BRPI0708341A2

BRPI0708341A2 - agonistas peptìdicos seletivos do receptor vpac2

Info

Publication number: BRPI0708341A2
Application number: BRPI0708341-6A
Authority: BR
Inventors: Lianshan Zhang; Jorge Alsina-Fernandez
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2006-02-28
Filing date: 2007-02-26
Publication date: 2011-05-24
Also published as: WO2007101146A2; CA2638733A1; WO2007101146A3; US20100048460A1; MX2008011048A; AU2007220775A1; CN101389647A; JP2009528376A

Abstract

AGONISTAS PEPTIDICOS SELETIVOS DO RECEPTOR VPAC2. A presente invenção refere-se a peptídeos que ativam seletivamente o receptor VPAC2 e são úteis no tratamento de diabetes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "AGONISTASPEPTÍDICOS SELETIVOS DO RECEPTOR VPAC2".

A presente invenção refere-se a agonistas peptídicos seletivosdo receptor VPAC2.

Em particular, a presente invenção refere-se a agonistas peptídi-cos seletivos do receptor VPAC2 os quais são cíclicos.

Diabetes do tipo 2 ou diabetes mellitus não dependente de insu-lina (NIDDM) é a forma mais comum de diabetes, afetando 90% das pesso-as com diabetes. Com NIDDM, os pacientes têm função deficiente de célulasβ, resultando em produção insuficiente de insulina e/ou sensibilidade diminu-ída à insulina. Se NIDDM não é controlada, glicose em excesso se acumulano sangue, resultando em hiperglicemia. Ao longo do tempo, complicaçõesmais graves podem surgir, incluindo disfunção renal, problemas cardiovascu-lares, perda visual, ulceração de membros inferiores, neuropatia e isquemia.

Tratamentos para NIDDM incluem dieta aperfeiçoada, exercício e controlede peso, bem como uso de uma variedade de medicações orais. Indivíduoscom NIDDM podem inicialmente controlar seus níveis de glicose no sanguetomando tais medicações orais. Essas medicações, contudo, não diminuema perda progressiva de função de células β que ocorre em pacientes comNIDDM e, assim, não são suficientes para controlar os níveis de glicose nosangue nos estágios posteriores da doença. Também, tratamento com me-dicações atualmente disponíveis expõe os pacientes com NIDDM a efeitoscolaterais potenciais, tais como hipoglicemia, problemas gastrointestinais,retenção de fluxo, edema e ganho de peso.

O peptídeo de ativação de ciclase de adenilato na pituitária (PA-CAP) e o peptídeo intestinal vasoativo (VIP) pertencem à mesma família depeptídeos que a secretina e o glucagon. PACAP e VIP funcionam através detrês receptores proteína G-acoplados que exercem sua ação através dasvias de transdução de sinal cAMP-mediadas e outras Ca2+-mediadas. Essesreceptores são conhecidos como receptor do tipo 1 que prefere PACAP(PAC1) (lsobe e outros, Regul. Pept, 110: 213-217 (2003); Ogi e outros, Bi-ochem. Biophys. Res. Commun., 196: 1511-1521 (1993)) e os dois recepto-res do tipo 2 VlP-compartilhados (VPAC1 e VPAC2) (Sherwood e outros,Endocr. Rev., 21: 619-670 (2000); Hammar e outros, Pharmacol Rev, 50:265-270 (1998); Couvineau e outros, J. Biol. Chem., 278: 24759-24766(2003); Sreedharan e outros, Biochem. Biophys. Res. Commun., 193: 546-553 (1993); Lutz e outros, FEBS Lett., 458: 197-203 (1999); Adamou e ou-tros, Biochem. Biophys. Res. Commun., 209: 385-392 (1995)). Uma série deanálogos de PACAP é descrita na US 6.242.563 e WO 2000/05260.

O PACAP tem atividades comparáveis com relação a todos ostrês receptores, enquanto que o VIP ativa seletivamente os dois receptoresVPAC (Tsutsumi e outros, Diabetes, 51: 1453-1460 (2002)). Foi mostradoque o VIP (Eriksson e outros, Peptides, 10: 481-484 (1989)) e PACAP (Fi-lipsson e outros, JCEM, 82: 3093-3098 (1997)) não apenas estimulam a se-creção de insulina no homem quando fornecidos intravenosamente, mastambém aumentam a secreção de glucagon e produção hepática de glicose.

Como uma conseqüência, estimulação de PACAP ou VIP geralmente nãoresulta em um aperfeiçoamento líquido da glicemia. Ativação de múltiplosreceptores pelo PACAP ou VIP também tem amplos efeitos fisiológicos so-bre os sistemas nervoso, endócrino, cardiovascular, reprodutivo, muscular eimune (Gozes e outros, Curr. Med. Chem., 6: 1019- 1034 (1999)). Além dis-so, parece que a diarréia aquosa VlP-induzida em ratos é mediada por ape-nas um dos receptores VPAC, VPAC1 (lto e outros, Peptides, 22: 1139-1151(2001); Tsutsumi e outros, Diabetes, 51: 1453-1460 (2002)). Além disso, osreceptores VPAC1 e PAC1 são expressos sobre células α e hepatócitos e,assim, estão mais provavelmente envolvidos nos efeitos sobre a produção hepática de glicose.

Exendina-4 é encontrada nas excreções salivares do Gila Mons-ter, Heloderma Suspectum (Eng e outros, J. Biol. Chem., 267(11): 7402-7405 (1992)). Ela é um peptídeo de 39 aminoácidos, a qual tem uma ativida-de secretagoga de insulina dependente de glicose. Peptídeos agonistas deExendina e Exendina PEGuiIada em particular são descritos no WO2000/66629.

Informação obtida de estudos da estrutura e clivagem proteolíti-ca de análogos de VIP lineares tem sido usada na síntese e desenvolvimen-to de análogos de VIP cíclicos (Bolin e outros, Biopolymers (Peptide Scien-ce), 37: 57-66 (1995) e Bolin e outros, Drug Design and Discovery, 13: 107-114 (1996)). A US 5 677 419 e EP 0 536 741 (Hoffmann-La Roche Inc.) des-crevem uma série de análogos de VIP ciclizados, os quais são úteis para otratamento de asma. Um processo para a síntese de um análogo de VIP cí-clico a partir de quatro fragmentos peptídicos protegidos é descrito na US 6080 837 (também, US 6 316 593) e WO 97/29126 (Hoffmann-La Roche Inc.).Foi mostrado que um análogo de VIP cíclico em particular, identificado comoRO 15-1392, é um agonista seletivo do receptor VPAC2 (Bolin e outros, J.PharmacoL Exp. Ther., 281(2): 629-633 (1997)). Além disso, um análogo deVIP cíclico foi usado como o ponto de início para o desenvolvimento de umantagonista do peptídeo de receptor VPAC2 (Moreno e outros, Peptides, 21:1543-1549(2000)).

Estudos recentes mostraram que peptídeos seletivos para o re-ceptor VPAC2 são capazes de estimular a secreção de insulina do pâncreassem efeitos colaterais gastrointestinais (GI) e sem intensificação da liberaçãode glucagon e produção hepática de glicose (Tsutsumi e outros, Diabetes,51: 1453-1460 (2002)). Peptídeos seletivos para o receptor VPAC2 foraminicialmente identificados através de modificação do VIP e/ou PACAP (veja,por exemplo, Xia e outros, J Pharmacoi Exp Ther., 281: 629-633 (1997);Tsutsumi e outros, Diabetes, 51: 1453-1460 (2002); WO 01/23420; WO2004/006839).

Muitos dos agonistas peptídicos de receptor VPAC2 reportadosaté o momento, contudo, têm menos do que os perfis de potência, seletivi-dade e estabilidade desejados, o que poderia impedir sua viabilidade clínica.Além disso, muitos desses peptídeos não são adequados para candidatoscomerciais como um resultado de problemas de estabilidade associados aospolipeptídeos em formulação, bem como problemas com a meia-vida curtadesses polipeptídeos in vivo. Portanto, há uma necessidade por novas tera-pias, as quais superam os problemas associados às medicações atuais paraNIDDM.A presente invenção busca proporcionar compostos aperfeiçoa-dos que são seletivos para o receptor VPAC2 e os quais induzem a secre-ção de insulina a partir do pâncreas apenas na presença de altos níveis deglicose no sangue. Os compostos da presente invenção são peptídeos, osquais acredita-se que também melhorem a função de células beta. Essespeptídeos podem ter o efeito fisiológico de induzir à secreção de insulinasem efeitos colaterais Gl ou um aumento correspondente na produção hepá-tica de glicose e também têm, em geral, seletividade, potência e/ou estabili-dade intensificada in vivo do peptídeo comparado com agonistas peptídicosconhecidos do receptor VPAC2.

A presente invenção busca, particularmente, proporcionar ago-nistas peptídicos do receptor VPAC2 cíclicos tendo seletividade, potênciae/ou estabilidade aumentadas comparado com os agonistas peptídicos doreceptor VPAC2 lineares.

De acordo com primeiro aspecto da invenção, é proporcionadaum agonista peptídico do receptor VPAC2 cíclico compreendendo a seqüên-cia de aminoácido:

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De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, éproporcionada uma composição farmacêutica compreendendo um agonistapeptídico do receptor VPAC2 da presente invenção e um ou mais diluentes,veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

De acordo com um terceiro aspecto da presente invenção, éproporcionado um agonista peptídico do receptor VPAC2 cíclico da presenteinvenção para uso como um medicamento.

De acordo com um quarto aspecto da presente invenção, é pro-porcionado um agonista peptídico do receptor VPAC2 cíclico da presenteinvenção para uso no tratamento de diabetes não dependente de insulina oudiabetes dependente de insulina ou para uso na supressão da ingestão dealimento.

De acordo com um quinto aspecto da presente invenção, é pro-porcionado o uso de um agonista peptídico do receptor VPAC2 cíclico dapresente invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamentode diabetes não dependente de insulina ou diabetes dependente de insulinaou para a supressão da ingestão de alimento.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, é pro-porcionado um método de tratamento de diabetes não dependente de insuli-na ou diabetes dependente de insulina ou de supressão da ingestão de ali-mento em um paciente que precisa do mesmo compreendendo administra-ção de uma quantidade eficaz de um agonista peptídico do receptor VPAC2cíclico da presente invenção.

De acordo com ainda um outro aspecto da presente invenção, éproporcionado uma composição farmacêutica contendo um agonista peptídi-co do receptor VPAC2 cíclico da presente invenção para o tratamento dediabetes não dependente de insulina ou diabetes dependente de insulina oupara supressão da ingestão de alimento.

