BRPI0708393A2

BRPI0708393A2 - proteìna de fusão não estrutural do vìrus da hepatite c

Info

Publication number: BRPI0708393A2
Application number: BRPI0708393-9A
Authority: BR
Inventors: Anne Fournillier; Genevi Ve Inchauspe; Laurence Chatel; Francois Penin
Original assignee: Transgene Sa
Priority date: 2006-03-09
Filing date: 2007-03-06
Publication date: 2011-05-31
Also published as: US8211444B2; CN101400366A; JP2009529322A; ATE556136T1; US20090186046A1; KR20080113358A; ES2387321T3; AU2007222580A1; AU2007222580B2; EP1993603B1; EP1993603A1; ZA200806551B; JP5188400B2; HK1130664A1; CN101400366B; MX2008011361A; CA2645177A1; WO2007101657A1

Abstract

PROTEìNA DE FUSãO NãO ESTRUTURAL DO VìRUS DA HEPATITE C. A presente invenção revela uma proteína de fusão isolada compreendendo pelo menos três polipeptídeos NS originados de um vírus da hepatite C (VHC) configurados na referida proteína de fusão em uma ordem diferente da ordem na qual eles aparecem na configuração nativa. A presente invenção também se refere a uma molécula de ácido nucléico codificando tal proteína de fusão e a um vetor compreendendo tal molécula de ácido nucléico. A presente invenção também prevê partículasvirais infecciosas e células hospedeiras compreendendo tal molécula de ácido nucléico ou tal vetor. A presente invenção também diz respeito a um método para produzir tal proteína de fusão de forma recombinante. Por fim, a presente invenção também prevê uma composição farmacêutica compreendendo tal proteína de fusão, molécula de ácido nucléico, vetor, partículas virais infecciosas e célula hospedeira, bem como o uso terapêutico desta composição para o tratamento ou prevenção de infecções pelo VHC, doenças associadas ao VHC e condições patológicas, assim como um método para induzir ou estimular uma resposta imunológica contra o VHC em um organismo hospedeiro.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invençãopara PROTEÍNA DE FUSÃO NÃO ESTRUTURAL DOVÍRUS DA HEPATITE C".

O VHC pertence à família Flaviviridae econstitui a principal causa de hepatite aguda e doenças crônicasdo fígado. A infecção viral pelo VHC está associada a umagrande incidência (54-86%) de cronicidade, que, em 5 a 24% doscasos, pode evoluir para uma cirrose e, posteriormente, para umcarcinoma hepatocelular num período de 20 a 30 anos(McHutchinson, 2004, The American Journal of Managed Care10, S21-29). Atualmente, na Europa e nos Estados Unidos, 20 a30% dos transplantes de fígado e 15 a 33% dos cânceres de fígadopodem ser atribuídos à infecção pelo VHC. Em 1999, aOrganização Mundial da Saúde estimou que cerca de 170 milhõesde pessoas no mundo inteiro apresentam contágio crônico peloVHC, e que a cada ano, 3 a 4 milhões de pessoas sãocontaminadas.

O VHC é um vírus encapsulado com umgenoma de ácido ribonucléico (RNA) positivo, de fita única, deaproximadamente 9.600 nucleotídeos, cuja organização é comuma todas as linhagens e isolados do VHC. A tradução do genomado VHC na fase 0 gera uma grande poliproteína de 3010 a 3030aminoácidos, de acordo com o genótipo que é proteoliticamenteclivado por proteases virais e celulares para produzir 10 proteínasvirais. A terça parte amino-terminal da poliproteína codifica asproteínas estruturais do vírion: a proteína Núcleo (C) e asglicoproteínas do envoltório El e E2. Após a região estrutural,vem uma proteína de membrana integral pequena, p7, que parecefuncionar como um canal iônico. O restante do genoma codificaas proteínas não estruturais (NS) NS2, NS3, NS4A, NS4, NS4B,NS5A e NS5B, que mediam os processos intracelulares do ciclode vida do vírus (Penin, 2004, Hepatology 39, 5-19). O VHCtambém codifica proteínas pequenas, chamadas de F(deslocamento do quadro de leitura, ou frame shift) ou ARFP(proteína do quadro de leitura alternativo), que podem serproduzidas pelo deslocamento do quadro ribossômico ou pelainiciação interna em um quadro de leitura +1 alternativo dentro dogene núcleo (vide Branch e col., 2005, Semin. Liver Dis. 25:105-117; and W02004/069864). As seqüências de codificação depoliproteínas são flanqueadas em ambas as extremidades por duasregiões não traduzidas altamente conservadas (UTR), 5'UTR e3'UTR, respectivamente. Um sítio de entrada ribossomal interno,localizado na 5'UTR, permite a fixação ribossomal para iniciaçãoda tradução; quanto à 3'UTR, acredita-se que ela desempenhe umpapel importante na iniciação da replicação viral.

A terapia padrão atual para pacientes com infecção crônica pelo VHC é uma combinação entre o interferonalfa peguilado (PEG-IFN-α) e a ribavirina (Fried e col., 2002, N.Engl. J. Med. 347, 975-982). No entanto, essa terapia apresentaalto custo por causa dos efeitos colaterais expressivos que levamao término prematuro do tratamento em 10% dos casos, sendoinadequada para um grande número de pacientes (por exemplo, osque apresentam cirrose hepática descompensada, doenças auto-imunes, histórico de depressão e gravidez). Outro dado muitoimportante: apenas 50% dos pacientes tratados apresentaramresposta (Falck-Ytter, e col., 2002, Ann. Intern. Med. 136, 288-292) e o índice de resposta é ainda menor nos pacientes infectados pelo genótipo 1 (27% a 35%).

Em geral, uma série de evidênciasexperimentais vem se acumulando no sentido de enfatizar o papelcrucial exercido pela imunidade das células-T no controle dainfecção pelo VHC, principalmente as respostas mediadas pelascélulas-T CD4+ e CD8+ direcionadas às proteínas não estruturais(NS) (por exemplo, Francavilla e col., 2004, Eur. J. Immunol. 34,427-37; Grakoui e col., 2003, Science 302, 659-662; Shoukry ecol., 2003, J. Exp. Med. 197, 1645-1655; Thimme e col., 2001, J.Exp. Med. 194, 1395-1406; Lechner et al., 2000, J. Exp. Med.191, 1499-1512; Gerlach, 1999, Gastroenterology 117, 933-941;Folgori e col., 2006, Nat Med. 12, 190-197). De fato, respostasvigorosas pelas células-T específicas ao VHC geralmente sãoobservadas em pacientes que se recuperam espontaneamente dahepatite C aguda autolimitada; já as respostas das células-T sãofracas e pouco direcionadas nos pacientes com contágio crônico.Por outro lado, o papel exercido pelos anticorpos neutralizantes(imunidade mediada pelas células-B) é muito menos claro(Logvinoff, 2004, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101, 10149-54).

Desde a descoberta do vírus da Hepatite C hácerca de 15 anos, ainda não foi possível criar uma vacina para oVHC visto a dificuldade de se obter o crescimento eficiente dovírus em cultura celular e também pela falta de modelos delaboratório da infecção viral para pronta utilização. Entretanto,recentemente surgiram diversos candidatos à vacina (Barth eBaumert, 2004, Novel vaccine strategies, p. 214-227, In State ofthe Art of Hepatology: Molecular and Cell Biology eds KluwerAcademic Publishers; Inchauspe and Feinstone, 2003, Clin. LiverDis. 7, 243-259), baseados, por exemplo, em peptídeos derivadosdo VHC (Cerny e col, 1995, J. Clin. Invest. 95, 521- 30), emantígenos do VHC produzidos de forma recombinante, emvacinas baseadas no DNA e no vírus (Brinster e col., 2001,Hepatology 34, 1206-1217; Forns e col., 2000, Hepatology 32,618-625) e em partículas semelhantes ao vírus da Hepatite C(Baumert e col., 1999, Gastroenterology 117, 1397-1407; Jeong ecol., 2004, J. ViroL 78, 6995-7003). Vários candidatos vêm sendoavaliados em modelos pré-clínicos e a primeira leva está entrandona etapa de ensaios clínicos. As vacinas mais avançadasatualmente na fase II utilizam proteínas do envoltório El comadjuvante (Innogenetics) e epítopos das células-T CD4+ e CD8+(Intercell).

Uma abordagem energicamente investigadadurante a última década consiste no uso de poliproteínasassociando vários domínios antigênicos como imunógenos. Agrande maioria das poliproteínas da técnica anterior resulta dafusão entre polipeptídeos antigênicos, fragmentos ou epítoposoriginados de várias proteínas do VHC NS de modo a formar umúnico polipeptídeo (com sorte) imunogênico. Por exemplo, aW001/30812 e a W003/031588 revelam a fusão dospolipeptídeos do VHC a partir de NS3 a NS5B para formar umúnico polipeptídeo englobando as principais proteínas NS. AW003/097677 descreve a fusão dos fragmentos antigênicos de 30a 70 aminoácidos originados dos polipeptídeos NS3, NS4B eNS5B. A W02004/046176 revela uma poliproteínacompreendendo o Núcleo, NS3, NS4B e NS5B. AW02004/111083 descreve o adenovírus e vetores MVA para co-expressar NS3, NS4 e NS5B, em que NS3 e NS4 são expressoscomo uma proteína de fusão e NS5B é expresso de formaindependente.

Deve-se observar que a configuração daspoliproteínas da técnica anterior é como no contexto nativo, comos vários componentes aparecendo na ordem em que eles ocorremnaturalmente no precursor nativo do VHC. Em particular, a NS3 ésucedida pela NS4, que é sucedida pela NS5. No entanto, aconfiguração "nativa" não é ideal em termos de expressão eimunogenicidade das poliproteínas resultantes.

A previsão é de que o VHC continue sendo umsério risco à saúde global por muitos anos por causa da naturezacrônica e persistente da infecção, além de sua alta prevalência epela morbidade significativa das doenças associadas. Sendoassim, há a real necessidade de se desenvolver mais polipeptídeosimunogênicos, vetores de expressão, métodos de preparaçãodestes e usos destes, com o objetivo de melhorar a prevenção e otratamento das infecções pelo VHC ou das doenças ou síndromesrelacionadas ao VHC.

A presente invenção refere-se a proteínas defusão envolvendo polipeptídeos não estruturais (NS) dispostos emuma configuração não nativa. Fragmentos específicos dospolipeptídeos NS do VHC (por exemplo, NS3, NS4A e NS5B e,como opção, NS4B) foram selecionados e configuradosespecificamente com o objetivo de otimizar a imunogenicidadee/ou o processo de produção recombinante das proteínas de fusãoresultantes. Se comparado aos polipeptídeos NS nativos, as novasproteínas de fusão do VHC proporcionadas pela presenteinvenção ou suas seqüências de nucleotídeos codificadoras podempermitir o aprimoramento de uma resposta imune anti-VHC e/ouo aprimoramento de uma resposta citotóxica geral quando daintrodução em um organismo hospedeiro e/ou o aprimoramentoda produção de lotes clínicos. Sendo assim, a invenção representaum avanço significativo no atual tratamento e prevenção dasinfecções pelo VHC ou das doenças ou distúrbios associados aoVHC. Particularmente, ela pode ser utilizada para reforçar asterapias já existentes ou oferecer um tratamento alternativo aospacientes com contágio crônico, principalmente àqueles que nãoreagem à terapia convencional.

Esse problema técnico é solucionado por meiodas concretizações, conforme definidas nas reivindicações.

Esses e outros aspectos, características evantagens da presente invenção ficarão evidentes na descrição dasconcretizações presentemente preferidas da invenção, que seráapresentada a seguir. Essas concretizações são apresentadas parafins de revelação.

Logo, em um primeiro aspecto, a presenteinvenção oferece uma proteína de fusão isolada compreendendopelo menos três polipeptídeos NS que se originam de um vírus dahepatite C (VHC), em que os referidos polipeptídeos NS sãoconfigurados na referida proteína de fusão em uma ordemdiferente da ordem na qual eles aparecem na configuração nativa.

Como empregados neste documento por todo opedido, os termos "um" e "uma" são utilizados no sentido de"pelo menos um(a)", "pelo menos um(a) primeiro(a)", "um(a) oumais" ou "uma multiplicidade" dos compostos ou etapasreferenciados, salvo em outros contextos. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma multiplicidade de células, inclusive umamistura delas.

O termo "e/ou", sempre que empregado nestedocumento, inclui o significado de "e", "ou" e "toda e qualquer

combinação diferente dos elementos conectados pelo aludido termo".

O termo "cerca de" ou "aproximadamente",conforme utilizado neste documento, significa que algo estádentro de 20%, de preferência dentro de 10% e maispreferivelmente dentro de 5% de um dado valor ou faixa de valores. Os termos "aminoácidos" e "resíduos" são sinônimos eenglobam aminoácidos naturais, assim como análogos deaminoácidos (por exemplo, aminoácidos não naturais, sintéticos emodificados, inclusive isômetros ópticos D ou L).

Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e"proteína" são utilizados aqui de forma alternada para referir-se apolímeros de resíduos de aminoácidos que compreendem dez oumais aminoácidos ligados via ligações peptídicas. O polímeropode ser linear, ramificado ou cíclico e pode compreenderanálogos de aminoácidos e/ou de ocorrência natural e pode serinterrompido por não-aminoácidos. Como indicação geral, se opolímero do aminoácido for longo (por exemplo, mais de 50resíduos de aminoácidos), ele é preferivelmente chamado depolipeptídeo ou proteína.

Dentro do contexto da presente invenção, ostermos "ácido nucléico", "molécula de ácido nucléico","polinucleotídeo" e "seqüência de nucleotídeos" são usadosalternadamente e definem um polímero de qualquer tamanho, sejade moléculas de polideoxiribonucleotídeos (DNA) (por exemplo,cDNA, DNA genômico, plasmídeos, vetores, genomas virais,DNA isolado, sondas, oligonucleotídeos iniciadores e qualquermistura destes) ou de poliribonucleotídeos (RNA) (por exemplo,mRNA, RNA anti-sentido) ou poliribo-polideoxiribonucleotídeosmixturados. Eles abrangem polinucleotídeos de fita dupla ouúnica, lineares ou circulares, naturais ou sintéticos. Além disso,um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos de ocorrêncianão natural, como nucleotídeos metilados e análogos denucleotídeos (vide a US 5,525,711, US 4,711,955 ou a EPA 302175 como exemplos de modificações) e podem ser interrompidospor componentes que não sejam nucleotídeos. Caso estejampresentes, modificações no nucleotídeo podem ser realizadastanto antes como após a polimerização.

Conforme usado neste documento, quandoutilizado para definir produtos, composições e métodos, o termo"compreendendo" quer dizer que os produtos, composições emétodos incluem os componentes ou etapas referenciados, semexcluir outros. "Consistindo essencialmente de" significaexcluindo outros componentes ou etapas de qualquer significânciaessencial. Sendo assim, uma composição consistindoessencialmente dos componentes citados não excluiriacontaminantes vestigiais e veículos aceitáveis do ponto de vistafarmacêutico. "Consistindo de" significa excluindo mais quemicroelementos de outros componentes ou etapas. Por exemplo,um polipeptídeo "consiste de" uma seqüência de aminoácidosquando o polipeptídeo não contém nenhum aminoácido fora aseqüência de aminoácidos citada. Um polipeptídeo "consisteessencialmente de" uma seqüência de aminoácidos quando talseqüência de aminoácidos está presente junto com apenas algunsresíduos de aminoácidos adicionais, normalmente de cerca de 1 acerca de 50 resíduos adicionais. Um polipeptídeo "compreende"uma seqüência de aminoácidos quando a seqüência deaminoácidos faz parte pelo menos da seqüência de aminoácidosfinal do polipeptídeo. Tal polipeptídeo pode ter de poucos atécentenas de resíduos de aminoácidos adicionais. Tais resíduos deaminoácidos adicionais podem desempenhar um papel no trânsitode polipeptídeos, facilitar a produção ou purificação dospolipeptídeos; prolongar a meia-vida, entre outras coisas. Omesmo pode ser aplicado a seqüências de nucleotídeos.

Como usado neste documento, o termo"isolado" refere-se a uma proteína, polipeptídeo, peptídeo ou umácido nucléico que é purificado ou removido de seu ambientenatural. O termo "purificado" refere-se a uma proteína,polipeptídeo, peptídeo ou ácido nucléico que é separado pelomenos dos outros componentes aos quais ele está normalmenteassociado.

"VHC" significa "vírus da hepatite C". Extensasanálises filogenéticas levaram à classificação dos isolados doVHC em 7 genótipos principais (1 a 6) contendo diferentessubtipos (a. b, c, etc.) (Simmons e col., 2005. Hepatology 42,962-973). Exemplos de isolados do VHC do genótipo Ia incluem,sem a isto se limitar, o VHC-I (Choo e col., 1991, Proc. Natl.Acad. Sei. USA 88, 2451-2455), -Jl (Okamoto e col., 1992,Nucleic Acids Res. 20, 6410-6410) e -H (Inchauspe e col., 1991,Proc. Natl. Acad. Sei. 88, 10292-10296). Exemplos de isoladosdo VHC do genótipo Ib incluem, sem a isto se limitar, VHC-JA(Kato e col., 1990, Proc. Natl. Acad., Sei. 87, 9524-9528) e BK(Takamizawa e col., 1991, J. Virol. 65, 1105-1113). Exemplos deisolados do VHC do genótipo Ic incluem, sem a isto se limitar, oVHC-G9 (Okamoto e col., 1994, J. Gen. Virol. 45, 629-635).Exemplos de isolados do VHC do genótipo 2a incluem, sem a istose limitar, o VHC-G9 (Okamoto e col, 1991, J. Gen. ViroL 72,2697-2704). Exemplos de isolados do VHC do genótipo 2bincluem, sem a isto se limitar, o VHC-J8 (Okamoto e col., 1992,Virology 188, 331-341). Exemplos de isolados do VHC dogenótipo 2c incluem, sem a isto se limitar, o VHC-BEBE1 (Nakoe col., 1996, J. Gen. Virol. 141, 701-704). Exemplos de isoladosdo VHC do genótipo 3a incluem, sem a isto se limitar, o VHC-NZLl (Sakamoto e col., 1994, J. Gen. Virol. 75, 1761- 1768).Exemplos de isolados do VHC do genótipo 3b incluem, sem a istose limitar, o VHC-Tr (Chayama e col., 1994, J. Gen. Virol. 75,3623-3628). Exemplos de isolados do VHC do genótipo 4aincluem, sem a isto se limitar, o VHC-ED43 (Chamberlain e col.,1997, J. Gen. Virol. 78, 1341-1347). Exemplos de isolados doVHC do genótipo 5 a incluem, sem a isto se limitar, o VHC-EUH480 (Chamberlain e col., 1997, Biochem. Biophys. Res.Commun. 236, 44-49). Exemplos de isolados do VHC dogenótipo 6a incluem, sem a isto se limitar, o VHC-EUH480(Chamberlain e col., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun.234, 393-396).

O termo "fusão" ou "proteína de fusão",conforme utilizado neste documento, refere-se à combinação comoutro dentre pelo menos três polipeptídeos NS (ou fragmentos ouvariantes destes) em uma cadeia de polipeptídeos. De preferência,a fusão entre os vários polipeptídeos NS é realizada por meiosgenéticos, isto é, fiisionando-se em quadro as seqüências denucleotídeos codificando cada um dos polipeptídeos NS. Entende-se por "fusionado em quadro" que a expressão das seqüências decodificação fusionadas resulta em uma única proteína semnenhuma terminador traducional entre cada um dos polipeptídeosNS. A fusão entre cada um dos polipeptídeos NS pode ser diretaou por meio de um peptídeo de ligação. Como utilizado nestedocumento, o termo "direta" refere-se a uma fusão entre doispolipeptídeos NS sem nenhum resíduo de aminoácido adicionalinterveniente (por exemplo, os códons codificando umpolipeptídeo NS são contíguos aos códons codificando opolipeptídeo NS seguinte). Como alternativa, pode-se utilizar umpeptídeo de ligação na junção de pelo menos dois polipeptídeosNS. A presença de um peptídeo de ligação pode facilitar aformação, enovelamento e/ou funcionamento correto da proteínade fusão. A presente invenção não se limita à forma, tamanho ounúmero de seqüências de peptídeos de ligação empregado, sendopossível inserir várias cópias de uma seqüência de peptídeos deligação na junção entre dois polipeptídeos NS. Peptídeos deligação adequados de acordo com a invenção contêm de 3 a 30aminoácidos de comprimento e são compostos de repetições deresíduos de aminoácidos como a glicina, serina, treonina,asparagina, alanina e/ou prolina (vide, por exemplo, Wiederrechte col., 1988, Cell 54, 841; Aumailly e col., 1990 FEBS Lett. 262,82; e Dekker e col., 1993, Nature 362, 852). Exemplosrepresentativos de peptídeos de ligação adequados incluem umpeptídeo de ligação Ser-Gli-Ser para conectar o polipeptídeo NSN-terminal ao segundo polipeptídeo NS e um peptídeo de ligaçãoGli-Ser-Gli-Ser-Gli para conectar o segundo polipeptídeo NS aoterceiro polipeptídeo NS. Como alternativa, também é possívelusar seqüências derivadas do VHC para conectar doispolipeptídeos NS um ao outro (por exemplo, a parte C-terminal deum polipeptídeo NS4A nativo estendendo aproximadamente daposição 1691 até aproximadamente a posição 1711 numerada emrelação à poliproteína do VHC-I de comprimento total). "Pelomenos três" significa um número igual ou maior que três, compreferência especial por três ou quatro.

Conforme usado neste documento, o termo"polipeptídeo NS" refere-se a uma proteína não estruturalreconhecida na técnica, escolhida preferivelmente dentre o grupoque consiste dos polipeptídeos NS2, NS3, NS4A, NS4B e NS5B.Contudo, é preferível que a proteína de fusão não contenhanenhum polipeptídeo NS5A. No contexto da invenção, ospolipeptídeos NS incluídos na proteína de fusão da invençãopodem se originar independentemente de qualquer linhagem ouisolado do VHC identificado nos dias atuais, como os descritosacima em conexão com o termo "VHC". O termo "originado"significa ser isolado, clonado, derivado ou relacionado. Sendoassim, de acordo com a presente invenção, cada um dospolipeptídeos NS incluídos na proteína de fusão pode se originarde um polipeptídeo NS nativo ou de um polipeptídeo NSmodificado, como definido em detalhes abaixo.

