BRPI0708273A2

BRPI0708273A2 - uso de compostos de hexoses

Info

Publication number: BRPI0708273A2
Application number: BRPI0708273-8A
Authority: BR
Inventors: Waldemar Priebe; Slawomir Szymanski; Izabela Fokt; Charles Conrad; Sigmund Hsu; Theodore J Lampidis
Original assignee: Univ Texas
Priority date: 2006-02-24
Filing date: 2007-02-26
Publication date: 2011-05-24
Also published as: EP1986660A2; WO2007101148A2; MX2008010833A; US20100130434A1; EP1986660A4; WO2007101148A3; CA2643038A1; JP2009531301A; KR20080096807A; AU2007220777A1

Abstract

USO DE COMPOSTOS DE HEXOSES. Métodos de tratamento de glioblastoma e câncer pancreático são providos pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de hexose para um indivíduos em necessidade do mesmo. O objeto da invenção inclui método de tratamento de câncer cerebral e pancreático, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de manose a um indivíduo em necessidade do mesmo. O objeto da invenção inclui ainda métodos de tratamento da proliferação de tumores, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de 2-FM a um individuo em necessidade do mesmo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DECOMPOSTOS DE HEXOSES".

Este pedido reivindica prioridade ao pedido U.S. provisório60/776 793, depositado em 24 de fevereiro de 2006; ao pedido U.S.

provisório 60/795 621, depositado em 27 de abril de 2006 e ao pedido U.S.provisório 60/796 173, depositado em 28 de abril de 2006, os conteúdos dosquais são aqui incorporados em sua totalidade por referência neste pedidode patente.

Campo da Invenção

A presente invenção é dirigida a compostos de hexoses, úteis notratamento de câncer, e a métodos de tratamento de doenças mediadas porcâncer, em um indivíduo em necessidade do mesmo, pela administraçãodeste composto.

Antecedentes da Invenção

Os tratamentos contra câncer são freqüentemente associados adesafios representados pelo desenvolvimento de resistência do tumor.Apoptose, um tipo de morte celular programada, envolve uma série deeventos bioquímicos que levam à morfologia e morte celular. O processoapoptótico é executado de maneira que os fragmentos celulares sejamdispostos com segurança. No entanto, as terapias contra o câncerpossibilitam afetar as estruturas e processos fundamentais que induzemmorte celular pela elucidação das vias de transdução da sinalizaçãointracelular. De fato, processos defeituosos de apoptose foram implicadosem inúmeras doenças. Apoptose em excesso causa doenças com perdacelular, como em lesões isquêmicas. Por outro lado, um nível insuficiente deapoptose resulta em proliferação celular descontrolada, como ocorre nocâncer.

As alterações ocorridas na progressão de gliomas malignospodem estar relacionadas com a ativação da via de PI/3K AKT (tipicamente,pela perda de PTEN ou pela ação de fatores do crescimento, como EGFR).Esta via relacionada com a sobrevivência ativa algumas alterações deadaptação que incluem entre outras, um estímulo para angiogênese,inibidores para alterações de apoptose e desvios metabólicos quepromovem, de preferência, ativação de glicólise. Da forma semelhante,novos alvos para o tratamento contra câncer pancreático incluem aquelesdas vias de transdução de sinalização e moléculas envolvidas emangiogênese, especificamente, a via de sinalização do oncogene ras einibidores de metaloproteínases da matriz (MMP).

Muitos cânceres, como gliomas malignos e câncer pancreático,são intrinsecamente resistentes a terapias convencionais e representamdesafios terapêuticos importantes. A incidência anual de gliomas malignos éde 6,4 por 100.000 casos (Central Brain Tumor Registry of the United States,2002-2003), sendo estes o subtipo mais comum de tumores cerebraisprimários e o mais fatal entre os cânceres humanos. Em sua manifestaçãomais agressiva, gliobastoma multiforme (GBM), a duração média dasobrevida em pacientes varia de 9 a 12 meses, apesar de esforços máximosde tratamento. De fato, os tumores de aproximadamente um terço dospacientes com GBM continuarão a se desenvolver apesar do tratamentocom irradiação e quimioterapia. Da mesma forma, dependendo da extensãodo tumor quando diagnosticado, o prognóstico para câncer pancreático égeralmente considerado reservado, com poucas vítimas ainda vivas 5 anosapós o diagnóstico, sendo rara a remissão completa.

Ademais, além do desenvolvimento de resistência a tratamentosdo tumor, um outro problema no tratamento de tumores malignos é a suatoxicidade para tecidos normais que não foram afetados pela doença. O alvode quimioterapias é freqüentemente eliminar células que se dividemrapidamente, independentemente se estas são normais ou malignas. Noentanto, pode não ser necessário morte celular disseminada e os efeitoscolaterais associados a tratamentos contra câncer para a supressão dotumor, se as vias de controle de crescimento de tumores puderem serneutralizadas. For exemplo, uma das abordagens é o uso de terapiasensibilizante, ou seja, tratamento convencional em dose baixa, combinadoa um fármaco que vise especificamente processos fundamentais na célulatumoral, aumentando os efeitos do outro fármaco.Além disso, terapias combinadas incluem estratégias à base devacinas, combinando os elementos citorredutores e imunomoduladores daquimioterapia com a especificidade citotóxica para a célula tumoral daimunoterapia. No entanto, terapias combinadas são tipicamente mais difíceis,para o paciente e o médico, do que terapias que requerem somente um únicoagente. Além disso, certos tumores possuem uma resistência intrínsecacontra radioterapia e muitas modalidades de quimioterapia, possivelmentedecorrente dos padrões diferenciados de crescimento, e tipos diferentes depadrões de crescimento podem representar vários graus de hipóxia emregiões de cada tumor. For exemplo, gliomas podem crescer de maneirapredominantemente infiltrativa, com pouca ou nenhuma intensificação decontraste em exames de IRM, em comparação a lesões de massa decrescimento mais rápido que intensificam o contraste. Da mesma forma,estágios precoces de câncer pancreático podem passar despercebidos. Alémdo mais, áreas hipóxicas relativas podem ser observadas não só no centro damassa tumoral de crescimento rápido, a qual freqüentemente apresentaregiões de necrose associadas à mesma, como também algumas regiõesrelativamente hipóxicas no componente infiltrativo do tumor. De acordo com omesmo, algumas destas regiões relativamente hipóxicas podem contercélulas cujo ciclo ocorre em velocidade mais lenta e podem, por conseguinte,ser resistentes a agentes quimioterápicos.

Recentemente, foram propostas algumas terapias contra câncervoltadas para o uso de inibidores glicolíticos. Esse tipo de inibidor pretendebeneficiar-se da seletividade resultante da troca de metabolismo aeróbicopara anaeróbico pela célula. Por causa do crescimento do tumor, as célulascancerosas distanciam-se do sangue (suprimento de oxigênio). Sob hipóxia,as células do tumor regulam positivamente a expressão de transportadoresde glicose e de enzimas glicolíticas, favorecendo, por seu turno, absorçãoaumentada dos análogos de glicose, em comparação a células normais emambiente aeróbico. O bloqueio da glicólise, em uma célula no sangue, nãoprovocará a sua morte porque esta sobrevive utilizando oxigênio paraqueimar gordura e proteína, existentes em sua mitocôndria, para produçãode energia (por meio de moléculas que armazenam energia como ATP). Emcontraposição, quando a glicólise é bloqueada em células em ambientehipóxico, a célula morre porque sem oxigênio, ela é incapaz de produzirenergia (via mitocôndria) por oxidação de gordura e proteína. Porconseguinte, embora os inibidores glicolíticos tenham mostrado ser umapromessa para o tratamento de certos tipos de câncer, nem todas as célulascancerosas existem em ambiente hipóxico. Realmente, observaçõesclássicas por Otto Warburg demonstraram ser preferência de muitos tumoresutilizarem preferivelmente a glicólise para produção celular de energia,mesmo na presença de quantidades adequadas de oxigênio (denominadaI glicólise oxidativa ou "efeito de Warburg"). Esta resposta adaptativa do tumorparece ainda ser verdadeira também para gliomas malignos.

Por conseguinte, há necessidade para tratamento de cânceresque exibem resistência à quimioterapia, padrões diferenciados decrescimento ou padrões de crescimento com vários níveis de hipóxia emregiões no interior do tumor e/ou que possuem vias para sobrevivência queestimulam a angiogênese ou inibem a apoptose.Sumário da invenção

Foram descobertos compostos de hexoses e composiçõesfarmacêuticas dos mesmos que previnem, inibem e modulam câncer,juntamente com o uso dos compostos para tratamento de câncer,especialmente, glioblastoma e câncer pancreático. A presente invençãoexpõe o uso de compostos de hexoses úteis no tratamento de câncer e dedistúrbios e condições mediadas por câncer. Os métodos de tratamento deglioblastoma e câncer pancreático compreendem a administração de umaquantidade terapeuticamente eficaz de um composto de hexose para umindivíduo em necessidade da mesma. De particular interesse, é o método detratamento da proliferação de tumores, compreendendo a administração deuma quantidade terapeuticamente eficaz de 2-FM para um indivíduo emnecessidade do mesmo. A presente invenção inclui métodos de tratamentode câncer pela administração de um composto de manose a um indivíduoem necessidade do mesmo.Descrição Detalhada dos Desenhos

A Figura 1A retrata os resultados de um ensaio de inibição decrescimento de um tumor, em células SKBR3, com 2-DG, 2-FDG, 2-FDM eoxamato por um período de 24 horas. Cada valor representa a média ± DPde amostras em triplicata.

A Figura 1B retrata os resultados de um ensaio decitotoxicidade, em células SKBR3, com 2-DG, 2-FDG, 2-FDM ou oxamatoem 24 horas. Cada valor representa a média ± DP de amostras em triplicata.

A Figura 2A retrata os resultados do crescimento de célulasSKBR3, em 24 horas, na ausência ou presença de 2-DG ou 2-FDG e Iactatoem concentração de 2 mM no meio.

A Figura 2B retrata os resultados do crescimento de célulasSKBR3, em 6 horas, na presença de 2-DG ou 2-FDG nas mesmasconcentrações utilizadas na Figura 2A, seguido pela quantificação de ATPem Iisados de células inteiras.

A Figura 3A retrata os resultados de ensaios de inibição decrescimento em células SKBR3, após tratamento com 2-DG na presença devários açúcares. Cada valor representa a média ± DP de amostras emtriplicata.

A Figura 3B retrata os resultados de ensaios de citotoxicidadeem células SKBR3, após tratamento com 2-DG na presença de váriosaçúcares. Cada valor representa a média ± DP de amostras em triplicata.

A Figura 3C retrata os resultados de ensaios de inibição decrescimento em três modelos diferentes de "hipóxia", após tratamento com2-DG na presença ou ausência de manose a 2 mM.

A Figura 3D retrata os resultados de ensaios de citotoxicidadeem três modelos diferentes de "hipóxia", após tratamento com 2-DG napresença ou ausência de manose a 2 mM.

A Figura 4A retrata os resultados de células SKBR3 tratadas por48 horas com vários fármacos, conforme indicado para cada faixa, e extratoscelulares foram obtidos e analisados pela técnica de Western Blot com oconjugado HRP-ConA. Quantidades iguais de proteína foram carregadas emcada faixa e verificadas por β-actina. As glicoproteínas (delimitadas porsetas) mostram que 8 mM de 2-DG e 2-FDM, porém não de 2-FDG, diminuias suas ligações a ConA e que essa redução pode ser revertida por manose.

A Figura 4B retrata os resultados das células da Figura 4A queforam analisadas pela técnica Western Blot quanto à presença de erbB2,uma glicoproteína com alto nível de expressão. O peso molecular destaproteína é alterado por doses semelhantes de 2-DG e 2-FDM.

A Figura 5A apresenta os resultados de células SKBR3 tratadascom 8 mM de 2-DG, 2-FDG ou 2-FDM por 24 horas, e Iisados de célulasinteiras foram analisados pela técnica Western Blot quanto à presença deI duas chaperonas moleculares, Grp78 e Grp94. 1 micrograma/ml detunicamicina (TUN) foi utilizado como controle positivo. A carga protéica foiverificada por β-actina.

A Figura 5B mostra análises por Western Blot das proteínas dosensaios, quando células em modelos de "hipóxia" A, B e C foram tratadascom doses semelhantes de análogos de açúcar.

A Figura 6 retrata os resultados de células SKBR3 tratadas com8 mM de 2-DG, 2-FDG ou 2-FDM por 24 horas, e Iisados de células inteirasforam testados com sondas quanto a CHOP/GADD 154. A indução deCHOP/GADD154 por 2-DG e 2-FDM foi revertida pela adição de manoseexógena, enquanto que a glicose não exerceu efeito sobre a quantidadedesta proteína. Tunicamicina foi utilizada como controle positivo. A cargaprotéica foi verificada por β-actina.

A Figura 7 apresenta vias de glicólise e de glicosilação ligada aN, ilustrando que 2-DG, 2-FDM e 2-FDG são capazes de inibir afosfoglicoisomerase, resultando em bloqueio de glicólise e levando à mortecelular em células de tumores hipóxicos. No entanto, em certos tipos decélulas tumorais sob condições aeróbicas, 2-DG e 2-FDM podem interferirem montagem de oligossacarídeos ligados a lipídeos, levando à indução deresposta celular a proteínas não enoveladas e toxicidade porque as suasestruturas assemelham -se à de manose, bem como a de glicose, (triângulo= glicose, hexágono = manose e quadrado = N-acetil-glicosamina)A Figura 8A apresenta ensaios de MTT, demonstrando assensibilidades de linhagens celulares selecionadas de gliomas e certoscompostos de hexose, objeto da invenção.

A Figura 8B apresenta ensaios de MTT1 demonstrando assensibilidades de linhagens celulares selecionadas de gliomas e certoscompostos de hexose, objeto da invenção.

A Figura 8C apresenta ensaios de MTT, demonstrando assensibilidades de linhagens celulares selecionadas de gliomas e certoscompostos de hexose, objeto da invenção.

A Figura 9A retrata o crescimento de células de gliomasmediante tratamento com vários compostos de hexoses.

A Figura 9B retrata a supressão do crescimento de células D54mediante tratamento com 2-DG.

A Figura 9C retrata a supressão do crescimento de células D54mediante tratamento com 2-FG.

A Figura 10 demonstra a diferença em efeito de hipóxia sobrecélulas tratadas com 2-DG.

A Figura 11 exibe a produção de Iactato de uma linhagem celularde glioblastoma humano, sob condições hipóxicas e normóxicas.

A Figura 12 exibe os resultados do crescimento de umalinhagem de células de glioma sob condições hipóxicas e normóxicas.

A Figura 13 demonstra a absorção de 2-FG em células deglioma.

A Figura 14 exibe os resultados do tratamento de gliomas com2-DG em camundongos.

A Figura 15 exibe a ação de 2-FM contra células Colo357-FG decâncer pancreático.

A Figura 16 exibe a ação de 2-halo-D-manose contra célulasU251 de gliomas.

A Figura 17 exibe a supressão de crescimento de células U87por 2-FM.

A Figura 18 fornece um quadro descrevendo o percentual deindução de autofagia em células U87 de gliomas após tratamento com 2-flúor-manose.

Descrição Detalhada

As opções terapêuticas para gliomas malignos permanecembastante limitadas. Esse fato é decorrente em parte da resistência intrínsecadas células a muitas opções disponíveis para quimioterapia. Talvez este fatoseja decorrente em parte também aos padrões de crescimentosdiferenciados que os gliomas malignos exibem. Em outras palavras, osgliomas podem crescer de maneira predominantemente infiltrativa, compouca ou nenhuma intensificação de contraste observada em exames deIRM, em comparação a lesões de massa de crescimento mais rápido queintensificam o contraste. Muitos estudos indicaram que esses tiposdiferentes de padrões de crescimento representam também vários graus deregiões hipóxicas em cada tumor. Áreas hipóxicas relativas podem serobservadas não só no centro da massa tumoral de crescimento rápido quefreqüentemente apresentam regiões de necrose associadas à mesma, comotambém algumas regiões relativamente hipóxicas no componente infiltrativodo tumor. De acordo com o mesmo, algumas destas regiões relativamentehipóxicas podem conter células cujo ciclo ocorre em velocidade mais lenta epodem, por conseguinte, ser resistentes a muitos agentes quimioterápicos.

Adicionalmente, as observações por Warburg que descreveu umapreferência de muitos tumores a utilizarem glicólise, mesmo na presença dequantidades adequadas de oxigênio (denominada glicólise oxidativa ou"efeito de Warburg"), parecem ser ainda verdadeiras também para gliomasmalignos. Postula-se que, por causa dessas características, os gliomas eoutros tumores que se sustentam com altos níveis de glicólise, comotumores pancreáticos, podem ser sensíveis a inibidores de glicólise e quepossam exercer um impacto importante sobre o crescimento do tumor.

Dessa forma, uma característica adicional única para o cérebro,de modo geral, e gliomas especificamente é a expressão aumentada detransportadores de glicose que absorvem açúcar com avidez para dentro doSNC. Postula-se que, por causa destas características, os gliomasrepresentem um estado de doença único que deve ser particularmentesensível a inibidores de glicólise. A fim de testar essa hipótese, utiliza-seinibidores conhecidos de glicólise contra alguns painéis de linhagenscelulares de gliomas in vitro, sob condições hipóxicas e normóxicas. O efeitodos agentes foi analisado também em animais com xenoenxertos ortotópicosde gliomas, empregando alguns esquemas diferentes de doseamento.

