BRPI0708153A2 - métodos e composições para tratar hiperalgesia - Google Patents

Abstract

MéTODOS E COMPOSIçõES PARA TRATAR HIPERALG ESIA. Essa invenção proporciona compostos os quais inibem especificamente TRPA1, porém não inibem outros membros da família de canais iónicos termoTRP. São também fornecidos na invenção métodos do uso de inibidores TRPA1-específicos para tratar ou aliviar dores mediadas pela sensação mecânica nociva.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS ECOMPOSIÇÕES PARA TRATAR HIPERALGESIA".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Esse pedido de patente reivindica o benefício de prioridade sobU.S.C. 35 §119(e) ao Pedido de Patente Provisório No. 60/775.519, requeri-do em 21 de fevereiro de 2006. A descoberta do pedido de prioridade é aquiincorporada por referência na sua totalidade e para todos os propósitos.

DECLARAÇÃO SOBRE O SUPORTE GOVERNAMENTAL

Essa invenção foi feita em parte com o suporte do governo sob aConcessão NINDS Nos. NS42822 e NS046303, ganha pelo National Institu-tes of Health. O Governo dos Estados Unidos pode, deste modo, ter certosdireitos sobre esta invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere de um modo geral aos métodos ecomposições para antagonizar um canal iônico envolvido na sensação tér-mica, sensação mecânica e sensação química nociva. Mais particularmente,a invenção se refere aos compostos que inibem especificamente a transdu-ção mecânica mediada por TRPA1, e aos métodos de uso de tais compostospara tratar a hiperalgesia mecânica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os neurônios sensoriais dos gânglios da raiz dorsal (DRGs) po-dem detectar alterações ambientais através de projeções na pele. A noci-cepção é o processo pelo qual o estímulo nocivo, tal como calor e toque, fazcom que os neurônios sensoriais (nociceptores) na pele enviem sinais para osistema nervoso central. Alguns desses neurônios ou são mecanossensíveis(de limiar alto ou baixo) ou termossensíveis (resposta de quente, morno oufrio). Ainda outros neurônios, chamados de nociceptores polimodais, sentemestímulos nocivos tanto térmicos (frio e quente) quanto mecânicos.

Os canais iônicos desempenham um papel central na neurobio-logia como proteínas de amplitude de membrana que regulam o fluxo de íons.Categorizadas de acordo com os seus mecanismos de fechamento, os ca-nais iônicos podem ser ativados por sinais tais como Iigantes específicos,voltagem ou força mecânica. Um subgrupo da família dos canais de cálciode Potencial Receptor Transiente (TRP) dublaram os termo TRPs implicouna sensação térmica, por exemplo, TRPM8 e TRPA1. TRPM8 é ativado a25°C. Ele também é o receptor para o composto mentol, proporcionandouma explicação molecular do por que flavores de menta são tipicamentepercebidos como refrigerantes de modo refrescante. TRPA1, também cha-mado de ANKTM1, é ativado a 17°C. Ele é um canal iônico expresso emneurônios sensoriais polimodais e pode ser ativado por frio nocivo e por umavariedade de compostos dolorosos naturais que causam uma sensação dequeimado/dor. Ver1 por exemplo, Patapoutian et al., Nat. Rev. Neurosci. 4 :529 a 539, 2003; Story et al., Cell 112: 819 a 829, 2003; e Bandell et al.,Neuron. 41: 849 a 57, 2004.

A sensação mecânica está emaranhadamente ligada aos esta-dos de dor em muitas doenças e condições médicas. Por exemplo, a trans-dução mecânica é um componente importante da sensação de dor associa-da com artrite e dor neuropática. Entretanto, ao contrário daquela para asensação térmica nociva, a identidade molecular dos canais de transduçãomecânica responsáveis pela sensação de forças mecânicas nocivas que sãorelevantes para a dor é desconhecida. A presente invenção se refere a es-sas e a outras necessidades não-atendidas na técnica.

RESUMO DA INVENÇÃO

Num aspecto, a presente invenção proporciona métodos paratratar a hiperalgesia num indivíduo. Os métodos envolvem a administraçãoao indivíduo de uma composição farmacêutica que compreende uma quanti-dade eficaz de um antagonista TRPA1 o qual, pelo bloqueio específico daativação de TRPA1, suprime ou inibe a sensação química, sensação térmicae sensação mecânica nociva no indivíduo. Em alguns dos métodos, o anta-gonista TRPA1 empregado não bloqueia a ativação de um ou mais dos ou-tros termoTRPs selecionados do grupo consistindo em TRPV1, TRPV2,TRPV3, TRPV4 e TRPM8. Em alguns métodos, o antagonista TRPA1 usadoé (Z)-4-(4-clorofinil)-3-metilbut-3-en-2-oxima. Em alguns outros métodos, oantagonista TRPA1 usado é N,N'-bis-(2-hidroxibenzil)-2,5-diamino-2,5-dime-tilexano. Em alguns outros métodos, um anticorpo antagonista TRPA1 é em-pregado.

Alguns dos métodos terapêuticos da invenção são direcionadosa tratar indivíduos sofrendo de condições inflamatórias ou de dores neuropá-ticas. Em alguns dos métodos, o indivíduo sendo tratado sofre de hiperalge-sia mecânica ou térmica. Em alguns métodos, o indivíduo sendo tratado éum humano. Além do antagonista TRPA1, um segundo agente redutor dedor é administrado ao indivíduo em alguns dos métodos terapêuticos. Porexemplo, o segundo agente redutor de dor pode ser um agente analgésicoselecionado do grupo consistindo em acetaminofeno, ibuprofeno e indome-tacina e opióides. O segundo agente redutor de dor também pode ser umagente analgésico selecionado do grupo consistindo ou de morfina ou demoxonidina.

Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para identifi-car um agente que iniba ou suprima a sensação mecânica nociva. Essesmétodos requerem (a) o contato dos compostos de teste com uma célulaque expresse o canal iônico do receptor de potencial transitório TRPA1, e (b)a identificação do composto que inibe uma atividade de sinalização de umTRPA1 numa célula em resposta a um estímulo mecânico. Em alguns des-ses métodos, os compostos identificados são ainda examinados quanto aoefeito na ativação das atividades de sinalização de um ou mais dos termo-TRPs selecionados do grupo consistindo em TRPV1, TRPV2, TRPV3,TRPV4 e TRPM8. Em alguns métodos, o composto identificado suprime oureduz a atividade de sinalização do canal iônico de TRPA1 ativado em rela-ção à atividade de sinalização do canal iônico de TRPA1 na ausência docomposto. Em alguns dos métodos, o composto identificado não bloqueia aativação de um ou mais termoTRPs selecionados do grupo consistindo emTRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 e TRPM8.

Em alguns desses métodos de varredura, o canal iônico TRPA1é ativado por um agonista TRPA1 selecionado do grupo consistindo em al-deído cinâmico, eugenol, gingerol, salicilato de metila e alicina. Exemplos decélulas que podem ser empregadas nesses métodos incluem uma célulaCHO expressando TRPA1, um oócito de Xenopus expressando TRPA1 e umneurônio DRG cultivado. A atividade de sinalização a ser monitorada nosmétodos pode ser, por exemplo, a corrente elétrica induzida por TRPA1 a-través da membrana da célula ou de influxo de cálcio na célula. O estímulomecânico aplicado na varredura pode ser, por exemplo, de pressão por suc-ção ou estresse hiperosmótico.

A invenção ainda proporciona um uso de um inibidor específicode TRPA1 na produção de um medicamento para tratar a hiperalgesia térmi-ca ou mecânica num indivíduo. Os inibidores específicos de TRPA1 a seremempregados são, por exemplo, (Z)-4-(4-clorofinil)-3-metilbut-3-en-2-oxima ouN,N'-bis-(2-hidroxibenzil)-2,5-diamino-2,5-dimetilexano. Composições farma-cêuticas compreendendo os inibidores específicos de TRPA1 também sãofornecidas na invenção.

Outro entendimento da natureza e vantagens da presente inven-ção podem ser constatados por referência às porções remanescentes daespecificação e reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figuras 1A a 1D mostram que TRPA1 é ativada por estímulomecânico. (A) Correntes registradas de células expressando TRPA1 em res-posta ao frio (direita, η = 62), osmolaridade hipertônica (meio, η = 8) e (-)pressão (esquerda, η = 10) aplicado da pipeta de registro; (B) relação cor-rente-voltagem representativa em resposta a diferentes estímulos que ati-vam TRPA1. (C) Células TRPA1 apresentam respostas robustas de correnteem relação a pressões negativas de -90 mmHg ou superiores. Valores nasbarras preenchidas demonstram uma quantidade de respostas fora de todosos trechos testados na pressão relevante. (D) Um pré-pulso de frio sublimiarsensibiliza a resposta das células TRPA1 a um estímulo mecânico de baixolimiar (n= 5).