Um polipeptídeo NS "nativo" refere-se a umaproteína, polipeptídeo ou peptídeo NS que pode ser encontrado ouisolado de uma fonte na natureza, em vez de ser modificadoartificialmente ou alterado no laboratório pelo homem. Sendoassim, o termo "polipeptídeo NS nativo" incluiria polipeptídeosNS de ocorrência natural e seus fragmentos. Tais fontes nanatureza incluem amostras biológicas (por exemplo, sangue,plasma ou soro de pacientes contaminados pelo VHC ou que jáforam contaminados por um VHC), células cultivadas, bem comomateriais recombinantes (por exemplo, vírus ou genoma do VHC,bibliotecas genômicas ou de cDNA, plasmídeos contendo fragmentos do genoma do VHC, precursor pré-processadorecombinante ou polipeptídeo NS processado, entre outros). Asseqüências de nucleotídeos e aminoácidos de váriospolipeptídeos/genes NS nativos foram descritas em publicaçõesespecíficas e encontram-se disponíveis em bancos de dados especializados. Exemplos representativos de polipeptídeos NSnativos são apresentados na SEQ ID NO: 1-4 (A SEQ ID NO: 1-4fornece as seqüências de aminoácidos dos polipeptídeos NS3,NS4A, NS4B e NS5B nativos da linhagem JA do VHC genótipolb). Entretanto, os polipeptídeos NS nativos não se limitam a essas seqüências exemplificativas. De fato, as seqüências deaminoácidos podem variar entre diferentes genótipos, subtipos eisolados do VHC, e esse escopo natural de variação genética estáincluído no âmbito da invenção. Um ou mais dos polipeptídeosNS incluídos na proteína de fusão da invenção podem, de forma independente um do outro, incluir uma ou mais modificações deaminoácidos a partir das seqüências exemplificativas ou de outrospolipeptídeos NS nativos. Modificações podem ser geradas pormeio de mutação e/ou pela adição de componentes químicos (porexemplo, alquilação, acetilação, amidação, fosforilação, entreoutros) ou componentes de marcação. As mutações incluemdeleção, substituição ou adição de um ou mais resíduos deaminoácidos ou combinações dessas possibilidades. Quandovárias modificações são contempladas, elas podem envolverresíduos consecutivos e/ou resíduos não consecutivos.Modificações podem ser feitas de diversas maneiras conhecidaspelos versados na técnica. Por exemplo, a seqüência denucleotídeos codificando o polipeptídeo NS pode ser modificadausando técnicas recombinantes de rotina, tal como corteenzimático seguido de modificação e ligação do fragmentodefinido, mutagênese direcionada ao sítio (por exemplo, usando osistema de mutagênese in vitro Sulptor™ da Amersham, LesUllis, France), mutagênese do DNA ou embaralhamento do DNA

Um polipeptídeo NS modificado preferidoretém um alto nível de identidade de seqüência de aminoácidoscom o polipeptídeo NS nativo correspondente, por exemplo, pelomenos 75% de resíduos de aminoácidos idênticos ao longo daseqüência de aminoácidos de comprimento total ou um fragmentomais curto desta (por exemplo, de pelo menos 10, 15, 20, 25, 30,40, 100 aminoácidos de comprimento). Mais especificamente, nocontexto da invenção, o polipeptídeo NS modificado em uso nainvenção compartilha um grau de identidade com o polipeptídeoNS nativo correspondente maior do que 75%, de preferênciamaior que 80%, ainda mais preferivelmente maior que 85%,preferivelmente maior que 90%, mais preferivelmente maior que95%, ainda mais preferivelmente maior que 97%. A identidade deporcentagem entre os dois polipeptídeos é em função do númerode posições idênticas compartilhadas pelas seqüências, levandoem conta o número de intervalos que precisam ser introduzidospara o alinhamento ideal e o comprimento de cada intervalo.Vários programas de computador e algoritmos matemáticosencontram-se disponíveis na técnica para determinar asidentidades de porcentagem entre as seqüências de aminoácidos,como por exemplo, o programa Blast (por exemplo, Altschul ecol., 1997, Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402; Altschul e col.,2005, FEBS J. 272, 5101-5109) disponível na NCBI. Porexemplo, qualquer um ou todos os polipeptídeos NS incluídos naproteína de fusão da invenção podem ser modificados de modo arepresentarem um genótipo ou subtipo específico, e, dessa forma,compreenderem uma seqüência de aminoácidos correspondendo auma seqüência próxima ao consenso, que é geralmentedeterminada após o alinhamento de seqüência de vários NS de umgenótipo ou subtipo específico. Qualquer um ou todos ospolipeptídeos NS também podem ser modificados para obter umpolipeptídeo NS com propriedades funcionais modificadas, talcomo função enzimática reduzida e/ou capacidade reduzida deserem ancorados em uma membrana celular e/ou capacidadereduzida de serem processados após a tradução, como descrito aseguir. Os aminoácidos que são essenciais para tais propriedades17

funcionais podem ser identificados por métodos de rotina, talcomo por análise estrutural e funcional. Os versados na técnicapodem determinar imediatamente o tipo de modificação(ões)capaz de reduzir ou interromper uma determinada atividade enzimática. Por exemplo, pode-se proceder com a mutagênesedirecionada ao sítio ou técnicas PCR de modo a deletar ousubstituir um ou mais aminoácidos dentro de uma região ativa daatividade enzimática (por exemplo, no sítio catalítico), de modoque a atividade enzimática nativa seja reduzida ou abolida significativamente. A redução ou falta de uma atividade biológicapode ser facilmente determinada em ensaios apropriados deacordo com a atividade enzimática a ser testada usando métodosconhecidos pelos versados na técnica. Os domínios de ancoragemde membrana são geralmente prognósticos com base em suanatureza hidrofóbica.

De acordo com a presente invenção, os pelomenos três polipeptídeos NS incluídos na proteína de fusão dainvenção são configurados em uma ordem diferente da ordem naqual eles aparecem na configuração nativa. A configuração nativaé conhecida na técnica (vide o resumo geral fornecido na seção deintrodução do presente pedido) e a ordem na qual os polipeptídeosNS aparecem é como encontrado em um precursor de poliproteínado VHC, isto é, a partir do N até o C-terminal NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B. De acordo com a configuração nativa:o Um polipeptídeo NS2 sempre precede umpolipeptídeo NS3 ou um polipeptídeo NS4A ou um polipeptídeoNS4B ou um polipeptídeo NS5A ou um polipeptídeo NS5B; e

o Um polipeptídeo NS3 sempre precede umpolipeptídeo NS4A ou um polipeptídeo NS4B ou um polipeptídeoNS5A ou um polipeptídeo NS5B; e

o Um polipeptídeo NS4A sempre precede umpolipeptídeo NS4B ou um polipeptídeo NS5A ou um polipeptídeoNS5B; e

o Um polipeptídeo NS4B sempre precede umpolipeptídeo NS5A ou um polipeptídeo NS5B; e

o Um polipeptídeo NS5A sempre precede umpolipeptídeo NS5B.

Na proteína de fusão da invenção, aconfiguração não é nativa no sentido de que pelo menos um dospolipeptídeos NS aparece numa ordem diferente da ordem daconfiguração nativa. Sendo assim, se a proteína de fusãocompreender um polipeptídeo NS3, um polipeptídeo NS4A e umpolipeptídeo NS5B, a configuração nativa seria NS3-NS4A-NS5B com NS3 no N-terminal e NS5B no C-terminal. Emcontrapartida, uma configuração não nativa pode ser NS5B-NS3-NS4A, NS5B-NS4A-NS3, NS4A-NS3-NS5B, NS4A-NS5B-NS3ou NS3-NS5B-NS4A.

Em particular, a proteína de fusão da invençãocompreende pelo menos um dentre os seguintes:o Um polipeptídeo NS4A fusionadodiretamente, ou através de um peptídeo de ligação, ao N-terminalde um polipeptídeo NS3;

o Um polipeptídeo NS3 fusionado diretamente,ou através de um peptídeo de ligação, ao N-terminal de umpolipeptídeo NS 5B;

o Um polipeptídeo NS4B fusionadodiretamente, ou através de um peptídeo de ligação, ao N-terminalde um polipeptídeo NS5B;

o Um polipeptídeo NS4A fusionadodiretamente, ou através de um peptídeo de ligação, ao N-terminalde um polipeptídeo NS3 que é fusionado diretamente, ou atravésde um peptídeo de ligação, ao N-terminal de um polipeptídeoNS4B; e/ou

o Um polipeptídeo NS3 fusionado diretamente,ou através de um peptídeo de ligação, ao N-terminal de umpolipeptídeo NS4B que é fusionado diretamente, ouatravés de um peptídeo de ligação, ao N-terminal de umpolipeptídeo NS 5B.

Em tais partes específicas da proteína de fusãoda invenção, cada um dos polipeptídeos NS pode serindependentemente nativo ou modificado. Por exemplo, opolipeptídeo NS4A incluído na parte NS4A-NS3 pode ser nativo,ao passo que o polipeptídeo NS3 compreende pelo menos umadas modificações descritas abaixo.Em uma concretização, todos os polipeptídeosNS incluídos na proteína de fusão da invenção se originam damesma linhagem ou isolado do VHC. Como alternativa, pelomenos dois dos polipeptídeos NS se originam de diferenteslinhagens ou isolados do VHC de modo a obter proteção contrauma variedade maior de genótipos do VHC. Também seriainteressante adaptar a proteína de fusão à região geográficaespecífica onde ela será utilizada pela inclusão de pelo menos umpolipeptídeo NS a partir de um VHC endêmico nesta região (porexemplo, os genótipos Ia, Ib, 2 e 3 são os mais prevalentes naAmérica do Norte, na Europa e na Ásia; o genótipo 4 épredominante na África do Norte e Central; o genótipo 5 foi, atéagora, identificado principalmente na África do Sul e isolados dogenótipo 6 foram encontrados principalmente no Vietnã e emHong Kong). Por exemplo, se a proteína de fusão compreenderum polipeptídeo NS3, um polipeptídeo NS4A e um polipeptídeoNS5B, o polipeptídeo NS3 pode se originar de uma primeiralinhagem do HCV, e os polipeptídeos NS4A e NS5B de umasegunda linhagem do VHC. Como alternativa, o polipeptídeoNS4A pode se originar de uma primeira linhagem do VHC, e ospolipeptídeos NS3 e NS5B de uma segunda linhagem do VHC.Como alternativa, o polipeptídeo NS5A pode se originar de umaprimeira linhagem do VHC, e os polipeptídeos NS3 e NS4A deuma segunda linhagem do VHC. Como alternativa, cada um dospolipeptídeos NS3, NS4A e NS5B se origina de diferenteslinhagens do VHC. Quando a proteína de fusão da invençãotambém compreende um polipeptídeo NS4B, ele pode se originarda mesma linhagem do VHC ou de uma linhagem do VHCdiferente da dos outros polipeptídeos.

As concretizações preferidas da invenção estãovoltadas para uma fusão que compreende, ou consisteessencialmente de, ou consiste de um polipeptídeo NS4A, umpolipeptídeo NS3, e um polipeptídeo NS5B com NS4A no N-terminal e NS5B no C-terminal (fusão NS4A-3-5B).

Como opção, a fusão também pode incluir umpolipeptídeo NS4B (ou fragmentos ou variantes deste) paramelhorar ainda mais a atividade imunogênica da proteína de fusãoresultante. O polipeptídeo NS4B é, de preferência, incluído entreos polipeptídeos NS3 e NS5B. Portanto, a presente invençãotambém se refere a uma proteína de fusão que compreende, ouconsiste essencialmente de, ou consiste de um polipeptídeoNS4A, um polipeptídeo NS3, um polipeptídeo NS4B e umpolipeptídeo NS5B com NS4A no N-terminal e NS5B no C-terminal (fusão NS4A-3-4B-5B). Com exceção dos polipeptídeosNS3, NS4A, NS5B e do opcional NS4B, prefere-se, contudo, quea proteína de fusão da invenção não contenha outros polipeptídeosdo VHC, e em especial nenhum núcleo, e como discutido acimaem conexão com os polipeptídeos NS, nenhum polipeptídeoNS5A.

Mais especificamente, o termo "polipeptídeoNS3" refere-se a uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo NS3nativo obtido de qualquer linhagem HCV ou a uma proteína,polipeptídeo ou peptídeo NS3 modificado conforme definidoacima. O polipeptídeo NS3 em uso na invenção tem umcomprimento de pelo menos 200 aminoácidos, para melhorproveito, pelo menos 300 aminoácidos, de preferência, pelomenos 400 aminoácidos, mais preferivelmente, pelo menos 500aminoácidos, e ainda mais preferivelmente, pelo menos 600aminoácidos. Para fins de ilustração, a proteína NS3 do VHC-Inativa tem 631 aminoácidos de comprimento e está localizadaaproximadamente nas posições 1027 a 1657 no precursor da poliproteína. Um polipeptídeo NS3 nativo compreende doisdomínios ativos distintos, um domínio serina protease no N-terminal e um domínio helicase no C-terminal. A protease NS3 éresponsável por processar o precursor da poliproteína do VHC nasjunções NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A e NS5A/NS5B, e exige o NS4A como cofator para a atividade proteolítica (Tomei ecol., 1993, J. Virol. 67, 4017-4026) e para o enovelamento correto(Yao e col., 1999, Structure (London) 7 pp 1353). Um motivoprotéico, consistindo de um ácido aspártico ou glutâmico naposição 6 e uma cisteína ou treonina na posição 1 a montante do sítio de clivagem e uma serina ou alanina na posição 1 a jusantedo sítio de clivagem, é especificamente reconhecido pela proteaseNS3 do VHC. Acredita-se que a helicase NS3 seja importantepara o enovelamento do intermediário do RNA de fita dupladurante a replicação viral (Tai e col., 1996, J. Virol. 70, 8477- 8 4 84).Entende-se por "polipeptídeo NS4A" umaproteína, polipeptídeo ou peptídeo NS4A nativo de qualquerlinhagem do VHC ou uma proteína, polipeptídeo ou peptídeoNS4A modificado conforme definido acima. O polipeptídeoNS4A em uso na invenção tem um comprimento de pelo menos10 aminoácidos, para melhor proveito, pelo menos 11aminoácidos, de preferência, pelo menos 12 aminoácidos, maispreferivelmente, pelo menos 13 aminoácidos. Entende-se por"polipeptídeo NS4B" uma proteína, polipeptídeo ou peptídeoNS4B nativo de qualquer linhagem do VHC ou uma proteína,polipeptídeo ou peptídeo NS4B modificado conforme definidoacima. O polipeptídeo NS4B em uso na invenção tem umcomprimento de pelo menos 20 aminoácidos, para melhorproveito, pelo menos 25 aminoácidos, de preferência, pelo menos30 aminoácidos, mais preferivelmente, pelo menos 31aminoácidos, e ainda mais preferivelmente, pelo menos 32aminoácidos. Para fins de ilustração, a proteína NS4 do VHC-Inativa (A-B) tem 315 aminoácidos de comprimento e estálocalizada aproximadamente nas posições 1658 a 1972 noprecursor da poliproteína. O polipeptídeo NS4A (posições 1658 a1711) é um co-fator na protease NS3, mas também é necessáriopara a estabilidade do NS3 e a localização na membrana doretículo endoplasmático (ER) (Failla e col., 1994, J. Virol. 68,3753-3760). O polipeptídeo NS4B (posições 1712 a 1972) é umaproteína de membrana integral, cuja função ainda é desconhecida.Os algoritmos previstos sugerem a presença de quatro a seissegmentos transmembrana. Sua expressão, no entanto, induz àformação de uma rede membranosa derivada do ER (Egger e col.,2002, J.Virol. 76, 5974-5984).

Entende-se por "polipeptídeo NS5B" umaproteína, polipeptídeo ou peptídeo NS5B nativo de qualquerlinhagem do VHC ou uma proteína, polipeptídeo ou peptídeoNS 5B modificado conforme definido acima. O polipeptídeoNS5B em uso na invenção tem um comprimento de pelo menos200 aminoácidos, para melhor proveito, pelo menos 300aminoácidos, de preferência, pelo menos 400 aminoácidos, maispreferivelmente, pelo menos 500 aminoácidos, e ainda maispreferivelmente, pelo menos 550 aminoácidos. Para fins deilustração, a proteína NS5B do VHC-I nativa tem 591aminoácidos de comprimento e está localizada aproximadamentenas posições 2421 a 3011 no precursor da poliproteína. A proteínaNS5B nativa age como uma RNA polimerase dependente doRNA, que supostamente permite a síntese de um intermediário deRNA de fita negativa e cópias de progênie de fita positiva(Lohman e col., 1997, J. Virol. 71, 8416-8428). Ela se encontraassociada à membrana do retículo endoplasmático por suaseqüência de aminoácidos C-terminal 21 (Schmidt-Mende e col.,2001, J. Biol. Chem. 276, 44052-44063). Para fins de clareza, asextensões de aminoácidos citadas neste documento em conexãocom os polipeptídeos NS3, NS4A, NS4B e NS5B sãoapresentadas com respeito a suas posições no precursor depoliproteína do VHC-I (conforme descrito por Choo e col., 1991,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 2451-2455 ou em GenBank sob onúmero de acesso M62321). Entretanto, como discutido acima, apresente invenção também abrange polipeptídeos NS de outraslinhagens e isolados do VHC, bem como polipeptídeos NSmodificados. Portanto, salvo indicação em contrário pelocontexto, quando se faz referência neste documento a umpolipeptídeo NS ou a um peptídeo deste por referência aoprecursor de poliproteína do VHC-1, isso se refere aopolipeptídeo NS ou seu peptídeo do VHC-1, a um polipeptídeoNS ou seu peptídeo de outra linhagem ou isolado do VHC, ou aum polipeptídeo NS modificado ou seu peptídeo. Umaconcretização preferida da presente invenção está voltada parauma proteína de fusão compreendendo os polipeptídeos NS3,NS4A, NS5B e o polipeptídeo NS4B opcional originados dalinhagem do VHC JA genótipo Ib (Kato e col., 1990, Proc. Natl.Acad., Sei. 87, 9524-9528).

Em uma concretização, o polipeptídeo NS 3incluído na proteína de fusão da presente invenção é modificadoem comparação com o polipeptídeo NS3 nativo correspondentede modo a apresentar atividade significativamente reduzida daprotease, e, assim, ser incapaz de mediar a clivagem da proteínade fusão em polipeptídeos individuais. A atividade da protease foilocalizada na parte N-terminal do polipeptídeo NS3,aproximadamente a partir da posição 1027 até a posição 1207,numerada em relação à poliproteína do VHC-I de comprimentototal (aproximadamente a partir da posição 1 até a posição 181 dopolipeptídeo NS3 do VHC-JA ilustrado SEQ ID NO: 1). Maisespecificamente, a atividade da protease NS3 foi atribuída aosresíduos da tríade catalítica His (H) na posição 1083, Asp (D) naposição 1107 e Ser (S) na posição 1165 (respectivamente,posições 57, 81 e 139 da SEQ ID NO: 1). Exemplosrepresentativos de polipeptídeos NS3 deficientes em proteaseadequados são descritos em Bartenshlager e col., 1993, J. Virol.67, 3835-3844 e Tomei e col., 1993, J. Virol. 67, 4017-4026. Depreferência, uma vez que os resíduos Asp e Ser catalíticosresidem dentro de um domínio antigênico previsto, o polipeptídeoNS3 em uso na presente invenção compreende a substituição doresíduo His na posição 1083 (correspondendo à posição 57 doSEQ ID NO:l) ou do resíduo de aminoácido localizado em umaposição equivalente de um polipeptídeo NS3 nativo de outroserótipo do VHC, para qualquer resíduo de aminoácido que nãoseja o His, com especial preferência por uma substituição para umresíduo Ala (H1083A). A interrupção da atividade da proteasepode ser determinada usando ensaios bem conhecidos na técnica(Takeshita e col., 1997, Anal. Biochem. 247, 242-246; Kakiuchi ecol., 1997 J. Biochem 122, 749-755; SaIi e col, 1998,Biochemistry 37, 3392-3401; Kakiuchi e col., 1999, J. Virol.Meth. 80, 77-84).

Como alternativa ou em combinação, opolipeptídeo NS3 incluído na proteína de fusão da invenção émodificado se comparado ao polipeptídeo NS3 nativocorrespondente, de modo a apresentar uma atividade da helicasesignificativamente reduzida. Quatro resíduos estavam envolvidosna atividade da helicase associada ao NS3, respectivamente, Thrna posição 1295, Thr na posição 1437, Arg na posição 1490 e Argna posição 1493, numerados em relação à poliproteína do VHC-Ide comprimento total (que corresponde aos resíduos Thr nasposições 269 e 411 e aos resíduos Arg nas posições 464 e 467 dopolipeptídeo NS3 do VHC-JA nativo apresentado no SEQ ID NO:1). Exemplos representativos de polipeptídeos NS3 deficientes emhelicase adequados são descritos em Kim e col. (1997, J. Virol.71, 9400) e Lin and Kim (1999, J. Virol. 73, 8798-8807). Depreferência, o polipeptídeo NS3 em uso na presente invençãocompreende a substituição do resíduo Arg na posição 1490(correspondendo à posição 464 do SEQ ID NO: 1) ou do resíduode aminoácido localizado em uma posição equivalente de umpolipeptídeo NS3 nativo de outro serótipo do VHC por qualquerresíduo de aminoácido que não seja o Arg e a substituição doresíduo Thr na posição 1295 (correspondendo à posição 269 doSEQ ID NO: 1) ou do resíduo de aminoácido localizado em umaposição equivalente de um polipeptídeo NS3 nativo de outroserótipo do VHC por qualquer resíduo de aminoácido que nãoseja o Thr, com especial preferência por uma substituição por umresíduo Ala em ambos os casos (T1295A e R1490A). Ainterrupção da atividade da helicase pode ser determinada usandoensaios bem conhecidos na técnica, por exemplo, avaliando-se aatividade de desenovelamento.Mais preferivelmente, o polipeptídeo NS3 emuso na presente invenção é mutado para reduzir ou interrompertanto as atividades de protease como de helicase do polipeptídeoNS3 nativo e compreende as modificações discutidas acima emconexão com essas funções enzimáticas, com especial preferênciapelas mutações H1083A, T1295A e R1490A.

Como alternativa ou em combinação com asmodificações propostas acima em conexão com o polipeptídeoNS3, o polipeptídeo NS5B incluído na proteína de fusão dainvenção é modificado se comparado ao polipeptídeo NS5Bnativo correspondente de modo a apresentar uma atividade deRNA polimerase dependente do RNA significativamentereduzida. Dois resíduos Asp estavam envolvidos nessa funçãoenzimática, respectivamente, nas posições 2640 e 2738numeradas em relação à poliproteína do VHC-I de comprimentototal (que corresponde aos resíduos Asp nas posições 220 e 318do polipeptídeo NS5B do VHC-JA apresentados no SEQ ID NO:4). Exemplos representativos de polipeptídeos NS5B deficientesem polimerase adequados são descritos em Lohmann e col. (1997,J. Virol. 71, 8416-8428). De preferência, o polipeptídeo NS5B emuso na presente invenção compreende pelo menos a substituiçãodo resíduo Asg na posição 2640 (correspondendo à posição 220do SEQ ID NO: 4) ou do resíduo de aminoácido localizado emuma posição equivalente de um polipeptídeo NS5B nativo deoutro serótipo do VHC por qualquer resíduo de aminoácido quenão seja o Asp e/ou a substituição do resíduo Asp na posição2738 (correspondendo à posição 318 do SEQ ID NO: 4) ou doresíduo de aminoácido localizado em uma posição equivalente deum polipeptídeo NS5B nativo de outro serótipo do VHC porqualquer resíduo de aminoácido que não seja o Asp, com especialpreferência por uma substituição por um resíduo Asn em ambosos casos. A interrupção da atividade da RNA polimerase pode serdeterminada usando ensaios bem conhecidos na técnica, porexemplo, ensaios convencionais de replicase baseados naincorporação do substrato de nucleotídeos radioativo em umproduto de RNA nascente (vide, por exemplo, Behrens e col.,1996, EMBO J. 15, 12-22; Ferrari e col., 1999, J. Virol. 73, 1649-1654).

Em outra concretização, os polipeptídeos NSincluídos na proteína de fusão da invenção também podemcompreender modificações adicionais se comparado aospolipeptídeos NS nativos correspondentes. Modificaçõesadequadas são aquelas benéficas ao processamento, estabilidade esolubilidade da proteína de fusão resultante, por exemplo, as quevisam a inativar os sítios de clivagem potenciais, a ancoragem damembrana e/ou a glicosilação, como descrito abaixo.

