BRPI0708212A2 - métodos aperfeiçoados de produção de ovos de aves e pássaros de status livre de germes especificado - Google Patents
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Abstract
CIRCUITO DE CORTE POR BAIXA TENSãO DA BATERIA. A presente invenção refere-se a um dispositivo eletrónico que inclui um componente elétrico (16) alimentado por uma bateria (12) e um compartimento para receber a bateria. Um circuito de corte por baixa tensão (10) é configurado para acoplar-se à bateria. (12). O circuito de corte por baixa tensão (10) inclui um dispositivo de chaveamento (14) com um terminal de controle (14a), um terminal de fonte de corrente (14c) e um terminal de drenagem de corrente (14b), e um resistor (20) acoplado entre o terminal de controle (14a) e um primeiro terminal da bateria (12). O circuito tem um primeiro (lOa) e um segundo terminais de saída (lOb). O primeiro terminal de saída (1 Qa) é acoplado ao primeiro terminal da bateria e o segundo terminal de saída (lOb) é acoplado ao terminal de fonte de corrente (14c) do transistor.(14) O primeiro e o segundo terminais de saída (lOa, lOb) são configurados para aceitar conexões com os terminais positivo e negativo do componente elétrico (16).
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSAPERFEIÇOADOS DE PRODUÇÃO DE OVOS DE AVES E PÁSSAROSDE STATUS LIVRE DE GERME ESPECIFICADO".
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a um método aperfeiçoado decriar um pássaro de status livre de germe especificado. Especificamente, apresente invenção está direcionada a um método para aumentar a capaci-dade de incubação e a viabilidade de ovos removidos de maneira estéril doabdômen de uma mãe pássaro e o ovo seja status livre de germe. A inven-ção também se refere à produção de ovos de ave de status livre de germeespecificado.
Nesse relatório, os termos "livre de contaminação" e "livre degerme" são usados intercambiavelmente. Esses termos são amplamenteusados e se referem a patógenos e de infecções que podem ser portadospor pássaros, particularmente aves domésticas, como frangos, perus, e ou-tras espécies de aves, que são amplamente usadas para produzir bandos deaves para reprodução para produzir ovos férteis para produção comercial epara produzir ovos e carne para consumo humano. Além disso, tais ovos epássaros são usados na fabricação de uma grande variedade de substân-cias biológicas incluindo vacinas, anticorpos, anticorpos monoclonais, fibro-blastos e proteínas, ambos para uso terapêutico e profilático em pessoas eanimais. Os mesmos são também usados extensivamente para testes diag-nósticos e para produção de ovos e de pássaros transgênicos. Muitos des-ses usos requerem que ovos e/ou os pássaros produzidos a partir dos mes-mos sejam livres de todos os contaminantes especificados como, por exem-plo, infecções, incluindo uma variedade de espécies de parasito, bactéria,micoplasma, vírus, retrovírus, príons, fragmentos de DNA e RNA. Algumasvezes, os vírus podem ser pequenos vírus incluindo o picornavírus e o par-vovírus. Algumas das bactérias provenientes de ovos são freqüentementecontaminados incluem Clostridia e Enterobacteria. Há muitos organismosnão patogênicos que deveriam ser controladas. Similarmente, são indesejá-veis muitos dos microorganismos que incluem parasitos, bactéria aeróbica eanaeróbica, espécies comensais e espécies associadas ao intestino e cloa-ca. Similarmente, também são indesejáveis micoplasma, os vírus incluindoretrovírus, príons, fungos, levedura e motos.
Portanto, o termo "livre de contaminação especificada" ou "destatus livre de germe" poderiam incluir algum ou todos e é muito mais amplodo que apenas patógenos específicos. Por exemplo, os patógenos livres es-pecíficos convencionais (SPF) não são especificados livres de alguns vírus ena verdade podem ser contaminados com bactéria e vírus. Portanto, paradeterminados usos, esses podem ser suficiente. O uso para o qual os ovos eos pássaros são destinados irá determinar os contaminantes que o ovo ou opássaro deve estar livre. Os ovos convencionais livres de germe e algunsovos SPF são obtidos por tratamento de ovos postos naturalmente frescoscom produtos químicos, incluindo desinfetantes e antibióticos, e colocandoos mesmos em isoladores. Tais ovos postos naturalmente são tomados depássaros reprodutores mãe selecionados. Ao mesmo tempo em que essesmétodos foram relativamente bem sucedidos na produção de ovos SPF, osmesmos não foram verdadeiramente bem sucedidos na produção de ovoslivres de contaminantes. Contudo, os produtos químicos não são capazes deeliminar os contaminantes de, por exemplo, bactérias que entram nos porosda casca do ovo imediatamente antes da e/ou após a postura e antes dedesinfecção. A contaminação dos ovos sejam SPF, livre de germe ou gnoto-bióticos, resulta na perda de aquiescência com especificações e, em muitosexemplos, perda de valor e utilidade comercial.
Antecedentes da Invenção
A Patente Européia No. O 295 964 descreve uma técnica de cul-tura de embrião de ave in vitro que descreve em alguns detalhes o desen-volvimento embrionário de ovos. Esse relatório está direcionado à incubaçãode um embrião em um recipiente fechado após o embrião ter sido removidode sua casca. Na verdade, nesse relatório, o recipiente usado é preferivel-mente parte de uma casca de ovo que tenha sido escolhida da mesma es-pécie como está sendo cultivada ou, em termos da presente invenção, deuma galinha similar. Esta invenção está direcionada à engenharia genéticaou aves domésticas, mas também à investigação de mecanismos fundamen-tais de desenvolvimento de aves. Similarmente, A Patente Européia No. O511 431 descreve um método de cultura in vitro para um ovo fertilizado deuma galinha na qual um embrião que acaba de ser fertilizado é retirado deuma parte superior do magno do oviduto de uma galinha dentro de uma horaaproximadamente após a oviposição e então subseqüentemente cultivado.Contudo, ambos os relatórios descrevem meramente a cultura artificial deovos e não lidam com o propósito da presente invenção.
O Pedido de Patente Europeu No. 01650109 é direcionado a ummétodo de criação de um pássaro status livre de contaminação especificada.O método geral descrito nessa aplicação compreende alojar um pássarocomo um pássaro mãe, remoção estéril de um ovo do pássaro mãe paratransferir o ovo para a cloaca no pássaro mãe, chocar o ovo e incubar o ovopara produzir um pássaro de postura. O pedido também se refere à produ-ção de ovos de pássaro de status livre de contaminação especificada.
Contudo, é sempre necessário o aperfeiçoamento de tais méto-dos. É desejável aumentar as taxas de capacidade de incubação e diminuira mortalidade dos frangos vivos. É comercialmente muito desejável a obten-ção tanto de resultados consistentes quando de resultados que incluam altacapacidade de incubação (idealmente, as variações de aproximação comer-cial de >85%, mas certamente consistentemente >50%). Isso é de particulare vital importância ao se trabalhar com populações pequenas, raras e alta-mente valiosas, como, por exemplo, pássaros transgênicos.
A presente invenção, ao contrário da aplicação anterior, propor-ciona métodos aperfeiçoados para se obter consistentemente alta capacida-de de incubação de ovos livres de germe. Portanto, a presente invenção es-tá direcionada a um refinamento e aperfeiçoamento do processo, conformereivindicado no Pedido de Patente Europeu No. 01650109.
Descrição da Invenção
A presente invenção está direcionada a um método aperfeiçoadode criação de um pássaro de status livre de germe especificado. Especifica-mente, a invenção se refere à aplicação de técnicas específicas que podemser usadas para assegurar que o ovo prematuro seja removido de sua cascaantes de entrar na cloaca e permanecer estéril de acordo com a invenção.
