BRPI0708311A2

BRPI0708311A2 - métodos para danificar células usando funções efetoras de anticorpos anti-epha4

Info

Publication number: BRPI0708311A2
Application number: BRPI0708311-4A
Authority: BR
Inventors: Shuichi Nakatsuru; Megumi Yoshikawa; Shinichi Hiroshima
Original assignee: Oncotherapy Science Inc
Priority date: 2006-02-28
Filing date: 2007-02-22
Publication date: 2011-05-24
Also published as: CN101432022A; CA2643790A1; KR20080105111A; US8003098B2; WO2007102383A1; RU2429246C2; EP2004228A1; RU2008138541A; US20090191211A1; JP2009531273A

Abstract

MéTODOS PARA DANIFICAR CéLULAS USANDO FUNçõES EFETORAS DE ANTICORPOS ANTI-EphA4. A presente invenção refere-se ao uso de citotoxicidade baseada na função efetora de anticorpos anti-EphA4. Especificamente, a presente invenção refere-se a métodos e composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo anti-EphA4 como um ingrediente ativo para danificar células que expressam EphA4 usando função efetora do anticorpo. Já que EphA4 é fortemente expresso em células de câncer pancreático, a presente invenção é particularmente útil em terapias de câncer pancreático.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSPARA DANIFICAR CÉLULAS USANDO FUNÇÕES EFETORAS DE ANTI-CORPOS AN-n-EphA4". ~

Esse pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Pa-tente Provisório U.S. Ne de Série 60/777.794 depositado em 28 de fevereirode 2006, cujos conteúdos estão aqui incorporados por referência na sua to-talidade.Campo Técnico

A presente invenção refere-se a métodos para danificar célulasusando a função efetora de anticorpos anti-EphA4 e a composições úteispara isto.

Antecedente da Técnica

O câncer pancreático tem uma das maiores taxas de mortalidadede qualquer malignidade, e a taxa de 5 anos de sobrevida dos pacientes éde 4%. Aproximadamente 28.000 pacientes são diagnosticados com câncerpancreático a cada ano, e quase todos os pacientes morrerão da doença(Greenlee, R. T., et al., (2001) CA Câncer J Clin, 51: 15-36). O péssimoprognóstico dessa'malignidade é um resultado da dificuldade de diagnósticoprecoce e pouca resposta aos métodos terapêuticos atuais (Greenlee, R. T.,etal. (2001) CACancerJ Clin, 51:15-36, Klinkenbijl, J. H., et al. (1999) AnnSurg, 230: 776-82; discussão 782-4.). Em particular, não há marcadores tu-morais identificados que permitam o rastreamento confiável em um estágioprecoce, potencialmente curativo da doença.

Pesquisas direcionadas para uma elucidação de mecanismoscarcinogênicos revelaram várias moléculas alvo candidatas para o desenvol-vimento de agentes antitumorais. Por exemplo, o inibidor de farnesiltransfe-rase (FTI) mostrou-se eficaz na terapia de tumores dependentes de Ras emmodelos animais (Sun J et al., (1998) Oncogene, 16:1467-73.). Esse agentefarmacêutico foi desenvolvido para inibir vias de sinalização de crescimentorelacionadas a Ras, que é dependente de farnesilação pós-transcricional.Testes clínicos em seres humanos onde agentes antitumorais foram aplica-dos em combinação com o anticorpo monoclonal antiHER2, trastuzumab, afim de antagonizar o proto-oncogene HER2/neu tiveram sucesso em melho-rar a resposta clínica, e melhoram a taxa de sobrevida global de pacientescom câncer de mama. O inibidor de tirosina quinase STI-571 é um inibidorque desativa seletivamente a proteína de fusão bcr-abl. Esse agente farma-cêutico foi desenvolvido para a terapia de leucemia mielóide crônica, onde aativação constante da tirosina quinase bcr-abl desempenha um papel impor-tante na transformação de células brancas do sangue. Tais agentes farma-cêuticos são desenhados para inibir a atividade carcinogênica de produtosgênicos específicos (Molina MA, et al., (2000) Câncer Res, 16:4744-9). Des-sa forma, em células de câncer, produtos gênicos com expressão estimuladasão geralmente alvos potenciais para o desenvolvimento de novos agentesantitumorais.

Outra estratégia de terapia do câncer envolve o uso de anti-corpos que se ligam às células do câncer. Os seguintes são mecanismosrepresentativos de terapia de câncer mediada por anticorpos:

Terapia de alvo (míssil): nessa abordagem, um agente farma-cêutico é ligado a um anticorpo que se liga especificamente às células docâncer, permitindo assim que o agente aja especificamente sobre elas. Essadistribuição direcionada permite que até mesmo aqueles agentes com fortesefeitos colaterais ajam intensamente sobre as células do câncer. Além deagentes farmacêuticos, também há relatos de abordagens onde precursoresde agentes farmacêuticos, enzimas que metabolizam os precursores parauma forma ativa, e assim por diante, são ligados aos anticorpos.

Uso de anticorpos que atingem moléculas funcionais: essaabordagem inibe a ligação entre fatores de crescimento e células de câncerusando, por exemplo, anticorpos que se ligam a receptores de fator de cres-cimento ou a fatores de crescimento. A proliferação de algumas células can-cerosas é altamente dependente de fatores de crescimento. Por exemplo,alguns cânceres são conhecidos por serem dependentes de fator de cresci-mento epitelial (EGF) ou fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)para o crescimento das células. Para tais cânceres, inibir a ligação entre umfator de crescimento e as células do câncer pode ter um efeito terapêutico.Citotoxicidade de anticorpo: anticorpos que se ligam a certostipos de antígenos podem obter citotoxicidade em células cancerosas. Comesses tipos de anticorpos, a molécula de anticorpo em si tem um efeito anti-tumoral direto. Anticorpos que apresentam citotoxicidade a células de câncerestão ganhando atenção como agentes de anticorpo esperados para tergrande eficácia contra tumores.

Descrição da invenção

Os presentes inventores descreveram anteriormente que EphA4é um gene relacionado ao câncer pancreático cuja expressão está aumenta-da em células de câncer pancreático. Vide W02004/031412, incorporadoaqui por referência na sua totalidade. Eles ainda descreveram que siRNAcontra EphA4 suprime a proliferação de células pancreáticas. Vide,W02005/083086, incorporado aqui por referência na sua totalidade. Aqui, ospresentes inventores investigaram anticorpos capazes de induzir citotoxici-dade, com foco em genes, como por exemplo EphA4, que mostram expres-são aumentada em células de câncer. Os resultados revelaram que citotoxi-cidade potente pode ser induzida em células que expressam EphA4 quandoessas células são contatadas com anticorpos anti- EphA4 completando as-sim a presente invenção.

Especificamente, a presente invenção refere-se às seguintescomposições farmacêuticas ou métodos:

[1] uma composição farmacêutica para danificar uma célula queexpressa EphA4, a composição contendo como um ingrediente ativo um an-ticorpo anti-EphA4, em que o anticorpo possui função efetora de anticorpo;

[2] a composição farmacêutica de [1], em que a célula que ex-pressa EphA4 é uma célula de câncer pancreático;

[3] a composição farmacêutica de [1], em que o anticorpo anti-EphA4 é um anticorpo monoclonal;

[4] a composição farmacêutica de [1], em que a função efetora doanticorpo é citotoxicidade dependente de anticorpo ou citotoxicidade depen-dente de complemento, ou ambas;

[5] a composição farmacêutica [1], em que o anticorpo é compos-to de uma cadeia VH e uma VL, cada cadeia VH e VL tendo seqüências deaminoácido de CDR designadas CDR1, CDR2 e CDR3 separadas por estru-tura de seqüências de aminoácido, a seqüência de aminoácido de cada CDRem cada cadeia VH e VL sendo selecionada a partir do grupo que consisteem:

CDR1 de VH humana: ELSMH (SEQ ID Ne: 10),CDR2 de VH humana: GFDPEDGETIYAQKFQG (SEQ ID N9:11),

CDR3 de VH humana: AQPFHWGDDAFDI (SEQ ID Ns: 12),CDR1 de VL humana: SGSSSNIGSNTVN (SEQ ID Ne: 15),CDR2 de VL humana: SNNQRPS (SEQ ID Ne: 16),CDR3 de VL humana: AAWDDSLNGPV (SEQ ID N5: 17); eCDR1 de VH humana: SNSAAWN (SEQ ID N9: 20),CDR2 de VH humana: RTYYRSKWYNDYAVSVKS (SEQ ID N9:21),

CDR3 de VH humana: DSLRSFDY (SEQ ID N9: 22),CDR1 de VL humana: SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID N9: 24),CDR2 de VL humana: DNNKRPS (SEQ ID N9: 25),CDR3 de VL humana: GTWDSSLSAVV (SEQ ID N9: 26).

[7] a composição farmacêutica de [5], em que o anticorpo aindainclui um domínio Fc de IgGI humana;

[8] um anticorpo composto de uma cadeia VH e uma VL, cadacadeia VH e VL tendo seqüências de aminoácido de CDR designadas C-DR1, CDR2 e CDR3 separadas por seqüências de aminoácido de estrutura,a seqüência de aminoácido de cada CDR em cada cadeia VH e VL é sele-cionada a partir do grupo que consiste em:

CDR1 de VH humana: ELSMH (SEQ ID N9: 10),

CDR2 de VH humana: GFDPEDGETIYAQKFQG (SEQ ID N9:11),

CDR3 de VH humana: AQPFHWGDDAFDI (SEQ ID N9: 12),

CDR1 de VL humana: SGSSSNIGSNTVN (SEQ ID N9: 15),CDR2 de VL humana: SNNQRPS (SEQ ID N9: 16),CDR3 de VL humana: AAWDDSLNGPV (SEQ ID N5: 17); e

CDR1 de VH humana: SNSAAWN (SEQ ID N°: 20);

CDR2 de VH humana: RTYYRSKWYNDYAVSVKS (SEQ ID N°-:21),

CDR3 de VH humana: DSLRSFDY (SEQ ID N°: 22),

CDR1 de VL humana: SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID N°: 24),

CDR2 de VL humana: DNNKRPS (SEQ ID N°: 25),

CDR3 de VL humana: GTWDSSLSAVV (SEQ ID N°: 26)

[9] o anticorpo de [8], em que a VH humana corresponde à se-qüência de aminoácido de SEQ ID N°: 27 ou 29, e a VL humana correspon-de à seqüência de aminoácido de SEQ ID N°: 28 ou 30;

[10] o anticorpo de [8], em que o anticorpo ainda compreende odomínio Fc de IgGI humana;

[11] um polinucleotídeo isolado que codifica o anticorpo de [8];

[12] um vetor que contém o polinucleotídeo de [11];

[13] uma célula hospedeira isolada que contém o vetor de [12];

[14] um processo para produzir um anticorpo incluindo as etapasde cultivar a célula hospedeira de [13] para que o polinucleotídeo seja ex-presso, e recuperar o anticorpo da cultura de célula hospedeira;

[15] uma composição farmacêutica para danificar uma célula queexpréssa EphA4, em que a composição contém o polinucleotídeo de [11], ouum vetor contendo o mesmo;

[16] Um método para danificar uma célula que expressa EphA4,incluindo as etapas de:

a) colocar a célula que expressa EphA4 em contato com um anti-corpo anti-EphA4, e

b) danificar a célula que expressa EphA4 com a função efetorado anticorpo que ligou à célula;

[17] uma composição imunogênica para induzir um anticorpo quetem uma função efetora contra uma célula que expressa EphA4, em que acomposição inclui, como um ingrediente ativo, EphA4, um fragmento imuno-Iogicamente ativo do mesmo, ou um DNA que pode expressar EphA4 ou seufragmento imunologicamente ativo;

[18] um método para induzir um anticorpo que tem uma funçãoefetora contra uma célula que expressa EphA-4, em que o método inclui aetapa de administrar EphA4, um fragmento imunologicamente ativo domesmo, ou uma célula ou um DNA que pode expressar EphA4 ou o frag-mento imunologicamente ativo; e

[19] um método para tratar ou prevenir um câncer pancreático emum indivíduo que compreende a etapa de administrar ao dito indivíduo umaquantidade farmaceuticamente eficaz de um anticorpo anti-EphA4, ou umfragmento imunologicamente ativo do mesmo, em que o anticorpo possuifunção efetora de anticorpo.

A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas paradanificar células que expressam EphA4 usando função efetora de anticorpo,em que as composições contêm um anticorpo anti-EphA4 como um ingredi-ente ativo. A presente invenção também refere-se ao uso de um anticorpoanti-EphA4 para produzir composições farmacêuticas para danificar célulasque expressam EphA4 usando a função efetora de um anticorpo anti-EphA4.As composições farmacêuticas da presente invenção são compostas de an-ticorpos anti-EphA4 e veículos farmaceuticamente aceitáveis.

Os presentes inventores usaram microarranjos de cDNA paraanálise de expressão gênica de células de câncer de próstata ou pâncreas ecélulas normais coletadas a partir de pacientes com câncer prostático e pan-creático. Vários genes com expressão especificamente aumentada em célu-las de câncer pancreático foram subseqüentemente identificados. Dessesgenes com expressão alterada em células de câncer pancreático, um gene,o gene A4 do receptor Eph (referido aqui como "EphA4") que codifica umaproteína da membrana citoplasmática com baixos níveis de expressão emórgãos importantes, foi selecionado como um gene alvo candidato para tera-pias de câncer pancreático (Nakamura T. et al. (2004) Oncoaene. 2004 Mar25;23(13):2385-400). Por selecionar genes com baixos níveis de expressãoem órgãos importantes, foi presumido que o risco de efeitos colaterais pode-ria ser evitado. Dentre as proteínas codificadas pelos genes selecionadosdesta forma, anticorpos anti-EphA4 foram confirmados como tendo funçõesefetoras contra células que expressam EphA4.

Os achados obtidos pelos presentes inventores mostram que, emum sistema de expressão forçada, EphA4 sinalizado com c-myc-His estavalocalizado na membrana citoplasmática, o que foi confirmado usando mi-croscopia de imunofluorescência. O gene EphA4 codifica uma seqüência deaminoácido que supostamente funciona como um peptídeo de sinal na suaterminação N. como mencionado acima, essa proteína foi observada estan-do localizada principalmente na membrana citoplasmática, e assim presume-se que seja uma proteína transmembrana. Além disso, o baixo nível de ex-pressão desse gene em órgãos importantes e sua alta expressão em célulasde câncer pancreático, estabeleceu EphA4 como sendo útil como marcadorclínico e alvo terapêutico.

As condições necessárias para destruir células de câncer usandofunção efetora são, por exemplo, os seguintes:

• expressão de grandes números de moléculas antigênicas nasuperfície da membrana de células de câncer;

• distribuição uniforme de antígenos dentro de tecidos cance-rosos;

· permanência de antígenos ligados aos anticorpos sobre asuperfície celular por um longo tempo.

Mais especificamente, por exemplo, antígenos reconhecidospor anticorpos devem ser expressos sobre a superfície da membrana celular.Além disso, é preferível que a proporção de células positivas para o antígenoseja a mais alta possível nas células que formam os tecidos cancerosos. Emuma situação ideal todas as células do câncer são positivas. Quando célulaspositivas e negativas para o antígeno são misturadas em populações de cé-lulas de câncer, o efeito clínico terapêutico de um anticorpo específico paraelas será substancialmente diminuído.

Geralmente quando o maior número possível de moléculas éexpresso sobre a superfície celular, funções efetoras potentes podem seresperadas. Também é importante que um anticorpo ligado a tal antígeno nãoseja absorvido pelas células. Alguns receptores são absorvidos pelas células(endocitose) após ligação a um ligante. De forma semelhante, anticorposligados a antígenos de superfície celular também podem ser absorvidos pelacélula. Esse tipo de fenômeno, pelo qual anticorpos são absorvidos por célu-las, é chamado de internalização. Quando a internalização ocorre, a regiãoconstante do anticorpo (Fc) é absorvida pela célula. Entretanto, células oumoléculas essenciais para a função efetora permanecem do lado de fora dascélulas que expressam o antígeno. Dessa forma, a internalização inibe afunção efetora do anticorpo. Portanto, quando a função efetora do anticorpoé desejada, é importante selecionar um antígeno que resulte em internaliza-ção limitada. Os presentes inventores revelaram pela primeira vez queEphA4 é um antígeno-alvo que possui tal propriedade.