Um desvio em metabolismo por gliomas de grau alto para utilizarpreferivelmente glicólise como a fonte primária para produção energia,mesmo na presença de oxigênio, "O Efeito Warburg", o qual é, em parte,promovido por HIF-1A e ativação da via da PI-1 quinase. 2-desoxiglicose,inibidor eficaz da glicólise, bloqueia a conversão de 2-desoxiglicose-6-fosfato, pela reação da enolase, e produz acúmulo desse produto na célulagraças ao grupamento fosfato carregado.

Os desvios metabólicos conhecidos ocorrem em neoplasmas degrau alto, incluindo gliomas, que utilizam preferivelmente glicólise para asnecessidades energéticas da célula. Estes desvios são promovidos por viasde sobrevivência, incluindo ativação de HIF-1A e PI-3 quinase, que induzema produção de enzimas fundamentais exigidas para glicólise, bem comoregulam positivamente transportadores de glicose. Este fenótipo glicolítico éuma característica dominante que prevalece mesmo sob condiçõesnormóxicas. Este fenótipo foi reconhecido e descrito anteriormente como "oEfeito de Warburg". Em decorrência deste desvio fenotípico, esses tumoresdevem ser mais sensíveis a inibidores de glicólise do que células normais.Um grupo de inibidores glicolíticos à base de açúcares e outros compostosde manose podem servir como agentes terapêuticos. Foi demonstrado,nesse estudo, que um protótipo de inibidor à base de açúcar, 2-desoxigli-cose, possui efeitos antiglioma toleráveis e potentes. Compostos dehexoses, isoladamente ou combinados à quimioterapia citotóxica, sãoeficazes no tratamento de câncer, especialmente, gliomas e câncerpancreático. Adicionalmente, como este fenótipo glicolítico é promovidoinicialmente por condições hipóxicas no ambiente do tumor, esse tipo deterapia deve ser considerado junto a uma terapia antiangiogênica. De fato,tumores capazes de "escapar" de terapia antiantiogênica podem serpreferivelmente mais sensíveis a inibidores de glicólise e/ou compostos dehexoses de modo geral.

Demonstrou-se que compostos de hexoses à base de açúcaressão eficazes no tratamento de tumores formados por gliomas de grau alto ecâncer pancreático. Adicionalmente, outros tipos de inibidores doscompostos estão sendo criados para favorecerem a absorção no SNC emanterem a biodisponibilidade oral favorável que o 2-DG desfrutaatualmente. Estudos em andamento com compostos de hexoses, emcombinação com agentes citotóxicos e agentes antiangiogênicos,forneceram direções inteligentes em otimização para futuros estudos clínicosde combinações.

Composto de hexose significa e inclui qualquer monossacarídeocontendo seis átomos de carbonos. A família de aldohexoses é uma classede hexoses que inclui glicose, galactose e manose, por exemplo. Asaldohexoses podem compreender também vários desoxiaçúcares, como2-desoxiglicose, fucose, cimarose e ramnose. A família de cetohexosespertence a uma outra classe de hexoses, exemplificadas por frutose esorbose. Embora as hexoses da presente invenção possuam normalmente aD-configuração que ocorre naturalmente, elas podem ser também L-enan-tiômeros. Hexoses da presente invenção podem incluir alfa anômeros, betaanômeros e misturas destes. Qualquer hexose da presente invenção podeser opcionalmente substituída. Essas substituições envolvem a troca de umgrupo hidroxila por um halogênio, como flúor, cloro ou bromo. Na presenteinvenção, a substituição é tipicamente no carbono C-2 da hexose, podendoocorrer na posição axial ou equatorial de uma hexose na conformação emcadeira de seu anel de 6 membros. A substituição em C-2, na posição axial,indica que o açúcar é um derivado de manose ou um açúcar de mano-configuração. A substituição em C-2, na posição equatorial, indica que oaçúcar é um derivado de glicose ou um açúcar de glico-configuração.

Compostos de hexoses úteis na prática do objeto da invençãoincluem compostos expostos na Patente U.S. N9 6 670 330 e pedidos dePatente U.S. 20030181393, 20050043250 e 20060025351, aqui incorpo-rados por referência neste pedido. Em certas concretizações da presenteinvenção, os compostos preferidos são inibidores à base de açúcares deproliferação tumoral, como 2-desóxi-glicose (2-DG), 2-desóxi-manose (2-DM), 2-flúor-glicose (2-FG) e 2-flúor-manose (2-FM) e similares.

"Tumor do sistema nervoso central" significa qualquercrescimento anormal em tecido do cérebro, medula espinhal ou outro tecidodo sistema nervoso central, quer benigno ou maligno. Ele incluiparticularmente gliomas, como astrocitoma pilocítico, astrocitoma de graubaixo, astrocitoma anaplástico e glioblastoma multiforme (GBM ouglioblastoma). "Tumor do sistema nervoso central" inclui também outros tiposde gliomas benignos ou malignos, como glioma do tronco cerebral,ependimoma, ganglioneuroma, glioma pilocítico juvenil, glioma misto,oligodendroglioma e glioma de nervo óptico. "Tumor do sistema nervosocentral" inclui também não-gliomas, como cordoma, craniofaringioma,meduloblastoma, meningioma, tumores pineais, adenoma hipofisário,tumores neuroectodérmicos primitivos, schwannoma, tumores vasculares eneurofibromas. Finalmente, "tumor do sistema nervoso central" incluitambém tumores metastáticos, quando há disseminação de células malignaspara o sistema nervoso central de outras partes do corpo.

De acordo com a presente invenção "tratando", "tratamento" ou"alívio" refere-se a tratamento terapêutico e profilático ou medidas deprevenção, em que o objetivo é prevenir ou retardar o crescimento de umtumor do sistema nervoso central ou eliminá-lo completamente. Aqueles emnecessidade de tratamento incluem indivíduos com tumor identificado dosistema nervoso central, indivíduos com suspeita de tumor do sistemanervoso central e indivíduos identificados como em risco de desenvolvimentode tumor do sistema nervoso central. O "tratamento" de um tumor dosistema nervoso central é bem-sucedido em um indivíduo se, depois desteter recebido uma quantidade terapêutica de um composto de hexose, deacordo com os métodos da presente invenção, for observada uma ou maisdas seguintes condições: redução no tamanho do tumor ou ausência dotumor; inibição ou interrupção do crescimento do tumor; inibição ouinterrupção de metástase do tumor; e/ou alívio em alguma medida de um oumais dos sintomas associados com o tumor, como redução de morbidade emortalidade ou melhora da qualidade de vida.

Na medida em que os compostos de hexose impedem ocrescimento e/ou eliminar células existentes em tumores cerebrais, elespodem ser considerados citostáticos e/ou citotóxicos.

Os termos "co-administrando" ou "co-administração" pretendemincluir administração de terapias simultânea ou em série. Por exemplo, co-administração pode incluir a administração de um inibidor glicolítico e de umagente quimioterápico em uma única composição. Ela pode incluir tambémadministração simultânea de uma pluralidade destas composições.

Alternativamente, co-administração pode incluir administração de umapluralidade destas composições em tempos diferentes durante o mesmoperíodo.

Um composto de hexose da presente invenção inclui, entreoutros, um inibidor glicolítico capaz de inibir glicólise oxidativa em glioma ououtro tumor cerebral, e pode incluir compostos de hexoses como2-desoxiglicose, 2-flúor-glicose, 2-flúor-manose e similares.

O tratamento antiproliferativo definido anteriormente neste pedidopode ser aplicado como terapia exclusiva ou pode envolver, além de umcomposto da invenção, uma ou mais outras substâncias e/ou tratamentos. Estetratamento pode ser obtido pela administração simultânea, em série ouseparada de cada componente do tratamento. Os compostos desta invençãopodem ser úteis também em combinação a agentes e tratamentos contracâncer e citotóxicos conhecidos, como radioterapia. Se formulado em dosefixada, estes produtos combinados empregam os compostos desta invenção nointervalo de doses descrito neste pedido e o outro agente farmaceuticamenteativo em seu intervalo aprovado de doses. Inibidores glicolíticos podem serutilizados em seqüência como parte de um regime quimioterápico envolvendotambém outros agentes anticâncer ou citotóxicos e/ou em conjunto comtratamentos não-quimioterápicos, como cirurgia ou radioterapia.Agentes quimioterápicos incluem, mas sem estar restritas àsmesmas, três categorias principais de agente terapêutico: (i) agentesantiangiogênicos, como linomide, inibidores da função da integrina-alfa-beta3, angiostatina, razoxano; (ii) agentes citostáticos, como antiestrógenos (porexemplo, tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, iodoxifeno),progestógenos (por exemplo, acetato de megestrol), inibidores da aromatase(por exemplo, anastrozol, letrozol, borazol, exemestano), antihormônios,antiprogestógenos, antiandrógenos (por exemplo, flutamide, nilutamide,bicalutamide, acetato de ciproterona), agonistas e antagonistas de LHRH(por exemplo, acetato de goserelina, leuprolide), inibidores da testosterona5-alfa-dihidroredutase (for exemplo, finasteride), inibidores da farnesiltrans-ferase, agentes anti-invasão (for exemplo, inibidores da metaloproteinase,como marimastat e inibidores da função do receptor de ativador deplasminogênio de uroquinase) e inibidores da função de fatores de cresci-mento (estes fatores de crescimento incluem, por exemplo, EGF, FGF, fatorde crescimento derivado de plaquetas e fator de crescimento de hepatócito;estes inibidores incluem anticorpos contra fatores de crescimento, anticorposcontra receptores de fatores de crescimento, como Avastin (bevacizumab) eErbitux (cetuximab); inibidores de tirosina quinase e inibidores deserina/treonina quinase); e (iii) fármacos antiproliferativos/antineoplásicos ecombinações destes, conforme empregados em oncologia médica, comoantimetabólitos (por exemplo, antifolatos como metotrexato, fluorpirimidinascomo 5-fluoruracil, análogos de purina e adenosina, citosina-arabinosídeo);antibióticos antitumor intercalados (por exemplo, antraciclinas, comodoxorrubicina, daunomicina, epirrubicina e idarrubicina, mitomicina-C,dactinomicina, mitramicina); derivados de platina (por exemplo, cisplatina,carboplatina); agentes alquilantes (por exemplo, mostarda nitrogenada,melfalan, clorambucil, bussulfan, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosuréias,tiotepa; agentes antimitóticos (por exemplo, alcalóides de vinca, comovincristina, e taxóides, como Taxol (paclitaxel), Taxotere (docetaxel) eagentes mais recentes com ação em microtúbulos, como análogos deepotilona, análogos de discodermolide e análogos de eleuterobina);inibidores da topoisomerase (por exemplo, epipodofilotoxinas, comoetoposide e teniposide, ansacrina, topotecan); inibidores do ciclo celular;modificadores de resposta biológica e inibidores de proteassomo, comoVelcade (bortezomib).

Qualquer técnico no assunto reconhecerá rapidamente que osmétodos de tratamento expostos na presente invenção podem ser efetuadospor diversas vias de administração e com várias quantidades/concentraçõesde compostos de hexoses. A via de administração preferida pode variardependendo dos compostos de hexoses que estão sendo utilizados, e estasvias incluem, entre outras, oral, bucal, intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.),I intraparenteral (i.p.), tópica ou qualquer outra via de administraçãoreconhecida pela FDA. As concentrações administradas ou terapêuticasvariarão dependendo do indivíduo em tratamento e os compostos de hexoseque estão sendo administrados. Em certas concretizações, a concentraçãodos compostos de hexoses varia de 1 mg a 50 gm por quilograma de pesocorporal.

Inicialmente, uma série de análogos de glicose 2-flúor, 2-bromoe 2-cloro substituídos foi preparada e analisada como possíveis substratoscompetitivos para glicose na via da glicólise, e se estes análogos operariamcomo inibidores glicolíticos de maneira semelhante à de 2-desóxi-glicose (2-DG). Descobriu-se que 2-flúor-D-manose é um agente antitumoral eficazporque as suas propriedades poderiam ser derivadas do fato de que 2-flúor-D-manose (doravante referido também como "2-FM") é semelhante a 2-desóxi-D-glicose (igual a 2-desóxi-D-manose), considerando a semelhançaem tamanho do átomo de flúor e do hidrogênio, ou poderia ser semelhante aD-manose por se parecer mais com o grupo hidroxila do que o hidrogênio,em termos de efeitos indutores e a possibilidade de formação de ligaçãocom hidrogênio. Em uma situação posterior, 2-flúor-D-manose poderia afetarfunções biológicas, processos metabólicos e biológicos relacionados com aD-manose. Além disso, a combinação de efeitos que poderia afetarprocessos celulares relacionados com a D-glicose e D-manose.

De fato, os dados providos nas Figuras 15 a 18 mostram que a2-flúor-D-manose é mais potente do que 2-DG e que possui tambématividade melhor ou semelhante à de 2-flúor-D-glicose em células Colo357-FG pancreáticas. Além disso, 2-flúor-D-manose (2-FM) foi comparada comoutros análogos da 2-desóxi-D-manose, a saber, 2-cloro-D-manose (2-CM) e2-bromo-D-manose (2-BM). Surpreendentemente e não previsto, 2-flúor-manose é mais potente do que as outras nesta série. Especificamente, osdados revelam que 2-flúor-D-manose (2-FM) é claramente superior a ambosos análogos, de bromo (2-BM) e cloro (2-CM), em inibição de crescimento decélulas U251 do tumor cerebral glioblastoma. 2-FM exibiu tambémsurpreendentemente atividade melhor sob normóxia do que sob hipóxiacontra células U87 de glioblastoma (Figura 17). Adicionalmente, pelo menosum modo de ação de 2-FM que não foi possível de predizer foi a capacidadeexibida por 2-FM de induzir potencialmente autofagia em células de tumorcerebral, fornecendo, portanto, pelo menos uma explicação do mecanismode sua ação contra linhagens de células tumorais.

Conforme apresentado imediatamente abaixo, 2-desóxi-glicose(2-DG) possui dois hidrogênios na posição C-2 do açúcar. Na conformaçãoem cadeira do anel de seis membros do açúcar, estes dois hidrogêniosocupam a posição axial e a equatorial.

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Em essência, 2-flúor-manose (2-FM) substitui o hidrogênio axialna 2-desoxiglicose (o mesmo em 2-desoximanose) por flúor. O flúor éconsiderado geralmente isotérico com hidrogênio. Por conseguinte, emalguns aspectos, a química de 2-FM poderia ser semelhante a de 2-DG. Defato, 2-FM exibiria atividade inibidora da glicólise com base nesse argumentoisotérico. No entanto, o flúor é substancialmente mais eletronegativo do queo hidrogênio e é capaz de envolver-se em motivos de ligação comhidrogênio em resultado. A esse respeito, 2-FM poderia exibircomportamento mais próximo ao da manose e, dessa forma, poderianeutralizar as vias de glicolipídeos N-ligados/proteínas na síntese deoligossacarídeos ricos em manose.

Em resumo, 2-FM exibe efeitos proliferativos surpreendente-mente bons contra células tumorais e parece ser mais potente do que 2-desóxi-D-glicose (também referida neste pedido como "2-DG") e 2-desóxi-2-flúor-D-glicose (também referida neste pedido como "2-FG"). Conforme édiscutido abaixo, o composto 2-FM foi testado especificamente em linhagensde células 231-GFP de câncer de mama, U251 de tumor cerebralgliobastoma multiforme (figura 16) e Colo357-FG de câncer pancreáticohumano (figura 15). Em células U251 e Colo357-FG, 2-FM foi comparadodiretamente a 2-DG, 2-FG, 2-desóxi-2-cloro-D-manose (às vezes referidaneste pedido como "2-CM"), 2-desóxi-2-bromo-manose (referida tambémneste pedido como "2-BM"), 2-desóxi-cloro-D-glicose (referida também nestepedido como "2-CG") e 2-desóxi-2-bromo-D-glicose (referida também nestepedido cornos "2-BG"). Em glioblastoma (Figuras 16, 17 e 18) e câncerpancreático (Figura 15), 2-FM foi o agente mais potente daquelescomparados, e as diferenças observadas foram especialmente grandesentre 2-FM e seus derivados de cloro e bromo. As diferenças foram tambémsignificativas quando comparado a 2-DG. Os dados, por conseguinte,indicam que o 2-FM pode operar de modo diferente daquele de 2-DG e 2-FGna inibição da proliferação de células tumorais. Os dados indicam ainda queo tratamento terapêutico antitumoral com 2-FM pode ser muito eficaz paracâncer, especialmente em tumores cerebrais e pancreáticos.

A Figura 15 demonstra mais particularmente as curvas deresposta à dose de viabilidade celular, por meio dos ensaios de MTT deresposta de linhagens de células Co1o357 a tratamento com 2-desóxi-glicose (2-DG), 2-flúor-glicose (2-FG) ou 2-flúor-manose (2-FM). Conformepode ser observado, o desvio das curvas de resposta à dose para esquerdaindica que 2-FM é mais potente do que 2-DG ou 2-FG. A Figura 16demonstra que a natureza do halogênio na posição 2 da manose é um fatorimportante que afeta a atividade. A linhagem de células U251 MG de gliomafoi tratada com 2-cloro-manose (2-CM), 2-bromo-manose (2-BM) ou 2-flúor-manose (2-FM). A viabilidade celular foi novamente medida por ensaio deMTT e o resultado revela claramente atividade superior de 2-FM, quandocomparada à de análogos com outros halogênios. A Figura 17 demonstraensaios de MTT da linhagem de células U87 sendo tratada com 2-flúor-manose (2-FM) na presença de hipóxia (<1% de oxigênio) ou normóxia (20%de oxigênio). Conforme pode ser observado, os dados representam umasituação incomum com este agente em linhagem de células U87 que não émais sensível na presença de hipóxia. Esse fato indica possivelmente queum mecanismo alternativo de ação da 2-FM pode ser responsável pelo efeitode eliminação de células.

