BRPI0708446A2 - tratamento de cáncer combinando agente de linfodepleção com ctls e citocinas - Google Patents

Abstract

TRATAMENTO DE CáNCER COMBINANDO AGENTE DE LINFODEPLEçãO COM CTLs E CITOCINAS. A presente invenção refere-se a um tratamento de câncer combinando terapia celular com quimioterapia, células T CD8~ +~ autólogas que são obtidas de um paciente, ativadas ex vivo através de contato delas com células apresentando antígeno xenogênicas carregadas com antígeno de peptideo selecionado, deste modo gerando linfócitos T citotóxicos ativados específicos de antígeno. Tais CTLs ativados são administrados ao paciente em conjunto com um regime de linfodepleção e manutenção de CTL compreendendo um agente náo-mieoablativo, mas de linfodepleção, tal como cladribina ou denileucina diftitox, e citocinas estimuladoras interleucina-2 e interferon-<198>-2b.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TRATAMEN-TO DE CÂNCER COMBINANDO AGENTE DE LINFODEPLEÇÃO COMCTLs E CITOCINAS".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

O presente pedido reivindica prioridade do Pedido de PatenteProvisório dos Estados Unidos N9 60/778.516 depositado em 12 de março de2006.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a métodos para tratamento decâncer em pacientes envolvendo a administração de linfócitos T citotóxicosativados, citocinas tais como IL-2 e IFN-alfa-2b e cladribina ou denileucinadiftitox como um agente de linfodepleção.ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Para facilitar uma compreensão da invenção, esta seção podediscutir os antecedentes históricos e técnicos que levam ao desenvolvimentoda invenção, incluindo observações, conclusões e pontos de vista que po-dem ser únicos a um inventor. Deste modo, as declarações de antecedentesaqui não devem ser consideradas como uma admissão com relação ao teorda técnica anterior.

Várias terapias foram desenvolvidas para tratar uma variedadede cânceres. Muitos desses esforços centraram em torno de regimes quimio-terapêuticos. Em um regime de quimioterapia de combinação particularchamado tratamento para melanoma metastático, taxas de resposta de 35-50% foram relatadas com o "Regime Dartmouth" (uma combinação de DTIC,cisplatina, BCNU e tamoxifeno), mas a duração de sobrevivência permane-ceu em 6 a 10 meses. Altas taxas de remissão também foram relatadas paraquimioterapia de intensidade de alta dose agressiva1 e repleção de hemato-poiese com transplantes de medula óssea autólogos. Não obstante, a dura-ção média de sobrevivência foi curta, aproximadamente 4 meses.2

Aperfeiçoamentos significantes em sobrevivência da ordem devários anos foram notados em uma pequena porcentagem de pacientes commelanoma sofrendo certas imunoterapias. Isto inclui imunoterapia específicaativa com vacinas para câncer, bem como o uso de reforçadores não-específicos do sistema imune, tal como interleucina-2 (IL-2) e interferon-alfa(IFN-a).3"5

A identificação de antígenos de tumor definidos por célula T emmelanoma levou a testes clínicos que se direcionam a células de câncer a-través da tentativa de aumentar a resposta imune celular específica de antí-geno. Esta abordagem tem sido seguida em várias estratégias de vacinaonde os antígenos são aplicados em um contexto imunogênico em uma ten-tativa de induzir respostas de célula T potentes in vivo. Embora algumasrespostas clínicas tenham sido observadas nos testes de vacina, a magnitu-de da resposta de célula T induzida tem sido geralmente baixa, ou indetec-tável e pobremente correlacionada com respostas clínicas. Imunização depacientes com melanoma com antígenos de câncer pode aumentar o núme-ro de precursores de CTL em circulação; no entanto, ela não se correlacio-nou com regressão de tumor clínica, sugerindo um defeito em função ou ati-vação in vivo.

Estudos em modelos de tumor de camundongo demonstraramque imunoterapia adotiva, que envolve imunização in vitro de células T es-pecíficas para um ou mais antígenos de tumor, pode ser eficaz com toxidezmínima. Um obstáculo na aplicação desta estratégia para o tratamento detumores humanos foi a identificação de antígenos imunogênicos que tornamas células de tumor suscetíveis à destruição mediada por CTL. O isolamentode células T reativas a tumor de pacientes com melanoma levou à identifica-ção de alguns dos antígenos de tumor (epítopos) aos quais CTLs são dire-cionados. Esses incluem tirocinase, MART-1/Melan A, gp100 e MAGE. Des-ses, tirocinase e MART-1 são quase que universalmente expressos em me-lanoma e então representam uma escolha-alvo desejada para imunoterapiaadotiva6"13.

Terapia de célula T adotiva envolve a remoção de células T doambiente hospedeiro onde mecanismos tolerogênicos são ativos in vivo empacientes com câncer e contribuem para as respostas ineficazes demons-tradas nesta população de paciente. Células T CD8+ podem ser estimuladasex vivo para gerar CTLs específicos de antígeno (vide, por exemplo, PatenteU.S. N9 6.225.042). Abordagens de imunoterapia adotiva iniciais usavamlinfócitos ativados como um tratamento para vários cânceres.14 Inicialmente,células assassinas ativadas com Iinfocina (LAK), e mais tarde linfócitos infil-trantes em tumor (TIL), ativados ex vivo com IL-2, foram usados, mas a de-monstração da eficácia foi equivocada. Esses testes clínicos controlados,iniciais, falharam em mostrar uma vantagem para o uso das células ativadasex vivo sobre a administração direta de IL-2 a pacientes com melanoma. Es-tudos mais recentes por Yee e outros (Fred Hutchinson Câncer ResearchCenter)15 e Dudley e outros (NCI)16 demonstraram o potencial para certasabordagens terapêuticas de célula T adotiva. Esses estudos envolveram ouso ou de clones de célula T específicos para MART-1 ou gp100 e IL-2 debaixa dose, ou TILS expandidos ex vivo com células nutridoras alogênicas eIL-2 de alta dose. Esses estudos confirmaram que imunoterapia adotiva éuma promessa de um tratamento de câncer, embora seu desenvolvimentointegral tenha sido impedido pela falta de métodos reproduzíveis para gera-ção ex vivo de números terapêuticos de CTLs de CD8+ específicos de antígeno.17

Células T CD8+ citotolíticas são uma linha principal de defesacontra infecções virais. Linfócitos CD8+ especificamente reconhecem e Iisamcélulas hospedeiras que são infectadas com um vírus. Embora fosse desejá-vel controlar a atividade citotóxica de CTLs, alguns procedimentos in vitro/exvivo foram disponibilizados para especificamente ativar CTLs. A identificaçãode antígenos associados a melanoma-chave e um método para ativação invitro específica de CTLs permitem uma avaliação eficiente de imunoterapiaadotiva para melanoma metastático.15"18

Onde for possível usar células apresentando antígeno de ocor-rência natural (APCs) para ativação de CD8+ in vitro (por exemplo, célulasdendríticas, macrófagos, células de tumor autólogas), a eficiência de ativa-ção é baixa uma vez que as moléculas de Classe I de MHC de APCs nativascontêm muitos outros epítopos de peptídeo, então permitindo apresentaçãomínima de epítopos de peptídeo associados a tumor. A maioria desses pep-tídeos apresentados representa proteínas endógenas inócuas, normais.Uma abordagem mais direta para este problema seria ativar células T CD8+especificamente para aqueles epítopos relevantes para combater a doença,neste caso particular, antígenos associados a melanoma.

Recentemente, uma APC artificial foi desenvolvida utilizandouma linhagem de célula embriônica de Drosophila melanogaster (mosca dafruta), que expressa as moléculas de Classe I de complexo de histocompati-bilidade principal (MHC).18,19 Vide também Patentes U.S. N9S 6.225.042 e6.355.479. Uma vez que o inseto Drosophila não tem um sistema imune a-Vangadoi os transportadores de peptídeo TAP-1,2, que estão envolvidos nocarregamento de epítopos de peptídeo nas moléculas de Classe I humana,estão ausentes. Como resultado, as moléculas de Classe I transfectadasaparecem na superfície de célula de Drosophila como recipientes vazios. Aoincubar essas células de Drosophila transfectadas com peptídeos sintéticosexógenos que se ligam a moléculas de Classe I específicas (isto é, epítoposde peptídeo de célula T de antígeno de tumor), todas as moléculas de Clas-se I disponíveis podem ser ocupadas com epítopo(s) de peptídeo específi-co(s), restrito(s) a MHC. A expressão de alta densidade das moléculas deClasse I apresentando epítopos únicos ou múltiplos, e a adição de moléculasco-estimuladoras-chave B7-1 (CD80), CD70, LFA-3 (CD58) e ICAM-1(CD54) nessas APCs de Drosophila permitem a geração in vitro de células TCD8+ citotóxicas autólogas, potentes, que são específicas para os peptídeosantigênicos.20

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Vários aspectos gerais e modalidades preferidas da invençãosão refletidos nas reivindicações apensas a este relatório descritivo, que sãoincorporadas aqui a título de referência. Outras modalidades, característicase vantagens preferidas dos vários aspectos da invenção se tornarão aparen-tes a partir da descrição detalhada tomada em conjunto com as figuras dosdesenhos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 ilustra atividade citotóxica de CTLs gerados ex vivodirecionados contra células-alvo carregadas com peptídeo. Células T CD8+isoladas de um paciente com melanoma foram imunizadas in vitro comAPCs de Drosophila carregadas com cinco epítopos de peptídeo associadosa melanoma diferentes. As células T ativadas CD8+ foram culturadas in vitrousando IL-2 e IL-7 para seletivamente expandir os CTLs específicos de me-lanoma. Atividade foi avaliada como Iise específica de células-alvo T2 mar-cadas com 51Cr individualmente carregadas com cada peptídeo (Tyr-1689,Tyr-2792, gp100-1817, gp100-2853 ou MART-18ig versus células T2 carregadascom um peptídeo controle HLA-A2).

A Figura 2 provê uma ilustração esquemática de duas modalida-des preferidas de regimes de tratamento de acordo com a invenção juntocom um regime controle.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO E SUAS MODALIDADES PRE-FERIDAS

Os vários aspectos da invenção são ilustrados abaixo através dadescrição detalhada de modalidades específicas e preferidas. Por questãode brevidade, as descrições de todas as patentes e outras publicações cita-das aqui são incorporadas a título de referência. A menos que aqui definidode outro modo ou aparente a partir do contexto, todos os termos técnicos ecientíficos usados aqui têm o mesmo significado conforme geralmente usadona técnica.

Os termos "incluindo", "compreendendo" e "contendo" são usa-dos aqui em seu sentido não-limitante, aberto.

Os regimes terapêuticos da invenção, que compreendem admi-nistração de CTLs que foram ativados pelo contato de xAPCs carregadascom peptídeo selecionado em conjunto com citocinas e pelo menos um a-gente de linfodepleção selecionado de cladribina e DAB-IL2, podem ser em-pregados para tratar câncer em um indivíduo com necessidade de tal trata-mento. De preferência, o câncer é selecionado de melanoma maligno, mie-loma múltiplo, câncer de próstata, linfoma, Iinfoma de não-Hodgkin, Ieucemi-a, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielóide aguda, leucemia linfocíti-ca crônica, leucemia mielóide crônica, linfoma de Burkitt, câncer da tireóide,câncer uterino, câncer de fígado, câncer ovariano, câncer de pulmão, câncerde mama, câncer de fígado, câncer pancreático, câncer de próstata, câncerde colo, câncer de pele, câncer de estômago e câncer cervical.

Então, em uma modalidade preferida, a invenção provê um re-gime de terapia de CTL adotiva para tratamento ou melhora de um melano-ma metastático compreendendo: obtenção de células T CD8+ puras de umindivíduo; contato das células T CD8+ puras com células apresentando antí-geno xenogênicas (xAPCs) que foram carregadas com antígeno de peptídeoselecionado, deste modo gerando CTLs ativados que se direcionam a célu-las expressando o antígeno de peptídeo selecionado; administração de C-TLs ativados de volta ao indivíduo; administração de pelo menos um agentede linfodepleção selecionado de cladribina e DAB-IL2; e administração depelo menos duas citocinas que realizam persistência de CTL. O regime deterapia de CTL adotiva emprega de preferência células T CD8+ que são ati-vas ex vivo, que quando ativadas e administradas a um indivíduo de acordocom a invenção são capazes de destruição in vivo de células de tumor car-regando epítopos antigênicos associados a câncer.

