BRPI0708340A2

BRPI0708340A2 - peptìdio isolado, mimético dele, composição, processo de tratamento de uma condição em um mamìfero requerendo remoção ou destruição de células, e processo de prevenção ou inibição de estenose, oclusão ou bloqueio de um cateter

Info

Publication number: BRPI0708340A2
Application number: BRPI0708340-8A
Authority: BR
Inventors: Paul A Averback; Jack Gemmell
Original assignee: Nymox Corp
Priority date: 2006-02-28
Filing date: 2007-02-28
Publication date: 2011-05-24
Also published as: EP1994152A4; PL1994152T3; ZA200807394B; US8067378B2; US8716247B2; PT1994152E; MX2008010942A; CN101389760A; AU2007219669A1; US20120114679A1; DK1994152T3; SI1994152T1; EP1994152A1; CA2643100A1; EP1994152B1; US20080176805A1; EA200801853A1; ES2400920T3; JP2009528298A; WO2007098588A1

Abstract

PEPTIDIO ISOLADO, MIMéTICO DELE, COMPOSIçãO, PROCESSO DE TRATAMENTO DE UMA CONDIçãO EM UM MAMìFERO REQUERENDO REMOçãO OU DESTRUIçãO DE CéLULAS, E PROCESSO DE PREVENçãO OU INIBIçãO DE ESTENOSE, OCLUSãO OU BLOQUEIO DE UM CATETER. As concretizações incluem processos de tratamento de condições requerendo a remoção ou destruição de elementos celulares, tais como tumores benignos ou malignos em seres humanos, usando compostos baseados em pequenos peptídios. O processo inclui, mas não é limitado a, administração dos compostos intramuscularmente, oralmente, intraveno samente, intratecalmente, intratumoralmente, intranasalmente, topicamente, transdermicamente, etc., sozinho ou conjugado a um transportador.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invençãopara "PEPTÍDIO ISOLADO, MIMÉTICO DELE,COMPOSIÇÃO, PROCESSO DE TRATAMENTO DE UMACONDIÇÃO EM UM MAMÍFERO REQUERENDOREMOÇÃO OU DESTRUIÇÃO DE CÉLULAS, EPROCESSO DE PREVENÇÃO OU INIBIÇÃO DEESTENOSE, OCLUSÃO OU BLOQUEIO DE UMCATETER".

REMISSÃO RECÍPROCA A UM PEDIDO DEPATENTE RELACIONADO

Este pedido de patente reivindica o benefício dopedido de patente provisório U.S. 60/776.933, depositado em 28de fevereiro de 2006, que é incorporado inteiramente porreferência no presente relatório descritivo.

ANTECEDENTES

1. Campo das concretizações

As concretizações incluem processos detratamento de condições requerendo a remoção ou destruição deelementos celulares, tais como tumores benignos ou malignos emseres humanos, usando compostos baseados em pequenospeptídios. O processo inclui, mas não é limitado a, aadministração de compostos intramuscularmente, oralmente,intravenosamente, intratecalmente, intratumoralmente,intranasalmente, topicamente, transdermicamente, etc., sozinhosou conjugados com um transportador.

2. Descrição da técnica relacionadaA essência de muitos tratamentos médicos eprocedimentos envolve a remoção ou destruição de tecido nocivoou indesejado. Os exemplos desses tratamentos importantesincluem a remoção cirúrgica de crescimentos cancerígenos, adestruição de tumores metatásticos por quimioterapia, e a reduçãode hiperplasia glandular (por exemplo, da próstata). Outrosexemplos incluem a remoção de pelo facial indesejado, a remoçãode verrugas, e a remoção de tecido gorduroso indesejado.

Há uma necessidade óbvia para um agenteefetivo que destrua e, por conseguinte, facilite a remoção ouinibição de mais crescimento de células e tecido nocivos ouindesejados, mas vai ter principalmente efeitos locais e umatoxicidade sistêmica mínima ou ausente.

Classes desses agentes são descritas nos pedidosde patentes dos estadunidenses Ser. No. 10/092,934, intitulado:"Methods of Treating Tumors and Related Conditions UsingNeural Thread Proteins", Ser. No. 10/153,334, intitulado:"Peptides Effective In The Treatment Of Tumors And OtherConditions Requiring The Removal Or Destruction Of Cells";Ser. No. 10/198,069, intitulado: "Peptides Effective In TheTreatment Of Tumors And Other Conditions Requiring TheRemoval Or Destruction Of Cells"; Ser. No. 10/198,070,intitulado: "Peptides Effective In The Treatment Of Tumors AndOther Conditions Requiring The Removal Or Destruction OfCells", Ser. No. 10/294, 891 intitulado: "Peptides Effective In TheTreatment Of Tumors And Other Conditions Requiring TheRemoval Or Destruction Of Cells"; e Ser. No. 10/920,313intitulado: "Peptides Effective In The Treatment Of Tumors AndOther Conditions Requiring The Removal Or Destruction OfCells", cujas descrições são incorporas nas suas totalidades porreferência no presente relatório descritivo.

São descritos no presente relatório descritivocompostos, fragmentos e subseqüências de um desses agentespeptídicos (SEQ ID N0 1 : Ile - Asp - Gln - Gln - Val - Leu - Ser -Arg - Ile - Lys - Leu - Glu - lie - Lys - Arg - Cys - Leu), que sãotambém úteis no tratamento de tumores e de outras condiçõesrequerendo a remoção ou destruição de células.

O câncer é uma anomalia nos mecanismosreguladores internos das células, que resulta em crescimento ereprodução descontrolados da célula. As células normaisproduzem tecidos, e quando essas células perdem as suascapacidades de comportarem-se como uma unidade específica,controlada e coordenada, (desdiferenciação), o defeito leva a umadesarrumação na população celular. Quando isso ocorre, umtumor é formado.

Os supercrescimentos benignos de tecidos sãoanomalias, nas quais é desejável remover as células de umorganismo. Os tumores benignos são proliferações celulares quenão metastatizam pelo corpo, mas, no entanto, provocamsintomas de doenças. Esses tumores podem ser letais, se foramlocalizados em áreas inacessíveis em órgãos, tal como o cérebro.Há tumores benignos de órgãos, incluindo pulmão, cérebro, pele,pituitária, tiróide, córtex e medula adrenal, ovário, útero,testículos, tecido conectivo, músculo, intestinos, ouvido, nariz,garganta, amídalas, boca, bexiga biliar, pâncreas, próstata,coração e outros órgãos.

A cirurgia é, freqüentemente, a primeira etapano tratamento de câncer. O objetivo da cirurgia varia. Algumasvezes, é usada para remover tanto quanto possível do tumorevidente, ou pelo menos para "desbastá-lo" (remover o ou osgrande tumores, de modo que haja uma menor necessidade detratamento por outros meios). Dependendo do tipo e localizaçãodo câncer, a cirurgia pode também proporcionar um alíviosintomático para o paciente. Por exemplo, se um cirurgião poderemover uma grande parte de um tumor no cérebro em expansão,a pressão dentro do crânio vai diminuir, provocando umaperfeiçoamento nos sintomas do paciente.

Nem todos os tumores são receptivos a cirurgia.Alguns podem estar localizados em partes do corpo queimpossibilitam a remoção completa deles. Os exemplos dessesvão ser os tumores no troncoencefálico (uma parte do cérebro quecontrola a respiração), ou um tumor que cresceu em e em torno deum vaso sangüíneo grande. Nesses casos, o papel da cirurgia élimitado devido ao alto risco associado com a remoção do tumor.

Em alguns casos, a cirurgia não é usada paradesbastar o tumor, porque simplesmente não é necessária. Umexemplo é linfoma de Hodgkin, um câncer dos nós linfáticos, queresponde muito a combinações quimioterapia e terapia deradiação. No linfoma de Hodkin, a cirurgia é raramente necessáriapara obtenção de cura, mas é sempre usada para estabelecer umdiagnóstico.

A quimioterapia é uma outra forma comum detratamento de câncer. Essencialmente, envolve o uso demedicamentos (usualmente administrados pela boca ou porinjeção), que atacam, especificamente, rapidamente as célulasdivisoras (tais como aquelas encontradas em um tumor) por todoo corpo. Isso faz com que a quimioterapia seja útil no tratamentode cânceres que já tenham metastatizado, bem como tumores quetêm uma alta chance de se espalharem pelo sangue e sistemaslinfáticos, mas que não são evidentes além do tumor primário. Aquimioterapia também pode ser usada para melhorar a resposta detumores localizados a cirurgia e terapia de radiação. Esse é o caso,por exemplo, para alguns cânceres da cabeça e do pescoço.

Infelizmente, outras células no corpo humano,que também se dividem rapidamente (tal como o revestimento doestômago e do pelo), são também afetadas por quimioterapia. Poressa razão, muitos agentes quimioterápicos induzem efeitoscolaterais indesejáveis, tais como náusea, vômito, anemia, perdade pelo ou outros sintomas. Esses efeitos colaterais sãotemporários, e existem medicamentos que podem ajudar a aliviarmuitos desses efeitos colaterais. Como o nosso conhecimento temcontinuado a crescer, os pesquisadores têm planejado agentesquimioterápicos mais novos, que não apenas melhor exterminamas células cancerígenas, mas que têm também menos efeitoscolaterais para o paciente.

A quimioterapia é administrada de váriosmodos. Alguns incluem pílulas e outros são administrados poruma injeção intravenosa ou outra. Para quimioterapia injetável,um paciente vai ao consultório de um médico ou hospital paratratamento. Outros agentes quimioterapêuticos requerem a infusãocontínua na corrente sangüínea 24 horas por dia. Para esses tiposde quimioterapia, um pequeno procedimento cirúrgico éconduzido para implantar uma pequena bomba, a ser usada pelopaciente. A bomba então administra lentamente a medicação. Emmuitos casos, um orifício permanente é colocado em uma veia dopaciente, para eliminar a necessidade de repetidas picadas deagulha.

A terapia de radiação é outra arma comumenteusada na luta contra o câncer. A radiação mata o câncer pordanificar o DNA dentro das células tumorosas. A radiação étransmitida de diferentes modos. O mais comum envolve apontarum feixe de radiação no paciente de uma maneira altamenteprecisa, focalizando no tumor. Para que isso seja feito, umpaciente deita em uma mesa e o feixe é movimentado em tornodele. O procedimento dura minutos, mas pode ser feitodiariamente por várias semanas (dependendo do tipo de tumor),para obter uma dose prescrita total particular.

Outro processo de radiação algumas vezesempregado, chamado braquiterapia, envolve pegar pelotas(sementes) ou fios radioativos e implantá-los no corpo, na área dotumor. Os implantes podem ser temporários ou permanentes. Paraimplantes permanentes, a radiação nas sementes decai por umperíodo de dias ou semanas, de modo que o paciente não ficaradioativo. Para implantes temporários, toda a dose de radiação éusualmente transmitida em uns poucos dias, e o paciente deveficar no hospital, durante esse período. Para ambos os tipos debraquiterapia, a radiação é geralmente transmitida a uma área bemalvejada, para aquisição de controle local do câncer (em oposiçãoao tratamento de todo o corpo, como faz a quimioterapia).

Alguns pacientes altamente selecionados podemser referidos para transplantes de medula óssea. Esseprocedimento é usualmente conduzido ou porque um paciente temum câncer, que é particularmente agressivo, ou porque tem umcâncer que reincidiu após ter sido tratado com terapiaconvencional. O transplante de medula óssea é um procedimentocomplicado. Há muitos tipos e variam nos seus potenciais deprovocar efeitos colaterais e cura. A maior parte dos transplantesé feita em centros especializados, e, em muitos casos, o uso delesé considerado investigativo.

Existem várias outras terapias, embora a maiorparte delas ainda estejam sendo exploradas em ensaios clínicos enão representam ainda um cuidado usual. Os exemplos incluem ouso de imunoterapia, anticorpos monoclonais, fatores deangiogênese e terapia de genes.Imunoterapia: Há várias técnicas elaboradaspara ajudar o próprio sistema imune do paciente a lutar contra ocâncer, bem separadamente da radiação ou quimioterapia.Freqüentemente, para obtenção de resultado, os pesquisadoresinjetam no paciente uma vacina derivada especialmente.

Anticorpos monoclonais: Esses são anticorposelaborados para ficarem presos nas células cancerígenas (e nãonas células normais), tirando vantagem das diferenças entre ascélulas cancerígenas e as não cancerígenas, nas suascaracterísticas antigênicas e/ou outras. Os anticorpos podem seradministrados ao paciente sozinhos ou conjugados a várioscompostos citotóxicos ou em uma forma radioativa, de modo queo anticorpo tem como alvo preferencial as células cancerígenas,desse modo, transferindo o agente tóxico ou radioatividade àscélulas desejadas.

Fatores de antiangiogênese: Como as célulascancerígenas rapidamente se dividem e os tumores crescem,podem superar em crescimento os seus suprimentos de sangue.Para compensar isso, alguns tumores secretam uma substânciaacreditada como ajudando a induzir o crescimento de vasossangüíneos nas suas vizinhanças, dotando, desse modo, as célulascancerígenas com uma fonte vascular de nutrientes. Terapiasexperimentais foram desenvolvidas para deter o crescimento devasos sangüíneos em tumores.

Terapia de genes: O câncer é o produto de umasérie de mutações, que levam, basicamente, à produção de umacélula cancerígena e a sua proliferação excessiva. Os câncerespodem ser tratados por introdução de genes nas célulascancerígenas, que vão agir para checar ou interromper aproliferação de câncer, ativar os mecanismos celularesprogramados das células para destruir a célula, melhorar oreconhecimento imune da célula, ou expressar um pró-medicamento que se converte em um metabólito tóxico ou emuma citocina, que inibe o crescimento do tumor.

Os tumores malignos e as má formaçõestambém podem ser tratados por vários processos, incluindocirurgia, radioterapia, terapia de medicamento, ablação térmica ouelétrica, crioterapia e outros. Embora os tumores benignos nãomatastatizem, podem crescer muito e podem voltar. A extirpaçãocirúrgica de tumores benignos tem todas as dificuldades e efeitoscolaterais da cirurgia em geral, e, freqüentemente, deve serconduzida repetidamente para alguns tumores benignos, tais comoadrenomas pituitários, meningeomas do cérebro, hiperplasiaprostática e outros.

Outras condições envolvendo elementoscelulares indesejados existem, quando a remoção celular seletivaé desejável. Por exemplo, doença cardíaca e acidentes vascularescerebrais são provocados por aterosclerose, que é uma lesãoproliferativa de elementos musculares lisos fibroadiposos emodificados, que distorcem a parede do vaso sangüíneo, estreitamo lúmen, restringem o fluxo sangüíneo, predispõem a coágulossangüíneos focais e, por fim, provocam bloqueio e infartação. Hávários tratamentos para aterosclerose, tais como: enxertos dederivação; enxertos artificiais; angioplastia com recanalização,curetagem, radiação, laser ou outro tipo de remoção;farmacoterapia para inibir aterosclerose por redução de lipídios;terapias anticoagulantes; e medidas gerais de dieta, exercício eestilo de vida. Um processo para remoção de lesõesateroscleróticas, sem o risco e os efeitos colaterais dosprocedimentos cirúrgicos, é necessário.

Outros exemplos de elementos celularesindesejados, quando a remoção celular seletiva é desejável,incluem crescimentos induzidos virais, tais como verrugas. Outroexemplo é o das massas inflamatórias hipertróficas encontradasem condições inflamatórias, e cicatrizes ou quelóideshipertróficos. Ainda outros exemplos são encontrados emcontextos cosméticos, tal como a remoção de pelo indesejado, porexemplo, pelo facial, ou para retração de áreas de tecidoindesejadas para fins cosméticos, tal como na derme facial e nostecidos conectivos ou nas dermes e tecido conectivo dasextremidades.

