BRPI0708128A2

BRPI0708128A2 - derivado de ácido hialurÈnico, processo para produção de um derivado de ácido hialurÈnico, composição, artigo cosmético, artigo sanitário, médico ou cirúrgico, cápsula ou microcápsula de medicamento, métodos para realizar procedimentos em oftalmologia, no tratamento de osteoartrite, e no tratamento de cáncer, para realizar administração transdérmica e dérmica de um agente farmacologicamente ativo, e administração dérmica de um cosmético, e para realizar procedimentos no tratamento de perda de cabelo ou calvìcie, métodos oftalmológico, de tratamento de osteoartrite, de uma ferida, e de perda de cabelo ou calvìcie, e, uso de um derivado de ácido hialurÈnico

Info

Publication number: BRPI0708128A2
Application number: BRPI0708128-6A
Authority: BR
Inventors: Corinne Eenschhten; Morten Wurtz
Original assignee: Novozymes Biopolymer As
Priority date: 2006-03-02
Filing date: 2007-03-02
Publication date: 2011-05-17
Also published as: EP1994062B1; WO2007098770A1; DK1994062T3; US20110257123A1; CA2643714C; CA2643714A1; CN101415732B; DE602007001593D1; CN101415732A; JP2009528406A; ES2329731T3; AU2007219545B2; EP1994062A1; JP5399716B2; US8071757B2; AU2007219545A1

Abstract

DERiVADO DE áCIDO HIALURÈNICO, PROCESSO PARA PRODUçãO DE UM DERIVADO DE áCIDO HIALURÈNICO, COMPOSIçãO, ARTIGO COSMéTICO, ARTIGO SANITáRIO, MEDICO OU CIRURGICO, CAPSULA OU MICROCáPSULA DE MEDICAMENTO, METODOS PARA REALIZAR PROCEDIMENTOS EM OFTALMOLOGIA, NO TRATAMENTO DE OSTEOARTRITE, E NO TRATAMENTO DE CáNCER PARA REALIZAR ADMINISTRAçãO TRANSDéRMICA E DéRMICA DE UM AGENTE FARMACOLOGICAMENTE ATIVO, E ADMINISTRAçãO DéRMICA DE UM COSMETICO, E PARA REALIZAR PROCEDIMENTOS NO TRATAMENTO DE PERDA DE CABELO OU CALVICIE, MéTODOS OFTALMOLóGICO, DE TRATAMENTO DE OSTEOARTRITE, DE UMA FERIDA, E DE PERDA DE CABELO OU CALVIClE, E, USO DE UM DERIVADO DE áCIDO HIALURÈNICO Um derivado de ácido hialurónico, e métodos de produção e uso do referido derivado, o derivado incluindo n unidades de repetição e tendo a fórmula estrutural geral (1) em que, em pelo menos uma unidade de repetição, um ou mais entre Ri, R2, R3, R4 inclui uma aril/alquil sulfona ligada a éter tendo a fórmula estrutural geral (II) em que R inclui um grupo alquila ou arila, e de outra forma Ri, R2, R3, R4 são grupos hidroxila, OH.

Description

"DERIVADO DE ÁCIDO HIALURÔNICO, PROCESSO PARA PRODUÇÃODE UM DERIVADO DE ÁCIDO HIALURÔNICO, COMPOSIÇÃO, ARTIGOCOSMÉTICO, ARTIGO SANITÁRIO, MÉDICO OU CIRÚRGICO,CÁPSULA OU MICROCÁPSULA DE MEDICAMENTO, MÉTODOS PARAREALIZAR PROCEDIMENTOS EM OFTALMOLOGIA, NOTRATAMENTO DE OSTEOARTRITE, E NO TRATAMENTO DE CÂNCER,PARA REALIZAR ADMINISTRAÇÃO TRANSDÉRMICA E DÉRMUCA DEUM AGENTE FARMACOLOGICAMENTE ATIVO, E ADMINISTRAÇÃODÉRMICA DE UM COSMÉTICO, E PARA REALIZAR PROCEDIMENTOSNO TRATAMENTO DE PERDA DE CABELO OU CALVÍCIE, MÉTODOSOFTALMOLÓGICO, DE TRATAMENTO DE OSTEOARTRITE, DE UMAFERIDA, E DE PERDA DE CABELO OU CALVÍCIE, E, USO DE UMDERIVADO DE ÁCIDO HIALURÔNICO"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à modificação de ácidohialurônico (HA) com aril- ou alquil-vinil sulfonas para produzir derivadosaril/alquil vinil sulfona de HA (AVS-HA), aos derivados AVS- HA em si, àsua fabricação, e a suas aplicações e usos, particularmente nas indústrias decosméticos e biomédica.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os heteropolissacarídeos mais abundantes do corpo são osglicosaminoglicanos. Glicosaminoglicanos são polímeros de carboidratos nãoramificados, consistindo de unidades de repetição de dissacarídeos (somentesulfato de queratano é ramificado na região núcleo do carboidrato). Asunidades de dissacarídeos geralmente incluem, como uma primeira unidadede sacarídeo, um dos dois açúcares modificados - N-acetilgalactosamina(GalNAc) ou N-acetilglucosamina (GlcNAc). A segunda unidade é,usualmente, um ácido urônico, como ácido glucurônico (GlcUA) ouiduronato. Glicosaminoglicanos são moléculas negativamente carregadas, epossuem uma conformação estendida que confere alta viscosidade quando emsolução. Glicosaminoglicanos são localizados primariamente na superfície dascélulas ou na matriz extracelular. Glicosaminoglicanos também possuem altacompressibilidade em solução e, em resultado disso, são ideais como fluidoslubrificantes fisiológicos, por exemplo, de juntas. A rigidez dosglicosaminoglicanos proporciona integridade estrutural a células eproporciona passagens entre as células, permitindo migração de células. Osglicosaminoglicanos de maior importância fisiológica são hialuronano,condroitin sulfato, heparina, heparan sulfato, dermatan sulfato, e queratansulfato. A maior parte dos glicosaminoglicanos se liga covalentemente a umaproteína núcleo proteoglicano através de estruturas oligossacarídicasespecíficas. Hialuronano forma grandes agregados com certos proteoglicanos,mas é uma exceção já que cadeias de carboidratos livres formam complexosnão covalentes com proteoglicanos.

