BRPI0708229A2

BRPI0708229A2 - lipases e seus usos

Info

Publication number: BRPI0708229A2
Application number: BRPI0708229-0A
Authority: BR
Inventors: Der Laan Jan Metske Van; Margot Elisabeth Francoise Schooneveld-Bergmans
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv
Priority date: 2006-02-23
Filing date: 2007-02-22
Publication date: 2011-05-17
Also published as: WO2007096201A2; EA200801873A1; WO2007096201A8; MX2008010832A; AU2007217732A1; JP5118651B2; IL193469A0; EA015172B1; US8916368B2; CA2643408A1; AU2007217732B2; WO2007096201A3; JP2009527238A; EP1989221A2; US20090053362A1

Abstract

LIPASES E SEUS USOS A presente invenção é para seqúências de polinucleotideos recentemente identificados compreendendo genes que codificam novas enzimas lipolíticas LIPOl-LIPO3. A enzima LIPOl pode ser isolada de Ma9-naporthe grísae, a LIPO2 e a LIPO3 podem ser obtidas pela modificação da seqúência de polinucleotideo que codifica a LIPOl. A invenção apresenta a seqúência codificadora de comprimentototal do novo gene, a qual é adequada para a expressão numa célula hospedeira adequada, assim como a seqúência deaminoácidos do comprimento total da proteína funcional e equivalentes funcionais do gene ou da seqúência de aminoácidos. A invenção também se refere aos métodos do uso dessas proteínas em procesoss industriais, por exemplo, na indústria de panificação, de desgomagem de óleo vegetal, da produção ou modificação de emulsificantes alimentícios e da produção de glicose a partir de glúten de trigo.

Description

lipases e seus usos

Campo da invenção

A invenção se refere a seqüências de polinucleotídeosrecentemente identificadas compreendendo genes quecodificam uma nova enzima lipolítica. As enzimas podem serisoladas de Magnaporthe grisae. A invenção exibe ocomprimento total da seqüência codificadora do novo gene,assim como a seqüência de aminoácidos da proteína funcionalcompleta e equivalentes funcionais do gene ou da seqüênciade aminoácidos. A invenção também se refere aos métodos deuso dessas proteínas em processos industriais, por exemplo,na indústria de panificação. São também incluídas nainvenção células transformadas com um polinucleotídeo deacordo com a invenção adequadas para produzir essasproteínas e células em que uma proteína de acordo com ainvenção é geneticamente modificada para aumentar oureduzir a sua atividade e/ou nível de expressão.

Antecedentes da invenção

Para melhoras as propriedades de manuseio da massa defarinha e/ou as propriedades finais dos produtos assados,tem havido um esforço contínuo para desenvolver adjuvantesde processamento com propriedades proveitosas. Adjuvantesdo processamento são aqui definidos como os compostos quemelhoram as propriedades de manuseio da massa de farinhae/ou as propriedades finais dos produtos asados. Aspropriedades da massa de farinha que podem ser melhoradascompreendem estabilidade, maquinabilidade, capacidade deretenção de gás, formação de bolhas reduzida, viscosidadereduzida, elasticidade, extensibilidade, moldabilidade eassim por diante. As propriedades dos produtos assados quepodem ser melhoradas compreendem o volume do pão,encrespamento da crosta do pão, textura do miolo do pão,estrutura do miolo do pão, maciez do miolo do pão,deterioração relativa do sabor e vida de prateleira. Essesadjuvantes do processamento que melhoram os produtos demassa de farinha e/ou assados podem ser divididos em doisgrupos: aditivos químicos e enzimas' (também referidas comoenzimas de cozimento).

Aditivos químicos com propriedades propíciascompreendem agentes oxidantes tais como ácido ascórbico,bromato e azodicarbonato, agentes redutores tais como L-cisteína e glutationa, emulsificantes que agem comocondicionadores de massa de farinha tais como ésteres demono/diglicerídeos do ácido diacetiltartárico (DATEM),estearoil-Iactilato de sódio (SSL) ou estearoil-lactilatode cálcio (CSL), ou agindo como amaciantes de miolo de pãotais como monoestearato de glicerol e outros (GMS),materiais graxos tais como triglicerídeos (gordura) oulecitina e outros.

Como resultado de uma necessidade direcionada peloconsumidor de substituir os aditivos químicos por produtosmais naturais, várias enzimas de cozimento foramdesenvolvidas com propriedades propícias de produtos demassa de farinha e/ou assados e os quais são usados emtodas as combinações possíveis dependendo das condições deaplicação da cozimento específicas.

Emulsificantes, aplicados na indústria de panificação,podem ser aproximadamente divididos em agentes amaciadoresdo miolo de pão e fortificadores da massa de pão.Monoglicerídeos destilados são usados principalmente para oamaciamento do miolo de pão. A complexação dosmonoglicerídeos com amido previne a completarecristalização do amido, o que resulta num amaciamento domiolo de pão inicial e/ou na redução da taxa de firmamentodo miolo durante a vida de prateleira do produto assado.Para a fortificação da massa de farinha, alguns análogossintéticos diferentes de lipídeos polares são aplicados,tais como DATEM, CSL e SSL. Seus efeitos ao fazer pão sãopara melhorar a estabilidade da massa de farinha, aumentaro volume do pão e induzir uma estrutura de miolo fina euniforme. Considerando esse último aspecto, deve ser notadoque o amaciamento do miolo de pão também está incluídoquando esses emulsificantes são aplicados. Também aviscosidade reduzida da massa de farinha, a maquinabilidademelhorada da massa de farinha, o volume de pão aumentado doproduto assado, a estrutura do miolo de pão melhorada, amaciez do miolo de pão melhorada, a friabilidade melhoradada crosta do pão podem ser alcançados.

Os emulsificantes, devido às suas porções polares eapolares, podem se concentrar nas interfaces óleo-água egás-água. Ao fazer pão as células são inicialmenteencerradas numa matiz de glúten-amido, porém durante afermentação as células de gás aumentam de volume e asinterfaces entre as células gasosas compreendem somente umfilme líquido de material ativo de superfície. Os lipídeospolares endógenos de farinha de trigo estão presentesnesses filmes líquidos, assim como os emulsificantesadicionados. Sabe-se que diacilgliceróis polares, tais comolecitinas ou DATEM produzido a partir de diacilgliceróis,têm somente um efeito limitado para fazer pães emcomparação com os seus correlatos de monoacilglicerol.

Sabe-se na técnica que certas enzimas lipolíticaspodem ser usadas como substituintes de DATEM, tal como, porexemplo, é revelado por L. Chirstiansen et al emProceedings of the Third Symposium on Enzymes in GrainProcessing, 25 a 27 de setembro de 2002, ρ 269 a 274.

Enzimas lipolíticas são enzimas que catalisam ahidrólise de ligações éster em substratos lipídicos. Asenzimas lipolíticas podem agir várias vezes em lipídeos,variando de glicerídeos (por exemplo, triglicerídeos),fosfolipídeos, esfingolipídeos ou glicolipídeos, tais comogalactolipídeos.

Glicerídeos são ésteres de glicerol e ácidos graxos.Triglicerídeos (também conhecidos como triacilglicerol outriacilglicerídeos) são na sua maior parte presentes emóleos vegetais e em gordura animal. Lipases (EC 3.1.1.3) sãoaqui definidas como enzimas que hidrolisam um ou mais dosácidos graxos dos lipídeos, mais especificamente, elashidrolisam a ligação éster entre ácido graxo e gruposhidroxila do glicerol.

Os galactolipídeos consistem de uma estrutura deglicerol com dois ácidos graxos esterifiçados numa posiçãoexterna (sn-1) e no meio (sn-2) , enquanto que o terceirogrupo hidroxila é ligado a resíduos de açúcar tais como umagalactose, por exemplo, monogalactosildiglicerídeo oudigalactosildiglicerídeo. Galactolipase (EC 3.1.1.26)catalisa a hidrólise de um ou ambos os grupos acil graxosnas posições sn-1 e sn-2, respectivamente, de umgalactosildiglicerídeo.

Fosfolipídeos consistem de uma estrutura de glicerolcom dois ácidos graxos esterifiçados numa posição externa(sn-1) e mediana (sn-2), enquanto que o terceiro grupohidroxila do glicerol é esterifiçado com o ácido fosfórico.0 ácido fosfórico pode, por sua vez, ser esterifiçado, porexemplo, num aminoálcool tipo etanolamina(fosfatidiletanolamina), colina (fosfatidilcolina).Fosfolipases são definidas aqui como enzimas que participamna hidrólise de uma ou mais ligações nos fosfolipídeos.

As enzimas lipolíticas compreendem, por exemplo,lipases, galactolipases e fosfolipases, tais como, porexemplo, fosfolipase Al, A2 e lisofosfolipase, dependendo dosubstrato sobre o qual elas agem.

Existe uma necessidade continua por enzimas lipolíticasmelhoradas que podem ser usadas como substituintes deemulsif icantes químicos, tais como DATEM, CSL e SSL, naprodução de pão.

Objeto da invenção

É o objeto da presente invenção proporcionar uma novaenzima lipolítica a qual seja adequada para ser usada comoum substituto enzimático para emulsificantes químicos. Alémdisso, é um objeto da invenção proporcionar novospolinucleotídeos que codificam a nova enzima lipolítica.Outro objeto é proporcionar enzimas lipolíticas naturalmentee recombinantemente produzidas, assim como cepasrecombinantes que as produzem. Também polipeptídeos de fusãosão parte da invenção, assim como métodos para fazer e usaros polinucleotídeos e polipeptídeos de acordo com ainvenção.

Resumo da invenção

A presente invenção proporciona uma nova enzimalipolítica a qual é adequada para ser usada como umsubstituto enzimático para emulsificantes químicos.Surpreendentemente, a nova enzima lipolítica é extremamenteadequada para uso como substituto para emulsificantesquímicos, uma vez que a enzima tem pelo menos uma dasseguintes propriedades in situ quando usada em massa defarinha:

• uma atividade relativamente baixa para lipídeosapolares,

• uma atividade relativamente alta para diacil-lipídeos polares, pelo menos para diacil-galactolipídeos,

• uma atividade relativamente baixa para monoacilcompostos.

Por exemplo, a enzima de acordo com a invenção podeapresentar in situ uma atividade de lisofosfolipaserelativamente baixa e uma atividade de lipase relativamentebaixa. Essas inesperadas propriedades são todas consideradascomo sendo vantajosas quando usadas como um substituto deemulsificantes químicos em massa de farinha.

As novas enzimas lipolíticas conferem uma ou maispropriedades de produtos assados e/ou de massa de farinhamelhoradas se usadas aqui, selecionadas do grupo de forçaaumentada da massa de farinha, elasticidade aumentada damassa de farinha, estabilidade aumentada da massa defarinha, viscosidade reduzida da massa de farinha,extensibilidade melhorada da massa de farinha,maquinabilidade melhorada da massa de farinha, volumeaumentado do produto assado, estrutura do miolo de pãomelhorada do produto assado, formação de bolhas reduzida doproduto assado, maciez melhorada do produto assado,antienvelhecimento melhorado do produto assado, crosta dopão melhorada do produto assado ou a qual tenha uma grandeespecificidade de substrato.

A invenção, além disso, proporciona novospolinucleotídeos que codificam novas enzimas lipoliticas.

Particularmente, a invenção proporcionapolinucleotídeos com uma seqüência de nucleotídeos quehibridiza preferivelmente sob altas condições estringentesnuma seqüência de acordo com qualquer uma dentre SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 (de agora em diantechamadas de "SEQ ID NO: 2 a 4) . Conseqüentemente, ainvenção proporciona ácidos nucléicos que são pelo menos85%, preferivelmente pelo menos 88%, mais preferivelmentepelo menos 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos 95%,96%, 97%, 98% ou 99% de homologia com a seqüência de acordocom SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 OU SEQ ID NO: 4.

Numa modalidade a invenção proporciona umpolinucleotídeo obtenível de um fungo filamentoso,particularmente Magnaporthe é preferido e Magnaporthegrisae ainda mais preferido.

Numa outra modalidade, tal polinucleotídeo isolado podeser obtido sinteticamente pelos métodos conhecidos pelapessoa versada na técnica.

Ainda em outra modalidade, a invenção proporciona umpolinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência deácidos nucléicos codificando um polipeptídeo com umaseqüência de aminoácidos conforme mostrado na SEQ ID NO: 5,SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQID NO: 14 (de agora em diante referidas como "SEQ ID NO: 5a 14") ou equivalentes funcionais de qualquer uma delas.

Numa outra modalidade, a invenção proporciona umpolinucleotídeo isolado codificando pelo menos um domíniofuncional de um polipeptídeo de acordo com qualquer umadentre as SEQ ID NO: 5 a 14 ou a equivalentes funcionaisdele.

Em outra modalidade, a invenção proporciona um gene deenzima lipolítica de acordo com qualquer uma dentre as SEQID NO: 2 a 4 ou variantes ou fragmentos seus que aindacodificam a enzima ativa.

A invenção também se refere a vetores compreendendo umaseqüência de polinucleotídeos de acordo com a invenção einiçiadores, sondas e fragmentos que podem ser usados paraamplificar ou detectar o DNA de acordo com a invenção.

Numa outra modalidade preferida, um vetor é fornecidoem que a seqüência de polinucleotídeo de acordo com ainvenção está funcionalmente ligada com pelo menos umaseqüência regulatória adequada para a expressão da seqüênciade aminoácidos codificada numa célula hospedeira adequada,tal como Aspergillus, mais especificamente Aspergillusniger, oryzae ou nidulans. Preferivelmente, a célulahospedeira é Aspergillus niger. A invençãotambémproporciona métodos para preparar polinucleotídeos evetores de acordo com a invenção.

A invenção também se refere a células hospedeirasrecombinantemente produzidas que contêm polinucleotídeosheterólogos ou homólogos de acordo com a invenção.

Em outra modalidade, a invenção proporciona célulashospedeiras recombinantes em que a expressão de uma enzimalipolítica de acordo com a invenção é significantementeaumentada ou em que a atividade da enzima lipolítica éaumentada.

Em outra modalidade, a invenção proporciona uma célulahospedeira produzida recombinantemente que contém DNAhomólogo ou heterólogo de acordo com a invenção e em que acélula é capaz de produzir uma enzima lipolítica funcionalde acordo com a invenção, preferivelmente uma célula capazde superexpressar a enzima lipolítica de acordo com ainvenção, por exemplo, uma cepa de Aspergillus compreendendouma quantidade de cópias aumentada de um gene de acordo coma invenção.

Ainda em outro aspecto da invenção, um polipeptídeopurificado é fornecido. Os polipeptídeos de acordo com ainvenção incluem os polipeptídeos codificados pelospolinucleotídeos de acordo com a invenção. É especialmentepreferido um polipeptídeo de acordo com qualquer uma dentreas SEQ ID Nos: 5 a 14 ou equivalentes funcionais de qualqueruma delas.

Proteínas de fusão compreendendo um polipeptídeo deacordo com a invenção também estão dentro do escopo dainvenção. A invenção também proporciona métodos para fazeros polipeptídeos de acordo com a invenção.

A invenção também se refere ao uso da enzima lipolíticade acordo com a invenção em qualquer processo industrialconforme aqui descrito.

Descrição detalhada da invenção

Polinucleotídeos

Numa modalidade, a presente invenção proporcionapolinucleotídeos que codificam enzimas lipolíticas,tentativamente chamadas de LIPOl, com uma seqüência deaminoácidos de acordo com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 5,SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 (de agora em diante referidascomo "SEQ ID NOS: 5 a 7") ou equivalentes funcionais delas.

Em outra modalidade, a invenção proporcionapolinucleotideos que codificam enzimas lipoliticas,tentativamente chamadas de LIP02, com uma seqüência deaminoácidos de acordo com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 8,SEQ ID NO: 9 (de agora em diante chamadas de "SEQ ID Nos: 8a 9") ou equivalentes funcionais de qualquer uma delas.Numa outra modalidade, a invenção proporcionapolinucleotideos que codificam enzimas lipoliticas,tentativamente chamadas de LIP03, com uma seqüência deaminoácidos de acordo com qualquer uma dentre SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO:14 (de agora em diante chamadas de "SEQ ID NOs: 10 a 14")ou equivalentes funcionais de qualquer uma delas (de agoraem diante chamadas de "SEQ ID Nos: 10 a 14") ouequivalentes funcionais de qualquer uma delas.

A seqüência do gene codificando a LIPOl foi determinadapelo seqüenciamento de um cline genômico obtido a partir deMagnaporthe grisae de acordo com a SEQ ID NO: 1. Asseqüências dos genes codificando LIP02 e LIP03 foramobtidas pela modificação de umclone genômico obtido apartir de Magnaporthe grisae de acordo com a SEQ ID NO: 1.O LIP02 constitui de uma mutação pontual em relação aoLIPO1. A invenção proporciona seqüências de polinucleotídeocompreendendo o gene que codifica a enzima lipoliticaLIPlO-LIP03, assim como sua seqüência codificante.Concordantemente, a invenção se refere a um polinucleotídeoisolado compreenendo a seqüência de nucleotídeos de acordocom qualquer uma dentre as SEQ ID Nos: 2 a 4 ou seusequivalentes funcionais.

Particularmente, a invenção se refere a umpolinucleotídeo isolado hibridizável sob condiçõesestringentes, preferivelmente sob condições altamenteestringentes, num polinucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO:2 a 4 .

Vantajosamente, tal polinucleotídeo isolado pode serobtido a partir de fungos filamentosos, particularmente de

Magnaporthaceae, tal como Magnaporthel por exemplo, grisae,oryzae, poae, rhizophila, salvinii, preferivelmente deMagnaporthe grisae. Mais especificamente, a invenção serefere a um polinucleotídeo isolado com uma seqüência denucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 2.

Em outra modalidade de acordo com a invenção, ainvenção se refere a um polinucleotídeo isolado hibridizávelsob condições estringentes, preferivelmente sob condiçõesaltamente estringentes, num polinucleotídeo de acordo com aSEQ ID NO: 3 ou com a SEQ ID NO: 4. Tal polinucleotídeoisolado pode ser obtido pela síntese com métodos conhecidospor uma pessoa versada na técnica. Ainda maisvantajosamente, tal polinucleotídeo isolado pode ser obtidopela modificação de um polinucleotídeo obtido a partir defungos filamentosos, particularmente de Magnaporthaceae,tais como Magnaporthe, por exemplo grisae, oryzae, poae,rhizophila, salvinii, preferivelmente de Magnaporthegrisae, e mais preferivelmente um polinucleotídeocompreendendo uma seqüência de nucleotídeos de acordo com aSEQ ID NO:1 ou com a SEQ ID NO: 2.

A invenção também se refere a um polinucleotídeoisolado codificando pelo menos um domínio funcional de umpolipeptídeo de acordo com qualquer uma dentre as SEQ IDNos: 5 a 14 ou equivalentes funcionais de qualquer umadelas.

Conforme aqui utilizados, os termos "gene" e "generecombinante" se referem a moléculas de ácido nucléico asquais podem ser isoladas a partir de DNA cromossomal, asquais incluem uma estrutura de leitura aberta codificandouma proteína, por exemplo, uma enzima lipolítica deMagnaporthe grisae. Um gene pode incluir seqüênciascodificadoras, seqüências não-codificadoras, íntrons eseqüências regulatórias. Além disso, um gene se refere auma molécula de ácido nucléicoisolada conforme aquidefinido.

Uma molécula de ácido nucléico da presente invenção,tal como uma molécula de ácido nucléico com a seqüência denucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2 a 4 ou umaequivalente funcional seu, pode ser isolada usando técnicasde biologia molecular padrões e a informação de seqüênciaaqui fornecida. Por exemplo, usando toda ou uma porção daseqüência de ácidos nucléicos de qualquer uma dentre as SEQID Nos: 2 a 4 como uma sonda de hibridização, moléculas deácido nucléico de acordo com a invenção podem ser isoladasusando hibridização padrão e técnicas de clonagem (porexemplo, conforme descrito em Sambrook, J., Fritsh, E. F.,e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2a,ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Além disso, uma molécula de ácido nucléico englobandotoda ou uma porção de qualquer uma dentre as SEQ ID Nos: 2a4 pode ser isolada pela reação em cadeia da polimerase (PCR)usando iniciadores de oligonucleotídeos sintéticosprojetados baseando-se na informação de seqüência contida emqualquer uma das SEQ ID Nos: 2 a 4.

Um ácido nucléico da invenção pode ser amplificadousando DNAc, RNAm ou, alternativamente, DNA genômico, comoum molde e iniciadores de oligonucleotídeos apropriados, deacordo com técnicas de amplificação de PCR padrões. 0 ácidonucléico amplificado dessa forma pode ser clonado num vetorapropriado e caracterizado por análise de seqüência de DNA.

Além disso, oligonucleotídeos correspondendo a ouhibridizáveis em seqüências de nucleotídeos de acordo com ainvenção podem ser preparados por técnicas sintéticaspadrões, por exemplo, pelo uso de um sintetizador de DNAautomatizado.

Numa modalidade preferida, uma molécula de ácidonucléico isolada da invenção compreende a seqüência denucleotídeos mostrada em qualquer uma dentre as SEQ ID Nos:2 a 4. A seqüência da SEQ ID NO: 2 corresponde à regiãocodificante do DNAc da enzima lipolítica baseando-se no DNAgenômico de acordo com a SEQ ID NO: 1. Esse DNAc compreendeas seqüências codificando o LIPOl de Magnaporthe grisae deacordo com qualquer uma dentre as SEQ ID Nos: de 5 a 7.