O termo "indivíduo" neste contexto refere-se a um paciente ma-mífero com necessidade de tratamento para um câncer. Por exemplo, umindivíduo pode ser um ser humano diagnosticado com um melanoma, talcomo um melanoma metastático maligno avançado, por exemplo, um paci-ente que foi diagnosticado ser HLA-A2 positivo e ter doença não-ressectávelEstágio lll/IV.

O agente CTL é preparado a partir de xAPCs. Células apresen-tando antígeno xenogênicas exemplares (xAPCs) que são adequadas parauso podem incluir os componentes que seguem: uma molécula de MHC Iexógena; uma ou mais moléculas de auxílio exógenas para auxiliar na ativa-ção de células T puras; e células hospedeiras capazes de expressão dasmoléculas exógenas em sua superfície. De preferência, as moléculas exó-genas são codificadas por ácido nucléico xenogênico que foi introduzido nascélulas hospedeiras. As xAPCs de preferência também expressam molécu-las co-estimuladoras e de adesão exógenas, que potencializam a capacida-de de ativação de célula T das xAPCs. De preferência, as células hospedei-ras são células de inseto, com mais preferência células de Drosophila, taiscomo células Schneider 2 (S2). xAPCs exemplares e métodos para sua fa-bricação são descritos nas, por exemplo, Patentes U.S. N9S 6.225.042 e 6.355.479.

As xAPCs podem ser carregadas com antígeno de peptídeo a-través de uma variedade de métodos conhecidos ou disponíveis na técnica.Peptídeos são selecionados que são capazes de ligação às moléculas deClasse I de MHC vazias. Peptídeos selecionados de preferência correspon-dem a epítopos compreendendo seqüências de aminoácido antigênicas ouimunogênicas derivadas de proteína expressa nas superfícies de células,que vão servir como alvos para as células T empregadas na terapia de CTLadotiva. A fim de carregar moléculas de Classe I de MHC vazias com peptí-deo selecionado, uma ou mais espécies de peptídeo antigênico ou imunogê-nico que se ligam a moléculas de Classe I de MHC podem ser contatadascom as xAPCs sob condições adequadas para a ligação acontecer.

Uma ou mais espécies de peptídeo antigênico ou imunogênicopodem ser selecionadas. Se mais de uma espécie for selecionada, elas po-dem ser contatadas com as xAPCs simultaneamente ou em casos distintos,resultando em complexos de MHC-peptídeo multiantigênicos ou multiimuno-gênicos produzidos nas xAPCs.

Carregamento do peptídeo selecionado em moléculas de MHCvazias de preferência acontece sob condições que se aproximam de condi-ções de ligação biológica, que podem ser aproximadas in vitro, ex vivo ou invivo. Na seleção de peptídeos, o versado pode considerar um ou mais fato-res tais como considerações termodinâmicas, eletrostáticas, energéticas eentrópicas, bem como aminoácidos específicos dentro de peptídeos selecio-nados que são requeridos para ligação eficaz a moléculas de MHC.

Peptídeos preferidos incluem, por exemplo, os peptídeos corres-pondendo a seqüências de aminoácido selecionadas de uma proteína tiroci-nase, uma proteína gp100 e uma proteína MART-1. Outros peptídeos prefe-ridos incluem YMNGTMSQV (SEQ ID NO:1), YMDGTMSQV (SEQ ID NO:2),AAGIGILTV (SEQ ID N0:3), ITDQVPFSV (SEQ ID N0:4), YLEPGPVTA(SEQ ID N0:5) e KTWGQYWQV (SEQ ID N0:6). Peptídeos exemplares adi-cionais que podem ser selecionados incluem, por exemplo, as seqüênciasde aminoácido que seguem, onde a proteína da qual cada peptídeo é deri-vado é escrita parenteticamente : SILSLKEAST (C-Lectina; SEQ ID NO:1),KMASRSMRL (C-Lectina; SEQ ID NO:2 ), ALALAALLVV (Pec 60; SEQ IDNO: 3), ALLVVDREV (Pec60; SEQ ID NO: 4), YMNGTMSQV (Tirocinase;SEQ ID NO:5), YMDGTMSQV (Tirocinase; SEQ ID NO:6), ITDQVPFSV(gp100; SEQ ID NO:7), YLEPGPVTA (gp100; SEQ ID NO:8), AAGIGILTV(MART-1; SEQ ID NO:9), ELAGIGILTV (MART-1; SEQ ID N0:10),CLTSTVQLV (Her-2/neu; SEQ ID NO:11), HLYQGCQVV (Her-2/neu; SEQ IDNO:12), KIFGSLAFL (Her-2/neu; SEQ ID NO:13), IISAVVGIL (Her-2/neu;SEQ ID NO:14), PLTSIISAV (Her-2/neu; SEQ ID NO: 15), VMAGVGSPYV(Her-2/neu; SEQ ID NO: 16), VLVKSPNHV (Her-2/neu; SEQ ID NO: 17),ELVSEFSRM (Her-2/neu; SEQ ID NO: 18), YLSGANLNL (CEA; SEQ IDNO:19), GPLTPLPV (AES; SEQ ID N0:20), SLLMWITQC (NY-ESO-1; SEQID NO:21), KALFAGPPV (CA-125; SEQ ID NO:22), YLETFREQV (CA-125;SEQ ID NO:23), GLQSPKSPL (CA-125; SEQ ID NO:24), VLLKLRRPV (CA-125; SEQ ID NO:25), ELYIPSVDL (CA-125; SEQ ID NO:26), SLLMWITQV20 (NY-ESO-1; SEQ ID NO:27), ILAKFLHWL (Telomerase; SEQ ID NO:28),STAPPVHNV (MUC-1; SEQ ID NO:29), FLWGPRALV (MAGE-3; SEQ IDN0:30), FMWGNLTLA (CA-125; SEQ ID NO:31), RLVDDFLLV (Telomerase;SEQ ID NO:32), HLSTAFARV (G250; SEQ ID NO:33), QLSLLMWIT (NY-ESO-1; SEQ ID NO:34), ELWTHSYKV (FBP; SEQ ID NO:35), KVAELVHFL25 (MAGE-3; SEQ ID NO:36), YIFATCLGL (MAGE-3; SEQ ID NO:37), HLYI-FATCL (MAGE-3; SEQ ID NO:38), MLMAQEALAFL (CAMEL; SEQ IDNO:39), STLEKINKT (SSX-4; SEQ ID N0:40), KASEKIFYV (SSX-2; SEQ IDNO:41), SLLMWITQCFL (NY-ESO-1; SEQ ID NO:42), ELTLGEFLKL (Survi-vina; SEQ ID NO:43), LTLGEFLKL (Survivinã; SEQ ID NO:44), SLLEKREKT30 (SP17; SEQ ID NO:45), TLGEDDPWL (SART-1; SEQ ID NO:46), KLGLK-PLEV (SART-1; SEQ ID NO:47), YLWTSAKNT (SCP-1; SEQ ID NO:48),STAPPAHGV (MUC-1; SEQ ID NO:49), GMGSEELRL (LIVIN; SEQ IDN0:50), SLGSPVLGL (LIVIN; SEQ ID Ν0:51), YLFFYRKSV (hTRT; SEQ IDΝΟ:52), CQQEETFLL (CA-125; SEQ ID ΝΟ:53), TLAKFSPYL (PRAME; SEQID ΝΟ:54), NLTHVLYPV (PRAME; SEQ ID ΝΟ:55), STFKNWPFL (Survivina;SEQ ID ΝΟ:56), SLLQHLIGL (PRAME; SEQ ID ΝΟ:57), FLDQRVFFV(gplOO; SEQ ID ΝΟ:58), FLDQRVFVV (gplOO; SEQ ID ΝΟ:59), FLDQ-VAFVV (gplOO; SEQ ID Ν0:60), GLDREQLYL (MUC-16; SEQ ID Ν0:61),VMQHLLSPL (MUC-16; SEQ ID ΝΟ:62), QQTHGITRL (MUC-16; SEQ IDΝΟ:63), LQPLSGPGL (MUC-16; SEQ ID ΝΟ:64), TLDRDSLYV (MUC-16;SEQ ID ΝΟ:65), QLYLELSQL (MUC-16; SEQ ID ΝΟ:66), KVLEYVlKV (MA-GE-1; SEQ ID ΝΟ:67), KVADLVGFL (MAGE-1; SEQ ID ΝΟ:68) eKTWGQYWQV (SEQ ID Ν0:70).

Peptídeos selecionados podem ser apresentados às células a -través de uma variedade de meios e métodos na técnica. Peptídeos selecio-nados podem ser apresentados de uma maneira que os permite entrar emum grupo intracelular de peptídeos. Por exemplo, peptídeos podem ser a-presentados através de carregamento osmótico. De preferência, peptídeossão adicionados ao meio de cultura do sistema de xAPC. Os peptídeos po-dem ser adicionados ao meio de cultura na forma de um polipeptídio ou pro-teína intacto que é subseqüentemente degradado através de processos ce-lulares, tais como, por exemplo, degradação enzimática. Alternativamente, opolipeptídio ou proteína intacto pode ser degradado através de alguns outrosmeios tais como digestão química (por exemplo, brometo de cianogênio) ouproteases (por exemplo, tripsina e quimiotripsina) antes da adição ao meiode cultura do sistema de xAPC. Alternativamente, uma seqüência de proteí-na ou polipeptídio inteira pode ser clonada em um vetor apropriado e inseri-da em uma célula procariótica, como o que a célula gera quantidades signifi-cantes do polipeptídio antigênico que são então coletadas, purificadas e di-geridas em peptídeos que são então adicionados ao meio de cultura de sis-tema de xAPC.

Uma quantidade suficiente de cada peptídeo selecionado podeser adicionada à cultura de célula para permitir que moléculas de MHC deClasse I se liguem e subseqüentemente apresentem uma densidade grandedo peptídeo sobre a superfície de células expressando MHC de Classe Ihumanas.

As xAPCs podem ser ensaiadas quanto à função de APC au-mentada comparado com a função de APC de células apresentando antíge-no não-xenogênicas ou endógenas. Função de APC aumentada pode serdeterminada medindo qualquer um de uma variedade de parâmetros de ati-vação de célula T CD8+, tais como, por exemplo, um grau de uma ou maisexpressões de proteínas de superfície celular, que é indicativa de ativaçãode célula T CD8+, tal como expressão de superfície de célula CD69, um graude diferenciação, um grau de habilidade de morte citoióxica, um grau de Iisede célula específica e um grau de produção de citocina.

Purificação de proteínas e peptídeos pode ser conseguida atra-vés de várias técnicas que são conhecidas na arte, tal como cromatografiade imunoafinidade, cromatografia de afinidade, precipitação de proteína, tro-cas de tampão, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interaçãohidrofóbica, cromatografia de exclusão de tamanho. CTLs estimulados porantígeno podem ser detectados ou isolados por fingimento de tetrâmero pep-tídeo-MHC pMHC, onde CTLs detectados são específicos para um peptídeoselecionado apresentado pelas xAPCs.

Leucócitos de sangue periférico (PBLs) são obtidos de um indi-víduo, e de preferência purificados. Métodos para purificação de PBLs inclu-em, métodos empregando gradientes Ficoii podem ser utilizados para estepropósito. Os PBLs purificados são então misturados com células xAPCspré-incubadas com os peptídeos antigênicos apropriados. De preferência,PBLs são purificados através de sistemas de purificação de conta magnéticaque estão na técnica, tais como contas Miltenyi (Myltenyi Biotec) e sistemasDynabead (Dynal Biotech). PBLs podem ser também purificados através deprocedimentos de classificação celular, tais como com métodos baseadosem classificação de célula auxiliada por fluorescência (FACS), ou outros dis-positivos e metodologia de separação de células apropriados. Tais métodosde separação de célula ou separação de células sangüíneas vermelhas u-sando proteína fluorescente (GFP) como um marcador para várias proteínasespecíficas de célula.

Células T puras são incubadas em cultura com as xAPCs apro-priadas e carregadas com peptídeo selecionado por um período de temposuficiente para ativar e enriquecer mais uma população de células CD8+. Porexemplo, a Patente U.S. Ns 4.690.915 descreve um método de obtenção denúmeros grandes de linfócitos através de linfocitoferese. De preferência, ascélulas CD8+ são ativadas de uma maneira específica de antígeno. A razãode células CD8+ em repouso ou precursoras (efetoras) para células apresen-tando antígeno pode variar de indivíduo para indivíduo e pode depender ain-da de variáveis tais como a tendência dos linfócitos de um indivíduo a condi-ções de cultura e a natureza e severidade do câncer. De preferência, no en-tanto, a razão de linfócito:célula apresentando antígeno (por exemplo, célulade Drosophila) está de preferência na faixa de cerca de 30:1 a 300:1. Porexemplo, em uma modalidade, 3x107 PBL humano e 1x106 células de Dro-sophila vivas são misturados e mantidos em 20 ml de meio de cultura RPMI1640.