Numerosos papéis de hialuronano no corpo foramidentificados (ver, Laurent T. C. e Fraser J. R. E., 1992, FASEB J. 6: 2397-2404; e Toole B.P., 1991, "Proteoglycans and hialuronan in morphogenesisand differentiation." (Proteoglicanos e hialuronano em morfogênese ediferenciação) em: Cell Biology of the Extracellular Matrix (Biologia daCélula da Matriz Extracelular), pp. 305-341, Hay E. D., ed., Plenum, NovaIorque). Hialuronano está presente na cartilagem hialina, fluido sinovial dejuntas, e tecido da pele, tanto derme como epiderme. Suspeita-se também quehialuronano tenha um papel em numerosas funções fisiológicas, como adesão,desenvolvimento, motilidade celular, câncer, angiogênese, e cicatrização deferidas. Devido às propriedades físicas e biológicas únicas de hialuronano,este é empregado em cirurgia ocular e de juntas e está sendo avaliado emoutros procedimentos médicos. Os termos "hialuronano" ou "ácidohialurônico" são usados em literatura para significar polissacarídeos ácidoscom diferentes pesos moleculares constituídos por resíduos de ácido D-glucurônico e ácidos N-acetil-D-glucosamínicos, que ocorrem naturalmenteem superfícies de células, nas substâncias extracelulares básicas do tecidoconectivo de vertebrados, no fluido sinovial das juntas, no fluido endobulbardo olho, no tecido do cordão umbilical humano e em cristas de gaios.

O termo "ácido hialurônico" é, de fato, usado para significaruma série completa de polissacarídeos com resíduos alternados de ácidos D-glucurônico e N-acetil-D-glucosamínico com pesos moleculares variados oumesmo as frações degradadas dos mesmo, e pareceria, assim, mais corretousar o termo plural de "ácidos hialurônicos". O termo singular será, noentanto, usado com o mesmo significado nesta descrição; além disso, aabreviação "HA" será freqüentemente usada no lugar desse termo coletivo.

HA desempenha um importante papel no organismo biológicocomo um suporte mecânico para as células de muitos tecidos, como a pele,tendões, músculos e cartilagem; é um componente principal da matrizintercelular. HA também desempenha outras importantes partes nos processosbiológicos, como a hidratação dos tecidos, e lubrificação.

HA pode ser extraído dos tecidos naturais acima mencionados,embora hoje seja preferível prepará-lo por métodos microbiológicos paraminimizar o risco potencial de transferência de agentes infecciosos e paraaumentar a uniformidade, qualidade e disponibilidade do produto.

HA e suas várias frações de tamanho molecular e osrespectivos sais dos mesmos foram usados como medicamentos,especialmente no tratamento de artropatias, como um auxiliar e/ou agentesubstituto para órgãos e tecidos naturais, especialmente em oftalmologia ecirurgia cosmética, e como agentes em preparações cosméticas. Produtos dehialuronano também foram desenvolvidos para uso em ortopedia,reumatologia e dermatologia.

HA pode também ser usado como um aditivo para váriosmateriais poliméricos usados para artigos sanitários e cirúrgicos, comopoliuretanos, poliésteres etc. com o efeito de tornar estes materiaisbiocompatíveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se à preparação de uma nova geração deácido hialurônico derivado de reagentes vinil-sulfona monofuncionais.

Reagentes vinil-sulfona monofuncionais possuem a fórmulageral (CH2=CH-SO2-R) onde R é um grupo arila ou alquila que é,preferivelmente, mas não necessariamente, hidrofóbico. A reação que gera amodificação ocorre entre o grupo vinila reativo do reagente sulfona e asporções hidroxila do ácido hialurônico.

A invenção pode ser usada para preparar uma larga faixa dederivados dependendo da natureza do grupo pendente R. Compostoscomercialmente disponíveis no mercado incluem metil-, etil-, fenil, p-tolil-,octil- e outras alquil-/aril vinil sulfonas. Em contraste com divinil sulfona(DVS), reagentes R-vinil sulfona são monofuncionais, evitando assimqualquer reticulação do HA. Os derivados resultantes, modificados comgrupos hidrofóbicos, podem encontrar aplicação na indústria de cosméticoscomo emulsificantes ou em sistemas avançados de transferência comonanocápsulas. Podem também ser usados para umidificação da pele através deformação de filme. As propriedades dos derivados permitem a fabricação denovos biomateriais enquanto mantêm a biocompatibilidade ebiodegradabilidade do hialuronano original.

O método é baseado em uma química bem estabelecida (DVS foiusado por mais de 20 anos para reticular HA) e possui várias vantagens, sendo ummétodo muito versátil: o HA é usado como seu sal de sódio, a síntese pode serfeita em uma única etapa, a reação ocorre em temperatura ambiente, é umprocesso simples e curto, e a purificação subseqüente pode ser feita muitoeficientemente sem deixar nenhum resíduo de reagentes vinil sulfona.

Existe uma necessidade, particularmente nas indústriascosméticas e biomédicas, de compostos ou derivados baseados em ácidohialurônico que possuam certas características alteradas comparadas a HAnão modificado. Propriedades de interesse são capacidade melhorada deestabilizar espuma, e a capacidade de se misturar com materiais nãohidrofílicos como é usado tipicamente em produtos cosméticos.

A invenção provê produtos anfifílicos derivados de HA compropriedades benéficas em aplicações cosméticas ou biomédicas. Estes produtosse ligam mais fortemente à pele de modo que não são lavados tão facilmente. Osderivados AVS-HA são também adequados para uso em formulações cosméticasou biomédicas mais avançadas, por exemplo na formação de nano/macro cápsulasou nano/macro esferas para transferência de compostos ativos ou fármacos.Derivados AVS-HA de peso molecular (MW) mais baixo penetrarão na pele maiseficientemente do que HA não derivado de MW comparável.

Assim, em um primeiro aspecto a invenção refere-se a umderivado de ácido hialurônico contendo η unidades de repetição e tendo afórmula estrutural geral (I):

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em que, em pelo menos uma unidade de repetição, um ou maisentre RI, R2, R3, R4 consiste de uma aril/alquil sulfona ligada a éter tendo afórmula estrutural geral (II), em que R inclui um grupo alquila ou arila, e deoutra forma Rl, R2, R3, R4 são grupos hidroxila, OH:

<formula>formula see original document page 6</formula>Em outras palavras, um aspecto da invenção refere-se aum derivado de ácido hialurônico, em que um ou mais grupos hidroxilado ácido hialurônico foram reagidos com um ou mais compostosalquil/aril vinil sulfona monofuncionais, para formar uma ligação éterentre o ácido hialurônico e os um ou mais compostos alquil-/arilsulfona resultantes.

Em um segundo aspecto, a invenção refere-se a umderivado de ácido hialurônico, em que uma reação de adição ocorreu entreum ou mais grupos hidroxila do ácido hialurônico e um ou maiscompostos aril/alquil vinil sulfona monofuncionais, para formar umaligação éter entre o ácido hialurônico e os um ou mais compostos aril-alquil sulfona resultantes.

Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a um processo deprodução de um derivado de ácido hialurônico, o processo compreendendo asetapas de:

(a) reagir um ácido hialurônico com um ou mais compostosalquil-/aril-vinil sulfona tendo a fórmula estrutural geral (III) em condiçõesalcalinas em uma solução aquosa, sendo assim formado o derivado de ácidohialurônico; e

(b) recuperar o derivado de ácido hialurônico.

