BRPI0708503A2

BRPI0708503A2 - regulação das respostas imune por modulação da função do antìgeno presente em células

Info

Publication number: BRPI0708503A2
Application number: BRPI0708503-6A
Authority: BR
Inventors: Barbara Jane Johnson; Caroline Amanda Dobbin; Inge E A Flesch
Original assignee: Cbio Ltd
Priority date: 2006-03-02
Filing date: 2007-03-01
Publication date: 2011-05-31
Also published as: RU2008139299A; EP2007409A4; US8796225B2; MX2008011167A; CA2644058C; WO2007098557A1; US20100256059A1; KR20090003310A; CA2644058A1; JP2009528297A; NZ571696A; AU2007219733A1; CN101443032A; EP2007409A1; WO2007098557A8

Abstract

REGULAçãO DAS RESPOSTAS IMUNE POR MODULAçãO DA FUNçãO DO ANTIGENO PRESENTE EM CéLULAS A presente invenção refere-se ao uso de chaperonina 10 para modular a função de células apresentando antígeno. Mais particularmente a invenção reside na modulação de expressão em superfície de célula de moléculas de MHC tal como HLA.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "REGULA-ÇÃO DAS RESPOSTAS IMUNE POR MODULAÇÃO DA FUNÇÃO DOANTÍGENO PRESENTE EM CÉLULAS".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se genericamente à regulação derespostas imunes através de modulação da função de células apresentandoantígeno (APCs). Em particular, a presente invenção refere-se ao uso dechaperonina 10 na modulação de função de APC tal como expressão de su-perfície de célula de principais moléculas de complexo de histocompatibili-dade (MHC), por exemplo, HLA, e a métodos associados, usos e composi-ções para o tratamento de doenças, e a métodos para seleção de modulado-res de função de APC.

Antecedentes da Invenção

Um componente central de sistemas de defesa de hospedeiroscontra patógenos virais e bacterianos invasores envolve o reconhecimentobem-sucedido do patógeno, ou seus componentes, através de receptorescelulares que induzem uma cascata sinalizante resultando em estimulaçãodo sistema imune. Um aspecto essencial deste sistema é o reconhecimentode célula T de principais complexos de complexo de histocompatibilidadeprincipal-(MHC)-peptídeo.

Células T CD4+ são capazes de reconhecer peptídeos derivadosde patógenos quando tais peptídeos são mostrados no contexto de molécu-las classe II MHC, que são compostas por uma cadeia a- e β- originalmentemontada no retículo endoplásmico. Estas cadeias a- e β- associam com acadeia invariante (li) que protege a ranhura de ligação de peptídeo e facilitatrânsito de moléculas classe II MHC para compartimentos endossomais. Noscompartimentos endossomais, II é limpa, deixando um peptídeo (CLIP) naranhura de ligação. A molécula chaperona HLA-DM facilita substituição deCLIP por peptídeos antigênicos. Moléculas classe II MHC maduras carrega-das com peptídeo antigênico então migram para a superfície de célula ondeelas podem ser apresentadas a células T CD4+.

Este sistema de processamento de antígeno e apresentação demoléculas classe Il MHC maduras ocorre em células dendríticas (DC), quesão as únicas APCs que podem estimular células T simples e induzirem umaresposta imune primária. Assim, DC desempenha um papel central em apre-sentação de antígeno e a indução de imunidade adaptativa. A capacidade deDC induzir uma resposta imune é dependente de seu estado de maturação.

É pensado que DC imatura expressando baixos níveis de MHC e moléculasco-estimuladoras de célula T tais como CD40, CD80, CD83 e CD86 sobre asuperfície de célula captura antígenos na periferia. Elas então migram paratecidos linfóides secundários e sofrem um método de maturação. Com matu-ração, molécula MHC são redistribuídas a partir de compartimentos intrace-lulares para a superfície de célula o que resulta em uma aumentada capaci-dade para apresentar antígenos. Concomitantemente, a expressão em su-perfície de moléculas co-estimuladoras que promovem ativação de célula Té regulada ascendentemente. O perfil de citocina secretada por DC é tam-bém dependente de seu estágio de maturação. Citocinas produzidas por DCmadura incluem IL-12, IL-1 α/β, IL-18, IFN-α/β, IL-6, TNF-α, IL-10, e TGF-β.

O perfil de citocina de DC finalmente determina o resuItado-Th 1/Th2 da res-posta imune. Ou seja, antígenos que induzem secreção de IL-12 por DC in-duzem diferenciação Th 1 enquanto antígenos que não induzem produção deIL12 promovem diferenciação Th2.

Muitos dos métodos reguladores envolvidos em maturação deDC permanecem desconhecidos. Em particular, muitos dos caminhos sinali-zantes moleculares que são envolvidos quando moléculas classe Il MHCsofrem mudanças em localização a partir de estruturas endossomais em DCimatura para a membrana de plasma em DC madura permanecem incertos.

Chaperonina 10 (CpnIO) é uma chaperona mitocondrial altamen-te conservada desempenhando um papel essencial em dobra de proteína.CpnIO também foi mostrada estar envolvida em um número de atividadesimuno moduladoras, por exemplo, inibição de ativação de fator-κΒ (NF-κΒ) eprodução de citocinas pró-inflamatórias, ambos, in vitro e in vivo. A presenteinvenção é baseada na surpreendente e inesperada verificação de queCpnIO tem a capacidade de modular função de APC1 incluindo redistribuiçãode moléculas MHC a partir de compartimentos intracelulares para a superfí-cie de célula em DC1 e ativação mediada por APC de células T.Sumário da Invenção

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, éprovido um método para modulação de uma resposta imune em um sujeitoou em pelo menos uma célula da mesma, tecido ou órgão, através de modu-lação de nível de expressão em superfície de célula de pelo menos uma mo-lécula MHC, onde o dito método compreende administração de uma quanti-dade efetiva de chaperonina 10.

O método ainda pode compreender modulação de uma respostaj imune em um sujeito ou em pelo menos uma célula da mesma, tecido ouórgão, através de modulação de nível de expressão em superfície de célulade pelo menos uma outra molécula de superfície de célula, compreendendoadministração de uma quantidade efetiva de chaperonina 10.

A molécula MHC pode ser uma molécula Ciasse I MHC, umamolécula Clsse Il MHC, ou uma molécula MHC não-clássica. A moléculaClasse Il MHC pode ser HLA. O HLA pode ser HLA-DR, HLA-DP, ou HLA-DQ.

A expressão em superfície de célula pode ser aquela de umacélula apresentando antígeno. A célula apresentando antígeno pode ser se-lecionada do grupo compreendendo um macrófago, célula dendrítica oucélula B.

A chaperonina 10 pode ser uma chaperonina 10 derivada natu-ralmente, produzida recombinantemente ou produzida sinteticamente.

A chaperonina 10 pode ser de origem eucariótica. A chaperonina 10 pode serde origem mamífera. A chaperonina 10 pode ser chaperonina 10 humana.

A chaperonina 10 pode compreender a seqüência de polipeptí-deo como mostrada em SEQ ID Ng: 1, SEQ ID N5: 2 ou SEQ ID N9: 3.

A chaperonina 10 pode ser acetilada ou não-acetilada.

A chaperonina 10 pode ser administrada na forma de um polinu-cleotídeo codificando chaperonina 10. O polinucleotídeo codificando chape-ronina 10 pode estar localizado em uma construção genética, ligada opera-velmente a um promotor. O polinucleotídeo pode compreender a seqüênciamostrada em SEQ ID N9: 4.

De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, éprovido um método para tratamento ou prevenção de uma doença ou condi-ção em um sujeito através de modulação de nível de expressão em superfí-cie de célula de pelo menos uma molécula MHC1 onde o dito método com-preende administração ao sujeito de uma quantidade efetiva de chaperonina 10.

O método ainda pode compreender tratamento ou prevenção deuma doença ou condição em um sujeito através de modulação de nível deexpressão em superfície de célula de pelo menos uma outra molécula desuperfície de célula, compreendendo administração de uma quantidade efe-tiva de chaperonina 10.

A molécula MHC pode ser uma molécula Classe I MHC, umamolécula Classe Ii MHC, ou uma molécula MHC não-ciássica. A molécuiaclasse Il MHC pode ser HLA. O HLA pode ser HLA-DR, HLA-DP ou HLA-DQ.

A expressão em superfície de célula pode ser aquela de umacélula apresentando antígeno. A célula apresentando antígeno pode ser se-lecionada do grupo compreendendo um macrófago, célula dendrítica ou cé-lula B.

A doença ou condição pode resultar de, ou de outro modo serassociada com, infecção do sujeito por um patógeno viral ou bacteriano.

A doença ou condição pode ser câncer, um distúrbio autoimune, inflamação,alergia, asma ou doença infecciosa.

A chaperonina 10 pode ser de origem eucariótica. A chaperonina 10 podeser chaperonina 10 humana.

A chaperonina 10 pode compreender a seqüência de polipeptí-deos como mostrada em SEQ ID N9: 1, SEQ ID N9: 2 ou SEQ ID N9: 3.

A chaperonina 10 pode ser acetilada ou não-acetilada.A chaperonina 10 pode ser administrada na forma de um polinu-cleotídeo codificando chaperonina 10. O polinucleotídeo codificando chape-ronina 10 pode estar localizado em uma construção genética, ligada opera-velmente a um promotor. O polinucleotídeo pode compreender a seqüênciacomo mostrada em SEQ ID Ne: 4.

De acordo com um terceiro aspecto da presente invenção, éprovido um método para modulação de nível de expressão em superfície decélula de pelo menos uma molécula MHC em um sujeito, ou em pelo menosuma célula da mesma, tecido ou órgão, onde o dito método compreendeadministração de uma quantidade efetiva de chaperonina 10.

O método ainda pode compreender modulação de nível de ex-pressão em superfície de célula de pelo menos uma outra molécula de su-perfície de célula em um sujeito, ou em pelo menos uma célula da mesma,tecido ou órgão, compreendendo administração de uma quantidade efetivade chaperonina 10.

A molécula MHC pode ser uma molécula Classe I MHC, uma mo-lécula Classe II MHC, ou uma molécula MHC não-clássica. A molécula ClasseII MHC pode ser HLA. O HLA pode ser HLA-DR, HLA-DP, ou HLA-DQ.

De acordo com um quarto aspecto da presente invenção, é pro-vido um método para modulação de função de uma célula apresentando an-tígeno em um sujeito, ou em pelo menos um seu tecido ou órgão, onde odito método compreende administração de uma quantidade efetiva de cha-peronina 10.

A célula apresentando antígeno pode ser selecionada do grupocompreendendo um macrófago, célula dendrítica ou célula B.

A função pode ser selecionada do grupo compreendendo migra-ção para um nódulo linfático, ativação de célula T ou proliferação de célula T.De acordo com um quinto aspecto da presente invenção, é pro-vida uma composição quando usada para o tratamento ou prevenção deuma doença ou condição, onde a dita composição compreende chaperoninajunto com pelo menosum carreador, diluente ou adjuvante farmaceutica-'5 mente aceitável, e onde a chaperonina 10 modula o nível de expressão emsuperfície de célula de pelo menos uma molécula MHC.

A chaperonina 10 ainda pode modular o nível de expressão emsuperfície de célula de pelo menos uma outra molécula de superfície decélula.

A molécula MHC pode ser uma molécula Classe I MHC, uma mo-lécula Classe Il MHC, ou uma molécula MHC não-clássica. A molécula Classe11 MHC pode ser HLA. O HLA pode ser HLA-DR, HLA-DP, ou HLA-DQ.

A expressão em superfície de célula pode ser aquela de umacélula apresentando antígeno. A célula apresentando antígeno pode ser se-iecionada do grupo compreendendo um macrófago, célula dendrítica oucélula B.

De acordo com um sexto aspecto da presente invenção, é provi-da uma composição quando usada para o tratamento ou prevenção de umadoença ou condição, onde a dita composição compreende chaperonina 10junto com pelo menos um carreador, diluente ou adjuvante farmaceutica-mente aceitável, e onde a chaperonina 10 modula a função de uma célulaapresentando antígeno em um sujeito, ou em pelo menos um seu tecido ouórgão.