Em outra modalidade preferida, uma molécula de ácidonucléico isolada da invenção compreende uma molécula deácido nucléico a qual é um complemento da seqüência denucleotídeos mostrada nas SEQ ID Nos: 2 a 4 ou umequivalente funcional dessas seqüências de nucleotídeos.

Uma molécula de ácido nucléico a qual é complementar aoutra seqüência de nucleotídeos é uma a qual ésuficientemente complementar ã outra seqüência denucleotídeos de modo que ela possa hibridizar para aseqüência de nucleotídeos, deste modo formando um duplexestável.

Um aspecto da invenção pertence a moléculas de ácidonucléico isoladas que codificam um polipeptídeo da invençãoou um equivalente funcional seu, tal como um fragmento oudomínio biologicamente ativo, assim como moléculas de ácidonucléico suficientes para usar como sondas de hibridizaçãopara identificar moléculas de ácido nucléico codificando umpolipeptídeo da invenção e fragmentos de tais moléculas deácido nucléico adequados para uso como iniciadores de PCRpara a amplificação ou mutação de moléculas de ácidonucléico.

Um "polinucleotídeo isolado" ou "ácido nucléicoisolado" é um DNA ou RNA que não é imediatamente contíguocom ambas as seqüências codificadoras com as quais ele éimediatamente contíguo (uma da extremidade 5' e outra daextremidade 3') no genoma de ocorrência natural do organismoa partir do qual ele é derivado. Deste modo, numamodalidade, um ácido nucléico isolado inclui algumas outodas as seqüências 5' não-codificantes (por exemplo,promotoras) que são imediatamente contíguas à seqüênciacodificadora. O termo, conseqüentemente, inclui, porexemplo, um DNA recombinante que é incorporado num vetor,num vírus ou plasmídeo áutonomicamente replicante ou no DNAgenômico de um procarioto ou eucarioto, ou o qual existecomo uma molécula separada (por exemplo, um DNAc ou umfragmento de DNA genômico produzido por PCR ou portratamento com uma endonuclease de restrição)independentemente de outras seqüências. Ele também inclui umDNA recombinante que é parte de um gene híbrido codificandoum polipeptídeo adicional que é substancialmente livre dematerial celular, material viral ou meio de cultura (quandoproduzido por técnicas de DNA recombinantes), ou precursoresquímicos ou outras substâncias químicas (quando quimicamentesintetizado). Além disso, um "fragmento de ácido nucléicoisolado" é um fragmento de ácido nucléico que não ocorrenaturalmente como um fragmento e poderia não ser encontradono estado natural.

Conforme aqui utilizados, os termos "polinucleotídeo"ou "molécula de ácido nucléico" são tencionados a incluirmoléculas de DNA (por exemplo, DNAc ou DNA genômico) emoléculas de RNA (por exemplo, RNAm) e análogos do DNA ou doRNA gerado usando análogos de nucleotídeos. A molécula deácido nucléico pode ser de fita única ou de fita dupla,porém pref erivelmente é um DNA de fita dupla. O ácidonucléico pode ser sintetizado usando análogos denucleotídeos ou derivados (por exemplo, nucleotídeos deinosina ou de fosforotioato). Tais oligonucleotídeos podemser usados, por exemplo, para preparar ácidos nucléicos quetêm capacidades de pareamento de base alteradas ouresistência aumentada às nucleases.

Outra modalidade da invenção proporciona uma moléculade ácido nucléico isolada a qual é anti-sentido a umamolécula de ácido nucléico LIP01-LIP03, por exemplo, ofilamento codificante de uma molécula de ácido LIP01-LIP03.Também incluídos dentro do escopo da invenção são osfilamentos de complemento das moléculas de ácido nucléicoaqui descritas.Erros de seqüenciamento

A informação da seqüência, conforme aqui fornecida, nãodeve ser tão estreitamente construída como a requerer ainclusão de bases erroneamente identificadas. As seqüênciasespecíficas aqui reveladas podem ser prontamente usadas paraisolar o gene completo de fungos filamentosos,particularmente de Magnaporthe grisae os quais, por suavez, podem ser facilmente submetidos a análises deseqüência adicionais, identificando dessa forma erros deseqüenciamento.

A não ser que seja indicado de outra forma, todas asseqüências de nucleotídeos determinadas pelo seqüenciamentode uma molécula de DNA aqui foram determinadas usando umseqüenciador de DNA automatizado e todas as seqüências deaminoácidos de polipeptídeos codificadas por moléculas deDNA aqui determinadas foram previstas por tradução de umaseqüência de DNA determinada conforme acima.Conseqüentemente, conforme é conhecido na técnica paraqualquer seqüência de DNA determinada por essa abordagemautomática, qualquer seqüência de nucleotídeos determinadaaqui pode conter alguns erros. Seqüências de nucleotídeodeterminadas por automação são tipicamente pelo menos cercade 90% idênticas, mais tipicamente pelo menos cerca de 95%até pelo menos cerca de 99,9% idênticas á seqüência denucleotídeos efetiva da molécula de DNA seqüenciada. Aseqüência efetiva pode ser mais precisamente determinada poroutras abordagens incluindo métodos de seqüenciamento de DNAmanuais bem conhecidos na técnica. Conforme também éconhecido na técnica, uma única inserção ou anulação numaseqüência de nucleotídeos determinada comparada com aseqüência efetiva irá causar uma alteração de estrutura natradução da seqüência de nucleotídeos de modo que aseqüência de aminoácidos prevista codificada por umaseqüência de nucleotideos determinada será completamentediferente da seqüência de aminoácido efetivamente codificadapela molécula de DNA seqüenciada, iniciando no ponto de talinserção ou anulação.

A pessoa versada na técnica é capaz de identificar taisbases erroneamente identificadas e sabe como corrigir taiserros.

Fragmentos de ácidos nucléicos, sondas e iniciadores

Uma molécula de ácido nucléico de acordo coma invençãopode compreender somente uma porção ou um fragmento daseqüência de ácido nucléico de acordo com qualquer umadentre as SEQ ID Nos: 2 a 4, por exemplo, um fragmento oqual possa ser usado como uma sonda ou iniciador ou umfragmento codificando uma porção de uma proteína LIPOl-LIP03. A seqüência de nucleotídeo determinada a partir daclonagem do gene LIPOl- LIP03 e DNAc permite a geração desondas e iniciadores projetados para o uso na identificaçãoe/ou clonagem de outros membros da família LIP01-LIP03,assim como homólogos da LIP01- LIP03 de outras espécies. Asonda/iniciador tipicamente compreende o oligonucleotídeosubstancialmente purificado, o qual tipicamente compreendeuma região da seqüência de nucleotídeos que hibridizapreferivelmente sob condições altamente estringentes atépelo menos cerca de 12 ou 15, preferivelmente cerca de 18 ou20, pref erivelmente cerca de 22 ou 25, mais pref erivelmentecerca de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, ou 75 ou maisnucleotídeos consecutivos de uma seqüência de nucleotídeosde acordo com qualquer uma dentre as SEQ ID Nos: 2 a 4, ouum equivalente funcional seu.

Sondas baseadas nas seqüências de nucleotídeos LIPOl-LIP03 podem ser usadas para detectar transcritos ouseqüências LIPOl- LIP03 genômicas que codificam proteínasiguais ou homólogas, por exemplo, em outros organismos. Emmodalidades preferidas, a sonda ainda compreende um grupomarcador ligado a ela, por exemplo, o grupo marcador podeser um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ouum cofator enzimático. Tais sondas podem também ser usadascomo parte de um kit de teste diagnóstico para identificarcélulas as quais expressam uma proteína LIP01-LIP03.

Identidade e homologia

Os termos "homologia" ou "identidade porcentual" sãousados intercambiavelmente aqui. Para o propósito destainvenção, é definido aqui que para determinar a identidadeporcentual de duas seqüências de aminoácidos ou de duasseqüências de ácidos nucléicos, as seqüências são alinhadaspara propósitos de comparação ótima (por exemplo, intervalospodem ser introduzidos na seqüência de uma primeiraseqüência de aminoácido ou de ácido nucléico para oalinhamento ótimo com uma segunda seqüência de aminoácido oude ácido nucléico). Os resíduos ou nucleotídeos deaminoácidos nas posições ou de aminoácidos ou nas posiçõesde nucleotídeos correspondentes são, a seguir, comparados.Quando uma posição na primeira seqüência é ocupada pelomesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a posiçãocorrespondente na segunda seqüência, então as moléculas sãoidênticas naquela posição. A identidade porcentual entre asduas seqüências é uma função da quantidade das posiçõesidênticas compartilhadas pelas seqüências (isto é, % deidentidade = quantidade de posições idênticas/quantidadetotal de posições (isto é, posições sobrepostas) χ 100).Preferivelmente, as duas seqüências são do mesmocomprimento.

A pessoa versada estará a par do fato de que váriosprogramas de computador diferentes são disponíveis paradeterminar a homologia entre duas seqüências. Por exemplo,uma comparação de seqüências e a determinação de identidadeporcentual entre duas seqüências pode ser conseguida usandoum algoritmo matemático. Numa modalidade preferida, aidentidade porcentual entre duas seqüências de aminoácidos édeterminada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J.Mol. Biol. (48): 444 a 453 (1970)) o qual foi incorporadono programa GAP no pacote de programas de computadorAccelrys GCG (disponível em

http://www.accelrys.com/products/gcg/), usando ou umamatriz Blossom 62 ou uma matriz PAM250 matrix, e um peso deintervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso decomprimento dei, 2, 3, 4, 5 ou 6. A pessoa habilitada iráperceber que todos esses parâmetros diferentes irá produzirresultados levemente diferentes, porém que a porcentagemtotal de identidade das duas seqüências não ésignificativamente alterada ao usar diferentes algoritmos.

Ainda em outra modalidade, a identidade porcentualentre duas seqüências de nucleotídeos é determinada usando oprograma GAP no pacote de programas de computador AccelrysGCG (disponível em http://www.accelrys.com/products/gcg/),usando uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de intervalo de40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3,4, 5 ou 6. Em outra modalidade, a identidade porcentual deduas seqüências de nucleotídeo ou de aminoácidos édeterminada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller(CABIOS, 4:11 a 17 (1989), o qual foi incorporado noprograma ALIGN (versão 2.0) (disponível em ALIGN Queryusando dados de seqüência do servidor Genestream IGHMontpellier France http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) usando uma tabela de resíduos de peso PAM12 0,uma penalidade de comprimento de intervalo de 12 e umapenalidade de intervalo de 4.

As seqüência de proteína e de ácido nucléico dapresente invenção podem ainda ser usadas como "seqüência deconsulta" para efetuar uma busca contra bancos de dadospúblicos para, por exemplo, identificar outros membros dafamília ou seqüências relacionadas. Tais buscas podem serefetuadas usando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0)de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 a 10. Asbuscas de nucleotídeos BLAST podem ser efetuadas com oprograma NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra =12 para obter seqüências de nucleotídeos homólogas àsmoléculas de ácido nucléico LIPOl- LIP03 da invenção. Asbuscas de proteína BLAST podem ser efetuadas com o programaXBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 paraobter seqüências de aminoácidos homólogas às moléculas deproteína LIPOl- LIP03 da invenção. Para obter alinhamentosespaçados para propósitos de comparação, BLAST espaçadopode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al. ,(1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Ao utilizar osprogramas BLAST e BLAST espaçado, os parâmetrospredefinidos dos programas respectivos (por exemplo, XBLASTe NBLAST) podem ser usados. Ver a home Page do NationalCenter for Biotechnology Information em

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Hibridiζação

Conforme aqui utilizado, o termo "hibridizando" étencionado a descrever condições para hibridização elavagem sob as quais seqüências de nucleotídeos de pelomenos cerca de 60%, de pelo menos cerca de 70%, de pelomenos cerca de 80%, mais pref erivelmente de pelo menoscerca de 85%, ainda mãos pref erivelmente de pelo menoscerca de 90%, mais pref erivelmente de pelo menos 95% dehomologia entre si tipicamente permanecem hibridizadas umaem relação à outra.

Um exemplo não-limitativo exemplar de tais condições dehibridização são hibridização em 6x de cloreto desódio/citrato de sódio (SSC) em cerca de 45 °C, seguido poruma ou mais lavagens em 1 χ SSC, 0,1% de SDS a 50 °C,preferivelmente a 55 °C, pref erivelmente a 60 °C e aindamais preferivelmente a 65 °C.

Condições altamente estringentes incluem, por exemplo,hibridização a 68 0C em 5 χ SSC/5 χ de solução deDenhardt/1,0% de SDS e lavagem em 0,2 χ SSC/0,1% de SDS emtemperatura ambiente. Alternativamente, a lavagem pode serefetuada a 42 °C.

O técnico habilitado saberá que condições aplicar paracondições de hibridização estringentes e altamenteestringentes. Orientações adicionais considerando taiscondições são prontamente disponíveis na técnica, porexemplo, em Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; e emAusubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in MolecularBiology, (John Wiley & Sons, N.Y.).

É claro que um polinucleotídeo o qual hibridizasomente numa seqüência poli A (tal como o trecho poli (A)3'-terminal de RNAms) ou a um filamento complementar deresíduos T (ou U) poderia não ser incluído numpolinucleotídeo da invenção usado para se hibridizarespecificamente numa porção de um ácido nucléico dainvenção, uma vez que tal polinucleotídeo poderiahibridizar para qualquer molécula de ácido nucléicocontendo um trecho poli (A) do seu complemento (por exemplo,praticamente qualquer clone de DNAc de fita dupla).

Obtenção de DNA de comprimento total a partir de outrosorganismos

Numa abordagem típica, as bibliotecas de DNAcconstruídas a partir de outros organismos, por exemplo,fungos filamentosos, particularmente das espéciesMagnaporthe podem ser varridas.

Por exemplo, cepas de Magnaporthe podem ser varridaspara os polinucleotídeos homólogos LIPOl- LIP03 por análisede Northern blot. Na detecção dos transcritos homólogos aospolinucleotídeos de acordo com a invenção, bibliotecas deDNAc podem ser construídas a partir de RNA isolado da cepaapropriada, usando técnicas padronizadas bem conhecidaspelas pessoas versadas na técnica. Alternativamente, umabiblioteca de DNA genômico total pode ser varrida usandouma sonda hibridizável num polinucleotídeo LIPOl- LIP03 deacordo com a invenção.

Seqüências de genes homólogas podem ser isoladas, porexemplo, efetuando-se PCR usando dois grupos de iniciadoresde ,oligonucleotídeos degenerados projetados com base dasseqüências de nucleotídeos conforme aqui ensinado.

O molde para a reação pode ser um DNAc obtido pelatranscrição reversa do RNAm preparado a partir de cepasconhecidas ou suspeitas de expressarem um polinucleotídeo deacordo com a invenção. 0 produto de PCR pode ser subclonadoe seqüenciado para assegurar que as seqüências amplificadasrepresentam as seqüências de uma nova seqüência de ácidonucléico LIPOl- LIP03 ou de um equivalente funcional seu.

O fragmento de PCR pode, então, ser usado para isolarum cIone de DNAc de comprimento total por uma variedade demétodos conhecidos. Por exemplo, o fragmento amplificadopode ser marcado e usado para fazer a varredura de umabiblioteca de DNAc de bacteriófago ou cosmídeo.Alternativamente, o fragmento marcado pode ser usado paravarrer uma biblioteca genômica.

A tecnologia de PCR pode também ser usada para isolaras seqüências de DNAc de comprimento total de outrosorganismos. Por exemplo, RNA pode ser isolado seguindo osprocedimentos padronizados a partir de uma fonte de tecidoou de células apropriada. Uma reação de transcrição reversapode ser efetuada no RNA usando um iniciador deoligonucleotídeo específico para a maioria das extremidades5' do fragmento amplificado para a iniciação da síntese doprimeiro filamento.

O híbrido de RNA/DNA resultante pode, então, ser"emendado" (por exemplo, com guaninas) usando uma reação detransferase terminal padrão, o híbrido pode ser digerido comRNase Hea síntese do segundo filamento pode, então, seriniciada (por exemplo, com um iniciador poli-C). Deste modo,seqüências de DNAc à montante do fragmento amplificado podemser facilmente isoladas. Para uma revisão de estratégias declonagem múltiplas, ver por exemplo Sambrook et al. , acima;e Ausubel et al., acima.

Vetores

Outro aspecto da invenção pertence aos vetores,preferivelmente aos vetores de expressão contendo um ácidonucléico codificando uma proteína LIPOl- LIP03 ou umequivalente funcional seu. Conforme aqui utilizado, o termo"vetor" se refere a uma molécula de ácido nucléico capaz detransportar outro ácido nucléico o qual tenha sido ligado.Um tipo de vetor é um "plasmídeo", o qual se refere a umaalça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNAadicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetorviral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligadosno genoma viral. Certos vetores são capazes de efetuar areplicação autonômica numa célula hospedeira na qual elessão introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos comorigem de replicação bacteriana e vetores mamíferosepissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores demamíferos não-epissomais) são integrados no genoma de umacélula hospedeira na introdução na célula hospedeira, edesse modo são replicados ao longo com o genoma hospedeiro.Além disso, certos vetores são capazes de direcionar aexpressão dos genes aos quais eles são operativãmenteligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores deexpressão". Em geral, vetores de expressão de utilidade nastécnicas de DNA recombinante estão geralmente na forma deplasmídeos. Os termos "plasmídeo" e "vetor" podem ser usadosintercambiavelmente aqui, uma vez que plasmídeo é a forma devetor mais comumente usada. Entretanto, a invenção étencionada a incluir tais outras formas de vetores deexpressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírusdefeituoso de replicação, adenovirus e vírusadenoassociados), os quais servem a funções equivalentes.

Os vetores de expressão recombinantes da invençãocompreendem um ácido nucléico da invenção numa formaadequada para a expressão do ácido nucléico numa célulahospedeira, o que significa que o vetor de expressãorecombinante inclui uma ou mais seqüências regulatórias,selecionadas com base das células hospedeiras a serem usadaspara a expressão, o qual está operativamente ligado àseqüência de ácido nucléico a ser expressa. Num vetor deexpressão recombinante, "operativamente ligado" é tencionadoa significar que a seqüência de nucleotídeos de interesseestá ligada à(s) seqüência(s) regulatória(s) de uma forma aqual permita a expressão da seqüência de nucleotídeos (porexemplo, num sistema de transcrição/tradução in vitro ou umacélula hospedeira quando o vetor é introduzido na célulahospedeira). O termo "seqüência regulatória" é tencionado aincluir promotores, intensificadores e outros elementos decontrole de expressão (por exemplo, sinal depoliadenilação). Tais seqüências regulatórias são descritas,por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990). Seqüências regulatórias incluem aquelas as quaisdirecionam a expressão constitutiva de uma seqüência denucleotídeos em muitos tipos de células hospedeiras eaquelas as quais direcionam a expressão da seqüência denucleotídeos somente numa certa célula hospedeira (porexemplo, seqüências regulatórias tecido-específicas). Serápercebido pelas pessoas versadas na técnica que o design dovetor de expressão pode depender de tais fatores como aescolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível deexpressão da proteína desejado, etc. Os vetores deexpressão da invenção podem ser introduzidos nas célulashospedeiras para, deste modo, produzir proteínas oupeptídeos, codificados por ácidos nucléicos conforme aquidescrito (por exemplo, proteínas LIP01-LIP03, formasmutantes das proteínas LIPOl-LIP03, fragmentos, variantesou equivalentes funcionais seus, proteínas de fusão, etc.).

Os vetores de expressão recombinantes da invençãopodem ser projetados para a expressão de proteínas LIPOl-LIP03 em células procarióticas ou eucarióticas. Porexemplo, proteínas LIPOl- LIP03 podem ser expressas emcélulas bacterianas tais como E. coli, células de insetos(usando vetores de expressão de baculovírus) , células delevedura ou células de mamíferos. Células hospedeirasadequadas são discutidas adicionalmente em Goeddel, GeneExpression Technology: Methods in Enzymology 185, AcademicPress, San Diego, CA (1990). Alternativamente, o vetor deexpressão recombinante pode ser transcrito e traduzido invivo, por exemplo, usando seqüências regulatórias dopromotor T7 e T7 polimerase.

Vetores de expressão úteis na presente invençãoincluem vetores derivados de cromossomos, epissomos evírus, por exemplo, vetores derivados de plasmídeosbacterianos, bacteriófagos, epissoma de levedura, elementoscromossomais de levedura, vírus tais como baculovírus,vírus papova, vírus vaccinia, adenovírus, pox vírus deaves, vírus pseudorrábicos e retrovírus, e vetoresderivados de suas combinações, tais como aqueles derivadosde plasmídeos e de elementos genéticos bacteriófagos, taiscomo cosmídeos e fagemídeos.

A inserção de DNA deve estar operativamente ligada aum promotor apropriado, tal como o promotor lambda PL defago, os promotores Iac, trp e tac de E. coli, ospromotores inicial e tardio de SV4 0 e os promotores de LTRsretrovirais, para citar alguns. Outros promotores adequadosserão conhecidos pela pessoa habilitada. Numa modalidadeespecífica, são preferidos promotores que sejam capazes dedirecionar um alto nível de expressão de enzimaslipolíticas em fungos filamentosos. Tais promotores sãoconhecidos na técnica. Os constructos de expressão podemconter sítios para a iniciação da transcrição, terminaçãoe, na região transcrita, um sítio de ligação de ribossomopara a tradução. A porção codificante dos transcritosmaduros expressa pelos constructos irá incluir uma AUG deiniciação de tradução no início e um códon de terminaçãoapropriadamente posicionado no final do polipeptídeo a sertraduzido.