Outros exemplos de elementos celularesindesejados, quando a remoção celular seletiva ou a inibição deproliferação celular é desejável, incluem estenose e restenose dequalquer artéria, válvula ou canal no sistema circulatório,incluindo, mas não limitado a, válvulas (por exemplo, estenoseaórtica que envolve o estreitamente do orifício da válvula aórtica),artérias coronárias (por exemplo, esclerose ostial coronária, queenvolve o estreitamento das aberturas das artérias coronárias),artérias carótidas e artérias renais. Outros exemplos incluem ainibição ou remoção de crescimento ou acúmulo celularindesejado, provocando a oclusão parcial ou completa dedispositivos médicos, tais como cateteres, colocadas ouimplantadas dentro de um vaso sangüíneo para o tratamento deestenoses, estreitamentos ou aneurismas neles ou dentro do tratourinário e nos dutos biliares.

Ainda outros exemplos vão ser óbvios paraaqueles versados na técnica. Em todos ou na maior parte dosexemplos, há uma necessidade para tratamentos que podemremover ou destruir os elementos celulares indesejados, sem osriscos e os efeitos colaterais de terapias convencionais, ouremover os elementos celulares indesejados com mais precisão.

Ao longo dessa descrição, incluindo a descriçãoprecedente da técnica relacionada, quaisquer e todos osdocumentos disponíveis publicamente descritos no presenterelatório descritivo, incluindo quaisquer e todas as patentesestadunidenses, são especificamente incorporados por referêncianas suas totalidades no presente relatório descritivo. A descriçãoprecedente da técnica relacionada não é intencionada de qualquermodo como uma admissão que quaisquer dos documentosdescritos nela, incluindo os pedidos de patentes estadunidensespendentes, são técnica anterior para a presente descrição. Além domais, a descrição no presente relatório descritivo de quaisquerdesvantagens associadas com os produtos, processos e/ouaparelhos descritos, não é intencionada para limitar asconcretizações. De fato, os aspectos das concretizações podemincluir certos aspectos dos produtos, processos e/ou aparelhosdescritos, sem sofrer das suas desvantagens descritas.

RESUMO DAS CONCRETIZAÇÕES

Persiste uma necessidade na técnica para novostratamentos menos tóxicos, para tratar elementos celularesindesejados. As concretizações satisfazem essas necessidades.

Esta descrição é baseada, em parte, nadescoberta de que certos peptídios, incluindo um peptídioespecífico descrito pela seqüência de aminoácidos Ile - Asp - Gln

-Gln - Val - Leu - Ser - Arg - Ile - Lys - Leu - Glu - Ile - Lys -Arg - Cys - Leu, são capazes de tratar e/ou exterminarproliferações celulares indesejadas. Essas proliferações celularesindesejadas incluem, entre outros, tumores benignos e malignos,hiperplasia glandular (por exemplo, da próstata), pelo facialindesejado, verrugas e tecido adiposo indesejado.

As concretizações descritas no presente relatóriodescritivo são baseadas, em parte, na descoberta surpreendente einesperada de que certos fragmentos e subseqüências de peptídiosdo peptídio Ile - Asp - Gln - Gln - Val - Leu - Ser - Arg - Ile - Lys-Leu - Glu - Ile - Lys - Arg - Cys - Leu ("peptídios S05A") têm acapacidade de tratar e/ou exterminar proliferações celularesindesejadas.

Algumas concretizações são dirigidas aprocessos de tratamento de proliferações celulares indesejadas(tumores benignos e malignos, hiperplasia glandular (porexemplo, da próstata), pelo facial indesejado, verrugas e tecidoadiposo indesejado), que compreendem a administração a ummamífero carente dele de uma quantidade terapeuticamenteefetiva de peptídio S05A.

Esse peptídio S05A pode ser administradosozinho ou conjugado a um transportador ou um anticorpo. Ospeptídios S05A podem ser administrados intramuscularmente,oralmente, intravenosamente, intraperitonealmente,intracerebralmente (intraparenquimalmente),intracerebroventicularmente, intratumoralmente,intralesionalmente, intradermicamente, intratecalmente,intranasalmente, intra-ocularmente, intra-arterialmente,topicamente, transdermicamente, por meio de um aerossol,infusão, injeção de bolo, dispositivo de implantação, sistema deliberação constante, etc., sozinho ou conjugado com umtransportador. Alternativamente, os peptídios S05A pode serexpressos in vivo por administração de um gene, que expressa ospeptídios S05A, por administração de uma vacina que induz essaprodução ou por introdução de células, bactérias ou vírus queexpressam o peptídio in vivo, por causa da modificação genéticaou de outro modo.

Além disso, os peptídios S05A podem serusados em conjunto com outras terapias, para o tratamento detumores benignos e malignos e outros crescimentos celularesindesejados ou nocivos.Ambas a descrição geral precedente e adescrição detalhada a seguir são exemplificativas e explicativas esão intencionadas para proporcionar mais explicação dasconcretizações, como reivindicadas. Outros objetos, vantagens ecaracterísticas vão ser prontamente evidentes para aquelesversados na técnica, a partir da descrição detalhada a seguir dasconcretizações.

DESCRIÇÃO DETALHADA DASCONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Antes das presentes proteínas, seqüências denucleotídeos, peptídios, etc. e processos serem descritos, deve-seentender que esta invenção não é limitada à metodologia,protocolos, linhas celulares, vetores e reagentes particularesdescritos, pois esses podem variar. Deve-se também entender quea terminologia usada no presente relatório descritivo é com afinalidade de descrever apenas concretizações particulares, e nãose tem intenção de limitar o âmbito das presentes concretizações,que vai ser limitado apenas pelas reivindicações em anexo.

Os termos e frases usados no presente relatóriodescritivo são definidos como mostrado abaixo, a menos queindicado de outro modo.

Ao longo desta descrição, as formas singular"o", "a", "um" e "uma" incluem as referências no plural, a menosque o contexto dite claramente de outro modo. Desse modo, porexemplo, uma referência a uma "célula hospedeira" inclui umapluralidade dessas células hospedeiras, e uma referência a "umanticorpo" é uma referência a um ou mais anticorpos e seusequivalentes conhecidos daqueles versados na técnica, e assim pordiante.

Os aminoácidos e resíduos de aminoácidosdescritos no presente relatório descritivo podem ser referidoscomo de acordo com o código de uma a três letras proporcionadona tabela abaixo.

Tabela 1

<table>table see original document page 19</column></row><table>O termo "peptídio", como usado no presenterelatório descritivo, se refere a uma cadeia de pelo menos doisaminoácidos e inclui homólogos, derivados, fragmentos evariantes do peptídio. A expressão "peptídio S05A" se refere a umpeptídio compreendendo pelo menos um fragmento ou umasubseqüência do peptídio SEQ ID N0 1 (lie - Asp - Gln - Gln -Val - Leu - Ser - Arg - Ile - Lys - Leu - Glu - Ile - Lys - Arg - CysLeu) e inclui qualquer homólogo, fragmento, derivado, variante,proteína de fusão e miméticos de peptídios do peptídio, a menosque o contexto indique de outro modo. A expressão "peptídiosS05A" inclui (mas não é limitada a peptídios compreendendo pelomenos um peptídio selecionado do grupo consistindo de:

a) o peptídio representado pela seqüência deaminoácidos na SEQ ID N0 2 (lie - Asp - Gln - Gln - Val - Leu -Ser - Arg - lie);

b) o peptídio representado pela seqüência deaminoácidos na SEQ ID N0 3 (Lys - Leu - Glu - Ile - Lys - Arg -Cys - Leu);

c) o peptídio representado pela seqüência deaminoácidos na SEQ ID N0 4 (Vai - Leu - Ser - Arg - Ile - Lys);

d) o peptídio representado pela seqüência deaminoácidos na SEQ ID N0 5 (Arg - Ile - Lys - Leu - Glu - Ile - Lys);

e) o peptídio representado pela seqüência deaminoácidos na SEQ ID N°6 (Vai - Leu - Ser - Arg - Ile - Lys -Leu - Glu - Ile - Lys - Arg - Cys - Leu); ef) o peptídio representado pela seqüência deaminoácidos na SEQ ID N0 7 (lie - Asp - Gln - Gln - Val - Leu -Ser - Arg - Ile - Lys - Leu - Glu - lie).

O termo "fragmento" ou "subseqüência" serefere a uma proteína ou polipeptídio, que consiste de umasubseqüência contínua da seqüência de aminoácidos de umaproteína ou peptídio, e inclui fragmentos naturais, tais comovariantes de junções, e fragmentos resultantes de uma atividadede protease in vivo natural. Esse fragmento pode ser truncado naterminação amino, terminação carbóxi e/ou internamente (talcomo por junção natural). Esses fragmentos podem ser preparadoscom ou sem um terminal amino de metionina. O termo"fragmento" inclui fragmentos, se idênticos ou diferentes, damesma proteína ou peptídio, com uma seqüência de aminoácidoscontígua em comum ou não, unidos, diretamente ou por meio deum agente de ligação. Por conseguinte, qualquer peptídio, queinclui um fragmento de SEQ ID N0 1, pode quaisquer daquelasselecionadas acima, bem como outros fragmentos ou subseqüências que,ainda que não delineadas no presente relatório descritivo para finsde brevidade, vão ser prontamente evidentes para aquelesversados na técnica. Uma pessoa versada na técnica vai ser capazde selecionar um fragmento adequado, para uso nas concretizações, semexperimentação indevida, usando as orientações e procedimentosdescritos no presente relatório descritivo.

O termo "variante" se refere a uma proteína oupolipeptídio, no qual uma ou mais substituições, extinções e/ouinserções de aminoácidos estão presentes, comparadas com aseqüência de aminoácidos de uma proteína e inclui variaçõesalélicas naturais ou variantes de junções alternativas de umaproteína ou peptídio. O termo "variante" inclui a substituição deum ou mais aminoácidos em uma seqüência de peptídios com umou mais aminoácidos similares ou homólogos. Há muitas escalasnas quais os aminoácidos podem ser classificados como similaresou homólogos (Gunnar von Heijne, Sequence Analysis inMolecular Biology, p. 123 - 39 - Academic Press, Nova York,N.Y. 1987). As variantes preferidas incluem as substituições dealanina em uma ou mais posições dos aminoácidos. Outrassubstituições preferidas incluem as substituições conservadoras,que têm pouco ou nenhum efeito na carga líquida global,polaridade, ou hidrofobia da proteína. As substituiçõesconservadoras são apresentadas na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2

<table>table see original document page 19</column></row><table><table>table see original document page 20</column></row><table>A Tabela 3 mostra outro esquema desubstituição de aminoácidos.

Tabela 3

<table>table see original document page 20</column></row><table>Outras variantes podem consistir desubstituições menos conservadoras de aminoácidos, tal como aseleção de resíduos que diferem mais significativamente nos seusefeitos na manutenção de: (a) a estrutura do esqueleto poliméricode polipeptídio na área da substituição, por exemplo, como umaconformação em folha ou helicoidal; (b) a carga ou hidrofobia damolécula no sítio alvo; ou (c) a massa da cadeia lateral. Assubstituições, que são, em geral, esperadas ter um efeito maissignificativo na função, são aquelas nas quais: (a) glicina e/ouprolina é substituída por outro aminoácido ou é eliminada ouinserida; (b) um resíduo hidrofílico, por exemplo, serina outreonila, é substituído por um resíduo hidrofóbico, por exemplo,leucila, fenilalanina, valila, ou alanila; (c) um resíduo de cisteína ésubstituído por qualquer outro resíduo; (d) um resíduo tendo umacadeia lateral eletropositiva, por exemplo, lisila, arginila, ouhistidila, é substituído por um resíduo tendo uma cargaeletronegativa, por exemplo, glutamila ou aspartila; ou (e) umresíduo tendo uma cadeia lateral volumosa, por exemplo,fenilalanina, é substituído por um não tendo tal cadeia lateral, porexemplo, glicina. Outras variantes incluem aquelas elaboradaspara ou gerar um ou mais novos sítios de glicosilação e/oufosforilação, ou aquelas elaboradas para eliminar um ou maissítios de glicosilação e/ou fosforilação existentes. As variantesincluem pelo menos uma substituição de aminoácido em um sítiode glicosilação, um sítio de clivagem proteolítica e/ou um resíduode cisteína. As variantes também incluem proteínas e peptídioscom resíduos de aminoácidos adicionais, antes ou depois daseqüência de aminoácidos de proteínas ou peptídios nos peptídiosde ligação. Por exemplo, um resíduo de cisteína pode seradicionado em ambos os terminais amino e carbóxi de umpeptídio S05A, para permitir a ciclização do peptídio pelaformação de uma ligação de dissulfeto. O termo "variante"também abrange polipeptídios, que têm a seqüência deaminoácidos de um peptídio S05A com pelo menos um e até 25ou mais aminoácidos adicionais flanqueando a extremidade 3' ou5' do peptídio.

O termo "derivado" se refere a uma proteína oupolipeptídio modificado quimicamente, que tenha sidomodificado quimicamente por processos naturais, tal como porprocessamento e outras modificações pós-translacionais, mastambém por técnicas de modificação química, como, porexemplo, por adição de uma ou mais moléculas de poli (glicoletilênico), açúcares, fosfatos e/ou outras dessas moléculas, em quea ou as moléculas não são naturalmente presas nas proteínas dotipo silvestre ou peptídios S05A. Os derivados incluem sais. Essasmodificações químicas são bem descritas em textos básicos e emmonografias mais detalhadas, bem como em uma literatura depesquisa volumosa, e são bem conhecidas daqueles versados natécnica. Vai-se considerar que o mesmo tipo de modificação podeestar presente no mesmo ou em um grau variável em vários sítiosem uma dada proteína ou polipeptídio. Também, uma dadaproteína ou polipeptídio pode conter muitos tipos demodificações. As modificações podem ocorrer em qualquer lugarem uma proteína ou polipeptídio, incluindo o esqueletopolimérico do peptídio, as cadeias laterais dos aminoácidos e osterminais amino ou carboxila. As modificações incluem, porexemplo, acetilação, acilação, ribosilação com ADP, amidação,ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma parteheme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado denucleotídeo, ligação covalente de um lipídio ou derivado delipídio, ligação covalente de fosfotidilinositol, reticulação,ciclização, formação de ligação de dissulfeto, desmetilação,formação de reticulações covalentes, formação de cisteína,formação de piroglutamato, formilação, carboxilação gama,glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodação,metilação, miristoilação, oxidação, processamento proteolítico,fosforilação, prenilação, racemização, glicosilação, ligação delipídios, sulfatação, carboxilação gama de resíduos de ácidoglutâmico, hidroxilação e ribosilação com ADP, selenoilação,sulfatação, adição mediada por RNA de transferência deaminoácidos a proteínas, tais como arginilação e ubiquitinação.Consultar, por exemplo, "Proteins - Structure And MolecularProperties", 2a Ed., Τ. E. Creighton, W. H. Freeman andCompany, Nova York (1993) e Wold, F., nPosttranslationalProtein Modifications: Perspectives and Prospects," pp. 1 - 12 em"Posttranslational Covalent Modification Of Proteins", B. C.Johnson, Ed., Academic Press, Nova York (1983); Seifter et al.,Meth. Enzymol. 182:626 - 646 (1990) e Rattan et al., "ProteinSynthesis: Posttranslational Modifications and Aging," Ann. N.Y.Acad. Sei. 663: 48 - 62 (1992). 0 termo "derivados" inclui asmodificações químicas resultando na proteína ou polipeptídioficando ramificado ou cíclico, com ou sem ramificação. Asproteínas ou polipeptídios cíclicos, ramificados e circularesramificados podem resultar dos processos naturais de pós-translação, e podem ser produzidos também por processosinteiramente sintéticos.

O termo "homólogo" se refere a uma proteína,que é pelo menos 60 por cento idêntica na sua seqüência deaminoácidos de um peptídio S05A, como determinado pormétodos usuais, que são comumente usados para comparar asimilaridade em posição dos aminoácidos dos dois polipeptídios.O grau de similaridade ou identidade entre as duas proteínas podeser calculado prontamente por métodos conhecidos, incluindo,mas não limitado a, aqueles descritos em "ComputationalMolecular Biology", Lesk, A. M., ed., Oxford University Press,Nova York, 1988; "Biocomputing: Informatics and GenomeProjects", Smith, D. W., ed., Academic Press, Nova York, 1993;"Computer Analysis of Sequence Data, Part I", Griffin, A. M., eGriffín, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; "SequenceAnalysis in Molecular Biology", von Heinje, G., Academic Press,1987; "Sequence Analysis Primer", Gribskov, M. e Devereux, J.,eds., M Stockton Press, Nova York, 1991 ; e Carillo H. e Lipman,D., SIAM, J. Applied Math., 48:1073 (1988). Os métodospreferidos para determinar a identidade são elaborados para gerara maior semelhança entre as seqüências testadas. Os métodos paradeterminar a identidade e a similaridade são codificados emprogramas computadorizados disponíveis publicamente.