A célula apresentando antígeno pode ser selecionada do grupocompreendendo um macrófago, célula dendrítica ou célula Β. A função podeser selecionada do grupo compreendendo migração para um nódulo linfáti-co, ativação de célula T ou proliferação de célula T.

De acordo com um sétimo aspecto da presente invenção, é pro-vido o uso de chaperonina 10 para a fabricação de um medicamento para otratamento ou prevenção de uma doença ou condição, onde a chaperonina10 modula o nível de expressão em superfície de célula de pelo menos umamolécula MHC.A chaperonina 10 ainda pode modular o nível de expressão emsuperfície de célula de pelo menos uma outra molécula de superfície de cé-lula.

A molécula de MHC pode ser uma molécula Classe I MHC, umamolécula Classe Il MHC, ou uma molécula MHC não-clássica. A moléculaClasse Il MHC pode ser HLA. O HLA pode ser HLA-DR, HLA-DP ou HLA-DQ.

A expressão em superfície de célula pode ser aquela de umacélula apresentando antígeno. A célula apresentando antígeno pode ser se-lecionada do grupo compreendendo um macrófago, célula dendrítica ou célula B.

De acordo com um oitavo aspecto da presente invenção, é pro-vido o uso de chaperonina 10 para a fabricação de um medicamento para otratamento ou prevenção de uma doença ou condição, onde a chaperonina10 moduia a função de uma célula apresentando antígeno em um sujeito, ouem pelo menos um seu tecido ou órgão.

A função pode ser selecionada do grupo compreendendo migra-ção para um nódulo linfático, ativação de célula T, ou proliferação de célula T.

De acordo com um nono aspecto da presente invenção, é provi-do um método para modulação de produção, localização dentro de uma cé-lula e/ou expressão em superfície de célula de um ou mais imuno - modula-dores em um sujeito, ou pelo menos uma célula da mesma, tecido ou órgão,onde o dito método compreende administração de uma quantidade efetivade chaperonina 10, e onde a chaperonina 10 modula o nível de expressãoem superfície de célula de pelo menos uma molécula MHC ou pelo menosuma outra molécula de superfície de célula.

A molécula MHC pode ser uma molécula Classe I MHC, uma mo-lécula Classe Il MHC, ou uma molécula MHC não-clássica. A molécula ClasseIl MHC pode ser HLA. O HLA pode ser HLA-DR, HLA-DP, ou HLA-DQ.

De acordo com um décimo aspecto da presente invenção, é pro-vido um método para identificação de um composto que modula uma respos-ta imune, onde o dito método compreende:

(a) contato de uma célula ou extrato de célula com um com-posto candidato na presença de Cpn10; e

(b) determinação de se expressão sobre a superfície da ditacélula de pelo menos uma molécula MHC é modulada com contato com odito composto candidato.

O método ainda pode compreender:

(c) determinação de se expressão sobre a superfície da ditacélula de pelo menos uma outra molécula de superfície de célula é modula-da com contato com o dito composto candidato.

A molécula MHC pode ser uma molécula Classe I MHC, umamolécula Classe Il MHC, ou uma molécula MHC não-clássica. A moléculaClasse Il MHC pode ser HLA. O HLA pode ser HLA_DR, HLA-DP ou HLA-DQ.

De acordo com um décimo primeiro aspecto da presente inven-ção, é provido um método para seleção de uma pluralidade de compostospara identificar um composto que modula uma resposta imune, onde o ditométodo compreende:

(a) contato de uma célula ou extrato de célula com a ditapluralidade de compostos na presença de Cpn10; e

(b) determinação de se expressão sobre a superfície da ditacélula de pelo menos uma molécula MHC é modulada com contato com adita pluralidade de compostos.O método ainda pode compreender:

(c) determinação de se expressão sobre a superfície da ditacélula de pelo menos uma outra molécula de superfície de célula é modula-da com contato com a dita pluralidade de compostos.

A molécula MHC pode ser uma molécula Classe I MHC1 uma mo-lécula Classe Il MHC, ou uma molécula MHC não-clássica. A molécula ClasseIl MHC pode ser HLA. O HLA pode ser HLA-DR, HLA-DP, ou HLA-DQ.

A expressão em superfície de célula pode ser aquela de umacélula apresentando antígeno. A célula apresentando antígeno pode ser se-lecionada do grupo compreendendo um macrófago, célula dendrítica ou cé-I lula B.

De acordo com um décimo primeiro aspecto da presente inven-ção, é provido um método para indução de modulação do nível de expressãoem superfície de célula de pelo menos uma molécula MHC em um sujeito, ouem pelo menos uma célula da mesma, tecido ou órgão, onde o dito métodocompreende administração de uma quantidade efetiva de chaperonina 10.

O método ainda pode compreender modulação do nível de ex-pressão em superfície de célula de pelo menos uma outra molécula de su-perfície de célula em um sujeito, ou em pelo menos uma célula da mesma,tecido ou órgão, compreendendo administração de uma quantidade efetivade chaperonina 10.

A molécula MHC pode ser uma molécula Classe I MHC, uma mo-lécula Classe Il MHC, ou uma molécula MHC não-clássica. A molécula ClasseII MHC pode ser HLA. O HLA pode ser HLA-DR, HLA-DP, ou HLA-DQ.

De acordo com um décimo terceiro aspecto da presente inven-ção, é provido um método para identificação de um composto que modulauma resposta imune, onde o dito método compreende:

(b) determinação de se a migração da dita célula para umnódulo linfático ou a habilidade para ativar e/ou causar proliferação de célu-las T é modulada com contato com o dito composto candidato.

A célula pode ser uma célula apresentando antígeno. A célulaapresentando antígeno pode ser selecionada do grupo compreendendo ummacrófago, célula dendrítica ou célula B.

De acordo com um décimo quarto aspecto da presente inven-ção, é provido um método para seleção de uma pluralidade de compostospara identificar um composto que modula uma resposta imune, onde o ditométodo compreende:

(b) determinação de se a migração da dita célula para umnódulo linfático ou a habilidade para ativar e/ou causar proliferação de célu-las T é modulada com contato com a dita pluralidade de compostos.

De acordo com um décimo quinto aspecto da presente invenção,é provido um método para modulação de função de uma célula apresentan-do antígeno em um sujeito, ou em pelo menos um seu tecido ou órgão, ondeo dito método compreende administração de uma quantidade efetiva dechaperonina 10.

A função pode ser selecionada do grupo compreendendo migra-ção para um nódulo linfático ou ativação de célula T.

Definições

No contexto deste relatório descritivo, o termo "compreendendo"significa "incluindo principalmente, mas não necessariamente unicamente".Além disso, variações da palavra "compreendendo", tal como "compreende",têm correspondentemente significados variados.

Como aqui usados os termos "tratamento", "tratando" e suas va-riações, referem-se a quaisquer e todos os usos que remediam um estadoou sintomas de doença, previnem o estabelecimento de doença, ou de outromodo previnem, impedem, retardam, ou revertem a progressão de doençaou outros sintomas indesejáveis de qualquer outro modo.

Como aqui usado o termo "quantidade efetiva" inclui em seu sig-nificado uma quantidade não-tóxica mas suficiente de um agente ou com-posto para prover o desejado efeito terapêutico ou profilático. A exata quan-tidade requerida variará de sujeito para sujeito dependendo de fatores taisj como as espécies sendo tratadas, a idade e condição genérica do sujeito, aseveridade da condição sendo tratada, o particular agente sendo administra-do e o modo de administração e assim por diante. Assim, não é possível es-pecificar uma exata "quantidade efetiva". Entretanto, para qualquer caso da-do, uma apropriada "quantidade efetiva" pode ser determinada por aquelesversados na técnica usando somente experimentação rotineira.

O termo "polipeptídeo" significa um polímero constituído de ami-noácidos ligados por ligações peptídicas. Os termos "polipeptídeo" e "proteí-na" são usados intercambiavelmente , embora para os propósitos da presen-te invenção um "polipeptídeo" pode constituir uma porção de uma proteínade inteiro comprimento.

O termo "polinucleotídeo" como aqui usado refere-se a um polí-mero de fita simples ou dupla de desoxirribonucleotídeo, bases ribonucleotí-deo ou análogos conhecidos ou nucleotídeos naturais, ou suas misturas.

Como aqui usados, os termos "modulação", "modula" e suas va-riações referem-se a aumento ou diminuição de nível de atividade, produção,secreção ou funcionamento de uma molécula na presença de uma particularmolécula moduladora ou agente da invenção comparado ao nível de ativida-de, produção, secreção ou outro seu funcionamento na ausência da molécu-la ou agente modulador. Estes termos não implicam quantificação do au-mento ou diminuição. A modulação pode ser de qualquer magnitude sufici-ente para produzir o desejado resultado e pode ser direta ou indireta.O termo "imunomodulador" como aqui usado refere-se a um me-diador molecular que desempenha um papel na ativação, manutenção, ma-turação, inibição, supressão ou aumento de uma resposta imune.

O termo "molécula de MHC" refere-se a qualquer molécula com-plexada a, associada com ou formando uma parte de um principal complexode histocompatibilidade. Uma "molécula MHC" por isso pode incluir um antí-geno leucócito humano (HLA) de qualquer descrição, por exemplo, incluindomas não limitado a HLA-DR (classe Il MHC), moléculas classe I MHC, oumoléculas MHC não-clássicas tais como, por exemplo, CD1a, CD1b ou CD1c.

O termo "outra molécula de superfície de célula" refere-se aqualquer molécula expressa sobre a superfície de uma célula, e pode ou nãoincluir uma molécula co-estimuladora. O termo "molécula co-estimuladora"refere-se a qualquer molécula capaz de contribuir para, direta ou indireta-mente, a transdução de sinalização envolvendo uma molécula MHC.

Breve Descrição dos Desenhos

A presente invenção será agora descrita, por meio de somenteexemplo não-limitante, com referência aos desenhos acompanhantes.

Figura 1 CpnIO reduz significantemente expressão deHLA-DR em DC

DCs humanas foram diferenciadas de monócitos na presença deGM-CSF e IL-4 por 5 dias. Conversão de monócitos em DC com LPS foi ve-rificada por análises citométricas de fluxo de expressão em superfície decélula de CD1a e CD14. DC CDIa+ CD14" foram ainda analisadas para ex-pressão em superfície de célula do marcador de maturação HLA-DR. DCderivadas de monócitos cultivadas foram usadas para avaliar a capacidadede CpnIO modular maturação de DC induzida por LPS. A expressão deHLA-DR foi inalterada sobre DC madura incubada com CpnIO (A). Entretan-to, regulação ascendente induzida por LPS sobre expressão de HLA-DR foisignificantemente reduzida por CpnIO (A vs. Β, ρ = 0,0408; A vs. C, ρ =0,0324; A vs. D, ρ = 0,0161) (Β). Representativo de 3 experimentos inde-pendentes.Figura 2 Cpn10 diminui liberação de TNF-α constitutivo por DC

DC derivadas de monócitos cultivadas foram usadas para avaliara capacidade de Cpn10 modular liberação de TNF-α constitutivo. DC foramincubadas com uma faixa de concentração de Cpn10 por 20 horas. Acumu-lação de TNF-α em sobrenadantes de cultura foi medida através de ELISA.Dados mostrados são representativos de 4 experimentos independentes.

Figura 3 Cpn10 reduz produção de IFN-γ em uma reaçãode leucócito - mista primária (MLR)

DC derivadas de monócitos cultivadas foram usadas para avaliar acapacidade de Cpn 10 modular ativação de célula T através de DC em umareação leucócito - mista primária (MLR). DCs foram co-cultivadas com célu-las T CD+ por 6 dias e produção de IFN-γ foi medida nos sobrenadantes decultura através de ELISA. Acumulação de IFN-γ foi significantemente reduzi-da por Cpn10. Dados são representativos de 2 experimentos independentes.