0 DNA do vetor pode ser introduzido nas célulasprocarióticas ou eucarióticas através da transformaçãoconvencional de técnicas de transfecção. Conforme aquiutilizados, os termos "transformação" e "transfecção" sãotencionados a se referir a uma variedade de técnicasreconhecidas na técnica para introduzir ácidos nucléicosestrangeiros (por exemplo, DNA) numa célula hospedeira,incluindo co-precipitação com cloreto de cálcio ou fosfatode cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrana,transdução, infecção, lipofecção, transfecção lipomediadacatiônica ou eletroporação. Métodos adequados paratransformar ou transfectar células hospedeiras podem serencontrados em Sambrook, et al. (Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2a , ed. Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NYi 1989), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology(198 6) e em outros manuais de laboratório.

Para a transfecção estável de células de mamíferos,sabe-se que, dependendo do vetor de expressão e da técnicade transfecção usada, somente uma pequena fração de célulaspode integrar o DNA estrangeiro no seu genoma. Paraidentificar e selecionar esses integrantes, um gene quecodifica um marcador selecionável (por exemplo, deresistência a antibióticos) é geralmente introduzido nascélulas hospedeiras juntamente com o gene de interesse.Marcadores selecionáveis preferidos incluem aqueles osquais conferem resistência às drogas, tais como G418,higromicina e metotrexato. Ácido nucléico codificando ummarcador selecionável pode ser introduzido numa célulahospedeira no mesmo vetor que aquele codificando umaproteína LIPOl- LIP03 ou pode ser introduzido num vetorseparado. Células estavelmente transfectadas com o ácidonucléico introduzido podem ser identificadas por seleção defármaco (por exemplo, células que tenham incorporado o genemarcador selecionável irão sobreviver, enquanto que asoutras morrerão).

A expressão das proteínas em procariotos é geralmenteexecutada em E. coli com vetores contendo promotoresconstitutivos ou induzíveis direcionando a expressão deproteínas ou de fusão ou que não são de fusão. Vetores defusão adicionam uma quantidade de aminoácidos numa proteínaali codificada, por exemplo, ao amino terminal da proteínarecombinante. Tais vetores de fusão tipicamente servem paratrês propósitos: 1) para aumentar a expressão da proteínarecombinante; 2) para aumentar a solubilidade da proteínarecombinante; e 3) para ajudar na purificação da proteínarecombinante agindo como um ligante na purificação porafinidade. Geralmente, em vetores de expressão de fusão, umsítio de clivagem proteolítico é introduzido na junção daporção de fusão e da proteína recombinante para permitir aseparação da proteína recombinante da porção de fusãosubseqüente â purificação da proteína de fusão.

Conforme indicado, os vetores de expressão irãopreferivelmente conter marcadores selecionáveis. Taismarcadores incluem a diidrofolato redutase ou resistência àneomicina para cultura de células eucarióticas eresistência à tetraciclina ou ampicilina para cultura em E.coli e em outras bactérias. Exemplos representativos dehospedeiros apropriados incluem células bacterianas, taiscomo de E. coli, Streptomyces e Salmonella typhimurium;células fúngicas, tais como de levedura; células de inseto,tais como de Drosophila S2 e de Spodoptera Sf9; células deanimais tais como CHO, COS e Bowes melanoma-, e célulasvegetais. Meios e condições de cultivo apropriados para ascélulas hospedeiras acima descritas são conhecidos natécnica.

Vetores preferidos para uso em bactérias são, porexemplo, descritos em W0-Al-2004/074468, os quais são pormeio disso englobados por referência. Outros vetoresadequados serão prontamente aparentes pelo técnico versado.

Promotores bacterianos conhecidos adequados para usona presente invenção incluem os promotores revelados em WO-Al-2004/0744 68, os quais são por meio disso englobados porreferência.

A transcrição do DNA codificando os polipeptídeos dapresente invenção por eucariotos superiores pode seraumentada pela inserção de uma seqüência intensificadora novetor. Intensificadores são elementos de ação eis do DNA,geralmente de cerca de 10 até 3 00 pb que agem para aumentara atividade transcricional de um promotor num dado tipo decélula hospedeira. Exemplos de intensificadores incluem ointensificador SV4 0, o qual está localizado na últimalateral da origem de replicação no PB de 100 a 270, ointensificador do promotor inicial de citomegalovírus, ρintensificador de polioma na última lateral da origem dereplicação e os intensificadores de adenovírus.

Para a secreção da proteína traduzida no lúmen doretículo endoplasmático, no espaço periplásmico ou noambiente extracelular, o sinal de secreção apropriado podeser incorporado no polipeptídeo expresso. Os sinais podemser endógenos ao polipeptídeo ou eles podem ser sinaisheterólogos.

0 polipeptídeo LIPOl- LIP03 pode ser expresso numaforma modificada, tal como numa proteína de fusão, e podeincluir não somente sinais de secreção como também regiõesfuncionais heterólogas adicionais. Deste modo, por exemplo,uma região dos aminoácidos adicionais, particularmenteaminoácidos carregados, pode ser adicionada ao N-terminaldo polipeptídeo para melhorar a estabilidade e apersistência na célula hospedeira, durante a purificação oudurante o manuseio e estocagem subseqüente. Também asporções peptídicas podem ser adicionadas ao polipeptídeopara facilitar a purificação.

Polipeptídeos de acordo com a invenção

A invenção proporciona um polipeptídeo isolado com aseqüência de aminoácidos de acordo com qualquer uma dentreas SEQ ID NOs: 5 a 14, e uma seqüência de aminoácidosobtenível pela expressão do polinucleotídeo de qualquer umadas SEQ ID noS: 2 A 4 num hospedeiro apropriado. Também, umpeptídeo ou polipeptídeo compreendendo um equivalentefuncional dos polipeptídeos acima está compreendido napresente invenção.

Conforme é conhecido pela pessoa versada na técnica, épossível que o N-terminal das SEQ ID Nos: 5 a 14 devam serheterólogos, assim como o C-terminal das SEQ ID Nos: 5 a14, devido aos erros de processamento durante a maturação.Particularmente, tais erros de processamento devem ocorrerna superexpressão do polipeptídeo. Além disso, a atividadeda exoprotease deve gerar heterogeneidade. A extensão àqual a heterogeneidade ocorre depende também do hospedeiroe dos protocolos de fermentação que são usados. Taisartefatos de processamento C-terminal devem levar apolipeptídeos mais curtos ou a polipeptídeos mais longosconforme indicado com a SEQ ID NO: 5 a 14. Como resultadode tais erros, o N-terminal deve também ser heterólogo.

Numa outra modalidade, a invenção proporciona umpolinucleotídeo isolado codificando pelo menos um domíniofuncional de um polipeptídeo de acordo com qualquer umadentre as SEQ ID nos: 5 a 14 contém resíduos adicionais einiciam na posição -1, ou -2 ou -3, etc. Alternativamente,ele pode não ter certos resíduos e, como conseqüência,inicia na posição 2, ou 3, ou 4, etc.

Mais especificamente para LIPOl, numa modalidade dainvenção a SEQ ID NO: 5 revela a proteína como diretamentetraduzida do DNAc conforme dado na SEQ ID NO: 2.Geralmente, tal proteína será processada antes de produziruma proteína madura e irá, por exemplo, desprender umaseqüência de sinal, preferivelmente por meio distoproduzindo as SEQ ID Nos: 6 ou 7. Par a seqüência deaminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 6 e na SEQ IDNO: 7, o N-terminal, no caso de conter resíduos adicionais,deve conter as seguintes seqüências de aminoácidosadicionais R, GR ou EGR, correspondendo a um início do N-terminal nas posições -1, -2 ou -3, respectivamente.Analogamente os artefatos de processamento C-terminaisdevem levar a polipeptídeos mais curtos ou a polipeptídeosmais longos. No caso específico da SEQ ID NO: 7, o C-terminal, no caso de conter resíduos adicionais,preferivelmente contém as seguintes seqüências deaminoácidos adicionais R, RR ou RRD, correspondendo a um C-terminal prolongado nas posições 310 + 1, +2 ou +3,respectivamente.

Mais especificamente para o LIP02, em ainda outramodalidade, a invenção proporciona um polinucleotídeoisolado compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicoscodificando um polipeptídeo com uma seqüência deaminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 9 ouequivalentes funcionais de qualquer um deles. A SEQ ID NO:8 revela a proteína como diretamente traduzida do DNAcconforme dado na SEQ ID NO: 3. Geralmente tal proteína seráprocessada antes de produzir uma proteína madura e irá, porexemplo, desprender uma seqüência de sinal, preferivelmentedeste modo produzindo a SEQ ID NO: 9. Pode ser que o C-terminal e o N-terminal da proteína resultante sejamheterólogos, por exemplo, devido aos artefatos deprocessamento.

Mais especificamente para o LIP03, em ainda outramodalidade, a SEQ ID NO: 10 revela a proteína comodiretamente reduzida do DNAc conforme dado na SEQ ID NO: 4.Geralmente tal proteína será processada antes de produziruma proteína madura e irá, por exemplo, desprender umaseqüência de sinal, preferivelmente deste modo gerando aSEQ ID NO: 11, 12, 13 OU 14.

Os polipeptídeos acima são coletivamente compreendidosno termo "polipeptídeos de acordo com a invenção".

Os termos "peptídeo" e "oligopeptídeo" sãoconsiderados sinônimos (conforme é comumente reconhecido) ecada termo pode ser usado intercambiavelmente uma vez que ocontexto requeira indicar uma cadeia de pelo menos doisaminoácidos acoplados por ligações peptidil. A palavra"polipeptídeo" é aqui utilizada para cadeias contendo maisdo que sete resíduos de aminoácidos. Todas as fórmulas deoligopeptídeos e polipeptídeos ou seqüências aqui sãoescritas da esquerda para a direita e na direção doterminal amino para o terminal carbóxi. O código de umaletra dos aminoácidos aqui utilizado é comumente conhecidona técnica e pode ser encontrado em Sambrook, et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a,ed. Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY, 1989)

Por polipeptídeo ou proteína "isolada" se entende umpolipeptídeo ou proteína removida do seu ambiente natural.Por exemplo, polipeptídeos e proteínas recombinantementeproduzidas expressas em células hospedeiras sãoconsideradas isoladas para o propósito da invenção uma vezque são polipeptídeos naturais ou recombinantes os quaistenham sido substancialmente purificados por qualquertécnica adequada tal como, por exemplo, o método depurificação de uma única etapa revelado por Smith eJohnson, Gene 67:31-40 (1988).

A enzima lipolítica LIPOl- LIP03 de acordo com ainvenção pode ser recuperada e purificada a partir deculturas de células recombinantes por métodos conhecidos natécnica (Protein Purification Protocols, Methods inMolecular Biology series by Paul Cutler, Humana Press,2004) .

Polipeptídeos da presente invenção incluem produtosnaturalmente purificados, produtos de procedimentosquímicos sintéticos e produtos produzidos por técnicasrecombinantes de um hospedeiro procariótico ou eucarióticoincluindo, por exemplo, células bacterianas, de levedura,de plantas superiores, de insetos e de mamífero. Dependendodo hospedeiro empregado num procedimento de produçãorecombinante, os polipeptídeos da presente invenção podemser glicosilados ou podem ser não-glicosilados. Além disso,os polipeptídeos da invenção podem também incluir umresíduo de metionina modificado inicial, em alguns casos,como resultado de processos mediados pelo hospedeiro.

Fragmentos de proteínaA invenção também exibe fragmentos biologicamenteativos dos polipeptídeos de acordo com a invenção.

Fragmentos biologicamente ativos de um polipeptídeo dainvenção incluem polipeptídeos compreendendo seqüências deaminoácidos suficientemente idênticas a ou derivadas daseqüência de aminoácidos da proteína LIPOl- LIP03 (porexemplo, a seqüência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 5 a 14,as quais incluem menos aminoácidos do que a proteína decomprimento total, porém a qual exibe pelo menos umaatividade biológica da proteína de comprimento totalcorrespondente. Tipicamente, fragmentos biologicamenteativos compreendem um domínio ou porção com pelo menos umaatividade da proteína LIP01-LIP03. Um fragmentobiologicamente ativo de uma proteína da invenção pode serum polipeptídeo o qual seja, por exemplo, de 10, 25, 50,100 ou mais aminoácidos de comprimento. Além disso, outrasporções biologicamente ativas, nas quais outras regiões daproteína são anuladas, podem ser preparadas por técnicasrecombinantes e avaliadas para uma ou mais das atividadesbiológicas da forma natural de um polipeptídeo da invenção.

A invenção também exibe fragmentos de ácido nucléicoos quais codificam os fragmentos biologicamente ativosacima da proteína LIP01-LIP03.

Proteínas de fusão

As proteínas da presente invenção ou seus equivalentesfuncionais, por exemplo, porções biologicamente ativassuas, podem ser operativamente ligadas a um polipeptídeonão-LIPOl- LIP03 (por exemplo, seqüências de aminoácidosheterólogas) para formar proteínas de fusão. Umpolipeptídeo "não LIP01-LIP03" se refere a um polipeptídeocom uma seqüência de aminoácidos correspondendo a umaproteína a qual não é substancialmente homóloga à proteínaLIP01-LIP03. Tal "polipeptídeo não-LIP01-LIP03" pode serderivado de um organismo igual ou diferente. Numa proteínade fusão LIP1-LIP03, o polipeptídeo LIPOl- LIP03 podecorresponder a todo ou a uma parte do fragmento de umaproteína LIP01-LIP03. Numa modalidade preferida, umaproteína de fusão LIPO1- LIP03 compreende pelo menos duasporções biologicamente ativas de uma proteína LIP01-LIP03.Na proteína de fusão, o termo "operativamente ligado" étencionado a indicar que o polipeptídeo LIPO1- LIP03 e opolipeptídeo não-LIPOl- LIP03 são fundidos na estruturaentre si. O polipeptídeo não-LIPO1- LIP03 pode ser fundidoao N-terminal ou ao C-terminal do polipeptídeo LIP01-LIP03.

Por exemplo, numa modalidade, a proteína de fusão éuma proteína de fusão GST-LIP01- LIP03 na qual asseqüências LIPO1- LIP03 são fundidas no C-terminal dasseqüências GST. Tais proteínas de fusão podem facilitar apurificação de LIPOl- LIP03 recombinante. Em outramodalidade, a proteína de fusão é uma proteína LIPOl -LIP03contendo uma seqüência de sinal heteróloga no seu N-terminal. Em certas células hospedeiras (por exemplo,células hospedeiras de mamíferos e de levedura), aexpressão e/ou a secreção de LIPOl- LIP03 pode seraumentada através do uso de uma seqüência de sinalheteróloga.

Em outro exemplo, a seqüência secretória gp67 daproteína envelope do baculovírus pode ser usada como umaseqüência de sinal heteróloga (Current Protocols inMolecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons,1992) . Outros exemplos de seqüências de sinal heterólogaseucarióticas incluem as seqüências secretórias de melitinae de fosfatase alcalina placentária humana (Stratagene; LaJolla, Califórnia). em ainda outro exemplo, seqüências desinal heterólogas procarióticas úteis incluem o sinalsecretório phoA (Sambrook et al., acima) e o sinalsecretório da proteína A (Pharmacia Biotech; Piscataway,Nova Jérsei).

Uma seqüência de sinal pode ser usada para facilitar asecreção e o isolamento de uma proteína ou polipeptídeo dainvenção. Seqüências de sinal são tipicamentecaracterizadas por um núcleo de aminoácidos hidrofóbicos,os quais são geralmente clivados da proteína madura durantea secreção em um ou mais eventos de clivagem. Taispeptídeos de sinal contêm sítios de processamento quepermitem a clivagem da seqüência de sinal das proteínasmaduras uma vez que eles passam através da via secretória.A seqüência de sinal direciona a secreção da proteína, talcomo de um hospedeiro eucariótico no qual o vetor deexpressão é transformado, e a seqüência de sinal ésubseqüentemente ou concorrentemente clivada. A proteínapode, então, ser prontamente purificada do meioextracelular por métodos conhecidos. Alternativamente, aseqüência de sinal pode ser ligada à proteína de interesseusando uma seqüência, a qual facilita a purificação, talcomo com um domínio GST. Deste modo, por exemplo, aseqüência codificando o polipeptídeo pode ser fundida comuma seqüência marcadora, tal como uma seqüência codificandoum peptídeo, o que facilita a purificação do polipeptídeofundido, em certas modalidades preferidas desse aspecto dainvenção, a seqüência marcadora é um peptideo dehexaistidina, tal como a etiqueta fornecida num vetor pQE(Qiagen, Inc.), dentre outros, muitos dos quais sendocomercialmente disponíveis. Conforme descrito em Gentz etal, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:821 a 824 (1989), porexemplo, hexaistidina proporciona uma purificaçãoconveniente da proteína de fusão. A etiqueta HÁ é outropeptideo útil para a purificação o qual corresponde a umepítopo derivado da proteína de hemaglutinina de influenza,a qual foi descrita por Wilson et al., Cell 37:767 (1984),por exemplo.

Preferivelmente, uma proteína de fusão LIPOl- LIP03 dainvenção é produzida por técnicas de DNA recombinantespadronizadas. Por exemplo, fragmentos de DNA codificandopara diferentes seqüências de polipeptídeos são unidos naestrutura de acordo com técnicas convencionais, porexemplo, pelo emprego de terminais com extremidade cega oucom extremidade falha para ligação, digestão de enzima derestrição para proporcionar terminais apropriados,preenchimento de extremidades coesivas conforme apropriado,tratamento com fosfatase alcalina para evitar uniõesindesejáveis e ligação enzimática. Em outra modalidade, ogene de fusão pode ser sintetizado por técnicasconvencionais incluindo sintetizadores de DNAautomatizados. Alternativamente, a amplificação por PCR dosfragmentos de genes pode ser executada usando iniciadoresâncora, os quais geram projeções complementares entre doisfragmentos de genes consecutivos, os quais podem sersubseqüentemente anelados e reamplifiçados para gerar umaseqüência de gene quimérica (ver, por exemplo, CurrentProtocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. JohnWiley & Sons: 1992). Além disso, muitos vetores deexpressão são comercialmente disponíveis que já codificamuma porção de fusão (por exemplo, um polipeptídeo GST) . Umácido nucléico que codifica LIPOl- LIP03 pode ser clonadoem tal vetor de expressão de modo que a porção de fusão éligada na estrutura à proteína LIP01-LIP03.Equivalentes funcionais

Os termos "equivalentes funcionais" e "variantesfuncionais" são usados intercambiavelmente aqui.Equivalentes funcionais do DNA de LIPOl- LIP03 sãofragmentos de DNA isolados que codificam um polipeptídeoque exibe uma função particular da enzima lipolítica LIPOl-LIP03 conforme aqui definido. Um equivalente funcional deum polipeptídeo LIP01- LIP03 de acordo com a invenção é umpolipeptídeo que exibe pelo menos uma função de uma enzimalipolítica de Magnaporthe grisae conforme aqui definido.Equivalentes funcionais para isso também englobamfragmentos biologicamente ativos.

Equivalentes de polipeptídeo ou de proteínasfuncionais podem conter somente substituições conservativasde um ou mais aminoácidos das SEQ ID Nos: 5 a 14 ousubstituições, inserções ou anulações de aminoácidos não-essenciais. Concordantemente, um aminoácidos não-essencialé um resíduo que pode ser alterado na SEQ ID Nos 5 a 14 semalterar substancialmente a função biológica. Por exemplo,resíduos de aminoácidos que são conservados dentre asproteínas LIPOl- LIP03 da presente invenção são previstoscomo sendo particularmente não-sensíveis a alterações. Alémdisso, aminoácidos conservados dentre as proteínas LIPOl-LIP03 de acordo com a presente invenção e outras enzimaslipoliticas não são propensos a serem sensíveis aalterações.

0 termo "substituição conservativa" é tencionado aindicar uma substituição na qual o resíduo de aminoácido ésubstituído com um resíduo de aminoácido com uma cadeialateral similar. Essas famílias são conhecidas na técnica eincluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (porexemplo lisina, arginina e histidina), cadeias lateraisácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico),cadeias laterais polares não-carregadas (por exemploglicina, asparaginas, glutamina, serina, treonina,tirosina, cisteína), cadeias laterais não-polares (porexemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina,fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias lateraisbeta-ramifiçadas (por exemplo, treonina, valina,isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplotirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

Equivalentes de ácidos nucléicos funcionais podemtipicamente conter mutações silenciosas ou mutações que nãoalterem a função biológica do polipeptídeo codificado.Concordantemente, a invenção proporciona moléculas de ácidonucléico que codificam proteínas LIPOl- LIP03 que contêmalterações nos resíduos de aminoácidos que não sejamessenciais para uma atividade biológica particular. Taisproteínas LIPOl- LIP03 diferem na seqüência de aminoácidosda SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5;SEQ ID NO: 6, mas ainda retêm pelo menos uma atividadebiológica sua. Numa modalidade a molécula de ácido nucléicoisolada compreende uma seqüência de nucleotídeos quecodifica uma proteína, em que a proteína compreende um umaseqüência de aminoácidos substancialmente homóloga de pelomenos cerca de 60%, pref erivelmente 65%, maispreferivelmente 70%, ainda mais preferivelmente 75%, 80%,85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de homologia emrelação à seqüência de aminoácidos apresentada nas SEQ IDNos: 5 a 14.

