BRPI0707954A2 - aparelho para regular a temperatura de uma amostra biológica e/ou quìmica e método de uso deste - Google Patents

Abstract

APARELHO PARA REGULAR A TEMPERATURA DE UMA AMOSTRA BIOLóGICA E/OU QUìMICA E MéTODO DE USO DESTE. A invenção oferece um aparelho para regular a temperatura de uma amostra química e/ou biológica e um método de uso deste. O aparelho inclui pelo menos um módulo de controle de temperatura. O módulo de controle de temperatura inclui um aquecedor, um condutor de calor e um sensor de temperatura. O aquecedor do módulo de controle de temperatura é adaptado para se comunicar termicamente com um substrato removível, sobre o qual a referida amostra química e/ou biológica é colocada, via o condutor de calor, O sensor de temperatura do módulo de controle de temperatura é adaptado para detectar e controlar a temperatura do substrato via o condutor de calor, O aparelho é projetado de modo que o substrato fique situado acima do referido módulo de controle de temperatura para cobrir totalmente o referido módulo de controle de temperatura.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invençãopara "APARELHO PARA REGULAR A TEMPERATURADE UMA AMOSTRA BIOLÓGICA E/OU QUÍMICA EMÉTODO DE USO DESTE".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um aparelhopara regular a temperatura de uma amostra biológica e/ouquímica, em especial a uma amostra em uma gotícula de líquido.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Muitos procedimentos diagnósticos, analíticos epreparativos incluem etapas em que mudanças de temperatura sãoefetuadas. Para obter resultados precisos e reproduzíveis, énecessário manter o controle da temperatura de uma mistura dereação, tal como uma amostra, e manter a uniformidade datemperatura dentro da respectiva mistura de reação. Além disso,muitos procedimentos diagnósticos, analíticos e preparativosrecorrem ao uso de enzimas, que apresenta o desempenho ideal auma temperatura definida. Para obter o controle exato datemperatura, geralmente é necessário obter estreito contato entre amistura de reação e o elemento de aquecimento ou resfriamento.

Ao mesmo tempo, é necessário evitar contaminações cruzadas dediferentes misturas de reação, por exemplo, amostras.

Um exemplo de processo em que o aquecimentocontrolado e a manutenção da uniformidade da temperatura sãoparticularmente importantes é a amplificação de ácido nucléico invitro por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR).Normalmente, o processo PCR é um processo de ciclagemtérmica, em que o ciclo básico pode ser dividido em três etapas:(a) separação da fita dupla de DNA em cerca de 90 0C a cerca de94 'C (b) resfriamento para cerca de 50 0C - 70 0C para renaturaros oligonucleotídeos iniciadores {primers) específicos ao DNA defita única (anelamento), e (c) aumentar a temperatura a cerca de70 'C - 80 0C para extensão dos oligonucleotídeos iniciadorescom polimerase termoestável do DNA (alongamento).

O controle de temperatura durante uma reaçãoPCR é geralmente realizado por um sistema de laço derealimentação, ao passo que a uniformidade da temperatura éobtida por materiais com elevada condutividade térmica, masvolumosos, como o cobre. Além do controle de temperatura e damanutenção da uniformidade de temperatura dentro da amostra,também é importante obter uma taxa de aquecimento(resfriamento) de amostra de pelo menos 5K/s (-5K/s). A alta taxade aquecimento é obtida pela implementação de um sistema decontrole Proporcional-Integral-Derivativo (PID) limitado por umapotência máxima dissipada e capacitância térmica. A alta taxa deresfriamento é bem difícil de ser alcançada, e os sistemasvolumosos exigem resfriamento por força, tanto por um ElementoTermoelétrico (TEC, geralmente chamado de elemento de Peltier)ou por outro meio, como a água. Tais dispositivos sãocomplicados e ávidos por energia.

Por os sistemas serem volumosos, suasconstantes térmicas de tempo são em minutos em vez desegundos. Isso resulta em longos tempos de transição esubprodutos indesejados da reação PCR. O alto consumo deenergia também elimina a possibilidade de produzir um sistemaPCR portátil e operado por bateria. Além disso, os tubos dereação são grandes e a quantidade exigida de coquetel da PCRtorna elevado o custo de todo o processo. Além do mais, adetecção do produto da PCR tem de ser feita fora de linha, isto é,empregando outro dispositivo, o que resulta em custos adicionais.

Embora os sistemas atualmente utilizados pararealizar as reações PCR permitam a realização de várias amostrasao mesmo tempo, eles não permitem o controle de temperaturaindividual das diferentes amostras. Quando é desejado expor asamostras a condições de ciclo de temperatura variáveis, váriossistemas precisam, portanto, ser empregados em paralelo.Portanto, é necessário um aparelho que seja capaz de lidarsimultaneamente com as amostras de maneira separada durante aPCR.

A miniaturização dos dispositivos na áreaquímica, farmacêutica e biotecnológica levou ao desenvolvimentode dispositivos microfluídicos e microarranjos. Por conseqüência,métodos de micro PCR ^PCR) estão sendo desenvolvidos;espera-se que estes métodos se tornem a parte central de um"Lab-on-a-Chip" ou Microsistemas de Análise Total (μΤΑβ).Duas abordagens básicas podem ser identificadas, uma sendo umsistema estacionário com temperatura de ciclagem, a outra sendoum sistema de fluxo com três regiões a temperaturas diferentes.Os sistemas estacionários realizam a ciclagemda temperatura da câmara com o objetivo de modificar atemperatura da solução PCR. Eles não exigem um sistema debombeamento ou outro meio para transferir a amostra PCR. Ossistemas de fluxo passante geralmente possuem regiões sob trêstemperaturas constantes, entre as quais a amostra é movida e,assim, altera sua temperatura. Ainda que seja mais rápido do queo sistema estacionário, o sistema de fluxo passante exige umaimplementação de um mecanismo para transferir entre as regiõesde temperatura diferente. Em ambos os casos, um aquecedor éintegrado ao sistema PCR, logo, não é econômico descartar odispositivo para evitar a contaminação cruzada após a realizaçãode apenas um único teste.

Um exemplo recente de um método micro PCRestacionário utiliza um dispositivo de chip planar e a formação deuma Câmara de Reação Virtual (VRC). A VRC é formada peloencapsulamento de uma amostra baseada em água no óleo(Guttenberg, Z., e col., Lab Chip, 2005, 5, 308 - 317). Uma vezque não é necessária nenhuma cobertura sólida ou microcanais, afabricação do dispositivo consiste apenas na deposição epadronização dos aquecedores de película fina e sensorestemperatura sobre um substrato adequado. Entretanto, orespectivo dispositivo é ainda muito caro para um sistemadescartável.

Outro desafio proveniente da miniaturização é orisco de contaminação cruzada entre as amostras. A maneira maissegura de se evitar tal contaminação cruzada é pelo uso de umsistema descartável. No mínimo, a parte do dispositivo que entraem contato com a amostra deve ser descartável. Até então, forampropostos muitos sistemas diferentes. Esses sistemasnormalmente não atendem a todos os requisitos listados acima esão relativamente caros. Uma abordagem com uma peçadescartável feita de folha plástica foi revelada na patente US6.509.186. Um conjunto de poços é formado por gravação aquente e o conjunto inteiro é colocado sobre aquecedores. Essesistema emprega um processo de microfabricação relativamentecomplicado e a placa descartável precisa ser personalizada.Portanto, persiste a necessidade de uma μΡΟΚ que seja simples dese fabricar, fácil de se operar e suficientemente econômica paraser descartável. O recurso opcional de ser integrado em umsistema μΤΑ8 completo é altamente desejável.

Sendo assim, um dos objetivos da presenteinvenção é o de propor um aparelho e um método para regular atemperatura de uma amostra química e/ou biológica que evite asdesvantagens apresentadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção oferece umaparelho para regular a temperatura de uma amostra química e/oubiológica. O aparelho inclui pelo menos um módulo de controlede temperatura. O módulo de controle de temperatura inclui umaquecedor, um condutor de calor e um sensor de temperatura. Oaquecedor do módulo de controle de temperatura é adaptado parase comunicar termicamente com um substrato removível, sobre oqual a referida amostra química e/ou biológica é colocada, via ocondutor de calor. O sensor de temperatura do módulo de controlede temperatura é adaptado para detectar e controlar a temperaturado substrato via o condutor de calor. O aparelho é projetado demodo que o substrato fique situado acima do referido módulo decontrole de temperatura para cobrir totalmente o referido módulode controle de temperatura.

Em um aspecto adicional, a presente invençãooferece um método para regular a temperatura de uma amostraquímica e/ou biológica. O método inclui proporcionar umaparelho para regular a temperatura de uma amostra química e/oubiológica. O aparelho inclui pelo menos um módulo de controlede temperatura. O módulo de controle de temperatura inclui umaquecedor, um condutor de calor e um sensor de temperatura. Oaquecedor do módulo de controle de temperatura é adaptado parase comunicar termicamente com um substrato removível, sobre oqual a referida amostra química e/ou biológica é colocada, via ocondutor de calor. O sensor de temperatura do módulo de controle de temperatura é adaptado para detectar e controlar a temperaturado substrato via o condutor de calor. O aparelho é projetado demodo que o substrato fique situado acima do referido módulo decontrole de temperatura para cobrir totalmente o referido módulode controle de temperatura. O método adicionalmente incluiproporcionar um valor de temperatura para aquecer a amostraquímica e/ou biológica. O método também inclui medir atemperatura do condutor de calor por meio do sensor detemperatura. O método adicionalmente inclui aplicar calor aoreferido condutor de calor, contanto que a temperatura medidaesteja abaixo do valor de temperatura fornecido, dessa formaaquecendo o referido substrato e a referida amostra química e/oubiológica.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A invenção será melhor entendida comreferência à descrição detalhada quando considerada emcombinação com os exemplos não limitantes e os desenhosapensos, nos quais:

A Figura 1 representa uma fotografia de umaconcretização de um aparelho da invenção. Os módulos decontrole de temperatura são soldados em uma Placa de CircuitoImpresso (PCB). Acima dela, encontra-se uma lâmina de vidroquadrada como substrato. As amostras são colocadas sobre osubstrato na forma de gotículas de líquido.