As Figuras 2A a 2D mostram que as respostas mecânicas deTRPA1 são bloqueadas por vários agentes conhecidos. (A) Gd3+ bloqueiacompetitivamente a ativação de corrente do TRPA1 na hiperosmolaridade (n =5 de 5 células) tal como o vermelho de rutênio 5 μΜ (n = 5 de 5 células parapressão (-) e η = 6 de 6 células para hiperosmolaridade). (B) um neurônioDRG sensível a aldeído cinâmico responde a -200 mm Hg e à capsaicina. Arelação corrente-voltagem em resposta à pressão negativa (coletada do localcom um asterisco no traço) é apresentada. (C) Cânfora 2 mM bloqueia com-pletamente a ativação de corrente do TRPA1 na pressão (-) em células CHO(n = 5). (D) Cânfora 2 mM bloqueia completamente a corrente de resposta àpressão (-) dos neurônios DRG (n = 15 de 18 células testadas com pressão(-). Em 12 das 15 células as correntes também foram ativadas por aldeídocinâmico 500 μΜ.

As Figuras 3A a 3D mostram que o Composto 18 bloqueia a ati-vação de TRPA1. (A) Estruturas químicas do composto 18 (acima) e aldeídocinâmico (abaixo). (B) relações dose-resposta para bloquear o influxo decálcio pelo composto 18 em camundongos expressando células CHO e TR-PA1 humana eliciada por 50 μΜ de aldeído cinâmico (painel esquerdo). Oinfluxo de cálcio foi medido usando um ensaio FLIPR padrão, os pontos dedados são a média de 4 poços (~ 8.000 células/poço) e as barras de erroapresentam o erro padrão. Os valores são normalizados até a resposta má-xima (observada na ausência do composto 18). Os valores de IC5o são de3,1 μΜ e de 4,5 μΜ para humanos e camundongos, respectivamente. Ocomposto 18 moda a EC50 do aldeído cinâmico em TRPA1 de camundongopara a direita de um modo dependente de concentração (painel da direita).Os dados foram gerados usando o ensaio de influxo de cálcio FLIPR, η = 3poços 8.000 células/poço) e normalizados até a resposta máxima. As bar-ras mostram o erro padrão e as curvas sólidas são ajustes de equação hilldas quais os valores de EC5O são derivados. Os valores de EC50 para o alde-ído cinâmico são de 50 μΜ (controle), 111 μΜ (10 μΜ de composto 18) e220 μΜ (25 μΜ de composto 18). As respostas máximas foram de magnitu-de similar em todos os casos. (C) Relação corrente-voltagem de TRPA1. Ascorrentes retificadoras externas auxiliadas pelo aldeído cinâmico (painel es-querdo) em macro fragmentos às avessas de oócitos Xenopus expressandoTRPA1 foram suprimidas pelas coaplicações do composto 18 (painel da di-reita). (D) Composto 18 suprime os comportamentos nociceptivos agudos noaldeído cinâmico, porém não na capsaicina. O tempo gasto dando pancadase golpes nas patas traseiras injetadas com aldeído cinâmico (16,4 mM) oucapsaicina (0,328 mM) é medido por 5 min e comparado com a pata traseirade outro animal coinjetado com o composto 18 (1 mM). A quantidade de ca-sos para cada experimento da esquerda é de 8, 8, 6 e 6, respectivamente(*** ρ < 0,001, *p < 0,05, teste T de Student bicaudal).

As Figuras 4A a 4D mostram que o TRPA1 medeia a hipersensi-bilidade mecânica e ao frio sob inflamação (A - B). Um novo bloqueador deTRPA1, o composto 18, reverte os comportamentos mecânicos nociceptivosinduzidos por CFA - (n = 8) ou BK (n = 12), porém não os comportamentostérmicos (n = 8 para cada um de CFA e BK) em camundongos. Os símbolosvermelhos representam respostas das patas traseiras injetadas com CFA (A)ou BK (B), enquanto que os símbolos azuis representam as respostas dasoutras patas traseiras não-injetadas dos mesmos animais. Círculos repre-sentam respostas ao tratamento com composto 18, enquanto que triângulosrepresentam respostas aos tratamentos com veículo (A - C). Limiares VonFrey são medidos e é feita a média. (*** ρ < 0,001, *p < 0,05, teste T de Stu-dent bicaudal). (C) Composto 18 reverte os comportamentos ao frio de ratosinjetados com CFA. Os símbolos vermelhos representam as respostas depatas traseiras injetadas com CFA enquanto que os símbolos azuis repre-sentam as respostas das outras patas traseiras não-injetadas dos mesmosanimais. A quantidade de pancadas, golpes, levantamentos da pata por 10min em cada ponto de tempo são contados e feita uma média (n = 8, *p <0,05, teste T de Student bicaudal). (D) Pré-pulso de 1 nM de BK sensibiliza aresposta da TRPA1 das células CHO co-expressando o receptor B2 até umestímulo mecânico de baixo limiar. Cânfora 2 mM foi incubada durante o pul-so de BK para proteger a ativação branda e a subseqüente dessensibiliza-ção de TRPA1 por BK. Os resultados indicam que o limiar mecânico das cé-lulas foi reduzido até-60 mmHg.

DESCRIÇÃO DETALHADA

I. Visão geral

A presente invenção é predicada em parte nas descobertas pe-los presentes inventores de que o TRPA1, além de ser um importante com-ponente da sensação de dor que sinaliza a temperatura de frio nociva, tam-bém é um sensor para o estímulo mecânico nocivo. Os inventores tambémidentificaram compostos que inibem especificamente a ativação de TRPA1,porém não a de outros canais iônicos da família Trp. Conforme detalhadonos Exemplos abaixo, os presentes inventores descobriram que TRPA1 éativado por forças mecânicas nocivas, e que essa ativação é facilitada sobcondições inflamatórias. Foi ainda descoberto que pequemos inibidores mo-leculares de TRPA1 podem reduzir significativamente o comportamento no-ciceptivo em resposta ao aldeído cinâmico, porém não à capsaicina em ca-mundongos. Além disso, os inibidores bloqueiam a hiperalgesia mecânica epor frio, porém não a hiperalgesia por calor.

De acordo com essas descobertas, a invenção proporciona mé-todos de varredura para agentes terapêuticos que podem ser usados parasuprimir ou inibir a sensação mecânica nociva. São também fornecidos nainvenção métodos do emprego de inibidores específicos para TRPA1 paraaliviar dores associadas com estímulos mecânicos nocivos em várias doen-ças e condições. As seguintes seções proporcionam orientações para fazere usar as composições da invenção, e para executar os métodos da inven-ção.

II. Definições

A não ser que seja definido de outra forma, todos os termos téc-nicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que aqueles comu-mente entendidos pelas pessoas normalmente versadas na técnica às quaisessa invenção pertence. As seguintes referências proporcionam uma pessoaversada com uma definição geral de muitos dos termos usados nessa inven-ção: Singleton et al., Dictionary of Microbiology And Molecular Biology(2â ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed., 1988); e Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary ofBiology (1991). Além disso, as seguintes definições são fornecidas paraajudar ao leitor na prática da invenção.

O termo "agente" ou "agente de teste" inclui qualquer substân-cia, molécula, elemento, composto, entidade ou uma combinação destes.Ele inclui, porém não está limitado a, por exemplo, proteína, polipeptídeo,molécula orgânica pequena, polissacarídeo, polinucleotídeo e semelhantes.Ele pode ser um produto natural, um composto sintético ou um compostoquímico, ou uma combinação de duas ou mais substâncias. A não ser queseja especificado de outra forma, os termos "agente", "substância" e "com-posto" são usados aqui intercambiavelmente.

O termo "análogo" é aqui usado para se referir a uma moléculaque lembra estruturalmente uma molécula de referência, porém a qual tenhasido modificada de um modo alvejado e controlado, pela substituição de umsubstituinte específico da molécula de referência com um substituinte alter-nado. Em comparação com a molécula de referência, poderia se esperar poruma pessoa versada na técnica que um análogo, exibisse uma utilidade i-gual, similar ou melhorada. A síntese e a varredura dos análogos para identi-ficar variantes de compostos conhecidos com características melhoradas (talcomo maior afinidade de ligação para uma molécula alvo) é uma abordagemque é bem conhecida na química farmacêutica.

Conforme aqui utilizado, "em contato" tem seu significado normale se refere à combinação de dois ou mais agentes (por exemplo, polipeptí-deos ou compostos moleculares pequenos) ou combinação de agentes ecélulas. O contato pode ocorrer in vitro, por exemplo, pela combinação dedois ou mais agentes, ou pela combinação de um agente de teste e umacélula ou um Iisato celular num tubo de ensaio ou outro recipiente. O contatotambém pode ocorrer numa célula ou in situ, por exemplo, pelo contato dedois polipeptídeos numa célula pela co-expressão na célula de polinucleotí-deos recombinantes codificando os dois polipeptídeos, ou num Iisato celular.

Conforme aqui utilizado, "hiperalgesia" ou "um estado hiperalgé-sico" se refere a uma condição na qual um animal de sangue quente é ex-tremamente sensível a estímulos mecânicos, químicos ou térmicos que, naausência da condição, poderiam ser indolores. A hiperalgesia é conhecidapor acompanhar certos ferimentos físicas ao corpo, por exemplo, o ferimentoinevitavelmente causado por uma cirurgia. A hiperalgesia também é conhe-cida por acompanhar certas condições inflamatórias no homem, tal como asdoenças artrítica e reumática. Hiperalgesia, deste modo, se refere à dorbranda a moderada a severa, tal como a dor associada com, porém não limi-tada, a condições inflamatórias (por exemplo, tal como artrite reumatóide eosteoartrite), dor pós-operatória, dor pós-parto, a dor associada com as con-dições de dentárias (por exemplo, cáries dentárias e gengivite), a dor asso-ciada com queimaduras, incluindo porém sem se limitar a queimaduras desol, abrasões, contusões e semelhantes, a dor associada com ferimentos etorceduras de esporte, condições de pele inflamatórias incluindo, porém semse limitar ao sumagre venenoso, e erupções de pele alérgicas e dermatite, eoutras dores que aumentam a sensibilidade ao estímulo brando, tal como frionocivo.