As palavras "um", "uma", "o" e "a" como usadas aqui, significam"pelo menos um(a)" a menos que especificamente indicado em contrário.

Um polipeptídeo "isolado" ou "purificado" é um polipeptídeo que ésubstancialmente livre de material celular, tal como carboidrato, lipídio, ououtras proteínas contaminantes oriundas da fonte de célula ou tecido a partirda qual a proteína é derivada, e/ou substancialmente livre de precursoresquímicos ou outros químicos quando sintetizado quimicamente. O termo"substancialmente livre de material celular" abrange preparações de um poli-peptídeo nas quais o polipeptídeo é separado de componentes celulares dascélulas das quais ele é isolado ou produzido recombinantemente. Dessaforma, um polipeptídeo que é substancialmente livre de material celular incluipreparações de polipeptídeo que têm menos do que cerca de 30%, 20%,10%, ou 5% (em peso seco) de proteína heteróloga (também referida quecomo "proteína contaminante"). Quando o polipeptídeo é produzido recombi-nantemente, ele também é preferivelmente substancialmente livre de meiode cultura, o que inclui preparações de polipeptídeo com um volume de meiode cultura de menos do que 20%, 10%, ou 5% do volume da preparação deproteína. Quando o polipeptídeo é produzido por síntese química, ele é pre-ferivelmente substancialmente livre de precursores químicos ou outros quí-micos, o que inclui preparações de polipeptídeo com precursores químicosou outros químicos envolvidos na síntese da proteína compondo menos doque 30%, 20%, 10%, 5% (em peso seco) do volume da preparação de prote-ína. Pode-se mostrar que uma preparação de proteína particular contém umpolipeptídeo isolado ou purificado, por exemplo, pelo aparecimento de umaúnica banda após eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio (SDS)-poliacrilamida da preparação de proteína e coloração do gel com Azul Bri-lhante de Coomassie. Em uma modalidade preferida, anticorpos da presenteinvenção ou fragmentos destes são isolados ou purificados.

Uma molécula de ácido nucléico "isolada" ou "purificada" é umaque é separada da outras moléculas de ácido nucléico que estão presentesna fonte natural da molécula de ácido nucléico. Uma molécula de ácido nu-cléico "isolada" ou "purificada", por exemplo, uma molécula de cDNA, podeser substancialmente livre de outro material celular, ou meio de culturaquando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre deprecursores químicos ou outros químicos quando sintetizada quimicamente.Em uma modalidade preferida, moléculas de ácido nucléico que codificamanticorpos da presente invenção ou fragmentos destes são isoladas ou puri-ficadas.

"Anticorpos" ou "imunoglobulinas" são glicoproteínas que têm asmesmas características estruturais. Enquanto anticorpos exibem especifici-dade de ligação a um antígeno específico, imunoglobulinas incluem tantoanticorpos como outras moléculas semelhantes a anticorpos, para as quais aespecificidade por um antígeno ainda não foi definida. Polipeptídeos do últi-mo tipo são, por exemplo, produzidos em baixos níveis pelo sistema linfáticoe em níveis elevados por mielomas.

"Anticorpos e imunoglobulinas nativas" são tipicamente glicopro-teínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 dáltons, compostas de duascadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada ca-deia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação de dissulfeto cova-lente, embora o número de ligações dissulfeto entre as cadeias pesadas dediferentes isotipos de imunoglobulina possa variar. Cada cadeia pesada eleve também tem ligações dissulfeto intracadeia em espaços regulares. Ca-da cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (VH) se-guido por vários domínios constantes (CH). Cada cadeia leve tem um domí-nio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante na sua outraextremidade (CL); o domínio constante da cadeia leve é alinhado com o pri-meiro domínio variável da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeialeve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se quecertos resíduos de aminoácido formem uma interface entre os domínios va-riáveis de cadeia leve e pesada (Chothia et ai, (1985) J Mol Biol.;186:651-63; Novotny & Haber1 (1985) Proc Natl Acad Sci USA.;82:4592-6).

O termo "variável" refere-se ao fato de que certas porções dosdomínios variáveis diferem muito em seqüência entre anticorpos e, portantopresume-se que estejam envolvidos na ligação e especificidade de cada an-ticorpo particular para seu antígeno particular. Entretanto, a variabilidade nãoé distribuída homogeneamente por todos os domínios variáveis dos anticor-pos. Ao invés disso, ela geralmente está concentrada nos três segmentoschamados "regiões de determinação de complementaridade" (também co-nhecidas como "CRDs") ou regiões hipervariáveis tanto nos domínios variá-veis de cadeia leve como de cadeia pesada. As porções mais conservadasdos domínios variáveis são chamadas de estrutura (FR). Os domínios variá-veis de cadeias pesada e leve nativas incluem cada quatro regiões de estru-tura, que adotam largamente uma configuração de folha-β, conectadas portrês CDRs, que formam alças conectando em alguns casos fazendo parte daestrutura de folha-β. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em pro-ximidade pelas regiões de estrutura, e com as CDRs da outra cadeia, contri-buem para a formação do sítio tridimensional de ligação ao antígeno de umanticorpo (Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Inte-rest, Quinta Edição, National Institute of Health, Bethesda, Md.). Os domí-nios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticor-po a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, por exemplo, partici-pação do anticorpo em toxicidade celular dependente de anticorpo.

Digestão com papaína de um anticorpo produz dois fragmentosde ligação de antígeno idênticos chamadas fragmentos "Fab", cada um comum sítio de ligação de antígeno, e um fragmento "Fc" residual. Tratamentocom pepsina gera um fragmento F(ab')e que tem dois sítios de ligação deantígeno. "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio com-pleto de reconhecimento e ligação de antígeno. Essa região é geralmentecomposta de um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um decadeia leve, em ligação não-covalente forte. É nesta configuração que astrês CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de liga-ção de antígeno sobre a superfície do dímero de VH-VL. Coletivamente, asseis CDRs conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo.Entretanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compos-to de apenas três CDRs específicas para o antígeno) tem a habilidade dereconhecer e se ligar a um antígeno, embora com uma afinidade menor doque o sítio de ligação inteiro.

O fragmento Fab também contem o domínio constante da cadeialeve e o primeiro domínio constante (CH-1) da cadeia pesada. FragmentosFab' diferem de fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos na termina-ção carbóxi do domínio CH-1 da cadeia pesada incluindo uma ou maiscisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação aquiusada para Fab', no qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constan-tes carregam um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 original-mente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que tem cisteínasde dobradiça entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos deanticorpos também são conhecidos na técnica.

As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquerespécie de vertebrado podem ser classificadas em um de dois tipos clara-mente distintos, referidos como κ (kappa) e λ (Iambda)1 respectivamente,com base nas seqüências de aminoácido de seus domínios constantes.

Dependendo da seqüência de aminoácido do domínio constantede suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser classificadas emdiferentes classes. Há cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD,IgE, IgG, e IgM, e várias dessas podem ainda ser divididas em subclasses(isotipos), por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, e lgA2. Os domíniosconstantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes deimunoglobulinas são chamados α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. As estrutu-ras e configurações tridimensionais das subunidades de diferentes classesde imunoglobulinas são bem-conhecidas na técnica.

O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui se refere a umanticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmentehomogêneos, por exemplo, os anticorpos individuais dentro da populaçãosão idênticos, com a exceção de possíveis mutações de ocorrência naturalque podem estar presentes em pequenas quantidades. Anticorpos monoclo-nais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítioantigênico. Além disso, ao contrário de preparações de anticorpo convencio-nais (policlonais), que incluem tipicamente diferentes anticorpos direciona-dos contra determinantes (epitopos) diferentes, cada anticorpo monoclonal édirecionado contra um único determinando sobre o antígeno. Além de suaespecificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos em que eles po-dem ser sintetizados por cultura de hibridoma, não contaminados por outrasimunoglobulinas. Dessa forma, o modificador "monoclonal" indica o caráterdo anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmentehomogênea de anticorpos, e não deve ser considerado como requerendo aprodução do anticorpo por nenhum método em particular. Por exemplo, osanticorpos monoclonais da presente invenção podem ser feitos pelo métodode hibridoma primeiro descrito por Kohler & Milstein1 (1975) Nature.;256:495-7, ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante (Cabilly et al.,(1984) Proc Natl Acad Sci USA.;81:3273-7).

Os anticorpos monoclonais descritos aqui incluem especifica-mente anticorpos ou imunoglobulinas "quiméricas", nos quais uma porção dacadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a seqüências correspon-dentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou que per-tencem a uma classe ou subclasse de anticorpo em particular, enquanto queo restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a seqüências correspon-dentes em anticorpos derivados de outras espécies ou que pertencem a ou-tra classe ou subclasse, assim como fragmentos de tais anticorpos, contantoque eles exibam a atividade biológica desejada (Cabilly et al., supra; Morri-son et ai, (1984) Proc Natl Acad Sci USA.;81:6851-5). Os anticorpos ou i-munoglobulinas quiméricas mais comuns são compostas de fragmentos deanticorpos humanos e de murino, geralmente regiões constantes humanas evariáveis de camundongo.

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exem-plo, murinos) são imunoglobulinas quiméricas específicas, cadeias de imu-noglobulina ou fragmentos destas que contem uma seqüência mínima deri-vada de imunoglobulina não-humana. Tais fragmentos também incluem Fv,Fab, Fab', F(ab')2, e outras subseqüências de ligação de antígeno de anti-corpos. Para a maioria, anticorpos humanizados são imunoglobulinas huma-nas (anticorpo receptor) nos quais resíduos de uma região de determinaçãode complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de-rivados de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador), porexemplo, um camundongo, rato, ou coelho que tem a especificidade, afini-dade e capacidade desejada. Em alguns casos, resíduos Fv de estrutura daimunoglobulina humana podem ser substituídos por resíduos humanos cor-respondentes. No contexto da presente invenção, apenas algumas, duas, oupreferivelmente uma, estrutura(s) no anticorpo humanizado é(são) substituí-da(s) por aqueles de resíduos não humanos. Além disso, anticorpos humani-zados podem conter resíduos que não são encontrados nem na seqüênciado anticorpo receptor nem nas seqüências de CDR ou estrutura importadas.Essas modificações são geralmente introduzidas para refinar e otimizar ain-da mais o desempenho dos anticorpos. Em geral, um anticorpo humanizadoincluirá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, do-mínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões deCDR correspondem àquelas de uma seqüência consenso de imunoglobulinahumana. Um anticorpo otimamente humanizado também incluirá pelo menosuma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamenteaquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes vide Jones etal., (1986) Nature.;321:522-5; Riechmann et al., (1988) Nature.;332:323-7;Presta, (1992) Curr Opin Struct Biol. 2:593-6.Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "sFv" são com-postos dos domínios VH e VL de um anticorpo, em que esses domínios es-tão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Preferivelmente, o poli-peptídeo Fv ainda inclui um Iigante de polipeptídeo entre os domínios VH eVL que permite que o sFv forme a estrutura tridimensional desejada neces-sária para ligação do antígeno. Vários métodos foram descritos para reco-nhecer estruturas químicas para converter as cadeias leve e pesada de poli-peptídeo naturalmente agregadas, mas quimicamente separadas de umaregião V de anticorpo em uma molécula de sFv que se dobrará em uma es-trutura tridimensional substancialmente similar à estrutura de um sítio de li-gação de antígeno (Pat. U.S. Nss 5.091.513, 5.132.405, e 4.946.778; Pluck-thun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenberg &Moore eds., Springer-Verlag1 Nova Iorque, pp. 269-315 (1994)).

A região Fc (Fragmento, cristalizável) mencionada acima é deri-vada da haste do "Y" do anticorpo e é composta de duas cadeias pesadasque contribuem cada com dois a três domínios constantes (dependendo daclasse do anticorpo). Fc se liga a vários receptores celulares e proteínas docomplemento. Desta forma, ela media diferentes efeitos fisiológicos de anti-corpos (opsonização, Iise celular, desgranulação de mastócitos, basófilos eeosinófilos e outros processos).

Algumas células (por exemplo, mastócitos e fagócitos) têm re-ceptores específicos sobre sua superfície para ligação de anticorpos. Essessão chamados receptores de Fe, e como o nome sugere, esses receptoresinteragem com a região Fc de alguns anticorpos (por exemplo, IgA, IgG, I-gE). O encontro de um anticorpo particular com o receptor de Fc em umacélula particular irá disparar a função efetora daquela célula (por exemplo,fagócitos irão fagocitar, mastócitos irão desgranular) o que em última análi-se, resultará na destruição do micróbio invasor. Os receptores de Fc são iso-tipo-específicos, o que dá uma grande flexibilidade ao sistema imune, por-que diferentes situações requerem apenas alguns mecanismos imunes pararesponder aos antígenos. Conseqüentemente, no contexto da presente in-venção, o termo "função efetora" refere-se à citotoxicidade envolvida com asregiões Fc de anticorpos. Alternativamente, função efetora também pode serexplicada como um papel que determina a atividade biológica disparada peloreconhecimento de antígeno de um anticorpo. Por exemplo, funções quedirecionam o efeito pelo qual as regiões Fc de anticorpos ligados a antíge-nos danificam células que expressam estes antígenos, também podem serreferidas como funções efetoras de anticorpo. Aqui, células-alvo preferidassão células de câncer.

Geralmente a ligação de um anticorpo a um antígeno não temefeito biológico direto. Ao invés disso, os efeitos biológicos significativos sãouma conseqüência das "funções efetoras" secundárias de anticorpos. Asimunoglobulinas mediam uma variedade dessas funções efetoras. Geral-mente a habilidade de executar uma função efetora particular requer que oanticorpo se ligue ao seu antígeno. Entretanto, nem toda imunoglobulina irámediar todas as funções efetoras. Exemplos de funções efetoras de anticor-po conhecidas incluem: Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo(ADCC). Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), e atividadeneutralizante. Cada função é descrita abaixo.Citotoxicidade Mediada por Célula Dependente de Anticorpo (ADCC):

Funções de células efetoras executadas pelas regiões Fc de vá-rios anticorpos dependem em grande parte da classe do anticorpo. Existemcélulas que contêm receptores de Fc específicos para uma região Fc dasclasses IgG1 IgE ou IgA de imunoglobulinas. A região Fc de anticorpos dasclasses IgG, IgE e IgA se ligam cada, a um receptor de Fc específico, e célu-las que expressam um receptor de Fc correspondente reconhecem e se Ii-gam a anticorpos ligados a membranas celulares e assim por diante. Comoum resultado, por exemplo, células que têm receptores de Fc são ativadas, efuncionam no transporte intercelular de anticorpo.

Por exemplo, um anticorpo da classe IgG é reconhecido por re-ceptores de Fc sobre células T, células NK, neutrófilos, e macrófagos. Essascélulas se ligam e são ativadas pela região Fc de anticorpos da classe IgGl eexpressam citotoxicidade contra células às quais esses anticorpos se liga-ram. Células, tais como células T, células NK, neutrófilos, macrófagos, queadquirem citotoxicidade através de função efetora de anticorpo, são chama-das células efetoras. Em particular, anticorpos da classe IgG ativam célulasefetoras através de receptores de Fc sobre essas células, e então matamcélulas-alvo às quais as regiões variáveis dos anticorpos estão ligadas. Issoé chamado citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo(ADCC). ADCC pode ser dividida com base no tipo de célula efetora, comosegue:

ADMC: citotoxicidade mediada por macrófago dependente deIgG, e

ADCC: citotoxicidade mediada por célula NK dependente de IgG.Não há limitação sobre os tipos de células efetoras na ADCC dapresente invenção. Em outras palavras, a ADCC da presente invenção tam-bém abrange ADMC, em que macrófagos são as células efetoras.