De forma vantajosa, a proteína de fusão dainvenção não compreende um ou mais dos sítios de clivagemreconhecidos pelo NS3 normalmente presentes no precursor depoliproteína do VHC nas junções NS3/NS4A, NS4A/NS4B,NS4B/NS5A e NS5A/NS5B, de modo a evitar o processamentoem polipeptídeos NS individuais. Embora o polipeptídeo NS3preferido em uso na presente invenção apresente uma atividade daprotease significativamente reduzida, a inativação dos sítios declivagem reconhecidos pelo NS3 introduz um nível adicional desegurança. A seqüência consenso do sítio de clivagem é Asp/Glu-X4-Cys/Thr-Ser/Ala, em que X é qualquer resíduo deaminoácido. Foi mostrado que a clivagem pelo polipeptídeo NS3nativo ocorre após o resíduo Cys/Thr. De preferência, opolipeptídeo NS3 em uso na invenção não compreende o resíduoThr ou Cys normalmente presente no C-terminal de umpolipeptídeo NS3 nativo (posição 1657 numerada em relação àpoliproteína do VHC-I que corresponde à posição 36 do SEQ IDNO :1 ou a uma posição equivalente de um polipeptídeo NS3nativo de outro serótipo do VHC). Como alternativa ou emcombinação, o polipeptídeo NS4A não compreende o resíduo Cysnormalmente presente no C-terminal de um polipeptídeo NS4Anativo (posição 1711 numerada em relação à poliproteína doVHC-I que corresponde à posição 54 do SEQ ID NO:2 ou a umaposição equivalente de um polipeptídeo NS4A nativo de outroserótipo do VHC). Como alternativa ou em combinação, opolipeptídeo NS4A opcional não compreende o resíduo Cysnormalmente presente no C-terminal de um polipeptídeo NS4Bnativo (posição 1972 numerada em relação à poliproteína doVHC-I que corresponde à posição 261 do SEQ ID NO:3 ou auma posição equivalente de um polipeptídeo NS4B nativo deoutro serótipo do VHC).Em ainda outra concretização, a proteína defusão da invenção pode ser modificada ainda mais de modo aexcluir um ou mais domínios hidrofóbicos que normalmente estãoenvolvidos na ancoragem da membrana dos polipeptídeos NS4A,NS4B e/ou NS5B nativos. Seis domínios hidrofóbicos deancoragem à membrana foram identificados no polipeptídeoNS4B nativo, sendo que um está presente na parte N-terminal dopolipeptídeo NS4A nativo e o outro na parte C-terminal dopolipeptídeo NS5B nativo. A deleção pelo menos parcial delespode permitir melhorar a solubilidade da proteína de fusão e,dessa forma, facilitar sua produção por meios recombinantes. Issotambém pode permitir limitar a citotoxicidade geral da proteína defusão se comparado à administração dos polipeptídeos do VHCindividuais em um determinado organismo hospedeiro.

Sob esse aspecto, o polipeptídeo NS4A évantajosamente modificado pela deleção ou substituição de um oumais resíduos de aminoácidos hidrófobos normalmente presentesdentro da parte N-terminal do polipeptídeo NS4A nativo. Umpolipeptídeo NS4A preferido é deletado em até os 20 primeirosaminoácidos no N-terminal (por exemplo, deleção preferidaaproximadamente a partir da posição 1658 até aproximadamente aposição 1677, numerada em relação à poliproteína do VHC-I decomprimento total que corresponde à deleção aproximadamente apartir da posição 1 até aproximadamente a posição 20 dopolipeptídeo NS4A do VHC-JA nativo ilustrado na SEQ ID NO:2) enquanto, contudo, retém a parte do polipeptídeo NS4A nativoestendendo aproximadamente a partir da posição 1678 atéaproximadamente a posição 1690 numerada em relação àpoliproteína do VHC-I de comprimento total (aproximadamente apartir da posição 21 até aproximadamente a posição 33 dopolipeptídeo NS4A do VHC-JA nativo apresentado no SEQ IDNO: 2). Ele pode ou não reter a parte C-terminal do polipeptídeoNS4A nativo, por exemplo, a parte que se estendeaproximadamente da posição 1691 para aproximadamente aposição 1711 numerada em relação à poliproteína do VHC-I decomprimento total (que corresponde aproximadamente a partir daposição 34 até aproximadamente a posição 54 do polipeptídeoNS4A do VHC-JA nativo apresentado no SEQ ID NO: 2). Maispreferivelmente, o polipeptídeo NS4A incluído na proteína defusão da invenção consiste da parte de um polipeptídeo NS4Anativo que se estende a partir da posição 1678 até a posição 1690numerada em relação à poliproteína do VHC-I de comprimentototal (que corresponde à parte NS4A que se estende da posição 21à posição 33 do polipeptídeo NS4A do VHC-JA apresentado noSEQ ID NO: 2).

Como alternativa ou em combinação, umpolipeptídeo NS5B preferido é deletado em 10 a 30 resíduos deaminoácidos normalmente presentes no C-terminal de umpolipeptídeo NS5B nativo, com especial preferência pela deleçãodos últimos 21 resíduos de aminoácidos C-terminal (por exemplo,da posição 2991 até a posição 3011, numerada em relação àpoliproteína do VHC-I que corresponde da posição 571 à posição591 do SEQ ID NO: 4).

Como alternativa ou em combinação, umpolipeptídeo NS4B opcional preferido é deletado em pelo menosum dos seis domínios hidrófobos de ancoragem à membrana.Mais preferivelmente, o polipeptídeo NS4B opcional é truncadopor um ou mais aminoácidos tanto no N quanto no C-terminal dopolipeptídeo NS4B nativo correspondente de modo aessencialmente reter o domínio antigênico interno. Depreferência, o polipeptídeo NS4B opcional em uso na invençãocompreende, ou como alternativa, consiste essencialmente dosegmento de aminoácido que se estende aproximadamente a partirda posição 1789 até aproximadamente a posição 1820, numeradasem relação à poliproteína do VHC-I de comprimento total (quecorresponde aproximadamente à posição 78 até aproximadamentea posição 109 do polipeptídeo NS4B do VHC-J apresentado noSEQ ID NO. 3).

Em ainda outra concretização, a proteína defusão da invenção é adicionalmente modificada de modo asuprimir a potencial N-glicosilação quando da expressão em umadeterminada célula hospedeira. Sob esse aspecto, um sítio deglicosilação consenso Asn-Val-Ser-Val foi identificado nopolipeptídeo NS5B nativo a partir da posição 2789 à posição 2793numeradas em relação à poliproteína do VHC-I de comprimentototal (posição 369 à posição 372 da proteína NS5B do VHC-JAnativo apresentado no SEQ ID NO: 4). Um exemplo de mutaçãosob esse aspecto consiste na substituição do resíduo Sew naposição 2791 numerada em relação à poliproteína do VHC-I decomprimento total (posição 371 do SEQ ID NO: 4) por umresíduo diferente de um resíduo Ser, tal como um resíduo Gly.

De preferência, a proteína de fusão da invençãoé imunogênica, no sentido de que ela é capaz de induzir ouestimular uma resposta imune específica ao antígeno, seja elahumoral ou celular, ou ambas, quando da introdução em umorganismo hospedeiro. A presente invenção também abrangeproteínas de fusão criadas por engenharia genética de modo aaprimorar a imunogenicidade (por exemplo, por oxidação daligação de dissulfeto). De preferência, o enovelamento dos váriospolipeptídeos NS incluídos na proteína a de fusão da invenção écomo o enovelamento dos polipeptídeos NS nativos. No contextoda invenção, prefere-se que a proteína de fusão retenha um oumais domínios antigênicos reconhecidos por um receptor decélulas-T. Diversos domínios antigênicos do VHC que podem serretidos apropriadamente na proteína de fusão são descritos empublicações específicas (vide, por exemplo, Chien e col., 1992,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 10011-10015; Chien e col., 1993,J. Gastroent. Hepatol. 8, S33-39 e W003/097677).

De preferência, o polipeptídeo NS3 incluído naproteína de fusão da invenção retém as partes do polipeptídeoNS3 nativo que se estendem aproximadamente da posição 1038até aproximadamente a posição 1082, aproximadamente daposição 1096 até aproximadamente a posição 1181, eaproximadamente da posição 1244 até aproximadamente aposição 1274 numerada em relação à poliproteína do VHC-I decomprimento total (por exemplo, aproximadamente a partir daposição 12 até aproximadamente a posição 56, aproximadamentea partir da posição 70 até aproximadamente a posição 155 e/ouaproximadamente a partir da posição 218 até aproximadamente aposição 248 do polipeptídeo NS3 do VHC-JA nativo revelado noSEQ ID NO: 1). De preferência, o polipeptídeo NS5B incluído naproteína de fusão da invenção retém a parte do polipeptídeoNS5B nativo que se estende aproximadamente da posição 2573até aproximadamente a posição 2601 numeradas em relação àpoliproteína do VHC-I de comprimento total (por exemplo,aproximadamente a partir da posição 155 até aproximadamente aposição 182 do polipeptídeo NS5B do VHC-J nativo revelado noSEQ ID NO: 4). Quando a proteína de fusão da invençãocompreende um polipeptídeo NS4B, ela de preferência retém aparte do polipeptídeo NS4B nativo que se estendeaproximadamente da posição 1789 até aproximadamente aposição 1820 numeradas em relação à poliproteína do VHC-I decomprimento total (por exemplo, aproximadamente a partir daposição 78 até aproximadamente a posição 109 do polipeptídeoNS4B do VHC-J nativo revelado no SEQID NO: 3).

A atividade imunogênica da proteína de fusãoda invenção pode ser avaliada por uma série de técnicas de usocomum, como as descritas mais adiante em associação com ométodo da invenção ou ilustradas nos Exemplos. No contexto dainvenção, prefere-se que a atividade imunogênica da proteína defusão seja maior em extensão e/ou natureza do que a atividadeimunogênica usual proporcionada por um polipeptídeoNS nativo. Por exemplo, quando da introdução da proteína defusão em um organismo hospedeiro, a resposta imune pode ser demaior intensidade, ou de natureza mais ampla (por exemplo,envolvendo mais células imunes como as células CD4+ eCD8+) ou seu escopo pode ser diferente (por exemplo,direcionado a um epítopo críptico não dominante) do quequando da introdução de um polipeptídeo NS nativo. Issoproporcionaria melhor efeito terapêutico, com isso possibilitandoa redução dos regimes de dosagem e melhorando a qualidade devida.

Um polipeptídeo NS3 preferido se origina daproteína NS3 do VHC-JA nativa apresentada no SEQ ID NO: 1que é modificada pelo menos de tal forma que:

o ela retenha a parte que se estende da posição12 até a posição 56, da posição 70 até a posição 155 e da posição218 até aposição 248;

o ela compreenda a substituição do resíduo Hisna posição 57 por um resíduo de aminoácido diferente de um His,tal como um resíduo Ala;

o ela compreenda a substituição do resíduo Thrna posição 269 por um resíduo de aminoácido diferente de umThr, tal como um resíduo Ala; eela compreenda a substituição do resíduo Argna posição 464 por um resíduo de aminoácido diferente de umArg, tal como um resíduo Ala; eo ela não compreenda o resíduo Thr na posição 631.

Ainda mais preferivelmente, o polipeptídeo NS3em uso na invenção compreende, essencialmente consiste, oualternativamente consiste da seqüência de aminoácidosapresentada no SEQ ID NO: 5.

Um polipeptídeo NS4A preferido se origina daproteína NS4A do VHC-JA nativa apresentada no SEQ ID NO: 2que é modificada pelo menos de tal forma que:

o ela contenha a parte do SEQ ID NO: 2 daposição 21 até aposição 33;

o ela não contenha a parte do SEQ ID NO: 2 daposição 1 até a posição 20;

Ainda mais preferivelmente, o polipeptídeoNS4A tem uma seqüência de aminoácidos que consisteessencialmente da parte do SEQ ID NO: 2 da posição 21 até aposição 33 precedida por um resíduo Met iniciador. Maispreferivelmente, o polipeptídeo NS4A consiste essencialmente daseqüência de aminoácidos apresentada no SEQ ID NO: 6precedida por um resíduo Met iniciador.

Um polipeptídeo NS4B preferido opcional seorigina da proteína NS4B do VHC-JA nativa apresentada no SEQID NO: 3 que é modificada pelo menos de tal forma que:o ela compreenda a parte que se estende doresíduo Ser na posição 78 até o resíduo Leu na posição 109;

o ela não compreenda o resíduo Cys na posição 261.

Ainda mais preferivelmente, o polipeptídeoNS4B opcional consiste essencialmente, ou alternativamenteconsiste da seqüência de aminoácidos conforme apresentada noSEQ ID NO: 7.

Um polipeptídeo NS5B preferido se origina daproteína NS5B do VHC-JA nativa apresentada no SEQ ID NO: 4que é modificada pelo menos de tal forma que:

o ela compreenda a parte que se estende doresíduo Arg na posição 154 até o resíduo Leu na posição 182;

o ela compreenda a substituição do resíduo Aspna posição 220 por um resíduo de aminoácido diferente de umAsp, tal como um resíduo Asn;

o ela compreenda a substituição do resíduo Aspna posição 318 por um resíduo de aminoácido diferente de umAsp, tal como um resíduo Asn; e

o ela não compreende a parte que se estende doresíduo Trp na posição 571 até o resíduo Arg na posição 591.

Ainda mais preferivelmente, o polipeptídeoNS 5B opcional compreende, consiste essencialmente, oualternativamente consiste da seqüência de aminoácidos conformeapresentada no SEQ ID NO: 8.As proteínas de fusão mais preferidas dainvenção compreendem, ou consistem essencialmente oualternativamente de uma seqüência de aminoácidos que éhomóloga ou idêntica à seqüência de aminoácidos apresentada noSEQ ID NO: 9 ou 10. A seqüência apresentada no SEQ ID NO: 9(Figura 1) corresponde à fusão dos polipeptídeos NS4A, NS3 eNS5B preferidos descritos acima, com um Met iniciador N-terminal na posição 1, o polipeptídeo NS4A estendendo-se apartir do resíduo de aminoácido 2 até o resíduo de aminoácido 14,o peptídeo de ligação estendendo-se a partir do resíduo deaminoácido 15 até o resíduo de aminoácido 17, o polipeptídeoNS3 estendendo-se a partir do resíduo de aminoácido 18 até oresíduo de aminoácido 647, o peptídeo de ligação estendendo-se apartir do resíduo de aminoácido 648 até o resíduo de aminoácido652 e o polipeptídeo NS5B estendendo-se a partir do resíduo deaminoácido 653 até o resíduo de aminoácido 1222. A seqüênciaapresentada no SEQ ID NO: 10 (Figura 2) corresponde à fusãodos polipeptídeos NS4A, NS3, NS4B e NS5B mais preferidosdescritos acima, com um Met iniciador N-terminal na posição 1, opolipeptídeo NS4A estendendo-se a partir do resíduo deaminoácido 2 até o resíduo de aminoácido 14, o peptídeo deligação estendendo-se a partir do resíduo de aminoácido 15 até oresíduo de aminoácido 17, o polipeptídeo NS3 estendendo-se apartir do resíduo de aminoácido 18 até o resíduo de aminoácido647, o polipeptídeo NS4B estendendo-se a partir do resíduo deaminoácido 648 até o resíduo de aminoácido 679 e o polipeptídeoNS5B estendendo-se a partir do resíduo de aminoácido 680 até oresíduo de aminoácido 1249.

Também incluídos no âmbito da presenteinvenção estão novos fragmentos peptídicos das proteínas defusão da invenção, em especial os apresentados no SEQ ID NO: 9ou no SEQ ID NO: 10. Como utilizado neste documento, umfragmento compreende pelo menos 10, 15, 20, 50 ou maisresíduos de aminoácidos contíguos das proteínas de fusãoreveladas neste documento. Tais fragmentos podem serescolhidos baseando-se em sua capacidade de realizar umafunção, por exemplo, de se ligar a um substrato ou de agir comoum imunógeno. Fragmentos peptídicos adequados são geralmenteaqueles que compreendem um domínio ou motivo protéico daproteína de fusão contendo novas estruturas imunogênicas.Domínios imunogênicos previstos são prontamente identificáveispor programas de computador, além de serem bem conhecidos eencontrarem-se prontamente disponíveis aos versados na técnica.Os fragmentos peptídicos da invenção podem ser sintetizadosusando métodos de síntese protéica conhecidos.

A proteína de fusão da presente invenção e seusfragmentos peptídicos podem ser produzidos por qualquer métodoadequado, por exemplo, por técnicas de sintetização peptídicadireta convencionais (por exemplo, Bodanszky, 1984 emPrincipies of peptide synthesis, Springer-Verlag), e pelatecnologia do DNA recombinante, conforme descrito abaixo emconexão com os vetores da invenção.Sendo assim, a presente invenção tambémoferece uma molécula de ácido nucléico isolada codificando aproteína de fusão da invenção, com especial preferência oumoléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína de fusãocompreendendo, ou como alternativa, consistindo essencialmentede uma seqüência de aminoácidos como apresentada no SEQ IDNO: 9 ou no SEQ ID NO: 10 ou uma seqüência de aminoácidoshomóloga ao SEQ ID NO: 9 ou ao SEQ ID NO: 10.

De preferência, as moléculas de ácido nucléicoda invenção são otimizadas para proporcionar expressão de altonível em uma célula hospedeira específica, por exemplo, emcélulas hospedeiras de mamíferos, de levedura (por exemplo,Saccharomyces eerevisiae, Saccharomyees pombe ou Pichiapastoris) ou procarióticas (por exemplo, E. coli). De fato, foiobservado que, quando mais de um códon está disponível paracodificar para um dado aminoácido, os padrões de uso de códondos organismos são extremamente pouco aleatórios (vide, porexemplo Wada e col., 1992, Nucleic Acids Res. 20, 2111-2118) ea utilização dos códons pode ser apreciavelmente diferente entreos diferentes hospedeiros (vide, por exemplo, Nakamura e col.,1996, Nucleic Acids Res. 24, 214-215). Uma vez que asseqüências de nucleotídeos de codificação NS usadas na invençãosão de origem viral (VHC), elas podem ter um padrão deutilização de códon inapropriado para expressão eficiente nascélulas hospedeiras, como as células bacterianas ou eucarióticasinferiores.Geralmente, a otimização do códon é realizadasubstituindo-se um ou mais códons "nativos" (por exemplo, oVHC) correspondendo a um códon pouco utilizado nesta célulahospedeira específica por um ou mais códons codificando omesmo aminoácido que é utilizado com mais freqüência. Issopode ser obtido pela mutagênese convencional ou por técnicasquímicas sintéticas (por exemplo, resultando em uma molécula deácido nucléico sintética). Não é necessário substituir todos oscódons nativos correspondendo aos códons pouco utilizados, vistoque a expressão aumentada pode ser obtida mesmo comsubstituição parcial. Além do mais, alguns desvios da aderênciaestrita para utilização otimizada dos códons podem ser realizadospara acomodar a introdução do(s) sítio(s) de restrição na moléculade ácido nucléico resultante.

Além da otimização da utilização dos códons, aexpressão nas células hospedeiras pode ser melhorada ainda maispor modificações adicionais da seqüência de nucleotídeos. Porexemplo, a molécula de ácido nucléico da invenção pode sermodificada de modo a impedir a agregação de códons raros, nãoideais, presentes em áreas concentradas e/ou suprimir oumodificar elementos de seqüência parcialmente negativos, pois seespera que estes influenciem negativamente os níveis deexpressão. Tais elementos de seqüência negativa incluem, semlimitação, as regiões que apresentam um teor de GC altíssimo(>80%) ou baixíssimo (<30%); segmentos de seqüências ricas eAT ou ricas em GC; seqüências de repetições diretas ou invertidasinstáveis; estruturas secundárias de RNA; e/ou elementosregulatórios críticos internos, como caixas TATA internas, sítios-chi, sítios de entrada ribossomal e/ou sítios doadores/receptoresde splicing (montagem de genes).

A molécula de ácido nucléico otimizada dainvenção é, de preferência, capaz de expressar a proteína de fusãoda invenção em uma determinada célula hospedeira em um nívelsuperior, isto é, pelo menos 110%, vantajosamente pelo menos150% e preferivelmente pelo menos 200%, se comparada ao nívelexpresso por uma molécula de ácido nucléico envolvendo osgenes do VHC nativos correspondentes sob condições idênticas(por exemplo, mesmo tipo de célula, mesmas condições decultura, mesmo vetor de expressão, etc.). Os níveis de expressãopodem ser avaliados por técnicas convencionais, como o Westernblotting, usando um anticorpo específico para um dospolipeptídeos do VHC incluídos na proteína de fusão da invenção.

De acordo com uma concretização preferida, apresente invenção proporciona moléculas de ácido nucléico quecompreendem, ou como alternativa, consistem essencialmente de,ou alternativamente consistem de uma seqüência de nucleotídeosque é homóloga, ou ainda mais preferivelmente, idêntica aqualquer uma das seqüências de nucleotídeos apresentadas noSEQ ID NO: 11-16. A molécula de ácido nucléico do SEQ IDNO: 11 codifica uma proteína de fusão NS4A-3-5B, cujaseqüência de nucleotídeos foi otimizada para expressão emcélulas de mamíferos (por exemplo, humanos). A molécula deácido nucléico do SEQ ID NO: 12 codifica uma fusão NS4A-3-4B-5B, cuja seqüência de nucleotídeos foi otimizada paraexpressão em mamíferos (por exemplo, células humanas). Amolécula de ácido nucléico do SEQ ID NO: 13 codifica umafusão NS4A-3-5B, cuja seqüência de nucleotídeos foi otimizadapara expressão em leveduras (por exemplo, P pastoris). Amolécula de ácido nucléico do SEQ ID NO: 14 codifica umafusão NS4A-3-4B-5B, cuja seqüência de nucleotídeos foiotimizada para expressão em leveduras (por exemplo, P pastoris).

A molécula de ácido nucléico do SEQ ID NO: 15 codifica umafusão NS4A-3-5B, cuja seqüência de nucleotídeos foi otimizadapara expressão em procariotos (por exemplo, E. coli). A moléculade ácido nucléico do SEQ ID NO: 16 codifica uma fusão NS4A-3-4B-5B, cuja seqüência de nucleotídeos foi otimizada paraexpressão em procariotos (por exemplo, E. coli). Obviamente, asseqüências podem ser equipadas com seqüências nãocodificadoras 5' e 3' proporcionando, se necessário, um iniciadorMet na extremidade 5', um ou mais códons de PARADA naextremidade 3' e sítios de restrição adequados em ambas asextremidades para facilitar as etapas de clonagem. Exemplos demoléculas de ácido nucléico também são proporcionados nasFiguras 3 a 8.

