ensaio de geração deplasmina mediada com tPA foi examinada (Figura 9M). Não se observouqualquer ativação de tPA/plasminogênio com IgIV Gammagard nativa. Combase na potência de ativação de tPA/plasminogênio das diversas preparaçõesde IgIV Gammagard desnaturada, é possível classificar três grupos,nominalmente ativadores moderados (IgIV RF, IgIV 65, IgIV 69 e IgIVBase), ativadores potentes (IgIV 76, IgIV 80, IgIV 83 e IgIV 86) e ativadoresmuito potentes (IgIV Ácido e IgIV HFIP/TFA). É possível observar umadiferença notável na estrutura de IgIV quando a temperatura de dobramentoincorreto é incrementada de 69°C para 76°C. Imagens TEM revelam que, a69°C, formam-se alguns poucos agregados densos (Figura 9D) enquanto que,a 76°C, foi possível observar conjuntos relativamente grandese muito densosque aumentam de tamanho quando a temperatura de dobramento incorreto éainda mais elevada (Figura 9E-H). Este aumento de tamanhjo dos conjuntosde IgIV é acompanhado de um aumento da ativação de tPA/plasminogênio,quando os dobramentos incorretos a 69°C e 76°C são comparados (Figura 9M).

Preparações de Αβ

As várias preparações de Αβ42 e Αβ40 apresentam níveisincrementados de fluorescência de ThT, CR e ANS (Figura 10). Αβ42ΗΟ eAP40PBS1 aparecem como agregados fibrilares em imagens de TEM (FiguraHC, F). Αβ40ί=0, Αβ42ΐ=0, Αβ40Η01 e Ap42HBS aparecem como agregadosamorfos (Figura HA, B, D, E). De maneira notável, os fibrilos de Ap40PBSlapresentam níveis similares de fluorescência de ThT quando comparado comAp40HCl e Αβ40ί=0, enquanto que o Ap42HCl aumenta fortemente afluorescência de ThT e CR.

Albumina de soro humana

Como se observa na Figura 12A, HSA desnaturada a umaconcentração de 20 mg/ml aumenta fortemente a fluorescência de ThT,enquanto que, a outras concentrações, não se observa aumento emcomparação com HSA nativa. Não se observou agregados por meio de análisede TEM de HSA nativa ou HSA desnaturada a 1 mg/ml (Figura 12B, C).Agregados amorfos, com tamanhos aproximados de 500 nm, foramobservados em HSA desnaturada a 2,5, 5 e 10 mg/ml (Figura 12D-F). Otamanho dos agregados e o número relativo dos agregados aumenta em muitoquando HSA foi desnaturado a 20 mg/ml (Figura 12G).

IgG de camundongo

Observou-se fluorescência incrementada de ThT e CR com aspreparações de IgG de camundongo que foram dobradas incorretamenteusando-se diversos métodos, em comparação com IgG de camundongo nativa(Figura 13). A fluorescência de Tioflavina T e vermelho Congo sãoaumentadas da seguinte maneira:

ThT: IgG nativa < IgG base < IgG ÁCIDO « IgG 85°Cvermelho Congo: IgG nativa «IgG base < IgG ÁCIDO < IgG 85°C

No que se refere aos sinais de ThT comparou-se diferençasentre IgG BASE e IgG ÁCIDO com IgG a 85°C que são mais pronunciadasdo que no caso de sinais de fluorescência de vermelho Congo. Conclui-se quetodos os três métodos de dobramento incorreto resultaram em dobramentoincorreto da IgG acompanhado de formação de estrutura β cruzada.Apopolipoproteina A-I

ApoA-I desnaturada com calor a 100°C em tamponadorcom 100 mM de NaOH, resultou em um ligeiro aumento do sinal defluorescência, e também do sinal de fluorescência de CR, quando secompara com ApoA-I nativa (Figura 14A e Β). A diminuição observadada fluorescência de ThT e CR não se deveu a perda de proteína conformemedido com A280 nm (Figura 14C). A Figura 14B mostra que afluorescência de CR de ApoA-I desnaturada a 37°C em tamponador com100 mM de NaOH (pH elevado) foi ligeiramente incrementada emcomparação com ApoA-I nativa. Embora não se tenha observadodiferenças claramente perceptíveis nas intensidades de fluorescência deThT ou CR, observa-se diferenças significativas na potência daspreparações de ApoA-I dobradas incorretamente para ativartPA/plasminogênio em um ensaio de ativação de plasminogênio mediadacom tPA. As preparações de ApoA-I que foram aquecidas a 37°C ou 75°Crepresentam ativadores relativamente moderados a potentes detPA/plasminogênio (Figura 14D). ApoA-I dobrada incorretamente a100°C é um ativador muito potente de tPA/plasminogênio. Na Figura 14Ee F apresenta-se os resultados dos estudos ELISA para a determinação dapresença de estrutura β cruzada e/ou conformação induzida por β cruzadanas diversas preparações de ApoA-I de plasma humano. ApoA-I nativa eApoA-I com 100 mM de NaOH adicionados ao estoque de ApoA-I nativa,seguido de aquecimento a 37°C, ou 750C ou IOO0C5 durante 30 minutos,são incorporadas nos estudos. Atingiu-se ligação semi-máxima de Fn F4-5com 110 μg/ml (ApoA-I nativa), 73 μg/ml (ApoA-I dobradaincorretamente a 75°C), 48 μg/ml (ApoA-I dobrada incorretamente a100°C) e 5,2 μg/ml (HbAGE). No caso de ApoA-I dobrada incorretamentea 37°CI, não foi possível calcular ligação saturada. Estas figuras e ascurvas mostram que, quando do dobramento incorreto de ApoA-I, aafinidade para a ligação de Fn F4-5 aumenta no caso de ApoA-I dobradaincorretamente a 75 ou 100°C, acompanhado de um aumento do númerototal de sítios de ligação (Bmax). Adicionalmente, avalia-se a ligação detPA com as preparações de ApoA-I. O maior número de sítios de ligaçãopara tPA (Bmax) está presente em ApoA-I nativa, em comparação com aspreparações de ApoA-I dobrada incorretamente s. tPA quase não se liga aApoA-I aquecido, a alto pH, a 100°C (não se detectou ligação saturada).No caso de ApoA-I nativa, ApoA-I dobrada incorretamente a 37°C,ApoA-I misfolded a 750C e HbAGE, obtém-se ligação semi-máxima comconcentrações de tPA de 4,3, 3,1, 1,6 e 3,5 nM, respectivamente,indicando que dobramento incorreto a 37°C ou 75°C em condiçõesbásicas resulta em exposição de sítios de ligação de tPA com os quais tPAinterage com maior afinidade, em comparação com ApoA-I nativa. Aobservação de que tPA se liga com afinidade relativamente elevada aApoA-I nativa, com medidas comparáveis como observado com HbAGE,mostra que moléculas com estrutura β cruzada e/ou conformação induzidacom β cruzada já estão presentes na ApoA-I nativa. Esta verificação éainda mais substanciada através da observação de que ApoA-I nativaapresenta maior fluorescência de vermelho Congo fluorescência eTioflavina T.

Níveis de endotoxina em amostras usadas como Exemplos

Níveis de endotoxina em diversas soluções usadas para osexperimentos descritos nos Exemplos de 6 a 20 foram determinados com o kitLimulus Amebocyte Lysate (LAL) (Cambrex, QCL-1000). O kit foi usado deacordo com o protocolo do fabricante, exceto que agora se realizou mediçõesusando metade do volume de ensaio descrito. Como uma referência,lipopolissacarídio (LPS, Sigma, 2,5 mg/ml L-2630 clone 011:B4) foiincorporado em diversas medições. Com os sinais obtidos com uma curvapadrão de LPS, calculou-se uma estimativa do teor de endotoxina emmassa/volume com sinais em unidades de endotoxina (EU, endotoxin units)obtidas de amostras desconhecidas. Na Tabela 6, níveis de endotoxina em EUsão apresentados para as soluções de consumo.

Exemplo 6

'Enriquecimento cruzado': enriquecimento de IgIV humana no sentidode maior afinidade por proteína β cruzada Ά' também resulta em IgIVenriquecida com maior afinidade por proteína β cruzada 'B', 'C, 'D',...

Nós mostramos previamente que IgIV Octagam enriquecidoem matriz de BSA-AGE também aumentou a afinidade por outras proteínasdobradas incorretamente como Αβ40, Hb-AGE e dOVA (ver Exemplo 4).Agora, nós expandimos este experimento enriquecendo IgIV em matriz defibrilos de Αβ40/Αβ42, matriz de BSA-AGE, matriz de dlglV ou matriz dedHSA e testes de ligação de IgIV enriquecida com várias proteínas β cruzadadobrada incorretamente s. Proteínas dobradas incorretamente foramimobilizadas relativamente a NHS-Sepharose. Fatores de enriquecimento comIgIV eluídos de cada uma das matrizes de afinidade foram determinados,entre outros, para a ligação a fibrilos de Αβ40/Αβ42, agregados de Αβ, HSA,dHSA, B SA-AGE, dOVA, my-globulinas e dmy-globulinas em um ELISA.

Materiais e métodos

HSA (Cealb, Sanquin, Países Baixos, lote 05C29H120A) eIgIV (Octagam, Octapharma, lote 50244018432) a 1, 2,5, 5, 10 ou 20mg/ml foram dobradas incorretamente antes da imobilização sobre NHS-Sepharose (GE-Healthcare). HSA foi dobrada incorretamente em pH 2(HCl) por meio de aquecimento a 65 0C durante 6 horas, seguido deneutralização com NaOH. IgIV foi dobrada incorretamente por meio deaquecimento em etapas (0,5°C por minuto) de 25°C a 65°C, em 10 mM detamponador NaPi (pH 8,1). NHS-Sepharose foi lavada 12 vezes com 1 mMde HCl em copos de filtração Amicon (Millipore, UFC30SV00) antes douso. Para fins de imobilização, as cinco preparações de HSA dobradaincorretamente ou preparações de IgIV foram misturadas (1: 2,5: 5: 10: 20mg/ml numa relação de 5:4:3:2:1 (V: V: V: V: V)) e diluídas 3x emtamponador de imobilização (0,5 M de NaCl; 0,2 M de NaHCO3). BSA-AGE (10,25 mg/ml) e fibrilos de Αβ40/Αβ42 (0,28 mg/ml) foramimobilizados de maneira análoga. Os fibrilos foram preparados comodescrito na seção de Materiais. Em resumo, Αβ40 foi incubado durante 186h a 37°C, e Αβ42 foi incubado durante 24 h em HCl. Estes fibrilos forammisturados a 1:1 em tamponador de imobilização. A matriz foi incubadaem tamponador de imobilização de ura dia para o outro e bloqueada com0,1 M de Tris pH 8,5. A matriz foi lavada 3x com 0,1 M de Tris pH 8,5 e3x com NaOAc 0,1 M; 0,5 M de NaCl. Estas etapas de lavagem foramrepetidas quatro vezes. As matrizes foram incubadas com IgIV Octagam(50 mg/ml) durante 4 h ou de um dia para o outro. Coletou-se o perfluxo[('FT1), flow-through] de IgIV e a matriz foi lavada 12 vezes com HBS(solução salina tamponada com HEPES, 140 mM de NaCl, 10 mM deHEPES, 45 mM de CaCl2, 0,005% de Tween20, pH 7,4) antes da eluição(2x 1 hora em 1,140 M de NaCl, 10 mM de HEPES, 45 mM de CaCl2,0,005% de Tween20, pH 7,4; 'eluado'). Eluados foram dialisados contraHBS antes de análise ulterior. O FT e eluado foram testados quanto àligação a diversas proteínas imobilizadas usando um ELISA: fibrilos deΑβ40/Αβ42, agregados não-fibrilares de Αβ40/Αβ42, HSA, dHSA, BSA-AGE, nOVA e dOVA. Preparou-se quatro diferentes agregados não-fibrilares de Αβ40/Αβ42 como descrito na seção de Materiais e misturadosa 1:1:1:1, a uma concentração de 400 μg/ml. Resumidamente, Αβ40 foidissolvido em PBSl e congelado a -80°C diretamente, Αβ40 foi incubadodurante 24 h em solução de HCl, Αβ42 foi dissolvido em PBSl e congeladoa -80°C diretamente, e Αβ42 foi dissolvido em HBS e incubado durante 24h a 37°C. Fatores de enriquecimento foram calculados como descrito noExemplo 4. Concentrações de proteína no FT e eluados foramdeterminados usando-se um kit de ensaio de BCA (Pierce, n° de catálogo23223) e usando-se IgIV Octagam para uma curva padrão.

Resultados

Figura 15 mostra um resultado típico de um experimento deenriquecimento de IgIV usando-se matrizes de afinidade de proteína βcruzada dobrada incorretamente . Obteve-se dados similares paracombinações alternativas de IgIV enriquecida usando-se matriz com proteínadobrada incorretamente X e proteína imobilizada Y, Z,..., como discutidoabaixo e como resumido na Tabela 7. No exemplo ilustrativo indica-se queregiões de afinidade que são selecionadas usando matriz de afinidade defibrilo A6 ligam-se a diversas outras proteínas dobradas incorretamente comdiferentes seqüências e comprimentos de aminoácidos, p. ex. BSA-AGE(Figura 15). Adicionalmente, IgIV enriquecida em matriz de BSA-AGEapresenta um fator de enriquecimento de aproximadamente 6 para ligação afibrilos de Αβ40/Αβ42, em comparação com material de partida (OctagamIgIV). Em dois experimentos similares, nós obtivemos fatores deenriquecimento ainda mais elevados (25 e 53) para ligação de matriz de IgIVenriquecida com BSA-AGE a fibrilos de Αβ40/Αβ42. IgIV enriquecida emmatriz de fibrilos de Αβ40/Αβ42 apresenta um fator de enriquecimento de 3para ligação a fibrilos de Αβ40/Αβ42. Com IgIV de matriz de BSA-AGE éenriquecido mais eficientemente para ligação a Αβ40/Αβ42 do que secomparado com o enriquecimento observado com uma matriz de fibrilos deΑβ40/Αβ42.

O fator de enriquecimento para ligação a BSA-AGE é, emmédia, o maior para IgIV enriquecida em BSA-AGE-Sepharose. O fator deenriquecimento para ligação de IgIV enriquecida com fibrilos de Αβ40/Αβ42para BSA-AGE é de aproximadamente 5, como determinado em trêsexperimentos separados (Figura 15). O eluado de IgIV da BSA-AGE-Sepharose também é enriquecido para ligação a dOVA (fator deenriquecimento 3). Em experimentos similares, também o eluado de IgIV dadlglV-Sepharose e fibrilos de Ap40/Ap42-Sepharose foram enriquecidos paraligação a dOVA com fatores de enriquecimento 1,5 e 6, respectivamente. Esteúltimo fator de enriquecimento não foi observado em um dos três estudosconsecutivos. Não se observou enriquecimento para ligação a nOVA,indicando que, com o procedimento de enriquecimento, obtém-se uma sub-população de IgIV que se liga especificamente a contrapartes dobradasincorretamente de proteínas.

Determinou-se os fatores de enriquecimento para proteínasdobradas incorretamente adicionais. Uma série de concentrações de materialde partida IgIV Octagam dificilmente liga-se a HSA imobilizada, my-globulinas e dmy-globulinas. Observa-se ligação incrementada de IgIVOctagam a dHSA quando comparado com ligação a HSA. Eluados de IgIV detodas as matrizes de proteína dobrada incorretamente foram enriquecidos paraligação a dHSA. A ligação a agregados não-fibrilares de Αβ40/Αβ42 dobradoincorretamente s foi mais incrementada para IgIV enriquecida em matriz defibrilos de Αβ40/Αβ42 e BSA-AGE-Sepharose (fatores de enriquecimento deaproximadamente 10). Eluado de IgIV de BSA-AGE-Sepharose é enriquecidapara ligação a γ-globulinas de camundongo dobradas incorretamente (dmy-globulinas).

Considerado em conjunto, nós mostramos que IgIV Octagamenriquecida em uma matriz de afinidade compreendendo uma proteína βcruzada dobrada incorretamente 1A' também é enriquecida para ligação aproteína β cruzada dobrada incorretamente 1B', 'C', etc. Com matrizes deafinidade compreendendo fibrilos de Αβ40/Αβ42 ou BSA-AGE, obteve-seIgIV enriquecida com especificidade de amplo espectro, expressa como osfatores de enriquecimento relativamente maiores, para proteínas β cruzadamisfolded (Tabela 7). O mais interessante é que, para a preparação dematrizes de afinidade, incorpora-se três proteínas β cruzada dobradasincorretamente não-fibrilares nos estudos, i.e. BSA-AGE, dHSA e dlglV (verFigura 6, 7, 12 na seção de Materiais e Métodos Gerais para imagens deTEM).

Com base nos resultados descritos aqui, proporciona-se umprocedimento para selecionar aquelas regiões de afinidade uma composiçãode regiões de afinidade, que se ligam especificamente a proteínas dobradasincorretamente compreendendo estrutura β cruzada, que contribuemespecificamente para a patologia de uma determinada doença (ver tambémFigura 26). Por isso, em uma concretização, aplica-se consecutivamente umacombinação de duas matrizes β cruzada separadas com afinidade por regiõesde afinidade que são capazes de ligar especificamente proteínas dobradaincorretamente s. Como descrito mais detalhadamente abaixo, em qualqueruma de duas possíveis ordens, usa-se uma matriz I para selecionar regiões deafinidade que são capazes de interagir especificamente com qualquer estruturaβ cruzada e/ou proteína dobrada incorretamente compreendendo umaestrutura 3-D não nativa e/ou uma estrutura β cruzada e/ou amilóide, i.e. oMisfoldome, e também como uma matriz II com uma ou mais proteínasdobradas incorretamente selecionadas que contribuem para a patologia deuma doença de interesse, para a qual se projeta regiões de afinidadeterapêuticas para fins de tratamento, para selecionar aquelas regiões deafinidade que são capazes de ligar-se especificamente à proteína dobradaincorretamente relacionada com doença. Quando as matrizes são aplicadas naordem de I -» II, qualquer conjunto de proteínas compreendendo uma amplafaixa de possíveis aparecimentos de estrutura β cruzada ou conformaçõesinduzidas com estrutura β cruzada, e/ou representativas para o Misfoldomecompleto, compreendendo ou não aquelas proteínas dobradas incorretamenteque contribuem para a patologia da doença-alvo de dobramento incorreto deproteína, são usadas para a preparação da matriz de afinidade I. Quando asmatrizes são aplicadas na ordem de II —» I, o conjunto de proteínascompreendendo uma ampla faixa de possíveis aparecimentos de estrutura βcruzada ou conformações induzidas com estrutura β cruzada, e/ou proteínasrepresentativas para a o Misfoldome completo, não compreendem aquelasproteínas dobradas incorretamente que contribuem para a patologia dadoença-alvo de dobramento incorreto de proteína, que foram implicadas paraprojetar matriz de afinidade II. Evidentemente, uma pessoa versada na arte écapaz de projetar concretizações alternativas.

Exemplo 7

Enriquecimento específico e saturável de IgIV para afinidade paraproteínas β cruzada dobradas incorretamente usando-se matrizes deafinidade com diversas β cruzada proteínas dobrada incorretamente s.

No Exemplo 4 usou-se matriz de HbAGE para isolamentode uma sub-população de imunoglobulinas (Ig) com afinidade porproteínas β cruzada misfolded de Octagam IgIV. Nós testamos a ligaçãode IgIV Octagam enriquecida e o residual esgotado, denominado perfluxo'Flow Through1 (FT), para ligação a várias proteínas β cruzada. Nósobservamos que IgIV eluída da matriz de afinidade é efetivamenteenriquecida para ligação a HbAGE (fator de enriquecimento de 600) e queo FT é esgotado para ligação a HbAGE (fator de enriquecimento de 0,5,ou alternativamente: fator de esgotamento de 2,0). Para testar se IgIV foiespecificamente enriquecida em Sepharose-proteína β cruzada dobradaincorretamente para uma sub-população de moléculas de Ig com afinidadeespecífica para a proteína β cruzada misfolded (no exemplo acima,HbAGE) e não para matriz, no corrente experimento o FT, após incubaçãode IgIV com matriz de BSA-AGE, foi contactado novamente com umanova porção de matriz de BSA-AGE, que foi repetida em três etapassucessivas. Se a ligação de IgIV à matriz de BSA-AGE for não específica,a IgIV poderia ser esgotada sem saturação em cada etapa consecutiva,terminando finalmente sem Ig no FT. Se a ligação for específica, obter-se-á cada vez menos IgIV enriquecida quando da incubação de FT com umanova quantidae de matriz de BSA-AGE.

Materiais e Métodos

Dez ml de matriz de NHS-Sepharose foram lavados 12x com10 ml de HCl 1 mM antes do revestimento de BSA-AGE. O revestimento foirealizado de um dia para o outro em um dispositivo de rolamento a 4°C pormeio de adição de 2,5 ml de solução de imobilização (5,1 mg/ml de BSA-AGE, 0,2 M de NaHCO3, 0,5 M de NaCl, pH 8,3), seguido de uma etapa debloqueio com 0,1 M de Tris pH 8,5 durante 4 horas. Para remover a proteínanão-revestida, realiza-se diversas etapas de lavagem, 3x com 0,1 M Tris pH8,5 seguido de 3x tamponador ácido (0,1 M de acetato, 0,5 M de NaCl, pH4,2). Estas etapas de lavagem foram repetidas 4 vezes. Pérolas foramarmazeandas em HBS suplementado com 0,1% de azida de sódio. Antes daligação de Octagam (carga 5024018434), a matriz foi lavada 6x com HBSpara remover a azida. A uma porção de 2200 μΐ de pérolas, adicionou-se 1100μΐ de IgIV Octagam (50 mg/ml). As pérolas foram incubadas com Octagamdurante 1 hora e coletou-se a fração FT (FT1). Guardou-se 200 ml deste FT eo volume restante foi aplicado em uma porção fresca de matriz de BSA-AGE.A quantidade de matriz de afinidade foi ajustada ao volume restante do FT,em que a quantidade de matriz fresca agora é de 1800 μΐ. Novamente a matrizfoi incubada durante 1 hora com FTl antes da centrifugação para se coletar asegunda fração de FT (FT2). Isto foi repetido 4 vezes, resultando em 4 fraçõesde FT (FT1-FT4). Todas as amostras de matrizs incubadas com os FTsconsecutivos foram lavadas e as Igs ligadas foram eluídas duas vezes durante1 h, quando da incubação com sal em alto teor (1,14 M de NaCl, 10 mM deHEPES, 4,5 mM de CaCl2, 0,005% de Tween20, pH 7,4), resultando em 4frações de eluição (E1-E4). Também Αβ e dOVA foram acoplados à matrizde NHS-Sepharose da mesma maneira como descrito acima. Αβ1-40 commutação de tipo Holandês E22Q foi dissolvida em PBS a uma concentraçãode 1 mg/ml e incubada em um dispositivo de rolamento à temperaturaambiente durante 2 h, enquanto era protegida da luz com folha. A Αβ1-40E22Q foi incubada com matriz a uma concentração de 0,66 mg/ml, emsolução de imobilização. Para a preparação de matriz de afinidade de dOVA-Sepharose, ovalbumina foi desnaturada durante 1 h a 100°C em PBS a umaconcentração de 5 mg/ml, e imobilizada em NHS-Sepharose em tamponadorde imobilização a uma concentração de 3,5 mg/ml. Medições de Tioflavina Te vermelho Congo confirmaram a formação de estrutura β cruzada na amostrade dOVA dobrada incorretamente quando do aquecimento a 100°C. Fatoresde enriquecimento das 4 frações de FT e os 4 eluados foram determinados emum ELISA como descrito acima (Exemplo 4). Proteínas β cruzada dobradasincorretamente foram dOVA, Hb-AGE, BSA-AGE e Αβ40.

Resultados e discussão

A imobilização de albumina de soro bovino extensivamenteglucose-6-phospate-glicosada, BSA-AGE β cruzada dobrada incorretamente ,sobre matriz de NHS-Sepharose resultou em uma eficiente matriz deafinidade para capturar ligação de IgIV da Octagam com ligação de BSA-AGE (Figura 16A e B). Mostra-se que uma fração de IgIV Octagam liga-seespecificamente à BSA-AGE-Sepharose. FTl é esgotado em até 85% paramoléculas de Ig com afinidade por afinidade por BSA-AGE (fator deenriquecimento 0,15). Este número aumenta em 94,6% (fator deenriquecimento 0,054) a 95% (fator de enriquecimento 0,050) e 96,2 (fator deenriquecimento 0,038) nas frações subseqüentes FT2-4. Os dados mostramque o esgotamento de IgIV para moléculas com afinidade por BSA-AGE éobtida após um primeiro contato de IgIV com BSA-AGE-Sepharose. Paratestar se moléculas de Ig ligadas especificamente à BSA-AGE na matriz,eluados (El-4) foram testadso em um ELISA quanto à ligação a BSA-AGE edeterminou-se fatores de enriquecimento. El mostra a maior afinidade porbinding a BSA-AGE, como esperado. O fator de enriquecimento diminui de41,3 para El a 13,7 para E2 e de 11,8 para E3 a 8,7 para E4 nas etapas deligação subseqüentes em que FTs subseqüentes foram contactados novamentecom matriz de BSA-AGE. Isto mostra claramente que a quantidade demoléculas de Ig no FT com afinidade por BSA-AGE diminui drasticamente jáapós o primeiro contato com matriz de afinidade. Isto tornou-se ainda maisclaro em um experimento similar em que as frações de FT foram aplicadas 6vezes na nova matriz de afinidade. Neste experimento, o fator deenriquecimento para FT tornou-se tão baixo quanto 0,031, de modo que,basicamente, não restaram propriedades de ligação de BSA-AGE (nãomostrado). As quantidades relativas de IgIV nos eluados de El a 4 foram de89 μg (0,16%), 36 μg (0,23%), 18 μβ (0,28%) e 17 μg (0,53%),respectivamente.