De acordo com uma modalidade mais generalizada da presenteinvenção, é proporcionado um método para determinar quando deverá ocor-rer a remoção do ovo prematuro de sua casca do pássaro mãe.
De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é proporcio-nado um método para aumentar a capacidade de incubação e a viabilidadede ovos obtidos cirurgicamente de status livre de germe quando obtidos deum pássaro mãe onde o método é realizado em um ambiente estéril antesda remoção de um ovo prematuro de um pássaro mãe e que inclui as se-guintes etapas:
a) alojar um pássaro como um pássaro mãe;
b) determinar a cronometragem de quando remover o ovo pre-maturo do pássaro mãe por:
i. Determinar a posição do ovo prematuro no trato reprodutivo dopássaro mãe antes da transferência do ovo prematuro para a cloaca do pás-saro mãe; e
ii. Estabelecer quando o nível de requisito da formação da cascado ovo e a calcificação ocorreu pela determinação do estágio de desenvol-vimento do ovo prematuro em termos de formação de casca e de calcificação.
De acordo com um segundo aspecto da invenção, é proporcio-nado um método de criação de um pássaro de status livre de germe com-preendendo, em um ambiente estéril
a) alojar um pássaro como um pássaro mãe;
b) determinar a cronometragem de quando remover o ovo pre-maturo de sua casca do pássaro mãe por:
i. determinar a posição do ovo prematuro no trato reprodutivo dopássaro mãe antes de transferir o ovo prematuro para a cloaca do pássaromãe; e
ii. estabelecer quando o nível de requisito de formação de cascade ovo e calcificação ocorreu pela determinação do estágio de desenvolvi-mento do ovo prematuro em termos de formação de casca e de calcificação.
c) remover o ovo prematuro em sua casca do pássaro mãequando o nível de requisito de formação e de calcificação de casca de ovotiver ocorrido e antes de transferir o ovo prematuro para a cloaca no pássaromãe; e
d) incubar o ovo prematuro em sua casca e incubar o ovo pre-maturo para produzir um pássaro de postura.
De acordo com um terceiro aspecto da invenção, é proporciona-do um método para a remoção de microorganismos que possam infectar oovo prematuro enquanto o mesmo estiver do trato reprodutivo, incluindo oovário, antes que o ovo entre na cloaca.
De acordo com um quarto aspecto da invenção, os ovos produ-zidos de acordo com esta invenção são usados na produção de substânciasbiológicas para fins terapêuticos e profiláticos.
De acordo com um quinto aspecto da invenção, o método dainvenção é usado para proporcionar pássaros estérios para reabastecimentode reproduções de pássaro.
Descrição Detalhada da Invenção
A cloaca é a principal área de contaminação em um pássaro. Acloaca é uma câmara ligada tanto ao sistema digestivo quanto ao reproduti-vo de um pássaro, portanto, podem estar presentes na cloaca ao mesmotempo um ovo e fezes. Em geral, como uma casca de ovo é porosa por umcurto período de tempo, a contaminação externa quando entra na cloaca éum grande problema. Portanto, a invenção reconheceu que são requeridosmétodos específicos para remover o ovo prematuro do pássaro mãe aomesmo tempo em que matem o mesmo estéril e com status livre e germe.
Especificamente, a presente invenção reconheceu a necessida-de de aperfeiçoar e refinar o método para determinar quando deve ocorrer aremoção do ovo prematuro de sua casca do pássaro mãe. Portanto, a pre-sente invenção proporciona um método para aumentar a capacidade de in-cubação e a viabilidade de ovos obtidos de status livre de germe quandoobtidos de um pássaro mãe. Qualquer aumento na capacidade de incubaçãoe /ou viabilidade do ovo de status livre de germe será de significativa impor-tância comercial, mesmo que o aumento percentual seja modesto.
A presente invenção também reconheceu que a remoção de mi-croorganismos, bactérias, micoplasma, vírus, retrovírus, príons, parasitos,que são capazes de infectar o ovo enquanto no trato reprodutivo e antes doovo entrar na cloaca é importante na geração de um ovo livre de germe.
Especificamente, a invenção reconhece a necessidade de de-terminar precisamente a posição e o estágio de desenvolvimento do ovoprematuro no trato reprodutivo antes de completar o seu desenvolvimento nopássaro mãe e antes de ser removido do pássaro mãe. Isso assegura que oovo prematuro seja removido do pássaro mãe no tempo correto para asse-gurar um ovo viável e que sejam produzidos pássaros de postura. Se o ovoprematuro for removido cedo demais, poderia ser dotado de uma casca molee descalcificada que iria requerer condições de cultura mais especializadas epoderia não resultar em um ovo viável. A remoção do ovo prematuro do tratoreprodutivo antes de entrar na cloaca impede a contaminação do ovo e dopássaro produzido do mesmo. Esta invenção proporciona métodos para es-tabelecer quando remover o ovo do pássaro mãe e assegura que o ovoprematuro seja removido do pássaro mãe no tempo correto em termos deformação de casca e calcificação para resultar em um ovo e em um pássarode postura viáveis.
Geralmente, antes de remover o ovo, o padrão de postura dopássaro mãe é registrado várias vezes para produzir um tempo de transfe-rência estimado do ovo para o trato reprodutivo distai e cloaca. Nesse está-gio, o ovo e sua casca estão preferivelmente totalmente formados. Isso pro-porciona um guia de maneira que a remoção estéril do ovo do abdômenpossa ser realizada o mais próximo possível, mas antes do tempo de trans-ferência estimado.
Idealmente, a casca do ovo deve estar calcificada para um está-gio avançado que pode ser quantificado usando métodos diagnósticos como,por exemplo, radiografias ou mesmo pressão digital suave, palpação, e ob-servação da distorção da casca. As cascas parcialmente calcificadas e emcascas específicas que são dotadas de níveis de calcificação baixos usual-mente serão macias e frágeis e, portanto, dotadas de baixos níveis de capa-cidade de incubação. A presente invenção reconhece que os ovos prematu-ros não devem ser removidos nesse estágio se forem desejadas uma capa-cidade de incubação ótima e a viabilidade do ovo e de pássaros resultantes.
De acordo com uma modalidade da invenção, o método paradefinir o estágio de desenvolvimento, particularmente com relação à posiçãoda casca e a posição no trato reprodutivo antes da remoção do ovo do pás-saro mãe pode compreender observação, seja observação contínua ou gra-vação de vídeo do lapso de tempo da freqüência normal (por exemplo, diá-ria) e o tempo de postura do ciclo de postura normal ou modificado, confor-me aplicável para espécies e pássaro individual. A observação de quando edo tempo que cada ovo reside em seções diferentes do trato reprodutivo in-cluindo o útero com relação ou tempo de ovulação e de postura de ovo. Acorrelação desses conjuntos diferentes de as observações permitem prog-nosticar não apenas, por exemplo, quando o próximo ovo irá permanecer noútero, como também o seu estágio de desenvolvimento, por exemplo, o graude formação e de calcificação da casca.
O método pode em determinadas espécies maiores (por exem-pio, galinhas) ser refinado pela localização física do ovo no abdômen. Essaabordagem é particularmente útil para uso de rotina após estabelecer a cor-relação necessária entre observações palpadas, estágio de desenvolvimentodo ovo e posição no trato reprodutivo.
A confirmação da posição do ovo no trato reprodutivo, e a pre-sença de uma casca por métodos físicos incluindo palpação abdominal epélvica, as técnicas de visualização, como, por exemplo, ultra-som, raios-Xou MRI, e/ou observação direta por anestesia geral e cirurgia ou exame pós-morte podem também ser usados na combinação com as técnicas de obser-vação ou em suas próprias.
As técnicas de observação normalmente requerem anestesiageral de um pássaro usando, por exemplo, halotano e oxigênio. O equipa-mento veterinário usado para visualização de gatos e de cachorros é fre-qüentemente adequada para pássaros após ajustes sistemáticos para expo-sição de fixações. O ultra-som é apenas possível em pássaros com poucasou nenhuma pena abdominal.
