BRPI0708512A2

BRPI0708512A2 - peridrolase para branqueamento de dente

Info

Publication number: BRPI0708512A2
Application number: BRPI0708512-5A
Authority: BR
Inventors: Edward M Concar; Ayrookaran J Poulose
Original assignee: Genencor Int
Priority date: 2006-03-03
Filing date: 2007-02-26
Publication date: 2011-05-31
Also published as: EP1991199A1; CN101394832A; RU2008139320A; WO2007103050A1; US20090311198A1

Abstract

PERIDROLASE PARA BRANQUEAMENTO DE DENTE. A presente invenção refere-se a composições e métodos para o uso de peridrolase para branquear dentes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PERIDRO-LASE PARA BRANQUEAMENTO DE DENTE".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a composições e métodos para ouso de peridrolase para branquear dentes.ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A maioria das pessoas deseja ter dentes brancos, brilhantes,visto que os dentes e sorriso são uma parte importante da imagem geral daface. Ao contrário, os dentes fortemente descobridos parecem doentiose/ou mesmo repulsivos. Os dentes mais brancos tendem a ser associadoscom a beleza e um estilo de vida saudável. Em geral, as pessoas com umsorriso mais luminoso tendem a sorrir mais e são freqüentemente menosinibidas. Além disso, um sorriso mais branco pode ajudar a minimizar o apa-recimento de rugas faciais, ao mesmo tempo em que fornecendo um apare-cimento mais jovem e enérgico. Além disso, um sorriso mais branco podetender a dar uma aparência mais amigável.

Desse modo, o branqueamento de dente é de grande interesse.Por muitos anos, poucas abordagens foram usadas para branquear dentes.As coroas e dentaduras foram por muito tempo consideradas os únicos mei-os de evitar a descoloração devido a exposição aos antimicrobianos (porexemplo, tetraciclina), café, vinho, chá, e tabaco. Realmente, embora o alve-jamento de dente tenha sido usado desde de 1870, seu uso não foi difundidoaté os últimos anos. O peróxido entrou primeiro em uso para alvejamento dedentes em 1880 e continua sendo o método de alvejamento de dente geral-mente usado. Os métodos recentemente desenvolvidos incluem tratamento a laser.

Embora o alvejamento de dente possa ser muito efetivos, há al-gumas desvantagens para muitos dos procedimentos. Por exemplo, uso dealvejante pode resultar dor nas gengivas e/ou dentes. Além disso, o alveja-mento não é efetivo para todas as pessoas. Realmente, até mesmo os mé-todos de laser mais novos não são sempre efetivos e a duração de tempoque o efeito dura pode ser relativamente curta (por exemplo, 12-18 meses).Desse modo, para algumas pessoas as coroas ou vernizes permanece sen-do a melhor escolha. Além disso, as bandejas geralmente usadas por alve-jamento doméstico podem ser incômodas. Realmente, embora o alvejamen-to de dente tenha se tornado mais comum e novos métodos e composiçõestenham sido desenvolvidas, permanece uma necessidade na técnica paramétodos seguros, efetivos, fáceis de usar e composições para embranque-cer dente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece composições e métodos para o usode peridrolase para branquear dentes. Em algumas modalidades, qualquerperácido adequado encontra uso no branqueamento de dentes e/ou méto-dos de limpeza e/ou composições da presente invenção.

A presente invenção fornece composições de cuidado oral quecompreendem pelo menos uma enzima de peridrolase. Em algumas modali-dades preferidas, as composições orais são produtos de cuidados orais se-lecionados de dentifrícios, pastas de dentes, pó para dente, lavagens de bo-ca, pré-enxágües, produtos de branqueamento de dentes, agentes de limpe-za de dentadura. Em algumas modalidades particularmente preferidas, aperidrolase compreende a seqüência de aminoácido apresentada na SEQ IDNO:2. Em algumas modalidades alternativas preferidas, a peridrolase é codi-ficada por uma seqüência de DNA que compreende a seqüência apresenta-da em SEQ ID NO: 1. Porém, não é pretendido que a presente invenção sejalimitada a estas seqüências específicas, uma vez que variantes numerosas,homólogos, derivados, etc., também encontram uso na presente invenção,ao mesmo tempo em que incluindo, porém não limitado às enzimas apresen-tadas no Pedido de Patente U.S. ne de Série 10/581.014 (aqui incorporadopor referência em sua totalidade). Em algumas modalidades, a composiçãocompreende uma quantidade de pelo menos uma peridrolase suficiente parabranquear dentes. Em modalidades adicionais, a composição também com-preende um sistema de geração de peróxido de hidrogênio. Em ainda outrasmodalidades, a composição também compreende peróxido de hidrogênio.Em ainda outras modalidades preferidas, a composição também compreen-de um sistema de geração de perácido. Em algumas modalidades preferidasadicionais, a composição também compreende um ácido selecionado deácido peracético e ácido acético.