Figura 4 Cpn10 não afeta proliferação de célula T em uma reaçãode leucócito - mista primária (MLR)

DCs derivadas de monócitos cultivadas e células T CD4+ aloge-néicas isoladas foram co-cultivadas na presença ou ausência de CpnIO por6 dias. Proliferação foi medida usando um kit de ensaio de proliferação decélulas CyQUANT de acordo com as instruções do fabricante. Representati-vo de 2 experimentos independentes.

Melhor Modo de Realização da Invenção

Usando uma proteína marcada com fluorocromo, os inventoresmostraram que CpnIO interage fortemente com células apresentando antí-geno, principalmente células dendríticas. Dados de experimentos in vitro,nos quais tanto células dendríticas (DC) mielóides como plasmacitóides dePBMC foram especificamente suprimidas antes de estimulação com umafaixa de ligantes TLR, mostraram dinâmicas apreciavelmente alteradas deprodução de citocina na presença de Cpn10. Além disso, os inventores de-monstraram que DCs derivadas de monócitos maturadas junto com Cpn10redistribuíram um reduzido nível de HLA-DR e outras moléculas co-estimuladoras a partir de compartimentos intracelulares para a superfície decélula. Esta modulação descendente de expressão de molécula classe IlMHC e reduzida capacidade de apresentação de antígeno podem contribuirpara os efeitos antiinflamatórios totais de Cpn 10.

Em particular, para avaliar o efeito de CpnIO sobre maturaçãode DC1 os inventores usaram DC derivada de monócito qie foi extensivamen-te caracterizada no passado (J. Exp. Med. 1994; 179:1109; Blood 2002; 99:993; PNAS 1996; 93; 2588; Int. Immunol. 2004; 16: 767). DCs derivadas demonócitos imaturas são células CD14" HLA-DR+ CD1a+. Com ativação comLPS1 elas regulam ascendentemente HLA-DR e expressam Iigantes estimu-Iadores para células T sobre a superfície de célula. Aqui é mostrado queCpnIO modula a extensão de maturação de DC in vitro.

Os inventores por isso mostraram que CpnIO regula descenden-temente expressão de HLA-DR induzida por LPS na superfície de célula.Esta reduzida expressão de HLA-DR pode ser conseqüente para reduzidaprodução de IFN-γ por DC maturando (descrito em J. Immunol. 1989;143:3781). Por outro lado, regulação descendente de HLA-DR induzida porCpnIO pode refletir uma mudança na eficiência do caminho endocítico paratransporte de moléculas classe Il MHC carregadas com antígeno para a su-perfície de célula. Entretanto, dados aqui apresentados proporcionam claraevidência de que a prevenção de maturação de DC e uma reduzida capaci-dade de apresentação de antígeno de DC e células B são um provável modode ação de CpnIO no melhoramento de doença autoimune.

Da mesma maneira, a presente invenção provê métodos paramodulação de uma resposta imune em um sujeito ou em pelo menos umacélula da mesma, tecido ou órgão, através de modulação de nível de ex-pressão em superfície de célula de pelo menos uma molécula MHC, onde osditos métodos compreendem administração de uma quantidade efetiva dechaperonina 10.

Os métodos ainda podem compreender modulação de uma res-posta imune em um sujeito ou em pelo menos uma célula da mesma, tecidoou órgão, através de modulação de nível de expressão em superfície de cé-lula de pelo menos um outra molécula de superfície de célula, compreen-dendo administração de uma quantidade efetiva de chaperonina 10.

A molécula MHC pode ser uma molécula Classe I MHC1 uma mo-lécula Classe Il MHC1 ou uma molécula MHC não-clássica. A molécula ClasseIl MHC pode ser HLA. O HLA pode ser HLA-DR, HLA-DP, ou HLA-DQ.

A chaperonina 10 pode ser uma chaperonina 10 derivada natu-ralmente, produzida recombinantemente ou produzida sinteticamente. A cha-peronina 10 pode ser de origem eucariótica. A chaperonina 10 pode ser deorigem mamífera. A chaperonina 10 pode ser chaperonina 10 humana.

A chaperonina 10 pode compreender a seqüência de polipeptí-deos como mostrada em SEQ ID N2: 1, SEQ ID NQ: 2 ou SEQ ID N5: 3.

A chaperonina 10 pode ser acetilada ou não-acetilada.

A chaperonina 10 pode ser administrada na forma de um polinu-cleotídeo codificando chaperonina 10. O polinucleotídeo codificando chape-ronina 10 pode ser localizado em uma construção genética, ligada opera-velmente a um promotor. O polinucleotídeo pode compreender a seqüênciacomo mostrada em SEQ ID NQ: 4.

A presente invenção também provê métodos para tratamento ouprevenção de uma doença ou condição em um sujeito através de modulaçãode nível de expressão em superfície de célula de pelo menos uma moléculaMHC1 onde os ditos métodos compreendem administração ao sujeito de umaquantidade efetiva de chaperonina 10.

Os métodos ainda podem compreender tratamento ou preven-ção de uma doença ou condição em um sujeito através de modulação denível de expressão em superfície de célula de pelo menos uma outra molé-cuia de superfície de célula, compreendendo administração de uma quanti-dade efetiva de chaperonina 10. A molécula MHC pode ser uma moléculaClasse I MHC, uma molécula Classe Il MHC, ou uma molécula MHC não-clássica. A molécula Classe Il MHC por ser HLA. O HLA pode ser HLA-DR,HLA-DP ou HLA-DQ.

A doença ou condição pode resultar de, ou de outro modo podeestar associada com, infecção do sujeito através de um patógeno viral oubacteriano. A doença ou condição pode ser câncer, um distúrbio autoimune,inflamação, alergia, asma ou doença infecciosa.

A chaperonina 10 pode ser uma chaperonina 10 derivada natu-ralmente, produzida recombinantemente ou produzida sinteticamente. Achaperonina 10 pode ser de origem eucariótica. A chaperonina 10 pode serde origem mamífera. A chaperonina 10 pode ser chaperonina 10 humana.

A chaperonina 10 pode compreender a seqüência de polipeptí-deos como mostrada em SEQ ID N2: 1, SEQ ID N2: 2 ou SEQ ID N2: 3.A chaperonina 10 pode ser acetilada ou não-acetilada.

A chaperonina 10 pode ser administrada na forma de um polinu-cleotídeo codificando chaperonina 10. O polinucleotídeo codificando chape-ronina 10 pode ser localizado em uma construção genética, ligada opera-velmente a um promotor. O polinucleotídeo pode compreender a seqüênciacomo mostrada em SEQ ID N2: 4.

A presente invenção adicionalmente provê métodos para modu-lação de nível de expressão em superfície de célula der pelo menos umamolécula MHC em um sujeito, ou em pelo menos uma célula da mesma, te-cido ou órgão, onde os ditos métodos compreendem administração de umaquantidade efetiva de chaperonina 10.

Os métodos ainda podem compreender modulação de nível deexpressão em superfície de célula de pelo menos uma outra molécula desuperfície de célula em um sujeito, ou em pelo menos uma célula da mesma,tecido ou órgão, compreendendo administração de uma quantidade efetivade chaperonina 10.A molécula MHC pode ser uma molécula Classe I MHC1 uma mo-lécula Classe Il MHC1 ou uma molécula MHC não-clássica. A molécula ClasseII MHC pode ser HLA. O HLA pode ser HLA-DR, HLA-DP ou HLA-DQ.

A presente invenção ainda provê métodos para modulação defunção de uma célula apresentando antígeno em um sujeito, ou em pelomenos um seu tecido ou órgão, onde os ditos métodos compreendem admi-ti nistração de uma quantidade efetiva de chaperonina 10.

A função pode ser selecionada do grupo compreendendo migra-ção para um nódulo linfático, ativação de célula T ou proliferação de célula

Α presente invenção além disso provê composições quando u-sadas para o tratamento ou prevenção de uma doença ou condição, onde asditas composições compreendem chaperonina 10 junto com pelo menos umcarreador, diluente ou adjuvante farmaceuticamente aceitável, e onde a cha-peronina 10 modula o nível de expressão em superfície de célula de pelomenos uma molécula MHC.

A chaperonina 10 pode ainda modular o nível de expressão emsuperfície de célula de pelo menos uma outra molécula de superfície de cé-lula.

A molécula MHC pode ser uma molécula Classe I MHC, uma mo-lécula Classe Il MHC, ou uma molécula MHC não-clássica. A molécula ClasseII MHC pode ser HLA. O HLA pode ser HLA-DR, HLA-DP ou HLA-DQ.

A expressão em superfície de célula pode ser aquela de umacélula apresentando antígeno. A célula apresentando antígeno pode ser se-lecionada do grupo compreendendo um macrófago, célula dendrítica ou cé-lula B.A presente invenção também provê composições quando usa-das para o tratamento ou prevenção de uma doença ou condição, onde asditas composições compreendem chaperonina 10 junto com pelo menos umcarreador, diluente ou adjuvante farmaceuticamente aceitável, e onde a cha-peronina 10 modula a função de uma célula apresentando antígeno em umsujeito, ou em pelo menos um seu tecido ou órgão.

A função pode ser selecionada do grupo compreendendo migra-ção para um nódulo linfático, ativação de célula T ou proliferação de célula T.

A presente invenção adicionalmente provê o uso de chaperoninapara a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevençãode uma doença ou condição, onde a chaperonina 10 modula o nível de ex-pressão em superfície de célula de pelo menos uma molécula MHC.

A chaperonina 10 ainda pode modular o nível de expressão emsuperfície de célula de pelo menos uma outra molécula de superfície de cé-lula.

A molécula MHC pode ser uma molécula Classe I MHC, uma mo-lécula Classe Il MHC, ou uma molécula MHC não-clássica. A molécula Classe11 MHC pode ser HLA. O HLA pode ser HLA-DR, HLA-DP ou HLA-DQ.

A presente invenção ainda provê o uso de chaperonina 10 paraa fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de umadoença ou condição, onde a chaperonina 10 modula a função de uma célulaapresentando antígeno em um sujeito, ou em pelo menos um seu tecido ouórgão.

A célula apresentando antígeno pode ser selecionada do grupocompreendendo um macrófago, célula dendrítica ou célula B.A função pode ser selecionada do grupo compreendendo migra-ção para um nódulo linfático, ativação de célula T ou proliferação de célulaT.

A presente invenção além disso provê métodos para modulaçãode produção, localização dentro de uma célula e/ou expressão em superfíciede célula de um ou mais imunomoduladores em um sujeito, ou pelo menosuma célula da mesma, tecido ou órgão, onde os ditos métodos compreen-dem administração de uma quantidade efetiva de chaperonina 10, e onde achaperonina 10 modula o nível de expressão em superfície de célula de pelomenos uma molécula MHC ou pelo menos uma outra molécula de superfíciede célula.

A presente invenção também provê métodos para identificaçãode um composto que modula uma resposta imune, onde os ditos métodoscompreendem:

Os métodos ainda podem compreender:

A molécula MHC pode ser uma molécula Classe I MHC, umamolécula Classe Il MHC, ou uma molécula MHC não-clássica. A moléculaClasse Il MHC pode ser HLA. O HLA pode ser HLA-DR, HLA-DP ouHLA-DQ.

A presente invenção adicionalmente provê métodos para sele-ção de uma pluralidade de compostos para identificar um composto que mo-dula uma resposta imune, onde os ditos métodos compreendem:

(b) determinação de se expressão sobre a superfície da ditacélula de pelo menos uma molécula MHC é modulada com contato com adita pluralidade de compostos.

Os métodos ainda podem compreender:

A molécula MHC pode ser uma molécula Classe I MHC1 umamolécula Classe Il MHC, ou uma molécula MHC não-clássica. A moléculaClasse Il MHC pode ser HLA. O HLA pode ser HLA-DR1 HLA-DP ouHLA-DQ.

A expressão em superfície de célula pode ser aquela de umacélula apresentando antígeno. A célula apresentando antígeno pode ser se-lecionada do grupo compreendendo um macrófago, uma célula dendrítica oucélula B.