A presente invenção também se refere amoléculas de ácido nucléico capazes de se hibridizarem sobcondições rigorosas nas moléculas de ácido nucléico comodefinidas acima. As condições rigorosas de hibridização sãoconhecidas pelos versados na técnica. Tipicamente, a hibridizaçãoé realizada em 6 vezes citrato de sódio/cloreto de sódio (SSC) acerca de 45°C, seguido de uma ou mais lavagens em 0,2 vezesSSC, 0,1% SDS a 50-65°C. De preferência, tais ácidos nucléicosde hibridização compartilham um grau de identidade de seqüênciacom as moléculas de ácido nucléico definidas acima maior do que70% de todo o comprimento da seqüência de nucleotídeos ou deum fragmento mais curto dela (por exemplo, de um comprimentode pelo menos 30, 45, 50, 60, 80, 100, 150, 200 nucleotídeos).Mais preferivelmente, o grau de identidade entre elas é maior doque 70%, para melhor proveito, maior do que 80%, sendo maisrecomendável maior do que 85%, de preferência maior do que90%), mais preferivelmente maior do que 95%, ainda maispreferivelmente maior do que 97%. Exemplos representativos detais moléculas de ácido nucléico de hibridização incluem, semlimitação, moléculas de ácido nucléico complementares a pelomenos cerca de 20, 30, 40, 50, 100 ou 150 nucleotídeos contíguosincluídos em qualquer um dos SEQ ID NOs: 11-16 (por exemplo,moléculas de ácido nucléico anti-sentido). Variações dasseqüências exemplificativas, como códons degenerados, oupolimorfismo entre diferentes isolados/linhagens do VHC ouvariações decorrentes de técnicas como o embaralhamento deDNA também são abrangidas pela presente invenção.

Outra concretização da invenção refere-se afragmentos da molécula de ácido nucléico da invenção, porexemplo, fragmentos gerados pela endonuclease de restrição epela PCR. Tais fragmentos podem ser usados como sondas,oligonucleotídeos iniciadores ou fragmentos codificando umaparte imunogênica da proteína de fusão. A molécula de ácidonucléico da presente invenção pode ser gerada usando dados deseqüência acessíveis na técnica e as informações de seqüênciasfornecidas neste documento. A seqüência de DNA codificandopara cada um dos polipeptídeos do VHC incluídos na proteína defusão da presente invenção pode ser isolada diretamente decélulas contendo VHC, do cDNA e bibliotecas genômicas, degenomas virais ou qualquer vetor da técnica anterior conhecidopor incluí-la, pela biologia molecular convencional ou técnicas dePCR, e, se necessário, pode ser adicionalmente modificada portécnicas de mutagênese de rotina (por exemplo, para otimizar aexpressão em uma célula hospedeira específica, para correspondera uma seqüência específica do genótipo ou subtipo, como descritoacima. A fusão das seqüências codificando cada um dospolipeptídeos do VHC pode ser realizada, por exemplo, porligação em quadro tanto diretamente ou através de uma seqüênciacodificando uma ligação peptídica. Como alternativa, a moléculade ácido nucléico da invenção também pode ser gerada porsíntese química no processo automatizado (por exemplo, montadaa partir de oligonucleotídeos sintéticos sobrepostos, comodescrito, por exemplo, em Edge, 1981, Nature 292, 756; Nambaire col., 1984, Science 223, 1299; Jay e col., 5 1984, J. Biol. Chem.259, 6311 ).Também é proporcionado pela presenteinvenção um vetor compreendendo uma ou mais cópias da(s)molécula(s) de ácido nucléico da invenção. Por exemplo, pode servantajoso incluir, no mesmo vetor, moléculas de ácido nucléicocodificando proteínas de fusão originadas de diferentes genótiposou subtipos.

O termo "vetor", como utilizado nestedocumento, refere-se tanto a vetores de expressão como aquelesque não são de expressão, e incluem tanto vetores virais como nãovirais, inclusive vetores extracromossomais (por exemplo,plasmídeos multicópia) e vetores integrantes projetados paraserem incorporados ao(s) cromossomo(s) hospedeiro(s). Departicular importância no contexto da invenção são os vetorespara uso na terapia gênica (ou seja, capazes de distribuir amolécula de ácido nucléico a um organismo hospedeiro), assimcomo vetores de expressão para uso em variados sistemas deexpressão.

Uma variedade de sistemas de vetor-hospedeiropode ser usada para expressar a proteína de fusão da invenção,inclusive organismos procarióticos como bactérias (por exemplo,E. coli ou Bacillus subtilis) transformados com vetores debacteriófagos, plasmídeos ou cosmídeos contendo a molécula deácido nucléico de codificação da fusão; leveduras (por exemplo,Saccharomyces eerevisiae, Saccharomyees pombe, Piehiapastoris) transformadas com vetores de expressão de leveduracontendo a molécula de ácido nucléico de codificação da fusão;sistemas de células de insetos (por exemplo, células Sf 9)infectadas com vetores de expressão viral (por exemplo,baculovírus) contendo a molécula de ácido nucléico decodificação da fusão; sistemas de células de plantas infectadoscom vetores de expressão viral (por exemplo, vírus do mosaico dacouve-flor CaMV; vírus do mosaico do tabaco TMV) outransformados com vetores de expressão de plasmídeos (porexemplo, plasmídeo Ti) contendo a molécula de ácido nucléico decodificação da fusão; ou sistemas de células de mamíferos (porexemplo, células cultivadas) transfectados ou infectados comvetores de expressão de plasmídeo ou vírus contendo a moléculade ácido nucléico de codificação da fusão.

Vetores adequados para uso em sistemasprocarióticos incluem, sem limitação, o pBR322 (Gibco BRL),pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), ρ Poly (Lathe e col.,1987, Gene 57, 193-201), pTrc (Amann e col., 1988, Gene 69,301-315); pET Ild (Studier e col., 1990, Gene ExpressionTechnology: Methods in Enzymology 185, 60-89); pIN (Inouye ecol., 1985, Nucleic Acids Res. 13, 3101-3109; Van Heeke e col.,1989, J. Biol. Chem. 264, 5503-5509); e vetores pGEX em que amolécula de ácido nucléico da invenção pode ser expressa emfusão com a glutationa S-transferase (GST). O plasmídeo pGEX-2T (Amersham Biosciences Product code: 27-4801-01, Genbankaccession No. U13850) é particularmente adequado no contextoda invenção. Vetores adequados para expressão em levedura (porexemplo. S. cerevisiaé) incluem, mas sem a isto se limitar,ρYepSecl (Baldari e col., 1987, EMBO J. 6, 229-234), pMFa(Kujan e col., 1982, Cell 30, 933-943), pJRY88 (Schultz e col.,1987, Gene 54, 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, SanDiego, Calif.) and pTEF-MF (Dualsystems Biotech Product code:P03303). Os vetores adequados para expressão em célulashospedeiras de mamíferos podem ser de origem viral ou não viral(por exemplo, DNA de plasmídeo). Vetores de plasmídeoadequados incluem, sem restrição, pREP4, pCEP4 (Invitrogene),pCI (Promega), pCDM8 (Seed, 1987, Nature 329, 840) epMT2PC (Kaufman e col., 1987, EMBO J. 6, 187-195), pVAX epgWiz (Gene Therapy System Inc; Himoudi e col., 2002, J. Virol.76, 12735-12746). Além disso, os sistemas de vetor de hospedeiroutilizados no contexto da presente invenção também podemcompreender um ou mais elemento(s) adicionais, permitindo amanutenção, propagação ou expressão da molécula de ácidonucléico da presente invenção na célula hospedeira. Taiselementos adicionais incluem, sem limitação, genes marcadoresde modo a facilitar a identificação e o isolamento das célulashospedeiras recombinantes (por exemplo, por complementação deuma auxotrofia celular ou por resistência a antibióticos),elementos de estabilização (por exemplo, seqüência cer comodescrito em Summers and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103 esistema DAP como descrito na US 5,198,343) e elementosintegrantes (por exemplo, seqüências virtuais LTR e transpósons).

Genes marcadores adequados para expressãonas células hospedeiras procarióticas incluem a tetraciclina egenes de resistência à ampicilina. Além disso, os genes deresistência podem ser usados para expressão em célulashospedeiras de mamíferos, tal como a diidrofolato redutase (dhfr)que confere resistência ao metotrexato (Wigler e col., 1980, Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 77, 3567; O1Hare e col., 1981, Proc. Natl.Acad. Sei. USA 78, 1527); gpt, que confere resistência ao ácidomicofenólico (Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 78, 2072); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeoG-418 (Colberre-Garapin e col., 1981, J. MoI. BioL 150, 1); zeo,que confere resistência à zeomicina, kana, que confere resistênciaà canamicina e hydro, que confere resistência à hydromicina(Santerre e col., 1984, Gene 30, 147). Os genes URA3 e LEU2podem ser usados para expressão em sistemas de levedura, o queproporciona complementação dos mutantes de levedura ura3 ouleu2. Em particular, o gene URA3 a partir do qual seu promotorfoi deletado pode ser vantajosamente utilizado.

Diversos sistemas de expressão baseado emvírus também podem ser utilizados no contexto da invenção,derivados de uma variedade de vírus diferentes (por exemplo,retrovírus, adenovírus, AAV, poxvírus, vírus da herpes, vírus dosarampo, vírus espumoso, entre outros). Como utilizado nestedocumento, o termo "vetor viral" abrange o DNA de vetor, bemcomo partículas virais geradas a partir dele. Os vetores viraispodem ser capazes de replicação, ou podem ser geneticamentedesabilitados de modo a serem defectivos para replicação ouincapazes para replicação. O termo "capaz de replicação",conforme usado neste documento, abrange vetores virais dereplicação seletiva e condicionalmente replicativos criados porengenharia genética para replicarem de forma melhor ou seletivaem células hospedeiras específicas (por exemplo, célulastumorais).

Tais vetores incluem, por exemplo, vetoresadenovirais que possuem uma série de vantagens bemdocumentadas para transferência gênica ou para produçãorecombinante (para obter uma visão geral, consulte "Adenoviralvectors for gene therapy", 2002, Ed D. Curiel and J. Douglas,Academic Press). Os vetores adenovirais para uso de acordo coma presente invenção podem ser derivados de uma variedade defontes humanas ou animais. Qualquer serótipo pode serempregado dentre os serótipos do adenovírus 1 a 51, com especialpreferência pelos adenovírus humanos 2 (Ad2), 5 (Ad5), 6 (Ad6),11 (Adi 1), 24 (Ad24) e 35 (Ad35). Os adenovírus citadosencontram-se disponíveis na American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, Md.), e foram o objeto de estudo denumerosas publicações descrevendo sua seqüência, organização emétodos de produção, permitindo aos técnicos aplicá-los (veja,por exemplo, a US 6,133,028; US 6,110,735; WO 02/40665; WO00/50573; EP 1016711; Vogels e col., 2003, J. Virol. 77, 8263-8271).

Em uma concretização, o vetor adenoviral dapresente invenção é capaz de replicação. Exemplos de tais vetoresadenovirais capazes de replicação são bem conhecidos na técnicae encontram-se prontamente disponíveis aos versados na técnica(vide, por exemplo, Hernandez-Alcoceba e col., 2000, HumanGene Ther. 11, 2009-2024; Nemunaitis e col, 2001, Gene Ther.8, 746- 759; Alemany e col., 2000, Nature Biotechnology 18,723-727). Vetores adenovirais capazes de replicação adequadospara uso na invenção podem ser criados por engenharia genética apartir de um genoma de adenovírus do tipo selvagem por deleçãodo domínio ElA CR2 para anular a ligação ao Rb (vide, porexemplo, a W000/24408) e/ou por substituição dos promotoresEl e/ou E4 nativos por promotores específicos à condição dotecido, tumor ou célula (vide, por exemplo, a US5,998,205,W099/25860, US5,698,443, WOOO/46355, W000/15820 eW001/36650).

Em outra concretização, o vetor adenoviral dainvenção é defectivo para replicação (vide, por exemplo, aW094/28152; Lusky e col., 1998, J. Virol 72, 2022-2032).

Vetores adenovirais defectivos para replicaçãopreferidos são o El-defectivo (vide, por exemplo, a US 6,136,594e a US 6,013,638), com uma deleção El estendendo-seaproximadamente das posições 459 a 3328 ou aproximadamentedas posições 459 a 3510 (por referência à seqüência doadenovírus humano tipo 5 revelado no GeneBank sob o númerode acesso M 73260 e em Chroboczek e col., 1992, Virol. 186,280-285). A capacidade de clonagem pode ser melhorada aindamais deletando parte(s) adicionais do genoma adenoviral (toda ouparte da região E3 não essencial ou das outras regiões E2, E4essenciais).

A molécula de ácido nucléico da presenteinvenção pode ser inserida em qualquer localização do genomaadenoviral. De preferência, ela é inserida em substituição daregião El. Ela pode ser posicionada na orientação no sentido ouanti-sentido em relação à direção transcricional natural da regiãoem questão.

Outros vetores virais adequados são derivadosdos poxvírus (vide, por exemplo, Cox e col. Em "Viruses inHuman Gene Therapy" Ed J. M. Hos, Carolina Academic Press).

No contexto da presente invenção, um vetor poxviral pode serobtido de qualquer membro da Poxviridae, em especial do víruscanarypox, fowlpox e da varíola, sendo preferido este último.

Vírus da Varíola adequados incluem, sem limitação, a linhagemCopenhagen (Goebel e col., 1990, Virol. 179, 247-266 e 517-563;Johnson e col., 1993, Virol. 196, 381-401), a linhagem Wyeth e alinhagem Ankara modificada (MVA) (Antoine e col., 1998, Virol.244, 365- 396). As condições gerais para construir o poxvírusrecombinante são bem conhecidas na técnica (vide, por exemplo,a EP 206 920; Mayr e col., 1975, Infection 3, 6-14; Sutter andMoss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 10847-10851; US6,440,422). A molécula de ácido nucléico da presente invenção é,de preferência, inserida dentro do genoma poxviral em um lócusnão essencial. O gene da timidina quinase é particularmenteapropriado para inserção nos vetores da rubéola Copenhagen(Hruby e col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80, 3411-3415;Weir e col., 1983, J. Virol. 46, 530-537) e deleção II ou III parainserção no vetor MVA (Meyer e col, 1991, J. Gen. Virol. 72,1031-1038; Sutter e col., 1994, Vaccine 12, 1032-1040).

De acordo com uma concretização preferida, osvetores da invenção compreendem a molécula de ácido nucléicoda invenção em uma forma adequada para sua expressão em umacélula ou organismo hospedeiro, o que significa que a moléculade ácido nucléico é colocada sob o controle de uma ou maisseqüências regulatórios, apropriadas ao vetor e/ou à célulahospedeira. Como utilizado neste documento, o termo "seqüênciareguladora" refere-se a qualquer seqüência que permita, contribuaou module a expressão de uma molécula de ácido nucléico emuma determinada célula hospedeira, inclusive replicação,duplicação, transcrição, splicing (montagem de genes), tradução,estabilidade e/ou transporte do ácido nucléico ou um de seusderivados (isto é, o mRNA) na célula hospedeira. Será apreciadopelos versados na técnica que a escolha das seqüênciasreguladoras pode depender de fatores tais como a célulahospedeira, o nível de expressão desejado, etc.

O promotor é de especial importância, epromotores adequados úteis no contexto da presente invençãoincluem promotores constitutivos que direcionam a expressão damolécula de ácido nucléico em muitos tipos de célulashospedeiras e aqueles que direcionam a expressão da seqüência denucleotídeos apenas em certas células hospedeiras (por exemplo,seqüências reguladoras específicas do fígado) ou em resposta aeventos específicos ou fatores exógenos (por exemplo, portemperatura, aditivo nutriente, hormônio ou outro ligante).

Promotores adequados para expressão na célulahospedeira de E. coli incluem, sem a isto se limitar, o promotorpL lamba bacteriófago, os promotores lac, TRP e pTAC induzívelpor IPTG. Promotores adequados para expressão em leveduraincluem os promotores TEF (Mumberg e col., 1995, Gene 156,119-122), PGK (Hitzeman e col., 1983, Science 219, 620-625),MF alfa (Inokuchi e col., 1987, MoI. Cell. Biol. 7, 3185-3193),CYC-I (Guarente e col, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78,2199), GAL-I, GAL4, GALlO5 PH05, gliceraldeído-3-fosfatodesidrogenase (GAP ou GAPDH), e álcool desidrogenase (ADH)(Denis e col., 1983, J. Biol. Chem. 25, 1165). Para expressão emvetores poxvirais, pode-se utilizar o promotor 7,5K, H5R, TK,p28, pll ou KlL da varíola, os promotores sintéticos descritos emChakrabarti e col. (1997, Biotechniques 23, 1094-1097),Hammond e col. (1997, J. Virological Methods 66, 135-138) eKumar and Boyle (1990, Virology 179, 151-158), bem comopromotores quiméricos precoces/tardios. Promotores adequadospara expressão constitutiva em células de mamíferos incluem opromotor precoce imediato do citomegalovírus (CMV) (Boshart ecol., 1985, Cell 41, 521-530), o promotor tardio principal doadenovírus, o promotor da fosfoglicero quinase (PGK) (Adra ecol, 1987, Gene 60, 65-74), e o promotor da timidina quinase(TK) do vírus da herpes simplex (HSV)-I. Promotoreseucarióticos induzíveis por compostos fornecidos de formaexógena incluem, sem a isto se limitar, o promotor dametalotioneína induzível por zinco (MT) (Mc Ivor e col., 1987,Mol. Cell Biol. 7, 838-848), o promotor do vírus do tumormamário de camundongo induzível por dexametasona (Dex)(MMTV), o sistema promotor da polimerase T7 (WO 98/10088),o promotor de inseto ecdisona (No e col., 1996, Proc. Natl. Acad.Sei. USA 93, 3346-3351), o promotor reprimível por tetraciclina(Gossen e col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 5547-5551),o promotor induzível por tetraciclina (Kim e col., 1995, J. Virol.69, 2565-2573), o promotor induzível por RU486 (Wang e col.,1997, Nat. Biotech. 15, 239-243 e Wang e col., 1997, Gene Ther.4, 432-441) e o promotor induzível por rapamicina (Magari e col.,1997, J. Clin. Invest. 100, 2865-2872).

Promotores específicos do tecido tambémpodem ser usados, principalmente aqueles que permitem visar ascélulas infectadas pelo VHC para as quais se deseja obterbenefício terapêutico. Promotores adequados incluem promotoresespecíficos do fígado, como os da HMG-CoA redutase (Luskey,1987, Mol. Cell. Biol. 7, 1881-1893); elemento regulador doesterol 1 (SRE-I; Smith e col., 1990, J. Biol. Chem. 265, 2306-2310); albumina (Pinkert e col., 1987, Genes Dev. 1, 268-277);fosfoenol piruvato carboxi quinase (PEPCK) (Eisenberger e col.,1992, Mol. Cell Biol. 12, 1396-1403); proteína reativa-C humana(CRP) (Li e col., 1990, J. Biol. Chem. 265, 4136-4142);glucoquinase humana (Tanizawa e col., 1992, Mol.Endocrinology 6, 1070-1081); colesterol 7-alfa hidrolase (CYP-7)(Lee e col., 1994, J. Biol. Chem. 269, 14681-14689); alfa-1antitripsina (Ciliberto e col., 1985, Cell 41, 531-540); proteína deligação ao fator de crescimento tipo insulina (IGFBP- 1) (Babajkoe col., 1993, Biochem Biophys. Res. Comm. 196, 480-486);transferrina humana (Mendelzon e col., 1990, Nucleic Acids Res.18, 5717-5721); colágeno tipo I (Houglum e col., 1994, J. Clin.Invest. 94, 808-814) e genes FIX (US 5,814,716).

Promotores adicionais adequados para uso nestainvenção podem ser obtidos de genes que são preferivelmenteexpressos em células tumorais proliferativas, como os promotoresdo gene da alfa-foetoproteína superexpresso em câncereshepáticos (Kanai e col., 1997, Câncer Res. 57, 461-465), atranscriptase reversa telomerase (TERT) (W099/27113, WO02/053760 e Horikawa e col., 1999, Câncer Res. 59, 826), eelemento responsivo à hipoxia (HRE).

Os versados na técnica irão apreciar que oselementos reguladores controlando a expressão da molécula deácido nucléico da invenção podem compreender ainda elementosadicionais para iniciação, regulação e/ou terminação adequada datranscrição (por exemplo, seqüências de sinal de localizaçãopoliA), transporte de mRNA (por exemplo, seqüências de sinal delocalização nuclear), processamento (por exemplo, sinais desplicing (montagem de genes)), e estabilidade (por exemplo,íntrons e seqüências 5' e 3' não codificadoras), tradução (porexemplo, sinal peptídico, propeptídeo, seqüências líderestripartidas, sítios de ligação ribossomal, seqüências de Shine-Dalgamo, etc.) na célula ou organismo hospedeiro e etapas depurificação (por exemplo, uma marca).

Por exemplo, um peptídeo de sinal,eventualmente em combinação com um pró-peptídeo, pode serusado para facilitar a secreção da proteína de fusão no meio decultura. O peptídeo de sinal é geralmente inserido no N-terminalda proteína de fusão imediatamente após o iniciador Met, e, senecessário, o pró-peptídeo é inserido a jusante do peptídeo desinal. A escolha dos peptídeos de sinal e/ou pró-peptídeos é amplae acessível aos versados na técnica.

Exemplos de pró-peptídeos/peptídeos de sinalapropriados para a presente invenção incluem, sem a isto selimitar, as seqüências de peptídeos de sinal do fatorcorrespondente (MF) alfa (Kurjan e Herskowitz, 1982, Cell 30,933-934 e US 5,879,926); invertase (W084/01153); PH05 (DK3614/83); YAP3 (protease aspártica de levedura 3; W095/02059);e BARl (W087/02670). Durante a entrada no ER, o peptídeo desinal é clivado fora do polipeptídeo precursor em um sítio deprocessamento. O sítio de processamento pode compreenderqualquer seqüência peptídica que seja reconhecida por umaenzima proteolítica da célula hospedeira. Exemplos de sítios deprocessamento preferidos incluem, sem a isto se limitar, qualquercombinação dos dois resíduos básicos Lys e Arg (com especialpreferência por Lis-Arg), que são clivados pela endopeptidasecodificada pelo gene KEX2 da Saccharomyces eerevisiae (videFuller e col., 1986, Microbiology, 273-278) ou a proteaseequivalente de outras espécies de levedura (vide Julius e col.,1983, Cell 32, 839-852).

Uma marca peptídica (por exemplo, umaseqüência curta de peptídeos capaz de ser reconhecida pelo anti-soro disponível) pode ser utilizada para facilitar a purificação daproteína de fusão recombinante a partir da célula hospedeira oudo sobrenadante da cultura. De preferência, a marca é inserida noC-terminal da proteína de fusão. Exemplos de marcas incluem,sem limitação, a marca His (por exemplo, composta de 6 ou maisresíduos de histidina), seqüência de peptídeos da glutationa-S-transfera (GST) do S mansoni, proteína de ligação à maltose(MPB) da E. coli, fosfatase alcalina humana, o octapeptídeoFLAG e a marca-e (US ,686,152).

Uma concretização preferida da invenção estávoltada para um plasmídeo para expressão em levedura,compreendendo a molécula de ácido nucléico da invenção (porexemplo, a seqüência de nucleotídeos do SEQ ID NO: 13 e 14)colocada sob o controle do promotor TEF e uma seqüênciaterminadora transcricional adequada (por exemplo: terminadoreye do citocromo) que adicionalmente compreende origens dereplicação para e células hospedeiras de levedura e E. coli (porexemplo, ORI e 2μ, respectivamente), marcadores de seleçãoapropriados para expressão em E. coli (por exemplo, gene deresistência à ampicilina) e levedura (por exemplo URA3 paraautoxotrofía e leu2-3).Outra concretização preferida da invenção estávoltada a um plasmídeo pGEX adequado para expressão em E.coli, compreendendo a molécula de ácido nucléico da invenção(por exemplo, a seqüência de nucleotídeos do SEQ ID NO: 15 e16) colocada sob o controle do promotor pTAC induzível porIPTG e uma seqüência terminadora transcricional apropriada queadicionalmente compreende uma origem adequada de replicaçãopara E. coli (por exemplo, ORI) e um marcador de seleçãoadequado (por exemplo, gene de resistência à ampicilina).