Os métodos de programas computadorizadospreferidos, úteis na determinação da identidade e da similaridadeentre duas seqüências, incluem, mas não são limitados a, o pacotede programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research,12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, e FASTA, Atschul, S. F.et al., J. Molec. Biol., 215: 403 - 410 (1990). O programa BLASTX é publicamente disponível da NCBI e de outras fontes (BLASTManual, Altschul, S., et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md.20894; Altschul, S., et al, J. MoI. Biol., 215: 403 - 410 (1990).Por meio de exemplo, usando um algoritmo de computador, talcomo do GAP (Genetic Computer Group, Universidade deWisconsin, Madison, Wis.), as duas proteínas são alinhadas paraótima similaridade dos seus respectivos aminoácidos (a"varredura igualada", determinada pelo algoritmo).

Uma penalidade de abertura de vão (que écalculado como 3 vezes a diagonal média; a "diagonal média" é amédia da diagonal da matriz de comparação sendo usada; a"diagonal" é o escore ou número atribuído a cada comparaçãoperfeita de aminoácido pela matriz de comparação particular), euma penalidade de extensão de vão (que é usualmente {fração(1/10)} vezes a penalidade de abertura de vão), bem como amatriz de comparação, tal como PAM 250 ou BLOSUM 62, sãousadas em conjunto com o algoritmo. Uma matriz de comparaçãopadrão (consultar Dayhoff et al. em: "Atlas of Protein Sequenceand Structure", vol. 5, supp. 3 para a matriz de comparaçãoPAM250; consultar Henikoff et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA,89:10915 - 10919 para a matriz de comparação BLOSUM 62)também pode ser usada para o algoritmo. A identidade percentualé então calculada pelo algoritmo. Os homólogos vão tertipicamente uma ou mais substituições, extinções e/ou inserçõesde aminoácidos, comparados com a proteína ou peptídio decomparação, como pode ser o caso.

O termo "proteína de fusão" se refere a umaproteína, na qual um ou mais peptídios são fundidosrecombinantemente ou conjugados quimicamente (incluídocovalentemente e não covalentemente) em uma proteína, tal como(mas não limitada a) um anticorpo ou fragmento de anticorpo,como um fragmento F.sub.ab ou Fv de cadeia curta. O termo"proteína de fusão" também se refere a multímeros (isto é,dímeros, trímeros, tetrâmeros e multímeros superiores) depeptídios. Esses multímeros compreendem multímeroshomoméricos compreendendo um peptídio, multímerosheteroméricos compreendendo mais de um peptídio, e multímerosheteroméricos compreendendo pelo menos um peptídio e pelomenos uma outra proteína. Esses multímeros podem resultar deassociações, combinações ou ligações hidrofóbicas, hidrofílicas,iônicas e/ou covalentes, e podem ser formados por reticulaçõesusando moléculas de ligação ou podem ser ligados diretamentepor, por exemplo, formação de lipossomos.O termo "peptídio mimético" ou "mimético" serefere a compostos biologicamente ativos que simulam aatividade biológica de um peptídio ou proteína, mas não maispeptídicos em natureza química, isto é, não mais contêmquaisquer ligações de peptídios (isto é, ligações de amidas entreos aminoácidos). No presente relatório descritivo, o termomimético peptídico é usado em um sentido mais amplo paraincluir moléculas, que não são mais de natureza completamentepeptídica, tais como os pseudopeptídios, semipeptídios epeptóides. Os exemplos de miméticos de peptídios nesse sentidomais amplo (nos quais parte de um peptídio é substituída por umaestrutura carente de ligações de peptídios) são descritos abaixo.Se completa ou parcialmente não peptídios, os miméticos depeptídios, de acordo com as concretizações, proporcionam umadisposição espacial de partes químicas reativas que lembrambastante a disposição tridimensional de grupos ativos no peptídiono qual o mimético de peptídio é baseado. Em conseqüência dageometria de sítio ativo similar, o mimético de peptídio temefeitos nos sistemas biológicos, que são similares à atividadebiológica do peptídio.

Os miméticos de peptídios das concretizaçõessão, de preferência, substancialmente similares em ambas a formatridimensional e a atividade biológica para os peptídios descritosno presente relatório descritivo. Os exemplos de métodos demodificação estrutural de um peptídio conhecidos na técnica, paracriar um mimético de peptídio, incluem a inversão de centrosquirais do esqueleto polimérico, gerando estruturas de resíduos deaminoácidos D, que podem, particular na terminação N, provocaruma melhor estabilidade para a degradação proteolítica, semafetar adversamente a atividade. Um exemplo é dado no artigonTritriated D - ala.sup.l - Peptide T Binding", Smith C. S. et ai,Drug Development Res., 15, pp. 371 - 379 (1988). Um segundométodo é a alteração da estrutura cíclica para estabilidade, taiscomo imidas e lactamas de cadeias cruzadas NaC (Ede et al. emSmith and Rivier (Eds.) "Peptides: Chemistry and Biology",Escom, Leiden (1991), pp. 268 - 270). Um exemplo desse é dadoem conformidade limitada com os compostos similares atimopentina, tais como aqueles descritos na patente U.S.4.457.489 (1985), Goldstein, G et al., cuja descrição éincorporada na sua totalidade por referência no presente relatóriodescritivo. Um terceiro método é substituir as ligações depeptídios no peptídio por pseudoligações de peptídios, queconferem resistência a proteólise.

Várias pseudoligações de peptídios foramdescritas, que, em geral, não afetam a estrutura e a atividadebiológica dos peptídios. Um exemplo dessa abordagem ésubstituir as pseudoligações de peptídios retroinversas("Biologically active retroinverso analogues of thymopentin",Sisto A. et al in Rivier, J. E. and Marshall, G. R. (eds) "Peptides,Chemistry, Structure and Biology", Escom, Leiden (1990), pp.722 - 773) e Dalpozzo, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res.,41 :561 - 566, incorporados por referência no presente relatóriodescritivo). De acordo com essa modificação, as seqüências deaminoácidos dos peptídios podem ser idênticas às seqüências deum peptídio descritas acima, exceto que uma ou mais das ligaçõesde peptídios são substituídas por uma pseudoligação de peptídioretroinversa. De preferência, a maior parte da ligação de peptídiona terminação N é substituída, uma vez que uma substituição vaiconferir resistência a proteólise por exopeptidases agindo naterminação N. Outras modificações também podem ser feitas porsubstituição dos grupos químicos dos aminoácidos com outrosgrupos químicos de estrutura similar. Outra pseudoligação depeptídio adequada, que é conhecida por melhorar a estabilidade aclivagem enzimática, sem ou com pouca perda de atividadebiológica, é a pseudoligação de peptídio isóstera (Couder, et al.(1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41 :181 - 184, aquiincorporado na sua totalidade por referência).

Desse modo, as seqüências de aminoácidosdesses peptídios podem ser idênticas às seqüência de um peptídio,exceto que uma ou mais das ligações de peptídios são substituídaspor uma pseudoligação de peptídio isóstera. De preferência, amaior parte da ligação de peptídio na terminação N é substituída,uma vez que essa substituição vai conferir resistência a proteólisepor exopeptidases agindo na terminação Ν. A síntese de peptídioscom uma ou mais pseudoligações de peptídios isósteras éconhecida na técnica (Couder, et al. (1993), citado acima). Outrosexemplos incluem a introdução de ligações de cetometileno oumetilsulfeto para substituir as ligações de peptídios.Os derivados de peptóides representam umaoutra classe de miméticos de peptídios, que mantêm osdeterminantes estruturais importantes para a atividade biológica,ainda eliminam as ligações de peptídios, conferindo, desse modo,resistência a proteólise (Simon, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei.USA, 89:9367 - 9371 , incorporado no presente relatóriodescritivo por referência na sua totalidade). Os peptóides sãooligômeros de glicinas N-substituídas. Vários grupos N-alquilaforam descritos, cada um deles correspondendo à cadeia lateral deum aminoácido natural (Simon, et al., 1992, citado acima).Alguns dos aminoácidos dos peptídios podem ser substituídoscom glicina N-substituída correspondente ao aminoácidosubstituído.

O termo "mimético de peptídio" ou "mimético"também inclui peptídio D reversos e enantiômeros, comodefinidos abaixo.

O termo "peptídio D reverso" se refere a umaproteína biologicamente ativa de peptídio, consistindo deaminoácidos D dispostos em uma ordem reversa, comparado aseqüência de aminoácidos L de um peptídio. Desse modo, oresíduo de terminação carbóxi de um peptídio de aminoácido L setorna com terminação amino para o peptídio de aminoácido D, eassim por diante. Por exemplo, o peptídio, ETESH, se transformaem HdSbEdTdEd, em que Ed, Hd, Sd e Td são aminoácidos Dcorrespondentes aos aminoácidos L, Ε, H, S e T, respectivamente.O termo "enantiômero" se refere a uma proteínaou peptídio biologicamente ativo, em que um ou mais dosresíduos de aminoácidos L na seqüência de aminoácidos de umpeptídio são substituídos com o ou os resíduos de aminoácidos D.

Uma "composição", como usado no presenterelatório descritivo, se refere, de uma maneira geral, a qualquercomposição contendo um peptídio ou uma seqüência deaminoácidos relacionado. A composição pode compreender umaformulação seca, uma solução aquosa, ou uma composição estéril.As composições compreendendo peptídios podem ser empregadascomo sondas de hibridização. As sondas podem ser armazenadasem uma forma seca por congelamento e podem ser associadascom um agente estabilizador, tal como um carboidrato. Nashibridizações, a sonda pode ser colocada em uma solução aquosacontendo sais, por exemplo, NaCl, detergentes, por exemplo,dodecilsulfato de sódio (SDS), e outros componentes, porexemplo, solução de Denhardt, leite em pó, DNA de esperma desalmão, etc.

As concretizações são dirigidas a umacomposição compreendendo peptídios S05A, como definidosacima nessa concretização.

Além do mais, as concretizações incluem outrasproteínas, que contêm no todo ou em parte um peptídio S05A, emque as proteínas possuem, de preferência, a mesma, uma similarou uma melhor bioatividade que o peptídio. Usando asorientações proporcionadas no presente relatório descritivo, umapessoa versada na técnica pode sintetizar proteínas específicas,com base na seqüência de aminoácidos para qualquer peptídioS05A verificado como sendo um agente efetivo para provocarmorte celular, e testá-las para eficiência como agentes paraprovocar morte celular.

Outras seqüências de peptídios derivadas de umpeptídio S05A, verificadas como sendo um agente efetivo paraprovocar morte celular, também podem ser agentes efetivos paraprovocar morte celular. Uma pessoa versada na técnica pode,usando as orientações proporcionadas no presente relatóriodescritivo, sintetizar sem experimentação indevida fragmentos deuma varredura de peptídios efetiva por toda a seqüência deaminoácidos dessa proteína, para identificar outras seqüências depeptídios efetivas.

Os peptídios S05A das concretizaçõesparticularmente preferidas incluem, mas não são limitadas a, asseguintes:

SEQ ID N0 2 IDQQVLSRI Ile - Asp - Gln - Gln - Val - Leu - Ser - Arg - lie;SEQ ID N°3 KLEKRCL Lys-Leu-Glu-De-Lys-Aig-Cys-Leu;SEQ JD N°4 VLSRIK Val-Leu-So--Aig-De-Lys;SEQ ID N0 5 RIKLEIK Arg - Ile - Lys - Leu - Glu - Ile - Lys - Arg;SEQ ID N0 6 VLSRIKLEIKRCL Val-Leu-Ser-Arg-De-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Aig-C^s-Leu; eSEQIDN0? IDQQVLSRKLEI De-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Aig-De-Lys-Leu-Glu-De.

Vai ser evidente para aqueles versados natécnica que outros fragmentos menores dos peptídios S05A acimapodem ser selecionados, de modo que esses peptídios possuam amesma ou uma atividade biológica similar. Outros fragmentosdeles podem ser selecionados por aqueles versados na técnica, demodo que esses peptídios possuam a mesma ou uma atividadebiológica similar. Os peptídios das concretizações abrangem essesoutros fragmentos. Em geral, os peptídios das concretizações têmpelo menos 6 aminoácidos, de preferência, pelo menos 5aminoácidos, e, particularmente, pelo menos 4 aminoácidos.

As concretizações também abrangem ospeptídios S05A, compreendendo dois ou mais peptídios S05Aunidos. Desde que um peptídio S05A tenha a atividade biológicadesejada, segue que dois desses peptídios vão também possuir aatividade biológica desejada.

Os peptídios S05A e os seus fragmentos,variantes, derivados, homólogos, proteínas de fusão e miméticosabrangidos por essa concretização podem ser preparados usandoprocessos conhecidos daqueles versados na técnica, tal comotecnologia de DNA recombinante, síntese de proteínas eisolamento de peptídios naturais, proteínas, proteína AD7c e seusfragmentos, variantes, derivados e homólogos.

Os peptídios S05A e os seus fragmentos,variantes, derivados, homólogos, proteínas de fusão e miméticospodem ser preparados de outros peptídios, proteínas e seusfragmentos, variantes derivados e homólogos, usando osprocessos conhecidos daqueles versados na técnica. Essesprocessos incluem (mas não são limitados a) o uso de proteasespara clivar o proteína, ou proteína nos peptídios S05A desejados.Um peptídio S05A pode ser preparado usandoos processos da tecnologia de DNA recombinante bemconhecidos, tais como aqueles apresentados por Sambrook et ai.Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. e/ou Ausubel et al.,eds., Current Protocols in Molecular BioIogy, Green PublishersInc. e Wiley and Sons, N.Y..

Um gene ou um cDNA codificando um peptídioS05A pode ser obtido, por exemplo, por triagem de umabiblioteca genômica ou de cDNA, ou por amplificação PCR.Sondas de iniciadores, úteis para triagem da biblioteca, podem sergeradas com base nas informações das seqüências para outrosgenes ou fragmentos de genes conhecidos dos mesmos ou de umafamília relacionada de genes, tais como, por exemplo, os motivosmantidos encontrados em outros peptídios ou proteínas. Alémdisso, quando um gene codificando um peptídio S05A éidentificado, todo ou uma parte desse gene pode ser usado comouma sonda para identificar genes homólogos. As sondas ouiniciadores podem ser usados para triar bibliotecas de cDNA devárias fontes de tecidos acreditadas como expressando um genede peptídio S05A. Tipicamente, as condições de alta gravidadevão ser empregadas para minimizar o número de positivos falsosobtidos da tela.

Outro meio para preparar um gene codificandoum peptídio S05A é o de empregar síntese química usandoprocessos bem conhecidos daqueles versados na técnica, taiscomo aqueles descritos por Engels et al., Angew. Chem. Intl. Ed.,28:716 - 734. Esses processos incluem, entre outros, a síntese defosfotriéster, fosforamidita e de fosfonato ácido para a síntese deácido nucléico. Um processo preferido para essa síntese química éuma síntese suportada por polímero usando química defosforamidita usual. Tipicamente, o DNA codificando umpeptídio ou proteína vai ser várias centenas de nucleotídeos emcomprimento. Os ácidos nucléicos maiores do que cerca de 100nucleotídeos podem ser sintetizados como vários fragmentosusando esses processos. Os fragmentos podem ser depois ligadosentre si, para formar o peptídio ou proteína de comprimento total.Usualmente, o fragmento de DNA codificando a terminaçãoamino da proteína vai ter um TG, que codifica um resíduo demetionina. Essa metionina pode estar ou não presente na formamadura da proteína ou peptídio, dependendo se a proteínaproduzida na célula hospedeira é elaborada para ser secretadadaquela célula.