O termo "modula", em relação a uma proteína de referência (porexemplo, um TRPA1) se refere à inibição ou ativação de uma atividade bio-lógica da proteína de referência (por exemplo, uma atividade relacionadacom a sinalização de dor de TRPA1). A modulação pode ser a supra-regulação (isto é, a ativação ou estimulação) ou infra-regulação (isto é, inibi-ção ou supressão). O modo de ação pode ser direto, por exemplo, atravésda ligação à proteína de referência como um ligante. A modulação tambémpode ser indireta, por exemplo, através da ligação a e/ou modificação deoutra molécula a qual, de outro modo, se liga a e modula a proteína de refe-rência.

"Dor neuropática" engloba dor oriunda de condições ou eventosque resultam em dano aos nervos. "Neuropatia" se refere a um processo dedoença resultando em dano aos nervos. "Causalgia" denota um estado dedor crônica após injúria ao nervo ou uma condição ou evento, tal como en-farte cardíaco, que causa a referida dor. "Alodinia" compreende uma condi-ção na qual uma pessoa experimenta dor em resposta a um estímulo nor-malmente indolor, tal como um toque suave. Um "agente analgésico" é umamolécula ou combinação de moléculas que causa uma redução na dor. Umagente analgésico emprega um mecanismo de ação diferente da inibição doTRPA1 quando seu mecanismo de ação não envolve a ligação direta (atra-vés de interações eletrostáticas ou químicas) a e a redução na função doTRPA1.

"Polinucleotídeo" ou "seqüência de ácidos nucléicos" se refere auma forma polimérica de nucleotídeos (polirribonucleotídeo ou polidesoxirri-bonucleotídeo). Em alguns exemplos, um polinucleotídeo se refere a umaseqüência que não é imediatamente contígua com qualquer uma das se-qüências codificadoras com a qual ele é imediatamente contíguo (uma naextremidade 5' e uma na extremidade 3') no genoma de ocorrência naturaldo organismo a partir do qual ele é derivado. O termo, deste modo, inclui porexemplo um DNA recombinante o qual é incorporado num vetor; num vírusou plasmídeo de replicação autonômica; ou no DNA genômico de um proca-rioto ou eucarioto, ou o qual existe como uma molécula separada (por e-xemplo, um DNAc) independente de outras seqüências. Polinucleotídeospodem ser ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos ou formas modificadasde qualquer nucleotídeo.

Um polipeptídeo ou proteína (por exemplo, TRPA1) se refere aum polímero no qual os monômeros são resíduos de aminoácidos que sãounidos através de ligações amida. Quando os aminoácidos são alfa-aminoácidos, ou o isômero L-ótico ou o isômero D-ótico pode ser usado, osL-isômeros sendo típicos. Um polipeptídeo ou fragmento de proteína (porexemplo, de TRPA1) pode ter uma seqüência de aminoácidos igual ou subs-tancialmente idêntica à proteína de ocorrência natural. Um polipeptídeo oupeptídeo com uma seqüência substancialmente idêntica significa que umaseqüência de aminoácidos é extensamente, porém não totalmente igual, po-rém retém uma atividade funcional da seqüência a qual ela está relacionada.

Polipeptídeos podem ser substancialmente relacionados devidoa substituições conservativas, por exemplo, TRPA1 e variante TRPA1 con-tendo tais substituições. Uma variação conservativa denota a substituição deum resíduo de aminoácido por outro resíduo biologicamente semelhante.Exemplos de variações conservativas incluem a substituição de um resíduohidrofóbico tal como isoleucina, valina, Ieucina ou metionina por outro, ou asubstituição de um resíduo polar por outro, tal como a substituição de argini-na por lisina, ácidos glutâmico por aspártico, ou glutamina por asparagina, esemelhantes. Outros exemplos ilustrativos de substituições conservativasincluem as alterações de: alanina para serina; arginina para lisina; asparagi-na para glutamina ou histidina; aspartato para glutamato; cisteína para seri-na; glutamina para asparagina; glutamato para aspartato; glicina para proli-na; histidina para asparagina ou glutamina; isoleucina pra Ieucina ou valina;Ieucina para valina ou isoleucina; lisina para arginina, glutamina ou glutama-to; metionina para Iecina ou isoleucina; fenilalanina para tirosina; Ieucina oumetionina; serina para treonina; valina para isoleucina ou leucina.

O termo "indivíduo" inclui mamíferos, especialmente humanos,assim como outros animais não-humanos, por exemplo, cavalos, cachorrose gatos.

Uma "variante" de uma molécula de referência (por exemplo, umpolipeptídeo TRPA1 ou um modulador TRPA1) é tencionado a se referir auma molécula substancialmente similar em estrutura e atividade biológica oua uma molécula de referência inteira ou a um fragmento seu. Deste modo,contanto que duas moléculas possuam uma atividade semelhante, elas sãoconsideradas variantes uma vez que esse termo é aqui utilizado mesmo se acomposição ou estrutura secundária, terciária ou quaternária de uma dasmoléculas não for idêntica àquela encontrada na outra, ou se a seqüência deresíduos de aminoácidos não for idêntica.

III. Inibidores específicos do TRPA1

Uma vez que o TRPA1 é um receptor para estímulos químicos,térmicos e mecânicos nocivos, os compostos antagonistas do TRPA1 sãoúteis na redução da dor associada com a somatossensação, incluindo sen-sação mecânica, por exemplo, hiperalgesia e alodinia mecânica. Os com-postos que inibem especificamente ou suprimem a sensação mecânica me-diada por TRPA1 podem ter várias aplicações terapêuticas ou profiláticas(por exemplo, antinociceptiva). Qualquer molécula que iniba o canal iônicodo TRPA1 deve ser capaz de reduzir a dor mediada pelos estímulos nocivos,tais como sensação mecânica. Entretanto, moléculas as quais são capazesde inibir outros termoTRPs (por exemplo, TRPV1, TRPV2, TRPV3 e TRPM8)além do TRPA1 podem interferir com as várias funções efetuadas por aque-las moléculas. Tais inibidores não-seletivos de TRPA1, embora sendo capa-zes de reduzir a dor, são propensos a ter muitos efeitos colaterais indeseja-dos. Deste modo, moléculas que inibem seletivamente o canal iônico doTRPA1 são preferidas em tais aplicações terapêuticas. Pela inibição especi-ficamente da sinalização mediada por TRPA1 enquanto não causa efeito nasinalização dos outros termoTRPs, sintomas de um indivíduo sofrendo dehiperestesia mecânica podem ser reduzidos ou inibidos.

Inibidores do TRPA1 que podem ser empregados na prática dapresente invenção incluem compostos que interferem com a expressão, mo-dificação, regulação ou ativação do TRPA1, ou compostos que infra-regulamuma ou mais das atividades biológicas do TRPA1 (por exemplo, seu canaliônico). Um inibidor seletivo do TRPA1 significativamente bloqueia a ativaçãodo TRPA1 ou inibe as atividades de sinalização do TRPA1 numa concentra-ção na qual as atividades de ativação ou sinalização dos outros termoTRPs(por exemplo, TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 e/ou TRPM8) não são signi-ficativamente afetados. vários antagonistas TRPA1-específicos podem serusados na presente invenção. Alguns desses inibidores TRPA1 -específicossão identificados pelos presentes inventores, conforme descrito nos Exem-pios abaixo. Esses compostos podem ser obtidos comercialmente ou são, deoutro modo, descritos na técnica. Um desses compostos é o Composto 18,(Z)-4-(4-clorofinil)-3-metilbut-3-en-2-oxima. Esse composto pode ser obtidocomercialmente da Maybridge (Cornwall, Reino Unido). Outro exemplo é oComposto 40, N,N'-bis-(2-hidroxibenzil)-2,5-diamino-2,5-dimetilexano, o qualfoi descrito na Patente Americana No. de Série 4.129.556. Conforme mos-trado nos Exemplos abaixo, esses dois compostos são capazes de inibir es-pecificamente a ativação ou função do TRPA1, e desse modo suprimem anorcicepção mecânica mediada por TRPA1. Eles têm pouco ou nenhum efei-to na ativação ou atividades dos outro termoTRPs tais como TRPV1,TRPV2, TRPV3, TRPV4, ou TRPM8. Deste modo, esses dois compostospodem ser prontamente usados para tratar ou aliviar a hiperalgesia mecâni-ca conforme descrito em maiores detalhes abaixo.Além desses antagonistas TRPA1-específicos exemplificados,inibidores TRPA1-específicos adicionais podem ser prontamente identifica-dos usando métodos aqui descritos ou métodos que tenham sido descritosna técnica. Novos antagonistas TRPA1 que podem ser identificados comesses métodos de varredura incluem moléculas de compostos orgânicospequenas e anticorpos antagonistas que inibem especificamente a atividadedo TRPA1 na sensação de estímulos mecânicos. Anticorpos antagonistas deTRPA1, preferivelmente anticorpos monoclonais, podem ser gerados usandométodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a produção de anticorposmonoclonais não-humanos, por exemplo, de murinos ou ratos, pode serconseguida, por exemplo, pela imunização do animal com um polipeptídeoTRPA1 ou seu fragmento (ver Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Ma-nual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque, 1988). Tal imunó-geno pode ser obtido de uma fonte natural, por síntese de peptídeos ou porexpressão recombinante.