Ainda outra concretização preferida da invençãoestá voltada a um vetor adenoviral defectivo para replicação paraexpressão em células de mamíferos, compreendendo a moléculade ácido nucléico da invenção (por exemplo, a seqüência denucleotídeos do SEQ ID NO: 11 e 12) colocada sob elementosreguladores apropriados. De preferência, o vetor adenoviraldefectivo para replicação é um genoma Ad5 El e E3 deletados,com a deleção do El estendendo-se desde aproximadamente onucleotídeo 459 até aproximadamente o nucleotídeo 3511 e adeleção do E3 desde aproximadamente o nucleotídeo 28592 atéaproximadamente o nucleotídeo 30470. Um vetor adenoviralpreferido compreende seqüências Ad5 desde aproximadamente onucleotídeo 1 até aproximadamente o nucleotídeo 458, o cassetede expressão contendo, de 5' a 3', a seqüênciareforçadora/promotor de resposta imediata CMV, um íntronquimérico da β-globina/IgG humana (como encontrado no vetorPCI disponível na Promega), a seqüência codificando qualqueruma das duas formas de poliproteína (SEQ ID NO: 11 ou 12) e osinal de poliadenilação tardio SV40 seguido da seqüência Ad5desde aproximadamente o nucleotídeo 3512 até aproximadamenteos nucleotídeos 28592 e desde aproximadamente o nucleotídeo30470 até aproximadamente o nucleotídeo 35935. Se necessário,o vetor da invenção pode adicionalmente compreender um oumais transgene(s), por exemplo, um gene de interesse a serexpresso junto com a molécula de ácido nucléico da invenção emuma célula ou organismo hospedeiro. De preferência, a expressãodo transgene tem uma atividade terapêutica ou protetora em umadoença ou distúrbio associado ao VHC. Transgenes adequadosincluem, sem limitação, os genes de codificação da citocina (porexemplo, IL-2, IL-7, IL-15, IL-18, IL-21, IFNg), genes decodificação da toxina (e.g. ricina, toxina da difteria, toxina dacólera), genes suicidas, e, principalmente, os genes codificando oTK HSV-I (Caruso e col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90,7024-7028), que será utilizado em combinação com o pró-fármaco acyclovir ou ganciclovir, citosina deaminase (CDase),uracil fosforibosil transferase (UPRTase), que devem serutilizadas em combinação com o prodrug 5-fluorcitosina (5-FC).

O produto gênico FCU-I (descrito na WO 99/54481) éparticularmente útil neste contexto. Se um transgene for utilizado,ele é colocado sob o controle de elementos reguladoresapropriados e pode ser inserido em qualquer localização do vetorda invenção ou em um vetor independente que é utilizado emcombinação com o vetor da invenção.A inserção da molécula de ácido nucléico dainvenção em um backbone de vetor pode ser realizada pelabiologia molecular de rotina, por exemplo, como descrito emSambrook e col. (2001, Molecular Cloning- A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory). A inserção em umvetor adenoviral ou em um vetor poxviral pode ser realizadaatravés da recombinação homóloga, como descritorespectivamente em Chartier e col. (1996, J. Virol. 70, 4805-4810) e Paul e col. (2002, Câncer gene Ther. 9, 470-477).

A presente invenção também abrange vetores(por exemplo, DNA de plasmídeo) complexados em lipídeos oupolímeros para formar estruturas particuladas, como lipossomas,lipoplexos ou nanopartículas. Tais tecnologias encontram-sedisponíveis na técnica (vide, por exemplo, Arangoa e col., 2003,Gene Ther. 10: 5-14; Eliaz e col., 2002, Gene Ther. 9, 1230-1237e Betageri e col., 1993, "Liposome drug delivery systems",Technomic Publishing Company, Inc).

Em outra concretização, a presente invençãooferece partículas virais infecciosas compreendendo as moléculasde ácido nucléico ou vetores previamente descritos da presenteinvenção.

Geralmente, tais partículas virais são produzidaspor meio de um processo compreendendo as etapas de:

(a) introduzir o vetor viral da invenção em umalinhagem celular adequada,(b) cultivar a referida linhagem celular sobcondições adequadas de modo a permitir a produção da referidapartícula viral infecciosa,

(c) recuperar a partícula viral infecciosaproduzida da cultura da referida linhagem celular, e

(d) opcionalmente purificar a referida partículaviral infecciosa recuperada. Quando o vetor viral é defectivo, aspartículas infecciosas são geralmente produzidas em umalinhagem celular de complementação ou pelo uso de um vírusauxiliar, que fornece in trans os genes virais funcionais. Porexemplo, linhagens celulares adequadas para complementar osvetores adenovirais deletados em El incluem as células 293(Graham e col., 1997, J. Gen. ViroL 36, 59-72), bem como ascélulas PER-C6 (Fallaux e col., 1998, Human Gene Ther. 9,1909-1917). Células apropriadas para a propagação dos vetorespoxvirais são as células de aves, e mais preferivelmente,fibroblastos de embrião de galinha (CEF) primários preparados apartir de embriões de galinha obtidos de ovos fertilizados.

As partículas virais infecciosas podem serrecuperadas do sobrenadante da cultura ou das células após a lise.Elas podem ser adicionalmente purificadas de acordo comtécnicas convencionais (cromatografia, ultracentrifugação em umgradiente de cloreto de césio, como descrito, por exemplo, naW096/27677, W098/00524, W098/22588, W098/26048,WO00/40702, EPl016700 e na WO00/50573).A presente invenção também engloba vetores oupartículas virais que foram modificados para permitir odirecionamento preferencial a uma célula-alvo específica (vide,por exemplo, Wickam e col., 1997, J. Virol. 71, 8221-8229;Arnberg e col., 1997, Virol. 227, 239-244; Michael e col, 1995,Gene Therapy 2, 660-668; W094/10323; W002/96939 e a EP 1146 125). Um aspecto característico dos vetores direcionados edas partículas virais da invenção é a presença, em sua superfície,de um ligante capaz de reconhecer e se ligar a um componentecelular e exposto à superfície, tal como um marcador de célulaespecífica (por exemplo, uma célula infectada pelo VHC), ummarcador de tecido específico (por exemplo, um marcadorespecífico do fígado), bem como um antígeno viral (por exemplo,o VHC). Exemplos de ligantes adequados incluem anticorpos ouseus fragmentos direcionados a um domínio antigênico do VHC.O direcionamento celular pode ser realizado pela inserçãogenética do ligante em um polipeptídeo presente na superfície dovírus (por exemplo, fibra adenoviral, penton, pIX ou produtogênico pi 4 da varíola).

A invenção refere-se também a célulashospedeiras que compreendem as moléculas de ácido nucléico,vetores ou partículas virais infecciosas da invenção descritas nopresente documento. No contexto da presente invenção, o termo"célula hospedeira" deve ser interpretado de maneira ampla, semlimitação a uma organização específica no tecido, órgão ou nascélulas isoladas. Tais células podem ser de um tipo único decélulas ou um grupo de tipos diferentes de células e abrangemlinhagens celulares cultivadas, células primárias e célulasproliferativas.

No contexto da invenção, as células hospedeirasincluem células procarióticas, células eucarióticas inferiores,como a levedura, e outras células eucarióticas, como as células deinsetos, as células de plantas e células de mamíferos (porexemplo, humanos ou não humanos). Células hospedeiras de E.coli preferidas incluem, sem limitação, a BL21 de E. coli(disponível na Amersham Biosciences). Células hospedeiras delevedura preferidas incluem, sem limitação, S. cerevisiae, S.pombe, Pichia pastoris, com especial preferência por KEX-2expressando células de levedura, como a linhagem TGY47.1 (ouseu conversor Leu+ isogênico TGY73.4) descrita na EP 607 080 eaquelas descritas na US 5,879,926, US 5,162,208 e US 6,103,515.

Células hospedeiras de mamíferos preferidas incluem, semlimitação, BHK (células renais de hamster), CV-I (linhagemcelular renal de Maçado Africano), células COS (por exemplo,COS-7), células do ovário de hamster chinês (CHO), célulasNIH/3T3 de camundongo, células HeLa e células Vero. Ascélulas hospedeiras também englobam células decomplementação, capazes de complementar pelo menos umafunção defectiva de um vetor defectivo para replicação dainvenção (por exemplo, vetor adenoviral), tal como as células 293e PERC.6. De acordo com uma concretização específica dainvenção, a célula hospedeira pode ser adicionalmenteencapsulada. A tecnologia de encapsulamento celular já foidescrita anteriormente (Tresco e col., 1992, ASAIO J. 38, 17-23;Aebischer e col., 1996, Human Gene Ther. 7, 851-860).

Ainda outro aspecto da presente invençãoconsiste em um método para produzir por recombinação aproteína de fusão, empregando os vetores, partículas viraisinfecciosas e/ou células hospedeiras da invenção. O método paraprodução da proteína de fusão compreende (a) introduzir um vetorou uma partícula viral infecciosa da invenção em uma célulahospedeira adequada para produzir uma célula hospedeiratransfectada ou infectada, (b) cultivar in-vitro a referida célulahospedeira transfectada ou infectada sob condições adequadas aocrescimento da célula hospedeira, (c) recuperar a proteína defusão da cultura celular, e (d) opcionalmente, purificar a proteínade fusão recuperada.

Espera-se que os versados na técnica conheçamos numerosos sistemas de expressão disponíveis para produzir asproteínas de fusão da invenção em células hospedeirasapropriadas e os métodos para introduzir um vetor ou umapartícula viral infecciosa em uma célula hospedeira. Tais métodosincluem, sem a isto se limitar, microinjeção (Capechi e col., 1980,Cell 22, 479-488), transfecção mediada por CaPO4 (Chen andOkayama, 1987, Mol. Cell Biol. 7, 2745-2752), transfecçãomediada por DEAE-dextrano, eletroporação (Chu e col., 1987,Nucleic Acid Res. 15, 1311-1326), fusão porlipofecção/lipossoma (Feigner e col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 84, 7413-7417), bombardeio de partículas (Yang e col.,1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 9568-9572), biobalística,transdução, infecção viral, bem como administração direta em umorganismo hospedeiro por variados meios.

Os vetores da invenção podem ser utilizados emassociação com reagentes de transfecção a fim de facilitar aintrodução do vetor na célula hospedeira, tais como polímerospolicatiônicos (por exemplo, quitosana, polimetacrilato, PEI, etc.)e lipípeos catiônicos (por exemplo, DC-Chol/DOPE, lipofectinatransfectam, que agora se encontra disponível através daPromega). Além do mais, como discutido acima, tecnologias deDNA recombinante podem ser utilizadas para melhorar aexpressão da molécula de ácido nucléico na célula hospedeira, porexemplo, utilizando-se vetores de grande número de cópia,substituindo ou modificando-se uma ou mais seqüênciasreguladoras transcricionais (por exemplo, promotor, seqüênciareforçadora, entre outros), otimizando a utilização dos códons damolécula de ácido nucléico de codificação da fusão para a célulahospedeira, e suprimindo as seqüências negativas que podemdesestabilizar a transcrição.

As células hospedeiras da presente invençãopodem ser cultivadas em bioreatores de fermentação, frascos eplacas de Petri convencionais. A cultura pode ser realizada a umatemperatura, pH e teor de oxigênio apropriados para umadeterminada célula hospedeira. Não será feita uma tentativa dedescrever em detalhes os vários métodos conhecidos para aprodução de proteínas em células procariotas e eucariotas. Aprodução da proteína de fusão pode ser periplásmica, intracelularou secretada fora da célula hospedeira (por exemplo: no meio decultura).

Quando a proteína de fusão não é secretada forada célula hospedeira produtora, ou quando ela não é secretadacompletamente, ela pode ser recuperada por procedimentos de Iisepadrão, incluindo gelo-degelo, sonicação, rompimento mecânico,uso de agentes indutores da lise, entre outros. Caso seja secretada,ela pode ser recuperada diretamente do meio de cultura. Aproteína de fusão pode então ser purificada por métodos depurificação consolidados, inclusive precipitação por sulfato deamônio, extração de ácido, eletroforese em gel, filtração emétodos cromatográficos (por exemplo, fase reversa, exclusão portamanho, troca iônica, afinidade, fosfocelulose, interaçãohidrófoba, hidroxilapatita, ou cromatografia líquida de altaeficiência). As condições e tecnologia utilizadas para purificaruma proteína de fusão específica da invenção dependerão defatores como a carga líquida, o peso molecular, a hidrofobia, ahidrofilia, e serão facilmente reconhecidas pelos versados natécnica. Além disso, o nível de purificação irá depender do fim aque se destina. Também é entendido que, dependendo da célulahospedeira produtora, as proteínas de fusão podem ter váriospadrões de glicosilação, ou podem ser não glicosiladas (porexemplo, quando produzidas em bactérias).Em outro aspecto, a presente invenção ofereceuma composição compreendendo a proteína de fusão, a moléculade ácido nucléico, o vetor, a partícula viral infecciosa, a célulahospedeira da invenção (também chamada aqui de "agente ativo")ou qualquer combinação destes (por exemplo, combinação deproteínas de fusão ou vetores/partículas virais codificandoproteínas de fusão de diferentes genótipos ou subtipos). Depreferência, a composição é uma composição farmacêutica quecompreende, além de uma quantidade eficaz do(s) agente(s)ativo(s) do ponto de vista terapêutico, um veículo aceitável doponto de vista farmacêutico. Como usado neste documento, uma"quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico" é uma dosesuficiente para o alívio de um ou mais sintomas normalmenteassociados à doença ou condição que se deseja tratar. Comrespeito ao uso profilático, esse termo significa uma dosesuficiente para impedir ou retardar a consolidação de uma doençaou condição. Por exemplo, uma quantidade eficaz do ponto devista terapêutico para induzir uma resposta imune poderia ser aquantidade necessária para causar a ativação do sistemaimunológico (por exemplo, resultando no desenvolvimento deuma resposta anti-VHC).

Como usado neste documento, o termo "veículoaceitável do ponto de vista farmacêutico" pretende incluir todo equalquer veículo, solvente, diluente, excipiente, adjuvante, meiode dispersão, revestimento, agente antibacteriano e antifungico eagente de retardo de absorção, entre outros, compatível com aadministração farmacêutica.

De forma apropriada, a composiçãofarmacêutica da invenção compreende um diluente apropriadopara uso humano ou animal. De preferência, ele é isotônico,hipotônico ou fracamente hipertônico, e tem uma força iônicarelativamente baixa. Exemplos representativos incluem águaestéril, solução salina fisiológica (por exemplo, cloreto de sódio),solução de Ringer, glicose, trealose ou soluções de sacarose,solução de Hank, e outras soluções salinas fisiologicamenteequilibradas (vide, por exemplo, a edição mais recente deRemington : The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro,Lippincott, Williams&Wilkins). A composição da invenção éadequadamente tamponada de modo a ser apropriada para usohumano a um pH fisiológico ou ligeiramente básico (porexemplo, entre aproximadamente o pH 7 e pH 9). Tampõesadequados incluem, sem limitação, tampão fosfato (por exemplo,PBS), tampão bicarbonato e/ou tampão Tris.

A composição também pode conter outrosexcipientes aceitáveis do ponto de vista farmacêutico para obterpropriedades farmacêuticas ou farmacodinâmicas desejadas,incluindo, por exemplo, modificar ou manter o pH, osmolalidade,viscosidade, clareza, cor, esterilidade, estabilidade, coeficiente dedissolução da formulação, modificar ou manter a liberação ouabsorção em um organismo humano ou animal, promover otransporte através da barreira sangüínea ou penetração em umórgão específico (por exemplo, o fígado). Excipientes adequadosincluem aminoácidos.

Veículos aceitáveis do ponto de vistafarmacêutico incluídos na composição da invenção tambémdevem permitir a preservação de sua estabilidade sob as condiçãode fabricação e estocagem a longo prazo (isto é, de pelo menosum mês) sob congelamento (por exemplo, -70°C, -20°C),temperaturas refrigeradas (por exemplo, 4°C) ou à temperaturaambiente. Sob esse aspecto, formulações que são particularmenteadaptadas à composição da invenção incluem:

o IM sacarose, 150 mM de NaCl, ImM deMgCl2, 54 mg/l de Tween 80, 10 mM de Tris pH 8.5(especialmente quando o agente ativo é um vetor adenoviral), e

o 10 mg/ml de manitol, 1 mg/ml de HSA, 20mM de Tris, pH 7.2, e 150 mM de NaCl 25

o solução salina fisiológica

Além disso, a composição da invenção podecompreender um ou mais adjuvantes adequados para aplicaçãosistêmica ou mucosal em humanos. De preferência, o adjuvante écapaz de estimular a imunidade para a composição da invenção,em especial uma imunidade mediada por célula T, por exemplo,através dos receptores do tipo "toll" (TLR), como o TLR-7, TLR-8 e o TLR-9. Exemplos representativos de adjuvantes úteisincluem, sem limitação, alume, emulsão de óleo minera, tal comoos adjuvantes completos e incompletos de Freynd (IFA),lipopolissacarídeo ou um derivado deste (Ribi e col., 1986,Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins,Plenum Publ. Corp., NY3 p407-419), saponinas como a QS21(Sumino e col., 1998, J.Virol. 72, 4931-4939; WO 98/56415),compostos de imidazol-quinolina como Tmiquimod (Suader,2000, J. Am Acad Dermatol. 43, S6-S11) e o compostorelacionado S- 27609 (Smorlesi, 2005, Gene Ther. 12, 1324-1332), oligodeoxinucleotídeos de citosina fosfato guanosina comoo CpG (Chu e col., 1997, J. Exp. Med. 186: 1623; Tritel e col.,2003, J. Immunol. 171 : 2358-2547) e peptídeos catiônicos comoo IC-31 (Kritsch e col., 2005, J. Chromatogr Anal. TechnolBiomed Life Sci 822, 263-270).

A composição da presente invenção pode seradministrada por uma variedade de modos de administração,inclusive administração sistêmica, tópica e localizada. A injeçãopode ser realizada por qualquer meio, por exemplo, por injeçãosubcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa,intraperitonial, intratumoral, intravascular, intra-arterial ou diretaem uma artéria (por exemplo, por infusão na artéria heptática) ouem uma veia que alimenta o fígado (por exemplo, injeção na veiaporta). As injeções podem ser realizadas com seringas e agulhasconvencionais, ou qualquer outro dispositivo apropriadodisponível na técnica. Como alternativa, a composição dapresente invenção pode ser administrada via uma rota mucosal, talcomo a rota oral/alimentar, nasal, intratraqueana, intrapulmonar,intravaginal ou intraretal. A administração no trato respiratóriopode ser realizada através da nebulização ou aerossolização degotículas, spray ou composições em pó seco usando um recipientepressurizado (por exemplo, com um propelente adequado, comodiclorodifluormetano, propano, nitrogênio, entre outros) ou emum dispensador não pressurizado. A administração tópica tambémpode ser realizada utilizando-se meios transdérmicos (porexemplo, adesivo e similares). No contexto da invenção, asadministrações intramuscular e subcutânea constituem as rotaspreferidas.

A composição da invenção pode ser em váriasformas, por exemplo, sólida, líquida ou congelada. Composiçõessólidas (por exemplo, em pó seco ou liofilizadas) podem serobtidas por um processo envolvendo secagem a vácuo ousecagem por congelamento. Para administração mucosal, ascomposições podem ser formadas como cápsulas e grânulosgastrorresistentes para administração via oral, supositórios paraadministração retal ou vaginal, talvez com acentuadores deabsorção úteis para aumentar o tamanho de poro das membranasmucosais. Tais acentuadores de absorção normalmente sãosubstâncias que possuem similaridades estruturais com osdomínios de fosfolipídeo das membranas mucosais, como odeoxicholato de sódio, glicocholato de sódio, dimetil-beta-ciclodextrina, lauroil-1 -lisofosfatidilcolina).

A dosagem apropriada pode ser adaptada emfunção de vários parâmetros, em especial do modo deadministração; da composição empregada; da idade, da saúde, edo peso do organismo hospedeiro; da natureza e do grau dossintomas; do tipo de tratamento simultâneo; da freqüência dotratamento; e/ou da necessidade de prevenção ou terapia. Outrosapuramentos sobre os cálculos necessários para determinar adosagem apropriada para tratamento são efetuados rotineiramentepor um profissional, considerando as circunstâncias relevantes.

Para orientação geral, a dosagem adequada para uma composiçãocompreendendo um vírus (por exemplo, partículas de adenovírus)varia de cerca de IO5 a IO13 ui (unidades de infecção), depreferência cerca de IO7 a IO12 ui. Uma composição baseada emplasmídeos de vetor pode ser administrada em doses entre 10 μg e20 mg, de preferência entre 100 μg e 2 mg. Uma composiçãoprotéica pode ser administrada em uma ou mais doses entre 10 nge 20 mg, com especial preferência por um dosagem de cerca de0,1 μg a cerca de 2 mg da proteína terapêutica por kg de pesocorporal. A administração pode ocorrer em uma única dose ou emuma dose repetida uma ou várias vezes após certo intervalo detempo.

A composição farmacêutica da invenção podeser empregada em métodos para tratar uma variedade de doençase condições patológicas, principalmente aquelas associadas a umainfecção pelo VHC. Como utilizado neste documento, o termo"tratamento" abrange tanto profilaxia quanto terapia. Ele é deespecial utilidade no tratamento de infecções persistentes peloVHC e do câncer hepático em pacientes infectados pelo VHC. Otermo "câncer" abrange quaisquer condições cancerosas, inclusivetumores difusos ou localizados, metástase, pólipos cancerosos,bem como lesões preneoplásticas (por exemplo, cirrose). Depreferência, quando da introdução em um organismo hospedeirode acordo com as modalidades descritas neste documento, acomposição da invenção proporciona um benefício terapêutico aohospedeiro tratado. O termo "organismo hospedeiro" pretendeincluir qualquer animal, principalmente mamíferos, assim comomurinos, ratos, bovinos, suínos, caninos, felinos, eqüinos,macacos ou pacientes humanos, por exemplo, um humanoinfectado pelo VHC. O benefício terapêutico pode ser evidenciadapor diversas formas, por exemplo, uma diminuição da viremia doVHC detectada no sangue, plasma ou soro de um indivíduoinfectado, se comparado a antes do tratamento, e/ou pela detecçãode uma resposta imune anti-VHC (por exemplo, produção deanticorpos anti-VHC e/ou imunidade mediada por células T) oupelo retardo dos sintomas associados a uma infecção pelo VHC(por exemplo, retardo no desenvolvimento de uma cirrose oucâncer hepático), ou por uma redução dos sintomas deinflamação/esteatose/fíbrose do fígado, geralmente associados áinfecção pelo VHC ou por uma resposta melhor do indivíduo àsterapias convencionais.

Sendo assim, a presente invenção tambémabrange o uso da proteína de fusão, molécula de ácido nucléico,vetor, partícula viral infecciosa, célula hospedeira ou composiçãoda invenção para a preparação de um fármaco destinado aotratamento ou prevenção de infecções pelo VHC, doençasassociadas ao VHC e condições patológicas, de acordo com asmodalidades descritas acima.

A presente invenção também oferece ummétodo para o tratamento ou prevenção de um organismo humanoou animal, compreendendo administrar ao referido organismouma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de fusão, damolécula de ácido nucléico, do vetor, da partícula viral infecciosa,da célula hospedeira ou da composição da invenção.