Por exemplo, orientações envolvendo como fazersubstituições de aminoácidos fenotipicamente silenciosassão fornecidas em Bowie, J.U. et al. , Science 247: 1306 a1310 (1990) e nas referências ali citadas. Conforme osautores estabelecem, esses estudos revelaram que proteínassão surpreendentemente tolerantes às substituições deaminoácidos. Os autores ainda indicaram que alterações sãoprováveis de serem permissivas numa certa posição daproteína.

Uma molécula de ácido nucléico isolada codificando umhomólogo da proteína LIPOl- LIP03 à proteína de acordo comqualquer uma das SEQ ID Nos: 5 a 7, SEQ ID Nos: 8 a 9, SEQID Nos: 10 a 14, respectivamente, pode ser criada pelaintrodução de uma ou mais substituições, adições ouanulações de nucleotídeos nas seqüências de nucleotídeocodificantes de acordo com, respectivamente, qualquer umadentre as SEQ ID Nos: 2 a 4, de modo que uma ou maissubstituições, anulações ou inserções de aminoácidos sejaintroduzida na proteína codificada. Tais mutações podem serintroduzidas por técnicas padrões, tais como mutagênesedirecionada a sítio e mutagênese mediada por PCR.

0 termo "equivalentes funcionais" também englobaortólogos da proteína LIP01-LIP03. Ortólogos da proteínaLIPOl- LIP03 são proteínas que podem ser isoladas de outrascepas ou espécies e possuem uma atividade biológica similarou idêntica. Tais ortólogos podem ser prontamenteidentificados uma vez que compreendem uma seqüência deaminoácidos que é substancialmente homóloga às SEQ ID Nos:5 a 14.

Conforme aqui definido, o termo "substancialmentehomólogo" se refere a uma primeira seqüência de aminoácidosou de nucleotídeos, a qual contém uma quantidade suficienteou mínima de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos ouequivalentes (por exemplo, com cadeias lateraissemelhantes) em relação a uma segunda seqüência deaminoácidos ou nucleotídeos de modo que a primeira e asegunda seqüência de aminoácidos ou de nucleotídeos têm umdomínio comum. Por exemplo, seqüências de aminoácidos ou denucleotídeos as quais contêm um domínio comum com cerca de60%, preferivelmente 65%, mais preferivelmente 70%, aindamais preferivelmente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%ou 99% de identidade ou mais são definidas aqui comosuficientemente idênticas.

Também ácidos nucléicos codificando outros membros dafamília LIP01-LIP03, os quais deste modo têm uma seqüênciade nucleotídeos que difere da SEQ ID Nos: 2 a 4 estãodentro do escopo da invenção. Além disso, ácidos nucléicoscodificando as proteínas LIPOl- LIP03 de diferentesespécies, as quais podem ter uma seqüência de nucleotídeosa qual seja diferente das SEQ ID Nos: 2 a 4 estão dentro doescopo da invenção.

Moléculas de ácidos nucléicos correspondendo avariantes (por exemplo, variantes alélicas naturais) ehomólogos do DNA de LIPOl- LIP03 da invenção podem serisolados baseando-se nas suas homologias em relação aosácidos nucléicos LIPOl- LIP03 revelados aqui usando osDNAcs aqui revelados ou um fragmento adequado seu, como umasonda e hibridização de acordo com técnicas de hibridizaçãopadrões preferivelmente sob condições de hibridizaçãoaltamente estringentes.

Além de variantes alélicas de ocorrência natural daseqüência LIP01-LIP03, a pessoa habilitada irá reconhecerque alterações podem ser introduzidas pela mutação nasseqüências de nucleotídeo das SEQ ID Nos: 2 a 4, levandodessa forma a alterações na seqüência de aminoácidos daproteína LIPOl- LIP03 sem alterar substancialmente a funçãoda proteína LIP01-LIP03.

Em outro aspecto da invenção, proteínas LIPOl- LIP03melhoradas são fornecidas. Proteínas LIPOl- LIP03melhoradas são proteínas em que pelo menos uma atividadebiológica é melhorada. Tais proteínas podem ser obtidaspela introdução aleatória de mutações ao logo de toda ou departe da seqüência codificante LIP01-LIP03, tal como pormutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podemser expressos recombinantemente e varridos para a atividadebiológica. Por exemplo, a técnica proporciona para ensaiospadrões para medir a atividade enzimática da enzimalipolítica e, dessa forma, proteínas melhoradas podem serfacilmente selecionadas.

Numa modalidade preferida, a proteína LIP01- LIP03 temuma seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5a7, SEQ ID NO: 8 a 9, SEQ ID NO: 10 a 14, respectivamente.Em outra modalidade, o polipeptídeo LIPOl- LIP03 ésubstancialmente homólogo à seqüência de aminoácidos deacordo com as SEQ ID Nos: 5 a 14 e retém pelo menos umaatividade biológica de um polipeptídeo de acordo com as SEQID Nos: 5 a 14, que ainda difere na seqüência deaminoácidos devido ã variação ou mutagênese naturalconforme descrito acima.

Numa outra modalidade preferida, a proteína LIPOl-LIP03 tem uma seqüência de aminoácidos codificada por umfragmento de ácido nucléico isolado capaz de hibridizarpara um ácido nucléico de acordo com respectivamentequalquer uma dentre as SEQ ID Nos: 2 a 4, preferivelmentesob condições de hibridização altamente estringentes.

Concordantemente, a proteína LIPOl- LIP03 épreferivelmente uma proteína a qual compreende umaseqüência de aminoácidos de pelo menos cerca de 60%, 65%,70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais dehomologia em relação à seqüência de aminoácidos mostrada naSEQ ID Nos: 5 a 14 e retém pelo menos uma atividadefuncional do polipeptídeo de acordo com as SEQ ID Nos: 5 a 14.

Equivalentes funcionais de uma proteína de acordo coma invenção também podem ser identificados, por exemplo,pela varredura de bibliotecas combinatoriais de mutantes,por exemplo, mutantes de truncamento da proteína dainvenção para atividade de enzima lipolítica. Numamodalidade, uma biblioteca diversificada de variantes égerada por mutagênese combinatorial no nível do ácidonucléico. Uma biblioteca diversificada de variantes podeser produzida, por exemplo, pela ligação enzimática de umamistura de oligonucleotídeos sintéticos em seqüências degenes de modo que um grupo degenerado de seqüências deproteínas seqüenciais é pode ser expresso comopolipeptídeos individuais ou, alternativamente, como umgrupo de proteínas de fusão maiores (por exemplo, paraexibição de fago). Existe uma variedade de métodos quepodem ser usados para produzir bibliotecas de variantespotenciais dos polipeptídeos da invenção a partir de umaseqüência de oligonucleotídeos degenerada. Métodos parasintetizar oligonucleotídeos degenerados são conhecidos natécnica (ver, por exemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3;Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakuraet al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) NucleicAcid Res. 11:477) .

Além disso, bibliotecas de fragmentos da seqüênciacodificante de um polipeptídeo da invenção podem ser usadaspara gerar uma população diversificada de polipeptídeospara varrer uma seleção subseqüente de variantes. Porexemplo, uma biblioteca de fragmentos de seqüênciacodificante pode ser gerada pelo tratamento de um fragmentode PCR de fita dupla da seqüência codificadora de interessecom uma nuclease sob condições em que o corte ocorresomente cerca de uma vez por molécula, a desnaturação doDNA de fita dupla, a renaturação do DNA para formar um DNAde fita dupla a qual pode incluir pares de sentido/anti-sentido de diferentes produtos cortados, a remoção deporções de fita única de duplexes reformados por tratamentocom a Sl nuclease e a ligação da biblioteca de fragmentosresultante num vetor de expressão. Por esse método, umabiblioteca de expressão pode ser derivada a qual codifiquefragmentos N-terminais e internos de vários tamanhos daproteína de interesse.

Várias técnicas são conhecidas na arte para varrerprodutos gênicos de bibliotecas combinatoriais feitas pormutações ou truncamento pontual, e para varrer bibliotecasde DNAc pra produtos gênicos com uma propriedadeselecionada. As técnicas mais amplamente usadas, as quaissão responsáveis pela análise de alta produtividade, paravarrer grandes bibliotecas gênicas tipicamente incluem aclonagem da biblioteca gênica em vetores de expressãoreplicáveis, transformando células apropriadas com abiblioteca resultante dos vetores, e expressando os genescombinatoriais sob condições nas quais a detecção de umaatividade desejada facilita o isolamento do vetorcodificando os genes cujo produto tenha sido detectado. Amutagênese em conjunto recorrente (REM), uma técnica a qualintensifica a freqüência de mutações funcionais nasbibliotecas, pode ser usada juntamente com as técnicas devarredura para identificar variantes de uma proteína dainvenção (Arkin e Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA89: 7811 a 7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering6(3): 327 a 331) .

Além da seqüência gênica LIPOl- LIP03 mostrada nas SEQID Nos: 2 a 4, respectivamente, será claro para a pessoaversada na técnica que os polimorfismos da seqüência de DNApodem existir dentro de uma dada população, o qual odelevar a alterações na seqüência de aminoácidos da proteínaLIP01-LIP03. Tais polimorfismos genéticos podem existir emcélulas de diferentes populações ou dentro de uma populaçãodevido à variação alélica natural. Variantes alélicas podemtambém incluir equivalentes funcionais.Fragmentos de um polinucleotídeo, de acordo com ainvenção, podem também compreender polinucleotídeos que nãocodificam polipeptídeos funcionais. Tais polinucleotídeospodem funcionar como sondas ou iniciadores para uma reaçãode PCR.

Ácidos nucléicos de acordo com a invenção,independentemente se eles codificam polipeptídeosfuncionais ou não-funcionais, podem ser usados como sondasde hibridização ou como iniciadores da reação em cadeia dapolimerase (PCR). Os usos das moléculas de ácido nucléicoda presente invenção que não codificam um polipeptídeo comuma atividade LIPOl- LIP03 incluem, inter alia, o genecodificando a proteína LIP01-LIP03, ou suas variantesalélicas de uma biblioteca de DNAc, por exemplo, de outrosorganismos do que Magnaporthe grisae; hibridização in si tu(por exemplo, FISH) para propagações cromossomaismetafásicas para proporcionr a localização cromossomialprecisa do gene LIP01- LIP03 conforme descrito em Verma etal., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques,Pergamon Press, New York (1988); análise de Northern blotpara detectar a expressão de RNAm de LIPOl- LIP03 emtecidos e/ou células específicas e 4) sondas e iniciadoresque podem ser usados como uma ferramenta de diagnósticopara analisar a presença de um ácido nucléico hibridizávelpara a sonda LIPOl- LIP03 numa dada amostra biológica (porexemplo, tecido).

É também englobado pela invenção um método de obtençãode um equivalente funcional de um gene LIP01-LIP03. Talmétodo requer a obtenção de uma sonda marcada que inclui umácido nucléico isolado o qual codifica toda ou uma porçãoda seqüência de proteína de acordo com as SEQ ID Nos: 5 a14 ou uma variante de qualquer uma delas; a varredura deuma biblioteca de fragmento de ácido nucléico com a sondamarcada sob condições que permitam a hibridização da sondaem fragmentos de ácido nucléico na biblioteca, formandodessa forma duplexes de ácido nucléico, e preparando umaseqüência de genes de comprimento total dos fragmentos deácido nucléico em qualquer duplex marcado para obter umgene relacionado com o gene LIP01-LIP03.

Numa modalidade, um ácido nucléico LIPOl- LIP03 dainvenção apresenta pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de homologia em relação auma seqüência de ácidos nucléicos mostrada emrespectivamente qualquer uma dentre as SEQ ID nos: 2 a 4 ouaos seus complementos.

Células hospedeiras

Em outra modalidade, a invenção exibe células, porexemplo, células hospedeiras transformadas ou célulashospedeiras recombinantes que contêm um ácido nucléicoenglobado pela invenção. Uma "célula transformada" ou"célula recombinante" é uma célula na qual (ou numancestral da qual) tenha sido introduzido, através detécnicas de DNA recombinante, um ácido nucléico dé acordocom a invenção. Tanto células procarióticas quantoeucarióticas são incluídas, por exemplo, bactérias, fungos,leveduras e semelhantes, são especialmente preferidascélulas de fungos filamentosos, particularmente espécies deMagnaporthe grisae ou de Aspergillus tais como Aspergillusniger ou oryzae.

Uma célula hospedeira pode ser escolhida que module aexpressão das seqüências inseridas, ou modifique e processeo produto gene de um modo especifico e desejado. Taismodificações (por eemplo, glicosilação) e processamento(por exemplo, clivagem) dos produtos protéicos podemfacilitar o funcionamento ótimo da proteína.

Várias células hospedeiras têm mecanismos específicose características para o processamento pós-tradução e amodificação de proteínas e de produtos gênicos. Linhagenscelulares apropriadas ou sistemas hospedeiros familiares àspessoas versadas na técnica de biológica molecular e/oumicrobiologia podem ser escolhidas para assegurar amodificação desejada e correta e o processamento daproteína estrangeira expressa. Para essa finalidade,células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinariacelular para o processamento próprio do transcritoprimário, glicosilação e fosforilação do produto gênicopodem ser usadas. Tais células hospedeiras são bemconhecidas na técnica.

Células hospedeiras também incluem, porém não estãolimitadas, a linhagens de células de mamíferos tais comoCHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 e linhagenscelulares de plexo coróide.

Caso desejado, uma linhagem celular estavelmentetransfectada pode produzir os polipeptídeos de acordo com ainvenção. Uma variedade de vetores adequados para atransfecção estável de células de mamíferos é disponívelpara o público, métodos para construir tais linhagenscelulares também são publicamente conhecidos, por exemplo,em Ausubel et al (acima).

Uso da enzima lipolítica LIPOl- LIP03 em processosindustriais

Surpreendentemente, a enzima lipolítica de acordo coma invenção não está restrita à hidrólise de meramente umsubstrato específico, porém é capaz de efetuar diferentestipos de atividades lipolíticas, sendo atividade dafosfolipase, lipase e galactolipase. A enzima lipolítica deacordo com a invenção pode apresentar essas atividades aomesmo tempo ou podem ter uma estreita especificidade comuma atividade individual e pouca ou nenhuma outraatividade, ou ela pode ter uma especificidade mais amplacom uma atividade predominante e menos outras atividades,dependendo da composição da massa de farinha, do tempo dereação, do pH, da temperatura e do conteúdo de água.

Devido à sua diversidade, a enzima lipolítica deacordo com a invenção pode ser usada em várias aplicaçõesindustriais, incluindo a produção dedigalactosilmonoglicerídeo de um digalactosildiglicerídeocontendo a fonte ou a modificação dos emulsificantesfosfolipídicos. Um exemplo de um emulsificantefosfolipídico é a lecitina, a qual é uma mistura delipídeos tanto polares quanto neutros nos quais o conteúdode lipídeos polares é de pelo menos 60%. Emulsificantesfosfolipídicos têm muitas aplicações alimentícias e não-alimentícias, por exemplo, lecitina de ovo é usada como umemulsificante, por exemplo, em produtos derivados de leite,especificamente maionese, molhos, massas para tortas, etc.,lecitina de soja, por exemplo, é usada como umemulsificante em molhos (de baixa caloria), pão, margarina,cosméticos, etc, outras lecitinas são usadas, por exemplo,em chocolates, ração de bezerros. A modificação dosemulsificantes fosfolipídicos pela enzima lipolítica deacordo com a invenção pode causar uma emulsificaçãoaumentada da mistura óleo/água. A modificação dosemulsificantes fosfolipídicos pela enzima lipolítica deacordo com a invenção pode aumentar a estabilidade dasemulsões resultantes da adição dos emulsificantes defosfolipídeo modificados para uma faixa de pH e/outemperatura mais ampla ou diferente. A modificação dosemulsificantes de fosfolipídeos pela enzima lipolítica deacordo com a invenção pode aumentar a estabilidade dasemulsões, resultantes da adição de emulsificantes defosf olipídeos modificados, na presença de íons Ca2+ ou Mg2+.

Outro exemplo de aplicação industrial da enzimalipolítica de acordo com a invenção é que ela pode serusada para a desgomagem de óleos vegetais no processamentodesses óleos. Num processo de desgomagem típico, aslecitinas são removidas dos óleos vegetais, por exemplo,óleos de soja, óleos de semente de colza (canola), óleos delinhaça, óleos de girassol, para aumentar, dentre outros, aestabilidade do óleo vegetal, pela lavagem da fase oleosacom água, em que a mistura de água e óleo sob condições dealto cisalhamento força a massa das lecitinas na faseaquosa, a qual é subseqüentemente removida num separador.Nessa chamada fase de desgomagem aquosa, somente osfosfolipídeos rapidamente hidratáveis são prontamenteremovidos, por exemplo, fosfatidilcolina,fosfatidilinositol e fosfatidiletanolamina. Osfosfolipídeos/fosfatídeos não-hidratáveis, na sua maiorparte os fosf olipídeos, os quais consistem de até 50% desais de magnésio e/ou cálcio, não podem ser prontamenteremovidos na etapa de desgomagem aquosa. A exposição dosfosfolipídeos/fosfatídeos não-hidratáveis às enzimaslipolíticas, de acordo com a invenção, torna essesfosfolipídeos mais solúveis em água e, conseqüentemente,mais fáceis de extrair numa fase de desgomagem aquosa.

Outro exemplo de aplicação industrial da enzimalipolítica de acordo com a invenção é a remoção doprecipitado que ocorre durante a sacarificação (com a ajudada α-amilase e da glicoaminlase) de glúten de trigo ou deamido de trigo para produzir xarope de glicose. A remoçãodo precipitado acelera consideravelmente a subseqüentefiltração dos xaropes de glicose resultantes.

Ainda outro exemplo de uma aplicação industrial daenzima lipolítica de acordo com a invenção em alimentos é oseu uso em aplicações de cozimento para melhorar aqualidade da massa de farinha ou do produto assado.

Surpreendentemente, a lipase de acordo com a invençãoapresenta pelo menos uma das seguintes propriedades in si tuquando usada em massa de farinha (e também nos outrosprocessos industriais mencionados):

• uma atividade relativamente baixa para lipideosapolares,

• uma atividade relativamente alta para diacil-lipídeos polares, pelo menos para diacilgalactolipídeos,

• uma atividade relativamente baixa para monoacilcompostos polares.

Por exemplo, a enzima de acordo com a invenção podeapresentar in si tu uma atividade da lisofosfolipaserelativamente baixa e uma atividade da lipase relativamentebaixa. Essas propriedades inesperadas também sãoconsideradas como sendo extremamente vantajosas quandousadas como um substituinte de emulsificantes químicos emmassas de farinha.

Vários tipos de atividade de fosfolipase podem serdistinguidos, os quais hidrolisam as ligações éster queligam as porções de acil graxo à estrutura do glicerol:

•Fosfolipase Al (EC 3.1.1.32) e A2 (EC 3.1.1.4)catalisam a desacilação de um grupo acil graxo nas posiçõessn-l e sn-2 respectivamente, de umdiacilglicerofosfolipideo para produzir umlisofosfolipídeo. Essa é uma atividade desejável para asubstituição do emulsificante.

•Lisofosfolipase (EC 3.1.1.5 - também chamada defosfolipase B pelo Comitê de Nomenclatura da UniãoInternacional de Bioquímica e Biologia Molecular (EnzymeNomenclature, Academic Press, Nova Iorque, 1992)) catalisaa hidrólise do grupo acil graxo remanescente numlisofosfolipídeo. Uma fosfolipase B foi reportada dePenicillium notatum (Saito et al., 1991, Methods inEnzymology 197: 446 a 456), a qual catalisa a desacilaçãotanto de ácidos graxos de um diacilglicerofosfolipídeo epossui intrinsecamente a atividade da lisofosfolipase. Paraa substituição do emulsificante, a atividade dalisofosfolipase é menos desejável, uma vez que isso poderiaresultar na anulação da combinação de uma cabeça polar e deuma cauda apoiar, incapacitando o produto resultante deinfluenciar nas propriedades de superfície.

Surpreendentemente foi mostrado que a lipase de acordo coma invenção apresenta uma atividade de lisofosfolipaserelativamente baixa na massa de farinha.A farinha de trigo contém aproximadamente 2,2 a 2,9%de lipídeos. Os lipídeos da farinha podem ser divididos emlipídeos de amido (0,8 a 0,9%) e em lipídeos que não são deamido (1,4 a 2,0%). Enquanto que os lipídeos de amidoconsistem principalmente de lisofosfolipídeos polares, oslipídeos que não são de amido consistem de cerca de 4 0% detriglicerídeos neutros e 40% de fosfo- e glicolipídeospolares. Para otimização da fração de lipídeos da farinha alipase de acordo com a invenção é capaz de hidrolisar oslipídeos polares, sendo os fosfolipídeos e glicolipídeos,mais especificamente os galactolipídeos in si tu na massa defarinha pela adição da lipase de acordo com a invenção.