A Figura 18 demonstra um mecanismo único e não previamenteidentificado da 2-flúor-manose (2-FM). Em linhagens de células U87 MG deglioma, 2-FM induz morte celular por autofagia. Os resultados da análise decitometria de fluxo de Organelas Vesiculares Ácidas (AVO) por coloraçãocom laranja de acridina (consultar procedimentos) são representadosgraficamente e são específicos e característicos do processo autofágico. Osresultados indicam aumento do percentual de células submetidas à autofagiacom exposição crescente de doses de 2-FM. Esse grau de indução deautofagia é impressionante, uma vez que o tempo de exposição de somente40 horas é bem curto para que este efeito possa ser observado.

2-DG está sendo correntemente administrado em um estudoclínico para avaliar até quanto a adição de um inibidor glicolítico que eliminacélulas tumorais hipóxicas de crescimento lento, a população celular maisresistente encontrada em tumores sólidos, pode aumentar a eficácia dotratamento de quimioteria convencional direcionada para células normóxicasque se dividem rapidamente. A presente invenção surgiu, em parte, dadescoberta de que, mesmo na presença de oxigênio, certas linhagens decélulas tumorais são mortas quando são administrados 2-DG ou 2-FM,porém não 2-desóxi-2-flúor-D-glicose (2-FG). Como 2-FG e 2-DG inibemambos a glicólise, foi suposto que um outro mecanismo diferente de bloqueiode glicólise possa ser responsável por este efeito.

De acordo com o relatado por estudos conduzidos na década desetenta, 2-DG e 2-FM interferem na glicosilação N-Iigada de glicoproteínasdo revestimento viral, interferência esta que pode ser revertida pela adiçãode manose. Como a diferença entre manose e glicose reside na orientaçãodo hidrogênio na posição do carbono 2 e porque 2-DG possui doishidrogênios na posição 2 (em vez de um hidrogênio e um grupo hidroxila,conforme é o caso para manose e glicose), ela pode ser vista como umanálogo de manose ou de glicose. De acordo com o mesmo, 2-DG podeatuar tanto sobre a glicólise como a glicosilação.

A presente invenção provê métodos para inibir a proliferação decélulas tumorais, independentemente se as células estão em ambientehipóxico ou normóxico, empregando derivados de hexoses isoladamente ouem combinação com outros tratamentos antitumorais, incluindo, entre outros,agentes citotóxicos que visam células normóxicas, antes antiangiogênicos,radioterapia e cirurgia. A presente invenção provê também fundamentaçãopara o uso clínico de análogos, como 2-DG, 2-CM e 2-FM, como agentescitotóxicos que podem ter como alvo populações de células cancerosasnormóxicas (via interferência em glicosilação) e todas as hipóxicas (viabloqueio de glicólise), em certos tipos de tumor.

Os exemplos abaixo fornecem dados que averiguam aefetividade da invenção e confirmam que 2-DG, 2-CM e 2-FM, porém não 2-FG, são tóxicos para tipos selecionados de células tumorais que crescemsob normóxia. Alguns experimentos descritos nos exemplos foramplanejados para determinar se a interferência na glicosilação, emcontraposição à inibição de glicólise, é o mecanismo responsável pelo efeitonormóxico. Embora não desejando prender-se à teoria, os resultados obtidossustentam que estes compostos podem inibir a glicosilação e, pelo menos,eliminar certos tipos de células cancerosas, independentemente se estascélulas estão em ambiente hipóxico.

Os resultados também apoiam a conclusão de que 2-FM, 2-DGe 2-CM, porém não 2-FG, atrapalham a montagem de cadeias deoligossacarídeos ligados a lipídios e induzem uma resposta celular aproteínas não enoveladas (UPR), o que pode ser indicativo de interferênciana síntese de glicoproteínas. A UPR, por seu turno, leva à ativação desinalização apoptótica específica da UPR em células sensíveis, porém nãoresistentes.

Foram identificados tipos de célula tumoral sensíveis a 2DG, 2-FM e 2-CM, sob condições normóxicas. As células foram isoladas de umtumor e testadas ex vivo para determinar se eram sensíveis a 2-DG, 2-CMou 2-FM, sob condições normóxicas. Os exemplos abaixo ilustram métodospara determinação se uma célula é sensível. Em outras concretizações,assinaturas moleculares de pares de célula estreitamente relacionados,sensíveis e resistentes a 2-DG, são comparadas a uma linhagem celular deteste. São descritas diferenças no nível e/ou atividade da fosfomanoseisomerase e de outras enzimas envolvidas na glicosilação e de enzimasenvolvidas em depósito de 2-DG.

Na presença de oxigênio (condições normóxicas), 2-DG é tóxicapara um subconjunto de linhagens de células tumorais. Esse resultado foisurpreendente, uma vez que pesquisas anteriores demonstraram haverinibição de crescimento, porém não morte, de células de tumor e normaisquando tratadas com 2-DG sob normóxia. Esta observação anterior deinibição de crescimento supostamente seria decorrente do acúmulo de 2-DGpara níveis suficientemente altos que bloqueassem a glicólise em célulassob normóxia, de forma que o crescimento era reduzido por redução dosníveis dos intermediários da via glicolítica, utilizados para vários processosanabólicos envolvidos na proliferação celular. Contudo, as células nãomorrem porque, se a função mitocondriana estiver normal, então célulastratadas em condições aeróbicas podem sobreviver o bloqueio da glicólisepor 2-DG. Uma possível explicação para como uma célula pode ser sensívela 2-DG sob condições normóxicas é, por conseguinte, que a célula possuimitocôndria defeituosa. A esse respeito, sabe-se que células tumoraisutilizam glicose através de glicólise anaeróbica para produção de energia(ATP), em vez de fosforilação oxidativa decorrente de respiraçãomitocondriana defeituosa. Contudo, experimentos posteriores demonstraramque outros inibidores da glicólise, como oxamato e 2-FG, não são tóxicospara estas células, assim, um defeito na respiração mitocondrianaprovavelmente não é responsável pela sensibilidade a 2-DG das células. Foi,portanto, lançada a hipótese de que um outro mecanismo, diferente debloqueio de glicólise, seria o responsável pela toxicidade de 2-DG nestaslinhagens celulares selecionadas, sob condições normóxicas.

De acordo com o mesmo, outras hipóteses podem explicar omecanismo desta citotoxicidade normóxica. Um possível mecanismo foiinterferência em glicosilação. O apoio para este possível mecanismo podia seridentificado em uma série de artigos, apresentados na década de setenta, nosquais foi relatado que, em certas vírus, a síntese de glicoproteínas N-Iigadasera inibida por alguns análogos de açúcar, incluindo 2-DG.

A glicose é metabolizada através de três vias importantes:glicólise, desvio para a via das pentose-fosfato e glicosilação. A Figura 7apresenta um diagrama esquemático das vias metabólicas glicólise eglicosilação. Depois que a glicose penetra no citoplasma, a hexoquinasefosforila o carbono 6 da glicose, resultando na síntese de glicose-6-fosfato(G6P) Se G6P for convertida para frutose-6-fosfato, pela fosfoglicoseisomerase (PGI), ela pode continuar na via da glicólise e produzir ATP epiruvato. Alternativamente, G6P pode ser utilizada também para síntese devários grupos de açúcares, incluindo manose, necessária para montagem deoligossacarídeos ligados a lipídeos, cuja síntese é executada no retículoendotelial (RE). Foi demonstrado que 2-DG interfere em duas das três viasmetabólicas: ele pode bloquear a glicólise, por inibição da PGI, ou podeatrapalhar a montagem de precursores de oligossacarídeos N-ligados,interferindo com a transferência de manoses ligadas a guanosina difosfato(GDP) ou dolicol fosfato para os resíduos N-acetilglicosamina, e podeesgotar as reservas de dolicol-P, necessário para transferência de manosedo citoplasma para o lúmen do RE.

Conforme observado acima, porque 2-DG possui hidrogénios emambas as posições do carbono 2 e é semelhante a um análogo da manose.

Em contraposição, a presença de fluoreto nesta posição, em análogos deflúor, cria um novo centro enantiomérico e, portanto, os derivados de flúorpodem somente ser considerados análogos de glicose ou manose; quandoestes análogos são descritos, o grupamento fluoreto é desenhado "paracima" ou acima do plano do anel carboidrato, em análogos de manose, epara baixo, nos de glicose.

Para que a manose possa ser acrescentada à cadeia deoligossacarídeos ligados a lipídeos, ela deve ser ativada inicialmente, sendotransferida para guanosina difosfato (GDP) ou dolicol fosfato. 2-DG sofre aconversão para 2-DG-GDP, o qual compete com manose-GDP para a adiçãode manose em resíduos de N-acetil-glicosamina, durante a montagem deoligossacarídeos ligados a lipídeos. Dessa forma, os oligassacarídeosanormais, produzidos em resultado de tratamento com 2-DG, levaram àdiminuição da síntese das glicoproteínas virais nos experimentos relatados naliteratura científica. Nestes experimentos, o efeito inibidor de 2-DG foirevertido, adicionando-se manose exógena, porém não quando glicose foiadicionada, confirmando mais ainda que 2-DG atua de modo um poucoparecido com o de um análogo de manose. Esses investigadores mostraramtambém que outro análogo de manose, 2-flúor-manose (2-FM) apresentavaefeitos semelhantes aos de 2-DG e que também eram revertidos por manose,indicando que a configuração da manose destes análogos pode serimportante para sua interferência na glicosilação.

Ademais, estudos genéticos demonstratam que a interrupção daglicosilação pode ter efeitos biológicos profundos. A enzima fosfomanoseisomerase (PMI) está ausente em pacientes que sofrem de Síndrome daGliproteína Deficiente em Carboidrato do tipo 1b. A ausência desta enzimaresulta em hipoglicosilação de glicoproteínas séricas, levando a trombose edistúrbios gastrintestinais, caracterizados por enteropatia por perda deproteína. Quando manose exógena é acrescentada às dietas destespacientes, os seus sintomas desaparecem, as suas glicoproteínas séricasretornam ao normal e eles se recuperam da doença. Esta observação écompatível com um mecanismo de ação para os compostos úteis napresente invenção, uma vez que dados experimentais revelam que manoseexógena pode resgatar as células tumorais selecionadas que são eliminadasquando tratadas com 2-DG, na presença de níveis normais de oxigênio.É possível que estas células tumorais especificadas regulem negativamentePMI ou possuam um defeito nesta enzima. Por outro lado, enzimas queproduzem intermediários de manose, necessários para glicosilação N-ligada,podem ser reguladas positivamente nestas células, resultando em umarelação mais alta de 2-DG-GDP para manose-GDP e causando, pelomesmo, esta sensibilidade incomum a 2-DG, sob condições normais deoxigênio.

Não obstante o mecanismo, a presente invenção provê métodospara tratamento de câncer pela administração de 2-DG e de outros análogosde glicose e manose, como agentes isolados para tratamento de tumores,mesmo sob condições normóxicas. Os compostos demonstraram exercerefeito sobre algumas linhagens de células tumorais, incluindo linhagem decélulas de câncer de mama humano (SKBR3), de câncer pulmonar decélulas não pequenas (NSCLC), gliomas, câncer pancreático e deosteossarcoma, todas tendo sofrido morte celular quando tratadas comdoses relativamente baixas de 2-DG.

A Figura 3B é um gráfico mostrando a resposta de célulasSKBR3, tratadas por 72 horas com 2-DG, 2-FM e outros agentes, sobcondições normais de oxigênio, nas doses indicadas. A citotoxicidade foimedida pelo método de exclusão de azul de tripano. Os resultados revelamque 2-DG e o análogo da manose, 2-FM, são tóxicos, enquanto que 2-FG,um análogo de glicose não o é. Ademais, oxamato, um análogo de piruvatoque bloqueia a glicólise em nível de desidrogenase láctica, também não étóxico para estas células que crescem sob condições normóxicas. Emcontraposição, o análogo de manose, 2-FM provou ser também tóxiconestas células, indicando novamente que uma cadeia principal de manoseera importante para compostos com esta atividade.

O efeito inibidor de 2-DG foi revertido, adicionando-se manoseexógena, porém não quando glicose foi adicionada, confirmando mais aindaque 2-DG atua como um análogo de manose. Outros testes revelaram que2-DG é tóxico também para NSCLC que cresce sob condições normóxicas,e que a adição de manose a 1 mM reverte esta toxicidade.

Esses dados apoiam mais ainda que 2-DG e 2-FM são tóxicospara células tumorais selecionadas que crescem sob condições normóxicas,por interferirem no processo de glicosilação. Evidências adicionais de queestes análogos de manose atuam através deste mecanismo e não debloqueio de glicólise são que as proteínas de resposta a proteínas nãoenoveladas, GRP 78 e 94, indicativas de que proteínas incorretamenteenoveladas ou incorretamente glicosiladas são reguladas positivamente por2-DG e 2-FM, de maneira dose dependente, porém não por 2-FG; esseefeito é igualmente revertido por adição de manose.

Assim, os análogos de manose, 2-DG e 2-FM, porém não oanálogo de glicose 2-FG, são tóxicos para tipos de célular tumoralselecionados que crescem sob normóxia, e a adição de manose reverte estatoxicidade. Como 2-FG inibe mais a glicólise do que 2-DG, a interferência naglicosilação e não a inibição de glicólise é o mecanismo supostamenteresponsável por este efeito. Como mencionado acima, foi relatado que 2-DGinterfere na glicosilação N-Iigada de proteínas de revestimento viral e que aadição de manose exógena reverte o efeito. Os efeitos tóxicos de 2-DGsobre linhagens de células SKBR3, NSCLC e de outros tumores humanossão, portanto, possivelmente decorrentes da interferência na glicosilação. Seessa teoria para mecanismo estiver correta, então, a toxicidade de 2-DG,nestas linhagens de células, seria revertida pela adição de manose. De fato,1 mM de manose reverte os efeitos tóxicos de 6 mM de 2-DG em uma daslinhagens de células testadas (NSCLC).

Os níveis de manose no sangue são conhecidos e variam entre50 e 60 micrograma/ml, portanto, é possível executar experimentos dose-resposta para determinar a dose mínima de manose, necessária parareversão da toxicidade de 2-DG. Por exemplo, essa determinação pode serfeita por experimentos nos quais o meio de crescimento é complementadocom soro bovino fetal (FBS) dialisado, uma vez que FBS contémnormalmente quantidades residuais de manose. Além disso, a fim deconfirmar que a adição de manose, e não de outros açúcares, é necessáriapara reversão da toxicidade de 2-DG, açúcares que sabidamente participamna síntese de glicoproteínas, ou seja, glicose, fucose, galactose esemelhantes, podem ser testado quanto a capacidade para reversão detoxicidade de 2-DG. Se qualquer um destes açúcares for capaz de reverterigualmente a toxicidade, a sua atividade pode ser, então, comparada à damanose, nos experimentos descritos abaixo para reversão dos efeitos de2-DG em induzir UPR e suas conseqüências, interferência no alongamentoda cadeia de oligossacarídeos e ligação com conconavalina A. No geral,estes experimentos permite assessar in vitro a dose de 2-DG ou 2-FM quepode ser utilizada in vivo para produzir antividade antitumoral, na presençaI de concentrações fisiológicas de manose. A dose terapeuticamente eficaz de2-DG, 2-FM e 2-CM, administrados por via oral, a ser utiilizada nos métodosda invenção variará, contudo, tipicamente de 5 - 500 mg/kg de peso dopaciente, como de 50 - 250 mg/kg. Em uma concretização, a dose éaproximadamente 100 mg/kg de peso do paciente.

A presente invenção provê também alguns métodosdiagnósticos que um médico pode utilizar para determinar se um tumor oucâncer contém células suscetíveis ao método corrente de tratamento. Emuma concretização, células de um tumor são testadas, sob condiçõesnormóxicas, para determinar se são mortas por 2-DG, 2-FM ou 2-CM. Emoutra concretização, este teste é conduzido; em seguida, manose éacrescentada para determinar se esta reverte os efeitos citotóxicos.