Se desejado, o método da invenção pode serrealizado em combinação com uma ou mais modalidadesterapêuticas convencionais (por exemplo, radiação, quimioterapiae/ou cirurgia). O uso de múltiplas abordagens terapêuticas ofereceao paciente uma intervenção de base mais extensa. Em umaconcretização, o método da invenção pode ser precedido ouseguido de uma intervenção cirúrgica. Em outra concretização,ele pode ser precedido ou seguido de radioterapia (por exemplo,radiação gama). Os versados na técnica serão capazes de formularde imediato protocolos e parâmetros apropriados para a terapiapor radiação para serem utilizados (vide, por exemplo, Perez andBrady, 1992, Principies and Practice of Radiation Oncology, 2ndEd. JB Lippincott Co; usando adaptações e modificaçõesapropriadas, que podem ser facilmente concebidas pelos versadosna técnica).

Em ainda outra concretização, o método ou usoda invenção está associado à quimioterapia com um ou maisfármacos para o VHC convencionalmente utilizados para otratamento ou prevenção de infecções pelo VHC, doençasassociadas ao VHC ou condições patológicas. Exemplosrepresentativos de fármacos para o VHC incluem, sem limitação,inibidores da protease (por exemplo, inibidores da serina protease,como o VX950 da Vertex), inibidores da polimerase, inibidoresda helicase, antifibróticos, análogos de nucleosídeos, agonistas deTLR, inibidores da N-glicosilação, siRNA, oligonucleotídeosanti-sentido, anticorpos anti-VHC, moduladores imunológicos,vacinas terapêuticas e agentes antitumorais geralmente utilizadosno tratamento de hepatocarcinomas associados ao VHC (porexemplo, adriamicina ou uma mistura de adriamicina lipiodol espongel, normalmente administrada por quimioembolização naartéria hepática). Por exemplo, vacinas terapêuticas incluemantígenos recombinantes, VLPs, vetores ou peptídeos sintéticosbaseados em, ou codificando proteínas estruturais do VHC(Núcleo, envoltório El e/ou E2) que são particularmenteadequadas para desencadear uma resposta humoral anti-VHC.Tais fármacos para o VHC podem ser fornecidos em uma doseúnica, ou, como alternativa, em múltiplas doses segundo osprotocolos, dosagens e regimes convencionais, ao longo de váriashoras, dias e/ou semanas. A administração desses fármacos podeocorrer antes, durante ou depois da administração da composiçãoda invenção. Uma combinação particularmente adequada inclui otratamento com IFN-a2a peguilado (por exemplo, a uma dose de10 μg/semana) e/ou ribavirina (por exemplo, de 800 a 1200mg/dia) durante 24 a 48 semanas, antes, durante ou depois dométodo da invenção.

Em outra concretização, o método ou uso dainvenção é realizado de acordo com uma modalidade terapêuticade indução e reforço, que compreende a administração seqüencialde uma ou mais composições iniciadoras e uma ou maiscomposições reforçadoras. Geralmente, as composiçõesiniciadoras e reforçadoras utilizam diferentes veículos, quecompreendem ou codificam pelo menos um domínio antigênicoem comum. A composição iniciadora é inicialmente administradaao organismo hospedeiro e a composição reforçadora ésubseqüentemente administrada ao mesmo organismo hospedeiroapós um período, que pode variar de um dia a doze meses. Ométodo da invenção pode compreender de uma a dezadministrações seqüências da composição iniciadora, seguido deuma a dez administrações seqüenciais da composição reforçadora.

De preferência, os intervalos de injeção são uma questão de umasemana a seis meses. Além do mais, as composições iniciadoras ereforçadoras podem ser administradas no mesmo local, ou emlocais alternativos, pela mesma via ou por vias de administraçãodiferentes. Por exemplo, composições baseadas em polipeptídeopodem ser administradas por uma via mucosal, ao passo quecomposições baseadas em vetores são preferivelmente injetadas,por exemplo, injeção subcutânea para um vetor MVA, injeçãointramuscular para um plasmídeo de DNA e para um vetoradenoviral.No contexto da invenção, uma composição dainvenção é utilizada tanto para induzir quanto para reforçar, ouentão para induzir e reforçar uma resposta imunológica anti-VHC.As composições iniciadoras preferidas da invenção são, depreferência, aquelas que compreendem um vetor/vírus adenoviralde codificação da fusão e um DNA de plasmídeo de codificaçãode fusão. De preferência, utilizam-se vetores/vírus MVA decodificação da fusão para o reforço. Entretanto, é possível utilizara proteína de fusão produzida por recombinação de formaindependente para a iniciação ou reforço. Por exemplo, pode-serealizar a iniciação com uma proteína de fusão produzida porrecombinação contendo a seqüência de aminoácidos apresentadano SEQ ID NO: 9 ou no SEQ ID NO: IOeo reforço com umvetor adenoviral codificando tal proteína de fusão. Como outroexemplo, pode-se realizar a iniciação com uma um plasmídeo deDNA codificando uma proteína de fusão contendo a seqüência deaminoácidos apresentada no SEQ ID NO: 9 ou no SEQ ID NO:10 e o reforço com partículas de vírus MVA codificando talproteína de fusão. Também é possível utilizar a composição dainvenção em combinação com qualquer material do estado datécnica codificando ou compreendendo um domínio antigênicoem comum com a composição da invenção (por exemplo, umdomínio antigênico do polipeptídeo NS3, NS4B e/ou NS5B). Aorigem desse material é vasta, e inclui, sem limitação, peptídeos,proteínas, vetor viral de uma variedade de vírus, DNA deplasmídeo, partícula proteináceas, como partículas tipo vírus(Burns e col, 1994, Mol. Biol. Tech no. 1, 137-145), materiaiscelulares, como células irradiadas, partículas de vírus, etc. Porexemplo, vetores particularmente apropriados úteis neste contextosão os vetores adenovirais e MVA descritos na W02004/111082que codificando o NS3, NS4 e NS5B. Como outro exemplo, ospeptídeos descritos na W003/0976t77 compreendendo domíniosantigênicos de NS3, NS4B e NS5B também são úteis no contextoda invenção. Para fins ilustrativos, pode-se realizar a iniciaçãocom as partículas adenovirais da W02004/111082 e depois oreforço com a proteína de fusão produzida de forma recombinantedo SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10 ou com o vetor/vírus MVAcodificando a proteína de fusão do SEQ ID NO: 9 ou SEQ IDNO: 10 conforme definida acima. Como outro exemplo, pode-serealizar a iniciação com um plasmídeo de DNA codificando aproteína de fusão do SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10, e reforçarcom o vetor MVA da W02004/111082.

No entanto, outras combinações de indutor ereforço também são plausíveis no contexto da invenção.

A presente invenção também oferece ummétodo para induzir ou estimular uma resposta imunológicacontra o VHC em um organismo hospedeiro, compreendendoadministrar, ao referido organismo, a proteína de fusão, amolécula de ácido nucléico, o vetor, a partícula viral infecciosa, acélula hospedeira ou composição da invenção de modo a induzirou estimular a referida resposta imunológica. A respostaimunológica pode ser uma resposta específica e/ou não específica,humoral e/ou mediada por célula. A resposta imunológica é, depreferência, uma resposta de células T direcionada a um antígenodo VHC.

A capacidade do método da invenção eminduzir ou estimular uma resposta imunológica anti-VHC quandoda administração em um organismo animal ou humano pode seravaliada tanto in vitro quanto in vivo usando uma variedade deanálises convencionadas na técnica. Para uma descrição geral dastécnicas disponíveis para avaliar o princípio e a ativação de umaresposta imunológica, consulte, por exemplo, Coligan e col. (1992e 1994, Current Protocols in Immunology ; ed J Wiley & SonsInc, National Institute of Health). A medição da imunidade celularpode ser realizada medindo-se os perfis de citocina secretadospelas células efetoras ativadas incluindo os derivados das células-T CD4+ e CD8+ (por exemplo, quantificação das célulasproduzindo IL-IO ou IFNg por ELIspot), pela determinação dacondição de ativação das células efetoras imunológicas (porexemplo, ensaios de proliferação de células-T por uma absorçãode timidina [ H] clássica), analisando a presença de linfócitos-Tespecíficos do antígeno em um paciente sensibilizado (porexemplo, Iise específica do peptídeo em uma análise decitotoxicidade). A capacidade de estimular uma resposta humoralpode ser determinada pela ligação de anticorpos e/ou competiçãona ligação (refira-se, por exemplo, a Harlow, 1989, Antibodies,Cold Spring Harbor Press). O método da invenção também podeser validado em modelos animais desafiados com um agenteinfeccioso ou indutor de tumor apropriado (por exemplo, um vírusda varíola expressando genes NS) para determinar a neutralizaçãodo agente infeccioso ou indutor de tumor e, por fim, a resistênciaparcial aos sintomas associados, refletindo uma indução ou umamelhora de uma resposta imunológica anti-VHC. O teste evalidação das composições da invenção também são ilustrados naseção de Exemplos anexa.

A invenção também oferece anticorpos que seligam seletivamente à proteína de fusão da presente invenção ou afragmentos peptídeos dela. Como usado neste documento, umanticorpo se liga seletivamente a um peptídeo-alvo quando ele seliga ao peptídeo-alvo e não se liga significativamente a proteínasnão relacionadas. Em certos casos, entende-se que o anticorpoligando-se ao peptídeo ainda é seletivo apesar de certo nível dereatividade cruzada. Contudo, prefere-se que o anticorpo dainvenção não se ligue com alta afinidade ou alta seletividade apolipeptídeos NS nativos individuais e fusões dos polipeptídeosNS configuradas em uma configuração nativa.

Como usado neste documento, um anticorpodefine-se em termos condizentes com o reconhecido na esferatécnica. Os anticorpos da presente invenção incluem anticorpospoliclonais e anticorpos monoclonais, bem como fragmentos detais anticorpos, incluindo, sem a isto se limitar, fragmentos Favou F(ab').sub.2, e Fv. Os anticorpos da presente invenção podemser produzidos usando técnicas convencionais, por exemplo, apósa administração, a um animal, de uma quantidade eficaz de umaproteína de fusão da presente invenção e/ou de um fragmentopeptídico dela. Os anticorpos são preferivelmente preparados apartir de regiões ou fragmentos distintos da proteína de fusão dainvenção compreendendo seqüências únicas, como as quesobrepõe o sítio de fusão entre os polipeptídeos NS4A e NS3 e ospolipeptídeos NS3 e NS5B.

Os anticorpos da presente invenção possuemuma variedade de usos possíveis, todos os quais se enquadram noâmbito da presente invenção. Por exemplo, tais anticorpos podemser usados (a) como reagentes em ensaios para detectar umaproteína de fusão da presente invenção, (b) como reagentes emensaios para detectar a presença de um vírus VHC em umaamostra biológica e/ou (c) como ferramentas para recuperar aproteína de fusão produzida de forma recombinante da presenteinvenção a partir de uma mistura de proteínas e outroscontaminantes (por exemplo, permitindo a purificação pelacromatografia por afinidade ou imunoprecipitação a partir decélulas hospedeiras cultivadas).

A presente invenção também se refere a ummétodo para a detecção e/ou quantificação de um vírus VHC ouum anticorpo anti-VHC em uma amostra biológica (por exemplo,plasma, soro, tecido) coletada de um indivíduo suscetível a serinfectado pelo referido vírus VHC usando a proteína de fusão,molécula de ácido nucléico, vetor, partícula viral infecciosa,célula hospedeira, composição ou anticorpo da invenção.Em uma concretização, o método é maisparticularmente adequado para a detecção e/ou quantificação deum vírus VHC em uma amostra biológica e compreende pelomenos as etapas de colocar a referida amostra biológica emcontato com pelo menos um dos anticorpos da invenção sobcondições que permitem a formação de um complexo entre ovírus e o anticorpo, e detectar e/ou quantificar a formação doreferido complexo por qualquer meio apropriado.

Em outra concretização, o método é maisparticularmente adequado à detecção e/ou quantificação de umanticorpo anti-VHC em uma amostra biológica e compreendepelo menos as etapas de colocar a referida amostra biológica emcontato com pelo menos um dentre a proteína de fusão, amolécula de ácido nucléico, o vetor, a partícula viral infecciosa, acélula hospedeira, a composição da invenção sob condições quepermitem a formação de um complexo entre o anticorpo anti-VHC e a proteína de fusão, a molécula de ácido nucléico, o vetor,a partícula viral infecciosa, a célula hospedeira, a composição dainvenção, e detectar e/ou quantificar a formação do referidocomplexo por qualquer meio apropriado.

Os versados na técnica serão capazes dedeterminar facilmente a quantidade de anticorpos, proteínas defusão, moléculas de ácido nucléico, vetores, partículas viraisinfecciosas, células hospedeiras e composições a serem utilizadosnos métodos da invenção. Os meios de detecção e/ouquantificação do vírus são comuns e conhecidos pelos versados natécnica. A título de ilustração, podemos mencionar "blots",ELISA, as chamadas técnicas "sanduíche", técnicas decompetição e técnicas PCR, em especial as chamadas técnicas"em tempo real". O uso de um anticorpo, proteína de fusão,molécula de ácido nucléico, vetor, partícula viral infecciosa,célula hospedeira, ou composição da presente invenção comoreagente pode ser facilitado pelo acoplamento (isto é, ligaçãofísica) a uma substância detectável. Exemplos de substânciasdetectáveis incluem várias enzimas (por exemplo, peroxidase deraiz-forte, fosfata alcalina, beta-galactosidadse ouacetilcolinesterase), grupos protéticos (por exemplo,estreptavidina/biotina, ou avidina/biotina), materiais fluorescentes(por exemplo, umbeliferona, fluoresceína ou derivados dafluoresceína), materiais luminescentes, materiais bioluminescentes (por exemplo, luciferase, luciferina ouaequorina) e materiais radioativos (por exemplo 125I, 131I, 35S ou3H).

Finalmente, a invenção refere-se ao uso daproteína de fusão, molécula de ácido nucléico, vetor, partículaviral infecciosa, célula hospedeira, composição ou anticorpo dainvenção para o diagnóstico in vitro de uma infecção pelo VHCem uma amostra biológica.

A invenção foi descrita de maneira ilustrativa, edeve ser compreendido que a terminologia utilizada é de caráterdescritivo em vez de limitativo. Obviamente, muitas modificaçõese variações da presente invenção são possíveis à luz dosensinamentos acima. Portanto, deve-se entender que dentro doâmbito das reivindicações apensas, a invenção pode ser praticadade forma diferente da descrita especificamente neste documento.

Todas as revelações de patentes, publicações eentradas de base de dados citadas acima são incorporadas nestepor referência em sua totalidade da mesma forma que se cadapatente, publicação ou entrada individual fosse indicada de formaespecífica e individual para ser incorporada por referência.

Legendas das Figuras

A Figura 1 ilustra a seqüência de aminoácidosde uma proteína de fusão NS4A-3-5B. Resíduos de aminoácidosadicionados ou modificados encontram-se sublinhados, ao passoque os resíduos nativos substituídos são apresentados abaixo da seqüência.

A Figura 2 ilustra a seqüência de aminoácidosde uma proteína de fusão NS4A-3-4B-5B. Resíduos deaminoácidos adicionados ou modificados encontram-sesublinhados, ao passo que os resíduos nativos substituídos sãoapresentados abaixo da seqüência. A Figura 3 ilustra a seqüênciade nucleotídeos codificando a proteína de fusão NS4A-3-5Botimizada para expressão em células de mamíferos.

A Figura 4 ilustra a seqüência de nucleotídeoscodificando a proteína de fusão NS4A-3-4B-5B otimizada paraexpressão em células de mamíferos.

A Figura 5 ilustra a seqüência de nucleotídeoscodificando a proteína de fusão NS4A-3-5B otimizada paraexpressão em células de levedura.A Figura 6 ilustra a seqüência de nucleotídeoscodificando a proteína de fusão NS4A-3-4B-5B otimizada paraexpressão em células de levedura.

A Figura 7 ilustra a seqüência de nucleotídeoscodificando a proteína de fusão NS4A-3-5B otimizada paraexpressão em células procarióticas.

A Figura 8 ilustra a seqüência de nucleotídeoscodificando a proteína de fusão NS4A-3-4B-5B otimizada paraexpressão em células procarióticas, e a Figura 9 ilustra o desenhoesquemático das proteínas de fusão NS4A-3-5B e NS4A-3-4B-5Bilustradas nos Exemplos a seguir. A, B, C, D e E representamdomínios antigênicos que podem ser prognosticados nospolipeptídeos NS3, NS4B e NS5B (vide a W003/097677).

A Figura 10 ilustra a construção esquemáticados vetores de expressão gWiz NS4A-3-5B Hs e gWiz NS4A-3-4B-5B Hs.

A Figura 11 ilustra a expressão in vitro porWestern blot após a transfecção das células Huh-7 com osplasmídeos gWiz NS4A-3-5B (A pista 1 e C pista 3), gWizNS4A-3-4B-5B (B pista 1 e C pista 2) e gWiz (A pista 2, B pista2 e C pista 1). As células Huh-7 transfectadas foram submetidas àIise 48h após a transfecção e as proteínas de fusão foramdetectadas pela análise "Western blot" usando anticorpos anti-NS3 monoclonais de camundongo (A e B) ou anti-NS5Bmonoclonais de camundongo (C).A Figura 12 ilustra a avaliação das respostas dascélulas CD8+T específicas do NS3 pelo ensaio IFNy ELISPOTapós a injeção intramuscular de gWiz NS4A-3-5B Hs. Osesplenócitos de camundongos individuais foram cultivados napresença do peptídeo específico do NS3 DLL ou de um peptídeoirrelevante por 40 h. Os resultados são ilustrados como o valormédio do número de manchas detectadas para IO6 esplenócitosobtidos para poços em triplicata. Ml, M2, M3 e M4 representam4 camundongos imunizados com o gWiz NS4A-3-5B Hs. Mc éum camundongo controle.

A Figura 13 ilustra a expressão das proteínas defusão a partir de células infectadas pelo adenovírus.

Células A549 (l,5xl06 células) foram infectadasem um MOI de 10 com diferentes adenovírus, respectivamente, osadenovírus de expressão de fusão AdtG 17476 e AdtG 17477, bemcomo um adenovírus vazio e um adenovírus recombinanteirrelevante como controles negativos. As células foram cultivadaspor 48h com 10% de soro antes de serem submetidas à Iise comtampão Laemmli. Amostras de proteínas (1/20 do volume) foramcarregadas em um gel de eletroforese SDS PAGE. As proteínasforam detectadas pelo azul de Coomassie. Pista 1: marcadores depeso molecular; Pista 2: células A549 não infectadas; Pista 3:células A 549 infectadas com adenovírus vazio; Pista 4: células A549 infectadas com um adenovírus irrelevante; Pista 5: células A549 infectadas com AdTG17476; e Pista 6: células A 549infectadas com AdTG17477.A Figura 14 ilustra respostas IFNy Elispotinduzidas com proteínas de fusão do VHC Ad em camundongostransgênicos HLA-A2.1. O AdTG 17476, AdTG 17477 ou AdVazio foram injetados pela via intramuscular no músculo tibialanterior 1 vez a uma dose de IO9 IU/camundongo. As respostasimunológicas celulares foram investigadas 2 semanas após ainjeção por IFNy ELISPOT para cada grupo animal (incluindo 4camundongos para os grupos de teste e 2 camundongos para ogrupo controle). As respostas dos camundongos individuais (Ml a4) contra os epítopos restritos em HLA-A2 específicos ao NS3GLL (Figura 14A) e KLT (Figura 14B) e o epítopo restrito emHLA-A2 específico ao NS5B KLQ (Figura 14C) sãoapresentadas. O peptídeo irrelevante DLM é utilizado comocontrole negativo. Uma resposta ELISPOT é considerada positivese o número de manchas para IO6 esplenócitos for maior do que50 (linha de corte).

Os exemplos a seguir servem para ilustrar apresente invenção.

EXEMPLOS

Materiais e Métodos

As construções descritas abaixo são preparadasde acordo com as técnicas gerais de engenharia genética e declonagem molecular, como detalhado em Sambrook e col. (2001,Molecular Cloning ; A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor NY) ou segundo asrecomendações do fabricante quando um kit comercial é utilizado.As técnicas de amplificação PCT são conhecidas pelos versadosna técnica (vide, por exemplo, PCR Protocols - A guide toMethods and applications, 1990; Ed Innis, Gelfand, Sninsky andWhite, Academic Press Inc). A linhagem celular do hepatomaHuh-7 humano foi utilizada para avaliar a expressão correta dasproteínas de fusão a partir das construções descritas nos exemplosque seguem. As condições de cultura são convencionais natécnica. Para fins ilustrativos, as células são cultivadas a 37°C ematmosfera de C02 5% em meio DMEM completo contendo meiode Eagles modificado por Dulbecco suplementado com Soro FetalBovino a 10%, 2mM de L-glutamina e lOOIU/ml depenicilina/estreptomicinas (Sigma). As células são transfectadasusando o reagente Lipofectamine Plus (Invitrogen) e segundo asinstruções do fabricante. Anticorpos monoclonais murinosdirecionados ao NS3 e ao NS5B podem ser adquiridoscomercialmente ou preparados segundo as técnicasconvencionadas.

Construções dos plasmídeos

Oligonucleotídeos sobrepostos foram utilizadospara gerar genes sintéticos (GeneART, Regensburg, Alemanha)codificando, respectivamente, as proteínas de fusão NS4A-NS3-NS5B (3666 nucleotídeos) e NS4A-NS3-NS4B-NS5B (3747nucleotídeos). O desenho das fusões é ilustrado na Figura 9. Asseqüências de nucleotídeos foram otimizadas para expressãoelevada em homo sapiens (SEQ ID NO: 11 e 12 e Figuras 3 e 4),Pichia (SEQ ID NO: 13 e 14 e Figuras 5 e 6) e E. coli (SEQ IDNO: 15 e 16 e Figuras 7 e 8). A seqüência de aminoácidos dasfusões resultantes é ilustrada no SEQ ID NO: 9 para NS4A-NS3-NS5B e no SEQ ID NO: 10 para NS4A-NS3-NS4B-NS5B. Cadauma das seqüências de nucleotídeos sintéticos foi clonada nossítios de restrição SacI e KpnI do plasmídeo pPCR-Script(Stratagene).

Para expressão temporária em células demamíferos, genes sintéticos de codificação de fusão otimizadospara expressão em homo sapiens (SEQ ID NO: 11-12 e Figuras 3e 4) foram inseridos nos sítios de restrição SacI e NotI do vetor deexpressão gWiz (Gene Therapy Systems) sob o controletranscricional do promotor do citomegalovírus, para gerar osvetores gWiz NS4A-3-5B Hs e gWiz NS4A-3-4B-5B Hs (Figura10). Em seguida, a seqüência foi modificada para aperfeiçoar aseqüência consenso Kozak (sublinhada) usando ooligonucleotídeo apresentado no SEQ ID NO: 17 (5'-ATG TACGTC GAC CACC ATG GGC AGC GTG GTG ATT GTG GGCCGG ATC 3') e para criar códons de parada (em negrito) usandoo oligonucleotídeo apresentado no SEQ ID NO: 18 (5'-CAT GTAGC GGC CGC TCA TCA TCT AGG CCT GGC CCT GGACAG-3'). Os plasmídeos AU foram verificados porsequenciamento.

