BRPI0708259A2 - métodos para aumentar o rendimento de planta em relação às plantas de controle, e para produzir uma planta transgênica, plantas, partes de planta, ou células de planta, construto, usos de um construto, e de uma seqüência de ácido nucléico, planta transgênica, partes colhìveis de uma planta, e, produtos - Google Patents

métodos para aumentar o rendimento de planta em relação às plantas de controle, e para produzir uma planta transgênica, plantas, partes de planta, ou células de planta, construto, usos de um construto, e de uma seqüência de ácido nucléico, planta transgênica, partes colhìveis de uma planta, e, produtos Download PDF

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METODOS PARA AUMENTAR O RENDIMENTO DE PLANTA EM RELAçãO AS PLANTAS DE CONTROLE, E PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGêNICA, PLANTAS, PARTES DE PLANTA, OU CéLULAS DE PLANTA, CONSTRUTO, USOS DE UM CONSTRUTO, E DE UMA SEQUENCIA DE áCIDO NUCLéICO, PLANTA TRANSGêNICA, PARTES COLHI VEIS DE UMA PLANTA, E, PRODUTOS. A presente invenção refere-se geralmente ao campo da biologia molecular e conceme a um método para aumentar o rendimento de planta relativo às plantas de controle. Mais especificamente, a presente invenção conceme a um método para aumentar o rendimento de planta compreendendo a expressão em uma planta de uma seqúéncia de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo fator de transcrição de domínio (de ligação de DNA) MYB (MYB-TF). Em uma modalidade particular, a presente invenção conceme a um método de aumentar o rendimento de planta compreendendo preferencialmente o aumento da expressão de uma seqúéncia de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF, no endosperma de uma semente de planta. A presente invenção também conceme às plantas possuindo expressão aumentada de uma seqúéncia de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF, bem como às plantas possuindo preferencialmente expressão aumentada de uma seqúência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF no endosperma de sementes, cujas plantas possuem rendimento aumentado relativo às plantas de controle. A invenção também proporciona construtos úteis nos métodos da invenção.

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"MÉTODOS PARA AUMENTAR O RENDIMENTO DE PLANTA EMRELAÇÃO ÀS PLANTAS DE CONTROLE, E PARA PRODUZIR UMAPLANTA TRANSGÊNICA, PLANTAS, PARTES DE PLANTA, OUCÉLULAS DE PLANTA, CONSTRUTO, USOS DE UM CONSTRUTO, EDE UMA SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLÉICO, PLANTATRANSGÊNICA, PARTES COLHÍVEIS DE UMA PLANTA, E,PRODUTOS"
A presente invenção refere-se geralmente ao campo dabiologia molecular e concerne a um método para aumentar o rendimento deplanta relativo às plantas de controle. Mais especificamente, a presenteinvenção concerne a um método para aumentar o rendimento de plantacompreendendo a expressão em uma planta de uma seqüência de ácidonucleico codificadora de um polipeptídeo fator de transcrição de domínio (deligação de DNA) MYB (MYB-TF). Em uma modalidade particular, apresente invenção concerne a um método de aumentar o rendimento de plantacompreendendo preferencialmente o aumento da expressão de uma seqüênciade ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF, no endospermade uma semente de planta. A presente invenção também concerne às plantaspossuindo expressão aumentada de uma seqüência de ácido nucleicocodificadora de um polipeptídeo fator de transcrição de domínio MYB, bemcomo às plantas possuindo preferencialmente expressão aumentada de umaseqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo fator detranscrição de domínio MYB, no endosperma de sementes, cujas plantaspossuem rendimento aumentado relativo às plantas de controle. A invençãotambém proporciona construtos úteis nos métodos da invenção.
A população mundial sempre crescente e o fornecimentodecrescente de terra arável disponível para agricultura alimenta pesquisa nadireção de aumento de eficiência de agricultura. Meios convencionais paramelhorias de colheita e horticulturas utilizam técnicas de geração seletivaspara identificar plantas possuindo características desejáveis. Contudo, taistécnicas de geração seletivas possuem várias desvantagens, a saber que estastécnicas são tipicamente intensivas em labor e resultam em plantas que muitasvezes contêm componentes genéticos heterogêneos que nem sempre podemresultar na feição desejável sendo passada das plantas parentais. Avanços embiologia molecular têm permitido que a humanidade modificasse o plasmagerminativo de animais e plantas. Engenharia genética de plantas requer oisolamento e a manipulação de material genético (tipicamente na forma deDNA ou RNA) e a subseqüente introdução daquele material genético em umaplanta. Tal tecnologia tem a capacidade para fornecer colheitas ou plantaspossuindo feições econômicas, agronômicas ou horticulturais melhoradas.
Uma feição de interesse econômico particular é rendimento, eno caso de muitas plantas o rendimento de semente. Rendimento énormalmente definido como a produção mensurável de valor econômico deuma colheita. Este pode ser definida em termos de quantidade e/ou dequalidade. Rendimento é diretamente dependente de vários fatores, porexemplo, o número e o tamanho dos órgãos, a arquitetura da planta (porexemplo, o número de ramos), a produção de sementes e mais.Desenvolvimento de raiz, captação de nutriente e tolerância ao estressetambém podem ser fatores importantes na determinação de rendimento.Otimização de um dos fatores acima mencionados pode portanto contribuirpara aumentar o rendimento de colheita. Sementes de planta são uma fonteimportante de nutrição humana e animal. Colheitas tais como, milho, arroz,trigo, canola e feijão-soja respondem por mais da metade de ingestão calóricahumana total, seja através de consumo direto das próprias sementes sejaatravés do consumo de produtos de farinha produzidos de sementesprocessadas. Também são uma fonte de açúcares, óleos e muitos tipos demetabólitos usados em processos industriais. Semente contém um embrião, afonte de novos brotos e raízes após germinação, e um endosperma, a fonte denutrientes para o crescimento de embrião, durante germinação e crescimentoinicial de mudas. O desenvolvimento de uma semente envolve muitos genes,e requer a transferência de metabólitos das raízes, folhas e caules para dentroda semente em crescimento. O endosperma, em particular, assimila osprecursores metabólitos de carboidratos, óleos e proteínas e sintetiza-os emmacromoléculas de armazenagem para enchimento do grão. A capacidade emaumentar o rendimento de semente de planta, seja através do número desementes, da biomassa da semente, do desenvolvimento da semente, doenchimento da semente, ou de qualquer outra feição relacionada com asemente teria muitas aplicações em agricultura, e ainda muitos usos não-agrícolas tal como a produção biotecnológica de substâncias tais comofármacos, anticorpos ou vacinas.
Proteínas de domínio MYB são fatores de transcrição comdomínio de ligação de DNA elevadamente conservado. O domínio MYB foioriginalmente descrito no oncogene (v-myb) do vírus da mieloblastose aviária(Klempnauer et al. (1982) Cell: 453-63). Proteínas MYB contêm uma aquatro repetições diretas imperfeitas de uma seqüência conservada de 50-53aminoácidos que codifica uma estrutura de hélice-volta-hélice envolvida emligação de DNA (Rosinski & Atchley (1998) J Mol Evol 46: 74-83).Polipeptídeos fator de transcrição de domínio MYB têm sido identificados emmuitos eucariotos superiores, incluindo plantas (Jiang et al. (2004) GenomeBiology 5:R46). Polipeptídeos fator de transcrição de domínio MYBconstituem um da família mais vasta de fatores de transcrição em plantas(pelo menos 130 em Arabidopsis thaliana), mas com pouca conservação deseqüência fora do domínio MYB. Portanto têm sido agrupados em subgruposbaseados em motivos conservados identificados fora da região codificadorade MYB (Jiang et al., supra).
Um polipeptídeo de fator de transcrição de domínio MYB dearroz, OsMYB4, foi clonado por hibridização usando a molécula de ácidonucleico codiflcadora de Cl MYB de milho como sonda (Suzuki et ai. (1997)Gene 198: 393-398; Número de acesso de proteína de NCBI de BAA23340).O domínio de ligação de DNA MYB de OsMYB4 é formado por duasrepetições, que são mais similares às segunda e terceira repetições das trêsrepetições (RI, R2 e R3) normalmente encontradas em domínios de ligaçãode DNA MYB de animal, e é portanto parte da família MYB de tipo R2R3 depolipeptídeos. Níveis de OsMYB4 mRNA foram preferencialmenteobservados em sementes em desenvolvimento, portanto foi postulado queOsMYB4 desempenha um papel em maturação de semente (Suzuki et al.,supra).
WO 03/007699 descreve uma seqüência de ácido nucleicocodificadora de um fator de transcrição OsMYB4. Também são descritosmétodos para uso do polinucleotídeo para alterar a resistência ou tolerância deplantas ao estresse, para alterar as rotas biológicas e para alterar a expressãode gene.
Pedidos de Patente US 2004/0045049 e 2004/0019927proporcionam seqüências de ácido nucleico codificadoras de um fator detranscrição OsMYB4 e seu ortólogo de Arabidopsis (referido nestes pedidoscomo G211). Foi relatado que a sobreexpressão de G211 em Arabidopsis temum efeito sobre desenvolvimento de folha e de inflorescência, dando plantasde arbusto pequeno com rendimento de semente reduzido comparado com oscontroles de tipo selvagem.
Surpreendentemente, agora tem sido verificado que o aumentode expressão em uma plana de uma seqüência de ácido nucleico codiflcadorade um polipeptídeo fator de transcrição de domínio (de ligação de DNA)MYB (MYB-TF) dá plantas possuindo rendimento aumentado em relação àsplantas de controle. Também tem sido verificado que expressãopreferencialmente aumentada da seqüência de ácido nucleico codificadora deum polipeptídeo MYB-TF no endosperma de uma semente de planta, dáplantas possuindo rendimento aumentado em relação às plantas de controle.
De acordo com a presente invenção, é proporcionado ummétodo para aumentar o rendimento de planta em relação às plantas decontrole, compreendendo expressão em uma planta de uma seqüência deácido nucleico codificadora de polipeptídeo MYB-TF. em uma modalidadeparticular, é proporcionado um método para aumentar o rendimento emrelação às plantas de controle, compreendendo preferencialmente aumentar aexpressão de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de polipeptídeoMYB-TF, no endosperma de uma semente de planta.
Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são aqui usadosintercambiavelmente e referem-se aos aminoácidos em uma forma poliméricade qualquer comprimento.
Os termos "polinucleotídeo(s)", "seqüência(s) de ácidonucleico", "seqüência(s) de nucleotídeos" são aqui usadosintercambiavelmente e referem-se aos nucleotídeos, quer ribonucleotídeosquer desoxirribonucleotídeos ou uma combinação de ambos, em uma formapolimérica de qualquer comprimento.
A escolha de uma planta de controle é uma parte rotineira deuma configuração experimental e pode incluir plantas de tipo selvagemcorrespondentes ou plantas correspondentes sem o gene de interesse. Uma «planta de controle » é tipicamente de mesma espécie de planta ou até demesma variedade que a da planta a ser avaliada. A planta de controle tambémpode ser um nulizigoto da planta a ser avaliada. Uma "planta de controle"como aqui usada refere-se não apenas às plantas inteiras, mas também àspartes de planta, incluindo sementes e partes de semente.
O termo "rendimento aumentado" como aqui definido étomado para significar um aumento em biomassa (peso) de uma ou maispartes de uma planta, que pode incluir partes acima do solo (que podem sercolhidas) e/ou partes abaixo do solo (que podem ser colhidas).Em particular, tais partes que podem ser colhidas sãosementes, e o desempenho dos métodos da invenção resulta em plantaspossuindo rendimento de semente aumentado em relação ao rendimento desemente de plantas de controle.
Rendimento de semente aumentado pode se manifestar comoum ou mais dos seguintes: a) um aumento em biomassa de semente (pesototal de semente) que pode ser em uma base de semente individual e/ou porplanta e/ou por hectare ou acre; b) número de flores aumentado por planta; c)número aumentado de sementes (cheias); d) taxa de enchimento de sementeaumentada, que é expressada como a razão entre o número de sementes cheiasdividido pelo número total de sementes; e) índice de ceifa aumentado, que éexpressado como uma razão do rendimento de partes que podem ser colhidas,tais como sementes, dividida pela biomassa total; e f) peso de mil grãos[Thousand Kernel Weight] (TKW) aumentado, que é extrapolado do númerode sementes cheias contadas e seu peso total. Um TKW aumentado poderesultar de um peso de semente e/ou tamanho de semente aumentado, etambém pode resultar de um aumento em tamanho de embrião e/ou deendosperma.
Um aumento em rendimento de semente também pode sermanifestado como um aumento em tamanho de semente e/ou volume desemente. Ademais, um aumento em rendimento de semente também pode semanifestar como um aumento em área de semente e/ou comprimento desemente e/ou largura de semente e/ou perímetro de semente. Rendimentoaumentado também pode resultar em arquitetura modificada, ou pode ocorrerpor causa da arquitetura modificada.
Tomando milho como um exemplo, um aumento derendimento pode ser manifestado como um ou mais dos seguintes: aumentono número de plantas por hectare ou acre, aumento no número de espigas porplanta, um aumento no número de fileiras de grãos, número de grãos porfileira, peso de grão, peso de mil grãos, diâmetro/comprimento de espiga,aumento na taxa de enchimento de semente (que é o número de sementescheias dividido pelo número total de sementes e multiplicado por 100), dentreoutros. Tomando-se arroz como um exemplo, um rendimento aumentadopode se manifestar como um aumento em um ou mais dos seguintes: númerode plantas por hectare ou acre, número de panículas por planta, número deespiguetas por panícula, número de flores (flósculos) por panícula (que éexpressado como uma razão do número de sementes cheias sobre o número depanículas primárias), aumento na taxa de enchimento de semente (que é onúmero de sementes cheias dividido pelo número total de sementes emultiplicado por 100), aumento no peso de mil grãos, dentre outros.
De acordo com uma característica preferida da presenteinvenção, desempenho dos métodos da invenção dá plantas possuindorendimento de semente aumentado em relação às plantas de controle. Portantode acordo com a presente invenção, é proporcionado um método paraaumentar o rendimento de semente em plantas em relação ao rendimento desemente de plantas de controle, o método compreendendo aumentar aexpressão em uma plante de uma seqüência de ácido nucleico codificadora depolipeptídeo fator de transcrição de domínio MYB. Em uma modalidadeparticular, é proporcionado um método para aumentar o rendimento desemente em plantas em relação ao rendimento de semente de plantas decontrole, o método compreendendo preferencialmente aumentar a expressãode uma seqüência de ácido nucleico codificadora de polipeptídeo fator detranscrição de domínio MYB, no endosperma de uma semente de planta.
Visto que as plantas transgênicas de acordo com a presenteinvenção possuem rendimento aumentado, é provável que estas plantasexibam uma taxa de crescimento aumentada (durante pelo menos parte de seuciclo de vida), em relação à taxa de crescimento das plantes de tipo selvagemcorrespondentes em um estágio correspondente em seu ciclo de vida. A taxade crescimento aumentada pode ser específica para uma ou mais partes deuma planta (incluindo sementes), ou pode ser considerada substancialmente aplanta inteira. Uma planta possuindo uma taxa de crescimento aumentadapode até mesmo exibir floração precoce. O aumento em taxa de crescimentoocorre em um ou mais estágios no ciclo de vida de uma planta ou durantesubstancialmente o todo o ciclo de vida da planta. Taxa de crescimentoaumentada durante os estágios iniciais no ciclo de vida de uma planta poderefletir vigor aumentado (vigor de muda aumentado na emergência). Oaumento em taxa de crescimento pode alterar o ciclo de colheita de umaplanta permitindo que as plantas sejam semeadas mais tarde e/ou colhidasmais cedo do que diferentemente seria possível. Se a taxa de crescimento ésuficientemente aumentada, ela pode permitir semeadura adicional desementes de mesma espécie de planta (por exemplo semeadura e colheita deplantas de arroz seguidas por semeadura e colheita de outras plantas de arroztodas dentro de um período de crescimento convencional). Similarmente, se ataxa de crescimento é suficientemente aumentada, ela pode permitirsemeadura adicional de sementes de espécies de planta diferentes (porexemplo a semeadura e a colheita de plantas de arroz seguidas por, porexemplo, a semeadura e a colheita opcional de feijão-soja, batata, ou qualqueroutra planta adequada). Tempos adicionais de colheita de mesmo rizoma nocaso de algumas plantas de colheita também podem ser possíveis. Alteraçãodo ciclo de colheita de uma planta pode levar a um aumento em produção debiomassa anual por metro quadrado (devido a um aumento no número devezes (a saber em um ano) que qualquer planta particular pode ser crescida ecolhida). Um aumento em taxa de crescimento também pode permitir ocultivo de plantas transgênicas em uma área geográfica mais ampla do que ade suas contra-partes de tipo selvagem, porque as limitações territoriais paracrescimento de uma colheita são muitas vezes determinadas por condiçõesambientais adversas quer no tempo do plantio (estação inicial) quer no tempoda colheita (estação tardia). Tais condições adversas podem ser evitadas se ociclo de colheita for encurtado. A taxa de crescimento pode ser determinadapela derivação de vários parâmetros das curvas de crescimento, taisparâmetros podem ser: T-Médio (o tempo que demora para as plantasalcançarem 50% de seu tamanho máximo) e T-90 (tempo que demora para asplantas alcançarem 90% de seu tamanho máximo), dentre outros.
Desempenho dos métodos da invenção dá plantas possuindouma taxa de crescimento aumentada. Portanto, de acordo com a presenteinvenção, é proporcionado um método para aumentar a taxa de crescimentode plantas, cujo método compreende aumentar a expressão em uma planta deuma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF.em uma modalidade particular, é proporcionado um método para aumentar ataxa de crescimento de plantas, cujo método compreende preferencialmenteaumentar a expressão de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de umpolipeptídeo MYB-TF, no endosperma de uma semente de planta.
Um aumento em rendimento e/ou taxa de crescimento ocorrese a planta estiver sob condições de não-estresse ou se a planta for exposta avários estresses comparado com as plantas de controle. Plantas tipicamenterespondem à exposição ao estresse pelo crescimento mais lento. Emcondições de estresse severo, a planta pode até mesmo parar de crescer detodo. Estresse suave por outro lado é aqui definido como qualquer estresse aoqual uma planta é exposta que não resulta na cessação da planta em crescer detodo sem a capacidade de continuar a crescer. Estresse suave no sentido dainvenção leva a uma redução no crescimento das plantas estressadas de menordo que 40%, 35% ou 30%, preferivelmente menor do que 25%, 20% ou 15%,mais preferivelmente menor do quel4%, 13%, 12%, 11% ou 10% ou menosem comparação com a planta de controle sob condições de não-estresse.Devido aos avanços em práticas agrícolas (irrigação, fertilização, tratamentoscom pesticida) estresses severos não são muitas vezes encontrados em plantasde colheita cultivadas. Como uma conseqüência, o crescimento comprometidoinduzido por estresse suave é muitas vezes uma característica indesejável paraagricultura. Estresses suaves são os estresses bióticos e/ou abióticos(ambientais) de cada dia aos quais uma planta é exposta. Estresses abióticospodem ser devido à estiagem ou ao excesso de água, estresse anaeróbico,estresse de sal, depleção de nutriente, toxicidade química, estresse oxidativo etemperaturas quentes, frias ou congelantes. O estresse abiótico pode ser umestresse osmótico causado por um estresse de água (particularmente devido àestiagem), estresse de sal, estresse oxidativo ou um estresse iônico. Estressesbióticos são tipicamente aqueles estresses causados por patógenos, tais comobactérias, vírus, fungos e insetos.
Em particular, os métodos da presente invenção podem serrealizados sob condições de não-estresse ou sob condições de estiagem brandapara dar plantas possuindo rendimento de semente aumentado em relação àsplantas de controle. Como relatado em Wang et al. (Planta (2003) 218: 1-14),estresse abiótico leva a uma série de mudanças morfológicas, fisiológicas,bioquímicas e moleculares que adversamente afetam o crescimento e aprodutividade da planta. Estiagem, salinidade, temperaturas extremas eestresse oxidativo estão conhecidamente interconectados e podem induzirdano de crescimento e celular através de mecanismos similares. Rabbani et al.(Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767) descrevem um grau particularmentealto de "conversa cruzada" entre estresse de estiagem e estresse de salinidadealta. Por exemplo, estiagem e/ou salinização são manifestadas primariamentecomo estresse osmótico, resultando na disrupção de homeostácia edistribuição iônica na célula. Estresse oxidativo, que freqüentementeacompanha temperatura alta ou baixa, salinidade ou estresse de estiagem,pode causar desnaturação de proteínas estruturais e funcionais. Como umaconseqüência, estes diversos estresses ambientais muitas vezes ativam rotasde sinalização de célula e respostas celulares similares, tais como a produçãode proteínas de estresse, supra-regulação de antioxidantes, acúmulo de solutoscompatíveis e parada de crescimento. O termo condições de "não-estresse"como aqui usado refere-se àquelas condições ambientais que permitem oótimo crescimento das plantas. Pessoas experientes na arte estão cientes dascondições de solo normais e das condições climáticas normais para uma dadalocalização.
Desempenho dos métodos da invenção dá plantas crescidassob condições de não-estresse ou sob condições de estiagem suave,rendimento de semente aumentado em relação às plantas de controle crescidassob condições comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, éproporcionado um método para aumentar o rendimento de planta das plantascrescidas sob condições de não-estresse ou sob condições de estiagem suave,cujo método compreende aumentar a expressão em uma planta de umaseqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF comodefinido acima. Em uma modalidade particular, a presente invenção concernea um método para aumentar o rendimento de planta das plantas crescidas sobcondições de não-estresse ou sob condições de estiagem suave,compreendendo preferencialmente aumentar a expressão de uma seqüência deácido nucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF, no endosperma deuma semente de planta.
O métodos da invenção são vantajosamente aplicáveis aqualquer planta.
O termo "planta" como aqui usado inclui plantas inteiras,ancestrais ou progênie das plantas e partes de planta, incluindo sementes,brotos, caules, folhas, raízes (incluindo tubérculos), flores, e tecidos e órgãos,no qual cada um dos mencionados acima compreende a seqüência de ácidonucleico /gene de interesse. O termo "planta" também inclui células de planta,culturas em suspensão, tecido de calo, embriões, regiões meristemáticas,gametófitos, esporófitos, pólen e macroesporos, de novo no qual cada um dosmencionados acima compreende a seqüência de ácido nucleico /gene deinteresse.
Plantas que são particularmente úteis nos métodos da invençãoincluem todas as plantas que pertencem às superfamília Viridiplantae, emparticular plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas incluindo forragem oulegume de forragem, plantas ornamentais, colheitas de alimento, árvores ouarbustos selecionadas da lista compreendendo Acer spp., Actinidia spp.,Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera,Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus,Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagusofficinalis, Avena spp. (e.g. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina,Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp.,Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (e.g.Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza, nabo]), Cadaba farinosa,Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata,Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius,Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp.,Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta,Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp.,Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota,Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp.,Echinochloa spp., Elaeis (e.g. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusinecoracana, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugeniauniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica,Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (e.g. Glycine max,Soja hispida or Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (e.g.Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (e.g.Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrusspp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffaacutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (e.g.Lyeopersieon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersiconpyriforme), Maerotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginate, Mammeaamericana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicagosativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp.,Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopusspp., Oryza spp. (e.g. Oryza sativa, Oiyza latifolia), Panicum miliaceum,Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Perseaspp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleumpratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp.,Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp.,Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanussativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp.,Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Seeale cereale, Sesamum spp.,Sinapis sp., Solanum spp. (e.g. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium orSolanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp.,Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp.,Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (e.g. Triticum aestivum, Triticum durum,Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum orTriticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp.,Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris,Ziziphus spp., dentre outras.
De acordo com uma modalidade preferida da presenteinvenção, a planta é uma planta de colheita. Exemplos de planta de colheitaincluem feijão-soja, girassol, canola, alfafa, colza, algodão, tomate, batata etabaco. Adicionalmente preferivelmente, a planta é uma plantamonocotiledônea. Exemplos de plantas monocotiledôneas incluem cana-de-açúcar. Mais preferivelmente a planta é um cereal. Exemplos de cereaisincluem arroz, milho, trigo, cevada, painço, centeio, triticale, sorgo e aveia.O termo "polipeptídeo MYB-TF" como aqui definido refere-sea qualquer polipeptídeo compreendendo da terminação-N até a terminação-C(i) um domínio R2R3 MYB compreendendo duas repetições MYB; e (ii) umdomínio MYB4 possuindo em ordem crescente de preferência pelo menos55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais deidentidade de seqüência ao domínio MYB4 representado por qualquer uma oumais de: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 27, ou SEQ ID NO: 28.
Exemplos de polipeptídeos MYB-TF como definido aquiacima são dados em Tabela A de Exemplo 1.