Determinou-se também as propriedades de ligação de IgIVenriquecida com BSA-AGE e perfluxos acompanhantes a Αβ40, dOVA eHbAGE. As frações de FT não foram esgotadas para ligação a Αβ40 nem paradOVA, i.e. o fator de enriquecimento permaneceu em 1 (Figura 16C, E). Semdesejar ater-nos à teoria, uma possível explicação para esta observação é que,quando do enriquecimento com matriz de BSA-AGE, somente aquelasregiões de afinidade são selecionadas que compreendem afinidade de faixalarga por BSA-AGE, e tambémpor Αβ40 e por dOVA. Aparentemente, muitasmoléculas de Ig com afinidade relativamente alta por Αβ40 ou dOVA, porémmenos afinidasde por BSA-AGE permanecem na fração de FT, explicando omodesto esgotamento. Figuras 16C e D, no entanto, mostram que os eluadosapós contactarem IgIV com BSA-AGE Sepharose ainda são enriquecidos demoléculas de Ig com afinidade por Αβ40, apesar de serem selecionados combase na afinidade por BSA-AGE. No caso de dOVA, observa-se um fator deenriquecimento de 1,8 com El (Figura 16E e F). O fator de enriquecimento émenor para eluados subseqüentes, mas não em paralelo com os fatores deenriquecimento decrescentes para ligação a BSA-AGE em eluadosconsecutivos. Aparentemente, a fração de moléculas de Ig em IgIV Octagamcom afinidade dupla, por BSA-AGE e também por dOVA, é relativamentepequena e, assim, enriquecimento com matriz de BSA-AGE resultados apenasem pouco enriquecimento para ligação a dOVA. A ligação das frações de FTe as frações de eluado a HbAGE segue padrões similares como se observa nocaso da ligação a B SA-AGE, mostrando epítopos que se superpõem emambas as proteínas β cruzada dobradas incorretamente (Figura 16G e 16H).Em frações de FT consecutivas, a fração de moléculas de Ig que se liga aHbAGE diminui drasticamente. Em paralelo, o fator de enriquecimento paraligação de IgIV enriquecida com matriz de BSA-AGE elua para HbAGEdiminui quando se compara eluados consecutivos.

Em conclusão, estes experimentos mostram que, com a matrizde afinidade B SA-AGE, IgIV Octagam não só é enriquecida para ligação aB SA-AGE, mas também para ligação a outras proteínas β cruzada dobradasincorretamente como AB40, HbAGE e dOVA. Isto mostra que BSA-AGE βcruzada não-fibrilar dobrada incorretamente compreende epítopos quetambém são expostos nas outras três proteínas β cruzada dobradaincorretamente s. Parece que IgIV compreende uma fração de regiões deafinidade com afinidade por BSA-AGE que não apresenta grandesobreposição com uma sub-população de moléculas de Ig com afinidade porΑβ40 ou por dOVA.

Uma vantagem de se usar quantidades sub-ótimas deSepharose-proteína β cruzada é que, em uma primeira incubação, apenasregiões de afinidade com afinidade relativamente elevada serão selecionadas.Isto é uma vantagem para os fins em que apenas regiões de afinidade com altaafinidade deveriam ser usadas.

Em um experimento similar subseqüente, usou-se Αβ40-Sepharose e dOVA-Sepharose para seis incubações consecutivas de FTs (nãomostrado). Com a matrizz Αβ40, os FTs foram esgotados para ligação a BSA-AGE, ρ. ex. após 6 ciclos de ligação de frações de FT sucessivas aquantidades frescas de matriz de Αβ40, o fator de 'enriquecimento' foi de0,45. A ligação de FTs após incubação com Ap40-matriz a dOVA é menosafetada, o fator de 'enriquecimento' é de 0,83 após seis etapas de ligação. Oseluados da matriz de Αβ40 são enriquecidos para ligação a B SA-AGE, comfatores de enriquecimento de 17, 4, 5, 3, 8, e 4. Estes eluados não se ligam demodo algum a dOVA. Isto mostra que a sub-população de regiões deafinidade em IgIV que se ligam a Αβ40 efetivamente se sobrepõe à sub-população de moléculas de Ig que se liga a B SA-AGE, mas não à sub-população de moléculas de Ig que se liga a dOVA.

Com dOVA-Sepharose o esgotamento de IgIV Octagam FTpara ligação a dOVA já é sub-ótima (83%) com a relação aplicada de matrizde afinidade e IgIV, i.e. com incubações consecutivas de FTs com matriz dedOVA não se obtém redução adicional de ligação dos FTs a dOVA. Osfatores de enriquecimento, que se lê efetivamente como fatores de'esgotamento', para ligação das frações de FT a BSA-AGE ou Αβ40 não sãoafetados e permanecem em torno de 0,8 para BSA-AGE e em 1 para Αβ40.Os eluados, contudo, são enriquecidos para ligação a BSA-AGE e Αβ40(fatores de enriquecimento são de 5 e 14, respectivamente). Os fatores deenriquecimento não aumentam em eluados obtidos durante etapas de ligaçãosucessivas usando-se os FTs consecutivos.

Novamente, os experimentos mostram que IgIV enriquecidausando matriz de afinidade com proteína β cruzada dobrada incorretamenteΆ' também é enriquecida para ligação a proteína β cruzada dobradaincorretamente 'B'. Estes experimentos também mostram que, com os ajustesexperimentais, a sub-população de moléculas de Ig em IgIV Octagam que seliga a Αβ-Sepharose não se sobrepõe à sub-população de regiões de afinidadeem IgIV Octagam que se liga a dOVA. No caso de BSA-AGE-Sepharose asquantidades absolutas e relativas de IgIV enriquecidas em eluados de E1-6foram de 31,5 μg (0,084%), 11,2 (0,062), 9,5 (0,098), 7,2 (0,16), 4,1 (0,145) e0,27 (0,032%), respectivamente. No caso de Αβ40 estes números foram de33,9 (0,09), 29,4 (0,17), 11,2 (0,11), 9,45 (0,21), 9,8 (0,35) e 3,8 με (0,22%),respectivamente. Para a matriz de dOVA estas figuras foram de 27,6 (0,07),22,4 (0,07), 21,8 (0,12), 17,1 (0,15), 11,5 (0,13) e 2,8 μβ (0,06%).

Os resultados também mostram que regiões de afinidade comespecificidade por proteínas β cruzada dobradas incorretamente sãoselecionadas particularmente usando-se uma matriz de afinidade com proteínaβ cruzada dobrada incorretamente imobilizada. O esgotamento de umaquantidade de IgIV é saturável, ou seja, o esgotamento de IgIV de uma sub-população com especificidade para proteínas dobradas incorretamente éobtido usando-se matriz de proteína dobrada incorretamente .

Embora BSA, Hb, Αβ40 e OVA não apresentem homologia deseqüências e, em seu estado nativo, não apresentem homologia estrutural 3 D,B SA-AGE, HbAGE, Αβ40 e dOVA compartilham a presença de extensões deaminoácidos com uma conformação β cruzada. Portanto, nossos resultadosmostram que IgIV compreende uma sub-população de regiões de afinidadecom amplo espectro de afinidade por conformação β cruzada ou conformaçãoinduzida com β cruzada em várias proteínas que não apresentam homologiaestrutural 3D em sua forma nativa e/ou não apresentam homologia deseqüências. Além disso, os resultados com Αβ-Sepharose e ELISAs de dOVAsubseqüentes mostram que a estrutura β cruzada aparece com detalhesestruturais variados, resultando em ligação de diferentes sub-populações deIgIV, mas os mesmos corantes de β cruzada, i.e. vermelho Congo, ThT (ver'Materiais e Métodos Gerais para os exemplos de 6 a 20'.

Exemplo 8

A liqüefação de IgIV Octagam e IgIV enriquecida, obtida como uso de uma matriz de afinidade de HbAGE, a fibrina, agregados de Αβ eovalbumina dobrada incorretamente .Materiais e Métodos

Para testar se IgIV Octagam compreende moléculas de Ig comafinidade por fibrina, que são polímeros que compreendem estrutura βcruzada, (ver pedido de patente US2007003552, parágrafo [187, 188]),realiza-se ELISAs em que a fibrina é formada in situ incubando-sefibrinogênio com trombina/fator IIa nos poços da placa de ELISA.Adicionalmente, para ligação de comparação de IgIV a ovalbumina dobradaincorretamente imobilizada (dOVA) com características de uma proteína comestrutura β cruzada (ver seção de Materiais) e a agregados de amilóide-β éavaliada.

Ovalbumina (Sigma, A5503 de classe V) foi dissolvidacuidadosamente em PBS a uma concentração de 1 mg/ml, incubada durante20 minutos a 37°C, subseqüentemente durante 10 minutos à temperaturaambiente em um dispositivo de rolamento, e armazenada a -80°C —> referidacomo nOVA. nOVA foi aquecida de 30°C a 85°C a 5°C min-1. Esta etapa foirepetida quatro vezes, e OVA desnaturada foi armazenada subsequentèmentea -80°C —> referida como dOVA std. Para estudos de ligação com dOVA std,revestiu-se 5 μg/ml de dOVA std. Para analisar a afinidade de IgIV Octagampor Αβ imobilizada, os estoques de Αβ40ΐ=0 e Αβ42ί=0 foram incorporadosnos estudos de ligação. Ambas as preparações AB são revestidas a 5 μg/ml.HbAGE também é revestida a 5 μg/ml e determina-se a análise de ligação aesta proteína β cruzada como um controle positivo. Para testar a ligação deIgIV e tPA a fibrina imobilizada com uma conformação β cruzada, aplicou-seo protocolo a seguir para se obter poços de placas ELISA de 96 poços comfibrina imobilizada:

1. Preparar um estoque de fator IIa de 2 U/ml em H2O a partirde um estoque de trombina/fator IIa convencional (plasma humano, HighActivity, Calbiochem, Alemanha, n° do produto: 605195)

2. Preparar uma solução de fibrinogênio a 50 μg/ml (Fib3L2170L em 20 mM de citrato de sódio-HCl pH 7,0, Kordia, Países Baixos) emPBS a partir de uma solução de consumo que é centrifugada durante 10minutos a 16.000*g antes do uso.

3. Pipetar 5 μl de solução de fator IIa nos poços, adicionar 100μl de solução de fibrinogênio, ou adicionar 100 μΐ de PBS nos poços decontrole. Concentrações finais: [fator lia] « 0,1 U/ml, [fibrinogênio] « 47,5μg/ml.

4. incubar durante 2 horas à temperatura ambiente comagitação cuidadosa. Controles de revestimento são realizzados usando-seanticorpo de fibrinogênio anti-humano (DAKO-Cytomation, P0455).

5. Poços esvaziados são lavados duas vezes com TBS/0,1% deTween20. TBS: solução salina tamponada com Tris com 150 mM de NaCl, 50mM de Tris-HCl, pH 7,3.

Primeiramente, poços revestidos com Αβ, dOVA, fibrina outamponador de revestimento de controle são recobertos em triplicata comséries de concentrações de 50 μΐ/poço de IgIV ou tPA durante 1 hora àtemperatura ambiente, com agitação cuidadosa. Na série de tPA, inclui-se 10mM de sACA no tamponador de ligação para evitar a ligação dos domínioskringle a radicais arginina e lisina expostos da fibrina, e dirigir a ligação dodomínio de dedo de tPA à conformação de estrutura β cruzada exposta. Ossinais obtidos com poços de controle revestidos com fila sem fibrinogênioque são sobrepostos com a série de concentrações de tPA ou IgIV, sãosubtraídos dos poços correspondentes com fibrina imobilizada. Para todos ossinais obtidos com proteínas imobilizadas com estrutura β cruzada, sinaiscorrespondentes obtidos com poços revestidos com tamponador derevestimento são subtraídos como fundo.

Em uma segunda série de experimentos, avaliou-se a ligaçãode IgIV enriquecida, que foi obtida mediante incubação da matriz deafinidade de HbAGE com Octagam IgIV, a fibrina.Resultados e discussão/conclusões

Nós determinamos previamente que polímeros de fibrinaapresentam características reminiscentes a proteínas com propriedadessimilares a amilóide, como ligação de corantes específicos para β cruzada,vermelho Congo e Tioflavina T, e ativação de tPA e plasminogênio. Nóstambém determinamos que IgIV Octagam compreende uma sub-população deIg's que apresenta afinidade por proteínas com estrutura β cruzada. Assim,nós avaliamos se IgIV se liga a fibrina em um ELISA. Na Figura 17 mostra-seque a IgIV liga-se efetivamente a controle positivo HbAGE, como foiavaliado previamente (ver, por exemplo, Figura 1), e também a preparaçõesde dOVA, Αβ40 e Αβ42. A afinidade por HbAGE é relativamente elevada,enquanto que a afinidade pelas três proteínas dobradas incorretamentereferidas por último, é um tanto menor. Quando se considera a fibrina, tantotPA como também IgIV ligam-se de uma maneira saturável. A ligação semi-máxima da IgIV à fibrina é obtida a 200 μg/ml (aproximadamente 1,3 μΜ) eeste valor é comparável com os valores obtidos com preparações de dOVA eΑβ. Estas verificações mostram que IgIV Octagam não só se liga às proteínascompreendendo estrutura β cruzada usadas rotineiramente, i.e. HbAGE,dOVA, Αβ, mas também às moléculas compreendendo β cruzadarecentemente identificadas na fibrina.

Estes resultados mostram que IgIV Octagam compreende umasub-população de Ig's com afinidade por fibrina. Conseqüentemente, o usodesta sub-população é benéfica em desordens em que a vida útil prolongadada fibrina, devido à competição de fibrina ligando IgIV com tPA, contribuipara menores sintomas de doenças ou de problemas de saúde, ou emdesordens em que a formação prejudicada de fibrina é benéfica, que é obtidaintroduzindo-se IgIV ligada a fibrina, que interfere com a polimerização demonômeros de fibrina.

Exemplo 9Ligação de regiões de afinidade de IgIV a apoliproteína A-I de plasmahumano dobrada incorretamente

Fundamentos

Amilóide nos meniscos da junta do joelho e uma das formasmais comuns de amiloidose localizada e é prevalente, de formacrescentemente prevalente, nos idosos. Os depósitos amilóides podem resultarem problemas de juntas que, finalmente, requerem ação cirúrgica. Aapoliproteína A-I (ApoA-I) é detectável nas juntas dos joelhos, formaamilóide e está implicada numa variedade de doenças e de problemas desaúde, incluindo problemas de juntas. A ApoA-I é o componente protéicoprincipal da lipoproteína de alta densidade. ApoA-I amilóide também éencontrada em placas ateroscleróticas e artérias de pacientes comaterosclerose. Conseqüentemente, a remoção de ApoA-I dobradaincorretamente da circulação ou alhures no corpo é benéfica para pacientesque sofrem de doenças associadas com ApoA-I amilóide. Nós testamos seregiões de afinidade são capazes de ligar-se a ApoA-I misfolded, e se osmeios e métodos revelados são capazes de selecionar regiões de afinidadeenriquecidas para aquelas regiões de afinidade que se ligam a ApoA-I. Osresultados apresentados abaixo mostram que regiões de afinidade reconhecemefetivamente ApoA-I e que os métodos e meios revelados são vantajosos parao isolamento de regiões de afinidade capazes de se ligarem a ApoA-I. Assim,a ApoA-I serve como outro exemplo de uma proteína associada com doençapara a qual regiões de afinidade são isoladas.

Materiais e Métodos

Para análise das propriedades de ligação de IgIV enriquecidaque foi obtida com a seleção de regiões de afinidade usando HbAGE-Sepharose que foi incubada com Octagam IgIV, no sentido de ApoA-I deplasma humano, realiza-se ELISAs diretos com preparações de ApoA-Iimobilizada. Para estes estudos, incorpora-se ApoA-I nativa, e ApoA-I em100 mM de NaOH, aquecido durante 30 minutos a 37°C, ou 75°C, 100°C,seguido de ajuste do pH com 5 M de NaOH5 de volta ao pH fisiológico. Comose pode ver na Figura 14, observa-se a seguinte ordem na positividade relativapara marcadores β cruzada selecionados, i.e. aumento da fluorescência dovermelho Congo, aumento da fluorescência de ThT, ativação detPA/plasminogênio, ligação de fibronectina dedo4-5 e ligação de tPA:vermelho Congo: 100°C < nativa < 3 7°C < 75°C

ThT: 100°C < nativa <75°C< 37°C

tPA/Plg act.: fundo = nativo < 37°C < 75°C « 100°C

Fn F4/5 ligação: nativa = 37°C < 75°C < 100°C

tPA ligação: fundo = 100°C < nativa « 37°C « 75°C

A partir destas comparações fica claro que até mesmo ApoA-I nativaapresenta características de uma proteína dobrada incorretamente comestrutura β cruzada, i.e. isto aumenta a fluorescência do vermelho Congo eThT, e liga-se a tPA. De uma forma geral, as preparações de ApoA-I obtidaspor meio de aquecimento a 37°C ou 75°C em condições básicas atuam comocomposições com um teor relativamente elevado de estrutura β cruzada. Noentanto, quando se considera apenas a potência para ativar serina proteases(tPA/plasminogênio), claramente a ApoA-I aquecida a 100°C é descrita comoa composição com o maior teor de β cruzada 'biologicamente ativo'.

Resultados e discussão

Na Figura 18 apresenta-se curvas de ligação para ligação deIgIV enriquecida a ApoA-I nativa e três preparações dobradas incorretamentecom calor/base. Quando se considera IgIV enriquecida, kD's encontram-se emordem crescente de 1,3, 1,6, 2,0 e 2,8 μg/ml para ApoA-I a 75°C, ApoA-I a37°C, ApoA-I nativa e ApoA-I a 100°C, respectivamente. O número de sítiosde ligação é similar para ApoA-I nativa e ApoA-I a 75°C, um tanto maiorpara ApoA-I a 37°C, e muito menor para ApoA-I a 100°C. A partir demedições de A280 concluiu-se que o teor de proteína é similar nas quatropreparações. Diferenças no número máximo de sítios de ligação podem serrefletidas por diferenças na eficiência de revestimento. No entanto, é a ApoA-I a 100°C que expõe a maior parte dos sítios de ligação para Fn F4-5 (Figura14E). Quando se compara a afinidade de IgIV enriquecida para as quatropreparações de e ApoA-I com a afinidade de Octagam IgIV, de que seselecionou IgIV enriquecida, fatores de enriquecimento, calculados divindo-se as kD's obtidas com IgIV Octagam pelas kD's obtidas com IgIVenriquecida são de 4,8 para ApoA-I nativa e para ApoA-I a 75°C, enquantoque para ApoA-I-37°C o fator de enriquecimento é de 12,8. Para ApoA-I a100°C não foi possível determinar um fator de enriquecimento, embora não setenha detectado qualquer ligação de Octagam IgIV, e ligação modesta de IgIVenriquecida. No entanto, o enriquecimento para ligação a ApoA-I a 100°C érefletido pelas características de ligação como descrito na Figura 18C.

Em conclusão, os sinais obtidos com ApoA-I 'nativa' paramarcadores β cruzada são refletidos em características de ligação de IgIV(enriquecida), substanciando adicionalmente a conclusão de que a ApoA-Inativa compreende estrutura β cruzada, da forma como é adquirida dofabricante. Além disso, conclui-se que o aumento relativo dafluorescência de ambos, vermelho Congo e ThT, quando do contato compreparações de ApoA-I tem poder preditivo com relação às característicasde ligação esperadas de IgIV (enriquecida), em que a fluorescência deThT apresenta a correlação mais forte. A partir dos dados de ELISA comIgIV enriquecida e ApoA-I aquecida a 37°C conclui-se que estapreparação de ApoA-I compreende estrutura β cruzada ou conformação deproteína induzida com estrutura β cruzada que apresenta a semelhançamais estreita com a conformação de proteína de HbAGE usada paraenriquecimento de IgIV, e/ou o número mais comparável de epítopos comestrutura β cruzada expostos que servem como sítios de ligação emApoA-I para IgIV enriquecida. De uma forma geral, os dados mostramque aplicando-se uma matriz de afinidade de β cruzada apropriada,seleciona-se regiões de afinidade que se ligam a ApoA-I dobradaincorretamente . Desta maneira, obtém-se uma composição terapêuticaque representa uma pista de regiões de afinidade para uso em regimes detratamento de doenças ou problemas de saúde relacionados com apresença de ApoA-I dobrada incorretamente , como por exemplo,tratamento de dor causada por amiloidose das juntas dos joelhos,dissolução de deposição de amilóide nas artérias, e tratamento deaterosclerose acompanhado por acúmulo de amilóide de ApoA-I emplacas.

Exemplo 10

Moléculas de IgG dobradas incorretamente compreendem o epítopo-alvodo Fator Reumatóide, auto-anticorpos presentes em 70-80% de pacientescom artrite reumatóide.

Materiais e métodos

Dobramento incorreto de IgG e análise de estrutura

Nós testamos nossa hipótese de que Fator Reumatóide (RF,Rheumatoid Factor) humano, um anticorpo presente em de 70 a 80% depacientes com artrite reumatóide (RA, RheumatoidArthritis), se liga a β cruzadaou conformação de proteína induzida com β cruzada no auto-antígeno de IgG.Nós verificamos que constitui senso comum para a detecção de ligação de IgGpor RF [Fator Reumatóide], que é, particularmente, uma subclasse de IgM(embora também ocorra RF de IgG e IgA), com domínios Fc presumivelmentepredominantes de seu auto-antígeno alvo, agregação da IgG quando dadesnaturação com calor a 650C é uma exigência. Nós aquecemos IgG humanapurificada (Octagam IgIV) a 65°C de acordo com os procedimentos descritos naseção de Materiais e Métodos Gerais dos Exemplos de 6 a 20, e analisamos aestrutura por meio de fluorescência de vermelho Congo, fluorescência deTiofiavina T, fluorescência de ANS e análise da ligação e ativação de tPA. Oaumento da fluorescência de vermelho Congo e Tioflavina T foi determinadocom suspensões de IgTV diluídas a 100 μg/mL Subseqüentemente, determinou-seo aumento da atividade de tPA/plasminogênio usando um ensaio cromogênicopadronizado (como descrito no pedido de patente W02006101387, parágrafo[0195]). Ligação de tPA na presença de 10 mM de ácido ε-amino capróico aIgIV dobradas incorretamente foi avaliado em um ELISA convencional, comodescrito aqui previamente, com imobilizada Αβ40ί=0 como um controle positivopara ligação de tPA.

Resultados

Aumento da fluorescência de vermelho Congo e ThT por meio de IgGdesnaturada

O aumento da fluorescência do vermelho Congo e dafluorescência de Tioflavina T foi medido com IgIV dobrada incorretamentedesnaturada com calor. Com base nos sinais relativos comparados com IgIVde controle, IgIV aquecida é dobrada incorretamente com característicasmarcantes de uma proteína dobrada incorretamente com uma conformação βcruzada (Figura 19A, B).

Ligação de tPA a IgG dobrada incorretamente

Nós observamos que tPA, que é um componente das Via βcruzada, liga-se a dlglV (Figura 19E). Esta observação demonstraadicionalmente que dlglV é dobrada incorretamente de uma maneira em quecomponentes da Via β cruzada reconhecem as características estruturaisrecentemente introduzidas.

Ativação de tPA/Plg por IgG dobrada incorretamente

Agora que nós observamos ligação de tPA a dlglV, nóstestamos se dlglV ativa tPA/plasminogênio em um ensaio cromogênico detPA/plasminogênio. IgIV nativa não induz ativação de plasminogêniomediada com tPA (Figura 19D). No entanto, as amostras de IgIV misfoldeddesnaturadas com calor ativam tPA/plasminogênio, i.e. ambas as IgIVdesnaturadas a 65°C em tamponador com pH 2 (não mostrado), e também aIgIV desnaturada com calor em tamponador de NaPi.

Discussão

Introdução de dobramento incorreto com estrutura β cruzada em IgGdesmascara epítopos no auto-antígeno do (RF, fator reumatóide)

IgG humana aquecida a 650C apresenta uma série decaracterísticas estruturais comumente observadas com proteínas dobradasincorretamente similares a amilóide com estrutura β cruzada. A temperaturaaplicada encontra-se ligeiramente acima da temperatura de 61°C em que seinduz alterações conformacionais, de acordo com medições de calorimetriadiferencial de varredura descritas previamente por outros investigadores. IgGdobrada incorretamente aumenta a fluorescência de vermelho Congo eTioflavina T, liga-se a tPA e ativa tPA/plasminogênio. Que o saibamos, nóssomos agora os primeiros a reportar que auto-antígeno de IgG dobradaincorretamente para RF expõe neo-epítopos compreendendo propriedadesestruturais reminiscentes a amilóide com uma conformação β cruzada. Deforma alinhada com nossas observações, o fato reportado de que a atividadede protease de tPA e fator XII, duas serina proteases ligadas e que sãoativadas por proteínas compreendendo estrutura β cruzada, é aumentada empacientes de RA [artrite reumatóide], é explicada agora.

Nossas observações apontam o RF [fator reumatóide] como umafonte útil de anticorpos humanos das classes IgG, IgA e IgM que apresentamespecificidade por estrutura β cruzada, e/ou por conformações induzidas porestrutura β cruzada em proteínas. Combinando com nossas observações de queuma sub-população de moléculas de Ig em IgIV se liga a moléculas de IgIVdobradas incorretamente (ver Tabela 7) e/ou a γ-globulinas de mouse dobradaincorretamente (ver Exemplo 19), nós concluímos que, efetivamente, a sub-população isolada em IgIV com afinidade por Ig dobrada incorretamente ouproteínas dobradas incorretamente em geral é reminiscente do RF. Ambas asfontes de regiões de afinidade com afinidade por auto-antígeno de IgG dobradaincorretamente são benéficas para o desenvolvimento de terapêuticas à base deregião de afinidade destinadas ao tratamento de doenças ou problemas de saúdeassociados com a ocorrência de IgGs dobrada incorretamente s.