Os agonistas peptídicos do receptor VPAC2 da presente inven-ção têm a vantagem de que eles têm seletividade, potência e/ou estabilidadeintensificadas com relação a agonistas peptídicos do receptor VPAC2 co-nhecidos. A adição da seqüência C-terminal dè Exendina-4 ou uma variantedessa seqüência C-terminal, como a seqüência de c-revestimento, surpre-endentemente, aumentou a seletividade do receptor VPAC2, bem como aestabilidade proteolítica. Em particular, agonistas peptídicos do receptorVPAC2 cíclicos têm mobilidade conformacional restrita comparado com ago-nistas peptídicos do receptor VPAC2 lineares de tamanho pequeno/médio epor essa razão, peptídeos cíclicos têm um número menor de conformaçõespermitidas comparado com peptídeos lineares. Restrição da flexibilidadeconformacional de peptídeos lineares através de ciclização intensifica a afi-nidade de ligação ao receptor, aumenta a seletividade e melhora a estabili-dade proteolítica e biodisponibilidade comparado com peptídeos lineares.Agonistas peptídicos do receptor VPAC2 cíclicos da presente in-venção podem ser PEGuilados. PEGuilação é a fixação covalente de umaou mais moléculas de polietileno glicol (PEG), ou um derivado do mesmo, aresíduos particulares de um agonista peptídico do receptor VPAC2. Por e-xemplo, uma molécula de PEG pode ser presa a um aminoácido Iisina noagonista peptídico.

O termo "VPAC2" é usado para se referir ao receptor em particu-lar (Lutz e outros, FEBS Lett., 458: 197-203 (1999); Adamou e outros, Bio-chem. Biophys. Res. Commun., 209: 385- 392 ( 1995)) que os agonistas dapresente invenção ativam. Esse termo também é usado para se referir aosagonistas da presente invenção.

Um "agonista peptídico seletivo do receptor VPAC2" ou um "a-gonista peptídico do receptor VPAC2" da presente invenção é um peptídeoque ativa seletivamente o receptor VPAC2 para induzir a secreção de insuli-na. De preferência, a seqüência para um agonista peptídico seletivo do re-ceptor VPAC2 tem vinte e oito aminoácidos que ocorrem naturalmente e/ouque não ocorrem naturalmente e, adicionalmente, compreende uma exten-são C-terminal.

Um "agonista peptídico seletivo do receptor VPAC2 cíclico" ouum "agonista peptídico do receptor VPAC2 cíclico" é um agonista peptídicoseletivo do receptor VPAC2 ciclizado por meio de uma ligação covalente queune as cadeias laterais de dois aminoácidos na cadeia peptídica. A ligaçãocovalente pode, por exemplo, ser uma ligação em ponte de Iactama ou umaligação em ponte de dissulfeto.

O termo "ligação em ponte de lactama", conforme usado aqui,significa uma ligação covalente, em particular uma ligação de amida, queune o término amino da cadeia lateral de um aminoácido no agonista peptí-dico ao término carbóxi da cadeia lateral de outro aminoácido no agonistapeptídico. Uma ligação em ponte de lactama pode ser formada através dafixação covalente da cadeia lateral de um resíduo em Xaan à cadeia lateralde um resíduo em Xaan+4, em que η é 1 a 28. Uma ligação em ponte de lac-tama pode ser formada através da fixação covalente do término amino dacadeia lateral de um resíduo de Lys, Orn ou Dab ao término carbóxi da ca-deia lateral de um resíduo de Asp ou Glu. P403 tem uma ligação em pontede Iactama a qual é formada através da fixação covalente do término aminoda cadeia lateral do resíduo de Orn na posição 21 e do término carbóxi dacadeia lateral do resíduo de Glu na posição 25.

O termo "ligação em ponte de dissulfeto", conforme usado aqui,significa uma ligação covalente que une um átomo de enxofre no término dacadeia lateral de um aminoácido no agonista peptídico a um átomo de enxo-fre no término da cadeia lateral de outro aminoácido no agonista peptídico.

Uma ligação em ponte de dissulfeto pode ser formada através da fixaçãocovalente da cadeia lateral de um resíduo em Xaan à cadeia lateral de umresíduo em Xaan+4, em que η é 1 a 28. Uma ligação em ponte de dissulfetopode ser formada através da fixação covalente da cadeia lateral de um resí-duo de Cys ou hC à cadeia lateral de outro resíduo de Cys ou hC.

Agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 cíclicos dapresente invenção têm uma extensão C-terminal. Uma "extensão C-terminal"pode compreender uma seqüência tendo de um a trinta aminoácidos queocorrem naturalmente ou não ocorrem naturalmente ligados ao C-término daseqüência peptídica no N-término da extensão C-terminal via uma ligaçãopeptídica. Quaisquer resíduos de Cys, Lys, K(W) ou K(CO(CH2)2SH) na ex-tensão C-terminal podem ser covalentemente ligados a uma molécula dePEG e/ou o aminoácido carbóxi terminal da extensão C-terminal pode sercovalentemente ligado a uma molécula de PEG. A extensão C-terminal doP403 é GGPSSFENDAPPS (SEQ ID NO: 7).

Conforme usado aqui, o termo "ligado a", com referência ao ter-mo extensão C-terminal, inclui a adição ou fixação de aminoácidos ou gru-pos químicos diretamente ao C-término da seqüência peptídica.

Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 cíclicos dapresente invenção têm uma modificação N-terminal. A modificação N-terminal do P403 é a adição de um grupo hexanoíla. Outros exemplos demodificações N-terminais são descritos abaixo.

O termo "modificação N-terminal", conforme usado aqui, inclui aadição ou fixação de aminoácidos ou grupos químicos diretamente ao N-término de um peptídeo e a formação de grupos químicos os quais incorpo-ram o nitrogênio no N-término de um peptídeo.

Uma modificação N-terminal pode compreender a adição de umou mais aminoácidos que ocorrem naturalmente ou não ocorrem natural-mente à seqüência do agonista peptídico do receptor VPAC2, de preferênciaexistem não mais do que dez aminoácidos, com um aminoácido sendo maispreferido. Aminoácidos que ocorrem naturalmente os quais podem ser adi-cionados ao N-término incluem metionina e isoleucina. Um aminoácido modi-ficado adicionado ao N-término pode ser D-histidina. Alternativamente, osseguintes aminoácidos podem ser adicionados ao N-término: SEQ ID NO: 5Ser-Trp-Cys-Glu-Pro-Gly-Trp-Cys-Arg, em que a Arg é ligada ao N-términodo agonista peptídico. De preferência, quaisquer aminoácidos adicionadosao N-término são ligados ao N-término através de uma ligação peptídica.

O termo "ligado a", conforme usado aqui com referência ao ter-mo modificação N-terminal, inclui a adição ou fixação de aminoácidos ougrupos químicos diretamente ao N-término do agonista do receptor VPAC2.A adição das modificações N-terminais acima pode ser obtida sob condiçõesnormais de acoplamento para a formação de ligação peptídica.

O N-término do agonista peptídico pode também ser modificadoatravés da adição de um grupo alquila (R)1 de preferência um grupo Ci-Cealquila, para formar (R)NH-.

Alternativamente, o N-término do agonista peptídico pode sermodificado através da adição de um grupo da fórmula -C(O)R1 para formaruma amida da fórmula R1C(O)NH-. A adição de um grupo da fórmula -C(O)R1 pode ser obtida através da reação com um ácido orgânico da fórmu-la R1COOH. Modificação do N-término de uma seqüência de aminoácidousando acilação é demonstrada na técnica (por exemplo, Gozes e outros, J.Pharmacol Exp Ther, 273: 161-167 (1995)). A adição de um grupo da fórmu-la -C(O)R1 pode resultar na formação de um grupo uréia (veja WO 01/23240,WO 2004/006839) ou um grupo carbamato ao N-término. Também, o N-término pode ser modificado através da adição de ácido piroglutâmico ouácido 6-aminohexanóico.

O N-término do agonista peptídico pode ser modificado atravésda adição de um grupo da fórmula -SO2R5 para formar um grupo sulfonami-da no N-término.

O N-término do agonista peptídico pode também ser modificadoatravés de reação com anidrido succínico para formar um grupo succinimidano N-término. O grupo succinimida incorpora o nitrogênio no N-término dopeptídeo.

O N-término pode, alternativamente, ser modificado através daadição de sulfóxido de metionina, ácido biotinil-6-aminohexanóico ou -C(=NH)-NH2. A adição de -C(=NH)-NH2 é uma modificação por guanidação,onde a NH2 terminal do aminoácido N-terminal se torna -NH-C(=NH)-NH2.

A maioria das seqüências da presente invenção, incluindo asmodificações N-terminais e as extensões C-terminais, contém os códigospadrões com uma única letra ou três letras para os vinte aminoácidos queocorrem naturalmente. Os outros códigos usados aqui são definidos comosegue:

C6 = hexanoílaAib = ácido amino isobutíricoOMe = metóxiNle = Nor-IeucinaOrn = ornitinaK(CO(CH2)2SH) = s-(3'-mercaptopropionil)-lisinaK(W) = £-(L-triptofil)-lisinaDab = ácido diaminobutíricohC = homocisteínaPEG = polietileno glicoll-1 = uma ligação em ponte de Iactama ou dissulfeto

VIP ocorre naturalmente como uma única seqüência tendo 28aminoácidos. Contudo, o PACAP existe como um peptídeo de 38 aminoáci-dos (PACAP-38) ou como um peptídeo com 27 aminoácidos (PACAP-27)com uma carboxila amidada (Miyata e outros, Biochem Biophys Res Com-mun, 170: 643-648 (1990)). As seqüências para VIP, PACAP-27 e PACAP-38 são como segue:

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O termo "aminoácido que ocorre naturalmente", conforme usadoaqui, significa os vinte aminoácidos codificados pelo código genético huma-no (isto é, os vinte aminoácidos padrões). Esses vinte aminoácidos padrõessão: Alanina, Arginina, Asparagina, Ácido Aspártico, Cisteína, Glutamina,Ácido Glutâmico, Glicina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina,Fenilalanina, Prolina, Serina, Treonina, Triptofano, Tirosina e Valjna.

Exemplos de "aminoácidos que não ocorrem naturalmente" in-cluem aminoácidos sintéticos e aqueles modificados pelo corpo. Esses in-cluem D-aminoácidos, aminoácidos semelhantes à arginina (por exemplo,homoarginina) e outros aminoácidos tendo um metileno extra na cadeia late-ral ("homo" aminoácidos) e aminoácidos modificados (por exemplo, norleuci-na, lisina (isopropila) - em que a amina da cadeia lateral da lisina é modifi-cada por um grupo isopropila). Também incluídos são aminoácidos tais co-mo ornitina, ácido amino isobutírico e ácido 2-aminobutanóico.

"Seletivo", conforme usado aqui, refere-se a um agonista peptí-dico do receptor VPAC2 com seletividade aumentada pelo receptor VPAC2comparado com outros receptores conhecidos. Esse grau de seletividade édeterminado pela proporção de afinidade de ligação ao receptor VPAC2 paraa afinidade de ligação ao receptor VPAC1 ou pela proporção de afinidade deligação ao receptor VPAC2 para a afinidade de ligação ao receptor PAC1. Aafinidade de ligação é determinada conforme descrito abaixo no Exemplo 4.