A cultura efetora/apresentando antígeno pode ser mantida porum tempo mais longo do que necessário para ativar e enriquecer uma popu-lação de um número terapeuticamente útil ou eficaz de células CD8+. Comum nível de ativação de CD8+ específico máximo geralmente sendo obser-vado após um a dez dias de cultura, por exemplo, após cinco dias de cultura,um tempo preferido é de a partir de cerca de três a sete dias. Em uma moda-lidade da presente invenção, ativação in vitro de células T CD8+ pode serdetectada dentro de um breve período de tempo após transfecção de umalinhagem de célula. Em uma modalidade, expressão transiente em uma li-nhagem de célula transfectada capaz de ativação de células T CD8+ é detec-tável dentro de 48 horas de transfecção. Então, culturas ou estáveis ou tran-sientes de células transformadas expressando moléculas de MHC de ClasseI são eficazes na ativação de células T CD8+.

Linfócitos T citotóxicos ativados podem ser eficazmente separa-dos de xAPCs (por exemplo, células de Drosophila) usando um método ade-quado conhecido ou disponível na técnica. Por exemplo, anticorpos mono-clonais específicos para as APCs artificiais, para os peptídeos carregadosnas APCs artificiais ou para os CTLs (ou um segmento dos mesmos), podemser utilizados para ligar seu Iigante complementar apropriado. Células mar-cadas com anticorpo podem então ser extraídas da mistura de célula estimu-ladora-efetora através de qualquer um de uma variedade de métodos natécnica, tais como, por exemplo, métodos de imunoprecipitação e imunoen-saio. Alternativamente, uma etapa de separação pode ser omitida comple-tamente e as xAPCs inativadas podem ser deixadas em cultura com os C-TLs ativados.

Quantidades citotóxicas, terapeuticamente eficazes, dos CTLsativados podem ser selecionadas conforme adequado para os usos in vitro ein vivo descritos, por exemplo, em vista da quantidade e tipo de células quesão o alvo final dessas células de CTL. A quantidade será também selecio-nada em vista da condição do paciente e pode ser determinada através daconsideração de todos os fatores apropriados pelo praticante. De preferên-cia, cerca de 1x10® a cerca de 1x1012, com mais preferência cerca de 1x10®a cerca de 1x1011, com mais preferência ainda cerca de 1x109 a cerca de1x1010, células CD8+ ativadas são utilizadas para seres humanos adultos,comparado com cerca de 5x10® - 5x107 células usadas em camundongos.

De preferência, as células CD8+ ativadas, que são CTLs, sãocoletadas conforme acima descrito da cultura de xAPC antes da administra-ção das células CTLs ao indivíduo sendo tratado. O sistema de cultura celu-lar de preferência não é tumorigênico. Deste modo, se separação completade células de Drosophila e células CD8+ ativadas não for conseguida, nãodeve haver nenhum perigo inerente associado com a administração de umnúmero pequeno de células de Drosophila.

Células T CD4+ ou células T CD8+ puras, ou ambas células TCD4+ e células T CD8+, podem ser de preferência extraídas de um indivíduoantes da incubação com culturas de xAPC. Indivíduos podem sofrer qual-quer um de uma variedade de procedimentos de separação de célula san-güínea conhecidos ou disponíveis (por exemplo, leucoferese) para coletarcélulas sangüíneas brancas.Células T puras podem ser coletadas de um indivíduo antes doinício de outro tratamento ou terapia que possa interferir com, atenuar ou dequalquer modo limitar a ativação específica de métodos e usos de células Tpuras conforme provido na presente invenção. Por exemplo, no tratamentode um indivíduo com uma neoplasia ou tumor, uma amostra de células Tpuras pode ser obtida antes do início de um tratamento de quimioterapia oude radiação e mantida em cultura. Após as células puras serem ativadascom xAPCs carregadas com peptídeo, as células T puras podem ser expan-didas e ativadas, e os CTLs ativados podem ser introduzidos de volta no in-divíduo. Alternativamente, células T puras podem ser ativadas, e os CTLsativados podem ser introduzidos de volta no indivíduo de onde as células Tpuras foram obtidas antes, após, ou em conjunto com outras formas de tra-tamento opcionais, tais como quimioterapia ou radiação.

Os CTLs ativados podem ser também suspensos em um veículoapropriado para aplicação e infusão em um indivíduo. Técnicas de reintrodu-ção de componentes celulares são conhecidas na arte e incluem procedi-mentos tais como aqueles exemplificados nas Patentes U.S. N9S 4.844.893e 4.690.915. Por exemplo, administração de células de CTLs ativados atra-vés de infusão intravenosa pode ser empregada. Infusões múltiplas podemser requeridas, e essas infusões podem acontecer durante um período devárias semanas ou mais.

Nos regimes de tratamento da invenção, citocinas são tambémadministradas para atingir persistência de CTL e então aumentar as proprie-dades de meia-vida, atividade, potência e/ou seletividade dos CTLs que sãoadministrados a um indivíduo. Tal persistência pode resultar de um efeitodireto sobre os CTLs ou de um efeito indireto que envolve supra-regulagemde expressão de antígeno em células alvo dos CTLs. Citocinas preferidassão IFN-a-2b e IL-2.

Agentes de linfodepleção Cladribina (2-CdA, Leustatin®) e/ouDAB IL-2 (ONTAK®) são também administrados nos regimes de tratamentoda invenção. Esses agentes são não-mieloablativos e elicitam uma imunos-supressão transiente em indivíduos recebendo a terapia de CTL.O momento e a duração da administração de cada um do CTL,citocina e agentes de linfodepleção podem ser selecionados pelo versado natécnica com base em experimentação de rotina e a orientação aqui, incluin-do os exemplos abaixo.

Para ilustrar vários aspectos e características da invenção, osexemplos que seguem são providos.

EXEMPLOS

Preparação Ex-Vivo de CTLs

Linhagens de APC xenogênica (xAPC) são geradas de célulasSchneider S2 (células S2), que foram estabelecidas em 1969 de várias cen-tenas de embriões de Drosophila melanogaster (Oregon-R) Oregon-R (tiposelvagem) de 20 a 24 horas de vida, de acordo com procedimentos publica-dos (Schneider, J. Embryol. Morph. 27:353-365, 1972). A linhagem de célulaS2 foi depositada com o American Type Cultura Collection (CRL10974). Ofornecimento original de células S2 usado para derivar as linhagens de célu-la das quais as xAPCs derivaram é obtido desta fonte. A fim de gerar xAPCs,células S2 são transfectadas com vetores derivados de vetor de plasmídeopRMHa-3 (vide, por exemplo, Patente U.S. Ne 6.225.042). Uma linhagem dexAPC, chamada clone A, é transfectada com vetores codificando HLA-A2.1Classe I, B7.1 e ICAM-1. Uma segunda linhagem de xAPC, chamada cloneB, é transfectada com vetores codificando HLA-A2.1 Classe I, B7.1, B7.2,ICAM-1 e LFA-3. Uma terceira linhagem de xAPC, chamada clone C, étransfectada com vetores codificando HLA-A2.1 Classe I, B7.1, ICAM-1,LFA-3 e CD70. Então, clone A expressa HLA-A2, B7.1 e ICAM-1, clone Bexpressa HLA-A2.1 Classe I, B7.1, B7.2, ICAM-1 e LFA-3 e clone C expres-sa HLA-A2.1 Classe I, B7.1, ICAM-1, LFA-3 e CD70.B7.2 e LFA-3.

Culturas contínuas independentes de células descendentes declone A e clone B são mantidas em meio Schneider suplementado com sorobovino fetal a 10% e 500 pg/ml de geneticina (G418) e são divididas duasvezes por semana com meio fresco adicionado durante cada divisão paraajustar a densidade celular para aproximadamente 1 χ 106 células/mL. Apro-ximadamente um dia antes da indução (dia -2 a -4; dia 0 definido como o diaque as células são testadas quanto à expressão de moléculas exógenas esão carregadas com peptídeo), 3 χ frascos T75 são inoculados com um vo-lume de suspensão celular mantida em culturas de estoque equivalente a1,5 χ 107 células/frasco. Meio DrosophiIa-SFM completo sem G418 é adicio-nado para trazer o volume até 15 ml/frasco. Os frascos são então incubadosem uma câmara em aproximadamente 27°C. Aproximadamente no dia -1 a -3, as células são então induzidas através da adição de sulfato de cobre (Cu-SO4) para uma concentração final de 1,0 mM (diluição 1:200 de estoque a200 mM de CuSO4; 75 μl de CuSO4 para cada frasco T75 contendo 15 ml desuspensão celular) e retornadas para a câmara a 27°C. O tempo de induçãodura aproximadamente 24 a 72 horas.

No dia O, frascos contendo culturas de célula induzida são che-cados visualmente e microscopicamente quanto à evidência de contamina-ção. Frascos não-contaminados são agrupados e células viáveis contadas.Amostras de culturas de célula agrupadas de aproximadamente 6x10® célu-las são avaliadas através de citometria de fluxo usando análise de separa-ção de célula auxiliada por fluorescência (FACS) para determinar o nível deexpressão de moléculas exógenas. Culturas de célula (aproximadamente 1 χ107 células) são então testadas para verificar a expressão de HLA-A2.1,B7.1 e ICAM-1 (para células de Clone A) ou HLA-A2.1, B7.1, B7.2, ICAM-1 eLFA-3 (para células de Clone B) exógenas antes do carregamento de peptí-deo. Uma vez a expressão de moléculas exógenas sendo verificada, cadacultura de célula é lavada dividindo cada cultura em dois tubos cênicos de 50ml estéreis. Cada tubo é então enchido com meio HYQ SFX-Insect (HycIone)e centrifugado a 1.700 rpm (600 χ g) por aproximadamente sete minutos pa-ra peletizar as células. Sobrenadantes são descartados, e os tubos contendopélete de célula são novamente centrifugados a 1.700 rpm (600 χ g) por a-proximadamente um minuto. Sobrenadantes são removidos com uma pipetade ponta fina. Péletes de cada cultura de célula dividida são então recombi-nados e ressuspensos em 8 mL de meio SFX Insect para uma densidadecelular de aproximadamente 1 χ 107 célula/mL. Aproximadamente 40 μΙ_ deuma solução de estoque de microglobulina β2 a 1,0 mg/mL e 24 μΙ_ de umadiluição 1:50 de uma solução combo de peptídeo de estoque a 1,67 mg/mLpara cada peptídeo são adicionados a cada cultura ressuspensa. Então, ca-da suspensão de cultura celular contém microglobulina β2 em uma concen-tração final de aproximadamente 5 pg/mL e cada peptídeo selecionado podeser carregado a xAPCs em uma concentração final de aproximadamente 0,1pg/mL por peptídeo. Culturas de célula são incubadas na suspensão con-tendo microglobulina β2 e peptídeos por pelo menos quatro horas, e nãomais do que oito horas, com serpenteamento a cada 30 minutos em tempe-ratura ambiente. Após o período de incubação de peptídeo, alíquotas de a-proximadamente 1 mL de cada cultura celular são distribuídas separada-mente em oito tubos de polipropileno (Falcon 2006). Qualquer suspensão decultura de célula residual é descartada.

Células CD8+ isoladas de amostras de Ieucaferese através deseleção positiva com um anticorpo anti-CD8 são estimuladas contra peptí-15 deos associados a melanoma humano (tirocinase-689369-377, tirocinase-792369-377, MART-1-81927-35, gp100-817209-217, gp100-818280-288 egp100-835154-162) apresentados por células de Drosophila expressandomoléculas de Classe I humanas e co-estimulação/adesão HLA-A2.1, B7.1,CD70, LFA3 e ICAM-1. Células CD8+ são reestimuladas por duas rodadas20 com monócitos autólogos (pulsados com os epítopos descritos) na presençade IL-2 e IL-7. O número de células efetoras é então aumentado através deestimulação não-específica com anticorpo monoclonal anti-CD3 na presençade células nutridoras autólogas irradiadas com gama e IL-2. Atividade delinfócito T citotóxico é medida contra células T2 carregadas com peptídeo e25 um painel de células de melanoma, enquanto a pureza de células T CD8+estimuladas in vitro é avaliada através de citometria de fluxo.Materiais

Linhagem de Célula FonteDrosophila S2 ATCCMalme 3 ATCC (Fibroblasto de pele normal de um paciente com melanoma)Malme 3M ATCC (Melanoma metastático de pulmão, mesmo paciente que Malme 3)<table>table see original document page 18</column></row><table>

Reaaentes

rhlL-7. lnterleucina-7 humana recombinante (IL-7) é uma Iinfoci-na produzida em E. coli e purificada pelo fornecedor (PreproTech) usandocromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) mas não anticorpo. IL-7,recebida como um pó, é diluída em DPBS estéril contendo albumina de sorohumano a 1 %. A solução bruta é então filtrada através de um filtro de 0,2μιη, separada em alíquota (30.000 U/mL, concentração de 1000X) em fras-cos estéreis e armazenada a -80°C antes do uso.

rhlL-2. lnterleucina-2 humana recombinante (IL-2) é produzidaatravés de tecnologia de DNA recombinante e fornecida pela Chiron Corpo-ration (Proleukin®). IL-2, recebida como um pó, é diluída em diluente de IL-2(albumina de soro humano a 0,5% em ácido acético a 50 mM), filtrada atra-vés de um filtro de 0,2 μιη, separada em alíquota em frascos estéreis(20.000 U/mL, concentração de 1000X) e então armazenada a -80°C antesdo uso.