WOO 4 /104193 revela o uso de uma fosfolipase C deMagnaporthe grisae em aplicações de cozimento. Entretanto,a atividade da fosfolipase C não é desejável para umaenzima ser usada como um substituinte para emulsificantesquímicos, uma vez que isso não produz compostos ativos desuperfície suficientes. Além disso, a fosfolipase Crevelada em W004/104193 é não-homóloga às SEQ ID Nos: 3, 4 ou 5.

WO 98/45453 revela um polipeptídeo com atividade delipase derivada de Aspergillus tubigensis, o qual tambémapresenta atividade hidrolítica nodigalactosildiglicerídeo. Essa enzima, entretanto, sofre deuma atividade específica relativamente baixa emgalactosildiglicerídeos e de uma atividade relativamentealta em triglicerídeos in si tu em pães (exemplo 10), o quetorna essa enzima não adequada para ser usada como umsubstituinte total para emulsificantes químicos.

Enzimas de cozimento podem ser usadas em múltiplosprodutos assados. 0 termo "produtos assados" é aquidefinido como para compreender pães tais como tin bread,filões de pães, pão francês assim como pãezinhos, bolos,tortas, sonhos, crescidos com leveduras e rosquinhas debolo e semelhantes.

A enzima lipolítica de acordo com a invenção pode, porexemplo, ser usada em produtos assados. Produtos assadostais como pães são preparados a partir de uma massa defarinha a qual é geralmente feita a partir dos ingredientesbásicos farinha (de trigo), água e opcionalmente sal.Dependendo dos produtos assados, outros ingredientesadicionados podem ser açúcares, saborizantes, etc. Paraprodutos levedados, primeiramente leveduras para cozimentosão usadas próximas a sistemas de fermentação tais como umacombinação de um ácido (composto gerador) e bicarbonato.

Leveduras, enzimas e aditivos químicos são geralmenteadicionados separadamente à massa de farinha.

Enzimas podem ser adicionadas numa forma seca,porexemplo, granulada ou numa forma líquida. Os aditivosquímicos estão, na maioria dos casos, na forma de pó.

Também composições adjuvantes de processamento, as quaissão adaptadas para aplicações de cozimento específicas,podem ser compostas de uma mistura dedicada de aditivosquímicos e de enzima.

A preparação de uma massa de farinha a partir dosingredientes e de adjuvantes de processamento descritosacima é bem conhecida na técnica e compreende a mistura dosreferidos ingredientes e adjuvantes de processamento e deum ou mais passos de modelagem e fermentação.

A preparação dos produtos assados a partir de taismassas de farinha também é bem conhecida na técnica e podecompreender a modelagem e a configuração e a fermentaçãoadicional da massa de farinha seguido pela cozimento emtemperaturas requeridas e em tempos de cozimento. Apresente invenção se dirige a pelo menos um, senão todos osproblemas acima.

A invenção também se refere ao uso da enzimalipolítica de acordo com a invenção numa variedade deprocessos industriais. Apesar da experiência a longo prazoobtida com esses processos, a enzima lipolítica de acordocom a invenção apresenta uma variedade de desvantagenssignificativas em relação às enzimas atualmente usadas.

Dependendo da aplicação específica, essas vantagens podemincluir aspectos como baixos custos de produção, altaespecificidade para o substrato, menor antigenicidade emenos atividades secundárias indesejáveis, rendimentos maiselevados quando produzidos num microrganismo adequado,faixas de temperatura e de pH mais adequadas, melhoressabores do produto final assim como um melhor graualimentício e aspectos kosher.

A presente invenção também se refere a métodos parapreparar uma massa de farinha ou um produto assadocompreendendo a incorporação na massa de farinha de umaquantidade eficaz de uma enzima lipolítica da presenteinvenção, a qual melhora uma ou mais propriedades da massade farinha ou do produto assado obtido a partir da massa defarinha em relação a uma massa de farinha ou a um produtoassado no qual o polipeptídeo não é incorporado.

A frase "incorporando na massa de farinha" é aquidefinida como adicionando a enzima lipolítica de acordo coma invenção à massa de farinha, qualquer ingrediente do quala massa de farinha é para ser feita, e/ou qualquer misturade ingredientes de massa de farinha dos quais a massa épara ser feita. Em outras palavras, a enzima lipolítica deacordo com a invenção pode ser adicionada em qualquer passoda preparação de massa de farinha e pode ser adicionada emum, dois ou mais passos. A enzima lipolítica de acordo coma invenção é adicionada aos ingredientes de uma massa defarinha que é amassada e assada para fazer o produto assadousando métodos bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo,a Patente Americana No. 4.567.046, EP-A-426.211, JP-A-60-78529, JP-A-62-11162 9, e JP-A-63-258528.

0 termo "quantidade eficaz" é aqui definido como umaquantidade da enzima lipolítica de acordo com a invençãoque é suficiente para proporcionar um efeito mensurável empelo menos uma propriedade de interesse da massa de farinhae/ou do produto assado.

0 termo "propriedade melhorada" é aqui definido comoqualquer propriedade de uma massa de farinha e/ou de umproduto obtido da massa de farinha, particularmente de umproduto assado, o qual é melhorado pela ação da enzimalipolítica de acordo com a invenção em relação a uma massade farinha ou produto no qual a enzima lipolítica de acordocom a invenção não é incorporada. A propriedade melhoradapode incluir, porém não está limitada, à força aumentada damassa de farinha, á elasticidade aumentada da massa defarinha, à estabilidade aumentada da massa de farinha, àviscosidade reduzida da massa de farinha, à extensibilidademelhorada da massa de farinha, à maquinabilidade melhoradada massa de farinha, ao volume aumentado do produto assado,ao sabor melhorado do produto assado, à estrutura do miolode pão melhorada do produto assado, à maciez do miolo depão melhorada do produto assado, à formação de bolhasreduzida do produto assado e/ou ao antienvelhecimentomelhorado do produto assado.

A propriedade melhorada pode ser determinada porcomparação de uma massa de farinha e/ou de um produtoassado preparado com e sem a adição de um polipeptídeo dapresente invenção de acordo com os métodos da presenteinvenção estão descritos abaixo nos Exemplos. Qualidadesorganolépticas podem ser avaliadas usando procedimentos bemestabelecidos na indústria de panificação, e podem incluir,por exemplo, o uso de um painel de provadores-testadorestreinados.

O termo "força aumentada da massa de farinha" é aquidefinido como a propriedade de uma massa de farinha que temgeralmente mais propriedades elásticas e/ou requer maisquantidade de trabalho para moldar e dar forma.

O termo "elasticidade aumentada da massa de farinha" éaqui definido como a propriedade de uma massa de farinha aqual tem uma tendência mais elevada de ganhar novamente suaforma original depois de ser submetida a um certoesticamento físico.

O termo "estabilidade aumentada da massa de farinha" éaqui definido como a propriedade de uma massa de farinhaque é menos susceptível ao abuso mecânico, conseqüentementemantendo melhor sua forma e volume e é avaliada pelaproporção de peso/extensão de uma seção cruzada de um pãodepois de uma prova normal e/ou estendida.

O termo "viscosidade reduzida da massa de farinha" éaqui definido como a propriedade de uma massa de farinha deter uma tendência menor a aderir em superfícies, porexemplo, na maquinaria de produção de massa de farinha, e éou avaliada empiricamente pelo padeiro testador versado oumedida pelo uso de um analisador de textura (por exemplo,TAXT2) conforme é conhecido na técnica.

O termo "extensibilidade melhorada da massa defarinha" é aqui definido como a propriedade de uma massa defarinha poder ser submetida ao esticamento ou estiramentoaumentado sem ruptura.

0 termo "maquinabilidade melhorada da massa defarinha" é aqui definido como a propriedade de uma massa defarinha ser geralmente menos viscosa e/ou mais forme e/oumais elástica.

O termo "volume aumentado do produto assado" é medidocomo o volume de um dado pedaço de pão determinado por umanalisador de volume de pão automático (por exemplo BVM-3,TexVol Instruments AB, Viken, Suécia) usando ultra-som oudetecção a laser conforme é conhecido na técnica.

0 termo "formação reduzida de bolhas do produtoassado" é aqui definido como uma redução visualmentedeterminada de formação de bolhas na crosta do pão assado.

0 termo "estrutura de miolo de pão melhorada doproduto assado" é aqui definido como a propriedade de umproduto assado com células mais finas e/ou paredescelulares mais finas no miolo de pão e/ou distribuição maisuniforme/homogênea de células no miolo de pão e éusualmente avaliado visualmente pelo padeiro ou por análisede imagem digital conforme é conhecido na técnica (porexemplo, C-cell, Calibre Control International Ltd,Appleton, Warrington, Reino Unido).

0 termo "maciez melhorada do produto assado" é ooposto de "firmeza" e é aqui definido como a propriedade deum produto assado que é mais fcilmente comprimido e éavaliada ou empiricamente pelo padeiro de teste versado oumedido pelo uso de um analisador de textura (por exemplo,TAXT2) conforme é conhecido na técnica.

O termo "sabor melhorado do produto assado) é avaliadopor um painel de teste treinado.

0 termo "antienvelhecimento melhorado do produtoassado" é aqui definido como as propriedades de um produtoassado que tem uma taxa reduzida de deterioração dosparâmetros de qualidade, por exemplo, maciez e/ouelasticidade, durante a estocagem.

O termo "massa de farinha" é aqui definido como amistura de farinha e outros ingredientes formes osuficiente para misturar ou enrolar. A massa de farinhapode ser fresca, congelada, preparada ou pré-assada. Apreparação da massa de farinha congelada é descrita porKulp e Lorenz em Frozen e Refrigerated Doughs e Batters.

0 termo "produto assado" é aqui definido como qualquerproduto preparado a partir de massa de farinha, seja de umcaráter macio ou friável. Exemplos de produtos assados,seja do tipo branco, claro ou escuro, os quais podem servantajosamente produzidos pela presente invenção são pão(particularmente pão branco, de farinha integral ou decenteio), tipicamente na forma de cone ou rolos, pão tipobaguete francês, massas, macarrões (fervidos ou fritos(mexidos)), pão de pita, "tortillas", "tortilla" de milho,bolos, panquecas, biscoitos (biscuits), biscoitos(cookies), rosquinhas, bagles, crostas de tortas, pãofervido e pão torrado, e semelhantes.

A enzima lipolitica da presente invenção e/ou enzimasadicionais a serem usadas nos métodos da presente invençãopodem estar em qualquer forma adequada para o uso emquestão, por exemplo, na forma de um pó seco, pó aglomeradoou granulado, particularmente num granulado sem pó,líquido, particularmente num líquido estabilizado ou enzimaprotegida tal conforme descrito em WOOl/11974 e emW002/26044. Granulados e pós aglomerados podem serpreparados por métodos convencionais, por exemplo, pelapulverização da enzima lipolitica de acordo com a invençãonum veiculo num granulador de leito fluidizado. 0 veículopode consistir de núcleos particulados com um tamanho departícula adequado. 0 veículo pode ser solúvel ouinsolúvel, por exemplo, um sal (tal como NaCl ou sulfato desódio), açúcar (tal como sacarose ou lactose), álcool deaçúcar (tal como sorbitol), amido, arroz, grãos de milho ousoja. A enzima lipolitica de acordo com a invenção e/ouenzimas adicionais podem estar contidas em formulações delenta liberação. Métodos para preparar formulações de lentaliberação são bem conhecidas na técnica. A adição deestabilizantes nutricionalmente aceitáveis tais comoaçúcar, álcool de açúcar ou outro poliol, e/ou de ácidolático ou outro ácido orgânico de acordo com métodosestabelecidos pode, por exemplo, estabilizar preparaçõesenzimáticas líquidas.

A enzima lipolitica de acordo com a invenção tambémpode ser incorporada em leveduras compreendendo composiçõestais como aquelas reveladas em EP-A-0619947, EP-A-0659344 eWOO2/4 9441.

Para inclusão em pré-misturas de farinha, é vantajosoque o polipeptídeo de acordo com a invenção esteja na formade um produto seco, por exemplo, de um granulado sem pó,enquanto que para inclusão juntamente com um líquido eleestá vantajosamente na forma líquida.

Uma ou mais enzimas adicionais também podem serincorporadas na massa de farinha. A enzima adicional podeser de qualquer origem, incluindo de mamífero e devegetais, e preferivelmente de origem microbiana(bacteriana, de levedura ou fúngica) e pode ser obtida portécnicas convencionalmente usadas na arte.

Numa modalidade preferida, a enzima adicional pode seruma amilase - tal como uma alfa-amilase (útil para forneceraçúcares fermentáveis por levedura e retardar oenvelhecimento), beta-amilase, amilase maltogênica ouamilase não-maltogênica - ciclodextrinoglicanotransferase,peptidase, particularmente uma exopeptidase (útil naintensificação do sabor), transglutaminase, lipase (útilpara a modificação de lipídeos presentes na massa defarinha ou em constituintes da massa de farinha de modo aamaciar a massa de farinha), galactolipase, fosfolipase,celulase, hemicelulase, particularmente uma pentosanase talcomo xilanase (útil para a hidrólise parcial de pentosanos,mais especificamente abrabinoxilan, o qual aumenta aextensibilidade da massa de farinha), protease (útil para oenfraquecimento do glúten, particularmente quando usado emfarinha de trigo dura), proteína dissulfeto isomerase, porexemplo, uma proteína dissulfeto isomerase conformerevelado em WO 95/00636, glicosiltransferase, peroxidase(útil para melhorar a consistência da massa de farinha),lacase ou oxidase, por exemplo, uma glicose oxidase, hexoseoxidase, aldose oxidase, piranose oxidase, lipoxigenase ouL-aminoácido oxidase (útil para melhorar a consistência damassa de farinha).

Quando uma ou mais atividades enzimáticas adicionaissão para ser adicionadas de acordo com os métodos dapresente invenção, essas atividades podem ser adicionadasseparadamente ou juntamente com o polipeptídeo de acordocom a invenção, opcionalmente como constituinte(s) dacomposição melhoradora de pão e/ou melhoradoras de massa defarinha. As outras atividades enzimáticas pode ser qualqueruma das enzimas descritas acima e podem ser dosadas deacordo com práticas de cozimento estabelecidas.

A presente invenção também se refere aos métodos parapreparar um produto assado compreendendo a cozimento de umamassa de farinha obtida por um método da presente invençãopara produzir um produto assado. A cozimento da massa defarinha para produzir um produto assado pode ser feitausando métodos bem conhecidos na técnica.

A presente invenção também se refere às massas defarinha e aos produtos assados, respectivamente, produzidospelos métodos da presente invenção.

A presente invenção ainda se refere a uma pré-mistura,por exemplo, na forma de uma composição de farinha, paramassa de farinha e/ou produtos assados feitos com massa defarinha, nos quais a pré-mistura compreende um polipeptídeoda presente invenção. 0 termo "pré-mistura" é aqui definidopara ser entendido no seu sentido convencional, isto é,como uma mistura de agentes de cozimento, geralmenteincluindo farinha, a qual pode ser usada não somente emplantas/recursos de cozimento de pães industriais, mastambém em padarias a varejo. A pré-mistura pode serpreparada pela mistura do polipeptídeo ou de uma composiçãomelhoradora de pães e/ou melhoradora de massa de farinha dainvenção compreendendo o polipeptídeo com um veículoadequado tal como farinha, amido, um açúcar ou um sal. Apré-mistura pode conter outros aditivos melhoradores demassa de farinha e/ou melhoradores de pães, por exemplo,qualquer um dos aditivos, incluindo as enzimas mencionadasacima.

A presente invenção ainda se refere a aditivos decozimento na forma de um granulado ou pó aglomerado, osquais compreendem um polipeptídeo da presente invenção. 0aditivo de cozimento preferivelmente tem uma distribuiçãode tamanho de partícula estreita com mais de 95% (em peso)das partículas na faixa de 25 a 500 μπι.

Na fabricação de massas de farinha e de pães, apresente invenção pode ser usada juntamente com osadjuvantes de processamento definidos mais acima, tais comoos adjuvantes de processamento químico tais como oxidantes(por exemplo, ácido ascórbico), agentes redutores (porexemplo, L-cisteína) e/u emulsificantes (por exemplo,DATEM, SSL e/ou CSL) e/ou adjuvantes de processamentoenzimático tais como oxirredutases (por exemplo, glicoseoxidase), enzimas modificadoras de polissacarídeos (porexemplo, α-amilase, hemicelulase, enzimas ramificadoras,etc.) e/ou enzimas modificadoras de proteínas(endoprotease, exoprotease, enzimas ramificadoras, etc.).

As aplicações industriais acima mencionadas da enzimalipolítica de acordo com a presente invenção compreendemsomente alguns exemplos e essa listagem não é tencionada aser restritiva.

A enzima lipolítica LIP01- LIP03 pode serconvenientemente produzida em microrganismos. Nos processosacima, é vantajoso usar as enzimas lipolíticas que sãoobtidas por técnicas de DNA recombinante. Tais enzimasrecombinantes têm várias vantagens em relação às suascontrapartes tradicionalmente purificadas. Enzimasrecombinantes podem ser produzidas com baixo custo, altorendimento, livres de agentes contaminantes como bactériasou vírus, porém também livres de toxinas bacterianas oucontaminando outras atividades enzimáticas.

Daqui por diante a invenção é ilustrada pelosseguintes exemplos não-limitativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Fermentação de Aspergillus niger

As enzimas lipolíticas codificadas pelas seqüências denucleotídeos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4,conforme aqui fornecidas, foram obtidas pela construção deplasmídeos de expressão contendo as seqüências de DNA,transformando uma cepa de A. niger com tal plasmídeo efazendo as cepas de Aspergillus niger crescerem da seguinteforma.

Esporos frescos (10^6 a 10^7) de cepas de A. niger foraminoculadas em 20 mL de meio CSL (frasco de 100 mL, septo) ecresceram por 20 a 24 horas a 34°C e 170 rpm. Depois dainoculação de 5 a 10 mL de CSL pré-cultivado em 100 mL demeio CSM (frasco de 500 mL, septo) as cepas foramfermentadas a 34 0C e 170 rpm por 3 a 5 dias.

Sobrenadantes livres de células foram obtidos porcentrifugação em tubos Greiner de 50 mL (30 minutos, 5.000rpm). Os sobrenadantes foram pré-filtrados num filtro demicrofibra GF/A Whatman Glass (150 mm E) para remover aspartículas maiores, ajustados para pH 5 com KOH 4 N (casonecessário) e esterilizados por filtração num filtro de 0,2μm (topo da garrafa) com sucção para remover a matériafúngica. Os sobrenadantes foram armazenados a 4 °C (ou -20°C) .

0 meio CSL consistiu de (em quantidade por litro): 100g de sólidos macerados de milho (Roquette) 1 g deNaH2P04*H2O, 0,5 g de MgS04*7H20, 10 g de glicose*H20 e 0,25g de Basildon (antiespumante). Os ingredientes foramdissolvidos em água desmineralizada e o pH foi ajustadopara pH 5,8 com NaOH ou H2SO4. Frascos de 100 mL com septoe bolas de espuma foram preenchidos com 2 0 mL de caldo defermentação e esterilizados por 20 minutos a 120 0C depoisdo que 200 μL de uma solução contendo 5000 UI/mL depenicilina e 5 mg/mL de estreptomicina foram adicionados acada frasco depois de esfriar até a temperatura ambiente.

0 meio CSM consistiu de (em quantidade por litro): 150g de maltose*H20, 60 g de Soytone (peptona) , 1 g deNaH2P04*H20, 15 g de MgS04*7H20, 0,08 g de Tween 80, 0,02 gde Basildon (antiespumante), 20 g de MES, 1 g de L-arginina. Os ingredientes foram dissolvidos em águadesmineralizada e o pH foi ajustado para pH 6,2 com NaOH ouH2SO4; frascos de 500 mL com septo e bolas de espuma (foambali) foram preenchidos com 10 0 mL de caldo de fermentaçãoe esterilizados por 20 minutos a 120 °C, depois do que 1 mLde uma solução contendo 500 Ul/mL de penicilina e 5 mg/mLde estreptomicina foram adicionados a cada frasco depois doesfriamento até a temperatura ambiente.

Exemplo 2

Purificação da enzima lipolítica da invenção

Passo 1 - Preparação de ultra filtrados

Os sobrenadantes das culturas, conforme obtidos noExemplo 1, foram ultrafiltrados para remover as fracascontaminações moleculares que poderiam interferir com asdeterminações de atividade enzimática e co os testes decozimento. A ultrafiltração de 3 0 mL de sobrenadante foiefetuada num sistema TFF da Millipore Labscale equipado comum filtro com um corte de 10 KDa.

Dependendo de suas cores, as amostras foram lavadas de3 a 5 vezes com volumes de 40 mL de tampão fosfato 100 mMpH 6,0 incluindo CaCl2 0,5 mM. O volume final da soluçãoenzimática foi de 3 0 mL e é ainda referido como"ultrafiltrado".

O conteúdo de proteína total das amostras foideterminado usando o método Bradford (The Protein ProtocolsHandbook, 2a edição, editado por J.M.Walker, Humana PressInc, Totowa 2002, ρ 15 a 21).