"Atividade insulinotrópica" refere-se à capacidade de estimular asecreção de insulina em resposta a níveis elevados de glicose, desse modo,causando a captação de glicose pelas células e níveis diminuídos de glicoseno plasma. A atividade insulinotrópica pode ser avaliada através de métodosconhecidos na técnica, incluindo usar experimentos que medem a atividadede ligação ao receptor VPAC2 ou ativação de receptor (por exemplo, secre-ção de insulina por linhagens de célula de insulinoma ou ilhotas, teste detolerância à glicose intravenosa (IVGTT)1 teste de tolerância à glicose intra-peritoneal (IPGTT) e teste de tolerância à glicose oral (OGTT)). A atividadeinsulinotrópica é rotineiramente medida em seres humanos através de medi-ção dos níveis de insulina ou níveis de C-peptídeo. Agonistas peptídicos se-letivos do receptor VPAC2 da presente invenção têm atividade insulinotrópi-ca.

"Potência in vitro", conforme usado aqui, é a medida da capaci-dade de um peptídeo ativar o receptor VPAC2 em um ensaio baseado emcélula. A potência in vitro é expressa como a "EC5o", a qual é a concentraçãoeficaz de composto que resulta em 50% do aumento máximo na atividadeem um único experimento de dose-resposta. Para fins da presente invenção,a potência in vitro é determinada usando dois ensaios diferentes: DiscoveRxe Alpha Screen. Veja Exemplos 3 e 5 para outros detalhes desses ensaios.Embora esses ensaios sejam realizados de formas diferentes, os resultadosdemonstram uma correlação geral entre os dois ensaios.

O termo "meia-vida no plasma" refere-se ao tempo no qual me-tade das moléculas relevantes circulam no plasma antes de serem elimina-das. Um termo alternativamente usado é "meia-vida de eliminação". O termo"prolongada" ou "mais longa" usado no contexto de meia-vida no plasma oumeia-vida de eliminação indica que há um aumento estatisticamente signifi-cativo na meia-vida de um agonista peptídico do receptor VPAC2 PEGuiIadocom relação àquela da molécula de referência (por exemplo, a forma nãoPEGuiIada do peptídeo ou do peptídeo nativo), conforme determinado sobcondições apropriadas. Aqueles versados na técnica apreciarão que a meia-vida é um parâmetro derivado que muda como uma função da depuração evolume de distribuição.

A depuração é a medida da capacidade do corpo de eliminar umfármaco. À medida que a depuração diminui em virtude, por exemplo, demodificações em um fármaco, espera-se que a meia-vida aumente. Contudo,essa relação recíproca é exata apenas quando não há alteração no volumede distribuição. Uma relação aproximada útil entre a meia-vida Iog-Iinearterminal (t1/2>, depuração (C) e volume de distribuição (V) é fornecida pelaequação: tV2 -0,693 (V/C). A depuração não indica quanto fármaco estásendo removido mas, antes, o volume de fluido biológico, tal como sangueou plasma que teria de ser completamente liberado do fármaco para contarpara a eliminação. A depuração é expressa como um volume por unidade detempo.

"Identidade de seqüência percentual (%)", conforme usado aqui,se destina a denotar seqüências as quais, quando alinhadas, têm aminoáci-dos similares (idênticos ou conservativamente substituídos) em posições ouregiões semelhantes, onde aminoácidos idênticos ou conservativamentesubstituídos são aqueles os quais não alteram a atividade ou função da pro-teína quando comparado com a proteína inicial. Por exemplo, duas seqüên-cias de aminoácido com pelo menos 85% de identidade uma com a outratêm pelo menos 85% de similares (resíduos idênticos ou conservativamentesubstituídos) em uma posição semelhante quando alinhadas otimamente,permitindo até 3 fendas, contanto que, com relação às fendas, um total denão mais do que 15 resíduos de aminoácido seja afetado. O peptídeo dereferência usado para os cálculos dá identidade percentual de seqüênciaaqui é:

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A identidade percentual de seqüência pode ser calculada deter-minando-se o número de resíduos que diferem entre um peptídeo abrangidopela presente invenção e um peptídeo de referência, tal como P57 (SEQ IDNO: 6), tomando esse número e dividindo o mesmo pelo número de aminoá-cidos no peptídeo de referência (por exemplo, 39 aminoácidos para P57),multiplicando-se o resultado por 10O e subtraindo esse número resultante de100. Por exemplo, uma seqüência tendo 39 aminoácidos com quatro amino-ácidos que são diferentes de P57 teria uma identidade percentual (%) deseqüência de 90% (por exemplo, 100 - ((4 / 39) χ 100)). Para uma seqüênciaque é mais longa do que 39 aminoácidos, o número de resíduos que difereda seqüência do P57 incluirá òs aminoácidos adicionais além dos 39 parafins do cálculo antes mencionado. Por exemplo, uma seqüência tendo 41aminoácidos, com quatro aminoácidos diferentes dos 39 aminoácidos naseqüência do P57 e com dois aminoácidos adicionais no término carbóxi osquais não estão presentes na seqüência do P57, teria um total de seis ami-noácidos que diferem de P57. Assim, essa seqüência teria uma identidadepercentual (%) de seqüência de 84% (por exemplo, 100 - ((6 / 39) χ 100)). Ograu de identidade de seqüência pode ser determinado usando métodosbem-conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Wilbur, W.J. e Lipman, D.J.,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 726-730 (1983) e Myers E. e Miller W., Com-put. Appi Biosci. 4: 11-17 (1988)). Um programa o qual pode ser usado nadeterminação do grau de similaridade é o método MegAIign com um par deLipman-Pearson (usando os parâmetros preestabelecidos), o qual pode serobtido da DNAstar Inc, 1128, Selfpark Street, Madison, Wisconsin, 53715,EUA como parte do sistema Lasergene. Outro programa o qual pode serusado é o Clustal W. Esse é um pacote de alinhamento múltiplo de seqüên-cia desenvolvido por Thompson e outros (Nucleic Acids Research, 22(22):4673- 4680(1994)) para seqüências de DNA ou proteína. Essa ferramenta éútil para realizar comparações entre espécies de seqüências relacionadas evisualização de conservação de seqüência. O Clustal W é um programa dealinhamento de seqüência múltipla de uso geral para DNA ou proteínas. Eleproduz alinhamentos de seqüência múltipla biologicamente significativo deseqüências divergentes. Ele calcula a melhor combinação para as seqüên-cias selecionadas e alinha as mesmas de modo a identificar similaridades eas diferenças podem ser observadas. Relações evolucionárias podem serobservadas via Cladogramas ou Filogramas.Um agonista peptídico seletivo do receptor VPAC2 cíclico é sele-tivo para o receptor VPAC2 e pode ter uma identidade de seqüência na faixade 60% a 70%, 60% a 65%, 65% a 70%, 70% a 80%, 70% a 75%, 75% a80%, 80% a 90%, 80% a 85%, 85% a 90%, 90% a 97%, 90% a 95% ou 95%a 97%, com P57 (SEQ ID NO: 6). P403 tem uma identidade de seqüência de85% com P57.

O termo "PEG", conforme usado aqui, significa uma molécula depolietileno glicol. Em sua forma típica, o PEG é um polímero linear com gru-pos hidroxila terminais e tem a fórmula H0-CH2CH2-(CH2CH20)w-CH2CH2-OH, onde η é de cerca de 8 a cerca de 4000. O hidrogênio terminal pode sersubstituído por um grupo protetor, tal como um grupo alquila ou alcanok Depreferência, o PEG tem pelo menos um grupo hidróxi, mais preferivelmenteum grupo hidróxi terminal. É esse grupo hidróxi o qual é, de preferência, ati-vado para reagir com o peptídeo. Numerosos derivados de PEG existem natécnica. (Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos: 5.445.090; 5.900.461;5.932.462; 6.436.386; 6.448.369; 6.437.025; 6.448.369; 6.495.659;6.515.100 e 6.514.491 e Zalipsky, S. Bioconjugate Chem. 6: 150-165, 1995).O peso molecular da molécula de PEG é, de preferência, de 500-100.000daltons. O PEG pode ser linear ou ramificado e agonistas peptídicos do re-ceptor VPAC2 PEGuiIados podem ter uma, duas ou três moléculas de PEGpresas ao peptídeo. É mais preferível que existam uma ou duas moléculasde PEG por agonista peptídico do receptor VPAC2 PEGuilado. Considera-seainda que ambas as extremidades da molécula de PEG podem ser homo- ouheterofuncionalizadas para ligação reticulada de dois ou mais agonistas pep-tídicos do receptor VPAC2 juntos.

Na presente invenção, uma molécula de PEG pode ser covalen-temente presa ao resíduo de Lys do P403. Qualquer resíduo de Lys em umagonista peptídico pode ser substituído por um K(W) ou K(CO(CH2)2SH) oqual pode, então, ser PEGuilado. K(W) é um resíduo de Trp acoplado à ca-deia lateral de um resíduo de Lys e é PEGuilado através de fixação covalen-te de uma molécula de PEG ao resíduo de Trp. Um grupo K(CO(CH2)2SH) éPEGuilado para formar K(CO(CH2)2S-PEG).O termo "PEGuilação", conforme usado aqui, significa a fixaçãocovalente de uma ou mais moléculas de PEG1 conforme descrito acima, aoagonista peptídico do receptor VPAC2.

A região do VIP do tipo silvestre de ácido aspártico na posição 8para a isoleucina na posição 26 tem uma estrutura de alfa-hélice. Aumentodo teor helicoidal de um peptídeo intensifica a potência e seletividade en-quanto que, ao mesmo tempo, melhora a proteção contra degradação enzi-mática. O uso de uma extensão C-terminal, tal como uma extensão de E-xendina-4, pode intensificar a helicoidicidade do peptídeo. Além disso, a in-trodução de uma ligação covalente, por exemplo, uma ligação em ponte delactama, que une as cadeias laterais de dois aminoácidos sobre a superfícieda hélice, também intensifica a helicoidicidade do peptídeo.

PEGuilação de proteínas pode superar muitos dos problemasfarmacológicos e toxicológicos/imunológicos associados ao uso de peptí-deos ou proteínas como produtos terapêuticos. Contudo, para qualquer pep-tídeo individual, não se sabe se a forma PEGuiIada do peptídeo terá perdasignificativa de bioatividade quando comparado com uma forma não PEGui-lada do peptídeo.