Peptídeo de Tirocinase YMNGTMSQV. Um peptídeo de tirocina-se (tyr 369-377), correspondendo aos aminoácidos 369-377 de tirocinasehumana, é fabricado e purificado usando padrões obedientes a GLP (Syn-pep Corporation). O pó de peptídeo conforme recebido do fabricante (Syn-prep Corporation) é dissolvido em sulfóxido de dimetila (DMSO) para atingiruma solução de peptídeo de estoque em uma concentração de 10 mg/mL, eé armazenado a -72°C a -88°C antes do uso. Esta solução de peptídeo deestoque é mistura em partes iguais com outras soluções de estoque de pep-tídeo (também em uma concentração de 10 mg/ml) para gerar soluções depeptídeo de combinação para uso em carregamento de xAPCs. As soluçõesde peptídeo de combinação são separadas em alíquota em frascos estéreisem uma sala limpa de Classe 10.000 sob condições assépticas em uma ca-bine de biossegurança de Classe II.

Peptídeo de Tirocinase YMDGTMSQV. Uma forma desaminadado peptídeo tyr 369-377 descrito acima, que contém um resíduo de ácidoaspártico no lugar de um resíduo de asparagina na posição três do peptídeo,é fabricada e purificada usando padrões obedientes a GLP (Synpep Corpo-ration). Esta forma de desaminação é chamada tyr 369-377d. O pó de peptí-deo recebido do fabricante é dissolvido em sulfóxido de dimetila (DMSO)para atingir uma solução peptídeo de estoque em uma concentração de 10mg/mL e é armazenado a -72°C a -88°C antes do uso.

Peptídeo de gp100 ITDQVPFSV. Um peptídeo de gp100(gp1002o9-2i7), correspondendo aos aminoácidos 209-217 de gp-100 huma-no, é fabricado e purificado usando padrões obedientes a GLP (Synpep Cor-poration). O pó de peptídeo é dissolvido em sulfóxido de dimetila (DMSO)para atingir uma solução de peptídeo de estoque em uma concentração de10 mg/mL e é armazenado a -72°C a -88°C antes do uso.

Peptídeo de gp100 KTWGQYWQV. Um peptídeo de gp100(gp100i54-i62), correspondendo aos aminoácidos 154-162 de gp100 humano,é fabricado e purificado usando padrões obedientes a GLP. O pó de peptí-deo conforme recebido da Synpep Corporation é dissolvido em sulfóxido dedimetila (DMSO) para atingir uma solução de peptídeo de estoque em umaconcentração de 10 mg/mL e é armazenado a -72°C a -88°C antes do uso.

Peptídeo de gp100 YLEPGVTA. Um peptídeo de gp100(gp10028o-288). correspondendo a aminoácidos 280-288 de gp100 humano éfabricado e purificado usando padrões obedientes a GLP pela Synpep Cor-poration. O pó de peptídeo é dissolvido em sulfóxido de dimetila (DMSO)para atingir uma solução de peptídeo de estoque em uma concentração de10 mg/mL, e é armazenado a -72°C a -88°C antes do uso.

Peptídeo de MART-1 AAGIGILTV. Um peptídeo de MART-1(MART-127-35), correspondendo aos aminoácidos 27-35 de MART-1 humano,é fabricado e purificado usando obediência a GLP (Synpep Corporation). Opó de peptídeo é dissolvido em sulfóxido de dimetila (DMSO) para atingiruma solução de peptídeo de estoque em uma concentração de 10 mg/mL eé armazenado a -72°C a -88°C antes do uso.

DYNABEADSfs M-450. DYNABEADS® M-450 (SAM) IgG sãocontas paramagnéticas estéreis revestidas com IgG anticamundongo de ca-bra policlonal que se liga à IgG de camundongo primária. DYNABEADS, dis-poníveis da Baxter Oncology, Inc., são armazenadas a 4°C antes do uso emisolamento de célula T usando o Isolex 300i Magnetic Cell Selector.

Albumina de Soro Humano. HSA a 25%, USP (Baxter FenwalLaboratories; a fonte de plasma para cada lote testado ser negativo paraHIV-1, HIV-2, HCV e HBV), é armazenada em temperatura ambiente antesdo uso como uma fonte de proteína tamponada durante a preparação decélula T que segue e as etapas de ativação: purificação de células T CD8+ ecélulas T CD8'; carregamento de peptídeo de células aderentes; e formula-ção final de células T ativadas.

Anticorpo anti-CD8. Anticorpo monoclonal anti-CD8 (37B1A) éum anticorpo monoclonal de murino direcionado contra o antígeno CD8 decélulas T, que é usado para selecionar células T CD8+ com o sistema Isolex300i Magnetic Cell Selector. A solução concentrada é diluída em DPBS esté-ril para uso em processos de isolamento ou ativação de célula T CD8+. Asolução é filtrada através de um filtro de 0,2 pm e então separada em alíquo-tas em frascos de uso único em uma sala de limpeza Classe 10.000 sobcondições assépticas em uma cabine de biossegurança de Classe II. Alíquo-tas (10,0 mg/mL) são armazenadas a -80°C antes do uso.

Peptídeo de Cadeia Alfa CD8 - AAEGLDTQRFSG. Peptídeo decadeia leve alfa CD8 (AAEGLDTQRFSG) é purificado e fabricado sob pa-drões obedientes a GLP. O peptídeo de cadeia alfa CD8 é usado em pro-cessos de isolamento de célula T CD8+ para liberar células T CD8+ captura-das usando anticorpo CD8 (38B1A) e o Isolex 300i Magnetic Cell Selector.Cada lote de peptídeo é fabricado pela Synprep Corporation para satisfazeros padrões de grau farmacêutico, e é testado quanto à seqüência, pureza,peso molecular e aparência de peptídeo. O peptídeo de cadeia alfa CD8,recebido como um pó, é processado mais para criar uma solução de estoquede 10 mg/ml. Esta solução de estoque é diluída em DPBS, filtrada através deum filtro de 0,2 μητι, separada em alíquotas em frascos estéreis e armazena-da a -72°C a -88°C antes do uso. Enchimento do reagente de peptídeo emfrasco é realizado em uma sala limpa de Classe 10.000 sob condições as-sépticas em uma cabine de biossegurança de Classe II.

Microglobulina β2Μ Humana. Um concentrado de microglobulinabeta-2 humana (β2Μ) produzido através de tecnologia de DNA recombinanteé diluído em DPBS estéril para atingir uma concentração de 1,0 mg/mL Asolução bruta é então filtrada através de um filtro de 0,2 μηη, separada emalíquota em frascos estéreis e armazenada a -80°C antes do uso durante apreparação e carregamento de peptídeo de xAPCs e carregamento de pep-tídeo de células aderentes.

Solução de Citrato de Sódio. Uma solução de citrato de sódioanticoagulante não-pirogênica, estéril, USP (Baxter Fenwall), é armazenadaem temperatura ambiente (RT) antes do uso como um aditivo de tampãopara funcionamento do Isolex 300i Magnetic Cell Selector para seleção decélulas T CD8+ e células T CD8".

Meio de Schneider. Meio de Drosophila de Schneider é um meiode cultura usado para cultura de células de Drosophila. Cada lote de meio étestado pelo fornecedor (Invitrogen Corporation) quanto à osmolaridade, pH,esterilidade e a habilidade em sustentar o crescimento de células de Droso-phila. O meio de Drosophila de Schneider (concentração 1X) é armazenadoa 2°C a 6°C antes do uso.

Soro Bovino Fetal. Soro bovino fetal (FBS), que é usado comouma fonte de proteína para o cultivo de células hospedeiras ou célulasxAPCs, é armazenado a -80°C. O FBS, disponível da Gemini Bioproducts, éprocessado de sangue fetal bovino de animais de origem dos Estados Uni-dos. Os animais maternos dos quais o sangue é derivado são livres de do-enças infecciosas e contagiosas e parasitas prejudiciais.Meio HYQ SFX Insect. Meio SFX Insect da Hyclone (HycloneCorporation) é um meio de cultura livre de soro (concentração 1X) usadodurante o carregamento de peptídeo de xAPCs e é armazenado a 2°C a 6°Cantes do uso. Este meio não contém produtos de origem bovina.

Sulfato de Cobre. Pentaidrato de sulfato de cobre (II) (AIdrich) éusado para indução de células hospedeiras modificadas para expressar mo-léculas humanas HLA, co-estimuladoras e de adesão. A solução de estoqueé formulada através da dissolução do CuSO4 cristalino em água estéril livrede endotoxina para atingir uma concentração de 200 mM e assepticamentefiltrando a solução através de um filtro de 0,2 μιτι em um recipiente estéril emuma cabine de biossegurança de Classe II. A solução de estoque filtrada éarmazenada a 2°C a 6°C antes do uso.

RPMI. Meio de cultura RPMI (disponível da Invitrogen Corporati-on ou Gibco), que é livre de soro e antibiótico (concentração 1X), é usadopara cultivar células T. Meio de cultura RPMI é armazenado a 2 a 6°C antesdo uso.

Solução Salina Tamponada com Fosfato da Dulbecco (DPBS).Solução salina tamponada com fosfato da Dulbecco (DPBS) (disponível daInvitrogen Corporation ou Gibco, concentração 1X) é armazenada em RTantes do uso. DBPS é usada para os procedimentos que seguem: funciona-mento do instrumento Isolex 300i Magnetic Cell Selector durante a seleçãode células T CD8+ e células T CD8"; lavagem de células não-aderentes du-rante etapas de reestimulação e lavagem de anticorpo monoclonal OKT3não-ligado durante expansão não-específica; e diluição de microglobulina β2humana, IL-7, peptídeo CD8 e OKT3.

Meio de Leibovitz. Meio L-15 de Leibovitz (sem L-glutamina;concentração 1X), disponível da Sigma-AIdrich, é armazenado a 2°C a 6°Cantes do uso durante carregamento de peptídeo do processo de ativação decélula T.

Anticorpo OKI® 3. Orthoclone OKT^ 3 (1,0 mg/mL), um anticor-po monoclonal de murino específico para o antígeno CD3 de células T for-necido em ampolas como uma solução estéril aprovado para uso clínico(disponível da Ortho), é separado em alíquotas em frascos de uso único sobcondições estéreis e armazenado congelado a -80°C antes do uso na ativa-ção de células T.

Geneticina (G418). Geneticina (Invitrogen Corporation) é um an-tibiótico seletivo usado na cultura de células de Drosophila para manutençãoda expressão de moléculas exógenas codificadas por ácido nucléico xeno-gênico. Geneticina é fornecida como uma solução de estoque estéril (50mg/mL) e é armazenada a 2 a 6°C antes do uso.

Cloreto de Cálcio. Hidrato de cloreto de cálcio é usado para coa-gulação de plasma autólogo obtido do produto de linfoferese para gerar soroautólogo usado em processos de isolamento ou ativação de célula T CD8+.Hidrato de cloreto de cálcio é recebido como um pó cristalino, é compostoem uma solução de estoque (1M) e armazenado a 2°C a 6°C antes do uso.A solução de estoque é formulada dissolvendo cloreto de cálcio em águaestéril livre de endotoxina e assepticamente filtrando através de um filtro de0,2 μm em um recipiente estéril em uma cabine de biossegurança de Classe II.

Ácido Acético. Ácido acético (17,4M) usado para a preparaçãode soluções de estoque de IL-2 é obtido da Sigma Corporation e armazena-do em RT antes do uso.