A palpação deveria usualmente ser realizada com o pássaropreso aproximadamente na posição de pé normal. A palpação do abdômen éfeita entre o polegar e os dedos do operador. Deve ser realizada gentilmentepara evitar qualquer dano ao pássaro ou aos ovos dentro do abdômen.
Os ovos não devem ser removidos do pássaro antes da calcifi-cação da casca se o chocamento amplamente convencional e as condiçõesde incubação deverem ser usadas subseqüentemente. Os ovos mais prema-turos, como, por exemplo, aqueles macios, cascas não calcificadas ou pre-maturos requerem condições de cultura especializadas e/ou recipientes decascas de ovo. Em caso de dúvida para um pássaro ou ovo específico, aremoção do ovo deve ser retardada até que o ovo observado tenha sido pos-to. Um ovo subseqüente pode então ser removido.
Essas técnicas envolvem uma avaliação subjetiva por uma pes-soa conduzindo o procedimento. A palpação determina se o ovo está ou nãomacio e não calcifiçado. Essa técnica pode ser combinada com técnicas pa-ra determinar a posição do ovo dentro do abdômen. O ovo deve estar situa-do antes da saída pélvica. Preferivelmente, o ovo deve estar substâncial-mente a meio caminho entre o aspecto caudal do externo e o osso ilíaco. Adistância varia de pássaro para pássaro. Preferivelmente, a palpação é usa-da em combinação com rio-X, MRI ou técnicas de visualização de ultra-som.
De acordo com uma modalidade da invenção, o método com-preende uma combinação de observação e/ou métodos físicos. Idealmente,os ditos métodos físicos incluem palpação abdominal ou pélvica, ultra-som,raios-X e/ou varredura MRI. Idealmente, os métodos de observação incluemas etapas de monitorar e registrar o padrão de postura do pássaro mãe vá-rias vezes para produzir um tempo de transferência estimado. A seleção dométodo mais apropriado irá depender da destreza manual e conhecimentodo operador em palpação, bem como de outros fatores, como, por exemplo,o tamanho do pássaro. O refinamento adicional pode ser obtido pela obser-vação cuidadosa do pássaro individual para determinar o tempo durante odia que um pássaro usualmente põe um ovo; um alvo é remover o ovo pró-ximo a e ligeiramente antecipado antes da postura do ovo.
De acordo com outra modalidade da invenção, é proporcionadoum método para impedir infecção de um ovo prematuro por microorganismosque possam infectar o ovo enquanto no trato reprodutivo (incluído o ovário),mas antes que o ovo entre na cloaca. Esse tipo de infecção pode ser por viada rota transovariana. Os microorganismos podem ser impedidos de obterentrada para o ovo em desenvolvimento ou serem removidos do ovo nãoposto pela administração, para cada pássaro mãe e/ou o ovo, de antimicro-bianos como apropriado para o microorganismo alvo. Essa modalidade pro-porciona um método para a remoção de contaminação do ovo prematuronão posto pela seleção de antimicrobianos conhecidos como ativos contra omicroorganismo alvo na ova e sua administração para o pássaro mãe oupara o ovo não posto.
A seleção do antimicrobiano correto e sua dose, regime e rotada administração são baseados em concentrações na ova e o tempo obtidoem ova específica para o estágio particular de desenvolvimento do ovo. Es-ses regimes e rotas de dosagem podem diferir daqueles mais tipicamenteusados no tratamento de rotina de doenças comuns.
O método geralmente compreende a identificação dos microor-ganismos alvos pelo uso de técnicas de laboratório de identificação microbi-ana padrão e então a seleção dos antimicrobianos apropriados para mataros microorganismos.
A seleção dos antimicrobianos, o regime de dosagem e a rota deadministração podem ser determinados pelos resultados de sensibilidade invitro padrão conforme usados rotineiramente laboratórios microbiológicosclínicos que operam em padrões internacionais como, por exemplo, CLS.Para resultados ótimos, deveriam ser usados a determinação na ova deconcentrações antimicrobianas e o tempo relativo ao tempo de dosagem e oestágio de desenvolvimento específico do ovo. As concentrações na ova deantimicrobianos individuais requerem dados farmacocinéticos para concen-trações de ovo determinadas em amostras em série de ovos em estágiosdiferentes de desenvolvimento. Isso pode ser determinado pela administra-ção de dose conhecida de antimicrobiano para galinha poedeira que sãoentão sacrificadas nos pontos de tempo serial apropriado (dependendo daadministração do antimicrobiano, por exemplo, 0,5; 1; 2; 4; 8; 12; 20 e 24horas após a administração) e as amostras apropriadas dos ovos coletadosapós a morte. As concentrações antimicrobianas nos ovos devem ser deter-minadas usando métodos convencionais adaptados e especificamente vali-dados para uso com material de ovo.
Podem ser usados os antimicrobianos fluoroquinolona, cefalos-porina, macrolida, para diminuir ou eliminar bactérias e "mycoplamsas", de-pendendo da sensibilidade antimicrobiana e da segurança nas espécies depássaro. Devem ser administrados os antimicrobianos fluoroquinolona comoenrofloxacina para alcançar matança bactericida ou "mycoplamsal" depen-dente de concentração, e regimes de dosagem de uso de pelo menos aque-les recomendados para uso terapêutico rotineiro. Por exemplo, enrofloxacinade 10 a 30 mg/kg/ administrados por dia em água durante um período de 2 a5 horas. Os antimicrobianos cefalosporina e macrolida devem usar regimesde dosagem para assegurar exposição máxima com base na matança bacte-ricida dependente do tempo. Podem ser usadas outras classes de antimicro-bianos.
Tais microorganismos podem ser impedidos de obter acesso aoovo em desenvolvimento a partir do ovo não posto pela administração deantimicrobianos ao pássaro mãe e/ou ao ovo, conforme apropriado para osmicroorganismos alvo. Os antimicrobianos são usualmente administradosoralmente (por gavagem ou na alimentação ou na água) ou parentalmentepor vias subcutâneas, intramusculares ou intravenosas. O ultra-som guiadoou injeção direta de laparoscópica no ovo em desenvolvimento é então tam-bém possível.
O ideal é que o ovo seja removido cirurgicamente em uma ma-neira estéril do abdômen do pássaro mãe.
A invenção proporciona adicionalmente um método no qual aremoção cirúrgica compreende:
realizar uma incisão de Iaparotomia e atando o oviduto no pás-saro em ambas as extremidades com suturas;
transeccionar o oviduto distai para cada sutura;
remover o ovo encerrado no oviduto;
esterilizar o oviduto;
remover o ovo; e
esterilizar o ovo.
Alternativamente, o método de remoção cirúrgica pode compre-ender:
fazer uma incisão na pele do pássaro;
manipular o útero para a superfície; e
fazer uma incisão no útero para remover o ovo e o útero ouprender o útero e remover o ovo.
Quando o útero é preso e o ovo é removido, o útero pode serreparado de maneira que o pássaro seja capaz de por mais ovos. Esse as-pecto é importante na situação em que o pássaro mãe é valioso e não devaser sacrificado. Nessa situação o pássaro é anestesiado. Alternativamente, opássaro pode ser sacrificado antes da remoção estéril do ovo.
É aconselhável que a remoção cirúrgica estéril do ovo seja com-pletada rapidamente, em torno de menos de 30 minutos do tempo da euta-násia ou da anestesia, para evitar deterioração da viabilidade do embrião. Ouso prolongado de anestésicos ou de demoras excessivas entre a eutanásiado pássaro mãe e a remoção do ovo irá afetar adversamente a viabilidadedo embrião.