A bioatividade de proteínas PEGuiIadas pode ser afetada por fa-tores tais como: i) o tamanho da molécula de PEG; ii) os sítios particularesde fixação; iii) o grau de modificação; iv) condições de acoplamento adver-sas; v) sé um Iigante é usado para fixação ou se o polímero é diretamentepreso; vi) geração de co-produtos prejudiciais; vii) o dano imposto pelo polí-mero ativado; ou viii) retenção de carga. O trabalho realizado sobre a PEGui-lação de citocinas, por exemplo, mostra o efeito que a PEGuilação pode ter.Dependendo da reação de acoplamento usada, modificação de citocinascom polímero resultou em reduções dramáticas na bioatividade [Francis,G.E. e (1998) PEGyIation of cytokines and other therapeutic proteins andpeptides: the importance of biological optimization of coupling techniques,Intl. J. Hem. 68: 1-18]. Manter a bioatividade de peptídeos PEGuiIados é a-inda mais problemático do que para proteínas. Uma vez que peptídeos sãomenores do que proteínas, modificação através de PEGuilação pode ter po-tencialmente um maior efeito sobre a bioatividade.

Os agonistas peptídicos do receptor VPAC2 da presente inven-ção podem ser modificados através da fixação covaíente de uma moléculade um polietileno glicol (PEG) e podem ter perfis farmacocinéticos aperfeiço-ados em virtude de degradação proteolítica mais lenta e depuração renal.

Fixação de uma molécula de PEG (PEGuilação) aumentará o tamanho evi-dente dos agonistas peptídicos do receptor VPAC2, assim, reduzindo a fil-tração renal e alterando a biodistribuição. PEGuilação pode proteger epíto-pos antigênicos dos agonistas peptídicos do receptor VPAC2, assim, redu-zindo a depuração do retículo endotelial e reconhecimento pelo sistema i-mune e também reduzindo a degradação por enzimas proteolíticas, tal comoDPP-IV.

Fixação covaíente de uma molécula de PEG a um pequeno ago-nista peptídico do receptor VPAC2 biologicamente ativo impõe ò risco deafetar adversamente o agonista, por exemplo, através de desestabilizaçãoda estrutura secundária inerente e conformação bioativa e reduzindo a bioa-tividade, de modo a tornar o agonista inadequado para uso como um produtoterapêutico. Contudo, PEGuilação de um agonista peptídico do receptorVPAC2 pode, surpreendentemente, resultar em um agonista peptídico doreceptor VPAC2 PEGuiIado biologicamente ativo com uma meia-vida pro-longada e depuração reduzida quando comparado com aquelas de agonis-tas peptídicos do receptor VPAC2 não PEGuilados.

De forma a determinar os sítios de PEGuilação potenciais emum agonista peptídico do receptor VPAC2, varredura de serina pode serconduzida. Um resíduo de Ser é substituído em uma posição particular nopeptídeo e o peptídeo Ser-modificado é testado com relação à potência eseletividade. Se a substituição de Ser tem um impacto mínimo sobre a po-tência e o peptídeo Ser-modificado é seletivo para o receptor VPAC2, o resí-duo de Ser é, então, substituído por um resíduo de Cys ou Lys, o qual servecomo um sítio de PEGuilação direto ou indireto. PEGuilação indireta do resí-duo é a PEGuilação de um grupo químico ou resíduo o qual está ligado aoresíduo do sítio de PEGuilação. PEGuilação indireta de Lys inclui PEGuiIa-ção de K(W) e K(CO(CH2)2SH).

Agonistas peptídicos do receptor VPAC2 da presente invençãopodem ser covalentemente presos a uma molécula de polietileno glicol(PEG) ou um derivado da mesma. PEGuilação pode intensificar a meia-vidados agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2, resultando em ago-nistas peptídicos do receptor VPAC2 PEGuiIados com uma meia-vida deeliminação de pelo menos uma hora, de preferência pelo menos 3, 5, 7, 10,15, 20 ou 24 horas e, mais preferivelmente, pelo menos 48 horas. Agonistaspeptídicos do receptor VPAC2 PEGuiIados têm, de preferência, um valor dedepuração de 200 ml/h/kg ou menos, mais preferivelmente 180, 150, 120,100, 80, 60 ml/h/kg ou menos e, ainda mais preferivelmente, menos do que50, 40 ou 20 ml/h/kg.

A presente invenção abrange a descoberta de que aminoácidosespecíficos adicionados ao C-término de uma seqüência peptídica para umagonista peptídico do receptor VPAC2 pode proteger o peptídeo, bem comopode intensificar a atividade, seletividade e/ou potência. Por exemplo, essasextensões C-terminais podem estabilizar a estrutura helicoidal do peptídeo eestabilizar sítios localizados próximos do C-término os quais são propensosà clivagem enzimática. Ainda, muitos dos peptídeos C-terminalmente esten-didos divulgados aqui podem ser mais seletivos para o receptor VPAC2 epodem ser mais potentes do que o VIP, PACAP e outros agonistas peptídi-cos do receptor VPAC2 conhecidos. Um exemplo de uma extensão C-terminal é o peptídeo de extensão Exendina-4; GGPSSFENDAPPS. Essaextensão C-terminal de Exendina-4 é a extensão C-terminal do P403. A E-xendina-4 é encontrada nas excreções salivares do Gila Monster, HelodermaSuspectum, (Eng e outros, J. Bioi Chem., 267(11): 7402-7405 (1992)). Ou-tros exemplos de extensões C-terminais são as seqüências C-terminais dehelodermina e helospectina. Helodermina e helospectina também são en-contradas nas excreções salivares do Gila Monster.

Portanto, descobriu-se, além disso, que modificação do N-término do agonista peptídico do receptor VPAC2 pode intensificar a potên-cia e/ou proporcionar estabilidade contra clivagem pela DPP-IV.VIP e alguns agonistas peptídicos do receptor VPAC2 conheci-dos são suscetíveis à clivagem por várias enzimas e, assim, têm uma curtameia-vida in vivo. Vários sítios de clivagem enzimática nos agonistas peptí-dicos do receptor VPAC2 são discutidas abaixo. Os sítios de clivagem sãodiscutidos com relação às posições de aminoácido no VIP (SEQ ID NO: 2) esão aplicáveis às seqüências mencionadas aqui.

Clivagem do agonista peptídico pela enzima dipeptidil-peptidase-IV (DPP-IV) ocorre entre a posição 2 (serina no VIP) e a posição 3 (ácidoaspártico no VIP). Os compostos da presente invenção podem ser tornadosmais estáveis à clivagem pela DPP-IV nessa região através da adição deuma modificação N-terminal. Exemplos de modificações N-terminais quepodem melhorar a estabilidade contra clivagem pela DPP-IV incluem a adi-ção de acetila, propionila, butirila, pentanoíla, hexanoíla, metionina, sulfóxidode metionina, 3-fenilpropionila, fenilacetila, benzoíla, norleucina, D-histidina,isoleucina, 3-mercaptopropionila, ácido biotinil-6-aminohexanóico ouC(=NH2)-NH2.

Existem sítios de clivagem de quimiotripsina no VIP do tipo sil-vestre entre os aminoácidos 10 e 11 (tirosina e treonina) e aqueles em 22 e23 (tirosina e leucina). Substituição de Tyr(OMe) por tirosina pode aumentara estabilidade no sítio 10-11. Uma ligação em ponte de lactama, por exem-plo, unindo as cadeias laterais dos aminoácidos nas posições 21 e 25, podeproteger o sítio 22-23 de clivagem.

Há um sítio de clivagem de tripsina entre os aminoácidos nasposições 12 e 13 do VIP do tipo silvestre. Determinados aminoácidos tornamo peptídeo menos suscetível à clivagem nesse sítio, por exemplo, ornitina naposição 12.

No VIP do tipo silvestre e em numerosos agonistas peptídicos doreceptor VPAC2 conhecidos na técnica, existem sítios de clivagem entre osaminoácidos básicos nas posições 14 e 15 e entre aqueles nas posições 20e 21. Os agonistas peptídicos seletivos do recepto VPAC2 cíclicos da pre-sente invenção podem ter estabilidade proteolítica aperfeiçoada in vivo emvirtude de substituições nesses sítios. As substituições preferidas nessessítios são aquelas as quais tornam o peptídeo menos suscetível à clivagempor enzimas semelhantes à tripsina, incluindo tripsina. Por exemplo, ácidoamino isobutírico na posição 15 e ornitina na posição 21 são substituiçõespreferidas as quais podem levar à estabilidade aperfeiçoada.

Há também um sítio de clivagem entre os aminoácidos nas posi-ções 25 e 26 do VIP do tipo silvestre.

A região do agonista peptídico do receptor VPAC2 abrangendoos aminoácidos nas posições 27, 28 e 29 também é suscetível à clivagemenzimática. A adição de uma extensão C-terminal pode tornar o agonistapeptídico mais estável contra neuroendopeptidase (NEP) e pode tambémaumentar a seletividade pelo receptor VPAC2. Essa região pode também seratacada por enzimas semelhantes à tripsina. Se isso ocorre, o agonista pep-tídico pode perder sua extensão C-terminal com a atividade de carbóxi pep-tidase adicional levando a uma forma inativa do peptídeo. Resistência à cli-vagem nessa região pode ser aumentada substituindo o aminoácido na po-sição 27 e/ou 28 por ornitina.

Além dos agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 cí-clicos com resistência à clivagem por várias peptidases, os agonistas peptí-dicos seletivos do receptor VPAC2 cíclicos da presente invenção podemtambém abranger peptídeos com seletividade intensificada pelo receptorVPAC2, potência aumentada e/ou estabilidade aumentada comparado comalguns peptídeos conhecidos na técnica.

De preferência, os agonistas peptídicos seletivos do receptorVPAC2 cíclicos da presente invenção têm um valor de EC5O de menos de 2nM. Mais preferivelmente, o valor de EC5O é de menos de 1 nM. Ainda maispreferivelmente, o valor de EC50 é de menos de 0,5 nM. Ainda mais preferi-velmente, o valor de EC50 é de menos de 0,1 nM.

De preferência, os agonistas da presente invenção têm umaproporção de seletividade onde a afinidade pelo receptor VPAC2 é pelo me-nos 50 vezes maior do que pelos receptores VPAC1 e/ou PAC1. Mais prefe-rivelmente, essa afinidade é pelo menos 100 vezes maior pelo VPAC2 doque pelo VPAC1 e/ou pelo PAC1. Ainda mais preferivelmente, a afinidade épelo menos 200 vezes maior pelo o VPAC2 do que pelo VPAG1 e/ou peloPAC1. Ainda mais preferivelmente, a afinidade é 500 vezes maior peloVPAC2 do que pelo VPAC1 e/ou pelo PAC1. Ainda mais preferivelmente, aproporção é pelo menos 1000 vezes maior pelo VPAC2 do que pelo VPAC1e/ou pelo PAC1.