A presente invenção ainda provê métodos para indução de mo-dulação do nível de expressão em superfície de célula de pelo menos umamolécula MHC em um sujeito, ou em pelo menos uma célula da mesma, te-cido ou órgão, onde os ditos métodos compreendem administração de umaquantidade efetiva de chaperonina 10.

Os métodos ainda podem compreender modulação do nível deexpressão em superfície de célula de pelo menos uma outra molécula desuperfície de célula em um sujeito, ou em pelo menos uma célula da mesma,tecido ou órgão, compreendendo administração de uma quantidade efetivade chaperonina 10.

A expressão em superfície de célula pode ser aquela de umacélula apresentando antígeno. A célula apresentando antígeno pode ser se-I lecionada do grupo compreendendo um macrófago, uma célula dendrítica oucélula B.

A presente invenção além disso provê métodos para identifica-ção de um composto que modula uma resposta imune, onde os ditos méto-dos compreendem:

(a) contato de uma célula ou extrato de célula com um composto candidato na presença de Cpn 10; e

(b) determinação de se a migração da dita célula para umnódulo linfático ou a habilidade para ativar e/ou causar proliferação de célu-

las T é modulada com contato com o dito composto candidato.

A presente invenção também provê métodos para seleção deuma pluralidade de compostos para identificação de um composto que mo-dula uma resposta imune, onde os ditos métodos compreendem:

(b) determinação de se a migração da dita célula para umnódulo linfático ou a habilidade parta ativar e/ou causar proliferação de célu-las T é modulada com contato com a dita pluralidade de compostos.

A presente invenção adicionalmente provê métodos para modu-lação de função de uma célula apresentando antígeno em um sujeito, ou empelo menos um seu tecido ou órgão, onde os ditos métodos compreendemadministração de uma quantidade efetiva de chaperonina 10.

Aqueles versados na técnica apreciarão que de acordo com osmétodos da presente invenção CpnIO pode ser administrada sozinha ou emconjunção com um ou mais agentes adicionais. Por exemplo, CpnIO podeser administrada junto com um ou mais agonistas de TLR capazes de esti-mularem um ou mais de TLR3, TLR4, TLR7 e TLR9. Adicionalmente, a pre-sente invenção contempla terapia de combinação usando CpnIO em conjun-ção com outras abordagens terapêuticas para o tratamento de doenças edistúrbios. Por exemplo, CpnIO pode ser útil no tratamento de doenças viraisque são responsivas a terapia com interferons Tipo I tais como IFNp ouFNa. Ainda, na medida em que ativação de TLR7 e TLR9 induzida por ago-nista tenha sido previamente reportada para aperfeiçoar a resposta de tumo-res para terapia de radiação, CpnIO pode ser usada em conjunção com te-rapia de radiação para o tratamento de câncer.

Para tais terapias de combinação, cada componente da terapiade combinação pode ser administrado ao mesmo tempo, ou seqüencialmen-te em qualquer ordem, ou em momentos diferentes, de modo a prover o de-sejado efeito. Alternativamente, os componentes podem ser formulados jun-tos em uma unidade de dose simples como um produto combinação. Quan-do administrados separadamente, pode ser preferido que os componentessejam administrados através da mesma rota de administração, embora nãoseja necessário que seja assim.CpnIO

De acordo com aspectos e realizações da presente invenção,um sujeito em necessidade de tratamento é administrado com uma quanti-dade efetiva de Cpn10. Em particulares realizações o sujeito a ser tratado éum ser humano, e da mesma maneira, o polipeptídeo CpnIO é o polipeptí-deo CpnIO humano. Aqueles versados na técnica apreciarão que a precisaidentidade do CpnIO usado de acordo com a presente invenção pode variardependendo de um número de fatores, por exemplo, as espécies a seremtratadas, de modo que a CpntO pode ser selecionada de modo a ser deriva-da das espécies a serem tratadas.

CpnIO pode ser CpnIO nativa, derivada naturalmente, recombi-nante ou sintética. Métodos descritos em Morton et al., 2000 (lmmunol CellBiol 78:603-607), Ryan et al., 1995 (J Biol Chem 270:22037-22043) e Johna-son et al., 2005 (J Biol Chem 280:4037-4047) são exemplos de métodos deprodução apropriados para proteína Cpnl0 recombinante e sintética enquan-to métodos descritos em Somodevilla - Torres et al., 2003 (Protein Expres-sion and Purification 32:276-287), Ryan et al., 1995 (J Biol Chem 270:22037-22043) e Zhang et al., 2000 (J Neurol Sci 182:5-15) são exemplos de apro-priados métodos de produção para proteína CpnIO nativa e derivada natu-ralmente embora aqueles versados endereçados apreciarão que a presenteinvenção não é limitada pelo método de purificação ou produção usado equalquer outro método pode ser usado para produzir CpnIO para uso deacordo com os métodos e composições da presente invenção.

Polipeptídeos CpnIO e fragmentos de polipeptídeos para uso deacordo com a presente invenção podem ser obtidos usando técnicas pa-drões de ácido nucléico recombinante ou podem ser sintetizados, por exem-plo, usando convencionais técnicas de síntese de fase líquida ou sólida.Peptídeos CpnIO podem ser produzidos através de digestão de um polipep-tídeo com uma ou mais proteinases como endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-Ce staphylococcus V8-protease. Os fragmentos de peptídeo digeridos po-dem ser purificados através de, por exemplo, técnicas cromatográficas líqui-das de alta performance (HPLC).Modalidades da invenção também contemplam a administraçãode um polinucleotídeo codificando Cpn10. Em tais situações o polinucleotí-deo é tipicamente operavelmente ligado a um promotor de modo que a a-propriada seqüência de polipeptídeo é produzida seguindo administração dopolinucleotídeo ao sujeito. O polinucleotídeo pode ser administrado a sujei-tos em um vetor. O vetor pode ser um vetor plasmídeo, um vetor viral, ouqualquer outro veículo apropriado adaptado para a inserção de seqüênciasestranhas, sua introdução em células eucarióticas e a expressão das se-qüências introduzidas. Tipicamente o vetor é um vetor de expressão eucarió-tico e pode incluir seqüências de controle de expressão e processamentocomo um promotor, um aperfeiçoador, sítios de ligação de ribossoma, sinaisde poliadenilação e seqüências de término de transcrição. A construção deácido nucléico a ser administrada pode compreender ADN nu ou pode estarna forma de uma composição, junto com um ou mais carreadores farmaceu-ticamente aceitáveis.

O polipeptídeo CpnIO pode ter a seqüência de aminoácidos co-mo mostrado em SEQ ID NQ: 1. A seqüência de nucleotídeos do polinucleo-tídeo codificando CpnIO pode ser como mostrado em SEQ ID NQ: 4 ou mos-trar suficiente identidade de seqüência à mesma para hibridizar para a se-qüência de SEQ ID NQ: 4. Em realizações alternativas, a seqüência de nu-cleotídeos do polinucleotídeo pode compartilhar pelo menos 30%, 40%,50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidadecom a seqüência mostrada em SEQ ID N9: 4.

Dentro do escopo dos termos "polipeptídeo" e "polinucleotídeo"como aqui usados estão seus fragmentos e variantes. Somente por exem-plo, fragmentos de peptídeos de CpnIO como descrito em WO 95/15338 (is-to é, "Chaperonin 10" PCT application Ng PCT/AU94/00740) podem ser usa-dos de acordo com aspectos e realizações da presente invenção.

O termo "fragmento" refere-se a um ácido nucléico ou seqüênciade polipeptídeo que codifica um constituinte ou é um constituinte de proteínaCpnIO de inteiro comprimento. Em termos do polipeptídeo o fragmento pos-sui atividade biológica qualitativa em comum com a proteína de inteiro com-primento. Um fragmento biologicamente ativo de CpnIO usado de acordocom a presente invenção tipicamente pode possuir pelo menos cerca de50% da atividade imunomoduladora da correspondente proteína de inteirocomprimento, mais tipicamente pelo menos cerca de 60% de tal atividade,mais tipicamente pelo menos cerca de 70% de tal atividade, mais tipicamen-te pelo menos cerca de 80% tal atividade, mais tipicamente pelo menos cer-ca de 90% de tal atividade, e mais tipicamente pelo menos cerca de 95% detal atividade.

O termo "variante" como aqui usado refere-se a moléculas subs-tancialmente similares. Genericamente, variantes de seqüência de ácido nu-cléico codificam polipeptídeos que possuem atividade biológica qualitativaem comum. Genericamente, variantes de seqüência de polipeptídeo tambémpossuem atividade biológica qualitativa em comum. Ainda, estas variantesde seqüência de polipeptídeo podem compartilhar pelo menos 50%, 55%,60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% deidentidade de seqüência.

Ainda, um polipeptídeo variante pode incluir análogos, onde otermo "análogo" significa um polipeptídeo que é um derivado de uma Cpn10,cujo derivado compreende adição, supressão, substituição de um ou maisaminoácidos, de modo que o polipeptídeo retenha substancialmente a mes-ma função como CpnIO nativa. É bem-conhecido na técnica que alguns a -minoácidos podem ser trocados dentro de um polipeptídeo sem alteração deatividade do polipeptídeo (substituições conservativas). O termo "substitui-ção conservativa de aminoácido" refere-se a uma substituição de um amino-ácido por outro aminoácido com similares propriedades dentro de uma ca-deia de polipeptídeo (seqüência primária de uma proteína). Por exemplo, asubstituição do aminoácido carregado ácido glutâmico (GIu) por aminoácidosimilarmente carregado ácido aspártico (Asp) pode ser uma substituiçãoconservativa de aminoácido. Adições de aminoácidos podem resultar da fu-são de um polipeptídeo CpnIO ou seu fragmento com um segundo polipeptí-deo ou peptídeo, tal como um marcador polihistidina, fusão de proteína deligação de maltose, fusão de glutationa S transferase, fusão de proteína fluo-rescente verde, ou a adição de um marcador epítopo tal como FLAG ou c-myc. Por exemplo, o polipeptídeo CpmIO humano tipo selvagem pode com-preender uma adicional metade tripeptídeo GSM no terminus-N (SEQ ID N-:2; vide por exemplo, WO 95/15338, a descrição da qual é aqui incorporadapor referência) ou um adicional resíduo alanina (A) no terminus-N (SEQ IDN9: 3; WO 2004/041300 (isto é, "Chaperonin 10 immunosuppression" PCTapplication Ne PCT/AU2003/001467)), a descrição do qual é aqui incorpora-da por referência) ou um adicional resíduo glicina (G) no terminus-N (SEQ IDN-: 5; PCT/AU2006/001278 ("Modified Chaperonin 10" PCT application)), adescrição do qual é aqui incorporada por referência. A presente invençãotambém contempla o uso de polinucleotídeos codificando tais formas modifi-cadas de Cpn 10.

Variantes de CpnIO podem ser geradas através de mutagênesede uma proteína CpnIO ou mutagênese de um ácido nucléico codificante, talcomo através de mutagênese randômica ou mutagênese direcionada de sítiousando métodos bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais mé-todos podem ser encontrados, por exemplo, em Current Protocols In Molecu-lar Biology (Chapter 9), Ausubel et al., 1994, John Wiley & Sons, Inc., Novalorque, a descrição da qual é aqui incorporada por referência. Variantes eanálogos também abrangem polipeptídeos complexados com outras meta-des químicas, proteínas de fusão ou de outro modo modificadas pós-transicionalmente. Exemplos de apropriadas modificações são descritos nopedido de patente co-pendente N- PCT/AU2005/000041, a descrição da qualé aqui incorporada por referência.

Ainda, o polipeptídeo CpnIO ou seu fragmento pode possuir ou-tras modificações pós-traducionais, incluindo modificações de cadeia lateralcomo, por exemplo, acetilação, amidinação, carbamoilação, alquilação redu-tora e outras modificações como são conhecidas por aqueles versados natécnica.

Composições e Rotas de Administração

Em geral, composições apropriadas para uso de acordo com osmétodos da presente invenção podem ser preparadas de acordo com méto-dos e procedimentos que são conhecidos por aqueles versados na técnica eda mesma maneira podem incluir um carreador, diluente e/ou adjuvante far-maceuticamente aceitável.