Uma vez que o ovo tenha sido removido o pássaro mãe é entãochocado em um ambiente estéril e incubado para produzir um pássaro depostura.
Essencialmente, o que a presente invenção faz é proporcionar ouso de ovos obtidos artificialmente de pássaros mãe na produção de ovos epássaros obtidos para proporcionar pássaros de postura para o controle demicroorganismos. Os ditos ovos e pássaros são apropriados para sua utili-dade subseqüentemente incubados, criados, mantidos e reproduzidos, ouconvencionalmente, ou em alguma forma de ambiente isolador ou estéril.
Idealmente, cria-se o pássaro como um pássaro mãe em umambiente estéril, alimentado o pássaro com comida estéril. Então, o ovo éremovido do pássaro mãe artificialmente antes de transferir o ovo para umaárea de contaminação potencial no pássaro mãe e então o ovo é chocado eincubado para produzir um pássaro de postura que é mantido nesse ambien-te estéril.
Em uma modalidade da invenção, o pássaro mãe é escolhido deum bando de pássaros similares todos criados sob as mesmas condições.
Em outra modalidade da invenção, o pássaro mão é incubadonaturalmente em um ambiente estéril a partir de um bando de pássaros destatus livre de contaminação similar existente.
Em uma modalidade adicional da invenção, o pássaro mãe é umde um bando de pássaros que são de outro status livre de contaminantestendo sido produzidos por seleção adequada e métodos de criação naturalsob condições controladas e o método é usado para proporcionar pássarosde diferentes status livres de contaminantes.
Preferivelmente1 um pássaro de postura é parte de um bando eapós os pássaros de postura terem sido incubados, uma amostra dos pássa-ros de postura é removida e testada para contaminantes específicos paraproporcionar uma medição do status livre de contaminantes do bando. Ide-almente, quando o status livre de contaminante especificado não é alcança-do no pássaro de postura, o pássaro de postura é usado como um pássaromãe no método. Por meio de um processo iterativo, será possível produzireventualmente um bando de pássaros que será virtualmente estéril e de sta-tus livre de germe.
Em uma modalidade, o pássaro de postura é removido do ambi-ente estéril para por ovos que são, em seqüência, incubados para produzirpássaros de postura adicionais.
Em outra modalidade, o pássaro de postura é removido do am-biente estéril e alimentado com comida contendo flora intestinal normal nãopatogênica. Os pássaros produzidos por esse método, sendo dotados deflora intestinal normal, podem ser mantidos em baixo custo e são adequadospara consumo ou uso na indústria alimentícia.
Em uma modalidade adicional, os ovos livres de germe de fran-gos ou de pássaros adultos podem ser infectados com organismos não pa-togênicos selecionados (incluindo bactérias ou parasitos probióticos em po-tencial), ou patógenos ou combinações de não patogênicos e patógenos. Osovos e pássaros assim produzidos podem ser usados, por exemplo, parainvestigação cientifica de interações de hóspede patógeno, interações hós-pede comensal e descoberta e desenvolvimento de tratamento de novasdoenças e métodos e produtos de prevenção para aplicação ou em pássarosou em mamíferos.
Tipicamente, o pássaro é um frango. Apesar desse método po-der ser realizado em todos os pássaros.
Enquanto a descrição acima estava inteiramente relacionada a
aves domesticas e especificamente a galinhas, deve ser observado que apresente invenção pode ser realizada em outros pássaros.
Preferivelmente, quando um pássaro é incubado de um pássarode postura sendo dotado de status livre de contaminante especificado e nãoé um pássaro de postura, o pássaro posto dessa forma é criado em um am-biente estéril para subseqüente fertilização de pássaros de postura do mes-mo status mais baixo livre de contaminante.
A invenção também proporciona um ovo e um pássaro produzi-dos por quaisquer dos métodos da invenção.
De acordo com um aspecto adicional da invenção, a invençãoproporcionar adicionalmente um método para proporcionar um ovo de umstatus livre de contaminante especificado compreendendo um ambiente es-téril:
alojar um pássaro de postura sendo dotado do mesmo ou demelhor status livre de contaminação conforme proporcionado de acordo como método da invenção;
usar o pássaro de postura para por o ovo; eremover o ovo para outro ambiente estéril.
Idealmente, o ovo é, ao ser posto, imediatamente removido e acasca do ovo é esterilizada.
O pássaro de postura pode então ser usado para por um ovo,que pode ser o próprio produto final, ou que pode incubar em um pássaroque poderia formar um bando de pássaros de status livre de germe ou senão for um pássaro de postura, ser usado para fertilizar um pássaro de postura.
Preferivelmente, o pássaro é anestesiado ou sacrificado por eu-tanásia ou matança antes da remoção do ovo de sua casca. Os pássarosmãe fêmea podem ser vivos ou recém mortos. Os pássaros vivos podem, deacordo com a ética, legal e considerações do bem-estar animal, estar total-mente consciente, sedado ou anestesiado. Os ovos e a ova podem ser ferti-lizados ou não fertilizados.
Os organismos infecciosos que podem ser controlados pela in-venção incluem organismos que podem ser patogênicos ou não patogênicospara as espécies relevantes. Esses incluem espécies de pássaros (tipica-mente frangos, aves comestíveis e perus), seres humanos ou outros mamí-feros (tipicamente cachorros, gatos, cavalos, gado, porcos, carneiro, cabras,ratos e camundongos). Para a finalidade da invenção, os microorganismosincluem parasitas, bactérias (incluindo espécies aeróbicas e anaeróbicas,espécies comensais e espécies associadas ao intestino), micoplasma, vírus(incluindo retrovírus), príons, fungos, leveduras, mofos e fragmentos de DNAe RNA.
Se os ovos férteis forem usados para produzir cria ou pássarosobtidos, então os ovos podem ser incubados, criados, mantidos e reproduzi-dos ou em sistemas de cultivo agrícola convencional, sistemas SPF ou emisoladores para controlar a entrada de microorganismos e manter o statuslivre de germe.
De acordo com a invenção, para liberdade máxima dos ovos demicroorganismos é preferível ser derivado assepticamente de mães (a me-nos que os mesmos sejam também livres de germe ou gnotobióticos) e ociclo de vida deve ser completado em isoladores. O ciclo de vida pode sercompletado fora dos isoladores quando são produzidos os ovos SPF e ospássaros.
De acordo com a presente invenção, a derivação asséptica deovos e, se incubação, criação, manutenção e reprodução de pássaros apro-priada pode ser usada em combinação com outro método de controle decontaminação microbiana. Tais métodos incluem desinfetantes, antimicrobi-anos, antibióticos, agentes antivírus, antiparasíticos, antibióticos, agentesantivirais, antiparasíticos, imunomuduladores e vacinas.
Deve ser observado que em determinadas circunstâncias, aotomar os pássaros selecionados como pássaros pais, os pássaros de postu-ra produzidos podem não estar suficientemente livres de contaminantes paraproduzirem pássaros de postura de qualidade correta. Pode então ser ne-cessário realizar novamente as mesmas etapas produzidas dos tais pássa-ros de postura e remover artificialmente os ovos desses pássaros de posturapara proporcionar pássaros de postura adicionais que esperançosamenteestarão livres de contaminantes.
Deve ser observado que os quando são incubados pássaros quenão são pássaros de postura, os mesmos serão então retidos para subse-qüente fertilização dos pássaros de postura. Dessa maneira, todo o bandopode ser estéril.
É possível, na presente invenção, produzir simplesmente os o-vos para uso subseqüente. Quando são exigidos ovos livres de status livrede germe, a primeira coisa a fazer é incubar os ovos obtidos cirurgicamentedos pássaros pais.
A criação e a reprodução de um pássaro em um estado saudá-vel e produtivo e ao mesmo tempo mantido em um ambiente livre de conta-minação especificada e estéril requerem dietas especializadas para com-pensar a falta de determinados nutrientes normalmente produzidos, por e-xemplo, pelos contaminantes encontrados no intestino ou na pele de umpássaro em um ambiente convencional.