Alternativa ou adicionalmente, um "polipeptídeo MYB-TF"como definido aqui refere-se a qualquer seqüência de polipeptídeo quequando usada na construção de uma árvore filogenética de MYB, tal comoaquela mostrada em Figura 3, tende a agrupar com o grupo de seqüências depolipeptídeo compreendendo as seqüências de polipeptídeo comorepresentadas pela SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4 (Figura 3, seta em negrito;o círculo mostra a origem do grupo sobre a árvore) em vez de com qualqueroutro grupo. Um método preferido para gerar uma árvore filogenética édescrito por Kranz et al. (1998) Plant Journal 16(2): 263-276).
Uma pessoa experiente na arte poderia prontamente determinarse qualquer seqüência de polipeptídeo em questão cai dentro da definição deum "polipeptídeo MYB-TF" usando técnicas conhecidas e programa decomputador para a preparação de uma tal árvore filogenética, tais comopacote GCG, EBI ou CLUSTAL, usando parâmetros pré-estabelecidos.Qualquer seqüência se agrupando dentro do grupo compreendendo asseqüências de polipeptídeo como representadas pelas SEQ ID NO: 2 e SEQID NO: 4 seria considerado em caindo dentro da definição acima mencionadade um "polipeptídeo MYB-TF", e seria considerada adequada para uso nosmétodos da invenção.
Alternativa ou adicionalmente, um "polipeptídeo MYB-TF"como aqui definido refere-se a qualquer seqüência de polipeptídeo com emordem crescente de preferência pelo menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%,65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade deseqüência em relação à seqüência de polipeptídeo como representada pelaSEQ ID NO: 2.
Homólogos de um polipeptídeo MYB-TF também podem serusados para realizar os métodos da invenção. "Homólogos" de uma proteínaincluem peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimaspossuindo substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido em relação àproteína não modificada em questão e possuindo atividade funcional ebiológica similar à da proteína não modificada da qual são derivados.
Uma deleção refere-se à remoção de um ou mais aminoácidosde uma proteína.
Uma inserção refere-se a um ou mais resíduos de aminoácidosendo introduzidos em um sítio predeterminado em uma proteína. Inserçõespodem compreender fusões N-terminais e/ou C-terminais bem como inserçõesde intra-seqüência de um aminoácido ou de múltiplos aminoácidos.Geralmente, inserções dentro da seqüência de aminoácidos serão menores doque as fusões N-terminais ou C-terminais, da ordem de cerca de 1 a 10resíduos. Exemplos de peptídeos ou proteínas de fusão N- ou C-terminaisincluem o domínio de ligação ou domínio de ativação de um ativador detranscrição como usado no sistema de dois-híbridos de levedura, proteínas decapa de fago, etiqueta-(histidina)-6, etiqueta-glutationa-S-transferase, proteínaA, proteína ligadora de maltose, di-hidro-folato redutase, epitopo Tag*100,epitopo c-myc, epitopo-FLAG®, IazC, CMP (peptídeo ligador decalmodulina), epitopo HA, epitopo de proteína C e epitopo VSV.
Uma substituição refere-se à troca de aminoácidos da proteínapor outros aminoácidos possuindo propriedades similares (tais comohidrofobicidade, hidrofilicidade, antigenicidade, propensão a formar ouquebrar estruturas α-helicoidais ou estruturas de β-folha similares).Substituições de aminoácido são tipicamente de resíduos individuais, maspodem ser agrupados dependendo das restrições funcionais postas sobre opolipeptídeo; inserções normalmente serão da ordem de cerca de 1 a 10resíduos de aminoácido. As substituições de aminoácido são preferivelmentesubstituições de aminoácido conservativas. Tabelas de substituiçõesconservativas são bem conhecidas na arte (veja por exemplo Creighton (1984)Proteins. W.H. Freeman and Company e Tabela 1 abaixo).
Tabela 1: Exemplos de substituições de aminoácidoconservadas
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Substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido podemser prontamente feitas usando técnicas de síntese de peptídeo bem conhecidasna arte, tais como síntese de peptídeo em fase sólida e semelhante, ou pormanipulação de DNA recombinante. Métodos para a manipulação deseqüências de DNA para produzir variantes de substituição, inserção oudeleção de uma proteína são bem conhecidas na arte. Por exemplo, técnicaspara preparação de mutações de substituição em sítios predeterminados emDNA são bem conhecidas por aquelas pessoas experientes na arte e incluemmutagênese Ml 3, mutagênese T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH),mutagênese QuickChange Site Directed (Stratagene, San Diego, CA),mutagênese sítio-direcionada mediada por PCR ou outros protocolos demutagênese sítio-direcionada.
Homólogos (ou proteínas homólogas) podem ser prontamenteidentificados usando técnicas rotineiras conhecidas na arte, tal como poralinhamento de seqüências. Métodos para o alinhamento de seqüências paracomparação são bem conhecidos na arte, tais métodos incluem GAP,BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. GAP usa o algoritmo de Needlemane Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443453) para encontrar o alinhamento deduas seqüências completas que maximiza o número de combinações eminimiza o número de lacunas. O algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) JMol Biol 215: 403-10) calcula a identidade de seqüência percentual e realizauma análise estatística da similaridade entre as duas seqüências. O programade computador para realizar a análise BLAST está publicamente disponívelatravés da National Centre for Biotechnology Information. Homólogos podemser prontamente identificados usando, por exemplo, o algoritmo dealinhamento de seqüências múltiplas ClustalW (versão 1.83) disponível noserviço GenomeNet no Kyoto University Bioinformatics Center, com osparâmetros de alinhamento pareado pré-estabelecidos, e um método de escoreem percentagem. Edição manual menor pode ser realizada para otimizar oalinhamento entre motivos conservados, como seria evidente para uma pessoaexperiente na arte.
Homólogos também incluem ortólogos e parálogos, queincluem conceitos evolucionários usados para descrever relações ancestrais degenes. Parálogos são genes dentro da mesma espécie que têm originadoatravés de duplicação de um gene ancestral e ortólogos são genes deorganismos diferentes que têm originado através de especiação.
Ortólogos e parálogos podem ser facilmente encontrados porrealização de uma denominada pesquisa blast recíproca. Esta pode ser feitaprimeiro por BLAST envolvendo BLASTing de uma seqüência inquirida (porexemplo, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2) contra qualquer banco de dadosde seqüências, tal como o banco de dados publicamente disponível NCBI.BLASTN ou TBLASTX (usando valores pré-estabelecidos padrão pode serusado quando se parte de uma seqüência de nucleotídeos e BLASTP ouTBLASTN (usando valores pré-estabelecidos padrão) pode ser usado quandose parte de uma seqüência de proteína. Os resultados de BLAST podem seropcionalmente filtrados. As seqüências de comprimento total de querresultados filtrados quer resultados não-filtrados são então BLASTed de volta(segundo BLAST) contra seqüências do organismo do qual a seqüênciainquirida é derivada (onde a seqüência inquirida é SEQ ID NO: 1 ou SEQ IDNO: 2 o segundo BLAST portanto seria contra as seqüências Oryza). Osresultados dos primeiro e segundo BLASTs são então comparados. Umparálogo é identificado se um hit de posição do segundo BLAST for damesma espécie da qual a seqüência inquirida é derivada; um ortólogo éidentificado se um hit de posição alta não for de mesma espécie da qual aseqüência inquirida é derivada. Hits de posição alta são aqueles possuindo umvalor-E baixo. Quanto menor o valor-E, mais significativo será o escore (ouem outras palavras menor a probabilidade de que o hit ser encontrado poracaso). Computação do valor-E é bem conhecida na arte. No caso de famíliasgrandes, ClustalW pode ser usado, seguido por árvore de junção de vizinhos,para ajudar a visualizar o agrupamento de genes relacionados e paraidentificar ortólogos e parálogos. Em adição aos valores-E, comparaçõestambém são classificadas por identidade percentual. Identidade percentualrefere-se ao número de nucleotídeos (ou aminoácidos) idênticos entre as duasseqüências de ácido nucleico (ou polipeptídeo) comparadas sobre umcomprimento particular. Preferivelmente, homólogos de polipeptídeo MYB-TF possuem em ordem crescente de preferência pelo menos 25%, 30%, 40%,50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais deidentidade de seqüência ou similaridade (identidade funcional) em relação aum polipeptídeo MYB-TF não-modificado como representado pela SEQ IDNO: 2. Identidade percentual entre homólogos de polipeptídeo MYB-TF forado domínio MYB é reputadamente baixa. Preferivelmente, homólogos depolipeptídeo MYB-TF são como representados por qualquer uma dasseqüências de polipeptídeo dadas em Tabela A, ou qualquer ortólogo ouparálogo de qualquer uma das SEQ LD NOs dadas em Tabela A.
O polipeptídeo MYB-TF pode ser um derivado de SEQ IDNO: 2. "Derivados" incluem peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos quepodem, comparados com a seqüência de aminoácidos da forma naturalmenteocorrente da proteína, tal como a representada em SEQ ID NO: 2,compreender substituições de aminoácidos por resíduos de aminoácido não-naturalmente ocorrentes, ou adições de resíduos de aminoácido não-naturalmente ocorrentes. Derivados de qualquer uma das seqüências depolipeptídeo dadas em Tabela A, ou qualquer ortólogo ou parálogo dequalquer uma das SEQ ID NOs dadas em Tabela A são outros exemplos quepodem ser adequados para uso nos métodos da invenção. "Derivados" de umaproteína também incluem peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos que podemcompreender resíduos de aminoácido naturalmente ocorrentes (glicosilados,acilados, ubiquinados, premiados, fosforilados, miristoilados, sulfatados etc.)ou resíduos de aminoácido não-naturalmente ocorrentes comparados com aseqüência de aminoácidos de uma forma naturalmente ocorrente dopolipeptídeo. Um derivado também pode compreender uma ou mais adiçõesou substituições de não-aminoácido comparado com a seqüência deaminoácidos da qual ele é derivado, por exemplo uma molécula repórter ououtro ligante, covalentemente ou não-covalentemente ligado na seqüência deaminoácidos, tal como uma molécula repórter que é ligada para facilitar suadetecção, e resíduos de aminoácido não-naturalmente ocorrentes em relação àseqüência de aminoácidos de uma proteína naturalmente ocorrente.
O termo "domínio" significa um conjunto de aminoácidosconservados em posições específicas ao longo de um alinhamento deseqüências (realizado como descrito aqui acima) de proteínasevolucionariamente relacionadas. Embora aminoácidos em outras posiçõespossam variar entre homólogos, aminoácidos que estão elevadamenteconservados em posições específicas indicam aminoácidos que são essenciaisna estrutura, na estabilidade, ou na atividade de uma proteína. Devido ao fatode serem identificados por seu alto grau de conservação em seqüênciasalinhadas de uma família de homólogos de proteína, podem ser usados comidentificadores para determinar se um polipeptídeo comum da seqüênciarecém-determinada pertence a uma família de polipeptídeos previamenteidentificada.
O domínio MYB (compreendendo repetições MYB) em umpolipeptídeo MYB-TF pode ser identificado usando banco de dadosespecializados e.g. SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA95, 58575864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244;hospedado por EMBL em Heidelberg, Alemanha), InterPro (Mulder et al.,(2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318; hospedado por EuropeanBioinformatics Institute (EBI) no Reino Unido), Prosite (Bucher and Bairoch(1994), Uma sintaxe de perfil generalizada para motivos de seqüênciasbiomoleculares e sua função em interpretação de seqüência automática. (Em)ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systemsfor Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D.,Eds., pp53-61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res.32:D134-D137, (2004), o servidor de proteômica ExPASy é proporcionadocomo um serviço para a comunidade científica (hospedado pelo SwissInstitute of Bioinformatics (SIB) em Suíça) ou Pfam (Bateman et al., NucleicAcids Research 30(1): 276-280 (2002), hospedado pelo Sanger Institute noReino Unido). O domínio MYB compreende até quatro repetiçõesimperfeitas, cada uma formando uma estrutura de hélice-volta-hélice de cercade 53 aminoácidos. Repetições de MYB são caracterizadas por resíduos detriptofano regularmente espaçados.
O domínio MYB4 como representado pela SEQ ID NO: 38((D/N)(D/A)XF(S/T/P/)SFL(N/D)(S/A)L(I/M)N(E/D), como representadopela SEQ ID NO: 27 ((D/N)(D/A)XF(S/T/-)SFL(N/D)SL(I/M)N(E/D), ondeX é qualquer aminoácido e onde - é nenhum aminoácido), e/ou comorepresentado pela SEQ ID NO : 28 (DDDFSSFLDSLIND), pode seridentificado usando métodos para o alinhamento de seqüências paracomparação como descrito aqui acima. Em algumas situações, os parâmetrospré-estabelecidos podem ser ajustados para modificar a estringência dapesquisa. Por exemplo usando BLAST, o limite de significância estatística(chamado de valor "esperado") para relatar combinações contra seqüências debanco de dados pode ser aumentado para mostrar combinações menosestringentes. Deste modo, combinações curtas quase exatas podem seridentificadas, incluindo o domínio MYB4 de SEQ LD NO : 38 e/ou o domínioMYB4 de SEQ ID NO: 27 sem mudanças, ou com uma ou mais mudançasconservativas em qualquer posição, ou com uma, duas ou três mudanças nãoconservativas em qualquer posição; ou com uma deleção em qualquerposição. Por exemplo, o domínio MYB4 do polipeptídeo MYB-TF de Oryzasativa como representado pela SEQ ID NO: 2, é dado em SEQ ID NO: 28(DDDFSSFLDSLIND). Preferivelmente, polipeptídeos MYB-TF úteis narealização dos métodos da invenção compreendem um domínio MYB4possuindo em ordem crescente de preferência pelo menos 55%, 60%, 65%,70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade deseqüência ao domínio MYB4 representado por qualquer uma ou mais de:SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 27, ou SEQ ID NO: 28.
Ademais, polipeptídeos MYB-TF (pelo menos em sua formanativa) tipicamente possuem atividade de ligação de DNA e um domínio deativação. Uma pessoa experiente na arte pode facilmente determinar apresença de um domínio de ativação e atividade de ligação de DNA usandoprocedimentos e técnicas de rotina. Interação de proteínas com ospolipeptídeos MYB-TF (como, por exemplo, em complexos de transcrição)pode ser facilmente identificada usando técnicas padrão para uma pessoaexperiente na arte.
Exemplos de seqüências de ácido nucleico codificadoras depolipeptídeos MYB-TF incluem mas não são limitadas àquelas representadaspor qualquer uma das seqüências de ácido nucleico dadas em Tabela A, ou aqualquer seqüência de ácido nucleico codificadora de ortólogo ou parálogo dequalquer uma das SEQ ID NOs dadas em Tabela A. Variantes de seqüênciasde ácido nucleico codificadoras de polipeptídeos MYB-TF podem seradequadas para uso nos métodos da invenção. Variantes adequadas incluemporções de seqüências de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeosMYB-TF e/ou seqüências de ácido nucleico capazes de hibridizarem comgenes/seqüências de ácido nucleico codificadores de polipeptídeos MYB-TF.Outras variantes incluem variantes de editoração e variantes alélicas deseqüências de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeos MYB-TF.
O termo "porção" como aqui definido refere-se um pedaço deDNA codificador de um polipeptídeo compreendendo desde a terminação-Naté a terminação-C (i) um domínio R2R3 MYB compreendendo duasrepetições MYB; e (ii) um domínio MYB4 possuindo em ordem crescente depreferência pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,98%, 99% ou mais de identidade de seqüência ao domínio MYB4representado por qualquer uma ou mais de: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 27,ou SEQ ID NO: 28. Uma porção pode ser preparada, por exemplo, pelarealização de uma ou mais deleções em uma seqüência de ácido nucleicocodificadora de um polipeptídeo MYB-TF. As porções podem ser usadas naforma isolada ou podem ser fusionadas em outras seqüências codificadoras(ou não-codificadoras) com o propósito de, por exemplo, produzir umaproteína que combina várias atividades. Quando fusionado em outrasseqüências codificadoras, o polipeptídeo resultante produzido sob traduçãopode ser maior do que aquele predito para a porção MYB-TF.Preferivelmente, a porção codifica um polipeptídeo com substancialmente amesma atividade biológica que a do polipeptídeo MYB-TF de SEQ ID NO: 2.
Preferivelmente, a porção é uma porção de uma seqüência deácido nucleico como representada por qualquer uma das seqüências de ácidonucleico dadas em Tabela A, ou a qualquer seqüência de ácido nucleicocodificadora de um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das SEQ ID NOsdadas em Tabela A. Mais preferivelmente a porção é uma porção de umaseqüência de ácido nucleico como representada pela SEQ ID NO: 1.
Outra variante da seqüência de ácido nucleico codificadora deum polipeptídeo MYB-TF, útil nos métodos da presente invenção, é umaseqüência de ácido nucleico capaz de hibridizar sob condições de estringênciareduzida, preferivelmente sob condições estringentes, com uma sondaderivada da seqüência de ácido nucleico como definida aqui antes, cujaseqüência de hibridização codifica um polipeptídeo compreendendo daterminação-N até a terminação-C (i) um domínio R2R3 MYB compreendendoduas repetições MYB; e (ii) um domínio MYB4 possuindo em ordemcrescente de preferência pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência ao domínio ΜΎΒ4representado por qualquer uma ou mais de: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 27,ou SEQ ID NO: 28.
Preferivelmente, a seqüência de hibridização é uma que écapaz de hibridizar com uma seqüência de ácido nucleico como representadapela (ou com as sondas derivadas de) qualquer uma das seqüências de ácidonucleico dadas em Tabela A, ou com qualquer seqüência de ácido nucleicocodificadora de um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das SEQ ID NOsdadas em Tabela A, ou com uma porção de qualquer uma das seqüênciasmencionadas acima (a seqüência alvo). Mais preferivelmente a seqüência dehibridização é capaz de hibridizar com SEQ ID NO: 1 (ou com sondasderivadas da mesma). Sondas são geralmente menores do que 1.000 pb emcomprimento, preferivelmente menores do que 500 pb em comprimento.Comumente, comprimentos de sonda para hibridizações de DNA-DNA talcomo Southern blotting, variam entre 100 e 500 pb, enquanto que região dehibridização em sondas para hibridizações de DNA-DNA tal como emamplificação por PCR são geralmente mais curtos do que 50 mas mais longosdo que 10 nucleotídeos .
O termo "hibridização" como aqui definido é um processo noqual seqüências de nucleotídeos complementares substancialmente homólogasanelam-se umas nas outras. O processo de hibridização pode ocorrerinteiramente em solução, i.e. ambas as moléculas de ácido nucleicocomplementares estão em solução. O processo de hibridização também podeocorrer com uma das moléculas de ácido nucleico complementaresimobilizada em uma matriz tal como glóbulos magnéticos, glóbulos deSepharose ou qualquer outro tipo de resina. O processo de hibridização podeadicionalmente ocorrer com uma das moléculas de ácido nucleicocomplementares imobilizadas em um suporte sólido tal como membrana denitro-celulose ou de náilon ou imobilizada por e.g. fotolitografia em, porexemplo, um suporte de vidro de silício (o último conhecido como arranjos oumicroarranjos de ácido nucleico ou como chips de ácido nucleico). Com oobjetivo de permitir que a hibridização ocorra, as moléculas de ácido nucleicosão geralmente termicamente ou quimicamente desnaturadas para fusão deuma fita dupla em duas fitas únicas e/ou para remoção de grampos-de-cabeloou outras estruturas secundárias das moléculas de ácido nucleico de fita única.
O termo "estringência" refere-se às condições sob as quaisocorre uma hibridização. A estringência de hibridização é influenciada pelascondições tais como temperatura, concentração de sal, força iônica ecomposição de tampão de hibridização. Geralmente, condições deestringência baixa são selecionadas para serem de cerca de 3O0C abaixo doponto de fusão térmico (Tm) para a seqüência específica em uma força iônicae em um pH determinados. Condições de estringência média são quando atemperatura é 20°C abaixo de Tm, e condições de estringência altas sãoquando a temperatura é 10°C abaixo de Tm. Condições de hibridização deestringência alta são tipicamente usadas para isolamento de seqüências dehibridização que possuem similaridade de seqüência alta em relação àseqüência de ácido nucleico alvo. Contudo, seqüências de ácido nucleicopodem se desviar uma das outras e ainda codificar um polipeptídeosubstancialmente idêntico, devido à degeneração do código genético. Portantocondições de hibridização de estringência média podem algumas vezes seremnecessárias para identificar tais moléculas de ácido nucleico.
O Tm é a temperatura sob pH e força iônica definidos, na qual50% da seqüência alvo hibridiza com uma sonda perfeitamente combinada. OTm é dependente das condições de solução e da composição de base e docomprimento da sonda. Por exemplo, seqüências mais longas hibridizamespecificamente em temperaturas mais altas. A taxa máxima de hibridização éobtida de cerca de 16°C a até 32°C abaixo de Tm. A presença de cátionsmonovalentes na solução de hibridização reduz a repulsão eletrostática entreas duas fitas de ácido nucleico promovendo deste modo a formação dehíbrido; este efeito é visível para concentrações de sódio de até 0,4M (paraconcentrações maiores, este efeito pode ser ignorado). Formamida reduz atemperatura de fusão de dúplices de DNA-DNA e de DNA-RNA com 0,6 a0,7°C para cada percentual de formamida, e adição de formamida 50%permite que a hibridização seja realizada a de 30 a 45°C, embora a taxa dehibridização seja abaixada. Más combinações de par de bases reduzem a taxade hibridização e a estabilidade térmica dos dúplices. Em média e para sondasgrandes, a Tm diminui cerca de 1°C por % de má combinação de base. A Tmpode ser calculada usando as seguintes equações, dependendo dos tipos dehíbridos:
• Híbridos de DNA-DNA (Meinkoth e Wahl, Anal. Biochem., 138:267-284, 1984):
Tm = 81,5°C + 16,6 χ Iog[Na+]a + 0,41 χ %[G/C]b - 500 χ [Lc]"1 -0,61 χ %formamida
•híbridos de oligo-DNA ou de oligo-RNA:
Tm = 79,8 + 18,5 (log10[Na+]a) + 0,58(%G/Cb) + 11,8(%G/Cb)2 -820/Lc
• híbridos de DNA-RNA ou de RNA-RNA:
Para <20 nucleotídeos: Tm= 2 (/„)
Para 20-35 nucleotídeos: Tm= 22 + 1,46 (/„)a ou para outro cátion monovalente, mas apenas acurada dentro da faixade 0,01-0,4 M.
apenas acurada para %GC dentro da faixa de 30% a 75%.
cL = comprimento de dúplex em pares de base.
d Oligo, oligonucleotídeo; /„, comprimento efetivo de iniciador = 2x(no.de G/C)+(no. de A/T).
Ligação não-específica pode ser controlada usando qualqueruma de numerosas técnicas conhecidas tais como, por exemplo, bloqueio damembrana com soluções contendo proteína, adições de SDS, DNA e RNAheterólogos no tampão de hibridização, e tratamento com Rnase. Para sondasnão-homólogas, uma série de hibridizações pode ser realizada pela variaçãode um de (i) abaixamento progressivo da temperatura de anelamento (porexemplo de 68°C para 42°C) ou (ii) abaixamento progressivo da concentraçãode formamida (por exemplo de 50% para 0%). O técnico experiente estáciente de vários parâmetros que podem ser alterados durante hibridização eque quer manterão ou mudarão as condições de estringência.
Além das condições de hibridização, especificidade dahibridização tipicamente também depende da função de lavagens de pós-hibridização. Para remover o genótipo residual de hibridização não-específica,amostras são lavadas com soluções salinas diluídas. Fatores críticos de taislavagens incluem a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final:quanto mais baixa a concentração de sal e mais alta a temperatura de lavagem,mais alta será a estringência da lavagem. Condições de lavagem sãotipicamente realizadas em ou abaixo da estringência de hibridização. Umahibridização positiva dá um sinal que é pelo menos o dobro daquele dogenótipo residual. Geralmente, condições estringentes adequadas para ensaiosde hibridização de ácido nucleico ou procedimentos de detecção deamplificação de gene são como descritas acima. Condições mais ou menosestringentes também podem ser selecionadas. O técnico experiente está cientedos vários parâmetros que podem ser alterados durante a lavagem e que quermanterão quer alterarão as condições de estringência.