O gene, cDNA, ou seu fragmento codificando opeptídio S05A, pode ser inserido em um vetor de expressão ouamplificação adequado, usando técnicas de ligação usuais. Ovetor é tipicamente selecionado para ser funcional na célulahospedeira particular empregada (isto é, o vetor é compatível como maquinário da célula hospedeira, de modo que a amplificaçãodo gene e/ou a expressão do gene possa ocorrer). O gene, cDNAou seu fragmento, codificando o peptídio S05A, pode seramplificado / expresso em células hospedeiras eucarióticas, delevedura, de inseto (sistemas baculovírus) e/ou eucarióticas. Aseleção da célula hospedeira vai depender, em parte, de se opeptídio S05A vai ser glicosilado e/ou fosforilado. Sendo assim,células hospedeiras de levedura, inseto ou de mamíferos são aspreferíveis.

Tipicamente, os vetores usados em quaisquerdas células hospedeiras vão conter pelo menos uma seqüência deflanqueamento 5' (também referida como um promotor) e tambémoutros elementos regulatórios, tal como um ou mais agentes deintensificação, uma origem de elemento de replicação, umelemento de terminação transcricional, uma seqüência completade introns contendo um sítio de junção de doador e aceitador, umaseqüência de peptídios de sinal, um elemento de sítio de ligaçãode ribossomos, uma seqüência de polialdenilação, uma região desítio de policlonagem para inserção do ácido nucléico codificandoo polipeptídio a ser expresso, e um elemento marcadorselecionável. Cada um desses elementos é discutido abaixo.Opcionalmente, o vetor pode conter uma seqüência deidentificação, isto é, uma molécula de oligonucleotídeo localizadana extremidade 5' ou 3' da seqüência de codificação de proteínaou peptídio; a molécula de oligonucleotídeo codifica poliHis (talcomo hexaHis), ou outra identificação, tal como FLAG, HÁ(vírus de gripe de hemaglutinina) ou myc para os quais existemanticorpos disponíveis comercialmente. Essa identificação étipicamente fundida no polipeptídio por expressão dopolipeptídio, e pode servir como um meio para purificação deafinidade da proteína ou peptídio da célula hospedeira. Apurificação de afinidade pode ser feita, por exemplo, porcromatografia em coluna usando anticorpos contra aidentificação, como uma matriz de afinidade. Opcionalmente, aidentificação pode ser removida subseqüentemente da proteína oupeptídio purificado por vários meios, tal como por uso de certaspeptidases.

A articulação de imunoglobulina humana e aregião Fc podem ser fundidas na terminação N ou na terminaçãoC por uma pessoa versada na técnica. A proteína de fusão Fcsubseqüente pode ser purificada por uso de uma coluna deafinidade de proteína A. Fc é conhecido por apresentar uma meiavida farmacocinética longa in vivo, e verificou-se que as proteínasfundidas em Fc apresentam uma meia vida substancialmentemaior in vivo do que a contraparte não fundida. Também, a fusãona região Fc permite a dimerização / multimerização da molécula,o que pode ser útil para a bioatividade de algumas moléculas.

A seqüência de flanqueamento 5' pode serhomóloga (isto é, da mesma espécie e/ou cepa que da célulahospedeira), heteróloga (isto é, de espécie diferente daquela daespécie de célula hospedeira ou cepa), híbrida (isto é, umacombinação de seqüências de flanqueamento 5' de mais de umafonte), sintética, ou pode ser a seqüência de flanqueamento 5' dogene da proteína ou peptídio nativa. Como tal, a fonte daseqüência de flanqueamento 5' pode ser qualquer organismoprocariótico ou eucariótico unicelular, qualquer organismovertebrado ou invertebrado, ou qualquer vegetal, desde que aseqüência de flanqueamento 5' seja funcional no, e possa serativada por, o maquinário da célula hospedeira.

As seqüências de flanqueamento 5' úteis nosvetores dessa concretização podem ser obtidas por quaisquer dosvários processos bem conhecidos na técnica. Tipicamente, asseqüências de flanqueamento 5' úteis na presente invençãodiferentes da seqüência de flanqueamento de genes de proteínasou peptídios vão ter sido previamente identificadas pormapeamento e/ou por restrição de digestão de endonuclease epodem ser, desse modo, isoladas da fonte de tecido adequada,usando as endonucleases de restrição adequadas. Em algunscasos, a seqüência de nucleotídeos integral da seqüência deflanqueamento 5' podem ser conhecida. Na presente invenção, aseqüência de flanqueamento 5' pode ser sintetizada por uso dosprocessos descritos acima para síntese ou clonagem de ácidonucléico.

Quando toda ou apenas uma parte da seqüênciade flanqueamento 5' é conhecida, ela pode ser obtida por uso dePCR e/ou por triagem de uma biblioteca genômica comfragmentos de seqüência de flanqueamento 5' e/ou deoligonucleotídeos adequados da mesma ou de outra espécie.

Quando a seqüência de flanqueamento 5' não éconhecida, um fragmento de DNA contendo uma seqüência deflanqueamento 5' pode ser isolado de um maior pedaço de DNA,que pode conter, por exemplo, uma seqüência de codificação oumesmo outro ou outros genes. O isolamento pode ser feito porrestrição de digestão de endonuclease, usando uma ou maisenzimas selecionadas cuidadosamente, para isolar o fragmento deDNA adequado. Após digestão, o fragmento desejado pode serisolado por purificação por gel de agaros, coluna de Qiagen® oupor outros métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Aseleção das enzimas adequadas para atingir esse fim vai serfacilmente evidente para aqueles versados na técnica.

A origem do elemento de replicação é,tipicamente, uma parte de vetores de expressão procarióticosadquiridos comercialmente, e ajuda na amplificação do vetor emuma célula hospedeira. A amplificação do vetor a um certonúmero de cópias pode ser, em alguns casos, ser importante para aexpressão ótima da proteína ou peptídio. Se o vetor de seleçãonão contiver uma origem do sítio de replicação, pode sersintetizado quimicamente, com base em uma seqüênciaconhecida, e ligado ao vetor. O elemento de terminação detranscrição é, tipicamente, localizado em 3' da extremidade daseqüência de codificação da proteína ou peptídio e serve paraterminar a transcrição da proteína ou peptídio. Usualmente, oelemento de terminação de transcrição em células procarióticas éum fragmento rico em G - C, seguido por um seqüência poli T.Ainda que o elemento possa ser clonado de uma biblioteca ouadquirido comercialmente como parte de um vetor, pode sertambém facilmente sintetizado usando processos para a síntese deácido nucléico, tais como aqueles descritos acima.Um elemento de gene marcador selecionávelcodifica uma proteína necessária para a sobrevivência e ocrescimento de uma célula hospedeira, crescida em um meio decultura seletivo. Os genes marcadores de seleção típicoscodificam as proteínas que: (a) conferem resistência a antibióticosou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, tetraciclina, oucanamicina para células hospedeiras procarióticas; (b)complementam as deficiências auxotróficas da célula; ou (c)suprem os nutrientes críticos não disponíveis dos meioscomplexos. Os marcadores selecionáveis preferidos são o gene deresistência canamicina, o gene de resistência ampicilina e o genede resistência tetraciclina.

O elemento de ligação ribossomo, comumentechamado a seqüência de Shine - Dalgarno (procariotas) ou asuperfície de Kozak (eucariotas), é usualmente necessário para ainiciação por translação de mRNA. O elemento é tipicamentelocalizado em 3' para o promotor e em 5' para a seqüência decodificação da proteína ou peptídio a ser sintetizado. A seqüênciade Shine - Dalgarno é variada, mas é, tipicamente, uma polipurina(isto é, tento um alto teor de A - G). Muitas seqüências de Shine -Dalgarno foram identificadas, cada uma das quais pode serfacilmente sintetizada usando processos apresentados acima eusados em um vetor procariótico.

Naqueles casos nos quais é desejável que umpeptídio S05A seja secretado da célula hospedeira, uma seqüênciade sinais pode ser usada para dirigir o peptídio para fora da célulahospedeira, na qual é sintetizado, e parte de terminação carbóxi daproteína pode ser eliminada, para impedir ancoragem namembrana. Tipicamente, a seqüência de sinais é posicionada naregião de codificação do gene do peptídio S05A ou cDNA, oudiretamente na extremidade 5' da região de codificação de genesde peptídios. Muitas seqüências de sinais foram identificadas, equaisquer delas, que são funcionais na célula hospedeiraselecionada, podem ser usadas em conjunto com o gene depeptídio ou cDNA. Portanto, a seqüência de sinais pode serhomóloga ou heteróloga para o gene de peptídio ou cDNA, e podeser homóloga ou heteróloga para o gene de peptídio ou cDNA.Adicionalmente, a seqüência de sinais pode ser sintetizadaquimicamente, usando os processos apresentados acima. Namaior parte dos casos, a secreção do polipeptídio da célulahospedeira, pela presença de um peptídio de sinal, vai resultar naremoção da metionina com terminação amino do polipeptídio.

Em muitos casos, a transcrição do gene depeptídio ou cDNA é aumentada pela presença de um ou maisintrons no vetor; isso é particularmente verdade quando o peptídioé produzido em células hospedeiras eucarióticas, especialmente,células hospedeiras de mamíferos. Os introns usados podem sernaturais dentro do gene de peptídio, especialmente quando o geneusado é uma seqüência genômica de comprimento integral de umfragmento dele. Quando o intron não é natural dentro do gene(como para a maior parte dos cDNAs), o ou os introns podem serobtidos de outra fonte. A posição do intron com relação a essaseqüência de flanqueamento e ao gene de peptídio é importante,pois o intron deve ser transcrito para que seja efetivo. Como tal,quando o gene de peptídio inserido no vetor de expressão é umamolécula de cDNA, a posição preferida para o intron é 3' para osítio de início de transcrição, e 5' para a seqüência de terminaçãode transcrição de poli A. De preferência, para o peptídio cDNA, oou os introns vão ser localizados em um lado ou no outro (isto é,5' ou 3') do cDNA, de modo que não interrompa essa seqüênciade codificação. Qualquer intron de qualquer fonte, incluindoquaisquer organismos virais, procarióticos e eucarióticos (vegetaisou animais), pode ser usado para a prática dessa concretização,desde que seja compatível com a ou as células hospedeiras nasquais é inserido. Também são incluídos na presente invenção osintrons sintéticos. Opcionalmente, mais de um intron pode serusado no vetor.

Quando um ou mais dos elementos apresentadosacima não estão ainda presentes no vetor a ser usado, podem serindividualmente obtidos e ligados ao vetor. Os processos usadospara a obtenção de cada um dos elementos são bem conhecidosdaqueles versados na técnica e são comparáveis aos processosapresentados acima (isto é, síntese do DNA, triagem de bibliotecae assemelhados).

Os vetores finais usados para a prática dessaconcretização podem ser construídos de vetores de partida, talcomo um vetor comercialmente disponível. Esses vetores podemconter ou não alguns dos elementos que vão ser incluídos no vetorcompleto. Se nenhum dos elementos presentes está presente novetor de partida, cada elemento pode ser ligado individualmenteao vetor, por corte do vetor com a ou as endonucleases derestrição adequadas, de modo que as extremidades do elementosejam ligadas e as extremidades do vetor sejam compatíveis paraligação. Em alguns casos, pode ser necessário cegar asextremidades para que sejam ligadas entre si, para obter umaligação satisfatória. O cegamento é feito primeiramente porenchimento em "extremidades aderentes" usando polimerase deDNA Klenow ou polimerase de DNA T4, na presença de todos osquatro nucleotídeos. Esse procedimento é bem conhecido natécnica e é descrito, por exemplo, por Sambrook et al., supra.Alternativamente, dois ou mais desses elementos, que vão serinseridos no vetor, podem ser primeiramente ligados entre si (sevão ser posicionados adjacentes entre si) e depois ligados aovetor.

Um processo adicional para a construção dovetor é conduzir todas as ligações dos vários elementossimultaneamente em uma mistura reacional. Na presenteinvenção, muitos vetores absurdos ou não funcionais vão sergerados, devido à ligação ou inserção inadequada dos elementos,embora, o vetor funcional possa ser identificado e selecionado pordigestão de endonuclease de restrição.

Os vetores preferidos para a prática dessaconcretização são aqueles que são compatíveis com as célulashospedeiras bacterianas, de insetos e de mamíferos. Esses vetoresincluem, entre outros, pCRII, pCR3, e pcDNA3.1 (InvitrogenCompany, San Diego, Calif.), pBSII (Stratagene Company, LaJolla, Calif.), pET15b (Novagen, Madison, Wis.), PGEX(Pharmacia Biotech, Piscataway, N. J.), pEGFP - N2 (Clontech,Palo Alto, Calif.), pETL (BlueBachl; Invitrogen), e pFastBacDual(Gibco/BRL, Grand Island, N. Y.).

Após o vetor ter sido construído e uma moléculade ácido nucléicos codificando a proteína ou peptídio decomprimento integral ou truncado ter sido inserida no sítioadequado do vetor, o vetor completo pode ser inserido em umacélula hospedeira adequada, para amplificação e/ou expressão depolipeptídio. As células hospedeiras podem ser célulashospedeiras procarióticas (tal como E. coli) ou célulashospedeiras eucarióticas (tal como uma célula de levedura, umacélula de inseto ou uma célula de vertebrado). A célulahospedeira, quando cultivada sob condições adequadas, podesintetizar proteína ou peptídio, que pode ser coletadosubseqüentemente do meio de cultura (se a célula hospedeirasecretá-lo no meio) ou diretamente da célula hospedeiraproduzindo-o (se não for secretado).

Após coleta, o peptídio S05A pode serpurificado usando processos, tais como cromatografia de peneiramolecular, cromatografia de afinidade e assemelhados. A seleçãoda célula hospedeira para a produção de proteína ou peptídio vaidepender em parte se o peptídio vai ser glicosilado ou fosforilado(em cujo caso, as células hospedeiras procarióticas são aspreferidas), e a maneira na qual a célula hospedeira é capaz deformar prega no peptídio na sua estrutura terciária nativa (porexemplo, orientação adequada de pontes de dissulfeto, etc.), demodo que a proteína biologicamente ativa for preparada pelopeptídio, que tem atividade biológica, o peptídio pode formarprega, após síntese usando condições químicas adequadas, comodiscutido abaixo. As células ou linhas celulares adequadas podemser células de mamíferos, tais como células de ovário de hamsterchinês (CHO), células 293, 293T, ou células 3T3 de rimembriônico humano (HEK). A seleção de células hospedeiras demamíferos e os processos para transformação, cultura,amplificação, triagem e produção e purificação de produtoadequados são conhecidos na técnica. Outras linhas celulares demamíferos adequadas são as linhas celulares COS-I e COS-7 e alinha celular CV-I de macacos. Outras células hospedeiras demamíferos exemplificativas incluem linhas celulares de primatase linhas celulares de roedores, incluindo as linhas celularestransformadas. As células diplóides normais, as cepas celularesderivadas de cultura in vitro de tecido primário, bem comoexplantes primários, também são adequadas. As célulascandidatas podem ser deficientes genotipicamente no gene deseleção, ou podem conter um gene de seleção agindodominantemente. Outras linhas celulares de mamíferos adequadasincluem, mas não são limitadas a, células N2A de neuroblastomade camundongo, HeLa, células L-929 de camundongo, linhas 3T3derivadas de camundongos suíço, Balb-c ou NIH, linhas celularesde hamster BHK ou HaK.

Similarmente úteis como as células hospedeirasadequadas para as presentes concretizações são as célulasbacterianas. Por exemplo, as várias cepas de E. coli (por exemplo,HBlOl , DH5.alfa., DH10, e MC1061) são bem conhecidas comocélulas hospedeiras no campo da biotecnologia. Várias cepas deB. subtilis, Pseudomonas spp., outro Bacillus spp., Streptomycesspp. e assemelhados também podem ser empregadas nesseprocesso. Muitas cepas de células de levedura, conhecidasdaqueles versados na técnica, também estão disponíveis como ascélulas hospedeiras para expressão dos polipeptídios daspresentes concretizações.