Em um quarto aspecto, a invenção refere-se a uma composiçãocontendo um derivado de ácido hialurônico conforme definido nos primeiroou segundo aspectos, e um ingrediente ativo, em que o ingrediente ativo épreferivelmente um agente farmacologicamente ativo.

Um quinto aspecto da invenção refere-se a uma composiçãofarmacêutica contendo uma quantidade eficaz de um derivado de ácidohialurônico como definido no primeiro ou segundo aspectos, junto com umcarreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Um sexto aspecto refere-se a uma composição farmacêuticacontendo uma quantidade eficaz de um derivado de ácido hialurônico comodefinido no primeiro ou segundo aspectos como um veículo, junto com umagente farmacologicamente ativo.

Um sétimo aspecto refere-se a um artigo cosmético contendocomo ingrediente ativo uma quantidade eficaz de um derivado de ácidohialurônico como definido no primeiro ou segundo aspectos, ou umacomposição como definida em quaisquer dos quarto, quinto, ou sextoaspectos.

Em um oitavo aspecto, a invenção refere-se a um artigo dehigiene, médico ou cirúrgico contendo um derivado de ácido hialurônicocomo definido no primeiro ou segundo aspectos, ou uma composição comodefinida em quaisquer dos quarto, quinto, ou sexto aspectos, sendo o artigopreferivelmente uma fralda, um absorvente, uma esponja cirúrgica, umaesponja para cicatrização de feridas, ou uma parte incluída em um band-aidou outro material de cobertura de feridas.

Um importante aspecto refere-se a uma cápsula oumicrocápsula de medicamente contendo um derivado de ácido hialurônicocomo definido no primeiro ou segundo aspectos, ou uma composição comodefinida em quaisquer dos quarto, quinto ou sexto aspectos.

Aspectos finais da invenção referem-se a métodos derealização de procedimentos em oftalmologia, no tratamento de osteoartriteou câncer, perda de cabelo ou calvície, de tratamento de feridas, deadministração dérmica ou transdérmica de um agente farmacologicamenteativo, ou administração dérmica de um cosmético, a melhoria que consiste nouso de um derivado de ácido hialurônico definido nos primeiro ou segundoaspectos uma composição definida em quaisquer dos quarto, quinto ou sextoaspectos. Vários aspectos referem-se a usos de um derivado de ácidohialurônico como definido em quaisquer dos primeiro ou segundo aspectos ouuma composição como definida em quaisquer dos quarto, quinto ou sextoaspectos, para a fabricação de um medicamento para o tratamento deosteoartrite, câncer, fabricação de um medicamento para um tratamentooftalmológico, fabricação de um medicamento para o tratamento de umaferida, fabricação de um medicamento para angiogênese, fabricação de ummedicamento para o tratamento de perda de cabelo ou calvície, ou fabricaçãode um hidratante.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Espectro 1H RMN (HA, 300 kDa).

Figura 2: Espectro 1H RMN, (PVS-HA de HA 300 kDa) razãoPVSiHA 1,5:1.

Figura 3: Espectro 1H RMN, (PVS-HA de HA 300 kDa) razãoPVS: HA 5:1.

Figura 4: Espectro 1H RMN, (PVS-HA de HA 300 kDa) razãoPVS :HA 10:1

Figura 5: Espectro IR, (PVS-HA de HA 300 kDa) razãoPVS :HA 10:1.

Figura 6: Espectro 1H RMN, (EVS-HA de HA 300 kDa) razãoEVS :HA 1,5:1.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Ácido hialurônico

"Ácido hialurônico" é definido aqui como umglicosaminoglicano não sulfatado composto de unidades de repetição dedissacarídeos de N-acetilglucosamina (GlcNAc) e ácido glucurônico(GlcUA)ligados por ligações glicosídicas alternadas beta-1,4 e beta-1,3. Acidohialurônico é também conhecido como hialuronano, hialuronato, ou HA. Ostermos hialuronano e ácido hialurônico são usados aqui intercambiavelmente.

Cristas de galo são uma fonte comercial significativa parahialuronano. Microorganismos são uma fonte alternativa. Patente U.S. No. 4801 539 divulga um método de fermentação para preparar ácido hialurônicoenvolvendo uma linhagem de Streptococcus zooepidemicus com rendimentosreportados de cerca de 3,6 g de ácido hialurônico por litro. Patente EuropéiaNo. EP0694616 divulga processos de fermentação usando uma linhagemmelhorada de Streptococcus zooepidemicus com rendimentos reportados decerca de 3,5 g de ácido hialurônico por litro. Como divulgado em WO03/054163 (Novozymes), que é aqui incorporado em sua totalidade, ácidohialurônico ou seus sais podem ser recombinantemente produzidos, porexemplo em um hospedeiro Bacillus gram-positivo.

Hialuronano sintases de vertebrados, patógenos bacterianos, evírus de algas foram descritos (DeAngelis, P. L., 1999, Cell Mol. Life Sei. 56:670-682). WO 99/23227 divulga uma hialuronato sintase do Grupo I deStreptococcus equisimilis. WO 99/51265 e WO 00/27437 descrevem umahialuronato sintase do Grupo II de Pasturella multoeida. Ferretti et al,divulgam o operon de hialuronano sintase de Streptoeoceus pyogenes, que écomposto de três genes, hasA, hasB, e hasC, que codificam hialuronatosintase, UDP glicose desidrogenase, e UDP-glicose pirofosforilase,respectivamente (Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 98, 4658-4663, 2001). WO99/51265 descreve um segmento de ácido nucléico tendo uma região decodificação para uma hialuronano sintase de Streptoeoceus equisimilis.

Como o hialuronano de uma célula recombinante de Bacillus éexpressa diretamente no meio de cultura, um processo simples pode ser usadopara isolar o hialuronano do meio de cultura. Primeiro as células e resíduoscelulares de Bacillus são fisicamente removidos do meio de cultura. O meiode cultura pode ser diluído primeiro, se desejado, para reduzir a viscosidadedo meio. Muitos métodos para remoção de células do meio de cultura sãoconhecidos dos especialistas na arte, como centrifugação ou microfiltração.Se desejado, o sobrenadante remanescente pode, então, ser filtrado, como porultrafiltração, para concentrar e remover pequenas moléculas contaminantesdo hialuronano. Após remoção das células e resíduos celulares, uma simplesprecipitação do hialuronano do meio é realizada por mecanismos conhecidos.Sal, álcool ou combinações de sal e álcool podem ser usados para precipitar ohialuronano do filtrado. Uma vez reduzido a um precipitado, o hialuronanopode ser facilmente isolado da solução por meios físicos. O hialuronano podeser seco ou concentrado a partir da solução de filtrado usando técnicas deevaporação conhecidas da arte como secagem por pulverização.