Ainda de acordo com uma modalidade adicional da invenção, éproporcionado um método para obter produtos biológicos terapêuticos e pro-filáticos obtidos de ovos estéreis produzidos de acordo com a invenção. Taisprodutos incluem vacinas (vivas e mortas), anticorpos, anticorpos monoclo-nais como, por exemplo, interferon, proteínas terapêuticas e profiláticas eoutros produtos biológicos similares que são todas produzidas por técnicasbem conhecidas. Podem também ser produzidos os antígenos para testeserológico ou outros testes diagnósticos. Os ovos podem ser usados paracultura de tecido / célula e meio de produção e em uso de pesquisa. O usode ovos para a produção de, por exemplo, anticorpos monoclonais, têm avantagem de que os anticorpos ou outras proteínas produzidos são dotadosde alta atividade, são da mesma forma que os anticorpos humanos em ter-mos de, por exemplo, glicolização. Além disso, os custos relacionados à pu-rificação do produto de proteína resultante / anticorpo monoclonal podem serreduzidos uma vez que a remoção dos organismos vivos, e produtos tóxicosou de contaminação obtidos dos mesmos requerem processamento adicio-nal, e freqüentemente caros, que também freqüentemente provocam produ-ções inferiores e/ou potência de proteína alvo.
Opcionalmente, o pássaro mãe pode ser um pássaro transgêni-co (isto é, um pássaro transgenicamente modificado para conduzir DNA e-xógeno) que dará origem a um ovo que produz uma proteína exógena ououtras substâncias.
Há um risco de vacinas de contaminação com patógenos quesão transmitidos através de ovos embrionados. No passado, para que a pro-dução da vacina fosse bem sucedida, usando embriões de bandos livres depatógeno específico (SPF) minimizado o risco e alternativa ou adicionalmen-te os bandos foram mantidos em ambiente muito limpo. Esse novo métodode produção de ovos de status livre de germe assegura que os ovos usadosna produção de vacina são estéreis e superam a contaminação e os proble-mas estéreis que podem resultar em vacinas consideradas inseguras parauso humano ou animal. Esse novo método proporciona uma fonte alternativade ovos estéreis que não estão contaminados por microorganismos. Issotem a vantagem de superar os problemas anteriormente encontrados comrelação à contaminação.
Os ovos produzidos de acordo com a invenção podem ser usa-dos para isolar um microorganismo patogênico, produzir uma vacina, anti-corpos, anticorpo monoclonal e outras moléculas terapêuticas e profiláticas,como, por exemplo, peptídeos e proteínas e produzir antígenos para uso emtestes serológicos.
A produção de ovo de uma vacina contra um microorganismocomo, por exemplo, um vírus geralmente ocorre por via do método seguinte.A cepa de vírus apropriada é selecionada e então adaptada para crescer nosovos. Essas cepas de vírus adaptada são injetadas em ovos fertilizados, quesão substâncialmente chocados para possibilitar o crescimento do vírus.Grandes quantidades do vírus podem então ser coletadas do ovo antes queo mesmo alcance o estágio de incubação. O vírus coletado pode então sermisturado e processado através de várias etapas para eventualmente pro-duzir uma vacina totalmente formulada tanto para humano quanto vacinaçãoanimal, conforme apropriado. Grandes grupos de até vários milhões de ovossão coletados, processados e combinados para formar um produto de vaci-na. Os números substânciais dos ovos são usados para a criação de semen-tes de vírus para iniciar a infecção dos ovos com o vírus alvo e também paraavaliar a segurança da vacina, por exemplo, para confirmar a ausência deagentes estranhos ou processamento inapropriado do vírus alvo na vacina.
Deve ser compreendido que a vacina pode ser pode ser com-posta de microorganismos patogênicos mortos, cepas vivas de microorga-nismo, cepas recombinantes, subunidades e/ou antígenos específicos isola-dos.
Ainda de acordo com um aspecto adicional da invenção, é pro-porcionado um método para a produção de pássaros semi-estéreis microbio-lógicos ou pássaros livres especificados de patógenos específicos para rea-bastecimento de bandos de pássaro. Isso é particularmente valioso onde acriação convencional e/ou os bandos de SPF quebraram e se tornaram in-fectados com patógenos especificados. Nessas circunstancias um dos mé-todos mais rápidos e eficazes para recriar bandos SPF é derivar um novobando de bandos infectados existentes, pelo uso dos mesmos produzir ovoslivre de germe obtidos de uma maneira estéril de pássaros resguardados eselecionados do bando infectado. Essa abordagem é particularmente valiosaquando os pássaros infectados são de genética especial ou mérito transgê-nico. Isso é particularmente aplicável para bandos de pássaros que foraminfectados com, por exemplo, vírus de gripe aviária ou algumas espéciesbacterianas como, por exemplo, salmonela.
A gripe aviária é uma doença contagiosa de aves comestível.Enquanto todas as espécies de pássaros são sujeitos a serem suscetíveis,os bandos de aves domésticas são especialmente vulneráveis às infecçõesque podem rapidamente atingir proporções epidêmicas. As medidas de con-trole mais importantes incluem a rápida destruição de pássaros expostos,remoção apropriada das carcaças e a quarentena e rigorosa desinfecçãodos bandos de pássaros remanescentes. O método da presente invençãopara a produção de pássaros livres de germe é aplicável à situação ondetenha havido uma epidemia de tal vírus e os bandos de pássaro precisemser reabastecidos. Esse método proporciona um método seguro e confiávelpara o reabastecimento de bandos de pássaros que são estéreis ou pelomenos semi-estéreis ou de status especificado incluindo liberdade de micro-organismos específicos incluindo vírus da gripe aviária.
O método para a produção de ovos livres de germe, semi-estéreis ou livres de patógeno específico para reabastecimento de bandosde pássaros compreende o método de quaisquer reivindicações precedentesonde o pássaro mãe é obtido ou do bando de pássaros a ser reabastecidoou de uma alternativa adequada, o pássaro de postura produzidos dosmesmos e de acordo com o método da invenção é testado para proporcionaruma medida de status livre de germe uma vez que o status livre de germedesejado tenha sido obtido o pássaro de postura é usado para produzir u-sando o método reivindicado, prole para formar um bando de pássaros destatus livre de germe apropriado.
Alternativamente, o pássaro e os ovos podem ser proporciona-dos para alimento e uso de consumo humano, ou uso animal como, por e-xemplo, em uma situação especificada para pacientes particularmente frá-geis com suscetibilidade maior do que a usual à infecção ou para qualqueranimal ou ser humano onde seja desejável evitar uma infecção.
Deve ser compreendido que essa invenção se aplica a todas asespécies aviárias e reptilianas, incluindo, mas não se limitando a, frangos,perus, codorna, patos, gansos, galinha-d'angola, faisão, perdiz, papagaio egalo silvestre.
A invenção será mais claramente compreendida a partir da des-crição que se segue do método de acordo com a presente invenção.
Exemplo 1
Método
Um bando de cinqüenta frangos fêmeas adultas e cinco machoadultos do status SPF conhecido foi mantido em dietas selecionadas e per-mitidos a reproduzir naturalmente. A cronometragem da postura do ovo (ovi-posição) foi registrada individualmente para cada fêmea durante um períodode duas semanas. O tempo médio do dia (tempo, L) quando um ovo foi pos-to foi calculado para cada fêmea. O tempo do dia para L-3h foi calculado e operíodo de L-3 para L foi indicado como o intervalo de derivação. O intervaloera o tempo no qual foi realizada a Iaparotomia cirúrgica asséptica dos ovosmais desenvolvidos em cada pássaro.