Por exemplo, condições de hibridização de estringência altatípicas para híbridos de DNA mais longos do que 50 nucleotídeos incluemhibridização a 65°C em Ix SSC ou a 42°C em Ix SSC e formamida 50%,seguida por lavagem a 65°C em 0,3x SSC. Exemplos de condições dehibridização de estringência média para híbridos de DNA mais longos do que50 nucleotídeos incluem hibridização a 50°C em 4x SSC ou a 40°C em 6xSSC e formamida 50%, seguida por lavagem a 50°C em 2x SSC. Ocomprimento do híbrido é o comprimento antecipado para a molécula deácido nucleico hibridizando. Quando seqüências de ácido nucleico conhecidassão hibridizadas, o comprimento de híbrido pode ser determinado poralinhamento de seqüências e identificação das regiões conservadas aquidescritas.
1xSSC é NaCl 0,15M e citrato de sódio 15mM; ashibridizações e lavagens podem adicionalmente incluir 5 χ reagente deDenhardt, SDS 0,5-1,0%, 100 μ^πιΐ de DNA de salmão fragmentado,desnaturado, pirofosfato de sódio 0,5%.
Para os propósitos de definição do nível de estringência,referência pode ser convenientemente feita a Sambrook et al. (2001)Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring HarborLaboratory Press, CSH, New York, ou a Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 e atualizações anuais).
O polipeptídeo MYB-TF pode ser codificado por uma variantede editoração alternativa. O termo "variante de editoração alternativa" comoaqui usado inclui variantes de uma seqüência de ácido nucleico nas quaisíntrons e/ou exons selecionados têm sido excisados, substituídos, deslocadosou adicionados, ou nas quais íntrons têm sido encurtados ou alongados. Taisvariantes serão aquelas nas quais a atividade biológica substancial da proteínaé retida, que podem ser obtidas por retenção seletiva de segmentos funcionaisda proteína. Tais variantes de editoração podem ser encontradas em naturezaou podem ser feitas pelo homem. Métodos para preparar tais variantes deeditoração são bem conhecidos na arte.
Variantes de editoração preferidas são variantes de editoraçãoda seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TFcompreendendo desde a terminação-N até a terminação-C (i) um domínioR2R3 MYB compreendendo duas repetições MYB; e (ii) um domínio MYB4possuindo em ordem crescente de preferência pelo menos 55%, 60%, 65%,70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade deseqüência ao domínio MYB4 representado por qualquer uma ou mais de:SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 27, ou SEQ ID NO: 28. Outras variantes deeditoração preferidas das seqüências de ácido nucleico codificadoras depolipeptídeos MYB-TF compreendendo características como definidas aquiacima são variantes de editoração de uma seqüência de ácido nucleico comodada em Tabela A, ou qualquer seqüência de ácido nucleico codificadora deum ortólogo ou parálogo de qualquer uma das SEQ ID NOs dadas em TabelaA. Mais preferida é uma variante de editoração de uma seqüência de ácidonucleico como representada pela SEQ ID NO: 1.
O polipeptídeo MYB-TF também pode ser codificado por umavariante alélica de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de umpolipeptídeo compreendendo desde a terminação-N até a terminação-C (i) umdomínio R2R3 MYB compreendendo duas repetições MYB; e (ii) umdomínio MYB4 possuindo em ordem crescente de preferência pelo menos55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais deidentidade de seqüência ao domínio MYB4 representado por qualquer uma oumais de: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 27, ou SEQ ID NO: 28.
Variantes alélicas preferidas de seqüências de ácido nucleicocodificadoras de polipeptídeos MYB-TF compreendendo características comodefinidas aqui acima são variantes alélicas de uma seqüência de ácidonucleico como dada em Tabela A, ou qualquer seqüência de ácido nucleicocodificadora de um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das SEQ ID NOsdadas em Tabela A. Mais preferida é uma variante alélica de uma seqüênciade ácido nucleico como representada pela SEQ ID NO: 1. Variantes alélicasexistem na natureza, e incluído dentro dos métodos da presente invenção é ouso destes alelos naturais. Variantes alélicas incluem Polimorfismos deNucleotídeo Unico (SNPs), bem como Polimorfismos de Inserção/Deleçãopequenos (INDELs). O tamanho de INDELs é normalmente menor do que100 pb. SNPs e INDELs formam o conjunto maior de variantes de seqüênciaem cepas polimórficas naturalmente ocorrentes da maioria dos organismos.
Evolução direta (embaralhamento de gene) também pode serusada para gerar variantes de seqüências de ácido nucleico codificadoras depolipeptídeos MYB-TF. Isto consiste de interações de embaralhamento deDNA seguido por triagem e/ou seleção apropriado de variantes de gene deseqüências de ácido nucleico ou de suas porções codificadoras depolipeptídeos MYB-TF ou homólogos ou suas porções possuindo umaatividade biológica individual (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151-4; Patentes US 5.811.238 e 6.395.547).
Mutagênese sítio-direcionada pode ser usada para gerarvariantes de seqüências de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeosMYB-TF. Vários métodos estão disponíveis para realizar mutagênese sítio-direcionada, os mais comuns sendo métodos baseados em PCR based(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds.).
Seqüências de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeosMYB-TF podem ser derivadas de qualquer fonte natural ou artificial. Aseqüência de ácido nucleico pode ser modificada de sua forma nativa emcomposição e/ou ambiente genômico através de manipulação humanadeliberada. Em uma modalidade, seqüência de ácido nucleico MYB-TF é deorigem de planta, preferivelmente de uma planta monocotiledônea,adicionalmente preferivelmente da família Poaceae, mais preferivelmente dogênero Oryza, muito mais preferivelmente a seqüência de ácido nucleico é deOryza sativa.
A expressão aumentada da seqüência de ácido nucleicocodificadora de um polipeptídeo MYB-TF pode ser realizada pela introduçãode uma modificação genética, preferivelmente no local de um gene MYB-TF,na planta. O local de um gene como aqui definido é considerado parasignificar uma região genômica, que inclui o gene de interesse e IOKB amontante ou a jusante da região de codificação. Em uma modalidadeparticular, a expressão de uma seqüência de ácido nucleico codificadora deum polipeptídeo MYB-TF é preferencialmente aumentada no endosperma deuma semente de planta.
A modificação genética pode ser introduzida, por exemplo, porqualquer um dos seguintes método: ativação de T-DNA, TILLING erecombinação homóloga ou por introdução e expressão em uma planta, deuma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF.A expressão do ácido nucleico codificador de um polipeptídeo MYB-TF éaumentada. Em uma modalidade particular, a expressão de uma seqüência deácido nucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF é preferivelmenteaumentada no endosperma de uma semente de planta. Após introdução damodificação genética, segue uma etapa opcional de seleção de expressãoaumentada na planta de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de umpolipeptídeo MYB-TF5 cuja expressão aumentada dá plantas possuindorendimento aumentado em relação às plantas de controle. Em umamodalidade particular, após introdução da modificação genética, segue umaetapa opcional de seleção de expressão preferencialmente aumentada de umaseqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF noendosperma de uma semente de planta, cuja expressão aumentada dá plantaspossuindo rendimento aumentado em relação às plantas de controle.
Etiquetação de ativação de T-DNA (Hayashi et al. Science(1992) 1350-1353) envolve inserção de T-DNA, normalmente contendo umpromotor (também pode ser um intensificador de tradução ou um íntron), naregião genômica do gene de interesse ou 10 kb a montante ou a jusante daregião de codificação de um gene em uma configuração de tal modo que opromotor dirija a expressão do gene selecionado. Tipicamente, regulação deexpressão do gene selecionado por seu promotor natural é interrompida e ogene cai sob o controle do promotor recém-introduzido. O promotor étipicamente embebido em um T-DNA. Este T-DNA é aleatoriamente inseridono genoma de planta, através de infecção por Agrobacterium e leva àexpressão modificada de genes próximos do T-DNA inserido. As plantastransgênicas resultantes mostram fenótipos dominantes devido à expressãomodificada dos genes próximos do promotor introduzido. O promotor a serintroduzido pode ser qualquer promotor capaz de aumentar a expressão emuma planta da seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeoMYB-TF. Em uma modalidade particular, o promotor de escolhapreferivelmente aumenta a expressão no endosperma de uma semente deplanta.
Uma modificação genética também pode ser introduzida nolocal de um gene codificador de um polipeptídeo MYB-TF usando a técnicade TILLING ([Targeted Induced Local Lesions In Genomes], Lesões LocaisInduzidas Selecionadas Em Genomas). Esta é uma tecnologia de mutagêneseútil para gerar e/ou identificar uma seqüência de ácido nucleico codificadorade um polipeptídeo MYB-TF com atividade e/ou expressão modificada.TILLING também permite a seleção de plantas trazendo tais variantesmutantes. Estas variantes mutantes podem exibir expressão modificada, querem comprimento quer em localização ou em temporização (se as mutaçõesafetam o promotor por exemplo). Estas variantes mutantes podem exibiratividade mais alta de MYB-TF do que a exibida pelo gene em sua formanatural. Estas variantes mutantes podem exibir TILLNG que combinamutagênese de densidade alta com métodos de seleção de produtividade alta.As etapas tipicamente seguidas em TILLING são: (a) mutagênese EMS(Redei GP e Koncz C (1992) In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C,Chua NH, Schell J, eds. Singapore, World Scientific Publishing Co, pp. 16-82; Feldmann et al., (1994) Em Meyerowitz EM, Somerville CR, eds,Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,pp 137-172; Lightner J and Caspar T (1998) em J Martinez-Zapater, J Salinas,eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp91-104); (b) preparação de DNA e coleção de indivíduos; (c) amplificaçãopor PCR de uma região de interesse; (d) desnaturação e anelamento parapermitir a formação de heterodúplices; (e) DHPLC, onde a presença de umheteroduplex em uma coleção é detectada como um pico extra nocromatograma; (f) identificação do indivíduo mutante; e (g) seqüenciamentode produto de PCR mutante. Métodos para TILLING são bemconhecidos na arte (McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457;revisto por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50). Plantas trazendo taisvariantes mutantes têm aumentada expressão de uma seqüência de ácidonucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF. Em uma modalidadeparticular, plantas trazendo tais variantes mutantes possuempreferencialmente expressão aumentada de uma seqüência de ácido nucleicocodificadora de um polipeptídeo MYB-TF no endosperma de uma semente deplanta.
Ativação de T-DNA e TILLING são exemplos de tecnologiasque permitem a geração de modificações genéticas compreendendo expressãoaumentada em uma planta de uma seqüência de ácido nucleico codificadorade um polipeptídeo MYB-TF, ou compreendendo preferencialmente aumentoda expressão de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de umpolipeptídeo MYB-TF no endosperma de uma semente de planta.
Recombinação homóloga permite a introdução em um genomade uma seqüência de ácido nucleico selecionada em uma posição selecionadadefinida. Recombinação homóloga é uma tecnologia padrão rotineiramenteusada em ciências biológicas para organismos inferiores tal como levedura ouo musgo Physcomitrella. Métodos para realizar recombinação homóloga emplantas têm sido descritos não apenas para plantas modelo (Offringa et ai.(1990) EMBO J 9(10): 3077-84) mas também para plantas de colheita, porexemplo arroz (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030-4; lida e Terada(2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132-8). A seqüência de ácido nucleico a serselecionada é preferivelmente a região controlando a expressão natural deuma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TFem uma planta. Um promotor constitutivo forte ou alternativamente, umpromotor forte específico de endosperma, é introduzido nesta região,substituindo-o parcial ou substancialmente todo ele.
Um método preferido para introduzir uma modificaçãogenética (que neste caso não necessita estar no local de um gene MYB-TF) éa introdução e expressão em uma planta de uma seqüência de ácido nucleicocodificadora de um polipeptídeo MYB-TF, como definida aqui acima. Aexpressão de ácido nucleico codificador de um polipeptídeo MYB-TF éaumentada. Em uma modalidade particular, um método preferido paraintroduzir uma modificação genética (que neste caso não necessita estar nolocal de um gene MYB-TF) é introduzir e preferencialmente aumentar aexpressão uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeoMYB-TF, como definida aqui acima, no endosperma de uma semente deplanta.
A seqüência de ácido nucleico a ser introduzida em uma plantapode ser uma seqüência de ácido nucleico de comprimento total ou pode seruma porção ou uma seqüência de hibridização ou outra variante de ácidonucleico como definida aqui acima.
Os métodos da invenção baseiam-se na expressão aumentadaem uma planta de uma seqüência de ácido nucleico codificadora depolipeptídeo MYB-TF. Em uma modalidade particular, os métodos dainvenção baseiam-se preferivelmente em expressão aumentada de umaseqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF, noendosperma de uma semente de planta. Métodos de aumentar a expressão degenes ou de produtos de gene estão bem documentados na arte e incluem, porexemplo, sobreexpressão conduzida por promotores apropriados, o uso deintensificadores de transcrição ou de intensificadores de tradução. Seqüênciasde ácido nucleico isoladas que servem como elementos promotores ouintensificadores podem ser introduzidas em uma posição apropriada(tipicamente a montante) de uma forma não-heteróloga de um polinucleotídeode modo a supra-regular a expressão de uma seqüência de ácido nucleicocodificadora de um polipeptídeo MYB-TF. Por exemplo, promotoresendógenos podem ser alterados in vivo por mutação, deleção e/ou substituição(veja, Kmiec, Pat. U.S. de No. 5.565.350; Zarling et al., PCT/US93/03868),ou promotores isolados podem ser introduzidos em uma célula de planta naorientação e distância apropriadas de um gene da presente invenção de modoa controlar a expressão do gene.Se a expressão de polipeptídeo é desejada, é geralmentedesejável introduzir uma região de poliadenilação na extremidade-3' de umaregião codificadora de polinucleotídeo. A região de poliadenilação pode serderivada do gene natural, de uma variedade de outros genes de planta, ou deT-DNA. A seqüência de extremidade 3' a ser adicionada pode ser derivadade, por exemplo, os genes de nopalina sintase ou octopina sintase, oualternativamente de outro gene de planta, ou menos preferivelmente dequalquer outro gene eucariótico.
Uma seqüência de íntron também pode ser adicionada naregião não-traduzida (UTR) 5' ou a seqüência codificadora da seqüênciacodificadora parcial para aumentar a quantidade da mensagem madura queacumula no citosol. Tem sido mostrado que inclusão de um íntron editorávelna unidade de transcrição em ambos os construtos de expressão de planta eanimal aumenta a expressão de gene em ambos os níveis de mRNA e deproteína em até 1.000 vezes (Buchman e Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1:1183-1200). Tal intensificação deíntron da expressão de gene é tipicamente mais elevada quando posicionadapróxima da extremidade 5' da unidade de transcrição. É conhecido na arte ouso de íntrons de milho íntron 1, 2, e 6 Adh 1-S, o íntron Bronze-1. Parainformação geral veja: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling e Walbot,Eds., Springer, N.Y. (1994).
Outras seqüências de controle (além de seqüências depromotor, intensificador, silenciador, íntron, regiões 3'UTR e/ou 5'UTR)podem ser elementos estabilizadores de proteína e/ou de RNA.
A invenção também proporciona vetores e construtosgenéticos para facilitar a introdução e/ou expressão preferencial dasseqüências de ácido nucleico úteis nos métodos de acordo com a invenção, noendosperma de uma semente de planta.
Portanto, é proporcionado um construto compreendendo:(i) Uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeoMYB-TF como definido aqui acima;
(ii) Uma ou mais seqüências de controle capazes de conduzir expressãoem uma planta, parte de planta ou célula de planta, da seqüência deácido nucleico de (a); e opcionalmente
(iii) Uma seqüência de terminação de transcrição.
Preferivelmente, uma das seqüências de controle é pelo menosuma de : (i) um promotor constitutivo, preferivelmente um promotor G0S2 ;ou (ii) um promotor específico de endosperma, preferivelmente um promotorprolamina.
Construtos úteis nos métodos de acordo com a presenteinvenção podem ser construídos usando tecnologia de DNA recombinantebem conhecidas pelas pessoas experientes na arte. Os construtos de genepodem ser inseridos em vetores, que podem estar comercialmente disponíveis,adequados para transformação em plantas e adequados para expressão dogene de interesse nas células transformadas. A invenção portanto proporcionauso de um construto de gene como definido aqui acima nos métodos dainvenção.
Plantas são transformadas com um vetor compreendendo aseqüência de interesse (i.e., uma seqüência de ácido nucleico codificadora deum polipeptídeo MYB-TF). O técnico experiente está bem ciente doselementos genéticos que têm que estar presentes no vetor com o propósito debem sucedidamente transformar, selecionar e propagar as células hospedeirascontendo a seqüência de interesse. A seqüência de interesse éoperacionalmente ligada em uma ou mais seqüências de controle (pelo menosem um promotor). Os termos "elemento regulatório", "seqüência de controle"e "promotor" são todos aqui usados intercambiavelmente e são para seremtomados em um contexto amplo para se referirem às seqüências de ácidonucleico regulatórias capazes de efetuarem a expressão das seqüências nasquais estão ligadas. Incluídas pelos termos acima mencionadas são asseqüências regulatórias de transcrição derivadas de um gene genômicoeucariótico clássico (incluindo a box TATA que é requerida para iniciação detranscrição acurada, com ou sem a seqüência de box CCAAT) e elementosregulatórios adicionais (i.e. silenciadores, intensificadores e seqüências deativação a montante) que alteram a expressão de gene em resposta aosestímulos externos e/ou desenvolvimentais, ou em uma maneira específica detecido. Também está incluída dentro do termo uma seqüência regulatória detranscrição de um gene procariótico clássico, em cujo caso pode incluir umaseqüência de box 35- e/ou - seqüências regulatórias de transcrição de box 10-.O termo "elemento regulatório" também inclui uma molécula de fusãosintética ou derivado que confere, ativa ou intensifica a expressãode uma molécula de ácido nucleico em uma célula, tecido ou órgão. O termo"operacionalmente ligado" como aqui usado refere-se a uma ligaçãofuncional entre a seqüência de promotor e o gene de interesse, de tal modoque a seqüência de promotor seja capaz de iniciar a transcrição do gene deinteresse.
O termo "promotor constitutivo" como aqui usado refere-se aum promotor que é transcricionalmente ativo durante a maioria das, masnecessariamente em todas as, fases de crescimento e desenvolvimento e sobas condições mais ambientais, em pelo menos uma célula, tecido ou órgão (talcomo o endosperma de uma semente de planta). Tabela 2 abaixo dá exemplosde promotores constitutivos.
Um promotor constitutivo é particularmente útil nos métodosda invenção. Deve estar claro que a aplicabilidade da presente invenção não érestrita à seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF, como representada pela SEQ ID NO: 1, nem é a aplicabilidade dainvenção restrita à expressão de uma seqüência de ácido nucleico codificadorade um polipeptídeo MYB-TF, quando conduzida por um promotorconstitutivo.
Tabela 2: Exemplos de promotores constitutivos
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Um promotor específico de órgão ou específico de tecido é umque é capaz de preferencialmente iniciar a transcrição em certos órgãos outecidos, tais como as folhas, raízes, tecido de semente etc. Por exemplo, um"promotor específico de raiz" é um promotor que é transcricionalmente ativopredominantemente em raízes de planta, substancialmente à exclusão dequaisquer outras partes de uma planta, enquanto ainda permitindo qualquerexpressão subnormal nestas outras partes de planta.
Um promotor específico de endosperma refere-se a qualquerpromotor capaz de preferencialmente conduzir a expressão do gene deinteresse no endosperma de uma semente de planta. Referência aqui a"preferencialmente" conduzindo expressão no endosperma de uma sementede planta é tomada para significar condução da expressão de qualquerseqüência operacionalmente ligada no mesmo no endospermasubstancialmente à exclusão de condução de expressão alhures na planta, àparte de qualquer expressão residual devido à expressão de promotorsubnormal. Por exemplo, o promotor prolamina mostra expressão forte noendosperma de uma semente de planta, com subnormalidade em meristema,mais especificamente no meristema de broto e/ou centro de discriminação nomeristema. O promotor específico de endosperma pode ser um promotor quernatural quer sintético.
Preferivelmente, o promotor específico de endosperma é umpromotor isolado de um gene prolamina, tal como promotor RP6 promalinade arroz (Wen et al., (1993) Plant Physiol 101(3): 1115-6) como representadopela SEQ ID NO: 29 ou pela SEQ ID NO: 41, ou um promotor de forçasimilar e/ou um promotor com um padrão de expressão similar como opromotor prolamina de arroz. Padrão de força similar e/ou expressão similarpode ser analisado, por exemplo, por copulação dos promotores em um generepórter e checagem da função do gene repórter em tecidos da planta. Umgene repórter bem conhecido é beta-glicuronidase e a mancha GUScolorimétrica é usada para visualizar a atividade de beta-glicuronidase emtecido de planta. Deve ficar claro que a aplicabilidade da presente invençãonão é restrita à seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeoMYB-TF representada por SEQ ID NO: 2, nem a aplicabilidade da invenção érestrita à expressão de um ácido nucleico codificador de um polipeptídeoMYB-TF quando conduzida por um promotor prolamina. Exemplos de outrospromotores específicos de endosperma que também podem ser usados pararealizar os métodos da invenção são mostrados em Tabela 3 abaixo.
Tabela 3: Exemplos de promotores específicos de endospermapara uso na presente invenção
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Outro exemplo de um promotor específico de tecido é um queé capaz de preferencialmente iniciar a transcrição em tecidos de expansãojovens, tal como promotor beta-expansina. Preferivelmente, o promotor beta-expansina é de arroz, mais preferivelmente substancialmente similar à SEQID NO : 40, muito mais preferivelmente é como representado pela SEQ IDNO : 40. Um tal promotor também é útil na realização dos métodos de acordocom a invenção.
Opcionalmente, uma ou mais seqüências de terminador(também uma seqüência de controle) podem ser usadas no construtointroduzido em uma planta. O termo "terminador" inclui uma seqüência decontrole que é uma seqüência de DNA na extremidade de uma unidade detranscrição que sinaliza poliadenilação e processamento 3' de um transcritoprimário e terminação de transcrição. Elementos regulatórios adicionaispodem incluir intensificadores de transcrição bem como de tradução. Aquelaspessoas experientes na arte estão cientes das seqüências de intensificador e determinador que podem ser adequadas para uso na realização da invenção. Taisseqüências seriam conhecidas ou podem ser prontamente obtidas por umapessoa experiente na arte.
Os construtos genéticos da invenção podem adicionalmenteincluir uma origem de seqüência de replicação que é requerida paramanutenção e/ou replicação em um tipo de célula específico. Um exemplo équando um construto de gene é requerido para ser mantido em uma célulabacteriana como um elemento genético epissomal (e.g. molécula deplasmídeo ou cosmídeo). Origens de replicação adequadas incluem, mas nãosão limitadas a, fl-ori e colEl.O construto genético pode opcionalmente compreender umgene marcador selecionável. Como aqui usado, o termo "gene marcadorselecionável" inclui qualquer gene que confere um fenótipo a uma célula naqual ele é expressado para facilitar a identificação e/ou seleção de células quesão transferidas ou transformadas com um construto de ácido nucleico dainvenção. Marcadores adequados podem ser selecionados de marcadores queconferem resistência a antibiótico ou a herbicida, que introduzem uma novafeição metabólica ou que permitem seleção visual. Exemplos de genesmarcadores selecionáveis incluem genes conferindo resistência a antibióticos(tais como nptll que fosforila neomicina e canamicina, ou hpt, fosforilação dehigromicina, ou genes conferindo resistência a, por exemplo, bleomicina,estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina(G418), espectinomicina ou blasticidina), aos herbicidas (por exemplo bar queproporciona resistência a Basta®; aroA ou gox proporcionando resistênciacontra glifosato, ou os genes conferindo resistência a, por exemplo,imidazolinona, fosfinotricina ou sulfonil-uréia), ou genes que proporcionamuma feição metabólica (tal como manA que permite que as planta susemmanose como a única fonte de carbono ou xilose isomerase para a utilizaçãode xilose, ou marcadores anti-nutritivos tal como a resistência à 2-desóxiglicose). Expressão de genes marcadores visuais resulta na formação decor (por exemplo β-glicuronidase, GUS ou β-galactosidase com seussubstratos coloridos, por exemplo X-Gal), luminescência (tal como o sistemaluciferina/luciferase) ou fluorescência (Proteína Fluorescente Verde, GFP, eseus derivados). Esta lista representa apenas um número pequeno demarcadores possíveis. O técnico experiente está familiarizado com taismarcadores. Marcadores diferentes são preferidos, dependendo do organismoe do método de seleção.
A presente invenção também inclui plantas obteníveis pelosmétodos de acordo com a presente invenção. A presente invenção portantoproporciona plantas, partes de planta ou células de planta das mesmasobteníveis pelo método de acordo com a presente invenção, cujas plantas oupartes ou células das mesmas compreendem um ácido nucleico isoladocodificador de um polipeptídeo MYB-TF sob o controle de um promotorconstitutivo como definido aqui acima. Em uma modalidade particular, apresente invenção proporciona plantas, partes de planta ou células de plantadas mesmas obteníveis pelo método de acordo com a presente invenção, cujasplantas ou partes ou células das mesmas compreendem um ácido nucleicoisolado codificador de um polipeptídeo MYB-TF sob o controle de umpromotor específico de endosperma.
