BRPI0707974A2 - métodos de coleta e seleção de uma população de célula -tronco tipo embrionário de tecidos foliculares e periodontais adultos humanos - Google Patents

Abstract

MéTODOS DE COLETA E SELEçãO DE UMA POPULAçãO DE CéLULA-TRONCO TIPO EMBRIONáRIA DE TECIDOS FOLICULARES E PERIODONTAIS ADULTOS HUMANOS. A presente invenção refere-se a métodos para o isolamento, expansão e armazenamento de uma população de células-tronco pertencente a folículos dentários humanos, denominadas FENC (células-tronco da Crista Neural Embrionária derivadas de Folículo) que incluem: a) Coleta do saco folicular em condições estéreis, digestão e crescimento de cultura primária e expansão; b) Amplificação opcional; c) FACS.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSDE COLETA E SELEÇÃO DE UMA POPULAÇÃO DE CÉLULA-TRONCOTIPO EMBRIONÁRIA DE TECIDOS FOLICULARES E PERIODONTAISADULTOS HUMANOS".

SUMÁRIO

A presente invenção refere-se a um novo método para o isola-mento de uma nova subpopulação de células-tronco de folículo dentário hu-mano com características antigênicas tipo embrionárias, bem como a ummétodo para a expansão da cultura dessa: as células isoladas podem sercaracterizadas é armazenadas em coleções de células para usos experi-mentais e terapêuticos.

Mais particularmente, a invenção descreve: 1) isolamento decélulas-tronco de tecidos foliculares e periodontais do doador; seu cresci-mento in vitro, em particular condições de cultura capazes de permitir o iso-lamento de' células tipo embrionárias; seu banco para preservar a viabilida-de; sua diferenciação com relação a citotipos diferentes; o uso de citotipoestaminal isolado em terapias celulares e/ou engenharia de tecidos no pró-prio doador ou hospedeiro compatível com HLA, para regenerar lesões dediversas etiologias.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Hoje em dia a chance de se isolar as células-tronco de tecidoshumanos é controversa e muito discutida. A própria definição de célula-tronco, uma célula capaz de se auto-renovar e se diferenciar de todos oscitotipos diferentes do organismo do qual essa é derivada, não se adequa àscaracterísticas antigênicas e funcionais das células-tronco adultas, até agoracoletáveis em seres humanos após o nascimento. Do ponto de vista da "au-to-renovação", realmente, as células-tronco adultas que foram isoladas até omomento, não apresentam capacidade de proliferação ilimitada e, de outroponto de vista, a capacidade de diferenciação dificilmente foi submetida àmultipotência (a capacidade de se diferenciar em todos os citotipos que seoriginam da mesma camada germinal) ou à pluripotência (a capacidade dese diferenciar nos citotipos que se originam de camadas germinais diferen-tes também), sem atingir a totipotência (a capacidade de se diferenciar emcada citotipo); o segundo é uma capacidade pertencente ao zigoto e às célu-las do blastocisto, que resulta nas primeiras etapas do desenvolvimento hu-mano. Por outro lado, a chance de manipular células coletadas de embriõeshumanos para aplicações terapêuticas e pesquisa geralmente colide comdificuldades técnicas, éticas e legais. Por esses motivos a chance de isola-mento em citotipos indiferenciados humanos adultos, representa não só ummodelo experimental interessante de diferenciação celular e para casos re-lacionados com câncer, como também uma ferramenta terapêutica importan-te para curar doenças baseadas em degeneração tecidual, causadas pordefeitos quantitativo e qualitativos.

As células-tronco são citotipos caracterizados por:

1) auto-renovação ilimitada;

2) capacidade de diferenciação voltada para inúmeros citotipos.

Com relação à técnica anterior, representada pelo documentoWO 03/066840 que inclui serótipo folicular, essa invenção mostra as seguin-tes diferenças:

1) Padrão antigênico e métodos de seleção das células. O do-cumento WO 03/066840 não descreve nenhuma seleção, enquanto que ométodo da invenção usa seleção por citofluorimetria de células-tronco em-1 brionárias, através da detecção de antígenos, tais como, SSEA-4, TRA 1-60,TRA 1-81, CD133, CD90, flk-1. Desta forma, é possível obter uma popula-ção homogênea de células embrionárias.