A Figura 2 é uma fotografia adicional doaparelho da invenção conforme revelado na Fig. 1. Os módulos decontrole de temperatura (8) são soldados em uma Placa deCircuito Impresso (PCB). Um substrato removível pode sercolocado sobre o aparelho. Um respectivo substrato (vide tambéma Fig. 1) cobre totalmente os módulos de controle de temperatura.

A Figura 3A representa uma seção transversalesquemática de uma concretização de um módulo de controle detemperatura de um aparelho da invenção, coberto com umsubstrato removível (1), sobre o qual uma amostra (2) estálocalizada. O substrato (1) entra em contato com um condutor decalor (3), que, por sua vez, está em contato com váriosaquecedores (4) e um sensor (5).

A Figura 3B representa uma seção transversalesquemática de uma concretização adicional de um módulo decontrole de temperatura. A amostra é uma gotícula de líquido, queinclui uma fase interna (6) e uma fase externa (7). Um substrato(1) entra em contato com um condutor de calor (3), que, por suavez, está em contato um aquecedor concêntrico (4) e um sensorconcêntrico (5).

A Figura 4 apresenta esquematicamente outraconcretização de um módulo de controle de temperatura doaparelho da invenção, visto de baixo. Um aquecedor (4) e umsensor (5) são concêntricos, com o aquecedor (4) circundando osensor (5). O condutor de calor (3) inclui duas partesconcêntricas, conectadas por uma ponte (10), bem como umaparte em forma de haste de um comprimento (9).

A Figura 5 representa disposições de módulosde controle de temperatura, em que pares de módulos de controlede temperatura estão opostos uns aos outros no plano que éessencialmente paralelo ao plano do substrato, que é o plano dosubstrato sobre o qual a amostra é colocada. Todos (Fig. 5A, Fig.5C) ou alguns pares dos módulos de controle de temperatura (Fig.5B, Fig. 5D, Fig. 5E) podem estar opostos uns aos outros comoimagens invertidas. A Fig. 5F representa uma concretização emque pares de módulos de controle de temperatura estão opostosuns aos outros em um ângulo que difere de 180°.

A Figura 6A representa os resultados de umaAnálise de Elemento Finito (FEA) realizada pelo softwareANSYS, mostrando a uniformidade da temperatura acima dequatro módulos de controle de temperatura com as temperaturasatingidas de 55 0C (direita), 72 0C (cima), 72 0C (esquerda) e 940C (baixo).

A Figura 6B ilustra uma imagem infravermelhada concretização de um aparelho de acordo com a presenteinvenção ilustrada na Fig. 6A, incluindo quatro elementos deaquecimento soldados em uma PCB.

A Figura 6C representa o perfil de temperaturaao longo da linha a...a' na Fig. 6B. A variação de temperaturaacima dos módulos de controle de temperatura está dentro de ±0,5 'C.

A Figura 7 representa um diagrama esquemáticoelétrico de um módulo de controle de temperatura de único canalde um aparelho da invenção. O aquecedor (4) e o sensor (5) fazemparte do módulo de controle de temperatura, ao passo que osoutros dispositivos são colocados na Placa de Circuito Impressa.

A Figura 8 representa um perfil detemperatura/tempo durante a PCR usando o aparelho e método dapresente invenção. São necessários somente 2 segundos para umaredução de temperatura de 94 0C para 54 0C, enquanto que oaquecimento é significativamente mais rápido, pois é controladopor um sistema PID.

A Figura 9 representa o sinal de fluorescênciadetectado a partir de um aparelho da invenção versus o tempodurante um ciclo PCR exemplificativo. Ao subtrair o sinal defluorescência a uma temperatura de 94 °C (segunda seta) do sinala uma temperatura de 72 °C (primeira seta), pontos de dados emtempo real podem ser traçados conforme representado na Fig. 10.

A Figura 10 representa o sinal de fluorescênciadetectado a partir de um aparelho da invenção versus o tempodurante 50 ciclos PCR. Os pontos de dados em tempo real foramobtidos subtraindo-se o sinal de fluorescência a uma temperaturade 94°C (segunda seta na Fig. 9) do sinal a uma temperatura de72°C (primeira seta na Fig. 9). O valor limite de ciclos nopresente exemplo foi de cerca de 25.

A Figura 11 apresenta uma comparação de umgradiente micro PCR usando o aparelho e método da invenção (■,linha em negrito) e os resultados obtidos com um sistemacomercial da MJ Research, Inc. (·, linha fina).

A Figura 12 representa um gráfico do sinal defluorescência normalizado (■) vs. o número de ciclos para 10.000cópias, provido de uma função (linha) sigmóide.

A Figura 13 representa o sinal de fluorescênciade uma análise de curva de fusão e sua aproximação pela funçãosigmóide<formula>formula see original document page 12</formula>

(vide os Exemplos abaixo). Os dados medidos(curva inferior, linha em negrito) e a função sigmóide (curvainferior, linha fina) são indistinguíveis, demonstrando a pureza doproduto obtido da PCR. O valor negativo de sua derivação éilustrado na curva superior.

A Figura 14 representa um perfil de eluição daeletroforese capilar. Os resultados confirmaram a pureza doproduto da PCR.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção oferece um método pararegular a temperatura de uma amostra biológica e/ou química. Ométodo é adequado a qualquer amostra, em especial a umaamostra em forma líquida, como por exemplo, uma gotícula (videabaixo).

A amostra pode ser de qualquer origem. Elapode, por exemplo, mas sem a isto se restringir, ser derivada dehumanos ou animais não humanos, plantas, bactérias, vírus,esporos, fungos ou protozoários, ou de materiais orgânicos ouinorgânicos de origem sintética ou biológica. Logo, qualquer umadas amostras seguintes selecionadas, mas sem se limitar, do grupoconsistindo de amostra de solo, amostra de ar, amostra ambiental,amostra de cultura celular, amostra de medula óssea, amostra deprecipitação pluviométrica, amostra de precipitação radioativa,amostra de água de esgoto, amostra de lençol aquático, amostrade abrasão, amostra arqueológica, amostra alimentícia, amostra desangue, amostra de soro, amostra de plasma, amostra de urina,amostra de fezes, amostra de sêmen, amostra de fluido linfático,amostra de fluido cerebroespinhal, amostra de secreçãonasofaríngea, amostra de escarro, amostra de esfregaço bucal,amostra de esfregaço da garganta, amostra de esfregaço nasal,amostra de lavagem broncoalveolar, amostra de secreçãobrônquica, amostra de leite, amostra de líquido amniótico,amostra de biópsia, amostra de câncer, amostra de tumor, amostrade tecido, amostra de células, amostra de cultura celular, amostrade lisado celular, amostra de cultura viral, amostra ungueal,amostra de cabelo, amostra de pele, amostra forense, amostra deinfecção, amostra de infecção nosocomiai, amostra de produção,amostra de preparação de fármaco, amostra de produção demolécula biológica, amostra de preparação de proteínas, amostrade preparação de lipídeos, amostra de preparação de carboidratos,amostra espacial, amostra extraterrestre ou qualquer combinaçãodos mesmos, pode ser processada no método. Quando desejado,uma respectiva amostra pode ter sido pré-processada a qualquergrau. Como exemplo ilustrativo, uma amostra de tecido pode tersido digerida, homogeneizada ou centrifugada antes de ser usadacom o dispositivo da presente invenção. A amostra pode, alémdisso, ter sido preparada na forma de um fluido, tal como umasolução. Exemplos incluem, sem a isto se restringir: uma soluçãoou pasta semifluida de nucleotídeo, polinucleotídeo, ácidonucléico, peptídeo, polipeptídeo, aminoácido, proteína, polímerosintético, composição bioquímica, composição química orgânica,composição química inorgânica, metal, lipídeo, carboidrato,produto químico combinado, molécula candidata a fármaco,molécula de fármaco, metabólito de fármaco ou qualquercombinação destes. Exemplos adicionais incluem, sem a isto selimitar: suspensão de um metal, suspensão de liga metálica, esolução de um íon metálico ou qualquer combinação destes, bemcomo uma suspensão de uma célula, um vírus, ummicroorganismo, um patógeno, um composto radioativo ou dequaisquer combinações destes. Deve-se entender que umaamostra pode também incluir qualquer combinação dos exemplossupracitados.

Muitas vezes, mas não necessariamente, aamostra incluirá, ou espera-se que a amostra inclua matéria-alvoou um precursor desta. A matéria-alvo pode, por exemplo, seruma célula ou molécula adicionada ou incluída na amostra, e podeser desejado expor a matéria-alvo ao calor. Como outro exemplo,a matéria-alvo pode ser um composto conhecido ou queteoricamente pode ser obtido a partir de um composto precursorpor meio de um processo químico que ocorre ao aumentar atemperatura. Neste caso, a amostra pode, por exemplo, incluiruma solução de tal composto precursor.