Composições podem ser administradas através de rotas pa-drões. Em geral, as composições podem ser administradas através da rotaparenteral (por exemplo, intravenosa, intraespinhal, subcutânea ou intra-muscular), oral ou tópica. Administração pode ser sistêmica, regional ou lo-cal. A particular rota de administração a ser usada em qualquer dada cir-cunstância dependerá de um número de fatores, incluindo a natureza dacondição a ser tratada, a severidade e extensão da condição, a dosagemrequerida do particular composto a ser liberado e os potenciais efeitos cola-terais do composto.

Em geral, composições apropriadas podem ser preparadas deacordo com métodos que são conhecidos por aqueles versados na técnica epodem incluir um diluente, adjuvante e/ou excipiente farmaceuticamente a-ceitável. Os diluentes, adjuvantes e excipientes têm de ser "aceitáveis" emtermos de serem compatíveis com os outros ingredientes da composição, enão prejudiciais para seu receptor.

Exemplos de carreadores ou diluentes farmaceuticamente acei-táveis são água desmineralizada ou destilada; solução salina; óleos de basevegetal como óleo de amendoim, óleo de açafrão, óleo de oliva, óleo de se-mente de algodão, óleo de milho, óleos de sésamo como óleo de amendoim,óleo de açafrão, óleo de oliva, óleo de semente de algodão, óleo de milho,óleo de sésamo, óleo arachis ou óleo de coco; óleos de silicone, incluindo polissiloxanos, como metil polissiloxano, fenil polissiloxano, e metil fenil po-lissiloxano; silicones voláteis; óleos minerais como parafina líquida, parafinamole ou esqualano; derivados de celulose como metil celulose, etil celulose,carbóxi metil celulose, sódio carbóxi metil celulose ou hidróxi propil metil ce-lulose; alcanóis inferiores, por exemplo, etanol ou isopropanol; aralcanóisinferiores; polialquileno glicóis inferiores ou alquileno glicóis inferiores, porexemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, etileno glicol, propileno glicol,1,3-butileno glicol ou glicerina; ésteres de ácido graxo como palmitato deisopropila, miristato de isopropila ou oleato de etila; polivinil pirridona; ágar;carrageenan; goma tragacanto ou goma acácia, e geléia de petróleo. Tipi-camente, o carreador ou carreadores formarão de 10% a 99,9% em pesodas composições.

As composições da invenção podem estar em uma forma apro-priada para administração através de injeção, na forma de uma formulaçãoapropriada para ingestão oral (como cápsulas, comprimidos, caplets, elixires,por exemplo), na forma de uma pomada, creme ou loção apropriada paraadministração tópica, em uma forma apropriada para liberação como umagota ocular, em uma forma de aerossol apropriada para administração atra-vés de inalação, tal como inalação intranasal ou inalação oral, em uma formaapropriada para administração parenteral, ou seja, injeção subcutânea, in-tramuscular ou intravenosa.

Para administração como uma solução ou suspensão injetável,diluentes ou carreadores parenteralmente aceitáveis não-tóxicos podem in-cluir, solução de Ringer, solução salina isotônica, solução salina tamponadacom fosfato, etanol e 1,2-propileno glicol. Alguns exemplos de apropriadoscarreadores, diluentes, excipientes e adjuvantes para uso oral incluem óleode amendoim, parafina líquida, sódio carbóxi metil celulose, metil celulose,alginato de sódio, goma acácia, goma tragacanto, dextrose, sacarose, sorbi-tol, manitol, gelatina e lecitina. Em adição estas formulações orais podemconter apropriados aromatizantes e agentes corantes. Quando usada emforma de cápsula, as cápsulas podem ser revestidas com compostos taiscomo monoestearato de glicerila ou diestearato de glicerila que retarda de-sintegração.

Adjuvantes tipicamente incluem emolientes, emulsificantes, a-gentes espessantes, conservantes, bactericidas e agentes tamponantes.

Formas sólidas para administração oral podem conter Iigantesaceitáveis em prática farmacêutica humana e veterinária, adoçantes, agen-tes desintegrantes, diluentes, aromatizantes, agentes de revestimento, con-servantes, lubrificantes e/ou agentes de retardo de tempo. Apropriados Iigan-tes incluem goma acácia, gelatina, amido de milho, goma tragacanto, algina-to de sódio, carbóxi metil celulose, ou polietileno glicol. Apropriados adoçan-tes incluem sacarose, lactose, glucose, aspartame ou sacarina. Apropriadosagnetes desintegrantes incluem amido de milho, metil celulose, polivinil pirro-lidona, goma guar, goma xantana, bentonita, ácido algínico ou ágar. Apropri-ados diluentes incluem lactose, sorbitol, manitol, dextrose, caolin, celulose,carbonato de cálcio, silicato de cálcio ou fosfato de dicálcio. Apropriados a-gentes aromatizantes incluem óleo de hortelã, óleo de gaultéria, aroma decereja, laranja ou framboesa.

Apropriados agentes de revestimento incluem polímeros ou co-polímeros de ácido acrílico e/ou ácido metacrílico e/ou seus ésteres, ceras,j álcoois graxos, zeína, shellac ou glúten. Apropriados conservantes incluembenzoato de sódio, vitamina E, alfa tocoferol, ácido ascórbico, metil parabe-no, propil parabeno ou bissulfito de sódio. Apropriados lubrificantes incluemestearato de magnésio, ácido esteárico, oleato de sódio, cloreto de sódio outalco. Apropriados agentes de retardo de tempo incluem monoestearato deglicerila, ou diestearato de glicerila.

Formas líquidas para administração oral podem conter, em adi-ção aos agentes acima, um carreador líquido. Apropriados carreadores líqui-dos incluem água, óleos tais como óleo de oliva, óleo de amendoim, óleo desésamo, óleo de girassol, óleo arachis, óleo de coco, parafina líquida, etilenoglicol, propileno glicol, polietileno glicol, etanol, propanol, isopropanol, glice-rol, álcoois graxos, triglicerídeos, ou suas misturas.

Suspensões para administração oral ainda pode compreenderagentes dispersantes e/ou agentes de suspensão. Apropriados agentes desuspensão incluem sódio carbóxi metil celulose, metil celulose, hidróxi propilmetil celulose, polivinil pirrolidona, alginato de sódio ou álcool acetílico.Apropriados agentes dispersantes incluem lecitina, polioxietileno ésteres deácidos graxos como ácido esteárico, mono- ou dioleato, estearato ou Iauratode polioxietileno sorbitol, mono- ou dioleato, estearato ou Iaurato de polioxie-tileno sorbitano e similares.

As emulsões para administração oral ainda podem compreenderum ou mais agentes emulsificantes. Apropriados agentes emulsificantes in-cluem agentes dispersantes como exemplificado acima ou gomas naturaiscomo goma guar, goma acácia ou goma tragacanto.

Métodos para preparação de composições administráveis paren-teralmente são visíveis para aqueles versados na técnica, e são descritosem mais detalhes em, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Science,15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., aqui incorporado por refe-rência.

As formulações tópicas da presente invenção compreendem umingrediente ativo junto com um ou mais carreadores aceitáveis, e opcional-mente outros ingredientes terapêuticos. Formulações apropriadas para ad-ministração tópica incluem preparações líquidas ou semilíquidas apropriadaspara penetração através de pele para o sítio onde o tratamento é requerido,tais como linimentos, loções, cremes, pomadas ou pastas, e gotas apropria-das para administração ao olho, ouvido ou nariz.

Gotas de acordo com a presente invenção podem compreendersoluções ou suspensões aquosas ou oleosas. Estas podem ser preparadasatravés de dissolução de ingrediente ativo em uma solução aquosa de umagente bactericida e/ou fungicida e/ou qualquer outro apropriado conservan-te, e opcionalmente incluindo um agente tensoativo. A resultante soluçãoentão pode ser clareada por filtração, transferida para um apropriado recipi-ente e esterilizada. Esterilização pode ser obtida através de: autoclavagemou manutenção a 90-1OO0C por meia hora, ou através de filtração, seguidapor transferência para um recipiente através de uma técnica asséptica.Exemplos de agentes bactericidas e fungicidas apropriados para inclusãonas gotas são nitrato ou acetato de fenil mercúrico (0,002%), cloreto de ben-zalcônio (0,01%) e acetato de clorhexidina (0,01%). Apropriados solventespara a preparação de uma solução oleosa incluem glicerol, álcool diluído epropileno glicol.

Loções de acordo com a presente invenção incluem aquelas a-propriadas para aplicação à pele ou olho. Uma loção ocular pode compreen-der uma solução aquosa estéril opcionalmente contendo um bactericida epode ser preparada através de métodos similares àqueles descritos acimaem relação à preparação de gotas. Loções ou Iinimentos para aplicação àpele também podem incluir um agente para acelerar secagem e para resfriara pele, tal como um álcool ou acetona, e/ou um umectante tal como glicerol,ou óleo como óleo de mamona ou óleo arachis.

Cremes, pomadas ou pastas de acordo com a presente inven-ção são formulações semi-sólidas do ingrediente ativo para aplicação exter-na. Elas podem ser fabricadas através de mistura de ingrediente ativo emforma pulverizada ou finamente dividida, sozinho ou em solução ou suspen-são em um fluido aquoso ou não-aquoso, com uma base graxa ou não-graxa. A base pode compreender hidrocarbonetos tais como parafina dura,mole ou líquida, glicerol, cera de abelha, um sabão metálico; uma mucila-gem; um óleo de origem natural como óleo de amêndoa, milho, arachis,mamona ou oliva; gordura de lã ou seus derivados, ou um ácido graxo talcomo ácido esteárico ou oléico junto com um álcool tal como propileno glicolou macrogols.

A composição pode incorporar qualquer tensoativo apropriadotal como um tensoativo aniônico, catiônico ou não-iônico tal como sorbitanoésteres ou seus derivados polioxietileno. Agentes de suspensão tais comogomas naturais, derivados de celulose ou materiais inorgânicos como sílicassilicosas, e outros ingredientes como lanolina, também podem ser incluídos.

As composições também podem ser administradas na forma delipossomas. Lipossomas são genericamente derivadas de fosfolipídeos ououtras substâncias lipídeos, e são formadas por cristais líquidos hidratadosmono- ou multilamelares que são dispersos em um meio aquoso. Qualquerlipídeo metabolizável e fisiologicamente aceitável, não-tóxico, capaz de for-mar lipossomas pode ser usado. As composições em forma de Iipossomapodem conter estabilizantes, conservantes, excipientes e similares. Os lipí-deos preferidos são os fosfolipídeos e as fosfatidil colinas (lecitinas), ambasnaturais e sintéticas. Métodos para formação de lipossomas são conhecidosna técnica, e em relação a isto é feita específica referência a: Prescott, Ed.,Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y.(1976), p. 33 et seq., o conteúdo do qual é aqui incorporado por referência.As composições podem ser conjugadas a um arranjo de deriva-dos de polietileno glicol (PEG). A adição de PEG a proteínas (PEGilação) éum método bem estabelecido para diminuição de taxas de depuração deproteínas em plasma, pelo que aumentando sua eficiência (Nucci et al.,1991, Adv. Drug Del. Vide. 6:133). Adicionais efeitos benéficos de PEGilaçãopodemincluir maior estabilidade de proteínas, diminuída imunogenicidade,aperfeiçoada solubilidade e diminuída susceptibilidade a proteólise (SheffieldW. 2001, Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord. 1:1-22). Moléculasde PERG contêm a estrutura de repetição básica de -(OCH3CH2)n-OH e sãoclassificadas em grupos de acordo com seu peso molecular. Derivados dePEG são conjugados a proteínas para aumentar seu raio hidrodinâmico eem geral, seu aumento em meia-vida está diretamente relacionado ao tama-nho da cadeia PEG ligada (Sheffield W. 2001, Curr Drug Targets CardiovascHaematol Disord. 1:1-22).