2) Métodos de cultura, proliferação e diferenciação celular; real-mente, o documento WO 03/066840 descreve as técnicas para coletar umapopulação celular que contém apenas em uma pequena parte elementos decélulas-tronco adultas, enquanto que o método de seleção de acordo com apresente invenção permite a preparação de uma população de células-tronco tipo embrionárias homogêneas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção descreve um método para isolar do saco folicularuma nova subpopulação de célula-tronco não-hematopoiética, mesenquimal,referida daqui por diante como FENC (células-tronco da Crista Neural Em-brionária derivadas de Folículo), por meio de seleção FACS1 após a colora-ção adequada com anticorpos específicos.

A invenção também proporciona métodos de cultura e prolifera-ção de FENC. As células obteníveis pelo método da invenção são capazesde se diferenciar entre todos os tecidos das três camadas germinais forman-do, assim, FENCs, uma população de célula totipotente/multipotente. AFENC pode ser armazenada preservando sua viabilidade, de modo que sejapossível estabelecer bancos de células para armazenar células-tronco em-brionárias coletadas de pacientes adultos. A invenção também proporcionamétodos para terapia celular e/ou genômica por meio de FENCs bem comoaplicação terapêutica clínica de células e tecidos obtidos a partir da diferen-ciação de FENCs.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a um método para o isolamento de um no-vo citotipo de células-tronco embrionárias coletadas de adultos humanos,em particular, um método para o isolamento dessas células, inclusive a cole-ta dessas do saco folicular.

O folículo dentário, como o complexo tecidual que envolve odente durante sua formação antes da erupção, representa uma fonte privile-giada de células indiferenciadas devido a dois motivos:

1) Cada dente, tanto permanente como decíduo, representa umórgão incompleto no nascimento. Esses trazem em seu sítio de desenvolvi-mento células indiferenciadas que, após a proliferação, se tornarão célulasodontogênicas. A origem embrionária, das cristas neurais, explica sua imatu-ridade. No final da odontogênese também, essa célula indiferenciada per-manece in loco até a erupção, dentro do folículo, pois se tornarão as futurascélulas de periodóntio e ápices radiculares que se desenvolvem após a e-rupção. Agora é certa a presença de células-tronco adultas dentro do Iiga-mento periodontal (Gronthos, Lancet 2004), e dentro da polpa do dente(Gronthos, PNAS 2000; Miura, PNAS 2003; Laino, JBMR 2005).

2) O folículo dentário é um nicho biológico com um fácil acessocirúrgico, bem como com uma grande proporção entre células-tronco indife-renciadas e volume tecidual coletado. O sacrifício tecidual para a coleta decélula-tronco é mínimo devido à extração dos dentes do siso ser muito fre-qüente e requerer a coleta do saco folicular. As células-tronco, que possuemcaracterísticas embrionárias obtidas dessas amostras biológicas, podem serarmazenadas para pesquisa e aplicações terapêuticas autólogas.

Essas células derivam da neuroectoderma e expressam a capa-cidade de diferenciação nos citotipos originados dessa camada.

A invenção proporciona pela primeira vez o isolamento de umapopulação de células homogêneas com características de adultos humanos.

Essa estratégia apresenta as seguintes vantagens: 1) cirurgiapouco invasiva com anestesia local; 2) baixa morbidade do local; 3) culturamesenquimal altamente clonogênica, devido à ausência de fração hemato-poiética; 4) isolamento de células embrionárias de adultos humanos.

Obtenção de FENCs - as células-tronco obtidas do saco folicularsão derivadas diretamente de células mesenquimais originadas nas cristasneurais durante a organogênese. Sua origem explica sua plasticidade. Paraisolar as células-tronco do saco folicular, essas devem estar intactas semcomunicação com a cavidade oral.