Adicionalmente, quando desejado, os sistemasde células de insetos podem ser utilizados nos processos daspresentes concretizações. Esses sistemas são descritos, porexemplo, por Kitts et al. (Biotechniques, 14:810 - 817 ), Lucklow(Curr. Opin. Biotechnol., 4:564 - 572 ) e Lucklow et al. (J. Virol.,67:4566 - 4579 ). As células de insetos preferidas são Sf- 9 andHi5 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.).

A inserção (também referida comotransformação ou transfecção) do vetor na célula hospedeiraselecionada pode ser feita por uso desses processos, como oprocesso de cloreto de cálcio, eletroporação, microinjeção,lipofecção, ou DEAE - dextrana. O processo selecionado vai ser,em parte, uma função do tipo de célula hospedeira a ser usada.Esses processos e outros processos adequados são bemconhecidos daqueles versados na técnica e são apresentados, porexemplo, por Sambrook et ai, supra.

As células hospedeiras contendo o vetor (isto é,transformadas ou transfectadas) podem ser cultivadas usandomeios usuais bem conhecidos daqueles versados na técnica. Osmeios vão conter, usualmente, todos os nutrientes necessáriospara o crescimento e a sobrevivência das células. Os meiosadequados para a cultura de células E. coli são, por exemplo,Caldo Luria (LB) e/ou Caldo Terrific (TB). Os meios adequadospara cultura de células eucarióticas são RPMI 1640, MEM,DMEM, todos podendo ser suplementados com soro e/ou fatoresde crescimento, como requerido pela linha celular particularsendo cultivada. Um meio adequado para culturas de insetos é omeio Grace suplementado com pó de extrato de levedura("yeastolate"), hidrolisado de lactalbumina e/ou soro fetal debezerro, quando necessário. Tipicamente, um antibiótico ou outrocomposto útil para o crescimento seletivo das célulastransformadas é apenas adicionado como um suplemento para osmeios. O composto a ser usado vai ser ditado pelo elementomarcador selecionável, presente no plasmídeo com o qual a célulahospedeira foi transformada. Por exemplo, quando o elementomarcador selecionável é resististe a canamicina, o compostoadicionado ao meio de cultura vai ser canamicina.

A quantidade de peptídio S05A produzida nacélula hospedeira pode ser avaliada por uso de processosconhecidos na técnica. Esses processos incluem, sem limitação,análise da mancha ocidental, eletroforese de SDS - gel depoliacrilamida, eletroforese de gel não desnaturante, separaçãopor HPLC, espectroscopia de massa, imunoprecipitação, e/ouensaios de atividade, tais como ensaios de deslocamento de gel deligação de DNA.

Se a proteína ou o peptídio tiver sido elaboradopara ser secretado das células hospedeiras, a grande parte daproteína ou do peptídio pode ser encontrada no meio culturalcelular. As proteínas preparadas desse modo não vão possuir,tipicamente, uma metionina com terminação amino, pois ela éremovida durante a secreção da célula. Se, no entanto, a proteínaou o peptídio não for secretado das células hospedeiras, vai estarpresente no citoplasma e/ou no núcleo (para as célulashospedeiras eucarióticas) ou citosol (para células hospedeiras debactérias gram-positivas) e pode ter uma metionina comterminação amino.

Para um peptídio S05A situado no citoplasmae/ou núcleo da célula hospedeira, as células hospedeiras sãotipicamente primeiro despedaçadas mecanicamente ou comdetergente, para liberar o conteúdo intracelular em uma soluçãotamponada. O peptídio pode ser depois isolado dessa solução.

A purificação dos peptídios S05A da soluçãopode ser feita por uso de várias técnicas. Se o peptídio S05A tiversido sintetizado, de modo que contenha uma identificação, talcomo hexa-histidina (por exemplo, peptídio / hexaHis) ou outropequeno peptídio tal como FLAG (Sigma - Aldrich, St. Louis,Mo.) ou peptídio de ligação de calmodulina (Stratagene, La JoIIa,Calif.) em qualquer uma das suas terminações de carboxila ouamino, pode ser essencialmente purificado em um processo deuma etapa, por passagem da solução por uma coluna de afinidade,na qual a matriz da coluna tem uma alta afinidade para aidentificação ou para a proteína diretamente (isto é, um anticorpomonoclonal reconhecendo especificamente o peptídio). Porexemplo, poliistidina se liga com grande afinidade eespecificidade a níquel, zinco e cobalto; desse modo,cromatografia de afinidade de íon metálico imobilizado, queemprega uma resina de afinidade à base de níquel (como usada nosistema QIAexpress da Qiagen ou o sistema Xpress daInvitrogen) ou uma resina de afinidade à base de cobalto (comousada no sistema Talon da BD Biosciences-CLONTECH) podeser usada para a purificação de peptídio / poliHis. (Consultar, porexemplo, Ausubel et al., eds., Current Protocols in MolecularBiology, Seção 10.11.8, John Wiley & Sons, Nova York).

Quando o peptídio S05A é preparado sem umaidentificação anexada, e nenhum anticorpo está disponível, outrosprocedimentos bem conhecidos para purificação podem serusados. Esses procedimentos incluem, sem limitação,cromatografia de troca iônica, cromatografia de hidroxiapatita,cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de peneiramolecular, HPLC, eletroforese de gel nativo em combinação comeluição com gel, e focalização isoelétrica preparatória (máquina /técnica Isoprime, Hoefer Scientific). Em alguns casos, duas oumais dessas técnicas podem ser combinadas para obtenção de umamaior pureza.

Prevê-se que o peptídio S05A vai serencontrado, basicamente, intracelularmente, o materialintracelular (incluindo os corpos de inclusão para bactérias gram-negativas) pode ser extraído da célula hospedeira, usandoqualquer técnica usual conhecida daqueles versados na técnica.Por exemplo, as células hospedeiras podem ser Usadas paraliberar o conteúdo do periplasma / citoplasma por um prensafrancesa, homogeneização e/ou aplicação de ultra-som, seguidapor centrifugação. Se o peptídio tiver formado corpos de inclusãono citosol, os corpos de inclusão podem, freqüentemente, serligados às membranas celulares internas e/ou externas, e, dessemodo, vão ser encontrados basicamente no material em pelotas,após a centrifugação. O material em pelotas pode ser depoistratado a extremos de pH ou com agente caotrófico, tal como umdetergente, guanidina, derivados de guanidina, uréia, ou derivadosde uréia, na presença de um agente redutor, tal como ditiotreitol aum pH alcalino ou tris-carboxietilfosfma a um pH ácido, paraliberar, separar e solubilizar os corpos de inclusão. O peptídio ficaentão em uma forma solúvel, podendo ser depois analisadousando eletroforese de gel, imunoprecipitação ou assemelhados.Se for desejado isolar-se o peptídio, o isolamento pode ser feitousando processos usuais, tais como aqueles apresentados abaixo epor Marston et al. Meth. Enz., 182:264 - 275.Em alguns casos, o peptídio S05A pode não serbiologicamente ativo após isolamento. Vários processos paraformar prega de novo ou converter o polipeptídio na sua estruturaterciária e gerar ligações de dissulfeto podem ser usados pararestaurar a atividade biológica. Esses processos incluem aexposição do polipeptídio solubilizado a um pH usualmenteacima de 7 e na presença de uma concentração particular de umagente caotrópico. A seleção do agente caotrópico é muito similaràs seleções usadas para solubilização dos corpos de inclusão, masusualmente a uma concentração mais baixa, e não énecessariamente o mesmo agente caotrópico, como o usado para asolubilização. Na maior parte dos casos, a solução de formação deprega / oxidação vai também conter um agente redutor, para gerarum potencial de oxirredução particular, propiciando a ocorrênciade mudança de posição do dissulfeto, na formação da ou daspontes de cisteína de proteína. Alguns dos pares de oxirreduçãousados comumente incluem cisteína / cistamina, glutationa (GSH)/ ditiobis GSH, cloreto cúprico, ditiotreitol (DTT) / ditiano DTT,2-mercaptoetanol (bME) / ditio-b(ME). Em muitos casos, um co-solvente é necessário para aumentar a eficiência da formação deprega, e os reagentes mais comuns usados para esse fim incluem,por exemplo, glicerol, poli (glicol etilênico) de vários pesosmoleculares, e arginina.

Se os corpos de inclusão de peptídio S05A nãosão formados a um grau significativo na célula hospedeira, opeptídio S05A vai ser ligado basicamente no sobrenadante, apóscentrifugação do homogeneizado, e o peptídio S05A pode serisolado do sobrenadante por uso de processos, tais como aquelesapresentados abaixo.

Naquelas situações nas quais é preferível isolar,parcial ou completamente, o peptídio S05A, a purificação podeser feita usando processos usuais bem conhecidos daquelesversados na técnica. Esses processos incluem, sem limitação,separação por eletroforese seguida por eletroeluição, vários tiposde cromatografia (de imunoafinidade, peneira molecular e/outroca iônica), e/ou cromatografia líquida de alta pressão. Emalguns casos, pode ser preferível usar mais de um dessesprocessos para purificação completa.

Além de preparar e purificar os peptídios S05Ausando técnicas de DNA recombinante, os peptídios S05A e osseus fragmentos, variantes, homólogos, proteínas de fusão,miméticos de peptídios, e derivados podem ser preparados porprocessos de síntese química (tal como síntese de peptídios emfase sólida) usando técnicas conhecidas no ramo, tais comoaquelas apresentadas por Merrifield et al., J. Am. Chem. Soe,85:2149 , Houghten et al. Proc Natl Acad. Sei. USA, 82:5132 , eStewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, PierceChemical Co., Rockford, III. Esses peptídios podem sersintetizados com ou sem uma metionina na terminação amino.

Os peptídios S05A sintetizados quimicamentepodem ser oxidados usando os processos apresentados nessasreferências, para formar pontes de dissulfeto. Os peptídios S05Asão esperados ter uma atividade biológica comparável com ospeptídios produzidos recombinantemente ou purificados de fontesnaturais, e, desse modo, podem ser usados intecambiavelmentecom peptídio recombinante ou natural.

As composições de peptídios S05A modificadasquimicamente, nas quais o peptídio é ligado a um polímero, sãoincluídas dentro do âmbito das presentes concretizações. Opolímero selecionado é, tipicamente, solúvel em água, de modoque a proteína na qual é preso não se precipita em um meio físicoaquoso, tal como um meio físico fisiológico. O polímeroselecionado é usualmente modificado para ter um grupo reativoúnico, tal como um éster ativo para acilação ou um aldeído paraalquilação, de modo que o grau de polimerização pode sercontrolado, como proporcionado nos presentes processos. Opolímero pode ser de qualquer peso molecular e pode serramificado ou não ramificado. Inclui-se dentro do âmbito dospolímeros de peptídios uma mistura polimérica.

Em alguns casos, pode ser desejável prepararvariantes de ácido nucléico e/ou aminoácido de peptídios S05Anaturais. As variantes de ácido nucléico podem ser produzidasusando mutagênese dirigida a sítio, amplificação PCR ou outrosprocessos adequados, nos quais o ou os iniciadores têm asmutações pontuais desejadas (consultar Sambrook et al., supra, eAusubel et al., supra, para descrições de técnicas de mutagênese).Os processos usando síntese química, descritos por Engels et al.,supra, também podem ser usados para preparar essas variantes.Outros processos conhecidos daqueles versados na técnica podemser também usados.

As variantes de ácidos nucléicos preferidas sãoaquelas contendo substituições de nucleotídeos considerando apreferência de códons na célula hospedeira, que vai ser usada paraproduzir os peptídios S05A. Essa otimização de códons pode serdeterminada por meio de algoritmos computadorizados, queincorporam tabelas de freqüências de códons, tal como a Ecohigh.Cod para preferência de códon de genes bacterianos altamenteexpressos, como proporcionado pelo pacote da Universidade deWisconsin, versão 9.0, Grupo de Computação Genética, Madison,Wis. Outras tabelas de freqüências de códons úteis incluemCelegansj[iota]igh.cod, Celegansjow.cod, Drosophila_high.cod,Humanjiigh.cod, Maize_high.cod, e Yeastj [iota]igh.cod. Outrasvariantes preferidas são aquelas codificando variações deaminoácidos conservadoras, como descrito acima (por exemplo,quando a carga ou polaridade da cadeia lateral de aminoácidonatural não é alterada substancialmente por substituição com umdiferente aminoácido), comparado o tipo silvestre, e/ou aqueleselaborados para gerar um ou mais novos sítios de glicosilaçãoe/ou fosforilação, ou aqueles elaborados para eliminar um ou maissítios de glicosilação e/ou fosforilação.

Os peptídios S05A e os seus fragmentos,homólogos, variantes, proteínas de fusão, miméticos de peptídios,derivados e sais também podem ser produzidos usando técnicasde síntese de peptídios convencionais conhecidas daquelesversados na técnica. Essas técnicas incluem os processos deacoplamento químico (de acordo com Wunsch, E: "Methoden derorganischen Chemie", Volume 15, Band 1+2, Synthese vonPeptiden, thime Verlag, Stuttgart (1974), e Barrany, G.;Marrifíeld, R. B.: "The Peptides," eds. E. Gross, J. Meienhofer,Volume 2, Chapter 1 , pp. 1 - 284, Academic Press (1980)),processos de acoplamento enzimático (de acordo com Widmer, F.Johansen, J. T., Carlsberg Res. Commun., Vol. 44, pp. 37 - 46(1979); Kullmann, W.: "Enzymatic Peptide Synthesis", CRCPress Inc. Boca Raton, Fia. (1987); e Widmer, F., Johansen, J. T.in "Synthetic Peptides in Biology and Medicines," eds. Alitalo,K., Partanen, P., Vatieri, A., pp.79 - 86, Elsevier, Amsterdam(1985)), ou uma combinação de processos químicos eenzimáticos, se isso for vantajoso para a elaboração e economiado processo. Usando as orientações proporcionadas na presenteinvenção, aqueles versados na técnica são capazes de variar aseqüência de peptídios do peptídio S05A, para produzir umhomólogo tendo a mesma ou uma atividade biológica(bioatividade) similar àquela do peptídio S05A original ou nativo.

Existem vantagens para o uso de um miméticode um determinado peptídio S05A em vez do próprio peptídio.Em geral, os miméticos de peptídios são mais biodisponíveis, têmuma maior duração de ação e podem ser mais baratos de produzirdo que as proteínas e os peptídios nativos.

Desse modo, os peptídios descritos acima têmutilidade no desenvolvimento desses pequenos compostosquímicos com atividades biológicas similares, e, portanto, comutilidades terapêuticas similares. Os miméticos de peptídios depeptídios S05A podem ser desenvolvidos usando técnicas dequímica combinatória e outras técnicas conhecidas no ramo(consultar, por exemplo, " Proceedings of the 20th EuropeanPeptide Symposium", ed. G. Jung, E. Bayer, pp. 289 - 336, e asreferência nele).

Os exemplos de processos conhecidos natécnica para a modificação estrutural de um peptídio, para criarum mimético de peptídio, incluem a inversão de centros quiraisde esqueleto polimérico, propiciando estruturas de resíduos deaminoácidos D, que podem, particularmente na terminação N,provocarem uma melhor estabilidade para a degradaçãoproteolítica, sem afetar adversamente a atividade. Um exemplo éproporcionado no artigo "Tritriated D - ala.sup.l - Peptide TBinding", Smith C. S. et al., Drug Development Res. 15, pp. 371 -379 (1988).

Um segundo processo é a alteração da estruturacíclica para estabilidade, tais como as imidas e lactamas deintercadeias NaC (Ede et al. em Smith e Rivier (Eds.) "Peptides:Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), pp. 268 - 270).Um exemplo disso é dado em compostos similares à timopentinalimitados conformacionalmente, tais como aqueles descritos napatente U.S. 4.457.489 (1985), Goldstein, G. et al., cuja descriçãoé incorporada inteiramente por referência no presente relatóriodescritivo.Um terceiro processo é substituir as ligações depeptídios no peptídio S05A por pseudoligações de peptídios, queconferem resistência a proteólise. Várias pseudoligações depeptídjos foram descritas, que, em geral, não afetam a estrutura ea atividade biológica. Um exemplo dessa abordagem é substituiras pseudoligações de peptídios retroinversas ("Biologically activeretroinverso analogues of thymopentin", Sisto A. et al em Rivier,J. E. e Marshall, G. R. (eds) "Peptides, Chemistry, Structure andBiology", Escom, Leiden (1990), pp. 722 - 773) e Dalpozzo, et al.(1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41 :561 - 566, incorporadospor referência no presente relatório descritivo). De acordo comessa modificação, as seqüências de aminoácidos dos peptídiospodem ser idênticas às seqüências dos peptídios descritas acima,exceto que uma ou mais das ligações de peptídios são substituídaspor uma pseudoligação de peptídio retroinversa. De preferência, aligação de peptídio na terminação N é substituída, uma vez queessa substituição vai conferir resistência a proteólise pelasexopeptidases agindo na terminação N.