ADCC de anticorpo é conhecida como sendo um importante me-canismo para conferir efeitos antitumorais, particularmente em terapias decâncer que usam anticorpos (Clynes RA1 et ai, (2000) Nature Med., 6: 443-6.). Por exemplo, uma íntima relação entre o efeito terapêutico de anticorposquiméricos anti-CD20 e ADCC foi relatada (Cartron G, et ai, (2002) Blood,99: 754-8.). Dessa forma, no contexto da presente invenção, ADCC tambémé particularmente importante entre funções efetoras de anticorpo.

ADCC é uma função efetora chave para a eficácia clínica de an-ticorpos monoclonais, particularmente na área de terapia do câncer. Por e-xemplo, acredita-se que ADCC seja um mecanismo importante nos efeitosantitumorais de Rituxan, Herceptin1 e semelhantes, para os quais, já se ini-ciou aplicação clínica. Rituxan e Herceptin são agentes terapêuticos conhe-cidos para o tratamento de Iinfoma não-Hodgkin e câncer de mama metastá-tico, respectivamente.

Atualmente, o mecanismo para a citotoxicidade mediada porADCC é explicada em termos gerais como segue: acredita-se que célulasefetoras, que estão ligadas às células-alvo através de anticorpos ligados àsuperfície celular, induzem apoptose da célula-alvo por transmitir algum tipode sinal letal para as células-alvo. Mais especificamente, ADCC é mediadaprimariamente através de um conjunto de receptores de Fcy intimamenterelacionados, com atividades ativadoras e inibitórias. Em qualquer caso, an-ticorpos que induzem citotoxicidade por células efetoras estão incluídos nosanticorpos que possuem função efetora no contexto da presente invenção.

Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse,um ensaio de ADCC in vitro, tal como aquele descrito nas Pat. U.S. Nos.5.500.362 ou 5.821.337 pode ser realizado. Alternativa, ou adicionalmente, aatividade de ADCC de uma molécula de interesse pode ser avaliada in vivo,por exemplo, em um modelo animal tal como aquele descrito em Clynes eta/., (1998) Proc NatIAcad Sci USA.;95:652-56.

Citotoxicidade dependente do complemento (CDC):

As regiões Fc de imunoglobulinas ligadas a antígenos são co-nhecidas como ativadoras de vias complementares. Também foi reveladoque a via de ativação pode diferir dependendo da classe da imunoglobulina.Por exemplo, dos anticorpos humanos, IgM e IgG ativam a via clássica. Poroutro lado, IgA, IgD, e IgE não ativam essa via. Isto quer dizer que a funçãode ativar o complemento é limitada aos anticorpos das classes IgM e IgG.Particularmente, a função de células de Iise às quais regiões variáveis deanticorpos são ligadas é chamada citotoxicidade dependente do complemen-to (CDC).

Os complementos ativados produzem, através de várias reações,um complexo de ataque à membrana (MAC) C5b-9 que tem atividade dedanificar a membrana. Acredita-se que MACs geradas dessa forma danifi-quem partículas virais e membranas celulares, de forma independente decélulas efetoras. O mecanismo para a citotoxicidade mediada por MAC sebaseia no seguinte. MACs possuem uma forte afinidade de ligação pormembranas celulares. MACs ligados a uma membrana celular abrem umorifício na membrana celular, tornando fácil para água fluir para dentro e forada célula. Como um resultado, a membrana celular é desestabilizada, ou apressão osmótica é alterada, e a célula é destruída. Citotoxicidade causadapor um complemento ativado se estende apenas para membrana próxima aoanticorpo que se ligou ao antígeno. Por essa razão, citotoxicidade mediadapor MAC é dependente de especificidade do anticorpo. Entretanto, na práti-ca, essas citotoxicidades podem funcionar em combinação em organismosvivos.

Para avaliar a atividade de CDC de uma molécula de interesse,um ensaio de CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al.,(1997) J Immunol Methods.; 202:163-71, pode ser realizado.

Atividade neutralizante:

Anticorpos capazes de retirar a infecciosidade de patógenos e a-tividade de toxinas são conhecidos na técnica. Neutralização mediada poranticorpo pode ser obtida através da ligação de uma região variável antigê-nica a um antígeno, ou alternativamente, pode requerer a mediação do com-plemento. Por exemplo, em alguns casos, anticorpos antivirais requeremmediação do complemento a fim de retirar a infecciosidade de um vírus. Re-giões Fc são essenciais para a participação de complementos. Dessa forma,tais anticorpos possuem função efetora que requer Fc para neutralizar víruse células.

Dessas, as funções efetoras preferíveis aqui são ADCC ou CDC,ou ambas. A presente invenção se baseia no achado de que certos anticor-pos anti-EphA4 se ligam a células que expressam EphA4, e então expres-sam função efetora.

A presente invenção também se refere a métodos para danificarcélulas que expressam EphA4, tais métodos incluindo as seguintes etapas:

1) colocar as células que expressam EphA4 em contato com an-ticorpos anti-EphA4, e

2) danificar as células que expressam EphA4 usando a funçãoefetora dos anticorpos que se ligaram às células.

Nos métodos ou composições farmacêuticas da presente inven-ção qualquer células que expressa EphA4 pode ser danificada ou morta. Porexemplo, células de câncer pancreático são preferíveis como as células queexpressam EphA4 da presente invenção. Dessas, células de carcinomapancreático são preferíveis.

Células e anticorpos podem ser contatados in vivo ou in vitro.Quando se atinge células de câncer in vivo como as células que expressamEphA4, os métodos da presente invenção são de fato métodos terapêuticosou preventivos para cânceres. Especificamente, a presente invenção fornecemétodos terapêuticos para cânceres que incluem as seguintes etapas:

1) administrar a um paciente com câncer um anticorpo que se li-ga a EphA4, e

2) danificar células de câncer usando a função efetora do anti-corpo ligado às células.

Os presentes inventores confirmaram que anticorpos que se Ii-gam a EphA4 danificam eficazmente células que expressam EphA4, em par-ticular, células de câncer pancreático por meio de função efetora. Os presen-tes inventores também confirmaram que EphA4 é altamente expressão emcélulas de câncer pancreático, com uma alta probabilidade. Além disso, osníveis de expressão de EphA4 em tecidos normais são baixos. Tomadas jun-tas, essas informações sugerem que métodos de terapia de câncer pancreá-tico em que um anticorpo anti-EphA4 é administrado pode ser eficaz, compouco risco de efeitos colaterais.

Anticorpos que incluem a região Fc de IgA, IgE, ou IgG são es-senciais para expressar ADCC. Igualmente, a região Fc do anticorpo IgM ouIgG é preferível para expressar CDC.

Entretanto, os anticorpos da presente invenção não são limitadoscontanto que eles possuam a função efetora desejada. Variantes, análogosou derivados da porção Fc podem ser construídos, por exemplo, por fazervárias substituições de resíduos ou seqüências. Em particular a presenteinvenção contempla anticorpos compostos de variantes de Fc manipuladoscom afinidade e especificidade do receptor de Fcy otimizada para aumentardessa forma a função efetora resultante.

Polipeptídeos variantes (ou análogos) incluem variantes de in-serção, em que um ou mais resíduos de aminoácido suplementam uma se-qüência de aminoácido de Fc. Inserções podem estar localizadas em qual-quer uma ou ambas as terminações da proteína, ou podem estar posiciona-das dentro de regiões internas da seqüência de aminoácido de Fc. Variantesinsercionais com resíduos adicionais em qualquer uma ou ambas as termi-nações podem incluir, por exemplo, proteínas de fusão e proteínas que in-cluem sinalizadores ou marcadores de aminoácido. Por exemplo, a moléculade Fc pode conter opcionalmente uma Met N-terminal, especialmente quan-do a molécula é expressa recombinantemente em uma célula bacteriana, talcomo E. coli.

Em variantes de deleção de Fc, um ou mais resíduos de aminoá-cido em um polipeptídeo de Fc são removidos. Deleções podem ser efetua-das em uma ou ambas as terminações do polipeptídeo de Fe, ou com remo-ção de um ou mais resíduos dentro da seqüência de aminoácido de Fc. Va-riantes de deleção, portanto, incluem todos os fragmentos de uma seqüênciade polipeptídeo de Fe.

No contexto de variantes de substituição de Fe, um ou mais resí-duos de aminoácido de um polipeptídeo de Fc são removidos e substituídospor resíduos alternativos. Um versado na técnica reconhecerá que adições,deleções, inserções ou substituições a uma seqüência de aminoácido quealteram um único aminoácido ou uma pequena porcentagem de aminoácidosresultam na conservação das propriedades da cadeia lateral de aminoácidooriginal. Elas são referidas como "substituições conservativas" ou "modifica-ções conservativas", em que a alteração de uma proteína resulta em umaproteína com funções similares. Tabelas de substituições conservativas quefornecem aminoácidos com funcionalidade similar são bem-conhecidas natécnica. Exemplos de propriedades de cadeias laterais de aminoácido sãoaminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Υ, V), aminoácidos hidrofílicos(R, D, N, C, E, Q, G, Η, K, S, T), e cadeias laterais que têm os seguintesgrupos funcionais ou características em comum: uma cadeia lateral alifática(G, A, V, L, I, P); uma cadeia lateral que contém um grupo hidroxila (S, T, Y);uma cadeia lateral que contém um átomo de enxofre (C, M); uma cadeia la-teral que contém um ácido carboxílico ou amida (D, Ν, E, Q); uma cadeialateral que contém uma base (R, K, H); e uma cadeia lateral que contém umaromático (H, F, Y, W). Além disso, os seguintes oito grupos contêm cada,aminoácidos que são substituições conservativas uns para os outros:1)Alanina (A), Glicina (G);

2)Ácido Aspártico (D), Ácido glutâmico (E);

3)Asparagina (N), Giutamina (Q);

4)Arginina (R)1 Lisina (K);

5)lsoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M)1 Valina (V);

6)Fenilalanina (F)1 Tirosina (Y), Triptofano (W);

7)Serina (S)1 Treonina (T); e

8)Cisteína (C), Metionina (M) (vide, por exemplo, Creighton, Pro-teins (1984)).

Em um aspecto, as substituições são conservativas em natureza.

Entretanto, a presente invenção não é restrita a elas e também abrangesubstituições que não são conservativas contanto que o polipeptídeo retenhaa função efetora necessária do anticorpo.

Preferivelmente, a região Fc do polipeptídeo parental é uma regi-ão Fc humana, por exemplo, uma região Fc de seqüência nativa de IgGIhumana (alotipos A e não-A) ou de lgG3 humana. Em uma modalidade, avariante com ADCC melhorada media ADCC substancialmente mais eficaz-mente do que um anticorpo com uma região Fc de IgGI e lgG3 de seqüên-cia nativa e a região de ligação de antígeno da variante. Preferivelmente, avariante inclui, ou consiste essencialmente em substituições de dois ou trêsresíduos nas posições 298, 333 e 334 da região Fe. A numeração de resí-duos em uma cadeia pesada de imunoglobulina é aquela do índex EU con-forme Kabat et ai, (supra), incorporado expressamente aqui por referência.Mais particularmente, resíduos nas posições 298, 333 e 334 são substituídos(por exemplo, por resíduos de alanina). Além disso, a fim de gerar uma vari-ante de região Fc que tem atividade de ADCC melhorada, geralmente irá semanipular uma variante de região Fc com afinidade de ligação melhoradapor FcyRIII, que acredita-se que seja um FcR importante para mediar ADCC.Por exemplo, pode-se introduzir uma modificação de aminoácido (por exem-pio, uma inserção, deleção, ou uma substituição) na região Fc parental emuma ou mais das posições de aminoácido 256, 290, 298, 312, 326, 330, 333,334, 360, 378 ou 430 para gerar tal variante. A variante com afinidade deligação melhorada por FcyRIII pode ainda ter afinidade de ligação reduzidapor FcyRII1 especialmente afinidade reduzida para inibir o receptor FcYRIIb.

Para reter a função efetora indispensável do anticorpo, é preferí-vel modificar (adicionar, deletar, inserir ou substituir) apenas um pequenonúmero ou uma pequena porcentagem de aminoácidos. Apesar disso, váriasinserções, deleções e/ou substituições de aminoácido variantes (por exem-plo, de 1 a 50 aminoácidos, preferivelmente 1 a 25 aminoácidos, mais prefe-rivelmente de 1 a 10 aminoácidos) são contempladas e estão dentro do es-copo da presente invenção. Alternativamente, a porcentagem de aminoáci-dos modificados é de preferivelmente 20% ou menos, mais preferivelmente15% ou menos, mais preferivelmente 10%, ainda mais preferivelmente 1 a5%. Substituições de aminoácido conservativas serão geralmente preferidas,apesar da presente invenção não ser limitada a elas. Além disso, alteraçõespodem estar na forma de aminoácidos alterados, tais como peptídeo-miméticos, ou D-aminoácidos.

Alternativamente, na presente invenção a atividade de ADCC po-de ser aumentada por modificar as propriedades bioquímicas diferentes daseqüência de aminoácido, tal como cadeia glico adicionada à região Fe. Porexemplo, foi relatado que a ausência de resíduo de fucose de IgG pode au-mentar a atividade de ADCC (Shinkawa et ai, (2003) J. Biol. Chem.: 278(5):3466-73.). Portanto, um anticorpo que não tem o resíduo de fucose da regi-ão Fc é preferido no contexto da presente invenção. Mais especificamente, afim de aumentar a atividade de ADCC, um resíduo de fucose ligado a umdomínio CH2 da região Fc pode ser removido. Outras células além de célu-las CHO podem ser usadas como célula hospedeira para expressão de umanticorpo que não tem o resíduo de fucose da região Fc. Aqui, um resíduode fucose foi adicionado a um anticorpo por alfa1,6-fucosiltransferase(FUT8), que é altamente expressa em CHO.

Portanto, anticorpos derivados de seres humanos que pertencema essas classes são preferíveis na presente invenção. Anticorpos humanospodem ser adquiridos usando células produtoras de anticorpo coletadas deseres humanos, ou animais quiméricos transplantados com genes de anti-corpos humanos (Ishida I, et al., (2002) Cloning and Stem Cells., 4: 91-102.)·Além disso, regiões Fc podem se ligar a regiões variáveis arbitrá-rias. Especificamente, anticorpos quiméricos em que as regiões variáveis dèdiferentes espécies de animais são ligadas a regiões constantes humanassão conhecidos na técnica. Alternativamente, um anticorpo quimérico huma-no-humano também pode ser adquirido por ligar regiões variáveis derivadasde humano a regiões constantes arbitrárias. Além disso, tecnologia de enxer-to de CDR, onde regiões de determinação de complementaridade (CDRs),que correspondem a regiões variáveis de anticorpo humanas, são substituí-das por CDRs de anticorpos heterólogos, também é conhecida ("Immuno-/ globulin genes", Academic Press (London), pp260-274, 1989; Roguska MA,et ai, (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 91: 969-73.). Por substituir CDRs,a especificidade de ligação do anticorpo é trocada. Isto é, EphA4 humanaserá reconhecida por anticorpos humanizados nos quais a CDR de anticor-pos de ligação a EphA4 tenham sido transferidos. Os anticorpos transferidostambém podem ser chamados anticorpos humanizados. Anticorpos assimobtidos e equipados com uma região Fc essencial para a função efetora po-dem ser usados como anticorpos da presente invenção, independente daorigem de suas regiões variáveis. Por exemplo, anticorpos que incluem Fcde IgG são preferíveis na presente invenção, mesmo se suas regiões variá-veis incluírem seqüências derivadas de uma imunoglobulina de outra classeou outra espécie.