Exemplo 11

Determinação de ocorrência relativa de subclasses de imunoglobulina eisotipos de IgG em diversas preparações de regiões de afinidadeMétodos

Para determinar o teor relativo de isótipos de IgG IgGl5 IgG2,IgG3 e IgG4 presentes na IgIV enriquecida obtida como eluado de uma matrizde afinidade de HbAGE, nós concentramos 550 μΐ da amostra usandodispositivos de centrifugação Nanosep IOk (Pall Iife science). A concentraçãofinal de IgIV enriquecida concentrada foi de 890 μg/ml, como determinadocomparando-se a absorbância a 280 nm com uma curva padrão determinadacom diluições de IgIV Octagam em PBS. A isotipificação e determinação daabundância relativa de subclasses de Ig foi determinada usando-se métodospadronizzados do Laboratory for Medicai Immunology (UMC Utrecht, PaísesBaixos), com o nefelômetro Image Immunochemistry (Beckman Coulter). Parafins de comparação, IgIV Octagam de que IgIV enriquecida foi extraída,também foi analisada quanto à abundância relativa de isótipos de IgG.Adicionalmente, determinou-se o aparecimento de subclasses de Ig. Além daamostra de IgIV enriquecida concentrada, também se submeteu material não-concentrado a 103 μg/ml em PBS a isotipificação e determinções de subclasses.De acordo com o fabricante, IgIV Octagam preparada da fração de Ig de maisde 3500 doadores humanos, consiste de IgG's (>95%), com uma fração menorde IgA (<0,4%) e uma quantidade em traços <0,2% de IgM. A distribuiçãosobre os quatro isótipos de IgG é: IgGl, 62,6%; IgG2, 30,1%; IgG3, 6,1%;IgG4, 1,2%. De acordo com o fabricante, na IgIV <3% das moléculas de Ig sãoagregadas, e mais de 90% das moléculas são monômeros e dímeros.Resultados e discussão

No caso de Octagam IgIV, todas as sete medições paradeterminação de subclasses e isotipificação de IgG encontram-se listadas naTabela 8. Com IgIV Octagam confirmou-se que, efetivamente, a maior partedas Igs é da subclasse de IgG, i.e. aproximadamente 99,5%. A distribuiçãoentre os quatro isótipos de IgG é bastante próxima do que é reportado na folhade dados da IgIV Octagam (como descrito na seção de Métodos). No caso daIgIV enriquecida não-concentrada a distribuição de subclasses não pôde serdeterminada devido ao menor limite de detecção do nefelômetro ImageImmunochemistry. A determinação da presença relativa de IgG2 também foiprejudicada devido a limites de detecção. Foi possível determinarconcentrações de IgGl, IgG3 e IgG4 (Tabela 8). A concentração total de Igem IgIV enriquecida foi estabelecida como sendo de 103 μg/ml, usando-se atécnica de determinação de concentração de proteína de BCA. Calculou-secom o nefelômetro que a concentração total de Ig foi de 108 μg/ml. Com IgIVenriquecida concentrada foi possível determinar as concentrações para todosos quatro isótipos de IgG, e também o teor total de IgG. Níveis de IgA e IgMforam menores do que o limite de detecção. Na fração de IgIV enriquecida, aabundância relativa de IgG3, quando comparada com IgGl como umareferência, é aumentada em aproximadamente duas vezes se comparado como material de partida IgIV Octagam do qual a IgIV enriquecida foiselecionada com matriz de afinidade de HbAGE. A abundância relativa deIgG2 e IgG4, quando comparada com a quantidade de IgGl, é pouco alteradacom o enriquecimento. Assim, em conclusão, uma sub-população de IgG3apresenta afinidade relativamente maior pela HbAGE-Sepharose do que osoutros isótipos.

Com base no resultado de que todos os quatro isótipos de IgGsão determinados na fração de IgIV enriquecida, conclui-se que a fração de Igconsiste de uma mistura de pelo menos quatro anticorpos humanos diferentes.O aparecimento de IgIV enriquecida como um esfregaço em um gel defocalização isoelétrica, em condições não redutoras, também mostra que maisde um anticorpo monoclonal está presente na seleção de IgIV enriquecida(não mostrado). A concentração de anticorpos de IgA e IgM na população deregiões de afinidade enriquecidas não pôde ser determinada, mas a presençade quantidade de traços de um ou mais clones de IgA e IgM não pode serexcluída com base nos resultados.

Exemplo 12

Análise da influência de regiões de afinidade de IgIV sobre a agregaçãode plaquetas induzida por lipoproteína de baixa densidade dobradaincorretamente (oxLDL, misfolded Iow density lipoprotein), e análise daligação de IgIV enriquecida, obtida de IgIV Octagam por meio deaplicação de uma matriz de afinidade de HbAGE, a oxLDL.

LDL modificado, por exemplo, devido a oxidação (oxLDL)desempenha um papel proeminente em doenças devastadoras e problemas desaúde, como por exemplo, aterosclerose. Nós demonstramos recentementeque, quando da oxidação, introduz-se características estruturais na porção deproteína do LDL, i.e. ApoB-100, que são reminiscentes da conformação βcruzada amilóide (ver pedido de patente W02003NL00501). Nós avaliamosagora a possibilidade de que IgIV compreende regiões de afinidade dirigidas àconformação β cruzada ou conformação induzida com β cruzada em oxLDLhumano, e, ainda mais preferivelmente, em ApoB-100. Para este estudo, usa-se a IgIV enriquecida que foi obtida por meio de extração com HbAGE-Sepharose cujas regiões de afinidade de IgIV humana Octagam, que se ligaespecificamente à proteína dobrada incorretamente imobilizada (ver Exemplo6, 7). Adicionalmente, IgIV Octagam é incluído nos estudos.

Materiais e métodos

Avaliou-se a influência de IgIV Octagam sobre a ativação deplaquetas sangüíneas humanas por oxLDL ou por TRAP (peptídeo ativador dereceptor de trombina, aminoácidos: SFLLRN). A oxLDL foi preparadaincubando-se LDL purificado de sangue humano compreendendo FeSO4 (verseção de Materiais de Métodos do Exemplo 2 para mais detalhes). Determinou-seum grau de oxidação de 56% medindo-se o teo de dieno. Como determinadopreviamente (pedido de patente W02003NL00501), quando da oxidação ooxLDL aumenta a fluorescência de Tioflavina T (dados não mostrados, ver pedidode patente US2007003552 para exemplos). A agregação de plaquetas foi seguidaao longo do tempo em um agregômetro (Chrono-Log Corporation, Havertown,PA, E.U.A.) durante 15 minutos a 37°C a 900 rpm. Um volume de 270 μΐ desuspensão de plaquetas (200.000/μ1) foi incubado com 30 μΐ de solução contendoamostras para análise em concentrações indicadas. Para experimentos de inibiçãocom IgTV5 270 μΐ de suspensão de plaquetas foram incubados com 0,3 mg/ml defibrinogênio (esgotado de plasminogênio, fibronectina e fator de von Willebrandfactor, Enzyme Research Laboratories, Lafayette, IN, E.U.A.), 25 μΐ de LDLoxidado, LDL nativo (nLDL) ou solução de TRAP e 5 μΐ de solução com IgIV.Em experimentos com inibidores, oxLDL, nLDL ou TRAP foram pré-incubadoscom concentrações crescentes de IgIV, a 22°C durante 10 minutos. A agregaçãomáxima foi expressa como um percentual da resposta induzida com 8 μΜ deTRAP, que foi ajustada arbitrariamente em 100%.

A ligação de Octagam IgIV, IgIV esgotada (perfluxo apóscontactar IgIV com HbAGE -Sepharose) e IgIV enriquecida, a oxLDL foiavaliada usando-se um ELISA. Como um controle positivo, testou-se aligação das regiões de afinidade preparações com BSA-AGE imobilizada.Resultados e discussão

Na Figura 20A observa-se que IgIV Octagam inibeeficientemente a ativação de plaquetas induzida com oxLDL e a agregação deuma forma dependente da dose. A IgIV não influencia a agregação deplaquetas quando da ativação com TRAP. O baixo nível de agregaçãoobservado quando da exposição de plaquetas a LDL nativa não é alteradoquando o LDL nativo é pré-incubado com a série de concentrações de IgIV.

Em uma montagem ELISA direta avaliou-se a ligação deregiões de afinidade a LDL oxidado, e a afinidade relativa por oxLDL da IgIVque foi enriquecida usando matriz de afinidade de HbAGE dobradaincorretamente foi comparada com a afinidade de IgIV esgotada, recuperadacomo perfluxo da matriz de afinidade, e com material de partida de OctagamIgIV, usado como uma fonte para selecionar regiões de afinidade comafinidade por proteínas β cruzada dobrada incorretamente s. Características deligação são comparadas com aquelas obtidas com B SA-AGE, outra proteínadobrada incorretamente . Na Figura 20 descreve-se os resultados dos estudos deligação. Comparação das propriedades de ligação de IgIV enriquecida ematerial de partida com BSA-AGE e oxLDL, mostra que a seleção de regiõesde afinidade usando matriz de HbAGE resulta em maior afinidade de IgIVenriquecida por ambas as proteínas dobrada incorretamente s. O fator deenriquecimento no sentido da ligação de albumina glicosada ou oxLDL,expresso como a relação entre os valores de kD obtidos com ligação da amostrade IgIV de partida, e calculou-se os valores de kD obtidos com IgIVenriquecida. No caso de B SA-AGE, o fator de enriquecimento é de 45. No casode oxLDL, o fator de enriquecimento é de 27. Dificilmente o perfluxo liga-se aambas as proteínas dobrada incorretamente s, indicando que, novamente, oesgotamento de IgIV de regiões de afinidade com especificidade por proteínasdobradas incorretamente usando HbAGE-Sepharose ocorre de forma bastanteeficiente, reminiscente do que foi descrito no Exemplo 7.

Anticorpos, administrados passivamente ou induzidos pormeio de vacinação, são considerados geralmente como bons terapêuticos parao tratamento de um número crescente de doenças. LDL modificado, incluindoLDL oxidado, é um alvo-candidato para o tratamento de doenças,notavelmente aterosclerose, associada com maior formação e deposição deLDL modificado. Estes resultados demonstram que o método revelado écapaz de selecionar regiões de afinidade, como anticorpos humanos que seligam preferivelmente a proteínas modificadas, compreendendocaracterísticas de estrutura β cruzada, como LDL oxidado. Referidosanticorpos são usados, de preferência, para a detecção e, de preferência, parao tratamento de doenças, como aterosclerose, associadas com a formação deproteínas dobrada incorretamente s, de preferência, LDL dobradoincorretamente como uma conseqüência de modificação, como oxidação.Adicionalmente, aquelas regiões de afinidade selecionadas são usadas, depreferência, como moléculas de modelo apresentando seqüências deaminoácidos e características estruturais 3D de regiões de afinidade comafinidade por proteínas dobrada incorretamente s, for o projeto de regiões deafinidade sintéticas (ver Exemplo 20).

Na Figura 20E, mostra-se que a IgIV liga-se de forma saturávelao oxLDL usado para ativação das plaquetas. Na Figura 20G mostra-se queregiões de afinidade que são selecionadas com base em sua afinidade por Hb-AGE dobrada incorretamente também se ligam com maior afinidade a oxLDL,quando comparado com IgIV Octagam de que a IgIV enriquecida foiselecionada. Em conjunto com o efeito inibidor observado da IgIV sobreagregação de plaquetas induzida com oxLDL, nossos resultados mostram queIgIV compreende regiões de afinidade com especificidade por ApoB 100dobrada incorretamente e que as regiões de afinidade são capazes de interferirem respostas de células a proteínas dobrada incorretamente s, i.e. nesteExemplo 12 a agregação de plaquetas mediante exposição ao oxLDL, umaproteína dobrada incorretamente relacionada com, por exemplo, aterosclerose.

Exemplo 13

Papel de compostos de ligação de estrutura β cruzada[,] imunoglobulinasintravenosas e domínio de dedo de ativador de fator de crescimento dehepatócitos sobre o tempo de sangramento em um experimento de corteda cauda de um camundongoMateriais e métodos

Para a análise da influência de compostos de ligação deestrutura β cruzada sobre a coagulação e/ou agregação de plaquetas in vivo,realizou-se o ensaio de corte da cauda de camundongo para determinar otempo de sangramento. Para esta abordagem usou-se 50 camundongosC57BL/6JOIaHsd pretos machos com de 11 a 13 semanas de vida de acordocom um protocolo que foi aprovado pelo comitê ético local para experimentoscom animais (Utrecht University, Países Baixos). Camundongos foraminjetados intravenosamente (i.v.) na veia da cauda com 100 μΐ de tamponador(PBS, grupo de controle, η = 14) ou tamponador com composto testador ouheparina (controle positivo, conhecid por prolongar sangramento). Após de 5a 20 minutos os camundongos foram anestesiados em uma câmara com 5% deIsoflurano (indução), seguido de anestesia com de 2 a 2,5% de Isofluranousando-se uma máscara durante o curso do experimento (manutenção).Camundongos foram mantidos em um cobertor aquecido (37°C) com suascaudas pendendo da tabela. Cortou-se 5 mm da cauda com uma tesoura ecoletou-se sangue em copos. Registrou-se o tempo entre a injeção e o corte dacauda, e também o tempo entre o início do sangramento e a interrupção dosangramento. Pontos de viragem foram a interrupção do sangramento, em queo tempo de sangramento dura mais de 20 minutos, que foi interrompidoativamente por meio de fechamento da ferida mediante queima, e atingindo-seum volume de sangue acima de 200 μΐ devido a sangramento rápido.Sangramento prolongado durante mais de 20 minutos e sangramentorelativamente excessivo foram, ambos, ajustados arbitrariamente em umtempo de sangramento de 20 minutos. Como um controle positivo parasangramento prolongado esperado, nós usamos 10 I.E./heparina decamundongo (Leo Pharmaceutical Products B.V., 5000 ΙΕ/ml) i.v. em 100 μΐde NaCl a 0,9% (n = 8). Usou-se ativador de fator de crescimento dehepatócitos (HGFA, Hepatocyte growth factor activator) domínio dededo/fibronectina de tipo I a 4,7 mg/ml. Injetou-se cem μΐ i.v. resultando emuma concentração final aproximada de 234 μ^πιΐ com base em um volume desangue estimado de 2 ml/camundongo (n = 14). Usou-se imunoglobulinasintravenosas humanas (IgIV, Octagam, OctaPharma) de um estoque de 50mg/ml conforme fornecido pelo fabricante, diluído 20 vezes (n = 14).

Para os estudos usou-se um domínio de dedo de HGFAsintético que foi sintetizado quimicamente de acordo com procedimentosconvencionais (Dr. T. Hackeng, Academic Hospital Maastricht, PaísesBaixos; Hackeng, T. et al. (2001) Protein Sei. 10, 864-870, Hackeng, T. et ai.(1997) Proc. Natl. Aead. Sei. E.U.A. 94, 7845-7850). Para HGFA, tomou-seradicais de 200 a 240 (entrada Swiss-Prot Q04756). O domínio F de HGFApode ligar-se a proteínas dobradas incorretamente com estrutura β cruzada(ver, por exemplo, pedido de patente WO2003NL00501).

Resultados

Determinou-se o tempo médio de sangramento de uma ferida nacauda após cortar-se aproximadamente 0,5 cm da cauda, em 14 camundongosdos camundongos tratados com IgIV e tratados com F de HGFA, tratados comtamponador (Figura 21). Tempos de sangramento foram classificadosrandomicamente por cinco pessoas diferentes. Controle positivo para induzirsangramento prolongado consistiu de heparina a uma dose de 10 IE/camundongo(n = 8). No grupo de referência injetou-se PBS (n = 14). O tempo médio desangramento é de 368 segundos para camundongos de controle injetados comPBS, e de 1056 segundos para camundongos de controle injetados com heparina.F de HGFA e IgIV prolongaram o tempo de sangramento a, em média, 706 e765 segundos. De acordo com um teste t não-pareado com valores P bicaudados,os tempos de sangramento em camundongos injetados com F de HGFA ecamundongos injetados com IgIV diferem significativamente do tempo desangramento observado em camundongos injetados com PBS (ver Figura 21).Valores P são de 0,013 para F de HGFA e de 0,0045 para IgIV, respectivamente,quando comparados com o grupo de controle injetado com PBS. Estasobservações demonstram um papel para proteínas dobradas incorretamente comestrutura β cruzada nas cascatas que resultam em coagulação e formação de umplugue de plaquetas. Como descrito por nós previamente (ver, por exemplo,pedido de patente W02003NL00501), a polimerização de fibrina requerformação de estrutura β cruzada, e Iise de coágulos de fibrina por tPA eplasminogênio é inibida com compostos de ligação de estrutura β cruzada. Alémdisso, plaquetas são ativadas por proteínas dobradas incorretamente comestrutura β cruzada, e plaquetas ativadas expõem, elas próprias, estrutura βcruzada. Nos Exemplos 2 e 12 nós mostramos que IgIV interfere com agregaçãode plaquetas iunduzida com β cruzada. No Exemplo 8 nós demonstramos queIgIV enriquecida com HbAGE-Sepharose liga-se com maior especificidade afibrina, quando comparado com material de partida usado para enriquecimentode IgIV. Os dados obtidos agora com F de HGFA e IgIV no ensaio desangramento de corta da cauda mostram que estas moléculas de ligação βcruzada são um ponto de partida valioso para o desenvolvimento de terapêuticosanti-coagulantes baseados em compostos de ligação de estrutura β cruzada oubaseados em compostos que se ligam às moléculas que se ligam à estrutura βcruzada durante a coagulação e ativação de plaquetas, e, com isto, facilitam acoagulação e/ou formação de trombos. Em uma concretização do terapêuticosugerido, seleciona-se regiões de afinidade com especificidade para as proteínascom estrutura β cruzada que contribuem para a coagulação e agregação deplaquetas, dirigindo com isso a ação terapêutica mais especificamente para asproteínas com estrutura β cruzada que subjazem à coagulação e/ou formação detrombos.

Exemplo 14

Isolamento e identificação de proteínas de plasma de pacientes deamiloidose sistêmica, e de soro e fluido sinovial de pacientes de RA[artrite reumatóide], usando-se matriz com regiões de afinidade porproteínas dobrada incorretamente s

Como estruturas β cruzada e proteínas compreendendo umaestrutura β cruzada são ligadas efetivamente a uma coleção de moléculas deIgIV de acordo com a invenção e/ou a uma composição de acordo com ainvenção, elas são separadas e/ou isoladas efetivamente de uma amostra e/oude um corpo de animal ou humano, e identificadas subseqüentemente. IgIVapós enriquecimento usando matriz de afinidade de β cruzada, foram usadaspara isolar estruturas β cruzada e/ou proteínas compreendendo uma estruturaβ cruzada e/ou proteínas capazes de ligação específica com estrutura βcruzada ou conformações induzidas com estrutura β cruzada em proteínas.Proteínas capazes de ligar-se especificamente a uma estrutura β cruzada e/ouuma conformação induzida com β cruzada em proteínas são identificadas pelofato de que, quanto ligadas a proteína com estrutura β cruzada e/ouconformação induzida com β cruzada de uma maneira insaturada, matrizes deIgIV enriquecida ligam-se aos sítios de ligação livres na proteína com βcruzada e/ou conformação induzida com β cruzada, desta forma ligando-seindiretamente às proteínas que se ligam à estrutura β cruzada ou conformaçãoinduzida com estrutura β cruzada ligada à estrutura β cruzada e/ouconformação induzida com β cruzada. A presença e/ou identidade de umaestrutura β cruzada, e/ou proteína compreendendo uma estrutura β cruzadae/ou proteínas capazes de se ligarem especificamente à estrutura β cruzada ouconformações induzidas com estrutura β cruzada em proteínas, de indivíduossaudáveis foi comparado com a presença e/ou identidade de uma estrutura βcruzada, e/ou proteína compreendendo uma estrutura β cruzada e/ou proteínascapazes de se ligarem especificamente à estrutura β cruzada ou conformaçõesinduzidas com estrutura β cruzada em proteínas, de indivíduos com umadoença ou problema de saúde relacionado e/ou associado com uma estrutura βcruzada e/ou uma proteína compreendendo uma estrutura β cruzada e/ouproteínas capazes de se ligarem especificamente a estrutura β cruzada ouconformações induzidas com estrutura β cruzada em proteínas, como porexemplo, de indivíduos com amiloidose AL primária ou artrite reumatóide(RA). A identidade das proteínas isoladas com uma matriz de regiões deafinidade foi identificada por meio de análises de espectrometria de massa. Osresultados de uma amostra que se origina de um indivíduo saudável e umaamostra que se origina de um paciente foram comparadas. Além disso,resultados obtidos com uma amostra de um paciente ou de um indivíduosaudável contactada com matriz de IgIV enriquecida foram comparados comresultados obtidos após o contato das mesmas amostras com matriz decontrole sem regiões de afinidade imobilizadas. Desta maneira, obteve-seinformação acerca da identidade e/ou suscetibilidade de proteínas propensas adobramento incorreto e a adotarem conformação de estrutura β cruzadadurante estados de doença definidos, e acerca da(s) proteína(s) que se liga(m)preferencialmente àquelas proteínas dobrada incorretamente s. Isto forneceinformação-chave para o desenvolvimento de ferramentas diagnosticas quesão específicas para doença, por exemplo para monitorar estado de doença,para monitorar efetividade da terapia, para monitorar a ocorrência de doença,e fornece pistas valiosas para o desenvolvimento de terapêuticos objetivadospara estruturas β cruzada e/ou proteína(s) compreendendo uma estrutura βcruzada e/ou proteínas capazes de se ligarem especificamente a estrutura βcruzada ou conformações induzidas com estrutura β cruzada em proteínas,que são, de preferência, específicas para as desordens exemplares. Osterapêuticos, por exemplo, eliminam as proteínas dobradas incorretamente insitu, ou eliminam as proteínas dobradas incorretamente extracorporalmente,usando, por exemplo, matriz de afinidade durante regimes de diálise.

Material e métodos

IgIV Octagam (Octapharma, lote 5024018434) foi enriquecidaem Αβ-Sepharose, HbAGE-Sepharose e dlglV-Sepharose, como descritaalhures neste pedido. Os eluados destas matrizes foram dialisados contra PBS(2 h, 1:2000, 4°C), combinados e revestidos sobre CNBr-Sepharose (GE-Healthcare, Amersham Biosciences). A imobilização de IgIV enriquecida foirealizada substancialmente como descrito alhures neste pedido para NHS-Sepharose. A matriz de CNBr foi dissolvida a 200 mg/ml em 1 mM de HCl etratada da mesma forma com o matriz de NHS, exceto por uma etapaadicional de ativação de 5 minutos em 1 mM de HCl, em um dispositivo derolamento, antes da lavagem neste tamponador. As frações enriquecidascombinadas foram diluídas em tamponador de imobilização (50 mM de NaCle 40 mM de NaHCOs) a uma concentração de 15 μg/ml. Matriz de controlefoi expostos a tamponador de imobilização, apenas. Após imobilização de umdia para o outro a matriz foi bloqueada com Tris e lavada.

Seis amostras foram incubadas com a IgIV-Sepharose e aSepharose de controle: plasma combinado normal, plasma de um paciente Iou de um paciente II, com amiloidose AL, soro de um paciente III com RA(Fator Reumatóide, titulação de RF de 682), soro de controle e fluido sinovialde um paciente IV com RA (titulação de RF de 23). Todas as amostras foramdiluídas 20x em HBS e aplicadas a 200 μΐ de pérolas em dois volumes de 500μl. Um volume foi incubado durante 4 h à temperatura ambiente e osobrenadante foi descartado após centrifugação (2 minutos a 1400 rpm).Subseqüentemente, o segundo volume foi aplicado na mesma matriz eincubado de um dia para o outro em um dispositivo de rolamento a 4°C. Amatriz de afinidade ou matriz de controle foi lavada 12 vezes com HBS e asproteínas ligadas foram eluídas com 2 χ 50 μΐ de uréia 8 M em PBS, em duasetapas de incubação subseqüentes de 1 h cada. Para coletar os eluados, asmatrizes foram centrifugadas e os dois eluados foram combinados para cadaamostra.

Códigos das amostras:

Al plasma combinado normal

Cl plasma combinado normalΑ2 paciente de amiloidose AL I

C2 paciente de amiloidose AL I

A3 paciente de amiloidose AL II

C3 paciente de amiloidose AL II

A4 soro do paciente III com RA (titulação de RF de 682)

C4 soro do paciente III com RA (titulação de RF de 682)

A5 soro de controle

C5 soro de controle

A6 fluido sinovial do paciente IV com RA (titulação de RF de 23)C6 fluido sinovial do paciente IV com RA (titulação de RF de 23)série A: matriz de afinidade de IgIV-Sepharose enriqueciasérie C: matriz de controle (Sepharose ativada/desativada)

Proteínas eluídas foram reduzidas com ditiotreitol (DTT) (60minutos, concentração final de 6,5 mM) e, depois, alquiladas comiodoacetamida (30 minutos, concentração final de 54 mM), seguido dedigestão tríptica de um dia para o outro (10 ng/μΐ). Digestões de proteínaforam dessalinizadas como descrito (Rappsilber et al 2003, Anal. Chem. 75,663-670), secadas a vácuo e dissolvidas em 2,5% de ácido fórmico.