A síntese de peptídios com uma ou maispseudoligações de peptídios retroinversas é conhecida na técnica(Sisto (1990) e Dalpozzo, et al. (1993), citados acima). Dessemodo, as ligações de peptídios podem ser substituídas porligações de não peptídios, que permitem que o mimético depeptídio adote uma estrutura similar, e, portanto, a atividadebiológica, do peptídio original. Outras modificações tambémpodem ser feitas por substituição de grupos químicos dosaminoácidos com outros grupos químicos de estrutura similar.Outra pseudoligação de peptídio adequada, que é conhecida comomelhorando a estabilidade a clivagem enzimática, sem ou compouca perda de atividade biológica, é a pseudoligação de peptídioisóstera reduzida (Couder, et al. (1993), Int. J. Peptide ProteinRes., 41 :181 - 184, incorporado por referência na sua totalidadeno presente relatório descritivo). Desse modo, as seqüências deaminoácidos desses peptídios podem ser idênticas às seqüênciasde um peptídio, exceto que uma ou mais das ligações de peptídiossão substituídas por uma pseudoligação de peptídio isóstera. Depreferência, a maior parte da ligação de peptídio na terminação Né substituída, uma vez que uma substituição vai conferirresistência a proteólise por exopeptidases agindo na terminaçãoΝ. A síntese de peptídios com uma ou mais pseudoligações depeptídios isósteras reduzidas é conhecida na técnica (Couder, etal. (1993), citado acima). Outros exemplos incluem a introduçãode ligações de cetometileno ou metilsulfeto, para substituir asligações de peptídios.

Os derivados de peptóides dos peptídios S05Arepresentam uma outra classe de miméticos de peptídios, queretêm os determinantes estruturais importantes para atividadebiológica, eliminando ainda as ligações de peptídios, conferindo,desse modo, resistência a proteólise (Simon, et al., 1992, Proc.Natl. Acad. Sei. USA, 89:9367 - 9371 e incorporado porreferência na sua totalidade no presente relatório descritivo). Ospeptóides são oligômeros de glicinas N-substituídas. Váriosgrupos N-alquila foram descritos, cada um deles correspondendoà cadeia lateral de um aminoácido natural (Simon et ai., 1992),citado acima e incorporado por referência na sua totalidade nopresente relatório descritivo). Alguns ou todos os aminoácidos dopeptídio são substituídos com a glicina N-substituídacorrespondente ao aminoácido substituído.

O desenvolvimento de miméticos de peptídiospode ser auxiliado por determinação da estrutura terciária dopeptídio original por espectroscopia NMR, cristalografia e/oumodelagem molecular auxiliada por computador. Essas técnicasajudam no desenvolvimento de novas composições de maiorpotência e/ou mais biodisponibilidade e/ou maior estabilidade doque do peptídio original (Dean (1994), BioEssays, 16: 683 - 687;Cohen e ShatzmiIler (1993), J. MoI. Graph., 11 : 166 - 173;Wiley e Rich (1993), Med. Res. Rev., 13: 327 - 384; Moore(1994), Trends Pharmacol. Sci., 15: 124 - 129; Hruby (1993),Biopolymers, 33: 1073 - 1082; Bugg et al. (1993), Sei. Am., 269:92 - 98, todos incorporados nas suas totalidades por referência nopresente relatório descritivo).

Uma vez que um composto de mimético depeptídio potencial é identificado, pode ser sintetizado e ensaiadousando os processos descritos nos exemplos abaixo paradeterminar a sua atividade. Os compostos de miméticos depeptídios obtidos pelos processos acima, tendo a atividadebiológica dos peptídios e estrutura tridimensional similar, sãoabrangidos por essa concretização, Vai ser prontamente evidentepara aqueles versados na técnica que um mimético de peptídiopode ser gerado de quaisquer dos peptídios contendo uma ou maisdas modificações descritas acima. Vai ser, além disso, evidenteque os miméticos de peptídios desta concretização possam serainda usados para o desenvolvimento de compostos nãopeptídicos ainda mais potentes, além da utilidade deles comocompostos terapêuticos.

Existem atualmente várias organizações que sãocapazes de sintetizar os peptídios descritos no presente relatóriodescritivo. Por exemplo, supondo a seqüência de um peptídioS05A, a organização pode sintetizar o peptídio e encaminhar opeptídio sintetizado com documentação anexada e prova deidentidade do peptídio.

As concretizações também abrangem o uso depeptídios S05A e das suas moléculas de ácido nucléicocorrespondentes para ensaios, para testar, qualitativa ouquantitativamente, para a presença de peptídios S05A, DNA depeptídios S05A ou RNA correspondente em amostras de tecidoou fluido corpóreo de mamíferos. Os peptídios S05A e as suasmoléculas de ácido nucléico correspondentes podem ter uso napreparação nesses ensaios, se ou não o peptídio do DNA depeptídio codificado mostram atividade biológica. As seqüênciasde ácidos nucléicos de peptídios S05A podem ser uma fonte útilde sondas de hibridização para testar, qualitativa ouquantitativamente, a presença de DNA de peptídio ou RNAcorrespondente em amostras de tecido ou fluido corpóreo demamíferos. Os peptídios S05A, que não são biologicamenteativos, podem ser úteis para a preparação de anticorpos quereconhecem e/ou se íigam aos peptídios S05A. Esses anticorpospodem ser preparados usando processos usuais. Desse modo, osanticorpos, que reagem com ou se ligam aos peptídios S05A, bemcomo os fragmentos de anticorpos de cadeia curta e outrosfragmentos reativos desses anticorpos, também são consideradoscomo dentro do âmbito das presentes concretizações. Osanticorpos podem ser policlonais, monoclonais, recombinantes,quiméricos, de cadeia única e/ou biespecíficos. Tipicamente, oanticorpo ou seu fragmento vai ser de origem humana ou vai serhumanizado, isto é, preparado de modo a impedir ou minimizaruma reação imune ao anticorpo, quando administrado a umpaciente. Os anticorpos preferidos são os anticorpos humanos,policlonais ou monoclonais. O fragmento de anticorpo pode serqualquer fragmento que seja reativo com os peptídios daspresentes concretizações, tais como, Fab, Fab', etc. Tambémproporcionados por essa concretização são os hibridomas geradospor apresentação de qualquer peptídio S05A, como um antígeno,a um mamífero selecionado, seguida por células de fusão (porexemplo, células do baço) do mamífero com certas célulascancerígenas, para criar linhas celulares imortalizadas portécnicas conhecidas. Os processos empregados para gerar essaslinhas celulares e os anticorpos dirigidos contra todo ou parte deum peptídio S05A, são também abrangidos pelas concretizações.Os anticorpos podem ser ainda usados para finsdiagnósticos ou de pesquisa in vivo e in vitro, tal como em umaforma marcada para detectar a presença de um peptídio S05A emuma amostra de fluido corpóreo ou célula.

As concretizações também abrangem o uso deum ou mais peptídios S05A, como padrões de calibração emensaios que testam, qualitativa ou quantitativamente, a presençade peptídios S05A, proteínas, DNA de peptídio, DNA deproteína, ou RNA correspondente em amostras de tecido ou fluidocorpóreo de mamíferos.

As presentes concretizações são dirigidas aprocessos de tratamento de condições requerendo a remoção decélulas, tais como tumores benignos e malignos, hiperplasiaglandular (por exemplo, da próstata), pelo facial indesejado,verrugas e tecido adiposo indesejado, ou a inibição ou prevençãode proliferação celular indesejada, tal como estenose de umcateter. Esse processo compreende a administração a ummamífero carente, ou revestimento de um dispositivo, tal comoum cateter, com uma quantidade terapeuticamente efetiva depeptídio S05A.

A condição pode ser, por exemplo, tumores dopulmão, mama, estômago, pâncreas, próstata, bexiga, osso,ovário, pele, rim, seio, cólon, intestino, estômago, reto, esôfago,sangue, cérebro e as suas coberturas, medula espinal e as suascoberturas, músculo, tecido conectivo, adrenal, paratiróide,tiróide, útero, testículos, pituitária, órgãos reprodutores, fígado,bexiga de bile, olho, ouvido, nariz, garganta, amídalas, boca, nóslinfáticos e sistema linfóide, e outros órgãos.

Como aqui usado, o termo "tumor maligno" éintencionado para abranger todas as formas de carcinomas,sarcomas e melanomas humanos, que ocorrem nas formas maldiferenciadas, moderadamente diferenciadas e bem diferenciadas.

Essa concretização satisfaz uma necessidade natécnica para os tratamentos que podem remover tumores benignoscom menos risco e efeitos colaterais indesejáveis reduzidos dacirurgia. Um processo para a remoção de tumores benignos emáreas de risco cirúrgico, tais como em locais profundos no corpo(por exemplo, cérebro, coração, pulmões e outros) éparticularmente necessário.

O processo de tratamento das condições nasquais as células devem ser removidas pode ser usado em conjuntocom os processos convencionais de tratamento dessas condições,tais como excisão cirúrgica, quimioterapia e radiação, ospeptídios podem ser administrados antes, durante ou após essestratamentos convencionais.

A condição a ser tratada pode ser também umahiperplasia, hipertrofia ou supercrescimento de um tecidoselecionado do grupo consistindo de pulmão, mama, estômago,pâncreas, próstata, bexiga, osso, ovário, pele, rim, seio, cólon,intestino, estômago, reto, esôfago, sangue, cérebro e as suascoberturas, medula espinal e as suas coberturas, músculo, tecidoconectivo, adrenal, paratiróide, tiróide, útero, testículos, pituitária,órgãos reprodutores, fígado, bexiga de bile, olho, ouvido, nariz,garganta, amídalas, boca, nós linfáticos e sistema linfóide.

Outras condições que podem ser tratadas usandoo processo das concretizações são o de tecido alterado viral,bacterial ou parasiticamente, selecionado do grupo consistindo depulmão, mama, estômago, pâncreas, próstata, bexiga, osso,ovário, pele, rim, seio, cólon, intestino, estômago, reto, esôfago,sangue, cérebro e as suas coberturas, medula espinal e as suascoberturas, músculo, tecido conectivo, adrenal, paratiróide,tiróide, útero, testículos, pituitária, órgãos reprodutores, fígado,bexiga de bile, olho, ouvido, nariz, garganta, amídalas, boca, nóslinfáticos e sistema linfóide.

A condição a ser tratada também pode ser umamá formação ou distúrbio de um tecido selecionado do grupoconsistindo de pulmão, mama, estômago, pâncreas, próstata,bexiga, osso, ovário, pele, rim, seio, cólon, intestino, estômago,reto, esôfago, sangue, cérebro e as suas coberturas, medulaespinal e as suas coberturas, músculo, tecido conectivo, adrenal,paratiróide, tiróide, útero, testículos, pituitária, órgãosreprodutores, fígado, bexiga de bile, olho, ouvido, nariz, garganta,amídalas, boca, nós linfáticos e sistema linfóide.

Em particular, a condição a ser tratada pode serhipertrofia tonsilar, hiperplasia prostática, psoríase, eczema,dermatose ou hemorróida. A condição a ser tratada pode ser umadoença vascular, tal como aterosclerose ou arteriosclerose, ou umdistúrbio vascular, tais como veias de varicose, estenose ourestenose de uma artéria ou de um cateter. A condição a sertratada pode ser também uma modificação cosmética de umtecedo,ta como tecido de pele,olho,ouvido, nariz,garganta,boca, músculo, tecido conectivo, pelo ou mama.

As composições terapêuticas dos peptídiosS05A também são consideradas nas presentes concretizações.Essas composições podem compreender uma proporçãoterapeuticamente efetiva de um peptídio S05A em mistura comum transportador farmaceuticamente aceitável. 0 materialtransportador pode ser água para injeção, de preferência,suplementado com outros materiais comuns nas soluções paraadministração a mamíferos. Tipicamente, um peptídio S05A parauso terapêutico vai ser administrado na forma de umacomposição, que compreende peptídio purificado em conjuntocom um ou mais transportadores, excipientes ou diluentesfisiologicamente aceitáveis. Solução salina tamponada neutra ousolução salina com albuina serosa são transportadores adequadosexemplificativos. De preferência, o produto é formulado como ummaterial liofilizado usando excipientes adequados (por exemplo,sacarose). Outros transportadores, diluentes e excipientes podemser incluídos, se desejado. As composições das concretizaçõestambém podem compreender tampões conhecidos daquelesversados na técnica, com uma faixa adequada de valores de pH,incluindo tampão Tris de uma faixa de pH de cerca de 7,0 - 8,5,ou tampão de acetato de uma faixa de pH de cerca de 4,0 - 5,5,que podem incluir ainda sorbitol ou um substituto adequado dele.O uso de peptídios S05A conjugados ou ligadosou presos em um anticorpo, fragmento de anticorpo, moléculasimilar a anticorpo,ou uma molecula com uma alta afinidadeum marcador de tumor específico, tal como um receptor celular,proteína de sinal ou enzima superexpressa, para alvejar elementoscelulares indesejados, também é abrangido pelo âmbito dasconcretizações. O anticorpo, fragmento de anticorpo, moléculasimilar a anticorpo, ou molécula com uma alta afinidade a ummarcador de tumor específico é usado para alvejar o conjugado depeptídio a um alvo de tecido ou celular específico. Por exemplo,um tumor com um distinto antígeno superficial ou antígenoexpresso pode ser alvejado pelo anticorpo, fragmento de anticorpoou molécula similar a anticorpo, e as células tumorosas podem serexterminadas pelo peptídio. Essa abordagem usando alvejamentode anticorpos tem as vantagens esperadas de diminuir a dosagem,aumentar a probabilidade de ligação e coleta pelas células alvo, euma maior utilidade para alvejar e tratar tumores metastáticos etumores de tamanhos microscópicos.

Essa concretização também abrange o uso depeptídios S05A conjugados ou ligados ou presos a uma proteínaou outra molécula, para formar uma composição que, apósclivagem, no ou nos ou próximo do ou dos sítios do tumor ou deoutras células indesejadas por uma enzima ou protease específicade tumor ou de sítio, ou por um conjugado de anticorpo quealveja o tumor ou outras células indesejadas, libera o peptídio noou nos ou próximo do ou dos sítios do tumor ou de outras célulasindesejadas.

Essa concretização também abrange o uso depeptídios S05A conjugados ou ligados ou presos em uma proteínaou outra molécula, para formar uma composição que libera opeptídio ou algum fragmento biologicamente ativo do peptídio,por exposição do tecido a ser tratado a luz (como em terapias delaser ou outra terapia fotodinâmica ou fotoativada), outras formasde radiação eletromagnética, tal como radiação infravermelha,radiação ultravioleta, radiação de raio X ou raio gama, calorlocalizado, radiação alfa ou beta, emissões ultra-sônicas, ou outrasfontes de energia localizada.

Os peptídios S05A podem ser empregadossozinhos, conjuntamente ou em combinação com outrascomposições farmacêuticas, tais como citocinas, fatores decrescimento, antibióticos, agentes indutores de apoptose,antiinflamatórios, e/ou agentes quimioterapêuticos, como éadequado para a indicação sendo tratada.