O paciente, durante a semana antes da cirurgia, deve seguir umprotocolo de higiene oral adequado, por exemplo, limpar a cavidade oral aomenos duas vezes ao dia com CHX 0,12 ou agentes similares. Para a coletado saco folicular, após a anestesia, o retalho é cortado e uma porta óssea éaberta para alcançar o dente impactado, envolvido pelo saco folicular. Umavez coletada em condições estéreis, a amostra é imersa em uma soluçãodigestiva durante 1 hora a 37°C. Ao término da primeira hora, a solução di-gestiva é filtrada para eliminar os agregados celulares e as partículas ECM.

Após isso, o processo digestivo é interrompido e as células são cultivadas,(em meio Mega Cell (SIGM A-Milan, Italy). Alternativamente, o meio das cé-lulas-tronco embrionárias (ES) pode ser usado. Observações microscópicasprovam que, partindo-se do primeiro dia de cultura; é possível obter um bomnúmero de células, aderentes ao fundo dos frascos, que dão origem a cio-nes. Após 5 dias em um frasco de 75 ml é possível calcular até 60 clones.

No 9°-100 dia, após a remoção do sobrenadante, as células sãodesafiadas em FACS, coleta-se os clones de células positivos para marca-dores de célula-tronco.

As FENCs isoladas se diferenciam, com ou sem estímulo, emcitotipos diferentes. É possível obter a proliferação sem diferenciação adi-cionando-se PFGF ao meio de cultura.

Após as células atingirem um número adequado, essas podemser congeladas e armazenadas em nitrogênio líquido a -80°C.

O procedimento é resumido abaixo:

1)Coleta do saco folicular em condições estéreis, digestão ecultura;

2)Amplificação de culturas primárias, se necessário;

3)FACS;

4)Amplificação, congelamento e/ou diferenciação celular;

5)análise FAC;

6)Manter em uma condição indiferenciada;

7)Engenharia tecidual de células diferenciadas.

Todos os tipos de células obtidos a partir da diferenciação deFENCs, podem ser usados não só em terapia celular como também paraformar tecidos diferentes.

Por exemplo, a FENC pode ser usada para obter precursoresosteogênicos, expressando RUNX-2, desses se derivam osteoblastos queexpressam HLA-I, CD44, RUNX-2 e CD54 e osteocalcina. Uma matriz oste-óide denominada LAB (Osso Autólogo Vivo) também pode ser obtida de os-teoblastos, expandidos e criopreservados. LAB é feito de amostras do tecidoósseo, com uma espessura maior que 1 cm e um volume maior que 1 cm3. Aformação de LAB, contendo osteoblastos que produzem ativamente o osso écaracterizada por: 1) formação de agrupamento que secretam, dentro deuma área central, cristais inorgânicos, fibras de colágeno e glicoproteínas; 2)organização 3D dessa estrutura formando uma matriz óssea mineralizada.

O dito LAB é formado ao desenvolver as células a 37°C em umaatmosfera ode 5% de CO2 utilizando meio de cultura α-MEM, adicionadocom 20% p/v de FBS1 100 μΜ de 2P-ácido ascórbico, 2 mM de L-glutamina,100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina. A formação de LAB éapenas bloqueada devido à falta de nutrientes.

O dito LAB pode ser produzido de forma contínua e o tecido oste-óide pode ser armazenado, mantendo-se os osteoblastos a 4°C ou em tempe-raturas <0°C, utilizando-se técnicas comuns de criopreservação celular.

Uma matriz 3D que contém LAB também pode ser obtida, em queos osteoblastos se desenvolvem na presença de uma matriz biocompatível 3D,que é colonizada por células. A dita matriz biocompatível pode ser reabsorvívelou não in vivo\ exemplos adequados de matrizes compreendem ácido lactídeoco-glicólico, colágenos sintéticos, HA, biocoral, sulfato de cálcio, enquanto a-quelas não reabsorvíveis por polimetacrilatos compreendem, PTFe, titânio, HAcompacta, HA bifásica (50% HA e 50% de β-TCP), cerâmica.