Para análise de misturas de peptídeos usou-se um sistemaAgilent 1100 HPLC (Agilent Technologies) conectado a um Thermo FinniganLTQ-MS (Thermo Electron, Bremen, Alemanha). Digestões de proteínaforam injetadas em uma coluna de aprisionamento (Reprosil Cl8 RP (DrMaisch, Alemanha), 20 mm χ 100 μιη de diâmetro interno) a 5 μΐ/minuto.Subseqüentemente, os peptídeos foram transferidos com uma taxa de fluxoparcialmente reduzido de 100 nl/minuto de solvente A (0,1 M de ácidoacético) na coluna analítica (Reprosil Cl8 RP, 20 cm χ 50 fim de diâmetrointerno). Eluição dos peptídeos foi obtida com um gradiente linear de 0 a 40%de B (0,1 M de ácido acético em 80% (v/v) de acetonitrila) em 40 minutos. Oefluente de coluna foi introduzido diretamente na fonte de ESI doespectrômetro de massa via um emissor de nano-ESI conectado ao fundo(New Objectives, Woburn, MA). O espectrômetro de massa foi operado nomodo de íon positivo, e íons parentais foram selecionados para fragmentaçãoem modo dependente de dados. Após medições espectrométricas de massa,gerou-se listas de picos usando o programa [software] BioWorks (ThermoElectron, Bremen, Alemanha). A identificação da proteína foi realizadausando o programa Mascot (www.matrixscience.com) mediante busca nobanco de dados IPIhuman (versão 3.24, descarregado deftp://ftp.ebi.ac.ukypub/databases/IPI/current) usando-se os seguintes ajustes:peptídeos totalmente trípticos, tolerância de peptídeo de 0,8 Da, tolerânciaMS/MS de 0,9 Da, 1 clivagem perdida permitida, carbamidometila (Cys) eoxidação (Met) como fixado e modificação variável, respectivamente. Usou-se o programa [software] Scaffold (www.proteomesoftware.com) paraclassificar os dados e para filtrar peptídeos num nível de confiança de 95%,permitindo apenas identificação de proteína com pelo menos 2 peptídeosidentificados.

Resultados e discussão

Na Tabela 9 os resultados são apresentados para as diferentesamostras. Para os pacientes com amiloidose usou-se sangue combinadohumano como um controle. Para o paciente de RA, usou-se soro de umindivíduo saudável como um controle. Os resultados para soro de controle eplasma combinado normal são usados para identificação de peptídeos queestão presentes apenas em composições de peptídeos obtidas com amostras depacientes. As proteínas apresentaram são as proteínas ou fragmentos deproteínas que se ligam especificamente de plasma ou soro de paciente, emcomparação com o plasma ou soro de controle. Como não haviadisponibilidade de fluido sinovial de um indivíduo saudável, usou-se apenas amatriz de controle como um controle negativo para o fluido sinovial de umpaciente de RA. Como mencionado, realizou-se a identificação de proteínamediante busca no banco de dados IPIhuman. IPI significa 'InternationalProtein Index' [índice internacional de proteínas], e é usado para identificarproteínas, precursores de proteínas e fragmentos de proteínas em diferentesbancos de dados, como Swiss-Prot, TrEMBL, e PIR (estes bancos de dadossão, todos, acoplados em UniProt). Prepara-se conjuntos de proteínas IPI paraum número limitado de espécies eucarióticas superiores cuja seqüênciagenômica foi determinada completamente, mas para a qual há um grandenúmero de seqüências de proteínas preditas que (ainda não) estão listadas noUniProt. IPI usa dados do UniProt e também de fontes compreendendopredições, e os combina de forma não-redundante a um conjunto abrangentede proteoma para cada espécie. Toda esta informação foi obtida por meio dowebsite [endereço da rede mundial de computadores] do EuropeanBioinformatics Institute (EBI) que é acessível via: www.ebi.ac.uk.

Uma proteína (IPI00807428) para a qual um peptídeo foiidentificado no eluado de matriz de controle que foi contactada com fluidosinovial encontra-se listada porque sete peptídeos desta proteína foramidentificados no eluado da matriz de IgIV enriquecida. Como se vê, hádiversas proteínas 'hipotéticas' e proteínas indicadas pelo peso molecular dasproteínas detectadas. Como seqüências de aminoácidos relativamente curtasnem sempre podem ser atribuídas a apenas uma proteína específica, que éobservada particularmente entre imunoglobulinas, são possíveis múltiplosresultados para alguns dos fragmentos de proteína identificados. Em algunsoutros casos, o número IPI da proteína hipotética refere-se a uma proteína jáidentificada.

Nas amostras 2/3, o soro de pacientes de amiloidose AL I e II,uma proteína identificada foi 'domínio 3 de cadeia pesada de dineína [dyneinheavy chain domain 3]'. Dineína é uma 'proteína motora', que move a cargaintracelular da membrana celular para o interior da célula. Este é, porexemplo, o caso na autofagia e transporte axonial. Dineína está envolvida notransporte de agregados de proteína. De modo que, se havia alguma razãorelacionada com um agregado de proteínas no plasma, isto poderia terminareventualmente ligando a matriz de IVIg enriquecida. Portanto, a dineína éidentificada como uma proteína de ligação β cruzada. Adicionalmente naamostra 2/3, identificou-se uma proteína hipotética, duas proteínas de 25 kDae uma região constante lambda de imunoglobulina 1. A proteína de 25 kDacom número IPIIPI00747752 não apresentou referência em qualquer um dosbancos de dados. No entanto, ela apresentava todas as característicasestruturais de imunoglobulinas. A outra protein de 25 kDa apresentou umareferência gênica com o lócus lambda da imunoglobulina. A proteínahipotética apresentava um gene e uma proteína de referência paraimunoglobulina lambda variável 4-3. Imunoglobulinas consistem de duascadeias pesadas, cada uma com uma região constante e uma região variávelde ligação de antígeno, e também de duas cadeias leves apresentando, cadauma, uma região constante e uma região variável de ligação de antígeno.Como os pacientes sofrem de amiloidose AL primária, as cadeias levesidentificadas são, mui provavelmente as cadeias leves de imunoglobulinadobradas incorretamente relacionadas com a patologia da doença.

Na amostra 4, identificou-se várias proteínas únicas no soro deum paciente de RA III. Este paciente apresentou uma titulação de RF acimade 600, indicando que este paciente sofre de RA grave. Quatro das proteínasidentificadas foram proteínas hipotéticas, em que uma delas (IPI00760678)apresentava uma referência gênica com o lócus lambda de imunoglobulina euma referência de proteína com as regiões constantes lambda deimunoglobulina. As outras três apresentam todas as características estruturaisde imunoglobulinas. Duas proteínas identificadas como proteínas de 25 kDa,apresentavam uma referência gênica com o lócus lambda de imunoglobulina.Uma apresentou uma referência de proteína específica para a cadeia leve doFator Reumatóide G9, uma região variável lambda 3 aparentemente específicapara Fator Reumatóide. Portanto, conclui-se que este fragmento é parte deuma imunoglobulina de ligação β cruzada. Havia duas proteínas identificadascomo imunoglobulina lambda constante 1 (IPI00658130, IPI00719373) eduas proteínas como imunoglobulina lambda constante 2 (ΓΡΙ00555945,IPI00450309). Havia uma outra proteína identificada como uma região deimunoglobulina, ou seja imunoglobulina lambda variável 3-25. Conclui-seque este fragmento compreende as seqüências de aminoácidos queapresentam afinidade por proteínas dobrada incorretamente s. Mostrou-se, emestudos diferentes, que o Fator Reumatóide contém, em muitos casos, regiõeslambda específicas, em que uma delas foi aparentemente identificada nesteexperimento. As outras regiões lambda identificadas também poderiam serparte do Fator Reumatóide. Estas regiões também poderiam ser parte demoléculas de imunoglobulina dobrada incorretamente , ou elas foram parte doauto-antígeno do RF, que é a região Fc de imunoglobulinas, que apresentacaracterísticas de uma proteína dobrada incorretamente compreendendoestrutura β cruzada (ver Exemplo 10). Identificou-se três outras proteínas.Uma foi identificada como Isoforma 1 da proteína Centrossômica Cep290(IPI00784201). Proteínas associadas com Centrosoma e Cilia desempenhampapéis cruciais na determinação da polaridade e na regulação do transporteintracelular em células pós-mitóticas. Devido a sua localização intracelular, apresença indica que o teor de células lisadas está presente na amostra dopaciente. A segunda foi identificada como a Isoforma Gama-B do precursorde cadeia gama de fibrinogênio (IPI00021891). Formas diferentes defibrinogênio são antígenos para auto-anticorpos na artrite reumatóide. Aforma desiminada de fibrinogênio é um destes antígenos, que é encontradoabundantemente na membrana sinovial de pacientes com artrite reumatóide.

A proteína final identificada (IPI00004233) foi o antígeno parao anticorpo monoclonal Ki-67. Este antígeno é usado como um marcador deproliferação. Em alguns casos ele é usado como um marcador para ocrescimento de tumor. O mais interessante é que ele também foi descritocomo um marcador de proliferação na artrite reumatóide, para se avaliar aproliferação de tipos de células inflamatórias no sinóvio.

Na amostra 6, o fluido sinovial de um paciente de artritereumatóide IV, temperatura se identificou unicamente diversas proteínas. Trêsdestas proteínas eram proteínas hipotéticas. Uma (EPI00807428) nãoapresentou quaisquer referências gênicas ou protéicas, mas todasapresentaram as características de imunoglobulinas. Uma (IPI00760678)apresentou referências gênicas de banco de dados com o lócus lambda deimunoglobulina (constante 2) e referências protéicas de banco de dados para aregião estante de lócus lambda de imunoglobulina, mas também referênciasprotéicas para a região variável 2-14 e para proteínas hipotéticas. A última(IPI00003362) era efetivamente proteína de choque com calor BiP (GRP78).BiP é um dos constituintes da Via β cruzada e liga-se a proteínas dobradasincorretamente (ver Tabela 4 e 5). BiP é identificado mui provavelmente naamostra do paciente porque encontra-se ligado a uma proteína misfolded. BiPtambém foi identificado como um auto-antígeno alvo per se em pacientes deRA. Diferentemente das proteínas hipotéticas, identificou-se três outrasproteínas não-denominadas; duas proteínas com 25 kDa e uma proteína com26 kDa. Ambas as proteínas com 25 kDa apresentaram referências gênicaspara o lócus lambda de imunoglobulina (IPI00747752, IPIOO154742). Umadestas (IPI00154742) também apresentou uma referência de proteína com acadeia leve GO do Fator Reumatóide, a região variável lambda 3 específicapara fator reumatóide, como indicado previamente. A proteína de 26 kDaapresentou referência gênica para variável κ de imunoglublina 1-5. Tambémforam identificadas algumas outras regiões de imunoglobulina. Uma foi aconstante κ de imunoglobulina (IPI00807413), um (IPI00166866) umaimunoglobulina de constante alfa 1 pesada, uma (IPI00748998) um fragmentode imunoglobulina Fv de cadeia simples (região variável de cadeia pesada) e,finalmente, um (IPI00658130) que foi identificada como uma imunoglobulinade cadeia leve constante 1.

O fluido sinovial também continha alguns componentes dosistema de complemento, nominalmente subunidade C de subcomponente decomplemento Clq (IPI00022394), subcomponente Clr de complemento(EPI00296165) e proteína 1 relacionada com fator H de complemento(IPI00011264). Mostrou-se que, no fluido sinovial de pacientes com artritereumatóide, encontra-se abundantemente micropartículas C4 e/ou C3 comClq ligado, em comparação com soro tanto de pacientes com artritereumatóide como também de controles saudáveis. Verificou-se também queClq acumula-se em placas beta amilóides. Por fim, Clq é estruturalmentesimilar à proteína tensoativa A (SP-A), em que ambos apresentam uma regiãode cabeça globular e uma cauda similar a colágeno. SP-A foi associado comcorpos lamelares no sinóvio, e estão presentes auto-anticorpos para SP-A nofluido sinovial de pacientes com artrite reumatóide. Estes auto-anticorposapresentam alguma reatividade cruzada com Clq. Clq atua na Via β cruzada(ver Tabela 4 e 5). Julgando a reatividade cruzada de auto-anticorpos contraSP-A com Clq, também se considera ser um auto-antígeno. Particularmenteporque o colágeno é um auto-antígeno na artrite reumatóide.

Clr de complemento é uma serina protease que é capaz deassociar-se com Clq. Clr pode ativar outros fatores de complemento. Não seencontrou uma associação clara com a artrite reumatóide ou dobramentoincorreto de proteína até aqui. Proteína relacionada com fator H decomplemento 1 (FHR-1, complement factor H-related protein 1) consiste decinco curtas repetições de consenso (também encontradas no fator H) e suafunção é desconhecida até aqui. FHR-1 é encontrado no plasma humano comoparte de determinadas partículas de lipoproteína. Mostrou-se que FHR-I estáassociada com um complexo de lipoproteína de fosfolipídeo e outras proteínasno plasma e que este complexo media respostas de células alipopolisacarídeos (LPS). Nós demonstramos que LPS induz conformação βcruzada em proteínas. Nós também determinamos que ApoA-I é capaz deadotar conformação β cruzada. Adicionalmente, ApoA-I é capaz de ligaçãocom outras proteínas compreendendo conformação β cruzada. A lipoproteínano complexo consiste de fosfolipídeos, apoliproteína A-I (apoAI), proteína deligação de lipopolissacarídio (LBP), e proteínas relacionadas com fator H(FHRs). Conclui-se que FHR-I apresenta um papel na realização e/ouregulação da função de LBP. Como FHR-I é o componente de proteínadominante destas partículas, FHR-I parece muitas vezes mais abundante doque ApoA-I ou LBP. Previamente, mostrou-se que uma proteína relacionadaconstituída de seis repetições curtas consenso conhecidas como beta 2-glicoproteína I (também denominada apoliproteína H) associa-se tanto compartículas de HDL e com fosfolipídeos. Beta 2-glicoproteína I (IPI00298828)também foi identificada na amostra de fluido sinovial. Beta 2-glicoproteína I éum auto-antígeno conhecido na aterosclerose e síndrome anti-fosfolipídeo,uma condição com risco incrementado de trombose. As funções de beta 2-glicoproteína I permanecem obscuras. No entanto, mostrou-se que ele inibereações de coagulação dependentes de fosfolipídeo, como a atividade docomplexo pró-trombinase - tenase, e ativação de fator XII. Ele também se ligaa fator XI e inibe sua ativação. Em contraste, ele inibe a atividade anti-coagulante de proteína C ativada e pode contribuir para a geração de trombinain vivo. Quando beta 2-glicoproteína I é clivada por plasmina, ela se liga aoplasminogênio e suprime a geração de plasmina. Nós mostramos que 62gpicompreende conformação β cruzada quando contactado com cardiolipina ouanálogos quando alquilado, dotando-o com potencial imunogênico. Outrastrês proteínas foram identificadas na amostra de fluido sinovial, ou sejaproteína 5 similar a calmodulina (IPI00021536) (também denominadaproteína da pele similar a calmodulina), isoforma I de desmoplaquina (DPI)(IPIOOO13933) e isoforma I de gelsolina (ΙΡΪ00026314). Proteína 5 similar acalmodulina é uma proteína de ligação de cálcio específica para a pele e suaexpressão é restrita ao stratum granulosum e às camadas inferiores do stratumcorneum. Ela é expressa durante a diferenciação celular. Esta proteína estáprovavelmente presente no fluido sinovial como uma contaminação (célulasda pele). A desmoplaquina é um regulador da organização de microtúbulos naepiderme, e associa-se com queratinas da epiderme. Esta proteínaprovavelmente também é uma contaminação. A Gelsolina termina filamentosde actina, e uma forma secretada de gelsolina está presente no plasma, ondeprovavelmente atua como um aglutinador de actina. A gelsolina também écapaz de formar depósitos amilóides e é uma das proteínas que causaangiopatia amilóide cerebral. Mutações no gene de gelsolina resultam no tipoFinlandês de amiloidose familiar de relacionada com gelsolina. Quandoagregados de gelsolina ou gelsolina dobrada incorretamente se encontravampresentes na amostra de fluido sinovial, não é de surpreender que se ligaram àmatriz de IVIg enriquecida.

Com o uso de matriz de afinidade de IgIV enriquecida, comodescrito no presente Exemplo, nós identificamos diversas proteínas únicaspara pacientes de amiloidose, e identificou-se unicamente séries de proteínasem amostras obtidas de pacientes com artrite reumatóide. Estas proteínas, oucontêm uma estrutura β cruzada ou são, elas próprias, proteínas de ligação βcruzada. Estas proteínas formam a base para o desenvolvimento de umaferramenta diagnóstico específica para doença e/ou são alvos recentementeidentificados para o desenvolvimento de terapêuticos objetivados paraesgotar pacientes de proteínas dobradas incorretamente moduladoras dedoença in Vivo (por exemplo, por meio de administração de drogas) e/ou exvivo (p. ex., dispositivo extracorpóreo). Além disso, os estudosproporcionaram compreensão sobre várias moléculas de ligação β cruzadaidentificadas aparentemente relacionadas com a doença. As regiões variáveisde Ig's identificadas servem como um bom ponto de partida para odesenvolvimento de regiões de afinidade sintéticas (ver abaixo, Exemplo20).

Exemplo 15

Modulação da interação de proteínas dobradas incorretamente comcélulas por regiões de afinidade.

Proteínas dobradas incorretamente compreendendo estrutura βcruzada são capazes de ligação a células e evocam respostas celulares,incluindo embora sem limitação, respostas inflamatórias e alterações nocrescimento de células ou apoptose. Nos avaliamos se regiões de afinidademodulam a interação de referidas proteínas dobradas incorretamente comcélulas. Nós usamos células endoteliais primárias humanas (HUVECs, humanprimary endothelial cells) isoladas de veias umbilicais.Materiais e métodos

Isolamento, cultura e análise de células endoteliais primárias humanas(HUVECs, human primary endothelial cells)

Isolamento e cultura

HUVECs são células endoteliais primárias (ECs, endothelialcells), isoladas de cordões umbilicais usando 0,1% de colagenase (Sigma,CO130, 100 mg, dissolvido em 100 ml de meio M199 suplementado com 10%de FCS (Gibco 10106-169) e Penicilina- Estreptomicina (P/S, Gibco, 15140-122)), de acordo com procedimentos convencionais amplamente usadosconhecidos por uma pessoa versada na arte. HUVECs apresentam ascaracterísticas típicas de ECs, p. ex. morfologia de pedra de rio earmazenamento de fator de von Willebrand em corpos de Weibel-Palade.HUVECs podem ser cultivadas regularmente até a passagem 5; além dapassagem 5 as HUVECs perdem marcadores típicos de EC. O isolamento édescrito aqui de forma resumida. O cordão umbilical é lavado durante menosde 3 minutos em etanol e subseqüentemente com PBS. A veia é conectada acânulas e enxaguada com enxaguada com 10 ml de PBS, seguido decarregamento com a solução de colagenase a 0,1%. Após uma incubação de15 minutos a 37°C, a suspensão de células endoteliais destacadas érecuperada por meio de enxágue da veia com 10 ml de meio que é adicionadosubseqüentemente à solução de colagenase. A suspensão de EC é centrifugadadurante 5 minutos à temperatura ambiente, com baixa força g. O sobrenadanteé descartado e o pellet de células é ressuspenso em 5 ml de 'meio rico1 (EGM-2; meio endotelial basal (EBM-2, Cambrex, CC-3156) e Singlequots contendosuplementos para células endoteliais (Cambrex, CC-4176)). Células(passagem 0, PO) são semeadas em um frasco de cultura revestid com 0,5%de gelatina (Sigma, G1393). Para facilitar a adesão das células endoteliais,adiciona-se fibronectina humana à cultura de células a uma concentração finalde 2 μg/ml. EC's são cultivadas a 37°C, a 5% CO2. O meio de cultura decélulas é renovado a cada 2-3 dias até a confluência. Em seguida, com aadição de tripsina-EDTA, as células são destacadas do frasco, centrifugadascom baixa força g, ressuspensas em meio rico e semeadas em frascos decultura de células maiores previamente revestido com gelatina a 0,5%.Expressão e purificação de RAGE

Para uma descrição da clonagem, expressão e purificação desRAGE humana recombinante, ver pedido de patente W02006101387(parágrafo [0303]). O estoque de sRAGE-FLAG-His purificado foi de 284μg/ml em PBS, armazenado a -80°C.

Adesão de células a proteínas dobrada incorretamente s

Em placas de 96 poços (Immulon IB Thermo Labsystems3355) proteínas, i.e. BSA-AGE (5 μg/ml), 10 μg/ml de IVIg nativa (Octagamcharge024018434), 10 μg/ml de IVIg enriquecida (enriquecida por meio decontato de IgIV Octagam com Hb-AGE-Sepharose [ver alhures no pedidopara uma descrição]) ou gelatina (Sigma G1393, solução a 2% em H2O ouPBS, controle positivo para adesão a ECs) foram revestidas usando-sesoluções de 100 μΐ. Após incubação durante 2 horas a 37°C as soluções foramdescartadas e os poços bloqueados durante 1 hora a 37°C com 100 μΐ/poço depolivinilpirrolidona a 0,5% (PVP, Sigma P5288) em PBS, esterilizadas porfiltração (0,22 μηι). PVP é um polímeros inerte que não suporta adesãocelular. Subseqüentemente, a solução com PVP foi descartada. Em seguida, asplacas foram incubadas com 40 μΐ de meio RPMI 1640 (Gibco 52400) e 10 μΐde inibidor potencial, como regiões de afinidade. HUVECs foram obtidas pormeio de tripsinização. Após centrifugação, células foram suspensas em meioRPMI 1640 com P/S e diluídas a 80.000- 100.000 células/ml. Cada poço foisemeado com 100 μΐ da suspensão de células. Células foram deixadas aderirdurante 1 hora a 37°C. Placas foram lavadas cuidadosamente com meio RPMI1640 com P/S. O meio foi removido por meio de pipetamento ao longo dasparedes dos poços. Placas foram lavadas até que os poços vazios contivessemquase nenhuma célula residual, i.e. de 1 a 3 vezes. Subseqüentemente,adicionou-se 50 μΐ de meio RPMI em cada poço, seguido da adição de 5μl/poço de 10% de Triton-XlOOO em PBS e incubação durante 10 min a 37°C.Em seguida, adicionou-se 50 ul de solução de lactodesidrogenase (LDH,Roche Applied Science, 11644793001) de acordo com instruções dofabricante. A placa foi incubada durante de 0,5 a 3 horas à temperaturaambiente no escuro. A absorbância a 490 nm foi medida em uma leitora demicroplacas Versamax em diversos momentos.

Ligação de proteínas dobradas incorretamente a células avaliada pormeio de análise de seleção de células ativada por fluorescência (FACS)

Para estes experimentos HUVECs foram isoladas portripsinização. Após a tripsinização células foram coletadas em RPMI 1640,contendo P/S e 10% FCS e centrifugadas. Após a centrifugação, células foramressuspensas em meio RPMI sem FCS a uma concentração de 250.000células/250 μΐ. Preparou-se tubos individuais de 4 ml (polipropileno, Greiner),contendo 250 μΐ de suspensões de células. Adicionou-se em cada tubo 75 μΐde uma amostra, contendo tamponador (PBS) apenas, 50 μΐ de tamponadorcom 25 μl de oxLDL (1 mg/ml) ou 74 μl de tamponador com 1 μl de BSA-AGE (25 mg/ml). Subseqüentemente, as células foram incubadas com aamostra durante aproximadamente 3,5 horas a 4°C. Em seguida, células forampelletizadas por meio de centrifiigação e o sobrenadante foi descartado.

Células foram lavadas subseqüentemente com tamponador de FACS(PBS/0,5% de BSA/0,05% m/v de NaN3) a 4°C e ressuspensas emtamponador de FACS a aproximadamente IxlO5 células/100 μΐ para análisesubseqüente. A morte celular foi determinada adicionando-se 3 μΐ de soluçãode 7-aminoactinomicina D (7AAD) (preparada de acordo com procedimentosconvencionais). A ligação da amostra BSA-AGE (ver alhures neste pedidopara detalhes sobre a preparação) foi determinada com anticorpo monoclonalanti-AGE 4B5 (10 μg/ml) e, após lavagem, com anticorpos anti-camundongode cabra secundários PE (Jackson Immunoresearch, West Grove, E.U.A.). Aligação de BSA-AGE também foi avaliada usando-se a fluorescênciaintrínseca de BSA-AGE no canal de PE. A ligação de LDL oxidado (oxLDL,oxidado a 56% após incubação com FeSC^; aumento específico dafluorescência de Tioflavina T) foi determinada com soro de coelho comanticorpos anti-ApoB100 policlonais (Dade Behring, Newark, DE, E.U.A.,lote 153670) a uma concentração de 160 μg/ml e, após lavagem das células,com anticorpos anti-coelho de cabra marcados com FITC (1:200, Jackson).

Resultados e conclusão

Adesão de células a proteínas dobrada incorretamente s

Verificou-se que HUVECs aderem a proteínas dobradaincorretamente s, i.e. como mostrado aqui com BSA-AGE, em grau um poucomaior, aproximadamente 125%, do que gelatina (Figura 22A, barras 1 versus3). Concentrações crescentes de regiões de afinidade, i.e. IgIV, inibiram aadesão de ECs a BSA-AGE (barras de 7 a 9 versus a barra 3). Estes dadosrevelam que regiões de afinidade interferem com a interação de proteínasdobradas incorretamente com as células.A Figura 22B mostra que células também se ligam a regiões deafinidade (IVIg, Octagam), de forma mais eficiente a regiões de afinidadeenriquecidas (IVIg enriquecida, após enriquecimento por meio de contato deOctagam com Hb-AGE-Sepharose, ver alhures neste pedido para descrição).

A ligação de ECs às regiões de afinidade imobilizadas compreendendodomínios Fc não é mediada por receptores de Fc clássicos, como referidosreceptores, i.e. CDl6, CD32a e b e CD64, não estiveram presentes nascélulas, como determinado usando análise FACS (não mostrado). Comoregiões de afinidade são capazes de se ligarem especificamente a proteínasdobrada incorretamente s, esta interação entre regiões de afinidade e células éexplicada por meio da ligação de proteínas dobradas incorretamente nascélulas às regiões de afinidade, especificamente. Efetivamente,aproximadamente de 1 a 2% das células se mostraram menos viáveis, comodeterminado com FACS (não mostrado).