Novas moléculas pequenas do TRPA1 podem ser identificadaspela varredura dos compostos de teste quanto à capacidade de inibir as ati-vidades do canal tônico de TRPA1. Para fazer a varredura dos compostosque antagonizam as atividades de sinalização de TRPA1, o TRPA1 deve serprimeiramente ativado. Uma forma de conseguir isso é aplicar frio. Entretan-to, essa abordagem não é prática num formato de varredura de alta produti-vidade. Nos métodos descritos no Pedido PCT W005/089206, um compostoantagonista TRPA1 tal como bradicinina, eugenol, gingerol, salicilato de me-tila, alicina e aldeído cinâmico é usado para ativar o TRPA1. Compostos deteste podem, deste modo, ser varridos quanto à capacidade de bloquear aativação de TRPA1 por qualquer um desses agonistas de TRPA1 ou inibir asatividades de sinalização de um canal tônico de TRPA1 ativado.

A título de exemplo, os métodos de varredura da presente in-venção envolvem tipicamente o contato de uma célula expressando TRPA1com os compostos de teste, e a identificação de um composto que suprimeou inibe uma atividade biológica ou de sinalização do TRPA1 ativado na cé-lula em resposta a um estímulo mecânico.TRPAI na célula pode ser ativadopela adição de um dos compostos agonistas TRPA1 mencionados acimaanteriormente, concorrentemente com ou depois do contato da célula comos compostos de teste. Os compostos podem ser varridos quanto à capaci-dade de modular o influxo de cálcio ou o nível de cálcio livre intracelular deuma célula expressando TRPA-1 ou um neurônio DRG cultivado em respos-ta a um estímulo mecânico. Conforme descrito nos Exemplos aqui, o efeitomodulador dos compostos de teste numa sensação mecânica mediada porTRPA1 pode ser examinado pelo ensaio FLIPR usando células CHO ex-pressando TRPA-1 ou DRGs de rato cultivados em resposta a uma pressãomecânica (por exemplo, sunction) ou estresse hiperosmótico. Eles tambémpodem ser examinados para a atividade na modulação das correntes demembrana da célula inteira de células expressando TRPA-1, por exemplo,pelo registro de correntes de TRPA1 induzidas por aldeído cinâmico em pe-daços cortados de oócitos Xenopus. Preferivelmente1 esses métodos de var-redura são efetuados num formato de alta produtividade. Por exemplo, cadacomposto teste pode ser colocado em contato com uma célula expressandoTRPA-1 num diferente poço de uma placa de micropipetas. O agonista TR-PA1 está presente em cada um desses poços para ativar TRPA1.

Se um composto teste suprimir ou inibir a atividade do TRPA1ativado (por exemplo, uma atividade de canal iônico), um antagonista ou ini-bidor TRPA1 candidato é identificado. Como controle, o antagonista TRPA1candidato também é testado para qualquer efeito na sinalização ou nas ati-vidades do canal iônico de um ou mais dos outros canais termoTRP, con-forme ilustrado nos Exemplos abaixo. Isso permite a identificação de inibido-res específicos para o TRPA-1 que poderiam não afetar as funções normaisdos outros canais termoTRP. Em algumas modalidades, o antagonista TR-PA1-específico identificado pode ser ainda examinado em modelos animaisadequados in vivo, por exemplo, pelos ensaios comportamentais (ensaio deretirada da pata) com ratos ou camundongos conforme descrito nos Exem-pios abaixo. Orientações adicionais para efetuar ensaios de hiperalgesia fo-ram descritos na literatura, por exemplo, Morqrich et al., Science 307: 1468,2005; e Caterina et al., Science 288: 306, 2000. Como controle, modelosanimais semelhantes também podem ser empregados para averiguar que osantagonistas TRPA-1 específicos candidatos não têm qualquer efeito signifi-cativo nos outros termoTRPs in vivo.

Os compostos de teste que podem ser varridos para novos mo-duladores TRPA1 (por exemplo, inibidores) incluem polipeptídeos, beta-volta(beta-turn) miméticos, polissacarídeos, fosfolipídeos, hormônios, prosta-glandinas, esteróides, compostos aromáticos, compostos heterocíclicos,benzodiazepinas, glicinas N-substituídas oligoméricas, oligocarbamatos, po-linucleotídeos (por exemplo, ácidos nucléicos inibitórios tais como siRNAs)polipeptídeos, sacarídeos, ácidos graxos, esteróides, purinas, pirimidinas,derivados, análogos estruturais ou combinações suas. Alguns agentes deteste são moléculas sintéticas, e outras moléculas naturais. Em alguns mé-todos preferidos, os agentes de teste são pequenas moléculas orgânicas(por exemplo, moléculas com um peso molecular não maior do que cerca de500 ou 1.000). Preferivelmente, ensaios de alta produtividade são adaptadose usados para varrer por tais moléculas pequenas. Em alguns métodos, bi-bliotecas combinatoriais de agentes de teste de moléculas pequenas podemser prontamente empregados para varrer por moduladores de moléculaspequenas de TRPA1. Uma variedade de ensaios conhecidos na técnica po-de ser prontamente identificada ou adaptada na prática dos métodos de var-redura da presente invenção, por exemplo, conforme descrito em Schultz etal., Bioorg Med Chem Lett 8: 2409 a 2414, 1998; Weller et al., Mol Divers. 3:61 a 70, 1997; Fernandes et al., Curr Opin Chem Biol 2: 597 a 603, 1998; eSittampalam et al., Curr Opin Chem Biol 1: 384 a 91,1997.

IV. Tratamento de hiperalaesia mecânica com inibidores TRPA-1específicos

A invenção proporciona métodos para reduzir a sensação de dorsob condições fisiológicas e patofisiológicas (por exemplo, alodinia e hipe-ralgesia), especialmente a percepção da dor que está associada com oumediada pela sensação mecânica através do TRPA1. Por exemplo, a hipe-ralgesia mecânica está presente em muitos distúrbios médicos. Por exem-plo, inflamação pode induzir a hiperalgesia. Exemplos das condições infla-matórias incluem osteoartrite, colite, cardite, dermatite, miosite, neurite, do-enças colágeno-vasculares tais como artrite reumatóide e lúpus. Indivíduoscom qualquer uma dessas condições geralmente experimentam sensaçõesde dor das quais a hiperalgesia mecânica é um componente. Outras condi-ções médicas ou procedimentos que podem causar dor excessiva incluemtrauma, cirurgia, amputação, abscesso, causalgia, doenças desmíelinizan-tes, neuralgia trigeminal, alcoolismo crônico, apoplexia, síndrome da dor ta-lâmica, diabetes, infecções câncer virais e quimioterapia. A sensação mecâ-nica pode desempenhar um papel importante na norcicepção de qualqueruma dessas condições.

Tipicamente, os métodos envolvem a administração a um indiví-duo necessitado de tratamento de uma composição farmacêutica que con-tém um inibidor específico de TRPA-1 da presente invenção. O inibidor es-pecífico de TRPA-1 pode ser usado sozinho ou juntamente com outros agen-tes analgésicos para aliviar a dor num indivíduo. Exemplos de tais agentesanalgésicos conhecidos incluem morfina e moxonidina (Patente AmericanaNo. 6.117.879). Indivíduos que são adequados para o tratamento com osmétodos da invenção são aqueles os quais sofrem de hiperestesia mecânica(particularmente hiperalgesia) ou aqueles os quais têm uma condição médi-ca ou distúrbio no qual a sensação mecânica nociva desempenha um papel.Eles incluem indivíduos humanos, mamíferos não-humanos e outros indiví-duos ou organismos que expressam TRPA1. Os indivíduos podem ter umacondição adiantada que esteja no momento causando dor e seja provável decontinuar a causar dor. Eles podem estar passando ou estarão passando porum procedimento ou evento que geralmente tenha conseqüências dolorosas.Por exemplo, o indivíduo pode ter condições dolorosas crônicas tais comohiperalgesia neuropática diabética ou doenças colágeno-vasculares. O indi-víduo pode também ter inflamação, danos aos nervos ou exposição à toxina(incluindo exposição a agentes quimioterapêuticos). O tratamento ou inter-venção é tencionado a reduzir ou diminuir a dor num indivíduo de modo queo nível de dor que o indivíduo sente seja reduzido em relação ao nível de dorque o indivíduo poderia sentir se ele não recebesse o tratamento.Geralmente, o tratamento deve afetar um indivíduo, tecido oucélula para obter um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeitopode ser profilático em termos de prevenir completamente ou parcialmenteuma doença ou sinal ou sintoma seu. Ele também pode ser terapêutico emtermos de uma cura parcial ou completa para distúrbios associados com hi-peralgesia e dor nociceptiva e/ou efeitos adversos (por exemplo, dor) queseja atribuível aos distúrbios. Onde o indivíduo é um humano, o nível de dorque a pessoa percebe pode ser avaliado pedindo para que ele ou a ela des-creva a dor ou a compare com outras experiências dolorosas. Alternativa-mente, os níveis de dor podem ser calibrados pela medição das respostasfísicas do indivíduo à dor, tal como a liberação de fatores relacionados com oestresse ou a atividade dos nervos transdutores de dor no sistema nervosoperiférico ou no SNC. Uma pessoa também pode calibrar os níveis de dormedindo a quantidade de um analgésico bem caracterizado requerido parauma pessoa reportar que não há dor ou para um indivíduo parar de exibir ossintomas de dor.