De acordo com uma modalidade adicional da invenção, a FENCtambém pode ser diferenciado de mioblastos, para obter células do músculoliso utilizando o meio de cultura Mega Cell com FBS p/v 2%, 100 μΜ de 2P-ácido ascórbico, 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mLde estreptomicina adicionada com 10 ng/ml de TGFp.

A FENC também pode ser diferenciada in vitro de mioblastos,para obter o músculo estriado, utilizando uma co-cultura com miotubos derato C2C12. A co-cultura é realizada utilizando uma razão 1:10 durante 7dias, que utiliza o seguinte meio de cultura: Meio de Eagle modificado porDulbecco (DMEM, Invitrogen), com 4 mM de L-glutamina, 1,5 g/L de bicar-bonato de sódio, 4,5 g/L de glucose e 1,0 mM de piruvato de sódio adiciona-do com 10% de FBS.

A FENC também pode ser diferenciada in vitro de células neuro-nais e gliais, utilizando uma cultura de 15 a 30 dias em Neurobasal A (Invi-trogen, Milano, Italy), adicionada com proteína B27 (Invitrogen, Milan).

As células gliais de neurônios obtidas por diferenciação deFENC podem ser selecionadas por FACS utilizando o anticorpo anti-GFAPde células gliais.A FENC também pode ser diferenciada entre adipócitos, medi-ante cultura durante 30 dias em α-MEM, adicionada com 20% p/v de FBS1100 μΜ de 2P-ácido ascórbico, 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicili-na, 100 Mg/mL de estreptomicina, 10"8 M de dexametasona.

A diferenciação de condrócitos de FENC1 para obter a cartila-gem, pode ser obtida ao cultivar as células de FENC durante 30 dias utili-zando α-MEM, adicionada com 20% p/v de FBS, 100 μΜ de 2P-ácido ascór-bico, 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de estrepto-micina de redução pÜ2 < 40 mmHg.

A invenção permite o uso autólogo de FENC em protocolos deterapia celular.

Em particular, o uso autólogo de FENC e células derivadas des-sas pode ser útil nas seguintes aplicações:

- patologias do aparelho esquelético tipo defeitos ósseos pormeio de osteoblastos derivados de FENC.

- degeneração do tecido muscular, tanto do tecido do músculoliso como estriado, por meio de mioblastos derivados de FENC.

- Patologias de CNS por meio de neurônios derivados de FENC.

- Degeneração da mielina por meio de células gliais derivadasde FENC.

- em cirurgia plástica, quando a formação de tecido adiposo fordesejada, por meio de adipócitos derivados de FENC.

- em campos de cirurgia oncológica e plástica, por meio de con-drócitos derivados de FENC.

Teste de Canceroaênese - Para controlar a cancerogênese, asFENCs e células diferenciadas dessas foram injetadas em ratos sem pêlos,após a infecção com lentivírus Ill (Invitrogen, Milano, Italia), por meio de umvetor que compreende GFP (proteína verde fluorescente) cDNA. Após otransplante, os animais foram acompanhados durante 30 dias e sacrificados.

Observações histológicas tanto do local de transplante como dos órgãosprincipais, não evidenciaram desenvolvimento de câncer. As células foramdesafiadas por principais marcadores de câncer e por análise de ciclo celu-lar: todas as células eram euplóides sem evidência de câncer.

Alguns exemplos de aplicações de FENCs estão registrados a-baixo.