Ligação de proteínas dobradas incorretamente a células determinada pormeio de citometria de fluxo

Usando-se dois métodos, verificou-se que BSA-AGE liga-seeficientemente a 96% das ECs com uma intensidade média de fluorescência(intensidade de fluorescência média (MFI, mean fluorescence intensity) de13,9. OxLDL ligou-se a 18% das ECs incubadas e apresentou uma MFI de1,6. As características de ligação obtidas com ECs incubadas em suspensãocom BSA-AGE estão alinhadas com a observação de que ECs se ligameficientemente em poços de placas de cultura de células que são revestidoscom BSA-AGE (ver Figura 22).

Considerado em conjunto, estes resultados demonstram quecélulas são capazes de ligar-se especificamente a proteínas dobradasincorretamente com estrutura β cruzada e que regiões de afinidade, depreferência, regiões de afinidade enriquecidas, modulam a interação dereferidas proteínas dobradas incorretamente com células. Neste Exemplo, nósobservamos que regiões de afinidade de IgIV presentes em IgIV Octagambloqueiam eficientemente a adesão de ECs a BSA-AGE dobradaincorretamente imobilizada. Conclui-se que regiões de afinidade dirigidascontra a proteína dobrada incorretamente imobilizada ligam e protegem aproteína dobrada incorretamente contra interação com receptores de superfíciede EC.

Exemplo 16

Esgotamento de soluções de proteínas dobradas incorretamente usandoIgIV enriquecida

Nós analisamos se a IgIV enriquecida, obtida após seleção deregiões de afinidade que se ligam a matrizes com proteínas dobradasincorretamente imobilizadas compreendendo estrutura β cruzada, sãovantajosas para esgotar soluções de estrutura β cruzada. Em resumo, em umaabordagem ELISA, uma mistura de IgIV enriquecida com o uso de Αβ fibrilo-Sepharose, dlglV-Sepharose, dHSA-Sepharose e BSA-AGE-Sepharose, comodescrito no Exemplo 6, foi imobilizada, exposta a soluções com um pico deHbAGE dobrada incorretamente e dOVA, e subseqüentemente avaliou-se aligação das proteínas dobradas incorretamente a IgIV enriquecida.

Materiais e Método

IgIV Octagam (lote 5024018434) foi enriquecida com o uso deAB fibrilo-Sepharose, dlglV-Sepharose, dHSA-Sepharose e BSA-AGE-Sepharose, como descrito no Exemplo 6. As concentrações de Ig foram deaproximadamente 30 μg/ml. Para o corrente experimento, os quatro eluadosdas matrizes de afinidade foram misturadas a 1:1:1:1 numa base em volume, erevestidas a uma concentração de 5 μg/ml em placas de alta ligação GreinerMicrolon, durante 1 h à temperatura ambiente com movimento. Como umcontrole revestiu-se apenas tamponador de controle negativo ou albumina desoro humano (HSA [Human Serum Albumine] nativa (CEALB, Sanquin,Países Baixos). Realizou-se ELISAs substancialmente como descrito acima.Poços bloqueados (reagente de bloqueio Roche) revestidos com IgIVenriquecida ou HSA ou tamponador de revestimento foram recobertos emduplicata com 0, 1, 10 ou 100 μg/ml de dOVA ou HbAGE. Avaliou-se aligação de dOVA usando albumina de ovo anti-frango monoclonal (Sigma,A6075, 1:10,000) e RAMPO (Dako Cytomation, P0260, 1:3,000). HbAGE foidetectado usando-se um hibridoma de camundongo específico para AGE IgG4B5, desenvolvido contra fibronectina humana glicada com glucose-6-fosfato,e RAMPO. Obteve-se sinais de fundo com poços revestidos com tamponadorque foram recobertos subseqüentemente com soluções de proteína (verabaixo), [que] foram substraídos de sinais obtidos com poços revestidos comIgIV enriquecida ou HSA. Adicionalmente, sinais de fundo obtidos paraincubações de anticorpos primários e secundários com poços em que não seadicionou dOVA ou HbAGE (controle de tamponador para ligação), foramsubtraídos dos sinais obtidos com 1, 10 e 100 μg/ml de proteína dobradaincorretamente.

Resultados e discussão

Figura 23 mostra que dOVA é extraída da solução por meio deIgIV enriquecida imobilizada, em que dificilmente ocorreu qualquer ligação aHSA. De forma análoga, HbAGE também foi extraída especificamente pelaIgIV enriquecida. Estes resultados mostram que a IgIV enriquecida comafinidade maior por proteínas dobradas incorretamente compreendendoestrutura β cruzada, que é imobilizada sobre um suporte sólido vantajoso, évantajosa para ser aplicada no esgotamento de soluções de proteínas dobradasincorretamente compreendendo estrutura β cruzada, como por exemplo,dOVA e HbAGE.

Aplicações para este método revelado com o fim de esgotarsoluções-de-proteína de proteínas dobradas incorretamente encontram-se nocampo de, por exemplo, embora sem restrição, i) diagnósticos para doençasde dobramento incorreto de proteínas, como por exemplo, falha renal,amiloidose sistêmica, como por exemplo, amiloidose AL, AA ou ATTR, ouRA, ii) controle de qualidade de soluções de proteína, como por exemplo,biofarmacêuticos e vacinas, iii) diálise, usando, por exemplo, dispositivosextracorporais, de pacientes que sofrem de doenças de dobramento incorretode proteínas, como por exemplo, falha renal, amiloidose sistêmica, como porexemplo, Amiloidose AL, AA ou ATTR, ou RA, e iv) eliminação debiofarmacêuticos de proteínas dobradas incorretamente apresentando um riscode indução de efeitos colaterais (imunogênicos). Para todas as aplicaçõesmencionadas acima, as especificações das regiões de afinidade aplicadas comrelação a ligação preferencial e específica a proteínas dobrada incorretamentes, são ajustadas de acordo com a necessidade. Em uma concretizaçãopreferida, com os métodos e meio descritos no Exemplo 6 e 7 e no "Sumáriobaseado nos Exemplos de 1 a 20", dados abaixo, seleciona-se aquelas regiõesde afinidade específicas dentre uma composição de regiões de afinidade quesão exigidas para determinados fins objetivados, como por exemplo, aqueleslistados acima.

Exemplo 17

Imunomodulação de respostas celulares a proteínas dobradasincorretamente por meio de regiões de afinidade enriquecidas

Para eliminar do corpo proteínas dobrada incorretamente s,células imunes respondem a proteínas dobradas incorretamente de diversasmaneiras. Respostas incluem a opsonização de proteínas dobradaincorretamente s, a produção de citocinas e quimiocinas para ativar e atrairoutras células do sistema imunológico e a expressão de marcadores desuperfície celular para ativar outras células. Em particular, anticorpos, comoregiões de afinidade capazes de se ligarem especificamente a proteínasdobrada incorretamente s, interagem com células imunes para ativar referidascélulas imunes. Nós testamos se regiões de afinidade, enriquecidas comanticorpos que reconhecem proteínas dobrada incorretamente s, como BSAglicosadas, são capazes de aumentar a resposta a proteínas dobradaincorretamente s. Nós usamos células dendríticas humanas primárias (DCs)isoladas do sangue periférico de um voluntário saudável. Nós determinamos aprodução da citocina interleucina-6 (IL-6) e quimiocina IL-8, expressão demarcadores de superfície celular (CD80, CD83, CD86 e CD40), e também aviabilidade e sobrevida das células (ligação de 7AAD).Materiais e métodos

Geração in viíro de células dendríticas derivadas de monócitos humanosdo sangue periférico, e análises para ativação

DCs humanas geradas de precursores não-proliferadoresselecionados dentre células mononucleares do sangue periférico (PBMC,peripheral blood mononuclear cells), substancialmente por meio de métodospublicados (Sallustro e Lanzavecchia [1994], J. Exp. Med. 179 1109-1118). Apresença relativa abundante de CDla, CD32, CD36, CD40, CD54, CD86,HLA-DR e CD206 e o teor relativamente baixo de células positivas paraCD14, positivas para CD16, positivas para CD64, positivas para CD80,positivas para CD83 e positivas para CD163 servem como uma medida dequalidade para as DCs imaturas. Após se obter as DCs imaturas medianteestimulação com GM-CSF e IL-4, suspensões de células de 1 ml sãoincubadasd durante 22 h com 50 μΐ dos seguintes compostos (concentraçõesfinais), i) PBS, ii) 50 μ^ιηΐ de poli-IC com 100 ng/ml de TNFa, iii) 50 μ^πύde BSA-AGE, iv) BSA-AGE + 4,4 jig/ml de IgIV enriquecida, v) como iv)mas as células são pré-incubadas com uma concentração de saturação deanticorpo anti-CD32a de bloqueio, vi) BSA-AGE + 660 μg/ml de OctagamIgIV5 vii) como vi) mas as células são pré-incubadas com uma concentraçãode saturado de anticorpo anti-CD32a de bloqueio. A IgIV enriquecida é obtidapor meio de contato da IgIV Octagam com HbAGE-Sepharose e,subseqüentemente, por meio de isolamento daquelas regiões de afinidade quese ligam à matriz de proteína dobrada incorretamente .As DCs foram analisadas quanto aos seguintes parâmetros:densidade de superfície (intensidade de fluorescência média, MFI, ou% decélulas positivas) de CD83, CD86, CD80 e CD40 medido usando-se FACS5 etambém densidade de células/viabilidade celular, como determinado pelaligação do marcador de apoptose 7-amino-actinomicina D (7 AAD).Adicionalmente, determinou-se a extensão da secreção de IL-6 e a secreçãode IL-8 no sobrenadante de cultura de células usando-se ELISA Pelipair(M9316, Sanquin Reagents, Amsterdam, Países Baixos) para IL-6 e um kitCytosets CHC 1304 (Biosource) para IL-8.

Resultados e discussão

A Tabela 10 mostra os resultados da análise. Verificou-se queas DCs respondem potencialmente ao estímulo de controle (poli I-C napresença de TNFalpha). Os dados demonstram que IgIV enriquecida é capazde estimular DCs na presença de BSA-AGE. Em contraste, IgIV não-enriquecida a uma concentração 150 vezes maior, dificilmente é capaz depotencializar DCs. Por exemplo, a expressão de IL-6 (4433 pg/ml) e IL-8(19316 pg/ml) é estimulada potencialmente por IgIV enriquecida, mas só aum grau limitado com IgIV não-enriquecida (191 pg/ml e 4682 pg/ml),respectivamente. Adicionalmente, IgIV enriquecida também estimula aexpressão de moléculas co-estimuladoras, como CD80, CD83, CD86 e CD40.A resposta é inibida por anticorpos dirigidos contra FcyRIIa (anti-CD32a),indicando que os efeitos são mediados por este receptor de Fc.

Considerados em conjunto, estes resultados mostram queregiões de afinidade, de preferência, regiões de afinidade enriquecidas,têm um papel de potencializar o sistema imunológico para removerproteínas dobrada incorretamente s, notavelmente por meio de FcR.Assim, por meio do método descrito, uma pessoa versada na arte é capazde selecionar regiões de afinidade a serem usadas, de preferência, notratamento de uma doença, para remover proteínas dobradaincorretamente s, para diminuir a contribuição das proteínas dobradasincorretamente na patologia da doença.

Exemplo 18

Análise da presença de anticorpos anti-peptídeo citrulinado cíclico emregiões de afinidade de IgIV enriquecida e em IgIV de que IgIVenriquecida foi selecionada usando-se matriz de afinidade de proteínadobrada incorretamente HbAGE-Sepharose

Nos Exemplos 1 e de 3 a 9 nós demonstramos que diversaspreparações de regiões de afinidade, i.e. IgIV humana, são capazes de ligar-seespecificamente a proteínas dobradas incorretamente com estrutura β cruzada.No Exemplo 10 nós demonstramos que o método amplamente disseminado deagregação por aquecimento a 650C para a preparação de IgG humana para usoem ensaios para análise de titulações de Fator Reumatóide (RF), auto-anticorpos dirigidos contra o domínio Fc de moléculas de IgG, induz estruturaβ cruzada nas moléculas de IgG. Verificou-se titulações de RF em de 70 a80% de todos os pacientes com artrite reumatóide. Adicionalmente,aproximadamente 5% da população aparentemente saudável também épositiva para RF. Nós avaliamos agora a possibilidade de que a sub-populaçãode Ig na IgIV que é capaz de ligar-se especificamente à estrutura β cruzada ouconformação de proteína induzida com estrutura β cruzada apresentaafinidade por peptídeo citrulinado cíclico (CCP, cyclic citrullínatedpeptidé).

Descreveu-se extensivamente que uma população de auto-anticorpos, encontrada em mais de 80% dos pacientes com artrite reumatóide,objetiva formas desiminadas de determinadas proteínas, como fibrinogênio,filagrina e vimentina. Recentemente descreveu-se que anticorpos anti-seqüências de filagrina citrulinada sintética ligam-se efetivamente a fibrinacitrulinada em pacientes. Nós mostramos antes que a fibrina portaconformação de estrutura β cruzada. Na desiminação, o aminoácido arginina éconvertido ao aminoácido citrulina. Portanto, este processo é referido comocitrulinação, resultando em proteínas citrulinadas. Usa-se rotineiramentetestes diagnósticos para artrite reumatóide que se baseiam na ligação destesauto-anticorpos anti-proteína citrulinada para proteínas citrulinadas, como oteste ELISA de peptídeo citrulinado cíclico (CCP, cyclic citrullinatedpeptidé)(ELISA anti-CCP). Até a presente invenção não se sabia, em grande parte,como a citrulinação de proteínas provoca uma resposta auto-imune empacientes com RA. Nós observamos que um resultado bem documentado decitrulinação de uma proteína é o desdobramento/redobramento da proteína.De acordo com a invenção, a citrulinação de radicais arginina pela enzimapeptidilarginina desiminase induz dobramento incorreto da proteína quecompreende o radical arginina. O resultado da citrulinação da arginina é aperda pura de uma carga positiva na proteína. Esta perda pura de cargapositiva contribui para o dobramento incorreto por meio da modulação deinterações iônicas e de ligações hidrogênio, envolvidas na estabilidade eintegridade da estrutura tridimensional da proteína. Nós demonstramospreviamente que o dobramento incorreto de proteínas com a ocorrência deconformação β cruzada torna a proteína em uma entidade imunogênica (verpedido de patente "adjuvantação β cruzada", W02007008070). Assim, nósconcluímos agora que a citrulinação de proteínas e o resultante dobramentoincorreto destas proteínas são acompanhados pela formação de estrutura βcruzada, explicando as características auto-imunogênicas destas proteínascitrulinadas. Para substanciar esta conclusão, nós testamos a presença deanticorpos anti-CCP em nossas regiões de afinidade de IgIV enriquecidapopulação que foi recuperada contactando-se IgIV Octagam comhemoglobina glicada dobrada incorretamente , imobilizada em NHS-Sepharose.

Materiais e métodos

As preparações de regiões de afinidade a seguir foramanalisadas quanto à ocorrência de titulações de anticorpos anti-CCP:1. IgIV Octagam (Octapharma, carga n°: 5024018434, 50mg/ml)

2. 10 mg/ml de γ-globulinas humanas (Sigma G4386, lote21k7600). Dissolvido em PBS5 incubado durante 10 minutos à temperaturaambiente em um dispositivo de rolamento, e subseqüentemente durante 10minutos a 37°C e novamente durante 10 minutos à temperatura ambiente emum dispositivo de rolamento.

3. IgIV Gammagard (Baxter Hyland Immuo Gammagard S/D5 g, Lote LE08E044AL, 52 mg/ml, dissolvido na solução fornecida, repartidoe armazenado a -20°C).

4. 103 μg/ml de IgIV enriquecida em PBS. Enriquecida deIgIV Octagam (carga n°: 5024018434) usando-se HbAGE-Sepharose, comodescrito no Exemplo 6, 7.

Realizou-se determinações de titulação de rotina peloLaboratório de Imunologia Médica [.Laboratory for Medicai Immunology](UMC Utrecht, Países Baixos) usando-se o sistema EIiA (Phadia GmbH) paraa determinação de titulação de anticorpos anti-CCP. Amostras de 1 a 4 foramdiluídas IOx para a análise, em lugar da diluição de IOOx que é realizadarotineiramente para soro de pacientes.

Resultados e discussão

Determinou-se as titulações de anticorpo anti-CCP em váriaspreparações de regiões de afinidade, por meio do laboratório local deimunologia médica [.Laboratory for Medicai Immunology] (UMC Utrecht,Países Baixos) usando-se o sistema EIiA. Ver a Tabela 11 para as titulaçõesdeterminadas. Os valores obtidos cçm preparações de γ-globulinas e IgIVenquadram-se nos limites indicados para determinar uma proteína de soroanti-CCP no soro como negativa com relação à finalidade de diagnosticaruma doença, i.e. <7 U/ml. Efetivamente, as titulações medidas sãoencontradas regularmente em soros de indivíduos aparentemente saudáveis.Com IgIV enriquecida, agora, a titulação obtida de 2,7 U/ml é comparávelcom o que se mediu com Octagam IgIV, de que a IgIV enriquecida foiisolada. No entanto, a concentração de IgIV enriquecida é 485 vezes inferior,implicando a um enriquecimento de 437 vezes daa preparação de regiões deafinidade de IgIV enriquecida para anticorpos anti-CCP. A partir disto, nósconcluímos que as regiões de afinidade selecionadas com base em suaafinidade por Hb dobrada incorretamente também apresentam afinidade porpeptídeo citrulinado.

A peptidilarginina desiminase foi localizada no nível deproteína e no nível de mRNA em uma ampla variedade de tecidos e células,mas não em eritrócitos. Além disso, a presença de peptidilarginina desimiasesno proteoma de eritrócito não foi detectada em uma abordagem proteômica.Portanto, com base nestas verificações, nós concluímos que a hemoglobinahumana (Hb) usada para glicação extensiva nos radicais lisina e arginina nãoé citrulinada. Adicionalmente, os peptídeos citrulinados cíclicos usados naanálise de titulação anti-CCP são seqüências modificadas com base nafilagrina humana e efetivamente não compreendem seqüências deaminoácidos de Hb. Um alinhamento de seqüências com seqüência deaminoácido filagrina humana e seqüência de aminoácidos de Hb humana comcadeia α ou cadeia β revela homologia de seqüências que é de baixa ainexistente (i.e. aproximadamente de 20 a 35%) entre filamentos de peptídeosde aproximadamente 19 radicais de aminoácidos, i.e. o comprimento da CCPda segunda geração usada na análise. Como mencionado acima, a citrulinaçãoé bem conhecida para a indução de redobramento de proteína. Portanto,nossos resultados demonstram que, com o uso de uma proteína dobradaincorretamente que compreende estrutura β cruzada, i.e. HbAGE, nós fomoscapazes de selecionar, dentre uma coleção de regiões de afinidade de IgIV,um conjunto de regiões de afinidade com especificidade para CCP, queapresenta uma seqüência de aminoácidos que não é relacionada com a Hbhumana. Com esta verificação, nós substanciamos nossa conclusão de que odobramento incorreto, seja induzido por glicação, ou induzido porcitrulinação, ou induzido por qualquer outros meios ou métodos para maldobramento de proteínas, resulta na adoção de uma característica estruturalcomum na proteína, i.e. a estrutura β cruzada e/ou uma conformação induzidacom estrutura β cruzada, que é independente da seqüência de aminoácidos.Isto tem uma implicação importante para a interpretação de dados de titulaçãoanti-CCP. Agora que se revelou que regiões de afinidade que são capazes deligar-se especificamente a proteínas citrulinadas compreendem efetivamenteuma população de regiões de afinidade com especificidade paracaracterísticas estruturais independentes de seqüência de aminoácidos que sãoinduzidas com citrulinação da proteína, a implicação de dobramento incorretode proteína na patologia das doenças de que sofrem os pacientes com astitulações anti-CCP identificadas, obviamente não pode ser negligenciada.Proteínas dobradas incorretamente formadas por meio de citrulinação são,portanto, um objetivo recentemente identificado para a direção da pesquisaconduzida para o desenvolvimento de, por exemplo, terapias específicas paraRA. Nosso resultados demonstram agora que as regiões de afinidade de IgIVenriquecida obtidas usando uma matriz de proteína dobrada incorretamente ,são um composto importante recentemente identificado para odesenvolvimento de drogas contra proteínas dobradas incorretamenterelacionadas com RA.

Exemplo 19

Regiões de afinidade de IgIV humana enriquecida com especificidadepara γ-globulinas dobradas incorretamente de camundongoFundamentos

Fator Reumatóide (RF) é uma composição de auto-anticorposde IgA, IgG, IgM dirigida para epítopos no domínio Fc de moléculas auto-IgG, que são expostas quando do dobramento incorreto da IgG por exposiçãoao calor. RF ocorre em de 70 a 80% dos pacientes de artrite reumatóide (RA)5e titulações de RF relativamente elevadas correlacionam-se com progressãode doença grave. No Exemplo 10, nós demonstramos que métodos para exporo epítopo de RF dobrado incorretamente efetivamente as IgGs de umamaneira a formar-se estrutura β cruzada, resultando na conclusão de que RFcompreendem regiões de afinidade com afinidade por estrutura β cruzada ouconformação induzida com estrutura β cruzada na IgG. Nós verificamos que aimunização de um camundongo com quatro proteínas diferentes com estruturaβ cruzada, i.e. Αβ1-40 humana sintética, amilóide A de soro de galinha,hemoglobina humana glicosada e fragmento sintético de cadeia α de fibrinahumana, elicitou uma resposta imune resultando em um clone de IgM dehibridoma com especificidade por IgG humana dobrada incorretamente , quecompreende estrutura β cruzada. Um ou mais dos quatro antígenos deproteína com seqüências de aminoácidos não-relacionadas, mas com apresença de estrutura β cruzada ou conformações induzidas com estrutura βcruzada em comum, compreendem estrutura β cruzada ou caraterísticasestruturais induzidas com estrutura β cruzada que, por sorte é estreitamentereminiscente das características β cruzada em IgG humana dobradaincorretamente . Uma explicação alternativa é que características β cruzadaestruturais em um ou mais dos quatro antígenos assemelha-se à estrutura βcruzada ou conformação induzida com estrutura β cruzada em auma auto-molécula de Ig de camundongo. Pode ter ocorrido reatividade cruzada durantea alta atividade do sistema imunológico, acompanhada de super-produção deIgs por células B. Conclui-se reatividade anormal do sistema imunológico decamundongo considerando o baço extremamente grande (número de célulasaumentado sete vezes), acompanhado de um grande número de fibroblastosinfiltrados. Além disso, o camundongo apresentava-se criticamente doentedurante algum tempo no ensaio de imunização. Estas observações podem sera conseqüência de uma resposta autoimune contra auto-IgG, refletida pelaafinidade observada da IgM de hibridoma por IgG humana dobradaincorretamente . Uma terceira explicação plausível é que o camundongoapresentava um clone de IgM de ligação β cruzada geral com propriedadesem comum com RP em seu repertório, assemelhando-se a IgGs que sãoselecionadas de IgIV humana por meio de aplicação de uma matriz deafinidade de β cruzada. Nós avaliamos agora se IgIV humana que éenriquecida de regiões de afinidade com afinidade por proteínas dobradasincorretamente quando da seleção em uma matriz de HbAGE, compreenderegiões de afinidade com especificidade para IgG de camundongo dobradaincorretamente . Isto substanciará adicionalmente o nosso conhecimento sobrea existência de uma população de auto-imunoglobulinas com especificidadepor proteínas dobradas incorretamente em geral.

Materiais e métodos

Para testar se o material de partida de IgIV Octagam usadocomo um combinado para seleção de regiões de afinidade que se ligam aestrutura β cruzada, e IgIV humana enriquecida, compreende uma populaçãode regiões de afinidade com especificidade por IgG de camundongo dobradaincorretamente com estrutura β cruzada, nós analisamos a ligação de IgIVOctagam e IgIV enriquecida a diversas formas dobradas incorretamente deIgG de camundongo e comparamos os resultados com a ligação a IgG decamundongo nativa. Medindo-se a fluorescência de ThT e a fluorescência dovermelho Congo com IgG nativa de camundongo, IgG de camundongoexpostos a elevado pH (dmlgG BASE), IgG de camundongo exposta a baixopH (dmlgG ÁCIDO) e IgG de camundongo aquecida a 85°C em PBS (dmlgG85°C) revelou que a estrutura β cruzada é induzida pelos diversos métodos dedobramento incorreto. O ELISA foi realizado de duas maneiras diferentes.Em uma abordagem, a IgG de camundongo foi revestida diretamente sobre ospoços e recoberta com uma série de concentrações de IgIV enriquecida. Deuma maneira alternativa, primeiramente revestiu-se os poços comimunoglobulinas anti-camundongo de coelho (RAMPO, Dako Cytomation,Dinamarca). Os poços foram bloqueados (reagente de bloqueio da Roche) e,subseqüentemente, as preparações de IgG de camundongo foram ligadas aosanticorpos imobilizados, antes de se aplicar nos poços uma série deconcentrações de IgIV Octagam humana em triplicata.

Resultados e discussão

Na Figura 24 resume-se os resultados das duas abordagensELISA alternativas. Em ambas as abordagens experimentais as regiões deafinidade humanas ligam-se, de preferência, às diversas formas dobradasincorretamente de IgG de camundongo. Dificilmente detecta-se qualquerligação de IgIV enriquecida a IgG nativa de camundongo, e IgIV Octagamnão se ligou de forma alguma a IgG nativa de camundongo. Tanto IgIVOctagam como também IgIV enriquecida ligaram-se com a maior afinidade admlgG BASE, com concentrações resultando em ligação semi-máxima deaproximadamente 200 μg/ml e 4,4 μg/ml de IgIV, respectivamente. O fato deque é possível observar, com IgIV enriquecida, alguma ligação a IgG nativade camundongo, enquanto que não foi possível detectar qualquer ligação comIgIV Octagam aponta para a presença de uma determinada fração demoléculas de IgG dobradas incorretamente na composição de IgG decamundongo, para a qual IgIV enriquecida possui afinidade incrementada.Deduz-se destas figuras que IgIV enriquecida é enriquecida para ligação comIgG de camundongo dobrada incorretamente por um fator deaproximadamente 50.