Para o procedimento, os pássaros foram sacrificados pelo des-locamento cervical e preparados logo em seguida. Os pássaros foram sub-mersos em uma solução desinfetante por 5 minutos. Foram removidas aspenas do tórax ventral e do abdômen e a pele exposta esterilizada usandouma solução de 50% de iodina em álcool aquecido a 379C. Cada pássaro foientão colocado sob um isolador cirúrgico especialmente adaptado esteriliza-do com uma solução de 5% de ácido peracético e contendo instrumentosestéreis e um frasco de 500 ml contendo iodina em álcool. O pássaro foi co-berto com um cortinado estéril e um orifício de entrada estéril do isolador foientão colocado sobre o cortinado. A incisão de Iaparotomia foi feita e o ovi-duto (tipicamente o útero) foi amarrado em ambos os lados do ovo usandomaterial de sutura. O oviduto foi então transeccionado distai para cada dassuturas do ovo e o oviduto contendo o ovo foi removido do abdômen da fê-mea. O ovo encerrado no útero foi então colocado na solução iodina / álcoolpor cinco minutos após os quais o ovo encerrado no oviduto foi transferidopor via de um orifício de entrada do isolador cirúrgico para um isolador re-ceptor. No isolador receptor, o oviduto foi aberto, o ovo removido, esfregadocom uma solução desinfetante e transferido para um isolador adaptado co-mo um incubador de chocadeira.
Em um dia de chocamento, os frangos vivos foram removidos doisolador de chocadeira e transferidos para dois isoladores de criação emgrande escala para criar grupos de crias de frangos. Os frangos foram cria-dos em dietas comerciais esterilizadas por radiação. Com 18 dias de idadecinco frangos foram removidos de cada isolador de criação, sacrificados eamostrados bacteriologia por cultura aeróbica e anaeróbica. As amostrasincluíam fígado, baço, sangue cardíaco, vagina / cloaca, cecal, e pequenasdigesta intestinal e fezes.
Resultados
Os frangos viáveis foram incubados com sucesso a partir dosovos obtidos artificialmente (capacidade de incubação> 50%, mais freqüen-temente > 90%). Nenhuma bactéria anaeróbica ou aeróbica foi isolada dosfrangos amostrados.
Conclusão
Foi estabelecido um método seguro para produção artificial deovos férteis livres de germe em frangos. Os ovos foram produzidos de fran-gos viáveis livres de germe que foram mantidos com sucesso em isoladores.O método acima, descrito no Pedido de patente Europeu No. 01650109,possibilita claramente a produção de frangos livres de germe. Contudo, ouso repetido do método indicado cujos resultados foram altamente cariáveise freqüentemente forneceram capacidade de incubação baixa (por exemplo,<30%) que geralmente não é aceitável comercialmente.
Exemplo 2
Uma série de estudos adicionais, realizados por cerca de umperíodo de 2 anos, foram conduzidos de acordo com o protocolo do Exemplo1 a fim de aperfeiçoar e refinar o método do Exemplo 1.
Um total de 100 pássaros, em seis bandos de idades e genóti-pos variados, foram usados em uma série de pequenos estudos (cada umusando de 9 a 20 pássaros) para derivar ovos livres de germe. Durante essetempo os resultados tanto da capacidade de incubação quanto do status li-vre de germe microbiológico dos frangos foram muito variáveis com a capa-cidade de incubação variando de zero a 40%. Isso foi marcadamente inferiorao resultado anteriormente encontrado. Outro fator de frustração foi a falhaem alguns estudos para obter um status livre de germe devido à contamina-ção microbiológica durante os procedimentos para derivar o ovo. Em conse-qüência disso, o tempo despendido para derivar um ovo após a indução daanestesia ou da eutanásia aumentou freqüentemente em um esforço paraassegurar a esterilidade.
Portanto, foram feitas várias investigações (Exemplo de 2A a2D) para avaliar os efeitos de várias diferenças no procedimento de remoçãodo ovo, na capacidade de incubação e no status microbiológico dos frangosdos ovos obtidos. Essas variáveis incluem o tempo a partir da indução deeutanásia ou anestésica para remoção do ovo do abdômen da mão, e dacronometragem da remoção do ovo com relação ao tempo antecipado dapostura do ovo e o estágio de desenvolvimento / maturidade do ovo no tratoreprodutivo. As avaliações incluíam imaturidade do ovo (por exemplo, cas-cas macias ou ovo imaturo demais para ser removido intacto), capacidadede incubação, esterilidade e facilidade de manipulação dos tecidos (o últimoprovocando um aumento substâncial no tempo a partir da eutanásia / anes-tesia para a remoção de um ovo). As variáveis foram avaliadas individualmente.
Foram avaliadas nesse exemplo as variáveis que afetam a este-rilidade e a viabilidade de ovos férteis obtidos por Iaparotomia estéril. Asavaliações feitas nos estudos e os resultados obtidos estão proporcionadosabaixo.
Exemplo 2A
Os efeitos de diferença no tempo entre a posição do ovo espe-rada e a remoção cirúrgica estéril do ovo do pássaro mãe na viabilidade eesterilidade do ovo e facilidade de manipulação cirúrgica.
Resultados
Capacidade de Incubacão:
controle (ovos postos naturalmente) de 85 a 100% de incubação,de 80 a 100% de esterilização;
ovos removidos do útero dentro de 30 minutos de anestesia oueutanásia, de 13 a 40% de incubação, de 80 a 100% de esterilização;
ovos removidos do útero 60 minutos após a eutanásia, 14% deincubação, de 80 a 92 % de esterilização.
Esses resultados estabelecem a viabilidade de ovos prematurosem galinhas diminuir com o tempo após a eutanásia.
Facilidade de Manipulação Cirúrgica:
Controle não aplicável;
30 minutos conforme acima, bom, tecidos facilmente levantados;
60 minutos como acima, difícil, tecidos difíceis para levantar /rigidez causada por morte prematura.
Esses resultados estabelecem que a remoção cirúrgica estéril deovos em um isolador cirúrgico livre de germe é facilitada pelo termino da ci-rurgia em 30 minutos.
Exemplo 2B
Os efeitos da posição de ovos cronometrada versus palpaçãoversus a combinação dessas técnicas na proporções de ovos com cascascompletas versus cascas moles, a viabilidade (usualmente os frangos vivosno tempo de incubação) e em facilidade de manipulação cirúrgica.
Resultados
Apenas cronometragem, cascas moles e nenhum ovo adequadopara remoção de 8 a 71%, viabilidade de 13 a 50%, esterilidade de 75 a100%, facilidade de manipulação cirúrgica, variável;
Apenas palpação, cascas moles e nenhum ovo adequado pararemoção de 13 a 71%, viabilidade de 13 a 54%, esterilidade de 89 a 100%,facilidade de manipulação cirúrgica, bom;Cronometragem combinada com palpação, cascas moles e ne-nhum ovo adequado para remoção de 10 a 23%, viabilidade de 14 a 57%,esterilidade de 92 a 100%, facilidade de manipulação cirúrgica, bom.
Esses resultados sugerem que a palpação ou a palpação com-binada com cronometragem pode ter algumas vantagens sobre apenas acronometragem, especialmente em termos de facilidade de manipulação naocasião da remoção do ovo do abdômen. Analises adicionais dos dados in-dicaram que a cronometragem mais a palpação tendem a ser associadas emperíodos mais curtos para remoção de ovo e que a apenas a cronometra-gem foi associada com os períodos mais longos refletindo um número menorde cascas moles no grupo de cronometragem mais a palpação. O númeromenor de cascas moles facilita a manipulação mais fácil e mais rápida du-rante a remoção do ovo.
Exemplo 2C
Os efeitos de antibióticos (por exemplo, fluoroquilonas adminis-tradas oralmente) na eliminação de bactérias transovarianas e infecções mi-coplasmal e na viabilidade e esterilidade de embriões e frangos subseqüen-tes.