Exemplo 1. Isolamento e cultura celular

Cada paciente saudável, começando da semana antes da cirur-gia, foi submetido ao tratamento de limpeza bucal com GHX 0,12 p/v duasvezes ao dia. Para a coleta do saco folicular, após anestesia local, o retalhofoi cortado e uma porta óssea foi aberta para alcançar o dente impactado,envolvido pelo saco folicular. Uma vez coletada em condições estéreis comuma cureta Gracey ou uma colher alveolar, a amostra foi imersa em umasolução digestiva durante 1 hora a 37°C. A solução digestiva era PBS (solu-ção tampão fosfato pH 7,4 1M) contendo 3 mg/mL de colagenase tipo I, 4mg/mL de Dispase, 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina e500 Mg/mL de claritromicina. O volume da solução dependeu dó volume dosaco folicular coletado, e variou de 8 a 15 mL. As amostras foram mantidasna solução durante 1 hora a 37°C. Ao término da primeira hora, a soluçãodigestiva foi filtrada com um coador Falcon® 70 pm para remover os frag-mentos de ECM, células ou grandes agregados. A amostra foi digerida no-vamente durante 30' se fragmentos de tecido ainda estiverem presentes.Para interromper a digestão, um volume igual a dez vezes o volume da di-1 gestão foi adicionado à solução digestiva e centrifugado durante 10' em 140g. O meio de cultura era Mega Cell (SIGMA, Milan, Italy), adicionado com10% P/v de soro fetal bovino (FBS), 100 μΜ de 2P-ácido ascórbico, 2 mM deL-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina. Ao tér-mino da centrifugação do fundo do tubo, 25 ml da suspensão foram coleta-dos e cultivados em um frasco de 50 ml a 37°C e 5% de CO2, alterando omeio de cultura duas vezes por semana. Observações microscópicas evi-denciaram que, começando do primeiro dia de cultura, as células aderentesderam origem a clones de células.

Exemplo 2. Crescimento e caracterização

Após 5 dias de cultura no meio descrito acima ou meio embrio-nário (meio ES1 Invitrogen, Milan, Italy) em 75 frascos foram calculados até60 clones.

No 9°-10° dia, após a remoção do sobrenadante e lavagem comPBS estéril, as células se desprenderam do fundo dos frascos. 4 mL de ED-TA 0,02%, dissolvidos em PBS Mg/Ca livre, durante 10' a 37°C e um FACSfoi realizado, coleta-se os clones celulares positivos para marcadores de cé-lulas-tronco. As células foram peletizadas (10' a 140 g), lavadas em BSA(Albumina de Soro Bovino) 0,01% em PBS a 4°C e incubadas durante 30' a4°C para coloração com 10 μl de anticorpo de solução estoque. Após a in-cubação, as células foram lavadas uma vez com 1 ml de BSA 0,1% em PBS,para remover anticorpos não reativos ou específicos, e analisadas para posi-tividade com os seguintes anticorpos: SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81, CD133,CD90, fIk-I (Santa Cruz, CA, USA). As células eram positivas para SSEA-4em uma percentagem de 70% e de 80% para TRA 1-60 e TRA 1-81. Emparticular, SSEA-4+ eram positivos tanto para TRA 1-60 como TRA 1-81.SSEA-4, TRA 1-60 e TRA 1-81 são moléculas de superfície presentes ape-nas em células indiferenciadas, ou em Células-Tronco Embrionárias (ES to-tipotente) e Células Germinais Embrionárias (EG pluripotente). Após a clas-sificação, uma pequena amostra foi desafiada por 3 fatores de transcrição,Nanog, OCT-4 e Rex-1, que são geralmente detectáveis apenas em célulasembrionárias indiferenciadas. A positividade dos antígenos anteriores con-firma a natureza embrionária das células (ES) (Zhang Nature 2003). A posi-tividade de OCT-4 era 100% em todas as células classificadas. Para análiseNanog e Rexl, após obter um número adequado de células, o RNA foi isola-do e analisado com RT-PCR.

Exemplo 3. Diferenciação tipo a (osso, músculo liso e cartilagem)

As FENCs, isoladas e caracterizadas como indicado nos exem-plos 1 e 2, podem se diferenciar com ou sem estímulo, ou podem se prolife-rar contendo a diferenciação, ao adicionar 8 ng/mL PFGF ao meio de cultura.

Para a diferenciação osteogênica, as células podem ser cultiva-das com α-MEM, com FBS 20% p/v, 100 μΜ de 2P-ácido ascórbico, 2 mMde L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina. Ascélulas se diferenciam em osteoblastos em aproximadamente 25 dias, for-mando o osso reticulado (positivo para anticorpos anticolágeno tipo I e III,osteocalcina, osteonectina, BAP).