Domínios VH e VL de anticorpos da presente invenção incluemcada, três CDRs designadas como CDR1, CDR2, e CDR3, separadas porregiões de estrutura. Seqüências de aminoácido das CDRs não são particu-larmente limitadas contanto que o anticorpo possa se ligar especificamente aEphA4. Exemplos de seqüências de aminoácido de CDR preferidas incluem,mas não estão limitadas a:

CDR1 de VH humana: ELSMH (SEQ ID NQ: 10),

CDR2 de VH humana: GFDPEDGETIYAQKFQG (SEQ ID Ne:11).

CDR3 de VH humana: AQPFHWGDDAFDI (SEQ ID N*: 12),CDR1 de VL humana: SGSSSNIGSNTVN (SEQ ID N*: 15),

CDR2 de VL humana: SNNQRPS (SEQ ID N = : 16),

CDR3 de VL humana: AAWDDSLNGPV (SEQ ID N°: 17); and

CDR1 de VH humana: SNSAAWN (SEQ ID Ns: 20),

CDR2 de VH humana: RTYYRSKWYNDYAVSVKS (SEQ ID N^:21),

CDR3 de VH humana: DSLRSFDY (SEQ ID N = : 22),

CDR1 de VL humana: SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID N*: 24),

CDR2 de VL humana: DNNKRPS (SEQ ID N = : 25),

CDR3 de VL humana: GTWDSSLSAVV (SEQ ID N«: 26).

Em uma modalidade mais preferida, VH corresponde à seqüên-cia de aminoácido de SEQ ID N5: 27 ou 29, e VL corresponde à seqüênciade aminoácido de SEQ ID N9: 28 ou 30.

Como observado acima, anticorpos da presente invenção podemser anticorpos monoclonais ou anticorpos policlonais. Mesmo quando admi-nistrado a seres humanos, anticorpos policlonais podem ser derivados usan-do os animais mencionados acima transferidos com um gene de anticorpohumano. Alternativamente, imunoglobulinas que foram construídas usandotécnicas de manipulação genética, tais como anticorpos humanizados, anti-corpos quiméricos humano-não-humano e anticorpos quiméricos humano-humano, podem ser usadas. Além disso, métodos para obter anticorpos mo-noclonais humanos por clonar células produtoras de anticorpo também sãoconhecidos.

EphA4, ou um fragmento incluindo seu peptídeo parcial, pode serusado como imunógeno para obter os anticorpos da presente invenção.A EphA4 da presente invenção pode ser derivada de qualquer espécie, pre-ferivelmente de um mamífero, por exemplo, um ser humano, camundongo,ou rato, mais preferivelmente um ser humano. A seqüência de nucleotídeo eseqüência de aminoácido de EphA4 humana são conhecidas na técnica.Para essa finalidade, a seqüência de nucleotídeo de cDNA de EphA4 (No.de Acesso GenBank NM_004438) é descrita em SEQ ID N9: 1 e as seqüên-cias de aminoácido codificadas por esta seqüência de nucleotídeo está des-crita em SEQ ID N9: 2 (No. de Acesso GenBank NP_004429). Um versadona técnica pode isolar rotineiramente genes que contêm a seqüência de nu-cleotídeo fornecida, por preparar um fragmento da seqüência necessária, eobter uma proteína correspondente à seqüência de aminoácido-alvo.

Por exemplo, o gene que codifica a proteína EphA4 ou seu frag-mento pode ser inserido em um vetor de expressão conhecido, e usado paratransformar células hospedeiras. A proteína desejada, ou seu fragmento po-de ser coletado de dentro ou de fora das células hospedeiras usando méto-dos arbitrários e comuns, e também pode ser usada como um antígeno. A-lém disso, proteínas, seus Iisados e proteínas sintetizadas quimicamentepodem ser usadas como antígenos. Além disso, células que expressam aproteína EphA4 ou um fragmento desta podem ser usadas como os imunó-genos.

Quando se usa um fragmento de peptídeo como o imunógeno deEphA4, é particularmente preferível selecionar uma seqüência de aminoáci-do que inclui uma região prevista para ser um domínio extracelular. Acredita-se que um peptídeo de sinal esteja presente na terminação N de EphA4, seestendendo das posições 1 a 19. Dessa forma, por exemplo, uma regiãodiferente do peptídeo de sinal N-terminal (isto é, os 19 resíduos de aminoá-cido iniciais) é preferida como o imunógeno para obter os anticorpos da pre-sente invenção. Isso quer dizer que anticorpos que se ligam a domínios ex-tracelulares de EphA4 são preferidos como anticorpos da presente invenção.

Portanto, anticorpos preferidos na presente invenção são anti-corpos equipados com um Fc essencial para função efetora, e uma regiãovariável que pode ser ligar a um domínio extracelular de EphA4. Quando setem por objetivo administração a seres humanos, é preferível estar equipadocom um Fc de IgG.

Qualquer mamífero pode ser imunizado com tal antígeno. Entre-tanto, é preferível considerar compatibilidade com células parentais usadasna fusão celular. Geralmente, roedores, Iagomorfos ou primatas são preferidos.

Roedores incluem, por exemplo, camundongo, ratos, e hamsters.Lagomorfos incluem, por exemplo, coelhos. Primatas incluem, por exemplo,macacos catarrinos (velho mundo) tais como Macaca fascicularis, Macacamulatta, babuínossagrados, e chimpanzés.

Métodos para imunizar animais com antígenos são bem-conhecidos no campo. Injeções intraperitoneais e subcutâneas de antígenosão os métodos comuns para imunizar mamíferos. Especificamente, os antí-genos podem ser diluídos e suspensos em uma quantidade apropriada desolução salina tamponada com fosfato (PBS), solução salina fisiológica eetc. Conforme desejado, suspensões de antígeno podem ser misturadascom uma quantidade apropriada de um adjuvante usual tal como adjuvantecompleto de Freund, e administradas a mamíferos após emulsificação. Sub-seqüentemente, é preferível que os antígenos misturados com uma quanti-dade apropriada de adjuvante incompleto de Freund sejam administradosem múltiplas doses a cada quatro a 21 dias. Um veículo apropriado tambémpode ser usado para examinar o soro quanto a um aumento no nível de anti-corpo desejado.

Anticorpos policlonais contra a proteína EphA4 podem ser prepa-rados a partir de mamíferos imunizados cujo soro foi investigado em relaçãoa um aumento nos anticorpos desejados. Isso pode ser obtido por coletarsangue desses animais, ou pelo uso de um método arbitrário usual para iso-lar soro de seu sangue. No contexto da presente invenção anticorpos poli-clonais incluem soro que contém anticorpos policlonais, e frações que con-têm anticorpos policlonais isolados do soro. IgG e IgM podem ser prepara-das a partir de frações que reconhecem a proteína EphA4 pelo uso, por e-xemplo, de uma coluna de afinidade acoplada a proteína EphA4, e entãopurificação adicional dessa fração usando colunas de proteína A ou proteínaG. Na presente invenção, anti-soro pode ser usado como anticorpo policlo-nal. Alternativamente, IgG, IgM ou tais podem ser usados.

Para preparar anticorpos monoclonais, imunócitos podem ser co-letados de mamíferos imunizados com antígenos, investigados quanto a umaumento do nível do anticorpo desejado no soro (conforme acima), e aplica-dos na fusão celular. Imunócitos para uso na fusão celular preferivelmentevêm do baço. Outras células de origem preferidas para fusão com os imunó-genos acima incluem, mas não são limitadas a, células de mieloma de ma-mífero, e mais preferivelmente células de mieloma que adquiriram proprie-dades para a seleção de células de fusão por agentes farmacêuticos.

Os imunócitos e células de mieloma acima podem ser fundidosusando métodos conhecidos, por exemplo, os métodos de (Galfre, G. & Mils-tein, C., (1981) Methods. Enzymol.: 73, 3-46.).

Hibridomas produzidos por fusão celular podem ser selecionadospor cultivar em um meio seletivo usual tal como meio HAT (meio compostode hipoxantina, aminopterina e timidina). A cultura celular em meio HAT ge-/ ralmente é continuada por vários dias até várias semanas, um período sufi-ciente para matar todas as células exceto os hibridomas desejados (célulasnão fundidas). Diluições seriadas usuais podem ser então realizadas, e ascélulas de hibridoma que produzem os anticorpos desejados são rastreadase clonadas.

Animais não humanos podem ser imunizados com antígenos pa-ra preparar hibridoma no método acima. Além disso, linfócitos humanos decélulas infectadas com vírus EB ou semelhantes, podem ser imunizados invitro usando proteínas, células que expressam proteínas, ou suspensõesdas mesmas. Os linfócitos imunizados podem então ser fundidos com célu-las de mieloma derivadas de humano capazes de se dividir ilimitadamente(U266, e etc), obtendo-se assim hibridomas que produzem os anticorposhumanos desejados que podem se ligar à proteína (Pedido de Patente Ja-ponês Publicado não-examinado Ns (JP-A) Sho 63-17688).

Os hibridomas obtidos podem então ser transplantados em cavi-dades abdominais de camundongos, e ascites são extraídas. Os anticorposmonoclonais obtidos podem ser purificados usando, por exemplo, precipita-ção com sulfato de amônio, colunas de proteína A ou proteína G, cromato-grafia de troca de íon DEAE, ou colunas de afinidade acopladas às proteínasda presente invenção. Os anticorpos da presente invenção podem ser usa-dos não apenas na purificação e detecção das proteínas da presente inven-ção, mas também como candidatos para agonistas e antagonistas das prote-ínas da presente invenção. Esses anticorpos também podem ser aplicadosàs terapias de anticorpo para doenças relacionadas às proteínas da presen-te invenção. Quando os anticorpos obtidos são administrados ãõ corpo hu-mano (terapia de anticorpo), anticorpos humanos ou humanizados são prefe-ridos devido a sua baixa imunogenicidade.

Por exemplo, animais transgênicos que possuem um repertóriode genes de anticorpos humanos podem ser imunizados com antígenos se-lecionados a partir de proteínas, células que expressam proteínas, ou sus-pensões das mesmas. Células produtoras de anticorpos podem então serrecuperadas dos animais, fundidas com células de mieloma para produzirhibridomas, e anticorpos humanos antiproteína podem ser preparados a par-tir desses hibridomas (vide Publicações Internacionais Nes 92-03918, 94-02602, 94-25585, 96-33735, e 96-34096).

Alternativamente, imunócitos tais como linfócitos imunizados queproduzem anticorpos, podem ser imortalizados usando genes de câncer, eusados para preparar anticorpos monoclonais.

Anticorpos monoclonais obtidos desta forma podem ser prepara-dos usando métodos de manipulação genética (por exemplo, vide, Borreba-eck, C.A.K. & Larrick, J.W., (1990) Therapeutic Monoclonal Antibodies,MacMiIIan Publishers, UK). Por exemplo, anticorpos recombinantes podemser preparados por clonar DNAs que codificam anticorpos de imunócitos taiscomo hibridomas ou linfócitos imunizados que produzem anticorpos; entãoinserir esses DNAs em vetores apropriados; e transformá-los em célulashospedeiras. Anticorpos recombinantes preparados conforme descrito aci-ma, também são contemplados na presente invenção.

Os anticorpos podem ser modificados por ligação com uma vari-edade de moléculas, por exemplo, polietileno glicóis (PEGs). Anticorpos mo-dificados dessa forma também podem ser usados na presente invenção. An-ticorpos modificados podem ser obtidos por modificação química dos anti-corpos. Esses tipos de métodos de modificação são convencionais para osversados na técnica. Os anticorpos também podem ser modificados por ou-tras proteínas. Anticorpos modificados por moléculas de proteína podem serproduzidos usando manipulação genética. Isto é, proteínas-alvo podem serexpressas por fundir genes de anticorpos com genes que codificam modifi-cação de proteínas. Por exemplo, função efetora de anticorpo pode ser au-mentada por ligação com citocinas ou quimiocinas. De fato, o aumento dafunção efetora de anticorpo para proteínas fundidas com IL-2, GM-CSF1 esemelhantes, já foi confirmado (Penichet ML, et ai, (2001) Human Antibodi-es, 10: 43-9.). IL-2, IL-12, GM-CSF, TNF, substância quimiotática de eosinófi-Io (RANTES) e etc. podem ser incluídos nas citocinas e quimiocinas queaumentam a função efetora.

Alternativamente, anticorpos da presente invenção podem serobtidos como anticorpos quiméricos que contêm uma região variável deriva-da de um anticorpo não-humano e uma região constante derivada de umanticorpo humano, ou como anticorpos humanizados que contêm uma regi-ão de determinação de complementaridade (CDR) derivada de um anticorponão-humano, uma região de estrutura (FR) derivada de um anticorpo huma-no, e uma região constante. Tais anticorpos podem ser produzidos usandométodos conhecidos.

As técnicas usuais de biologia molécula podem ser usadas parapreparar seqüências de DNA que codificam os produtos quiméricos e deCDR enxertada. Genes que codificam a CDR do anticorpo de interesse po-dem ser preparados, por exemplo, pelo uso da reação em cadeia da polime-rase (PCR) para sintetizar a região variável de RNA de células produtoras deanticorpo (vide, por exemplo, Larrick et al., "Methods: a Companion to Me-thods in Enzymology", vol. 2: página 106 (1991); Courtenay-Luck, "GeneticManipulation of Monoclonal Antibodies" in Monoclonal Antibodies: Producti-on, Engineering and Clinicai Application; Ritter et al. (eds.), página 166(Cambridge University Press, 1995), e Ward et al., "Genetic Manipulationand Expression of Antibodies" in Monoclonal Antibodies: Principies and Ap-plications; Birch et al. (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc., 1995)). Seqüênciasde DNA que codificam os produtos quiméricos e de CDR enxertada podemser sintetizados completamente ou em parte usando técnicas de síntese deoligonucleotídeo. Técnicas de mutagênese sítio-direcionada e reação emcadeia da polimerase podem ser usadas conforme apropriado. Por exemplo,síntese direcionada de oligonucleotídeo como descrito por Jones et al.,(1986) Nature.; 321:522-5 pode ser usada. Ainda mutagênese direcionadade oligonucleotídeo de uma região variável pré-existente como por exemplo,descrito por Verhoeyen et ai, (1988) Science.; 239:1534-6 ou Riechmann etal., (supra) pode ser usada. Ainda, preenchimento enzimático de oligonu-cleotídeos descontínuos usando DNA polimerase T4 como, por exemplo,descrito por Queen et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA.; 86:10029-33; Pu-blicação PCTWO 90/07861 pode ser usada.

Qualquer sistema de vetor/célula hospedeira adequado pode serusado para expressão das seqüências de DNA que codificam as cadeiaspesada e leve com CDR enxertada. Sistemas bacterianos, por exemplo, E.coli e outros sistemas microbianos podem ser usados, em particular paraexpressão de fragmentos de anticorpo tais como fragmentos Fab e (Fab')2 eespecialmente fragmentos Fv e fragmentos de anticorpo de cadeia única.Sistemas de expressão de célula hospedeira eucarióticos, por exemplo, demamíferos, podem ser usados, em particular, para a produção de produtosde anticorpo com CDR enxertada maiores, incluindo moléculas de anticorpocompletas. Células hospedeiras de mamífero adequadas incluem célulasCHO e linhagens celulares de mieloma e hibridoma.

Anticorpos obtidos como descrito acima podem ser purificadosaté estarem uniformes. Por exemplo, anticorpos podem ser purificados ouseparados de acordo com métodos gerais usados para purificar e separarproteínas. Por exemplo, anticorpos podem ser separados e isolados usandocombinações apropriadamente selecionadas de cromatografia de coluna,incluindo, mas não limitadas a cromatografia de afinidade, filtração, ultrafil-tração, precipitação de sal, diálise, eletroforese em gel de SDS poliacrilami-da, focalização isoelétrica, e etc. (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow &David, Lane (edit.), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

Colunas de proteína A e proteína G podem ser usadas como co-lunas de afinidade. Colunas de proteína A exemplares em uso incluem HyperD, POROS, e Sepharose FF (Pharmacia).Cromatografia exemplar (excluindo cromatografia de afinidade)inclui cromatografia de troca de íon, cromatografia hidrofóbica, filtração emgel, cromatografia de fase reversa, cromatografia de adsorção ("Strategiesfor Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual"Daniel R. Marshak et al., (1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press.)· Acromatografia pode ser executada de acordo com o procedimento de croma-tografias em fase líquida tais como HPLC ou FPLC.