As composições também podem ser administradas na forma demicropartículas. Micropartículas biodegradáveis formadas de polilactídeo(PLA), polilactídeo-co-glicolídeo (PLGA), e epsilon-caprolactona (-capro-lactona) têm sido extensivamente usadas como carreadores de fármacospara aumento de meia-vida em plasma e pelo que prolongando eficácia (R.Kumar, M., 2000, J Pharm Pharmaceut Sei. 3(2) 234-258). Micropartículasforam formuladas para a liberação de uma faixa de candidatos fármacos in-cluindo vacinas, antibióticos, e ADN. Além disso, estas formulações foramdesenvolvidas para várias rotas de liberação incluindo injeção subeutâneaparenteral, injeção intravenosa e inalação.

As composições podem incorporar uma matriz de liberação con-trolada que é composta por acetato isobutirato de sacarose (SAIB) e solven-te orgânico ou mistura de solventes orgânicos. Aditivos polímeros podem seradicionados ao veículo como um modificador de liberação para ainda au-mentar a viscosidade e diminuir a taxa de liberação. SAIB um aditivo de ali-mento bem-conhecido. Ele é um derivado de sacarose inteiramente esterifi-cada, muito hidrofóbico, em uma razão nominal de seis grupos isobutiratopara dois acetato. Como um éster misto, SAIB não cristaliza mas existe co-mo um líquido viscoso claro. Mistura de SAIB com um solvente orgânicofarmaceuticamente aceitável como etanol ou álcool benzílico diminui a vis-cosidade da mistura suficientemente para permitir injeção. Um ingredientefarmacêutico ativo pode ser adicionado ao veículo de liberação SAIB paraformar uma solução de SAIB ou formulações em suspensão. Quando a for-mulação é injetada subcutaneamente, o solvente difunde a partir da matrizpermitindo o fármaco SAIB ou misturas de polímero de SAIB-fármaco esta-beleça como um depósito formando in situ.

Para os propósitos da presente invenção moléculas e agentes podem ser administrados a sujeitos como composições tanto terapeutica-j mente como preventivamente. Em uma aplicação terapêutica, composiçõessão administradas a um paciente já sofrendo de uma doença, em uma quan-tidade suficiente para curar ou pelo menos impedir parcialmente a doença esuas complicações.

A composição deve prover uma quantidade da molécula ouagente suficiente para tratar efetivamente o paciente.

O nível de dose terapeuticamente efetiva para qualquer pacienteparticular dependerá de uma variedade de fatores incluindo: o distúrbio sen-do tratado e a severidade do distúrbio; atividade da molécula ou agente em-pregado; a composição empregada; a idade, peso de corpo, saúde geral,sexo e dieta do paciente; o tempo de administração; a rota de administração;a taxa de seqüestro da molécula ou agente; a duração do tratamento; fárma-cos usados em combinação ou coincidentes com o tratamento, junto comoutros fatores relacionados bem-conhecidos em medicina.

Aqueles versados na técnica podem ser capazes, através deexperimentação rotineira, de determinar uma quantidade não-tóxica, efetiva,de agente ou composto que pode ser requerida para tratar doenças aplicá-veis.

Genericamente, uma dosagem efetiva é esperada estar na faixade cerca de 0,0001 mg a cerca de 1000 mg por kg de peso de corpo por 24horas; tipicamente, cerca de 0,001 mg a cerca de 750 mg por kg de peso decorpo por 24 horas; cerca de 0,01 mg a cerca de 500 mg por kg de peso decorpo por 24 horas; cerca de 0,1 mg a cerca de 500 mg por kg de peso decorpo por 24 horas; cerca de 0,1 mg a cerca de 250 mg por kg de peso decorpo por 24 horas; cerca de 1,0 mg a cerca de 250 mg por kg de peso decorpo por 24 horas. Mais tipicamente, uma faixa de dose efetiva é esperadaestar na faixa de cerca de 1,0 mg a cerca de 200 mg por kg de peso de cor-po por 24 horas; cerca de 1,0 mg a cerca de de 100 mg por kg de peso decorpo por 24 horas; cerca de 1,0 mg a cerca de 50 mg por kg de peso decorpo por 24 horas; cerca de 1,0 mg a cerca de 25 mg por kg de peso decorpo por 24 horas; cerca de 5,0 mg a cerca de 50 mg por kg de peso decorpo por 24 horas; cerca de 5,0 mg a cerca de 20 mg por kg de peso decorpo por 24 horas; cerca de 5,0 mg a cerca de 15 mg por kg de peso decorpo por 24 horas.

Alternativamente, uma dosagem efetiva pode ser até cerca de500 mg/m2. Genericamente, uma dosagem efetiva é esperada estar na faixade cerca de 25 a cerca de 500 mg/m2, preferivelmente cerca de 25 a cercade 350 mg/m2, mais preferivelmente cerca de 25 a cerca de 300 mg/m2, ain-da mais preferivelmente cerca de 25 a cerca de 250 mg/m2, mesmo maispreferivelmente cerca de 50 a cerca de 250 mg/m2, e ainda mesmo maispreferivelmente cerca de 75 a cerca de 150 mg/m2.

Tipicamente, em aplicações terapêuticas, o tratamento pode serpela duração do estado de doença.

Ainda, será visível para aqueles versados na técnica que aquantidade e espaçamento otimizado de dosagens individuais serão deter-minados através da natureza e extensão do estado de doença sendo trata-do, a forma, rota e sítio de administração, e a natureza do particular ser indi-vidual tratado. Também, tais condições ótimas podem ser determinadas a-través de técnicas convencionais.

Também será visível para aqueles versados na técnica que ocurso otimizado de tratamento, tal como, o número de doses da composiçãodada por dia para um definido número de dias pode ser determinado por a-queles versados na técnica usando convencional curso de testes de deter-minação de tratamento.Aqonistas e antaaonistas de Cpn10

A presente invenção também contempla o uso de agonistas eantagonistas de Cpn10 e métodos de seleção e produção de tais agonistas eantagonistas.

Agonistas e antagonistas de Cpn10 podem ser especificamentedesenhados ou selecionados de acordo com o seu efeito sobre TLR3, TLR4,TLR7 e/ou TLR9 sinalizando e secreção de imunomodulador.

Anticorpos podem atuar como agonistas ou antagonistas deCpn 10, ou seus fragmentos ou análogos. Preferivelmente apropriados anti-corpos são preparados a partir de regiões ou fragmentos discretos do poli-peptídeo Cpn10, em particular aqueles envolvidos em atribuir atividade pro-tease e/ou ligação de parceiro ou substrato. Um polipeptídeo CpnIO antigê-nico contem pelo menos cerca de 5, e preferivelmente pelo menos cerca de10 aminoácidos.

Métodos para geração de apropriados anticorpos serão facil-mente apreciados por aqueles versados na técnica. Por exemplo, um anti-corpo monoclonal anti-Cpn10, tipicamente contendo porções Fab, pode serpreparado usando a tecnologia de hibridoma descrita em Antibodies-A Labo-ratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.(1988).

Em essência, na preparação de anticorpos monoclonais direcio-nados para Cpn10, ou seu fragmento ou análogo, qualquer técnica que pro-porcione a produção de moléculas de anticorpos através de linhas de célulascontínuas em cultura pode ser usada. Estas incluem a técnica de hibridomaoriginalmente desenvolvida por Kohler et al., 1975, Nature, 256:495-497,assim como a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de célula-B humana(Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72), e a técnica de hibridoma-EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., in Mono-clonal Antibodies and Câncer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., (1985)).Linhas de células produzindo anticorpos, imortais, podem ser criadas atravésde técnicas outras que não fusão, tal como transformação direta de linfócitosB com ADN oncogênico, ou transfecção com vírus Epstein-Barr. Vide, porexemplo, Μ. Schreier et al., "Hibridoma Techniques" (1980); Hammerling etal., "Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas" (1981); Kennett et al.,"Monoclonal Antibodies" (1980).

Em suma, um meio de produção de um hibridoma do qual o an-ticorpo monoclonal é produzido, um mieloma ou outra linha de célula de au-toperpetuação é fundida com linfócitos obtidos do baço de um mamífero hi-perimunizado com uma sua porção de ligação de fator de reconhecimentoou fator de reconhecimento, ou uma sua porção de ligação de ADN específi-co de origem. Hibridomas produzindo um anticorpo monoclonal útil na práti-ca desta invenção são identificados por sua habilidade para reação imunecom o presente fator de reconhecimento e sua habilidade para inibir especi-ficada atividade transcricional em células alvos.

Um anticorpo monoclonal útil na prática da presente invençãopode ser produzido através de iniciação de uma cultura de hibridoma mono-clonal compreendendo um meio nutriente contendo um hibridoma que secre-ta moléculas de anticorpos da apropriada especificidade de antígeno. A cul-tura é mantida sob condições e por um tempo suficientes para o hibridomasecretar as moléculas de anticorpo no meio. O meio contendo anticorpo éentão coletado. As moléculas de anticorpo então podem ser isoladas atravésde técnicas bem-conhecidas.

Similarmente, existem vários procedimentos conhecidos na téc-nica que podem ser usados para a produção de anticorpos policlonais. Paraa produção de anticorpo policlonal anti-Cpn10, vários animais hospedeirospodem ser imunizados através de injeção com Cpn10, ou um seu fragmentoou análogo, incluindo mas não limitado a coelhos, galinhas, camundongos,ratos, ovelha, cabras, etc. Ainda, o polipeptídeo CpnIO ou seu fragmento ouanálogo pode ser conjugado a um carreador imunogênico, por exemplo, al-bumina de soro bovino (BSA) ou hemocianina de Iimpeta fechadura (KLH).Também, vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a respostaimunológica, incluindo mas não limitado a Freund's (completo e incompleto),géis minerais como hidróxido de alumínio, substâncias tensoativas comolisolecitina, polióis piurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleos, he-mocianinas de Iimpeta fechadura, dinitrofenol, e adjuvantes humanos poten-cialmente úteis como BCG (bacilo Calmette-Guerin) e Corynebacterium par-vum.

Seleção para o anticorpo desejado também pode ser realizadaatravés de uma variedade de técnicas conhecidas. Ensaios para ligação i-munoespecífica de anticorpos podem incluir, mas não são limitados a, en-saios rádio - imunes, ELISASs (ensaio imunossorvente ligado a enzima),ensaios imunes de sanduíche, ensaios imunorradiométricos, reações de pre-cipitação de difusão em gel, ensaios de imuno difusão, ensaios imuno in situ,Western blots, reações de precipitação, ensaios de aglutinação, ensaios dej fixação de complemento, ensaios de imunofluorescência, ensaios de proteí-na A, e ensaios de imunoeletroforese, e similares (vide, por exemplo, Au-subel et al., eds., 1994, Current protocols in Molecular Biology, Vol. 1, JohnWiley & Sons, Inc., New York). Ligação de anticorpo pode ser detectada emvirtude de um marcador detectável sobre o anticorpo primário. Alternativa-mente, o anticorpo pode ser detectado em virtude de sua ligação com umanticorpo secundário ou reagente que é apropriadamente marcado. Umavariedade de métodos são conhecidos na técnica para detecção de ligaçãoem um ensaio imuno e estão dentro do escopo da presente invenção.

O anticorpo (ou seu fragmento) elevado contra CpnIO ou um seufragmento ou análogo tem afinidade de ligação para Cpn10. Preferivelmente,o anticorpo (ou seu fragmento) tem afinidade de ligação ou avidez maior quecerca de 105 M11 mais preferivelmente maior que cerca de 106 M"1, mais pre-ferivelmente ainda maior que cerca de 107 M1 e mais preferivelmente maiorque cerca de 108 M"1.