O primeiro aspecto da invenção refere-se a um derivado deácido hialurônico contendo η unidades de repetição e tendo a fórmulaestrutural geral (I):

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em que, em pelo menos uma unidade de repetição, um ou maisentre RI, R2, R3, R4 incluem uma aril/alquil sulfona ligada a éter tendo afórmula estrutural geral (II), em que R inclui um grupo alquila ou arila, e deoutra forma RI, R2, R3, R4 são grupos hidroxila, OH:

<formula>formula see original document page 11</formula>

Em outras palavras, um aspecto da invenção refere-se a umderivado de ácido hialurônico, em que uma reação de adição ocorreu entre umou mais grupos hidroxila do ácido hialurônico e um ou mais compostos aril-alquil-vinil sulfona monofuncionais, para formar uma ligação éter entre oácido hialurônico e os um ou mais compostos aril-/alquil sulfona resultantes.

Uma modalidade preferida refere-se ao derivado de ácidohialurônico da invenção, em que os um ou mais compostos aril-/alquil-vinilsulfona monofuncionais possuem a fórmula estrutural geral (III), em que Rconsiste de um grupo alquila ou arila.

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Ainda outra modalidade preferida refere-se ao derivado deácido hialurônico da invenção, em que dois ou mais entre R1, R2, R3, R4incluem uma ou mais aril/alquil sulfonas ligadas a éter tendo a fórmula geralestrutural (II); ou em que três ou mais entre R1, R2, R3, R4 incluem uma oumais aril/alquil sulfonas ligadas a éter tendo a fórmula geral estrutural (II); ou,na realidade, em que todos os R1, R2, R3, R4 incluem uma ou mais aril/alquilsulfonas ligadas a éter tendo a fórmula geral estrutural (II).

O principal sítio de reação ou adição no processo da invençãoé a hidroxila primária da unidade de repetição de ácido hialurônico, tambémmostrada como R4 na fórmula estrutural (I). Assim, uma modalidadepreferida refere-se ao derivado de HA da invenção, em que pelo menos R4inclui uma aril/alquil sulfona ligada a éter tendo a fórmula geral estrutural(II).

Imagina-se que muitos grupos diferentes alquila ou arila doscompostos alquil-/aril-vinil sulfona monofuncionais sejam adequados parauso na presente invenção. Uma modalidade preferida refere-se ao derivadoHA da invenção, em que R consiste de um grupo alquila, preferivelmente ogrupo alquila é hidrofóbico, preferivelmente o grupo alquila consiste de umgrupo C1-C20 alquila, preferivelmente metila, etila, propila, 2-octenila, 2-nonenila, 2- dodecenila, 2-hexadecenila, ou 2-octadecenila. Outra modalidadepreferida refere-se ao derivado HA da invenção, em que R consiste de umgrupo arila, preferivelmente o grupo arila é hidrofóbico, e maispreferivelmente o grupo arila é fenila ou p-toluila.Peso molecular

O nível de ácido hialurônico pode ser determinado de acordocom o método carbazol modificado (Bitter and Muir, 1962, Anal Biochem. 4:330-334). Além disso, o peso molecular médio do ácido hialurônico pode serdeterminado usando métodos padrões da arte, como os descritos por Ueno etal., 1988, Chem. Pharm. Buli. 36, 4971-4975; Wyatt, 1993, Anal. Chim. Acta272: 1-40; e Wyatt Technologies, 1999, "Light Scattering University DAWNCourse Manual" (Manual do curso de DAWN da Light Scattering University)e "DAWN EOS Manual" (Manual de DAWN EOS) Wyatt TechnologyCorporation, Santa Barbara, Califórnia.

Em uma modalidade preferida, os derivados de ácidohialurônico obtidos pelos métodos da presente invenção possuem um pesomolecular de cerca de 1000 a cerca de 10.000.000 Da. Em uma modalidademais preferida, os derivados de ácido hialurônico obtidos pelos métodos dapresente invenção possuem um peso molecular de cerca de 5.000 a cerca de5.000.000 Da. Em uma modalidade ainda mais preferida, os derivados deácido hialurônico obtidos pelos métodos da presente invenção possuem umpeso molecular de cerca de 10.000 a cerca de 3.000.000 Da.

Outra modalidade preferida refere-se ao produto do primeiroaspecto, em que o ácido hialurônico ou sal do mesmo tem um peso molecularna faixa de 300.000 a 3.000.000; preferivelmente na faixa de 400.000 a 2500.000; mais preferivelmente na faixa de 500.000 a 2.000.000; e no máximoda preferência na faixa de 600.000 a 1.800.000 Da.

Quando ácido hialurônico recombinantemente produzido ouseu sal é usado nos métodos da invenção para fabricar os produtos oucomposições da invenção, pode ser vantajoso em algumas aplicaçõesprimeiramente reduzir o peso molecular médio do ácido hialurônico ou deseus derivado ou sais. Por exemplo, foi verificado por vários fabricantes dasassim chamadas frações de baixo peso molecular de ácido hialurônico, de queelas são capazes de penetrar na barreira da pele para reestabelecer o teornatural de ácido hialurônico na pele; assim essas frações são particularmenteadequadas para composições cosméticas vendidas como agentes anti-envelhecimento da pele e agentes anti-rugas. Para aplicações alimentícias, foimostrado que ácido hialurônico de baixo peso molecular penetra na barreiragastrointestinal, aumentando assim sua biodisponibilidade. Finalmente, ácidohialurônico de baixo peso molecular apresenta efeito antiinflamatório e possuiaplicações potenciais no tratamento de doenças inflamatórias. Uma reduçãodo peso molecular médio de um ácido hialurônico ou derivado ou sal domesmo pode ser obtida por métodos padrões da arte, como tratamento térmicosimples, degradação enzimática, aplicação de ultra-som, ou hidrólise ácida.

Ver, por exemplo, Patente US 6 020 484, que descreve uma técnica deaplicação de ultra-som de HA incluindo NaOCl como aditivo, e T. Miyazakiet al. (2001) Polymer Degradation and Stability (Degradação e estabilidade depolímeros), 74: 77-85.

Assim, uma modalidade preferida refere-se ao derivado de HAda invenção, em que o ácido hialurônico ou derivado ou sal do mesmo temum baixo peso molecular médio na faixa de 10.000 a 3.000.000 Da;preferivelmente na faixa de 10.000 a 50.000 Da; ou preferivelmente na faixade 50.000 a 500.000 Da; ainda mais preferivelmente na faixa de 80.000 a300.000 Da.

Grau de substituição (DS)

DS foi determinado por espectroscopia 1H RMN (10 mg/ml,D2O, 80°C, 128 scans, 400 MHz) de acordo com o exemplo 6 abaixo, em queos picos do grupo OSA foram indicados com o uso de 2D-RMN (gCOSY). ODS foi então calculado comparando a intensidade dos prótons de vinila deOSA (5,4 e 5,6 ppm) com aquela dos prótons de acetila (2,0 ppm).

Em uma modalidade preferida o derivado de HA do primeiroaspecto tem um Grau de Substituição (DS) na faixa de 0,1 - 100%,preferivelmente 1 - 90%, mais preferivelmente 2 - 80%, ainda maispreferivelmente 4 - 70%, ainda mais preferivelmente 8 - 60%, ou 10 - 50%,14,40%, 16 - 30%, ou no máximo da preferência na faixa de 18 - 25%.