Conforme usado aqui, "agonistas peptídicos seletivos do recep-tor VPAC2 cíclicos" também incluem sais farmaceuticamente aceitáveis dosagonistas descritos aqui. Um agonista peptídico seletivo do receptor VPAC2da invenção pode possuir grupos funcionais suficientemente ácidos, suficien-temente básicos ou ambos e, conseqüentemente, reagem com qualqueruma de uma série de bases inorgânicas e ácidos inorgânicos e orgânicospara formar um sal. Ácidos comumente empregados para formar sais de a-dição de ácido são ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bro-mídrico, ácido iodídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico e semelhantes e áci-dos orgânicos, tais como ácido p-toluenossulfônico, ácido metanossulfônico,ácido oxálico, ácido p-bromofenil-sulfônico, ácido carbônico, ácido succínico,ácido cítrico, ácido benzóico, ácido acético, ácido trifluoroacético e seme-lhantes. Exemplos de tais sais incluem os sais sulfato, pirossulfato, bissulfa-to, sulfito, bissulfito, fosfato, monohidrogeno fosfato, dihidrogeno fosfato, me-tafosfato, pirofosfato, cloreto, brometo, iodeto, acetato, propionato, decanoa-to, caprilato, acrilato, formato, isobutirato, caproato, heptanoato, propiolato,oxalato, malonato, succinato, suberato, secabato, fumarato, maleato, butino-1,4-dioato, hexino-1,6-dioato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dini-trobenzoato, hidróxibenzoato, metoxibenzoato, ftalato, sulfonato, xilenossul-fonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenilbutirato, citrato, lactato, gama-hidróxibutirato, glicolato, tartatato, metanossulfonato, propanossulfonato,naftaleno-1 -sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, mandelato e semelhantes.

Sais de adição de base incluem aqueles derivados de bases i-norgânicas, tais como amônio ou hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos de metal alcalino ou metal alcalino-terroso e semelhantes. Tais bases úteis napreparação dos sais da presente invenção, assim, incluem hidróxido de só-dio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, carbonato de potássio esemelhantes.

Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 cíclicos dapresente invenção são, de preferência, formulados como composições far-macêuticas. Técnicas de formulação farmacêutica padrão podem ser em-pregadas, tais como aquelas descritas em Remington1S Pharmaceutical Scl·ences, Mack Publishing Company, Easton1 PA. Os agonistas peptídicos se-Jetivos do receptor VPAC2 da presente invenção podem ser formulados paraadministração através das vias bucal, tópica, oral, transdérmica, nasal oupulmonar ou para administração parenteral.

Administração parenteral pode incluir, por exemplo, administra-ção sistêmica, tal como através de injeção intramuscular, intravenosa, sub-cutânea, intradérmica ou intraperitoneal. Os agonistas peptídicos seletivosdo receptor VPAC2 cíclico podem ser administrados ao indivíduo em conjun-to com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável comoparte de uma composição farmacêutica para o tratamento de NIDDM ou osdistúrbios discutidos abaixo. A composição farmacêutica pode ser uma solu-ção ou, se administrada parenteralrnente, uma suspensão do agonista pep-tídico do receptor VPAC2 ou uma suspensão do agonista peptídico do re-ceptor VPAC2 cíclico em complexo com um cátion de metal divalente, talcomo zinco. Veículos farmacêuticos adequados podem conter ingredientesinertes os quais não interagem com o peptídeo ou derivado peptídico. Veícu-los farmacêuticos adequados para administração parenteral incluem, porexemplo, água estéril, solução salina fisiológica, solução salina bacteriostáti-ca (solução salina contendo cerca de mg/ml de álcool benzílico a 0,9%), so-lução salina tamponada com fosfato, solução de Hank, Iactato de Ringer esemelhantes. Alguns exemplos de excipientes adequados incluem lactose,dextrose, sacarose, trealose, sorbitol e manitol.

Os agonistas peptídicos do receptor VPAC2 cíclicos da invençãopodem ser formulados para administração de modo que os níveis no plasmasangüíneo sejam mantidos na faixa eficaz durante períodos de tempo pro-longados. A principal barreira à distribuição oral eficaz de fármaco peptídicoé a pobre biodisponibilidade em virtude de degradação de peptídeos por áci-dos e enzimas, pobre absorção através das membranas epiteliais e transi-ção de peptídeos para uma forma insolúvel após exposição ao ambientecom pH ácido no trato digestivo. Sistemas de distribuição oral para peptí-deos, tais como aqueles abrangidos pela presente invenção, são conhecidosna técnica. Por exemplo, agonistas peptídicos do receptor VPAC2 cíclicospodem ser encapsulados usando microesferas e, então, distribuídos oral-mente. Por exemplo, agonistas peptídicos do receptor VPAC2 cíclicos po-dem ser encapsulados usando microesferas compostas de um polímero bio-compatível, biodegradável comercialmente disponível, poli(lactídeo-co-glicolídeo)-COOH e óleo de oliva como um enchimento (veja Joseph, e ou-tros. DiabetoIogia 43: 1319-1328 (2000)). Outros tipos de tecnologia de mi-croesfera também estão comercialmente disponíveis, tais como polímerosbiodegradáveis Medisorb® e Prolease® da Alkermes. Polímeros Medisorb®podem ser produzidos com qualquer um dos isômeros de lactídeo. Propor-ções de lactídeo:glicolídeo podem ser variadas entre 0:100 e 100:0, permi-tindo uma ampla faixa de propriedades do polímero. Isso permite o designdos sistemas de distribuição e dispositivos implantáveis com tempos de re-absorção oscilando de semanas a meses. A Emisphere também publicounumerosos artigos discutindo a tecnologia de distribuição oral para peptí-deos e proteínas. Por exemplo, veja WO 95/28838 por Leone-bay e outros, oqual descreve veículos específicos compreendidos de aminoácidos modifi-cados para facilitar a absorção.

Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 cíclicosdescritos aqui podem ser usados para tratar indivíduos com uma ampla vari-edade de doenças e condições. Agonistas abrangidos pela presente inven-ção exercem seus efeitos biológicos atuando em um receptor referido comoo receptor VPAC2. Indivíduos com doenças e/ou condições que respondemfavoravelmente à estimulação do receptor VPAC2 ou à administração deagonistas peptídicos do receptor VPAC2 podem, portanto, ser tratados comos agonistas de VPAC2 cíclicos da presente invenção. Esses indivíduos sãomencionados como "precisando de tratamento com agonistas de VPAC2" ou"precisando de estimulação do receptor VPAC2".Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 cíclicos dapresente invenção podem ser empregados para tratar diabetes, incluindodiabetes do tipo 1 e do tipo 2 (diabetes mellitus não dependente de insulinaou NIDDM). Os agonistas também podem ser usados para tratar indivíduosrequerendo tratamento profilático com um agonista do receptor VPAC2, porexemplo, indivíduos em risco de desenvolver NIDDM. Tal tratamento podetambém retardar o início de diabetes e complicações diabéticas. Indivíduosadicionais os quais podem ser tratados com os agonistas da presente inven-ção incluem aqueles com tolerância deficiente à glicose (IGT) (Expert Com-mittee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Sup. 1): S5,1999) ou glicose deficiente em jejum (IFG) (Charles e outros, Diabetes 40:796, 1991), indivíduos cujo peso corporal está cerca de 25% acima do pesocorporal normal para a altura e estrutura corporal do indivíduo, indivíduostendo um ou mais dos pais com NIDDM, indivíduos que tinham tido diabetesgestacional e indivíduos com distúrbios metabólicos, tais como aqueles re-sultantes de secreção diminuída de insulina endógena. Os agonistas peptí-dicos seletivos do receptor VPAC2 podem ser usados para impedir indiví-duos com tolerância deficiente à glicose de prosseguir para desenvolverNIDDM, impedir deterioração de células β pancreáticas, induzir a prolifera-ção de células β, melhorar a função de células β, ativar células β dormentes,diferenciar células em células β, estimular a replicação de células β e inibir aapoptosé de células β. Outras doenças e condições que podem ser tratadasou prevenidas usando agonistas da invenção em métodos da invenção in-cluem: Diabetes do Jovem com Início na Maturidade (MODY) (Herman eoutros, Diabetes 43: 40, 1994); Diabetes Auto-imune Latente em Adultos(LADA) (Zimmet e outros, Diabetes Med. 11: 299, 1994); diabetes gestacio-nal (Metzger, Diabetes, 40: 197, 1991); síndrome X metabólica, dislipidemia,hiperglicemia, hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia e resistência à insulina.

Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 cíclicos dainvenção podem também ser usados em métodos da invenção para tratarcausas secundárias de diabetes (Expert Committee on Classification of Dia-betes Mellitus, Diabetes Care 22 (Sup. 1): S5, 1999). Tais causas secundá-rias incluem excesso de glicocorticóide, excesso de hormônio do crescimen-to, feocromocitoma e diabetes fármaco-induzido. Fármacos que podem in-duzir ao diabetes incluem, mas não estão limitados a, piriminil, ácido nicotí-nico, glicocorticóides, fenitoína, hormônio da tiróide, agentes β-adrenérgicos,α-interferon e fármacos usados para tratar infecção pelo HIV.

Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 cíclicos dapresente invenção podem ser eficazes na supressão da ingestão de alimen-to e no tratamento de obesidade.

Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 cíclicos dapresente invenção também podem ser eficazes na prevenção ou tratamentode distúrbios tais como hiperlipidemia por doença aterosclerótica, hipercoles-teremia, baixos níveis de HDL1 hipertensão, hipertensão pulmonar primária,doença cardiovascular (incluindo aterosclerose, doença cardíaca coronaria-na e doença da artéria coronária), doença cerebrovascular e doença do vasoperiférico; e para o tratamento de lupus, síndrome de ovário policístico, car-cinogênese e hiperplasia, problemas de reprodução em homens e mulheres,distúrbios sexuais, úlceras, distúrbios do sono, distúrbios do metabolismo delipídio e carboidrato, disfunção circadiano, distúrbios de crescimento, distúr-bios da homeostase de energia, doenças imunes, incluindo doenças auto-imunes (por exemplo, lupus eritematoso sistêmico), bem como doenças in-flamatórias agudas e crônicas, artrite reumatóide e choque séptico.

Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 cíclicos dapresente invenção podem também ser úteis para o tratamento de distúrbiosfisiológicos relacionados, por exemplo, à diferenciação celular para produzircélulas que acumulam lipídio, regulação de sensibilidade à insulina e dosníveis de glicose no sangue, os quais estão envolvidos, por exemplo, emfunção anormal de células β pancreáticas, tumores que secretam insulinae/ou hipoglicemia auto-imune em virtude de auto-anticorpos à insulina, auto-anticorpos ao receptor de insulina ou auto-anticorpos que são estimulatóriosde células β pancreáticas, diferenciação de macrófago a qual leva à forma-ção de placas ateroscleróticas, resposta inflamatória, carcinogênese, hiper-plasia, expressão de gene de adipócito, diferenciação de adipócito, reduçãona massa de células β pancreáticas, secreção de insulina, sensibilidade te-cidual à insulina, crescimento de células de lipossarcoma, doença de ováriopolicístico, anovulação crônica, hiperandrogenismo, produção de progeste-rona, esteroidogênese, estresse por potencial redox e oxidativo em células,produção de sintase de oxido nítrico (NOS), gama glutamil transpeptidaseaumentada, catalase, triglicerídeos no plasma, HDL e LDL colesterol e se-melhantes.