Por exemplo, a atividade de ligação de antígeno dos anticorposda presente invenção pode ser medida pelo uso de medidas de absorbância,ensaios imunoabsorventes ligados a enzima (ELISA), imunoensaios enzimá-ticos (EIA), radioimunoensaios (RIA) e/ou métodos imunofluorescentes. NoELISA, um anticorpo da presente invenção é tipicamente imobilizado sobreuma placa, uma proteína da presente invenção é adicionada à placa, e entãouma amostra contendo o anticorpo desejado tal como o sobrenadante decélulas que produzem o anticorpo ou anticorpo purificado é adicionada. Umanticorpo secundário que reconhece o anticorpo primário e que foi marcadocom uma enzima tal como fosfatase alcalina é então adicionado, e a placa éincubada. Após lavagem, um substrato da enzima tal como fosfato de p-nitrofenila é adicionado à placa, a absorbância é medida, e a atividade deligação de antígeno das amostras é avaliada. Fragmentos de proteína (frag-mentos C-terminais ou N-terminais e semelhantes) podem ser usados damesma forma que proteínas. A atividade de ligação dos anticorpos da pre-sente invenção pode ser avaliada usando BIAcore (Pharmacia).

Além disso, por seguir os métodos descritos nos Exemplos, afunção efetora de anticorpo pode ser avaliada. Por exemplo, células-alvoque expressam EphA4 podem ser incubadas com células efetoras na pre-sença de um anticorpo cuja função efetora será avaliada. Se for detectada adestruição da célula-alvo, o anticorpo pode ser confirmado como possuindofunção efetora que induz ADCC. O nível de destruição da célula-alvo obser-vada, na ausência de anticorpos ou de células efetoras, pode ser comparadocom um controle com o nível de função efetora. Células que expressam cla-ramente EphA4 podem ser usadas como as células-alvo. Especificamente,várias linhagens celulares que foram confirmadas como expressando EphA4nos Exemplos podem ser usadas. Essas linhagens celulares podem ser ob-tidas de bancos de células. Além disso, anticorpos monoclonais que possu-em função efetora mais potente podem ser selecionados.

Na presente invenção, anticorpos anti-EphA4 podem ser admi-nistrados a seres humanos ou outros animais como agentes farmacêuticos.Na presente invenção, animais diferentes de humanos aos quais os anticor-pos podem ser administrados incluem, mas não são limitados a, camundon-gos, ratos, porquinhos da índia, coelhos, galinhas, cães, ovelhas, porcos,vacas, macacos, babuínos, e chimpanzés. Os anticorpos podem ser admi-nistrados diretamente aos indivíduos e, além disso, podem ser formuladosem formas de dosagem usando métodos de formulação farmacêutica co-nhecidos. Por exemplo, dependendo das necessidades, eles podem ser ad-ministrados parenteralmente em uma forma injetável, tal como uma soluçãoou suspensão estéril com água ou outro fluido arbitrário farmaceuticamenteaceitável. Por exemplo, esses tipos de compostos podem ser misturadoscom veículos ou solventes aceitáveis, tal como água estéril, solução salinafisiológica, óleos vegetais, emulsificantes, agentes de suspensão, tensoati-vos, estabilizantes, agentes flavorizantes, excipientes, solventes, conservan-tes, agentes de ligação, e similares, em uma dosagem unitária geralmenteaceita essencial para uso como um agente farmacêutico.

Outras soluções isotônicas incluindo solução salina, glicose, eadjuvantes (tal como D-sorbitol, D-manose, D-manitol, e cloreto de sódio)podem ser usadas como a solução aquosa injetável. Elas também podemser usadas com solubilizantes apropriados tais como álcoois, especificamen-te etanóis e poliálcoois (por exemplo, propileno glicóis, e polietileno glicol), etensoativos não iônicos (por exemplo, Polissorbato 80® ou HCO-50).

Óleos de gergelim ou óleos de soja podem ser usados como so-lução oleaginosa, e álcoois, e benzoato de benzila ou álcoois benzílicos po-dem ser incluídos como solubilizante. Soluções tampão (tampões de fosfato,tampões de acetato de sódio, etc.) e analgésicos (cloridrato de procaína esemelhantes), estabilizantes (álcool benzílico, fenóis, e etc.) e antioxidantespodem ser incluídos na formulação. As injeções preparadas podem ser em-baladas em ampolas apropriadas.

Na presente invenção, os anticorpos anti-EphA4 podem ser ad-ministrados a pacientes, por exemplo, intrarterial, intravenosa, percutânea,intranasal, transbrônquica, local ou intramuscularmente. Administração intra-vascular (intravenosa) por "drip" ou injeção é um exemplo de um métodogeral para administração sistemática de anticorpos a pacientes com câncerpancreático. Métodos de concentrar localmente agentes de anticorpo para ofoco primário ou foco metastático no pulmão incluem injeção local usandoum broncoscópio (broncoscopia) e injeção local guiada por CT ou com tora-z coscopia. Métodos de concentrar localmente agentes de anticorpo para ofoco primário ou foco metastático no fígado incluem injeção local usandouma injeção portal hepática ou infusão arterial. Além disso, métodos nosquais um cateter intra-arterial é inserido próximo de uma veia que fornecenutrientes para células de câncer para injetar localmente agentes anticâncer,tal como agentes de anticorpo, são eficazes como terapias de controle localpara focos metastáticos assim como focos primários de câncer pancreático.

Embora métodos de dosagem e administração variem de acordocom o peso corporal e idade do paciente, e método de administração, essesparâmetros podem ser determinados rotineiramente por um versado na téc-nica. Além disso, DNA que codifica um anticorpo pode ser inserido em umvetor para terapia gênica, e o vetor pode ser administrado para terapia. Mé-todos de administração e dosagem variam de acordo com o peso corporal,idade, e condição do paciente; entretanto, um versado na técnica pode sele-cioná-los apropriadamente.

Anticorpos anti-EphA4 podem ser administrados a corpos vivosem uma quantidade tal que a citotoxicidade baseada em função efetora con-tra células que expressam EphA4 pode ser confirmada. Por exemplo, embo-ra haja certa diferença dependendo dos sintomas, uma dosagem típica deanticorpos anti-EphA4 varia de 0,1 mg a 250 mg/kg por dia. Geralmente, adosagem para um adulto (de 60 Kg de peso), é 5 mg a 17,5 g/dia, preferi-velmente 5 mg a 10 g/dia, e mais preferivelmente 100 mg a 3 g/dia. O es-quema de dosagem é de uma a dez vezes ao longo de um intervalo de doisa dez dias e, por exemplo, o progresso é observado após três a seis admi-nistrações.

Embora os anticorpos da presente invenção retenham funçãoefetora, em algumas modalidades, agentes citotóxicos podem ser ligadosaos anticorpos usando técnicas bem-conhecidas. Agentes citotóxicos sãonumerosos e variados e incluem, mas não são limitados a, fármacos citotó-xicos, ou toxinas ou fragmentos ativos de tais toxinas. Toxinas adequadas eseus fragmentos correspondentes incluem, mas não são limitados a, cadeiaA de difteria, cadeia A de exotoxina, cadeia A de ricina, cadeia A de abrina,curcina, crotina, fenomicina, enomicina, auristatina, e semelhantes. Agentescitotóxicos também incluem radioquímicos feitos por conjugar radioisótoposaos anticorpos da invenção ou ligação de um radionuclídeo a um agentequelante que foi ligado covalentemente ao anticorpo. Métodos para preparartais conjugados são bem-conhecidos na técnica.

Alternativamente, seqüências de ácido nucléico que codificamanticorpos ou derivados funcionais destes, podem ser administrados paratratar ou prevenir doenças associadas com células que expressam EphA4,tal como câncer pancreático, por meio de terapia gênica. Terapia gênica refe-re-se a terapia realizada pela administração a um indivíduo de um ácido nu-cléico expresso ou expressável. Nessa modalidade da invenção, os ácidosnucléicos produzem seu anticorpo ou fragmento de anticorpo codificado que,por sua vez, media o efeito terapêutico ou profilático.

Qualquer um dos métodos para terapia gênica disponíveis natécnica pode ser usado de acordo com a presente invenção. Métodos exem-plares são descritos abaixo.

Para revisões gerais dos métodos de terapia gênica, vide,Goldspiel et ai, (1993) Clin. Pharm.; 12:488-505; Wu & Wu1 (1991) Biothe-rapy.; 3:87-95; Tolstoshev, (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol.; 32:573-96;Mulligan, (1993) Science.; 260:926-32; Morgan & Anderson, (1993) Ann RevBiochem.; 62:191-217; Clare Robinson Trends Biotechnol.; 11(5):155-215.Métodos comumente conhecidos na técnica de tecnologia de DNA recombi-nante que podem ser usados são descritos em Ausubel et ai. (eds.), CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Ge-ne Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).

Em um aspecto preferido, uma composição da invenção inclui á-cidos nucléicos que codificam um anticorpo, os ditos ácidos nucléicos sendoparte de um vetor de expressão que expressa o anticorpo ou fragmentos ouproteínas quiméricas ou cadeias pesadas ou leves deste, em um hospedeiroadequado. Em particular, tais ácidos nucléicos têm promotores, preferivel-mente promotores heterólogos, operativamente ligados à região codificantedo anticorpo, o dito promotor sendo induzível ou constitutivo, e opcionalmen-te tecido-específico. Em outra modalidade particular, são usadas moléculasde ácido nucléico nas quais as seqüências codificantes de anticorpo e qual-quer outra seqüência desejada são flanqueadas por regiões que promovema recombinação homóloga em um local desejado no genoma, fornecendoassim expressão intracromossômica dos ácidos nucléicos que codificam oanticorpo (Koller & Smithies, (1989) Proc Natl Acad Sei USA.; 86:8932-5;Zijlstra et ai, (1989) Nature.; 342:435-8). Em modalidades específicas, a mo-lécula de anticorpo expressa é um anticorpo de cadeia única; alternativa-mente, as seqüências de ácido nucléico podem incluir seqüências que codi-ficam as cadeias pesada e leve, ou fragmentos destas, do anticorpo.

A liberação dos ácidos nucléicos em um indivíduo pode ser dire-ta, em cujo caso o indivíduo é exposto diretamente ao ácido nucléico ou aosvetores que carregam os ácidos nucléicos, ou indireta, em cujo caso as célu-Ias são primeiro transformadas com os ácidos nucléicos in vitro, e entãotransplantadas no indivíduo. Essas duas abordagens são conhecidas, res-pectivamente, como terapia gênica in vivo, ou ex vivo.

Em uma modalidade, a(s) seqüência(s) de ácido nucléico po-de(m) ser administrada(s) diretamente in vivo, onde ele é expresso para pro-duzir o produto codificado. Isso pode ser obtido pode qualquer um de váriosmétodos conhecidos na técnica, por exemplo, por construí-los como parte deum vetor de expressão de ácido nucléico apropriado e administrá-lo paraque ele se torne intracelular, por exemplo, por infecção usando vetores re-trovirais defeituosos ou atenuados ou outros vetores virais (vide, Pat. U.S. Nq4.980.286), ou por injeção direta de DNA nu, ou pelo uso de bombardeio demicropartículas (por exemplo, uma arma de genes; Biolistic, Dupont), ou re-vestimento com lipídios ou receptores de superfície celular ou agentes detransfecção, encapsulamento em lipossomas, micropartículas, ou microcáp-sulas, ou por administrá-los em ligação com um peptídeo que é conhecidopor entrar no núcleo, por administrá-lo em ligação com um Iigante sujeito aendocitose mediada por receptor (vide, por exemplo, Wu & Wu, (1987) J BiolChem.; 262:4429-32) (o que pode ser usado para atingir tipos de células queexpressam especificamente os receptores), etc. Em outra modalidade, po-dem ser formados complexos ácido nucléico-ligante, nos quais o Iigante in-clui um peptídeo viral fusogênico para romper os endossomos, permitindoque o ácido nucléico evite degradação lisossômica. Em outra modalidadeainda, o ácido nucléico pode ser direcionado in vivo para absorção e expres-são célula-específica por atingir um receptor específico (vide, por exemplo,Publicações PCT WO 92/06180, WO 92/22635, W092/20316, W093/14188ou WO 93/20221). Alternativamente, o ácido nucléico pode ser introduzidointracelularmente e incorporado dentro do DNA de uma célula hospedeirapara expressão, por recombinação homóloga (Koller & Smithies, (1989) ProcNatl Acad Sci USA.; 86:8932-5; Zijlstra et ai, (1989) Nature.; 342:435-8).

Em uma modalidade, vetores virais que contêm seqüências deácido nucléico que codificam um anticorpo da invenção ou fragmentos des-tes, são usados. Por exemplo, um vetor retroviral pode ser usado (vide, Mil-ler et ai, (1993) Methods Enzymol.; 217:581-99). Esses vetores retroviraiscontêm os componentes necessários para o empacotamento correto do ge-noma viral e integração no DNA da célula hospedeira. As seqüências de áci-do nucléico que codificam o anticorpo a ser usado em terapia gênica sãoclonados em um ou mais vetores, o que facilita a liberação do gene em umindivíduo. Mais detalhes sobre vetores retrovirais podem ser encontrados emBoesen et a!., (1994) Biotherapy.; 6:291-302, que descreve o uso de um ve-tor retroviral para liberar o gene mdr 1 a células tronco hematopoiéticas a fimde torná-las mais resistentes à quimioterapia. Outras referências que ilus-tram o uso de vetores retrovirais em terapia gênica são: Clowes etal., (1994)J Clin Invest.; 93:644-51; Kiem etal., (1994) Blood.; 83:1467-73; Saimons &Gunzberg1 (1993) Hum Gene Ther.; 4:129-41; Grossman & Wilson, (1993)Curr Opin Genet Dev.; 3:110-4.

Outro exemplo de um vetor viral que pode ser usado em terapiagênica é o adenovírus. Adenovírus são veículos especialmente atrativos pa-ra liberar genes ao epitélio respiratório. Adenovírus infectam naturalmente oepitélio respiratório onde causam uma doença leve. Outros alvos para siste-mas de liberação a base de adenovírus são fígado, o sistema nervoso cen-trai, células endoteliais, e músculo. Adenovírus têm a vantagem de seremcapazes de infectar células que não estão em divisão. Kozarsky & Wilson,(1993) Curr Opin Genet Dev.; 3:499-503 apresentam uma revisão de terapiagênica a base de adenovírus. Bout et ai, (1994) Hum Gene Ther.; 5:3-10demonstra o uso de vetores de adenovírus para transferir genes para o epi-télio respiratório de macacos rhesus. Outros exemplos do uso de adenovírusem terapia gênica podem ser encontrados em Rosenfeld et ai, (1991) Sci-ence.; 252:431-4; Rosenfeld etal., (1992) Cell.; 68:143-55; Mastrangeli etal.,(1993) J Clin Invest.; 91:225-34; Publicação PCT W094/12649; Wang etal.,(1995) Gene Ther.; 2:775-83. Em uma modalidade preferida, vetores de a-denovírus são usados.

Vírus adeno-associado (AAV) também foi proposto para uso emterapia gênica (Walsh et ai, (1993) Proc Soc Exp Biol Med.; 204:289-300;Pat. U.S. N9 5.436.146).

Outra abordagem para terapia gênica envolve transferir um genepara células em cultura de tecido por métodos como eletroporação, Iipofec-ção, transfecção mediada por fosfato de cálcio, ou infecção viral. Geralmen-te, o método de transferência inclui a transferência de um marcador selecio-nável para as células. As células são então colocadas sob seleção para iso-lar aquelas células que absorveram a estão expressando o gene transferido.Estas células podem então ser liberadas para um indivíduo.