FICOLL-PAQUÊ® Plus. Seguindo o isolamento de células TCD8+ e células T CD8" com o Isolex 300i Magnetic Cell Selector, células mo-nonucleares da fração não-CD8+ são fracionadas mais usando FICOLL-PLAQUE® Plus (concentração 1X), um reagente de gradiente Ficoll semquaisquer componentes animais disponível da Amersham Pharmacia Biote-ch usado para remover células mortas, neutrófilos e células vermelhas dosangue. O reagente é armazenado em RT antes do uso.

PENTASPAhfs. PENTASPAN (B. Braun Medicai Inc.) é uma so-lução estéril de pentaamido a 10% em cloreto de sódio a 0,9% para uso clí-nico (NDC 0264-1972,10) e é armazenada em RT antes do uso. Ela é usada(concentração 1X) como um crioprotetor na criopreservação de células TCD8" e células T CC8+ isoladas.Sulfóxido de Dimetila (DMSO). DMSO é usado como um criopro-tetor na criopreservação de células T CD8" e células T CD8+ isoladas. A so-lução de DMSO (concentração 1X), disponível da Sigma-AIdrich, é armaze-nada em RT antes do uso.

L-Glutamina. L-Glutamina (USP)1 200 mM (concentração 100X),disponível da Invitrogen Corporation, é usada como um meio de cultura RP-Ml suplementado, e é armazenada a -80°C antes do uso.

Solução de Piruvato de Sódio MEM. Solução de piruvato de só-dio MEM (100 mM, concentração 100X), disponível da Invitrogen Corporati-on, é usada para suplementar meio RPMI e é armazenada a 2 a 6°C antesdo uso.

Aminoácidos Não-essenciais. Aminoácidos não-essenciais (10mM; concentração 100X) da Invitrogen Corporation, usados para suplemen-tar meio RPMI, são armazenados a 2 a 6°C antes do uso.

Solução HEPES. Solução tampão HEPES a 1M (concentração200M) (Invitrogen Corporation), usada para suplementar meio RPMI, é ar-mazenada a 2°C a 6°C antes do uso.

Meio de Célula X-Vivo 10. Meio de cultura de célula X-vivo10,fornecido pela BioWhittaker, é armazenado a 2°C a 6°C antes do uso. Estemeio (concentração 1X), que é livre de soro, vermelho fenol e antibiótico, éusado durante a fase de expansão não-específica de células T ativadas porexposição a xAPCs carregadas com peptídeo.

Injeção de Cloreto de Sódio. Uma solução de cloreto de sódio a0,9%, USP, disponível da Baxter Fenwal Laboratories, é usada para proce-dimentos de lavagem de célula durante coleta de células Τ. A solução, que éestéril, não-pirogênica e livre de componentes animais, é armazenada em

RT antes do uso.

Solução de Dextrose + Cloreto de Sódio. Uma solução injetávelde dextrose a 0,5% e cloreto de sódio a 0,9%, USP (Baxter Fenwall Labora-tories), é obtida como uma solução não-pirogênica, estéril, livre de compo-nentes animais. A solução, que é usada como um tampão de armazenamen-to para células T ativadas, é armazenada em RT antes do uso.Solução de Ringer Lactada. Uma solução de Ringer Lactada a0,9%, USP (Baxter Healthcare Laboratories), que é uma solução de cloretode cálcio, cloreto de potássio, cloreto de sódio e Iactato de sódio em águapara injeção (livre de componentes animais) de baixa endotoxina, estéril, éarmazenada em RT antes do uso em coleta e suspensão de células T.

Água Destilada. Água destilada de grau de cultura celular, que éobtida através de filtragem em membrana e peneiramento de endotoxina(Invitrogen Corporatio), é usada como um solvente para a preparação desoluções de estoque de sulfato de cobre, cloreto de cálcio e interleucina-2(IL-2) e é armazenada em RT antes do uso.Outros Materiais

Produtos de Iinfoferese são coletados de indivíduos humanosdiagnosticados com melanoma e são armazenados em RT antes do uso pa-ra a geração de um produto de célula específico de paciente, autólogo.

Soro humano autólogo é usado como uma fonte de proteína pa-ra cultura de células T isoladas. Plasma humano autólogo é preparado deproduto de Iinfoferese através da adição de cloreto de cálcio para conseguircoagulação de fibrina e então coleta da fase de soro líquida. A fase de sorolíquida coletada é armazenada a 4°C por armazenamento a curto prazo e a - 80°C para armazenamento a longo prazo.

Uma linhagem de xAPC de Drosophila, derivada do clone B deDrosophila xenogênica, que é usada como um estoque de semente paracriar uma cultura de xAPC de Drosophila contínua, é obtida conforme descri-to abaixo.

Procedimentos

Isolamento de Células CD8+ Humanas

Células CD8+ são isoladas de amostras de Ieucaferese usandouma máquina Isolex 300i (Baxter) através de seleção positiva com um anti-corpo monoclonal anti-CD8 (anticorpol) seguido por um procedimento deisolamento de Dynabeads™ (DynaI) usando IgG anticamundongo de cabra(anticorpo2) revestido sobre contas magnéticas (contas SAM). O anticorpomonoclonal de camundongo CD8 anti-humano é adicionado às células lava-das ressuspensas em PBS da Dulbecco suplementado com HSA a 1% (Bax-ter-Hyland) e citrato de sódio a 0,2%. Contas magnéticas Dynal (Dynabe-ads®) são adicionadas em uma razão de conta para célula de 1:1 a 1:2 de-pendendo do número de PBMCs. As células CD8+ isoladas são removidas5 através de separação magnética. A fração não-CD8 restante é coletada ecriopreservada para uso futuro durante as etapas de reestimulação e expan-são não-específica. Dissociação do complexo célula CD8-anticorpo1-anticorpo2-conta é conseguida através da incubação a 37°C por 45 minutosna presença de peptídeo59-7o de CD8 (AAEGLDTQRFSG), o peptídeo para o10 qual anticorpo 1 foi gerado. Contas liberadas são removidas magneticamentee as células CD8+ são contadas e analisadas através de citometria de fluxopara avaliar a pureza. Recuperação de células CD8+ é tipicamente maior doque 80%. Soro inativado por calor é preparado coletando o plasma autólogono momento da etapa de lavagem de célula inicial. Fibrina é coagulada u-15 sando CaCfe e o coágulo de fibrina removido. Soro é inativado com calor,filtrado, separado em alíquota e congelado a -80°C. Células não-CD8+ sãoretidas do procedimento de seleção positivo e purificadas usando um gradi-ente Ficoll. Essas células são criopreservadas em DMSO, Pentaspan e soroautólogo inativado com calor e armazenadas em nitrogênio líquido (LN2).20 Essas células são usadas como a fonte de células aderentes no momentodas reestimulações e são pulsadas com peptídeo antes do uso como célulasapresentando antígeno.

Imunização In vitro de células T CD8+humanas purificadas

Estimulação Primária. Células S2 de Drosophila transfectadas25 são incubadas em meio de Schneider (106 células/mL) suplementado comsoro bovino fetal a 10% e sulfato de cobre a 27°C por 24 a 72 horas. CélulasS2 (clone 1120-3-9) são coletadas, lavadas e ressuspensas em meio HYQSFX-Insect (HycIone) contendo 0,1 pg/mL de cada peptídeo gp100i54-i62,gp1 OO209-217, gp1 0028o-288> MART-127-35, tirocinase-N369-377 e tirocinase-D369-37730 humano e 5 pg/mL de proteína recombinante de microglobulina β2 humanapurificada de E. coli. Seguindo incubação em temperatura ambiente (23-25°C) por quatro horas, as células S2 são misturadas com células CD8+ emuma razão de 1:10 (Células de Drosophila:cé\u\as T) em meio Roswell ParkMemorial Institute (RPMI) (Gibco) suplementado com soro autólogo a 5-10%.

A mistura de célula é incubada a 37°C tempo durante o qual as células deDrosophila morrem (em 48 horas). No dia quatro, IL-2 (20 U/mL) e IL-7 (30U/mL) são adicionadas para seletivamente expandir a população de CTLespecífica de melanoma.

Reestimulações. PBMCs depletadas de CD8, autólogas, obtidasno momento de Iinfaferese e congeladas para uso futuro, são descongela-das, lavadas e ressuspensas a 107 células/mL em meio RPMI contendo soroautólogo a 10%, 5 pg/mL de microglobulina β2 humana recombinante e 5μ g/m L de peptídeos gp100i54-i62, gp100209-2i7, gp10028o-288, MART-127-35, ti-rocinase-N36g-377 e tirocinase-D369-377 . Seguindo irradiação y 50 Gy (5.000rads), as células são incubadas a 37°C por duas horas nos frascos usadospara reestimulação. Células não-aderentes são removidas através de Iava-gem com PBS da Dulbecco. Monócitos aderentes são carregados com osepítopos de peptídeo e incubados por 90 minutos em meio Leibovitz conten-do 5 pg/Mc de microglobulina β2 humana em HSA a 1% e 5 pg/mL de cadapeptídeo. O sobrenadante é removido e a suspensão de célula CD8+ ativadacom Drosophila (2,5 χ 106 células/mL em meio RPMI com soro autólogo a10%) é adicionada em uma razão de cerca de 10 células CD8+ a um monóci-to aderente. Após três a quatro dias de cultura a 37°C, IL-2 (20 U/mL) e IL-7((30 U/mL) são adicionadas com uma mudança no meio para seletivamenteexpandir a população de CTL específica de melanoma.

Expansão não-específica. Células efetoras CD8+ que sofreramduas rodadas de reestimulação são expandidas em bolsas de cultura celularjunto com células nutridoras (células selecionadas não-CD8+ autólogas irra-diadas) após serem estimuladas com anticorpo OKT3. Células selecionadasnão-CD8+ congeladas são descongeladas, lavadas e então irradiadas comgama (3.500 rads). Uma razão de 4:1 (nutridora:efetora) é posta em frascosT-225 que foram revestidos com anticorpo OKT3. Estimulação de OKT3 érealizada em meio RPMI completo contendo soro autólogo a 10% suplemen-tado com 20 U/mL de IL-2. Dois dias depois, as células T estimuladas sãodiluídas com meio fresco (meio X-vivo 10) e transferidas para bolsas de cul-tura celular para expansão. Meio fresco e IL-2 são suplementados aproxi-madamente a cada dois a três dias para alimentar as células T se expandin-do rapidamente.

Preparação e Liberação de CTLs

Coleta de Célula e Formulação de Produto Final. Coleta do pro-duto de célula final é realizada através de centrifugação para remover meiode cultura e para concentrar as células. Após centrifugação, células são la-vadas em solução salina contendo albumina de soro humano (HSA) a 1%,filtradas através de um filtro de 70 μητι e então diluídas em meio de infusão.O produto de célula para infusão contém CTLs autólogos em 300 mL de In-jeção de Ringer Lactada, USP (76% v/v), Dextrose a 5% em cloreto de sódioa 0,9% (4% v/v) e HSA a 25% (20% v/v). Células de produto final são emba-ladas em uma bolsa de transferência de 1000 mL em um recipiente detransporte isolado resfriado com um miniregistrador ("dote logger")de tempe-ratura.

Teste do Produto. Testes realizados antes da liberação de pro-duto de CTL são listados abaixo. Atividade específica direcionada contrapeptídeos individuais é avaliada medindo a atividade citotóxica das célulasefetoras contra células T2 marcadas com cromo carregadas com cada pep-tídeo individual de uso para estimulação. Atividade citotóxica é também me-dida contra alvos de melanoma marcados com cromo (Malme 3M, M14), u-sando fibroblastos normais (Malme 3) ou linhagem de célula de melanoma(01-KN) negativa para tirocinase, gp100 e MART-1 como controles.

Fenótipo: Uma porção da coleta de célula é usada para testar ofenótipo do produto de CD8 antes do carregamento. A especificação do pro-duto final é expressão de CD3, CD8 e TCR. Avaliação fenotípica adicionalpara marcadores de acordo com memória, ativação, etc, é medida e regis-trada.

Identidade: O estado de HLA-A2, HLA-C e HLA-DR da amostraé determinado através da análise de uma preparação de DNA isolada deuma amostra de PBMC preparada no momento do recebimento da Ieucafe-rese inicial e de células T CD8+ coletadas no final da cultura, tomadas doproduto de célula coletado. Análise de PCR de amostras de DNA é realizadacom oligos iniciador específicos de HLA providos pela Genovision. A especi-ficação do produto final é identidade com amostra do dia 0.