Resultados
Sem antibióticos, viabilidade de 22 a 60%, e esterilidade de 66 a92%;
Com antibióticos, viabilidade de 13 a 57%, e esterilidade de 89 a100%.
Esses resultados estabelecem o benefício do uso de antibióticospara remover infecção transovariana (por exemplo, salmonela) e ausênciade efeitos adversos na viabilidade de ovos obtidos livres de germe.
Exemplo 2D
Os efeitos do tempo (zero a 180 minutos) entre a eutanásia e aremoção do ovo na viabilidade de na facilidade de manipulação, capacidadede incubação e esterilidade.
Resultados
Esterilidade 100%,Manipulação muito mais difícil após 30 minutos,A capacidade de incubação foi de 20, 40 e 80%, para os ovosremovidos 60, 40 e 20 minutos após a eutanásia (n= 10 por hora).
Esses resultados estabelecem que a remoção estéril de ovos doabdômen de pássaros em um isolador cirúrgico livre de germe é facilitadapelo término da cirurgia em aproximadamente 30 minutos.
Exemplo 3
Uma revisão dos resultados das investigações nos Exemplos de2A a 2D sugere que a maior capacidade de incubação e esterilidade micro-biológica de ovos obtidos foi mais provavelmente obtida com os pássarosnos quais foi praticada a eutanásia (os pássaros anestesiados sendo maisdifícil de serem manipulados), nos quais o ovo foi removido o mais rápidopossível após a eutanásia (dentro de 15 a 30 minutos) e nos quais a cascado ovo estava firmemente e bem formada (maturação de ovo bem avançada,nenhuma casca mole) com base em uma combinação de ovo cronometradoe palpação manual. Com base em outros dados usados para definir condi-ções de incubação ótimas para ovos obtidos prematuros, uma umidade rela-tivamente baixa (aproximadamente 25%) foi selecionada para os primeiros18 dias de incubação. Esse método descrito acima foi uma investigação con-firmatória onde todas as variáveis identificadas no Exemplo 2 foram coloca-das juntas em uma maneira ótima para estimar as interações entre essasvariáveis.
Método e Materiais:
Um total de 180 frangos de reprodução fêmeas adultas do statusSPF conhecido em 7 grupos sucessivos (de idades e genótipos variados)foram mantidos em dietas selecionadas e permitidas para reproduzir natu-ralmente. Foi usada uma combinação de cronometragem e palpação paradeterminar o tempo ótimo para remoção do ovo do abdômen dos pássaros.
Para o procedimento, foi praticada eutanásia em pássaros pordeslocamento cervical e os mesmos preparados para a remoção dos ovos.Foram removidas as penas do tórax ventral e do abdômen e a pele expostaesterilizada usando uma solução de 50% de iodina em álcool. Cada pássarofoi então colocado sob um isolador cirúrgico especialmente adaptado esteri-lizado com uma solução de 50% de ácido peracético e contendo instrumen-tos estéreis. O pássaro foi coberto com um cortinado adesivo estéril e umorifício de entrada estéril do isolador foi então colocado sobre o cortinado.
Foi feita uma incisão de Iaparotomia e seguindo dissecação cuidadosa o ovofoi removido do útero / aspecto distai do trato reprodutivo e proximal da cloa-ca. O ovo foi então transferido sob condições livres de germe para um isola-dor adaptado como um incubador chocadeira. Foi recuperado com sucessoum total de 153 ovos com cascas boas de 13 a 32 minutos após a eutanásia,e foram considerados adequados para incubação.
Após o armazenamento por aproximadamente de 6 a 24 horas,em uma bandeja de ovo plástica ventilada, livre de vibração, a 18 a 20°C, osovos foram pesados e então colocados em pequenos incubadores de balan-ço. Os incubadores foram mantidos em um RH de aproximadamente 25%RH e a 37,6°C. Os ovos eram célula de ar presa no ponto mais alto e forampeados individualmente no primeiro, no sétimo e no décimo oitavo dia deincubação. No décimo oitavo dia, todos os incubadores foram ajustados paraproporcionar um RH de aproximadamente 65%. O número de ovos que fu-ram a casca de frangos viáveis vivos foi recorde.
Dentro de sete dias de incubação, os frangos vivos foram remo-vidos do isolador de chocadeira e transferidos para isoladores de criação emgrande escala adequados para criar grupos de crias de frango. Os frangosforam criados com dietas comerciais suplementadas esterilizadas por radia-ção. Quando os frangos estavam entre 14 e 21 dias de idade, foram removi-das amostras fecais e mechas de cada isolador de criação e amostradospara bacteriologia pó cultura enriquecida por aeróbica e anaeróbica.
Resultados:
Foram incubados com sucesso frangos viáveis dos ovos prema-turos obtidos artificialmente. Não foi isolada das amostras nenhuma bactériaaeróbica ou anaeróbica. (Os ovos postos naturalmente pelos pássaro depostura dentro de 9 dias antes da eutanásia eram dotados de uma capaci-dade de incubação de frango viável de 86%. Isso confirma que um nívelnormal ou alto de fertilidade natural nos ovos produzidos pelas fêmeas).
A capacidade de incubação dos 7 grupos de ovos livres de ger-me variou de 60% (9 de 15) a 77% (17 de 22), com uma média de 74%.Conclusão
Foi estabelecido um método seguro e altamente eficaz para pro-dução artificial de ovos livres de germe. Os ovos eram férteis e produzidosde frangos viáveis livres de germe que foram mantidos com sucesso em iso-ladores. O estudo confirmou o uso de um grande numero de ovos através de7 bandos sucessivos de frangos que, comparado com os métodos anterior- mente descritos para a produção de ovos férteis livres de germe, pode serobtida menor variabilidade na capacidade de incubação de ovos obtidos e100% de status microbiológico consistente livre de germe pela seleção depássaros com um ovo que é bem maturado (próximo ao tempo de posturanatural; seleção baseada na combinação de cronometragem de postura deovo e palpação), removendo rapidamente o ovo do pássaro mãe (de 15 a 30minutos do início da eutanásia ou anestesia) e então incubados em RH deaproximadamente 25% (mais inferior do que para ovos postos naturalmen-te).
Usando as técnicas descritas na presente aplicação, é possívelalcançar índices de incubação alta mais consistente, que é índice de capaci-dade de incubação consistentemente maior do que 60%. Isso não foi possí-vel antes de tal consistência de base.
Claims (43)
1. Método para aumentar a capacidade de incubação e viabili-dade de ovos de status livre de germe quando obtidos de um pássaro mãeque é realizado em um ambiente estéril antes da remoção de um ovo prema-turo em sua casca de um pássaro mãe e que inclui as seguintes etapas:a) alojar um pássaro como um pássaro mãe;b) determinar a cronometragem de quando remover o ovo pre-maturo do pássaro mãe por:(i) determinar a posição do ovo prematuro no trato reprodutivodo pássaro mãe antes da transferência do ovo prematuro para a cloaca dopássaro mãe; e(ii) estabelecer quando o nível de requisito da formação da cas-ca do ovo e a calcificação ocorreu pela determinação do estágio de desen-volvimento do ovo prematuro em termos de formação de casca e de calcifi-cação.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a etapa (b)ocorre por uma combinação métodos de observação e/ou físicos.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, em que os métodosfísicos incluem palpação abdominal e pélvica, ultra-som e raios-X e/ou var-redura MRI.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-cedentes, em que o método possibilita, antes da remoção do ovo prematurodo pássaro mãe, a determinação da localização do ovo prematuro antes dasaída pélvica do pássaro mãe.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, que possibilita de-terminar se o ovo prematuro está substâncialmente a meio caminho entre oaspecto caudal do externo e o osso ilíaco do pássaro mãe.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-cedentes, em que os métodos de observação incluem as etapas de monito-rar e registrar o padrão de postura do pássaro mãe várias vezes para produ-zir um tempo de transferência estimado do ovo para o trato reprodutivo distaie para a cloaca.