Em uma outra concretização, o teste quanto à suscetibilidade érealizado, utilizando glicosilação N-Iigada como indicador. Como observadoacima, 2-DG e 2-FM, porém não 2-FG, atrapalham a montagem de cadeias deoligossacarídeos ligados a lipídeos, (2) induzem uma resposta celular aproteínas não enoveladas (UPR), que é indicativa de interferência na síntesenormal de glicoproteínas, e (3) ativam sinalização apoptótica específica daUPR, em células sensíveis, porém não resistentes, a 2-DG. Adicionalmente, amanose reverte estes efeitos. De acordo com o mesmo, estes mesmos testespodem ser realizados em um tumor ou célula cancerosa de interesse paradeterminar se aquela célula é suscetível a tratamento com o presente método.Como observado acima, a incorporação de manose em umacadeia de oligossacarídeo ligado a Iipfdeo ocorre na superfíciecitoplasmática do RE, em vélulas infectadas por vírus, e esta incorporaçãopode ser inibida por derivados de GDP de 2-DG ou de 2-FM, ou seja, GDP-2DG e GDP-2-FM. Normalmente, depois que a quinta manose foiacrescentada, a cadeia do oligossacarídeo ligado a lipídeo volta-se para olúmen do RE. Para continuar acrescentando manose à cadeia emcrescimento, dolicol-fosfato (DoI-P) é utilizado como veículo para transportarmanose do citoplasma para a matriz do RE. 2-DG-GDP compete commanose-GDP pela ligação ao dolicol, interferindo mais ainda, pelo mesmo,na glicosilação N-ligada. Além disso, dolicol ligado a 2-DG compete tambémcom a transferência de manose para a cadeia de oligossacarídeos no RE.De acordo com o mesmo, é possível realizar experimentos para demonstraros efeitos de 2-DG e 2-FM na formação de precursores de oligossacarídeosligados a lipídeos, e dos derivados de manose, ou seja, manose-6-fosfato,manose-1-fosfato, GDP-manose e Dol-P-manose, em linhagens de célulassensíveis e em resistentes a 2-DG. Isso, por seu turno, demonstra a etapaou etapas na montagem de oligossacarídeos que são inibidas por 2-DG e 2-FM. O que, por sua vez, possibilita a caracterização de outros tipos decélulas como sensíveis ou resistentes, com base nos oligossacarídeosproduzidos (e não produzidos), ao serem expostas a 2-DG, 2-FM e/ou 2-CM.

Métodos cromatográficos previamente estabelecidos podem serutilizados para coletar e medir derivados de manose e precursores deoligossacarídeos ligados a lipídeos, presentes em células SKBR3 e NSCLC.Resumidamente, as células podem ser marcadas com [2-H3] manose e osIisados de células, extraídos com clorofórmio/metanol (3:2) eclorofórmio/metanol/água (10:10:3) para coleta de Dol-P-Man eoligossacarídeos ligados a lipídeos, respectivamente.

Alíquotas contendo Dol-P-Man podem ser submetidas àcromatografia em camada fina, enquanto que os oligossacarídeos ligados alipídeos podem ser separados por HPLC. Frações eluídas podem seranalisadas por contagem em cintilação líquida. Manose-fosfatos e GDP-manose podem ser separados por cromatografia decrescente em papel, e[2-3H] manose liberada de cada fração, por hidrólise ácida leve, e medidos.Os valores derivados de células tratadas com 2-DG ou 2-FM podem sercomparados a controles não tratados para demonstrar o efeito destesfármacos sobre precursores de oligossacarídeos N-Iigados e derivados demanoses. Como a toxicidade de 2-DG é revertida por manose exógena, épossível também testar se as alterações observadas na glicosilação,provocadas por 2-DG, são revertidas também pela manose.

Além de 2-DG e 2-FM, dois outros inibidores da glicosilação,tunicamicina e desoximanojirrimicina (DMJ), que exibem etapas específicasda glicosilação N-ligada, podem ser utilizados como controles positivos. Atunicamicina interfere na adição do primeiro resíduo da N-acetilglicosaminapara formar dolicol pirofosfato, e DMJ é inibidor específico da manosidase I,que retira 3 resíduos de manose no final da cadeia de oligossacarídeos N-ligados. Dessa forma, a toxicidade ou os efeitos sobre a glicosilação, dequalquer um destes agentes, não devem ser revertidos por manoseexógena. Além disso, como o análogo de glicose, 2-FG, não elimina célulasSKBR3 e NSCLC, sob normóxia, porém é mais potente do que 2-DG embloquear a glicólise e eliminar células hipóxicas, ele pode interferir naglicólise sem afetar a glicosilação e, por conseguinte, pode ser utilizadotambém como ferramenta nestes testes.

A interferência no processo de glicosilação N-Iigada no retículoendoplasmático (RE) provoca enovelamento inadequado de glicoproteínas, quesignifica uma resposta a estresse (ER) denominada resposta celular a proteínanão enovelada (UPR). Reminescente da resposta mediada por P53 a dano aoDNA, o RE responde a estresse de maneira muito parecida (1) aumentando acapacidade de enovelamente por indução de moléculas chaperonas existentes(GRP 78 e GRP 94), (2) rduzindo a sua própria carga biossintética porinterrupção da síntese protéica, e (3) aumentando a degradação de proteínasnão enoveladas. Quando o estresse não é aliviado, as vias apoptóticas sãoiniciadas e a célula morre subseqüentemente. Dessa forma, regulação positivade UPR é uma medição da interferência na glicosilação.Quando células SKBR3 são tratadas com 2-DG, estas duasproteínas de resposta a estresse do RE, GRP 78 e 94, aumentam em funçãode aumento de dose; a manose reverte esta indução. 2-FG não induz estasproteínas. De acordo com o mesmo, em uma outra concretização destainvenção, esta resposta é utilizada para determinar se um tumor ou célulacancerosa é suspectível a tratamento, em conformidade com o presentemétodo. Linhagens de células que não são sensíveis a 2-DG, sob condiçõesnormóxicas, podem ser igualmente utilizadas como controles negativos, emque a ausência de regulação positiva destas proteínas está correlacionada àresistência das células a 2-DG.

Quando o estresse do RE não pode ser superado, é iniciada asinalização para apoptose. O estresse do RE induz uma via apoptóticadependente de mitocôndria, via CHOP/GADD153, um fator de transcriçãonuclear que regula negativamente BCL-2, e uma via independente damitocôndria por ativação das caspases 4 e 5, em linhagens celulareshumanas, e da caspase 12 em linhagens celulares de camundongos. Porconseguinte, é possível realizar experimentos para determinar se a sinaliza-ção apoptótica, específica para estresse do RE, é ativada em células sensí-veis, porém não em células resistentes a 2-DG. A regulação positiva deCHOP/GADD153 e a ativação das caspases 4 e 5 podem ser analisadaspela técnica de western blot. Conforme ocorre com os testes anteriores, seesta regulação positiva for específica para linhagens sensíveis a 2-DG,então, a regulação positiva observada em uma célula cancerosa em testeserve como indicador de que o câncer do qual a célula foi derivada ésuscetível ao tratamento de acordo com a presente invenção. Comocélulas SKBR3 expressam a glicoproteína ErbB2 de maneira abundante, deacordo com o previsto 2-DG afetaria a glicosilação N-Iigada desta proteína,levando a enovelamento incorreto e degradação. A análise por Western blotde ErbB2 de células SKBR3 tratadas com 2-DG pode ser comparada a decélulas não tratadas para determinar o nível global desta proteína. Ademais,o teor de manose da ErbB2, após tratamento com 2-DG, pode ser analisadopor imunoprecipitação desta proteína e pela técnica Western Blot comConconavalina A, uma Iectina que reconhece oligossacarídeos N-Iigadoscom alto teor de manose. Como é possível que análogos de manosepossam inibir o teor de manose, não só na ErbB2, mas em todas asglicoproteínas N-ligadas, Iisados de células completas, obtidas destascélulas, podem ser testadas também com sondas contendo esta lectina.

O corante de Ponceau, que se liga a todas as proteínas, pode ser utilizadocomo controle negativo para verificar se 2-DG e 2-FM afetam asglicoproteínas e, novamente, esta ou metodologia semelhante pode serutilizada para determinar se um câncer ou célula tumoral é suscetível atratamento de acordo com a presente invenção.

Mesmo quando confirmado que o estresse do RE, indicativo deinterferência na glicosilação N-ligada, ocorreu de fato por causa de 2-DG e2-FM, a interferência na O-glicosilação, que ocorre no citoplasma, emcontrapartida a ocorrida no RE, pode ser avaliada também. Segundorelatada a literatura científica, 2-DG é capaz de inibir a remoção de resíduosde N-acetilglicosamina de um fator de transcrição O-glicosilado, Sp1,resultando em inibição da ligação a seus respectivos promotores. Sp1 é umimportante fator de transcrição para ativação de inúmeros oncogenes, oqual, se afetado por 2-DG poderia, pelo menos em parte, explicar porquecélulas SKBR3 que crescem sob normóxia são sensíveis a 2-DG. Dessaforma, o padrão de glicosilação de Sp1, após tratamento com 2-DG e 2-FMpode ser investigado por imunoprecipitação e testes com sondas contendoWGA, uma lectina que se liga especificamente a proteínas O-glicosiladas.

Uma vez que Sp1 e a glicosilação O-Iigada são afetados por 2-DG, essaalteração da glicosilação pode ser medida e utilizada como indicador de queum tumor ou outra linhagem de célula cancerosa é suceptível a morte celularmediada por 2-DG.

A morte celular, desencadeada pela resposta à proteína nãoenovelada que ocorre no retículo endoplasmático de toda célula em respostaa proteínas enoveladas inadequadamente, pode ser intensificada pelaadministração de um agente adicional, a versipelostatina. Por conseguinte,em uma concretização, 2-DG, 2-FM e/ou 2-CM são administrados a umpaciente que necessita tratamento contra câncer, e versipelostatina é co-administrada ao referido paciente.

Igualmente, a morte celular que ocorre em resposta aenovelamento inadequado de proteínas pode ser intensificada pelo bloqueioda proteólise das glicoproteínas enoveladas inadequadamente com uminibidor de proteossomo. Portanto, em uma outra concretização, a invençãoprovê um método de tratamento contra câncer pela administração de uminibidor de proteossomo, associado a 2-DG, 2-FM e/ou 2-CM. Em umaconcretização, o inibidor do proteossomo é Velcade.

Certos tipos de câncer podem ser mais suscetíveis aotratamento com o presente método do que outros. A fim de identificar estestipos, é possível analisar uma variedade de tipos de células de acordo comos métodos da invenção. Por exemplo, é possível obter uma variedade delinhagens de células cancerosas, provenientes da ATCC, e selecioná-lasconforme descrito acima para identificar outros tipos de célulasperfeitamente sensíveis a análogos de manose, como 2DG e 2FM, napresença de oxigênio. Células que são mortas por 2-DG ou 2-FM emconcentrações de 5 mM ou menos são identificadas como suscetíveis. Estaslinhagens de células tumorais sensíveis podem ser testadas também quantoà especificidade para 2-FG e oxamato em doses até 20 mM e 30 mM,respectivamente. Se a interferência na glicosilação for o modo pelo qualocorre toxicidade provocada por 2-DG e 2-FM, então estas linhagenscelulares devem ser resistentes a outros inibidores glicolíticos, 2-FM eoxamato, a não ser que a fosforilação oxidativa na mitocôndria sejadeficiente. A fim de confirmar a funcionalidade da mitocôndria destas células,a respiração pode ser medida, empregando, por exemplo, um aparelho comeletrodos do tipo Clark. A fim de confirmar que a toxicidade de 2-DG e 2-FMé decorrente de interferência na glicosilação destas linhagens de células, arecuperação da morte celular por manose pode ser analisada conformedescrito acima.

A base molecular de uma célula resistente ao método corrente ede uma outra pode não ser decorrente de diferença na expressão do geneenvolvido na síntese de GDP-manose a partir de glicose, ou seja,fosfoglicose isomerase (PMI), que converte glicose-6-fosfato em manose-6-fosfato (consultar a Figura 7). Foi demonstrado que supressão em PMI,conforme mencionado acima, causa síndrome de glicosilação 1b queresultou em hipoglicosilação de glicoproteínas séricas, levando à trombose edistúrbios gastrointestinais em um paciente identificado com este defeito. Foidemonstrado que a adição de manose à dieta alivia os sintomas do paciente,bem como normaliza suas glicoproteínas. Portanto, uma deficiência ouregulação negativa desta enzima explicaria a toxicidade de 2-DG e 2-FM ereversão, pela manose exógena, nas linhagens de células sensíveistestadas até esta data.

O motivo pelo qual regulação negativa ou supressão de PMIlevaria à toxicidade de 2-DG, nas Iinhages de células sensíveis, é que, naausência desta enzima, as células dependem de manose exógena (presenteno soro) para sintetisar precursores de oligossacarídeos N-ligados. Asconcentrações de manose no soro de mamíferos (50-60 microgramas/ml),ou no meio utilizado para estudos in vitro, são conhecidas por seremsignificativamente menores do que a concentração de glicose. Portanto, emcélulas que suprimiram ou regularam negativamente PMI1 doses baixas de2-DG e 2-FM competiriam favoravelmente com as quantidades pequenas demanose, presentes no soro, resultando em bloqueio completo da adiçãodeste açúcar às cadeias de oligossacarídeos. Por outro lado, células comPMI normal podem produzir GDP-manose a partir de glicose; portanto, sãonecessárias doses muito mais altas de 2-DG ou 2-FM para provocarinterrupção completa da montagem de oligossacarídeos. Esse fato explicariaporque a maioria das células testadas é resistente a 2-DG, sob condiçõesnormóxicas. Medições diretas da atividade desta enzima podem serutilizadas, de acordo com a invenção, para determianr se níveis deficientesou baixos de PMI são responsáveis pela sensibilidade a 2-DG e 2-FM emselecionar células que crescem sob normóxia, e se afirmativo, então, podemser utilizadas para identificar tumor e células cancerosas suscetíveis aotratamento de acordo com o presente método. Uma outra possibilidade,porém menos provável, para explicar esta sensibilidade incomum é que aPMI nestas células selecionadas é mais inibida por 2-DG e 2-FM do que namaioria das linhagens celulares normais e de células tumorais que são nãoafetadas por estes agentes quando em crescimento sob pressão normal deoxigênio. A fim de testar esta possibilidade diretamente, extratos de célulaspodem ser isolados de pares de células SKBR resistentes e sensíveis, e acapacidade para converter glicose-6-Ρ em manose-6-Ρ pode serdeterminada na presença ou ausência de 2-DG e 2-FM.

Se a atividade diminuída de PMI não for responsável pelatoxicidade de 2-DG em células SKBR3 sensíveis, então um mecanismoalternativo para explicar esse fato é a regulação positiva de genes quecodificam enzimas envolvidas na produção de derivados de manose,empregados na montagem de oligossacarídeos, ou seja, fosfomanomutase(PMM) e GDP Man sintase (Figura 7), Existe a possibilidade de que célulassensíveis a 2-DG estão sendo submetidas à glicosilação aumentada e, porconseguinte, regulam positivamente uma ou ambas estas enzimas. Estacélula acumularia mais 2-DG-GDP e, por conseguinte, levando ainterferência maior na glicosilação e conseqüetemente, morte celular, do queuma célula resistente na qual estava ocorrendo glicosilação em taxa oucapacidade mais lenta.

Independentemente se for descoberto que a regulação positivada glicosilação é um mecanismo pelo qual as células se tornam sensíveis a2-DG, a quantidade total de 2-DG acumulada ou incorporada em uma célulacontribui também para sua sensibilidade aumentada. Portanto, estudos deabsorção e de acúmulo, empregando [3H]-2-DG marcado, podem serrealizados para determinar se níveis mais altos, em uma célula, detransportador de glicose tornam esta célula mais suscetível ao tratamento deacordo com o presente método.

É possível obter mutantes resistentes a 2-DG, a partir de célulassensíveis, pelo tratamento das últimas com doses crescentes de 2-DG eseleção daquelas que sobreviverem. Nos métodos descritos, é possívelutilizar mutantes resistentes e seus equivalentes sensíveis originais. Estesestudos devem prover também um meio para se entender os mecanismospelos quais as células tornam-se resistentes a 2-DG e, por conseguinte,podem ser aplicados para utilizar melhor este fármaco clinicamente. Adiscussão precedente reflete que uma assinatura molecular pode serutilizada para predizer quais tipos de célula tumoral serão sensíveis a 2-DGe 2-FM, na presença de oxigênio.

A execução de morte celular exibe uma plasticidade remarcávelaumentando o intervalo entre apoptose e necrose. Utilizando métodosestabelecidos para comparar o modo de morte celular por investigação dotipo de clivagem de DNA1 alterações em composição, integridade e tônus demembrana podem determinar os mecanismos de morte celular, induzida porinterferência em glicosilação e por inibição de glicólise. A inibição da glicólisee da fosforilação oxidativa resulta em depleção grave de ATP, provocando,pelo mesmo, uma mudança de apoptose para necrose. Uma vez sendopreciso ATP para ativar caspases, quando este está gravemente depletado,a apoptose é bloqueada e, eventualmente sem energia, a célula sucumbevia necrose. Uma célula aeróbica tratada com um inibidor glicolítico é capazde produzir ATP via fosforilação oxidativa, promovida por aminoácidos e/ougorduras como fontes de energia. Portanto, quando 2-DG induz umaresposta UPR1 levando a morte celular sob normóxia, supõe-se que ascélulas passarão por apoptose. Por outro lado, em modelos de célulashipóxicas, prevê-se que, quando a dose de 2-DG for suficientemente altapara bloquear glicólise, estas células sofreriam depleção de ATP emorreriam por necrose.

É possível, portanto, empregar métodos estabelecidos paraanalisar apoptose e necrose e determinar se 2-DG está eliminando célulaspor meio de apoptose, necrose ou de uma combinação de ambas. Váriosparâmetros apoptóticos podem ser analisados para diferenciar necrose deapoptose, empregando-se a técnica de citometria de fluxo. Após tratamentocom 2-DG, as células podem ser duplamente coradas com Anexina-V eiodeto de propídio para detectar exposição de fosfatidil serina sobre asuperfície celular e perda de integridade da membrana celular,respectivamente. A coloração com anexina-V isolada ou com anexina-V eiodeto de propídio indica apoptose, enquanto que a coloração somente comiodeto de propídio indica necrose. Além disso, podem ser medidos tambémdois dos desfechos finais de apoptose, fracionamento de DNA nuclear eformação de DNA de fita simples. Os dois últimos parâmetros foramrelatados como exclusivos de morte celular por apoptose e têm sidoutilizados por vários investigadores para diferenciar apoptose de necrose.Níveis de ATP podem ser analisados também para determinar se estãocorrelacionados com os modos detectados de morte celular.