Essa concretização também abrangecomposições terapêuticas de peptídios S05A empregandodendrímeros, fulerenos e outras moléculas sintéticas, polímeros emacromoléculas, em que o peptídio e/ou a sua molécula de DNAcorrespondente é conjugado com uma, preso em uma ouencerrado na molécula, polímero ou macromolécula, ou por elemesmo ou em conjunto com outra espécie da molécula, tal comoum marcador específico de tumor. Por exemplo, a patente U.S.5.714.166, "Bioactive and/or Targeted Dendimer Conjugates",proporciona um processo de preparação e uso, entre outros, deconjugados poiiméricos dendríticos compostos de pelo menos umdendrímero com um ou mais diretores alvos e pelo menos umagente bioativo conjugado com ele. A descrição da patente U.S.5.714.166 é incorporada por referência no presente relatóriodescritivo na sua totalidade.

Essa concretização também abrangecomposições terapêuticas de peptídios S05A e/ou genes eveículos de transferência de medicamento, tais como emulsões delipídios, polímeros de micelas, microsferas poliméricas,polímeros eletroativos, hidrogéis e lipossomos.

O uso de peptídios S05A ou de genesrelacionados ou de genes equivalentes, transferidos para as célulasindesejadas, também é abrangido pelas concretizações. Asuperexpressão de peptídio dentro do tumor pode ser usada parainduzir as células no tumor a morrer e, desse modo, reduzir apopulação de células tumorosas. A transferência de gene ouequivalente de gene de peptídio S05A, para tratar os elementoscelulares indesejados é prevista ter a vantagem de requerer menosdosagem, e de ser passada para a progênie celular dos elementoscelulares alvos, necessitando, desse modo, de terapia menosfreqüente e menos terapia total. Essa concretização tambémabrange a transferência de genes, que codificam uma proteína defusão contendo um peptídio S05A para as células indesejadas oucélulas vizinhas que, seguinte à expressão do gene e à produçãoe/ou secreção da proteína de fusão, a proteína de fusão é clivadaou por enzimas ou proteases nativas ou por um pró-medicamento,para liberar o peptídio nas ou próximos das células indesejadas.

O uso de conjugados de anticorpos - peptídiosrecombinantes clonados, conjugados de fragmentos de peptídios -anticorpos recombinantes clonados, e conjugados de peptídios -proteínas na forma de anticorpos recombinantes clonados étambém abrangido pelo âmbito das concretizações. As vantagensde um peptídio S05A clonado combinado com um conjugado dealvo (tal como um anticorpo, um fragmento de anticorpo, umamolécula similar a anticorpo, ou uma molécula com uma altaafinidade a um receptor específico de câncer ou outro marcadorde tumor) são que essa molécula combina as vantagens dealvejamento descritas acima com as vantagens para manufatura eprodução padronizada da molécula conjugada clonada.

Essa concretização também abrange o uso decomposições terapêuticas de peptídios S05A ou genes ouequivalentes de genes, como um componente do revestimento deum dispositivo médico, tal como um cateter, para remover, inibirou impedir a proliferação ou acúmulo de células indesejadas.

As formas de dosagem sólidas paraadministração oral incluem, mas não são limitadas a, cápsulas,tabletes, pílulas, pós e grânulos. Nessas formas de dosagemsólidas, o composto ativo é misturado com pelo menos um dosseguintes: (a) um ou mais excipientes (ou transportadores) inertes,tal como citrato de sódio ou fosfato dicálcico; (b) cargas ouextensores, tais como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol eácido silícico; (c) aglutinantes, tais como carboximetilcelulose,alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarose e acácia; (d)umectantes, tal como glicerol; (e) agentes desintegradores, taiscom ágar-ágar, carbonato de cálcio, amido de batata ou tapioca,ácido algínico, certos silicatos complexos, e carbonato de sódio;(f) retardadores de solução, tal como parafina; (g) aceleradores deadsorção, tais como compostos de amônio quaternário; (h)agentes de molhamento, tais como álcool acetílico emonoestearato de glicerol; (i) adsorventes, tais como caulim ebentonita; e (j) lubrificantes, tais como talco, estearato de cálcio,estearato de magnésio, poli (glicóis etilênicos) sólidos,laurilsulfato de sódio, ou suas misturas. Para cápsulas, tabletes epílulas, as formas de dosagem sólidas podem tambémcompreender agentes de tamponamento.

As formas de dosagem líquidas paraadministração oral incluem emulsões, soluções, suspensões,xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Além doscompostos ativos, as formas de dosagem líquidas podemcompreender diluentes inertes comumente usados na técnica, talcomo água ou outros solventes, agentes de solubilização eemulsificantes. Os emulsificantes exemplificativos são álcooletílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila,álcool benzílico, benzoato de benzila, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol, dimetilformamida, óleos, tal como óleo de sementede algodão, óleo de tubérculo comestível, óleo de germe de trigo,azeite de oliveira, óleo de rícino e óleo de sésamo, glicerol, álcooltetraidrofurfurílico, poli (glicóis etilênicos), ésteres de ácidosgraxos de sorbitan, ou misturas dessas substâncias, eassemelhados. Além desses diluentes inertes, a composiçãopode também incluir auxiliares, tais como agentes demolhamento, agentes emulsificantes e de suspensão, agentesadoçantes, aromatizantes e perfumantes.

Os níveis de dosagem efetivos dos ingredientesativos nas composições das concretizações pode ser variado, paraobter uma proporção de peptídio S05A que é efetiva para obteruma resposta terapêutica desejada, para uma composição e umprocesso de administração particulares. O nível de dosagemselecionado depende, portanto, do efeito terapêutico desejado, darota de administração, da duração desejada do tratamento e deoutros fatores.

Com mamíferos, incluindo os seres humanos, asproporções efetivas pode ser administradas com base na áreacorpórea superficial. A inter-relação das dosagens para animais devários tamanhos, espécies e seres humanos (com base emmg/M.sup.e de superfície corpórea) é descrita por E. J. Freireichet al., Câncer Chemother. Rep., 50 (4):219 (1966). A áreacorpórea superficial pode ser aproximadamente determinada daaltura e do peso de um indivíduo (consultar, por exemplo,Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, N.Y. pp. 537 -538 (1970)).A dose diária total do peptídio S05A,administrado a um hospedeiro, pode ser única ou em dosesdivididas. As composições de dosagem unitária podem conteressas proporções desses seus submúltiplos, que podem ser usadaspara constituir a dose diária. Deve-se entender, no entanto, que onível de dose específico para qualquer paciente particular vaidepender de vários fatores, incluindo o peso corpóreo, saúdegeral, sexo, dieta, tempo e rota de administração, potência domedicamento administrado, taxas de absorção e excreção,combinação com outros medicamentos e a gravidade da doençaparticular sendo tratada.

Um processo de administração da composiçãode peptídio S05A de acordo com as concretizações inclui, masnão é limitado a, administração dos compostosintramuscularmente, oralmente, intravenosamente,intraperitonealmente, intracerebralmente(intraparenquimalmente), intracerebroventicularmente,intratumoralmente, intralesionalmente, intradermicamente,intratecalmente, intranasalmente, intra-ocularmente, intra-arterialmente, topicamente, transdermicamente, por meio de umaerossol, infusão, injeção de bolo, dispositivo de implantação,sistema de liberação constante, etc.

Outro processo de administração de um peptídioS05A das concretizações é por uma rota transdérmica outranscutânea. Um exemplo dessa concretização é o usado de umemplastro. Em particular, um emplastro pode ser preparado comuma suspensão fina de peptídio em, por exemplo,dimetilsulfóxido (DMSO), ou uma mistura de DMSO com óleode semente de algodão, e colocada em contato com a pele domamífero conduzindo o tumor longe do sítio de localização dotumor dentro de uma bolsa de pele. Outros meios ou misturas delecom outros solventes e suportes sólidos vão funcionar igualmentebem. O emplastro pode conter o composto de peptídio na formade uma solução ou uma suspensão. O emplastro pode ser depoisaplicado à pele do paciente, por exemplo, por meio de inserçãodele em uma bolsa de pele do paciente formada por formação deprega e retenção da pele conjunta por meio de pontos, grampos ououtros dispositivos de retenção. Essa bolsa deve ser empregada detal maneira que o contato contínuo com a pele seja garantido, sema interferência do mamífero. Além do uso de uma bolsa de pele,qualquer dispositivo pode ser usado que garante a firme colocaçãodo emplastro em contato com a pele. Por exemplo, umabandagem adesiva pode ser usada para reter o emplastro no lugarna pele.

Os peptídios S05A podem ser administrados emuma formulação ou preparação de liberação constante. Osexemplos adequados de preparações de liberação constanteincluem matrizes poliméricas semipermeáveis, na forma deartigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Asmatrizes de liberação constante incluem poliésteres, hidrogéis,polilactídeos (patente U.S. 3.773.919, EP 58.481), copolímeros deácido L-glutâmico e L-glutamato de etila gama (Sidman et al.,Biopolymers, 22: 547 - 556 ), poli (metacrilato de 2-hydroxietila)(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167 - 277 e Langer,Chem. Tech., 12: 98 - 105 ), etileno - acetato de vinila (Langer etal., supra) ou poli (ácido D(-)-hidroxibutírico) (EP 133.988). Ascomposições de liberação constante também podem incluirlipossomos, que podem ser preparados por quaisquer dos váriosprocessos conhecidos na técnica (por exemplo, Eppstein et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82: 3688 - 3692 ; EP 36.676; EP88.046; e EP 143.949.

Outro processo de administração de um peptídioS05A das concretizações é por infusão direta ou indireta no tumorou em outro tecido a ser tratado. Um exemplo de tal concretizaçãoé a injeção direta de peptídio no tumor ou em outro tecido a sertratado. O tratamento pode consistir de uma injeção única,injeções múltiplas em uma ocasião ou uma série de injeções emum período de horas, dias ou meses, com a regressão oudestruição do tumor ou outro tecido a ser tratado sendomonitorada por meio de biopsia, formação de imagem ou outrosprocessos de monitoramento de crescimento de tecido. A injeçãono tumor ou outro tecido a ser tratado pode ser por um dispositivoinserido em um orifício, tal como do nariz, boca, ouvido, vagina,reto ou uretra, ou por uma incisão, para atingir o tumor ou tecidoin vivo, e pode ser conduzida em conjunto com formação deimagem ou um sistema óptico, tal como no âmbito de ultra-somou fibra óptica, para identificar o sítio adequado para a ou asinjeções. Outro exemplo dessa concretização é o uso de umdispositivo que pode proporcionar uma infusão constante depeptídio S05A no tecido com o tempo.

Outro processo de administração de peptídioS05A das concretizações é em conjunto com um procedimentocirúrgico ou similar empregado por extermínio ou destruiçãofísica por excisão, remoção ou outra do tumor ou outro tecido, oude elementos celulares que precisam ou que se deseja que sejamdestruídos ou removidos, em que um peptídio S05A dasconcretizações é administrado à ou às áreas imediatascircundando a ou as áreas nas quais o tumor ou outro tecido foiremovido, para destruir ou impedir o crescimento de quaisquercélulas ou outros elementos celulares tumorosos não removidosou destruídos pelo procedimento.

Outro processo de administração de um peptídioS05A das concretizações é por implantação de um dispositivodentro do tumor ou de outro tecido a ser tratado. Um exemplo detal concretização é a implantação de uma pastilha contendopeptídio no tumor ou outro tecido a ser tratado. A pastilha libera adose terapêutica de peptídio no tecido com o tempo. Alternativaou adicionalmente, a composição pode ser administradalocalmente por implantação na área afetada de uma membrana,esponja ou outro material adequado no qual o peptídio S05A foiabsorvido. Quando um dispositivo de implantação é usado, odispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão, e atransferência do peptídio pode ser diretamente pelo dispositivo,por meio de bolo, ou por meio de administração contínua, ou pormeio de cateter usando infusão contínua.

Um processo alternativo de administração éintroduzir uma ou mais cópias de um gene codificando peptídioS05A na célula sendo alvejada e, se necessário, induzir a ou ascópias do gene, para começar a produzir o peptídiointracelularmente. Uma maneira na qual a terapia de gene podeser aplicada é usar o gene codificando peptídio S05A (DNAgenômico, cDNA, e/ou DNA sintético codificando o peptídio - ouum fragmento, variante, homólogo ou derivado dele), que podeser ligado operacionalmente a um promotor constitutivo ouinduzível, para formar um constructo de DNA de terapia de gene.

O promotor pode ser homólogo ou heterólogo a um genecodificando peptídio endovenoso, desde que seja ativo no tipo decélula ou tecido no qual o constructo vai ser inserido. Outroscomponentes do constructo de DNA de terapia de gene podeincluir, opcionalmente, caso necessário, moléculas de DNAelaboradas para integração específica de sítio (por exemplo,seqüências de flanqueamento endógenas úteis para recombinaçãohomóloga), promotor específico de tecido, agente ou agentes deintensificação ou silenciadores, moléculas de DNA capazes deproporciona uma vantagem seletiva em relação a uma célulamatriz, moléculas de DNA úteis como marcadores para identificarcélulas transformadas, sistemas de seleção negativos, agentes deligação específicos de células (como, por exemplo, alvejamentode células), fatores de internalização específicos de células, efatores de transcrição para acentuar a expressão por um vetor,bem como fatores para propiciar manufatura de vetores.

Os meios de liberação de genes para uma célulaou tecido, in vivo ou ex vivo, incluem (mas não são limitados a)injeção de DNA nu, processos balísticos, transferência mediadapor lipossomos, transferência mediada por receptores (complexoligante - DNA), eletroporação, e precipitação por fosfato decálcio. Consultar a patente U.S. 4.970.154, pedido de patenteinternacional WO 96/40958, patente U.S. 5.679.559, patente U.S.5.676.954 e patente U.S. 5.593.875, cujas descrições são aqui nassuas totalidades incorporadas por referência no presente relatóriodescritivo. Também incluem o uso de um vetor viral, tal como umretrovírus, um adenovírus, um vírus associado a adeno, vírus depústula, lentivírus, vírus papiloma ou vírus do herpes simples, usode conjungado de DNA - proteína e uso de um lipossomo. O usode vetores de terapia de gene é descrito, por exemplo, na patenteU.S. 5.672.344, patente U.S. 5.399.346, patente U.S. 5.631.2365 epatente U.S. 5.635.399, cujas descrições são aqui nas suastotalidades incorporadas por referência no presente relatóriodescritivo.

O gene codificando peptídio S05A pode sertransferido por implantação em pacientes de determinadas células,que foram engenheiradas geneticamente ex vivo, usandoprocessos tais como aqueles descritos no presente relatóriodescritivo, para expressar e secretar o peptídio S05A oufragmentos, variantes, homólogos ou derivados dele. Essascélulas podem ser células animais ou humanas, e podem serderivadas do próprio tecido do paciente ou de outra fonte, humanaou não humana. Opcionalmente, as células podem serimortalizadas ou serem células tronco. NO entanto, para diminuira chance de uma resposta imunológica, é preferido que as célulassejam encapsuladas para evitar a infiltração de tecidoscircundantes. Os materiais de encapsulação são tipicamentebiocompatíveis, fechamentos ou membranas que propiciam aliberação do ou dos produtos de proteínas, mas impedem adestruição das células pelo sistema imune do paciente ou poroutros fatores nocivos dos tecidos circundantes. Os processosusados para encapsulação por membrana de células são familiaresa uma pessoa versada na técnica, e a preparação de célulasencapsuladas e a implantação delas em pacientes podem ser feitassem experimentação indevida. Consultar, por exemplo, aspatentes U.S. 4.892.538, 5.011.472 e 5.106.627, cujas descriçõessão aqui nas suas totalidades incorporadas por referência nopresente relatório descritivo. Um sistema para encapsular célulasvivas é descrito no pedido de patente internacional WO 91/10425.As técnicas para formulação de vários outros meios de liberaçãoconstante ou controlada, tais como veículos de lipossomos,partículas ou contas bioerodíveis, são também conhecidasdaqueles versados na técnica, e são descritas, por exemplo, napatente U.S. 5.653.975, cujas descrição é aqui na sua totalidadesincorporada por referência no presente relatório descritivo. Ascélulas, com ou sem encapsulação, podem ser implantadas emtecidos corpóreos ou órgãos adequados do paciente.