A presente invenção também fornece métodos para alvejar den-tes que compreendem contatar os dentes com a composição de cuidado oralque compreende uma enzima de peridrolase, sob condições adequadas pa-ra alvejar dentes. Em algumas modalidades preferidas, as composições o-rais são produtos de cuidados orais selecionados de dentifrícios, pastas dedentes, pós para dente, lavagens de boca, pré-enxaguantes, produtos bran-queadores de dente, e agentes de limpeza de dentadura. Em algumas mo-dalidades particularmente preferidas, a peridrolase compreende a seqüênciade aminoácido apresentada em SEQ ID NO:2. Em algumas modalidadesalternativas preferidas, a peridrolase é codificada por uma seqüência deDNA que compreende a seqüência apresentada em SEQ ID NO: 1. Porém,não é pretendido que a presente invenção seja limitada a estas seqüênciasespecíficas, uma vez que numerosas variantes, homólogos, derivados, etc.,também encontram uso na presente invenção, incluindo, porém não limitadoàs enzimas apresentadas no Pedido de Patente U.S. n9 de Série 10/581.014(aqui incorporado por referência em sua totalidade). Em algumas modalida-des, a composição compreende uma quantidade de pelo menos um peridro-lase suficiente para branquear os dentes. Em modalidades adicionais, acomposição também compreende um sistema de geração de peróxido dehidrogênio. Em ainda outras modalidades, a composição também compre-ende peróxido de hidrogênio. Em ainda outras modalidades preferidas, acomposição também compreende um sistema de geração de perácido. Emalgumas modalidades preferidas adicionais, a composição também compre-ende um ácido selecionado de ácido peracético e ácido acético.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A maioria das pessoas considera que dentes limpos, brancossão esteticamente muito desejáveis. Porém, os dentes humanos não sãoverdadeiramente brancos, devido à amarelidão inerente dos dentes (isto é,devido ao manchamento intrínseco), e ao acúmulo de manchas externas nasuperfície dos dentes (isto é, manchamento extrínseco). Os dentes commanchas extrínsecas e/ou intrínsecas notáveis são censuráveis ao públicogeral tanto com base em aparência cosmética e uma indicação de higieneoral pobre.

Atualmente, a escovação de dente diária com dentifrícios é ométodo mais geralmente usado para remover manchas extrínsecas. Porém,a escovação de dentes sozinha é incapaz de completamente prevenir a for-mação de manchas extrínsecas. As áreas de dentição geralmente perdidasdurante a escovação de dente (por exemplo, as superfícies do dente inter-proximais, e as áreas Iinguais dos dentes anteriores), são muito propensasao acúmulo de manchas. Uma vez que a mancha tenha se formado, é muitodifícil a remoção sem obter uma limpeza dental profissional.

Relativamente recentemente, foi determinado que o ácido pera-cético é um agente alvejante ou de branqueamento surpreendentementeefetivo para dentes humanos descobridos ou manchados (Vide por exem-plo, EP 599 435BI e EP 545 594B1). EP 545 594 indica que uma soluçãoaquosa de 1% (em peso) de ácido peracético dá origem a um efeito debranqueamento mais rápido e superior quando aplicada aos dentes em tem-peraturas ambiente a faixa oral do que uma solução aquosa de 30% (empeso) de peróxido de hidrogênio. Além disso, o ácido peracético pode seraplicado diretamente aos dentes como através de aplicação de cotonete,incorporado em uma composição oral tal como uma pasta de dentes, gel ouenxaguante que deve ser aplicado topicamente, ou gerado in situ na compo-sição oral pela reação de uma fonte de peróxido tal como peróxido de hidro-gênio, peróxido de uréia, perborato de sódio, percarbonato de sódio, e peró-xidos de metal, por exemplo, SrO2, CaO2 e NaO2, com um ativador ou pre-cursor de peroxiácido que contém grupos de acetila lábeis. Os exemplosilustrativos de tais ativadores incluem tetracetiletilenodiamina, pentaacetilgli-cose, tetracetilglicoluril, hexaacetato de sorbitol ou pentaacetato de frutose.