Passo 2 - Determinação da concentração de enzimalipolítica por Ά280 e HPSEC

A concentração da enzima lipolítica no ultrafiltradofoi calculada a partir da extinção a 280 nm (A280)atribuível à enzima lipolítica e ao coeficiente de extinçãomolecular calculado da enzima lipolítica. A medição da A280foi efetuada num espectrofotômetro Uvikon XL Secomam (Beunde Ronde, Abcoude, Países Baixos).O coeficiente de extinção molecular de uma enzima podeser calculado a partir da quantidade de resíduos detirosina, triptofano e cisteína por molécula enzimática(S.C. Gill e P.H. von Hippel, Anal. Biochem. 182, 319 a 326(1989)). 0 coeficiente de extinção molecular dessesaminoácidos são 1280, 5690 e 120 M"1. cm"1, respectivamente.

A quantidade de resíduos de tirosina, triptofano e cisteínana enzima lipolítica da invenção pode ser deduzida dasseqüências de proteína selecionadas do grupo consistindodas SEQ ID Nos: 5 a 14. Os coeficientes de extinçãocalculados estão mostrados na Tabela 1.

Tabela 1. Coeficientes de extinção calculados e Ρ. M.das enzimas LIP01-LIP03.

<table>table see original document page 69</column></row><table>A extinção do ultraf iltrado a 280 nm (A280) que éatribuível à enzima lipolítica depende da pureza da amostraenzimática. Essa pureza foi determinada usando HPSEC(Cromatografia de Exclusão de Tamanho de Alta Eficiência)com uma coluna TSK SW-XL (300*7,8 mm; faixa de PM de 10 a300 KDa) . 0 tampão de eluição consistiu de tampão fosfatode sódio 25 mM pH 6,0 e foi usado num fluxo de 1 mL/min. Asamostras de 5 a 100 μΐ, foram injetadas. A absorvância a 280nm foi medida.

A A2 80 no ultrafiltrado atribuível à enzima lipolíticada invenção foi obtida a partir da proporção da superfíciedo pico do respectivo pico da enzima lipolítica nocromatograma e da superfície total dos picos absorvendo em280 nm. A concentração de enzima lipolítica noultrafiltrado foi, a seguir, calculada pela multiplicaçãoda A28 0 do ultrafiltrado pela proporção descrita acima edividido pelo coeficiente de extinção calculado (solução 1mg/mL - Tabela 1, coluna mais à direita) para a enzimalipolítica.

Exemplo 3

Medições de atividade

Os ultrafiltrados obtidos no Exemplo 2 podem sersubmetidos às seguintes medições de atividade enzimáticapara estabelecer a especificidade da enzima lipolítica:

• Lipase

• Fosfolipase Ai ou A2

• Lisofosfolipase

• Atividade da galactolipase

A atividade da lipase foi determinadaespectrofotometricamente pelo uso do substrato cromogênicopalmitato de p-nitrofenila (pNPP). Nesse ensaio o substratocromogênico palmitato de p-nitrofenila (pNPP) é dissolvidoem 2-propanol e suspenso em tampão fosfato pH 7,4 napresença de 0,1% de goma arábica e de 0,25% de desoxicolatode sódio. A lipase é incubada com essa solução de substratoa 37 °C e o p-nitrofenil formado (pNP) é medido por 2,6minutos a 4 05 nm. Esse ensaio também pode ser aplicado emdiferentes valores de pH para determinar a dependência depH de uma lipase. Deve ser entendido que em valores de pHdiferentes, tampões podem ser necessários ou detergentesdiferentes devem ser necessários para emulsificar osubstrato. Por exemplo, em pH = 4, tampão acetato 100 mMcom 1,0% de Triton X-100 é usado. Uma unidade de lipase édefinida como a quantidade de enzima que libera 1 micromolde p-nitrofenol por minuto nas condições reacionaisestabelecidas. Deve ser entendido que não é uma práticaincomum na análise de rotina usar soluções enzimáticas decalibração padrões com atividade conhecida determinadas numensaio diferente para correlacionar a atividade num dadoensaio com unidades conforme poderia ser determinado noensaio de calibração.

Alternativamente, a atividade da lipase pode serdeterminada pelo uso de 2,3-mercapto-l-propanoltributirato(TBDMP) como um substrato. A lipase hidrolisa as ligaçõestioéster do TBDMP, liberando desta forma ácido butanóico e2 , 3-mercapto-1-propanoldibutirato, 2,3-mercapto-1-propanolmonobutirato ou 2,3-mercapto-1-propanol. Os grupostióis liberados são titulados numa reação subseqüente com4,4,-ditiodipiridina (DTDP) formando 4-tiopiridona. Aúltima está em equilíbrio tautomérico com 4-mercaptopiridina, a qual absorve a 334 nm. A reação éexecutada em tampão acetato 0,1 M pH 5,0 contendo 0,2% deTriton-XlOO, TBDMP 0,65 mM e DTDP 0,2 mM a 37 °C. Umaunidade de lipase é definida como a quantidade de enzimaque libera 1 micromol de 4 -tiopiridona por minuto nascondições reacionais estabelecidas.

A atividade da fosfolipase A foi determinadaespectrofotometricamente pelo uso de 1,2-

dimercaptodioctanoiIfosfatidilcolina como substrato. Afosfolipase A hidrolisa a ligação tioéster na posição 1(PLAl) ou na posição 2 (PLA2), liberando desta forma ácidooctamóico e 1,2-dimercaptomonoctanoilfosfatidilcolina ou1,2-dimercaptofosfatidilcolina. Os grupos tiol liberadossão titulados numa reação subseqüente com 4,4'-ditiopiridina para formar 4-tiopiridona. 0 último está emequilíbrio tautomérico com 4-mercaptopiridina que absorveem 334 nm. A reação é executada em tampão acetato 0,1 M pH4,0 + Triton-XlOO 0,2% a 37 °C. Uma unidade de fosfolipaseA (APLU) é definida como a quantidade de enzima que libera1 micromol de 4-tiopiridona por minuto nas condiçõesreacionais estabelecidas.

A atividade da lisofosfolipase pode ser determinadacom espectroscopia 31P-RMN pelo uso da lisofosfatidilcolinacomo substrato. A lisofosfolipase hidrolisa a ligaçãoéster, deste modo liberando o ácido graxo da porçãoglicerol. A glicerolfosfocolina formada dessa forma équantificada usando RMN. A reação é executada em tampão deácido acético 5 0 mM pH 4,5 ainda contendolisofosfatidilcolina 1 mg/mL e CaCl2 5 mM por 30 minutos a55 °C. Uma unidade de lisofosfolipase (LPC) é definida comoa quantidade de enzima que forma 1 micromol deglicerolfosfocolina por minuto nas condições reacionaisestabelecidas.

A atividade da galactolipase foi determinada comespectroscopia de H-RMN pelo uso dedigalactosildiglicerideo como substrato, de acordo com ométodo descrito por Hirayama e Matsuda (1972) Agric. Biol.Chem. 36, 1831. A galactolipase hidrolisa a ligação ésterentre os ácidos graxos e a estrutura do glicerol, liberandodessa forma um ou ambos ácidos graxos. A reação é executadaem tampão de ácido acético 50 mM pH 4,5 contendo aindaCaCl2 4 mM, Triton X-IOO 0,2% e 1 mg/mL dedigalactosildiglicerideo (produtos lipidicos) por 30minutos a 30 °C. Uma unidade de galactolipase é definidacomo a quantidade da enzima que forma 1 micromol de ácidograxo por minuto nas condições reacionais estabelecidas.

Além da medição espectrofotométrica, a atividade dalipase também pode ser determinada usando mediçõestitulométricas. Por exemplo, a atividade da esterase de umaenzima lipolítica pode ser medida na tributirina como umsubstrato de acordo com Food Chemical Codex, Quarta Edição,National Academy Press, 1996, ρ 803. A atividade da lipaseé preferivelmente determinada usando substratos detriacilglicerídeo com ácidos graxos mais longos, porexemplo, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oléico,ácido linoléico, ácido linolênico. Geralmente óleo de olivaé aplicado em tais ensaios. Fosfolipase, lisofosfolipase egalactolipase podem, em princípio, também ser analisadoscom medições titulométricas.

Além das atividades lipoliticas mencionadas,atividades secundárias não-lipolíticas também podem estarpresentes nas amostras, por exemplo, a atividade alfa-amilase. A atividade da alfa-amilase fúngica pode sermedida usando comprimidos de teste Phadebas Amylase(Pharmacia). Os comprimidos Phadebas contêm um substrato deamido insolúvel em água e um corante azul, ligado porreticulação ao substrato. 0 substrato é hidrolisado pelaamilase fúngica, liberando maltodextrinas solúveis coradasque vão para a solução. Uma curva de calibração foipreparada com uma solução contendo uma atividade alfa-amilase fúngica de referência.

A partir da referência e das amostras desconhecidas,diluições apropriadas foram preparadas em tampão de ácidomálico 50 raM pH 5,5. Amostras de 5 mL foram incubadas a 30°C por 5 minutos, um comprimido Phadebas foi adicionado edepois de 15 minutos a reação foi interrompida pela adiçãode 1,0 mL de hidróxido de sódio 0,5 N. As misturas foramdeixadas esfriar até a temperatura ambiente por 5 minutos,depois do que 4,0 mL de água foram adicionados, agitadascom a mão e depois de 15 minutos as amostras foramcentrifugadas a 4700 rpm por 10 minutos. A extinção dascamadas do topo foi medida a 620 nm. A DO a 620 nm é umamedida para a atividade da alfa-amilase fúngica;

Uma unidade amilase fúngica (FAU) é aqui definida como25 a quantidade de enzima que converte 1 grama de amido (100%de matéria seca) por hora num produto com uma transmissão a620 nm depois da reação com uma solução de iodo de forçaconhecida nas condições reacionais estabelecidas.

Além das atividades mencionadas, atividades menores daglicoamilase, protease e xilanase também estavam presentes,entretanto, em quantidades menores de modo que essasenzimas não interferiram nos experimentos de cozimentodescritos nos exemplos abaixo. Os ultrafiltrados livres decélulas obtidos no Exemplo 1 foram sujeitos aos ensaios delipase, fosfolipase e galactolipase conforme resumido naTabela 2.

Tabela 2. Atividades da enzima lipolítica nosfiltrados clarificados livres de células conforme preparado

<table>table see original document page 75</column></row><table>

Deve ser notado que nos vários ensaios somente umúnico substrato está presente, e os números de atividadenão prevêem as atividades verdadeiras nas misturas devários substratos lipídicos ou em aplicações industriaistais como em massa de farinha. Em tal caso, a afinidade ouespecificidade por substratos se torna importante.

Caracterização enzimática

A estimativa de peso molecular SDS-PAGE foi efetuadacom a mancha NuPage 4-12% MES Simply Blue Safe nas amostrasultraf iltradas. Para a LIPOl o PM estimado foi de 33 KD.Para a LIP02 o PM estimado foi de 33 KD. Para a LIP03 duasbandas principais foram observadas, correspondendo ao PM de33 KD e ao PM de 41 KD.

Experimento de foco isoelétrico

pI calculado para a proteína de 275 aminoácidos LIPOlmadura: 5.pi calculado para o gene traduzido de LIPOl: 5,4.pi calculado para o gene traduzido de LIP02: 5,4. picalculado para a proteína LIP02 de 276 aminoácidos madura:5,5. O pi da LIP02 foi determinado experimentalmente usandoeletroforese em gel e uma faixa de anfólito de 3 a 10. Oexperimento IEF mostra múltiplas bandas na faixa de 4 a 5com bandas principais em pi = 4,7 e em pi = 4,3.

pI calculado para a proteína LIP03 de 276 aminoácidosmadura: 5,1 (usando SEQl).

pI calculado para o gene LIP03 traduzido de 348aminoácidos: 5,1 (usando SEQ 10).

pI calculado para o gene LIP03 traduzido de 314aminoácidos: 4,8 (usando SEQ 14).

O foco isoelétrico da lipase LIP03 produzida em A.niger apresentou múltiplas bandas na faixa de pi = 4 até pl= 5 com bandas principais em torno de pI = 4,7 e pi = 4,4.Determinação da glicosilação

A glicosilação deve afetar o peso molecular observadoem géis PAA-SDS. Geralmente o peso molecular ésuperestimado. Para verificar se a proteína LIPOl- LIP03 églicosilada e para determinar eficientemente o pesomolecular da proteína, a amostra de proteína foi tratadacom PNGASE-F glicosidase para desglicosilar a proteína.Subseqüentemente, as amostras tanto tratadas quanto não-tratadas foram submetidas à eletroforese em gel de PAA-SDS.Dois sítios de N-glicosilação potenciais estão presentes naproteína de 275 aminoácidos LIPOl: 126 NLTF e 264 NYTF. Umsítio de glicosilação potencial está presente na proteínaLIP02 de 276 aminoácidos madura: 264 NYTF. O LIP02 não-tratado apresenta uma banda em torno de 33 KD enquanto quedepois da desglicosilação é observada um banda em torno de30 KD. Um sítio de N-glicosilação potencial está presentena proteína de 276 aminoácidos madura: 264 NYTF. 0 LIP03não-tratado apresenta duas bandas, uma em torno de 33 KD euma em torno de 41 KD. Depois da desglicosilação, novamenteduas bandas são observadas, uma em torno de 3 0 KD e uma emtorno de 38 KD. Esses resultados sugerem que duas formas deLIP03 ocorrem que são ambas glicosiladas na mesma extensão.

A caracterização e o manuseio das glicoproteínas estáextensivamente descrito em The Protein Protocols Handbook,2a edição, editado por J.M.Walker, Humana Press Inc, Totowa2002, capítulo VI.

A massa intacta da enzima lipolítica produzida podeser determinada pelo uso de LC/MS, de acordo com o seguinteprotocolo:

<table>table see original document page 77</column></row><table>

As amostras de proteínas foram dessalinizadas porfiltração num filtro de dispositivo de centrífuga de 10 KDa(Pall) por centrifugação a 13.000 rpm por 15 minutos a 4°C. A desglicosilação foi feita por desglicosilaçãoenzimática com peptídeo-N-glicosidase F (PNGase, RocheDiagnostics GmbH, Manheim Alemanha). 0 filtrado de LIPOl-LIP03 foi dissolvido em bicarbonato de amônio 100 mM e foidesnaturado pela incubação a 95 0C por dez minutos. PNGASE-F (20 unidades) foi adicionada ás amostras e adesglicosilação foi efetuada pela incubação a 37 0C de umdia para o outro. Depois da desglicosilação as amostrasforam novamente filtradas num filtro de dispositivo decentrífuga de 10 KDa (Pall) pela centrifugação a 13.000 rpmpor 15 minutos para eliminar os açúcares. Os filtrados dadessalinização e os filtrados depois da desglicosilaçãoforam dissolvidos em AcN/MQ/FA 50/50/5 até uma concentraçãofinal de aproximadamente 1 mg/mL. As amostras foraminjetadas no espectrômetro de massa QTOFII por infusãodireta e as massas intactas foram calculadas usando ologaritmo MaxEntl no programa de computador Masslynx(versão 4 sp2, Waters).

Para a LIP02 um peso molecular de 32265 foi calculadopelo desenrolamento do espectro de MS da amostra LIP02intacta. Para OLIP02 desglicosilado, uma massa intacta foicalculada de 29905 Da, a qual corresponde aos resíduos 35 a310 da seqüência de aminoácidos teórica (SEQ NO 2) . Adiferença na massa intacta observada antes e depois dadesglicosilação corresponde provavelmente a 12 grupos demanose e a 2 grupos GlcNAC ligados à proteína.

Para o LIP03 desglicosilado mais de uma massa intactafoi observada. Ambas as massas intactas de LIP03 com e semo peptídeo C-terminal foram calculadas, PM = 29835 (SEQ 3,35 a 310) e PM = 34.100 (SEQ 6, 35 a 348), respectivamente.Além do fragmento C-terminal de PM = 29835 (SEQ3) serdesalinhado, uma vez que as massas do resíduo 35 a 309 (SEQ4) e 35 a 308 (SEQ 5) também foram observadas, ondeespecialmente o resíduo 35 a 309 é muito abundante emcomparação com o resíduo 35 a 310. Isso indica que aclivagem C-terminal de LIP03 não é completamenteespecífica.

pH ótimo

A dependência do pH ótimo da enzima lipolítica ode serdeterminada efetuando-se um ensaio que mede certos tipos deatividade lipolítica em diferentes valores de pH. O pH noqual a atividade máxima é observada é o pH ótimo da enzimaparticular. Uma vez que o pH ótimo pode depender do tipo desubstrato e das condições de ensaio aplicadas, ele deve serrestabelecido quando diferentes substratos são usados ouquando as condições de ensaio se alteram drasticamente.

Temperatura ótima

A temperatura ótima da enzima lipolítica é determinadaexecutando-se um dado ensaio em temperaturas diferentes.Pela demarcação da atividade como uma função datemperatura, a temperatura ótima da enzima pode serdeterminada.

Termoestabilidade

A termoestabilidade da enzima lipolítica pode ser

determinada através de calorimetria de varreduradiferencial (DSC). Como uma alternativa, atermoestabilidade pode ser analisada por determinação daT50. A T50 é definida como a temperatura na qual 50% daatividade é perdida no aquecimento da enzima lipolítica por20 minutos nas dadas condições.

A estabilidade ao armazenamento pode ser determinadaarmazenando a enzima lipolítica sob cercas condições numacerta temperatura. Depois de diferentes medidas de tempo asamostras são retiradas e a atividade residual nessasamostras é determinada sob condições de ensaiopadronizadas.

Exemplo 4

Experimento de cozimento - mini-baguetes (mini -Jbatardj

Mini-baguetes foram assados de peças de massa defarinha de 150 g obtidas pela mistura de 2 00 g de farinha(Kolibri™), 4,6 g de levedura comprimida, 4 g de sal, 68ppm de ácido ascórbico, 1 ppm de Bakezyme® P500 (alfa-amilase fúngica), 5 ppm de Bakezyme® HSP6000 (hemicelulasefúngica) e 114 mL de água. Depois de misturar por 6 minutose 15 segundos num misturador de pino, a massa de farinhafoi dividida em duas peças de 150 g, arredondadas eexperimentadas por 25 minutos em temperatura ambiente eumidade relativa de 90%. As peças de farinha foram, aseguir, moldadas e formatadas e provadas por 100 minutos a32 'C e 85% de umidade relativa. As peças de massa defarinha totalmente provadas foram cortadas e assadas numforno a 240 0C por 20 minutos com mais adição de vapor.

Os vários efeitos das enzimas lipolíticas LIP01- LIP03em diferentes doses foram comparados com um branco, um pãosem adições extras, e com um pão controle contendo 0,3% deDATEM (Panodan® 8 0CP). O volume do pão foi determinado porum analisador de volume de pão automático (BVM-3, TexVolInstruments AB, Viken, Suécia) depois de esfriar os pães.

Os outros efeitos foram avaliados por um padeiro experientede acordo com as escalas demonstradas na Tabela 3.

Tabela 3. Pontuações para os efeitos observados emmini-baguetes

<table>table see original document page 81</column></row><table>

Tabela 4. Desempenho da cozimento da enzima lipolíticaLIP01 em diferentes doses (mg de proteína por Kg de farinha

<table>table see original document page 81</column></row><table><table>table see original document page 82</column></row><table>

Tabela 5. Desempenho da cozimento da enzima lipolíticaLIP02 em diferentes doses (mg de proteína por Kg de farinha(determinado de acordo com Bradford) .___

<table>table see original document page 82</column></row><table>

Exemplo 5

Experimento de cozimento - baguete de extensão total0 desempenho da cozimento das enzimas lipolíticasLIPOl - LIP02 também foi testado em baguetes de extensãototal. 3.000 g de farinha (Kolibriw), 70 g de leveduracomprimida, 60 g de sal, 50 ppm de ácido ascórbico, 2 ppmde Bakezyme® P500 (alfa-amilase fúngica), 15 ppm deBakezyme® HSP6000 (hemicelulase fúngica) e 1.740 mL de águaforam misturados num misturador Diosna por 2 minutos numavelocidade de 1 e 100 Wh na velocidade 2, até umatemperatura da massa de farinha final de 27 °C. A massa defarinha foi dividida em 6 pedaços de 350 g, arredondadas eprovadas por 20 min a 32 0C e 90% de umidade relativa.Depois disso as peças de massa de farina foram moldadas eformatadas e provadas por 100 minutos a 34 0C numa umidaderelativa de 90%. As peças de massa de farinha totalmenteprovadas foram cortadas e assadas num forno a 24 0 0C por 3 0minutos com adição de vapor inicial.

Os vários efeitos da enzima lipolítica em diferentesdoses, tanto na massa de farinha quanto no produto assadofinal, foram comparadas com um branco, um pão sem adiçõesextras e com um pão de controle contendo 0,3% de DATEM(Panodan® 80CP). Depois de esfriar até a temperaturaambiente os volumes dos pães foram determinados por umanalisador de volume de pães automático (BVM-3, RI CardsInstruments AB, Viken, Suécia). Os outros efeitos foramavaliados manualmente e visualmente por um padeiroexperiente de acordo com as escalas demonstradas na Tabela6. Os resultados estão dados nas Tabelas 7 e 8.

Tabela 6. Pontuações para os efeitos observados nobaguete de extensão total

<table>table see original document page 83</column></row><table><table>table see original document page 84</column></row><table>

Tabela 7.Desempenho da cozimento da enzima lipolíticaLIPOl em diferentes doses (mg de proteína por Kg de farinha(determinado de acordo com Bradford).