Contagens de Célula: A dose de célula desejada para infusão é1010 células T CD8+. O limite de infusão de produto final é 1010 células. Onúmero total de células geradas é dependente do paciente. Doses de célulaforam em média 9 χ 109 em um estudo anterior onde as células foram gera-das sob o mesmo protocolo ex vivo. A contagem de célula final é feita atra-vés da determinação do número de células viáveis.

Viabilidade: A viabilidade de dose de célula final é >70%. O nú-mero de células viáveis é estabelecido através de contagem microscopica-mente de células que excluem corante azul tripano.

Teste de Micoplasma: Teste das células quanto a micoplasma érealizado antes das células serem administradas ao paciente para confirmardetecção de micoplasma negativo. O Roche PCR kit é usado que tambéminclui um ensaio ELISA. Ainda, amostras das culturas de célula T são cole-tadas na primeira alimentação de citocina (dia 6) e enviadas para BioReIian-ce para realizar o procedimento de cultura de 28 dias. Os resultados da cul-tura são recebidos pós-infusão de célula T.

Teste de Endotoxina: O teste de endotoxina no produto celularfinal é realizado usando um ensaio Limulus Amebocyte Lysate (Βίο Whitta-ker, Walkersville, MD). O limite de nível de endotoxina é menos do que 5EU/kg infundidos nos pacientes. A especificação de produto de célula final é<1EU/mL.

Testes de Esterilidade de Produto Em Processo: Teste em pro-cesso quanto à esterilidade é realizado usando o sistema BacT/Alert. Amos-tras são tomadas durante momentos de mudanças de meio. Uma amostrada dose final é também testada pelo sistema BacT/Alert, e a especificaçãodo produto final está ausente de crescimento.

Detecção de DNA de Drosophila e RNA Viral de Inseto. DNA éisolado do produto de célula T CD8+ final e usado como um molde para umensaio de PCR de DNA de Drosophila, que usa iniciadores específicos parao vetor de inseto usado para preparar as APCs de Drosophila recombinan-tes. Esta amostra é comparada com a amostra de CD8+ pura que age comocontrole negativo e DNA de célula de Drosophila é usado como o controlepositivo. RNA total é também isolado das mesmas amostras de célula TCD8+ e uma RT-PCR de tempo real quantitativa, que pode detectar 20 có-pias/Mg de cDNA de três vírus de RNA viral de inseto conhecidos, diferentes,é realizada. A especificação de produto para ambos ensaios é detecção ne-gativa de ácido nucléico de inseto genômico e viral.

Atividade Lítica: Atividade Iftica é avaliada para o produto de cé-lula T CD8+ final através de um ensaio de liberação de cromo em ambos al-vos de célula T2 carregada com peptídeo, para medir atividade antipeptídeo,e alvos HLA-A2 de célula de melanoma estabelecida ou autóloga e linha-gens de tumor e não-tumor compatíveis com doador (Malme 3 e Malme 3M) para avaliar morte específica de melanoma. A especificação de produto émorte específica de células alvo.

Também, para facilitar monitoramento os testes que seguempodem ser realizados em adição a testes de liberação descritos acima:

Tingimento Tetramérico: Células T CD8+ para a amostra deriva-da de Ieucaferese pura são avaliadas quanto à presença de células T espe-cíficas de antígeno com moléculas tetraméricas que foram feitas para enu-merar células T com especificidade para os epítopos de peptídeo usadospara gerar os CTLs ex vivo. Isto permite o monitoramento de células T espe-cíficas de antígeno após tratamento.

Células de Tumor Melanoma em Amostras de Sangue Periférico:Ensaios de PCR de tempo real quantitativa, sensível, permitem o monitora-mento de células de melanoma em circulação em amostras de sangue depaciente, antes, durante e após tratamento com fármaco. Embora nem todosos pacientes com melanoma de estágio lll/IV demonstrem células de tumorem circulação, a detecção dessas células pode ser usada como um marca-dor substituto para resposta à terapia.

Produtos de CTL preparados conforme descrito acima podemser usados nos regimes de tratamento de terapia de combinação da inven-ção conforme ilustrado pelas modalidades preferidas descritas nos exemplosque seguem.

Tratamento de Pacientes com Melanoma Metastático UsandoLinfócitos CDS+ Autólogos Estimulados Ex Vivo com Células de DrosophilaCarregadas com Peptídeos Associados a Melanoma (MART-1, gp100 e Ti-rocinase) e Administração Subcutânea de IFNa-2b e IL-2, Com e Sem Admi-nistração de 2-CdA ou DABIL-2

Esses exemplos ilustram tratamentos compreendendo a admi-nistração de linfócitos T citotóxicos autólogos (CTLs) que são específicospara epítopos de peptídeos derivados de antígenos associados a melanomaem combinação com um agente de linfodepleção selecionado de cladribina eDAB IL2 bem como citocinas IL-2 e IFN-a-2b, bem como um tratamento decontrole. O agente de terapia celular, que compreende CTLs autólogos queforam ativados de modo que eles especificamente se direcionam a célulasde melanoma expressando MART-1, gp100 e tirocinase através de contatode xAPCs de Drosophila carregadas com peptídeos antigênicos derivadosde MART-1, gp100 e tirocinase, é feito para aumentar e manter o direciona-mento imune de um paciente de células de melanoma expressando MART-1, gp100 e tirocinase. A adição de imunomoduladores IFN-a-2b e IL-2 é in-cluída para aumentar a resposta dos CTLs. Um regime preparativo (cladribi-na), não-mieloablativo, mas de depleção de linfócito, ou uma denileucinadiflitox de depleção de subconjunto de célula T específico (DAB IL-2) é ad-ministrado antes da infusão de CTL para aumentar o enxerto de CTLs. Otratamento é feito para causar regressão de tumor e benefício clínico atravésda persistência de CTLs específicos de melanoma.

Mais particularmente, pacientes clínicos com melanoma maligno,avançado, que são positivos para HLA-A2, são administrados com um regi-me preparativo não-mieloablativo, mas de depleção de linfócito, consistindoem ou cladribina (0,12 mg/kg/dia χ 5 dias) ou DAB IL-2 (uma injeção únicade 18 pg/kg). Ainda, um regime concomitante de interferon-a-2b (IFN-a-2b;10MIU/m2) é administrado diariamente, por 5 dias consecutivos, através deinjeção subcutânea antes da infusão de CTL. Subseqüentemente, os pacien-tes recebem uma dose única de células T CD8+ autólogas, estimuladas comxAPC de Drosophila, geradas ex vivo, que mostram o fenótipo de CTL. Ainfusão celular é imediatamente seguida por administração diária subcutâ-nea de IL-2 de dose baixa (por exemplo, 3MIU), por vinte e oito (28) dias,seguido por avaliação do tumor. Administração diária, subcutânea, de IL-2de dose baixa (por exemplo, 3MIU) é continuada em pacientes sem evidên-cia de progressão de doença.

Os CTLs são gerados através de um método onde células TCD8+ puras purificadas são estimuladas com xAPCs de Drosophiia apresen-tando seis epítopos de peptídeo de célula T associados a melanoma diferen-tes no contexto de restrição de classe I de MHC humano, resultando em C-TLs que mostram especificidades múltiplas para MART-1, gp100 e tirocina-se, após aproximadamente 34 dias em cultura.

Sangue é coletado na avaliação para qualificar pacientes para oestudo e o procedimento de Ieucaferese preparativo acontece no dia O oudia 1. Pacientes sofrem uma Ieucaferese 2,0-3,OX o volume de sangue pa-drão para obter células de sangue brancas requeridas para preparar o agen-te de terapia de célula. Nos momentos indicados, procedimentos de Ieucafe-rese adicionais (< do terço da quantidade usada para se obter a amostra deCD8 inicial) devem ser realizados para se obter células de sangue periféricopara análise. Essas amostras são usadas para monitorar a presença de cé-lulas T específicas de antígeno e possivelmente células de tumor de mela-noma em circulação. Células de plasma e sangue são também coletadaspara satisfazer os requisitos de xenotransplante para arquivamento de a-mostras pré- e pós-tratamento. Produtos de Ieucaferese são transportadospara uma instalação onde células T CD8+ são isoladas, estimuladas e cultu-radas por aproximadamente 34 dias.

Uma avaliação de lesões que podem ser medidas é conduzidaem ambas 4 e 8 semanas seguindo a infusão de CTL. Um objetivo do estudoé determinar se administração de uma depleção de linfócito, não-mieloablativa, total (cladribina) ou uma depleção de subconjunto de célula Teletiva (DAB IL-2), antes da infusão de célula T e em conjunto com um re-gime de citocina de aumento imune estabelecido, vai resultar em persistên-cia de célula T específica de antígeno com regressão de tumor objetiva a-companhante.

Preparação de Linfócitos Citotóxicos

Células CD8+ isoladas de amostras de Ieucaferese através deseleção positiva com um anticorpo anti-CD8 são estimuladas com peptídeosantigênicos associados com melanoma humanos (tirocinase369-377 (nativa),tirocinase369-377 (D371 modificada), MART-127-35, gp100i54-i63> gp1002o9-2i7 e10 gp10028ο-28δ) apresentados por xAPCs de Drosophila expressando moléculasde classe I humanas e co-estimuladoras (HLA-A2.1, β2 microglobulina, B7.1,CD70, ICAM-1 e LFA-3). As mesmas células CD8+ são reestimuladas porduas rodadas de células mononucleares pulsadas com peptídeo, autólogas,na presença de IL-2 e IL-7. Uma etapa de expansão não-específica com15 mAb anti-CD3 (OKT3) é também incluída para aumentar o número total decélulas: geralmente 25 vezes maior do que aquele obtido no final da segun-da etapa de reestimulação. Atividade de célula T citolítica é medida contracélulas T2 carregadas com peptídeo e um painel de células de melanomaA2+, enquanto a pureza das células T CD8+ estimuladas in vitro é avaliada20 através de citometria de fluxo. Adicionalmente, produção de interferon-gama,em resposta à estimulação específica de antígeno e análise tetramérica es-pecífica de peptídeo, confirma a função efetora e especificidade dos CTLsgerados, respectivamente.

Potência de CTLs Gerados de Células T CP8+ Puras Isoladas de Pacientes25 de Câncer Melanoma

Foi demonstrado em pacientes com melanoma que CTLs espe-cíficos de antígeno, isolados de amostras de sangue periférico, são parte deuma população heterogênea de células que varia de baixa a alta avidez parao complexo peptídeo específico/MHC ao qual o TCR é direcionado. No en-30 tanto, a maioria desses CTLs são de baixa avidez, e apenas os CTLs comalta avidez demonstram Iise de célula de tumor significante.21 Ainda, linfóci-tos infiltrantes de tumor (TILs) foram isolados de massas de tumor em paci-entes com melanoma. A expansão in vivo desses TILs na presença de IL-2de alta dose resultou em respostas objetivas em pacientes com melanoma;no entanto, essas respostas foram de curta duração e as células T clonadasaltamente reativas originando-se dos TILs falharam em gerar quaisquer res-postas completas.16

Em contraste, CTLs gerados ex vivo com xAPCs de Drosophilasão células T específicas de antígeno, de alta avidez, potentes, capazes deIise específica de peptídeo (vide, por exemplo, Figura 1) e morte de célula detumor melanoma forte. A geração reproduzível dos CTLs, com atividade cito-lítica forte para células de tumor, é acreditada ser atribuível a vários fatorescontribuintes. Primeiro, purificação de CD8+ com um anticorpo monoclonalanti-CD8, específico de peptídeo, selecionado para células com alta densi-dade de CD8, enquanto a liberação de anticorpo na presença de peptídeoespecífico, evitou estimulação não-específica de células T. Segundo, as cé-lulas T CD8+ altamente purificadas (Tabela I) são estimuladas com xAPCsapresentando epítopos de célula T específicos no contexto de moléculas deMHC, onde uma alta densidade de apresentação de antígeno resulta emuma resposta imune de célula T primária potente. A inclusão de moléculasde co-estimulação múltiplas nas APCs otimiza a estimulação de célula T.Terceiro, as etapas de reestimulação incorporam células mononucleares,autólogas, que foram carregadas com os mesmos epítopos de célula T as-sociados a melanoma usados na estimulação primária e provêem um reforçopara as células T em proliferação. Finalmente, uma etapa de expansão não-específica única com OKT3, células nutridoras autólogas e IL-2 de baixa do-se mantém a mesma porcentagem de células T específicas de antígeno re-gistrada no final da segunda etapa de reestimulação, enquanto aumentandoo número total de células T -25 vezes.Tabela I: Purificação de Células CD8+ Através de Seleção Positiva e Ana-lisada Através de Citometria de Fluxo (dados representam sumário de totalde 28 pacientes)

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Este protocolo de estimulação de célula T CD8+ de xAPC ex vivoresultou em CTLs com Iise de célula de tumor potente, alta avidez para ocomplexo peptídeo/MHC e especificidade de antígeno conforme avaliadoatravés da enumeração com moléculas tetraméricas específicas de peptí-deo, liberação de interferon-gama em resposta a estímulos antigênicos es-pecíficos e Iise de tumor específica.