A invenção também proporciona um método para a produçãode plantas transgênicas possuindo rendimento aumentado em relação àsplantas de controle, compreendendo introdução e expressão em uma planta deuma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF.Em uma modalidade particular, a invenção proporciona um método para aprodução de plantas transgênicas possuindo rendimento aumentado emrelação às plantas de controle, compreendendo introdução e preferencialmenteexpressão de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de umpolipeptídeo MYB-TF no endosperma de uma semente de planta.
Mais especificamente, a presente invenção proporciona ummétodo para a produção de plantas transgênicas possuindo rendimentoaumentado em relação às plantas de controle, cujo método compreende asetapas de:
(i) introduzir e expressar em uma planta, parte de planta ou uma célulade planta uma seqüência de ácido nucleico codificadora de umpolipeptídeo MYB-TF; e
(ii) cultivar a célula de planta sob condições promotoras de crescimentoe desenvolvimento de planta e no qual a expressão da seqüência deácido nucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF éconduzida por um promotor constitutivo, ou por um promotorespecífico de endosperma.
A seqüência de ácido nucleico pode ser introduzidadiretamente em uma célula de planta ou na própria planta (incluindointrodução em um tecido, órgão ou qualquer outra parte de uma planta). Deacordo com uma característica preferida da presente invenção, a seqüência deácido nucleico é preferivelmente introduzida em uma planta portransformação.
O termo "transformação" como aqui referido inclui atransferência de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira,independentemente do método usado para a transferência. Tecido de plantacapaz de subseqüente propagação clonal, seja por organogênese seja porembriogênese, pode ser transformado comum construto genético da presenteinvenção e uma planta inteira pode ser regenerada do mesmo. O tecidoparticular escolhido variará dependendo dos sistemas de propagação clonaldisponíveis para, e melhor adequados para, a espécie particular sendotransformada. Alvos de tecido exemplares incluem discos de folha, pólen,embriões, cotilédones, hipocótilos, megagametófitos, tecido de calo, tecidomeristemático existente (e.g., meristema apical, botões axilares, e meristemasde raiz), e tecido de meristema induzido (e.g., meristema de cotilédone emeristema de hipocótilo). O polinucleotídeo pode ser transientemente ouestavelmente introduzido em uma célula hospedeira e pode ser mantido não-integrado, por exemplo, como um plasmídeo. Alternativamente pode serintegrado no genoma hospedeiro. A célula de planta transformada pode serentão usada para regenerar uma planta transformada em uma maneiraconhecida por pessoas experientes na arte.
Transformação de espécies de planta é agora uma técnicabastante rotineira. Vantajosamente, qualquer um de vários métodos detransformação pode ser usado para introduzir o gene de interesse em umacélula ancestral adequada. Métodos de transformação incluem o uso delipossomos, eletroporação, compostos químicos que aumentam a captação deDNA livre, injeção de DNA diretamente dentro da planta, bombardeamentocom pistola de partículas, transformação usando vírus ou pólen emicroinjeção. Métodos podem ser selecionados de método de cálcio /propileno-glicol para protoplastos (Krens, F.A. et al. (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); eletroporação paraprotoplastos (Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102);microinjeção no material de planta (Crossway A et al. (1986) Mol. Gen Genet202: 179-185); bombardeio de partículas revestidas com DNA or RNA (KleinTM et al. (1987) Nature 327: 70) infecção com vírus (não-integrativos) esemelhante. Plantas transgênicas de arroz com expressão aumentada de umgene/seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TFsão preferivelmente produzidas via transformação mediada porAgrobacterium usando qualquer um dos métodos bem conhecidos paratransformação de arroz, tais como descritos em qualquer um dos seguintes:Pedido de Patente Européia publicada EP 1198985 Al, Aldemita e Hodges(Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506,1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), cujas descrições são aquiincorporadas como referências como se totalmente descritas. No caso detransformação de milho, o método preferido é como descrito quer em Ishidaet al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) quer em Frame et al. (PlantPhysiol 129(1): 13-22, 2002), cujas descrições são aqui incorporadas comoreferências como se totalmente descritas.
Geralmente após a transformação, as células de planta ouagrupamentos de células de planta são selecionados para a presença de um oumais marcadores que são codificados pelos genes expressáveis em planta co-transferidos com o gene de interesse, após o qual o material transformado éregenerado em uma planta inteira.Após transferência de DNA e regeneração, plantasputativamente transformadas podem ser avaliadas, por exemplo usandoanálise Southern, para a presença do gene de interesse, número de cópias e/ouorganização genômica. Alternativa ou adicionalmente, níveis de expressão doDNA recém-introduzido podem ser monitorados usando análise Northern e/ouWestern, ou PCR quantitativa, todas técnicas bem conhecidas pelas pessoaspossuindo experiência ordinária na arte.
As plantas transformadas geradas podem ser propagadas poruma variedade de meios, tais como propagação clonal ou técnicas de geraçãoclássica. Por exemplo, uma planta transformada de primeira geração (ou TI)pode ser auto-fertilizada para dar transformantes homozigóticos de segundageração (ou T2), e as plantas T2 podem ser adicionalmente propagadasatravés de técnicas de geração clássica.
Os organismos transformados gerados podem tomar umavariedade de formas. Por exemplo, podem ser quimeras de célulastransformadas e células não-transformadas; transformantes clonais (e.g., todasas células transformadas para conterem o cassete de expressão); enxertos detecidos transformados e não-transformados (e.g., em plantas, um rizomatransformado enxertado em um implante não-transformado).
A presente invenção claramente se estende a qualquer célulade planta ou planta produzida por qualquer uma dos métodos aqui descritos, ea todas as partes de planta e seus propágulos. Mais especificamente, apresente invenção proporciona plantas, partes de planta, ou células de plantaobteníveis pelos métodos da invenção, nos quais as citadas plantas, partes oucélulas das mesmas, compreende, um ácido nucleico isolado codificador deum polipeptídeo MYB-TF, cujo ácido nucleico codificador estáoperacionalmente ligado em um promotor constitutivo, ou em um promotorespecífico de endosperma.
A presente invenção se estende adicionalmente para incluir aprogênie de uma célula, tecido, órgão ou planta inteira transformada outransfectada primária que tem sido produzida por qualquer um dos métodosmencionados acima, e o único requerimento sendo que a progênie exibe a(s)mesma(s) característica(s) fenotípica(s) e/ou genotípica(s) que aquelasproduzidas pela planta parental nos métodos de acordo com a invenção.
A invenção também inclui células hospedeiras contendo umaseqüência de ácido nucleico isolada codificadora de um polipeptídeo MYB-TF. Células hospedeiras preferidas de acordo com a invenção são células deplanta.
A invenção também se estende às partes colhíveis de umaplanta tais como, mas não limitadas às, sementes, folhas, frutas, flores,rizomas, tubérculos e bulbos. A invenção adicionalmente se refere aosprodutos derivados, preferivelmente diretamente derivados, de uma partecapaz de ser colhida de uma tal planta, tais como pós ou pelotas secas, óleo,gordura e ácidos graxos, amido ou proteínas.
A presente invenção também inclui o uso de seqüências deácido nucleico codificadoras de polipeptídeos MYB-TF e o uso depolipeptídeos MYB-TF no aumento do rendimento de planta como definidoaqui acima nos métodos da invenção.
Seqüências de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeosMYB-TF, ou polipeptídeos MYB-TF, podem encontrar uso em programas degeração nos quais é identificado um marcador de DNA que pode sergeneticamente ligado em um gene MYB-TF gene . Os genes/seqüências deácido nucleico, ou os polipeptídeos MYB-TF podem ser usados para definirum marcador molecular. Este marcador de DNA ou proteína pode ser entãousado em programas de geração para selecionar plantas possuindo rendimentoaumentado como definido aqui acima nos métodos da invenção.
Variantes alélicas de um MYB-TF gene/seqüência de ácidonucleico também podem encontrar uso em programas de geração auxiliadospor marcador. Tais programas de geração algumas vezes requerem introduçãode variação alélica por tratamento mutagênico das plantas usando, porexemplo mutagênese EMS; alternativamente, o programa pode iniciar comuma coleção de variantes alélicas de denominada origem "natural" causadanão-intencionalmente. Identificação de variantes alélicas então ocorre, porexemplo, por PCR. Isto é seguido por uma etapa para seleção de variantesalélicas superiores da seqüência em questão e que dão rendimento aumentado.Seleção é tipicamente realizada por monitoração de desempenho decrescimento de plantas contendo variantes alélicas diferentes da seqüência emquestão. Desempenho de crescimento pode ser monitorado em uma estufa ouno campo. Outras etapas opcionais incluem cruzamento de plantas nas quais avariante alélila superior foi identificada com outra planta. Isto poderia serusado, por exemplo, para preparar uma combinação de característicasfenotípicas de interesse.
Uma seqüência de ácido nucleico codificadora de umpolipeptídeo MYB-TF também pode ser usada como sondas para genética efisicamente mapear os genes dos quais são uma parte, e como marcadorespara feições ligadas àqueles genes. Tal informação pode ser útil em geraçãode planta com o objetivo de desenvolver linhagens com fenótipos desejados.Tal uso de seqüências de ácido nucleico MYB-TF requer apenas umaseqüência de ácido nucleico de pelo menos 15 nucleotídeos em comprimento.As seqüências de ácido nucleico MYB-TF podem ser usadas comomarcadores de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição(RFLP). Southern blots (Sambrook J, Fritsch EF e Maniatis T (1989)Molecular Cloning, A Laboratory Manual) de DNA genômico de plantadigerido por restrição podem ser sondados com as seqüências de ácidonucleico MYB-TF. Os padrões de banda resultantes podem ser entãosubmetidos às análises genéticas usando programas de computador tal comoMapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174181) com o propósito deconstruir um mapa genético. Em adição, as seqüências de ácido nucleicopodem ser usadas para sondar Southern blots contendo DNAs genômicostratados com endonuclease de restrição de um conjunto de indivíduosrepresentando a planta parental e progênie de um cruzamento genétidodefinido. Segregação dos polimorfismos de DNA é notada e usada paracalcular a posição da seqüência de ácido nucleico MYB-TF no mapa genéticopreviamente obtido usando esta população (Botstein et al. (1980) Am. J.Hum. Genet. 32:314-331).
A produção e o uso de sondas derivadas de gene de planta parautilização em mapeamento genético são descritos em Bernatzky e Tanksley(1986) Plant Mol. Biol. Repórter 4: 37-41. Numerosas publicações descrevemo mapeamento genético de clones de cDNA específicos usando a metodologiadescrita acima ou suas variações. Por exemplo, populações deintercruzamento F2, populações de retro-cruzamento, populaçõesaleatoriamente combinadas, linhagens quase isogênicas, e outros conjuntos deindivíduos podem ser usados para mapeamento. Tais metodologias tambémsão bem conhecidas por aquelas pessoas experientes na arte.
As sondas de ácido nucleico também podem ser usadas paramapeamento físico (i.e., posicionamento de seqüências sobre mapas físicos;veja Hoheisel et al. em: Non-mammalian Genomic Analysis: A PracticalGuide, Academic press 1996, pp. 319-346, e referências do mesmo).
Em outra modalidade, as sondas de ácido nucleico codificadorpodem ser usadas em mapeamento de hibridização in situ com fluorescênciadireta (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7:149-154). Embora métodoscorrentes de mapeamento FISH favoreçam o uso de clones grandes (vários kba várias centenas de kb; veja Laan et al. (1995) Genome Res. 5:13-20),melhorias na sensibilidade podem permitir desempenho de mapeamento FISHusando sondas mais curtas.
Uma variedade de métodos baseados em amplificação de ácidonucleico para mapeamento genético e físico pode ser realizada utilizando asseqüências de ácido nucleico. Exemplos incluem amplificação específica dealelo (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95-96), polimorfismo oufragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics16:325-332), ligação específica de alelo (Landegren et al. (1988) Science241:1077-1080), reações de extensão de nucleotídeo (Sokolov (1990) NucleicAcid Res. 18:3671), Mapeamento de Híbrido com Radiação (Walter et al.(1997) Nat. Genet. 7:22-28) e Mapeamento Satisfatório (Dear e Cook (1989)Nucleic Acid Res. 17:6795-6807). Para estes métodos, a seqüência de umácido nucleico é usada para planejar e produzir pares de iniciadores para usona reação de amplificação ou em reações de extensão de iniciador. Oplanejamento de tais iniciadores é bem conhecido por aquelas pessoasexperientes na arte. Em métodos empregando mapeamento genético baseadoem PCR, pode ser necessária a identificação de diferenças de seqüência deDNA entre os indivíduos parentais do cruzamento de mapeamento na regiãocorrespondendo à presente seqüência de ácido nucleico. Isto, contudo,geralmente não é necessário para métodos de mapeamento.
O métodos de acordo com a presente invenção resultam emplantas possuindo rendimento aumentado, como descrito aqui acima. Esterendimento aumentado também é combinado com outras feiçõeseconomicamente vantajosas, tais como outras feições aumentadoras derendimento, tolerância a outros estresses abióticos e bióticos, feiçõesmodificando várias características arquitetônicas e/ou característicasbioquímicas e/ou fisiológicas.
Descrição das Figuras
A presente invenção agora será descrita com referência àsseguintes figuras nas quais:
Fig. 1 representa a estrutura esquemática de um polipeptídeoMYB-TF compreendendo desde a terminação-N até a terminação-C umdomínio de ligação de DNA R2R3 MYB (círculo grande) compreendendoduas repetições MYB (dois círculos menores), um domínio MYB4 (dentro deretângulo). As regiões do polipeptídeo fora destes domínios são regiõesvariáveis.
Fig. 2 representa uma tabela de seqüências relacionadas comum polipeptídeo MYB-TF, como tentativamente montado pelo The Institutefor Genomic Research (TIRG) (TC924083). O banco de dados de Ortólogosde Gene Eucariótico (EGO) pode ser usado para identificar tais seqüênciasrelacionadas, quer por pesquisa de palavra-chave quer pelo uso do algoritmoBLAST com o ácido nucleico ou seqüência de polipeptídeo de interesse. Estalista não é exaustiva, seqüências mais relacionadas podem ser identificadas nobanco de dados de Nucleotídeos Entrez no National Center for BiotechnologyInformation (NCBI) usando ferramentas de pesquisa de seqüências de bancode dados.
Fig. 3 é uma árvore filogenética de polipeptídeos R2R3 MYB-TF de planta, gerada por Kranz et al. (1998) Plant Journal 16(2) : 263-276. Aregião compreendendo a Clareira de interesse tem sido expandida da árvoreoriginal. SEQ ID NO : 2 (de Oryza sativa) e SEQ ID NO : 4 (de Arabidopsisthaliana) são indicadas em sua posição na árvore preparada com uma setanegra. A origem da Clareira de interesse está marcada com um círculo.
Fig. 4 é um alinhamento de seqüências de polipeptídeo MYB-TF. As seqüências foram alinhadas usando o programa AlignX de Vector NTIsuite (InforMax, Bethesda, MD). Alinhamento múltiplo foi feito com umapenalidade de abertura de lacuna de 10 e uma extensão de lacuna de 0,01.Adição manual menor também foi realizada onde necessário para melhorarposição de algumas regiões conservadas. A linha mostrada indica a separaçãode seqüências de polipeptídeo MYB-TF úteis nos métodos da invenção, eoutras seqüências de polipeptídeo MYB-TF. As duas repetições MYB (R2 eR3) estão pesadamente contidas dentro de retângulo através de todas asseqüências mostradas. As 3 hélices dentro destas duas repetições estãolevemente contidas dentro de retângulos. Os resíduos Trp (W) conservadosestão marcados com uma seta. O domínio MYB4 na terminação-C dasseqüências de polipeptídeo está mais pesadamente contido dentro deretângulo mas apenas através das seqüências de polipeptídeo MYB-TF úteisna realização dos métodos da invenção.
Fig. 5 mostra um veto para expressão em Oryza sativa de umaseqüência de ácido nucleico de Oryza sativa codificadora de um polipeptídeoMYB-TF, sob o controle de um promotor GOS2 (pG0S2) ou de um promotorprolamina (pProl) ou de um promotor beta-expansina (pExp).
Fig. 6 detalha exemplos de seqüências úteis na realização dosmétodos de acordo com a presente invenção.
Exemplos
A presente invenção agora será. descrita com referência aosseguintes exemplos, que são apenas por meio de ilustração. Os seguintesexemplos não são intencionados para completamente definirem oudiferentemente limitarem o escopo da invenção.
Exemplo 1 : Identificação de seqüências relacionadas coma seqüência de ácido nucleico usada nos métodos da invenção
Seqüências (cDNA de comprimento total, ESTs ou genômico)relacionadas com a seqüência de ácido nucleico usada nos métodos dapresente invenção foram identificadas dentre aquelas mantidas no banco dedados de Nucleotídeos Entrez Nucleotídeos no National Center forBiotechnology Information (NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) usando asferramentas de pesquisa de seqüência de banco de dados, tal como Ferramentade Alinhamento Local Básico [Basic Local Alignment Tool] (BLAST)(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; e Altschul et al. (1997)Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). O programa é usado para encontrarregiões de similaridade local entre seqüências por comparação de seqüênciasde ácido nucleico ou de polipeptídeo com os banco de dados de seqüências epelo cálculo da significância estatística de combinações. Por exemplo, opolipeptídeo codificado pela seqüência de ácido nucleico da presenteinvenção foi usado para o algoritmo TBLASTN, com ajustes pré-estabelecidos e o filtro para ignorar set off de seqüências de complexidadebaixa. O resultado da análise foi visto por comparação pareada, e classificadode acordo com o escore de probabilidade (valor-E), onde o escore reflete aprobabilidade de que um alinhamento particular ocorre ao acaso (quantomenor o valor-E, mais significativo é o hit). Em adição aos valores-E,comparações também foram classificadas por identidade percentual.Identidade percentual refere-se ao número de nucleotídeos (ou aminoácidos)idênticos entre duas seqüências de ácido nucleico (ou de polipeptídeo)comparadas sobre um comprimento particular. Em algumas situações, osparâmetro pré-estabelecidos podem ser ajustados para modificar aestringência da pesquisa. Por exemplo o valor-E pode ser aumentado paramostrar combinações menos estringentes. Neste modo, combinações curtasquase exatas podem ser identificadas.
A Tabela abaixo proporciona uma lista de seqüências de ácidonucleico relacionadas com a seqüência de ácido nucleico usada nos métodosda presente invenção.
Tabela A: Seqüências de ácido nucleico relacionadas com aseqüência de ácido nucleico usada nos métodos da presente invenção
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Em algumas situações, as seqüências relacionadas têm sidotentativamente montadas e publicamente descritas por instituições depesquisa, tal como The Institute for Genomic Research (TIRG). O banco dedados de Ortólogos de Gene Eucariótico (EGO) pode ser usado paraidentificar tais seqüências relacionadas, quer pela pesquisa de palavra-chavequer pelo uso de algoritmo BLAST com a seqüência de ácido nucleico ou depolipeptídeo de interesse. O resultado de uma tal pesquisa pode ser vista emFigura 2.
Exemplo 2: Alinhamento de seqüências de polipeptídeo relevantes
AlignX do Vector NTI (Invitrogen) é baseado no algoritmopopular Clustal de alinhamento progressivo (Thompson et ai. (1997) NucleicAcids Res 25:4876-4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31:3497-3500). Uma árvore filogenética pode ser construída usando um algoritmo deagrupamento de junção de vizinhos. Valores pré-estabelecidos são para apenalidade de abertura de lacuna de 10, para a penalidade de extensão delacuna de 0,1 e a matriz de peso selecionada é Blosum 62 (se polipeptídeossão alinhados).
O resultado do alinhamento de seqüências múltiplas usando ospolipeptídeos relevantes em identificação daqueles úteis na realização dosmétodos da invenção é mostrado em Figura 4. As seqüências foram alinhadasusando o programa AlignX de Vector NTI suite (InforMax, Bethesda, MD).Alinhamento de seqüências múltiplas foi feito com uma penalidade deabertura de lacuna de 10 e uma extensão de lacuna de 0,01. Adição manualmenor também foi realizada onde necessário para melhorar a posição dealgumas regiões conservadas.
A linha mostrada indica a separação de seqüências depolipeptídeo MYB-TF úteis na realização dos métodos da invenção, e outrasseqüências de polipeptídeo MYB-TF. As duas repetições MYB (R2 e R3)estão pesadamente contidas em retângulo através de todas as seqüênciasmostradas. Os resíduos de Trp (W) conservados estão marcados com umaseta. O domínio MYB4 na terminação-C das seqüências de polipeptídeoalinhadas está pesadamente contido em retângulo mas apenas para asseqüências de polipeptídeo MYB-TF que são úteis para na realização dosmétodos da invenção.
Exemplo 3: Cálculo da identidade percentual globalentre seqüências de polipeptídeo úteis na realização dos métodos dainvenção
Percentagens globais de similaridade e identidade entreseqüências de polipeptídeo de comprimento total úteis na realização dosmétodos da invenção foram determinadas usando um dos métodos disponíveisna arte, o programa de computador MatGAT (Ferramenta de AlinhamentoGlobal de Matriz [Matrix Global Alignment Tool]) (BMC Bioinformatics.2003 4:29. MatGAT: uma aplicação que gera matrizes desimilaridade/identidade usando as seqüências de proteína ou de DNA.Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; programa hospedado por LedionBitincka). Programa de computador MatGAT gera matrizes desimilaridade/identidade para seqüências de proteína ou DNA sem anecessidade de pré-alinhamento dos dados. O programa realiza uma série dealinhamentos pareados usando o algoritmo de alinhamento global de Myers eMiller (com uma penalidade de abertura de lacuna de 12, e uma penalidade deextensão de lacuna de 2), calcula similaridade e identidade usando porexemplo Blosum 62 (para polipeptídeos), e então posiciona os resultados emuma matriz de distância. Similaridade de seqüência é mostrada em metadeinferior da linha divisória e identidade de seqüência é mostrada na metadesuperior da linha divisória diagonal.
Parâmetros usados na comparação foram:
Matriz de escore: Blosum62
PrimeiraLacuna: 12
Lacuna de extensão: 2
Resultados da análise de programa de computador sãomostrados em Tabela B para a identidade e similaridade global docomprimento total das seqüências de polipeptídeo (excluindo as seqüências depolipeptídeo parciais). Identidade percentual é dada acima da diagonal esimilaridade percentual é dada abaixo da diagonal.
A identidade percentual entre as seqüências de polipeptídeoúteis na realização dos métodos da invenção varia entre 40 % e 56% deidentidade de aminoácido comparada com SEQ ID NO: 2.
Tabela B: Resultados de MatGAT para similaridade eidentidade globais sobre o comprimento total das seqüências de polipeptídeoMYB-TF úteis na realização dos métodos da invenção.
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O domínio MYB4 conservado como representado pela SEQID NO: 28 (DDDFSSFLDSLIND) está compreendido em SEQ ID NO: 2(coordenadas de aminoácido 231-244; veja Figura 4). Quando a identidadepercentual é calculada entre o domínio MYB4 conservado das seqüências depolipeptídeo úteis na realização dos métodos da invenção e o domínio MYB4conservado como representado pela SEQ ID NO: 28 (em vez de entre ospolipeptídeos de comprimento total), então é alcançada pelo menos 60% deidentidade de aminoácido. Por exemplo, se cinco resíduos de aminoácido deum domínio MYB4 conservado diferirem quando alinhados com o domínioMYB4 conservado como representado pela SEQ ID NO: 28, é entãocalculado 64% de identidade de aminoácido.
Exemplo 4: Identificação de domínios compreendidosnas seqüências de polipeptídeo úteis na realização dos métodos dainvenção
O banco de dados de Recurso Integrado de Famílias deProteínas, Domínios e Sítios (InterPro) é uma interface integrada para osbancos de dados de assinatura comumente usados para pesquisas baseadas emseqüência e texto. O banco de dados InterPro combina estes bancos de dados,que usam metodologias diferentes e graus variados de informação biológicasobre proteínas bem caracterizadas para derivar assinaturas de proteína.Bancos de dados colaboradores incluem SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL,PRINTS, ProDom e Pfam, Smart e TIRGFAMs, cada banco de dadospossuindo seus próprios algoritmos de pesquisa e números de acesso deentrada. InterPro está hospedado no European Bioinformatics Institute noReino Unido.
Os resultados de varredura do interPro da seqüência depolipeptídeo como representada pela SEQ ID NO: 2 são apresentados emTabela C e Figuras 1 e 4.Tabela C: Resultados de varredura de InterPro da seqüência depolipeptídeo como representada pela SEQ ID NO: 2.