<table>table see original document page 84</column></row><table><table>table see original document page 85</column></row><table>

Tabela 8. Desempenho de cozimento da enzima lipoliticaLIP02 em diferentes doses (mg de proteína por Kg de farinha(determinado de acordo com Bradford) ___

<table>table see original document page 85</column></row><table><table>table see original document page 86</column></row><table>

Exemplo 6

Determinação das conversões lipídicas em massa defarinha de mini-baguete

Lipídeos polares

Lipídeos foram extraídos por agitação vigorosa,liofilizados e moídos massa de farinha totalmente provadas(ver Exemplo 3) com butanol saturado em água. Depois dacentrifugação o sobrenadante límpido é analisado em HPLC emLiChrospher 100 DIOL 5 μπι (250 χ 4.0 mm), os componenteslipídicos foram detectados por Espalhamento de LuzEvaporativa (Alltech ELSD 2000ES), num fluxo de nitrogêniode 1,5 L/min, temperatura de 80 °C, impactador ligado. Aeluição foi efetuada usando duas fases móveis num programade gradiente, num fluxo de 1,0 mL/min:

A:heptano/isopropanol/butanol/tetraidrofurano/isoctano/água (64,5/17.5/7/5/5/1)

B: isopropanol/butanol/tetraidrofurano/isoctano/água(73/7/5/5/10).Em ambas as soluções de eluição 77 μL de solução deamoníaco e 77 μl, de ácido trifluoracético foram adicionadospor litro.

Programa de gradiente: linear de 100% de A até 100% deB em 25 min, depois 100% de B por 5 min, a seguir gradientelinear de 100% de B até 100% de A por 0,5 min, e finalmente100% de A por 5 min com um volume de injeção de 20 μl, enuma temperatura de coluna de 80°C.

Referências a galactolipídeos, fosfolipídeos, tri-,di- e monoglicerídeos, por exemplomonogalactosildiglicerídeo, monogalactosilmonoglicerídeo,digalactosildiglicerídeo, digalactosilmonoglicerídeo,fosfatidilcolina e lisofosfatidilcolina foram usadas paraindicar a ordem de eluição dos vários compostos e calcularseus fatores de resposta e quantidades presentes na massade farinha.

Nas Tabelas 9 e 10 as quantidades dos principaislipideos polares nas massas de farinha totalmente provadascontendo várias quantidades de LIP01 - LIP02 estãoapresentadas. Fica claro a partir desses resultados que aLIP01 - LIP02 converte eficientementegalactosildiglicerideos em galactosilmonoglicerídeos numadose relativamente baixa, com uma preferência pordigalactosildiglicerídeo em comparação commonogalactosildiglicerídeo, e também em comparação com afosfatidilcolina.

É ainda mais claro que uma dose de 2,4 ppm (proteínaBradford) o resultado de cozimento ótimo do Exemplo 4coincide com o nível mais elevado dedigalactosilmonoglicerídeo.Tabela 9. Lipídeos polares em massa de farinhatotalmente provada (expressos como g por Kg de massa defarinha liofilizada) contendo várias quantidades de LIPOl

<table>table see original document page 88</column></row><table>

MGDG = monogalactosildiglicerídeo; MGMGmonogalactosilmonoglicerídeo; DGDG

digalactosildiglicerídeo; DGMG

digalactosilmonoglicerídeo; PC = fosfatidilcolina; LPC =lisofosfatidilcolina

Tabela 10. Lipídeos polares em massa de farinhatotalmente provada (expressa como g por Kg de massa defarinha liofilizada) contendo várias quantidades de LIP02

<table>table see original document page 88</column></row><table><table>table see original document page 89</column></row><table>

MGDG = monogalactosildiglicerídeo; MGMGmonogalactosilmonoglicerídeo; DGDGdigalactosildiglicerídeo; DGMG

digalactosilmonoglicerídeo; PC = fosfatidilcolina; LPC =lisofosfatidilcolina

Lipídeos apolares

Lipídeos apolares são extraídos pela agitação vigorosade massa de farinha provada completamente moída eliofilizada (ver Exemplo de Cozimento 1) com heptanocontendo 1% de ácido acético. Depois da centrifugação osobrenadante líquido é analisado em HPLC em Spherisorb S3CN(Phenomenex OOD-O097-E0; 100 χ 4.6 mm), os componenteslipídicos são detectados por Espalhamento de LuzEvaporativa (Alltech ELSD 2000ES) num fluxo de nitrogêniode 1,5 mL/min, temperatura de 40 °C, com impactadordesligado. A eluição é efetuada usando duas fases móveis(A: heptano e B: éter terc-butilmetíIico contendo 1% deácido acético) no programa de gradiente linear a seguir,num fluxo de 1,0 mL/min, num volume de injeção de 20 μL etemperatura da coluna ambiente:

<table>table see original document page 89</column></row><table><table>table see original document page 90</column></row><table>

Referências aos tri-, di- e monoglicerídeos e ácidosgraxos são usadas para indicar a ordem de eluição dosvários compostos e calcular seus fatores de resposta equantidades presentes na massa de farinha.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> DSM IP Assets B.V.

<

120> LIPASES E USOS DAS MESMAS

<130> 25380WC)

<160> 14

<170> PatentIn na versão 3.1

<210> 1

<211> 1047

<212> DNA

<213> Magnaporthe grisae

<400> 1

atgaggttcc ccagcgtgct cacccttttg gccacagccc tcacctgctc ggcatcggtt 60

ctccctgccg gcctgaccta caccaagact gtcgagggcc gcgatgtgac cgtcagcgag 120

acagacctag acaacttccg tttctatgcg cagtacagcg cggcgaccta ctgcaacgat 180

gccgccgcct caggggccgc cgtcgcctgc agcaacgacg gatgtcccgc cgtcgtggcc 240

aacggagcca agatcatccg ttcgctgaac caagacacgt ccaccaacac tgccggctac 300

cttgcactcg accccaagcg gaagaacatc gtgctcgccc tccgtggctc cacgagcctc 360

cggaactgga tcaccaacct gactttcctg tggacccgct gcgactttgt ccaggactgc 420

aagctgcaca cgggctttgc cacagcctgg tcccaggtgc aggccgatgt tctggccgcc 480

atcgccgacg ccaaggccca gaaccccgac tacaccgtcg tcgtgacggg ccactccctc 540

ggcggcgccg tcgccaccgt cgcgggagtc tacctccgcc agctgggcta ccccgtcgag 600

gtttacacgt acggcagccc gcgcatcggc aatcaggagt ttgtgcagtg ggtttccacg 660caggccggca acgtcgagta ccgcgtcacg cacatcgacg accccgtccc ccgcctgccg 720cccatcttcc tcggctacag gcacgtcacc cccgagtact ggctcaactc tggcacctcc 780aacacggtca actacaccgt cgccgacatc aaggtctgcg agggcttcgc caacatcaac 840tgcaacggcg gcagcctcgg cctcgacaca aacgcccacc tctactacct caccgacatg 900atcgcctgcg gctccaacaa gttcgtcttc cgccgcgacg acgccaacgc catcagtgac 960gccgagctcg agcagaggct gaccatgtac gctcaaatgg atcgcgagtt tgttgctgcg 1020cttgaagcca acaagaccgt ggcttaa 1047

<210> 2<211> 1048

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência de DNA de Códon otimizado para expressão na espécieAspergillus, preferivelmente Aspergillus niger

<400> 2

atgcgcttcc cttcggtttt gactctgttg gcgaccgctc tcacctgcag cgcctcggtt 60 ctgcccgcgg gactcaccta caccaagact gtcgaaggac gcgatgtgac cgtttctgag 120 actgaccttg acaacttccg tttctacgct cagtactctg ctgcgaccta ctgcaacgat 180 gccgctgcct ctggtgccgc cgttgcttgc tccaacgacg gctgccccgc ggtcgtggct 240 aacggcgcca agattatccg ctccctcaac caggatactt ccaccaacac tgctggttac 300 ctcgccctgg accccaagcg taagaacatt gtccttgctc tgcgtggtag cacctccctc 360 cgtaactgga tcaccaacct caccttcctc tggacccgtt gcgatttcgt ccaggactgc 420 aagctgcaca ccggtttcgc caccgcttgg agccaggttc aggccgatgt ccttgcggcc 480 atcgctgacg ccaaggctca gaaccctgat tacactgtcg tcgtcaccgg ccactccttg 540 ggcggtgctg tggccaccgt cgccggagtt tacctgcgcc agcttggtta ccctgtggaa 600 gtctacactt acggctcgcc ccgcatcggc aaccaggagt tcgtccagtg ggtctccact 660 caggccggaa acgtggagta ccgcgtcacc cacatcgacg accccgttcc ccgcttgccc 720cctatcttcc tcggttaccg tcacgttacc cccgagtact ggctgaacag cggtacttcc 780

aacaccgtca actacaccgt cgccgacatt aaggtctgcg agggtttcgc taacatcaac 840

tgcaacggcg gctctctcgg tctggacacc aacgcccacc tctactacct taccgacatg 900

atcgcctgcg gttccaacaa gttcgtgttc cgccgtgatg acgccaacgc tatctccgat 960

gctgagctcg agcagcgtct gactatgtac gcccagatgg aacgcgactt cgttgccgct 1020

ctcgaggcga acaagaccgt cgcttaaa 1048

<210> 3

<211> 1044

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> cDNA otimizado para Α. niger com base na seqüência de M. grisae,

tendo um ponto de mutação

<400> 3

atgcgcttcc cctccgtcct gaccctcctt gccactgctc tgacctgctc tgcctccgtc ctccccgctg gtctgaccta caccaagacc gttgagggtc gtgatgtcac cgtctccgag actgacctcg acaacttccg cttctacgct cagtactctg ctgccaccta ctgcaacgat gctgctgcca gcggtgctgc tgttgcttgc tccaacgacg gctgccccgc cgttgttgcc aacggtgcca agatcatccg ctccctcaac caggacacct ccaccaacac tgctggctac ctggctctcg accccaagcg caagaacatt gtccttgctc tccgtggcag cacctcgctg cgcaactgga tcaccaacct ggacttcctc tggactcgct gcgacttcgt ccaggactgc aagctccaca ccggtttcgc cactgcctgg tcccaggtcc aggccgatgt ccttgctgcc attgccgatg ccaaggccca gaaccccgac tacaccgttg ttgtcactgg tcactctctt ggtggtgctg ttgccactgt tgctggtgtc tacctccgcc agctgggcta ccccgttgag gtctacacct acggcagccc tcgtatcggt aaccaggagt tcgtccagtg ggtttctact caggctggca acgtcgagta ccgtgtcacc cacattgatg accccgttcc tcgtcttcct cccatcttcc tgggctaccg ccacgtcacc cccgagtact ggctcaactc cggtacctcc aacaccgtca actacactgt tgccgacatc aaggtctgcg agggtttcgc caacatcaac tgcaacggtg gttccctggg tctcgacacc aacgcccacc tctactacct gaccgacatg attgcctgcg gcagcaacaa gttcgtcttc cgtcgtgatg atgccaacgc catctccgac gccgagctcg agcagcgtct gaccatgtac gctcagatgg accgtgagtt cgtcgctgct

120180240300360420480540600660720780840900960ctcgaggcca acaagaccgt tgcc

<210> 4<211> 1044<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223 > Matado a partir da seqüência obtida a partir de M. grisae<400> 4 atgcgcttcc cctccgtcct gaccctcctt gccactgctc tgacctgctc tgcctccgtc 60ctccccgctg gtctgaccta caccaagacc gttgagggtc gtgatgtcac cgtctccgag 120actgacctcg acaacttccg cttctacgct cagtactctg ctgccaccta ctgcaacgat 180gctgctgcca gcggtgctgc tgttgcttgc tccaacgacg gctgccccgc cgttgttgcc 240aacggtgcca agatcatccg ctccctcaac caggacacct ccaccaacac tgctggctac 300ctggctctcg accccaagcg caagaacatt gtccttgctc tccgtggcag catcaacatc 360cgcaactggc tgaccaacct ggacttcctc tggactcgct gcgacttcgt ccaggactgc 420aagctccaca ccggtttcgc cactgcctgg tcccaggtcc aggccgatgt ccttgctgcc 480attgccgatg ccaaggccca gaaccccgac tacaccgttg ttgtcactgg ccactctctt 540ggtggtgctg ttgccactgt tgctggtgtc tacctccgcc agcttggata ccccgttgag 600gtctacacct acggcagccc tcgtatcggt aaccaggagt tcgtccagtg ggtttccacc 660caggctggca acgtcgagta ccgtgtcacc cacatcgatg accccgttcc tcgtcttcct 720cctctgatct tcggttaccg tcacgtcacc cccgagtact ggctcaactc cggcacctcc 780aacaaggtca actacaccgt tgccgacatc aaggtctgcg agggtttcgc caacatcaac 840tgcaacggtg gctctcttgg tctcgacatt gctgctcacc tgtactacct cactgccatg 900gatgcctgca acgccggtgg tttcagctgg cgccgtgatg atgccaacgc catctccgac 960gccgagctcg agcagcgtct gaccatgtac gctcagatgg accgtgagtt cgtcgctgct 1020ctcgaggcca acaagaccgt tgcc 1044

<210> 5<211> 348<212> PRT<213> Magnaporthe grisae<400> 5

Met Arg Phe Pro Ser Val Leu Thr Leu Leu Ala Thr Ala Leu Thr Cys1 5 10 15

Ser Ala Ser Val Leu Pro Ala Gly Leu Thr Tyr Thr Lys Thr Val Glu20 25 30

Gly Arg Asp Val Thr Val Ser Glu Thr Asp Leu Asp Asn Phe Arg Phe 35 40 45

Tyr Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Thr Tyr Cys Asn Asp Ala Ala Ala Ser50 55 60

Gly Ala Ala Val Ala Cys Ser Asn Asp Gly Cys Pro Ala Val Val Ala65 70 75 80

Asn Gly Ala Lys Ile Ile Arg Ser Leu Asn Gln Asp Thr Ser Thr Asn85 90 95

Thr Ala Gly Tyr Leu Ala Leu Asp Pro Lys Arg Lys Asn Ile Val Ieu100 105 HO

Ala Leu Arg Gly Ser Thr Ser Leu Arg Asn Trp Ile Thr Asn Leu Thr 115 120 125

Phe Leu Trp Thr Arg Cys Asp Phe Val Gln Asp Cys Lys Leu His Thr130 135 140

Gly Phe Ala Thr Ala Trp Ser Gln Val Gln Ala Asp Val Leu Ala Ala145 150 155 160

Ile Ala Asp Ala Lys Ala Gln Asn Pro Asp Tyr Thr Val Val Val Thr165 170 175

Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala Thr Val Ala Gly Val Tyr Leu180 185 190

Arg Gln Leu Gly Tyr Pro Val Glu Val Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg 195 200 205Ile Gly Asn Gln Glu Phe Val Gln Trp Val Ser Thr Gln Ala Gly Asn210 215 220

Val Glu Tyr Arg Val Thr His Ile Asp Asp Pro Val Pro Arg Ieu Pro225 230 235 240

Pro Ile Phe Leu Gly Tyr Arg His Val Thr Pro Glu Tyr Trp Ieu Asn245 250 255

Ser Gly Thr Ser Asn Thr Val Asn Tyr Thr Val Ala Asp Ile Lys Val260 265 270

Cys Glu Gly Phe Ala Asn Ile Asn Cys Asn Gly Gly Ser Ieu Gly Leu275 280 285

Asp Thr Asn Ala His Leu Tyr Tyr Leu Thr Asp Met Ile Ala Cys Gly290 295 300

Ser Asn Lys Phe Val Phe Arg Arg Asp Asp Ala Asn Ala Ile Ser Asp305 310 315 320

Ala Glu Leu Glu Gln Arg Leu Thr Met Tyr Ala Gln Met Asp Arg Glu325 330 335

Phe Val Ala Ala Leu Glu Ala Asn Lys Thr Val Ala340 345

<210> 6

<211> 314

<212> PRT

<213> Magnaporthe grisae

<400> 6

Asp Val Ihr Val Ser Glu Thr Asp Leu Asp Asn Phe Arg Phe Tyr Ala15 10 15

Gln Tyr Ser Ala Ala Thr Tyr Cys Asn Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ala55 20 25 30Ala Val Ala Cys Ser Asn Asp Gly Cys Pro Ala Val Val Ala Asn Gly35 40 45

Ala Lys Ile Ile Arg Ser Leu Asn Gln Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala50 55 60

Gly Tyr Leu Ala Leu Asp Pro Lys Arg Lys Asn Ile Val leu. Ala Leu

65 70 75 80

Arg Gly Ser Thr Ser Leu Arg Asn Trp Ile Thr Asn Leu Thr Phe Leu85 90 95 Trp Thr Arg Cys Asp Phe Val Gln Asp Cys Lys Leu His Ihr Gly Phe100 105 110

Ala Thr Ala Trp Ser Gln Val Gln Ala Asp Val Leu Ala Ala Ile Ala115 120 125

Asp Ala Lys Ala Gln Asn Pro Asp Tyr Thr Val Val Val Ihr Gly His130 135 140

Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala Thr Val Ala Gly Val Tyr Leu Arg Gln145 150 155 160

Leu Gly Tyr Pro Val Glu Val Tyr Ihr Tyr Gly Ser Pro Arg Ile Gly165 170 175

Asn Gln Glu Phe Val Gln Trp Val Ser Thr Gln Ala Gly Asn Val Glu180 185 190

Tyr Arg Val Thr His Ile Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Ile195 200 205

Phe Leu Gly Tyr Arg His Val Thr Pro Glu Tyr Trp Leu Asn Ser Gly210 215 220

Thr Ser Asn Thr Val Asn Tyr Thr Val Ala Asp Ile Lys Val Cys Glu225 230 235 240

Gly Phe Ala Asn Ile Asn Cys Asn Gly Gly Ser Leu Gly Leu Asp Thr245 250 255Asn Ala His Leu Tyr Tyr Leu Thr Asp Met Ile Ala Cys Gly Ser Asn260 265 270

Lys Phe Val Phe Arg Arg Asp Asp Ala Asn Ala Ile Ser Asp Ala Glu275 280 285

Leu Glu Gln Arg Leu Thr Met Tyr Ala Gln Met Asp Arg Glu Phe Val290 295 300

Ala Ala Leu Glu Ala Asn Lys Thr Val Ala305 310

<210> 7

<211> 276

<212> PRT

<213> Magnaporthe grisae

<400> 7

Asp Val Thr Val Ser Glu Hir Asp Leu Asp Asn Phe Arg Phe Tyr Ala1 5 10 15

Gln Tyr Ser Ala Ala Thr Tyr Cys Asn Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ala20 25 30

Ala Val Ala Cys Ser Asn Asp Gly Cys Pro Ala Val Val Ala Asn Gly35 40 45

Ala Lys Ile Ile Arg Ser Leu Asn Gln Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala50 55 60

Glv Tvr Leu Ala Leu Asp Pro Lys Arg Lys Asn Ile Val Leu Ala Leu

70 75 80

Arg Gly Ser Thr Ser Leu Arg Asn Trp Ile Thr Asn Leu Thr Phe Leu

85 90 95

Trp Thr Arg Cys Asp Phe Val Gln Asp Cys Lys Leu His Thr Gly Phe100 105 HOAla Thr Ala Trp Ser Gln Val Gln Ala Asp Val Leu Ala Ala Ile Ala115 120 125

Asp Ala Lys Ala Gln Asn Pro Asp Tyr Thr Val Val Val Thr Gly His130 135 140

Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala Thr Val Ala Gly Val Tyr Leu Arg Gln145 150 155 160

Leu Gly Tyr Pro Val Glu Val Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Ile Gly165 170 175

Asn Gln Glu Phe Val Gln Trp Val Ser Thr Gln Ala Gly Asn Val Glu180 185 190

Tyr Arg Val Thr His Ile Asp Asp Pro Val Pro Arg Ieu Pro Pro Ile195 200 205

Phe Leu Gly Tyr Arg His Val Thr Pro Glu Tyr Trp Ieu Asn Ser Gly210 215 220

Thr Ser Asn Thr Val Asn Tyr Thr Val Ala Asp Ile Lys Val Cys Glu225 230 235 240

Gly Phe Ala Asn Ile Asn Cys Asn Gly Gly Ser Leu Gly Ieu Asp Thr245 250 255

Asn Ala His Leu Tyr Tyr Leu Thr Asp Met Ile Ala Cys Gly Ser Asn260 265 270

Lys Phe Val Phe275

<210> 8<211> 348<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Ponto de mutação com respeito à seqüência obtida a partir de M.Grisae

<400> 8Met Arg Phe Pro Ser Val Leu Thr Leu Leu Ala Thr Ala I^u Thr Cys1 5 10 15

Ser Ala Ser Val Leu Pro Ala Gly Leu Thr Tyr Thr Lys Thr Val Glu20 25 30

Gly Arg Asp Val Thr Val Ser Glu Thr Asp Leu Asp Asn Phe Arg Phe 35 40 45

Tyr Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Thr Tyr Cys Asn Asp Ala Ala Ala Ser50 55 60

Gly Ala Ala Val Ala Cys Ser Asn Asp Gly Cys Pro Ala Val Val Ala65 70 75 80

Asn Gly Ala Lys Ile Ile Arg Ser Leu Asn Gln Asp Thr Ser Thr Asn85 90 95

Thr Ala Gly Tyr Leu Ala Leu Asp Pro Lys Arg Lys Asn Ile Val Iea100 105 HO

Ala Leu Arg Gly Ser Thr Ser Leu Arg Asn Trp Ile Thr Asn Leu Asp 115 120 125

Phe Leu Trp Thr Arg Cys Asp Phe Val Gln Asp Cys Lys Leu His Ihr130 135 140

Gly Phe Ala Thr Ala Trp Ser Gln Val Gln Ala Asp Val Leu Ala Ala145 150 155 160

Ile Ala Asp Ala Lys Ala Gln Asn Pro Asp Tyr Thr Val Val Val Thr165 170 175

Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala Thr Val Ala Gly Val Tyr Leu180 185 190

Arg Gln Leu Gly Tyr Pro Val Glu Val Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg195 200 205

Ile Gly Asn Gln Glu Phe Val Gln Trp Val Ser Thr Gln Ala Gly Asn210 215 220Val Glu Tyr Arg Val Thr His Ile Asp Asp Pro Val Pro Arg I^u Pro225 230 235 240

Pro Ile Phe Leu Gly Tyr Arg His Val Thr Pro Glu Tyr Trp Leu Asn

245 250 255

Ser Gly Thr Ser Asn Thr Val Asn Tyr Thr Val Ala Asp Ile Lys Val260 265 270

Cys Glu Gly Phe Ala Asn Ile Asn Cys Asn Gly Gly Ser Leu Gly Leu275 280 285

Asp Thr Asn Ala His Leu Tyr Tyr Leu Thr Asp Met Ile Ala Cys Gly290 295 300

Ser Asn Lys Phe Val Phe Arg Arg Asp Asp Ala Asn Ala Ile Ser Asp305 310 315 320

Ala Glu Leu Glu Gln Arg Leu Thr Met Tyr Ala Gln Met Asp Arg Glu

325 330 335

Phe Val Ala Ala Leu Glu Ala Asn Lys Thr Val Ala340 345

<210> 9

<211> 276

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Ponto de mutação com respeito à seqüência obtida a partir de M.