7. Método de criação de um pássaro de status livre de germe,compreendendo, em um ambiente estérila) alojar um pássaro como um pássaro mãe;b) determinar a cronometragem de quando remover o ovo pre-maturo em sua casca do pássaro mãe por:i. determinar a posição do ovo prematuro no trato reprodutivo dopássaro mãe antes de transferir o ovo prematuro para a cloaca do pássaromãe; eii. estabelecer quando o nível de requisito de formação de cascade ovo e de calcificação ocorreu pela determinação do estágio de desenvol-vimento do ovo prematuro em termos de formação de casca e de calcifica-ção.c) remover o ovo prematuro em sua casca do pássaro mãequando o nível de requisito de formação e de calcificação de casca de ovotiver ocorrido e antes de transferir o ovo prematuro para a cloaca no pássaromãe; ed) chocar o ovo prematuro em sua casca e incubar o ovo prema-turo para produzir um pássaro de postura.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que a etapa (b)ocorre pela combinação de métodos de observação e/ou físicos.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, em que os ditosmétodos físicos incluem palpação abdominal e pélvica, ultra-som, raios-Xe/ou varredura MRI.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de-7 a 9, em que o método possibilita a determinação do local do ovo prematuroantes da saída pélvica do pássaro mãe antes da remoção do ovo prematurodo pássaro mãe.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que o ovoprematuro é removido quando o ovo prematuro está substâncialmente ameio do caminho entre o aspecto caudal do externo e o osso ilíaco do pás-saro mãe.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações deO 7 a 11, em que os métodos de observação incluem as etapas de monitorar eregistrar o padrão de postura do pássaro mãe várias vezes para produzir umtempo de transferência estimado do ovo para o trato reprodutivo distai e paraa cloaca.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 12, no qual a remoção do ovo prematuro ocorre antes e o mais próximopossível do tempo de transferência quando o ovo seria transferido natural-mente para a cloaca no pássaro mãe.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 13, compreendendo adicionalmente a etapa de remover microorganis-mos que infectam o ovo prematuro enquanto no trato reprodutivo.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, compreendendoas seguintes etapas:i. identificação de microorganismos alvo que infectam o ovoprematuro enquanto no trato reprodutivo;ii. seleção do antimicrobianos apropriados para combater os mi-croorganismos alvo, como, por exemplo, fluoroquinolona, cefalosporina eantimicrobianos macrolida; eiii. administração do antimicrobiano para pássaro mãe e/ou parao ovo prematuro na ova.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14a 15, em que a infecção do ovo prematuro no trato reprodutivo ocorre por viada rota transovariana.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 14 a 16, em que o nível de dosagem do antimicrobiano é determinado naova.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 17, em que o pássaro mãe é sacrificado, submetido à eutanásia, ou a-nestesiado e a remoção do ovo prematuro na etapa (c) é realizada em me-nos de aproximadamente 30 minutos do tempo do sacrifício, eutanásia ouanestesia do pássaro mãe.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, no qual o pássaro mãe é escolhido de um bando de pássarossimilares, todos criados sob as mesmas condições.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, no qual o pássaro mãe é incubado naturalmente em um ambi-ente estéril a partir de um bando de pássaros de existência similar do statuslivre de contaminação.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, no qual o pássaro mãe é um de um bando de pássaros quesão de outro status livre de contaminação tendo sido produzidos por seleçãoadequada e métodos de criação naturais sob condições controladas e o mé-todo é usado para proporcionar pássaros de um status livre de contamina-ção diferente.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de-7 a 21, no qual o pássaro de postura forma parte de um bando e após ospássaros de postura serem incubados, uma amostra dos pássaros de postu-ra é removida e testada para contaminantes específicos para proporcionaruma medida do status livre de contaminante do bando.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de-7 a 22, no qual quando o status livre de contaminante especificado não éalcançado no pássaro de postura, o pássaro de postura é usado como umpássaro mãe no método.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de-7 a 23, no qual o ovo é removido cirurgicamente do abdômen do pássaromãe.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, compreendendoas etapas de:i. fazer uma incisão na pele do pássaro;ii. manipular o útero para a superfície; eiii. fazer uma incisão no útero e remover o ovo ou prender o úte-ro e remover o ovo.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de-7 a 25, em que a remoção do ovo prematuro de um pássaro mãe anestesia-do, submetido à eutanásia ou sacrificado ocorre em um ambiente estéril e aesterilidade do procedimento é verificada durante todo o procedimento.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de-7 a 26, no qual o pássaro de postura é removido do ambiente estéril para porovos que são, em seqüência, incubados para produzir pássaros de posturaadicionais.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de-7 a 27, no qual o pássaro de postura é removido do ambiente estéril e ali-mentado com alimento contendo flora intestinal normal.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, no qual o pássaro é um frango.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de-7 a 29, no qual quando um pássaro é incubado a partir de um pássaro depostura sendo dotado de status livre de contaminante especificado e não éum pássaro de postura, o pássaro assim posto é criado em um ambienteestéril para subseqüente fertilização de pássaros de postura do mesmo oude status livre de contaminante inferior.
31. Método de provimento de um ovo de status livre de germeem um ambiente estéril compreendendo:i. alojar um pássaro de postura sendo dotado do mesmo ou demelhor status livre de germe, conforme provido como definido no método dequalquer uma das reivindicações de 7 a 30;ii. usar o pássaro de postura para por o ovo; eiii. remover o ovo para outro ambiente estéril.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, no qual o ovo é,ao ser posto, imediatamente removido e a casca do ovo é esterilizada.
33. Ovo produzido de acordo com o método da reivindicação 31ou 32.
34. Pássaro incubado de um ovo, como definido na reivindicação-33.
35. Pássaro incubado como definido no método das reivindica-ções de 7 a 30.
36. Pássaro incubado de um ovo posto por um pássaro de pos-tura criado como definido no método de qualquer das reivindicações de 7 a 30.
37. Uso de ovos produzidos de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 31 a 33 na produção de substâncias biológicas terapêuti-cas e profiláticas, como, por exemplo, vacinas, anticorpos, anticorpos mono-clonais, fibroblasto, proteína e/ou antígenos para teste serológico ou outrosprodutos de proteína similares.
38. Uso, de acordo com a reivindicação 37, na produção de umavacina onde o ovo é injetado com uma cepa de vírus selecionada, o ovo éentão incubado para produzir um vírus e o vírus produzido a partir do mesmoforma uma vacina.
39. Uso, de acordo com a reivindicação 37, em que o ovo produzuma proteína exógena.
40. Produtos biológicos para uso em métodos terapêuticos eprofiláticos, preparados usando um ovo conforme produzido pelos métodosde acordo com as reivindicações de qualquer das reivindicações precedentes.
41. Produto biológico, de acordo com a reivindicação 40, que éuma vacina, um anticorpo, um anticorpo monoclonal, um fibroblasto, umaproteína e/ou um antígeno para teste serológico ou outro produto de proteínasimilar.
42. Produto biológico, de acordo com a reivindicação 41, em queo produto é uma vacina, preferivelmente uma vacina para um vírus de gripe.
43. Método para a produção de ovos semi-estéreis para reabas-tecimento de bandos de pássaro, de acordo com o método de qualquer dasreivindicações de 7 a 30, em que o pássaro mãe é obtido do bando de pás-saros a ser reabastecido, o pássaro de postura produzido a partir do mesmoé testado para proporcionar uma medida de status livre de germe e uma vezque tenha sido obtido o status livre de germe desejado o pássaro de posturae sua prole forma um bando de pássaros de status livre de germe apropriado.
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