Preferivelmente, os métodos são direcionados para aliviar dor ouaguda ou crônica, a qual tenha um componente de hiperalgesia mecânico. Adiferença entre dor "aguda" e "crônica" é uma questão de tempo: a dor agu-da é experimentada logo (preferivelmente dentro de cerca de 48 horas, maispreferivelmente dentro de cerca de 24 horas, mais preferivelmente dentro decerca de 12 horas) depois da ocorrência do evento (tal como inflamação ouinjúria ao nervo) que leva a tal dor. Ao contrário, existe um intervalo de tem-po significativo entre a experiência da dor crônica e a ocorrência do eventoque leva a tal dor. Tal intervalo de tempo é de pelo menos 48 horas depoisde tal evento, preferivelmente de pelo menos cerca de 96 horas depois de talevento, mais preferivelmente de pelo menos cerca de uma semana depoisde tal evento. Em algumas modalidades da invenção, um inibidor TRPA-1específico é usado para tratar um indivíduo sofrendo de uma dor inflamató-ria. Tal dor inflamatória pode ser aguda ou crônica e pode ser devido a qual-quer quantidade de condições caracterizadas por inflamação incluindo, semlimitação, queimaduras de sol, artrite reumatóide, osteoartrite, colite, cardite,dermatite, miosite, neurite e doenças colágeno-vasculares.

Em algumas outras modalidades, o tratamento de indivíduoscom dor neuropática é tencionado. Esses indivíduos podem ter uma neuro-patia classificada como uma radiculopatia, mononeuropatia, mononeuropatiamultiplex, polineuropatia ou plexopatia. Doenças nessas classes podem sercausadas por uma variedade de condições ou procedimentos que causemdanos ao nervo incluindo, sem limitação, trauma, apoplexia, doenças desmi-elinizantes, abscesso, cirurgia, amputação, doenças inflamatórias dos ner-vos, causalgia, diabetes, doenças colágeno-vasculares, neuralgia trigeminal,artrite reumatóide, toxinas, câncer (o qual pode causar danos ao nervo dire-tos (por exemplo, paraneoplástico) ou remotos), alcoolismo crônico, infecçãopor herpes, AIDS e quimioterapia. Danos de nervos causando hiperalgesiapode ser nos nervos periféricos ou do SNC. Essa modalidade da invenção ébaseada nos experimentos mostrando que a administração de um inibidorTRPA1 diminui significativamente a hiperalgesia devido a diabetes, quimiote-rapia ou injúria ao nervo traumática.

Em algumas modalidades da invenção, indivíduos necessitadosde tratamento ou alívio de hiperalgesia mecânica são administrados comuma composição combinando um inibidor de TRPA1 com um ou mais agen-tes redutores de dor adicionais. Isso ocorre porque uma medicação para dorindividual geralmente proporciona um alívio de dor somente parcialmenteeficaz porque ela interfere com somente uma via transdutora de dor dentremuitas. Entretanto, dor associada com doenças ou condições médicas ge-ralmente envolve múltiplos norciceptores e diferentes vias de sinalização,por exemplo, tanto a sensação mecânica quanto a sensação térmica. Destemodo, mais de um agente redutor de dor é geralmente necessário para alivi-ar a norcicepção nessas situações. Em algumas outras aplicações, inibido-res de TRPA1 podem ser administrados juntamente com um agente analgé-sico que age num ponto diferente no processo de percepção da dor. Por e-xemplo, uma classe de analgésicos, tais como AINES (por exemplo aceta-minofeno, ibuprofeno e indometacina) infra-regulam os mensageiros quími-cos dos estímulos que são detectados pelos nociceptores. Outra classe defármacos, tais como opióides, alteram o processamento da informação noci-ceptiva no SNC. Outros analgésicos, tais como anestésicos locais incluindoanticonvulsivantes e antidepressivos também podem ser incluídos. A admi-nistração de uma ou mais classes de fármacos além dos inibidores de TR-PA1 pode proporcionar uma melhora mais eficaz de dor.

V. Composições farmacêuticas e administraçãoIndivíduos necessitados de tratamento ou alívio de dor mediadapor sensação mecânica nociva podem ser administrados somente com umcomposto inibidor TRPA1-específico. Entretanto, a administração de umacomposição farmacêutica que contém o inibidor específico de TRPA1 é maispreferida. Exemplos de inibidores específicos de TRPA-1 que podem serempregados nas composições farmacêuticas incluem o Composto 18 ou oComposto 40 descritos nos Exemplos abaixo. Novos inibidores de TRPAIque podem ser identificados de acordo com os métodos de varredura da in-venção também podem ser usados. A invenção também proporciona umacombinação farmacêutica, por exemplo, um kit. Tal combinação farmacêuti-ca pode conter um agente ativo, o qual é um composto inibidor de TRPA1aqui revelado, na forma livre ou numa composição, pelo menos um co-agente, assim como instruções para administração dos agentes.

As composições farmacêuticas que compreendem um compostoinibidor de TRPA1 podem ser preparadas de várias formas. Formas de pre-paração farmacêuticas sólidas ou líquidas adequadas são, por exemplo,grânulos, pós, comprimidos, comprimidos revestidos, (micro)cápsulas, supo-sitórios, xaropes, emulsões, suspensões, cremes, aerossóis, gotas ou solu-ções injetáveis numa forma de ampola e também, preparações com libera-ção prolongada dos compostos ativos. Elas podem ser preparadas de acor-do com os protocolos padrões bem conhecidos na técnica, por exemplo,fíemington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., LippincottWilliams & Wilkins (20§p ed., 2003). As composições farmacêuticas tipica-mente contêm uma quantidade eficaz do composto inibidor de TRPA1 que ésuficiente para reduzir ou melhorar a dor associada com ou mediada porTRPA1. Além dos compostos inibidores de TRPA1, as composições farma-cêuticas também podem conter certos veículos os quais intensificam ou es-tabilizam a composição ou facilitam a preparação da composição. Por e-xemplo, o composto inibidor de TRPA1 pode ser complexado com proteínascarreadoras tais como ovalbumina ou albumina sérica antes de sua adminis-tração para aumentar a estabilidade ou propriedades farmacológicas. Asvárias formas de composições farmacêuticas também podem conter excipi-entes e aditivos e/ou adjuvantes tais como desintegrantes, ligantes, agentesde revestimento, agentes de dilatação, lubrificantes, flavorizantes, adoçantese elixires contendo diluentes inertes comumente usados na técnica, tal comoágua purificada.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis são determinados emparte pela composição particular sendo administrada, assim como pelo mé-todo particular usado para administrar a composição. Eles também devemser tanto farmaceuticamente quanto fisiologicamente aceitáveis no sentidode serem compatíveis com os outros ingredientes e não prejudiciais ao indi-víduo. O veículo pode tomar uma ampla variedade de formas dependendoda forma da preparação desejada para a administração, por exemplo, oral,sublingual, retal, nasal, intravenosa ou parenteral. Por exemplo, exemplos desolventes não-aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetaistais como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato deetila. Veículos para recheios oclusivos podem ser usados para aumentar apermeabilidade da pele e aumentar a absorção de antígeno. Formas de do-sagem líquidas para administração oral podem geralmente compreenderuma solução de Iipossoma contendo a forma de dosagem líquida.

A composição farmacêutica contendo um composto inibidor deTRPA1 pode ser administrado localmente ou sistemicamente numa quanti-dade ou dose terapeuticamente eficaz. Eles podem ser administrados paren-teralmente, entericamente, por injeção, infusão rápida, absorção nasofarín-gea, absorção dérmica, retalmente e oralmente. Uma quantidade eficaz sig-nifica uma quantidade que seja suficiente para reduzir ou inibir uma dor no-ciceptiva ou uma resposta nociceptiva num indivíduo. Tal quantidade eficazvaria de indivíduo para indivíduo, dependendo da sensibilidade normal doindivíduo à dor, sua altura, peso, idade e saúde, à fonte de dor, ao modo deadministração do inibidor de TRPA1, ao inibidor particular administrado e aoutros fatores. Como resultado, é recomendável determinar empiricamenteuma quantidade eficaz para um indivíduo particular sob um grupo particularde circunstâncias.