Em conclusão, as três formas diferentes de IgG decamundongo dobradas incorretamente compreendem sítios de ligação paraIgIV humana enriquecida e Octagam IgIV, de que a IgIV enriquecida éselecionada. dmlgG BASE expõe a conformação de proteína dobradaincorretamente para que ambas, IgIV Octagam e IgIV enriquecida expressema maior afinidade. Estes dados mostram que com o uso de uma matriz deafinidade constituída de hemoglobina glicada dobrada incorretamente , umapopulação de regiões de afinidade é selecionada de uma composição demoléculas de IgG, i.e. Octagam IgIV5 que apresenta afinidade por IgG decamundongo dobrada incorretamente . Isto aponta para a ocorrência deregiões de afinidade similares a RF na fração selecionada de IgIVenriquecida, e, assim, na Octagam IgIV, i.e. regiões de afinidade que se ligampreferivelmente a regiões de afinidade dobradas incorretamente com estruturaβ cruzada.

Exemplo 20

Uma IgM de hibridoma com propriedades de ligação reminiscentes deFator Reumatóide

Fundamentos

Como mencionado previamente na seção de Materiais eMétodos dos Exemplos de 1 a 5, IgM de hibridoma de camundongo 7H2H2liga-se especificamente a algumas formas dobradas incorretamente deimunoglobulinas humanas. Assim, nós designamos 7H2H2 como umanticorpo similar a Fator Reumatóide. O camundongo foi imunizadoconsecutivamente com Αβ1-40 humano sintético, amilóide A de soro defrango, hemoglobina humana glicada e peptídeo sintético de cadeia α defibrina humana, antes de se isolar o cérebro para a preparação de hibridoma. Édigno de nota observar que, no momento em que o baço foi removido, elecompreendia uma número extraordinariamente grande de células, 7* IO8(número normal é de 1 * IO8 células). Adicionalmente, o baço compreendia umnúmero excepcionalmente grande de fibroblastos infiltrados. Estasobservações apontam para um baço altamente ativo, devido à elevadaatividade do sistema imunológico do camundongo. É digno de nota observarque, aproximadamente 40 semanas após as primeiras imunizações com Αβ,antes de qualquer imunização com um segundo, terceiro ou quarto antígenodobrado incorretamente , o camundongo ficou doente, mas recuperou-sedentro de algumas poucas semanas, bem antes da imunização com o segundoantígeno, i.e. SAA de frango. O fato de que 7H2H2 reconhece γ-imunoglobulinas e IgIV dobrada incorretamente , enquanto que se usa quatroantígenos para imunizações que compreendem seqüências de aminoácidosnão relacionadas, e não se usa imunoglobulinas (estranhas) como antígeno,combinado com a observação de um sistema imunológico altamente ativado ea doença do camundongo em algum ponto durante o procedimento deimunização, o que nos permitiu concluir que o camundongo desenvolveuresposta autoimune dirigida para auto-anticorpos. Para analisaradicionalmente as exigências estruturais de IgGs humanas para expor oepítopo a 7H2H2, nós resalizamos experimentos de ligação com uma série depreparações de IgG humana que compreendem anticorpos dobradoIncorretamente s obtidos por meio de métodos diferentes.

Materiais e métodos

Para a análise da ligação do clone de hibridoma IgM 7H2H2 adiversos aspectos estruturais da IgG humana, usou-se uma série de diluiçõesde 7H2H2 purificada (2,5 mg/ml em PBS; P. van Kooten, instalação de ABC-Hibridoma, University of Utrecht/UMC Utrecht, Países Baixos) ou umaconcentração fixa de 12,5 μg/ml de IgM em ELISAs com IgGs humanasimobilizadas. Como um controle negativo usou-se IgM de hibridoma 2G10.Formas dobradas incorretamente de IgGs humanas e controles nativos usadospara as análises são descritos na Figura 25, e são: 1) IgIV, 5 minutos a 65°C(método de 'RF'), 2) IgIV 65°C, 3) IgIV 69, 4) IgIV 76, 5) IgIV 80, 6) IgIV83, 7) IgIV 86, 8) controle de IgIV Ácido/base, 9) IgIV Ácido, 10) IgIV base,11) IgIV Gammagard nativa, 12) IgIV HFIP/TFA, 13) IgIV NaPi 5 mg/ml,14) IgIV NaPi 20 mg/ml, e 15) IgG BASE desnaturada, 37°C. Para detalhesestruturais, referir à seção de 'Materiais e Métodos Gerais' por os exemplos de6 a 20 sobre a preparação e determinação da estrutura de padrões β cruzada.Na Figura 8 e 9 descreve-se características estruturais das 15 formas de IgGhumana. As γ-globulinas humanas que foram aquecidas durante 30 minutos a37°C após adição de NaOH (hIgG-BASE-37°C) aparecem como grandesparticulados em suspensão (Figura 9L), apresentam fluorescência de Trpincrementada se comaprada com IgIV nativa (Figura 8F) e a preparaçãoaumenta a fluorescência de ThT e CR (Figura 8A, B).

Em um segundo experimento, a ligação de uma série deconcentrações de IgM de hibridoma de camundongo 7H2H2 purificada adiversas preparações de γ-globulinas de camundongo foi comparado comhIgG-BASE-37°C e o controle de IgIV Gammagard nativa, e comparada coma ligação do controle de IgM de hibridoma de camundongo 2G10 à mesmasérie de preparações de IgG. As mesmas preparações de IgG de camundongoque no Exemplo 19 foram incorporadas no estudo, i.e. mlgG nativa, dmlgGÁCIDO, dmlgG BASE, dmlgG 85°C. As preparações de IgG de camundongoe humana à base de 5 μg/ml ou tamponador de controle foram aplicadasrevestindo placas de ELISA de alta ligação Microlon (Greiner), que forambloqueadas com reagente de bloqueio (Roche) após o revestimento. IgM7H2H2 e IgM 2G10 (controle negativo) foram aplicadas nos poços emtriplicata a 0/1/10/100 μ^πιΐ em PBS/0,1% de Tween20. Após a lavagem,detectou-se a ligação de IgM usando anticorpo secundário anti-camundongo-IgM-PO de cabra (Jackson), diluído a 1:5000 em PBS/0,1% de Tween20. Aabsorbância foi lida a 450 nm. Sinais de fundo medidos para poços nãorevestidos com a série de concentrações de IgM, e sinais de fundo obtidoscom poços revestidos com IgG com 0 μg/ml sw IgM, mas com anticorposecundário, foram subtraídos dos sinais correspondentes com poços revestidoscom IgG recobertos com IgM.

Resultados e discussão

Na Figura 25A descreve-se que 12,5 μg/ml de IgM dehibridoma de camundongo 7H2H2 não se ligam ou dificilmente se ligam apreparações de IgG humana 1, 2, 3, 9, 10, 11, 13 e 14, ligam-se em menorgrau a preparações 4 e 5, ligam-se moderadamente a 6, 7, 8 e 12, e ligam-semelhor à preparação de IgG humana 15 (γ-globulinas, condições básicas,tratadas durante 30 minutos a 37°C, seguido de ajuste do pH com HCl devolta ao pH fisiológico). Quando a ligação da 7H2H2 purificada é analisadacom as preparações 1,6, 11, 14el5, não se detecta IgIV Octagam nativa, 1)IgIV 5 minutos a 65°C (método 1RF1), 11) IgIV Gammagard nativa ou 14)IgIV NaPi 20 mg/ml (Figura 25B). Observa-se ligação similar de alta-afinidade com preparação de IgG humana 6) IgIV Gammagard aquecida a83°C a 5 mg/ml em 20 mM de fosfato de sódio pH 5,0, e 15) IgG BASEdesnaturada, 37°C, a 5 mg/ml, a 37°C. O número dos sítios de ligação écomparável (Bmax é de 0,65 e 0,59 a.u., respectivamente), e também aconcentração de 7H2H2 à qual metade dos sítios de ligação são ocupados, i.e.3,3 μg/ml de 7H2H2 para ambas as preparações de IgG dobradaincorretamente imobilizadas. Preparação 15) apreceu em imagens de TEMcomo estruturas agregadas similares a IgIV BASE (amostra 10) e IgIVHFIP/TFA (amostra 12). O controle negativo para a ligação de IgM com asIgGs humanas imobilizadas, IgM de hibridoma 2G10, não mostrou qualquerafinidade pelas preparações de IgG humana (dados não mostrados). No casoda preparação 6) é evidente, a partir da Figura 9, que todas as sondasfluorescentes se ligam em grau relativamente elevado, e até mesmo no maiorgrau, com respeito ao vermelho Congo e Tioflavina S, em comparação comtodas as outras preparações (Figura 8). No entanto, a amostra 6) aumentoumoderadamente a ativação de tPA/plasminogênio, enquanto que 9) e 12)potencializaram fortemente a atividade de protease (Figura 9M). Análise deimagens TEM revelou que o aumento da fluorescência de corantescorrelaciona-se positivamente, até certo ponto, com um aumento do tamanhodos multímeros. Conclui-se que os seis pontos de dados de fluorescência (CR,ThT, ThS, Trp, bis-ANS e ANS) formam, em conjunto, potência preditiva daligação esperada de 7H2H2. A multiplicação dos sinais para cada preparaçãode IgG poderia predizer efetivamente que a amostra 6) apresentará, na melhordas hipóteses, ligante vantajoso para o clone de hibridoma. Quando tambémse considera a ativação de tPA/plasminogênio, prediz-se uma ligação umtanto maior de 7H2H2 com as amostras 9) e 12). Em conclusão, parece que amagnitude aumentada de ligação de uma série de corantes fluorescentes comafinidade por estrutura β cruzada, i.e. CR, ThT e ThS, ou que a exposição asolvente de sonda de remendos hidrofóbicos na estrutura de proteína, i.e. bis-ANS e ANS, e alterações no ambiente local de radicais Trp, apresentadoscomo aumentos da intensidade de fluorescência, predizem se o clone de IgMde hibridoma 7H2H2 se ligará com maior afinidade. Estes resultadosdemonstram claramente que, em algum momento, o camundongodesenvolveu, seja como uma resposta imune inata, ou como uma respostaadaptativa à exposição a um ou mais dos quatro antígenos β cruzada estranhosusados para imunização, uma resposta imune a epítopos que estão ocultos ounão presentes em IgGs dobradas nativamente, i.e. estrutura β cruzada exposta,ou conformação induzida com estrutura β cruzada. Em resumo, nossosresultados mostram que, selecionando uma determinada proteína dobradaincorretamente ou conjunto de proteínas dobrada incorretamente s, inflige-seuma resposta imune em camundongos, resultando em regiões de afinidadecom clara especificidade por uma proteína dobrada incorretamente definida,com ligação preferencial a um determinado aspecto da estrutura β cruzada ouconformação exposta mediada com β cruzada.

Na Figura 25C mostra-se que 7H2H2, em todas asconcentrações testadas, liga-se a hIgG-BASE-37°C, de acordo com o que sedemonstrou na Figura 25A e Β. A 100 μg/ml também se observa algumaligação a IgIV Gammagard nativa. Isto pode refletir a presença de umdeterminado percentual de agregados de IgIV em Gammagard, ou isto podeapresentar as condições desnaturadoras da placa de ELISA usada. O controlenegativo IgM 2G10 não ligou-se de forma alguma. Na Figura 25D observa-seque, já a 1 μ§/πι1, 7H2H2 liga a γ-globulinas de camundongo desnaturadascom ácido (dmlgG-ácido). A 10 e 100 μg/ml a IgM de hibridoma liga-se atodas as três formas de auto-IgG dobrada incorretamente , com os maioressinais obtidos a 100 pg/ml para dmlgG-ÁCIDO e dmlgG-BASE. A 100 ng/mltambém ocorre alguma ligação a mlgG nativa. O controle negativo IgM 2G10não se ligou a qualquer uma das preparações de IgG de camundongo (nãomostrado). Com estes resultados demonstra-se claramente que a IgM dehibridoma de camundongo 7H2H2 não só se liga especificamente a formasdobradas incorretamente de IgG humana, mas também a formas dobradasincorretamente de auto-IgG de camundongo. Isto mostra que o camundongoque que o clone de hibridoma 7H2H2 foi selecionado desenvolveu umaresposta auto-imune contra auto-IgG. Isto pode ter ocorrido durante osensaios de imunização com as quatro diferentes proteínas não-IgG, não-autodobrada incorretamente s, i.e. AB sintético humano, SAA de frango, HbAGEhumana e fragmento de fibrina humana sintética. Com a observação de que7H2H2 se liga a auto-IgG de camundongo dobrada incorretamente comestrutura β cruzada, esta IgM de hibridoma é projetada como um anticorpo deFator Reumatóide. Doença do camundongo durante o experimento deimunização e o baço incomumente grande com uma quantidade incomumentegrande de fibroblastos infiltrados estão relacionados com uma resposta auto-imune disparada enquanto imunizada com diferentes proteínas dobradasincorretamente compreendendo estrutura β cruzada.Regiões de afinidade recombinantes/sintéticas

Geração de regiões de afinidade recombinantes/sintéticas obtidas de IgIVenriquecida

A presente invenção revela métodos e meio para a seleção deregiões de afinidade específicas para proteínas dobradas incorretamente parao diagnóstico e tratamento de dobramento incorreto de proteína e doenças dedobramento incorreto de proteínas. Regiões de afinidade são selecionadas dequalquer biblioteca combinatorial de regiões de afinidade, como por exemplo,imunoglobulinas humanas naturalmente ocorrentes (i.e. IgIV ou IVIghumana). Regiões de afinidade análogas àquelas obtidas desta maneira sãopreparadas, por exemplo, por via recombinante ou sintética com a aplicaçãode técnicas convencionais conhecidas por uma pessoa versada na arte,incluindo análise de seqüencia de proteínas, tecniologia de expressão eclonagem de DNA. Este exemplo descreve uma concretização. Em etapassubseqüentes: (1) a seqüência de aminoácidos, pelo menos das regiõesvariáveis das cadeias de cadeia pesada e de cadeia leve, ou pelo menos dasregiões determinadoras de complementaridade 1-3 (CDRs), ou pelo menos deCDR3 da cadeia pesada (HC, heavy chain) das regiões de afinidade isoladasindividuais, é obtida por meio de análise de seqüencia de proteínas. (2) Umaseqüência de DNA que codifica a seqüência de aminoácidos identificada épreparada sinteticamente. Como uma alternativa para a seqüência exatadeterminada por meio de análise de proteína, é possível usar uma seqüênciaem que se introduz uma ou mais mutações, de preferência, na CDR3, e, deforma ainda mais preferível, na CDR3 da cadeia pesada (HC, heavy chain), deforma a produzir regiões de afinidade com afinidade alterada, de preferência,afinidade aumentada e/ou mais específica. (3) O DNA é clonado em um vetorde expressão apropriado. Referido vetor já contém, de preferência, asseqüências que codificam as regiões constantes de imunoglobulinas do tipodesejado, como para se obter IgGl, IgG2a, IgG2b, IgM, IgA, IgE etc. (4) Ovetor é transduzido por qualquer via em um sistema de expressão de escol, depreferência, uma célula mamífera. (5) Seleciona-se as células que expressam aregião de afinidade. (6) Regiões de afinidade preparadas por via recombinantesão purificadas das células ou de sobrenadante de cultura derivada de células.Caso se venha a introduzir mutações na seqüência de região de afinidadeoriginal para otimizar a afinidade, as regiões de afinidade recentementepreparadas podem ser re-selecionadas usando-os métodos em meiosdivulgados. Referida geração de regiões de afinidade semi-sintéticas com umrepertório ainda mais aumentado de regiões de afinidade, de preferência, nasregiões determinadoras de complementaridade, de preferência, na CDR3,ainda mais preferivelmente na CDR3 da HC, é realizada, de preferência, pormeio de geração de uma biblioteca semi-sintética, como uma biblioteca deapresentação de fago (ver abaixo).

Geração de regiões de afinidade recombinantes/sintéticas

Além de uma coleção de imunoglobulinas humanas, comoIVTg obtida de sangue, também é possível obter uma biblioteca combinatoriala partir de outro conjunto de regiões de afinidade, de preferência, um conjuntode regiões de afinidade recombinantes, como aquelas presentes em umabiblioteca de apresentação de fago (Winter et al. 1994; Hoogenboom, 1992,1997, 2000, 2002, 2005). De preferência, uma biblioteca do tipo referidoconstitui-se de seqüências relacionadas com regiões de afinidade mamíferas,de preferência, regiões de afinidade humanas, como imunoglobulinas. Depreferência, uma biblioteca de apresentação de fago do tipo referidocompreendendo uma coleção de regiões de afinidade é preparada como aseguir (Winter et al. 1994, de Kruif et al. 1995a, 1995b). Em primeiro lugar,extrai-se RNA de células B ou de um tecido compreendendo células B.Subseqüentemente, prepara-se cDNA. Em seguida, amplifica-se cDNAcodificando as regiões variáveis, que é clonado em um vetor de fagomídeoapropriado e transformada em um hospedeiro apropriado, como por exemplo,uma cepa de Escherichia coli. Desta maneira expressa-se regiões de afinidade,i.e. apresentadas por fagos, como proteínas de fusão sobre a superfície debacteriófagos filamentosos. Uma biblioteca de apresentação de fago épreparada, por exemplo, a partir de células B obtidas de um mamíferosaudável, de preferência, um humano, camundongo, rato ou lhama, ou,alternativamente, de um mamífero imunized com uma proteína dobradaincorretamente . Em uma concretização, uma biblioteca de apresentação defago é preparada de Células B de um mamífero, de preferência, um humanoque sofre de uma doença particular, de preferência, uma doença de maldobramento, como por exemplo, RA. Desta maneira, prepara-se uma coleçãode regiões de afinidade com um objetivo específico de compreender aquelasregiões de afinidade específicas para proteínas dobrada incorretamente s, porexemplo, um camundongo é imunized uma vez ou várias vezes com uma, ouuma seleção de, proteínas dobradas incorretamente (como neste exemplo 20),células B são isoladas do baço e usadas para preparar uma biblioteca deapresentação de fago. Em outro exemplo, células B são isoladas de umhumano com uma doença particular, por exemplo, artrite (reumatóide). cDNApreparado a partir destas células B é então usado para preparar uma bibliotecade apresentação de fago. Desta maneira, prepara-se uma biblioteca deapresentação de fago para compreender regiões de afinidade comespecificidade por proteínas dobradas incorretamente envolvidas na doença demal dobramento selecionada. Por exemplo, uma biblioteca é preparada comregiões de afinidade para o domínio Fc de Igs, i.e. regiões de afinidade, comoFator Reumatóide (RF) (van Esch et al. 2003, Clin Exp. Immunol). Damaneira descrita acima, uma pessoa versada na arte é capaz de projetar epreparar uma biblioteca de apresentação de fago com qualquer coleção deregiões de afinidade, com ênfase em uma aplicação ou doença particular.

Também é possível preparar sinteticamente uma biblioteca deapresentação de fago com uma coleção de regiões de afinidade do tipo referidocom um repertório incrementado (Hoogenboom, 1992, 1997, 2000, 2002, 2005;de Kruife/ al. 1995a, 1995b). Desta maneira, uma pessoa versada na arte é capazde projetar uma biblioteca compreendendo regiões de afinidade de diversidadeadicional considerável. É muito notável que, implementando-se seqüênciasadicionais nas regiões hipervariáveis, as CDRs que interagem com o antígeno, seprepara regiões de afinidade adicionais, remodelando os domínios variáveis. Alémde regiões de afinidade obtidas de seqüências humanas, uma pessoa versada naarte é capaz de criar uma coleção de regiões de afinidade de qualquer outraespécie, como lhama, camelo, alpaca ou camelídeo, para obter regiões deafinidade, como anticorpos de lhama, também referidos como nanocorpos, compropriedades relacionadas com estas espécies. Assim, prepara-se de muitasmaneiras uma biblioteca de apresentação de fago e/ou uma coleção de regiões deafinidade, de preferência, de um mamífero imunizado com uma, ou um conjuntode, proteínas dobrada incorretamente s. Em uma concretização particularmentepreferida, prepara-se uma biblioteca de apresentação de fago e/ou uma coleção deregiões de afinidade de um mamífero com uma doença, de preferência, umadoença de mal dobramento. Regiões de afinidade específicas para proteínasdobradas incorretamente são selecionadas de uma biblioteca de apresentação defago usando-se os meios e métodos revelados, combinados com procedimentosconvencionais para isolar fagos. Da maneira mais direta, em uma concretizaçãopreferida, proteínas dobradas incorretamente são preparadas e são imobilizadas, depreferência, de acordo com qualquer um dos procedimentos divulgados nestepedido e, subseqüentemente, deixados ligarem-se a fagos. Após lavagemextensiva, fagos ligados são recuperados e amplificados por meio de reinfecção dohospedeiro. Para permitira a recuperação de fagos específicos, o procedimento deseleção é repetido, de preferência, diversas vezes. Finalmente, isola-se aquelesfagos que são capazes de se ligarem especificamente a alvos dobradoincorretamente s. Alternativamente, proteínas dobradas incorretamente sãoisoladas da amostra de tecido obtida de um indivíduo ou de uma combinação deindivíduos com uma doença. Por exemplo, proteínas dobradas incorretamente sãoisoladas usando-se uma proteína que é capaz de ligar-se especificamente aproteínas dobradas incorretamente compreendendo estrutura β cruzada, comotPA, RAGE ou um equivalente funcional da mesma (ver Tabela 4), de fluidosinovial de um paciente com artrite (reumatóide). Em analogia, é possívelconsiderar qualquer outra amostra.

Usando abordagens como descritas acima, obtém-se, por viarecombinante, regiões de afinidade para proteínas dobrada incorretamente s.

Após seleção dos fagos apropriados, isola-se, de preferência,DNA que codifica as regiões variáveis das regiões de afinidade isoladas, do DNAde fagomídeo para gerar anticorpos plenos. Isto é facilmente realizado por umapessoa versada na arte de acordo com procedimentos convencionais. O DNA éclonado, de preferência, em vetores que codificam as regiões constantes para ascadeias pesada e leve. É possível usar qualquer vetor e qualquer tipo desejado deregião constante. O vetor é transduzido por meio de qualquer maneira conhecidapara um sistema de expressão de escol, de preferência, a célula mamífera.Seleciona-se as células que exprssam a região de afinidade. Regiões de afinidadepreparadas por via recombinante são purificadas, de preferência, das células ousobrenadantes de culturas derivadas de células. Desta maneira é possível prepararqualquer região de afinidade de imunoglobulina (Bloemendal et al 2004; Huls etal 1999a, 1999b; Boel eía/2000).Geração de regiões de afinidade recombinantes "quiméricas" ou"humanizadas"

Para uso em humanos, regiões de afinidade obtidas de outrasespécies são modificadas, de preferência, de tal modo que seqüências não-humanas são substituídas por seqüências humanas, sempre que possível,embora, de preferência, sem influenciar demais as propriedades de ligação daregião de afinidade. Regiões de afinidade também são preparadas duranteestratégias clássicas de imunização, de preferência, usando camundongos ouratos, ainda mais preferivelmente usando camundongos transgênicos quecodificam imunoglobulinas humanas. Após a imunização, linhas de células dehibridoma expressando anticorpos monoclonais são preparados por meio deprocedimentos convencionais, ou aplicando-se a tecnologia indicada acima deapresentação de fago. Seleciona-se anticorpos monoclonais que são capazesde interagir especificamente com proteínas dobrada incorretamente s. Versões"quiméricas" ou "humanizadas" de referidas regiões de afinidade, quandopreparadas usando-se camundongos ou ratos normais, são preparadas, porexemplo, substituindo-se as regiões constantes não-humans e as regiõesvariáveis não-humanas relevantes pelas regiões homólogas humanasrelevantes (Morrison et al 1984; Jones et ai. 1986). Além disso, introduz-seregiões constantes quando desejado.

Sumário baseado nos Exemplos de 1-20

Procedimento para selecionar regiões de afinidade enriquecidas com umaou um conjunto de proteínas dobrada incorretamente s, de preferência,específicas para uma doença ou problema de saúde particular associadocom a proteína dobrada incorretamente ou conjunto de proteínasdobrada incorretamente s.

Nos Exemplos de 1 a 9 nós demonstramos que com o uso dematrizes de afinidade contendo proteínas dobradas incorretamentecompreendendo proteínas dobradas incorretamente e/ou estrutura β cruzada,regiões de afinidade são selecionadas de qualquer composição de regiões deafinidade, que se ligam preferivelmente e seletivamente e com maiorafinidade a proteínas dobradas incorretamente e/ou proteínas compreendendoestrutura β cruzada, que não foram incluídas necessariamente no conjunto deregiões de afinidade usadas para a seleção. Os Exemplos demonstraram que,com o uso de um suporte solidocom proteínas dobradas incorretamenteimobilizadas selecionadas compreendendo estrutura β cruzada, nós somoscapazes de isolar de uma coleção de regiões de afinidade aquelas regiões deafinidade que apresentam afinidade por virtualmente qualquer proteínadobrada incorretamente . Com matrizes de HbAGE, dHSA, fibrilos de Αβ ede dlglV que se ligam a dHSA, fibrilos de Αβ, agregados de Αβ não-fibrilares, dOVA, B SA-AGE, Hb-AGE, IgG de camundongo dobradaincorretamente , proteína/peptídeo citrulinado, ApoA-I e oxLDL. Múltiplosmembros desta lista de ligantes para a composição de IgIV contribuem para apatologia de doenças de dobramento incorreto de proteínas, como porexemplo, Αβ (doença de Alzheimer), oxLDL e ApoA-I (aterosclerose,amiloidose), proteínas glicadas (amiloidose, doença renal de estágio final,diabetes, RA), IgG dobrada incorretamente , proteínas citrulinadas (ALamiloidose, RA).