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Exemplo 5: Clonagem da seqüência de ácido nucleicousada nos métodos da invenção
Manipulação de DNA: a não ser que seja enunciado de outromodo, técnicas de DNA recombinante são realizadas de acordo comprotocolos padrão descritos em (Sambrook (2001) Molecular Cloning: alaboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH,New York) ou em Volumes 1 e 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocolsin Molecular Biology, Current Protocols. Métodos e materiais padrão paratrabalho molecular de platna são descritos em Plant Molecular BiologyLabfase (1993) by R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific PublicationsLtd (UK) e Blackwell Scientific Publications (UK).
A seqüência de ácido nucleico usada nos métodos da invençãofoi amplificada por PCR usando como modelo uma biblioteca de cDNA demudas de Oryza sativa personalizadas (em pCMV Sport 6.0; Invitrogen,Paisley, UK). PCR foi realizada usando Hifi Taq DNA polimerase emcondições padrão, empregando 200 ng de modelo em uma mistura de PCR de50 μl. Os iniciadores usados foram prm05233 (SEQ ID NO: 30; senso, códonde iniciação em negrito, sítio AttBl em itálico: 5'-GGGGA CAA GTTTG TA CAAAAA A GCA GGCTTAAA G4 ATGAAGCGGAAGCGG 3') e prm05234 (SEQ ID NO: 31; inverso, complementar, sítio AttB2em itálico: 5' GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAATCTCCCGAAAGATTACTGT 3'), que inclui os sítios AttB para recombinaçãoGateway. O fragmento de PCR amplificado foi purificado também usandométodos padrão. A primeira etapa do procedimento Gateway, a reação BP, foientão realizada, durante a qual o fragmento de PCR recombina in vivo com oplasmídeo pDC)NR201 para produzir, de acordo com a terminologia Gateway,um "clone de entrada", pMYB-TF. Plasmídeo pDC)NR201 foi adquirido daInvitrogen, como parte da tecnologia Gateway®.
Exemplo 6: Construção de vetor de expressão
O clone de entrada foi subseqüentemente usado em umareação LR com um vetor de destinação usado para transformação de Oryzasativa. Este vetor contém como elementos funcionais dentro de bordas de T-DNA: um marcador detectável de planta; um cassete de expressão demarcador selecionável; e um cassete Gateway intencionado pararecombinação LR in vivo com a seqüência de ácido nucleico de interesse jáclonada no clone de entrada.
Em exemplo, um promotor GOS2 de arroz (pGOS2; SEQ IDNO: 39) para expressão constitutiva estava localizado a montante destecassete Gateway.
Em um segundo exemplo,um promotor prolamina de arroz(pProl; SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 41) para expressão específica deendosperma estava localizado a montante deste cassete Gateway.
Em um terceiro exemplo, um promotor beta-expansina dearroz (pExp; SEQ ID NO: 40) para expressão em tecidos de expansão jovensestava localizado a montante deste cassete Gateway.
Após a etapa de recombinação LR, os vetores de expressãoresultante pGOS2::MYB-TF, pProl::MYB-TF, e pExp::MYB-TF (Figura 5)foram independentemente transformados em cepa LBA4044 deAgrobacterium com métodos bem conhecidos na arte.
Exemplo 7: Transformação de plantaTransformação de arroz
As duas cepas de Agrobacterium contendo cada uma um vetorde expressão, foram usadas independentemente para transformar plantas deOryza sativa. Sementes secas maduras de arroz japonica cultivar Nipponbareforam descascadas. Esterilização foi realizada incubando por um minuto emetanol 70%, seguido por 30 minutos em HgCl2 0,2%, seguido por 6 lavagensde 15 minutos cada com água estéril. As sementes estéreis foram entãogerminadas sobre um meio contendo 2,4-D (meio de indução de calo). Apósincubação no escuro por quatro semanas, caules embriogênicos, derivados deescutelo foram excisados e propagados sobre o mesmo meio. Após duassemanas, os caules foram multiplicados ou propagados por sub-cultura sobreo mesmo meio por outras 2 semanas. Pedaços de calo embriogênico foramsub-cultivados sobre meio fresco 3 dias antes do co-cultivo (para reforçar aatividade de divisão celular).
Cepa LBA4404 de Agrobacterium contendo o vetor deexpressão foi usada para co-cultivo. Agrobacterium foi inoculada sobre meioAB com os antibióticos apropriados e cultivada por 3 dias a 28°C. Asbactérias foram então coletadas e suspensas em meio de co-cultivo líquidopara uma densidade (OD600) de cerca de 1. A suspensão foi então transferidapara uma placa de Petri e os caules imersos na suspensão por 15 minutos. Ostecidos de calo foram então secos sobre papel de filtro e transferidos parameio de co-cultivo, solidificado e incubados 3 dias no escuro a 25°C. Calosco-cultivados foram crescidos sobre meio contendo 2,4-D por 4 semanas noescuro a 28°C na presença de um agente de seleção. Durante este período, sedesenvolveram ilhotas de calo resistentes rapidamente crescendo na luz, opotencial embriogênico foi liberado e os brotos se desenvolveram nas quatro acinco semanas seguintes. Brotos foram excisados dos calos e incubados por 2a 3 semanas sobre meio contendo auxina do qual foram transferidos para osolo. Brotos endurecidos foram crescidos sob umidade alta e dias curtos emuma estufa.
Aproximadamente 35 transformantes de arroz TOindependentes foram gerados por construto. Os transformantes primáriosforam transferidos de uma câmara de cultura e de tecido para uma estufa.
Após uma análise de PCR quantitativa para verificar o número de cópias deinserto de T-DNA5 apenas plantas transgênicas de cópia única que exibiramtolerância ao agente de seleção foram mantidas para colheita de semente TI.Sementes foram então colhidas três a cinco meses após o transplante. Ométodo rendeu transformantes de local único em uma taxa de acima de 50%(Aldemita e Hodgesl996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
Exemplo 8: Procedimento de avaliação fenotípica
6.1 Configuração de avaliação
Aproximadamente 35 transformantes de arroz TOindependentes foram gerados. Os transformantes primários foram transferidosde uma câmara de tecido de cultura para uma estufa para crescimento ecolheita de semente TI. Foram retidos cinco a sete eventos independentes,dos quais a progênie Tl segregou 3:1 para presença/ausência do transgene.Para cada um destes eventos, aproximadamente 10 mudas Tl contendo otransgene (hetero- e homo-zigotos) e aproximadamente 10 mudas Tl faltantesde transgene (nulizigotos) foram selecionadas por monitoração de expressãode marcador visual. As plantas transgênicas e os nulizigotos correspondentesforam crescidos lado a lado em posições aleatórias. Condições de estufaforam de dias curtos (12 horas de luz), 28°C na luz e 22°C no escuro, e umaumidade relativa de 70%.
No caso de ser realizada uma avaliação de geração T2, oprocedimento foi o mesmo que o para a geração Tl mas com mais indivíduospor evento. Do estágio de semeadura até o estágio de maturidade as plantasforam passadas sete vezes através de uma cabine de imagem digital. Em cadainstante de tempo imagens digitais (2048x1536 pixéis, 16 milhões de cores)foram tiradas de cada planta de pelo menos 6 ângulos diferentes. Biomassaacima do solo foi deduzida das imagens usando programa de computadorapropriado.
Para medir os parâmetros relacionados com raiz, as plantasforam crescidas em potes especialmente projetados com fundos transparentespara permitir visualização das raízes. Uma câmara digital registrou imagensatravés do fundo do pote durante o crescimento de planta. Características deraiz tais como área projetada total (que pode ser correlacionada com o volumetotal de raiz), diâmetro e comprimento médios de raízes acima de uma certolimite de espessura (comprimento de raízes grossas, ou comprimento de raizgrossa) foram deduzidas da imagem usando programa de computadorapropriado. Mudanças destes parâmetros refletem modificações em biomassade raiz, por exemplo, área de raiz aumentada, comprimento de raiz aumentadoou número aumentado de raízes grossas são todos indicativos de biomassa deraiz aumentada.
6.2 Análise estatística: teste-F
Uma ANOVA (análise de variância) de dois fatores foi usadacomo um modelo estatístico para avaliação geral das característicasfenotípicas de planta. Um teste-F foi realizado em todos os parâmetrosmedidos de todas as plantas de todos os eventos transformados com o gene dapresente invenção. O teste-F foi realizado para checar um efeito do gene sobretodos os efeitos de transformação e para verificar um efeito geral do gene,também conhecido como um efeito de gene global. O limite para significânciapara um efeito de gene global verdadeiro foi ajustado em um nível deprobabilidade de 5% para o teste-F. Um valor de teste-F significativo apontapara um efeito de gene, significando que não é apenas a mera presença ouposição do gene que é causadora das diferenças em fenótipo.
6.3 Parâmetros medidos
Medida de parâmetro relacionado com biomassaDo estágio de semeadura até o estágio de maturidade asplantas foram passadas várias vezes através de uma cabine de imagem digital.Em cada instante de tempo imagens digitais (2048x1536 pixéis, 16 milhões decores) foram tiradas de cada planta de pelo menos 6 ângulos diferentes.
A área de planta acima de solo (ou biomassa foliar) foideterminada pela contagem do número total de pixéis sobre as imagensdigitais das partes de planta acima do solo discriminada do fundo. Este valorfoi tomado na média para as figuras tiradas no mesmo instante de tempo deângulos diferentes e foi convertido em um valor de superfície físicaexpressado em mm quadrado por calibração. Experimentos mostram que aárea de planta acima do solo medida por este modo correlaciona com abiomassa de partes de planta acima do solo. A área acima de solo é a áreamedida no instante de tempo no qual a planta havia alcançado sua biomassafoliar máxima. O vigor inicial é a área de planta (muda) acima do solo trêssemanas após a germinação.
Em adição, outro parâmetro foi deduzido das imagens dabiomassa cima do solo antes da floração: o índice de verdor, que é aproporção (expressada como %) de pixéis verdes e verdes escuros na últimaimagem antes da floração.
Aumento em biomassa de raiz é expressado como um aumentona biomassa de raiz total (medida como a biomassa máxima de raízesobservadas durante o período de vida de uma planta); ou como um aumentono índice de broto/raiz (medido como a razão entre massa de raiz e massa debroto no período de crescimento ativo de raiz e broto); ou como um aumentoem raízes grossas; ou como um aumento em raízes finas.
Medições de parâmetro relacionado com semente
As panículas primárias maduras foram colhidas, contadas,ensacadas, rotuladas com código de barras e então secas por três dias em umforno a 37°C. As panículas foram então debulhadas e todas as sementes foramcoletadas e contadas. As cascas cheias foram separadas das vazias usando umdispositivo de sopro de ar. As cascas vazias foram descartadas e a fraçãorestante foi de novo contada. As cascas cheias foram pesadas em uma balançaanalítica. O número de sementes cheias foi determinado pela contagem donúmero de cascas cheias que permaneceram após a etapa de separação. Opeso total de sementes por planta foi medido pela pesagem de todas as cascascheias colhidas de uma planta. O número total de sementes por planta foimedido pela contagem do número de cascas colhidas de uma planta. O pesode mil grãos [Thousand Kernel Weight] (TKW) é extrapolado do número desementes cheias e seu peso total. O índice de Ceifa [Harvest Index] (HI) napresente invenção é definido como a razão entre o peso total de sementes porplanta e a área (mm2 ) acima do solo, multiplicada por um fator 10 . O númerototal de flores por panícula como definido na presente invenção é a razãoentre o número total de sementes e o número de panículas primárias maduras.A taxa de enchimento de semente como definida na presente invenção é aproporção (expressada como uma %) do número de sementes cheias sobre onúmero total de sementes (ou flósculos).
Exemplo 9: Resultados da avaliação fenotípica das plantastransgênicas de arroz compreendendo a seqüência de ácido nucleicocodificadora de um polipeptídeo MYB-TF sob o controle de umpromotor constitutivo
Como apresentado em Tabela D, vigor de muda ememergência, número de raízes grossas, índice de verdor (antes da floração),taxa de enchimento de semente, peso total de sementes por planta, número desementes cheias, e índice de ceifa são aumentados nas plantas transgênicasconstitutivamente expressando uma seqüência de ácido nucleico codificadorade um polipeptídeo MYB-TF, comparadas com as plantas de controle, nageração T1.
Tabela D mostra o aumento percentual médio em vigor demuda em emergência, número de raízes grossas, índice de verdor (antes dafloração), taxa de enchimento de semente, peso total de sementes por planta,número de sementes cheias, e índice de ceifa dos dois melhores eventostransgênicos independentes, comparados com as plantas de controle, nageração TI.
<table>table see original document page 65</column></row><table>
Exemplo 10: Resultados da avaliação fenotípica dasplantas transgênicas de arroz compreendendo a seqüência de ácidonucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF sob o controle de umpromotor específico de endosperma
Como apresentado em Tabela Ε, o peso total de sementes porplanta, número de sementes cheias e índice de ceifa são aumentados nasplantas transgênicas com expressão preferencialmente aumentada de umaseqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF noendosperma, comparado com plantas de controle, tanto na geração Tl quantona geração T2.
Tabela E mostra o aumento percentual médio em rendimento(peso total de sementes por planta), no número de sementes cheias, e noíndice de ceifa, de eventos transgênicos independentes comparados complantas de controle, nas gerações T1 e T2.
<table>table see original document page 65</column></row><table>
O número total de sementes, a taxa de enchimento e o vigor demuda em emergência também são aumentados nas plantas transgênicaspossuindo preferencialmente expressão aumentada de uma seqüência de ácidonucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF no endosperma (de umasemente de planta), comparadas com as plantas de controle.
Exemplo 11: Resultados da avaliação fenotípica dasplantas transgênicas de arroz compreendendo a seqüência de ácidonucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF sob o controle de umpromotor para expressão em tecidos de expansão jovens
Plantas transgênicas expressando uma seqüência de ácidonucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF sob o controle depromotor beta-expansina, para expressão em tecidos de expansão jovens,mostram índice de ceifa aumentado comparadas com plantas de controle, nageração Tl (veja Tabela F).
Tabela F mostra o aumento percentual médio em índice deceifa de eventos transgênicos independentes comparados com plantas decontrole, na geração Tl
<table>table see original document page 66</column></row><table>
Exemplo 12: Exemplos de transformação de outrascolheitas
Transformação de milho
Transformação de milho (Zea mays) é realizada com umamodificação do método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6):745-50. Transformação é dependente de genótipo em milho e apenasgenótipos específicos são suscetíveis à transformação e à regeneração. Alinhagem natural Al88 (University of Minnesota) ou híbridos com Al 88como uma planta parental são fontes boas de material doador paratransformação, mas outros genótipos podem ser usados também com sucesso.Espigas são colhidas da planta de milho aproximadamente 11 dias após apolinização (DAP) quando o comprimento do embrião maduro é cerca de 1 a1,2 mm. Embriões imaturos são co-cultivados com Agrobacteriumtumefaciens contendo o vetor de expressão, e plantas transgênicas sãorecuperadas através de organogênese. Embriões excisados são crescidos sobremeio de indução de calo, então meio de regeneração de milho, contendo oagente de seleção (por exemplo imidazolinona mas vários marcadores deseleção podem ser usados). As placas de Petri são incubadas na luz a 25°Cpor 2-3 semanas, ou até brotos se desenvolverem. Os brotos verdes sãotransferidos de cada embrião para meio de enraizamento de milho e incubadosa 25°C por 2-3 semanas, até desenvolvimento de raízes. Os brotos enraizadossão transplantados para solo na estufa. Sementes T1 são produzidas dasplantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contêm uma cópiaúnica do inserto de T-DNA.
Transformação de trigo
Transformação de trigo é realizada com o método descrito porIshida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. O cultivar Bobwhite(disponível da CEMMYT, México) é comumente usado em transformação.Embriões imaturos são co-cultivados com Agrobacterium, os embriões sãocrescidos in vitro sobre meio de indução de calo, então sobre meio deregeneração, contendo o agente de seleção (por exemplo imidazolinona masvários marcadores de seleção podem ser usados). As placas de Petri sãoincubadas na luz a 25°C por 2-3 semanas, ou até brotos se desenvolverem. Osbrotos verdes são transferidos de cada embrião para meio de enraizamento eincubados a 25°C por 2-3 semanas, até desenvolvimento de raízes. Os brotosenraizados são transplantados para solo na estufa. Sementes T1 sãoproduzidas das plantas que exibem tolerância ao agente de seleção e quecontêm uma cópia única do inserto de T-DNA.
Transformação de feijão-soja
Feijão-soja é transformado de acordo com uma modificação dométodo descrito em Texas A&M Patente US 5.164.310. Diversas variedadescomerciais de feijão-soja são suscetíveis à transformação por este método. Ocultivar Jack (disponível da Illinois Seed Foundation) é comumente usadopara transformação. Sementes de feijão-soja são esterilizadas para semeadurain vitro. O hipocótilo, a radícula e um cotilédone são excisados de mudasjovens de sete dias de idade. O epicótilo e o cotilédone restante sãoadicionalmente crescidos para desenvolver nodos axilares. Os nodos axilaressão excisados e incubados com Agrobacterium tumefaciens contendo o vetorde expressão. Após tratamento de co-cultivo, os explantes são lavados etransferidos para meio de seleção. Brotos regenerados são excisados eposicionados sobre um meio de alongamento de broto. Brotos não maislongos do que 1 cm são posicionados sobre meio de enraizamento até raízesse desenvolverem. Os brotos enraizados são transplantados para solo naestufa. Sementes T1 são produzidas das plantas que exibem tolerância aoagente de seleção e que contêm uma cópia única do inserto de T-DNA.
Transformação de colza/canola
Hipocótilos e pecíolos cotiledonários de mudas jovens de 5-6dias de idade são usados como explantes para cultura de tecido etransformados de acordo com Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188).O cultivar comercial Westar (Agriculture Canada) é a variedade padrão usadapara transformação, mas outras variedades também podem ser utilizadas.Sementes de canola são esterilizadas na superfície para semeadura in vitro. Osexplantes de pecíolo de cotilédone com o cotilédone preso são excisados dasmudas in vitro, e inoculados com Agrobacterium (contendo o vetor deexpressão) por imersão da extremidade cortada do explante de pecíolo nasuspensão bacteriana. Os explantes são então cultivados por 2 dias sobre meioMSBAP-3 contendo 3 mg/l de BAP, 3% de sacarose, 0,7 % de Phytagar a23°C, 16 h de luz. Após dois dias de co-cultura com Agrobacterium, osexplantes de pecíolo são transferidos para meio MSBAP-3 contendo 3 mg/l deBAP, cefotaxima, carbenicilina, ou timentina (300 mg/l) por 7 dias, e entãocultivados sobre meio MSBAP-3 com cefotaxima, carbenicilina, ou timentinae agente de seleção até regeneração de raiz. Quando os brotos são de 5-100mm de comprimento, eles são cortados e transferidos para meio dealongamento de broto (MSBAP-0.5, contendo 0,5 mg/l de BAP). Brotos decerca de 2 cm de comprimento são transferidos para o meio de enraizamento(MSO) para indução de raiz. Os brotos enraizados são transplantados parasolo na estufa. Sementes Tl são produzidas das plantas que exibem tolerânciaao agente de seleção e que contêm uma cópia única do inserto de T-DNA.
Transformação de alfafa
Um clone de regeneração de alfafa (Medicago sativa) étransformado usando o método de (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119:839-847). Regeneração e transformação de alfafa são dependentes degenótipo e portanto uma planta de regeneração é requerida. Métodos paraobter plantas de regeneração têm sido descritos. Por exemplo, estes podem serselecionados do cultivar Rangelander (Agriculture Canada) ou de qualqueroutra variedade comercial de alfafa como descrito por Brovm DCW e AAtanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112).Alternativamente, a variedade RA3 (University of Wisconsin) tem sidoselecionada para uso em cultura de tecido (Walker et al., 1978 Am J Bot65:654-659). Explantes de pecíolo são co-cultivados com uma cultura noturnade Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al, 1999 PlantPhysiol 119: 839-847) ou LBA4404 contendo o vetor de expressão. Osexplantes são co-cultivados por 3 d no escuro sobre meio de indução SHcontendo 288 mg/L de Pro, 53 mg/L de tioprolina, 4,35 g/L de K2SO4, e 100μm [sic] de acetosiringinona. Os explantes são lavados em meio deMurashige-Skoog de meia-força (Murashige e Skoog, 1962) e plaqueadossobre o mesmo meio de indução SH sem acetosiringinona mas com um agentede seleção adequado e antibiótico apropriado para inibir crescimento deAgrobacterium. Após várias semanas, embriões somáticos são transferidospara meio de desenvolvimento BOÍ2Y não contendo reguladores decrescimento, nem antibióticos, e 50 g/ L de sacarose. Embriões somáticos sãosubseqüentemente germinados sobe meio Murashige-Skoog de meia-força.Mudas enraizadas foram transplantadas para potes em uma estufa. SementesT1 são produzidas das plantas que exibem tolerância ao agente de seleção eque contêm uma cópia única do inserto de T-DNA.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> CropDesign N.V.