A matéria-alvo ou precursor desta pode, assim,ser de qualquer natureza. Exemplos incluem, sem a isto serestringir: um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, umpolinucleotídeo, um ácido nucléico, um peptídeo, umpolipeptídeo, um aminoácido, uma proteína, um polímerosintético, uma composição bioquímica, uma composição químicaorgânica, uma composição química inorgânica, um lipídeo, umcarboidrato, um produto químico combinatório, uma moléculacandidata a fármaco, uma molécula de fármaco, um metabólito defármaco, uma célula, um vírus, um microorganismo ou qualquercombinação entre eles. Nas concretizações em que a matéria-alvoé, por exemplo, uma proteína, um polipeptídeo, um peptídeo, umácido nucléico, um polinucleotídeo ou um oligonucleotídeo, elapode conter uma marca de afinidade. Exemplos de marcas deafinidade incluem, sem a isto se limitar, dinitrofenol oudigoxigenina. Quando a matéria-alvo é uma proteína, umpolipeptídeo ou um peptídeo, exemplos adicionais de marca deafinidade incluem, mas sem a isto se limitar: oligohistidina,polihistidina, domínio da imunoglobulina, proteína de ligação àmaltose, glutationa-S-transferase (GST), peptídeo de ligação àcalmodulina (CBP)5 peptídeo FLAG, o epítopo T7 (Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly), proteína de ligação à maltose(MBP), o epítopo HSV da seqüência Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp da glicoproteína D do vírus da herpessimples, o epítopo da hemaglutinina (HA) da seqüência Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala e o epítopo "myc" do fator detranscrição c-myc da seqüência Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu. Quando a matéria-alvo é um ácido nucléico, umpolinucleotídeo ou um oligonucleotídeo, uma marca de afinidadepode também ser uma marca de oligonucleotídeo. Tal marca deoligonucleotídeo pode, por exemplo, ser utilizada para hibridizar-se em um oligonucleotídeo imobilizado com uma seqüênciacomplementar. Uma respectiva marca de afinidade pode estarlocalizada dentro ou ligada a qualquer parte da matéria-alvo.Como exemplo ilustrativo, ela pode ser operavelmente fusionadaao terminal amino ou ao terminal carboxi de qualquer uma dasproteínas exemplificativas supramencionadas.

O aparelho da invenção inclui pelo menos ummódulo de controle de temperatura. Em algumas concretizações,o aparelho inclui pelo menos dois módulos de controle detemperatura. Em concretizações ainda adicionais, o aparelhoinclui vários módulos de controle de temperatura. Quando oaparelho inclui mais de um módulo de controle de temperatura,eles geralmente estão termicamente isolados uns dos outros. Talisolamento pode ser obtido separando os módulos de controle detemperatura por um material mal condutor de calor, como porexemplo, plástico, madeira, vidro, quartzo, água, ar ou cerâmica.

Em algumas concretizações, o isolamento térmico por meio do arpode ser vantajoso, uma vez que se torna possível evitar aintrodução de um material adicional no aparelho. Quandodesejado, o aparelho pode incluir meios adicionais de controle datemperatura, tal como um módulo de resfriamento. Além disso,ou como alternativa, o módulo de controle de temperatura podeincluir um resfriador, que é adaptado, por exemplo, para ser capazde se comunicar termicamente com o condutor de calor. Emmuitas concretizações, quando é desejado manipular uma amostrasob valores de temperatura próximos ou acima à temperaturaambiente, o resfriamento da amostra a partir de um valor detemperatura maior para um menor, por exemplo, de 94 °C para 55°C, pode ser realizado de maneira conveniente sem um resfriador.O aparelho da invenção pode ser facilmente projetado parapermitir a emissão de calor a partir do condutor de calor e aamostra que possibilita rápidas taxas de resfriamento (vide, porexemplo, a Fig. 8).

O módulo de controle de temperatura - ou pelomenos um dos módulos de controle de temperatura dentre vários,e, em algumas concretizações, cada um desses módulos decontrole de temperatura -se baseia em um sistema deaquecimento direto que inclui um aquecedor e um sensor detemperatura. Ele inclui ainda um condutor de calor. O aquecedoré adaptado para se comunicar termicamente com o condutor decalor, estando assim apto a aquecer o condutor de calor. Comoexemplo ilustrativo, o aquecedor pode entrar em contato com ocondutor de calor. Sob controle do sensor de temperatura, oaquecedor está, dessa forma, apto a aquecer o condutor de caloraté a temperatura desejada e/ou manter o condutor de calor em umvalor de temperatura desejado. Como também foi explicadoabaixo, uma redução do valor de temperatura ao qual o aquecedorirá aquecer o condutor de calor geralmente resulta efetivamentena redução da temperatura do mesmo, e pode ser definida como"resfriamento". Normalmente, o sensor de temperatura éconfigurado para ser capaz de se comunicar com o condutor decalor, por exemplo, via contato direto. O condutor de calor podeser de qualquer material capaz de conduzir calor. O condutor decalor pode incluir, por exemplo, um metal, um semicondutor, umdiamante, um nanotubo de carbono ou um composto de fulereno.Exemplos de metais adequados incluem, mas sem a isto selimitar, prata, cobre, alumínio, zinco, ouro, titânio, ferro, chumbo,níquel, irídio e cádmio. Dois exemplos ilustrativos desemicondutores adequados são o silício e o germânio. A prata e osilício são dois exemplos típicos de um condutor de calor comcondutividade de 410 Wm-lK'1 e 157 Wm" 1K"1, respectivamente.

O aquecedor, o sensor e o condutor de calorpodem ter qualquer formato e serem dispostos em qualquerorientação em relação uns aos outros. Em algumasconcretizações, o aquecedor e o condutor são dispostos na mesmasuperfície do condutor de calor (vide também abaixo). Emalgumas dessas concretizações, o aquecedor e o sensor sãodispostos diretamente adjacente um ao outro.

O aparelho da invenção também é capaz deacomodar um substrato removível. Assim que um respectivosubstrato é colocado sobre o aparelho da invenção, o aparelhopode então ser usado, por exemplo, como uma incubadora. Comoexplicado abaixo, o aparelho também pode ser usado como umreator. O substrato, que o aparelho da invenção é adaptado paraser capaz de acomodar, pode ser de qualquer material desejado.Geralmente, o material é capaz de conduzir calor até pelo menoscerto grau. Exemplos incluem, mas sem a isto se limitar, silício,vidro e plástico. Também pode ser desejado escolher o substratode forma a ser de um material que não sofra uma reaçãoindesejada com a amostra. De modo similar, pode ser desejadoescolher o substrato de modo a ser de um material que nãointerfira, retarde ou impeça uma reação que deseja que se ocorrana ou com a mostra. Como exemplo ilustrativo, o silício (mas nãoo óxido de silício ou o oxinitreto de silício) é conhecido por inibira reação PCR. O substrato pode ter qualquer forma e geometria,contanto que possa ser acomodado pelo aparelho da invenção. Elepode ser, por exemplo, côncavo ou convexo arredondado. Emuma concretização, a pelo menos uma superfície é essencialmenteplana. Quando desejado, o substrato pode incluir uma cavidade.

Tal cavidade pode ser obtida, por exemplo, por meio de corrosãoou perfuração a laser. Em algumas concretizações, o substratotambém pode ser acomodado em uma cavidade do aparelho.

Pode ser desejado selecionar o material e/ouforma do substrato de modo a realizar um processo desejado ouimpedir que ocorram reações indesejadas. Em algumasconcretizações, pode ser desejado, por exemplo, selecionar ummaterial que auxilie a espalhar a amostra para proporcionar omáximo de contato com a superfície e aquecimento rápido. Emoutras concretizações, pode ser desejado proporcionar, porexemplo, baixa molhabilidade para a amostra com o intuito deimpedir a evaporação do líquido. O substrato pode, em algumasconcretizações, proporcionar uma superfície suja composiçãodifere da composição material do substrato remanescente. Emalgumas concretizações, a superfície do substrato pode sermodificada. Quando, por exemplo, a amostra é, ou está incluídaem, um líquido hidrófilo, tal como um líquido aquoso, o substratopode ser hidrófobo ou oleofóbico quando for desejado minimizaro espalhamento e a evaporação. Um respectivo substratohidrófobo pode, em algumas concretizações, ser selecionadodentre o grupo que consiste de silicone, plástico, vidro modificadona superfície, quartzo modificado na superfície, metal modificadona superfície e seus compostos.

Uma modificação de superfície é tipicamenteobtida por um tratamento realizado para alterar as característicasde uma superfície sólida. Tal tratamento pode incluir váriosmeios, como mecânicos, térmicos, elétricos ou químicos. Comoexemplo, uma superfície de materiais plásticos pode sertransformada em hidrófíla pelo tratamento com ácido clorídricodiluído ou ácido nítrico diluído. Como outro exemplo, umasuperfície de polidimetilsiloxano (PDMS) pode transformada emhidrófíla por oxidação com oxigênio ou plasma de ar. A superfíciede um polímero hidrófobo, tal como polimetilmetacrilato,politetrafluoretileno, tereftalato de polietileno e policarbonato,também pode ser transformada em hidrófíla por meio de radiaçãoiônica na presença de um gás reativo, conforme descrito por Kime col. (2003 ECI Conference on Heat Exchanger Fouling andCleaning: Fundamentais and Applications [2003], Vol. RP1, 1 ΟΤ-114). O silício pode ser transformado em hidrófilo por imersãoem H2OZH2O2ZNH4OH. Além disso, as propriedades de superfíciede qualquer superfície hidrófoba podem ser transformadas emhidrófilas por revestimento com um polímero hidrófílo ou portratamento com surfactantes. Exemplos de tratamento químico desuperfície incluem, mas sem a isto se limitar, exposição ou reaçãocom hexametildisilazano, trimetilclorosilano,dimetildiclorosilano, propiltriclorosilano, tetraetoxisilano,glicidoxipropiltrimetóxi silano, 3-aminopropiltrietoxisilano, 2-(3,4-epoxi ciclohexil)etiltrimetoxisilano, 3-(2,3-epoxipropoxil)propiltrimetoxisilano, polidimetilsiloxano (PDMS), γ-(3,4-epoxiciclohexil)etiltrimetoxisilano, poli(metil metacrilato) ouum copolímero de polimetacrilato, uretano, poliuretano,fluorpoliacrilato, poli(metoxi polietileno glicol metacrilato),poli(dimetil acrilamida), poli[N-(2-hidroxipropil)metacrilamida](PHPMA), a-fosforilcolina-o-(N,N-dietilditiocarbamil)undeciloligoDMAAm-oligo-STblock co-oligômero (vide, por exemplo,Matsuda, T e col., Biomaterials, (2003), 24, 4517-4527), poli(3,4-epoxi-l-buteno), 3,4-epoxi-ciclohexilmetilmetacrilato, 2,2-bis[4-(2,3-epóxi propóxi) fenil] propano, 3,4-epoxi-ciclohexilmetilacrilato, (3',4'-epoxiciclohexilmetil)-3,4-epoxiciclohexil carboxilato, di-(3,4-epoxiciclohexilmetil)adipato,bisfenol A (2,2-bis-(p-(2,3-epóxi propóxi) fenil) propano) ou 2,3-epóxi-l-propanol.