Ademais, se 2-DG induz tanto apoptose quanto necrose emcélulas hipóxicas, então é possível determinar o modo de morte celular,induzido por 2-FG sob condições hipóxicas. Como mencionado acima, 2-FGnão interfere em glicosilação e é um inibidor glicolítico mais potente do que2-DG. Portanto, prevê-se que a morte celular induzida por 2-FG ocorreráexclusivamente via necrose.

Linhagens de células comprovadamente sensíveis a 2-DG e/ou2-FM e/ou 2-CM in vitro, sob normóxia, que crescem rapidamente emcamundongos pelados podem ser utilizadas para demonstrar se 2-DG (e 2-FM e 2-CM) é eficaz, como agente isolado contra as mesmas, quandofornecido in vivo. Depois que os tumores atingem um certo tamanho, otratamento com 2-DG será aplicado via injeção intraperitoneal. A dose eregime de tratamento com 2-DG, de acordo com a dose letal mínimaestabelecida anteriormente nestes animais, podem ser utilizados parademonstrar regressão de tumor e citotoxicidade.

Exemplo 1: Materiais e métodos

Isolamento de Mutantes resistentes. Células SKBR3 e NSCLC,sensíveis a 2-DG, são expostas a doses crescentes de 2-DG e colôniasresistentes são isoladas e clonadas nas doses apropriadas de 2-DG. Ascélulas clonadas resistentes a 2-DG são analisadas, em seguida, ecomparadas à equivalente sensível do tipo selvagem quanto à expressão degenes específicos que podem ser responsáveis por esta sensibilidade única.

Fármacos e anticorpos. Rho 123, oligomicina, estaurosporina e2-DG, 2-FG, 2-FM, tunicamicina, desoximanojirrinomicina são obtidos deSigma Chemical Co. Os seguintes Abs primários podem ser utilizados:monoclonais contra HIF-Ia e LDH-a (BD Biosciences); erbB2 (Calbiochem,EUA); Grps 78 e 94, (StressGen, EUA); caspases 4 e 5 (StressGen1 EUA); eactina (Sigma Chemical Co.); abs policlonais contra GLUT-1 (USABiological) e GADD153/CHOP (Santa Cruz, EUA). Os anticorpossecundários são peroxidase de rábano conjugada a anticamundongo decoelho e anti-coelho de cabra (Promega.Co.).

Ensaio de citotoxicidade e Análise Rápida de Teor de DNA. Ascélulas são incubadas por 24 horas a 37 graus C em 5% de CO2, quandoentão os tratamentos com os fármacos iniciam e são continuados por 72horas. Nesse momento, células anexadas são submetidas a tratamento comtripsina e combinadas com seus respectivos meios de cultura, seguido porcentrifugação a 400 g por 5 min. Péletes contendo as células sãoressuspensos em 1,5 ml de um meio/mistura contendo azul de tripano paraensaios de citotoxicidade, ou em solução para coloração contendo iodeto depropídio/citrato hipotônico, para determinação do teor de DNA nuclear e ciclocelular, empregando um aparelho de citometria de fluxo Coulter XL. Sãoanalisadas, no mínimo, 10.000 células para gerar um histograma dedistribuição de DNA.

Ensaio de ácido lático. O ácido lático é medido adicionando-se0,025 ml de meio desproteinizado, proveniente de culturas tratadas e nãotratadas, a uma mistura de reação contendo 0,1 ml de ácido láticodesidrogenase (1000 unidades/ml), 2 ml de tampão glicina (glicina, 0,6 mol/l,e hidrazina, pH 9,2) e 1,66 mg/ml de NAD. A desproteinização ocorre pelotratamento de 0,5 ml do meio, proveniente de culturas em teste, com 1 ml deácido perclórico a 8% p/v, submetendo a vórtice por 30 s e, em seguida,incubação dessa mistura a 4 graus C por 5 min e centrifugação a 1500 g por10 min. O sobrenadante é centrifugado três vezes mais e 0,025 ml de umsobrenadante final transparente é utilizado para determinações de ácidolático. A formação de NADH é medida com um espectrofotômetro BeckmanDU r 520 UV/vis em 340 nm, a qual corresponde diretamente a níveis deácido lático, conforme determinado por uma curva-padrão de lactato.

Absorção de 2-DG. As células são semeadas em placas de Petrie incubadas por 24 horas a 37 graus C e 5% de CO2. O meio é removido emseguida e as placas são lavadas com meio livre de glicose e soro. 2 ml demeio livre de soro contendo 3H-2-DG marcado são acrescentados à placa (1TCi/placa), e estas são incubadas pela quantidade de tempo apropriada. Omeio é removido em seguida, as placas são lavadas três vezes com meiolivre de soro, a 4 graus C, contendo 100 micro M de 2-DG não marcado,sendo acrescentado 0,5 ml de NaOH a 1N. Após incubação a 37 graus C por3 horas (ou durante a noite), as células são raspadas e homogeneizadas porultrassonicação (10 segundos). A solução é coletada em tubos paraquantificação de 3H (reservando uma parte para ensaio de proteína). 100micro I de ácido fórmico, 250 micro I de amostra e 7 ml de coquetel decintilação são combinados em um frasco de contagem de 3H, e é efetuada aleitura em contador de cintilação. A taxa de transporte (nmol/mg deproteína/tempo) é calculada por CPM total/Radioatividadeespecífica/Proteína total.

Ensaio de quantificação de ATP. O kit ATP Iite (Perkin Elmer)pode ser utilizado para quantificar níveis de ATP. Cerca de 50 micro I desolução de Iise celular é acrescentado a 100 micro I de suspensão celularem uma placa de fundo branco de 96 cavidades. A placa é incubada emtemperatura ambiente em um agitador (700 rpm) por cinco minutos. Emseguida, acrescenta-se 50 micro I de solução contendo substrato àscavidades que são agitadas (700 rpm) por outros cinco minutos emtemperatura ambiente. A placa é deixada, em seguida, no escuro paraadaptação por dez minutos e efetuada a medição quanto à luminescência.

Marcação metabólica e extração de Dol-P Man e deoligossacarídeos ligados a lipídeos (LLO). De acordo com o procedimentodescrito por Lehle, as células são marcadas com [2-3H] manose por 30 min,raspadas e acrescentadas a 2 ml de metanol gelado e Iisadas porsonificação. Após adicionar 4 ml de clorofórmio, o material é sonificado,seguido por centrifugação por 10 min a 5000 rpm a 4 graus C. Ossobrenadantes são coletados e os péletes extraídos duas vezes comclorofórmio/metanol (3:2) (C/M). Os sobrenadantes combinados, contendoDol-P-Man e oligossacarídeos ligados a lipídeos de pequeno tamanho, sãosecados sob N2, dissolvidos em 3 ml de C/M, lavados e analisados porcromatografia em camada fina sobre lâminas de alumínio de sílica gel 60,em tampão corrente contendo C/M/H20 (65:25:4). O pélete restantecontendo LLOs de tamanho grande é lavado e extraído com C/M/H20(10:10:3). Alíquotas correspondentes dos extratos de C/M e C/M/H20 sãocombinadas e secas sob N2, sendo ressuspensas em 35 Yl de 1-propanolol.

A fim de liberar os oligossacarídeos por hidrólise ácida leve, sãoacrescentados 500 Tl de HCI a 0,02 N HCI, seguido por incubação por 30min a 100 graus C.

O material hidrolisado é secado sob N2 e ressuspenso emseguida por sonificação em 200 T1 de água, sendo a parte transparenteseparada por centrifugação. O sobrenadante, contendo os oligossacarídeosliberados, é utilizado para análise por HPLC.

Fracionamento de oligossacarídeos por tamanho por HPLC. Aseparação de LLOs pode ser realizada em uma coluna Supelcosil de LC-NH2 (25 cm χ 4,6 mm; 5 Tm; Supelco), incluindo uma pré-coluna de LC-NH2(2 cm χ 4,6 mm). É aplicado um gradiente linear de acetonitrila de 70% a50% em água, em vazão de 1 ml/min. As frações eluídas são analisadas porcontagem de cintilição líquida.

Preparo de manose-6-fosfato, manose-1-fosfato e GDP-manose.Após marcação com [2-3H] manose, as células são colhidas e manose livre éseparada de derivados ligados a nucleotídeos e de manose fosforilada, porcromatografia em papel, conforme descrito por Korner et al. As fraçõeseluídas são analisadas por contagem de cintilação líquida.

Análise de Western Blot. As células são dispostas em placas,em 104 células/cm2, e cultivadas sob tratamento com o fármaco pelostempos indicados. No final do período de tratamento, as células sãocoletadas e Iisadas com tampão RIPA (NaCI a 150 mM, Np-40 a 1%, DOC a0,5%, SDS a 0,1%, Tris-HCI a 50 mM, ph 8,0), complementado com umcoquetel de inibidor de proteinase. O DNA é fragmentado por passagem dasolução através de uma agulha de 21G, dez vezes. As concentrações deproteínas são medidas pelo kit Super Protein Assay (Cytoskeleton, EUA). Asamostras são misturadas com 2 χ tampão de amostra de Laemmli (Bio-Rad,EUA) e analisadas em gel de poliacrilamida de SDS. Os géis sãotransferidos para membranas de nitrocelulose (Amersham, EUA) e testadascom sondas contendo anticorpos específicos. Após a sondagem, asmembranas são lavadas e incubadas com um segundo anticorpo secundárioconjugado a HRP. A quimioluminescência é detectada por exposição a filme.

Quando indicado, as membranas são removidas com TampãoStripping (Pierce, EUA) e testadas novamente com sondas contendo umanticorpo primário antiactina.

Imunoprecipitação de ErbB2. Após tratamento por 24 horas, ascélulas são Iisadas por RIPA (NaCI a 15 mM, Np-40 a 1%, SDS a 0,1%) esonicadas. Os Iisados de células são incubados com partículas de CnBrativadas em Sefarose (Amersham, EUA), ligadas a anticorpo monoclonalanti-ErbB2 (Calbiochem, EUA), e agitados a 400 g por 5 min.

ErbB2 imunoprecipitado é carregado em géis de SDS-PAGE eanalisados por Western Blot com Conconavalina A, que se ligaespecificamente a resíduos de manose de glicoproteínas.

Ensaio de apoptose. O ensaio de apoptose por ELISA é utilizadoconforme descrito e baseia-se em desnaturação seletiva de DNA, emcromatina condensada das células apoptóticas, por formamida e reatividadede DNA de fita única (ssDNA) em células apoptóticas, com anticorposmonoclonais altamente específicos para ssDNA. Estes anticorpos detectamespecificamente células apoptóticas e não reagem com as célulasnecróticas.

Investigação do mecanismo de morte celular por citometria defluxo. A apoptose é diferenciada de necrose pelo kit de coloração An-nexin-V-Fluos Staining (Roche, EUA). Após tratamentos indicados, 106 células sãoressuspensas em tampão de incubação, contendo Anexina-V e iodeto depropídio conjugados a FITC, para detectar fosfatidilserina e integridade demembrana plasmática, respectivamente. Após incubação, as células sãoanalisadas por um citômetro de fluxo, empregando excitação a 488 nm efiltro de passagem de banda de 515 nm para detecção de fluoresceína, e umfiltro >600 nm para detecção de PI.

Análise de perfil de expressão gênica. Um kit de arranjo gênicopode ser adquirido de Super Array Inc. RNA total de linhagens de célulasselecionadas é testado com sondas contendo dCTP [a-32P] (3000 Ci/mmol),por reação de transcrição reversa. O cDNA marcado pela sonda éadicionado, em seguida, a arranjo de membrana pré-hibridizado e incubadoem estufa de hibridização durante a noite. Após lavagens múltiplas pararemoção de sonda livre, a membrana é exposta a filme de raio χ pararegistro da imagem.

Experimentos in vivo de tumor. O protocolo descrito para 2-DG +Dox, relatado em Câncer Res. 2004 (por Lampidis et ai) pode ser replicado,substituindo-se 2-FG por 2-DG. Camundongos pelados da linhagem CD1, 5a 6 semanas de vida, pesando 30 g, são implantados (S.C.) com 100 Tl dalinhagem celular 143b de osteossarcoma humano, em 107 células/ml.

Quando o tamanho dos tumores atinge 50 mm3 (9-10 dias mais tarde), osanimais são combinados em pares em quatro grupos (8 camundongos/grupo), da forma como segue: grupo de controle tratado com solução salina;2-FG isolado; Dox isolado e Dox + 2-FG. No Dia 0, os grupos de 2-FGisolado e de Dox + 2-FG recebem 0,2 ml de 2-FG i.p. a uma dose de 75mg/ml (500 mg/kg), repetida 3 χ por semana por toda duração doexperimento. No Dia 1, os grupos de Dox e de Dox + 2-DG recebem 0,3 mlde Dox i.v., na dose de 0,6 mg/ml (6 mg/kg), repetida uma vez por semanapor, no total, três tratamentos (18 mg/kg). Os camundongos são pesados, eos tumores medidos com compasso três vezes por semana.

Células SKBR3 são implantadas e testadas, no modelo acima,com 2-DG ou 2-FM sem doxorrubicina (Dox).

Exemplo 2:

Sensibilidade normóxica de certas células tumorais a derivadosde manose.Células que crescem sob hipóxia dependem exclusivamente dometabolismo da glicose, via glicólise, para produção de energiaConseqüentemente, quando esta via é bloqueada, com 2-desóxi-D-glicose(2-DG), as células hipóxicas morrem. Em contrapartida, quando a glicólise ébloqueada sob normóxia, a maioria das células sobrevivem porque gordurase proteínas podem substituir, como fontes de energia, servindo decombustível para fosforilação oxidativa na mitocôndria. A presente invençãobaseia-se em parte na descoberta de que, sob condições de pressão normalde oxigênio, um número selecionado de linhagens de células tumorais sãoeliminadas em uma dose relativamente baixa de 2-DG (4 mM). Foidemonstrado anteriormente que 2-DG interfere no processo de glicosilaçãoN-ligada, na síntese de glicoproteínas de revestimento viral, e que esta podeser revertida por adição de manose exógena. Como a toxicidade do 2-DG,sob normóxia, descrita neste pedido, pode ser completamente revertida pordose baixa de manose (2 mM), acredita-se que a glicosilação e não aglicólise seja o mecanismo responsável por esses resultados. Adicional-mente, 2-flúor-desóxi-D-glicose (2-FDG), mais potente do que 2-DG nobloqueio de glicólise e eliminação de células hipóxicas, não exibe toxicidadepara qualquer um dos tipos de células que são sensíveis a 2-DG, sobcondições normóxicas.

A fim de investigar o efeito de 2-DG sobre a síntese deglicoproteínas, concanavalina A (que se liga especificamente a porções demanose em glicoproteínas) foi utilizada em estudos que revelaram que2-DG, porém não 2-FDG, diminuiu a ligação, sendo esta reversível poradição de manose exógena. Igualmente, foi constatado que as proteínas deresposta a proteínas não enoveladas (URP), grp 98 e 78, as quaissabidamente são induzidas quando a glicosilação N-Iigada é alterada, foramreguladas positivamente por 2-DG, porém não por 2-FDG, e mais uma vez,esse efeito podia ser revertido por manose. Além disso, 2-DG induz mortecelular por regulação positiva de um fator de transcrição específico de UPR(GADD154/CHOP) que intermedia apoptose. Por conseguinte, em certostipos de células tumorais, 2-DG pode ser utilizado clinicamente como agenteisolado para eliminar seletivamente não só as células aeróbicas (viainterferência em glicosilação), como também as hipóxicas de um tumorsólido.

Apesar de angiogênese, as demandas metabólicas decrescimento rápido de tumor ultrapassam freqüentemente o suprimento deoxigênio, contribuindo para formação de regiões hipóxicas no interior damaioria dos tumores sólidos. A diminuição em níveis de oxigênio que ocorreà medida que o tumor cresce leve à taxa de replicação de célula mais lentanas áreas hipóxicas, resultando em resistência à maioria dos agentesquimioterápicos, os quais são voltados normalmente para células deproliferação rápida. Brown, J.M et ai, Exploiting Tumor Hypoxia In CâncerTreatment, Nat Rev Câncer 2004; 4:437-47. As células hipóxicas são resis-tentes a tratamento com irradiação, em decorrência de crescimento lento eda ausência de oxigênio, necessário para produzir tipos reativos de oxigênio.

Semenza, G.L., Intratumoral Hypoxia, Radiation Resistance, And HIF-1,Câncer Cell 2004;5:405-406. Além dessas desvantagens para tratamentocontra câncer, a hipóxia faz com que as células do tumor dependam de gli-cólise para produção de energia e sobrevivência. Sob hipóxia, a fosforilaçãooxidativa, o meio mais eficiente de produção de ATP, é inibida, restandosomente a glicólise como meio para produção de ATP. Por conseguinte, obloqueio da glicólise, em células tumorais hipóxicas, leva à morte celular. Defato, sob 3 condições diferentes de hipóxia simulada in vitro, foi demonstradoque células tumorais podem ser mortas por inibidores de glicólise. Maher,J.C. et ai, Greater Cell Cycle Inhibition And Cytotoxicity Induced By 2-Deoxy-D-Glucose In Tumor Cells Treated Under Hypoxic vs AerobicConditions, Câncer Chemother Pharmacol 2004; 53:116-122. Além disso, ainibição da glicólise em células normalmente oxigenadas não afeta significa-tivamente a sua produção de energia, porque fontes alternativas de carbono,isto é, aminoácidos e gorduras, podem ser utilizados para promoção de fos-forilação oxidativa na mitocôndria. Por conseguinte, inibidores glicolíticospodem ser utilizados para atingir células tumorais hipóxicas seletivamente,sem exibir muita toxicidade para células normais ou células tumorais quecrescem aerobicamente. Boros, L.G. et ai, Inhibition Of Oxidative AndNonoxidative Pentose Phosphate Pathways By Somatostatin: A PossibieMechanism Of Antitumor Action, Med Hypotheses 1998; 50:501; LaManna,J.C., Nutrient Consumption And Metaboiic Perturbation, Neurosurg Clin NAm 1997;8:145-163.