Além disso, os agonistas peptídicos seletivos do receptorVPAC2 cíclicos da invenção podem ser usados para o tratamento de asma(Bolin e outros, Biopolymer37: 57-66 (1995); Patente U.S. Ne 5.677.419; quemostram que o polipeptídeo R3PO é ativo no relaxamento do músculo lisotraqueal de porquinhos-da-índia); indução de hipotensão (VIP induz à hipo-tensão, taquicardia e rubor facial em pacientes asmáticos (Morice e outros,Peptides 7: 279-280 (1986); Morice e outros, Lancet 2: 1225-1227 (1983));para o tratamento de problemas de reprodução masculina (Siow e outros,Arch. AndroL 43(1): 67-71 (1999)); como um agente antiapopto-se/neuroprotetor (Brenneman e outros, Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 865: 207-12(1998)); para a cardioproteção durante eventos isquêmicos (Kalfin e outros,J. Pharmacol. Exp. Ther. 1268(2): 952-8 (1994); Das e outros, Ann. Ν. Y.Acad. Sei. 865: 297-308 (1998)); para a manipulação do relógio circadiano eseus distúrbios associados (Hamar e outros, Ceil 109: 497-508 (2002); Shene outros, Proc. Natl. Acad. Sei. 97: 11575-80, (2000)); como um agente anti-úlcera (Tuncel e outros, Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 865: 309-22, (1998)); e comoum tratamento para AIDS (Branch e outros, Blood 106: Abstract 1427,(2005)).

Uma "quantidade eficaz" de um agonista peptídico seletivo doreceptor VPAC2 cíclico é a quantidade que resulta em um efeito terapêuticoe/ou profilático desejado sem causar efeitos colaterais inaceitáveis quandoadministrada a um indivíduo que precisa de estimulação do receptor VPAC2.

Um "efeito terapêutico desejado" inclui um ou mais dos seguintes: 1) um alí-vio do(s) sintoma(s) associado(s) à doença ou condição; 2) um retardo noinício dos sintomas associados à doença ou condição; 3) longevidade au-mentada comparado com a ausência do tratamento; e 4) maior qualidade devida comparado com a ausência do tratamento. Por exemplo, uma "quanti-dade eficaz" de um agonista de VPAC2 cíclico para o tratamento de NIDDMé a quantidade que resultaria em um controle da concentração de glicose nosangue maior do que na ausência de tratamento, desse modo, resultandoem um retardo no início de complicações diabéticas, tais como retinopatia,neuropatia ou doença renal. Uma "quantidade eficaz" de um agonista peptí-dico seletivo do receptor VPAC2 cíclico para a prevenção de NIDDM é aquantidade que retardaria, comparado com a ausência de tratamento, o iní-cio de níveis elevados de glicose no sangue que requer tratamento com fár-macos anti-hipoglicêmicos, tais como sulfoniluréias, tiazolidinadionas, insuli-na e/ou bisguanidinas.

Uma "quantidade eficaz" do agonista peptídico seletivo do recep-tor VPAC2 cíclico administrada a um indivíduo também dependerá do tipo egravidade da doença e das características do indivíduo, tais como saúdegeral, idade, sexo, peso corporal e tolerância a fármacos. A dose de agonis-ta peptídico seletivo do receptor VPAC2 cíclico eficaz para normalizar a gli-cose no sangue de um paciente dependerá de uma série de fatores, dentreos quais estão incluídos, sem limitação, o sexo, peso e idade do indivíduo, agravidade da incapacidade de regular a glicose no sangue, a via de adminis-tração e biodisponibilidade, o perfil farmacocinético do peptídeo, a potência ea formulação.

Uma faixa de dose típica para os agonistas peptídicos seletivosdo receptor VPAC2 cíclicos da presente invenção oscilará de cerca de 1 μgpor dia a cerca de 5000 μg por dia. De preferência, a dose oscila de cercade 1 μg por dia a cerca de 2500 μg por dia, mais preferivelmente de cerca de1 μg por dia a cerca de 1000 μg por dia. Ainda mais preferivelmente, a doseoscila de cerca de 5 μg por dia a cerca de 100 μg por dia. Uma outra faixade dose preferida é de cerca de 10 μg por dia a cerca de 50 μg por dia. Maispreferivelmente, a dose é cerca de 20 μg por dia.

Um "indivíduo" é um mamífero, de preferência, um ser humano,mas também pode ser um animal, por exemplo, animais de companhia (porexemplo, cães, gatos e semelhantes), animais de fazenda (por exemplo, va-cas, ovelha, porcos, cavalos e semelhantes) e animais de laboratório (porexemplo, ratos, camundongos, porquinhos-da-índia e semelhantes).

Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 cíclicos dapresente invenção podem ser preparados usando métodos padrão de técni-cas de síntese de peptídeo em fase sólida. Sintetizadores de peptídeo estãocomercialmente disponíveis, por exemplo, da Rainin-PTI Symphony PeptideSynthesizer (Tucson, AZ). Reagentes para síntese em fase sólida estão co-mercialmente disponíveis, por exemplo, da Glycopep (Chicago, IL). Sinteti-zadores de peptídeo em fase sólida podem ser usados de acordo com asinstruções do fabricante para bloqueio de grupos de interferência, proteçãodo aminoácido a ser reagido, acoplamento, desacoplamento e revestimentode aminoácidos não reagidos.

Tipicamente, um aminoácido α-Ν-protegido e o aminoácido N-terminal sobre a cadeia peptídica em crescimento sobre uma resina são a-coplados em temperatura ambiente em um solvente inerte, tal como dimetil-formamida, N-metilpirrolidona ou cloreto de metileno na presença de agentesde acoplamento, tais como diciclohexilcarbodiimida e 1 -hidroxibenzotriazol euma base, tal como diisopropiletilamina. O grupo de α-Ν-proteção é removi-do da resina peptídica resultante usando um reagente, tal como ácido trifluo-roacético ou piperidina, e a reação de acoplamento repetida com o próximoaminoácido N-protegido desejado a ser adicionado à cadeia peptídica. Gru-pos de proteção amina adequados são bem-conhecidos na técnica e sãodescritos, por exemplo, em Green e Wuts, "Protecting Groups in OrganicSynthesis", John Wiley and Sons, 1991. Exemplos incluem t-butóxicarbonila(tBoc) e fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc).

Os agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2 tambémpodem ser sintetizados usando protocolos padrão automáticos de sínteseem fase sólida usando t-butoxicarbonil- ou fluorenilmetoxicarbonil-alfa-aminoácidos com proteção apropriada da cadeia lateral. Após término dasíntese, os peptídeos são clivados do suporte em fase sólida com simultâ-nea desproteção da cadeia lateral usando métodos padrão com fluoreto dehidrogênio ou ácido trifluoroacético (TFA). Peptídeos brutos são, então, ain-da purificados usando Cromatografia de Fase Reversa sobre colunas VydacC18 usando gradientes de acetonitrila em TFA a 0,1%. Para remover o ace-tonitrila, os peptídeos são Iiofilizados a partir de uma solução contendo TFAa 0,1%, acetonitrila e água. A pureza pode ser verificada através de croma-tografia de fase reversa analítica. A identidade dos peptídeos pode ser verifi-cada através de espectrometria de massa. Os peptídeos podem ser solubili-zados em tampões aquosos em um pH neutro.

Os agonistas peptídicos da presente invenção também podemser feitos através de métodos recombinantes conhecidos na técnica usandohospedeiros celulares eucariotas e procariotas.

A ciclização dos agonistas peptídicos do receptor VPAC2 podeser realizada em uma solução ou sobre um suporte sólido. Ciclização sobreum suporte sólido pode ser realizada imediatamente após síntese em fasesólida do peptídeo. Isso envolve a seleção ou proteção ortogonal dos ami-noácidos os quais serão covalentemente ligados em ciclização.

Várias características e modalidades preferidas da presente in-venção serão agora descritas com referência aos exemplos não Iimitativos aseguir.

Exemplo 1 - Preparação de agonistas peptídicos seletivos do receptorVPAC2 cíclicos através de química com t-Boc em fase sólida

Aproximadamente 0,5-0,6 grama (0,35-0,45 mmol) de resina BocSer(BzI)-PAM é colocado em um vaso de reação padrão de 60 ml_. Acopla-mentos duplos são realizados sobre um sintetizador de peptídeo AppliedBiosystems AB 1433 A. Os aminoácidos com cadeia lateral protegida a se-guir (cartuchos com 2 mmol de Boc aminoácidos) são obtidos da MidwestBiotech (Fishers, IN) e são usados na síntese:

Arg-tosila (Tos), Asp-ciclohexil éster (OcHx), Asp-9-fluorenilmetila (Fm), Cys-p-metilbenzila (p-MeBzl), Glu-ciclohexil éster (O-cHx), His-benziloximetila (Bom), Lys-2-clorobenziloxicarbonila (2Cl-Z), Lys-9-fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc), Orn-2-clorobenziloxicarbonila (2Cl-Z), Ser-O-benzil éter (OBzl), Thr-O-benzil éter (OBzl), Tyr-2-bromobenziloxicarbonila(2Br-Z), resina Boc-Ser (OBzI) PAM e resina MBHA. Ácido trifluoroacético(TFA), diisopropiletilamina (DIEA), hidroxibenzotriazol a 1,0 M (HOBt) emNMP e diciclohexilcarbodiimida a 1,0 M (DCC) em NMP são adquiridos daPE-AppIied Biosystems (Foster City, CA). Dimetilformamida (DMF-Burdickand Jackson) e diclorometano (DCM-MaIIinkrodt) são adquiridos da MaysChemical Co. (Indianapolis, IN). Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfônio (BOP) é obtido da NovaBiochem (San Diego, CA).

Acoplamentos duplos padrão são realizados usando anidrido si-métrico ou HOBt ésteres, ambos formados usando DCC. Ao término da sín-tese, o grupo Boe N-terminal é removido e as resinas de peptidila são reves-tidas com um ácido orgânico, tal como ácido hexanóico, usando diisopropil-carbodiimida (DIC) em DMF. A resina é, então, tratada com piperidina a 20%em DMF durante 20 min. Os grupos de proteção Fmoc e Fm são seletiva-mente removidos e a ciclização é realizada através de ativação do grupocarboxila no ácido aspártico com BOP na presença de DIEA. A reação é dei-xada processar durante 24 horas e monitorada através de um teste com nii-drina. Após lavagem com DCM, as resinas são transferidas para um vaso dereação de TEFLON e são secas in vácuo.