Sobre o substrato, a amostra química e/oubiológica é colocada. Quando o material selecionado do substratoé um condutor relativamente mal de calor (incluindo um materialcom propriedades bastante isolantes), o substrato pode ser depequena espessura. Como dois exemplos ilustrativos, uma tiraestreita de vidro ou um bloco fino de borracha de silicone podeser utilizado. As Figuras 3A e 3B ilustram dois exemplosilustrativos de um substrato fino removível. O substratoremovível é capaz de se comunicar termicamente com o condutorde calor, uma vez colocado sobre o aparelho da invenção. Oaquecedor é adaptado para se comunicar termicamente com osubstrato via o condutor de calor. De modo similar, o sensor detemperatura é adaptado para detectar e controlar a temperatura dosubstrato via o condutor de calor. Portanto, sob controle do sensorde temperatura, o aquecedor é capaz de aquecer o substrato até atemperatura desejada e/ou manter o substrato em um valor detemperatura desejado. Em concretizações como as representadasnas Figuras 3A e 3B, um substrato de vidro ou borracha éadequado para transferir o calor do condutor de calor para aamostra, ainda que seja mal condutor de calor. Em algumasconcretizações, a escolha de um substrato de baixa condutividadetérmica pode ser até mesmo vantajosa, uma vez que isso podefornecer um meio adicional de se isolar termicamente umelemento de controle de temperatura de outro, além, por exemplo,de um isolamento térmico.

O aparelho da invenção é projetado de tal formaque o substrato removível fique situado acima do módulo decontrole de temperatura. Os termos "acima" e "abaixo", conformeutilizados no presente documento, referem-se a uma posição, emque o aparelho da presente invenção é mantido de tal forma que osubstrato possa ser colocado sobre o aparelho, e após ter sidocolocado sobre ele, possa ser mantido somente pela força dagravidade. Nesta posição, o aparelho pode normalmente sercolocado sobre uma superfície plana. Em algumas concretizações,nesta posição, o aquecedor está localizado abaixo do condutor decalor. Em algumas concretizações, tanto o aquecedor quanto osensor estão localizados abaixo do condutor de calor.

Em algumas concretizações, o aquecedor incluiuma superfície que é disposta de forma essencialmente paralela aoplano do substrato removível, plano do substrato este sobre o qualé colocada a amostra. Em algumas concretizações, o aquecedorinclui uma superfície que é disposta de forma essencialmenteparalela ao plano do substrato, plano do substrato este sobre oqual é colocada a amostra. Em algumas concretizações, tanto oaquecedor quanto o sensor incluem uma superfície que é dispostade forma essencialmente paralela ao plano do substrato, plano dosubstrato este sobre o qual é colocada a amostra. Em algumasdessas concretizações, o aquecedor e o sensor compreendem umasuperfície disposta em um plano comum. Esse plano comum é,dessa forma, essencialmente paralelo ao plano do substrato, planodo substrato este sobre o qual é colocada a amostra. Em qualqueruma dessas concretizações, o aquecedor, o sensor, ou ambospodem ser localizados abaixo do condutor de calor.

Em qualquer uma dessas concretizações, emespecial quando o aquecedor e o sensor compreendem umasuperfície disposta em um plano comum, o aquecedor ou o sensorpodem ser concêntricos. Em algumas concretizações, tanto oaquecedor quanto o sensor são concêntricos. Um ou os dois, oupartes deles, podem, por exemplo, ter a forma de um círculovazado, um retângulo vazado, um triângulo vazado, um quadradovazado ou qualquer forma vazada (vide, por exemplo, a Fig. 5para exemplos). Módulos de controle de temperatura que contêmelementos de forma quadrada foram revelados, por exemplo, porGuttenberg e col. (vide abaixo). Em uma dessas concretizações,tanto o aquecedor quanto o sensor são concêntricos e o aquecedorcircunda o sensor. Em outra concretização, tanto o aquecedorquanto o sensor são concêntricos e o sensor circunda o aquecedor.Em uma concretização, que é representada em uma seçãotransversal na Fig. 3B, tanto o aquecedor quanto o sensor sãoconcêntricos e dispostos sob um condutor de calor concêntrico.Deve-se observar que, na concretização ilustrada, o aquecedor, osensor e o condutor de calor incluem uma área central vazada,fazendo com que cada um eles apareça como respectivos pares.

Em algumas concretizações, o condutor decalor, ou uma parte dele, tem uma forma adaptada paracorresponder à forma do sensor e/ou do aquecedor. Quando osensor e o aquecedor são, por exemplo, em uma forma quadradaou redonda concêntrica com um centro vazado, o condutor decalor pode possuir uma forma quadrada ou redonda concêntricacorrespondente com um centro vazado. Quando uma parte docondutor de calor é adaptada para corresponder à forma do sensore/ou do aquecedor, ele pode incluir outras partes adicionais comqualquer forma desejada. Como exemplo ilustrativo, ele podeincluir uma parte em forma de haste. Quando, por exemplo, aparte do condutor de calor, que é adaptada para corresponder àforma do sensor e/ou do aquecedor, é de perfil circular, ocondutor de calor pode ser na forma de anel. A Fig. 4 representauma concretização exemplificativa, na qual o condutor de calorinclui duas partes concêntricas, que são conectadas por umaponte. A parte interna dessas partes concêntricas está em contatodireto com um sensor concêntrico e um aquecedor concêntrico, oúltimo circundando o sensor. O condutor de calor inclui aindauma parte em forma de haste. Assim, ele tem a forma de anelduplo. A condutância térmica é dada pelo material do condutor decalor, pelo tamanho da parte em forma de haste e pela seçãotransversal das partes concêntricas. A capacitância térmica é dadapelo volume do anel duplo (vide a Fig. 4) com o volume daamostra.

Nas concretizações em que o aparelho incluimais de um módulo de controle de temperatura, cada um dosmódulos de controle de temperatura pode incluir uma superfíciedisposta em um plano comum. Esse plano comum pode seressencialmente paralelo ao plano do substrato, plano do substratoeste sobre o qual é colocada a amostra. Em algumas dessasconcretizações, principalmente quando os elementos deaquecimento são de dimensões idênticas, os módulos de controlede temperatura como um todo também podem ser configuradospara serem localizados em um plano comum. Em qualquer umadessas concretizações - por exemplo, quando pelo menos doismódulos de controle de temperatura incluem uma superfíciedisposta em um plano comum - os módulos de controle detemperatura podem estar defronte um ao outro no respectivoplano, por exemplo, o plano que é essencialmente paralelo aoplano do substrato. Como ilustrado na Fig. 5, o aparelho podeincluir, por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou mais pares demódulos de controle de temperatura. Os dois módulos de controlede temperatura de cada par podem se defrontar no plano que éessencialmente paralelo ao respectivo plano do substrato (isto é, oplano sobre o qual a amostra é colocada). Um exemplo de umarespectiva disposição é representado, por exemplo, na Fig. 2 (videtambém a Fig. 5). A Fig. 1 representa uma disposiçãocorrespondente com uma lâmina de cobertura de vidro comosubstrato e amostras colocadas sobre ela. As amostrasapresentadas na Figura 1 são gotículas à base de água, cada umacom um volume de 1 μl e colocadas diretamente acima dosmódulos de controle de temperatura, que estão localizados nooutro lado do substrato. As gotículas de água na concretizaçãoilustrada são cobertas com 5 μΐ de óleo mineral. Como ilustrado,por exemplo, na Fig. 5E e Fig. 5F, os elementos de controle detemperatura podem ser dispostos em uma fileira, análoga, porexemplo, à disposição dos poços em uma placa multipoços.

Várias fileiras como essa podem ser combinadas para obter umaparelho com, por exemplo, 32, 48 ou 96 elementos de controlede temperatura separadamente controláveis. Logo, o aparelho dapresente invenção pode ser utilizado para realizar reaçõesbiológicas e/ou químicas separadas (vide também abaixo) em umformato multipoços, dessa forma promovendo avançossignificativos no estado atual da técnica, que permite apenas aaplicação de um perfil de temperatura comum a todas as amostrasde um ensaio de multiplexação.

O aparelho da presente invenção é tambémprojetado de tal forma que o substrato removível cubrainteiramente o módulo de controle de temperatura. Nasconcretizações em que o aparelho inclui mais de um módulo decontrole de temperatura, o substrato removível pode cobririnteiramente todos os módulos de controle de temperatura doaparelho.

A presente invenção também oferece ummétodo para regular a temperatura de uma amostra química e/oubiológica, por exemplo, uma amostra incluída em uma gotícula delíquido. O método inclui proporcionar um aparelho conformedescrito acima. O método adicionalmente inclui proporcionar umvalor de temperatura predefínido para aquecer a amostra químicae/ou biológica. Esse valor de temperatura pode, por exemplo, serarmazenado em um dispositivo externo em comunicação com oaquecedor. O método também inclui medir a temperatura docondutor de calor por meio do sensor de temperatura. O valor detemperatura medido pode, por exemplo, ser transmitido a umdispositivo externo, em que a temperatura medida é comparadacom o valor de temperatura predefinido. Além disso, o métodoinclui aplicar calor ao condutor de calor, contanto que atemperatura medida esteja abaixo do valor de temperaturafornecido, por meio do aquecedor. Dessa forma, o substrato e aamostra química e/ou biológica são aquecidos.

Além do mais, mais de um valor de temperaturapredefinido pode ser selecionado e um período de tempo pode serassociado a cada um dos respectivos valores de temperatura.Sendo assim, um cronograma com intervalos predefinidos deaquecimento e sem aquecimento de qualquer duração desejadapode ser definido com antecedência e ser posteriormenterealizado usando o método da invenção. Como exemploilustrativo, um processo de ciclagem PCR conforme ilustradoacima (vide também os exemplos abaixo) pode ser realizadousando o método da presente invenção (vide também a Fig. 8).Deve-se entender que um intervalo também pode ser selecionado,durante o qual a temperatura aumenta ou diminuirgradativamente. Isso pode ser obtido, por exemplo, aumentandoou diminuindo gradativamente o valor de temperatura predefinido(e por conseqüência, o aquecimento que irá ocorrer) com o passardo tempo.