Para a diferenciação de músculo liso, as FENCs devem ser cul-tivadas com 2% de Mega Cell (SIGMA) FBS p/v, 100 μΜ de 2P-ácido ascór-bico, 2mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de estrepto-micina adicionando-se 10 ng/ml de TGFp. Nessas condições, as células sediferenciam em aproximadamente 4 a 5 dias e se tornam positivas para colo-ração por anticorpo SMA, marcador de diferenciação de músculo liso.

Para diferenciação de cartilagem, as FENCs foram cultivadasem meio α-MEM, adicionando-se 20% w/v de FBS, 100 μΜ de 2P-ácido as-córbico, 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de estrep-tomicina de redução p02 < 40 mmHg e cultivadas a 37°C com 5% de CO2. Aformação de cartilagem, devido à alta concentração celular (500.000/15 mL)ocorre em aproximadamente 30 dias e pode ser verificada por análise deexpressão da Colagenase Tipo II.

Exemplo 4. Diferenciação de tipo b (células neuronais e aliais)

As células foliculares podem se diferenciar tanto de maneira es-pontânea como utilizando o meio Neurobasal A (Invitrogen, Milan, Italy), adi-cionado de proteína B27 (Invitrogen, Milan, Italy). A cultura foi acompanhadadurante 5 a 7 dias. Em ambos os casos foi obtido um grande número de cé-lulas neuronais e gliais diferenciadas. Uma análise citofluorimétrica utilizan-do um anticorpo anti-GFAP pode, então, resultar na seleção e isolamento dedois citotipos. Realmente, as células diferenciadas são:

- células gliais quando positivas para o anticorpo GFAP;

- neuronais quando positivas para os anticorpos anti-TuJ1, anti-neurofilamento, anti-Bra3A (um fator de transcrição);

- neuronais periféricas quando positivas para anticorpos antiperi-ferina e anti-p75.

Exemplo 5. Diferenciação de tipo c (músculo estriado, adipócitos)

A diferenciação de FENC entre células musculares estriadaspode ser obtida por meio de co-cultura com miotubos de ratos C2C12. A co-cultura foi realizada utilizando a porcentagem de 1:10, por meio de métodosconhecidos (por exemplo, Laino et al., 2006), em um meio feito conformeexposto a seguir: meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitro-gen), adicionado com 4 mM de L-glutamina, 1,5 g/L de bicarbonato de sódio,4,5 g/L de glucose, 1,0 mM de piruvato de sódio, e 10% de FBS duranteuma semana. Após a co-cultura, a porcentagem de FENC fundido dentro demiotubos de ratos foi calculada por meio de Iaminina nuclear anti-humana.Geralmente, a porcentagem da fusão foi de cerca de 15 a 20%. Os miotubosfundidos podem ser usados para transplante.

A diferenciação de adipócitos foi obtida adicionando-se 10"8 Mde dexametasoria durante 30 dias no seguinte meio de cultura: α-MEM, adi-cionado com 20% de FBS p/v, 100 μΜ de 2P-ácido ascórbico, 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina. No final,inúmeros adipócitos que foram observados poderiam ser corados eom Su-dão negro ou, recentemente, com Óleo vermelho-O.

As células adiposas podem ser usadas para cirurgia plástica.

Exemplo 6. Engenharia Tecidual e Aplicação Clínica

A FENC, uma vez diferenciada, pode ser usada para reconstru-ção do tecido também por meio de culturas rotativas, em um aparelho Roller.As células diferenciadas em osteoblastos, por exemplo, podem ser semea-das em escafoldes de lactídeo co-glicólico (85:15) (que é reabsorvível dentrode 15 dias). As culturas rotativas (1/5 s.) são feitas em um incubador com5% de CO2 durante 30 dias. Uma vez que a espessura de 1 cm é atingida, aestrutura de tecido em 3D foi observada e avaliada por meio de técnicas his-tológicas, imunoistoquimicas e SEM.