Avaliação de Terapia de CTL em Melanoma Metastático Maligno de EstudosAnteriores

Dois testes de fase I e um teste de fase Il foram conduzidos, osquais envolviam um total de 55 indivíduos com melanoma de Estágio Ill ouEstágio IV. O estudo 1,"Autologous Cytotoxic T Lymphocytes (CD8+) Serial-ly Cultured Ex Vivo with Drosophila Antigen Presenting Cells, lnterleukin-2,lnterleukin-7, then Adherent Monocytes, and Tyrosinase Peptide", era umestudo aberto em 10 pacientes com melanoma de Estágio IV. Os pontos fi-nais clínicos foram: 1) segurança e tolerabilidade de CTLs autólogos rein-fundidos após imunização in vitro; 2) determinação da cinética dos CTLs in-fundidos na circulação sistêmica através de análise de diluição limitante; 3)disposição de corpo integral de CTLs marcados com 111 índio através de ra-diocintigrafia; 4) composição celular de nódulos que sofreram biópsia atravésde análise imunoistoquímica (CTLs, TH, NK, células B) e 5) regressão delesões que podem ser medidas e duração de resposta durante dois meses.22No Estudo 2, "Pilot Study of Subcutaneous Interferon-Alpha withInfusion of Drosophila Cell Stimulated Autologous CD8+ Lymphocytes for theTreatment of Advanced Melanoma", um total de 15 pacientes de melanomade Estágio lll/IV foi infundido com células T CD8+ autólogas em terapia demanutenção antecedente com IFNa-2b. Terapia de CTL foi avaliada atravésde: 1) monitoramento da segurança e tolerância dos CTLs reinfundidos; 2)composição celular de nódulos que sofreram biópsia; 3) regressão de lesõesque podem ser medidas e 4) duração de resposta durante três meses. Indi-víduos que tinham doença estável ou demonstraram uma resposta clínica naavaliação de acompanhamento (quatro semanas após a primeira infusão)receberam um segundo ciclo de tratamento. Oito (8) dos quinze (15) indiví-duos sofreram um segundo ciclo de terapia de CTL, quatro (4) indivíduosentraram em um terceiro ciclo e um (1) indivíduo foi tratado com quatro ci-clos de terapia de célula T.23

No estudo 3, "Randomized Phase Il Trial of Subcutaneous Inter-feron-oc-2b (IFN) and lnterleukin-2 (IL-2) with or without Infusion of DrosophilaCell-Stimulated Autologous CD8 Lymphocytes for the Treatment of AdvancedMelanoma", um total de 30 pacientes com melanoma de Estágio lll/IV foitratado com citocinas sozinhas (IFNoc e IL-2) ou citocinas mais células T. Elefoi um estudo aleatorizado onde pacientes entraram no braço apenas de ci-tocina (Braço A) ou braço de citocinas mais células T (Braço B). Os pacien-tes que entraram e continuaram no Braço A receberam uma oportunidade depassar para o braço de citocinas mais célula T (Braço C). O ponto final pri-mário deste estudo foi comparar o tempo de progressão (TTP) de doençaentre os dois grupos (Braço A versus Braço B). Significância estatística foiatingida em TTP em pacientes que entraram no Braço B versus aqueles queentraram no Braço A (Figura 11). Em pacientes que passaram do Braço Apara o Braço C, significância estatística em TTP foi também detectada empacientes recebendo células T. Segurança e tolerabilidade de IFNa e IL-2nas doses e no programa prescritos foram também monitoradas.24Argumento para Usar lnterferon-a-2b (IFN-a-2b)

Interferon-alfa (IFN-α) tem um espectro amplo de efeitos imuno-moduladores e antiproliferativos em uma variedade de males. Acredita-seque um mecanismo de ação de IFN-α seja a supra-regulação de expressãode antígeno de tumor em células de melanoma. Ele tem a habilidade emaumentar a expressão de moléculas imunologicamente importantes sobre asuperfície do tumor. Essas incluem antígenos de MHC, moléculas acessório,bem como antígenos associados a tumor.25"27 Esses efeitos imunomodulado-res podem melhorar a atividade do sistema imune, incluindo ambos os anti-corpos e linfócitos, para reconhecer e atacar células de tumor in vivo. Imuno-terapia específica, ativa, demonstrou respostas clínicas significantes no tra-tamento de melanoma disseminado. Os resultados de estudos de funçãoimune discutidos acima demonstraram que tratamento de vacina para mela-noma aumenta a freqüência de CTLs antimelanoma. Acredita-se que essasduas modalidades de imunoterapia possam agir sinergisticamente. Um cursode cinco (5) dias de IFN-α (10MU/m2; subcutaneamente) foi incluído no Es-tudo 2, e os resultados de fingimentos de IHC de tecido demonstraram que omomento e a dose eram suficientes para supra-regular expressão de antíge-no associado com ambos classe I e melanoma em amostras de biópsia seri-ais obtidas de um único paciente nos tempos destinados especificados. Omesmo curso de 5 dias em estudo clínico foi incluído no Estudo 3.

Argumento para Uso de lnterleucina-2

Interleucina-2 (IL-2) recombinante humana é uma Iinfocina pro-duzida através de tecnologia de DNA recombinante que foi mostrada exibiruma variedade de atividades biológicas. IL-2 estimula o sistema imune e e-xerce seus efeitos biológicos seguindo ligação a receptores específicos so-bre a superfície de células-alvo. In vitro, ela foi mostrada aumentar prolifera-ção de célula T e citotoxidez de linfócito, induzir a atividade assassina deambas as células assassinas ativadas por Iifocina e naturais e induzir produ-ção de interferon-gama. Administração de IL-2 de alta dose a 283 pacientesproduziu uma taxa de remissão de 7% com 9 respostas completas e os pa-cientes permaneceram livres de doença de 9 a mais de 91 meses.28 EmboraIL-2 de alta dose parecesse ser mais eficaz do que infusões contínuas debaixa dose, altas doses de IL-2 são também mais tóxicas. Os efeitos colate-rais mais comuns foram sintomas tipo gripe. Os efeitos colaterais mais seve-ros foram hipotensão, síndrome de vazamento capilar e perfusão de órgãoreduzida. Administração subcutânea de IL-2 de baixa dose (em 3MIU/dia χ28 dias) foi usada em parte do Estudo 3, para aumentar e manter o nível decélulas T autólogas adotivamente transferidas. Ela foi adicionada após umcurso curto de IFN-α e imediatamente seguindo a infusão de CTL para au-mentar a mitogênese de linfócito, citotoxidez de linfócito e produção de inter-feron-gama em um esforço em manter as células T específicas de antígenoin vivo.

Transferência Adotiva de Linfócitos Seguindo um Regime de QuimioterapiaImunossupressor Não-Mieloablativo

Estudos em camundongo demonstraram que indução de imu-nossupressão com quimioterapia antes da administração de células T foiessencial para permitir a transferência adotiva de linfócitos para mediar re-gressão de tumor máxima.29,30 Com base nesses estudos, protocolos clíni-cos foram iniciados para tratar pacientes com a transferência adotiva de lin-fócitos seguindo a aplicação de um regime quimioterapêutico não-mieloablativo.16,31 Regimes preparativos não-mieloablativos têm sido usadospara tratar pacientes recebendo transplantes de medula óssea alogenéicos,e esses regimes parecem idealmente adequados para induzir a imunossu-pressão transiente que pode aumentar o efeito de linfócitos T adotivamentetransferidos. Um regime de ciclofosfamida e fludarabina originalmente usadoem pacientes com câncer de célula renal recebendo alotransplantes compa-tíveis com HLA32 foi recentemente usado em pacientes com melanoma me-tastático16,31. O argumento para a incorporação de um regime de Iinfodeple-ção antes da transferência adotiva de células T foi possivelmente destruircélulas reguladoras, romper a regulagem homeostática de célula T ("criandoespaço") e anular outros mecanismos tolerogênicos normais que potencial-mente pudessem aumentar o enxerto das células T transferidas. Nenhumamortalidade relacionada a tratamento foi observada, e então quimioterapianão-mieoablativa em combinação com linfócitos antitumor mais IL-2 de altadose deve ser segura. A não-mieloablação foi induzida com fludarabina (25mg/m2) e ciclofosfamida (60 mg/kg) e foi seguida por uma infusão de linfócitoe IL-2 de alta dose (720.000 lU/kg).

A combinação de agentes quimioterapêuticos ciclofosfamida efludarabina, embora não completamente mieloablativa, foi demonstrada sermielossupressora, afetando neutrófilos, linfócitos, plaquetas e células san-güíneas vermelhas. Níveis de neutrófilo, que caíram para um ponto maisbaixo no dia 10 seguindo o início da quimioterapia, foram registrados em6/mm3 e recuperados para cerca de 500/mm3 no dia 14 com apoio de filgras-tim (G-CSF). Os níveis de linfócito tinham um ponto mais baixo de 6/mm3 erecuperaram para cerca de 200/mm3 durante o mesmo período de tempo.Pacientes geralmente mostraram contagens de neutrófilo acima de 500/mm3e contagens de plaqueta acima de 20.000/mm3, 2-3 semanas após o inícioda quimioterapia. Quaisquer pacientes necessitaram de uma transfusão decélula tronco para recuperar função da medula, e então o tratamento no ge-ral parece ser seguro. No entanto, contagens de CD4 permaneceram persis-tentemente baixas (a contagem de CD4 média em aproximadamente dia 200foi 156/mm3, com uma faixa entre 46/mm3 e 320/mm3, que é um efeito cola-teral conhecido de imunossupressão induzida com fludarabina. O desenvol-vimento de infecções oportunísticas aconteceu (isto é, erupção de herpesζοείθή, que melhorou seguindo o término de tratamento.

Cladribina (2-CdA, Leustatin®), um análogo de purina similar àfludarabina, é aprovada para uso no tratamento de leucemia de célula pilosae foi avaliada também em pacientes com esclerose múltipla (MS) em umesforço de reduzir linfócitos T auto-reativos. Em pacientes com MS uma di-minuição específica em subconjuntos de célula T foi correlacionada com do-ses diferentes de cladribina.33"35 Ela tem um perfil de toxidez muito favorávelcom relação a outros fármacos linfocitolíticos, enquanto induzindo uma Iinfo-penia de longa duração. Níveis de linfócito caem imediatamente após a pri-meira infusão de cladribina, atingem um ponto mais baixo em 5 meses ecomeçam a se recuperar em 6 meses quando administrada por 4 cursosmensais.33,34 Linfopenia foi observada em todos os pacientes, e complica-ções de infecção não foram um problema sério. O fármaco pode ser dadopela via subcutânea conveniente sem causar irritação local e com resultadosfarmacocinéticos e terapêuticos que parecem totalmente equivalentes à via IV.36,37

Um estudo recente em seres humanos identificando células Treguladoras (Treg) como imunossupressores em um ambiente de vacina de-monstrou uma resposta imune antitumor aumentada seguindo depleção dosubconjunto Treg que mostra um fenótipo CD4+/CD25+hl junto com CD28,CTLA-4 e GITR.38 Este subconjunto de célula T pode ser seletivamente de-pletado (aproximadamente 3 semanas) seguindo uma dose única de deni-Ieucina diftitix (DAB389IL-2, ONTAK®). Quatro dias seguindo a dose única,37-77% de depleção de células Treg foram notados em oito (8) pacientescom carcinoma de célula renal. Seguindo a depleção de célula T, uma vaci-na RNA-DC foi administrada e um aumento de 10 vezes na resposta imunepara os antígenos de vacina foi notada nos pacientes recebendo ambosDAB IL-2 e vacina versus vacina sozinha. Então, a mesma dose (18 Mg/kg)seis dias antes de uma transferência adotiva dos CTLs específicos de antí-geno é uma dose preferida para uso em regimes de acordo com a invenção.

Seleção de Paciente

Indivíduos para o estudo são pacientes humanos diagnosticadoscom melanoma metastático que são positivos para HLA-A2. Um anticorpomonoclonal (BB7.2) é usado para analisar amostras de PBMC através deanálise FACS e análise adicional é realizada usando o teste de PCR OlerupSSP® (GenoVision) para determinar o subtipo HLA-A*0201.