Como indicado acima, em algumasconcretizações, o aparelho da invenção inclui mais de um módulode controle de temperatura. Logo, um respectivo aparelho podeser usado no método da invenção. Em algumas dessasconcretizações, os módulos de controle de temperatura doaparelho são termicamente isolados uns dos outros (vide acima).Em tais concretizações, valores de temperatura individuais podemser fornecidos para aquecer a amostra química e/ou biológica emum respectivo módulo de controle de temperatura do aparelho.Logo, o método da invenção pode incluir, em tais concretizações,proporcionar um valor de temperatura individual para cadamódulo de controle de temperatura. Como explicado acima, essevalor de temperatura é geralmente definido para aquecer umaamostra química e/ou biológica, que pode ser colocada sobre umsubstrato acima do respectivo módulo de controle de temperatura.Assim, várias amostras podem ser selecionadas para seremaquecidas de forma independente, simultânea ou em intervalos detempo coincidentes usando o mesmo aparelho. Para qualquerquantidade desejada dessas amostras, por exemplo, para toda equalquer amostra, pode ser então proporcionado um respectivoconjunto de intervalos de aquecimento e/ou sem aquecimento.

Nas concretizações em que é utilizado umaparelho que inclui pelo menos dois módulos de controle detemperatura, termicamente isolados um do outro, a temperaturado condutor de calor de cada módulo de controle de temperaturapode também ser medida individualmente. Essa medição égeralmente realizada por meio do sensor de temperatura dorespectivo módulo de controle de temperatura. Em taisconcretizações, o método da invenção também pode incluiraplicar individualmente calor ao condutor de calor de cadamódulo de controle de temperatura, contanto que a temperaturamedida esteja abaixo do valor de temperatura fornecido. Dessaforma, cada substrato, e como conseqüência, uma amostraquímica e/ou biológica colocada sobre ele, é aquecidoindividualmente.

Sendo assim, para cada módulo de controle detemperatura, mais de um valor de temperatura predefínido podeser selecionado, independente de qualquer outro módulo decontrole de temperatura, e um período de tempo individual podeser associado a cada um dos respectivos valores de temperaturaem cada módulo de controle de temperatura. Sendo assim, umcronograma individual com intervalos predefínidos deaquecimento e sem aquecimento de qualquer duração desejadapode ser realizado em cada módulo de controle de temperaturausando o método da invenção. Como exemplo ilustrativo,processos de ciclagem PCR independentes podem ser realizadosem vários módulos de controle de temperatura no mesmoaparelho.

Em algumas concretizações, o método dainvenção proporcionando o aparelho inclui proporcionar umsubstrato. O substrato, que pode ser acomodado pelo aparelho(supra), é disposto acima do módulo de controle de temperatura,de modo a cobri-lo totalmente. A etapa de proporcionar oaparelho também pode incluir proporcionar uma amostra químicae/ou biológica e dispô-la sobre o substrato. A amostra pode serproporcionada por qualquer meio. Como exemplo ilustrativo,quando a amostra é uma gotícula de líquido, ela pode serdispensada sobre o substrato por uma pipeta ou por umdispensador automático.

Como indicado acima, a amostra pode ser umagotícula de líquido ou pode estar incluída nela. Em algumasconcretizações, o método da invenção inclui proporcionar umarespectiva gotícula de líquido. A gotícula de líquido pode ser dequalquer volume desejado, contanto que possa ser colocada sobreo substrato. Logo, os módulos de aquecimento podem serselecionados de modo a terem um tamanho correspondente. Ummódulo de controle de temperatura projetado para aquecer umagotícula de líquido pode, por exemplo, ter a dimensão de algunsmilímetros ou na micro ou nanoescala. Quando desejado, oaparelho da invenção, mesmo nas concretizações em que eleinclui uma grande quantidade de módulos de controle detemperatura, pode então ser um aparelho portátil.

A gotícula de líquido pode incluir outra matéria,como por exemplo, matéria que pode ser atraída magneticamente.Como exemplo ilustrativo, em algumas concretizações, aspartículas que podem ser atraídas magneticamente podem serincluídas na gotícula de líquido. Tais partículas podem sercapazes de atrair a matéria-alvo. Em algumas concretizações, aspartículas magnéticas podem ser funcionalizadas com afinidadeespecífica pela matéria-alvo e capturar a matéria-alvo, agindo,portanto, como meios de ligação.

Em algumas concretizações, a gotícula delíquido inclui uma fase interna e uma fase externa, em que a faseexterna está, por exemplo, circundando a fase interna como umapelícula. Tipicamente, em tais concretizações, o líquido da faseexterna é imiscível com o líquido da fase interna. Qualquerlíquido pode ser usado para a respectiva fase. Quando umagotícula contém duas fases imiscíveis, uma fase é geralmenteformada por um líquido polar (como por exemplo, água, etanol,acetona, Ν,Ν-dimetil-formamida ou nitrometano), enquanto que aoutra fase é formada por um líquido apoiar (como por exemplo,benzeno, hexano, dioxano, tetrahidrofurano ou éter dietílico).

A amostra pode ser misturada com matériaadicional, por exemplo, dissolvida ou suspensa nela, ouproporcionada junto com ela, por exemplo, no mesmo líquido.Como exemplo ilustrativo, uma amostra aquosa pode incluir umou mais compostos tampão. Diversos compostos tampão sãousados na técnica e podem ser usados para realizar os váriosprocessos descritos neste documento. Exemplos de tampõesincluem, mas sem a isto se limitar, soluções de sais de fosfato,carbonato, sucinato, carbonato, citrato, acetato, formato,barbiturato, oxalato, lactato, ftalato, maleato, cacodilato, borato,N-(2-acetamido)-2-amino-etanesulfonato (também chamado de(ACES), ácido N-(2-hidroxietil)-piperazina-N'-2-etanosulfônico(também chamado de HEPES), ácido 4-(2-hidroxietil)-l-piperazina-propanosulfônico (também chamado de HEPPS),piperazina-l,4-bis(2-ácido etanosulfônico) (também chamada dePIPES), ácido (2-[Tris(hidroximetil)-metilamino]-l-etansulfônico(também chamado de TES), ácido 2-ciclohexilamino-etansulfônico (também chamado de CHES) e N-(2-acetamido)-iminodiacetato (também chamado de ADA). Qualquer contra-íonpode ser utilizado nesses sais; amônio, sódio, e potássio podemservir de exemplos ilustrativos. Outros exemplos de tampõesincluem, mas sem a isto se limitar, trietanolamina, dietanolamina,etilamina, trietilamina, glicina, glicilglicina, gistidina,tris(hidroximetil)aminomeanol (também chamado de TRIS), bis-(2-hidroxietil)-imino-tris(hidroximetil)metanol (também chamadode BIS-TRIS) e N-[Tris(hidroximetil)-metil]-glicina (tambémchamado de TRICINE), para citar alguns. Os tampões podem sersoluções aquosas de tais compostos ou soluções tampão em umsolvente orgânico polar adequado.

Outros exemplos de matéria incluída em umaamostra, por exemplo, em uma fase da gotícula de líquidoincluem, mas sem a isto se limitar, reagentes, catalisadores ereagentes, para realizar um processo químico ou biológico. Comoexemplo ilustrativo, sais, substratos ou detergentes podem seradicionados a fim de manter as células ou proteínas num estadointacto. Como exemplo ilustrativo adicional, compostos quelantespodem ser necessários, por exemplo, para proteger os organismoscontra vestígios de sais tóxicos ou para aumentar o rendimento deuma reação química. Como ainda outro exemplo ilustrativo,inibidores da protease podem precisar ser adicionados de modo amanter as proteínas no estado intacto. Um exemplo adicional deum possível aditivo para uma amostra inclui partículas que podemser atraídas magneticamente (vide acima). Entende-se pelo que foidito acima que tal matéria adicional pode ser incluída em umagotícula de líquido. Quando a gotícula de líquido inclui mais deuma fase, tal matéria pode, por exemplo, ser incluída na mesmafase como a amostra ou em uma fase diferente.

O aquecimento da amostra biológica pode, emalgumas concretizações, iniciar, retomar ou provocar umaaceleração de um processo na mesma. Portanto, o método deaquecer a respectiva amostra inclui, em algumas concretizações,realizar um processo biológico e/ou químico. Um exemploilustrativo de um respectivo processo é uma reação química.Exemplos de reações químicas incluem, mas sem a isto se limitar,uma síntese química, uma degradação química, uma sínteseenzimática, uma degradação enzimática, uma modificaçãoquímica, uma modificação enzimática, uma interação com umamolécula de ligação e qualquer combinação destas. Exemplos desíntese enzimática incluem, mas sem a isto se limitar, uma sínteseprotéica, um ácido nucléico, síntese, uma síntese de peptídeo, umasíntese de um composto farmacêutico e qualquer combinaçãodestes. Dispositivos adicionais também podem ser utilizados paraauxiliar ou monitorar o processo. Além disso, a implementação dediversos sistemas de detecção óptica, por exemplo, fotodiodos(PD), tubos fotomultiplicadores (PMT), módulos de contagem defótons (PCM), espectrômetros e dispositivos de cargaemparelhada (CCDs), por exemplo, permite o monitoramentodessas reações bioquímicas em paralelo e em tempo real.Como exemplo ilustrativo, a amostra podeincluir uma molécula de ácido nucléico e o aquecimento daamostra química e/ou biológica pode incluir a reação em cadeiada polimerase ("PCR", vide também acima). A detecção emtempo real fornece um gráfico de amplificação representando osinal de fluorescência versus o tempo de reação expresso emnúmeros de ciclos (vide Fig. 12). Um aumento na fluorescênciaacima da linha de base indica a detecção do produto deamplificação acumulativo. Quando um limiar de fluorescênciafixo é definido acima da linha de base, o sinal de fluorescênciapassa então esse limiar em um determinado momento. Uma vezque o tempo é expresso em termos de números de ciclos, obtém-se o chamado número (ou valor) limiar de ciclos (CT). Quantomenor esse número, mais à esquerda estará uma respectiva curvade fluorescência localizada no gráfico de amplificação e quecorresponde à concentração maior do modelo inicial. O númeroCx maior corresponde à concentração inferior do modelo inicial.