Para um dado composto inibidor de TRPA1, uma pessoa versa-da na técnica pode facilmente identificar a quantidade eficaz de um agenteque modula uma resposta nociceptiva pelo uso de métodos farmacêuticosrotineiramente praticados. Tipicamente, dosagens usadas in vitro podemproporcionar orientação útil nas quantidades úteis para administração in situda composição farmacêutica, e modelos animais podem ser usados paradeterminar dosagens efetivas para o tratamento de distúrbios particulares.Mais comumente, uma dose terapêutica adequada pode ser determinada porestudos clínicos em espécies de mamíferos para determinar a dose máximatolerável e em indivíduos humanos normais para determinar a dose segura.Exceto sob certas circunstâncias quando dosagens maiores podem ser ne-cessárias, a dosagem preferida de um inibidor TRPA1 específico geralmentefica dentro da faixa de cerca de 0,001 até cerca de 1.000 mg, mais usual-mente de cerca de 0,01 até cerca de 500 mg por dia. Como regra geral, aquantidade de inibidor TRPA1 específico administrada é a menor dosagem aqual previne ou minimiza efetivamente e confiavelmente as condições dosindivíduos. Conseqüentemente, as faixas de dosagem acima são tenciona-das a proporcionar orientações gerais e suporte para os ensinamentos aqui,porém não são tencionadas a limitar o escopo da invenção. Orientações adi-cionais para a preparação e administração das composições farmacêuticasda invenção também foram descritas na técnica. Ver, por exemplo, Good-man & GiIman1S The Pharmacological Bases of Therapeutics, Hardman etal., eds., McGraw-HiII Professional (10âP ed., 2001); Remington: The Scienceand Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Lippincott Williams & Wilkins (20§ped., 2003); e Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Ansel et al. (eds.), Lippincott Williams & Wilkins (7âP ed., 1999).

EXEMPLOSOs seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, porém nãopara limitar a presente invenção.

Exemplo 1. TRPA1 é um sensor polimodal de estímulos mecâni-cos e térmicos nocivos

Nós testamos se o TRPA1 é ativado por forças mecânicas. Ocomportamento eletrofisiológico de células de Ovário de Hâmster Chinês(CHO) expressando termoTRP foi investigado com dois diferentes ensaiosde aplicação de estresse mecânico - pressão usando a pipeta de registro ealterações na osmolaridade externa. Em registros de células inteiras, célulasexpressando TRPA1 apresentaram respostas de corrente robustas aos es-tímulos que causam o encolhimento (ou 0100 mmHg de sucção (n = 10) oua aplicação de uma solução hiperosmótica de 450 mOsm (n = 8)) (Fig. 1A),porém não ao inchaço celular [ou por +100 mmHg (n = 11) ou 220 mOsm (n= 8). As correntes evocadas por pressão, hipertonicidade e frio (n = 62) mos-traram uma dessensibilização semelhante, e tem potenciais de anulação epropriedades de retificação similares, sugerindo que essas correntes sensí-veis mecânicas são devido à ativação do TRPA1 (Fig. 1B). Também foi ob-servado que as células CHO de controle não-transfectadas e outros termo-TRPs (TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPM8) expressos em células CHO nãoresponderam a estímulos mecânicos (dados não mostrados), confirmandoque a resposta de TRPA1 é específica.

Sabe-se que o TRPV4 e outros membros da família TRPV deDrosophila respondem a soluções hipotônicas, e que estudos knockout deTRPV4 mostram que esse canal é requerido para respostas de pressãocaudais normais. Neurônios de sensações mecânicas são geralmente classi-ficados como de limiar alto ou baixo, caracterizando respostas à dor e aotoque, respectivamente. Nós testamos o limiar mecânico de TRPA1 pela a-plicação de uma ampla faixa de pressões de pipeta negativas (Fig. 1C). Cé-lulas CHO expressando TRPA1 são ativadas em -90 mmHg ou mais, consis-tente com receptores mecânicos de limiar elevado envolvidos na sensaçãode dor (Cho et al., J Neurosci 22: 1238, 2002). Interessantemente, um pré-pulso gelado de 20°C sensibiliza a resposta TRPA1 a um baixo limiar mecâ-nico de -30 mmHg (η = 5), demonstrando que o limiar de ativação de TRPA1pode ser modulado (Fig. 1 D). Nós observamos que o vermelho de rutênio5 μΜ, um bloqueador de TRPA1 conhecido, bloqueou completamente ascorrentes sensíveis mecânicas (para -100 mmHg, η = 8; para 450 mOsm,η = 5, dados não apresentados), consistente com as respostas mecânicasoriginadas de TRPA1. Gadolínio (Gd3+) é considerado um bloqueador doscanais iônicos mecanicamente fechados (Martinac et al., Physiol Rev 81:685, 2001). Nós descobrimos que a aplicação de um banho de Gd3+ 10 μΜbloqueou completamente e reversivelmente as correntes de TRPA1 em res-posta a um estímulo de 2 min de 450 mOsm (n = 5) (Fig. 2A) ou -100 mmHg(n = 6). FM1-43 é um corante de estiril que marca especificamente célulassensoriais entrando através de canais de transdução abertos. Nós desco-brimos que o tratamento com FM1-43 marcou as células CHO transfectadascom TRPA1 e tratadas com aldeído cinâmico. Ao contrário, células expres-sando TRPA-1 que não foram ativadas pelo aldeído cinâmico não absorve-ram o corante (dados não apresentados). Além disso, foi observado que 10μΜ de FM1-43 foi capaz de bloquear correntes induzidas por aldeído cinâ-mico em células CHO expressando TRPA1 (n = 8). Esses resultados sãoconsistentes com TRPA1 sendo um sensor do canal de transdução.

Para assegurar que a resposta mecânica que nós observamosnão é um artefato do sistema de expressão heteróloga, nós testamos seneurônios expressando TRPA1 natural também respondem a tais estímulos.5/6 neurônios DRG sensíveis a aldeído cinâmico (expressando presumivel-mente TRPA1) responderam a uma amplificação de -200 mmHg de sucção,enquanto que 0/21 neurônios insensíveis ao aldeído cinâmico responderam(16 dos 21 eram sensíveis a capsaicina) (Fig. 2B). Cânfora milimolar foi re-centemente reportada como inibidora das correntes basais e a ativação doagonista coldor do TRPA1. Nós descobrimos que 2 mM de cânfora tambémforam capazes de bloquear completamente a resposta mecânica do TRPA1em células CHO até -100 mmHg (n = 5, Fig. 2C). Consistentemente, corren-tes dos neurônios DRG em resposta a -150 mmHg foram completamenteinibidas pela aplicação de cânfora na mesma concentração (Fig. 2D) (n = 15,-12 de 15 foram sensíveis a aldeído cinâmico). Esses dados suportam forte-mente que neurônios DRG expressando TRPA1 são sensíveis mecanica-mente, apresentando características comparáveis à sensibilidade mecânicade TRPA1 em células CHO.

Exemplo 2. TRPA1 apresenta um papel essencial na sensaçãode dor mecânica in vivo

Nós depois demonstramos para testar se o bloqueio agudo deTRPA1 tinha qualquer conseqüência fisiológica na sensação de dor. RR,Gd3+ ou cânfora não são compostos específicos e podem não ser usados invivo. Usando o ensaio de influxo de cálcio FLIPR, nós varremos 43.648 mo-léculas pequenas quanto à sua capacidade de bloquear a ativação de aldeí-do cinâmico de TRPA1 humano numa linhagem celular CHO. Vários acertosaparentaram ser análogos estruturais do aldeído cinâmico. Nós efetuamos aanálise a fundo de um desses análogos, o Composto 18, (Z)-4-(4-clorofinil)--3-metilbut-3-en-2-oxima (Maybridge, Cornwall, Reino Unido). O composto 18bloqueou a ativação de TRPA1 por 50 μΜ de aldeído cinâmico no ensaioFLIPR de células CHO com uma IC50 de 3,1 μΜ e 4,5 μΜ para clones huma-nos e de camundongo, respectivamente (Fig. 3B). Ao contrário, ele não blo-queou TRPV1, TRPV3, TRPV4 e TRPM8 a 50 μΜ (dados não apresenta-dos). O composto 18 mudou a EC5O para o aldeído cinâmico de um mododependente de concentração de 50 μΜ (controle) para 220 μΜ (sob 25 μΜde composto 18), sugerindo que os dois análogos estruturais competem pelomesmo sítio de ligação, porém têm efeitos opostos na atividade do canal(Fig. 3B). O composto 18 bloqueou as correntes de TRPA1 induzidas peloaldeído cinâmico em trechos cortados de oócitos de Xenopus (Fig. 3C) erespostas de TRPA1 em células CHO induzidas por frio ou pressão (dadosnão mostrados). Para testar a eficácia e especificidade do composto 18 invivo, nós co-injetamos aldeído cinâmico e o composto 18 na pata traseira decamundongos. 1 a 10 mM do composto 18 não causaram qualquer respostacomportamental (dados não mostrados). Entretanto, o composto 18 bloque-ou significativamente os eventos nociceptivos induzidos por aldeído cinâmi-co, porém não os induzidos por capsaicina, sugerindo eficácia e especifici-dade desse composto no bloqueio da nocicepção (Fig. 3D).

Hiperalgesia é definida como uma resposta aumentada a estí-mulos de dor (térmicos e/ou mecânicos) devido a ferimentos ou inflamação.Nós observamos que as respostas nociceptivas ao calor ou pressão agudosna pata não foram afetados pelo composto 18 (dados não mostrados). Entre-tanto, o composto 18 abrandou a hiperalgesia mecânica induzida pela inje-ção do adjuvante de Freund completo (CFA) na pata traseira quando injeta-do 24 horas depois de CFA (Fig. 4A). Uma redução similar no comportamen-to nociceptor mecânico foi observada com um modelo de hiperalgesia decurta duração (injeção de bradicinina) (Fig. 4B). De um modo importante,nós descobrimos que aquele composto 18 não bloqueou a hiperalgesia aocalor induzida por CFA ou por bradicinina (BK) (dados não mostrados), pro-porcionando evidências adicionais de especificidade do composto. Essesensaios comportamentais descritos aqui foram também efetuados com umcomposto estruturalmente não-relacionado que bloqueia TRPA1 (Composto40: N,N'-bis-(2-hidroxibenzil)-2,5-diamino-2,5-dimetilexano), com resultadosmuito semelhantes. Juntos, esses dados in vivo indicam que o bloqueio doTRPA1 alivia a hiperalgesia mecânica, porém não a hiperalgesia por calor.