Estudos de expressão in vitro

Análise Western blot

Um dia antes da transfecção, Huh-7 (5 χ 105por poço) foram distribuídas em uma placa de 6 poços. As célulasforam transfectadas com o vetor gWiz NS4A-3-5B Hs, gWizNS4A-3-4B-5B Hs ou com o plasmídeo gWiz como controlenegativo. Passadas 48 h da transfecção, as células foramsubmetidas à Iise em 50mM de T|ris-HCl, 150mM de NaCl, 0,1%de SDS, 1% de NP40 e 0,5% de Na-deoxicholato. Amostras deUsados foram aquecidas a 95°C por 5 minutos e as proteínasforam separadas por eletroforese em SDS-8% poliacrilamida. O"immunoblotting" foi realizado usando anticorpos monoclonaismurinos específicos do NS3 (por exemplo, 8G4C3, bioMerieux)ou NS5B (por exemplo, 11F6C8, bioMerieux) como anticorpoprimário seguido de um anticorpo anti-IgG-peroxidase decamundongo produzido em cabra (Sigma) como anticorposecundário. Os sinais foram revelados usando o kit ECLcomercial (Amersham Biosciences).

Análise de imunoflúorescência

Um dia antes da transfecção, lamínulas foramcolocadas numa placa de 6 poços e tratadas com Gelatina a 0,2%por 10 min e depois 5 χ 105 células Huh-7 foram distribuídas emcada poço da placa. As monocamadas celulares foramtransfectadas com o vetor gWiz NS4A-3-5B Hs, gWiz NS4A-3-4B-5B Hs ou com o plasmídeo gWiz como controle negativo.Passadas 48 h da transfecção, as lamínulas foram lavadas duasvezes em PBS e as células foram fixadas por 10 min com 4% PFAe então lavadas e permeabilizadas com Triton X-IOO a 0,1% emPBS por IOmin. As lamínulas foram lavadas e tratadas comanticorpos monoclonais murinos específicos do NS3 (porexemplo, 8D8E1, bioMerieux) ou NS5B (por exemplo, 5B-12B7,fornecido pelo D. Moradpour) como anticorpo primário por 1 h àtemperatura ambiente. Após a lavagem, adicionou-se anti-IgG decamundongo TRITC (Dako) por 30 min. Após a lavagem, aslamínulas foram montadas em glicerol a 80%. As pistas foramobservadas com um microscópio Carl Zeiss Axioplan, sendoobtidas imagens com a câmera digital AxioCam Color.

Estudos de expressão in vivoCamundongos transgênicos HLA-A2.1produzidos como descrito por Pascolo e col. (1997, J. ofExperimental Medicine 185, 2043-2051) foram procriados. Essescamundongos têm os genes H-2Db e murine p2-microglobulinamurina neutralizados e expressam uma molécula de classe I dehistocompatibilidade de monocadeia transgênica na qual o C-terminal do p2m humano é ligado de forma covalente ao N-terminal de uma cadeia pesada quimérica (domíniostransmembrana e intracitoplásmicos HLA-A2.1 al-a2, H-2Db a3)

Protocolos de ImunizaçãoCamundongos transgênicos HLA-A2 receberamum pré-tratamento com 10 μΜ de cardiotoxina (Latoxan) cincodias antes da injeção dos plasmídeos. Os plasmídeos gWiz NS4A-3-5B, gWIZNS4A-3-4B-5B e gWiz (controle negativo) foraminjetados por via intramuscular 2 vezes em intervalos de duassemanas a uma dose de 100 μg (em ΙΟΟμΙ de IX PBS). Asrespostas das células CD8+-T restritas em HLA-A2 foraminvestigadas 2 semanas após a 2~ imunização, tal como descritoem Himoudi e col. (2002, J. Virol. 76, 12735-46).

Monitoramento da resposta imunológica porensaios ELISPOT

Os esplenócitos (2 χ IO5) foram cultivados empoços em triplicata por 40 h em placas Multiscreen (Millipore)revestidas com anticorpo monoclonal anti- IFNy de camundongo(Pharmingen; 10 μ^πιΐ) em meio de cultura aMEM completo(Invitrogen) na presença de 10 unidades/ml de IL-2 recombinante(ReproTech Inc, England) sozinha como controle negativo, ou 5^g/ml de Concavalina A como controle positivo ou com 10 μΜde peptídeo (peptídeo irrelevante DLM, peptídeo GLL localizadona proteína NS3 descrito em Martin e col., 2004, J. Med. Virol.74, 397-405 e Himoudi e col., 2002. J. Virol. 76. 12735-46). Ascélulas produtoras de IFNy foram quantificadas pelo ensaioELISPOT (enzyme linked immunospot assay) específico àcitocina, conforme descrito anteriormente (Himoudi e col., 2002,J. Virol. 76, 12735-46). O número de manchas (representando ascélulas produtoras de IFNy individuais) nos poços de controlenegativos foi subtraído do número nos poços de teste contendopeptídeos. Os resultados são apresentados como o valor médioobtido para poços em triplicata.

EXEMPLO 1: Expressão in vitro daspoliproteínas NS4A-3-5B e NS4A-3-4B-5B

As seqüências codificando as proteínas de fusãoNS4A-3-5B e NS4A-3-4B-5B foram construídas como delineadona Figura 9. As seqüências foram otimizadas para expressão emtrês hospedeiros diferentes (GeneART, Regensburg, Alemanha),Pichia pastoris (Pp) humana (Hs) e E. coli (Ec), respectivamente,como listado a seguir:

NS4A-3-5B Hs otimizado para expressão emhomo sapiens (SEQ ID NO: 11 e Figura 3)

NS4A-3-5B Pp otimizado para expressão emPichia (SEQ ID NO: 13 e Figura 5)

NS4A-3-5B Ec otimizado para expressão em E.coli (SEQ ID NO: 15 e Figura 7)

NS4A-3-4B-5B Hs otimizado para expressãoem homo sapiens (SEQ ID NO: 12 e Figura 4)

NS4A-3-4B-5B Pp otimizado para expressãoem Pichia (SEQ ID NO: 14 e Figura 6)

NS4A-3-4B-5B Ec otimizado para expressãoem E. coli (SEQ ID NO: 16 e Figura 8)

As seqüências otimizadas para expressão em

homo sapiens codificando as fusões NS4A-NS3-NS4B-NS5B e

NS4A-NS3-NS5B foram clonadas no vetor de expressão gWiz

(GeneTherapy Systems) sob o controle transcricional do promotor

do citomegalovírus (Figura 10). A expressão das proteínas de

fusão NS foi avaliada por Western blot e a imunofluorescência

em células Huh-7 transfectadas com os vetores gWiz NS4A-3-5B

Hs, gWiz NS4A-3-4B-5B Hs ou o plasmídeo gWiz como controlenegativo.Como ilustrado na Figura 11, a análise WesternBlot revelou uma banda única contendo o peso molecularesperado de aproximadamente 135 kDa para cada fusãoindividual (Figura 1IA pista 1, e Figura IlC pista 3 para a fusãoNS4A-3-5B curta e Figura 1IB pista 1, e Figura IlC pista 2 paraa fusão NS4A-3-4B-5B longa) após a detecção com anticorposespecíficos anti-NS3 (Figuras IlA e 7B) ou anti-NS5B (Figura11C). Como esperado, nenhuma proteína foi detectada nasamostras obtidas das células Huh-7 transfectadas com oplasmídeo gWiz (Figura IlA pista 2, Figura IlB pista 2 FiguraIlC pista 1). Esses resultados confirmam que a fusão curtaNS4A-NS3-NS5B e a fusão longa adicionalmente incorporandoNS4B são expressas nas células Huh-7.

A análise de imunofluorescência confirmou aexpressão das duas proteínas de fusão nas células transfectadasHuh-7. Curiosamente, ambas as proteínas de fusão apresentaramuma localização citoplásmica indicando o processamentoapropriado como resultado da deleção da maioria dos domínios deancoragem à membrana hidrófobos. As células transfectadas como plasmídeo gWiz não apresentaram nenhum sinal.

EXEMPLO 2: Avaliação in vivo daimunogenicidade do gWIZ NS4A-3-5B Hs e do NS4A-3-4B-5BHs

Para avaliar a capacidade dos plasmídeos gWizNS4A-3-5B Hs e NS4A-3-4B-5B Hs em induzir respostas dascélulas CD8+-T em camundongos transgênicos HLA-A2, umestudo de imunogenicidade foi realizado seguindo oscamundongos transgênicos HLA-A2 como descritos em Materiale Métodos. As respostas das células CD8+-T restritas por HLA-A2 foram investigadas pelo ensaio ELISPOT IFNy 2 semanasapós a 2~ imunização. Como ilustrado na Figura 12, o pgWizNS4A-3-5B foi capaz de induzir células-T produtoras de IFNyespecíficas do peptídeo GLL bem conhecido e imunodominanterestrito em HLA-A2 (proteína NS3, Martin e col., 2004, J. Med.Virol. 74, 397- 405), evidenciando a apresentação correta desteepítopo. Também é possível utilizar ensaios de desafio murinopré-clínicos a fim de avaliar as proteínas de fusão quanto àimunidade protetora. Uma vez que os camundongos não podemser infectados diretamente pelos vírus VHC, esses ensaiosempregam ou vírus recombinantes da varíola (linhagem WR) ouListéria expressando os antígenos NS do VHC. Após a injeção dovírus da varíola ou Listéria, os camundongos desenvolvem umainfecção que alcança seu ápice 2 a 6 dias após a injeção,resultando em vírus ou bactérias detectados nos ovários (modelode varíola) ou fígados (modelo de Listéria) dos camundongosinjetados. A avaliação pré-clínica envolve a vacinação doscamundongos com a vacina candidata (administração da proteínade fusão recombinante ou de partículas de adenovírusexpressando a proteína de fusão), controles (por exemplo,administração da fusão de polipeptídeos NS na configuraçãonativa) e construções negativas (por exemplo: antígenos não-VHCou adenovírus vazio). Os animais são subseqüentementedesafiados com um vírus recombinante da varíola expressandotodos os antígenos NS do VHC (NS2 a NS5) ou Listériaexpressando um dos antígenos NS incluídos no candidato àvacina. Se a vacina iniciar com êxito células-T específicas, oscamundongos desafiados desenvolvem resposta imunológica aovetor da varíola ou Listéria e ao(s) antígeno(s) NS. A atividadeprotetora da vacina candidate irá resultar em títulos de varíola ouListéria reduzidos, conforme medido nos ovários ou fígados doscamundongos vacinados, se comparado aos títulos de varíola ouListéria medidos nos ovários ou fígados dos camundongos nãovacinados.

EXEMPLO 3: Expressão da proteína defusão NS4A-3-5B e NS4A-3-4B-5B em células de mamíferos.

Os genes sintéticos de codificação da fusãootimizados para expressão em homo sapiens (SEQ ID NO: 11-12), correspondendo a NS4A-NS3-NS5B (3666 nucleotídeos) eNS4A-NS3-NS4B-NS5B (3747 nucleotídeos) foram amplificadospela PCR a partir dos plasmídeos pPCR-Script correspondentes,utilizando-se os seguintes oligonucleotídeos iniciadoresOTG18033

(GGGGGGCTAGCGCCACCATGGGCAGCGTGGTGATTG;SEQ ID NO: 19) e OTG18036(GGGGGGGTACCCTCATCATCTAGGCCTGGCCCTG; SEQID NO: 20). Ambos os fragmentos foram inseridos nos sítios derestrição NheI e KpnI de um plasmídeo "lançadeira" adenoviralcontendo um cassete de expressão induzido pelo CMVcircundado por seqüências adenovirais (nucleotídeos adenovirais1-458 e nucleotídeos 3328-5788, respectivamente) para permitir ageração do genoma vetorial por recombinação homóloga(Chartier e col., 1996, J. ViroL 70, 4805- 4810). Os vetoresadenovirais resultantes são o E3 (nucleotídeos 28592-30470) e El(nucleotídeos 459-3511) deletados, com a região El substituídapelo cassete de expressão contendo, de 5' a 3', a seqüênciareforçadora/promotor de resposta imediata CMV, um íntronquimérico da β-globina/IgG humana (como encontrado no vetorpCI disponível na Promega), a seqüência codificando qualqueruma das duas formas de poliproteína e o sinal de poliadenilaçãotardio SV40. Os vetores adenovirais resultantes foram chamadosde pTG 17476 (NS4A-3-4B-5B) e pTG17477 (NS4A-3-5B). Osadenovírus recombinantes, AdTG 17476 e AdTG 17477, foramgerados transfectando os genomas virais linearizados PacI emuma linhagem celular de complementação El convencional. Apropagação do vírus, a purificação e a titulação foram realizadasconforme descrito anteriormente (Erbs, 2000, Câncer Res. 60,3813-3822).

A expressão das proteínas de fusão foi avaliadanas células infectadas pelo adenovírus pela eletroforese SDSPAGE. As células A549 (l,5xl06 células) (ATCC CCL-185)foram infectadas a um MOI de 10 ou 100 com os adenovírus deexpressão da fusão AdTG 17476 e AdTGl 7477, assim como comum adenovírus vazio e um adenovírus recombinante irrelevantecomo controles negativos. As células foram cultivadas por 48hcom soro a 10% antes de serem submetidas à Iise com tampãoLaemmli. Amostras de proteínas (1/20 do volume) foramcarregadas em um gel de eletroforese SDS PAGE e as proteínasforam coradas por Azul de Coomassie. Como ilustrado na Figura13, uma banda única contendo o peso molecular esperado deaproximadamente 135 kDa foi claramente observada nas célulasinfectadas com AdTGl 7476 e AdTG 17477 (Pistas 5 e 6),refletindo os altos níveis de expressão nas células infectadas comos vetores adenovirais de codificação da fusão. No entanto, essabanda está ausente nas amostras coletadas das células infectadascom os controles negativos (Pistas 3 e 4), bem como nas célulasA549 não infectadas (Pista T). Os níveis de expressão foramanalisados por Western Blot nas células A549 infectadas com asconstruções virais ao MOI de 10 por 48 horas. Os precipitados decélulas foram coletados e sondados com um anticorpomonoclonal murino anti-NS3 (por exemplo, 1B6, bioMerieux) eum anticorpo policlonal de Coelho anti-NS4 (por exemplo, RB,bioMerieux). Uma banda principal com o peso molecularesperado foi revelada nas amostras coletadas de células infectadascom o AdTG 17476 e o AdTGl 7477 após a detecção com osanticorpos específicos anti-NS3 ou anti-NS4, confirmando osaltos níveis de expressão detectados após corar com Azul deCoomassie.

EXEMPLO 4: Imunogenicidade dosAdenovírus expressando as poliproteínas do VHC emcamundongos transgênicos HLA A2. Modelo animalOs camundongos transgênicos HLA-A2.1 foramproduzidos como descrito por Pascolo e col. (1997, J Ex Med).Esses camundongos têm os genes H-2Db e murine β2-microglobulina murina neutralizados e expressam uma moléculade classe I de histocompatibilidade de monocadeia transgênica naqual o C-terminal do p2m humano é ligado de forma covalente aoN-terminal de uma cadeia pesada quimérica (domíniostransmembrana e intracitoplásmicos HLA-A2.1 <xl-a2, H-2Db a3)

Protocolo de Imunização

Três grupos de camundongos foram incluídosno protocolo, respectivamente, quatro camundongos injetadoscom AdTG 17476 (Ad NS4A-3-4B-5B), quatro camundongosinjetados com AdTG 17477 (Ad NS4A-3-5B) e dois camundongoscontrole injetados com um Ad vazio (Adi514). Os adenovírusforam injetados por via intramuscular no músculo anterior tibial 1vez a uma dose de IO9 em 100 μΐ de IX PBS. As respostasimunológicas celulares foram investigadas 2 semanas após ainjeção.

Monitoramento da resposta imunológica

Ensaios ELISPOT

Os esplenócitos de camundongos de cada grupoforam coletados e os glóbulos vermelhos do sangue foramsubmetidos à lise. 2, IO5 células foram cultivadas em poços emtriplicata por 40 h em placas Multiscreen (Millipore) revestidascom anticorpo monoclonal anti-IFNy de camundongo(Pharmingen; 10 μ^πιΐ) em meio de cultura aMEM complete(GIBCO BRL) diante da presença de 10 unidades/ml de UL-2murina recombinante (PeproTech Inc, Inglaterra), sozinho comocontrole negativo, ou com 10 μΜ de peptídeo (peptídeoirrelevante DLM, peptídeos GLL e KLT localizados na proteínaNS3, peptídeo KLQ localizado na proteína NS5B (Martin e col.,2004, J Med Virol. 74, 397-405) e (Himoudi col., 2002, J Virol.,76, 12735-12746), ou 5 μg/ml de Concavalina A como controlepositivo. As células-T produtoras de IFNy foram quantificadaspelo ensaio ELISPOT (enzyme linked immunospot assay)conforme descrito anteriormente (Himoudi e col., J Virol 2002).

O número de manchas (representando as células-T produtoras deIFNy individuais) nos poços de controle negativos foi subtraídodo número nos poços de teste contendo peptídeos. Os resultadossão apresentados como o valor médio obtido para poços emtriplicata.

Resultados

As respostas das células-T restritas em HLA-A2foram investigadas pelo ensaio ELISPOT IFNy 2 semanas após aimunização contra o adenovírus. Como ilustrado na Figura 14,tanto o AdTGl7476 como o AdTG17477 foram capazes deinduzir, em todos os animais vacinados, altas freqüências decélulas-T produtoras de IFNy específicas do epítopo GLL restritoem HLA-A2 (Figura 14A; valor mediano: 1210 e 868 manchas,respectivamente) com uma eficiência significativamente superiordo ponto de vista estatístico para o AdTG 17476 (teste de Mann-Whitney: P=0,0209). Ambos os vírus também induziram células-T produtoras de IFNy específicas do epítopo KLT subdominante(Figura 14B) com freqüências inferiores (valor mediano: 187 e 90manchas). Além disso, 2:4 camundongos vacinados comAdTG 17476 e 1:4 camundongos vacinados com AdTG 17477desenvolveram respostas direcionadas ao epítopo KLQ daproteína NS5B (Figura 14C).

Isso demonstra que as proteínas de fusão deacordo com a invenção podem ser produzidas em níveis elevadosnos sistemas eucarióticos e que as proteínas resultantes sãoimunogênicas nos animais do modelo convencional.Fig.l

seqüência de aminoácidos da proteína de fusão NS4A-3-5B

10 20 30 40 50 60í I I I I I_|-> NS3

MGSVVIVGRIILSGjSGSjAPITftYSQQTRGLLGCIITSLTGRDKNQVDGEVQVLSTATQSF

peptídeo^ie ligação 'domínio antigênico B, NS3 proteaae)' domínio de interação do NS4B

70 80 90 100 110 120

i I I I I I

LATCVNGVCWTVYAGAGSKTLAGPKGPITQMYTNVDQDLVGWPAPPGARSMTPCTCGSSDH ( domínio antigênico E, NS3 proteasa)

130 14 0 150 160 170 180

í I I I I I

LYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLS PRPVSYLKGSSGGPLLCPSGHVVGIFRAAVCTRGV

190 200 210 220 230 240

í I I I I I

AKAVDFIPVESMETTMRSPVFT DNS S PPAVPQTFQVAHLHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGY

250 260 270 280 290 300

i ! I I i !

KVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGIEPNIRTGVRTITTGGPITYSAYGKFLADGGCSGGA( domínio antigênico a, NS3 helicase) τ

310 320 330 340 350 360

IlllllY DI11CDECH STDWTTILGIGTVLDQAETAGARLVVLATAT PPGSITVPHPNIEEVALSN

370 380 390 400 410 420

<11111TGEIPFYGKAIPIEAIKGGRHLIFCHSKKKCDELAAKLTGLGLNAVAYYRGLDVSVIPTS.

4 30 440 4 50 4 60 470 480

IlllllGDVVVVATDALMTGFTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFSLDPTFTIETTTVPQDAVSRSQRRG

490 500 510 520 530 540

I I I I I I

ATGRGRSGIYRFVTPGERPSGMFDSSVLCECYDAGCAWYELTPAETTVRLRAYLNTPGLPR

550 560 570 580 590 600

IlllllVCQDHLEFWESVFTGLTHIDAHFLSQTKQAGDNFPYLVAYQATVCARAQAPPPSWDQMWK

610 620 630 640 650 660

Illlll

NS3 <- I_ I -> NS5B

CLIRLKPTLHGPTPLLYRLGAVQNEITLTHPITKFVMACMSADLEVVjGSGS^SMSYTWTG

peprideo de ligação

670 680 690 700 710 720

IlllllALITPCAAEESKLPINPLSNSLLRHHSMVYSTTSRSASLRQKKVTFDRLQVLDDHYRDVL

730 740 750 760 770 780

i I I I I I

KEMKAKASTVKARLLSIEEACKLTPPHSAKSKFGYGAKDVRSLSSRAVNHIRSVWEDLLE790 800 810 820 830 840

i I I I I ι

DTETFIDTTI WrtKNEVFCVQPfiKGGRKPARLI VF PDLGVRVCEKMAL YDVVS TLPQAVMG

( domínio antigênico D, NS5B)

850 860 870 880 890 900

IllllPS YGFQYSPGQRVEFLVNTWKSKKC PMGFS YNTRCFDSTVTENDIRTEESIYQCCDLAPE

D

910 920 930 940 950 960

I I I I I

ARQAIKSLTERLYIGGPLTNSKGQNCG YRRCRASGVLTTSCGNTLTC YLKAT AACRAAKL

970 980 990 1000 1010 1020

I I I I I !