Grisae

<400> 9

Asp Val Thr Val Ser Glu Thr Asp Leu Asp Asn Phe Arg Phe Tyr Ala1 5 10 15

Gln Tyr Ser Ala Ala Thr Tyr Cys Asn Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ala20 25 30

Ala Val Ala Cys Ser Asn Asp Gly Cys Pro Ala Val Val Ala Asn Gly35 40 45

Ala Lys Ile Ile Arg Ser Leu Asn Gln Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala50

55

60

Gly Tyr Leu Ala Leu Asp Pro Lys Arg Lys Asn Ile Val Leu Ala Leu65 70 75 80

Arg Gly Ser Thr Ser Leu Arg Asn Trp Ile Thr Asn Ieu Asp Phe Leu85 90 95

Trp Thr Arg Cys Asp Phe Val Gln Asp Cys Lys Leu His Thr Gly Phe100 105 HO

Ala Thr Ala Trp Ser Gln Val Gln Ala Asp Val Leu Ala Ala Ile Ala115 120 125

Asp Ala Lys Ala Gln Asn Pro Asp Tyr Thr Val Val Val Thr Gly His130 135 140

Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala Thr Val Ala Gly Val Tyr Ieu Arg Gln 145 150 155 160

Leu Gly Tyr Pro Val Glu Val Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Ile Gly165 170 175

Asn Gln Glu Phe Val Gln Trp Val Ser Thr Gln Ala Gly Asn Val Glu180 185 190

Tyr Arg Val Thr His Ile Asp Asp Pro Val Pro Arg Ieu Pro Pro Ile195 200 205

Phe Leu Gly Tyr Arg His Val Thr Pro Glu Tyr Trp Ieu Asn Ser Gly210 215 220

Thr Ser Asn Thr Val Asn Tyr Thr Val Ala Asp Ile Lys Val Cys Glu225 230 235 240

Gly Phe Ala Asn Ile Asn Cys Asn Gly Gly Ser Ieu Gly Ieu Asp Thr245 250 255

Asn Ala His Leu Tyr Tyr Leu Thr Asp Met Ile Ala Cys Gly Ser Asn260 265 270

Lys Phe Val Phe275

<210> 10

<211> 348

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Mutado a partir da seqüência obtida a partir de M. grisae

<400> 10

Met Arg Phe Pro Ser Val Leu Thr Leu Leu Ala Thr Ala Leu Thr Cys1 5 10 15

Ser Ala Ser Val Leu Pro Ala Gly Leu Thr Tyr Thr Lys Thr Val Glu20 25 30

Gly Arg Asp Val Thr Val Ser Glu Thr Asp Leu Asp Asn Phe Arg Phe35 40 45

Tyr Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Thr Tyr Cys Asn Asp Ala Ala Ala Ser50 55 60

Gly Ala Ala Val Ala Cys Ser Asn Asp Gly Cys Pro Ala Val Val Ala65 70 75 80

Asn Gly Ala Lys Ile Ile Arg Ser Leu Asn Gln Asp Thr Ser Thr Asn85 90 95

Thr Ala Gly Tyr Leu Ala Leu Asp Pro Lys Arg Lys Asn Ile Val Leu100 105 110

Ala Leu Arg Gly Ser Ile Asn Ile Arg Asn Trp Leu Thr Asn Leu Asp115 120 125

Phe Leu Trp Thr Arg Cys Asp Phe Val Gln Asp Cys Lys Leu His Thr130 135 140

Gly Phe Ala Thr Ala Trp Ser Gln Val Gln Ala Asp Val Leu Ala Ala145 150 155 160

Ile Ala Asp Ala Lys Ala Gln Asn Pro Asp Tyr Thr Val Val Val Ihr165 170 175Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala Thr Val Ala Gly Val Tyr Leu180 185 190

Arg Gln Leu Gly Tyr Pro Val Glu Val Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg195 200 205

Ile Gly Asn Gln Glu Phe Val Gln Trp Val Ser Thr Gln Ala Gly Asn210 215 220

Val Glu Tyr Arg Val Thr His Ile Asp Asp Pro Val Pro Arg leu Pro225 230 235 240

Pro Leu Ile Phe Gly Tyr Arg His Val Thr Pro Glu Tyr Trp Leu Asn245 250 255

Ser Gly Thr Ser Asn Lys Val Asn Tyr Thr Val Ala Asp Ile Lys Val260 265 270

Cys Glu Gly Phe Ala Asn Ile Asn Cys Asn Gly Gly Ser Ieu Gly Ieu275 280 285

Asp Ile Ala Ala His Leu Tyr Tyr Leu Thr Ala Met Asp Ala Cys Asn290 295 300

Ala Gly Gly Phe Ser Trp Arg Arg Asp Asp Ala Asn Ala Ile Ser Asp35 305 310 315 320

Ala Glu Leu Glu Gln Arg Leu Thr Met Tyr Ala Gln Met Asp Arg Glu325 330 335

Phe Val Ala Ala Leu Glu Ala Asn Lys Thr Val Ala340 345

<210> 11<211> 276<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Mutado a partir da seqüência obtida a partir de M. grisae

<400> 11

Asp Val Thr Val Ser Glu Thr Asp Leu Asp Asn Phe Arg Phe Tyr Ala1 5 10 15

Gln Tyr Ser Ala Ala Thr Tyr Cys Asn Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ala 20 25 30

Ala Val Ala Cys Ser Asn Asp Gly Cys Pro Ala Val Val Ala Asn Gly35 40 45

Ala Lys Ile Ile Arg Ser Leu Asn Gln Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala50 55 60

Gly Tyr Leu Ala Leu Asp Pro Lys Arg Lys Asn Ile Val Leu Ala Leu65 70 75 80

Arg Gly Ser Ile Asn Ile Arg Asn Trp Leu Thr Asn leu Asp Phe Leu85 90 95

Trp Thr Arg Cys Asp Phe Val Gln Asp Cys Lys Leu His Thr Gly Phe 100 105 110

Ala Thr Ala Trp Ser Gln Val Gln Ala Asp Val Leu Ala Ala Ile Ala115 120 125

Asp Ala Lys Ala Gln Asn Pro Asp Tyr Thr Val Val Val Thr Gly His130 135 140

Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala Thr Val Ala Gly Val Tyr Leu Arg Gln145 150 155 160

Leu Gly Tyr Pro Val Glu Val Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Ile Gly165 170 175

Asn Gln Glu Phe Val Gln Trp Val Ser Thr Gln Ala Gly Asn Val Glu 180 185 190

Tyr Arg Val Ihr His Ile Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Ieu195 200 205

Ile Phe Gly Tyr Arg His Val Ihr Pro Glu Tyr Trp Leu Asn Ser Gly210 215 220

Ihr Ser Asn Lys Val Asn Tyr Ttir Val Ala Asp Ile Lys Val Cys Glu225 230 235 240

Gly Phe Ala Asn Ile Asn Cys Asn Gly Gly Ser Leu Gly leu Asp Ile245 250 255

Ala Ala His Leu Tyr Tyr Leu Thr Ala Met Asp Ala Cys Asn Ala Gly260 265 270

Gly Phe Ser Trp275

<210> 12<211> 275<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Mutado a partir da seqüência obtida a partir de M. grisae<400> 12

Asp Val Thr Val Ser Glu Thr Asp Leu Asp Asn Phe Arg Phe Tyr Ala1 5 10 15

Gln Tyr Ser Ala Ala Thr Tyr Cys Asn Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ala20 25 30

Ala Val Ala Cys Ser Asn Asp Gly Cys Pro Ala Val Val Ala Asn Gly35 40 45

Ala Lys Ile Ile Arg Ser Leu Asn Gln Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala50 55 60

Gly Tyr Leu Ala Leu Asp Pro Lys Arg Lys Asn Ile Val Leu Ala Leu65 70 75 80

Arg Gly Ser Ile Asn Ile Arg Asn Trp Leu Ihr Asn leu. Asp Phe Leu85 90 95

Trp Thr Arg Cys Asp Phe Val Gln Asp Cys Lys Leu His Thr Gly Phe100 105 110

Ala Thr Ala Trp Ser Gln Val Gln Ala Asp Val Leu Ala Ala Ile Ala115 120 125Asp Ala Lys Ala Gln Asn Pro Asp Tyr Thr Val Val Val Thr Gly His130 135 140

Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala Thr Val Ala Gly Val Tyr Leu Arg Gln145 150 155 160

Leu Gly Tyr Pro Val Glu Val Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Ile Gly165 170 175

Asn Gln Glu Phe Val Gln Trp Val Ser Thr Gln Ala Gly Asn Val Glu180 185 190

Tyr Arg Val Thr His Ile Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro I^u195 200 205

Ile Phe Gly Tyr Arg His Val Thr Pro Glu Tyr Trp Leu Asn Ser Gly210 215 220

Thr Ser Asn Lys Val Asn Tyr Thr Val Ala Asp Ile Lys Val Cys Glu225 230 235 240

Gly Phe Ala Asn Ile Asn Cys Asn Gly Gly Ser Leu Gly Leu Asp Ile245 250 255

Ala Ala His Leu Tyr Tyr Leu Thr Ala Met Asp Ala Cys Asn Ala Gly260 265 270

Gly Phe Ser275

<210> 13<211> 274<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Mutado a partir da seqüência obtida a partir de M. grisae<400> 13

Asp Val Thr Val Ser Glu Thr Asp Leu Asp Asn Phe Arg Phe Tyr Ala1 5 10 15

Gln Tyr Ser Ala Ala Thr Tyr Cys Asn Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ala20 25 30Ala Val Ala Cys Ser Asn Asp Gly Cys Pro Ala Val Val Ala Asn Gly35 40 45

Ala Lys Ile Ile Arg Ser Leu Asn Gln Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala50 55 60

Gly Tyr Leu Ala Leu Asp Pro Lys Arg Lys Asn Ile Val Leu Ala I^u65 70 75 80

Arg Gly Ser Ile Asn Ile Arg Asn Trp Leu Thr Asn Leu Asp Phe Leu

85 90 95

Trp Thr Arg Cys Asp Phe Val Gln Asp Cys Lys Leu His Thr Gly Phe100 105 110

Ala Thr Ala Trp Ser Gln Val Gln Ala Asp Val Leu Ala Ala Ile Ala115 120 125

Asp Ala Lys Ala Gln Asn Pro Asp Tyr Thr Val Val Val Thr Gly His130 135 140

Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala Thr Val Ala Gly Val Tyr Leu Arg Gln145 150 155 160

Leu Gly Tyr Pro Val Glu Val Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Ile Gly

165 170 175

Asn Gln Glu Phe Val Gln Trp Val Ser Thr Gln Ala Gly Asn Val Glu180 185 190

Tyr Arg Val Thr His Ile Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Leu195 200 205

Ile Phe Gly Tyr Arg His Val Thr Pro Glu Tyr Trp Leu Asn Ser Gly210 215 220

Thr Ser Asn Lys Val Asn Tyr Thr Val Ala Asp Ile Lys Val Cys Glu225 230 235 240

Gly Phe Ala Asn Ile Asn Cys Asn Gly Gly Ser Leu Gly Leu Asp Ile

245 250 255Ala Ala His Leu Tyr Tyr Leu Thr Ala Met Asp Ala Cys Asn Ala Gly260 265 270

Gly Phe

<210> 14<211> 314<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Mutado a partir da seqüência obtida a partir de M. grisae<400> 14

Asp Val Thr Val Ser Glu Thr Asp Leu Asp Asn Phe Arg Phe Tyr Ala15 10 15

Gln Tyr Ser Ala Ala Thr Tyr Cys Asn Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ala20 25 30

Ala Val Ala Cys Ser Asn Asp Gly Cys Pro Ala Val Val Ala Asn Gly 35 40 45

Ala Lys Ile Ile Arg Ser Leu Asn Gln Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala50 55 60

Gly Tyr Leu Ala Leu Asp Pro Lys Arg Lys Asn Ile Val Leu Ala Ieu65 70 75 80

Arg Gly Ser Ile Asn Ile Arg Asn Trp Leu Thr Asn Leu Asp Phe Leu85 90 95

Trp Thr Arg Cys Asp Phe Val Gln Asp Cys Lys Leu His Thr Gly Phe100 105 110

Ala Thr Ala Trp Ser Gln Val Gln Ala Asp Val Leu Ala Ala Ile Ala 115 120 125

Asp Ala Lys Ala Gln Asn Pro Asp Tyr Thr Val Val Val Thr Gly His130 135 140

Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala Thr Val Ala Gly Val Tyr Leu Arg Gln145 150 155 160

Leu Gly Tyr Pro Val Glu Val Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Ile Gly165 170 175

Asn Gln Glu Phe Val Gln Trp Val Ser Thr Gln Ala Gly Asn Val Glu180 185 190

Tyr Arg Val Thr His Ile Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Leu195 200 205

Ile Phe Gly Tyr Arg His Val Thr Pro Glu Tyr Trp Leu Asn Ser Gly210 215 220

Thr Ser Asn Lys Val Asn Tyr Thr Val Ala Asp Ile Lys Val Cys Glu225 230 235 240

Gly Phe Ala Asn Ile Asn Cys Asn Gly Gly Ser Leu Gly Leu Asp Ile245 250 255

Ala Ala His Leu Tyr Tyr Leu Thr Ala Met Asp Ala Cys Asn Ala Gly260 265 270

Gly Phe Ser Trp Arg Arg Asp Asp Ala Asn Ala Ile Ser Asp Ala Glu275 280 285

Leu Glu Gln Arg Leu Thr Met Tyr Ala Gln Met Asp Arg Glu Phe Val290 295 300

Ala Ala Leu Glu Ala Asn Lys Thr Val Ala305 310

Claims

1. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fatode ser selecionado do grupo consistindo de:(a) um polinucleotídeo isolado hibridizável sobcondições de alta severidade para um polinucleotídeo deacordo com qualquer uma dentre as SEQ ID Nos: 2 a 4 ou compelo menos 85% de homologia com ele;(b) um polinucleotídeo isolado codificando umpolipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos deacordo com qualquer uma das SEQ ID Nos: 5 a 14 ouequivalentes funcionais de qualquer uma delas.(c) um polinucleotídeo isolado codificando pelo menosum domínio funcional de um polipeptídeo de acordo comqualquer uma das SEQ ID Nos: 5 a 14 ou equivalentesfuncionais de qualquer uma delas;(d) um polinucleotídeo isolado compreendendo umaseqüência de nucleotídeos de acordo com qualquer uma dasSEQ ID Nos: 2 a 4 ou equivalentes funcionais suas;(e) um polinucleotídeo isolado de acordo com qualqueruma dentre as SEQ ID Nos: 2 a 4.

2. Polinucleotídeo isolado, de acordo com aReivindicação 1, caracterizado pelo fato de codificar umaenzima lipolítica.

3. Polinucleotídeo isolado, de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de serproduzido sinteticamente.

4. Vetor caracterizado pelo fato de compreender umaseqüência de polinucleotídeos de qualquer uma dasreivindicações 1, 2 ou 3.

5. Vetor, de acordo com a Reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que a referida seqüência depolinucleotídeo de qualquer uma das Reivindicações 1, 2 ou-3 é operavelmente ligada com seqüências regulatóriasadequadas para a expressão da referida seqüência depolinucleotídeos numa célula hospedeira adequada.

6. Vetor, de acordo com a Reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira adequadaé um fungo filamentoso, preferivelmente da espécieAspergillus, mais preferivelmente Aspergillus niger.

7. Método para a produção de um polinucleotídeo dequalquer uma das Reivindicações 1, 2 ou 3 ou um vetor dequalquer uma das Reivindicações 4, 5 ou 6 caracterizadopelo fato de compreender as etapas de cultivar uma célulahospedeira transformada com o referido polinucleotídeo ou oreferido vetor e o isolamento do referido polinucleotídeoou do referido vetor a partir da referida célulahospedeira.

8. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato deser selecionado do grupo consistindo de:(a) um polipeptídeo isolado de acordo com qualquer umadas SEQ ID Nos: 5 a 14 ou equivalentes funcionais dequalquer uma delas;(b) um polipeptídeo isolado obtenível pela expressãode um polinucleotídeo de acordo com as Reivindicações 1 a 3ou um vetor de acordo com as Reivindicações 4 a 6 numacélula hospedeira apropriada, por exemplo, Aspergillusniger.

9. Enzima de cozimento recombinante caracterizadapelo fato de compreender um domínio funcional de umpolipeptídeo com uma seqüência de aminoácidos de acordo comqualquer uma dentre as SEQ ID Nos: 5 a 7 ou de umpolipeptídeo com uma seqüência de aminoácidos de acordo comqualquer uma dentre as SEQ ID Nos: 8 a 9 de um polipeptídeocom uma seqüência de aminoácidos de acordo com qualquer umadentre as SEQ ID Nos: 10 a 14.

10. Método de produção de um polipeptídeo dareivindicação 8 caracterizado pelo fato de compreender asetapas de transformar uma célula hospedeira adequada com umpolinucleotídeo isolado de qualquer uma das Reivindicações-1, 2 ou 3 ou um vetor de qualquer uma das Reivindicações 4,-5 ou 6, cultivar a referida célula sob condições quepermitam a expressão do referido polinucleotídeo eopcionalmente purificar o polipeptídeo codificado dareferida célula ou meio de cultura.

11. Célula hospedeira recombinante caracterizada pelofato de compreender um polinucleotídeo de qualquer uma dasReivindicações 1, 2 ou 3 ou um vetor de qualquer uma dasReivindicações 4, 5 ou 6.

12. Célula hospedeira recombinante caracterizada pelofato de expressar um polipeptídeo da Reivindicação 8.

13. Uso de um polipeptídeo isolado da Reivindicação 8caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma massade farinha.

14. Preparação de uma massa de farinha caracterizadapelo fato de compreender as etapas de adicionar opolipeptídeo da Reivindicação 8 para pelo menos um dosingredientes de massa de farinha.

15. Massa de farinha caracterizada pelo fato decompreender o polipeptídeo da Reivindicação 8.

16. Massa de farinha, de acordo com a Reivindicação-15, caracterizada pelo fato de ter uma estabilidade demassa de farinha melhorada.

17. Massa de farinha, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 15 ou 16, caracterizada pelo fato de terpelo menos uma das propriedades melhoradas selecionada dogrupo consistindo de força aumentada, elasticidadeaumentada, estabilidade aumentada, viscosidade reduzida e/ouextensibilidade melhorada da massa de farinha.

18. Preparação de um produto assado caracterizadapelo fato de compreender a etapa de assar a massa defarinha de qualquer uma das Reivindicações 15, 16 ou 17.

19. Produto assado caracterizado pelo fato de serobtenivel conforme a reivindicação 18.

20. Produto assado, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de ser pão.

21. Produto assado, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 19 ou 20, caracterizado pelo fato de ter umvolume de pão aumentado.

22. Produto assado, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 19, 20 ou 21, caracterizado pelo fato de terpelo menos uma propriedade melhorada selecionada do grupoconsistindo de volume aumentado, sabor melhorado, estruturado miolo de pão melhorada, maciez do miolo de pãomelhorada, formação de bolhas reduzida e/ouantienvelhecimento melhorado.

23. Uso do polipeptideo isolado da reivindicação 8caracterizado pelo fato de ser em um dos processosindustriais selecionados do grupo consistindo de:a. preparação de um produto assado,b. produção de digalactosilmonoglicerideo de uma fontecontendo digalactosildiglicerídeo,c. produção de xaropes de glicose a partir de glútende trigo,d. desgomar óleos vegetais oue. modificação de um emulsificante fosfolipídico.