Produção

Nos métodos da presente invenção HA recombinantementeproduzido pode ser usado. Este tipo de HA pode ser produzido por umprocesso, em que as células hospedeiras produtoras de HA são cultivadas emum meio nutriente adequado para produção do ácido hialurônico usandométodos conhecidos na arte. Por exemplo, a célula pode ser cultivada emfrasco com sacudimento, fermentações em pequena ou grande escala(incluindo fermentações contínuas, em batelada, alimentação em batelada, oufermentações de estado sólido) em laboratório ou fermentadores industriaisrealizadas em um meio adequado e em condições que permitem que asenzimas envolvidas na síntese de ácido hialurônico sejam expressas e o ácidohialurônico isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequadocontendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usandoprocedimentos conhecidos na arte. Meios adequados são disponíveis defornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo comcomposições publicadas (por exemplo, em catálogos da American TypeCulture Collection). O ácido hialurônico secretado pode ser recuperadodiretamente do meio. O ácido hialurônico resultante pode ser isolado pormétodos conhecidos na arte. Por exemplo, o ácido hialurônico pode serisolado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, masnão limitados a, centrifugação, filtração, extração, secagem com pulverização,evaporação, ou precipitação. O ácido hialurônico isolado pode, então, seradicionalmente purificado por vários procedimentos conhecidos na arteincluindo, mas não se limitando a, cromatografia (por exemplo, de trocaiônica, de afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização, e de exclusão detamanho), procedimentos eletroforéticos (e.g., focalização isoelétricapreparatória), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfatode amônio), ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification (Purificaçãode proteínas), J.-C. Janson and Lars Ryden, editores, VCH Publishers, NovaIorque, 1989).

Células Hospedeiras

Uma modalidade preferida refere-se a onde o ácidohialurônico ou sal do mesmo é recombinantemente produzido,preferivelmente por uma bactéria ou célula hospedeira Gram-positiva, maispreferivelmente por uma bactéria do gênero Bacillus.

A célula hospedeira pode ser qualquer célula de Bacillusadequada para produção recombinante de ácido hialurônico. A célulahospedeira de Bacillus pode ser do tipo selvagem ou um mutante da mesma.Células de Bacillus úteis na prática da presente invenção incluem, mas não selimitam a, células de Bacillus agaraderhens, Bacillus alkalophilus, Bacillusamyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii,Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacilluslicheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillusstearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis. Célulasmutantes de Bacillus subtilis particularmente adaptadas para expressãorecombinante são descritas em WO 98/22598. Células de Bacillus nãoencapsulantes são particularmente úteis na presente invenção.

Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira de Bacillusé uma célula de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus clausii, Bacillus lentus,Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus ou Bacillus subtilis. Emuma modalidade mais preferida, a célula de Bacillus é uma célula de Bacillusamyloliquefaciens. Em outra modalidade mais preferida, a célula de Bacillus éuma célula de Bacillus clausii. Em outra modalidade mais preferida, a célulade Bacillus é uma célula de Bacillus lentus. Em outra modalidade maispreferida, a célula de Bacillus é uma célula de Bacillus licheniformis. Emoutra modalidade mais preferida, a célula de Bacillus é uma célula de Bacillussubtilisl Em uma modalidade mais preferida, a célula hospedeira de Bacillusé de Bacillus subtilis A 164Δ5 (ver Patente U.S. No. 5 891 701) ou Bacillussubtilis 168Δ4.

Transformação da célula hospedeira de Bacillus com umconstruto de ácido nucléico da presente invenção pode, por exemplo, serefetuada por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Chang e Cohen,1979, Molecular General Genetics (Genética geral molecular) 168: 111-115),usando células competentes ver, por exemplo, Young and Spizizen, 1961,Journal of Bacteriology 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff- Abelson, 1971,Journal of Molecular Biology 56: 209-221), CPOR eletropração (ver, porexemplo, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou porconjugação (ver, por exemplo, Koenler and Thome, 1987, Journal ofBacteriology 169: 5271-5278).

Processo de derivação

(a) reagir um ácido hialurônico com um ou mais compostosalquil-/aril-vinil sulfona tendo a fórmula estrutural geral (III) em condiçõesalcalinas em uma solução aquosa, formando assim o derivado de ácidohialurônico; e

(b) recuperar o derivado de ácido hialurônico.

Uma modalidade preferida refere-se ao processo do terceiroaspecto, em que o grupo alquila-/arila, R em (III) consiste de um grupoalquila, preferivelmente um grupo hidrofóbico; mais preferivelmente o grupoalquila consiste de um grupo C1-C20 alquila, e no máximo da preferência ogrupo alquila inclui metila, etila, propila, 2-octenila, 2-nonenila, 2-dodecenila, 2-hexadecenila, ou 2-octadecenila; ou em que o grupo alquila -/arila consiste de um grupo arila, preferivelmente um grupo arila hidrofóbico,e mais preferivelmente o grupo arila consistindo de fenila ou p-toluila.

É também preferível que diferentes compostos vinil sulfonamonofuncionais possam ser empregados ao mesmo tempo, levando àadição de vários compostos alquil- ou aril-sulfona à molécula de HA.Assim, uma modalidade preferida refere-se ao processo do terceiroaspecto, em que o um ou mais compostos alquil-/aril-vinil sulfonaincluem dois ou mais grupos alquila e/ou arila. Preferivelmente, os doisou mais grupos alquila-/arila diferentes compreendem um grupo alquila,preferivelmente um grupo alquila hidrofóbico; mais preferivelmente ogrupo alquila inclui um grupo Cr C20 alquila, e no máximo da preferênciao grupo alquila inclui metila, etila, propila, 2- octenila, 2-nonenila, 2-dodecenila, 2-hexadecenila, ou 2-octadecenila; ou os dois ou mais gruposalquila-/arila diferentes incluem um grupo arila, preferivelmente umgrupo arila hidrofóbico, e mais preferivelmente o grupo arila inclui fenilaou p-toluila.

Outros ingredientes

Em uma modalidade preferida, as composições contendoum derivado de HA da invenção podem também conter outrosingredientes, preferivelmente um ou mais ingredientes ativos,preferivelmente uma ou mais substâncias farmacologicamente ativas, etambém preferivelmente um excipiente solúvel em água, como lactose.Exemplos não limitativos de um ingrediente ativo ou substânciafarmacologicamente ativa que pode ser usada na presente invençãoincluem fármacos proteínicos ou peptídicos, como, hormônio docrescimento humano, hormônio do crescimento bovino, hormônio docrescimento porcino, hormônio/peptídeo liberador de hormônio docrescimento, fator estimulante de colônias de granulócitos, fatorestimulante de colônias de granulócitos-macrófagos, fator estimulante decolônias de macrófagos, eritropoietina, proteína morfogênica óssea,interferon ou derivado do mesmo, insulina ou derivado da mesma,atriopeptina- III, anticorpo monoclonal, fator de necrose tumoral, fator deativação de macrófagos, interleucina, fator de degeneração de tumor, fatorde crescimento similar a insulina, fator de crescimento epidérmico,ativador plasminogênico tecidual, fator HV, fator IMV, e uroquinase.