QDCTMLVNGNDL VVICESAGTQEDAASLRVFTEAMTRYSAP PGDPPQPE YDLELITSCSSD

1030 1040 1050 1060 1070 1080

I I I l I I

NVSVAHDASGKRVYYLTRDPTTPLARAAWETVRHTPVNSWLGNIIMYAPTLWARMILMTH

1090 1100 1110 1120 1130 1140

IIIIIIFFSILLAQEQLEKALDCQIYGACYSIEPLDLPQIIERLHGLSAFSLHSYSPGEINRVASC

1150 1160 1170 1180 1190 1200

i I Illl

LRKLGVP PLRVWRHRARSVRAKLLSQGGRAATCGKYLFNWAVRTKLKLT PIPAASQLDLS

1210 1220I I

GWFVAGYNGGDIYHSLSRARPRFig.2

seqüência de aminoácidos da proteína de fusão NS4A-3-4B-5B

10 20 30 40 50 60i I Illl NS3

MGSVVIVGRT ILSGÍSGS]APITAY3QQTRGLLGCI ITSLTGRDKNQVDGEVQVLSTATQSF

peptídeo de ligação ( domínio antigênico. B, NS3 protease)

domínio de interação do NS4B

70 80 90 100 110 120

IlllllLATCVNGVCWTVYAGAGSKTLAGPKGPITQMYTNVDQDLVGWPAPPGARSMTPCTCGSSD

H ( domínio antigênico. E, NS3 Protease)

130 140 150 160 170 180

Illlll

LYLVTRHADVIPVRRRGDS RGSLLS PRPVS YLKGSSGGPLLCPSGHVVGIFRAAVCTRGV

190 200 210 220 230 240

IlllllAKAVDFIP VESMETTMRS P VFT DNS S P PAV PQT FQVAH LHA PTGSGKS TKV PAA YAAQG Y

250 260 270 280 290 300

!IllllKVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGIEPNIRTGVRTITTGGPITYSAYGKFLADGGCSGGA(,domínio antigênico a, NS3 helicase) τ

310 320 330 340 350 360

IlllllYDIIICDECHS TDWTTILGIGTVLDQAETAGARLVVLATAT PPGSITVPH PNIEEVALSN

370 380 390 400 410 420

IlllllTGEIPFYGKAIPIEAIKGGRHLIFCHSKKKCDELAAKLTGLGLNAVAYYRGLDVSVIPTS

430 440 450 460 470 480

IlllllGDVVWATDALMTGFTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFSLDPTFTIETTTVPQDAVSRSQRRG

490 500 510 520 530 540

i ι I I I I

ATGRGRSGIYRFVT PGERPSGMFDSSVLCECYDAGCAWYELTPAETTVRLRAYLNTPGLPr

550 560 570 580 590 600

I I Illl

VCQDHLEFWESVFTGLTHIDAHFLSQTKQAGDNFPYLVAYQATVCARAQAPPPSWDQMWK

610 620 630 640 650 660

Illlll

NS3 <-!-> NS4B epítopoCLIRLKPTLHGPTPLLYRLGAVQNEITLTH PI TKFVMACMSADLEVVlS LMA FTAS ITSPL|

* domínio

670 680 690 700 710 720

Illlll

. NS4B epitope <-|-> NS5B

|TTQNTLLFNILGGWVAAQL|SMSYTWTGALITPCAAEESKLPINPLSNSLLRHHSMVYSTTantigênico NS4B)760

730 740 750 760 770 780

I I I I I I

S RS AS LRQ KKVT FDRLQVLDDHYRDVLKEMKAKAST VKARLLSIEEACKLT P PHS AKSKF

790 800 810 820 830 840

!IllllGYGAKDVRSLSSRAVNHIRSVWEDLLEDTETPIDTTIMAKNEVFCVQPEKGGRKPARLIV

850

860

900

870 880 890

! I I I l I

FPDLGVRVCEKMALYDVVSTLPQA VMGPS YGFQYS PGQRVEFLVNTWKSKKCPMGFS YNT( domínio aaíigênico D, NS5B) D

960

910

920I

930

940

950

RCFDSTVTENDIRTEESIYQCCDLAPEARQAIKSLTERLYIGGPLTNSKGQNCGYRRCRA

970 980 990 1000 1010 1020

Il Illl

SGVLTTSCGNTLTCYLKATAACRAAKLQDCTMLVNGNDLVVICESAGTQEDAASLRVFTE

D

1030 1040 1050 1060 1070 1080

Il Illl

AMTRYS AP PGDPPQPE YDLELITSCS SNVSVAHDASGKRVY YLTRDPTTPLARAAWETVR

1090

1100 1110 1120 1130 1140

Il Illl

HTPVNSWLGNIIMYAPTLWARMILMTH FFSILLAQEQLEKALDCQIYGACYSIEPLDLPQ

1150 1160 1170 1180 1190 1200

i I I I I I

IIERLHGLSAFSLHSYSPGEINRVASCLRKLGVPPLRVWRHRARSVRAKLLSQGGRAATC

1210 1220 1230 1240

IlllGKYLFNWAVRTKLKLTPIPAASQLDLSGWFVAGYNGGDIYHSLSRARPRFig.3

Proteína de fusão_(Hs) 4A-3-5B otimizada para Homo sapiens

CGAATTGGGTACCGCCACCATGGGCAGCGTGGTGATTGTGGGCCGGATCATCCTGAGCGG

1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+

GCTTAACCCATGGCGGTGGTACCCGTCGCACCACTAACACCCGGCCTAGTAGGACTCGCC

MGSVVIVGRI_ILSG

CÀGCGGCAGCGCCCCCATCACCGCCTACAGCCAGCAGACCAGAGGCCTGCTGGGCTGTAT

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GTCGGACAGGTCCCGGTCCGGATCTACTACTCCTCGAGGTCGAAASLSRARPR*Fig.4

Proteína de fusão 4A-3-4B-5B (Hs) otimizada para Homo sapiens

KpnI NcoI

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3781---------+------

AGGTCGAAAACAAGGGFig.5

Proteína de fusão 4A-3-5BOtimizada para expressão em: Pichia pastoris

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CCAAGATAATAGACTAGTGGATCC

3661-----------+----------+-------

GGTT.CTA'~TATCTGATCACC?AGGPR**Fig.6

Proteína de fusão 4A-3-4B-5BOtimizada para expressão em Pichia pastoris

ATGGGGTCCGTTGTTATCGTTGGTAGAATCATCTTGTCTGGTTCTGGTTCCGCTCCAATT

1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+

TACCCCAGGCAACAATAGCAACCATCTTAGTAGAACAGACCAAGACCAAGGCGAGGTTAAMGSVVIVGRX ILSGSGSAPI

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481---------+---------+---------+---------+---------+---------+

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CGAAACCTGACAGTCTAAATGCCACGAACAATGAGGTAACTCGGTAACCTGAACGGTGTCALDCQIYGACY SIEPLDLPQ

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ATCAACAGAGTTGCTTCCTGTTTGAGAAAGTTGGGTGTTCCACCATTGAGAGTTTGGAGA

TAGTTGTCTCAACGAAGGACAAACTCTTTCAACCCACAAGGTGGTAACTCTCAAACCTCTINRVASCLRKLGVPPLRVWR

CACAGAGCTAGATCCGTTAGAGCTAAGTTGTTGTCCCAAGGTGGAAGAGCTGCTACTTGT

GTGTCTCGATCTAGGCAATCTCGATTCAACAACAGGGTTCCACCTTCTCGACGATGAACAHRARSVRAKLLSQGGRAATC

GGTAAGTACTTGTTCAACTGGGCTGTTAGAACAAAGTTGAAGTTGACTCCTATTCCTGCT

3601---------+--------- +---------+---------+---------+---------+

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GCTTCCCAATTGGATTTGTCCGGTTGGTTTGTTGCTGGTTACAACGGTGGTGACATCTAC

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3721---------+---------+---------+---------+-----

GTGAGAAACAGGTCTCGATCTGGTTCTATTATCTGATCACCTAGGProteína de fusão 4A-3-5BOtimizada para Escherichia coli

AGGGCGAATTGGGTACCATGGGGAGCGTTGTTATTGTTGGCCGCATTATTCTGAGCGGTA

1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+

TCCCGCTTAACCCATGGTACCCCTCGCAACAATAACAACCGGCGTAATAAGACTCGCCATMG SVVXVGRI_ILSGS

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GGCGGTGGGTCTCGAAAGACCGCTGGACACACTTACCACACACGACCTGGCAAATACGGCATQS_FLAT_CVNGVCWTVYAG

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241---------+---------+---------+---------+---------+---------+

CACGGCCATCGTTTTGGGACCGCCCAGGCTTTCCAGGCTAATGGGTCTACATGTGGTTGCAGSKT_L A G P K G P_I_TQMY TNV

TGGATCAGGATCTGGTTGGTTGGCCGGCGCCGCCGGGTGCCCGTAGCATGACCCCGTGTA

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ACCTAGTCCTAGACCAACCAACCGGCCGCGGCGGCCCACGGGCATCGTACTGGGGCACATDQDLVGWPAP_P G A R S M T_PCT

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33/45Fig.8

Proteína de fusão 4A-3-4B-5Botimizada para Escherichia coli

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AGAAAGCATTTACCAGTGCTGTGATCTGGCGCCGGAAGCÇÇGTCAGGCGATTAAAAGCCT

TCTTTCGTAAATGGTCACGACACTAGACCGCGGCCTTCGGGCAGTCCGCTAATTTTCGGA_E_S_I YQ-CC D L A P_E -A R Q A I K 8 L

GACCGAACGCCTGTATATTGGCGGTCCGCTGACCAATAGCAAAGGCCAGAACTGTGGTTA

2821-.Γ-------+--------------.___+---------+ __--------+-------:—+

CTGGCTTGCGGACATATAACCGCCAGGCGACTGGTTATCGTTTCCGGTCTTGACACCAATT E R L Y I G G P Xi T_ N - S K G Q N -C G Y

TCGTCGTTGTCGTGCCAGCGGTGTTCTGACCACCAGCTGTGGTAATACCCTGACCTGCTA

2881--------- +----—+---------+---------1---------+

AGCAGCAACAGCACGGTCGCCACAAGACTGGTGGTCGACACCATTATGGGACTGGACGATR R C R A S G V L T T S C Q N T L T C Y

CCTGAAAGCGACCGCCGCCTGTCGTGCCGCCAAACTGCAGGATTGTACCATGCTGGTTAA2941---------+---------+---------+---------+---------+---------+

GGACTTTCGCTGGCGGCGGACAGCACGGCGGTTTGACGTCCTAACATGGTACGACCAATTIiKATAACRAAKLQDCTMLVN

CGGCAATGATCTGGTGGTGATTTGTGAAAGCGCCGGCACCCAGGAAGATGCCGCCAGCCT

3001---------+---------+---------+----.-----+---------+---------+

GCCGTTACTAGACCACCACTAAACACTTTC.GCGGCCGTGGGTCCTTCTACGGCGGTCGGAGNDLVVI CE_S AGTQEDAASL

GCGCGTTTTTACCGAAGCGATGACCCGTTATAGCGCCCCGCCGGGTGATCCGCCGCAGCC

3061---------+---------+---------+---------+---------+---------+

CGCGCAAAAATGGCTTCGCTACTGGGCAATATCGCGGGGCGGCCCACTAGGCGGCGTCGGRVFTEAMTRYSAP_PGD_P_PQP

GGAATATGATCTGGAACTGATCACCAGCTGTAGCAGCAATGTTGGTGTTGCCCATGATGC

3121---------+-----_----+---------+---------+---------+---------+

CCTTATACTAGACCTTGACTAGTGGTCGACATCGTCGTTACAACCACAACGGGTACTACGE Y D L E L I_T_SCS_SNVGVAHDA

CAGCGGTAAACGTGTGTATTACCTGACCCGTGATCCGACCACCCCGCTGGCCCGTGCCGC

3181---------+---------+---------+---------+---------+---------+

GTCGCCATTTGCACACATAATGGACTGGGCACTAGGCTGGTGGGGCGACCGGGCACGGCGSGKRVYYL_TRDP_TTPLARAA

CTGGGAAACCGTTCGTCATACCCCGGTTAATAGCTGGCTGGGCAACATTATTATGTATGC

3241---------+--------·- +---------+---------+---------+---------+

GACCCTTTGGCAAGCAGTATGGGGCCAATTATCGACCGACCCGTTGTAATAATACATACG

V 5 TVRH_T_P_V_N, S W L G N I_IMYA

CCCGACCCTGTGGGCCCGTATGATTCTGATGACCCACTTCTTTAGCATTCTGCTGGCCCA

3301---------+---------+---------+---------+---------+---------+

GÇGCTGGGACACCCGGGCATACTAAGACTACTGGGTGAAGAAATCGTAAGACGACCGGGTP TLWARMI LMTHF_F_S_ILLAQ

GGAACAGCTGGAAAAAGCGCTGGATTGCCAGATTTATGGCGCCTGCTATAGCATTGAACC

3361---------+---------+-------+---------+---------+---------+

CCTTGTCGACCTTTTTCGCGACCTAACGGTCTAAATACCGCGGACGATATCGTAACTTGGEQLEKALDCQI Y GACYS_IEP

GCTGGATCTGCCGCAGATTATTGAACGTCTGCATGGCCTGAGCGCCTTTAGCCTGCATAG

3421---------+---------+---------+---------+---------+---------+

CGACCTAGACGGCGTCTAATAACTTGCAGACGTACCGGACTCGCGGAAATCGGACGTATCLDLPQ I_I_ERLHGLSAF_SLHS

CTACTCTCCGGGTGAAATTAATCGTGTGGCGAGCTGTCTGCGTAAACTGGGTGTTCCGCC

3481--------- +---------+---------+---------+---------+---------+

GATGAGAGGCCCACTTTAATTAGCACACCGCTCGACAGACGCATTTGACCCACAAGGCGG

Y S_PGE INRVASCLRKLGVP_P_

GCTGCGTGTCTGGCGTCATCGTGCCCGTAGCGTTCGTGCCAAACTGCTGTCTCAGGGTGG

3541---------+---------+---------'+---------+---------+---------+

CG.ACGCACAGACCGCAGTAGCACGGGCATCGCAAGCACGGTTTGACGACAGAGTCCCACC■Ι-, RVWRHRARSVRAKLL_S Q G G

CCGTGCCGCCACCTGTGGTAAATACCTGTTTAACTGGGCGGTTCGTACCAAACTGAAACT

3601---------+----------+---------+---------+---------+---------+

GGCACGGCGG.TGGACACCATTTATGGACAAATTGACCCGCCAAGCATGGTTTGACTTTGARAATCGKYLFNW A VRTKLKL

GACCCCGATTCCGGCGGCGAGCCAGCTGGATCTGAGCGGTTGGTTTGTTGCCGGTTATAA

3661---------+---------+---------+---------+---------+---------+

CTGGGGCTAAGGCCGCCGCTCGGTCGACCTAGACTCGCCAACCAAACAACGGCCAATATTTPIPAASQLDLSGWFVAGYNCGGCGGCGATATCTATCATAGCCTGAGCCGTGCCCGTCCGCGTTAATAAACTAGTGGATC

3721---------+---------+---------+---------+---------+---------+

GCCGCCGCTATAGATAGTATCGGACTCGGCACGGGCAGGCGCAATTATTTGATCACCTAGGGDIYHSLSRARPR* *

CGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCC

3781---------+---------+ --

GCCTCGAGGTCGAAAACAAGGGFig.9

NS3 NS4A NS4B NS5B

ΒΕΑ

TTTTc

construção NS4A-NS3-NS4B-NS5B I B E A C D construção NS4A-NS3-NS5B ■ B E A DFig. 10

<figure>figure see original document page 145</figure><figure>figure see original document page 146</figure>Fig.12

<figure>figure see original document page 147</figure><figure>figure see original document page 148</figure>

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)Figure 14

<figure>figure see original document page 149</figure>

Fig. 14 A

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Fig. 14 B

<figure>figure see original document page 149</figure>

Fig. 14 C

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Claims

1. - Proteína de fusão isolada compreendendopelo menos três polipeptídeos NS, dentre qual polipeptídeoNS4A, que se originam de um vírus da hepatite C (VHC)5caracterizada pelo fato de que os referidos polipeptídeos NS sãoconfigurados na referida proteína de fusão em uma ordemdiferente da ordem na qual eles aparecem na configuração nativa,onde o polipeptídeo NS4A é localizado no N-terminal.

2. - Proteína de fusão isolada, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a fusão entre cadaum dos polipeptídeos NS é direta ou através de um peptídeo deligação.

3. - Proteína de fusão isolada, de acordo cóm areivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que todos ospolipeptídeos NS se originam da mesma linhagem ou isolado doVHC.

4. - Proteína de fusão isolada, de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que pelo menosdois dos polipeptídeos NS se originam de linhagens ou isoladosdiferentes do VHC.

5. - Proteína de fusão isolada, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada porcompreender um polipeptídeo NS4A, um polipeptídeo NS3 e umpolipeptídeo NS5B, com NS5B no C-terminal da referida proteínade fusão.

6. - Proteína de fusão isolada, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada porcompreender um polipeptídeo NS4A, um polipeptídeo NS3, umpolipeptídeo NS4B e um polipeptídeo NS5B com NS5B no C-terminal da referida proteína de fusão.

7. - Proteína de fusão isolada, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato deque o polipeptídeo NS3 é modificado se comparado a umpolipeptídeo NS3 nativo, de modo a apresentar uma atividade daprotease significativamente reduzida.

8. - Proteína de fusão isolada, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato deque o polipeptídeo NS3 é modificado se comparado a umpolipeptídeo NS3 nativo, de modo a apresentar uma atividade dahelicase significativamente reduzida.

9. - Proteína de fusão isolada, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato deque o polipeptídeo NS5B é modificado se comparado a umpolipeptídeo NS5B nativo, de modo a apresentar uma atividade daRNA polimerase dependende do RNA significativamentereduzida.

10. - Proteína de fusão isolada de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato deque a referida proteína de fusão não compreende um ou mais dossítios de clivagem reconhecidos por NS3 normalmente presentesem um precursor de poliproteína do VHC nas junçõesNS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A e NS5A/NS5B.

11.- Proteína de fusão isolada, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato deque os polipeptídeos NS4A, NS4B e/ou NS5B são modificados demodo a deletar um ou mais domínios hidrófobos normalmenteenvolvidos na ancoragem membranar dos polipeptídeos NS4A,NS4B e/ou NS5B nativos.

12. - Proteína de fusão isolada, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato deque o polipeptídeo NS3 se origina da proteína NS3 apresentadano SEQ ID NO: 1 que é modificada pelo menos de tal maneiraque:o ela retenha a parte que se estende da posição-12 até a posição 56, da posição 70 até a posição 155 e da posição-218 até aposição 248;o ela compreenda a substituição do resíduo Hisna posição 57 por um resíduo de aminoácido diferente de His, talcomo um resíduo Ala;o ela compreenda a substituição do resíduo Thrna posição 269 por um resíduo de aminoácido diferente de Thr,tal como um resíduo Ala; eo ela compreenda a substituição do resíduo Argna posição 464 por um resíduo de aminoácido diferente de Arg5tal como um resíduo Ala; eo ela não compreenda o resíduo Thr na posição-631.

13. - Proteína de fusão isolada, de acordo com areivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeoNS3 compreende a seqüência de aminoácidos apresentada noSEQ ID NO: 5.

14. - Proteína de fusão isolada, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato deque o polipeptídeo NS4A se origina da proteína NS4Aapresentada no SEQ ID NO: 2 que é modificada pelo menos de talmaneira que:o ela contenha a parte do SEQ ID NO: 2 daposição 21 até aposição 33;o ela não contenha a parte do SEQ ID NO: 2 daposição 1 até a posição 20.

15. - Proteína de fusão isolada, de acordo com areivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeoNS4A consiste essencialmente da seqüência de aminoácidosapresentada no SEQ ID NO: 6 precedida por um resíduo Metiniciador.

16. - Proteína de fusão isolada, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato deque o polipeptídeo NS4B se origina da proteína NS4Bapresentada no SEQID NO: 3 que é modificada pelo menos de talmaneira que: o ela compreenda a parte que se estende do resíduoSer na posição 78 até o resíduo Leu na posição 109; o ela nãocompreenda o resíduo Cys na posição 261.

17. - Proteína de fusão isolada, de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeoNS4B opcional consiste essencialmente da seqüência deaminoácidos apresentada no SEQ ID NO: 7.

18. - Proteína de fusão isolada, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato deque o polipeptídeo NS5B se origina da proteína NS5B nativaapresentada no SEQ ID NO: 4 que é modificada pelo menos de talmaneira que:o ela compreenda a parte que se estende doresíduo Arg na posição 155 até o resíduo Leu na posição 182;o ela compreenda a substituição do resíduo Aspna posição 220 por um resíduo de aminoácido diferente de umAsp, tal como um resíduo Asn;o ela compreenda a substituição do resíduo Aspna posição 318 por um resíduo de aminoácido diferente de umAsp, tal como um resíduo Asn; eo ela não compreende a parte que se estende doresíduo Trp na posição 571 até o resíduo Arg na posição 591.

19. - Proteína de fusão isolada, de acordo com areivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeoNS5B compreende a seqüência de aminoácidos conformeapresentada no SEQ ID NO: 8.

20. - Proteína de fusão isolada, de acordo comqualquer uma das reivindicações 12 a 19, caracterizada pelo fatode que a referida proteína de fusão compreende uma seqüência deaminoácidos que é homóloga ou idêntica à seqüência deaminoácidos apresentada no SEQ ID NO: 9 ou 10.

21. - Molécula de ácido nucléico isolada,caracterizada por codificar a proteína de fusão de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 20.

22. - Molécula de ácido nucléico isolada, deacordo com a reivindicação 21, caracterizada por compreenderuma seqüência de nucleotídeos otimizada para expressão em umacélula hospedeira de mamífero.

23. - Molécula de ácido nucléico isolada, deacordo com a reivindicação 22, caracterizada por compreenderuma seqüência de nucleotídeos que é homóloga ou idêntica àsseqüências de nucleotídeos apresentadas no SEQ ID NO: 11 ouSEQ ID NO: 12.

24. - Molécula de ácido nucléico isolada, deacordo com a reivindicação 21, caracterizada por compreenderuma seqüência de nucleotídeos otimizada para expressão em umacélula hospedeira de levedura.

25. - Molécula de ácido nucléico isolada, deacordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que acélula hospedeira de levedura é selecionada dentre o grupo queconsiste de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe ePichia pastoris.

26. - Molécula de ácido nucléico isolada, deacordo com a reivindicação 25, caracterizada por compreenderuma seqüência de nucleotídeos que é homóloga ou idêntica àsseqüências de nucleotídeos apresentadas no SEQ ID NO: 13 ouSEQ ID NO: 14.

27. - Molécula de ácido nucléico isolada, deacordo com a reivindicação 21, caracterizada por compreenderuma seqüência de nucleotídeos otimizada para expressão em umacélula hospedeira procariótica.

28. - Molécula de ácido nucléico isolada, deacordo com a reivindicação 27, caracterizada por compreenderuma seqüência de nucleotídeos que é homóloga ou idêntica às seqüênciasde nucleotídeos apresentadas no SEQID NO: 15 ou SEQID NO: 16.

29. - Vetor, caracterizado por compreender umaou mais cópias da molécula de ácido nucléico de acordo comqualquer uma das reivindicações 21 a 28.

30. - Partícula viral infecciosa, caracterizadapor compreender a molécula de ácido nucléico de acordo comqualquer uma das reivindicações 5 a 28 ou o vetor de acordo coma reivindicação 29.

31. - Célula hospedeira, caracterizada porcompreender a molécula de ácido nucléico de acordo comqualquer uma das reivindicações 21 a 28 ou o vetor de acordocom a reivindicação 29 ou a partícula viral infecciosa de acordocom a reivindicação 30.

32. - Método para produzir de formarecombinante a proteína de fusão de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 20, caracterizado por compreender:(a) introduzir o vetor de acordo com areivindicação 29 ou a partícula viral infecciosa de acordo com areivindicação 30 em uma célula hospedeira para produzir umacélula hospedeira transfectada ou infectada de acordo com areivindicação 31,(b) cultivar in vitro a referida célula hospedeiratransfectada ou infectada sob condições adequadas para ocrescimento da célula hospedeira,(c) recuperar a proteína de fusão da culturacelular, e(d) como opção, purificar a proteína de fusãorecombinante.

33. - Composição, caracterizada porcompreender a proteína de fusão de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 20, a molécula de ácido nucléico de acordocom qualquer uma das reivindicações 21 a 28, o vetor de acordocom a reivindicação 29, a partícula viral infecciosa de acordo coma reivindicação 30, a célula hospedeira de acordo com areivindicação 31 ou qualquer combinação destes.

34. - Uso da proteína de fusão de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 20, da molécula de ácidonucléico de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 28,do vetor de acordo com a reivindicação 29, da partícula viralinfecciosa de acordo com a reivindicação 30, da célula hospedeirade acordo com a reivindicação 31 ou da composição de acordocom a reivindicação 33, caracterizado por ser para a preparaçãode um fármaco destinado ao tratamento ou prevenção deinfecções pelo VHC, doenças associadas ao VHC e condiçõespatológicas.

35. - Uso, de acordo com a reivindicação 34,caracterizado pelo fato de que o referido uso é realizado de acordocom uma modalidade terapêutica de indução-reforço, em que acomposição de acordo com a reivindicação 33 é utilizada tantopara ou reforçar, ou para induzir e reforçar uma respostaimunológica anti-VHC.

36. - Uso, de acordo com a reivindicação 34 ou-35, caracterizado pelo fato de que o referido uso é realizado emcombinação com quimioterapia com um ou mais fármacos para o VHC.