Nessa modalidade, o ácido nucléico é introduzido em uma célulaantes da administração in vivo da célula recombinante resultante. Tal intro-dução pode ser obtida por qualquer método conhecido na técnica, incluindo,mas não se limitando a transfecção, eletroporação, microinjeção, infecçãocom um vetor viral ou de bacteriófago, contendo as seqüências de ácido nu-cléico, fusão celular, transferência de gene mediada por cromossomo, trans-ferência de gene mediada por microcélula, fusão de esferoplasto, etc. Váriosmétodos são conhecidas na técnica para a introdução de genes estranhosem células (vide, por exemplo, Loeffler & Behr1 (1993) Methods Enzymol.;217:599-618; Cotton et ai, 1993, Methods Enzymol.; 217:618-44; Cline MJ.Pharmacol Ther. 1985; 29(1):69-92.) e podem ser usados de acordo com apresente invenção, contanto que as funções do desenvolvimento e fisiológi-cas das células receptoras não sejam prejudicadas. A técnica deveria gerar atransferência estável do ácido nucléico para a célula, para que o ácido nu-cléico seja expresso pela célula e preferivelmente herdado e capaz de serexpresso pela sua progênie celular.

As células recombinantes resultantes podem ser liberadas a umindivíduo por vários métodos conhecidos na técnica. Células vermelhas dosangue (por exemplo, células tronco ou progenitoras hematopoiéticas) sãoadministradas preferivelmente intravenosamente. A quantidade de célulaspretendida para uso depende do efeito desejado, do estado do paciente etc.e pode ser determinada por um versado na técnica.

Células nas quais um ácido nucléico pode ser introduzido parafins de terapia gênica abrangem qualquer tipo celular desejado disponível, eincluem, mas não são limitadas, a células epiteliais, células endoteliais, que-ratinócitos, fibroblastos, células musculares, hepatócitos; células sangüí-neas, tais como linfócitos T, linfócitos B, monócitos, macrófagos, neutrófilos,eosinófilos, magacariócitos, granulócitos; várias células tronco ou progenito-ras, por exemplo, obtidas de medula óssea, sangue de cordão umbilical,sangue periférico, fígado fetal etc. Em uma modalidade preferida, a célulausada para terapia gênica é autóloga ao indivíduo.

Em uma modalidade na qual células recombinantes são usadasem terapia gênica, seqüências de ácido nucléico que codificam um anticorpoou fragmento deste podem ser introduzidas nas células, tal que elas sejamexpressas pelas células ou sua progênie, e as células recombinantes sejamentão administradas in vivo para efeito terapêutico. Em uma modalidade es-pecífica, células tronco ou progenitoras são usadas, qualquer célula troncoou progenitora que pode ser isolada e mantida in vitro pode potencialmenteser usada de acordo com essa modalidade da presente invenção (vide,Publicação PCT WO 94/08598; Stemple & Anderson, (1992) Cell.; 71:973-85; Rheinwald1 (1980) Methods Cell Biol.; 21A:229-54; Pittelkow & Scott,(1986) Mayo Clin Proc.; 61:771-7).

Em uma modalidade preferida, o ácido nucléico a ser introduzidopara fins de terapia gênica inclui um promotor induzível operativamente ligadoà região codificante, tal que a expressão do ácido nucléico seja controlávelpelo controle da presença ou ausência do indutor de transcrição apropriado.

Além disso, a presente invenção fornece composições imunogê-nicas para induzir anticorpos que possuem funções efetoras contra célulasque expressam EphA4, em que as composições contêm como um ingredien-te ativo EphA4 ou um fragmento imunologicamente ativo de EphA4, ou umDNA ou célula que pode expressar a mesma. Alternativamente, a presenteinvenção refere-se aos usos de EphA4 ou um fragmento imunologicamenteativo de EphA4, ou um DNA ou célula que pode expressar a mesma na pro-dução de composições imunogênicas para induzir anticorpos que possuemfunções efetoras contra células que expressam EphA4.

A administração de anticorpos anti- EphA4 danifica células decâncer através da função efetora desses anticorpos. Dessa forma, se anti-corpos de EphA4 podem ser induzidos in vivo, efeitos terapêuticos equiva-lentes à administração de anticorpo podem ser obtidos. Quando se adminis-tra composições imunogênicas compostas de antígenos, anticorpos-alvo po-dem ser induzidos in vivo. As composições imunogênicas da presente inven-ção são assim particularmente úteis na terapia de vacina contra células queexpressam EphA4. Dessa forma, as composições imunogênicas da presenteinvenção são eficazes como, por exemplo, composições de vacina para te-rapias de câncer pancreático.As composições imunogênicas da presente invenção podem in-cluir como ingrediente ativo EphA4, ou um fragmento imunologicamente ati-vo de EphA4. No contexto da presente invenção, um fragmento imunologi-camente ativo de EphA4, refere-se a um fragmento que pode induzir anticor-pos anti- EphA4 que reconhecem EphA4 e possuem função efetora. Abaixo,EphA4 e o fragmento imunologicamente ativo de EphA4 são descritos comoproteínas imunogênicas. Determinar se um dado fragmento induz anticor-pos-alvo pode ser feito por imunizar o animal, e confirmar a atividade dosanticorpos induzidos. A indução de anticorpo e a confirmação de sua ativida-de podem ser feitos, por exemplo, usando métodos descritos nos Exemplos.

As composições imunogênicas da presente invenção podem con-ter veículos farmaceuticamente aceitáveis assim como proteínas imunogêni-cas, os ingredientes ativos. Se necessário, as composições também podemser combinadas com um adjuvante. Bactérias da tuberculose mortas, toxóidediftérico, saponina e etc. podem ser usados como o adjuvante.

Alternativamente, DNAs que codificam as proteínas imunogêni-cas, ou células que retêm estes DNAs em um estado que pode ser expres-so, podem ser usados como as composições imunogênicas. Métodos parausar DNAs que expressam o antígeno-alvo como imunógenos, as assimchamadas vacinas de DNA, são bem-conhecidos. Vacinas de DNA podemser obtidas por inserir um DNA que codifica EphA4 ou seu fragmento em umvetor de expressão apropriado.

Vetores de retrovírus, vetores de adenovírus, vetores de vírusadeno-associados, vetores de vírus Sendai, ou semelhantes são exemplosde vetores adequados. Além disso, DNAs nos quais um DNA que codificauma proteína imunogênica é conectado funcionalmente a jusante de umpromotor podem ser introduzidos diretamente em células como DNA nu, eentão expressos. DNA nu pode ser encapsulado em ribossomos ou vetoresde envelope viral, e introduzidos nas células.

Os polipeptídeos e polinucleotídeos de EphA4 da presente in-venção também podem ser usados para a indução de uma resposta imunein vivo, incluindo a produção de anticorpos e linfócitos T citotóxicos (CTL)específicos para células que expressam EphA4. Em tais métodos, a induçãode CTL por um peptídeo desejado por ser obtida por apresentar o peptídeo auma célula T através de uma célula apresentadora de antígeno (APC) in vivoou ex vivo.

Por exemplo, células sangüíneas, por exemplo, células mononu-cleares de sangue periférico (PBMC) de pacientes podem ser coletadas,transformadas usando um vetor que pode expressar as proteínas imunogê-nicas, e colocadas de volta no paciente. As células sangüíneas transforma-das produzem então as proteínas imunogênicas dentro do corpo do pacientee induzem os anticorpos-alvo. Alternativamente, PBMCs do paciente podemser coletadas, colocadas em contato com o polipeptídeo ex vivo, e após a in-dução de APCs ou CTLs, as células podem ser administradas ao indivíduo.APCs ou CTLs induzidas in vitro podem ser clonadas antes da administração.Por clonar e cultivar células que têm alta atividade de danificar células-alvo, aimunoterapia celular pode ser realizada mais eficazmente. Além disso, APCse CTLs isoladas dessa maneira podem ser usadas para imunoterapia celularnão apenas contra indivíduos a partir dos quais as células são derivadas,mas também contra tipos similares de tumores de outros indivíduos.

Geralmente, quando se usa um polipeptídeo para imunoterapiacelular, sabe-se que a eficácia da indução de CTL pode ser aumentada porcombinar uma pluralidade de polipeptídeos que têm estruturas diferentes ecolocá-las em contato com APCs, particularmente, células dendríticas. Por-tanto, quando se estimula APCs com fragmentos de proteína, é vantajosousar uma mistura de vários tipos de fragmentos.

A indução de imunidade antitumoral por um polipeptídeo podeser confirmada por observar a indução de produção de anticorpo contra tu-mores. Por exemplo, quando anticorpos contra um polipeptídeo são induzi-dos em um animal de laboratório imunizado com o polipeptídeo, e quando ocrescimento das células é suprimido por estes anticorpos, o polipeptídeo ésuposto como tendo a habilidade de induzir imunidade antitumoral.

Quando DNAs que codificam as proteínas imunogênicas, ou cé-lulas transformadas com os mesmos, são usados como composições imu-nogênicas da presente invenção, eles podem ser combinados com proteínasimunogênicas assim como proteínas transportadoras que aumentam suaspropriedades imunogênicas.

Como observado acima, a presente invenção fornece métodospara induzir anticorpos que possuem função efetora contra células que ex-pressam EphA4, onde os métodos incluem a etapa de administrar EphA4,um fragmento imunologicamente ativo de EphA4, ou DNA ou células quepodem expressar a mesma. Os métodos da presente invenção incluem anti-corpos que possuem função efetora que danifica células que expressamEphA4 tais como cânceres pancreáticos. Como um resultado, efeitos tera-pêuticos e etc. podem ser obtidos.

A cada dia, 0,1 mg a 250 mg por quilograma das composiçõesimunogênicas da presente invenção podem ser administrados oral ou paren-teralmente. Administração parenteral inclui injeção subcutânea e injeção in-travenosa. A dose de administração para um único adulto é geralmente de 5mg a 17,5 g/dia, preferivelmente 5 mg a 10 g/dia, e mais preferivelmente 100mg a 3 g/dia.

A presente invenção também fornece métodos para tratar ou pre-venir cânceres em um indivíduo. Em algumas modalidades, o método com-preende a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz deum anticorpo anti-EphA4, ou fragmento imunologicamente ativo deste, emque o anticorpo possui função efetora.

Todas as referências da técnica anterior citadas estão incorpora-das aqui por referência nas suas totalidades.

Breve descrição dos Desenhos

A figura 1 é uma fotografia mostrando o resultado de uma análisede RT-PCR semiquantitativo para o gene EphA4 em linhagens celulares decâncer pancreático.

A figura 2 mostra os resultados de um ensaio de ADCC usandoHerceptina e anticorpo anti-EphA4 humano 65 e 336 contra linhagens celula-res de câncer pancreático que super e subexpressam EphA4, MIAPaca-2 ePK-45P.Melhor Maneira de Executar a Invenção .

A seguir, a presente invenção será descrita em detalhe com rela-ção aos Exemplos. Entretanto, materiais, métodos e semelhantes descritosaqui apenas ilustram aspectos da invenção e de nenhuma forma são preten-didos para limitar o escopo da presente invenção. Materiais, métodos e se-melhantes ou equivalentes àqueles descritos aqui podem ser usados na prá-tica ou teste da presente invenção.

Linhagem celular:

Linhagens celulares de câncer de cólon ou pancreático humanoforam propagadas como uma monocamada em um meio apropriado com10% de soro fetal bovino. As linhagens celulares usadas no experimento sãomostradas na Tabela 1.

Tabela 1

<table>table see original document page 44</column></row><table>

*1 Institute of Development, Aging and Câncer, Tohoku University

*2 Meio Mínimo Essencial de Eagle

*3 Meio de McCoy 5A Modificado

Além disso, as seguintes linhagens celulares foram usadas nosensaios de ADCC usando anticorpos anti-EphA4: Carcinoma pancreático:MIAPaca-2.

Anticorpo Humano:

Rastreamento das bibliotecas de expressão de fago usando célu-las em culturaPara rastrear anticorpos de scFV humanos contra EphA4, a bibli-oteca de fagos AIMS4 que codifica anticorpos de scFV humanos(W001 /62907) foi usada. O método de rastreamento é descrito em P2005-185281 A.

Para o primeiro rastreamento, primeiro, células MIAPaca-2 comalta de expressão de EphA4 foram cultivadas em placas de 15 cm, colhidascom 2 mg/ml de colagenase I (Gibco BRL)/tampão de dissociação celular(Gibco BRL) e lavadas com PBD gelado. Uma solução da biblioteca de fagosde anticorpo humano (2x1013 cfu) foi misturada com 4x107 das células, BSAe NaN3/MEM. A concentração final foi então ajustada para BSA1%-NaN30,1%/MEM em um volume total de 1,6 ml, e a mistura foi agitada gen-tilmente por quatro horas a 4°C. A seguir, metade da solução reativa foi dis-pensada em cada um de dois tubos e centrifugada a 3000 rpm no solventeorgânico (ftalato de dibutila: cicloexano = 9:1) por dois minutos. Após o so-brenadante ter sido removido, as células foram ressuspensas em 0,7 ml de1%BSA/MEM, e centrifugadas em um volume igual de solvente de baixa po-laridade. Esta etapa foi repetida duas vezes. O sobrenadante foi removido, eas células foram então ressuspensas em 0,3 ml de PBS, congeladas comnitrogênio líquido, e derretidas a 37°C.

Esses fagos foram deixados infectar 20 ml de E. coli DH12S (OD0,5) por uma hora, e as células infectadas foram transferidas para 600 ml demeio YTGA 2x (YT 2x, sulfato de ampicilina 200 pg/ml, glicose 1%) e cultiva-das durante a noite a 30°C. 10 ml do mesmo foram adicionados a 200 ml demeio YTA 2x (2x YT, sulfato de ampicilina 200 pg/ml) e cultivados por 1,5 horaa 37°C. Após incubação adicional, 1x1011 de fago auxiliar K07 foram adicio-nados e cultivados por uma hora a 37°C novamente. Após uma hora de incu-bação, como acima, 800 ml YTGAK 2x (YT 2x, sulfato de ampicilina 200pg/ml, glicose 0,05%, canamicina 50 pg/ml) foram adicionados e cultivadosdurante a noite a 30°C. Essa cultura foi centrifugada a 8000 rpm por dez mi-nutos. O sobrenadante foi misturado com 200 ml de PEG líquido (polietileno-glicol 6000 20%, NaCI 2,5 M) e centrifugado a 8000 rpm por 10 minutos paraprecipitar o fago. Esse precipitado foi suspenso em 10 ml de PBS e parte dasuspensão foi usada para examinar o número de E. coli infectadas por fagos.

Para o segundo rastreamento, 0,8 ml de solução reativa (BSA1%- NaN3 0,1%/MEM), células da cultura (2x107) e fagos do primeiro rastre-amento (1x1010) foram usados. O volume total de solução reativa foi metadedaquele usado para o primeiro rastreamento. O terceiro rastreamento teveprocedimento similar ao segundo rastreamento exceto que 2x107 de células293T transfectadas com EPHA4 e 1x109 de fagos do segundo rastreamentoforam usados.

Seqüenciamento de DNA, verificação da expressão, e ELISA de células doclone de anticorpo

E. coli que foi rastreada e diluída como descrito acima foi entãocultivada sobre ágar nutriente com 100 pg/ml de ampicilina. As colônias obti-das foram isoladas e incubadas durante a noite a 30°C com meio YTGA 2x.O DNA foi obtido da cultura por PI-50 (Kurabo)1 e a seqüência de DNA foideterminada pelo método de didesóxi.

Além disso, 0,05 ml da cultura foi cultivado com 1,2 ml de YTAI2x (2x YT, sulfato de ampicilina 200 pg/ml, IPTG 0,5 mM) a 30°C, e o sobre-nadante foi coletado por centrifugação a 15000 rpm por 5 minutos.