O termo "molécula de ácido nucléico",conforme utilizado neste documento, refere-se a qualquer ácidonucléico em qualquer configuração possível, tal como de fitaúnica, de fita dupla ou uma combinação desses. Os ácidosnucléicos incluem, por exemplo, moléculas de DNA (porexemplo, cDNA ou DNA genômico), moléculas de RNA (porexemplo, mRNA), análogos do DNA ou RNA gerados usandoanálogos de nucleotídeo ou usando a química do ácido nucléico, ePNA (ácidos nucléicos de proteína). O DNA ou RNA podem serde origem sintética ou genômica e podem ser de fita única oudupla. No presente método da invenção, geralmente, mas nãonecessariamente, utiliza-se uma molécula de RNA ou de DNA.Tal ácido nucléico pode ser, por exemplo, mRNA, cRNA, RNAsintético, DNA genômico, DNA sintético do cDNA, copolímerodo DNA e do RNA, oligonucleotídeos, etc. Um respectivo ácidonucléico pode conter também análogos de nucleotídeo nãonaturais e/ou ser ligado a uma marca ou rótulo de afinidade (videacima).

Muitos análogos de nucleotídeo são conhecidose podem ser utilizados nos ácidos nucléicos e oligonucleotídeosutilizados no presente método da invenção. O análogo denucleotídeo é um nucleotídeo contendo uma modificação, porexemplo, nas metades da base, açúcar ou fosfato. Como exemploilustrativo, a substituição dos resíduos 2'-OH do siRNA pelosresíduos 2'F, 2'0-Me ou 2Ή é conhecida por aprimorar aestabilidade in vivo do respectivo RNA. Modificações na metadeda base incluem modificações naturais e sintéticas de A, C, G eT/U, diferentes bases de purina ou pirimidina, como uracil-5-ila,hipoxantin-9-ila, e 2-aminoadenin-9-ila, bem como outras basesde nucleotídeo além de purina ou pirimidina. Outros análogos denucleotídeo servem de bases universais. As bases universaisincluem 3-nitropirrol e 5-nitroindol. As bases universais sãocapazes de formar um par de bases com qualquer outra base. Asmodificações de base geralmente podem ser combinadas, porexemplo, com uma modificação de açúcar, como por exemplo, 2'-O-metoxietila, por exemplo, para obter propriedades únicas, comomaior estabilidade de duplex.

O aparelho e método da invenção podem, emalgumas concretizações, ser usados para determinar a estabilidadetérmica da matéria-alvo ou a estabilidade térmica de umcomplexo de ligação entre a matéria-alvo e outra matéria.

O método da invenção pode ser combinado comtais métodos analíticos e preparativos, como por exemplo,focalização isoelétrica, métodos de cromatografia, métodoseletrocromatográficos, de cromatografia eletrocinética eeletroforéticos. Exemplos de métodos eletroforéticos incluem, porexemplo, a Eletroforese de Fluxo Livre (FFE), a eletroforese emgel de Poliacrilamida (PAGE), a Eletroforese em Gel Capilar ouZona Capilar. A combinação com tais métodos pode incluir umsubstrato comum. Como exemplo, uma separação das proteínaspode ser realizada em uma superfície pequena, tal como ummicrochip, por exemplo, por focalização isoelétrica. A respectivasuperfície pode então ser aquecida usando o aparelho e método dapresente invenção, por exemplo, para realizar uma reação químicae/ou biológica.

Para que a invenção seja facilmente entendida ecolocada em prática, concretizações específicas serão descritas aseguir na forma dos exemplos não restritivos seguintes.

EXEMPLOS

Análise de Elemento FinitoUma estrutura de anel simples consistindo dequatro aquecedores, cada um deles conectado por uma viga aosubstrato, bem como uma forma de anel duplo com o aquecedor esensor localizada no anel interno (Fig. 4), foram modelados pelosoftware FEA (Finite Element Analysis - Análise de ElementoFinito), ANSYS, versão 9.0. Elementos SHELL-57 comconstantes reais de 450 μm para silício e 170 μm para vidro foramutilizados. As condições limite típicas para o modelo foramestabelecidas no perímetro do chip como 25 °C e a amplitudeadequada do fluxo de calor foi dissipada em todas as quatroformas de anel para estabelecer suas temperaturas em 94 °C, 72°Ce 55°C.

Para a estrutura de anel simples, o maiorgradiente térmico foi constatado como sendo ao longo do eixogeométrico da viga. Também havia um gradiente térmico aolongo da forma de anel causando uma irregularidade detemperatura relativamente alta de 1°C dentro da região deinteresse.

Os dois anéis da forma de anel duplo sãoconectados por duas vigas com condutividades térmicas iguais apelo menos metade da do anel interno. Isso resulta nauniformidade da temperatura dentro do anel interno. Os resultadosde simulação de uma estrutura de anel duplo são apresentados naFig. 6, demonstrando a uniformidade de temperatura atingida. Ocalor foi dissipado quase que totalmente via os cantilévers,confirmando nossa expectativa de que a interferência entre asregiões será mínima. Esse projeto permite controlar a temperaturade controle de todas as quatro áreas de forma independente umadas outras, sendo assim, poderíamos realizar quatro protocolosPCR diferentes simultaneamente. O chip utilizado para obter oaparelho foi projetado com uma configuração de bloco de ligaçãoidêntico a um soquete LCC-68 padrão, de modo que ele pudesseser fixado em um soquete de teste convencional para determinaros parâmetros térmicos do dispositivo. Uma vez que a espessurado nosso dispositivo era de apenas 0,45 mm, comparado ao chipLCC padrão, que tem uma espessura de cerca de 3mm, umaestrutura de plástico foi adicionada sobre o chip para compensarsua espessura menor de maneira a obter uma conexão elétricasatisfatória.

Fabricação

O substrato básico para a fabricação dodispositivo foi uma pastilha de silício convencional de 4".

Uma camada de 1 μηι de óxido de silício foidepositada por Deposição Química na Fase Vapor Assistida porPlasma (PECVD). O filme de SiO2 serve de isolador elétrico entreo silício e a película de metal subseqüente. Uma camada de ourode 250 nm com uma camada fina de adesão de cromo foidepositada por evaporação por feixe de elétrons com umaresistência de folha total de 0,11 Ω/D. A camada de Au/Cr foigravada litograficamente usando um fotorresiste positivo AZ7220 de 2 μηι de espessura para formar o aquecedor, o sensor, assaídas de conduto elétrico e as ilhas de contato.Ambos os metais foram gravados por soluçõesconvencionais de corrosão: ouro por KI/I2 e cromo por soluçõesbaseadas em (NH4)2Ce(NO3)6. Após a corrosão do "sanduíche" demetal, o fotorresiste foi removido por acetona e a segunda etapade litografia foi realizada usando o fotorresiste AZ4620 de 10 μηιde espessura. O fotorresiste espesso foi escolhido para servir demáscara para a corrosão de silício por Corrosão Iônica ReativaProfunda (DRIE) através de toda a espessura da pastilha desilício. Além de impedir que o silício seja corroído pela DRIE, ofotorresiste também protege as linhas douradas. O óxido de silíciofoi primeiro corroído por Ataque Químico de Óxido Tamponado(BOE) 7:1 para expor o silício nu, seguido da DRIE (processo deBosch, vide, por exemplo, a patente US 5498312). Uma vez queas linhas de corte do chip também foram gravadas, o processoDRIE produziu chips individuais e eliminou a necessidade dedivisão das estruturas MEMS relativamente frágeis. A últimaetapa do processo foi a limpeza de chip individual por soluçãoPiranha (H2SO4ZH2O2), enxágüe por água deionizada (DI) esecagem por meio de um fluxo de gás nitrogênio.

Caracterização do Aparelho

Os parâmetros elétricos dos dispositivosfabricados foram determinados sondando o dispositivo na estaçãode sonda (Cascade Microtech, Inc.) em diferentes temperaturas.

Os valores dos resistores foram medidos por um Analisador deParâmetros de Semicondutor Agilent 4156C.O valor de resistência R de um resistor versus adiferença de temperatura AR pode ser descrito por uma equaçãosimplificada:

R= R0(1 + αΔΤ) (1)

em que R0 é o valor de resistor à temperaturanominal e α é o Coeficiente de Temperatura da Resistência (TCR)do material. Ambos os parâmetros foram derivados dos dadosmedidos (vide Tabela I). Uma vez que RO e os valores foramcalculados, os chips foram soldados na PCB de modo quepudéssemos medir seus parâmetros térmicos.

O comportamento térmico de qualquer sistema édescrito pela equação de equilíbrio térmico diferencial:

HdΔT/dt + GΔT= ΔΡ (2)

em que H é a capacitância térmica e G é acondutância térmica do sistema, ΔΤ é a variação de temperatura, t

é o tempo e ΔΡ é a variação de energia dissipada dentro dosistema.

Anteriormente, foi publicado um método depulso para derivar os parâmetros térmicos de bolômetros paradetecção por infravermelho (Neuzil, P, Mei, T., Applied PhysicsLetters, 2002, 80, 1838 - 1840). Dado que os bolômetrosapresentam um comportamento similar ao dos dispositivos PCR,foi utilizado um método de teste idêntico. O sensor sob avaliação,junto com três resistores externos, formaram uma ponte deWheatstone equilibrada. Ele foi energizado por pulsos comdurações de 1 ms e amplitude de tensão de 5 V com uma repetiçãode 1 pulso por segundo.