Uma das desvantagens principais associadas com o uso de áci-do peracético empacotado para consumo interno pelo consumidor é sua ins-tabilidade relativa. As soluções aquosas a 1% diluídas de ácido peracéticosubstancialmente se decomporão em tão menos quanto 30 dias a tempera-turas ambientes. O armazenamento a 3°C significantemente melhora a esta-bilidade, porém não na medida requerida para a idade de mercado normalpara um produto de consumo ou profissional. Além disso, muitos adjuvantescomuns presentes nos produtos de consumidor e profissional tal como flavo-rizantes e outros materiais orgânicos podem reagir rapidamente com ácidoperacético, ao mesmo tempo em que destruindo os adjuvantes e o ácidoperacético.

Estes fatores tendem a ditar que uma abordagem preferida parao emprego de sustância química de ácido peracético em aplicações de denti-frício é para gerar o ácido peracético in situ na hora de uso. Nestas modali-dades anteriores, uma fonte de peróxido de hidrogênio e um derivado decarboxilato de ácido acético, tal como uma amida ou um éster, pode ser mis-turada junto em água a um pH elevado suficiente para gerar concentraçãosuficiente de ânion de peridroxila do peróxido de hidrogênio. Em contraste, apresente invenção fornece um meio in situ para enzimaticamente gerar pe-rácido por branqueamento de dente.

Além disso, a Patente U.S. nQ 5.055.305 (incorporada aqui porreferência em sua totalidade) descreve os comprimidos efervescentes para alimpeza in vitro de dentaduras que contêm, como componentes essenciais,um agente alvejante que compreende sais de perborato de persulfato ouhidratos de pirofosfato ou peróxidos de metal, um precursor alvejante de pe-roxiácido e uma composição de base de produção de efervescência. Entreos numerosos precursores de perácido orgânicos descritos estão ésteres deácido carboxílico tal como ácido acetilsalicílico (Vide por exemplo, BR836,988; incorporado aqui por referência em sua totalidade). É contempladoque a geração enzimática in situ de ácido peracético ou outros perácidospela peridrolase da presente invenção também encontre uso nos métodosde limpeza de dentadura similares.

EP 400 858 (incorporado aqui por referência em sua totalidade)descreve uma composição granular para a limpeza in vitro de dentadurasque compreendem um agente alvejante persal inorgânico que, um precursoralvejante de peroxiácido orgânico e um gerador de efervescência. É con-templado que a geração enzimática in situ de ácido peracético ou outros pe-rácidos pela peridrolase da presente invenção também encontre uso em mé-todos de limpeza de dentadura similares.

Em algumas modalidades, a presente invenção encontra uso nageração enzimática de perácidos de substratos de éster e peróxido de hidro-gênio. Em algumas modalidades preferidas, os substratos são selecionadosde um ou mais dos seguintes: ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico,ácido butírico, ácido valérico, ácido capróico, ácido caprílico, ácido nonanói-co, ácido decanóico, ácido dodecanóico, ácido mirístico, ácido palmítico, á-cido esteárico, e ácido oléico. Importantemente, a presente invenção fornecemeios para alvejamento/branqueamento efetivo em faixas amplas de pHamplo e temperatura. Em algumas modalidades, a faixa de pH utilizada nes-ta geração é 4-10. Em algumas modalidades alternativas, a faixa de tempe-ratura utilizada é entre 5o e 4°C. A presente invenção fornece alvejante nopH ideal de oxidação de perácido, como também fornecendo alvejamentoem pH neutro, pHs ácidos, pH alcalino e em baixas temperaturas.

Nessas aplicações onde as composições de dentifrício são de-signadas para uso in vivo, é essencial que o ácido peracético seja gerado etrabalhe rapidamente, desde que o usuário regularmente deseje limitar otempo no qual o dentifrício está em contato com os dentes. Além disso, aclasse de geradores de peróxido e precursores alvejantes de ácido peróxiúteis para aplicação in vivo aos dentes é severamente limitada devido à exi-gência que estes componentes sejam fisiologicamente seguros e não irritan-tes aos tecidos orais. Uma exigência adicional para uso in vivo é que o ácidoperacético é gerado a um pH relativamente neutro, perto do pH neutro fisio-lógico seguro de 7.