A expressão do anticorpo foi detectada como uma proteína defusão cp3. Mais especificamente, o sobrenadante foi reagido com Maxisorp®(NUNC) por duas horas a 37°C e a solução reagida aspirada. A placa comanticorpos foi bloqueada com BSA 5% por duas horas a 37°C, e a soluçãode bloqueio removida. Anticorpo anti-cp3 de coelho (MBL) diluído 1:2000com 0,05% Tween/PBS foi adicionado à placa e reagido em temperaturaambiente por uma hora, seguido por lavagem com PBS. Anticorpo de cabraanti-lgG de coelho marcado com HRP (MBL) diluído 1:2000 com Tween/PBS0,05% foi adicionado à placa e reagido em temperatura ambiente por umahora, seguido por lavagem com PBS. 100 μΙ de solução de OPD foram adi-cionados à placa e reagidos em temperatura ambiente por 15 minutos, e areação foi paralisada pela adição de ácido sulfúrico-amônio 2M. As proteínasde fusão foram detectadas por medir a absorbância a 492 nm por SPEC-TRAmax 340PC (Molecular Devices).A operação do ELISA de células foi como segue. Primeiro, 1x105células foram cultivadas em placas de 96 cavidades durante a noite, o meiofoi trocado por 200 μΙ de leite desnatado 5% /PBS. Após permanecer por trêshoras sobre gelo, os 100 μΙ de sobrenadante e 100 μΙ de leite desnatado 10%foram misturados e permaneceram sobre o gelo durante a noite. Após cincolavagens com PBS gelado, as células foram reagidas com 100 μΙ de anticorpomonoclonal anti-cp3 de camundongo 5 μg/ml, leite desnatado 5%/PBS porduas horas a 4°C. Após cinco lavagens com PBS gelado, a solução consistin-do em 25 μΙ de ENVISION + reagente de polímero marcado com peroxidase e75 μΙ de leite desnatado 15%/PBS foi reagida com as células por duas horas a4°C. Após cinco lavagens com PBS gelado, a reação foi paralisada pela adi-ção de ácido sulfúrico-amônio 2M, e a absorbância da mistura de reação foimedida a 492 nm por SPECTRAmax 340PC (Molecular Devices).

Os anticorpos de scFV reagidos positivamente ao antígeno con-forme confirmado pela citometria de fluxo foram convertidos para forma deIgG completa em IFA.

Esses dois clones tinham as seguintes seqüências de aminoácido.65: SEQ ID N5: 9 (VH) e SEQ ID Ne: 14 (VL)336: SEQ ID Ns: 19 (VH) e SEQ ID Ne: 23 (VL)

Esses anticorpos de scFV humanos foram convertidos para for-ma de IgG completa em IFA. As seguintes seqüências de aminoácido foramusadas como regiões constantes de cadeia pesada (CH) e cadeia leve (CL).CH (CH1.CH2, eCH3):

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAPHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID Ne: 13)CL:

QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NQ: 18)

RT-PCR semiquantitativo para EphA4:

O RNA total foi extraído das linhagens celulares usando o kitRneasy® (QIAGEN). Além disso, mRNA foi purificado a partir do RNA totalpor coluna de Oligo (dT)-celulose (Amersham Biosciences) e a primeira fitade cDNA sintetizada por transcrição reversa (RT) usando o SuperScript First-Strand Synthesis System (Invitrogen). Diluições seriadas apropriadas de ca-da reação da primeira fita de cDNA foram preparadas para amplificação porPCR subseqüente por monitoramento de GAPDH e β-actina como controlequantitativo. As seqüências dos iniciadores foram como segue:

5'-GAAGGCGTGGTCACTAAATGTAA-3' (SEQ. ID. N9: 3) e5'-TTTAATTTCAGAGGGCGAAGAC-3' (SEQ. ID. N9: 4) paraEphA4,

5'-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3' (SEQ. ID. N9: 5) e

5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3' (SEQ. ID. N9: 6) paraGAPDH,

5'-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3' (SEQ. ID. N9: 7) e5'-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3' (SEQ. ID. N9: 8) para β-actina.

Todas as reações de PCR envolveram desnaturação inicial a94°C por 2 min e consistiram em 94°C por 30 s, 58°C por 30 s, e 72°C por 1min por 21 ciclos para GAPDH, 20 ciclos por β-actin ou 28-32 ciclos paraEphA4 em um sistema de PCR GeneAmp 9700 (PE Applied Biosystems).

A super-expressão de EphA4 foi observada na linhagem celularde câncer pancreático Miapaca-2 (figura 1). Além disso, para elucidar a efi-cácia de anticorpo anti-EphA4 humano em vários cânceres, a expressão deEphA4 foi confirmada.

Análise de citometria de fluxo:

Células de câncer (5x106) foram incubadas a 4°C por 30 minutoscom anticorpo policlonal purificado (pAb), anticorpos monoclonais monoclo-nal (mAb), IgG de coelho (controle para pAb) ou IgG de camundongo (con-trole para mAb). As células foram lavadas com solução de tampão fosfato(PBS) e então incubadas a 4°C por 30 minutos em Alexa Fluor 488 marcadocom FITC. As células foram lavadas novamente em PBS1 e analisadas emum citômetro de fluxo (FACSCalibur®, Becton Dickinson) e então analisadaspelo programa BD CelIQuest® Pro (Becton Dickinson). A média de intensida-de de fluorescência (MFI) foi definida como a razão da intensidade da cito-metria de fluxo (intensidade por cada anticorpo específico para a proteí-na/intensidade por IgG de coelho).

Usando células que super-expressam EphA4, as proporções deligação de anticorpos anti-EphA4 sobre a superfície celular foram investiga-das. Como um resultado, uma proporção maior de anticorpos humanos anti-EphA4 65 e 336 se ligou às células MIAPaca-2 (MFI: 12,64 e 15,54, respec-tivamente) do que IgG humana (o controle).

Ensaios de ADCC:

Células-alvo foram expostas com 0,8 μΜ de acetoximetil éster decalceína (Calceína-AM, DOJINDO) a 37°C por 30 minutos. Calceína-AM setorna fluorescente após a clivagem de calceína-AM por esterases celularesque produzem um derivado fluorescente de calceína. Células cancerosas-alvo foram lavadas duas vezes antes de ser adicionadas ao ensaio, e as cé-lulas foram então plaqueadas em placas de 96 cavidades com fundo em U(4x103 células/cavidade). Células mononucleares de sangue periférico(PMBC) foram colhidas de uma pessoa saudável, separadas usando centri-fugação por gradiente de densidade com Ficoll-Paque (Amersham Bioscien-ces), e então usadas como células efetoras. Células cancerosas alvo (T) ecélulas efetoras (E) foram co-conjugadas em 250 μΙ de meio AIM-V em pla-cas de 96 cavidades em proporções E:T de 100:1 com anticorpo humanoanti-EphA4 em várias concentrações (0; 0,01; 0,1; 1; 10; 100 μg/cavidade)ou anticorpo controle Herceptin (Roche). Essa incubação foi executada emtriplicata, em 250 μΙ_ de meio AIM-V (Life Technologies, Inc), a 37°C por seishoras. Ensaios de controle incluíram a incubação de células-alvo apenascom anticorpo humano anti-EphA4 ou células efetoras. Herceptin foi usadocomo um controle em alguns experimentos.Os efeitos de ADCC de anticorpo, humano anti-EphA4 (65 e 336)para estas células foram avaliados com base nas imagens fluorescentes decélulas viáveis que foram adquiridas usando o IN Cell Analyzer 1000 (Amer-sham Bioscience). Essas imagens foram convertidas numericamente comocontagem de células viáveis (células-alvo por área da célula) por contagemdo objeto ou vesícula fluorescente usando o programa Developer tool ver.5.21 (Amersham Bioscience).

Herceptin foi usado como um controle em vários experimentos.Dano celular direto de células MIAPaca-2 pelos anticorpos humanos anti-EphA4 65 e 336 em si não foi observado. Entretanto, os anticorpos humanosanti-EphA4 65 e 336 induziram ADCC em células MIAPaca-2 que super-expressavam EphA4 (Figura 2), enquanto nenhum efeito foi observado con-tra células PK-45P com baixa expressão de EphA4 (Figura 2).Aplicabilidade Industrial:

A presente invenção se baseia, pelo menos em parte, na desco-berta de que células que expressam EphA4 podem ser danificadas por citoto-xicidade de anticorpo. EphA4 foi identificada pelos presentes inventores comoum gene fortemente expresso em cânceres pancreáticos. Dessa forma, o tra-tamento de doenças associadas com células que expressam EphA4, porexemplo, câncer pancreático é convencionalmente realizado usando anticor-pos que se ligam a EphA4. Resultados de fato confirmados pelos presentesinventores mostram citotoxicidade devido ao efeito de ADCC em linhagenscelulares de câncer pancreático, na presença de anticorpos de EphA4.

Embora a invenção tenha sido descrita em detalhe e com relaçãoàs modalidades específicas desta, será claro para os versados na técnicaque várias alterações e modificações podem ser feitas nela sem se afastardo espírito e escopo da invenção, e cujas limitações são descritas pelas rei-vindicações anexas.Listagem de Seqüência

<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC.

<i20> Métodos para danificar células usando funções efetoras de anticorposanti-EphA4

<130> ONC-A0602P<150> US 60/777,794<151> 28.02.2006<160> 30

<170> versão de patente 3.4

<210> 1

<211> 6364

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (43)..(3003)

<400> 1

ctgggataga agcggcagga gcagcgttgg caccggcgaa cc atg gct ggg att 54

Met Ala Gly Ile1

ctc ttc ggg att tgc gac gct gtc 102

Leu Phe Gly Ile Cys Asp Ala vai15 20

aat gaa gtt acc tta ttg gat tcc 150

Asn Glu vai Thr Leu Leu Asp Ser30 35

tgg ata gca age cct ctg gaa gga 198

Trp lie Ala Ser Pro Leu Glu Gly45 50

gat gaa aaa aat aca cca ate cga 246

Asp Glu Lys Asn Thr Pro Ile Arg65

ttc tat ttc gcc cta ttt tcg tgtPhe Tyr Phe Ala Leu Phe Ser Cys5 10

aca ggt tcc agg gta tac ccc gcgThr Gly Ser Arg vai Tyr Pro Ala25

aga tet gtt cag gga gaa ctt gggArg ser vai Gln Gly Glu Leu Gly40

ggg tgg gag gaa gtg agt ate atgGly Trp Glu Glu Val Ser Ile Met55 60acc tacThr Tyr

70cga actArg Thr85

att aaaIle Lys

act tgcThr Cys

aaa gagLys Glu

gct gctAla Ala150aag ctg Lys Leu165

ttt tacPhe Tyr

gtc cgtvai Arg

cag tttGln Phe

gtt cga

caa gtg tgc aat gtg atg gaa ccc age cag aat aac tgg cta 294Gln vai Cys Asn vai Met Glu Pro Ser Gln Asn Asn Trp Leu

75 80

gat tgg ate acc cga gaa ggg gct cag agg gtg tat att gag 342

Asp Trp Ile Thr Arg Glu Gly Ala Gln Arg Val Tyr Ile Glu90 95 100

ttc acc ttg agg gac tgc aat agt ctt ccg ggc gtc atg ggg 390

Phe Thr Leu Arg Asp Cys Asn Ser Leu Pro Gly vai Met Gly

105 110 115

aag gag acg ttt aac ctg tac tac tat gaa tca gac aac gac 438Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Tyr Glu Ser Asp Asn Asp

120 125 130

cgt ttc ate aga gag aac cag ttt gtc aaa att gac acc att 486Arg Phe Ile Arg Glu Asn Gln Phe vai Lys Ile Asp Thr Ile135 140 145

gat gag age ttc acc caa gtg gac att ggt gac aga ate atg 534

Asp Glu Ser Phe Thr Gln vai Asp lie Gly Asp Arg lie Met

155 160

aac acc gag ate cgg gat gta ggg cca tta age aaa aag ggg 582

Asn Thr Glu Ile Arg Asp vai Gly Pro Leu Ser Lys Lys Gly170 175 180

ctg gct ttt cag gat gtg ggg gcc tgc ate gcc ctg gta tca 630Leu Ala Phe Gln Asp vai Gly Ala Cys lie Ala Leu Val Ser

185 190 195

gtg ttc tat aaa aag tgt cca ctc aca gtc cgc aat ctg gcc 678

vai Phe Tyr Lys Lys Cys Pro Leu Thr vai Arg Asn Leu Ala

200 205 210

cct gac acc ate aca ggg gct gat acg tet tcc ctg gtg gaa 726

Pro Asp Thr Ile Thr Gly Ala Asp Thr Ser ser Leu Val Glu215 220 225

ggc tcc tgt gtc aac aac tca gaa gag aaa gat gtg cca aaa 774vai Arg Gly ser Cys vai Asn Asn ser Glu Glu Lys Asp Val Pro Lys

230 235 240

atg tac tgt ggg gca gat ggt gaa tgg ctg gta ccc att ggc aac tgc 822

Met Tyr Cys Gly Ala Asp Gly Glu Trp Leu vai Pro lie Gly Asn Cys245 250 255 260

cta tgc aac gct ggg cat gag gag cgg age gga gaa tgc caa gct tgc 870

Leu Cys Asn Ala Gly His Glu Glu Arg Ser Gly Glu Cys Gln Ala Cys

265 270 275

aaa att gga tat tac aag gct ctc tcc acg gat gcc acc tgt gcc aag 918

Lys Ile Gly Tyr Tyr Lys Ala Leu Ser Thr Asp Ala Thr Cys Ala Lys

280 285 290

tgc cca ccc cac age tac tet gtc tgg gaa gga gcc acc tcg tgc acc 966

Cys Pro Pro His Ser Tyr Ser Val Trp Glu Gly Ala Thr Ser Cys Thr295 300 305

tgt gac cga ggc ttt ttc aga gct gac aac gat gct gcc tet atg ccc 1014

Cys Asp Arg Gly Phe Phe Arg Ala Asp Asn Asp Ala Ala Ser Met Pro

310 315 320

tgc acc cgt cca cca tet gct ccc ctg aac ttg att tca aat gtc aac 1062

Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro Leu Asn Leu Ile Ser Asn Val Asn325 330 335 340

gag aca tet gtg aac ttg gaa tgg agt age cct cag aat aca ggt ggc 1110

Glu Thr ser vai Asn Leu Glu Trp Ser ser Pro Gln Asn Thr Gly Gly

345 350 355

cgc cag gac att tcc tat aat gtg gta tgc aag aaa tgt gga gct ggt 1158

Arg Gln Asp lie Ser Tyr Asn vai vai Cys Lys Lys Cys Gly Ala Gly

360 365 370

gac ccc age aag tgc cga ccc tgt gga agt ggg gtc cac tac acc cca 1206

Asp Pro ser Lys Cys Arg Pro Cys Gly Ser Gly vai His Tyr Thr Pro375 380 385

cag cag aat ggc ttg aag acc acc aaa gtc tcc ate act gac ctc cta 1254

Gln Gln Asn Gly Leu Lys Thr Thr Lys Val Ser Ile Thr Asp Leu Leu390 395 400gct cat acc aat tac acc ttt gaa ate tgg gct gtg aat gga gtg tcc 1302