De fato, experimentos in vivo revelaram que 2-DG (visandocélulas tumorais hipóxicas de crescimento lento) aumenta a eficácia deagentes quimioterápicos convencionais (direcionados contra célulasaeróbicas de proliferação rápida) em xenoenxertos de diferentes tumoreshumanos. Maschek, G. et ai, 2-Deoxy-D-Glucose Increases The Effieaey OfAdriamyein And Paelitaxel In Human Osteosareoma And Non-Small CellLung Caneers In Vivo, Câncer Res 2004;64:31-4. Os resultados destes estu-dos, bem como dados de modelos in vitro de hipóxia levou a testes destaestratégia para melhorar protocolos de quimioterapia em seres humanos, naforma de um estudo clínico de Fase I intitulado "Estudo de Fase I de escalo-namento de dose de 2-desóxi-D-glicose, isolada ou em combinação comdocetaxel, em pacientes portadores de malignidades sólidas em estágioavançado", o qual está atualmente em andamento. Maher, J.C. et ai,Greater Cell Cyele Inhibition And Cytotoxicity Indueed By 2-Deoxy-D-GlucoseIn Tumor Cells Treated Under Hypoxie vs Aerobie Conditions, CâncerChemother Pharmacol 2004; 53:116-122. Os dados de estudos com ani-mais, bem como os resultados preliminares do estudo clínico de Fase I indi-cam que 2-DG é bem tolerado e relativamente não-tóxico para células normais.

Embora teoricamente células tumorais com mitocôndria capazde executarem fosforilação oxidativa não devam ser mortas pelo inibidorglicolítico 2-DG, um número selecionado de linhagens de células cancerosasmorre, na presença de oxigênio, com doses baixas deste análogo de açúcar.

O mecanismo da toxicidade não é por intermédio de bloqueio de glicóliseporque estas linhagens de células passam por respiração mitocondriananormal e são resistentes a outros inibidores glicolíticos. Um mecanismosemelhante foi demonstrado em síntese de glicoproteínas virais, em que2-DG bloqueia glicosilação N-ligada, interferindo na montagem deoligossacarídeos ligados a lipídeos. Datema1 R. et ai, Interference WithGlycosylation Of Glycoproteins, Biochem J 1979; 184: 113-123; Datema, R.et ai, Formation Of 2-Deoxyglucose-Containing Lipid-LinkedOligosaccharides, Eur J Biochem 1978;90: 505-516. A toxicidade com 2-DG,nas linhagens de células tumorais selecionadas que crescem sob normóxia,parece ser decorrende de um mecanismo semelhante.

De acordo com a presente invenção, 2-DG pode ser utilizadocomo agente isolado em certos pacientes com tumores sólidos, contendocélulas sensíveis a 2-DG sob normóxia. Por conseguinte, nestes pacientes,2-DG exerceria efeito duplo, (1) atingindo a população aeróbicà das célulastumorais via interferência na glicosilação; e (2) inibindo a glicólise na porçãohipóxica do tumor; os dois mecanismos levam à morte celular.

Materiais e métodos

Tipos de células

As células p° foram isoladas por tratamento da linhagem decélulas 143B (wt) de osteossarcoma com brometo de etídio por períodosprolongados, conforme previamente descrito. King, M.P. et ai, Human CellsLacking Mtdna: Repopulation With Exogenous Mitoehondria ByComplementation, Science 1989; 246: 500-503. Como as células p° sãouridina e piruvato auxotróficas, elas são cultivadas em DMEM (GIBCO,EUA), complementado com soro fetal de bezerro a 10%, 50 micro g/ml deuridina e piruvato de sódio a 100 mM. A linhagem de células SKBR3 foiobtida do laboratório do Dr. Joseph Rosenblatt, na Universidade de Miami.

As linhagens de células 1420 e 1469 de câncer pancreático, a linhagem decélula SKOV3 de câncer de ovário, a linhagem de célula HELA de câncercervical e a linhagem de célula 143B de osteossarcoma foram adquiridas doATCC. As linhagens de células de câncer pulmonar de células nãopequenas e de câncer pulmonar de células pequenas foram derivadas depacientes pelo Dr. Dr. Niramol Savaraj, na Universidade de Miami. CélulasSKBR3 e SKOV3 foram cultivadas em meio 5A de McCoy; as células 1420,1469 e 143B, em DMEM (GIBCO, EUA); e as HELA em MEM (GIBCO,EUA). Os meios foram complementados com soro fetal de bezerro a 10%.Todas as células foram cultivadas sob CO2 a 5% e a 37°C.

Fármacos e substâncias químicas

2-DG, oligomicina e tunicamicina foram adquiridos da Sigma. 2-FDG e 2-FDM foram gentilmente doados pelo Dr. Priebe (MD AndersonCâncer Center, TX).

Hipóxia

para estudos em condições hipóxicas (Modelo C), as célulasforam semeadas e incubadas por 24 horas a 37°C e CO2 a 5%, conformedescrito abaixo, para ensaios diretos de citotoxicidade. Após 24 horas deincubação, as células receberam tratamento com fármaco e foram colocadasem uma câmara Pro-ox in vitro, fixada a um controlador de oxigênio modelo110 (Reming Bioinstruments Co. Redfield, NY), na qual uma mistura de 95%de nitrogênio e 5% de CO2 é utilizada para perfundir a câmara a fim deserem atingidos os níveis de 02 desejados (0,1%).

Ensaio de citotoxicidade

As células são incubadas por 24 horas a 37°C em 5% de CO2,quando então os tratamentos com os fármacos iniciam e são continuadospor 72 horas. Nesse momento, as células fixadas são submetidas a trata-mento com tripsina e combinadas a seus respectivos meios de cultura, se-guido por centrifugação a 400 g por 5 min. Os péletes são re-suspensos em1ml de solução de Hanks e analisador por um analisador de viabilidade ce-lular Vi-Cell (Beckman Coulter, EUA).

Ensaio de ácido lático.

O ácido lático é medido adicionando-se 0,025 ml de meio des-proteinizado, proveniente de culturas tratadas e não tratadas, a uma misturade reação contendo 0,1 ml de desidrogenase láctica (1000 unidades/ml), 2ml de tampão glicina (glicina, 0,6 mol/l, e hidrazina, pH 9,2) e 1,66 mg/ml deNAD. A desproteinização ocorre pelo tratamento de 0,5 ml do meio, proveni-ente de culturas em teste, com 1 ml de ácido perclórico a 8% p/v, submeten-do a vórtice por 30 s e, em seguida, expondo esta mistura a 4 graus C por 5min e centrifugação a 1.500g por 10 min. O sobrenadante é centrifugado trêsvezes mais e 0,025 ml de um sobrenadante final transparente é utilizado pa-ra determinações de ácido lático, conforme acima. A formação de NADH émedida com um espectrofotômetro Beckman DU r 520 UV/vis em 340 nm, aqual corresponde diretamente a níveis de ácido lático, conforme determinadopor uma curva-padrão de lactato.

Ensaio de quantificação de ATP.

O kit ATP Iite (Perkin Elmer) pode ser utilizado para quantificarníveis de ATP. Cerca de 50 micro I de solução de Iise celular é acrescentadoa 100 micro I de suspensão celular em uma placa de fundo branco de 96cavidades. A placa é incubada em temperatura ambiente em um agitador(700 rpm) por cinco minutos. Cerca de 50 micro I de solução contendo subs-trato é acrescentado, em seguida, às cavidades que são agitadas (700 rpm)por outros cinco minutos em temperatura ambiente. A placa é deixada, emseguida, no escuro para adaptação por dez minutos e efetuada a mediçãoquanto à luminescência.

Análise de Western Blot

As células são dispostas em placas, em 104 células/cm2, e culti-vadas sob tratamento com o fármaco pelos tempos indicados. No final doperíodo de tratamento, as células são coletadas e Iisadas com SDS a 1%SDS em tampão Tris-HCL a 80 mM (ph 7,4), complementado com um co-quetel de inibidores de proteinase. O DNA é fragmentado por sonicação e asconcentrações de proteínas são medidas com o kit de ensaio de proteínamicroBCA (Pierce, EUA). As amostras são misturadas com 2 χ tampão deamostra de Laemmli (Bio-Rad, EUA) e analisadas em gel de poliacrilamidade SDS. Os géis são transferidos para membranas de nitrocelulose (Amer-sham, EUA) e testados com sonda contendo anticorpo anti-KDEL (Stress-gen, Canadá) (para Grp78 e Grp94); anticorpo policlonal anti-CHOP/GADD154 (Santa Cruz, EUA), anticorpo policlonal anti-erbB2 (DAKO,EUA). Após a sondagem, as membranas são lavadas e incubadas com umsegundo anticorpo secundário conjugado a HRP. A quimioluminescência édetectada por exposição a filme. Quando indicado, as membranas são re-movidas com Tampão Stripping (Pierce, EUA) e testadas novamente comsondas contendo um anticorpo primário anti-actina (Sigma, EUA). Para ana-lisar a ligação com conconavalina A (ConA)1 as membranas foram incubadascom 0,2 micro g/ml de ConA conjugada a HRP, e a quimioluminescência foidetectada conforme descrito.

Resultados

2-DC e 2-flúor-D-manose, porém não 2-FDG, eliminaram célulasSKBR3, cultivadas sob condições normóxicas.

Ao ser efetuado o levantamento em algumas linhagens de célu-las tumorais quanto à sensibilidade diferencial destas células a inibidoresglicolíticos, sob condições normóxicas versus hipóxicas, foi descoberto que alinhagem de células SKBR3 de câncer de mama humano era sensível a 2-DG, quando cultivada sob condições normóxicas. As Figuras 1A e B de-monstram que, quando células SKBR3 são tratadas com 3 mM de 2-DG por72 horas, 50% de seu crescimento é inibido (ID50), enquanto que em 12 mM,60% das células são mortas. Estudos anteriores mostraram que, quando arespiração mitocondriana é deficiente ou quimicamente bloqueada, as célu-las tumorais morrem quando tratadas com doses semelhantes de 2-DG. Porconseguinte, para determinar se estas células apresentavam respiração mi-tocondriana deficiente, foi medido seu consumo de oxigênio. Conforme de-monstrado na Tabela 1 abaixo, não há diferença significativa entre o consu-mo médio de oxigênio de células SKBR3 e de duas outras linhagens celula-res resistentes a tratamento com 2-DG, quando cultivadas sob condiçõesnormóxicas. Por outro lado, o consumo de oxigênio por células p°, linhagemcelular com mitocôndria deficiente, reduziu drasticamente, confirmando queas células SKBR3 estavam respirando normalmente. Além disso, duas ou-tras linhagens de células, 1420 e HELA, que eram sensíveis a 2-DG sobnormóxia, respiraram tão bem ou melhor do que linhagens de células resis-tentes (consultar a Tabela 1). Por conseguinte, a toxicidade de 2-DG nestascélulas, sob condições normóxicas, é decorrente de um outro mecanismodiferente de bloqueio de glicólise. Para confirmar essa hipótese, células SK-BR3 foram tratadas com dois outros inibidores glicolíticos, ou seja, 2-desóxi-2-flúor-glicose (2-FDG) e oxamato. Nas Figuras 1A e B, pode ser observadoque nenhum destes agentes causaram toxicidade a células SKBR3, quandocultivadas sob normóxia.

Tabela 1. Comparação de consumo de oxigênio em linhagens de célulassensíveis versus resistentes a 2-DG

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Além disso, 2-flúor-D-manose (2-FDM) foi semelhante a 2-DG,embora menos eficiente, em causar citotoxicidade em células SKBR3(consultar a Figura 1). 2-DG e 2-FDM, porém não 2-FDG, possuem aestrutura semelhante à da manose, podendo, pelo mesmo, interferir nometabolismo da manose. Esses dados indicam que a interferência por 2-DGe 2-FDM no metabolismo da manose, que está primariamente envolvida emglicosilação N-Iigada de inúmeras proteínas, resulta em morte celular, bemcomo inibição de crescimento em células SKBR3.

2-FDG é um inibidor melhor de glicólise do que 2-DG, levando àdepleção melhor de ATP em células SKBR3.

Em um relatório anterior, foi sugerido que a toxicidade de 2-DGem células SKBR3, cultivadas sob normóxia, foi mediada via inibição deglicólise e de produção de ATP. Aft, R.L. et ai, Evaluation Of 2-Deoxy-D-Glucose As A Chemotherapeutic Agent: Mechanism Of Cell Death, Br JCâncer 2002;87:805-812. No entanto, conforme mencionado acima, outroinibidor glicolítico, 2-FDG, não é tóxico para estas células. Além disso, oanálogo 2-FDG é melhor do que 2-DG, em termos de inibição e glicólise eeliminação de células hipóxicas. Lampidis, T.J. et ai, Effieaey of 2-HalogenSubstituted D-Glueose Analogs in Bloeking Glycolysis and Killing "HypoxieTumor Cells", Câncer Chemother Pharmacol (no prelo). De fato, quando cé-lulas SKBR3 foram tratadas com 2-FDG versus 2-DG, o primeiro inibiu niveisde Iactato (uma medida de glicólise) melhor do que a última (consultar aFigura 2A). Ademais, a depleção de ATP foi mais proeminente no tratamentocom 2-FDG, confirmando mais ainda que este análogo de açúcar é uminibidor melhor de glicólise e da produção de ATP nestas células (consultar aFigura 2B). Além disso, foi descoberto que, quando as células SKBR3 foramcultivadas sob condições hipóxicas, 2-FDG foi mais tóxico do que 2-DG,confirmando mais ainda que este é um inibidor melhor de glicólise emcélulas SKBR3 (dados não mostrados). Portanto, ao contrário de relatóriosanteriores, a toxicidade induzida por 2-DG, sob condições normóxicas,parece ser independente de sua capacidade de inibir glicólise e diminuirpools de ATP.

A toxicidade de 2-DG em células SKBR3 sob normóxia pode serrevertida por manose exógena

Em proteínas virais, foi mostrado que 2-DG inibe a montagem deoligossacarídeos N-Iigados e que esta inibição pode ser revertida pormanose exógena. Datema, R. et al., Interference With Glycosylation OfGlycoproteins, Biochem J 1979; 184: 113-123. As Figuras 3A e 3B ilustramque com a adição de manose, porém não a de outros açúcares, isto é,glicose, frutose e fucose, morte celular, resultante de exposição a 2-DG, sobnormóxia, pode ser revertida, sugerindo que a morte celular é mediada porinterferência em glicosilação via um mecanismo semelhante. Datema, R. etal., Interferenee With Glycosylation Of Glycoproteins, Biochem J 1979; 184:113-123. Como controle negativo, foi descoberto que manose não revertetoxicidade, induzida por tunicamicina em células SKBR3, sob as mesmascondições. Isso pode ser explicado pelo fato de que tunicamicina interfereem glicosilação em uma etapa que precede a adição de manose à cadeia deoligossacarídeos, tornando, pelo mesmo, esta toxicidade independente dometabolismo de manose (dados não mostrados).

A toxicidade de 2-DG, em três modelos de "hipóxia" não podeser revertida por manose exógena.Como mencionado acima, as células que crescem sob condi-ções hipóxicas dependem exclusivamente da glicólise para produzir energia.

Dessa forma, a inibição desta via metabólica, por inibidores glicolíticos, leva-ria à morte celular, conforme foi previamente demonstrado. Maher, J.C. etal, Greater Cell Cycle Inhibition And Cytotoxicity Induced By 2-Deoxy-D-Glueose In Tumor Cells Treated Under Hypoxic vs Aerobic Conditions,Câncer Chemother Pharmacol 2004; 53:116-122. A fim de diferenciar omecanismo pelo qual 2-DG é tóxico para células SKBR3, cultivadas sobnormóxia, manose foi acrescentada às células cultivadas sob três condiçõesdiferentes de "hipóxia". Conforme apresentado nas Figuras 3C e D, nãoforam encontradas diferenças significativas em inibição de crescimento emorte celular, no meio normal de crescimento ou no mesmo meiocomplementado com manose a 2 mM. Esses resultados fornecemevidências de que a reversão da toxicidade de 2-DG em células SKBR3,cultivadas sob normóxia, por manose exógena não está relacionada com aglicólise, implicando ainda a interferência em glicosilação como o modo demorte celular nestas células que crescem sob normóxia.

2-DG e 2-FDM são tóxicos somente para um númeroselecionado de linhagens de células tumorais que crescem sob condiçõesnormóxicas.