As concretizações particularmente preferidasdos processos de tratamento de um distúrbio requerendo aremoção ou destruição de células, por administração de um oumais peptídios das concretizações, e as células a serem removidasou destruídas estão presentes em tecido linfóide. Outrasconcretizações preferidas incluem o tratamento de condições querequerem a remoção ou destruição de células, tal como umselecionado, individual ou coletivamente, de hipertrofia tonsilar,hiperplasia prostática, doença vascular (aterosclerose ouarteriosclerose), hemorróida, veias varicosas, psoríase, eczema,dermatose, e uma modificação cosmética em um tecido. Outrascondições tratáveis incluem estenose, restenose, oclusão oubloqueio de uma artéria ou de um cateter colocado ou implantadoem uma artéria. O tecido adequado, que pode ser tratado nasconcretizações preferidas, incluem pele, olho, ouvido, nariz,garganta, boca, músculo, conectivo, pelo e mama.

Outras condições preferidas tratadas de acordocom as concretizações incluem aquelas selecionadas de umadoença inflamatória, doença auto-imune, doença metabólica,doença hereditária / genética, doença traumática ou lesão física,doença de deficiência nutritiva, doença infecciosa, doençaamilóide, doença fíbrosa, doença de armazenamento, máformação congênita, doença de deficiência enzimática,envenenamento, intoxicação, doença ambiental, doençaradioativa, doença endócrina, doença degenerativa e doençamecânica. Em outra concretização preferida, o peptídio éconjugado, ligado ou preso em uma molécula selecionada de umanticorpo, fragmento de anticorpo e uma molécula de ligaçãosimilar a um anticorpo, em que a dita molécula tem uma maiorafinidade para ligação a um tumor ou outro alvo do que paraligação a outras células. Em outra concretização, o peptídio éparte de uma molécula recombinante recém-clonada única,consistindo do peptídio e de uma molécula selecionada do grupoconsistindo de um anticorpo, fragmento de anticorpo e umamolécula de ligação similar a um anticorpo, em que a moléculatem uma maior afinidade para ligação a um tumor ou outro alvodo que para ligação a outras células.

Os exemplos apresentados a seguir sãoproporcionados para ilustrar as presentes concretizações. Deve-seentender, no entanto, que as concretizações não são limitadas àscondições ou detalhes específicos descritos nesses exemplos. Aolongo do relatório descritivo, qualquer uma e todas as referênciasa um documento disponíveis publicamente, incluindo uma patenteU.S., são especificamente incorporados por referência.

Em particular, as concretizações incorporamexpressamente por referência os exemplos contidos no pedido depatente U.S. 10/092.934. Os processos de tratamento de tumores econdições relacionadas usando proteínas filamentosas neurais,que revelam toda a proteína AD7-C, é um agente efetivo paraprovocar morte celular, tanto em culturas celulares de glioma eneuroblastoma in vitro quanto em tecido muscular de roedornormal, tecido conectivo subcutâneo, e derme em váriosdiferentes tumores de origem humana e não humana, incluindocarcinoma mamário, carcinoma e papiloma de pele, carcinoma decólon, glioma de cérebro e outros em modelos de roedores. Asconcretizações também incorporam expressamente por referênciaos exemplos contidos nos pedidos de patente co-pendentes Ser N010/153.334, intitulado: "Peptides Effective In The Treatment OfTumors And Other Conditions Requiring The Removal OrDestruction Of Cells"; Ser. N0 10/198.069, intitulado: "PeptidesEffective In The Treatment Of Tumors And Other ConditionsRequiring The Removal Or Destruction Of Cells"; Ser. N010/198.070, intitulado: "Peptides Effective In The Treatment OfTumors And Other Conditions Requiring The Removal OrDestruction Of Cells", Ser. N0 10/294.891 intitulado: "PeptidesEffective In The Treatment Of Tumors And Other ConditionsRequiring The Removal Or Destruction Of Cells"; e Ser. N010/920.313 intitulado: "Peptides Effective In The Treatment OfTumors And Other Conditions Requiring The Removal OrDestruction Of Cells", cada um dos quais revela que certospeptídios especificados neles são agentes efetivos para provocarmorte celular in vivo com tecido muscular, tecido conectivosubcutâneo, derme e outro tecido de roedor normal.

EXEMPLO 1

A finalidade desse exemplo foi o determinar oefeito de peptídios S05A em tecido em sítios de injeção.Os seguintes peptídios S05A foram sintetizadosusando processos usuais:

S05A-2 (SEQ ID N0 2) TDQQVLSRT (Ue - Asp - Gln - Gln - Va! - Leu - Ser - Arg - I!e);

S05A-3 (SEQ ID N0 3) KLEIKRCL (Lys - Leu - Glu - Ile - Lys - Arg - Cys - Leu);

S05A-4 (SEQ ID N0 4) VLSRIK (Vai - Leu - Ser - Arg - Ile - Lys);

S05A-5 (SEQ ID N0 5) RIKLEIK (Arg - Ile - Lys - Leu - Glu - Ile - Lys);

S05A-6 (SEQIDN0Q VLSRIKLEIKRCL (Vai-Leu-Ser-Aig-De-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Aig- Cys-Leu); e

S05A-7(SEQIDNd?) IDQQVLSRIKLEI (De-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Aig-De-Lys-Leu- Ghi-De).

Ratos Sprague - Dawley (faixa de peso de 300gramas) foram anestesiados com éter e receberam um dospeptídios S05A mencionados acima por infusão intraprostática,uma injeção de controle de solução salina normal ou nenhumainjeção, após visualização cirúrgica da próstata. As injeçõesconsistiram de 300 μΐ de uma solução de 1 mg/mL de peptídioS05A em PBS, pH 7,4 (1,0 mg/kg) (n = 36). Os ratos foramsacrificados de forma indolor após 24 horas (n = 12), 72 horas (n= 12) e 7 dias (n = 12). As glândulas prostáticas foram dissecadas,fixadas em uma solução tamponada de formalina a 10% por 24horas, embebidas em parafina, seccionadas, e manchadas com H& E. Para cada animal, toda a glândula prostática foi embebida eseccionada. Todas as seções manchadas foram examinadashistologicamente e medidas. Para cada próstata, pelo menos 2seções histológicas foram examinadas, e para seção histológicadois diâmetros de seção transversal (D) a 90° entre si forammedidos (um total de > 8 medidas por próstata). A média dosdiâmetros das seções transversais (D) para cada grupo foi usadapara estimar o volume de acordo com V = 4/3 Π (D/2)3, e ovolume médio calculado para cada grupo. As variaçõeshistológicas foram determinadas com base na seguinte escala:

- ausente;

+ presente, mínima;++ presente, moderada;+++ presente, moderada e difusa; e++++ presente, difusa e extensa.Resultados: a Tabela 4 abaixo apresenta asvariações histológicas de morte celular observada.

Tabela 4

<table>table see original document page 83</column></row><table>

Os estudos anteriores de controle de injeções de1 mg/mL de PBS sozinho mostraram variações histológicasausentes ou mínimas, consistindo de inflamação focai branda dasagulhas (consultar os exemplos contidos nos pedidos de patenteU.S. Ser. N0 10/153.334, intitulado: "Peptides Effective In TheTreatment Of Tumors And Other Conditions Requiring TheRemoval Or Destruction Of Cells"; Ser. N0 10/198.070,intitulado: "Peptides Effective In The Treatment Of Tumors AndOther Conditions Requiring The Removal Or Destruction OfCells", Ser. N0 10/294.891, intitulado: "Peptídes Effective In TheTreatment Of Tumors And Other Conditions Requiring TheRemoval Or Destruction Of Cells"; e Ser. N0 10/920.313,intitulado: "Peptides Effective In The Treatment OfTumors AndOther Conditions Requiring The Removal Or Destruction OfCells", incorporados por referência).

A Tabela 5 mostra as variações volumétricas observadas.Tabela 5

<table>table see original document page 84</column></row><table>

A redução global no volume da próstata emratos injetados com peptídios So5A S05A-2 e S50A-7 foiestimada como sendo uma média > 40%, comparada comcontroles. Os ratos tratados com S05A-2 e S50A-7 mostraramextensas morte celular, necrose, perda de epitélio glandular eatrofia. Os controles mostraram variações mínimas ou ausentes,consistindo de inflamação aguda nos sítios de injeção emicroemorragias focais das agulhas.

Vai ser evidentes para aqueles versados natécnica que várias modificações e variação podem ser feitas nosprocessos e composições das presentes concretizações, sem que seafaste do espírito ou âmbito das concretizações.

Claims

1. Peptídio isolado caracterizado pelo fato deque consiste de urn fragmento de uni peptídio, que consiste daseqüência de aminoácidos na SEQ ID N0 1 (lie - Asp - Gln - Gln -Val - Leu - Ser - Arg - Ile - Lys - Leu - Glu - lie - Lys - Arg - Cys- Leu).

2. Peptídio de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupoconsistindo de:a) o peptídio representado pela seqüência deaminoácidos na SEQ ID N0 2 (Ilè - Asp - Gln - Gln - Val - Leu -Ser - Arg - lie);b) o peptídio representado pela seqüência deaminoácidos na SEQ ID N0 3 (Lys - Leu - Glu - Ile - Lys - Arg -Cys - Leu);c) o peptídio representado pela seqüência deaminoácidos na SEQ ID N0 4 (Vai - Leu - Ser - Arg - Ile - Lys);d) o peptídio representado pela seqüência deaminoácidos na SEQ ID N0 5 (Arg - Ile - Lys - Leu - Glu - Ile - Lys);e) o peptídio representado pela seqüência deaminoácidos na SEQ ID N°6 (Vai - Leu - Ser - Arg - Ile - Lys -Leu - Glu - Ile - Lys - Arg - Cys - Leu); ef) o peptídio representado pela seqüência deaminoácidos na SEQ ID N0 7 (lie - Asp - Gln - Gln - Val - Leu -Ser - Arg - Ile - Lys - Leu - Glu - lie).

3. Composição caracterizada pelo fato de quecompreende pelo menos um dos peptídios de acordo com areivindicação 1 e um transportador.

4. Mimético do peptídio, caracterizado pelofato de que o peptídio é de acordo com a reivindicação 1.

5. Peptídio isolado caracterizado pelo fato deque compreende dois fragmentos de um peptídio, que consiste daseqüência de aminoácidos na SEQ ID N0 1 (lie - Asp - Gln - Gln -Val - Leu - Ser - Arg - Ile - Lys - Leu - Glu - lie - Lys - Arg - Cys- Leu).

6. Peptídio isolado caracterizado pelo fato deque compreende duas repetições de um fragmento de um peptídio,que consiste da seqüência de aminoácidos na SEQ ID N0 1 (lie -Asp - Gln - Gln - Val - Leu - Ser - Arg - Ile - Lys - Leu - Glu - lie- Lys - Arg - Cys - Leu).

7. Peptídio isolado caracterizado pelo fato deque um aminoácido em ordem reversa D, com base na seqüênciade aminoácidos para um fragmento de um peptídio, que consisteda seqüência de aminoácidos na SEQ ID N0 1 (lie - Asp - Gln -Gln - Val - Leu - Ser - Arg - Ile - Lys - Leu - Glu - lie - Lys - Arg- Cys - Leu).

8. Peptídio isolado caracterizado pelo fato deque compreende um fragmento de um peptídio, que consiste daseqüência de aminoácidos na SEQ ID N0 1 (lie - Asp - Gln - Gln -Val - Leu - Ser - Arg - Ile - Lys - Leu - Glu - lie - Lys - Arg - Cys- Leu), fundido em um anticorpo, fragmento de um anticorpo ouuma molécula similar a anticorpo.

9. Peptídio isolado caracterizado pelo fato deque compreende um fragmento de um peptídio, que consiste daseqüência de aminoácidos na SEQ ID N0 1 (lie - Asp - Gln - Gln -Val - Leu - Ser - Arg - Ile - Lys - Leu - Glu - lie - Lys - Arg - Cys- Leu), e pelo menos um e até 25 aminoácidos adicionaisflanqueando a extremidade 3' ou 5' do peptídio, em que o ditopeptídio isolado não compreende o peptídio consistindo daseqüência de aminoácidos na SEQ ID N0 1 (lie - Asp - Gln - Gln -Val - Leu - Ser - Arg - Ile - Lys - Leu - Glu - lie - Lys - Arg - Cys- Leu).

10. Acido nucléico caracterizado pelo fato deque codifica uma seqüência de aminoácidos correspondente aopeptídio de acordo com a reivindicação 1, e seus homólogos,fragmentos e variantes.

11. Composição caracterizada pelo fato de quecompreende um ou mais ácidos nucléicos, de acordo com areivindicação 10, e um transportador farmaceuticamenteaceitável.

12. Processo de tratamento de uma condição emum mamífero requerendo remoção ou destruição de células,caracterizado pelo fato de que compreende a administração aomamífero de uma quantidade terapeuticamente efetiva do peptídiode acordo com a reivindicação 1.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o peptídio é administrado por umprocesso selecionado do grupo que consiste de oralmente,subcutaneamente, intradermicamente, intranasalmente,intravenosamente, intramuscularmente, intratecalmente,intranasalmente, intratumoralmente, topicamente etransdermicamente.

14. Processo de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que é conduzido no mamífero, antes,durante ou depois do tratamento do mamífero com um tratamentoselecionado do grupo consistindo de excisão cirúrgica,transplante, enxerto, quimioterapia, imunoterapia, vacinação,ablação térmica ou elétrica, crioterapia, terapia de laser,fototerapia, terapia de gene e radiação.

15. Processo de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que a condição é um tumor benignoou maligno de um tecido, que é selecionado do grupo consistindode pulmão, mama, estômago, pâncreas, próstata, bexiga, osso,ovário, pele, rim, seio, cólon, intestino, estômago, reto, esôfago,coração, baço, glândula salivar, sangue, cérebro e as suascoberturas, medula espinal e as suas coberturas, músculo, tecidoconectivo, adrenal, paratiróide, tiróide, útero, testículos, pituitária,órgãos reprodutores, fígado, bexiga de bile, olho, ouvido, nariz,garganta, amídalas, boca, nós linfáticos e sistema linfóide.

16. Processo de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que a condição é uma hiperplasia,hipertrofia ou supercrescimento de um tecido, que é selecionadodo grupo consistindo de pulmão, mama, estômago, pâncreas,próstata, bexiga, osso, ovário, pele, rim, seio, cólon, intestino,estômago, reto, esôfago, coração, baço, glândula salivar, sangue,cérebro e as suas coberturas, medula espinal e as suas coberturas,músculo, tecido conectivo, adrenal, paratiróide, tiróide, útero,testículos, pituitária, órgãos reprodutores, fígado, bexiga de bile,olho, ouvido, nariz, garganta, amídalas, boca, nós linfáticos esistema linfóide.

17. Processo de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que a condição é um tecido alteradoviralmente, bacterialmente ou parasiticamente, que é selecionadodo grupo consistindo de pulmão, mama, estômago, pâncreas,próstata, bexiga, osso, ovário, pele, rim, seio, cólon, intestino,estômago, reto, esôfago, coração, baço, glândula salivar, sangue,cérebro e as suas coberturas, medula espinal e as suas coberturas,músculo, tecido conectivo, adrenal, paratiróide, tiróide, útero,testículos, pituitária, órgãos reprodutores, fígado, bexiga de bile,olho, ouvido, nariz, garganta, amídalas, boca, nós linfáticos esistema linfóide.

18. Processo de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que a condição é uma má formação deum tecido, que é selecionado do grupo consistindo de pulmão,mama, estômago, pâncreas, próstata, bexiga, osso, ovário, pele,rim, seio, cólon, intestino, estômago, reto, esôfago, coração, baço,glândula salivar, sangue, cérebro e as suas coberturas, medulaespinal e as suas coberturas, músculo, tecido conectivo, adrenal,paratiróide, tiróide, útero, testículos, pituitária, órgãosreprodutores, fígado, bexiga de bile, olho, ouvido, nariz, garganta,amídalas, boca, nós linfáticos e sistema linfóide.

19. Processo de prevenção ou inibição deestenose, oclusão ou bloqueio de um cateter, caracterizado pelofato de que compreende o revestimento do cateter com pelomenos uma quantidade terapeuticamente efetiva do peptídio deacordo com a reivindicação 1.