Um excipiente solúvel em água pode ser incluído para afinalidade de estabilizar o(s) ingrediente(s) ativo(s), esse excipientepodendo incluir uma proteína, por exemplo, albumina ou gelatina; umaminoácido, como glicina, alanina, ácido glutâmico, arginina, lisina e umsal do mesmo; carboidrato como glicose, lactose, xilose, galactose, frutose,maltose, sacarose, dextrana, manitol, sorbitol, trealose e condroitin sulfato;um sal inorgânico como fosfato; um tensoativo como TWEEN® (ICI), polietileno glicol, e uma mistura dos mesmos. O excipiente ou estabilizadorpode ser usado em uma quantidade na faixa de 0,001 a 99% em peso doproduto. Vários aspectos da invenção referem-se a várias composições eprodutos farmacêuticos contendo, entre outros constituintes, umaquantidade eficaz do produto como definido no primeiro aspecto, e umingrediente ativo; preferivelmente o ingrediente ativo é um agentefarmacologicamente ativo; um carreador, excipiente ou diluentefarmaceuticamente aceitável, preferivelmente um excipiente solúvel emágua, e no máximo da preferência lactose. Além disso, aspectos dainvenção referem-se a artigos contendo um derivado de HA como definidono primeiro aspecto ou uma composição definida nos aspectos emodalidades acima, por exemplo, um artigo cosmético, um artigo sanitário,um artigo médico ou cirúrgico. Em um aspecto final, a invenção refere-se auma cápsula ou microcápsula de medicamento contendo um produto comodefinido no primeiro aspecto ou uma composição como definido em outrosaspectos e modalidades da invenção.EXEMPLOS

Exemplo 1. HA derivado de fenil vinil sulfona (PVS), (PVS-HA) com razão PVS:HA de 1,5:1

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Tabela 1

HA foi dissolvido em água milliQ (10 ml.) de um dia para ooutro em temperatura ambiente. NaOH foi acrescentado à solução aquosa deHA com agitação. PVS foi dissolvido em acetona (10 mL) e a soluçãoresultante foi adicionada em gotas após 4-5 minutos usando um funil deseparação. A mistura foi agitada de um dia para o outro em temperaturaambiente. A mistura bruta foi, então, purificada em um saco de diálise(Spectra/Por®, corte 14 kDa) imerso em água milliQ (7,5 L). A água milliQfoi trocada três vezes, após 3 horas, em seguida após uma noite e finalmenteapós 3 horas. A diálise foi monitorada por medições de condutividade da águamilliQ e interrompida quando a condutividade era de menos de 5 μ8/αη. Oproduto purificado foi finalmente diluído em água milliQ (50 m L) e seco porcongelamento.

A reação forneceu um material branco esponjoso de 94,5 mg,parcialmente solúvel em água milliQ. A composição do produto purificado foianalisada por TLC. Os valores de tempo de retenção mostraram que nenhumPVS residual permaneceu no produto purificado. A estrutura do produtopurificado foi verificada por 1H RMN e revelou um grau de substituição (DS)de 11% por unidade de repetição de dissacarídeo (Figura 2). FT-IR foitambém usado para confirmar a formação de HA derivado de fenil-vinilsulfona.

Um estudo da influência da quantidade de PVS envolvido nareação foi realizado. Este estudo mostrou que quantidades mais altos de PVSforneceram graus mais altos de substituição. Estes ficaram tipicamente entre11 % e 55% para razões PVS: HA na faixa de 5:1 a 10:1 (Exemplo 2).

Exemplo 2. HA derivado de fenil vinil sulfona (PVS), (PVS-HA) com razão PVSrHA de 5:1 e 10:1

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Tabela 2

Os derivados acima foram preparados de acordo com o métododescrito no Exemplo 1. A razão NaOH:HA foi de 1:1. O grau de substituiçãodos derivados é mostrado na tabela 3.

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Tabela 3: Grau de substituição de derivados PVS-HA de razões PVS :HA de5:1 e 10:1

Figura 3 e figura 4 representam os espectros RMN dosderivados. A figura 5 representa um espectro IR que confirma o enxerto de

PVS em cadeias de HA. Atribuição das bandas é apresentada na tabela 4.

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Tabela 4. Número de onda e natureza das bandas adicionais observadas noespectro PVA-HA comparados aos do espectro HA (razão PVS:HA 10:1).Exemplo 3. HA derivado de etil vinil sulfona (EVS), (EVS-HA) com razãoEVSrHA de 1,5:1

<table>table see original document page 22</column></row><table>

Tabela 5.

O derivado de EVS-HA foi preparado de acordo com o5 método descrito no Exemplo 1. A reação forneceu um material brancoesponjoso, solúvel em água milliQ (12,5 g/L). A estrutura do produtopurificado foi verificada por 1H RMN e revelou um grau de substituição de13,5 % por unidade de repetição de dissacarídeo (figura 6). O último foicalculado comparando o sinal de prótons de metila no substituinte e deprótons de metila no HA.

Claims

1. Derivado de ácido hialurônico, caracterizado pelo fato deconter η unidades de repetição e tendo a fórmula estrutural geral (I): <formula>formula see original document page 23</formula> em que, em pelo menos uma unidade de repetição, um ou maisentre RI, R2, R3, R4 consiste de uma aril/alquil sulfona ligada a éter tendo afórmula estrutural geral (II), em que R inclui um grupo alquila ou arila, e deoutra forma RI, R2, R3, R4 são grupos hidroxila, OH: <formula>formula see original document page 23</formula>

2. Derivado de ácido hialurônico de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato que dois ou mais entre RI, R2, R3,R4 incluem uma ou mais aril/alquil sulfonas ligadas a éter tendo a fórmulageral estrutural (II).

3. Derivado de ácido hialurônico de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato que três ou mais entre RI, R2,R3, R4 incluem uma ou mais aril/alquil sulfonas ligadas a éter tendo afórmula geral estrutural (II).

4. Derivado de ácido hialurônico de acordo com quaisquer dasreivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato que todos os RI, R2, R3, R4contêm uma ou mais aril/alquil sulfonas ligadas a éter tendo a fórmula geralestrutural (II).

5. Derivado de ácido hialurônico de acordo com quaisquer dasreivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato que pelo menos R4 contém umaaril/alquil sulfona ligada a éter tendo a fórmula geral estrutural (II).

6. Derivado de ácido hialurônico de acordo com quaisquer dasreivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato que R consiste de um grupoalquila, sendo o grupo alquila preferivelmente hidrofóbico.