Ala His Thr Asn Tyr Thr Phe Glu Ile Trp Ala vai Asn Gly Val Ser405 410 415 420

aaa tat aac cct aac cca gac caa tca gtt tet gtc act gtg acc acc 1350

Lys Tyr Asn Pro Asn Pro Asp Gln ser Val Ser Val Thr Val Thr Thr

425 430 435

aac caa gea gea cca tca tcc att gct ttg gtc cag gct aaa gaa gtc 1398

Asn Gln Ala Ala Pro ser ser lie Ala Leu vai Gln Ala Lys Glu vai

440 445 450

aca aga tac agt gtg gea ctg gct tgg ctg gaa cca gat cgg ccc aat 1446

Thr Arg Tyr Ser Val Ala Leu Ala Trp Leu Glu Pro Asp Arg Pro Asn

455 460 465

ggg gta ate ctg gaa tat gaa gtc aag tat tat gag aag gat cag aat 1494

Gly Val Ile Leu Glu Tyr Glu Val Lys Tyr Tyr Glu Lys Asp Gln Asn470 475 480

gag cga age tat cgt ata gtt cgg aca gct gcc agg aac aca gat ate 1542

Glu Arg Ser Tyr Arg Ile Val Arg Thr Ala Ala Arg Asn Thr Asp Ile485 490 495 500

aaa ggc ctg aac cct etc act tcc tat gtt ttc cac gtg cga gcc agg 1590

Lys Gly Leu Asn Pro Leu Thr Ser Tyr vai Phe His vai Arg Ala Arg

505 510 515

aca gea gct ggc tat gga gac ttc agt gag ccc ttg gag gtt aca acc 1638

Thr Ala Ala Gly Tyr Gly Asp Phe Ser Glu Pro Leu Glu vai Thr Thr

520 525 530

aac aca gtg cct tcc cgg ate att gga gat ggg gct aac tcc aca gtc 1686

Asn Thr vai Pro Ser Arg lie lie Gly Asp Gly Ala Asn ser Thr vai

535 540 545

ctt ctg gtc tet gtc tcg ggc agt gtg gtg ctg gtg gta att ctc att 1734

Leu Leu vai ser vai ser Gly Ser vai vai Leu vai vai Ile Leu lie550 555 560

gea gct ttt gtc ate age cgg aga cgg agt aaa tac agt aaa gcc aaa 1782Ala Ala Phe vai565

caa gaaGln Glu

gtg gacvai Asp

gcc aaaAla Lys

gtt ggtvai Gly630aag agaLys Arg645

gac aaaAsp Lys

ttt gacPhe Asp

aaa ccaLys Pro

gca ttcAla Phe710ggc atgGly Met725

gcg gatAla Asp

ccc tttPro Phe600gaa attGlu Ile615

gaa tttGlu Phe

gag ateGlu Ile

cag aggGln Arg

cat ccgHis Pro680gta atgvai Met695

ctc aggLeu Arg

Ile Ser570gaa gagGlu Glu585

acg tacThr Tyr

gac gcaAsp Ala

ggt gagGly Glu

tgt gtgCys vai650aga gacArg Asp665

aac ateAsn Ile

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aaa aatLys Asn

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20 25

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50 55

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85 90

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100 105

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195 200 205

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420 425 4B0

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435 440 445

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485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

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565 570 575

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580 585 590

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595 600 605

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610 615 620

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915 920 925

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965 970 975

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<210> 3

<211> 23<212> DNA<213> artificial<220>

<223> Seqüência iniciadora artificialmente sintetizada para rt-pcr.<400> 3

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<210> 4<211> 22<212> DNA<213> artificial<220>

<223> seqüência iniciadora artificialmente sintetizada para rt-pcr.<400> 4

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<210> 5<211> 20<212> DNA<213> artificial<220>

<223> Seqüência iniciadora artificialmente sintetizada para rt-pcr.<400> 5

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<210> 6

<211> 23

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<213> artificial<220>

<223> Seqüência iniciadora artificialmente sintetizada para RT-PCR.

<400> 6

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<210> 7

<211> 21

<212> DNA

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<223> Seqüência iniciadora artificialmente sintetizada para RT-PCR.

<400> 7

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<210> 8

<211> 21

<212> dna

<213> artificial<220>

<223> Seqüência iniciadora artificialmente sintetizada para rt-pcr.

<400> 8

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<210> 9

<211> 452

<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> Região de interesse Biológico<223> Seqüência de aminoácidos de VH de anticorpo anti-EPHA4 humano.<400> 9

Gln vai Gln Leu vai Gln ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

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20 25 30

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35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

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130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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245 250 255

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Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

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vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro385 390 395 400

Pro vai Leu Asp Ser Asp Gly ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr405 410 415

vai Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn vai Phe ser Cys Ser vai420 425 430

Met His Glu Ala Pro His Asn His Tyr Thr Gln Lys ser Leu Ser Leu435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450<210> 10<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> Região de interesse Biológico

<223> Seqüência de aminoácidds de VH CDRl de anticorpo anti-EPHA4 humano.

<400> 10Glu Leu Ser Met His1 5

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<21B> Homo sapiens

I <220>

f

<221> Região de interesse Biológico

<223> Seqüência de aminoácidos de VH CDR2 de anticorpo anti-EPHA4 humano.<400> 11

Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln15 10 15

Gly

<210> 12

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> Região de interesse Biológico

<223> Seqüência de aminoácidos de VH cdr3 de anticorpo anti-EPHA4 humano.

<400> 12

Ala Gln Pro Phe His Trp Gly Asp Asp Ala Phe Asp Ile1 5 10

<210> 13

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> Região de Interesse Biológico

<223> Seqüência de aminoácidos de VH CH de anticorpo anti-EPHA4 humano.<400> 13

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys1 5 10 15

Ser Thr ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu vai Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr ser35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val vai Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly210 215 220Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

vai Phe Ser Cys Ser vai Met His Glu Ala Pro His Asn His Tyr Thr305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys325 330

<210> 14<211> 216<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<221> Região de Interesse Biológico

<223> Seqüência de aminoácidos de VL de anticorpo anti-EPHA4 humano.<400> 14

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln15 10 15

Arg vai Thr lie Ser Cys ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly ser Asn

20 25 30

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35 40 45

Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln65 70 75 80Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

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130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys145 150 155 160

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165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His180 185 190

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210 215

<210> 15<211> 13<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<221> Região de interesse Biológico<223> Seqüência de aminoácidos de VL CDRl de anticorpo anti-EPHA4 humano.<400> 15

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn1 5 10

<210> 16<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> Região de interesse Biológico

<223> Seqüência de aminoácidos de anticorpo VL CDR2 de anti-EPHA4 humano.<400> 16

Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser1 5

<210> 17<211> 11<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<221> Região de interesse Biológico

<223> Seqüência de aminoácidos de VL CDR3 de anticorpo anti-EPHA4 humano.<400> 17

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val15 10

<210> 18<211> 105<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<221> Região de interesse Biológico

<223> Seqüência de aminoácidos de VL CL de anticorpo anti-EPHA4 humano.<400> 18

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser vai Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu15 10 15

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu vai Cys Leu lie ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln ser Asn Asn Lys50 55 60Tyr Ala Ala Ser ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser65 70 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln vai Thr His Glu Gly ser Thr vai Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 19 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Região de interesse ι 3iológico <223> Seqüência de aminoácidos de VH de anticorpo anti-EPHA4 humano <400> 19 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu vai Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 vai ser vai Lys ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro AS ρ Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser vai Thr Pro Glu Asp Thr Ala vai 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Leu Arg Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu vai Thr vai ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro ser ser Lys Ser Thr ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr ser Gly vai His Thr Phe Pro Ala vai

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

ser ser ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn vai Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys vai vai Val Asp vai Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

vai Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln vai Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val385 390 395 400Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe405

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly420

Glu Ala Pro His Asn His Tyr435

Gly Lys450<210> 20<211> 7

<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<221> Região de interesse Biológico<223> seqüência de aminoácidos de VH CDRl de anticorpo anti-EPHA4 humano.<400> 20

Ser Asn ser Ala Ala Trp Asn1 5

<210> 21<211> 18<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<221> Região de interesse Biológico<223> Seqüência de aminoácidos de anticorpo VH CDR2 de anti-EPHA4 humano.<400> 21

Arg Thr Tyr Tyr Arg ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala vai Ser vai15 10 15

Lys Ser

<210> 22

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

410 415

Asn vai Phe ser Cys Ser vai Met His

425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro440 445

<211> 8<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<221> Região de Interesse Biológico

<223> Seqüência de aminoácidos de VH CDR3 de anticorpo anti-EPHA4 humano.<400> 22

Asp Ser Leu Arg ser Phe Asp Tyr1 5

<210> 23<211> 216<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<221> Região de interesse Biológico

<223> Seqüência de aminoácidos de VL de anticorpo anti-EPHA4 humano.<400> 23

Gln Ser vai Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro ser Gly lie Pro Asp Arg Phe ser

50 55 60

Gly ser Lys ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly lie Thr Gly Leu Gln65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp ser Ser Leu

85 90 95

Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu115 120 125Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala vai Thr vai Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro vai Lys145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 24<211> 13<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> Região de interesse Biológico

<223> Seqüência de aminoácidos de VL CDRl de anticorpo anti-EPHA4 humano.<400> 24

Ser Gly Ser ser ser Asn lie Gly Asn Asn Tyr Val Ser15 10

<210> 25<211> 7<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> Região de interesse Biológico

<223> Seqüência de aminoácidos de VL CDR2 de anticorpo anti-EPHA4 humano.<400> 25

Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser1 5<210> 26

<211> 11

<212> PRT

<21Β> Homo sapiens

<220>

<221> Região de interesse Biológico

<223> Seqüência de aminoácidos de VL CDR3 de anticorpo anti-EPHA4 humano.

<400> 26

Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Val Val

1 5 10

I <210> 27

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> Região de Interesse Biológico<223> região VHDJ da cadeia pesada<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser vai Lys vai ser Cys Lys vai ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu

20 25 30

Ser Met His Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr lie Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60

Gln Gly Arg vai Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Thr Ala Gln Pro Phe His Trp Gly Asp Asp Ala Phe Asp Ile Trp100 105 110Gly Gln Gly Thr Met vai Thr vai Ser Ser

115 120

<210> 28<211> 111<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<221> Região de Interesse Biológico<223> região VLJ da cadeia leve<400> 28

Gln ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln15 10 15

Arg vai Thr lie ser Cys ser Gly ser Ser Ser Asn lie Gly ser Asn

20 25 30

Thr vai Asn Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly ser Lys ser Gly Thr ser Ala ser Leu Ala lie ser Gly Leu Gln65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Pro vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110

<210> 29

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Região de interesse Biológico<223> região vhdj da cadeia pesada<400> 29Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala

50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Leu Arg ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu vai Thr vai Ser ser115 120

<210> 30<211> 111<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<221> Região de interesse Biológico<223> região vlj da cadeia leve<400> 30

Gln ser vai Leu Thr Gln Pro Pro ser vai Ser Ala Ala Pro Gly Gln15 10 15

Lys vai Thr Ile Ser Cys ser Gly Ser ser ser Asn lie Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr vai Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Ser Ala Val vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110

Claims

1. Composição farmacêutica para danificar uma célula que ex-pressa EphA4, a composição compreendendo um anticorpo anti-EphA4 co-mo um ingrediente ativo, em que o anticorpo possui função efetora.

2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,em que a célula que expressa EphA4 é uma célula pancreática, cancerosa.

3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,em que o anticorpo anti-EphA4 é um anticorpo monoclonal.

4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,em que a função efetora do anticorpo é citotoxicidade dependente de anti-corpo ou citotoxicidade dependente de complemento, ou ambas.

5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,em que o anticorpo compreende uma cadeia VH e uma VL1 cada cadeia VHe VL compreendendo seqüências de aminoácido de CDR designadas CDR1,CDR2 e CDR3 separadas por estrutura de seqüências de aminoácido, a se-qüência de aminoácido de cada CDR em cada cadeia VH e VL é seleciona-da a partir do grupo que consiste em:CDR1 de VH humana: ELSMH (SEQ ID N5: 10),CDR2 de VH humana: GFDPEDGETIYAQKFQG (SEQ ID N9:11),CDR3 de VH humana: AQPFHWGDDAFDI (SEQ ID N9: 12),CDR1 de VL humana: SGSSSNIGSNTVN (SEQ ID N5: 15),CDR2 de VL humana: SNNQRPS (SEQ ID N9: 16),CDR3 de VL humana: AAWDDSLNGPV (SEQ ID Ne: 17); eCDR1 de VH humana: SNSAAWN (SEQ ID N5: 20),CDR2 de VH humana: RTYYRSKWYNDYAVSVKS (SEQ ID N9:21),CDR3 de VH humana: DSLRSFDY (SEQ ID Ne: 22),CDR1 de VL humana: SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID N9: 24),CDR2 de VL humana: DNNKRPS (SEQ ID N9: 25),CDR3 de VL humana: GTWDSSLSAVV (SEQ ID N9: 26).

6. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que a VHhumana compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID N9: 27 ou 29, ea VLhumana compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID N9: 28 ou-30.

7. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que o anti-corpo ainda compreende o domínio Fc de IgGI humana.

8. Anticorpo que compreende uma cadeia VH e uma VL, cadacadeia VH e VL compreendendo seqüências de aminoácido de CDR desig-nadas CDR1, CDR2 e CDR3 separadas por estrutura de seqüências de a-minoácido, a seqüência de aminoácido de cada CDR em cada cadeia VH eVL é selecionada a partir do grupo que consiste em:CDR1 de VH humana: ELSMH (SEQ ID N9: 10),CDR2 de VH humana: GFDPEDGETIYAQKFQG (SEQ ID N9:-11),CDR3 de VH humana: AQPFHWGDDAFDI (SEQ ID N9: 12),CDR1 de VL humana: SGSSSNIGSNTVN (SEQ ID N9: 15),CDR2 de VL humana: SNNQRPS (SEQ ID N9: 16),CDR3 de VL humana: AAWDDSLNGPV (SEQ ID N9: 17); eCDR1 de VH humana: SNSAAWN (SEQ ID N9: 20),CDR2 de VH humana: RTYYRSKWYNDYAVSVKS (SEQ ID N9:-21),CDR3 de VH humana: DSLRSFDY (SEQ ID N9: 22),CDR1 de VL humana: SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID N9: 24),CDR2 de VL humana: DNNKRPS (SEQ ID N9: 25),CDR3 de VL humana: GTWDSSLSAVV (SEQ ID N9: 26).

9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 8, em que a VH hu-mana compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID N9: 27 ou 29, e aVL humana compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID N9: 28 ou-30.

10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 8, em que o anti-corpo ainda compreende o domínio Fc de IgGI humana.

11. Polinucleotídeo isolado que codifica o anticorpo como defini-do na reivindicação 8.

12. Vetor que compreende o polinucleotídeo como definido nareivindicação 11.

13. Célula hospedeira isolada que compreende o vetor como de-finido na reivindicação 12.

14. Processo de produzir um anticorpo que compreende as eta-pas de cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 13, paraque o polinucleotídeo seja expresso, e recuperar o anticorpo da cultura decélula hospedeira.

15. Composição farmacêutica para danificar uma célula que ex-pressa EphA4, em que a composição compreende o polinucleotídeo comodefinido na reivindicação 11, ou um vetor compreendendo o mesmo.

16. Método para danificar uma célula que expressa EphA4,compreendendo as etapas de:a) colocar a célula que expressa EphA4 em contato com umanticorpo anti-EphA4, eb) danificar a célula que expressa EphA4 com a função efetorado anticorpo que ligou à célula.

17. Composição imunogênica para induzir um anticorpo quepossui uma função efetora contra uma célula que expressa EphA4, em que acomposição compreende, como um ingrediente ativo, EphA4, um fragmentoimunologicamente ativo do mesmo, ou um DNA que pode expressar EphA4ou o fragmento imunologicamente ativo do mesmo.

18. Método para induzir um anticorpo que possui uma funçãoefetora contra uma célula que expressa EphA-4, em que o método compre-ende administrar EphA4, um fragmento imunologicamente ativo do mesmo,ou uma célula ou um DNA que pode expressar EphA4 ou o fragmento imu-nologicamente ativo do mesmo.

19. Método para tratar ou prevenir um câncer pancreático emum indivíduo que compreende a etapa de administrar ao dito indivíduo umaquantidade farmaceuticamente eficaz de um anticorpo anti-EphA4, ou umfragmento imunologicamente ativo do mesmo, em que o anticorpo possuifunção efetora de anticorpo.