Em termos de obtenção de uma quantidade apropriada de umanticorpo de acordo com a presente invenção, pode-se fabricar o anticor-po^) usando fermentação em batelada com meio isento de soro. Após fer-mentação o anticorpo pode ser purificado via um procedimento multietapasincorporando cromatografia e etapas de inativação/remoção viral. Por exem-plo, o anticorpo pode ser primeiro separado por cromatografia de afinidadede Proteína A e então tratado com solvente/detergente para inativar quais-quer vírus envelopados em lipídeo. Ainda purificação, tipicamente através decromatografia de troca de anion e cátion pode ser usada para remover resi-duais proteínas, solventes/detergentes e ácidos nucléicos. O anticorpo puri-ficado pode ser ainda purificado e formulado em solução salina 0,9% usandocolunas de filtração de gel. A preparação volume formulada então pode seresterilizada e filtrada de vírus e dispensada.

Agonistas e antagonistas outros que não anticorpos também sãocontemplados. Um agonista ou antagonista candidato pode ser identificadoatravés de habilidade para formar um complexo molecular com TLR3, TLR4,TLR7 ou TLR9, e opcionalmente um agonista de TLR3, TLR4, TLR7 ouTLR9. Ainda, um antagonista candidato pode ser identificado por uma habili-dade para prevenir ou interromper formação de um complexo molecularcompreendendo Cpn10, e TLR3, TLR4, TLR7 ou TLR9, e opcionalmente umagonista de TLR3, TLR4, TLR7 ou TLR9.

Técnicas e procedimentos para identificação e produção de a-gonistas e antagonistas são bem-conhecidas por aqueles versados na técni-ca, incluindo seleção de bibliotecas de moléculas tais como bibliotecas quí-micas sintéticas tais como bibliotecas combinatoriais, seleção assistida porcomputador de bases de dados estruturais, modelagem e/ou desenho assis-tido por computador, ou técnicas biofísicas mais tradicionais que detectaminterações de ligação molecular.

A presente invenção será agora ainda descrita em maiores deta-lhes por referência aos seguintes exemplos específicos, que não devem serconstruídos em qualquer maneira como Iimitantes do escopo da invenção.

Exemplos

CpnIO humana recombinante

Para os experimentos descritos nos exemplos abaixo, CpnIOhumana recombinante (GenBank Accession N9 X75821) foi produzida em E.coli como descrito em Johnson et al., 2005 (J Biol Chem 280:4037-4047).

Pureza foi determinada ser >97% por SDS-PAGE. Alíquotas congeladas deCpnIO foram descongeladas somente uma vez antes de uso. Todas as bate-Iadas de CpnIO mostraram a mesma atividade moiar como E. coli Gro-ESem ensaios de redobra rhodanese mediada por Gro-EL (dados não mostra-dos).

Exemplo 1 - Materiais Genéricos e MétodosCultura de célula e moléculas sinalizantes de célulaRPMI suplementado (SPP-036) contendo 2-mercapto etanol (2-

ME) 50 μΜ (Gibco) e aminoácido não-essenciais 1% (Gibco) foi usado emtodos os experimentos de cultura de células, junto variadamente com GM-CSF humano recombinante (R&D systems, #215-GM, Lot No AR115021), IL-4 humano recombinante (R&D systems, #204 IL, Lot No. AG235051), micro-pérolas CD14+ (Miltenyi #130-050-201, Lot No 5050927008) e LPS de E. coliI (Sigma #L6529, Lot No 015K4103).

Geração de DC Imatura

PBMCs foram preparadas a partir de voluntários saudáveis(LTP-062.02). Estoques de PBMCs foram estocados em crio-tubos em nitro-gênio líquido (LTP-063-03). Monócitos foram purificados através do uso demicropérolas CD14+ de acordo com as instruções do fabricante. 5x107 mo-nócitos CD14+ foram semeados em frascos de 75 cm2 em 20 mL de RPMIsuplementado contendo 2-ME e aminoácidos não-essenciais. Para gerar DCimatura, GM-CSF (10 μg/mL) plus IL-4 (10 μg/mL) (GM-CSF/IL-4-DC) foi a-dicionado às culturas. No dia 4 de cultura, 10 mL de meio recente contendocitocinas foram adicionados.Maturação de DC na presença ou ausência de CpnIO

DCs imaturas foram colhidas no dia 5, lavadas e revestidas emplacas de 6 cavidades em uma concentração de 1x106 células/cavidade em3 mL de RPMI suplementado/cavidade. Maturação de DCs foi induzida porLPS (0,12 ng/mL) por 20 horas. CpnIO (10 μg/mL) foi adicionada 1 hora an-tes da adição de LPS.

Imuno fenotipificação de superfície de célula

DCs maduras foram colhidas, lavadas e marcadas por 30 minu-tos a 4°C usando os seguintes anticorpos monoclonais (mAb) conjugados a -APC-Cy7, -PE ou -APC de BD: CD14-APC-Cy7, HLA-DR-APC, CDIa-PE,CD11 c-PE, CD80-PE, CD83-PE, CD86-PE e CD40-PE. Controles isotípicosusados foram lgGrAPC-Cy7, -APC e -PE. Células mortas e debris foramexcluídos das análises nas bases de suas propriedades de dispersão de luz.As análises foram realizadas em um citômetro de fluxo BD FACS-Array.Análises de liberação de citocina por DC

DCs foram colhidas no dia 5 de cultura, lavadas e revestidas emplacas de micro - diluição de fundo chato em 1x106/mL. DCs foram matura-das com LPS (0,15 ng/mL) por 20 horas.

Para avaliar o efeito de CpnIO sobre produção de citocina deDC, CpnIO (0,1-10 μς/ηπΙ.) foi adicionada uma hora antes da adição de LPS.Sobrenadantes foram colhidos e estocados a -20°C. Acumulação de TNF-alfa em sobrenadantes de cultura seguindo incubação de DCs com CpnIOpor 20 horas foi avaliada por ELISA usando um R&D DuoSet Kit de acordocom instruções do fabricante.Ensaio de reação de leucócito mista primária (MLR)

Células T CD4+ foram purificadas de sangue recente através douso de CD4 T cell Isolation Kit Il (Miltenyi1 # 130-091-155, Lot No5060928051) de acordo com instruções do fabricante. Pureza de células Tfoi verificada rotineiramente através de citometria de fluxo. Um total de 1x105células T foi co-cultivado com 1 x104 DCs na presença ou ausência de Cpnl 0(0,1-10 μg/mL0 por 6 dias. Sobrenadantes foram coletados e analisados pa-ra acumulação de IFN-γ através de ELISA. Proliferação de células foi avalia-da usando um kit de ensaio de proliferação CyQUANT (Molecular Probes #C35006, Lot N- 45179a) de acordo com as instruções do fabricante.Exemplo 2 - CpnIO reduz maturação de DC in vitro

DC derivada de monócito cultivado foram usadas para avaliar acapacidade de CpnIO modular maturação de DC em resposta a LPS. Con-versão de monócitos em DC foi verificada por análises citométricas de fluxode expressão em superfície de célula de CD1a e CD14. DCs CDIa+ CD14"foram ainda analisadas para expressão em superfície de célula dos marca-dores de maturação HLA-DR, CD40, CD80, CD83 e CD86. A intensidade defluorescência média (MFI) de HLA-DR em resposta a LPS (Figura 1) foi sig-nificantemente reduzida quando CpnIO foi adicionada durante o período dematuração (p<0,05). Em contraste, a expressão de HLA-DR foi inalteradasobre DC madura incubada com Cpn10, na ausência de agonista. (Figura 1é representativa de 3 experimentos independentes).

Em adição, foi verificado que quando que quando DCs derivadasde monócito foram incubadas junto com CpnIO por 20 horas antes de testede fluido sobrenadante, houve uma significante e dependente de dose dimi-nuição na liberação constitutiva de TNF-alfa no fluido de cultura de células.Estes resultados podem refletir a habilidade de CpnIO para reduzir ativaçãode célula (Figura 2, representativa de 4 experimentos independentes).

Exemplo 3 - Modulação de CpnIO de estimulação de célula T por DC

A capacidade de CpnIO modular estimulação de célula T por DCem uma reação de leucócito mista primária (MLR) pode ser investigada juntocom análises do efeito de CpnIO sobre maduração de DC em resposta aIigantes como prostaglandina E2, IL-Ιβ, IL-6 e TNF-α ou CD40L triméricosolúvel. Como mostrado na Figura 3, DCs derivadas de monócito cultivadasforam usadas para avaliar a capacidade de CpnIO modular a ativação decélula T em resposta a co-cultura com células T CD4+ alogenéicas por 6 diasantes de teste de sobrenadante de cultura de célula para produção de IFN-γ.

Dados mostrados na Figura 3 (representativos de dois experimentos inde-pendentes) indicam que acumulação de IFN-γ foi significantemente reduzidapor Cpn10. Dados mostrados na Figura 4 demonstram que CpnIO não afetaproliferação de célula T durante uma MLR primária, como determinado atra-vés de ensaio de proliferação de célula CyQUANT. (Dados na Figura 3 sãorepresentativos de dois experimentos independentes).

Exemplo 4 - Composições para tratamento

De acordo com o melhor modo de realização da invenção aquiprovida, específicas composições preferidas são esboçadas abaixo. Os se-guintes são para serem construídos como exemplos meramente ilustrativosde composições e não como uma limitação do escopo da presente invençãoem qualquer maneira.

Exemplo 4(a) - Composição para administração parenteral

Uma composição para injeção intramuscular pode ser preparadapara conter 1 mL de água tamponada estéril, e 1 mg de um composto apro-priado.

Similarmente, uma composição para infusão intravenosa podecompreender 250 mL de solução de Ringer estéril, e 5 mg de um compostoapropriado.

Exemplo 4(b) - Composição injetável parenteral

Uma composição apropriada para administração através de inje-ção pode ser preparada através de mistura de 1% em peso de um compostoapropriado em 10% em volume de propileno glicol e água. A solução é este-rilizada através de filtração.

Exemplo 4(c) - Composição de cápsula

Uma composição de um composto apropriado na forma de umacápsula pode ser preparada através de enchimento de uma cápsula de gela-tina dura de duas peças padrão com 50 mg do agente ou composto, em for-ma pulverizada, 100 mg de Iactose1 35 mg de talco e 10 mg de estearato demagnésio.

Exemplo 4(d) - Composição de gota ocular

Uma composição típica para liberação como uma gota ocular éesboçada abaixo:

Composto apropriado 0,3 g

Hidroxi benzoato de metila 0,005 g

Hidróxi benzoato de propila 0,06 g

Água purificada para cerca de 100,00 mL

Os hidróxi benzoatos de metila e propila são dissolvidos em 70mL de água purificada a 75°C, e a resultante solução é deixada resfriar.O apropriado composto é então adicionado, e a solução esterilizada por fil-tração através de um filtro membrana (0,22 μm de tamanho de poro), e as-septicamente embalado em recipientes estéreis.

Exemplo 4(e) - Composição para administração por inalação

Para um recipiente de aerossol com uma capacidade de 20-30mL: uma mistura de 10 mg de um composto apropriado com 0,5-0,8% empeso de um agente lubrificante, tal como polissorbato 85 ou ácido oléico, édispersa em um propelente, tal como freon, e colocado em um recipiente deaerossol apropriado para administração de inalação oral ou intranasal.

Exemplo 4(f) - Composição de pomada

Uma típica composição para liberação como uma pomada inclui1,0 g de um composto apropriado, junto com parafina mole branca para100,0 g, dispersa para produzir um produto homogêneo, uniforme.

Claims

1. Método para modulação de uma resposta imune em um sujei-to ou em pelo menos uma célula da mesma, tecido ou órgão, através demodulação de nível de expressão em superfície de célula de pelo menosuma molécula MHC, em que o dito método compreende administração deuma quantidade efetiva de chaperonina 10.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito méto-do ainda compreende modulação de uma resposta imune em um sujeito ouem pelo menos uma célula da mesma, tecido ou órgão, através de modula-ção de nível de expressão em superfície de célula de pelo menos uma outramolécula de superfície de célula, compreendendo administração de umaquantidade efetiva de chaperonina 10.