Exemplo 3. Evidências adicionais da função do TRPA1 na hipe-ralaesia mecânica e de frio

Por nossa parte não é possível avaliar a resposta ao frio nocivaem camundongos. Por exemplo, camundongos não apresentam respostasnociceptivas a temperaturas frias tão baixas quanto 0°C, e nenhuma alodiniaao frio em resposta ao CFA. A ativação por frio do TRPA1 tem sido disputa-da, porém um papel in vivo na hiperalgesia ao frio em ratos tem sido recen-temente sugerido (Jordt et al., Nature 427: 260, 2004; e Obata et al., J ClinInvest 115: 2393, 2005). Nós, deste modo, usamos ratos para atribuir umpapel para o TRPA1 usando o composto 18. Nós descobrimos que TRPA1de rato também é bloqueado pelo Composto 18, semelhantemente ao TR-PA1 de humanos e camundongos (dados não apresentados). Nós observa-mos um bloqueio robusto de hiperalgesia ao frio induzido por CFA em ratoscom o composto 18 numa placa a 5°C (Fig. 4C). Coletivamente, os dadossugerem que TRPA1 age tanto como um receptor de frio quanto um receptormecânico in vivo, porém somente depois da sensibilização por sinais infla-matórios ou de ferimentos. Consistentemente, foi descoberto que camun-dongos TRPV1 nulos apresentam um forte fenótipo de hiperalgesia térmica,porém eles não apresentam ou apresentam um fenótipo brando numa ter-mossensação aguda (Davis et al., Nature 405: 183, 2000; e Caterina et al.,Science 288: 306, 2000). Um papel para o TRPA1 na hiperalgesia mecânicapoderia ser explicado se o TRPA1 for sensibilizado para responder a um li-miar mecânico menor em resposta à inflamação. Isso é similar à modulaçãoda sensibilidade ao calor do TRPV1. TRPV1 normalmente tem um limiar deativação de 43°C, porém uma variedade de sinais inflamatórios sensibilizaTRPV1 para ativar em temperaturas mais baixas.

Para testar essa possibilidade, nós examinamos se a sinalizaçãocom BK pode reduzir o limiar mecânico de TRPA1. Depois de um pré-tratamento de 3 minutos com pré-tratamento com BK 1 nM, as células CHOco-transfectaram com o receptor B2 de bradicinina, e TRPA1 apresentourespostas mecânicas a uma estimulação de pressão de -60 mmHg (Fig. 4D).A resposta sensibilizada do TRPA1 proporciona um mecanismo molecularem potencial para o papel fisiológico do TRPA1 na hiperalgesia mecânica.Em células CHO, a resposta do TRPA1 a pressão não é instantânea (com otempo de início variando na ordem de segundos), o que sugere que o TR-PA1 não é diretamente ativado por esticamento, e é provavelmente ativadoatravés dê um segundo mensageiro. Interessantemente, a aplicação de BKreduz o limiar de ativação e reduz o atraso.

Exemplo 4. Materiais e métodos gerais

Eletrofisiologia da célula de mamífero: Células CHO expressan-do termoTRP (TRPV1 de rato, TRPV2 de rato, TRPV3 de camundongo,TRPV4 de rato, TRPM8 de camundongo e TRPA1 de camundongo), célulasCHO de controle e neurônios DRG de rato cultivados foram preparados con-forme descrito em Story et al., Cell 112: 819, 2003; e Bandell et al., Neuron41: 849, 2004. Os registros eletrofisiológicos foram efetuados conforme des-crito em Bandell et al., Neuron 41: 849, 2004. Resumidamente, as célulasCHO foram apertadas a -60 mV e rampas de 0,8 segundo de -80 mV até+80 mV foram corridas a cada 4 segundos. As correntes dos neurônios DRGforam registradas a -60 mV e para as suas curvas corrente-voltagem, umpasso de voltagem de 300 ms a +20 mV foi usado 40 ms depois da rampade 800 ms de -80 mV até +80 mV para minimizar a contaminação da corren-te fechada de voltagem de Na+ ou Ca2+. A solução de pipeta para experi-mentos de temperatura e hiperosmóticos consistiu (em nM) de CsCI 140,EGTA 5, HEPES 10, MgATP 2, NaGTP 0,2, titulado até pH 7,4 com CsOH. Asolução externa de base para esses experimentos consistiu (em mM) deNaCI 140, KCI 5, HEPES 10, CaCI2 2, MgCI2 1, titulado até pH 7,4 com Na-OH. O manitol foi usado para ajustar a osmolaridade para soluções hipertô-nicas. Para TRPV3 de camundongo e TRPV2 de rato, o cálcio externo foisubstituído com EGTA 5 mM. Gluconato foi substituído por cloreto em pres-são (+) e experimentos hipotônicos para eliminar o potencial para correntesde cloreto ativadas por inchamento endógenas. Para esses experimentos, asolução de pipeta (295 mOsm) consistiu (em mM) de Cs-gluconato 125, Cs-Cl 15, EGTA 5, HEPES 10, MgATP 2, NaGTP 0,2, titulado até pH 7,4 comCsOH. A solução externa consistiu (em mM) de gluconato de Na 90, NaCI10, glucontato de K 5, HEPES 10, CaCI2 2, MgCI2 1, titulado até pH 7,4 comNaOH. A osmolaridade foi ajustada com manitol até 220 mOsm (hipotônica)ou 298 mOsm 15 (isotônica). Pressão (±) foi hidrostaticamente distribuídapela pipeta de registro usando bombeamento com seringa (Hamill et al., An-nu Rev Physiol 59: 621, 1997) e monitorada através do monitor de pressão(World Precision Instruments). O controlador de temperatura Warner (TC-324B e CL-100) foi usado para o aquecimento ou esfriamento das soluçõesde banho borrifadas. Experimentos nos quais os potenciais de jun-ção/resistências de acesso variaram significativamente ou uma corrente es-tável de -100 pA em -60 mV foi desenvolvida sem qualquer estímulo foramdescartados. Todos os termoTRPS diferentes do TRPA1 testados não res-ponderam a estímulos mecânicos. A quantidade de células (n) testada com -100 mmHg até -300 mmHg, ~+100 mmHg, 450 mOsm, e 220 mOsm paracada tipo celular, respectivamente, são: células CHO, η = I1 14, 5, 12;TRPV1, η = 6, 5, 7, 5; TRPV2, η = 4, 5, 3, 5; TRPV3, η = 3, 2, 3, 0; TRPM8,η = 12, 4, 10, 0. TRPV3 e TRPM8 foram conhecidos por não responder asoluções hipotônicas.

Experimentos de FM1-43; A marcação com FM1-43 das célulasCHO transfectadas com mTRPAI foi efetuada conforme descrito (Meyers etâl., J Neurosci 23: 4054, 2003). Resumidamente, as células CHO foramtransfectadas usando Fugene (Roche) com mTRPAI -pCDNA5. Para falsatransfecção, as células CHO foram tratadas com Fugene, porém sem qual-quer DNA de plasmídeo. 24 h depois da transfecção, as células foram incu-badas por 5 min com aldeído cinâmico 200 μΜ em tampão fisiológico (con-sistiu de (em mM) NaCI 130, KCI 3, MgCI2 2, CaCI2 2, HEPES 10, glicose 10)em temperatura ambiente, seguido por 3 min com 10 μΜ de FM1-43. As cé-lulas foram, a seguir, lavadas totalmente e visualizadas. Células CHO ex-pressando mTRPAI e hTRPAI foram testadas na configuração clamp dopedaço de célula inteira usando o PatchXpress (Axon Instruments) para oefeito do corante FM1-43 na ativação do TRPA1. As células foram plaquea-das no dia anterior da testagem e induzidas com 0,5 μg/mL de tetraciclinaconforme anteriormente descrito em Story et al., Cell 112: 819, 2003. Imedia-tamente antes da testagem, as células foram tripsinizadas e ressuspensasem meio DMEM sem cálcio (Invitrogen). Os registros foram efetuados emsolução extracelular contendo (em mM) KCI 2,67, KH2P04 1,47, MgCI2 0,5,NaCI 138, Na2HP04 8, glicose 5,6. A solução intracelular continha (em mM)KCI 140, HEPES 10, glicose 20, HEDTA 10 e cálcio livre tamponado 1 μΜ.As correntes suportadas a -80 mV foram usadas para análise quantitativa daativação e inibição de TRPA1. Experimentos envolveram uma aplicação ini-cial de aldeído cinâmico de 100 μΜ para eliciar uma corrente em células se-guido por uma segunda adição de aldeído cinâmico e FM1-43 10 μΜ. Umainibição da corrente foi observada em 7/8 células expressando mTRPAI e3/4 células expressando hTRPAI. Na média, um bloqueio de 50% de corren-te foi observado.