Adicionalmente, nós mostramos que tanto com proteínasdobradas incorretamente com aspecto fibrilar, como também com agregadosde proteína dobrada incorretamente não apresentando característicasfibrilares, seleciona-se regiões de afinidade que apresentam ampla faixa deespecificidade por proteínas dobradas incorretamente compreendendoestrutura β cruzada. Com matriz de afinidade de fibrilos de Αβ selecionou-seregiões de afinidade que apresentaram afinidade por multímeros não-fibrilaresde, por exemplo, BSA-AGE dobrada incorretamente , agregados de Αβ edOVA. Por outro lado, com o uso de matriz de HbAGE não fibrilar ou matrizde IgIV não-fibrilar dobrada incorretamente , selecionou-se regiões deafinidade que se ligam eficientemente a fibrilos de Αβ.

Com o uso de uma matriz de AGE-albumina de soro bovino,demonstramos regiões de afinidade com afinidade por Αβ humano, albuminahumana e ovalbumina de galinha. Com o uso de matriz de Αβ humanoselecionou-se regiões de afinidade que se ligam a albumina de soro bovinaglicada e ovalbumina de galinha. Com matriz de Hb humana glicadoselecionou-se regiões de afinidade que se ligam a IgG de camundongodobrada incorretamente . Estes dados mostram que com proteínas dobradasincorretamente que se originam de um espécie, seleciona-se regiões deafinidade humanas que apresentam afinidade por proteínas dobradasincorretamente que se originam de outra espécie.

Em conclusão, nós demonstramos que, de uma coleção deregiões de afinidade IgIV humana selecionou-se uma seleção de regiões deafinidade que se originam de pelo menos quatro diferentes clones de células Bproduzindo isótipos IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, que apresentam propriedadesde ligação no sentido de uma ampla faixa de proteínas que se originam dediversas espécies e que nem apresentam homologia substancial de seqüênciasde aminoácidos, nem comprimento similar de seqüências de aminoácidos,nem estrutura 3D congruente ou similar em sua dobra nativa, emboracompartilhem uma característica estrutural comum a proteínas dobradaincorretamente s. Esta característica estrutural pode ser introduzida naestrutura da proteína por diversos meios, como por exemplo, mas semrestringir-se, a glicação de radicais lisina e arginina, citrulinação de argininas,oxidação de cadeias laterais de aminoácidos, e qualquer combinação deexposição a baixo pH, alto pH, calor, carboidratos, todos em concentraçãovariável de proteína. As regiões de afinidade selecionadas com especificidadepor proteínas dobradas incorretamente e/ou proteínas compreendendoestrutura β cruzada são úteis para uma variedade de aplicações. Indica-seabaixo, de maneira mais detalhada, regiões de afinidade enriquecidas usadaspara terapia contra doenças de dobramento incorreto de proteínas.

Os meios e métodos revelados permitem a seleção de regiões deafinidade que são aplicáveis em terapêuticas e/ou diagnósticos para doençasassociadas com mal dobramento de proteínas. Um sumário que delineia ascaracterísticas gerais de procedimentos preferidos encontra-se descrito na Figura26. É possível usar qualquer proteína dobrada incorretamente de escol {mistura Xe Y na Figura 26, representando o Misfoldome) que é vantajosa para ser usadas naseleção de regiões de afinidade, porém, de preferência, proteínas dobradasincorretamente {mistura A na Figura 26) que estão implicadas em doença. Comoproteínas dobradas incorretamente compartilham características comuns, de umamaneira geral se selecionará regiões de afinidade que se ligam a mais de umaproteína dobrada incorretamente em particular. No entanto, como revelado nestepedido, também é possível selecionar regiões de afinidade que se ligam, depreferência, a um subconjunto ou mesmo a um tipo único de proteína dobradaincorretamente . Combinando-se um conjunto de colunas, uma pessoa versada naarte é capaz de selecionar aquelas regiões de afinidade que são aplicáveis naterapêutica e/ou no diagnóstico do dobramento incorreto em geral, ou que sãoaplicáveis, de preferência, a uma doença ou conjunto de doenças em particular emque uma proteína dobrada incorretamente de escol está implicada. Como descritona Figura 26 aplicação de coluna I (mistura de proteínas dobradas incorretamentenão necessariamente relacionadas com uma doença) resultará em regiões deafinidade (preparação 1) com afinidade por proteínas dobradas incorretamente emgeral, i.e. o Misfoldome. Referidas regiões de afinidade são vantajosas paradiagnósticos e também para terapia. No entanto o uso de referidas regiões deafinidade para fins terapêuticos implica os riscos potenciais de efeitos colaterais,devido ao fato de se introduz no paciente regiões de afinidade que não só se ligamà proteína dobrada incorretamente relacionada com doença (efeitos terapêuticosdesejados), mas, adicionalmente, a outras proteínas dobradas incorretamentepresentes (efeitos colaterais impredizíveis da terapia). Combinando-se as colunas Ie ΙΠ, e, mais preferivelmente, II e IV, uma pessoa versada na arte selecionaaquelas regiões de afinidade que interagem, de preferência, com proteínasdobradas incorretamente específicas para uma doença ou um conjunto de doenças.A coluna IV é usada para remover aquelas regiões de afinidade que são capazes deinteragir com proteínas dobradas incorretamente que não são relacionadas com adoença-alvo de escol. Conseqüentemente, preparações 3 e 4 são selecionadas, depreferência, para fins terapêuticos.

Tabelas:

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Tabelas de 6 a 11 (Exemplos de 6 a 20)

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Tabela 9 (continuação)

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Breve descrição dos desenhos

Figura 1. IgIV humana liga-se especificamente a proteínas glicadasdobrada incorretamente s

Em montagens ELISA a ligação de IgIV humana para usoterapêutico, obtida de dois fabricantes, I e II, foi avaliada com proteínasglicadas imobilizadas. A. Testou-se a ligação de IgIV do fabricante I (IgIV(I)) a hemoglobina humana glicada revestida (Hb-AGE), Hb recentementedissolvido e peptídeo β-amilóide agregado (Αβ). Β. Testou-se a ligação deIgIV do fabricante II (IgIV (II)) a Hb-AGE revestida, Hb recentementedissolvido e Αβ agregado. C. Analisou-se a ligação de IgIV (I) a albuminaglicada revestida (BSA-AGE), albumina de controle recentemente dissolvidae FP13 K157G amilóide. D. A influencia de tPA e K2P tPA sobre a ligaçãode 15 μg/ml IgIV (I) a Hb-AGE revestida foi avaliada mediante adição deséries de concentrações de tPA ou K2P tPA à mistura de incubação de IgIV(I). Adiciona-se 10 mM de sACA à mistura para evitar liqüefação de tPA acadeias laterais lisina ou arginina expostas.

Figura 2: Agregação de plaquetas induzida com proteínas glicadasdobradas incorretamente com conformação similar a amilóide é inibidacom IgIV e uma mistura de anticorpos monoclonais.

Agregação de plaquetas após introdução de colágeno ou TRAP(controles positivos), tamponador (controle negativo) ou hemoglobina oualbumina glicada similar a amilóide dobrada incorretamente foi acompanhadaem um agregômetro usando-se plaquetas isoladas de plasma citradorecentemente coletado em tamponador HEPES-Tyrode. Avaliou-se aspropriedades inibidoras propostas de IgIV humana e anticorpos monoclonaismurinos desenvolvidos contra quatro diferentes estruturas amilóides, sobre aagregação de plaquetas. A. IgIV adquirida do fabricante I inibe efetivamente aagregação de plaquetas induzida com hemoglobina glicada de doador humanoΆ'. IgIV (I) por si só não têm efeito sobre plaquetas, o que quer dizer,nenhuma agregação é induzida pela adição de IgIV (I) às plaquetas. Aconcentração de IgIV (I) usada foi de 4,7 mg/ml, a concentração de Hb-AGEfoi de 18 μg/ml, colágeno foi usado a uma concentração de 10 μg/ml. B.Determinou-se a influência de 10 μg/ml de colágeno, 18 μg/ml de Hb-AGE,4,7 mg/ml de IgIV (I) e 18 μg/ml de Hb-AGE que foi pré-incubado com 4,7experimento realizado com plaquetas de doadora A (Α.), agregação deplaquetas com plaquetas de doadora 'B1 foi acompanhada ao longo do tempo.Agora usou-se 10 μg/ml de colágeno, 90 μg/ml de Hb-AGE, 4,7 mg/ml deIgIV (I) e 90 pg/ml de Hb-AGE pré-incubado com 4,7 mg/ml de IgIV (I). D.Em um experimento de controle com plaquetas de doador 'C' usou-se 5 μΜ deTRAP como um controle positivo. A influência de 100 μg/ml de uma misturade cinco anticorpos monoclonais com afinidade por proteínas dobradasincorretamente com uma conformação de estrutura β cruzada foi determinadacom TRAP como ativador de agregação, ou com controle de tamponador deHEPES-Tyrode. E., F. Agregação de plaquetas (doador C) foi induzida com25 μg/ml de albumina de soro bovina glicada (BSA-AGE, E.) ouhemoglobina humana glicada (Hb-AGE, F.). Determinou-se a inibição destaagregação com 25 ou 100 μg/ml de mistura de cinco anticorpos monoclonaiscom afinidade por proteínas dobradas incorretamente com uma conformaçãode estrutura β cruzada.

Figura 3: Agregação de plaquetas do sangue é induzida por amilóide-β, einibida por IgIV ou anticorpos monoclonais

Α., B. Indução de agregação de plaquetas com 50 μg/ml deamilóide-β é inibida quando 2,5 mg/ml de IgIV (I) são pré-incubados comamilóide-β (Α.), ou quando 160 μg/ml da mistura de cinco anticorposmonoclonais que se ligam a proteínas dobradas incorretamente (B.) são pré-incubados com amilóide-β. Plaquetas de dois doadores DeE são analisadasseparadamente.

Figura 4. Compostos pequenos específicos para amilóide influenciam demaneira diferente a ligação de IgIV ou tPA a proteínas dobradasincorretamente imobilizadas.

Em montagens ELISA de ligação de IgIV ou tPA, umaproteína de ligação de multi-ligantes com afinidade por proteínas dobradasincorretamente que compreendem a dobra terciária/quaternária de estrutura βcruzada, foi analisada sob a influencia de séries de concentrações de corantesvermelho Congo e Tioflavina T específicos para amilóide. Α-C. A influênciade corantes espcificos para amilóide, vermelho Congo (Α.), Tioflavina T (Β.)e Tioflavina S (C.) sobre a ligação de 15 pg/ml de IgIV (I) a Hb-AGEimobilizada foi avaliada por meio de pré-incubação da IgIV (I) com séries deconcentrações dos três corantes antes de se adicionar as soluções em placasELISA. D., F. A influência do vermelho Congo sobre a ligação de umaconcentração sub-ótima of tPA a BSA-AGE revestida (D.) ou Αβ (F.). E., G.Influência da Tioflavina T sobre a ligação de uma concentração sub-ótima oftPA a BSA-AGE revestida (E.) ou Αβ (G.).

Figura 5. Uma matriz de afinidade com a capacidade de ligar-se aproteínas que se ligam a proteínas dobradas incorretamente com umaconformação de estrutura β cruzada.

Hemoglobina humana glicada e dobrada incorretamente foiligada a CNBr-Sepharose e determinou-se, por meio de análise da ligação detPA, a capacidade de ligar proteínas com afinidade por proteínas dobradasincorretamente que compreendem a dobra de estrutura β cruzada. Em seguida,a matriz de afinidade foi aplicada para isolar um subconjunto deimunoglobulina moléculas de IgIV-I compreendendo regiões de afinidadepara estrutura β cruzada e/ou proteínas compreendendo estrutura β cruzada.Α. Hb-AGE Sepharose e pérolas de controle vazias foram incubadas com 6μΜ de solução de tPA e o sobrenadante foi analisado subseqüentementequanto à presença de atividade de tPA por meio de adição de substratocromogênico de tPA S2765. B. Após incubação com tPA a Hb-AGESepharose e as pérolas de controle foram lavadas várias vezes comtamponador de lavagem. A presença de tPA no eluado de primeira lavagemfoi analisada novamente acompanhando-se ao longo do tempo a conversão desubstrato de tPA S2765 a 37°C. C. Após lavagem extensiva, o tPA ligado foieluído de pérolas de controle de Sepharose vazias e Hb-AGE Sepharose comalto teor de sal. Eluado diluído dez vezes foi analisado quanto à presença detPA por meio de adição de S2765. D. Curva padrão da absorbância a 590 nmde estoque de IgIV diluído (Octagam), manchado com ADVO1. E. Curvapadrão da ligação de uma série de diluições de estoque de IgIV (Octagam) aHb-AGE, como determinado com ELISA. F. Ligação a Hb-AGE imobilizadade estoque de IgIV diluído 1000 vezes, IgIV após contato com Hb-AGE —Sepharose e IgIV após contato com matriz de controle, conforme avaliadocom um ELISA. G. Ligação a Hb-AGE imobilizada de IgIV eluída de Hb-AGE - Sepharose e IgIV eluiu de matriz de controle, como analisado com umELISA. Sinais são dados como números relativos, como calculado de umacurva de ligação de estoque de IgIV (ver Figura Ε). H. Curva padrão deligação de uma série de diluições de estoque de IgIV (Octagam) a BSAdesnaturada com calor, como determinado com ELISA. I. Ligação a BSAdesnaturada com calor imobilizada de estoque de IgIV diluída 1000 vezes,IgIV após contato com Hb-AGE — Sepharose e IgIV após contato commatriz de controle, como analisado com um ELISA. J. Ligação a BSAdesnaturada com calor imobilizada de IgIV eluída de Hb-AGE - Sepharose eIgIV eluiu de matriz de controle, como analisado com um ELISA. Sinais sãodados como números relativos, conforme calculado da curva de ligação deestoque de IgIV (ver Figura H).Figura 6. Análise de TEM de hemoglobina (HbAGE) e albumina (BSA-AGE) dobrada incorretamente , por meio de glicação

As imagens mostram que BSA-AGE (A.) e HbAGE (B.)formam agregados amorfos não-fibrilares.

Figura 7. Dobramento incorreto de IgIV Octagam induz estrutura βcruzada A-E.

Análise de TEM de IgIV Octagram dobrada incorretamente a 1mg/ml (A), 2,5 mg/ml (B), 5 mg/ml (C), 10 mg/ml (D) e 20 mg/ml (E) em 10mM de tamponador de NaPi pH 8,1. F. Análise de Tioflavina T de IgIVOctagram dobrada incorretamente . Verificou-se que diferentes condições dedesnaturação resultam em proteínas dobradas incorretamente com diferentescaracterísticas de TEM e Tioflavina T.

Figura 8. Dobramento incorreto de IgIV Gammagard induz estrutura βcruzada

Fluorescência de tioflavina T (A), vermelho Congo (B)5 ANS(C)5 Bis-ANS (D) e Tioflavina S (E) de várias preparações de IgIVGammagard dobrada incorretamente preparações. F. Fluorescência detriptofano das várias preparações de IgIV Gammagard dobradaincorretamente quando a intensidade de fluorescência a 375 nm é medida comexcitação a 283 nm.

Figura 9. Dobramento incorreto de IgIV Gammagard induz agregação,acompanhada da capacidade de ativar tPA/plasminogênio.

Análise de TEM de A. IgIV Gammagard nativa, e várias formade IgIV Gammagard dobrada incorretamente , i.e. B. IgIV RF, C. IgIV 65, D.IgIV 69, E. IgIV 76, F. IgIV 80, G. IgIV 83 Gammagard, H. IgIV 86. 1. IgIVÁcido e J. IgIV Base. K. IgIV HFIP/TFA, L. hIgG-BASE-37°C, M. Geraçãode plasmina mediada com tPA quando da exposição a várias preparações deIgIV Gammagard desnaturadas a uma concentração final de 100 μg/ml. Aestimulação de co-fator de dOVA a 40 μ§/πι1 foi ajustada arbitraramente em100%.

Figura 10. Análise de com ThT, vermelho Congo e ANS de preparaçõesde Αβ.

Figura 11. Análise de Αβ com TEM.

Α. Αβ40ί=0, B. Ap40HCl, C. ίΑβ40 (i.e. armazenado durante168 h), D. Αβ42ί=0, Ε. AP42HBS, e F. fAp42 (i.e. HCl tratamento a 37°Cdurante 24 h).

Figura 12. Análise da estrutura de HSA.

Fluorescência de Tioflavina T de HSA nativa e desnaturada(A) e análise de TEM de HSA nativa (B) e HSA desnaturada a 1 mg/ml (C),2,5 mg/ml (D), 5 mg/ml (E) 10 mg/ml (F) ou 20 mg/ml (G).Figura 13. Fluorescência incrementada de ThT e CR com IgG decamundongo dobrada incorretamente.

Tioflavina T (A) e vermelho Congo (B) fluorescência de IgGdesnaturada com calor de camundongo (dmlgG 85°C), IgG desnaturada comácido de camundongo (dmlgG ÁCIDO), IgG desnaturada com base decamundongo (dmlgG BASE) e IgG nativa de camundongo (nmlgG). Apreparação de IgG de camundongo usada é uma composição de γ-globulinasde camundongo.

Figura 14. Análise de estrutura de ApoA-I humana.

(A) Fluorescência de ThT, (B) fluorescência de vermelhoCongo, (C) determinação de fluorescência a A280 nm, (D) ensaio de ativaçãode tPA/plasminogênio (PIg) e (E) ligação de fibronectina F4-5-FLAG-His aApoA-I imobilizada e HbAGE (controle positivo). Sinais de fundo obtidoscom poços revestidos com tamponador de controle são subtraídos de sinaisobtidos com séries de diluições Fn F4-5 em proteínas imobilizadas. ApoA-Idobrada incorretamente de a a c: a = incubada durante 30 minutos a 37°Capós adição de NaOH a uma concentração final de 100 mM a estoque deApoA-I nativa; adição de HCl a uma concentração final de 100 mM apósaquecimento; b = como em a, agora aquecido a 75°C; c = como em a, b,aquecida agora a 100°C. (F). Ligação de tPA às preparações de ApoA-I eHbAGE, similar como em A. Para maior clareza, apresenta-se um eixo y dedois segmentos, porque sinais absolutos obtidos com preparações de tPA eApoA-I são substancialmente menores do que o sinal obtido com HbAGE.Figura 15. Ligação incrementada a BSA-AGE dobrada incorretamentede regiões de afinidade que são enriquecidas usando proteínas β cruzadadobradas incorretamente indicadas acopladas a matrizes.

Na figura indica-se as proteínas dobradas incorretamenteindicadas que foram imobilizadas sobre uma matriz. 'FT', matriz de afinidadede perfluxo; 'EL', eluado de matriz de afinidade, ou fração recuperada apóseluição de regiões de afinidade ligadas às proteínas dobradas incorretamenteindicadas. A linha sólida em um fator de enriquecimento 1 indica o limiteentre esgotamento ou enriquecimento com relação à ligação de regiões deafinidade a, como neste exemplo ilustrativo, BSA-AGE.

Figura 16. Ligação de IgIV enriquecida ou esgotada com proteínas βcruzada dobradas incorretamente após contato de IgIV com matriz deafinidade BSA-aGE β cruzada dobrada incorretamente .

IgIV Octagam foi incubada com BSA-AGE Sepharose. Umaparte das frações de perfluox (FT,flow trough) foi testada em um ELISA paraligação a BSA-AGE, o FT restante foi novamente aplicado a uma quantidaderecente de matriz de BSA-AGE (A). As frações de eluado E foram coletadas etestadas em um ELISA quanto à ligação a BSA-AGE e também (Β). O fatorde enriquecimento é dado como a ligação a proteína dobrada incorretamentepor unidade de massa, em comparação com o material de partida OctagamIgIV. Durante as sucessivas etapas de ligação isola-se mais moléculas de Igde ligação a BSA-AGE do combinado de Octagam, resultando em um fator deenriquecimento decrescente para as sucessivas frações de FT. Moléculas de Igligadas especificamente à matriz de BSA-AGE são eluídas da matriz deafinidade (eluados, Ε). Fatores de enriquecimento de FTs e frações de eluadotambém foram determinados com Αβ (C e D), dOVA (E e F) e HbAGE (G eH).

Figura 17. Ligação de IgIV Octagam a várias proteínas com umaconformação β cruzada, incluindo fibrina, analisada com ELISAs.

A-D. ELISAs apresentando ligação de IgIV Octagam a Hb-AGE imobilizada (Α., controle positivo), dOVA (B.), fibrina (C)5 e Αβ 1-40 eΑβ 1-42 (D.). E. Ligação de tPA a fibrina (controle positivo para C).Figura 18. Ligação de várias preparações de IgIV a várias preparaçõesde apoliproteína A-I dobrada incorretamente de plasma humano

A. Em um ELISA avaliou-se a ligação de IgIV Octagam aApoA-I nativa imobilizada e ApoA-I dobrada incorretamente por meio de adiçãode NaOH a uma concentração final de 100 mM, seguido de incubação duranteminutos a 37°C, ou 75°C, ou 100°C. Não se observou ligação com a ApoA-I15 que foi aquecida a IOO0C B. ELISA como em A., com perfluxo de IgIVesgotada que foi recuperada de uma matriz de afinidade de HbAGE após contatoda matriz com Octagam IgIV. Novamente, não se observou ligação com ApoA-Iaquecida a IOO0C. C. ELISA como em A. e B., com o eluado de IgIVenriquecida após contato da matriz de afinidade de HbAGE com Octagam IgIV.Figura 19. Aumento da fluorescência de vermelho Congo e Tioflavina T,ligação de tPA e ativaçaõ de tPA/plasminogênio por IgIV dobradaincorretamente .

IgIV foi desnaturada com calor em concentrações crescentes, sejaa 65°C em tamponador de NaPi, pH 8,1, ou em HCl, pH 2, durante 6 horas a65°C. Mediu-se o aumento de fluorescência de vermelho Congo (A) e TioflavinaT (Β). A fluorescência de vermelho Congo não foi testada com IgIV desnaturada a1 mg/ml. Ativação de tPA/plasminogênio por IgTV nativa e IgIV misfoldeddesnaturada com calor, aquecida a 1 mg/ml ou 5 mg/ml é determinada usando-seum substrato cromogênico para plasmina. C. A atividade máxima de plasmina foideterminada com IgTV aquecida que foi dobrada incorretamente nasconcentrações indicadas. D. Gráfico representativo mostrando atividade deplasmina induzida por IgTV dobrada incorretamente em tamponador de NaPi a 1mg/ml e 5 mg/ml. E. Ligação de tPA a Ap40t=0 e IgIV dobrada incorretamente .

Figura 20. Agregação de plaquetas de sangue humano por meio deoxLDL é inibida por IgIV; afinidade de IgIV enriquecida por oxLDL, emcomparação com material de partida de IgIV não-enriquecida e esgotada,coletada como perfluxo, após exposição de IgIV à matriz de afinidade deHbAGE dobrada incorretamente.

A. Influência de IgIV sobre agregação de plaquetas induzidacom oxLDL. Agregação induzida com TRAP é máxima e é ajustadaarbitrariamente em 100%. A influência de uma séries de concentrações deIgIV é avaliado por meio de pré-incubação do controle de LDL nativo ouoxLDL com IgIV5 antes da adição à suspensão de plaquetas e início doexperimento de agregação. B.-D. ELISA: Ligação de IgIV Octagam a BSA-AGE imobilizada (B.), IgIV esgotado de regiões de afinidade que foramimobilizadas em uma matriz de HbAGE (C), e IgIV que foi enriquecida pormeio de aplicação de uma matriz de afinidade de HbAGE (D.). E.-G.apresentam ligação a oxLDL dos mesmos três estoques indicados de região deafinidade. E. material de partida, Octagam IgIV, F. IgIV esgotado de regiõesde afinidade com afinidade por β cruzada proteínas e/ou conformaçãoinduzida com β cruzada em proteínas, e G. ligação de IgIV enriquecida aoxLDL. Se possível, calcula-se valores de kD para se obter uma medida dequalidade comparável para os experimentos. A relação entre as kDs obtidaspara a ligação de IgIV a oxLDL e para ligação de IgIV enriquecida, usandouma matriz de HbAGE dobrada incorretamente , a oxLDL é de 27, mostrandoque o fator de enriquecimento obtido com o procedimento acompanhado é de27 para a ligação de regiões de afinidade a ApoB 100 dobrada incorretamente.

Figura 21. Influência de ligação de compostos de IgIV de estrutura βcruzada e F de HGFA sobre o tempo de sangramento em um ensaio detempo de sangramento em camundongo in vivo.

A. Em um ensaio de corte de cauda em camundongo, tanto Fde HGFA (aproximadamente 234 μ§/ιη1 de concentração final) comotambém IgIV (aproximadamente 2,5 mg/ml de concentração final)prolongam significamente o tempo de sangramento. Usou-se o tamponador(PBS) como uma referência para o tempo de sangramento. Usou-se dez IEde heparina por camundongo em um grupo de controle positivo de tempode sangramento prolongado. Indica-se tempos de sangramento médiocalculados e barras de erro. B. Os dados cujas médias foram calculadas sãomostrados em A. são apresentados agora em um gráfico de espalhamentode forma a proporcionar compreensão sobre a distribuição de tempos desangramento medidos. Nota: tempos de sangramento acima de 20 minutosforam ajustados em 20 minutos e o sangramento foi interrompidoativamente, e, adicionalmente, sangramento excedente que resulta emperda de sangue acima de 200 μΐ também foi ajustado em um tempo desangramento de 20 minutos e o sangramento foi interrompido ativamente(ambos os procedimentos estão de acordo com o protocolo que foiaprovado pelo comitê ético local).

Figura 22. Adesão de células a proteínas dobradas incorretamente emodulação com regiões de afinidade enriquecidas.