Clivagens são feitas prendendo os vasos de reação a um apare-lho de HF (ácido fluorídrico) (Penninsula Laboratories). 1 mL de m-cresol porgrama/resina é adicionado e 10 mL de HF (adquirido da AGA, Indianapolis,IN) são condensados no vaso pré-esfriado. 1 mL de DMS por grama de resi-na é adicionado quando metionina está presente. As reações são agitadasuma hora em um banho de gelo. O HF é removido in vácuo. Os resíduos sãosuspensos em etil éter. Os sólidos são filtrados e são lavados com éter. Ca-da peptídeo é extraído em ácido acético aquoso e é Iiofilizado ou é carrega-do diretamente sobre uma coluna de fase reversa.

Purificações são realizadas sobre uma coluna VYDAC C18 de2,2 χ 25 cm em tampão A (TFA a 0,1% em água). Um gradiente de 20% a90% de B (TFA a 0,1% em acetonitrila) é realizado sobre uma HPLC (Wa-ters) durante 120 minutos a 10 mL/minuto enquanto se monitora a UV a 280nm (4,0 A) e coletando frações de um minuto. As frações apropriadas sãocombinadas, congeladas e liofilizadas. Os produtos secos são analisadosatravés de HPLC (METASIL AQ C 18 de 0,46 χ 15 cm) e espectrometria demassa por MALDI.

Agonistas peptídicos do receptor VPAC2 cíclicos com uma liga-ção em ponte de Iactama unindo, por exemplo, um resíduo de ornitina e umresíduo de ácido glutâmico, são preparados através de proteção seletiva dascadeias laterais desses resíduos com Fmoc e Fm, respectivamente. Todosos outros aminoácidos usados na síntese são aminoácidos com cadeia Iate-ral de benzila Boc-protegida padrão. Ciclização pode, então, ser realizadaimediatamente após síntese em fase sólida do peptídeo.Exemplo 2 - Preparo dos aqonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2cíclicos através de química com Fmoc em fase sólida

Aproximadamente 114 mg (50 mmols) de resina Fmoc-Ser (tBu)WANG (adquirida da GIycoPep, Chicago, IL) são colocados em cada vasode reação. A síntese é conduzida sobre um Sintetizador de Peptídeo RaininSymphony. Análogos com amida C-terminal são preparados usando 75 mg(50 Mmols) de resina Rink Amide AM (Rapp Polymere, Tuebingen, Alema-nha).

Os seguintes Fmoc aminoácidos são adquiridos da GIycoPep(Chicago, IL) e NovaBiochem (La Jolla, CA): Arg-2,2,4,6,7-pentame-tildihidrobenzofuran-5-sulfonila (Pbf), Asn-tritila (Trt), Asp^-t-Butil éster (tBu),Asp-p-alil éster (Allyl), Glu-õ-t-butil éster (tBu), Glu-õ-alil éster (Allyl), Gln-tritila (Trt), His-tritila (Trt), Lys-t-butiloxicarbonila (Boc), Lys-aliloxicarbonila(Aloc), Orn-aliloxicarbonila (Aloc), Ser-t-butil éter (OtBu), Thr-t-butil éter (Ot-Bu), Trp-t-butiloxicarbonila (Boc), Tyr-t-butil éter (OtBu).

Solventes dimetilformamida (DMF-Burdick and Jackson), N-metilpirrolidona (NMP-Burdick and Jackson), diclorometano (DCM-MaIIinkrodt)são adquiridos da Mays Chemical Co. (Indianapolis, IN).

Hidroxibenzotrizol (HOBt), diisopropilcarbodiimida (DIC), diiso-propiletilamina (DIEA) e piperidina (Pip) são adquiridos da Aldrich ChemicalCo (Milwaukee, Wl). Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfônio (BOP) é obtido da NovaBiochem (San Diego, CA).

Todos os aminoácidos são dissolvidos em uma concentração de0,3 M em DMF. Acoplamentos de três horas DIC/HOBt-ativados são realiza-dos após 20 minutos de desproteção usando piperidina a 20%/DMF. Cadaresina é lavada com DMF após desproteções e acoplamentos. Após o últimoacoplamento e desproteção, as resinas de peptidila são lavadas com DCM esão secas in vácuo no vaso de reação. Para a acilação N-terminal, um ex-cesso de quatro vezes de anidrido simétrico do ácido correspondente é adi-cionado sobre a resina peptídica. O anidrido simétrico é preparado atravésde ativação de DIC em DCM. A reação é deixada processar durante 4 horase monitorada através de um teste de niidrina. Os grupos de proteção Aloc eAlila são seletivamente removidos e a ciclização é realizada através de ati-vação do grupo carboxila do ácido aspártico com BOP na presença de DlEA.A resina peptídica é, então, lavada com DCM e seca in vácuo.

A reação de clivagem é misturada durante 2 horas com um co-quetel de clivagem consistindo em 0,2 mL de tioanisola, 0,2 mL de metanol,0,4 mL de triisopropilsilano por 10 mL de TFA, todos adquiridos da AldrichChemical Co., Milwaukee, Wl. Se Cys está presente na seqüência, 2% deetanoditiol são adicionados. Os filtrados de TFA são adicionados a 40 mL deetil éter. Os precipitantes são centrifugados 2 minutos a 2000 rpm. Os so-brenadantes são decantados. Os péletes são resuspensos em 40 mL de é-ter, recentrifugados, redecantados, secos sob nitrogênio e, então, secos invácuo.

0,3-0,6 mg de cada produto é dissolvido em 1 mL de TFA a0,1%/acetonitrila (ACN) com 20 μί sendo analisados sobre HPLC [METASILAQ C 18 de 0,46 χ 15 cm, 1 mL/min, 45C°, 214 nM (0,2 A), A = TFA a 0,1%,B = TFA a 0,1%/ACN a 50%. Gradiente = 50% de B a 90% de B durante 30minutos].

Purificações são realizadas sobre uma coluna VYDAC C18 de2,2 χ 25 cm em tampão A (TFA a 0,1% em água). Um gradiente de 20% a90% de B (TFA a 0,1% em acetonitrila) é realizado sobre uma HPLC (Wa-ters) durante 120 minutos a 10 mL/minuto enquanto se monitora a UV a 280nm (4,0 A) e coletando frações de 1 minuto. As frações apropriadas sãocombinadas, congeladas e liofilizadas. Os produtos secos são analisadosatravés de HPLC (METASIL AQ C 18 de 0,46 χ 15 cm) e espectrometria demassa por MALDI.

Agonistas peptídicos do receptor VPAC2 cíclicos com uma liga-ção em ponte de lactama, por exemplo, um resíduo de ornitina e um resíduode ácido glutâmico, são preparados através de proteção seletiva das cadeiaslaterais desses resíduos com Aloc e Alila, respectivamente. Todos os outrosaminoácidos usados na síntese ao Fmoc-aminoácidos com cadeia lateral det-butila protegida padrão. Ciclização pode, então, ser realizada sobre suportesólido imediatamente após a síntese em fase sólida do peptídeo.Exemplo 3 - Potência in vitro em receptores VPAC2 humanos

Alpha Screen: Células (células CHO-S expressando estavelmen-te receptores VPAC2 humanos) são lavadas no frasco de cultura uma vezcom PBS. Então, as células são enxaguadas com tampão de dissociaçãoisento de enzima. As células dissociadas são removidas. As células são,então, centrifugadas e lavadas em tampão de estimulação. Para cada pontode dados, 50.000 células suspensas em tampão de estimulação são usadas.A esse tampão, contas aceitadoras Alpha Screen são adicionadas, juntocom o estímulo. Essa mistura é incubada durante 60 minutos. Tampão deIise e contas doadoras Alpha Screen são adicionados e incubados durante60 a 120 minutos. O sinal do Alpha Screen (indicativo dos níveis de cAMPintracelulares) é lido em um instrumento adequado (por exemplo, Alpha-Quest da Perkin-Elmer). Etapas incluindo contas doadoras e aceitadorasAlpha Screen são realizadas em luz reduzida. A EC50 para geração de cAMPé calculada a partir do sinal bruto ou é baseada nos níveis de cAMP absolu-tos, conforme determinado por uma curva padrão realizada sobre cada lâmi-na. As concentrações de peptídeo de teste são: 10000, 1000, 100, 10, 3, 1,0,1, 0,01, 0,003, 0,001, 0,0001 e 0,00001 nM.

DiscoveRx: Uma linhagem de célula CHO-S expressando esta-velmente o receptor VPAC2 humano em uma lâmina de microtitulação com96 cavidades é cultivada com 50.000 células/cavidade um dia antes do en-saio. As células são deixadas fixar durante 24 horas em 200 μΙ_ de meio decultura, No dia do experimento, o meio é removido. Também, as células sãolavadas duas vezes. As células são incubadas em tampão de ensaio maisIBMX durante 15 minutos em temperatura ambiente. Após o que, estímulossão adicionados e são dissolvidos em tampão de ensaio. Os estímulos estãopresentes durante 30 minutos. Então, o tampão de ensaio é gentilmente re-movido. O reagente de Iise de célula do kit cAMP DiscoveryRx é adicionado.

Após o que, o protocolo padrão para desenvolvimento do sinal de cAMP,conforme descrito pelo fabricante, é usado (DiscoveRx Inc., EUA). Os valo-res de EC5O para geração de cAMP são calculados a partir do sinal bruto ousão baseados nos níveis de cAMP absolutos, conforme determinado poruma curva padrão realizada sobre cada lâmina. As concentrações de peptí-deo de teste são: 1000, 300, 100, 10, 1, 0,3, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 e O nM.

Exemplo 4 - Seletividade

Ensaios de ligação: Membrana preparada a partir de uma linha-gem de célula VPAC2 estável (veja Exemplo 3) ou de células transitoriamen-te transfectadas com VPAC1 ou PAC1 são usadas. Um ensaio de ligação afiltro é realizado usando PACAP-27 1251-rotulado para VPAC1, VPAC2 ePAC1 como o rastreador.

Para esse ensaio, as soluções e equipamento incluem:solução de pré-embebimento: Polietileno amina a 0,5% em águadestilada.

Tampão para fluxo das lâminas de filtro: HEPES a 25 mM, pH de 7,4.

Tampão de bloqueio: HEPES a 25 mM, pH de 7,4; BSA a 0,2%isento de protease.

Tampão de ensaio: HEPES a 25 mM, pH de 7,4; BSA a 0,5%isento de protease.

Diluição e lâmina de ensaio: PS-Microplate, forma de U

Lâmina de filtração: MuItiscreen FB Opaque Plate; filtro de fibrade vidro do Tipo B de 1,0 μΜ.

De forma a preparar as lâminas de filtro, a solução de pré-embebimento é aspirada através de filtração a vácuo. As lâminas são sub-metidas a fluxo duas vezes com 200 μΙ_ de tampão de fluxo. 200 μΙ_ de tam-pão de bloqueio são adicionados à lâmina de filtro. A lâmina de filtro é, en-tão, incubada com 200 μΙ_ de solução de pré-embebimento durante 1 horaem temperatura ambiente.