A fim de investigar se a toxicidade de 2-DG, sob condiçõesnormóxicas, era restrita a um certo tipo de tecido canceroso, algumasIinhages de células foram testadas. Os resultados destes testes,apresentados na Tabela 2, revelam que somente um número selecionado delinhagens de células tumorais (6 de 15), cultivadas sob pressão normal deoxigênio, sofreram morte celular significativa, quando tratadas com 2-DG or2-FDM, porém não com 2-FDG, a 6 mM. As linhagens de célulasconstatadas como sensíveis a 2-DG foram SKBR3, uma linhagem de célulasde câncer de mama; 1420, uma linhagem de células de câncer pancreático;duas linhagens de células de câncer pulmonar de células não pequenas,derivadas diretamente de pacientes; RT 8226, uma linhagem de células demieloma múltiplo; HELA, uma linhagem de carcinoma cervical, e TG98, de49

glioblastoma. No entanto, foram encontradas linhagens de células cancero-sas, derivadas de tecidos semelhantes, resistentes a 2-DG e a 2-FDM, sobcondições normais de oxigênio, indicando que a toxicidade destes análogosde açúcar não é necessariamente específica de tipos de tecidos.

Tabela 2. Linhagens de células resistentes versus sensíveis (2-DG sob

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2-DG e 2-FDM diminuem a ligação com Conconavalina A (ConA)e o peso molecular de uma glicoproteína em células SKBR3.

ConA é uma Iectina que se liga especificamente à manose emglicoproteínas e que tem sido utilizada para detectar glicoproteínas do tiporicas em manose. Protein Purification Methods: A Practicai Approach, In:Harris ELV, Angal S, editores. New York: IRLPress at Oxford UniversityPress; 1994.p.270. Esta técnica foi utilizada para mostrar que tanto 2-DGcomo 2-FDM, bem como tunicamicina diminuem a ligação com ConA emalgumas glicoproteínas (consultar a Figura 4A). Ademais, manose exógenarestaura níveis de controle de ligação da ConA em células tratadas com 2-DG e 2-FDM, porém não em tratadas com tunicamicina, enquanto quecélulas tratadas com 2-FDG não exibem redução em ligação com ConA. A-lém disso, alteração em tamanho de uma glicoproteína conhecida, erbB2,que é um receptor de tirosina quinase expresso em células SKBR3, apóstratamento com 2-DG, foi analisada pela técnica Western blot. A Figura 4Bilustra que 2-DG e 2-FDM diminuíram o peso molecular de erbB2, enquantoque 2-FDG não exerceu efeito. Em correlação aos dados de ConA, manoseexógena restaurou o tamanho da proteína a seu peso original. Estes dadosapoiam ainda a conclusão de que 2-DG e 2-FDM, porém não 2-FDG, sãotóxicas para células tumorais selecionadas via interferência em glicosilaçãoN-ligada, e que esta interferência pode ser revertida por manose.

O tratamento com 2-DG ou 2-FDM leva a resposta a proteínasnão enoveladas em células SKBR3 sob normóxia.

Quando o processo normal de glicosilação de proteínas é afeta-do, proteínas enoveladas inadequadamente acumulam-se no retículo endo-plasmático (RE), levando a uma cascata de sinalização, conhecida comoresposta a proteínas não enoveladas (UPR). Foi demonstrado que fármacosque interferem na glicosilação induzem UPR e levam a aumento nacapacidade de enovelamento de proteínas do RE via a regulação positiva dechaperones, isto é, Grp78/Bip ou Grp94. Conforme apresentado na Figura5A, quando células SKBR3 são tratadas com 2-DG, 2-FDM ou tunicamicina,um inibidor bem conhecido de glicosilação, sob normóxia, tanto a Grp78como a Grp94 são reguladas positivamente.

Além disso, a adição de manose a 2 mM reverte a regulaçãopositiva, provocada por 2-DG e 2-FDM, de chaperones, porém não aquelade tunicamicina. A reversão da manose de UPR induzida por 2-DGcorrelaciona-se com dados na Figura 3D, demonstrando que a toxicidade de2-DG é revertida pela adição de manose exógena; foram encontradosresultados semelhantes em células tratadas com 2-FDM (dados nãomostrados). Conforme previsto, 2-FDG não aumenta os níveis desteschaperones tanto quanto 2-DG ou 2-FDM, em correlação com os dados detoxicidade (Figura 1B), ilustrando a ausência de morte celular em célulasSKBR3 quando tratadas sob condições normóxicas. Ao contrário, quando2-DG ou 2-FDM são aplicados a células cultivadas sob três condiçõesexperimentais diferentes de hipóxia, não é observada regulação positivasignificativa da UPR, nos modelos AeB, comparados ao modelo C, quandoambas as chaperones são reguladas positivamente. Ademais, é mostradoque tunicamcina, um controle positivo, induz a síntese destas chaperonesem todos os três modelos (Figura 5B). Esses resultados indicam que, quan-do células são tratadas com 2-DG ou 2-FDM, o mecanismo de morte celulardifere sob condições "hipóxicas" (bloqueio de glicólise) versus normóxicas(interferência em glicosilação).

A toxicidade de 2-DG e 2-FDM correlaciona-se com indução davia apoptótica UPR-específica em células SKBR3.

Foi relatado que, quando células não conseguem superar o es-tresse do RE, a UPR induz vias apoptóticas específicas, via indução deGADD154/CHOP. Xu, C., et al. Endoplasmic Reticulum Stress: Cell Life AndDeath Decisions, J Clin Invest 2005; 115: 2656-2664; Obeng, E.A. et ai,Caspase-12 And Caspase-4 Are Not Required For Caspase-DependentEndoplasmic Reticulum Stress-Induced Apoptosis, J Biol Chem 2005; 280:29578-29587. Por conseguinte, para determinar se 2-DG e 2-FDM eliminamcélulas SKBR3 em decorrência de estresse de RE, sob normóxia, estaproteína apoptótica, específica de UPR, foi analisada pela técnica deWestern Blot. Conforme pode ser observado na Figura 6, após tratmentocom 2-DG, 2-FDM e tunicamicina, porém não com 2-FDG, GADD154/CHOPé induzida. Quando induzida por 2-DG ou 2-FDM, esta via apoptótica podeser revertida por co-tratamento com manose; no entanto, GADD154/CHOPinduzida por tunicamicina não pode ser revertida por adição deste açúcar.Estes dados correlacionam-se com a reversão de toxicidade pela manose,conforme apresentado na Figura 2B.

Discusão dos Exemplos 1 e 2

Tumores sólidos contêm áreas hipóxicas, bem comonormóxicas, decorrentes de angiogênese insuficiente, crescimento rápido dotumor e diminuição da capacidade de transportar oxigênio de vasos dotumor. Gillies, R.J. etal., MRI Of The TumorMieroenviroment, J Magn ResonImaging 2002; 16:430-450; Maxwell, P.H. et ai, Hypoxia-Inducible Faeoro-IModulates Gene Expression In Solid Tumors And Influenees BothAngiogenesis And Tumor Growth, PNAS 1997; 94:8104-8109; Semenza,G.L., Targeting HIF-1 For Câncer Therapy, Nature Rev 2003;3:721-732. Emvirtude a glicólise ser a única via de produção de energia em célulashipóxicas, foi mostrado que o inibidor glicolítico 2-DG é seletivamente tóxicopara estas células, porém não é toxico e inibe somente o crescimento decélulas aeróbicas. Maher, J.C. et ai, Greater Cell Cycle Inhibition AndCytotoxicity Induced By 2-Deoxy-D-Glucose In Tumor Cells Treated UnderHypoxic vs Aerobie Conditions, Câncer Chemother Pharmacol 2004; 53:116-122; Maschek, G. et al., 2-Deoxy-D-Glucose Increases The Efficacy OfAdriamycin And Paelitaxel In Human Osteosarcoma And Non-Small CellLung Cancers In Vivo, Câncer Res 2004;64:31-4; Liu, H. et al.,I Hypersensitization Of Tumor Cells To Glycolytic lnhibitors, Biochemistry2001; 40:5542-5547; Liu1 H. et al., Hypoxia Increases Tumor Cell SensitivityTo Glycolytic lnhibitors: A Strategy For Solid Tumor Therapy (Model C),Biochem Pharmacol 2002; 64:1745-1751. No entanto, um númeroselecionado de linhagens de células tumorais é morto por 2-DG, napresença de oxigênio. Entre estes tipos de células sensíveis encontra-se alinhagem de células SKBR3 de câncer de mama humano. Uma deficiênciaem respiração mitocondriana poderia explicar a sensibilidade destas célulasa 2-DG, visto que o bloqueio da glicólise em células com mitocôndriascomprometidas diminuiria os níveis de ATP, levando à morte celular pornecrose. Gramaglia, D. et al., Apoptosis To Necrosis Switching DownstreamOf Apoptosome Formation Requires Inhibition Of Both Glycolysis AndOxidative Phosphorylation In A BCL-XL And PKB/AKT-Independent Fashion,Cell Death Differentiation 2004; 11: 342-353. Contudo, essa possibilidade foidescartada por experimentos envolvendo consumo de oxigênio querevelaram que células SKBR3 respiram semelhantemente a duas outraslinhagens de células, constatadas como sendo resistentes a 2-DG, sobnormóxia (Tabela 1). Além disso, foi constatado que a taxa de respiração dalinhagem de células 1420, também sensível a 2-DG sob normóxia, era maisalta do que em linhagens de células resistentes a 2-DG. Dessa forma, atoxicidade de 2-DG em SKBR3, sob normóxia, não pode ser explicada pordeficiência em função de mitocôndria, indicando que o mecanismo de mortecelular não é relacionado ao efeito deste açúcar de bloquear a glicólise.

Foi relatado previamente que células SKBR3 eram sensíveis a2-DG, sob normóxia em decorrência de inibição de glicólise, levando àdepleção de pools de ATP que resultou em expressão aumentada detransportador-l de glicose e absorção maior de 2-DG. Aft, R.L. et al.,Evaluation Of 2-Deoxy-D-Glucose As A Chemotherapeutic Agent:Mechanism Of Cell Death, Br J Câncer 2002;87:805-812. Contudo, 2-FDG éum inibidor mais potente de glicólise do que 2-DG (11, Figura 2), porém nãoé tóxico para células SKBR3, cultivadas sob normóxia, apoiando mais aindaa conclusão de que 2-DG elimina estas células via um mecanismo diferentede bloqueio de glicólise e inibição de produção de ATP.

Os dados mostrando que células SKBR3 são sensíveis tambémao análogo de manose, 2-FDM, indicam que a mano-configuração deanálogos de açúcares é importante para as suas atividades tóxicas emcélulas tumorais selecionadas, que crescem sob normóxia. A falta de umátomo de oxigênio no segundo carbono de 2-DG torna este composto umanálogo tanto de glicose quanto de manose, enquanto que o grupamentoflúor em 2-FDG torna este composto somente análogo de glicose. A conclu-são de que a mano-configuração é relevante para a toxicidade destes análo-gos de açúcares é amparada pelo trabalho publicado no final da década desetenta por um grupo liderado por Schwartz.

Este grupo mostrou que 2-DG, 2-FDG e 2-FDM podiam interferirna glicosilação N-Iigada em fibroblastos de embriões de pintos que foraminfectados pelo vírus de praga de aves domésticas, resultando em síntesediminuída de glicoproteínas e reprodução viral. Datema, R. et ai,Interference With Glycosylation Of Glyeoproteins, Bioehem J 1979; 184: 113-123; Datema, R. et ai, Formation Of 2-Deoxyglueose-Containing Lipid-Linked Oligosaecharides, Eur J Bioehem 1978;90: 505-516; Datema, R. etai, Fluoro-Glucose Inhibition Of Protein Glycosylation In Vivo, Eur J Bioehem1980; 109:331-341; Schmidt, M.F.G. et ai, Nueleoside-diphosphateDerivatives Of 2-Deoxy-D-GIueose In Animal Cells, Eur J Bioehem 1974; 49:237-247; Schmidt, M.F.G. et ai, Metabolism Of 2-Deoxy-2-Fluoro-D-[3H]Glucose And 2-Deoxy-2-Fluoro-D-[3H] Mannose In Yeast And Chick-EmbryoCells, Eur J Biochem 1978; 87: 55-68; McDoweII, W. et al., Mechanism OfInhibition Of Protein Glycosylation By The Antiviral Sugar Analogue 2-Deoxy-2-Fluoro-D-Mannose: Inhibition Of Synthesis Of Man(Gienae)2 PP-DoI ByThe Guanosine Diphosphate Ester, Bioehemistry 1985; 24:8145-8152. Seusrelatos concluíram que 2-DG é capaz de inibir a montagem deoligossacarídeos ligados a lipídeos que deveriam ser transferidos para asproteínas no retículo endoplasmático da célula. Foi demonstrado que ummetabólito de 2-DG, GDP-2DG, podia provocar a finalização prematura damontagem de oligossacarídeos levando a oligossacarídeos ligados apeptídeos encurtados, inadequados para serem transferidos para proteínas.Datema, R. et al., Formation Of 2-Deoxyglueose-Containing Lipid-LinkedOligosaecharides, Eur J Bioehem 1978;90: 505-516. No geral, estes resulta-dos revelaram que a potência destes análogos para inibir a síntese de glico-proteínas virais era na ordem de 2-DG>2-FDM>2-FDG, que é semelhante àtoxicidade destes análogos em células SKBR3, cultivadas sob normóxia.Datema, R. et al., Fluoro-Glucose Inhibition Of Protein Glycosylation In Vivo,Eur J Bioehem 1980; 109:331-341. Este grupo relatou também que osefeitos inibidores destes análogos podiam ser revertidos pela adição demanose exógena em dose baixa. Datema, R. et al., Interferenee WithGlycosylation Of Glyeoproteins, Bioehem J 1979; 184: 113-123. De modosemelhante, manose a 2 mM reverte completamente a toxicidade de 2-DG ede 2-FDM em células SKBR3, indicando que ambos os análogos da manoseeliminam estas células interferindo na glicosilação N-ligada. Datema, R. etal., Interferenee With Glycosylation Of Glyeoproteins, Bioehem J 1979; 184:113-123.; Datema, R. et al., Formation Of 2-Deoxyglueose-Containing Lipid-Linked Oligosaecharides, Eur J Bioehem 1978;90: 505-516; Datema, R. etal., Fluoro-Glucose Inhibition Of Protein Glycosylation In Vivo, Eur J Bioehem1980; 109:331-341; Schmidt, M.F.G. et al., Nueleoside-diphosphateDerivatives Of 2-Deoxy-D-Glueose In Animal Cells, Eur J Bioehem 1974; 49:237-247; Schmidt, M.F.G. et al., Metabolism Of 2-Deoxy-2-Fluoro-D-[3H]Glueose And 2-Deoxy-2-Fluoro-D-[3H] Mannose In Yeast And Chiek-EmbryoCells, Eur J Biochem 1978; 87: 55-68; McDoweII, W. et ai, Mechanism OfInhibition Of Protein Glycosylation By The Antiviral Sugar Analogue 2-Deoxy-2-Fluoro-D-Mannose: Inhibition Of Synthesis Of Man(Gicnac)2 PP-DoI ByThe Guanosine Diphosphate Ester, Bioehemistry 1985; 24:8145-8152.

Embora a manose seja um açúcar importante em proteínas gli-cosiladas N-ligadas, ela pode participar também na via glicolítica uma vezque esta pode ser convertida para frutose-6-fosfato pelafosfomanoisomerase. Por conseguinte, permanece possível que a manosepossa reverter a toxicidade de 2-DG em células SKBR3, esquivando-se davia glicolítica que 2-DG inibe (Figura 7). No entanto, essa possibilidade pare-ce menos provável, uma vez que manose a 2 mM mannose não reverteu(consultar as Figuras 3C e 3D) a inibição de crescimento e morte celular,induzidas por 2-DG nos modelos A e B de "hipóxia", enquanto que nomodelo C, no qual células efetivamente cresceram sob hipóxia, houve umdiscreto efeito de recuperação. Esta recuperação discreta poderia serexplicada por (1) 2-DG e 2-FDM interferindo na glicosilação mesmo sobcondições hipóxicas e/ou (2) mannose revertendo a inibição da glicólise nomodelo C, porque estas células, sob 0,5% de hipóxia ainda passam porfosforilação oxidativa, embora reduzida. No geral, a reversão da toxicidadede 2-DG e de 2-FDM pela manose, em células sensívies a estes análogosde açúcar, sob normóxia, porém não em células cujas mitocôndrias estãobloqueadas (modelos A e B), apóia a hipótese de que a interferência emglicosilação, e não inibição de glicólise, é responsável pela hipóxianormóxica.