<120> "PLANTAS POSSUINDO RENDIMENTO AUMENTADO E UM MÉTODO PARAPREPARAR AS MESMAS"
<130> PF58329<160> 41
<170> PatentIn versão 3.3
<210> 1
<211> 828
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 1
atgaagcgga agcggccggc ggcgctgcgc ggcggggagg aggcggcggc ggcggcgctg 60
aagcgtgggc catggacgcc cgaggaggac gaggtgctgg cgcggttcgt ggcgcgggag 120
gggtgcgacc ggtggcgcac gctgccgcgg cgcgcgggcc tgctgcgctg cggcaagagc 180
tgccgcctcc ggtggatgaa ctacctccgc cccgacatca agcgctgccc catcgccgac 240
gacgaggagg acctcatcct ccgcctccac cgcctcctcg gcaaccggtg gtcgctgatc 300
gccgggaggt tgccggggcg cacggacaac gagatcaaga actactggaa ctcgcatctc 360
agcaagaagc tcatcgcgca gggcatcgac ccgcggacgc acaagccgct gacggccgcc 420
gccgatcact ccaacgccgc cgctgccgtc gccgccactt cttacaagaa ggcggtgccg 480
gccaagccgc cgaggacggc atcctcgccg gccgctggca ttgagtgcag cgacgatcgt 540
gcccgaccgg ccgacggtgg cggtgacttc gcagcgatgg tgagcgccgc cgatgccgag 600
ggattcgaag gaggatttgg cgatcagttc tgtgccgagg atgcagttca tggtggcttc 660
gacatgggtt ctgcttccgc catggtgggt gacgacgact tctcctcgtt tcttgattct 720
ctgatcaacg acgagcagtt aggcgatctc ttcgtcgtcg agggcaacga tcacgagcat 780
ggcaatggtg agattggtca tggagacgtc atggaatcca aacagtaa 828
<210> 2
<211> 275
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 2
Met Lys Arg Lys Arg Pro Ala Ala Leu Arg Gly Gly Glu Glu Ala Ala15 10 15
Ala Ala Ala Leu Lys Arg Gly Pro Trp Thr Pro Glu Glu Asp Glu Val
20 25 30
Leu Ala Arg Phe Val Ala Arg Glu Gly Cys Asp Arg Trp Arg Thr Leu
35 40 45
Pro Arg Arg Ala Gly Leu Leu Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg
50 55 60
Trp Met Asn Tyr Leu Arg Pro Asp Ile Lys Arg Cys Pro Ile Ala Asp65 70 75 80
Asp Glu Glu Asp Leu Ile Leu Arg Leu His Arg Leu Leu Gly Asn Arg
85 90 95
Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile
100 105 110
Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His Leu Ser Lys Lys Leu Ile Ala Gln Gly
115 120 125
Ile Asp Pro Arg Thr His Lys Pro Leu Thr .Ala Ala Ala Asp His Ser
130 135 140
Asn Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Thr Ser Tyr Lys Lys Ala Val Pro145 150 155 160Ala Lys Pro Pro Arg 165 Thr Ala Ser Ser Pro 170 Ala Ala Gly Ile Glu 175 CysSer Asp Asp Arg 180 Ala Arg Pro Ala Asp 185 Gly Gly Gly Asp Phe 190 Ala AlaMet Val Ser 195 Ala Ala Asp Ala Glu 200 Gly Phe Glu Gly Gly 205 Phe Gly AspGln Phe 210 Cys Ala Glu Asp Ala 215 Val His Gly Gly Phe 220 Asp Met Gly SerAla Ser Ala Met Val Gly Asp Asp Asp Phe Ser Ser Phe Leu Asp Ser225 230 235 240Leu Ile Asn Asp Glu 245 Gln Leu Gly Asp Leu 250 Phe Val Val Glu Gly 255 AsnAsp His Glu His 260 Gly Asn Gly Glu Ile 265 Gly His Gly Asp Val 270 Met Glu
Ser Lys Gln275
<210> 3
<211> 750
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 3
atgatgtcat gtggtgggaa gaagccagtg tctaagaaaa caacgccgtg ttgcacgaag 60
atggggatga agagaggacc atggacggtg gaggaagacg agattcttgt gagcttcatt 120
aagaaagaag gtgaaggacg gtggcgatcg cttcctaaga gagctggttt actcagatgt 180
ggaaagagct gtcgtctacg gtggatgaac tatctccgac cctcggttaa acgtggagga 240
attacgtcgg acgaggaaga tctcatcctc cgtcttcacc gcctcctcgg caacaggtgg 300
tcattgatcg cgggaaggat accgggaagg actgataatg aaattaagaa ctattggaac 360
actcatcttc gtaagaaact tttaaggcaa ggaattgatc ctcaaaccca caagcctctt 42 0
gatgcaaaca acatccataa accagaagaa gaagtttccg gtggacaaaa gtaccctcta 480
gagcctattt ctagttctca tactgatgat accactgtta atggcgggga tggagatagc 540
aagaacagta tcaatgtctt tggtggtgaa cacggctacg aagactttgg tttctgctac 600
gacgacaagt tctcatcgtt tcttaattcg ctcatcaacg atgttggtga tccttttggt 660
aatattatcc caatatctca acctttgcag atggatgatt gtaaggatgg gattgttgga 720
gcgtcgtctt ctagcttagg acatgactag 750
<210> 4
<211> 249
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 4
Met Met Ser Cys Gly Gly Lys Lys Pro Val Ser Lys Lys Thr Thr Pro1 5 10 15 Cys Cys Thr Lys 20 Met Gly Met Lys Arg 25 Gly Pro Trp Thr Val 30 Glu GluAsp Glu Ile 35 Leu Val Ser Phe Ile 40 Lys Lys Glu Gly Glu 45 Gly Arg TrpArg Ser 50 Leu Pro Lys Arg Ala 55 Gly Leu Leu Arg Cys 60 Gly Lys Ser CysArg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg Gly Gly65 70 75 80Ile Thr Ser Asp Glu 85 Glu Asp Leu Ile Leu 90 Arg Leu His Arg Leu 95 LeuGly Asn Arg Trp 100 Ser Leu Ile Ala Gly 105 Arg Ile Pro Gly Arg 110 Thr AspAsn Glu Ile 115 Lys Asn Tyr Trp Asn 120 Thr His Leu Arg Lys 125 Lys Leu LeuArg
Ile145Glu
Asp
Tyr
Asn
Ile225Ala
Gln Gly130
His Lys
Pro Ile
Gly Asp
Glu Asp195Ser Leu210
Ser GlnSer Ser
Ile Asp
Pro Glu
Ser Ser165Ser Lys180
Phe Gly
Ile Asn
Pro Leu
Ser Ser245
Pro Gln Thr
135Glu Glu Val150
Ser His Thr
Asn Ser Ile
Phe Cys Tyr200
Asp Val Gly
215Gln Met Asp230
Leu Gly His
His Lys
Ser Gly
Asp Asp170Asn Val185
Asp AspAsp ProAsp CysAsp
Pro Leu Asp140
Gly Gln Lys155
Thr Thr Val
Phe Gly Gly
Lys Phe Ser205
Phe Gly Asn220Lys Asp Gly235
Ala Asn Asn
Tyr Pro Leu160
Asn Gly Gly175
Glu His Gly190
Ser Phe Leu
Ile Ile Pro
Ile Val Gly240
<210> 5
<211> 744
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum
<400> 5
atgagaaacc
gtagggttga
aacaaagaag
ggaaaaagct
attgctcccg
tcactaatag
actcacctga
aaccctcaac
tccatggcga
aagcaaaatt
gaccattatc
ataaatgaag
actcccttcg
ctacgaaaaaaaagagggccgcgaaggacggtcgtctccgatgaagaagactggaagaatgtaagaaattaactctcaccaaccaaacaaattatgacgaagcaacaacaatgatgatgcatcaaccaaa
agacaacgttatggacgccggtggcggactatggatgaattctcatcctcaccagggcgtgataagtcaaatcaccaccatcctccttcctgggagcaatagatcatgatattggtttcgatga
ggaaccaagagaagaagacgttacctaaactatctccgaccgccttcaccacagataacggggatcgatctcactcaaaccctcttcctggaagaccatcgatgtgttctaatttgggac
cgacgccgtg ttgcagcaaa 60agttattatc taattacatc 120gggctggtct tctccgatgc 180cttctgttaa acgtggccag 240gccttttagg gaatcggtgg 300aaataaagaa ctactggaat 360ctcgaacgca caagccttta 420cttcaccttc ttcatcatca 480ttcatgtcgt caacgctaac 540aagggatgat catgaacaat 600cttcttttct gaattcattg 660tctcacaagg atgggaatct 720 744
<210> 6
<211> 247
<212> PRT
<213> Gossypium hirsutum
<400> 6 Met Arg Asn Pro Thr Lys Lys Asp Asn Val Gly Thr Lys Thr Thr Pro1 5 10 15 Cys Cys Ser Lys 20 Val Gly Leu Lys Arg 25 Gly Pro Trp Thr Pro 30 Glu GluAsp Glu Leu 35 Leu Ser Asn Tyr Ile 40 Asn Lys Glu Gly Glu 45 Gly Arg TrpArg Thr 50 Leu Pro Lys Arg Ala 55 Gly Leu Leu Arg Cys 60 Gly Lys Ser CysArg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg Gly Gln65 70 75 80Ile Ala Pro Asp Glu 85 Glu Asp Leu Ile Leu 90 Arg Leu His Arg Leu 95 LeuGly Asn Arg Trp 100 Ser Leu Ile Ala Gly 105 Arg Ile Pro Gly Arg 110 Thr AspAsn Glu Ile 115 Lys Asn Tyr Trp Asn 120 Thr His Leu Ser Lys 125 Lys Leu IleSer Gln 130 Gly Ile Asp Pro Arg 135 Thr His Lys Pro Leu 140 Asn Pro Gln GlnLeu Ser Pro Ser Pro Pro Ser Leu Lys Pro Ser Pro Ser Ser Ser Ser145 150 155 160Ser Met Ala Lys Pro 165 Asn Asn Pro Pro Ser 170 Pro Leu Pro Val His 175 ValVal Asn Ala Asn 180 Lys Gln Asn Tyr Tyr 185 Asp Asp Gly Ser Asn 190 Glu AspHis Gln Gly 195 Met Ile Met Asn Asn 200 Asp His Tyr Gln Gln 205 Gln Gln AspHis Asp 210 Asp Val Phe Ser Ser 215 Phe Leu Asn Ser Leu 220 Ile Asn Glu AspAsp Asp Ala Leu Val Ser Asn Leu Gly Leu Ser Gln Gly Trp Glu Ser225 230 235 240Thr Pro Phe Asp Gln 245 Pro Lys
<210> 7<211> 993<212> DNA
<213> Lotus corniculatus<400> 7
atgaggaacc cgatagcatc atcatcaacg aacaagaaga agagcagtac tacaactggt 60
aatgaaaatg gcacgactgt tactactact ccgtgctgca gcaaagttgg gttgaagaga 120
gggccatgga caccggagga agacgaggtg ttggccagtt tcataaggaa agaaggcgaa 180
ggtcgctgga gaacgcttcc aaaaagagcc ggcctcctcc gctgcggtaa gagctgccgc 24 0
ctccgctgga tgaactacct ccgcccctct gtcaaacgcg gccagatcgc ccccgacgaa 300
gaagatctca tcctccgcct tcaccgcctc ctcggcaacc ggtggtcttt gatagcggga 360
agaattccgg gaagaactga taatgagata aagaacttct ggaacaccca tctcagcaag 420
aagcttatca gccaagggat tgatccaaga acccacaagc ctctcaaccc agaactatct 480
attccctctt cttccactac tccaccacca ccaccacctt ccaagcctct tcctgtgatc 540
acaaatcacc aaacacttca tgaaactact actcatcatc atctcaatat tgctagtgtc 600
aaccaagaat gtgatgaggg tcaatatcaa tatcaacaac ctcaagcagt agctgctgct 660
gcatatatgg tagctaatga tattcctgat gatgatgttc cttccatggg tcatctactt 720
gccaacaaca acaacaacca ggactacaat gatatcaatt attgttctga tgatatcttt 780
tcttccttcc tcaattctct gatcaatgag gatgctttct ctgcccagcg ccacctgcaa 84 0
tcggagcatc atgatgacct tgcacaggat cctgtaactt catcaacacc acaaggttat 900
aatggcattg gtgttgcatg ggaattgccc ctcatgcctg ctaatttcag ccaaaatgaa 960
cacagccatg aggttgatga tcatcacaaa tag 993
<210> 8
<211> 330
<212> PRT
<213> Lotus corniculatus
<400> ί ϊ Met Arg Asn Pro Ile Ala Ser Ser Ser Thr Asn Lys Lys Lys Ser Ser1 5 10 15 Thr Thr Thr Gly 20 Asn Glu Asn Gly Thr 25 Thr Val Thr Thr Thr 30 Pro CysCys Ser Lys 35 Val Gly Leu Lys Arg 40 Gly Pro Trp Thr Pro 45 Glu Glu AspGlu Val 50 Leu Ala Ser Phe Ile 55 Arg Lys Glu Gly Glu 60 Gly Arg Trp ArgThr Leu Pro Lys Arg Ala Gly Leu Leu Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg65 70 75 80Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg Gly Gln Ile
85 90 95Ala Pro Asp Glu Glu
Ile Leu
His Arg
100 105 110 Asn Arg Trp 115 Ser Leu Ile Ala Gly 120 Arg Ile Pro Gly Arg 125 Thr Asp AsnGlu Ile 130 Lys Asn Phe Trp Asn 135 Thr His Leu Ser Lys 140 Lys Leu Ile SerGln Gly Ile Asp Pro Arg Thr His Lys Pro Leu Asn Pro Glu Leu Ser145 150 155 160Ile Pro Ser Ser Ser 165 Thr Thr Pro Pro Pro 170 Pro Pro Pro Ser Lys 175 ProLeu Pro Val Ile 180 Thr Asn His Gln Thr 185 Leu His Glu Thr Thr 190 Thr HisHis His Leu 195 Asn Ile Ala Ser Val 200 Asn Gln Glu Cys Asp 205 Glu Gly GlnTyr Gln 210 Tyr Gln Gln Pro Gln 215 Ala Val Ala Ala Ala 220 Ala Tyr Met ValAla Asn Asp Ile Pro Asp Asp Asp Val Pro Ser Met Gly His Leu Leu225 230 235 240Ala Asn Asn Asn Asn 245 Asn Gln Asp Tyr Asn 250 Asp Ile Asn Tyr Cys 255 SerAsp Asp Ile Phe 260 Ser Ser Phe Leu Asn 265 Ser Leu Ile Asn Glu 270 Asp AlaPhe Ser Ala 275 Gln Arg His Leu Gln 280 Ser Glu His His Asp 285 Asp Leu AlaGln Asp 290 Pro Val Thr Ser Ser 295 Thr Pro Gln Gly Tyr 300 Asn Gly Ile GlyVal Ala Trp Glu Leu Pro Leu Met Pro Ala Asn Phe Ser Gln Asn Glu305 310 315 320His Ser His Glu Val 325 Asp Asp His His Lys 330
<210> 9
<211> 915
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<4 00> 9
atgatgaatc
aattcaaatc
gggttgaaga
aaagaaggtg
aaaagctgtc
gctcctgatg
ttgatagctg
catctcagca
aacccatctt
tttgcaccat
ccctctcaaa
gataatcatc
aacaattacg
gcatttgctg
ctgtgggaat
gggaaagctt
tatcttcatccaaacaaaaagaggaccgtgaaggtcgttggtctccgttgaagaagatctggagaattccagaaacttatcttcttcttccttcttctgacacaacaagcatgtgcttacgcggtgatgacacacagatccgccgccactcttag
aacagatcaaacagaagacagactgtagaagagaactcttgatgaattatcatcctccgcaggaagaacctaaccaagggaataatcccatcatcatcattcagggttgtcaacaacaactgtgtttactagagaatgatcatgatgaca
gacaaatcagacaacaactagaagatgaagcccaaacgagcttcgtccatctccaccgtcgataatgagaattgatcccaaatactaatcccaattactaggtaacttggagaggggatttcatttctggcctttgatcttctactcata
aaacaacaaacaccttgttgttttatcagactggtcttctccgtcaaacgttctcggcaattaaaaattagaactcacaaaccaaacaagtcactaacaattaatgatgtatggagacgaattcattgattatctgctgcatttcaccca
ttcaaattcacagtaaagtaatacatcaaaccgttgcggccggtcagatccaggtggtcattggaacacagcctcttaattactcctttttgaacctgatttctgcaatgcaatggtaatcaacgacgataccaccagctaaaccaagac
60120180240300360420480540600660720780840900915
<210> 10
<211> 304
<212> PRT
<213> Medicago truncatula<400> 10 Met Met Asn Leu Ser Ser Ser Thr Asp Gln Asp Lys Ser Glu Thr Thr1 5 10 15 Asn Ser Asn Ser Asn Ser Asn Pro Asn Lys Lys Gln Lys Thr Thr Thr 20 25 30 Thr Thr Pro Cys Cys Ser Lys Val Gly Leu Lys Arg Gly Pro Trp Thr 35 40 45 Val Glu Glu Asp Glu Val Leu Ser Glu Tyr Ile Lys Lys Glu Gly Glu 50 55 60 Gly Arg Trp Arg Thr Leu Pro Lys Arg Ala Gly Leu Leu Arg Cys Gly65 70 75 80Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Arg Pro Ser Val Lys 85 90 95 Arg Gly Gln Ile Ala Pro Asp Glu Glu Asp Leu Ile Leu Arg Leu His 100 105 110 Arg Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Ile Pro Gly 115 120 125 Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu Ser Lys 130 135 140 Lys Leu Ile Asn Gln Gly Ile Asp Pro Arg Thr His Lys Pro Leu Asn145 150 155 160Asn Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ile Pro Asn Thr Asn His Gln Thr 165 170 175 Ser Thr Pro Phe Phe Ala Pro Ser Ser Ser Asp His His His Pro Ile 180 185 190 Thr Ile Thr Asn Asn Glu Pro Asp Pro Ser Gln Thr Gln Gln Ala Gln 195 200 205 Gly Cys Gly Asn Leu Val Asn Asp Val Ser Ala Met Asp Asn His His 210 215 220 Val Leu Thr Asn Asn Asn Arg Gly Asp Tyr Gly Asp Asp Asn Gly Asn225 230 235 240Asn Asn Tyr Gly Gly Asp Asp Val Phe Thr Ser Phe Leu Asp Ser Leu 245 250 255 Ile Asn Asp Asp Ala Phe Ala Ala His Arg Ser Glu Asn Asp Pro Leu 260 265 270 Ile Leu Ser Ala Ala Pro Pro Ala Leu Trp Glu Ser Pro Pro Leu Met 275 280 285 Met Thr Ser Thr His Asn Phe Thr Gln Asn Gln Asp Gly Lys Ala Ser 290 295 300
<210> 11<211> 846<212> DNA
<213> Petunia hybrida<400> 11
atgagaaccc catcatcatc atcaacaaca agcaacaaag taacaccatg ttgtagcaag 60
gtagggttaa aaagaggtcc atggacacca gaagaagatg aaatattgac aaattatata 120
aataaagaag gagaaggacg gtggcgaacg ttgccaaaga aggcggggct cctccgttgt 180
ggaaaaagct gccgccttcg gtggatgaat tacctccgtc cttcagttaa acgtggccat 240
attgcacctg atgaagaaga tctcattctt cgcctccatc gtctccttgg caacaggtgg 300
tccttgatag ctgggagaat tccagggaga acagataatg agataaagaa ttattggaac 360
actcacctta gcaagaagtt aatcagtcac ggaatagatc ctagaactca caagccattg 420
aaaaactcta attcctcaag tgatgatatt accaacaaat tagcttcttc ttctcctcct 480
tcatcttcaa aagcaaatga tctcaatcca attctaagcc ccacttacat ttctagtttt 540
caaatggaag aaccattagg aaaaatcaat actcacccgg gagaaattac tagtcttgat 600
gatcaatatc aaagtaacgc gattcttgcc gagtatggtg atgatctgaa tattgcggtt 660
actattgagg aagatgttga aatgaattgt tgcacggatg atgttttctc ctctttcttg 720
aattctttga tcaatgaaga tatgttcgct tgccaaaacc aacaaaccaa cgggacgttc 780caagattttg atcctttcat ggcttcatca tctacacctt catctgatca atataatccc 840agttag 846
<210> 12<211> 281<212> PRT
<213> Petunia hybrida <400> 12 Met Arg Thr Pro Ser Ser Ser Ser Thr Thr Ser Asn Lys Val Thr Pro1 5 10 15 Cys Cys Ser Lys Val Gly Leu Lys Arg Gly Pro Trp Thr Pro Glu Glu 20 25 30 Asp Glu Ile Leu Thr Asn Tyr Ile Asn Lys Glu Gly Glu Gly Arg Trp 35 40 45 Arg Thr Leu Pro Lys Lys Ala Gly Leu Leu Arg Cys Gly Lys Ser Cys 50 55 60 Arg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg Gly His65 70 75 80Ile Ala Pro Asp Glu Glu Asp Leu Ile Leu Arg Leu His Arg Leu Leu 85 90 95 Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Ile Pro Gly Arg Thr Asp 100 105 110 Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu Ser Lys Lys Leu Ile 115 120 125 Ser His Gly Ile Asp Pro Arg Thr His Lys Pro Leu Lys Asn Ser Asn 130 135 140 Ser Ser Ser Asp Asp Ile Thr Asn Lys Leu Ala Ser Ser Ser Pro Pro145 150 155 160Ser Ser Ser Lys Ala Asn Asp Leu Asn Pro Ile Leu Ser Pro Thr Tyr 165 170 175 Ile Ser Ser Phe Gln Met Glu Glu Pro Leu Gly Lys Ile Asn Thr His 180 185 190 Pro Gly Glu Ile Thr Ser Leu Asp Asp Gln Tyr Gln Ser Asn Ala Ile 195 200 205 Leu Ala Glu Tyr Gly Asp Asp Leu Asn Ile Ala Val Thr Ile Glu Glu 210 215 220 Asp Val Glu Met Asn Cys Cys Thr Asp Asp Val Phe Ser Ser Phe Leu225 230 235 240Asn Ser Leu Ile Asn Glu Asp Met Phe Ala Cys Gln Asn Gln Gln Thr 245 250 255 Asn Gly Thr Phe Gln Asp Phe Asp Pro Phe Met Ala Ser Ser Ser Thr 260 265 270 Pro Ser Ser Asp Gln Tyr Asn Pro Ser
275 280
<210> 13
<211> 951
<212> DNA
<213> Populus tremuloides
<400> 13
atgagaaagc caacttcagc tacaacagcaatcaaggtag ggttaaagag aggaccgtggtatatcaaga aagaaggtga aggccggtggcgctgtggca agagctgccg tctccgctggggccagatcg ccgatgatga agaagatctcaggtggtcat tgatagctgg gagaattccatggaacacgc acctgagtaa gaagctgata
gaatcagcag caaagaccac cccatgctgc 60
acaccagaag aagatgaact ccttgttaac 120
cgaactttac ccaagaaagc cggtctcctc 180
atgaactacc tccgcccttc tgttaaacgt 240
attctccgcc tccatcgact cctaggcaat 300
gggcgtacag ataatgaaat aaagaattac 360
agccaaggaa ttgatccaag aacccataag 420cctctcaatc ctcaatcttt tgatcaatca aaaccttctt tgccgaaggc gaatctgcac 480
caagaacgcc taaaagaacc tattaagaat attgtttctt ctggtttgga agaaactact 540
agtggcagta ctcgcataat caacagagag aatgagtatt ttcaaaacaa cattaatgcc 600
cacctggatg aacagtatca cgcagaccat tttattgcaa gtcatggcta tacaagtttg 660
ctgaattatg atggtacttc tgggatggat ttgagaggcg atcaaagtct tggtattgga 720
gaagctgatc aagatatcaa ttccggcacc gacgatgtgt tttcgttcct caattcgctc 780
ataaatgagg aggctttgca acaacatcaa atccttaatg tgcctaatgt gaattgtgca 840
ccacccagtt cagatccttt tgtttcaatt gctgccacaa catttggact cggaactggc 900
tgggaatcta ctctcatgtc ttctgctttt aacaaaaatg attccaaata g 951
<210> 14<211> 316<212> PRT
<213> Populus tremuloides<400> 14
Met Arg Lys Pro Thr Ser Ala Thr Thr Ala Glu Ser Ala Ala Lys Thr1 5 10 15
Thr Pro Cys Cys Ile Lys Val Gly Leu Lys Arg Gly Pro Trp Thr Pro
20 25 30
Glu Glu Asp Glu Leu Leu Val Asn Tyr Ile Lys Lys Glu Gly Glu Gly
35 40 45
Arg Trp Arg Thr Leu Pro Lys Lys Ala Gly Leu Leu Arg Cys Gly Lys
50 55 60
Ser Cys Arg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg65 70 75 80
Gly Gln Ile Ala Asp Asp Glu Glu Asp Leu Ile Leu Arg Leu His Arg
85 90 95
Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Ile Pro Gly Arg
100 105 110
Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu Ser Lys Lys
115 120 125
Leu Ile Ser Gln Gly Ile Asp Pro Arg Thr His Lys Pro Leu Asn Pro
130 135 140
Gln Ser Phe Asp Gln Ser Lys Pro Ser Leu Pro Lys Ala Asn Leu His145 150 155 160
Gln Glu Arg Leu Lys Glu Pro Ile Lys Asn Ile Val Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Glu Glu Thr Thr Ser Gly Ser Thr Arg Ile Ile Asn Arg Glu Asn Glu
180 185 190
Tyr Phe Gln Asn Asn Ile Asn Ala His Leu Asp Glu Gln Tyr His Ala
195 200 205
Asp His Phe Ile Ala Ser His Gly Tyr Thr Ser Leu Leu Asn Tyr Asp
210 215 220
Gly Thr Ser Gly Met Asp Leu Arg Gly Asp Gln Ser Leu Gly Ile Gly225 230 235 240
Glu Ala Asp Gln Asp Ile Asn Ser Gly Thr Asp Asp Val Phe Ser Phe
245 250 255
Leu Asn Ser Leu Ile Asn Glu Glu Ala Leu Gln Gln His Gln Ile Leu
260 265 270
Asn Val Pro Asn Val Asn Cys Ala Pro Pro Ser Ser Asp Pro Phe Val
275 280 285
Ser Ile Ala Ala Thr Thr Phe Gly Leu Gly Thr Gly Trp Glu Ser Thr
290 295 300
Leu Met Ser Ser Ala Phe Asn Lys Asn Asp Ser Lys305 310 315
<210> 15<211> 936<212> DNA
<213> Vitis vinifera
<400> 15
atgaggaatg catcctcagc atcagctcca ccttcatctt cttcaaaaac accatgctgc 60
atcaaggttg gattgaagag ggggccatgg acgccggagg aagacgaggt tctggccaat 120
tacatcaaga aagaaggaga aggccggtgg cgcaccctcc cgaagcgcgc cggtctcctc 180
cgctgcggca agagctgtcg cctccgctgg atgaactacc tccgcccttc cgtcaagcgc 240
ggccagatcg cccccgatga agaggatctc attctccgcc tccaccgact tctcggcaac 300
aggtgggctt tgattgccgg aagaattccg ggccggacgg ataatgagat aaaaaactac 360
tggaacacac acctgagcaa gaagctgatc agccagggaa tagatccgag aacccataag 420
ccattgaacc ctaattcatc atctgttgat gtgaaagctt cttcttcaaa ggcaaaagct 480
gttatgaacc ctaaccctaa ccctaatcct tctccttcag aaaaagcagc agccaacaag 540
gaagctggga acttcaagag tgacaatcag tatcagattg gggcagctgg caatgatggc 600
agtgccaata tccagaattc ggatggttcc gggaccggat tgaggagcag caacaacgaa 660
gaagacgatg accttaactg tggcaccgat gatgtcttct cttcattttt gaactcattg 720
atcaatgagg atgtgtttcc tggacagcac catctccaac aacagcacca tggtggtctc 780
attgcaccgg gctccgatgc tttgatctct acttcttcag tccagtcgtt cgggttcggt 840
accagctggg aggctgcagc catgacttcc acgtctgttt ttagccaaat cgatcactcc 900
aagaggttta acgatcaacc tgataagcgg ttctga 936
<210> 1.6<211> 311<212> PRT