A lâmina de ensaio é enchida com 25 μΙ_ de tampão de ensaio,25 μΙ_ de membranas (2,5 μς) suspensas em tampão de ensaio, 25 μι. deagonista em tampão de ensaio e 25 μΐ_ de rastreador (cerca de 40000 cpm)em tampão de ensaio. A lâmina de filtro é incubada durante 1 hora com agi-tação.

A transferência da lâmina de ensaio para a lâmina de filtro éconduzida. O tampão de bloqueio é aspirado através de filtração a vácuo elavado duas vezes com tampão de fluxo. 90 μΐ_ são transferidos da lâminade ensaio para a lâmina de filtro. Os 90 μΙ_ transferidos da lâmina de ensaiosão aspirados e lavados três vezes com 200 μΙ_ de tampão de fluxo. O su-porte plástico é removido. Ele é seco durante 1 hora a 60°C. 30 μΙ_ de Mi-croscint são adicionados. A contagem é realizada.Exemplo 5 - Potência in vitro em receptores VPAC1 e VPAC2 de rato

DiscoveRx: Células CHO-PO são transitoriamente transfectadascom DNA de receptor VPAC1 ou VPAC2 de rato usando reagentes de trans-fecção comercialmente disponíveis (Lipofectamina da Invitrogen). As célulassão cultivadas em uma densidade de 10.000/cavidade em uma lâmina com96 cavidades e são deixadas crescer durante 3 dias em 200 mL de meio decultura. No dia 3, o ensaio é realizado.

No dia do experimento, o meio é removido. Também, as célulassão lavadas duas vezes. As células são incubadas em tampão de ensaiomais IBMX durante 15 minutos em temperatura ambiente. Após o que, osestímulos são adicionados e são dissolvidos em tampão de ensaio. Os estí-mulos estão presentes durante 30 minutos. Então, o tampão de ensaio égentilmente removido. O reagente de Iise de célula do kit DiscoveRx cAMP éadicionado. Após o que, o protocolo padrão para desenvolvimento do sinalde cAMP, conforme descrito pelo fabricante, é usado (DiscoveRx Inc., EUA).Valores de EC5O para a geração de cAMP são calculados a partir do sinalbruto ou são baseados nos níveis de cAMP absolutos, conforme determina-do através de uma curva padrão realizada sobre cada lâmina. As concentra-ções tipicamente testadas de peptídeo são: 1000, 300, 100, 10, 1, 0,3, 0,1,0,01,0,001,0,0001 e O nM.

Exemplo 6 - Ensaios in vivo

Teste de tolerância à glicose intravenosa (IVGTT): Ratos Wistarnormais são submetidos a jejum durante a noite e são anestesiados antesdo experimento. Um cateter de amostragem de sangue é inserido nos ratos.

O agonista é fornecido subcutaneamente, normalmente 24 h antes do estí-mulo com glicose. Amostras de sangue são tomadas da artéria carótida.

Uma amostra de sangue é coletada imediatamente antes da injeção de gli-cose junto com o agonista. Após a amostra de sangue inicial, glicose mistu-rada é injetada intravenosamente (i.v.). Um estímulo com glicose de 0,5 g/kgde peso corporal é fornecido, injetando um total de 1,5 mL de veículo comglicose e agonista por kg de peso corporal. As concentrações de peptídeosão variadas para produzir a dose desejada em μg/kg. Amostras de sanguesão coletadas a 2, 4, 6 e 10 minutos após fornecer glicose. O grupo de ani-mais de controle recebe o mesmo veículo junto com glicose, mas sem ne-nhum agonista adicionado. Em alguns casos, amostras de sangue 20 e 30minutos pós-glicose foram coletadas. Aprotinina é adicionada à amostra desangue (250-500 klU/ml de sangue). O plasma é, então, analisado com rela-ção à glicose e insulina usando metodologias padrão.

O ensaio usa um estoque de peptídeo formulado e calibrado emPBS. Normalmente, esse estoque é um estoque a 100 μΜ pré-diluído. Con-tudo, um estoque mais concentrado com aproximadamente 1 mg de agonis-ta por mL é usado. A concentração específica é sempre conhecida. A varia-bilidade na resposta máxima é principalmente em virtude da variabilidade nadose de veículo. Detalhes do protocolo são como segue:<table>table see original document page 37</column></row><table>

Exemplo 7 - Estudos de estabilidade em soro de rato

De forma a determinar a estabilidade dos agonistas peptídicosdo receptor VPAC2 no soro de rato, células CHO-VPAC2 clone #6 (lâminascom 96 cavidades/cavidade e 1 dia de cultura), PBS 1X (Gibco), os peptí-deos para a análise em uma solução de estoque a 100 μΜ, soro de rato deum rato Wistar normal sacrificado, aprotinina e um kit de ensaio DiscoveRxsão obtidos. O soro de rato é armazenado a 4°C até uso e é usado dentro deduas semanas.

No Dia 0, duas alíquotas de 100 μΙ_ de peptídeo ã 10 μΜ em so-ro de rato são preparadas através da adição de 10 μί de estoque de peptí-deo a 90 μΙ_ de soro de rato para cada alíquota. 250 klU de aprotinina/mLsão adicionados a uma dessas alíquotas. A alíquota é armazenada com a-protinina a 4°C. A alíquota é armazenada sem aprotinina a 37°C. As alíquo-tas são incubadas durante 24 horas.

No Dia 1, após incubação das alíquotas preparadas no dia O du-rante 24 horas, um tampão de incubação contendo PBS + CaCI2 a 1,3 mM,MgCI2 a 1,2 mM, glicose a 2 mM e IBMX a 0,5 mM é preparado. Uma lâminacom 11 diluições seriais 3x de peptídeo em soro para a alíquota de 4°C e37"C é preparada para cada peptídeo estudado. 4000 nM são usados comoa concentração máxima. A(s) lâmina(s) com células é(são) lavada(s) duasvezes em tampão de incubação e as células são incubadas em 50 μΙ_ demeio de incubação por cavidade durante 15 minutos. 50 μΐ_ de solução porcavidade são transferidos para as células da lâmina preparada com 11 dilui-ções seriais 3x de peptídeo para a alíquota de 4°C e 37°C para cada peptí-deo estudado, usando as concentrações máximas que são indicadas pelaseleção primária, em duplicata. Essa etapa dilui a concentração de peptídeoem um fator de dois. As células são incubadas em temperatura ambientedurante 30 minutos. O sobrenadante é removido. 40 μΙ./cavidade do tampãode extração/anticorpo DicoveRx são adicionados. As células são incubadassobre o agitador (300 rpm) durante 1 hora. Procedimento normal com o kitDiscoveRx segue. Padrões de cAMP são incluídos na coluna 12. Os valoresde EC50 são determinados a partir dos dados de ensaio de cAMP. A quanti-dade restante de peptídeo ativo é estimada através da fórmula EC5o,4 *cEC50, 37 -o para cada condição.

Outras modificações da presente invenção serão evidentes paraaqueles habilitados na técnica sem se desviar do escopo da invenção.

Listagem de Seqüência

<110> Eli Lilly and CompanyZhang, LianshanAlsina-Femandez, Jorge

<120> Agonistas peptídicos seletivos do receptor VPAC2<130> X17355 WO<150> US 60/743.365<151 >28/02/2006<160> 7

<170> Patentln versão 3.3<210> 1<211 >39<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintética: agonista peptídico do receptor VPAC2 cíclicoP403

<220>

<221 > MOD_RES<222> (1)..(1)<223> C6 acilação<220>

<221 > MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220><221 > MOD_RES<222> (12)..(12)<223> Orn<220>

<221 > MOD_RES<222> (15)..(15)<223> Aib<220>

<221 > MOD_RES<222> (17)..(17)<223> Nle<220>

<221 > MOD_RES<222> (21)..(21)<223> Orn<220><221 > SITE<222> (21)..(25)

<223> Ligação em ponte de Iactama<220>

<221 > MOD_RES<222> (27)..(28)<223> Orn<400> 1

His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15

Xaa Ala Ala Lys Xaa Tyr Leu Asn Glu Leu Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35

<210> 2<211> 28<212> PRT

<213> Homo sapiens<400>2

His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln1 5 10 15

Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn20 25

<210> 3<211> 27<212> PRT<213> Homo sapiens

<220><221 > MOD_RES<222> (27)..(27)<223> AMIDAÇÃO<400> 3

His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15

Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu20 25

<210> 4<211 >37<212> PRT<213> Homo sapiens

<220><221 > MOD_RES<222> (37)..(37)<223> AMIDAÇÃO<400> 4

His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15

Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Gln

20 25 30

ArgVaILysAsnLys35

<210> 5<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintética: modificação N-terminal<400> 5

Ser Trp Cys Glu Pro Gly Trp Cys Arg1 5

<210> 6<211 >39<212> PRT<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintética: peptídeo de referência usado para cálculos daidentidade percentual de seqüência<220><221 > MOD_RES<222> (1 )..(1)<223> C6 acilação<220>

<221 > MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>

<221 > MOD_RES<222> (17)..(17)<223> Nle<220><221 > SITE<222> (21)..(25)

<223> ligação em ponte de Iactama<400>6

His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gln1 5 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35

<210> 7<211> 11<212> PRT

<213> Heloderma suspectum<400>7

Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser1 5 10

Claims

1. Agonista peptídico do receptor VPAC2 cíclico compreenden-do a seqüência de aminoácido: <table>table see original document page 44</column></row><table>

2. Composição farmacêutica compreendendo o agonista peptídi-co do receptor VPAC2 cíclico de acordo com a reivindicação 1 e um ou maisdiluentes, veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

3. Agonista peptídico do receptor VPAC2 cíclico de acordo coma reivindicação 1 para uso como um medicamento.

4. Agonista peptídico do receptor VPAC2 cíclico de acordo coma reivindicação 1 para uso no tratamento de diabetes não dependente deinsulina ou diabetes dependente de insulina ou a supressão da ingestão dealimento.

5. Uso de um agonista peptídico do receptor VPAC2 cíclico deacordo com a reivindicação 1 para a fabricação de um medicamento para otratamento de diabetes nãò dependente de insulina ou diabetes dependentede insulina ou para a supressão da ingestão de alimento.

6. Método de tratamento de diabetes não dependente de insulinaou diabetes dependente de insulina ou para supressão da ingestão de ali-mento em um paciente que precisa do mesmo compreendendo administra-ção de uma quantidade eficaz de um agonista peptídico do receptor VPAC2de acordo com a reivindicação 1.

7. Composição farmacêutica contendo um agonista peptídico doreceptor VPAC2 cíclico de acordo com a reivindicação 1 para o tratamentode diabetes não dependente de insulina ou diabetes dependente de insulinaou para supressão da ingestão de alimento.

8. Agonista peptídico do receptor VPAC2 cíclico substancialmen-te conforme aqui antes descrito com referência aos exemplos.