7. Derivado de ácido hialurônico de acordo com areivindicação 6, caracterizado pelo fato que o grupo alquila é um grupo CrC20 alquila, preferivelmente metila, etila, propila, 2-octenila, 2-nonenila, 2-dodecenila, 2- hexadecenila, ou 2-octadecenila.

8. Derivado de ácido hialurônico de acordo com quaisquer dasreivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato que R consiste de um grupo arila,o grupo arila sendo preferivelmente hidrofóbico, e mais preferivelmentesendo fenila ou p-toluila.

9. Derivado de ácido hialurônico de acordo com quaisquer dasreivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ter um peso molecular médiode 10.000 a 3.000.000 Da.

10. Derivado de ácido hialurônico de acordo com areivindicação 9, caracterizado pelo fato de ter um peso molecular médio de- 10.000 a 50.000 Da.

11. Derivado de ácido hialurônico de acordo com areivindicação 9, caracterizado pelo fato de ter um peso molecular médio de- 50.000 a 500.000 Da, preferivelmente de 80.000 a 300.000 Da.

12. Derivado de ácido hialurônico de acordo com quaisquerdas reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato que o Grau de substituição(DS) fica na faixa de 0,1 - 100%, preferivelmente 1 - 90%, maispreferivelmente 2 - 80%, ainda mais preferivelmente 4 - 70%, ainda maispreferivelmente 8 - 60%, ou 10 - 50%, 14 - 40%, 16 - 30%, ou no máximo dapreferência na faixa de 18 - 25%, determinado como aqui definido.

13. Derivado de ácido hialurônico de acordo com quaisquerdas reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato que o ácido hialurônico érecombinantemente produzido, preferivelmente em um hospedeiro Bacillus.

14. Derivado de ácido hialurônico, caracterizado pela reaçãode adição ocorrida entre um ou mais grupos hidroxila do ácido hialurônicocom um ou mais compostos aril/alquil-vinil sulfona monofiincionais, paraformar uma ligação éter entre o ácido hialurônico e o um ou mais compostosaril/alquil sulfona resultantes.

15. Derivado de ácido hialurônico de acordo com areivindicação 14, caracterizado pelo fato de ter um peso molecular médio de-10.000 a 3.000.000 Da.

16. Derivado de ácido hialurônico de acordo com areivindicação 15, caracterizado pelo fato de ter um peso molecular médio de-10.000 a 50.000 Da.

17. Derivado de ácido hialurônico de acordo com areivindicação 15, caracterizado pelo fato de ter um peso molecular médio de-50.000 a 500.000 Da, preferivelmente de 80.000 a 300.000 Da.

18. Derivado de ácido hialurônico de acordo com quaisquerdas reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato que o um ou maiscompostos aril-/alquil-vinil mono- funcionais têm a fórmula geral estrutural(III), em que R inclui um grupo alquila ou arila.<formula>formula see original document page 25</formula>

19. Derivado de ácido hialurônico de acordo com quaisquerdas reivindicações 14 a 18, caracterizado pelo fato que o grupo alquila/arilaconsiste de um grupo alquila, preferivelmente um grupo alquila hidrofóbico,mais preferivelmente um grupo C1-C20 alquila, e no máximo da preferênciaum grupo metila, etila, propila, 2-octenila, 2-nonenila, 2-dodecenila, 2-hexadecenila, ou 2-octadecenila.

20. Derivado de ácido hialurônico de acordo com areivindicação 18, caracterizado pelo fato que o grupo alquila/arila consiste deum grupo arila, preferivelmente um grupo arila hidrofóbico.

21. Derivado de ácido hialurônico de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato que o grupo arila contém fenila ou p-toluila.

22. Derivado de ácido hialurônico de acordo com quaisquerdas reivindicações 14 a 21, caracterizado pelo fato que o Grau de substituição(DS) fica na faixa de 0,1 - 100%, preferivelmente 1 - 90%, maispreferivelmente 2 - 80%, ainda mais preferivelmente 4 - 70%, ainda maispreferivelmente 8 - 60%, ou 10 - 50%, 14 - 40%, 16 - 30%, ou no máximo dapreferência na faixa de 18 - 25%, determinada como aqui definida.

23. Derivado de ácido hialurônico de acordo com quaisquerdas reivindicações 14 a 22, caracterizado pelo fato que o ácido hialurônico érecombinantemente produzido, preferivelmente em um hospedeiro Bacillus.

24. Processo para produção de um derivado de ácidohialurônico, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:(a) reagir um ácido hialurônico com um ou mais compostosalquil-/aril-vinil sulfona tendo a fórmula estrutural geral (III) em condiçõesalcalinas em uma solução aquosa, sendo assim formado o derivado de ácidohialurônico; e(b) recuperar o derivado de ácido hialurônico

25. Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato que o grupo alquila/arila, R em (III), consiste de um grupo alquila,preferivelmente um grupo alquila hidrofóbico, mais preferivelmente umgrupo C1-C2O alquila, e no máximo da preferência metila, etila, propila, 2-octenila, 2-nonenila, 2-dodecenila, 2-hexadecenila, ou 2-octadecenila.

26. Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato que o grupo alquila/arila consiste de um grupo arila, preferivelmenteum grupo arila hidrofóbico, e mais preferivelmente um grupo fenila ou p-toluila.

27. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações 24 a-26, caracterizado pelo fato que o um ou mais compostos alquil-/aril-vinilsulfona incluem dois ou mais grupos alquila e/ou arila diferentes.

28. Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato que os dois ou mais grupos alquila/arila diferentes incluem umgrupo alquila, preferivelmente um grupo alquila hidrofóbico, maispreferivelmente um grupo CrC20 alquila, e no máximo da preferência o grupoalquila é metila, etila, propila, 2-octenila, 2-nonenila, 2-dodecenila, 2-hexadecenila, ou 2-octadecenila.

29. Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato que os dois ou mais grupos alquila/arila diferentes incluem umgrupo arila, preferivelmente um grupo arila hidrofóbico, e maispreferivelmente o grupo arila é fenila ou p-toluila.

30. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações 24 a-29, caracterizado pelo fato que o ácido hialurônico tem um peso molecularmédio de 10.000 a 3.000.000 Da.

31. Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de ter peso molecular médio de 10.000 a 50.000 Da.

32. Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de ter peso molecular médio de 50.000 a 500.000 Da,preferivelmente de 80.000 a 300.000 Da.

33. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações 24 a-32, caracterizado pelo fato que o derivado de ácido hialurônico tem um Graude substituição (DS) na faixa de 0,1 - 100%, preferivelmente 1 - 90%, maispreferivelmente 2 - 80%, ainda mais preferivelmente 4 - 70%, ainda maispreferivelmente 8 - 60%, o 10 - 50%, 14 - 40%, 16 - 30%, ou no máximo dapreferência na faixa de 18 - 25%, determinado como aqui definido.

34. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações 24 a-33, caracterizado pelo fato que ácido hialurônico é recombinantementeproduzido, preferivelmente em um hospedeiro Bacillus.