<213> Vitis vinifera <400> L 6 Met Arg Asn Ala Ser Ser Ala Ser Ala Pro Pro Ser Ser Ser Ser Lys1 5 10 15 Thr Pro Cys Cys Ile Lys Val Gly Leu Lys Arg Gly Pro Trp Thr Pro 20 25 30 Glu Glu Asp Glu Val Leu Ala Asn Tyr Ile Lys Lys Glu Gly Glu Gly 35 40 45 Arg Trp Arg Thr Leu Pro Lys Arg Ala Gly Leu Leu Arg Cys Gly Lys 50 55 60 Ser Cys Arg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg65 70 75 80Gly Gln Ile Ala Pro Asp Glu Glu Asp Leu Ile Leu Arg Leu His Arg 85 90 95 Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ala Leu Ile Ala Gly Arg Ile Pro Gly Arg 100 105 110 Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu Ser Lys Lys 115 120 125 Leu Ile Ser Gln Gly Ile Asp Pro Arg Thr His Lys Pro Leu Asn Pro 130 135 140 Asn Ser Ser Ser Val Asp Val Lys Ala Ser Ser Ser Lys Ala Lys Ala145 150 155 160Val Met Asn Pro Asn Pro Asn Pro Asn Pro Ser Pro Ser Glu Lys Ala 165 170 175 Ala Ala Asn Lys Glu Ala Gly Asn Phe Lys Ser Asp Asn Gln Tyr Gln 180 185 190 Ile Gly Ala Ala Gly Asn Asp Gly Ser Ala Asn Ile Gln Asn Ser Asp 195 200 205 Gly Ser Gly Thr Gly Leu Arg Ser Ser Asn Asn Glu Glu Asp Asp Asp 210 215 220 Leu Asn Cys Gly Thr Asp Asp Val Phe Ser Ser Phe Leu Asn Ser Leu225 230 235 240Ile Asn Glu Asp Val Phe Pro Gly Gln His His Leu Gln Gln Gln His 245 250 255His Gly Gly Leu Ile Ala Pro Gly Ser Asp Ala Leu Ile Ser Thr Ser
260 265 270
Ser Val Gln Ser Phe Gly Phe Gly Thr Ser Trp Glu Ala Ala Ala Met
275 280 285
Thr Ser Thr Ser Val Phe Ser Gln Ile Asp His Ser Lys Arg Phe Asn
290 295 300
Asp Gln Pro Asp Lys Arg Phe305 310
<210> 17
<211> 813
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 17
atgatgatgc ggaagccggc ggtgcagcag cgtggcgcgg gggcgataag gacgctcaag 60
cggggtgcgt ggacgccgga ggaggacgag ctgctggcgc ggcccgtggc gaaggacggg 120
gaggggcggt ggcgcacgct gccgcggcgg gcggggctgc ttcgctgcgg caagagctgc 180
aggctccgct ggatgaacta cctcaggccg gacatcaagc gcgggcctat cgccgccgac 240
gaggaggacc tcatcctccg cctccaccgc ctgctcggaa acaggtggtc gctgatcgct 300
gggcgtctgc ctggccgcac ggacaacgag gtcaagaact actggaactc gcacctcagc 360
aagaagctcg tcgcgcgggg catcgacccg cgcacgcaca cgcctctgcc cgcagcagct 420
gcgagcctgc actcgcactc ccaccgcgcc gacgacgact caccagcagg agccgccggt 480
tcgtctgccg acaagacgcc gccgccactg gtggaagtcg agccatcggt tgcgccgccg 540
ccagcgcagc cgaactcatc tttcggcgac ggaagcagcg gcgacttcgc ggggggcatg 600
atgggtctag gctccgaggg cttcgatgga gtcggtgatc cgttctgtgc accagctcct 660
ggcggcttcc acttgggctg ccccgtcgtg gacgacgcca ccttctcctc gttcctcgac 720
tcgctgatga acgaggagcg catgcgcatc gccgattaca ttggagatca cagggatgct 780
gatggtggga acgaccaggg tggagcttat tag 813
<210> 18
<211> 270
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 18 Met Met Met Arg Lys Pro Ala Val Gln Gln Arg Gly Ala Gly Ala Ile1 5 10 15 Arg Thr Leu Lys 20 Arg Gly Ala Trp Thr 25 Pro Glu Glu Asp Glu 30 Leu LeuAla Arg Pro 35 Val Ala Lys Asp Gly 40 Glu Gly Arg Trp Arg 45 Thr Leu ProArg Arg 50 Ala Gly Leu Leu Arg 55 Cys Gly Lys Ser Cys 60 . Arg Leu Arg TrpMet Asn Tyr Leu Arg Pro Asp Ile Lys Arg Gly Pro Ile Ala Ala Asp65 70 75 80Glu Glu Asp Leu Ile 85 Leu Arg Leu His Arg 90 Leu Leu Gly Asn Arg 95 TrpSer Leu Ile Ala 100 Gly Arg Leu Pro Gly 105 Arg Thr Asp Asn Glu 110 Val LysAsn Tyr Trp 115 Asn Ser His Leu Ser 120 Lys Lys Leu Val Ala 125 Arg Gly IleAsp Pro 130 Arg Thr His Thr Pro 135 Leu Pro Ala Ala Ala 140 Ala Ser Leu HisSer His Ser His Arg Ala Asp Asp Asp Ser Pro Ala Gly Ala Ala Gly145 150 155 160Ser Ser Ala Asp Lys 165 Thr Pro Pro Pro Leu 170 Val Glu Val Glu Pro 175 SerVal Ala Pro Pro Pro Ala Gln Pro Asn Ser Ser Phe Gly Asp Gly Ser180 185 190
Ser Gly Asp Phe Ala Gly Gly Met Met Gly Leu Gly Ser Glu Gly Phe
195 200 205
Asp Gly Val Gly Asp Pro Phe Cys Ala Pro Ala Pro Gly Gly Phe His
210 215 220
Leu Gly Cys Pro Val Val Asp Asp Ala Thr Phe Ser Ser Phe Leu Asp225 230 235 240
Ser Leu Met Asn Glu Glu Arg Met Arg Ile Ala Asp Tyr Ile Gly Asp
245 250 255
His Arg Asp Ala Asp Gly Gly Asn Asp Gln Gly Gly Ala Tyr260 265 270
<210> 19
<211> 720
<212> DNA
<213> Antirrhinum majus
<400> 19
gggccatgga cggcggagga ggacgggctt ttagcggagt acgtaaagga gggaggtgag 60
gggaagtggc gcacgctgcc gaaggaggcg gggctgctac ggtgcggcaa gagctgccgc 120
ctccggtgga tgaactacct ccgtccctcc gtcaagcgcg gccacatcac tcctgacgag 180
gaggatctca tcctccgcct ccaccgcctc ctcggaaaca ggtggtcttt aatagcggga 240
agaatacctg ggcggacaga taacgagata aagaactact ggaacactca cctcaccaaa 300
aaactcataa gccaaggaat cgatcccaaa acacacaagc cattgaatcc acttaacccc 360
agcagcatca aacattactc tccctcagaa aaatcagttg atgttccaat ttcctcagta 420
aacaatatcc aaattataga atatccagct gaaaacatca tgatcggtgc agagtccaag 480
aaattagagt tgagaataag tagtactaat gaggggacca tattgggtag tgatgatgaa 540
gataatgaca tgatcatcag cagttgtttc cctgataatg atgccttttc atccttcttg 600
aattcactca ttaacgatga tatgttcatt aataacaacc aaccccacga tgatcatcag 660
gaacaacaac aagaggaggg gagacgccga ccggctgctg cagatgtaat aaagtggtga 720
<210> 20
<211> 239
<212> PRT
<213> Antirrhinum majus
<400> 20 Gly Pro Trp Thr Ala Glu Glu Asp Gly Leu Leu Ala Glu Tyr Val Lys1 5 10 15 Glu Gly Gly Glu 20 Gly Lys Trp Arg Thr 25 Leu Pro Lys Glu Ala 30 Gly LeuLeu Arg Cys 35 Gly Lys Ser Cys Arg 40 Leu Arg Trp Met Asn 45 Tyr Leu ArgPro Ser 50 Val Lys Arg Gly His 55 Ile Thr Pro Asp Glu 60 Glu Asp Leu IleLeu Arg Leu His Arg Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly65 70 75 80Arg Ile Pro Gly Arg 85 Thr Asp Asn Glu Ile 90 Lys Asn Tyr Trp Asn 95 ThrHis Leu Thr Lys 100 Lys Leu Ile Ser Gln 105 Gly Ile Asp Pro Lys 110 Thr HisLys Pro Leu 115 Asn Pro Leu Asn Pro 120 Ser Ser Ile Lys His 125 Tyr Ser ProSer Glu 130 Lys Ser Val Asp Val 135 Pro Ile Ser Ser Val 140 Asn Asn Ile GlnIle Ile Glu Tyr Pro Ala Glu Asn Ile Met Ile Gly Ala Glu Ser Lys145 150 155 160Lys Leu Glu Leu Arg Ile Ser Ser Thr Asn Glu Gly Thr Ile Leu Gly
165 170 175Ser Asp Asp Glu Asp Asn Asp Met Ile Ile Ser Ser Cys Phe Pro Asp
180 185 190
Asn Asp Ala Phe Ser Ser Phe Leu Asn Ser Leu Ile Asn Asp Asp Met
195 200 205
Phe Ile Asn Asn Asn Gln Pro His Asp Asp His Gln Glu Gln Gln Gln
210 215 220
Glu Glu Gly Arg Arg Arg Pro Ala Ala Ala Asp Val Ile Lys Trp225 230 235
<210> 21
<211> 476
<212> DNA
<213> Lycopersicon esculentum<220>
<221> misc_feature
<222> (11) .. (11)
<223> η é a, c, g, t
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> η é a, c, g, ou t
<400> 21
tggtcattga nagcagggng aattcccgga agaacggata acgagataaa gaattattgg 60
aatacccacc ttagcaagaa attaatcaac caaggaatag atccaagaac acacaaacca 120
ttaatattaa acaaccctaa ttcctctaat agtgatgata atcacattat tacaaacaaa 180
gctaattctt cttctccttc ttcatcctca aaactagcaa ataattataa tctcaacaca 240
attaatattc caaaccccat ttacactcct aatttccaaa tgaaagaacc cttaagaagt 300
agcatcaaca ataataactg tcctggagaa actacgagtc ctgatgatga ttatcagtat 360
cagagcagta atgtgatgct tgccaattat cgcgatgatg atatgaatat tgtggttcat 42 0
gatgagggag atgatgaaat gaattgttgc gcggacgatg tcttctcctc cttctt 47 6
<210> 22
<211> 159
<212> PRT
<213> Lycopersicon esculentum
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido naturalmente ocorrente
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido naturalmente ocorrente
<400> 22
Trp Ser Leu Xaa Ala Gly Xaa Ile Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile1 5 10 15
Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu Ser Lys Lys Leu Ile Asn Gln Gly
20 25 30
Ile Asp Pro Arg Thr His Lys Pro Leu Ile Leu Asn Asn Pro Asn Ser
35 40 45
Ser Asn Ser Asp Asp Asn His Ile Ile Thr Asn Lys Ala Asn Ser Ser
50 55 60
Ser Pro Ser Ser Ser Ser Lys Leu Ala Asn Asn Tyr Asn Leu Asn Thr65 70 75 80
Ile Asn Ile Pro Asn Pro Ile Tyr Thr Pro Asn Phe Gln Met Lys Glu
85 90 95
Pro Leu Arg Ser Ser Ile Asn Asn Asn Asn Cys Pro Gly Glu Thr Thr
100 105 110
Ser Pro Asp Asp Asp Tyr Gln Tyr Gln Ser Ser Asn Val Met Leu Ala
115 120 125
Asn Tyr Arg Asp Asp Asp Met Asn Ile Val Val His Asp Glu Gly Asp
130 135 140
Asp Glu Met Asn Cys Cys Ala Asp Asp Val Phe Ser Ser Phe Leu145 150 155
<210> 23<211> 618<212> DNA
<213> Solanum chacoense<400> 23
cacgaggatc tcatcctccg cctccatcgc ctcctaggga acaggtggtc attgatagca 60
ggcagaattc caggaagaac agacaacgag ataaagaatt attggaatac tcaccttagc 120
aagaaattaa tctgccaagg aatagatcca agaacacaca aaccattaat attaaacagc 180
cctaattcct ctagtgatga taatcatatt attacaaaca aagctaattc ttcttctcct 240
tcttcatcct caaaactagc aaatgattat gatctcaaca caattaatac tccaaacccc 300
atttacaatc ctaatttcca aatgaaagaa cccttaggaa gtagcatcaa caataataac 360
cgtcctggag aaattacgag tcttgatgat gattatcagt atcagagcag taatgtgatg 420
cttgccaatt atcgcgatga tgatatgaac attgtggttc atgatgaggg agacgatgga 480
atgaattgtt gcgcggacga tgtcttctcc tccttcttga attctttgat caatgaagac 540
atgttcatga attgccaaaa tcaacaaatc aatggtacat tgcaagattt tgaccatttt 600
atggcttcat ctatatga 618
<210> 24<211> 205<212> PRT
<213> Solanum chacoense<400> 24
His Glu Asp Leu Ile Leu Arg Leu His Arg Leu Leu Gly Asn Arg Trp1 5 10 15
Ser Leu Ile Ala Gly Arg Ile Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys
20 25 30
Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu Ser Lys Lys Leu Ile Cys Gln Gly Ile
35 40 45
Asp Pro Arg Thr His Lys Pro Leu Ile Leu Asn Ser Pro Asn Ser Ser
50 55 60
Ser Asp Asp Asn His Ile Ile Thr Asn Lys Ala Asn Ser Ser Ser Pro65 70 75 80
Ser Ser Ser Ser Lys Leu Ala Asn Asp Tyr Asp Leu Asn Thr Ile Asn
85 90 95
Thr Pro Asn Pro Ile Tyr Asn Pro Asn Phe Gln Met Lys Glu Pro Leu
100 105 110
Gly Ser Ser Ile Asn Asn Asn Asn Arg Pro Gly Glu Ile Thr Ser Leu
115 120 125
Asp Asp Asp Tyr Gln Tyr Gln Ser Ser Asn Val Met Leu Ala Asn Tyr
130 135 140
Arg Asp Asp Asp Met Asn Ile Val Val His Asp Glu Gly Asp Asp Gly145 150 155 160
Met Asn Cys Cys Ala Asp Asp Val Phe Ser Ser Phe Leu Asn Ser Leu
165 170 175
Ile Asn Glu Asp Met Phe Met Asn Cys Gln Asn Gln Gln Ile Asn Gly180 185 190
Thr Leu Gln Asp Phe Asp His Phe Met Ala Ser Ser Ile195 200 205
<210> 25
<211> 732
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<220>
<221> misc_feature
<222> (502) .. (502)
<223> η é a, c, g, ou t
<400> 25
acggcgccgc
ttcgtggcgc
cgctgcggca
ggccccatcg
cggtggtcgc
tggaactcgc
ccgctcgccg
acggtcagac
ctggaactga
gcgatgagcg
gctgcttccc
ttcacctcgt
ggcgctatct
cgctgaagcggggagggggaagagctgccgccgaggacgatgatcgccggacctcagcaactgctcccggcgccgcacctcgcgacggcctcgacgcccagcggagtctttcctcgattcag
ggggccgtggggggcggtggcctgcggtggggaggacctcgaggctgccggaagctcatccagggcggcactgcccccgcgngacagccctgacttcgaacaacgacgtgcttgatgaat
acggcggaggcgcacgctgcatgaactaccatcctccgccgggcgcacgggcccagggccgctcctaccgcagcgcttgtaggcgacggaggtttcggtgatggggtgtcgagcgccagt
aggacgaggtcacggcgggctccggccggatccaccgcgtacaacgagattcgacccgcgacaagacgacgctgccgaccggcatgacgaatcagcttctcaatggtggatggctgctga
gctggcgcgggggcctgctgcatcaagcgccctcggcaaccaagaactacgacgcacatggtgggcgccgtcgtctgccgcctcgccgcgcgccgactaccgacgacacctcacaaggtt
60120180240300360420480540600660720732
<210> 26
<211> 243
<212> PRT
<213> Triticum aestivum
<220>
<221> misc_feature
<222> (168)..(168)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido naturalmente ocorrente
<400> '26
Thr Ala Pro Pro Leu Lys Arg Gly Pro Trp Thr Ala Glu Glu Asp Glu1 5 10 15 Val Leu Ala Arg Phe Val Ala Arg Glu Gly Glu Gly Arg Trp Arg Thr 20 25 30 Leu Pro Arg Arg Ala Gly Leu Leu Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu 35 40 45 Arg Trp Met Asn Tyr Leu Arg Pro Asp Ile Lys Arg Gly Pro Ile Ala 50 55 60 Glu Asp Glu Glu Asp Leu Ile Leu Arg Leu His Arg Val Leu Gly Asn65 70 75 80Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu 85 90 95 Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His Leu Ser Lys Lys Leu Ile Ala Gln 100 105 110 Gly Leu Asp Pro Arg Thr His Met Pro Leu Ala Ala Ala Pro Gly Arg 115 120 125 Ala Ala Ala Pro Thr Asp Lys Thr Thr Trp Ala Pro Thr Val Arg Pro 130 135 140 Pro His Leu Cys Pro Arg Gln Arg Leu Cys Cys Arg Pro Arg Leu Pro145 150 155 160Leu Glu Leu Thr Arg 165 Arg Pro Xaa Gln Pro 170 Arg Arg Arg Arg His 175 AspAsp Leu Ala Ala 180 Ala Met Ser Val Asp 185 Ala His Asp Phe Glu 190 Gly PheGly Asp Gln 195 Leu Leu Ala Asp Tyr 200 Ala Ala Ser Arg Gly 205 Val Phe AsnAsp Val 210 Met Gly Cys Pro Met 215 Val Asp Asp Asp Thr 220 Phe Thr Ser PheLeu Asp Ser Leu Met Asn Glu Arg Gln Leu Ala Ala Asp His Lys Val225 230 235 240Gly Ala Ile
<210> 27
<211> 14
<212> PRT
<213> Seqüênci
artificial
<220>
<223> domínio MYB4
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1) . . (1)
<223> /substituir = "Asn"
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2) .. (2)
<223> /substituir = "Ala"
<220>
<221> DÚBIO
<222> (3)..(3)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido naturalmente ocorrente
<220>
<221> VARIANTE
<222> (5) .. (5)
<223> /substituir = "Thr" /substituir = " "
<220>
<221> VARIANTE
<222> (9) .. (9)
<223> /substituir = "Asp"
<220>
<221> VARIANTE
<222> (12) .. (12)
<223> /substituir = nMet"
<220>
<221> VARIANTE
<222> (14) .. (14)
<223> /substituir = "Asp"
<400> 27
Asp Asp Xaa Phe Ser Ser Phe Leu Asn Ser Leu Ile Asn Glu<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> domínio MYB4 de Oryza sativa como em SEQ ID NO: 2
<400> 28
Asp Asp Asp Phe Ser Ser Phe Leu Asp Ser Leu Ile Asn Asp1 5 10
<210> 29
<211> 654
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 29
cttctacatc
ttattttaca
ttattgtaaa
aaacaagagt
attgaaatta
gcattaccaa
ccttatcaca
atcatgtata
gtgcacctaa
aaaactaaca
aatcctcatc
ggcttaggtgaaaatataaagttctacaaagtcaatggaatataattcaaaatatatatattgacacatatatgatagcccagaatatccctctaaagcaatccttcacc
tagcaacacgatagatcagtgctaatttaacaatgaaaacagagaataaagcttacaaaaaagtgagtgaacaaagttacaaataatatgaccgatgggaacaattcaaa
actttattatccctcaccacaagttattgccatatgacattccacatagccatgacaagctgagtcataatttgatgatgactcacttagaagcatctattattatagtt
tattattatt attattatta 60aagtagagca agttggtgag 120attaacttat ttcatattac 180actataattt tgtttttatt 240cgtaaagttc tacatgtggt 300ttagtttgaa aaattgcaat 360tattattttc tttgctaccc 420atatcaaaga acatttttag 480atcataatag agcatcaagt 540aaatagacaa gcacaatgaa 600gaagcatagt agta 654
<210> 30
<211> 50
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> iniciador: prm5233
<400> 30
Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Thr Thr Thr Gly Thr Ala Cys1 5 10 15 Ala Ala Ala Ala 20 Ala Ala Gly Cys Ala 25 Gly Gly Cys Thr Thr 30 Ala AlaAla Cys Ala 35 Ala Thr Gly Ala Ala 40 Gly Cys Gly Gly Ala 45 Ala Gly Cys
Gly Gly50
<210> 31
<211> 50
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> iniciador: prm5234
<400> 31Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala Cys Thr Thr Thr Gly Thr Ala Cys1 5 10 15
Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Gly Thr Ala Ala Thr20 25 30
Cys Thr Cys Cys Cys Gly Ala Ala Ala Gly Ala Thr Thr Ala Cys Thr35 40 45
Gly Thr50
<210> 32<211> 756<212> DNA
<213> Brassica napus<400> 32
atgacgtcat ctggaggaaa gaagcaggtc gtgaagaaga tgatcccgtg ctgcatgaag 60
atggggatga agagaggacc atggacggcg gaggaggatg agattcttgt tagcttcatc 120aagaaagaag gcgaaggaag gtggagatcg cttcccaaga gagctggttt actccgatgt 180ggaaagagct gccgcctacg gtggatgaac tatctccggc cgtctgtaaa acgcggcggt 240atcactcccg acgaggaaga tctcatcctc cgccttcatc gcctccttgg caaccggtgg 300tcactgatcg cgggaaggat accgggaagg actgataatg agattaagaa ctattggaac 360actcatcttc gtaagaaact cttaagtgaa ggcattgatc ctcgaaccca caagcctctt 420gatgcaaaca atgctcatca taaacccgga gaagaagttt ccggtggaca gaatcttcta 480gagcctaatt ctagttctca cactgatgac accaccgtta atagcggaaa tgaagctacc 540aagatcactt tcagtgtctt tggtggtgaa gacaacgaag actttggttt ctgttacgat 600gataagtttt cttcgtttct aaatgcgctt attaatgatg atccttttga tagtaatatt 660ccattgtccc agccgttacg gacgcaagat tgtactggtg agattgttgg aacgtcgtct 720agcttagaac atggccagag aatagaagat atatga 756
<210> 33
<211> 251
<212> PRT
<213> Brassica napus
<400> 33 Met Thr Ser Ser Gly Gly Lys Lys Gln Val Val Lys Lys Met Ile Pro1 5 10 15 Cys Cys Met Lys 20 Met Gly Met Lys Arg 25 Gly Pro Trp Thr Ala 30 Glu GluAsp Glu Ile 35 Leu Val Ser Phe Ile 40 Lys Lys Glu Gly Glu 45 Gly Arg TrpArg Ser 50 Leu Pro Lys Arg Ala 55 Gly Leu Leu Arg Cys 60 Gly Lys Ser CysArg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg Gly Gly65 70 75 80Ile Thr Pro Asp Glu 85 Glu Asp Leu Ile Leu 90 Arg Leu His Arg Leu 95 LeuGly Asn Arg Trp 100 Ser Leu Ile Ala Gly 105 Arg Ile Pro Gly Arg 110 Thr AspAsn Glu Ile 115 Lys Asn Tyr Trp Asn 120 Thr His Leu Arg Lys 125 Lys Leu LeuSer Glu 130 Gly Ile Asp Pro Arg 135 Thr His Lys Pro Leu 140 Asp Ala Asn AsnAla His His Lys Pro Gly Glu Glu Val Ser Gly Gly Gln Asn Leu Leu145 150 155 160Glu Pro Asn Ser Ser 165 Ser His Thr Asp Asp 170 Thr Thr Val Asn Ser 175 GlyAsn Glu Ala Thr 180 Lys Ile Thr Phe Ser 185 Val Phe Gly Gly Glu 190 Asp AsnGlu Asp Phe 195 Gly Phe Cys Tyr Asp 200 Asp Lys Phe Ser Ser 205 Phe Leu AsnAla Leu 210 Ile Asn Asp Asp Pro 215 Phe Asp Ser Asn Ile 220 Pro Leu Ser GlnPro Leu Arg Thr Gln Asp Cys Thr Gly Glu Ile Val Gly Thr Ser Ser225 230 235 240Ser Leu Glu His Gly 245 Gln Arg Ile Glu Asp 250 Ile
<210> 34
<211> 900
<212> DNA
<213> Eucalyptus grandis
<400> 34
atgaggaatc cgtcgtcgtc gtcgggaggg acgaagaccc cgtgctgcag caaggtgggg 60
ctgaagaggg ggccctggac gccggaggag gacgagctcc tcgccggcta catcaaccgc 120
gagggcgagg gccggtggcg gaccctcccc aagcgggccg gcctcctccg ctgcggcaag 180
agctgccgcc tccgctggat gaactacctc cgcccctccg tcaagcgcgg ccagatcgcc 240
cccgacgagg aggacctcat cctccgcctc caccgcctcc tcggcaaccg gtggtctttg 300
atagctggga gaatcccagg acggactgac aatgagatca agaactactg gaacactcac 360
cttagcaaga agctcatcag tcaaggaatt gatccgagga cgcacaagcc gctcaatcca 420
gaaacccaga actccagcag caatcctcca gcgaaacctc ctccttccaa agcggcacct 480
cgccctcgaa gccctaaccc tagccccatc tcttctggcc tcgaggaaac cagcagtggc 54 0
agcccagcca tcctcaaaga aaatgatcag atccaaagtg ccgataatac ggaggctgtg 600
tatcaaaatg ggactgcgac agctcacggt ggtgaagcca gttatttgcc gggtacccag 660
cattaccatg tgatgggctt gagaagcagc cacggactgt ctaatgagga ggaggaggac 720
ctcaactgct gcggggacga cgtcttctca tcgttcctga actccctgat caacgaggaa 780
gcattcccaa tccagcacca gctacaacaa caggccgtcg gctcctcgcc ggattcggat 840
tctctgattc ccatggctgc agcacctgca ttcgggatag ccgctggctg ggactcttag 900
<210> 35
<211> 299
<212> PRT
<213> Eucalyptus grandis
<400> 35
Met Arg Asn Pro Ser Ser Ser Ser Gly Gly Thr Lys Thr Pro Cys Cys1 5 10 15
Ser Lys Val Gly Leu Lys Arg Gly Pro Trp Thr Pro Glu Glu Asp Glu
20 25 30
Leu Leu Ala Gly Tyr Ile Asn Arg Glu Gly Glu Gly Arg Trp Arg Thr
35 40 45
Leu Pro Lys Arg Ala Gly Leu Leu Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu
50 55 60
Arg Trp Met Asn Tyr Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg Gly Gln Ile Ala65 70 75 80
Pro Asp Glu Glu Asp Leu Ile Leu Arg Leu His Arg Leu Leu Gly Asn
85 90 95
Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Ile Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu
100 105 110
Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu Ser Lys Lys Leu Ile Ser Gln
115 120 125
Gly Ile Asp Pro Arg Thr His Lys Pro Leu Asn Pro Glu Thr Gln Asn
130 135 140
Ser Ser Ser Asn Pro Pro Ala Lys Pro Pro Pro Ser Lys Ala Ala Pro145 150 155 160