Quando a glicosilação N-Iigada é inibida, as proteínas não con-seguem enovelar-se adequadamente e são retidas no RE. Ellgaard, L. etal.,Quality Control In The Endoplasmic Retieulum, Nat Rev Mol Cell Biol 2003;4:181-191; Parodi, A.J., Protein Glycosylation And Its Role In ProteinFolding, Annu Rev Bioehem 2000; 69: 69-93. O acúmulo de proteínas nãoenoveladas resulta em distensão da organela, bem como alteração da tradu-ção de proteínas. Nessa circunstância, as células iniciam uma complexa,porém ainda conservada, cascata de sinalização, conhecida como respostaa proteínas não enoveladas (UPR)1 para restabelecer a homeostase no RE.Três proteínas transmembranas do RE transmitem a sinalização deproteínas não enoveladas para o núcleo: enzima 1 que requer inositol(IRE1); proteína quinase ativada por RNA de fita dupla (PERK) e fator 6ativador de transcrição (ATF6). Schroder, M. et al., ER Stress And UnfoldedProtein Response, Mutat Res 2005; 569:29-63. Quando proteínas não eno-veladas acumulam-se no RE1 uma chaperone molecular, a proteína 78 regu-lada por glicose (Grp78/Bip), dissocia-se destas três proteínastransmembranas do RE, ativando estas proteínas pelo mesmo. Pahl, H.L.,Signal Transduction From The Endoplasmic Reticulum To The Cell Nucleus,I Physiol Rev 1999; 79: 683-701. O resultado é algumas alterações metabóli-cas e moleculares, incluindo a regulação positiva de transportadores de açú-cares, aumentos em síntese de fosfolipídeos, transporte de aminoácidos eexpressão das chaperones moleculares Grp78/ Bip e Grp94. Ma, Y. et al,The Unfolding Tale Of The Unfolded Protein Response, Cell 2001; 107: 827-830; Doerrler. W.T. et al., Regulation Of Dolichol Pathway In HumanFibroblasts By The Endoplasmic Reticulum Unfolded Protein Response,PNAS 1999; 96:13050-13055; Breckenridge, D.G. et al., Regulation OfApoptosis By Endoplasmic Retieulum Pathways, Oncogene 2003;22: 8608-8618.

2-DG e 2-FDM regulam positivamente a expressão de Grp78 ede Grp94 em células SKBR3, cultivadas em sob condições normóxicas, oque pode ser revertido pela adição de manose exógena, apoiandofortemente a hipótese de que estes análogos de açúcares estão interferindona glicosilação N-ligada, levando a formação de proteínas não enoveladas e,pelo mesmo, iniciando a UPR. Além disso, 2-FDG, que é melhor inibidor deglicólise do quer 2-DG ou 2-FDM, não é tão eficaz em induzir uma respostaUPR. A magnitude da resposta UPR a estes análogos parece refletir o graude interferência em glicosilação, o que concorda com relatos quedemonstram que 2-DG>2-FDM>2-FDG em bloqueio de montagem deoligossacarídeos ligados a lipídeos em proteínas de revestimento viral.Datema, R. et al., Fluoro-Glucose Inhibition Of Protein Glycosylation In Vivo,Eur J Biochem 1980; 109:331-341; Schmidt, M.F.G. et al., Nucleoside-diphosphate Derivatives Of 2-Deoxy-D-Giucose In Animal Cells, Eur JBiochem 1974; 49: 237-247; Schmidt, M.F.G. et al., Metabolism Of 2-Deoxy-2-Fluoro-D-[eH] Glucose And 2-Deoxy-2-Fluoro-D-[3H] Mannose In Yeast AndChiek-Embryo Cells, Eur J Bioehem 1978; 87: 55-68; McDoweII, W. et ai,Meehanism Of Inhibition Of Protein Glycosylation By The Antiviral SugarAnalogue 2-Deoxy-2-Fluoro-D-Mannose: Inhibition Of Synthesis OfMan(Gienae)2 PP-DoI By The Guanosine Diphosphate Ester, Bioehemistry1985; 24:8145-8152. Ademais, estes dados de UPR correlacionam-se comos resultados de citotoxicidade, os quais revelam semelhantemente que 2-DG>2-FDM »>2-FDG em inibição de crescimento e eliminação de célulasSKBR3, sob normóxia.

Por outro lado, no modelo "hipóxico" AeB, Grp78 e Grp94 nãosão reguladas positivamente por 2-DG, indicando que estas células morremvia inibição de glicólise e não por interferência em glicosilação. Um possívelmecanismo para explicar porque UPR não é induzida nestes modelo estárelacionado com níveis de ATP, conhecidos como necessários para ligaçãode Grp78/Bip a proteínas não enoveladas e ativando, pelo mesmo, UPR. Aocontrário do modelo AeB, UPR é induzida no modelo C (Figura 5B), em queníveis de ATP são menos diminuídos pelo 2-DG. Além disso, tunicamicina,conhecida por não afetar níveis de ATP significativamente, de fato regulapositivamente as chaperones nos modelos "hipóxicos", demonstrando umavia funcional de URP nestas células.

UPR é muito semelhante a p53, em que dano a DNA sinalizaparada de ciclo celular, ativação de enzimas que reparam o DNA e,dependendo do desfecho desses processos, apoptose. Por conseguinte, sea UPR deixar de estabelecer a homestase no retículo endoplasmático, viasapoptóticas específicas de estresse de RE são ativadas. Breckenridge, D.G.et al., Regulation Of Apoptosis By Endoplasmie Retieulum Pathways,Oneogene 2003;22: 8608-8618. Entre os mediadores de vias apoptóticasque incluem caspase 4, caspase 12 e CHOP/GADD154, a ativaçãoaumentada da última demonstrou ser um indicador melhor da via apoptóticade mamíferos, induzida por RE, do que as outras. Obeng, E.A. et ai,Caspase-12 And Caspase-4 Are Not Required For Caspase-DependentEndoplasmic Reticulum Stress-Induced Apoptosis, J Biol Chem 2005; 280:29578-29587. Dessa forma, a Figura 6, na qual é apresentado que aexpressão de CHOP/GADD154 correlaciona-se com citotoxicidade de 2-DGe 2-FDM, em células SKBR3 cultivadas sob normóxia, apoia o fato de queestes análogos de açúcar são tóxicos via interferência em glicosilação,levando a estresse do RE. Ademais, a reversão da indução deCHOP/GADD154 por adição de manose, porém não de glicose, apóia aindamais que 2-DG e 2-FDM são tóxicos por meio desse mecanismo.

Uma questão fundamental é o motivo porque certos tipos de cé-lulas tumorais morrem quando tratadas com 2-DG na presença de O2,enquanto que a maioria dos tumores, bem como células normais não ofazem. Uma resposta a essa pergunta é fornecida por estudos genéticos nosquais foi revelado que a enzima fosfomanoisomerase está excluída empacientes que sofrem do quadro descrito como Síndrome da GliproteínaDeficiente em Carboidrato do Tipo 1b. Niehues, R. et ai, Carbohydrate-Defieient Glyeoprotein Syndrome Type Ib., J Clin //ivesM998;101:1414-1420;Freeze, H.H., Human Disorders in N-glyeosylation and Animal Models,Bioehim Biophys Aeta 2002; 1573:388-93. A exclusão desta enzima resultaem hipoglicosilação de proteínas séricas, levando à trombose e distúrbiosgastrointestinais, caracterizado por enteropatia por perda de proteína. Quan-do manose exógena foi acrescentada às dietas destes pacientes, suas gli-coproteínas séricas retornaram ao normal, seus sintomas desapareceram.Freeze, H.H., Sweet Solution: Sugars to the Reseue, J Cell Biol 2002;158:615-616; Paneerselvam, K. et al., Mannose Correets Altered N-glyeosyIation in Carbohydrate-Defieient Glyeoprotein Syndrome Fibroblasts,J Clin Invest 1996; 97:1478-1487. Isso correlaciona-se com os dadospresentes mostrando que manose exógena resgata as células tumoraisselecionadas que são mortas quando tratadas com 2-DG em normóxia. Épossível que estes tipos de células tumorais sejam reguladas negativamenteou possuam fosfomanoisomerase defeituosa, ou que 2-DG afete mais estaenzima nestas células tumorais do que em outras que demonstraram serresistentes a tratamento com 2-DG em normóxia. Contudo, conformeindicado na Figura 7, há inúmeras outras etapas nas quais 2-DG e 2-FDMpodem estar inibindo o metabolismo da manose, envolvidas em glicosilação N-ligada.

2-DG, 2-CM e 2-FDM (2-FM) matam certos tipos de tumor porinterferência em glicosilação, levando a estresse do RE e apoptose.

O achado de que 2-FDG não mata estas células elimina a possibilidade deque a toxicidade de 2-DG e de 2-FDM é decorrente da inibição de glicólise edepleção de ATP. Estes agentes podem ser utilizados em terapias comoagentes isolados, no tratamento de tumores sólidos selecionados (consultara Figura 7).

Exemplo 3

Conforme exibidos nas Figuras 8 e 9, ensaios múltiplos de MTTdemonstram as sensibilidades de linhagens de células de glioma de graualto, e vários inibidores glicolíticos a base de açúcares são exibidosgraficamente. Várias condições são utilizadas, incluindo a exposição anormóxia ou hipóxia e a sua influência sobre a sensibilidade dessescompostos. Os resultados indicam uma sensibilidade relativamente uniforme dos vários inibidores glicolíticos à base de açúcar (com algumas diferençassutis). Há uma clara diferença entre algumas linhagens de células, em rela-ção à influência de sensibilidade em condições hipóxicas. De modo geral, amaioria das linhagens de células é mais sensível a inibidores glicolíticos,quando estas são cultivadas sob condições hipóxicas, o que seria previsto.No entanto, algumas linhagens de células, como de U87 MG, estãocompletamente comprometidas a um fenótipo aeróbico de glicólise ("EfeitoWarburg" completo), no qual o nível de ácido lático (um marcador substitutode glicólise) é máximo em condições normóxicas e não aumenta emcondições hipóxicas (consultar os dados de Iactato abaixo). Nessacircunstância, a diferença em sensibilidade é explicada pela observaçãoempírica de que as células cultivadas em condições hipóxicas possuemcrescimento mais lento e, por conseguinte, provavelmente há menosdemandas de energias sobre as células.

A Figura 8A exibe ensaios de MTT da linhagem de célula U87 decâncer cerebral humano sendo tratada com 2-FG, na presença de hipóxia(<1% de oxigênio) ou normóxia (20% de oxigênio). Ambas as Figuras 8B e8C representam experimentos semelhantes, contudo, os inibidoresglicolíticos à base de açúcar são diferentes. No caso do painel B, 2-DG éutilizado e no painel C, 2-FM. Conforme pode ser observado, U87 representaum fenótipo incomum que está persistentemente utilizando glicólise para assuas necessidades metabólicas e, por conseguinte, esta linhagem de célulasnão exibe sensibilidade aumentada a estes agentes em hipóxia.

A Figura 9 exibe curvas de crescimento ao longo de 6 dias, napresença de 2-FG ou 2-FM. Esse painel demonstra inibição de crescimentosignificativa da linhagem de células U87, no qual 2-FG parece serligeiramente mais eficaz do que 2-FM. O painel B e painel C demonstramcurvas semelhantes de inibição de crescimento para uma linhagem decélulas D-54, cultivada em condições de hipóxia e normóxia. Nesse caso, háum efeito evidentemente aumentado quando as células são cultivadas emcondições hipóxicas e este relaciona-se à capacidade de estimular aindamais o metabolismo glicolítico desta linhagem de célula em particular, emhipóxia.

Exemplo 4

As Figuras 10 e 11 exibem a diferença em sensibilidade dalinhagem de células U87 MG de glioblastoma-astrocitoma humano (U87)versus a linhagem de células D-54 de glioma humano, em condições denormóxia e hipóxia com exposição a 2-DG. As células U87 MG exibem taxasmais altas de glicólise tanto em condições hipóxicas como em aeróbicas(glicólise oxidativa ou "Efeito de Warburg"), portanto, a sensibilidade decélulas U87 MG a 2-DG não se altera quando cultivadas sob condiçõeshipóxicas. Por outro lado, as células D54 desviam-se parcialmente parametabolismo glicolítico sob condições de crescimento aeróbico e, porconseguinte, a sensibilidade a 2-DG é maior quando esta linhagem decélulas é cultivada em condições hipóxicas.A Figura exibe a diferença significativa entre estas duaslinhagens de células e a insensibilidade relativa de U87, que é maisproeminente.

A Figura 11 exibe a justificativa por trás desta diferençafenotípica entre U87 e D54. Esse painel demonstra a indução de glicólise emnível mais alto pela D54, enquanto que U87 já está produzindo Iactato emníveis máximos.

Os resultados exibidos nas Figuras 10 e 11 demonstram umefeito diferenciado de hipóxia quando as linhagens celulares são tratadascom inibidores glicolíticos. As linhagens de células que são altamentedependentes de glicólise (como U87 MG) já são sensibilizadas ao máximopara os inibidores glicolíticos e não requerem estar em ambiente anóxicopara exibir sensibilidade. Isso é demonstrado pelo nível alto e inalterado deprodução de Iactato por linhagens de células como U87 MG, enquanto queD54 aumenta tanto a sua sensibilidade como níveis de Iactato em resposta àhipóxia.

Surpreendentemente, as linhagens de células de glioma sãobastante resistentes a condições hipóxicas. Conforme observado na Figura12, linhagens de células cultivadas em condições normóxicas ou emcondições completamente hipóxicas (<1%) conseguem continuar a crescerrazoavelmente bem, baseando-se na glicólise para prover as demandas deenergia da célula.Exemplo 5

Demonstração de absorção pelo tumor do análogo de 2-DG, 2-flúor-18-glicose (2-F18G). A Figura 13 demonstra a absorção exagerada de2-F18G em um glioma durante estudos de rotina de imagem por PET. Umaimagem por PET de um paciente com glioblastoma multiforme demonstra aabsorção significativa de 2-FG no interior deste tumor. Os painéisapresentam uma TC sem contraste (A), TC com contraste (B) e o registro deimagem por PET da TC após o fornecimento para o paciente de 17 mCi de2-F18G. Esse fenômeno farmacodinâmico fornece uma demonstração dra-mática de que estes tumores são adequados, de maneira única, para inibido-res glicolíticos à base de açúcar.

Exemplo 6

Tratamento de gliomas humanos em camundongos. Xenoenxer-tos ortotópicos em camundongos de células de glioma humano foram trata-dos com 2-DG isolado ou associado a Temozolomide (Temodar). Esses a-nimais representam um modelo de xenoenxerto ortotópico de glioma de graualto. Esses experimentos foram repetidos três vezes com resultados seme-lhantes, conforme apresentados na Figura. 14. Os animais receberamimplantes intracranianos de células U87 MG e foram tratados 5 dias depois,em seguida, com controle negativo (PBS), controle positivo (Temodar),agente único experimental (2-DG) ou combinação experimental (2-DG +Temodar).

Os resultados apresentados na Figura 12 demonstram pelaprimeira vez a eficácia do agente único 2-DG contra um modelo de tumorortotópico. Estes resultados foram repetidos e compatíveis em trêsexperimentos consecutivos em animais com, no total, 18 animais em cadagrupo (dados não mostrados). Este modelo animal em particular é muitorigoroso e ganhos somente modestos em sobrevida são revelados semprecom novos fármacos em investigação. Conforme pode ser observado, 2-DGpossui efeito equivalente ao do melhor fármaco disponível atualmente paratumores cerebrais, Temozolomide (visto como controle positivo).

Surpreendentemente, 2-DG foi tão eficaz quanto Temodar, e acombinação foi ainda superior à terapia com o agente isolado. 2-DG foifornecido por via oral e bem tolerado. A equivalência funcional de 2-DG eTemodar foi notável porque Temodar é o "padrão ouro" atual paratratamento de tumores cerebrais. Finalmente, a eficácia do agente isolado foidemonstrada também para essa classe de agentes, que é única para essadoença.

Estes resultados demonstraram que uma inibição de glicóliseaumentou a sobrevida de animais, semelhantemente àquela do controle po-sitivo utilizado, temozolomide. Esta terapia foi bem tolerada pelos animais enão demonstrou evidências de toxicidade. Finalmente, estamos agora sele-cionando compostos de um grupo de inibidores glicolíticos à base de açúcarpara liderar seleções de candidatos que se basearão em eficácia in vitro e invivo, propriedades farmacocinéticas, estabilidade química e o custo da sín-tese química. Ao ser efetuada a seleção de líderes, estudos mais avança-dos, bem como testes formais de toxicologia em animais serão iniciados.

Embora concretizações específicas da invenção tenham sidoapresentadas e descritas em detalhes para ilustrar a aplicação dos princípiosda invenção, será entendido que a invenção pode ser concretizada de outrasformas sem se distanciar destes princípios.

Claims

1. Método de tratamento de glioblastoma, caracterizado pelo fatode que compreende a etapa de administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de 2-FM, 2-CM ou 2-BM a um indivíduo emnecessidade do mesmo.

2. Método de tratamento de câncer pancreático, caracterizadopelo fato de que compreende a etapa de administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de 2-FM, 2-CM ou 2-BM a um indivíduo emnecessidade do mesmo.

3. Método de tratamento da proliferação de tumores, caracteri-zado pelo fato de que compreende a etapa de administração de umaquantidade terapeuticamente eficaz de 2-FM, 2-CM ou 2-BM a um indivíduoem necessidade do mesmo.

4. Método de tratamento de câncer, caracterizado pelo fato deque compreende a etapa de administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de 2-FM, 2-CM ou 2-BM a um indivíduo emnecessidade do mesmo, em que a morte da célula de câncer é porautofagia.

5. Método para se atingir um efeito em um paciente, caracteriza-do pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade tera-peuticamente eficaz de 2-FM, 2-CM ou 2-BM, em que o efeito é selecionadoa partir do grupo consistindo em câncer pancreático e glioblastoma.

6. Método de tratamento de gliomas altamente glicólicos e dealto grau, caracterizado pelo fato de que compreende a administração deuma quantidade terapeuticamente eficaz de 2-DG a gliomas, em que a mortecelular dos gliomas ocorre.

7. Uso de 2-FM, 2-CM ou 2-BM, caracterizado pelo fato de serpara a preparação de uma composição para tratamento de glioblastoma,câncer pancreático, proliferação de tumores e câncer.

8. Uso de 2-DG, caracterizado pelo fato de ser para apreparação de uma composição para tratamento de gliomas altamente glicó-licos e de alto grau.