A. ECs ligam-se a poços de um placa de cultura que sãopré-revestidos com gelatina (ajustado arbitrariamente em 100%) ou BSA-AGE. Quando IgIV Octagam é titulado na suspensão de células, inibe deforma dependente-da-dose a aderência a albumina glicada. Observa-seinibição similar de aderência com fragmento solúvel recombinante deRAGE humana. B. ECs ligam-se, de preferência, a IgIV enriquecida sobreIgIV nativa revestida à mesma concentração. Controles positivos paraadesão são gelatina (ligação ajustada em 100%) e BSA-AGE. Controlenegativo compreende a aderência de células a poços de placas de culturade células que não foram de modo algum revestidas com proteína (0% deaderência).

Figura 23. Esgotamento de soluções de proteínas dobradasincorretamente usando IgIV enriquecida

A-B. Extração de dOVA dobrada incorretamente (A.) ouHbAGE (B.) de uma solução de proteína por meio do uso de regiões deafinidade de IgIV enriquecida que são imobilizadas sobre um suporte sólido,i.e. os poços de uma placa ELISA. Controle negativo: HSA imobilizada sobreo suporte sólido.

Figura 24. Ligação de IgIV humana enriquecida e IgIV Octagam a váriasformas de IgG de camundongo dobrada incorretamente .

A. A ligação de IgIV humana enriquecida a IgG decamundongo dobrada incorretamente foi avaliada em um ELISA direto compreparações de IgG imobilizada de camundongo. B. Em uma segundaabordagem, primeiramente anticorpo anti-IgG de camundongo foi aplicadorevestindo os poços de uma placa de 96 poços, seguido de ligação de váriaspreparações de IgG de camundongo, e se sobrepõe a uma série deconcentrações de IgIV humana Octagam.

Figura 25. Ligação de IgM de hibridoma de camundongo 7H2H2 a váriasformas de γ-imunoglobulinas humanas dobradas incorretamente e auto-γ-globulinas de camundongo.

A ligação de IgM de hibridoma de camundongo 7H2H2 avárias formas de preparações de IgG humana dobradas incorretamente foianalisada com ELISAs. A. IgM 7H2H2 a 12,5 pg/ml em PBS/0,1% de Tweenfoi testados quanto À ligação a 15 diferentes preparações de IgG humana,como indicado na seção de 'Materiais e Métodos Gerais, por exemplo, de 6 aB. Em um segundo experimento, IgM 7H2H2 de clone de hibridomapurificada, nas concentrações indicadas, foi novamente analisada quanto àligação a cinco preparações de IgG humana. IgGs nativas de controle sãoIgIV Gammagard e IgIV Octagam. Números para as preparações de IgIVreferem-se a preparações de IgIV usadas em A. (ver também o texto). C.Ligação de IgM de hibridoma de camundongo 7H2H2 a hIgG-BASE-37°C eIgIV Gammagard nativa. D. Ligação de 7H2H2 a várias preparações de IgGde camundongo dobrada incorretamente e γ-globulinas nativas decamundongo.

Figura 26. Sumário de procedimento preferido para selecionar regiões deafinidade para diagnósticos e terapêuticas específicos para doenças pormal dobramento de proteínas.

Regiões de afinidade dirigidas contra qualquer conjunto deproteínas dobradas incorretamente podem ser selecionadas aplicando-se umacomposição compreendendo regiões de afinidade sobre uma matriz deafinidade de proteínas dobrada incorretamente s. Quando referida matrizcontém uma ou um conjunto de proteínas dobradas incorretamente {misturaX, coluna I) obtém-se regiões de afinidade (preparação 1) que são dirigidascontra proteínas dobradas incorretamente em geral. Referidas regiões deafinidade podem ser aplicadas para todas as doenças de dobramento incorreto,mas podem causar efeitos colaterais, porque não são todas específicas paradoença. E possível isolar regiões de afinidade específicas para doençaaplicando uma uma composição de regiões de afinidade em uma coluna comuma ou com um conjunto de proteínas dobradas incorretamente específicaspara doença {mistura A, coluna II). Regiões de afinidade (preparação 2)obtidas desta maneira conter regiões de afinidade específicas para doença,mas também regiões de afinidade que interagem com proteínas dobradasincorretamente em geral. Estas últimas, similares às regiões de afinidadeobtidas da coluna I, ainda podem causar efeitos colaterais quando aplicadaspara a doença específica, devido à presença de regiões de afinidade quepodem ligar-se a qualquer proteína dobrada incorretamente que estejapresente na ocasião. Assim, mais preferivelmente, prepara-se regiões deafinidade (preparação 3) aplicando-se uma composição compreendendoregiões de afinidade em uma coluna de proteínas dobradas incorretamente(coluna I) e subseqüentemente em uma coluna com um ou um conjunto deproteínas dobradas incorretamente específicas para doença (coluna III, similarou idêntica à coluna II). De forma ainda mais preferível, regiões de afinidadealtamente específicas para proteínas dobradas incorretamente que contribuempara a patologia de uma doença (preparação 4) são obtidas quando se aplicauma composição compreendendo regiões de afinidade subseqüentemente emuma coluna com uma ou um conjunto de proteínas dobradas incorretamenteespecíficas para doença (coluna II) seguido de uma coluna (coluna IV)compreendendo qualquer conjunto de proteínas dobrada incorretamente s,porém excluindo aquelas proteínas dobradas incorretamente que contribuempara a patologia da doença-alvo e que estão imobilizadas na coluna II, usadaspara esgotar a mistura de regiões de afinidade coletadas com coluna IIdaquelas que geralmente interagem com proteínas dobrada incorretamente s.

Referências

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Claims

1. Método para selecionar pelo menos uma molécula de IgIV,de uma coleção de moléculas de IgIV compreendendo uma região deafinidade que é capaz de interagir com um epítopo de uma proteína dobradaincorretamente e/ou com um epítopo de uma estrutura β cruzada e/ou com umepítopo de uma proteína compreendendo uma estrutura β cruzada,caracterizado pelo fato de que compreende:contactar uma coleção de moléculas de IgIV com uma proteínadobrada incorretamente , uma estrutura β cruzada e/ou uma proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada, e coletar pelo menos uma moléculade IgIV compreendendo uma região de afinidade interagindo com referidoepítopo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que referido epítopo é pelo menos parte de uma estrutura β cruzada deuma proteína.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que referido epítopo é exposto em referida proteína compreendendouma estrutura β cruzada.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 3, caracterizado pelo fato de que referida proteína dobrada incorretamente ,estrutura β cruzada e/ou proteína compreendendo uma estrutura β cruzada éligada a um suporte sólido.

5. Coleção de moléculas de IgIV, enriquecidas com moléculasde IgIV, caracterizada pelo fato de que compreende uma região de afinidadeque é capaz de interagir com um epítopo de uma proteína dobradaincorretamente , uma estrutura β cruzada e/ou com um epítopo de umaproteína compreendendo uma estrutura β cruzada.

6. Coleção de moléculas de IgIV de acordo com areivindicação 5, caracterizada pelo fato de que é selecionada por meio de ummétodo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4.

7. Composição, caracterizada pelo fato de compreender pelomenos 5, de preferência, pelo menos 8, mais preferivelmente pelo menos 10moléculas isoladas, sintéticas e/ou recombinantes, que compreende umaregião de afinidade que é capaz de interagir com um epítopo de uma proteínadobrada incorretamente , uma estrutura β cruzada e/ou com um epítopo deuma proteína compreendendo uma estrutura β cruzada.

8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizadapelo fato de que compreende uma parte funcional, derivado e/ou análogo depelo menos uma molécula de IgIV compreendendo uma região de afinidadecapaz de interagir com um epítopo de uma proteína dobrada incorretamente ,uma estrutura β cruzada e/ou com um epítopo de uma proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada.

9. Composição de acordo com a reivindicação 7 ou 8,caracterizada pelo fato de que pelo menos uma de referidas moléculascompreende adicionalmente uma molécula de ligação de estrutura β cruzada.

10. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 7 a 9, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dereferidas moléculas compreende adicionalmente uma molécula efetora.

11. Composição de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de que referida molécula efetora é uma protease ou umaparte de ligação de estrutura β cruzada da mesma.

12. Composição de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de que referida molécula efetora é um compostoimunopotencializador, de preferência, uma citocina.

13. Composição de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de que referida molécula efetora é um fator de ativaçãode complemento.

14. Composição de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de que referida molécula efetora é um sinal deeliminação, de preferência, pelo menos parte de um domínio Fc.

15. Composição de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de que referida molécula efetora é um compostosupressor de inflamação, de preferência, um fator inibidor de complemento.

16. Composição de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de que referida molécula efetora é um fatorpotencializador de ligação de estrutura β cruzada.

17. Composição de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de que referida molécula efetora é um compostoopsonizador.

18. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 7 a 17, caracterizada pelo fato de que referida moléculaisolada, sintética e/ou recombinante é um composto opsonizador.

19. Método para produzir uma composição como definida emqualquer uma das reivindicações de 7 a 18, caracterizado pelo fato de quecompreende definir a seqüência de aminoácidos de uma região de afinidadede pelo menos uma molécula de IgIV capaz de interagir com um epítopo deuma proteína dobrada incorretamente , uma estrutura β cruzada e/ou com umepítopo de uma proteína compreendendo uma estrutura β cruzada, e produzirmoléculas isoladas, sintéticas e/ou recombinantes compreendendo referidaseqüência de aminoácidos.

20. Método para selecionar uma molécula, de uma coleção demoléculas de IgIV como definida na reivindicação 5 ou 6, ou de umacomposição como definida em qualquer uma das reivindicações de 7 a 18, amolécula compreendendo uma região de afinidade que, ao interagir com umepítopo de uma proteína dobrada incorretamente ou uma estrutura β cruzadae/ou ao interagir com um epítopo de uma proteína compreendendo umaestrutura β cruzada, é capaz de induzir opsonização de referida estrutura βcruzada e/ou proteína com uma célula fagocítica, caracterizado pelo fato deque compreende:- contactar uma coleção de moléculas de IgIV como definidana reivindicação 5 ou 6, ou a composição como definido em qualquer uma dasreivindicações de 7 a 18, com uma proteína dobrada incorretamente , umaestrutura β cruzada e/ou com uma proteína compreendendo uma estrutura βcruzada;- contactar qualquer complexo compreendendo uma proteínadobrada incorretamente , uma estrutura β cruzada e/ou uma proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada, ligada a uma molécula de IgIV e/oua uma molécula isolada, sintética e/ou recombinantes, com uma célulafagocítica; e- coletar uma molécula de IgIV e/ou molécula isolada,sintética e/ou recombinante que é capaz de induzir ou acentuar fagocitose, poruma célula fagocítica, de referida proteína dobrada incorretamente , estruturaβ cruzada e/ou proteína compreendendo uma estrutura β cruzada.

21. Coleção de moléculas de IgIV de acordo com areivindicação 5 ou 6, e/ou a composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 7 a 18, caracterizada pelo fato de que é para uso como ummedicamento.

22. Uso de uma coleção de moléculas de IgIV como definidana reivindicação 5 ou 6, e/ou uma composição como definido em qualqueruma das reivindicações de 7 a 18, caracterizado pelo fato de que é para afabricação de um medicamento para prevenção e/ou tratamento pelo menosparcial de uma doença relacionada e/ou associada com proteína dobradaincorretamente e/ou estrutura β cruzada, um distúrbio da coagulação dosangue, sépsis e/ou uma infecção microbiana/por patógeno/bacteriana/porparasita/viral.

23. Uso de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelofato de que referida infecção microbiana/por patógeno/bacteriana/porparasita/viral compreende uma infecção oportunista relacionada com HIV.

24. Método para incrementar degradação de proteínaextracelular e/ou eliminação de proteína em um indivíduo, caracterizado pelofato de que compreende administrar uma coleção de moléculas de IgIV comodefinido na reivindicação 5 ou 6, e/ou uma composição como definido emqualquer uma das reivindicações de 7 a 18, a referido indivíduo.

25. Método para inibir, pelo menos em parte, efeitos mediadospor proteína dobrada incorretamente e/ou estrutura β cruzada em umindivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar umaquantidade efetiva de uma coleção de moléculas de IgIV como definida nareivindicação 5 ou 6, e/ou uma composição como definida em qualquer umadas reivindicações de 7 a 18 a um indivíduo.

26. Método para prevenção e/ou tratamento pelo menos parcialde uma doença, um distúrbio e/ou uma infecção, sendo um distúrbio dacoagulação do sangue, sépsis e/ou uma infecção microbiana/porpatógeno/bacteriana/por parasita/viral relacionada e/ou associada comproteína dobrada incorretamente e/ou estrutura β cruzada em um indivíduo,caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma coleção demoléculas de IgIV como definido na reivindicação 5 ou 6, e/ou umacomposição como definida em qualquer uma das reivindicações de 7 a 18 areferido indivíduo.

27. Método para prevenção e ou tratamento pelo menos parcialde uma infecção oportunista relacionada com HTV em um indivíduo,caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma coleção demoléculas de IgIV como definida na reivindicação 5 ou 6, e/ou umacomposição como definida em qualquer uma das reivindicações de 7 a 18, areferido indivíduo.

28. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende:- uma coleção de moléculas de IgIV como definida nareivindicação 5 ou 6, e/ou- uma composição como definida em qualquer uma dasreivindicações de 7 a 18, e- um carreador, diluente e/ou excipiente vantajoso.

29. Composição de acordo com a reivindicação 28,caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um composto deligação de estrutura β cruzada.

30. Composição de acordo com a reivindicação 28 ou 29,caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um composto depotencialização de ligação de estrutura β cruzada.

31. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 28 a 30, caracterizada pelo fato de que compreendeadicionalmente um composto de ativação de complemento.

32. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 28 a 30, caracterizada pelo fato de que compreendeadicionalmente um composto imunopotencializador, um composto supressorde inflamação, e/ou um composto inibidor de complemento.

33. Uso de uma coleção de moléculas de IgIV como definidana reivindicação 5 ou 6, e/ou de uma composição como definida em qualqueruma das reivindicações de 7 a 18, caracterizado pelo fato de que é para inibiragregação de plaquetas sangüíneas induzida por proteína.

34. Uso de uma coleção de moléculas de IgIV como definidana reivindicação 5 ou 6, e/ou de uma composição como definida em qualqueruma das reivindicações de 7 a 18, caracterizado pelo fato de que é para ligaçãocompetitiva de ativador de plasminogênio de tipo tissular (tPA) com umaproteína dobrada incorretamente , a uma estrutura β cruzada e/ou a umamolécula compreendendo uma estrutura β cruzada.

35. Método para remover, pelo menos parcialmente, proteínasdobrada incorretamente s, estruturas β cruzadas e/ou proteínascompreendendo uma estrutura β cruzada de uma amostra, caracterizado pelofato de que compreende contactar uma amostra com uma coleção demoléculas de IgIV como definida na reivindicação 5 ou 6, e/ou umacomposição como definida em qualquer uma das reivindicações de 7 a 18, eremover de referida amostra um complexo de uma proteína dobradaincorretamente , e/ou uma estrutura β cruzada, e/ou proteína compreendendouma estrutura β cruzada, ligado a uma molécula de IgIV e/ou uma moléculaisolada, sintética e/ou recombinante.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que referida amostra é uma amostra de fluido.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que referido fluido compreende um fluido corporal.

38. Método de acordo com a reivindicação 35 ou 36,caracterizado pelo fato de que referido fluido compreende um farmacêutico ouqualquer um de seus constituintes.

39. Método de acordo com a reivindicação 35 ou 36,caracterizado pelo fato de que referido fluido compreende uma substânciaalimentícia.

40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-35 a 39, caracterizado pelo fato de que referida coleção de moléculas de IgIVe/ou composição é ligada a um suporte sólido.

41. Kit de diagnóstico, caracterizado pelo fato de quecompreende:- pelo menos uma região de afinidade de uma coleção demoléculas de IgIV como definida na reivindicação 5 ou 6, e/ou pelo menosuma região de afinidade de uma composição como definida em qualquer umadas reivindicações de 7 a 18, capaz de interagir com uma proteína dobradaincorretamente , com uma estrutura β cruzada e/ou com uma proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada, e- um modo de visualização de uma interação de referidaproteína dobrada incorretamente e/ou referida estrutura β cruzada e/oureferida proteína com referida região de afinidade.

42. Kit de diagnóstico de acordo com a reivindicação 41,caracterizado pelo fato de que referida proteína dobrada incorretamente e/ouestrutura β cruzada compreende uma proteína dobrada incorretamente e/ouestrutura β cruzada relacionada com doença.

43. Método para determinar se uma proteína dobradaincorretamente, e/ou uma proteína e/ou peptídeo compreendendo umaestrutura β cruzada está presente em uma solução aquosa compreendendo umaproteína, caracterizado pelo fato de que compreende:- contactar referida solução aquosa com uma coleção demoléculas de IgIV como definida na reivindicação 5 ou 6, e/ou umacomposição como definida em qualquer uma das reivindicações de 7 a 18, e- detectar se proteína dobrada incorretamente dobrada, e/ouuma proteína e/ou peptídeo compreendendo uma estrutura β cruzada estápresente.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que referida solução aquosa compreende um detergente, umproduto alimentício, um suplemento alimentício, um meio de cultura decélulas, uma solução de proteína comercialmente disponível usada para finsde pesquisa, sangue, um produto do sangue, fluido cerebroespinhal, fluidosinovial, fluido linfático, um produto cosmético, uma célula, uma composiçãofarmacêutica ou qualquer um de seus constituintes compreendendo umaproteína, ou uma combinação de qualquer um destes.

45. Método para remover uma proteína dobradaincorretamente, uma estrutura β cruzada e/ou uma proteína que compreendeuma estrutura β cruzada de uma composição farmacêutica ou qualquer um deseus constituintes compreendendo uma proteína, caracterizado pelo fato deque compreende:- contactar referida composição farmacêutica ou qualquer umde seus constituintes compreendendo uma proteína com uma coleção demoléculas de IgIV como definida na reivindicação 5 ou 6, e/ou com umacomposição como definida em qualquer uma das reivindicações de 7 a 18;- permitir ligação de referida proteína dobrada incorretamente ,e/ou proteína e/ou peptídeo compreendendo uma estrutura β cruzada areferida coleção de moléculas de IgIV e/ou composição; e- separar peptídeo e/ou proteína ligada compreendendo umaestrutura β cruzada de referida composição farmacêutica ou qualquer um deseus constituintes compreendendo uma proteína.

46. Método para reduzir e/ou prevenir efeitos colateraisindesejados de uma composição farmacêutica e/ou incrementar a atividadeespecífica por grama de proteína, caracterizado pelo fato de que compreenderemover uma proteína não-dobrada, um peptídeo não-dobrado, uma proteínadobrada incorretamente , uma proteína desnaturada, uma proteína agregada,um peptídeo agregado, uma proteína multimerizada e/ou um peptídeomultimerizado, e/ou uma proteína compreendendo uma estrutura β cruzada,de referida composição farmacêutica ou qualquer um de seus constituintes,usando um método como definido na reivindicação 45.

47. Composição farmacêutica ou qualquer um de seusconstituintes, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína,obtenível por meio de um método como definido na reivindicação 45 ou 46.

48. Uso de uma coleção de moléculas de IgIV como definidana reivindicação 5 ou 6, e/ou de uma composição como definida em qualqueruma das reivindicações de 7 a 18, caracterizado pelo fato de que é paradiminuir o acúmulo de proteína e/ou proteínas dobradas incorretamentecompreendendo uma estrutura β cruzada.

49. Uso de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelofato de que referida proteína dobrada incorretamente e/ou estrutura β cruzadaestá envolvida em uma doença conformacional.

50. Uso de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelofato de que referida doença é uma doença do tipo amiloidose, aterosclerose,diabetes, sangramento, trombose, câncer, sépsis e outras doençasinflamatórias, artrite reumatóide, encefalopatias espongiformestransmissíveis, esclerose múltipla, doenças autoimunes, doença associada comperda de memória ou mal de Parkinson e outras doenças neuroniais(epilepsia), encefalopatia, e/ou artrite, e/ou artrite reumatóide.

51. Uso de uma coleção de moléculas de IgIV como definidana reivindicação 5 ou 6, e/ou de uma composição como definida em qualqueruma das reivindicações de 7 a 18, caracterizado pelo fato de que é paradeterminar a presença de proteína ou proteínas dobradas incorretamentedepositadas acumuladas com uma estrutura β cruzada, de preferência,envolvida em uma doença conformacional.

52. Dispositivo de separação para realizar um método comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 35 a 40, ou de 45 a 46,caracterizado pelo fato de que referido dispositivo compreende um sistemapara transportar fluidos (circulantes), em que referido sistema é dotado commeios para conectar-se a um fluido em fluxo, de preferência, na circulação deum indivíduo, para entrada de fluido em referido sistema e retorno de fluidodo referido sistema, de preferência, na circulação de um indivíduo, em quereferido sistema compreende adicionalmente uma fase sólida, em que referidafase sólida compreende uma coleção de moléculas de IgIV como definido nareivindicação 5 ou 6, e/ou uma composição como definida em qualquer umadas reivindicações de 7 a 19.

53. Dispositivo de separação de acordo com a reivindicação-52, caracterizado pelo fato de que é um aparelho de diálise.

54. Método para interferir na coagulação do sangue,caracterizado pelo fato de que compreende fornecer no sangue uma coleção demoléculas de IgIV como definido na reivindicação 5 ou 6, e/ou umacomposição como definida em qualquer uma das reivindicações de 7 a 18.

55. Método para determinar a quantidade de proteínasdobradas incorretamente e/ou estruturas β cruzadas em uma composição, depreferência, em um medicamento e/ou vacina, caracterizado pelo fato de quecompreende:- contactar referida composição com uma coleção demoléculas de IgIV como definida na reivindicação 5 ou 6, e/ou com umacomposição como definida em qualquer uma das reivindicações de 7 a 18, e- relacionar a quantidade de proteínas dobradas incorretamentee/ou estruturas β cruzadas ligadas com a quantidade de estruturas β cruzadaspresentes em referida composição.

56. Método para determinar uma diferença no teor de estruturaβ cruzada de uma proteína em uma amostra de referência, em comparaçãocom o teor de estrutura β cruzada de referida proteína em uma amostra deteste, em que referida amostra de teste foi submetida a um tratamento que,espera-se, exerce um efeito sobre o teor de estrutura β cruzada de referidaproteína, caracterizado pelo fato de que o método compreende:- determinar em um exemplo de referência o teor de estrutura βcruzada de uma proteína usando-se uma coleção de moléculas de IgIV comodefinida na reivindicação 5 ou 6 e/ou uma composição como definida emqualquer uma das reivindicações de 7 a 18;- submeter referida proteína a um tratamento que, espera-se,exerce um efeito sobre o teor de estrutura β cruzada de referida proteína,obtendo-se desta forma uma amostra de teste;- determinar na amostra de teste obtida o teor de estrutura βcruzada de referida proteína usando-se uma coleção de moléculas de IgIVcomo definido na reivindicação 5 ou 6, e/ou uma composição como definidoem qualquer uma das reivindicações de 7 a 18; e- determinar se o teor de estrutura β cruzada de referidaproteína em referida amostra de referência é significativamente diferente doteor de estrutura β cruzada de referida proteína em referida amostra de teste.

57. Método para determinar a identidade de uma proteínadobrada incorretamente, de uma estrutura β cruzada ou de uma proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada em uma amostra compreendendouma proteína, caracterizado pelo fato de que compreende:- contactar referida amostra com uma coleção de moléculas deIgIV como definida na reivindicação 5 ou 6, e/ou uma composição comodefinida em qualquer uma das reivindicações de 7 a 18, resultando emproteínas dobradas incorretamente ligadas, estruturas β cruzadas e/ouproteína(s) ligada(s) compreendendo uma estrutura β cruzada, e- identificar uma proteína dobrada incorretamente ligada,estrutura β cruzada ligada e/ou proteína(s) ligada(s) compreendendo umaestrutura β cruzada.

58. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizadopelo fato de que referida amostra compreende uma solução aquosa, depreferência, um fluido corporal.

59. Método de acordo com a reivindicação 57 ou 58,caracterizado pelo fato de que se usa fluidos corporais originados deindivíduos saudáveis, e fluidos corporais de indivíduos que sofrem de, oususpeitos de sofrer de, uma doença relacionada e/ou associada com a presençade uma estrutura β cruzada.

60. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-57 a 59, caracterizado pelo fato de que se usa uma amostra de um indivíduoque sofre de, ou que se encontra em risco de sofrer de, amiloidose AL e/ouartrite.

61. Composto, caracterizado pelo fato de que é capaz de ligar-se especificamente a um composto descrito na tabela 9, e/ou capaz dediminuir a quantidade e/ou atividade de um composto descrito na Tabela 9,como um medicamento.

62. Uso de um composto capaz de ligar-se especificamente aum composto descrito na Tabela 9, e/ou capaz de diminuir a quantidade e/ouatividade de um composto descrito na tabela 9, caracterizado pelo fato de queé para a preparação de um medicamento contra uma doença, um distúrbio dacoagulação do sangue, sépsis e/ou uma infecção microbiana/porpatógeno/bacteriana/por parasita/viral relacionada e/ou associada comproteína dobrada incorretamente .

63. Uso de acordo com a reivindicação 51 ou 62, caracterizadopelo fato de que referida doença compreende amiloidose AL e/ou artrite.

64. Método para tratar um indivíduo que sofre de, ou em riscode sofrer de, uma doença, um distúrbio e/ou uma infecção, sendo um distúrbioda coagulação do sangue, sépsis e/ou uma infecção microbiana/porpatógeno/bacteriana/por parasita/viral, relacionada e/ou associada comproteína dobrada incorretamente , caracterizado pelo fato de que compreendeadministrar a referido indivíduo um composto capaz de ligar-seespecificamente a um composto descrito na Tabela 9, e/ou capaz de diminuir aquantidade e/ou atividade de um composto descrito na Tabela 9.

65. Método de acordo com a reivindicação 64, caracterizadopelo fato de que referida doença compreende amiloidose AL e/ou artrite.

66. Composição de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que referida molécula efetora é um inibidor dedobramento incorreto.