Esquema de Tratamento

A Figura 2 mostra os regimes de tratamento descritos em maisdetalhes abaixo. Os pacientes são divididos em três grupos de indivíduos,com 10 em cada grupo. No regime do Grupo A, um controle para o regimede linfodepleção, CTLs mais citocinas são administrados. No regime do Gru-po B, que é uma modalidade preferida da invenção, pacientes recebem cla-dribina (dias 0-4) mais CTLs (dia 36) mais citocinas. No regime do Grupo B,que é uma outra modalidade preferida da invenção, pacientes recebem DABIL-2 (dia 30) mais CTLs (dia 36) mais citocinas. Os regimes experimentaissão descritos em mais detalhes abaixo.

CTLs Específicos para Antíqenos Associados a Melanoma

Terapia de linfócito T citotóxico para melanoma maligno utilizacélulas T CD8+ ativadas in vitro autólogas para destruir células de melanomacarregando epítopos antigênicos associados a melanoma. CTLs são prepa-rados a partir de amostras de Ieucaferese geradas no sítio clínico e transfe-ridos para uma instalação onde CTLs são gerados sob orientações de GMPe retornados para infusão.

No dia O, pacientes com melanoma metastático sofrem Ieucafe-rese (administração de aproximadamente 10-15 litros, dependendo do pesoe condição do paciente). As células obtidas são transportadas da noite parao dia em temperatura ambiente para processamento em uma instalação defabricação GMP. Em momentos apropriados, Ieucaferese é realizada para seobter linfócitos de sangue periférico para análise. Essas amostras são usa-das para monitorar a presença de células T específicas de antígeno e a pre-sença de células de tumor de melanoma em circulação. O procedimento deIeucaferese de monitoramento processa aproximadamente 5 litros de san-gue periférico (ou um terço do volume coletado na Ieucaferese inicial para seobter células CD8 para infusão subseqüente) no sítio clínico e é transportadopara a instalação de fabricação GMP. Um ensaio PCR é usado para deter-minar uma diminuição no nível de células de melanoma em circulação se-guindo terapia. A detecção de células de melanoma em circulação pode sermedida através de um ensaio PCR de tempo real quantitativo, sensível.39'41

A presença de células T específicas de antígeno é avaliada com tetrâmerosespecíficos de peptídeo/HLA-A2.

A preparação de CTL final para infusão contém 1 χ 1010 CTLsautólogos em 300 mL, contidos em 76% (v/v) de Solução de Ringer Lactada,4% (v/v) de D5NS e 20% (v/v) de albumina de soro humano (HSA) a 25%. Oproduto de CTL é preparado em uma bolsa estéril, adequada para infusão,mantido em gelo e infundido durante 30 minutos, dentro de quarenta e duas(42) horas de preparação.

Antes da infusão, os CTLs são monitorados quanto à atividadelítica (lise de ambas as células direcionadas carregadas com peptídeo e cé-lula de tumor melanoma), viabilidade e pureza através de análise FACS. Aausência de ambos os DNA de célula de Drosophila e RNA viral de inseto échecada com ensaios de PCR de tempo real, quantitativa sensível. Esterili-dade é determinada através de análise BacT/Aler®, teste de micoplasma eanálise de tingimento Gram.

Pacientes recebem uma infusão de CTL de aproximadamente1010 células autólogas, que foram estimuladas e expandidas ex vivo para setornarem linfócitos T citotóxicos capazes de direcionamento a células in vivoexpressando os antígenos aos quais os CTLs são direcionados. As célulassão infundidas após o final do tratamento de IFN-alfa e imediatamente pre-cedem o início do regime de IL-2.

Citocinas

lnterleucina-2 (IL-2) é obtida da Chiron Corporation (Emeryville,CA). Ela é fornecida como frascos de uso único contendo 22 milhões UV(-1,3 mg) de IL-2 como uma torta Iiofilizada branca a esbranquiçada, estéril,mais 50 mg de manitol e 0,18 mg de dodecil sulfato de sódio, tamponadacom aproximadamente 0,17 mg de fosfato de sódio monobásico e 0,89 mgde dibásico para um pH de 7,5 (faixa 7,2 a 7,8). O pó é reconstituído com 1,2mL de Água Estéril para Injeção, USP, e a concentração resultante é 18 mi-lhões lU/ml ou 1,1 mg/mL. Frascos intactos são armazenados no refrigera-dor (2S-8°C) e protegidos da luz. IL-2 reconstituída é diluída com 2,4 mL deágua a 5%. A concentração final (6MU/mL), uma vez puxada para seringasplásticas, é boa por 14 dias após a reconstituição, se mantida refrigerada a2-8°C. A diluição final de IL-2 é auto-administrada em uma base de pacienteexterno subcutaneamente em uma dose de 3 unidades de milhão (3MIU),iniciando imediatamente seguindo a infusão de CTL e diariamente até pro-gressão da doença.

INTRON-A® é obtido da Schering-Plough Corporation (Kenilwor-th, NJ). Este produto de IFN-alfa-2b é fornecido ou como um pó Iiofilizado ouuma solução para injeção em frascos de 5 ml estéreis. Um frasco contémaproximadamente 3 χ 106 U ou 18 χ 106 U de IFN. O pó Iiofilizado é reconsti-tuído de preferência um pouco antes do uso, como não há nenhum agentebacteriostático incluído; pó liofilizado, sem uso, é armazenado em um refri-gerador ou freezer (-4°C a -20°C). Quando o agente é fornecido como umasolução injetável, ele é armazenado no refrigerador (2-8°C ou 369-46Q F). Adiluição final de IFN-_ é auto-administrada em uma base de paciente externoa 10 UM/m2 nos dias 31-35 como uma injeção subcutânea.DABgggI L-2

DAB389|L-2 (denileucina diftitox, ONTAK®) é uma proteína citotó-xica derivada de DNA recombinante composta das seqüências de aminoáci-do para fragmentos da toxina da difteria AeB seguidas pelas seqüênciaspara interleucina 2 que é expressa em E. coli. Ela é um fármaco direcionado,que se liga a células expressando CD25 (IL-2R) em sua superfície. Ela inte-rage com o receptor de IL-2 de alta afinidade sobre a superfície de células Treguladoras malignas ou normais (Treg) para inibir síntese de proteína intra-celular, rapidamente levando à morte celular. DAB389lL-2 é fornecida emfrascos de uso único como uma solução congelada, estéril, pretendida paraadministração intravenosa (IV). Cada frasco de 2 mL de ONTAK contém 300mcg de DAB-IL2 recombinante em uma solução estéril de ácido cítrico (20nM), EDTA (0,05 mM) e polissorbato 20 (<1%) em água para injeção, USP.A solução tem um pH de 6,9-7,2. Frascos intactos são armazenados conge-lados ou -10°C, mas não congelados novamente. O material é trazido para atemperatura ambiente (25°C ou 77s F) antes da preparação da dose des-congelando em um refrigerador por não mais do que 24 horas ou em tempe-ratura ambiente por 1-2 horas, e diluído com NS para uma concentração de>15 mcg/mL. DAB389lL-2 é administrada através de injeção intravenosa, depreferência através de infusão durante pelo menos 15 minutos. Pacientesdesignados para o Grupo C recebem uma injeção subcutânea única de DABIL-2 no dia 30, que é um dia antes do início de IFN-α e seis dias antes dainjeção dos CTLs. A dose é 10 pg/kg.

Cladribina

Leustatina® (2-cloro-2'-desoxi-p-D-adenosina) é um agente anti-neoplástico sintético. Ela é um análogo de nucleosídeo de purina resistenteà ação de adenosina desaminase, que resulta em Iinfocitotoxidez preferenci-al. Em células com uma razão alta de desoxicitidina cinase para desoxinu-cleotidase (por exemplo, linfócitos e monócitos), cladribina é fosforilada nodesoxinucleotídeo trifosfato, 2-CdATP, que acumula, causando um rompi-mento de metabolismo celular, dano de DNA e subseqüente morte celular. Ofármaco é uma solução isotônica transparente, incolor, estéril, livre de con-servante, fornecida em frascos de uso único contendo 10 mg (1 mg/mL) decladribina. Cada mL de cladribina contém 1 mg do ingrediente ativo e 9 mg(0,15 mEq) de cloreto de sódio como um ingrediente da invenção. A soluçãotem uma faixa de pH de 5,5 a 8,0. Ácido fosfórico e/ou fosfato de sódio dibá-sico pode ser adicionado para ajustar o pH para 6,3 ± 0,3. Frascos intactossão armazenados refrigerados (2-8°C). A dose de cladribina para o Grupo Bé 0,12 mg/kg/dia por um total de 5 dias, fracionada em 3-4 sítios onde ummáximo de 3,0 cm3 é administrado em um único sítio. A dose de cladribinatotal é 0,6 mg/kg. (Cladribina, administrada subcutaneamente neste mesmoprograma (5 dias consecutivos) e em uma dose de 0,14 mg/kg/dia (dose to-tal = 0,7 mg/kg) foi relatada ser segura em pacientes com leucemia de célulapilosa.37 Adicionalmente, a cladribina administrada neste programa e nestadose a sessenta pacientes produziu aproximadamente 70% de linfodepleçãoapós um ciclo único com mielossupressão clinicamente segura. Como umresultado de uma mudança em padronização, Leustatina foi verificada ser12% maior do que relatado em estudos clínicos anteriores comparado comum estoque de cladribina sintetizado em laboratório. A dose que foi relatadaser 0,1 mg/kg é agora estimada realmente ser apenas 0,087 mg/kg.33 Comrelação à segurança de administração subcutânea com a formulação Leusta-tina® fracionada em 2-3 sítios, um estudo em pacientes com esclerose múlti-pla recorrente-remitente usou 0,07 mg/kg/dia X 5 dias, mensalmente por 6meses para uma dose cumulativa total de 2,1 mg/kg.36 Um total de 27 paci-entes aleatorizados para o braço de fármaco de tratamento. Infecções foramlimitadas a um episódio de herpes zoster segmentai leve que aconteceu emdois pacientes tratados com cladribina e em um paciente recebendo place-bo. Não houve casos individuais de trombocitopenia significante, anemiagranulocitopenia ou supressão de medula óssea generalizada).Cuidado de Apoio Opcional

Pacientes podem receber qualquer um dos que seguem paraanular toxidez de IFN-alfa e IL-2 durante tratamento e em seguida: aeetami-nofeno (650 mg PO q4h prn), difenil hidramina (50 mg IM ou PO q4h prn),indometacina (25 mg PO TID ou 75 mg SR qd), proclorperazina (10 mg IV ouPO q4h prn náusea), Zantac® (150 mg BID gastrite). Outros agentes antiin-flamatórios e antieméticos não especificamente prescritos podem substituirqualquer um dos fármacos de apoio acima.

Embora a invenção tenha sido descrita em detalhes acima comreferência a exemplos ilustrativos e modalidades preferidas, o versado vaicompreender que o escopo da invenção é definido na apenas pela descriçãoacima, mas pelas reivindicações apensas conforme apropriadamente cons-truídas sob princípios de lei de patente.

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Claims (7)

1. Método para tratamento de um indivíduo com necessidade detratamento para câncer compreendendo:(a) obtenção de células T CD8+ puras do indivíduo;(b) contato das células T CD8+ puras com células apresentandoantígeno xenogênicas carregadas com um ou mais antígenos de peptídeo,deste modo gerando CTLs ativados que se direcionam a células expressan-do o dito um ou mais antígenos de peptídeo;(c) administração ao indivíduo dos CTLs ativados;(d) administração ao indivíduo de pelo menos duas citocinas querealizam persistência de CTL; e(e) administração ao indivíduo de um agente de linfodepleçãoselecionado do grupo consistindo em cladribina e denileucina diftitox.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que as ditas pelomenos duas citocinas compreendem interferon-oc-2b e interleucina-2.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o dito um oumais antígenos de peptídeo compreende uma seqüência de aminoácido de-rivada de uma proteína selecionada de gp100, tirocinase e MART-1.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito um oumais antígenos de peptídeo consiste em antígenos de peptídeo derivados deproteínas gp100, tirocinase e MART-1 humanas.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que cada umdos ditos um ou mais antígenos de peptídeo é selecionado do grupo consis-tindo em YMNGTMSQV (SEQ ID NO:1), YMDGTMSQV (SEQ ID NO:2),AAGIGILTV (SEQ ID NO:3), ITDQVPFSV (SEQ ID NO:4), YLEPGPVTA(SEQ ID NO:5) e KTWGQYWQV (SEQ ID NO:6).

6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o dito cân-cer é um melanoma.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a adminis-tração do agente de linfodepleção começa antes da administração dos CTLsativados.