Um sinal de tensão CC com amplitude entre OVe IV foi sobreposto nos pulsos. A capacitância térmica H dodispositivo é calculada a partir da derivada de temperatura emrelação ao tempo. O aumento de temperatura acima da ambientedevido à tensão CC aplicada é em função da condutância térmicaG. Os valores obtidos de H e G foram verificados por mediçãodireta da constante de tempo do sistema τ (igual a H/G). Todos osparâmetros térmicos e elétricos calculados e medidos são listadosna Tabela I.

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Tabela I: Parâmetros elétricos e térmicos dacâmara de PCR. Todos os valores foram medidos à temperaturaambiente de 23°C.

Distribuição de Temperatura

De modo a conectar elétrica e mecanicamente ochip, nós o soldamos em uma Placa de Circuito Impresso (PBC)usando uma técnica similar à conexão invertida (flip-chip). Asolda formou a conexão elétrica e mecânica entre o dispositivo dePCR e a PCB (vide a Fig. 2).O aparelho foi conectado ao componenteeletrônico de controle de temperatura (vide Fig. 7) conformedescrito a seguir. As temperaturas dos aquecedores individuais foiestabelecida aproximadamente em 65 0C, 85 0C e 94 0C, eimagens Infravermelhas (IR) em comprimentos de onda de 8 a 12μm foram capturadas. A resolução de temperatura da câmera foide 0,1 K da Diferença de Temperatura Equivalente (vide a Fig. 6).Como ilustrado na Fig. 6, a variação de temperatura ao longo dosaquecedores é menor que 10C e, portanto, o dispositivo é bastanteadequado para realizar, por exemplo, uma operação de PCR.

Sistema de controle

A temperatura acima da ambiente é controladapela modulação da energia de aquecimento. Nós empregamos oprincípio da Modulação de Largura de Pulso (PWN). Ele controlaa energia média dissipada modulando o ciclo de atividade dospulsos de energia de forma significativamente mais curta do que aconstante de tempo do sistema.

A PWM é digital e fácil de se implementar comum cartão de Aquisição de Dadas Lab VIEW (DAQ) controladopor um Computador Pessoal (PC). Um valor de um sensor detemperatura no chip foi usado para um modo de realimentaçãofechada. O método Proporcional-Integrado-Derivativo (PID) foiimplementado para obter o aquecimento rápido. A correntemáxima alimentada pelo cartão Lab VIEW 6014-E é de apenas8,5 mA da corrente, o que não é suficiente para o chip PCRaquecer à temperatura desejada. O cartão foi então conectado pormeio de interface com o chip PCR por um circuito integrado IR2121 (International Rectifiers, Inc.), um controladorMOSFET/IGBT de alta velocidade. Sua saída é capaz de forneceruma corrente elétrica que chega a Ia, com uma freqüência depulsos de até 10 kHz, capaz de alimentar o chip PCR.

O sensor de temperatura, junto com doisresistores fixos e um ajustável, formaram uma ponte deWheatstone. Suas saídas foram conectadas a um amplifícadordiferencial INA132US (Burr-Brown, Inc.) com um ganho fixo de10. Sua saída foi ligada ao software Lab View pelo mesmo cartãoque controlava o IR 2121. O diagrama esquemático completo deum canal colocado em uma placa PCB é apresentado na Fig. 7. APCB completa consiste de quatro canais individuais para quatroPCRs em paralelo.

O aparelho foi calibrado a uma precisão detemperatura melhor do que 0,5 °C. A calibração do dispositivo foirealizada em um banho controlado por temperatura preenchidocom Fluorinert™ 77. Sua temperatura foi medida por sensores detemperatura TSic™ (IST-AG, Watwill, Suíça) calibrados comuma precisão de 0,1 °C na faixa de 50 °C a 100 °C, soldados naPCB perto do dispositivo PCR.

Os valores de saída de todos os quatro canaisforam armazenados em um arquivo de configuração do LabVIEW e usados para a medição de realimentação. A lâmina decobertura de vidro do microscópio foi colocada sobre o chip PCR.Uma Câmara de Reação Virtual (VRC) com um volume de 1 μL e5 μΐ, da amostra e o óleo foi dispensado acima dos aquecedores(vide Fig. 1). O procedimento acima verificou precisamente atemperatura do aquecedor, mas não da própria amostra PCR, quepoderia ser diferente. A temperatura da amostra foi determinadapela análise de curva de fusão (Rutledge, R. G., Nucleid AcidsResearch (Métodos on-line) 2004, 32, el78), conforme descritoabaixo. Constatou-se que a temperatura da amostra foi dois grausmais baixo do que a temperatura do aquecedor a 94 0C e o arquivode configuração foi corrigido de forma correspondente.

Ciclagem Térmica

O procedimento de autocalibragem foi realizadapara otimizar os valores PID do controlador de modo a atingiruma rápida resposta de aquecimento enquanto a taxa deresfriamento foi determinada pela constante de tempo térmica epela temperatura circundante. Com base nos parâmetros listadosna Tabela 1, espera-se que o tempo de resfriamento do dispositivofique entre um e dois segundos, visto que a variação detemperatura de 94 0C para 55 0C é de cerca de 56% da diferençade temperatura entre 94 0C e a temperatura ambiente de 25 0C.Isso conferiria ao sistema uma rápida taxa de resfriamento, entre -20Ks a 40Ks , ultrapassando com grande margem a taxamínima exigida de -5Ks"'. O perfil PCR alcançado é ilustrado naFig. 8 com 15 segundos para desnaturação (94 0C), 15 segundospara anelamento (55 0C) e 30 segundos para alongamento (72 0C).

Detecção de FluorescêneiaEmpregou-se uma lâmpada de mercúrio comum cubo de excitação/detecção FITC que correspondia aossistemas utilizados anteriormente (Dasgupta, P. K., et ai, Anal.Chim. Acta, 2003, 500, 337 - 364; Cady, N. C, e col, Sensors andActuators B: Chemical, 2005, 107, 332 - 341), com a resposta defluorescência detectada por um Tubo Fotomultiplicador (PMT)(Hamamatsu H5784-20) com o ganho estabelecido para cerca de5x104. O chip PCR foi colocado sob um microscópio ZeissAxiotech Vario montado em uma tabela óptica. Toda aconfiguração de medição foi coberta com um pano preto de modoa suprimir a luz ambiente entrando no PMT de modo a aumentaro limite de detecção óptica. Um osciloscópio mediu e armazenouo valor da amplitude do sinal PMT.

Teste do Aparelho

(a) Preparação da superfície

Como descrito por Guttenberg e col. (Lab Chip,2005, 5, 308 - 317), a superfície do vidro para o sistema VRC temde ser hidrófoba, bem como oleófoba.

Várias soluções fluorinadas de silano diferentese métodos de preparação foram testados. O revestimentosubseqüentemente selecionado consistiu em limpar o vidro emuma mistura 3:1 de H2SO4ZH2O2, seguido de lavagem com águaDI. O vidro foi então colocado em um forno de vácuo (YES-15Eda Yield Engineering, Inc.) à temperatura ambiente junto com umbéquer contendo 1 mL de um silano [(heptadecafluor-1,1,2,2-tetrahidrodecil) trimetoxisilano] da Gelest, Inc. O forno foi entãoevacuado para atingir uma pressão residual abaixo de 1 Torr e atemperatura do forno foi elevada à 150 0C enquanto obombeamento continuava. O silano foi vaporizado e reagido coma superfície de vidro. Após 2 a 5 horas, o bombeamento foiinterrompido, o forno foi ventilado com nitrogênio e as lâminasde vidro foram removidas do forno. Os resultados do tratamentode superfície foram verificados pelo método de ângulo de contatousando o Sistema de Ângulo de Contato (Modelo OCA 30produzido pela Dataphysics GmbH). O ângulo de contato de umagotícula de água foi de 110 graus, enquanto que uma gotícula deóleo mineral (Sigma Inc.) tinha um ângulo de contato de 70 graus.

(b) Preparação da amostra

Como veículo de teste, 940 cópias de modelo deum fragmento de 208 pares de bases (Maxim Biotech, Inc.) dogene codificando para a glicerinaldeído 3-fosfato desidrogenase(GAPDH) foram utilizadas. 5'-

CTCATTTCCTGGTATGACAACGA-3' (SEQ ID No: 1) foiutilizado como oligonucleotídeo iniciador direto e 5'-GTCT AC ATGGC A ACTGTG AGGAG-31 (SEQ ID No: 2;Research Biolabs, Inc.) como oligonucleotídeo iniciador reverso.A mistura PCR foi preparada em uma solução estoque de 50 μΐ,conforme recomendado pelo fabricante (Qiagen, Inc.), com duasexceções: o SYBR Green (Invitrogen, Inc.) foi diluído a umaconcentração final de 1:10.000 e a soroalbumina bovina (CarlRoth, Inc.) foi adicionada em uma concentração final de 1%.

(c) Resultados da PCR em tempo realA solução estoque PCR preparada conformedescrito acima foi dividida em duas partes, sendo que 1 μΐ foiutilizado para o chip PCR e o restante foi utilizado em umtermociclador convencional (MJ Research, Inc.) como referência.

Em ambos os experimentos, a mistura PCR foi revestida por 5 μΙ,de óleo mineral (Sigma, Inc.) As condições de termociclagemforam as seguintes: 5 minutos a 94°C (desnaturação inicial),seguido de 500 ciclos de 1 minuto a 94°C (desnaturação), 1minuto a 58°C (anelamento) e 1 minuto a 72°C (extensão) comuma etapa final de 10 minutos a 72°C . Um minuto por etapatérmica do ciclo PCR é maior do que o normal. Entretanto, essetempo assegura que o sistema atinja o equilíbrio térmico e areação enzimática seja completada durante cada etapa. Isso é maisimportante nesse momento do que a otimização de cada etapavisando tornar o sistema PCR rápido.