Arg Pro Arg Ser Pro Asn Pro Ser Pro Ile Ser Ser Gly Leu Glu Glu165 170 175Thr Ser Ser Gly 180 Ser Pro Ala Ile Leu 185 Lys Glu Asn Asp Gln 190 Ile GlnSer Ala Asp 195 Asn Thr Glu Ala Val 200 Tyr Gln Asn Gly Thr 205 Ala Thr AlaHis Gly 210 Gly Glu Ala Ser Tyr 215 Leu Pro Gly Thr Gln 220 His Tyr His ValMet Gly Leu Arg Ser Ser His Gly Leu Ser Asn Glu Glu Glu Glu Asp225 230 235 240Leu Asn Cys Cys Gly 245 Asp Asp Val Phe Ser 250 Ser Phe Leu Asn Ser 255 LeuIle Asn Glu Glu 260 Ala Phe Pro Ile Gln 265 His Gln Leu Gln Gln 270 Gln AlaVal Gly Ser 275 Ser Pro Asp Ser Asp 280 Ser Leu Ile Pro Met 285 Ala Ala AlaPro Ala 290 Phe Gly Ile Ala Ala 295 Gly Trp Asp Ser
<210> 36<211> 1125<212> DNA
<213> Malus domestica<400> 36
atgaggaacc cgtcgtcttc gtcgaaagca acagcagcag caagtgctac gatgacaaca 60
gcatcgccgt cgtcgagcaa ggcggggatt gccggaggga gtaagacgcc gtgttgcgta 120
aaggtgggtt tgaagagggg gccgtggact cccgaagagg acgagctgct agccaattac 180
atcaagaaag aaggtgaagg acggtggcgg accctcccca agcaggctgg gttgctccgc 240
tgcggaaaaa gctgtcgcct ccgctggatg aactacctcc gcccttccgt taagcgcggc 300
cagatcgccc ccgatgaaga agatctcatt ctccgcctcc atcgcctcct cggcaatcgg 360
tggtctttga tagctgggag gattccaggt cgtacggaca atgagataaa gaactactgg 420
aacacacacc tgagcaagaa gctgataagc caaggcatag atcccagaac ccacaagcct 480
ctcaatccag atcatcactc tgctgctgcc gatgctgatg tgggcaacac aaataaatca 540
gctgctgctg ctgcttcttc caaagccaat aaccgattct caaaccctaa tcctagtcct 600
cctccttctg atcgtcttgt ccatcaagga gcggatccca gtatcaacgg taatgatgga 660
aacatcgcaa ttgatgatca tgatctgggc actatagtcc atagctgtgc aaacatgacc 720
acgtccatta acaatcccga tgcttcttct tcggccgcag caatgggcac tttgagttta 780
aggaccaaca acaatagcca cgctggagta ctacttgggg gaggaggaaa tgaagaggac 840
gaggacatca actgttgtgc ggacgatgtc ttctcttcgt ttctgaattc gttgatcaac 900
gaggatccat tttctgtaca acaccaattg caacaacagg tactgcacaa tgggaatgtt 960
agtacacacg cagctggtgc tggttccgac cacgttcctt tgatttctat gactagtgct 1020
agtactatgg cgccgtcaac atttggctgg gactctgctg tgctcatgtc ttctgctttc 1080
aaccaaaatg atcaccagag ggttactgat caaacggagc agtag 1125
<210> 37<211> 374<212> PRT
<213> Malus domestica<400> 37
Met Arg Asn Pro Ser Ser Ser Ser Lys Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala1 5 10 15
Thr Met Thr Thr Ala Ser Pro Ser Ser Ser Lys Ala Gly Ile Ala Gly
20 25 30
Gly Ser Lys Thr Pro Cys Cys Val Lys Val Gly Leu Lys Arg Gly Pro
35 40 45
Trp Thr Pro Glu Glu Asp Glu Leu Leu Ala Asn Tyr Ile Lys Lys Glu
50 55 60
Gly Glu Gly Arg Trp Arg Thr Leu Pro Lys Gln Ala Gly Leu Leu Arg65 70 75 80Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Arg Pro Ser
85 90 95
Val Lys Arg Gly Gln Ile Ala Pro Asp Glu Glu Asp Leu Ile Leu Arg
100 105 110
Leu His Arg Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Ile
115 120 125
Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu
130 135 140
Ser Lys Lys Leu Ile Ser Gln Gly Ile Asp Pro Arg Thr His Lys Pro145 150 155 160
Leu Asn Pro Asp His His Ser Ala Ala Ala Asp Ala Asp Val Gly Asn
165 170 175
Thr Asn Lys Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ser Lys Ala Asn Asn Arg
180 185 190
Phe Ser Asn Pro Asn Pro Ser Pro Pro Pro Ser Asp Arg Leu Val His
195 200 205
Gln Gly Ala Asp Pro Ser Ile Asn Gly Asn Asp Gly Asn Ile Ala Ile
210 215 220
Asp Asp His Asp Leu Gly Thr Ile Val His Ser Cys Ala Asn Met Thr225 230 235 240
Thr Ser Ile Asn Asn Pro Asp Ala Ser Ser Ser Ala Ala Ala Met Gly
245 250 255
Thr Leu Ser Leu Arg Thr Asn Asn Asn Ser His Ala Gly Val Leu Leu
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Asn Glu Glu Asp Glu Asp Ile Asn Cys Cys Ala Asp
275 280 285
Asp Val Phe Ser Ser Phe Leu Asn Ser Leu Ile Asn Glu Asp Pro Phe
290 295 300
Ser Val Gln His Gln Leu Gln Gln Gln Val Leu His Asn Gly Asn Val305 310 315 320
Ser Thr His Ala Ala Gly Ala Gly Ser Asp His Val Pro Leu Ile Ser
325 330 335
Met Thr Ser Ala Ser Thr Met Ala Pro Ser Thr Phe Gly Trp Asp Ser
340 345 350
Ala Val Leu Met Ser Ser Ala Phe Asn Gln Asn Asp His Gln Arg Val
355 360 365
Thr Asp Gln Thr Glu Gln370
<210> 38
<211> 14
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> domínio MYB4
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1) .. (1)
<223> /substituir = "Asn"
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> /substituir = "Ala"
<220><221>
DÚBIO<222> (3)..(3)<220>
<221> VARIANTE
<222> (5) .. (5)
<223> /substituir = "Thr" /substituir = "Pro" /substituir = " "
<220>
<221> VARIANTE
<222> (9)..(9)
<223> /substituir = "Asp"
<220>
<221> VARIANTE
<222> (12) . . (12)
<223> /substituir = "Met"
<220>
<221> VARIANTE
<222> (14) .. (14)
<223> /substituir = "Asp"
<400> 38
Asp Asp Xaa Phe Ser Ser Phe Leu Asn Ser Leu Ile Asn Glu1 5 10
<210> 39
<211> 2194
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 39
aatccgaaaa gtttctgcac cgttttcacc ccctaactaa caatataggg aacgtgtgct 60
aaatataaaa tgagacctta tatatgtagc gctgataact agaactatgc aagaaaaact 120
catccaccta ctttagtggc aatcgggcta aataaaaaag agtcgctaca ctagtttcgt 180
tttccttagt aattaagtgg gaaaatgaaa tcattattgc ttagaatata cgttcacatc 24 0
tctgtcatga agttaaatta ttcgaggtag ccataattgt catcaaactc ttcttgaata 300
aaaaaatctt tctagctgaa ctcaatgggt aaagagagag atttttttta aaaaaataga 360
atgaagatat tctgaacgta ttggcaaaga tttaaacata taattatata attttatagt 42 0
ttgtgcattc gtcatatcgc acatcattaa ggacatgtct tactccatcc caatttttat 480
ttagtaatta aagacaattg acttattttt attatttatc ttttttcgat tagatgcaag 540
gtacttacgc acacactttg tgctcatgtg catgtgtgag tgcacctcct caatacacgt 600
tcaactagca acacatctct aatatcactc gcctatttaa tacatttagg tagcaatatc 660
tgaattcaag cactccacca tcaccagacc acttttaata atatctaaaa tacaaaaaat 72 0
aattttacag aatagcatga aaagtatgaa acgaactatt taggtttttc acatacaaaa 780
aaaaaaagaa ttttgctcgt gcgcgagcgc caatctccca tattgggcac acaggcaaca 840
acagagtggc tgcccacaga acaacccaca aaaaacgatg atctaacgga ggacagcaag 900
tccgcaacaa ccttttaaca gcaggctttg cggccaggag agaggaggag aggcaaagaa 960
aaccaagcat cctccttctc ccatctataa attcctcccc ccttttcccc tctctatata 1020
ggaggcatcc aagccaagaa gagggagagc accaaggaca cgcgactagc agaagccgag 1080
cgaccgcctt ctcgatccat atcttccggt cgagttcttg gtcgatctct tccctcctcc 1140
acctcctcct cacagggtat gtgcctccct tcggttgttc ttggatttat tgttctaggt 1200
tgtgtagtac gggcgttgat gttaggaaag gggatctgta tctgtgatga ttcctgttct 1260
tggatttggg atagaggggt tcttgatgtt gcatgttatc ggttcggttt gattagtagt 1320
atggttttca atcgtctgga gagctctatg gaaatgaaat ggtttaggga tcggaatctt 1380
gcgattttgt gagtaccttt tgtttgaggt aaaatcagag caccggtgat tttgcttggt 1440
gtaataaagt acggttgttt ggtcctcgat tctggtagtg atgcttctcg atttgacgaa 1500
gctatccttt gtttattccc tattgaacaa aaataatcca actttgaaga cggtcccgtt 1560
gatgagattg aatgattgat tcttaagcct gtccaaaatt tcgcagctgg cttgtttaga 1620tacagtagtc cccatcacga aattcatgga aacagttata atcctcagga acaggggatt 1680
ccctgttctt ccgatttgct ttagtcccag aatttttttt cccaaatatc ttaaaaagtc 1740
actttctggt tcagttcaat gaattgattg ctacaaataa tgcttttata gcgttatcct 1800
agctgtagtt cagttaatag gtaatacccc tatagtttag tcaggagaag aacttatccg 1860
atttctgatc tccattttta attatatgaa atgaactgta gcataagcag tattcatttg 1920
gattattttt tttattagct ctcacccctt cattattctg agctgaaagt ctggcatgaa 1980
ctgtcctcaa ttttgttttc aaattcacat cgattatcta tgcattatcc tcttgtatct 2040
acctgtagaa gtttcttttt ggttattcct tgactgcttg attacagaaa gaaatttatg 2100
aagctgtaat cgggatagtt atactgcttg ttcttatgat tcatttcctt tgtgcagttc 2160
ttggtgtagc ttgccacttt caccagcaaa gttc 2194
<210> 40
<211> 1244
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 40
aaaaccaccg agggacctga tctgcaccgg ttttgatagt tgagggaccc gttgtgtctg 60
gttttccgat cgagggacga aaatcggatt cggtgtaaag ttaagggacc tcagatgaac 120
ttattccgga gcatgattgg gaagggagga cataaggccc atgtcgcatg tgtttggacg 180
gtccagatct ccagatcact cagcaggatc ggccgcgttc gcgtagcacc cgcggtttga 24 0
ttcggcttcc cgcaaggcgg cggccggtgg ccgtgccgcc gtagcttccg ccggaagcga 300
gcacgccgcc gccgccgacc cggctctgcg tttgcaccgc cttgcacgcg atacatcggg 360
atagatagct actactctct ccgtttcaca atgtaaatca ttctactatt ttccacattc 420
atattgatgt taatgaatat agacatatat atctatttag attcattaac atcaatatga 480
atgtaggaaa tgctagaatg acttacattg tgaattgtga aatggacgaa gtacctacga 54 0
tggatggatg caggatcatg aaagaattaa tgcaagatcg tatctgccgc atgcaaaatc 600
ttactaattg cgctgcatat atgcatgaca gcctgcatgc gggcgtgtaa gcgtgttcat 660
ccattaggaa gtaaccttgt cattacttat accagtacta catactatat agtattgatt 720
tcatgagcaa atctacaaaa ctggaaagca ataagaaata cgggactgga aaagactcaa 780
cattaatcac caaatatttc gccttctcca gcagaatata tatctctcca tcttgatcac 840
tgtacacact gacagtgtac gcataaacgc agcagccagc ttaactgtcg tctcaccgtc 900
gcacactggc cttccatctc aggctagctt tctcagccac ccatcgtaca tgtcaactcg 960
gcgcgcgcac aggcacaaat tacgtacaaa acgcatgacc aaatcaaaac caccggagaa 1020
gaatcgctcc cgcgcgcggc ggcgacgcgc acgtacgaac gcacgcacgc acgcccaacc 1080
ccacgacacg atcgcgcgcg acgccggcga caccggccgt ccacccgcgc cctcacctcg 1140
ccgactataa atacgtaggc atctgcttga tcttgtcatc catctcacca ccaaaaaaaa 1200
aaggaaaaaa aaacaaaaca caccaagcca aataaaagcg acaa 1244
<210> 41
<211> 654
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 41
cttctacatc ggcttaggtg tagcaacacg actttattat tattattatt attattatta 60
ttattttaca aaaatataaa atagatcagt ccctcaccac aagtagagca agttggtgag 120
ttattgtaaa gttctacaaa gctaatttaa aagttattgc attaacttat ttcatattac 180
aaacaagagt gtcaatggaa caatgaaaac catatgacat actataattt tgtttttatt 24 0
attgaaatta tataattcaa agagaataaa tccacatagc cgtaaagttc tacatgtggt 300
gcattaccaa aatatatata gcttacaaaa catgacaagc ttagtttgaa aaattgcaat 360
ccttatcaca ttgacacata aagtgagtga tgagtcataa tattattttt cttgctaccc 420
atcatgtata tatgatagcc acaaagttac tttgatgatg atatcaaaga acatttttag 480
gtgcacctaa cagaatatcc aaataatatg actcacttag atcataatag agcatcaagt 54 0
aaaactaaca ctctaaagca accgatggga aagcatctat aaatagacaa gcacaatgaa 600
aatcctcatc atccttcacc acaattcaaa tattatagtt gaagcatagt agta 654

Claims (31)

1. Método para aumentar o rendimento de planta em relação àsplantas de controle, caracterizado pelo fato de compreender aumentarexpressão em uma planta de uma seqüência de ácido nucleico codificadora deum polipeptídeo fator de transcrição de domínio MYB (MYB-TF), eopcionalmente selecionar plantas possuindo rendimento aumentado.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a expressão é preferencialmente aumentada no endosperma deuma semente de planta.
3. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que o citado polipeptídeo MYB-TF é qualquerpolipeptídeo compreendendo desde a terminação-N até a terminação-C (i) umdomínio R2R3 MYB compreendendo duas repetições MYB; e (ii) umdomínio MYB4 possuindo em ordem crescente de preferência pelo menos- 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais deidentidade de seqüência ao domínio MYB4 representado por qualquer uma oumais de: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 27, ou SEQ ID NO: 28.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o citado polipeptídeo MYB-TF équalquer seqüência de polipeptídeo que, quando usada na construção de umaárvore filogenética de MYB tal como aquela mostrada em Figura 3, tende aagrupar com o grupo de seqüências de polipeptídeo compreendendo asseqüências representadas por SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4, em vez de comqualquer outro grupo, como indicado em Figura 3.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o citado polipeptídeo MYB-TF équalquer seqüência de polipeptídeo com em ordem crescente de preferênciapelo menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,- 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência em relação àseqüência de polipeptídeo como representada pela SEQ ID NO: 2.
6. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que a citada expressão aumentada é efetuada pelaintrodução de uma modificação genética, preferivelmente no local de um genecodificador de um polipeptídeo MYB-TF, em uma planta.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que a citada modificação genética é efetuada por qualquer um ou maisde: ativação de T-DNA, TILLING e recombinação homóloga.
8. Método para aumentar o rendimento de planta em relação àsplantas de controle, caracterizado pelo fato de compreender introduzir eexpressar em uma planta, uma seqüência de ácido nucleico codificadora deum polipeptídeo MYB-TF.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que a citada seqüência de ácido nucleico está operacionalmente ligadaem um promotor constitutivo, preferivelmente em um promotor GOS2.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 6, ou 8, caracterizado pelo fato de que o citado rendimento de planta é um oumais de: (i) vigor de muda aumentado em emergência; (ii) biomassa de raizaumentada; (iii) índice de verdor aumentado (antes da floração); (iv) taxa deenchimento de semente aumentada (v) peso total de sementes por plantaaumentado; (vi) número aumentado de sementes cheias; ou (vii) índice deceifa aumentado.
11. Método para aumentar o rendimento de planta em relaçãoàs plantas de controle, caracterizado pelo fato de compreender introduzir epreferencialmente aumentar a expressão de uma seqüência de ácido nucleicocodificadora de um polipeptídeo MYB-TF, no endosperma de uma sementede planta.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que a citada seqüência de ácido nucleico está operacionalmenteligada em um promotor específico de endosperma, preferivelmente em umpromotor prolamina.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 6, ou 11, caracterizado pelo fato de que o citado rendimento de planta é um oumais de: (i) peso total de sementes por planta aumentado; (ii) númeroaumentado de sementes cheias; ou (iii) índice de ceifa aumentado.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a citada seqüência de ácidonucleico é uma porção ou uma variante alélica ou uma variante de editoraçãoou uma seqüência capaz de hibridizar com uma seqüência de ácido nucleicocomo dadas em Tabela A, no qual a citada porção, variante alélica, variantede editoração ou seqüência de hibridização codifica um polipeptídeo MYB-TF.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a citada porção, variante alélica, variante de editoração ouseqüência de hibridização codifica um ortólogo ou parálogo de umpolipeptídeo MYB-TF.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a citada seqüência de ácidonucleico codificadora de um polipeptídeo MYB-TF é de uma origem deplanta, preferivelmente de uma planta monocotiledônea, adicionalmentepreferivelmente da família Poaceae, mais preferivelmente do gênero Oryza,muito mais preferivelmente de Oryza sativa.
17. Plantas, partes de planta, ou células de planta obteníveispelo método como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes,caracterizadas pelo fato de que as citadas plantas, ou suas partes ou células,compreendem um ácido nucleico isolado codificador de um polipeptídeoMYB-TF, cujo ácido nucleico isolado está operacionalmente ligado em umpromotor constitutivo, ou em um promotor específico de endosperma.
18. Construto, caracterizado pelo fato de compreender:a. Uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeoMYB-TF;b. Uma ou mais seqüências de controle capazes de conduzir expressãoem uma planta, parte de planta ou célula de planta, da seqüência deácido nucleico de (a); e opcionalmentec. Uma seqüência de terminação de transcrição.
19. Construto de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que uma das citadas seqüências de controle é uma de:(i) um promotor constitutivo, preferivelmente um promotor GOS2 ; ou(ii) um promotor específico de endosperma, preferivelmente umpromotor prolamina.
20. Uso de um construto como definido na reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de ser para aumentar rendimento de planta.
21. Planta, parte de planta ou célula de planta, caracterizadapelo fato de estar transformada com um construto como definido nareivindicação 19 ou 20.
22. Método para produzir uma planta transgênica possuindorendimento aumentado em relação às plantas de controle, caracterizado pelofato de compreender:(i) introduzir e expressar em uma planta, parte de planta ou uma célulade planta uma seqüência de ácido nucleico codificadora de umpolipeptídeo MYB-TF, na qual a expressão da citada seqüência deácido nucleico é conduzida por um promotor constitutivo, ou porum promotor específico de endosperma; e(ii) cultivar a parte de planta ou célula de planta sob condiçõespromotoras de crescimento e desenvolvimento de planta.
23. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de possuirrendimento aumentado em relação às plantas de controle, o citado rendimentoaumentado resultante da expressão aumentada em uma planta de umtransgene de ácido nucleico codificador de um polipeptídeo MYB-TF.
24. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 23,caracterizada pelo fato de que a citada expressão está preferencialmenteaumentada no endosperma de uma semente de planta.
25. Planta transgênica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 17, 21, 23, ou 24, caracterizada pelo fato de que a citada plantaé uma planta de colheita ou uma planta monocotiledônea ou um cereal, talcomo arroz, milho, trigo, cevada, painço, centeio, triticale, sorgo e aveia.
26. Partes colhíveis de uma planta como definida em qualqueruma das reivindicações 17, 21, 23, 24, ou 25, caracterizadas pelo fato dascitadas partes colhíveis serem sementes.
27. Produtos, caracterizados pelo fato de serem derivados deuma planta como definida na reivindicação 25 e/ou das partes colhíveis daplanta como definida na reivindicação 26.
28. Uso de uma seqüência de ácido nucleico codificadora deum polipeptídeo MYB-TF, cuja seqüência de ácido nucleico estáoperacionalmente ligada em um promotor constitutivo, caracterizado pelo fatode ser no aumento de rendimento de planta comparado com uma planta decontrole.
29. Uso de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelofato de que o citado rendimento de planta é um ou mais de: (i) vigor de mudaaumentado em emergência; (ii) número aumentado de raízes grossas; (iii)índice de verdor aumentado (antes da floração); (iv) taxa de enchimento desemente aumentada (v) peso total de sementes por planta aumentado; (vi)número aumentado de sementes cheias; ou (vii) índice de ceifa aumentado.
30. Uso de uma seqüência de ácido nucleico codificadora deum polipeptídeo MYB-TF, cuja seqüência de ácido nucleico estáoperacionalmente ligada em um promotor específico de endosperma,caracterizado pelo fato de ser no aumento de rendimento de planta comparadocom uma planta de controle.
31. Uso de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelofato de que o citado rendimento de planta aumentado é um ou mais de:(i) peso total de sementes por planta aumentado;(ii) número aumentado de sementes cheias; ou(iii) índice de ceifa aumentado.
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CN117660474B (zh) * 2023-10-25 2024-10-01 南京农业大学 梨转录因子PbrMYB65与PbrACO2基因启动子互作在调控果实柠檬酸异构化中的应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2004053055A2 (en) * 2002-12-04 2004-06-24 Monsanto Technology Llc Transgenic maize with enhanced phenotype
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