3. Método para tratamento ou prevenção de uma doença oucondição em um sujeito através de modulação de nível de expressão emsuperfície de célula de pelo menos uma molécula MHC, em que o dito méto-do compreende administração ao sujeito de uma quantidade efetiva de cha-peronina 10.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o dito méto-do ainda compreende tratamento ou prevenção de uma doença ou condiçãoem um sujeito através de modulação de nível de expressão em superfície decélula de pelo menos um outra molécula de superfície de célula, compreen-dendo administração de uma quantidade efetiva de chaperonina 10.

5. Método para modulação de nível de expressão em superfíciede célula de pelo menos uma molécula MHC ém um sujeito, ou em pelo me-nos uma célula da mesma, tecido ou órgão, em que o dito método compre-ende administração de uma quantidade efetiva de chaperonina 10.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o dito méto-do ainda compreende modulação de nível de expressão em superfície decélula de pelo menos uma outra molécula de superfície de célula em um su-jeito, ou em pelo menos uma célula da mesma, tecido ou órgão, compreen-dendo administração de uma quantidade efetiva de chaperonina 10.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 4ou 6, em que a outra molécula de superfície de célula é uma molécula co-estimuladora.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-7, em que a molécula MHC é selecionada do grupo compreendendo umamolécula Classe I MHC, uma molécula Classe Il MHC1 e uma molécula MHCnão-clássica.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a moléculaClasse Il MHC é selecionada do grupo compreendendo HLA-DR1 HLA-DP eHLA-DQ.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-9, em que a expressão em superfície de célula é aquela de uma célula apre-sentando antígeno.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a célulaapresentando antígeno é selecionada do grupo compreendendo um macró-fago, uma célula dendrítica e uma célula B.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-11, em que a chaperonina 10 é uma chaperonina 10 derivada naturalmente,produzida recombinantemente ou produzida sinteticamente.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-12, em que chaperonina 10 é de origem eucariótica.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-13, em que chaperonina 10 é de origem mamífera.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a chape-ronina 10 é chaperonina 10 humana.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a chape-ronina 10 compreende a seqüência de polipeptídeos como mostrada emSEQ ID N9: 1, SEQ ID NQ: 2 ou SEQ ID Ns: 3.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a chape-ronina 10 é acetilada ou não-acetilada.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-17, em que chaperonina 10 é administrada na forma de um polinucleotídeocodificando chaperonina 10.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o polinu-cleotídeo codificando chaperonina 10 está localizado em uma construçãogenética, ligada operavelmente a um promotor.

20. Método de acordo com a reivindicação 18 ou reivindicação-19, em que o polinucleotídeo compreende a seqüência como mostrada emSEQ ID Ns: 4.

21. Método para modulação de função de uma célula apresen-tando antígeno em um sujeito, ou em pelo menos um seu tecido ou órgão,em que o dito método compreende administração de uma quantidade efetivade chaperonina 10.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a célulaapresentando antígeno é selecionada do grupo compreendendo um macró-fago, célula dendrítica ou célula B.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21ou 22, em que a função é selecionada do grupo compreendendo migraçãopara um nódulo linfático, ativação de célula T ou proliferação de célula T.

24. Composição quando usada para o tratamento ou prevençãode uma doença ou condição, em que a dita composição compreende chape-ronina 10 junto com pelo menos um carreador, diluente ou adjuvante farma-ceuticamente aceitável, e em que a chaperonina 10 modula o nível de ex-pressão em superfície de célula de pelo menos uma molécula MHC.

25. Composição de acordo com a reivindicação 24, em que achaperonina 10 ainda modula o nível de expressão em superfície de célulade pelo menos uma outra molécula de superfície de célula.

26. Composição de acordo com a reivindicação 25, em que aoutra molécula de superfície de célula é uma molécula co-estimuladora.

27. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 24 a 26, em que a molécula de MHC é selecionada do grupo compre-endendo molécula Classe I MHC, uma molécula Classe Il MHC, e uma mo-lécula MHC não-clássica.

28. Composição de acordo com a reivindicação 27 em que a mo-lécula Classe Il MHC é selecionada do grupo compreendendo HLA-DR,HLA-DP e HLA-DQ.

29. Composição de acordo com a qualquer uma das reivindica-ções 24 a 28, em que a expressão em superfície de célula é aquela de umacélula apresentando antígeno.

30. Composição de acordo com a reivindicação 29, em que acélula apresentando antígeno é selecionada do grupo compreendendo ummacrófago, uma célula dendrítica e uma célula B.

31. Composição quando usada para o tratamento ou prevençãode uma doença ou condição, em que a dita composição compreende chape-ronina 10 junto com pelo menos um carreador, diluente ou adjuvante farma-ceuticamente aceitável, e em que a chaperonina 10 modula a função de umacélula apresentando antígeno em um sujeito, ou em pelo menos um seu te-cido ou órgão.

32. Composição de acordo com a reivindicação 31, em que acélula apresentando antígeno é selecionada do grupo compreendendo ummacrófago, uma célula dendrítica ou célula B.

33. Composição de acordo com a reivindicação 31 ou reivindica-ção 32, em que a função é selecionada do grupo compreendendo migraçãopara um nódulo linfático, ativação de célula T ou proliferação de célula T.

34. Uso de chaperonina 10 para a fabricação de um medicamen-to para o tratamento ou prevenção de uma doença ou condição, em que achaperonina 10 modula o nível de expressão em superfície de célula de pelomenos uma molécula de MHC.

35. Uso de acordo com a reivindicação 34, em que a chaperoni-na 10 ainda modula o nível de expressão em superfície de célula de pelomenos uma outra molécula de superfície de célula.

36. Uso de acordo com a reivindicação 35, em que a outra molé-cula de superfície de célula é uma molécula co-estimuladora.

37. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 36,em que a molécula MHC é selecionada do grupo compreendendo umamolécula Classe I MHC, uma molécula Classe Il MHC, e uma molécula MHCnão-clássica.

38. Uso de acordo com a reivindicação 37 em que a moléculaClasse Il MHC é selecionada do grupo compreendendo HLA-DR, HLA-DP eHLA-DQ.

39. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a-38, em que a expressão em superfície de célula é aquela de uma célula a-presentando antígeno.

40. Uso de acordo com a reivindicação 39, em que a célula a-presentando antígeno é selecionada do grupo compreendendo um macrófa-go, uma célula dendrítica e uma célula B.

41. Uso de chaperonina 10 para a fabricação de um medicamen-to para o tratamento ou prevenção de uma doença ou condição, em que achaperonina 10 modula a função de uma célula apresentando antígeno emum sujeito, ou em pelo menos um seu tecido ou órgão.

42. Uso de acordo com a reivindicação 41, em que a célula a-presentando antígeno é selecionada do grupo compreendendo um macrófa-go, uma célula dendrítica ou uma célula B.

43. Uso de acordo com a reivindicação 41 ou reivindicação 42,em que a função é selecionada do grupo compreendendo migração para umnódulo linfático, ativação de célula T ou proliferação de célula T.

44. Método para modulação de produção, localização dentro deuma célula e/ou expressão em superfície de célula de um ou mais imuno-moduladores em um sujeito, ou pelo menos uma célula da mesma, tecido ouórgão, em que o dito método compreende administração de uma quantidadeefetiva de chaperonina 10, e em que a chaperonina 10 modula o nível deexpressão em superfície de célula de pelo menos uma molécula MHC oupelo menos uma outra molécula de superfície de célula.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, em que a outramolécula de superfície de célula é uma molécula co-estimuladora.

46. Método de acordo com a reivindicação 44 ou reivindicação-45, em que a molécula MHC é selecionada do grupo compreendendo umamolécula Classe I MHC1 uma molécula Classe Il MHC, e uma molécula MHCnão-clássica.k.

47. Método de acordo com a reivindicação 46 em que a molécu-la Classe Il MHC é selecionada do grupo compreendendo HLA-DR, HLA-DPe HLA-DQ.

48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44a 47, em que a expressão de superfície de célula é aquela de uma célulaapresentando antígeno.

49. Método de acordo com a reivindicação 48, em que a célulaapresentando antígeno é selecionada do grupo compreendendo um macró-fago, uma célula dendrítica e uma célula B.

50. Método para identificação de um composto que modula umaresposta imune, em que o dito método compreende:(a) contato de uma célula ou extrato de célula com um compostocandidato na presença de Cpn10; e(b) determinação de se expressão sobre a superfície da dita cé-lula de pelo menos uma molécula MHC é modulada com contato com o ditocomposto candidato.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, em que o dito mé-todo ainda compreende:(c) determinação de se expressão sobre a superfície da dita cé-lula de pelo menos uma outra molécula de superfície de célula é moduladacom contato com o dito composto candidato.

52. Método para seleção de uma pluralidade de compostos paraidentificar um composto que modula uma resposta imune, em que o dito mé-todo compreende:(a) contato de uma célula ou extrato de célula com a dita plurali-dade de compostos na presença de Cpn10; e(b) determinação de se expressão sobre a superfície da dita cé-lula de pelo menos uma molécula MHC é modulada com contato com a ditopluralidade de compostos.

53. Método de acordo com a reivindicação 52, em que o dito mé-todo ainda compreende:(c) determinação de se expressão sobre a superfície da dita cé-lula de pelo menos uma outra molécula de superfície de célula é moduladacom contato com a dita pluralidade de compostos.

54. Método para indução de modulação do nível de expressãoem superfície de célula de pelo menos uma molécula MHC em um sujeito,ou em pelo menos uma célula da mesma, tecido ou órgão, em que o ditométodo compreende administração de uma quantidade efetiva de chapero-ninalO.

55. Método de acordo com a reivindicação 54, em que o dito mé-todo ainda compreende modulação do nível de expressão em superfície decélula de pelo menos uma outra molécula de superfície de célula em um su-jeito, ou em pelo menos uma célula da mesma, tecido ou órgão, compreen-dendo administração de uma quantidade efetiva de chaperonina 10.

56. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 51,-53 ou 55, em que a outra molécula de superfície de célula é uma moléculaco-estimuladora.

57. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50a 56, em que a molécula de MHC é selecionada do grupo compreendendouma molécula Classe I MHC, uma molécula Classe Il MHC, e uma moléculaMHC não-clássica.

58. Método de acordo com a reivindicação 57, em que a molécu-la Ciasse Il MHC é selecionada do grupo compreendendo HLA-DR, HLA-DPe HLA-DQ.

59. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50a 58, em que a expressão em superfície de célula é aquela de uma célulaapresentando antígeno.

60. Método de acordo com a reivindicação 59, em que a célulaapresentando antígeno é selecionada do grupo compreendendo um macró-fago, uma célula dendrítica, e uma célula B.

61. Método para identificação de um composto que modula umaresposta imune, em que o dito método compreende:(a) contato de uma célula ou extrato de célula com um compostocandidato na presença de Cpn10; e(b) determinação de se a migração da dita célula para um nódulolinfático ou a habilidade para ativar e/ou causar proliferação de células T émodulada com contato com o dito composto candidato.

62. Método para seleção de uma pluralidade de compostos paraidentificação de um composto que modula uma resposta imune, em que odito método compreende:(a) contato de uma célula ou extrato de célula com a dita plurali-dade de compostos na presença de Cpn10; e(b) determinação de se a migração da dita célula para um nódulolinfático ou a habilidade para ativar e/ou causar proliferação de células T émodulada com contanto com a dita pluralidade de compostos.

63. Método de acordo com a reivindicação 61 ou reivindicação-62, em que a célula é uma célula apresentando antígeno.

64. Método de acordo com a reivindicação 63, em que a célulaapresentando antígeno é selecionada do grupo compreendendo um macró-fago, uma célula dendrítica ou célula B.

65. Método para modulação de função de uma célula apresen-tando antígeno em um sujeito, ou em pelo menos um seu tecido ou órgão,em que o dito método compreende administração de uma quantidade efetivade chaperonina 10.

66. Método de acordo com a reivindicação 65, em que a célulaapresentando antígeno é selecionada do grupo compreendendo um macró-fago, célula dendrítica, ou célula B.

67. Método de acordo com a reivindicação 65 ou reivindicação-66, em que a função é selecionada do grupo compreendendo migração paraum nódulo linfático, ativação de célula T, ou proliferação de célula T.