O tecido ósseo pode ser usado para detectar a regeneração. Seessas células puderem ser obtidas do paciente, um escafolde pode ser mo-delado e a cultura em 3D pode ser realizada. Após 20 a 30 dias, o complexoescafolde-células está pronto para ser implantado no Iocus do paciente.

O enxerto pode ser feito utilizando técnicas cirúrgicas padrão. Apreparação do Iocus para o transplante envolve a criação de um extravasa-mento sangüíneo evidente e a redução das camadas do córtex. Portanto, aintegração escafolde-células com o hospedeiro pode ser feita mais facilmen-te e o transplante pode ser, então, realizado.

A integração perfeita foi obtida em 40 a 60 dias.O reparo do tecido pode ser obtido devido à essa técnica autólo-ga utilizando células-tronco.

Terminologia

Mega cell = meio de cultura das células (Sigma-AIdrich, Milan,

Italy)

ES = meio de cultura (Invitrogen, Milan, Italy)PFGF = fator de crescimento beta do fibroblastoα-MEM = Meio Mínimo Essencial alfa (Invitrogen)anti-GFAP = anticorpo conduzido contra a proteína glial fibrilar

ácida

GFAP = Proteína Fibrilar Glial ÁcidaSMA = Actina de Músculo LisoTGFp = Fatorde Crescimento Tumoral βBAP = Fosfatase Alcalina ÓsseaPFGF = Fator de Crescimento de Fibroblasto βRT-PCR = Reação em Cadeia da Polimerase via Transcriptase

Reversa

Nanog = Fator de transcrição de células embrionárias durante o

• desenvolvimento precoce

Rexl = Fator de transcrição de células embrionárias durante odesenvolvimento precoce

OCT-4 - Octâmero 4

SSEA-4 = Antígeno embrionário específico de estágioTRA 1 = Antígeno de rejeição tumoral-1CD = Agrupamento de diferenciaçãoflk-1 = Quinase do Fígado Fetal-1HA = hidroxiapatitaTCP = fosfato de tricálcio

Claims (10)

1. Métodos para o isolamento, expansão e armazenamento decélulas-tronco pertencentes a folículos dentais humanos, denominadasFENC (células-tronco da Crista Neural Embrionária derivadas de Folículo)que incluem:a) Coleta do saco folicular em condições estéreis, digestão ecrescimento de cultura primária e expansão;b) Amplificação opcional;c) FACS.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a digestão érealizada utilizando enzimas proteolíticas e anticorpos.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a digestãoenzimática é realizada por meio de uma solução aquosa que contém: 3mg/mL de colagenase tipo I, 4 mg/mL de dispase, 100 U/mL de penicilina,-100 pg/mL de estreptomicina, 500 Mg/mL de claritromicina em PBS.

4. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 3, em que a di-gestão enzimática é realizada durante 1 h a 37°C, sob agitação.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-4, em que o crescimento de cultura primária e expansão são obtidos pormeio de meio de cultura específico para células-tronco.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, em que o meio decultura consiste em MEGA Cell, adicionado com 10% p/v de FBS, 100 pM de-2P-ácido ascórbico, 2mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 Mg/mLde estreptomicina.

7. Método de acordo com uma a reivindicação 5 ou 6, em que aincubação é realizada a 37°C e em uma atmosfera de 5% de CO2 durante 15a 20 dias, alterando o meio a cada 3 dias.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-7, em que o FACS é realizado utilizando SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81, CD-133, CD90, flk-1 como marcadores de célula-tronco.

9. Uso da FENC obtenível por meio dos métodos, como defini-dos em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, para obter precursores oste-ogênicos, osteoblastos, mioblastos, condrócitos, adipócitos, neurônios, célu-las gliais.

10. Uso de precursores osteogênicos, osteoblastos, mioblastos,condrócitos, adipócitos, neurônios, células gliais para preparações autólogaspara uso em protocolos de terapia celular para o tratamento de patologias doaparelho esquelético, degeneração do tecido muscular, patologias de CNS,degeneração da mielina, doenças oncológicas e em cirurgia plástica.