Varredura FLIPR: células CHO expressando TRPA1 humanoforam plaqueadas em placas de 384 poços numa concentração de ~ 8.000células/poço. As células foram transferidas para salina tamponada com fos-fato (PBS) e carregadas com o corante sensível a cálcio FLUO-4 usando okit de ensaio 3 de cálcio FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 1 horaantes do ensaio. Os ensaios correram usando o FLIPR2 (Molecular Devices,Sunnyvale, CA). Todos os compostos foram diluídos em PBS a partir de umaconcentração alta de solução estoque baseada em DMSO e adicionadosdurante a coleta de dados com a cabeça da pipeta interna FLIPR2. As con-centrações de DMSO finais nunca excederam 0,5%.

Pedaços cortados de oócito de Xenopus: TRPA1 humano foiclonado no vetor de expressão pOX (Jegla et al., J Neurosci 17: 32, 1997) etranscritos de RNAc foram produzidos usando o kit T3 mMessage Machine(Ambion, TX). Oócitos Xenopus desfoliculados 17 maduros foram injetadoscom 50 nL de RNAc de TRPA1 humano a ~ 1 μg/μL. Os oócitos foram incu-bados em ND96 (NaCI 96 mM, KCI 2 mM, MgCI2 1 mM, CaCI2 1,0 mM, HE-PES 5 mM, pH 7,4, suplementado com piruvato de Na (2,5 mM), penicilina(100 μ/mL) e estreptomicina (100 μg/mL) de 3 a 5 dias para assegurar a ex-pressão. Envelopes de vitelina foram mecanicamente removidos antes doregistro. Os registros foram feitos sob clamp de voltagem de pedaços corta-dos na configuração às avessas em temperatura ambiente com pipetas de 1a 1,5 ΜΩ. A área do banho foi isolada usando uma ponte agar. A capacitân-cia e a resistência de série foram compensadas e as soluções que elimina-ram as correntes de cloreto ativadas por cálcio naturais foram usadas (ele-trodo do fragmento (em mM): NaMES 140, NaCI 4, EGTA 1, HEPES 10, pH7,2; solução de banho: KMES 140, KCI 4, EGTA 1, HEPES 10, pH 7,2). Oscompostos foram adicionados à solução do banho. As correntes foram regis-tradas usando um amplificador Multiclamp 700B e o pacote de aquisiçãopCLAMP.

Ensaios comportamentais: Camundongos (C57BI6 Mus muscu-lus) de 8 a 10 semanas de idade e ratos Sprague Dawley de 150 a 250 gforam usados para todos os ensaios comportamentais. Os animais foramaclimatados por 20 a 60 min ao seus ambientes de testagem antes de todosos experimentos. O teste T de Student foi usado para todos os cálculos esta-tísticos. Todas as barras de erro representam o erro padrão da média(SEM). As placas térmicas, o método Hargreaves (Plantar Analgesia meter)e o aparelho de Von Frey (Dynamic Plantar Aesthesiometer) foram dos ins-trumentos UGO Basile e Columbus. Os ensaios de hiperalgesia mecânica outérmica foram efetuados conforme descrito em Morqrich et al., Science 307:1468, 2005; e Caterina et al., Science 288: 306, 2000). Resumidamente, oscamundongos foram aclimatados por 60 min nos seus ambientes de testa-gem antes de todos os experimentos. AS respostas de linha de base forammedidas primeiro e, a seguir, BK 10 nM foi injetado na pele das patas trasei-ras esquerdas. O limiar de Von Frey ou a latência da retirada da pata foi me-dido em 5, 15 e 30 min depois da injeção. 1 mM de composto 18 foi, algu-mas vezes, coinjetado nas patas traseiras esquerdas para testar seu efeitoanalgésico. Para o teste de hiperalgesia induzido por CFA, 5 μg de CFA em10 uL foram injetados em camundongos (Caterina et al., Science 288: 306,2000; e Cao et al., Nature 392: 390, 1998) e 50 μg em 100 uL (emulsão 1:1de óleo mineral e salina; Obata et al., J Clin Invest 115: 2393, 2005) foi inje-tado em ratos e, em 24 h, as medições foram efetuadas. Antes da medição,os animais foram reaclimatados ao ambiente por 20 a 60 min. Diferentespontos de tempo foram usados para os experimentos co animais injetadoscom CFA (30 min, 1, 1 1/2 2 e 4 h depois da injeção do composto 18).

Compostos: Todos os produtos químicos foram comprados daSigma-AIdrich, a não ser que tenha sido descrito de outra forma. Capsaicinafoi comprada da Fluka. Soluções estoque para vermelho de rutênio (10 mM)ou cloreto de gadolínio (100 mM) foram feitas usando água e foram diluídascom soluções de teste antes do uso.

É entendido que os exemplos e modalidades aqui descritos sãosomente para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou alteraçõesà sua luz serão sugeridas para as pessoas versadas na técnica e são paraserem incluídas no espírito e competência desse pedido e escopo das rei-vindicações em anexo. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantesou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática outestagem da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são des-critos.

Todas as publicações, seqüências GenBank1 depósitos ATCC,patentes e pedidos de patente aqui citados são por meio disto expressamen-te incorporados por referência na sua totalidade e para todos os propósitoscomo se cada um fosse denotado individualmente.

Claims (20)

1. Método de tratamento de hiperalgesia num indivíduo, compre-endendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica quecompreende uma quantidade eficaz de um antagonista TRPA1, em que oantagonista TRPA1 bloqueia especificamente a ativação do TRPA1, destemodo suprimindo ou inibindo a sensação química, sensação térmica e sen-sação mecânica nociva no indivíduo.

2. Método, de acordo com a Reivindicação 1, em que o antago-nista TRPA1 não bloqueia a ativação de um ou mais dos outros termoTRPsselecionados do grupo consistindo em TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 eTRPM8.

3. Método, de acordo com a Reivindicação 1, em que o antago-nista TRPA1 é (Z)-4-(4-clorofinil)-3-metilbut-3-en-2-oxima.

4. Método, de acordo com a Reivindicação 1, em que o antago-nista TRPA1 é N,N'-bis-(2-hidroxibenzil)-2,5-diamino-2,5-dimetilexano.

5. Método, de acordo com a Reivindicação 1, em que o antago-nista TRPA1 é um anticorpo antagonista TRPA1.

6. Método, de acordo com a Reivindicação 1, em que o indivíduosofre de uma condição inflamatória ou de uma dor neuropática.

7. Método, de acordo com a Reivindicação 1, em que o indivíduosofre de hiperalgesia mecânica ou térmica.

8. Método, de acordo com a Reivindicação 1, em que o indivíduoé um humano.

9. Método, de acordo com a Reivindicação 1, compreendendoainda a administração ao indivíduo de um segundo agente redutor de dor.

10. Método, de acordo com a Reivindicação 9, em que o segun-do agente redutor de dor é um agente analgésico selecionado do grupo con-sistindo em acetaminofeno, ibuprofeno e indometacina e opióides.

11. Método, de acordo com a Reivindicação 9, em que o segun-do agente redutor de dor é um agente analgésico selecionado do grupo con-sistindo em morfina e moxonidina.

12. Método para identificar um agente que inibe ou suprime asensação mecânica nociva, compreendendo (a) o contato dos compostos deteste com uma célula que expressa o canal iônico do receptor de potencialtransitório TRPA1, e (b) a identificação de um composto que inibe uma ativi-dade de sinalização de um TRPA1 ativado na célula em resposta a um estí-mulo mecânico; deste modo identificando um agente que inibe ou suprime asensação mecânica nociva.

13. Método, de acordo com a Reivindicação 12, compreendendoainda o exame do composto identificado quanto ao efeito nas atividades deativação ou sinalização de um ou mais termoTRPs selecionados do grupoconsistindo em TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 e TRPM8.

14. Método, de acordo com a Reivindicação 12, em que o com-posto identificado suprime ou reduz a atividade de sinalização do canal iôni-co TRPA1 ativado em relação à atividade de sinalização do canal iônico TR-PA1 na ausência do composto.

15. Método, de acordo com a Reivindicação 12, em que o com-posto identificado não bloqueia a ativação de um ou mais dos termoTRPsselecionados do grupo consistindo em TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 eTRPM8.

16. Método, de acordo com a Reivindicação 12, em que o canaliônico TRPA1 ativado é ativado por um agonista TRPA1 selecionado do gru-po consistindo em aldeído cinâmico, eugenol, gingerol, salicilato de metila ealicina.

17. Método, de acordo com a Reivindicação 12, em que a célulaé uma célula CHO expressando TRPA1, um oócito Xenopus expressandoTRPA1 ou um neurônio DRG cultivado.

18. Método, de acordo com a Reivindicação 12, em que a ativi-dade de sinalização é a corrente elétrica induzida por TRPA1 através damembrana da célula ou o influxo de cálcio na célula.

19. Método, de acordo com a Reivindicação 12, em que o estí-mulo mecânico é a pressão por sucção ou estresse hiperosmótico.

20. Uso de um inibidor TRPA1-específico na produção de ummedicamento para tratar a hiperalgesia térmica ou mecânica num indivíduo,em que o inibidor TRPA1-específico é (Z)-4-(4-clorofinil)-3-metilbut-3-en-2-oxima ou N,N'-bis-(2-hidroxibenzil)-2,5-diamino-2,5-dimetilexano.