Para a análise da curva de fusão (Rutledge, R.G., supra), a amostra foi resfriada a 65°C por 1 minuto, após oque a temperatura foi elevada continuamente a 95 0C com umataxa de aquecimento de O5OlKs"1. Durante a operação, tanto osinal de fluorescência (vide a Fig. 9, Fig. 10) quanto o valor dosensor de temperatura foram registrados simultaneamente. Apróxima etapa foi o cálculo de um valor médio do sinal defluorescência durante o término da fase de extensão a 72°C. Demodo a extrair o sinal de saída de fluorescência dos ciclos PCR,um pequeno programa foi preparando usando Fortran. Osparâmetros de entrada do programa eram o centro do primeirobloco de dados ilustrado pela primeira seta na Fig. 9, a duração dointervalo de dados e o número de intervalos. Em seguida, oprograma calculou a média do sinal a partir do intervalo e aassociou com um número de ciclos para todos os 50 ciclos. Essemesmo procedimento foi repetido para o sinal de fluorescência a94°C (indicado pela segunda seta na Fig. 9) de modo a obter umsinal de referência a ser subtraído do sinal de saída a 72°C. Oconjunto de dados subtraído foi aproximado com uma íunçãosigmóide:

em que Ab A2 são as constantes denormatização, o parâmetro x0 representa a localização do ponto deinflexão e k determina o gradiente máximo nesse ponto.

O protocolo PCR foi realizado com diferentesconcentrações de cópias de modelo, que variavam de 10 até ummilhão. Os parâmetros calculados de X0 foram representadosgraficamente em comparação com o número de modelos,ilustrando a curva padrão PCR (vide a Fig. 11, Fig. 12).

Como indicado acima, após a ciclagem térmicado dispositivo PCR, uma análise de curva de fusão (Fixman, M,Freire, J. J., Biopolymers, 1977, 16, 2693 - 2704; Wilkening, S.,Bader, A., J. of Biomolecular techniques, 2004, 15, 107- 111;Lyon, E., e col., Clinicai Chemistry, 2001, 47, 844 -850) foirealizada a fim de determinar a pureza da PCR (vide a Fig. 13). Osinal de fluorescência foi aproximado por uma função sigmoidalmodificada:

em que A0, A1, A2 e A3, assim como X0 e k, têmfunções idênticas às da Eq. (3).

O erro de ajuste apresenta apenas uma pequenadiferença entre os dados medidos e a curva de ajuste, mostrandoque há apenas um produto PCR com quantidade limitada desubprodutos. A pureza dos produtos foi comprovada pelosresultados da eletroforese capilar (vide a Fig. 14).

Claims (21)

1. - Aparelho para regular a temperatura de umaamostra química e/ou biológica, caracterizado por compreenderpelo menos um módulo de controle de temperatura, em que oreferido módulo de controle de temperatura compreende umaquecedor, um condutor de calor e um sensor de temperatura,em que o referido aquecedor é adaptado para secomunicar termicamente com um substrato removível, sobre oqual é colocada a referida amostra química e/ou biológica, via ocondutor de calor, em que o referido sensor de temperatura éadaptado para detectar e controlar a temperatura do referidosubstrato via o condutor de calor, eem que o referido aparelho é projetado de modoque o referido substrato fique situado acima do referido módulode controle de temperatura para cobrir totalmente o referidomódulo de controle de temperatura.

2. - Aparelho, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido aquecedor compreendeuma superfície que é disposta de forma essencialmente paralela aoplano do substrato, plano do substrato este sobre o qual écolocada a amostra.

3. - Aparelho, de acordo com a reivindicação 1ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido sensor compreendeuma superfície que é disposta de forma essencialmente paralela aoplano do referido substrato, plano do substrato este sobre o qual écolocada a amostra.

4. - Aparelho, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que cada umdentre o referido aquecedor e o referido sensor compreende umasuperfície disposta em um plano comum, em que o referido planoé essencialmente paralelo ao plano do referido substrato, plano dosubstrato este sobre o qual é colocada a amostra.

5. - Aparelho, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que cada um dentre o aquecedor e osensor é concêntrico.

6. - Aparelho, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que o aquecedor circunda o sensor.

7. - Aparelho, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o referidocondutor de calor compreende um material selecionado dentre ogrupo composto de um metal, um semicondutor, um diamante,um nanotubo de carbono e um composto de fulereno.

8. - Aparelho, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 7, caracterizado por compreender pelo menosdois módulos de controle de temperatura, em que os pelo menosdois módulos de controle de temperatura são termicamenteisolados um do outro.

9. - Aparelho, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que cada um dentre os pelo menos doismódulos de controle de temperatura compreende uma superfíciedisposta em um plano comum, que é essencialmente paralelo aoplano do referido substrato, plano do substrato este sobre o qual écolocada a amostra.

10. - Aparelho, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que os referidos dois módulos decontrole de temperatura estão opostos um ao outro no referidoplano essencialmente paralelo ao plano do referido substrato,plano do substrato este sobre o qual é colocada a amostra.

11. - Aparelho, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por compreender dois pares de módulos decontrole de temperatura, em que os dois módulos de controle detemperatura de cada par estão opostos um ao outro no referidoplano essencialmente paralelo ao plano do referido substrato,plano do substrato este sobre o qual é colocada a amostra.

12. - Aparelho, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender uma multiplicidade de módulosde controle de temperatura.

13. - Aparelho, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que cada módulo de controle detemperatura é isolado termicamente de todos os outros módulosde controle de temperatura.

14. - Método para regular a temperatura de umaamostra química e/ou biológica, caracterizado por compreender:• proporcionar um aparelho para regular atemperatura de uma amostra química e/ou biológica, o referidoaparelho compreendendo pelo menos um módulo de controle detemperatura, em que o referido módulo de controle detemperatura compreende um aquecedor, um condutor de calor eum sensor de temperatura,em que o referido aquecedor é adaptado para secomunicar termicamente com um substrato removível, sobre oqual a referida amostra química e/ou biológica é colocada, via ocondutor de calor,em que o referido sensor de temperatura éadaptado para detectar e controlar a temperatura do referidosubstrato via o condutor de calor, eem que o referido aparelho é projetado de modoque o referido substrato fique situado acima do referido módulode controle de temperatura para cobrir totalmente o referidomódulo de controle de temperatura• fornecer um valor de temperatura para aquecera referida amostra química e/ou biológica,• medir a temperatura do referido condutor decalor por meio do referido sensor de temperatura,• aplicar calor ao referido condutor de calor,contanto que a temperatura medida esteja abaixo do valor detemperatura fornecido, dessa forma aquecendo o referidosubstrato e a referida amostra química e/ou biológica.

15. - Método, de acordo com a reivindicação-14, caracterizado pelo fato de que a referida amostra química e/oubiológica está compreendida em uma gotícula de líquido.

16. - Método, de acordo com a reivindicação 14ou 15, caracterizado pelo fato de que o referido aparelho pararegular a temperatura de uma amostra química e/ou biológicacompreende pelo menos dois módulos de controle de temperatura,em que os pelo menos dois módulos de controle de temperaturasão termicamente isolados um do outro.

17. - Método, de acordo com a reivindicação-16, caracterizado pelo fato de que um valor de temperaturaindividual é fornecido para aquecer a amostra química e/oubiológica em cada módulo de controle de temperatura, e em que atemperatura do condutor de calor de cada módulo de controle de10 temperatura é medida individualmente por meio do referidosensor de temperatura de cada módulo de controle de temperatura,eem que o calor é aplicado ao condutor de calorde cada módulo de controle de temperatura, contanto que a15 temperatura medida esteja abaixo do valor de temperaturafornecido, dessa forma aquecendo individualmente cada substratoe a referida amostra química e/ou biológica.

18. - Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de queproporcionar um aparelho para regular a temperatura de umaamostra química e/ou biológica compreende:• proporcionar um substrato,• dispor o referido substrato acima do referidomódulo de controle de temperatura, de modo que ele cubra-ototalmente,• proporcionar uma amostra química e/oubiológica, e• dispor a referida amostra química e/oubiológica sobre o referido substrato.

19. - Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 14 a 18, caracterizado pelo fato de que a amostra éselecionada dentre o grupo que consiste de amostra de solo,amostra do ar, amostra ambiental, amostra de cultura celular,amostra de medula óssea, amostra de precipitação pluviométrica,amostra de precipitação radioativa, amostra de água de esgoto,amostra de lençol aquático, amostra de abrasão, amostraarqueológica, amostra alimentícia, amostra de sangue, amostra desoro, amostra de plasma, amostra de urina, amostra de fezes,amostra de sêmen, amostra de fluido iinfático, amostra de fluidocerebroespinhal, amostra de secreção nasofaríngea, amostra deescarro, amostra de esfregaço bucal, amostra de esfregaço dagarganta, amostra de esfregaço nasal, amostra de lavagembroncoalveolar, amostra de secreção brônquica, amostra de leite,amostra de líquido amniótico, amostra de biópsia, amostraungueal, amostra epitelial, amostra de câncer, amostra de tumor,amostra de tecido, amostra celular, amostra de lisado celular,amostra de cultura viral, amostra forense, amostra de infecção,amostra de infecção nosocomial, amostra de produção, amostra depreparação de fármaco, amostra de produção de moléculabiológica, amostra de preparação protéica, amostra de preparaçãode lipídeos, amostra de preparação de carboidratos, solução de umnucleotídeo, solução de polinucleotídeo, solução de um ácidonucléico, solução de um peptídeo, solução de um polipeptídeo,solução de um aminoácido, solução de uma proteína, solução deum polímero sintético, solução de uma composição bioquímica,solução de uma composição química orgânica, solução de umacomposição química inorgânica, solução de um lipídeo, soluçãode um carboidrato, solução de um produto químico combinatório,solução de uma molécula candidata a fármaco, solução de umamolécula de fármaco, solução de um metabólito de fármaco,suspensão de uma célula, suspensão de um vírus, suspensão deum microorganismo, suspensão de um metal, suspensão de umaliga metálica, solução de um íon metálico e qualquer combinaçãoentre eles.

20. - Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 14 a 19, caracterizado pelo fato de que aquecer aamostra química e/ou biológica inclui realizar um processoquímico e/ou biológico.

21. - Método, de acordo com a reivindicação-20, caracterizado pelo fato de que a amostra inclui uma moléculade ácido nucléico e o processo químico e/ou biológico é umareação em cadeia da polimerase.