35. Composição, caracterizada pelo fato de compreender umderivado de ácido hialurônico como definido em quaisquer das reivindicações1 a 23 e um ingrediente ativo, preferivelmente o ingrediente ativo sendo umagente farmacologicamente ativo.

36. Composição de acordo com a reivindicação 35, distinguidopelo fato de que também contém um excipiente solúvel em água,preferivelmente lactose.

37. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender uma quantidade eficaz de um derivado de ácido hialurônicocomo definido em quaisquer das reivindicações 1 a 23, junto com umcarreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

38. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender uma quantidade eficaz de um derivado de ácido hialurônicocomo definido em quaisquer das reivindicações 1 a 23 como um veículo,junto com um agente farmacologicamente ativo.

39. Artigo cosmético, caracterizado pelo fato de compreenderum derivado de ácido hialurônico como definido em quaisquer dasreivindicações 1 a 23 ou uma composição como definida em quaisquer dasreivindicações 35 a 38.

40. Artigo cosmético, caracterizado pelo fato de compreendercomo um ingrediente ativo uma quantidade eficaz de um derivado de ácidohialurônico como definido em quaisquer das reivindicações 1 a 23 ou umacomposição como definida em quaisquer das reivindicações 35 a 38.

41. Artigo sanitário, médico ou cirúrgico, caracterizado pelofato de compreender um derivado de ácido hialurônico como definido emquaisquer das reivindicações 1 a 23 ou uma composição como definida emquaisquer das reivindicações 35 a 38; sendo o artigo preferivelmente umafralda, um absorvente, uma esponja cirúrgica, uma esponja para cicatrizaçãode feridas, ou uma parte incluída em um band-aid ou outro material decobertura de feridas.

42. Cápsula ou microcápsula de medicamento, caracterizadapelo fato de compreender um derivado de ácido hialurônico como definidoem quaisquer das reivindicações 1 a 23 ou uma composição como definida emquaisquer das reivindicações 35 a 38.

43. Método para realizar procedimentos em oftalmologia,caracterizado pelo fato de que compreende o uso de um derivado de ácidohialurônico como definido em quaisquer das reivindicações 1 a 23, ou umacomposição como definida em quaisquer das reivindicações 35 a 38.

44. Método para realizar procedimentos no tratamento deosteoartrite, caracterizado pelo fato de que consiste no uso de um derivado deácido hialurônico como definido em quaisquer das reivindicações 1 a 23, ouuma composição como definida em quaisquer das reivindicações 35 a 38.

45. Método para realizar procedimentos no tratamento decâncer, caracterizado pelo fato de que compreende o uso de um derivado deácido hialurônico como definido em quaisquer das reivindicações 1 a 23, ouuma composição como definida em quaisquer das reivindicações 35 a 38.

46. Método para realizar administração transdérmica de umagente farmacologicamente ativo, caracterizado pelo fato de que compreendeo uso de um derivado de ácido hialurônico como definido em quaisquer dasreivindicações 1 a 23, ou uma composição como definida em quaisquer dasreivindicações 35 a 38.

47. Método para realizar administração dérmica de um agentefarmacologicamente ativo, caracterizado pelo fato de que compreende o usode um derivado de ácido hialurônico como definido em quaisquer dasreivindicações 1 a 23, ou uma composição como definida em quaisquer dasreivindicações 35 a 38.

48. Método para realizar administração dérmica de umcosmético, caracterizado pelo fato de compreender o uso de um derivado deácido hialurônico como definido em quaisquer das reivindicações 1 a 23, ouuma composição como definida em quaisquer das reivindicações 35 a 38.

49. Método para realizar procedimentos no tratamento deperda de cabelo ou calvície, caracterizado pelo fato de que compreende o usode um derivado de ácido hialurônico como definido em quaisquer dasreivindicações 1 a 23, ou uma composição como definida em quaisquer dasreivindicações 35 a 38.

50. Método oftalmológico, caracterizado pelo fato de ser deuso de um derivado de ácido hialurônico como definido em quaisquer dasreivindicações 1 a 23, ou de uma composição como definida em quaisquer dasreivindicações 35 a 38.

51. Método de tratamento de osteoartrite, caracterizado pelofato de compreender administrar uma quantidade eficaz de um derivado deácido hialurônico como definido em quaisquer das reivindicações 1 a 23 ouuma composição como definida em quaisquer das reivindicações 35 a 38 a ummamífero, sendo a administração preferivelmente dérmica, transdérmica, oral,ou por injeção.

52. Método de tratamento de uma ferida, caracterizado pelofato de compreender administrar uma quantidade eficaz de um derivado deácido hialurônico como definido em quaisquer das reivindicações 1 a 23 ouuma composição como definida em quaisquer das reivindicações 35 a 38 a ummamífero.

53. Método de tratamento de perda de cabelo ou calvície,caracterizado pelo fato de compreender administrar uma quantidade eficaz deum derivado de ácido hialurônico como definido em quaisquer dasreivindicações 1 a 23 ou uma composição como definida em quaisquer dasreivindicações 35 a 38 a um mamífero, sendo a administração preferivelmentedérmica, transdérmica, oral, ou por injeção.

54. Uso de um derivado de ácido hialurônico como definidoem quaisquer das reivindicações 1 a 23 ou de uma composição como definidaem quaisquer das reivindicações 35 a 38, caracterizado pelo fato de ser para afabricação de um medicamento para o tratamento de osteoartrite.

55. Uso de um derivado de ácido hialurônico como definidoem quaisquer das reivindicações 1 a 23 ou de uma composição como definidaem quaisquer das reivindicações 35 a 38, caracterizado pelo fato de ser para afabricação de um medicamento para tratamento oftalmológico.

56. Uso de um derivado de ácido hialurônico como definidoem quaisquer das reivindicações 1 a 23 ou de uma composição como definidaem quaisquer das reivindicações 35 a 38, caracterizado pelo fato de ser parafabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

57. Uso de um derivado de ácido hialurônico como definidoem quaisquer das reivindicações 1 a 23 ou de uma de composição comodefinida em quaisquer das reivindicações 35 a 38, caracterizado pelo fato deser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma ferida.

58. Uso de um derivado de ácido hialurônico como definidoem quaisquer das reivindicações 1 a 23 ou de uma composição como definidaem quaisquer das reivindicações 35 a 38, caracterizado pelo fato de ser para afabricação de um medicamento para angiogênese.

59. Uso de um derivado de ácido hialurônico como definidoem quaisquer das reivindicações 1 a 23 ou de uma composição como definidaem quaisquer das reivindicações 35 a 38, caracterizado pelo fato de ser para afabricação de um hidratante.

60. Uso de um derivado de ácido hialurônico como definidoem quaisquer das reivindicações 1 a 23 ou de uma composição definida emquaisquer das reivindicações 35 a 38, caracterizado pelo fato de ser para afabricação de um medicamento para o tratamento de perda de cabelo oucalvície.