A geração in situ e uso de ácido peracético como fornecido aquirepresenta várias vantagens sobre os métodos e composições conhecidosna técnica, incluindo controle sobre o quanto rápido e onde o ácido peracéti-co é gerado, como também fornecendo flexibilidade ao escolher um precur-sor mais estável para formulações de cuidado orais. Esta flexibilidade naescolha de enzima e substrato também fornece sistemas que encontram usona localização de produção de perácido no dente.

Durante o desenvolvimento da presente invenção, vários níveisde ácido peracético foram comparados com controles negativos mais amare-los, um controle positivo de peróxido de hidrogênio, e ácido peracético gera-do por peridrolase de diacetato de propileno glicol e peróxido de hidrogênio.Estes resultados indicaram que o ácido peracético enzimaticamente geradoproduziu embranquecimento de dente clinicamente significante.

Além disso, a presente invenção fornece métodos e composi-ções para o armazenamento estável de precursores de perácido para apli-cações de branqueamento de dentes. Estas composições e métodos tam-bém encontram us em alvejamento de dentes postiços (por exemplo, denta-duras). Além disso, a geração in situ de perácidos usando os métodos ecomposições da presente invenção liberam uma espécie oxidativa mais for-tes localmente para o alvejando e branqueamento de manchas de dente in-trínsecas, com sensibilização mínima do paciente.

Além disso, as enzimas peridrolase e/ou hidrolase da presenteinvenção são ativas em vários substratos doadores de acila, como tambémsendo ativas em concentrações de substrato mais baixas, e fornecem meiospara peridrólise eficiente devido à relação de perácido:ácido elevada. Real-mente, foi reconhecido que as relações de peridrólise mais elevada para dehidrólise são preferidas para aplicações de alvejamento (Vide, por exemplo,Patentes dos Estados Unidos nQ 5.352.594, 5.108.457, 5.030.240, 3974.082,e 5.296.616 todas das quais estão aqui incorporadas por referência). Emalgumas modalidades preferidas, as enzimas de peridrolase da presenteinvenção fornecem relações de peridrólise para hidrólise que são maiores doque 1. Em algumas modalidades particularmente preferidas, as enzimas deperidrolase fornecem uma relação de peridrólise para hidrólise maior do que1 e são encontrados usos no alvejamento.

Como indicado acima, os componentes principais para produçãode perácido por peridrólise enzimática são enzima, substrato de éster, e pe-róxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio pode ser adicionado direta-mente em batelada, ou gerado continuamente "in siti/'. Porém, estas enzi-mas também encontram uso com qualquer outra fonte adequada de H2O2,incluindo aquela gerada por meios químicos, eletro-químicos, e/ou enzimáti-cos. Os exemplos de fontes químicas são os percarbonatos e perboratosmencionados acima, ao mesmo tempo em que um exemplo de uma fonteeletroquímica é uma pilha termelétrica alimentada de gás oxigênio e hidro-gênio, e um exemplo enzimático inclui produção de H2O2 da reação de glico-se com glicose oxidase. A seguinte equação fornece um exemplo de um sis-tema acoplado que encontra uso com a presente invenção.

GlicoseOxidase

Glicose + H2O...............................-................> ácido glicônico + H2O2

+

Peridrolase

H2O2 + substrato de éster.....................................> álcool + perácido

Este sistema gera ácido(s) que em algumas modalidades, resul-ta em uma redução do pH do sistema. Não é pretendido que a presente in-venção seja limitada a qualquer enzima específica, como qualquer enzimaque gera H2O2 e ácido com um substrato adequado encontra uso nos méto-dos da presente invenção. Por exemplo, Iactato oxidases de espécies deLactobacillus que são conhecidas para criar H2O2 de ácido lático e oxigênioencontra uso com a presente invenção. Realmente, uma vantagem dos mé-todos da presente invenção é que a geração de ácido (por exemplo, ácidoglicônico no exemplo anterior) reduz o pH de uma solução básica para a fai-xa de pH na qual o perácido é muito efetivo no alvejamento (isto é, a ou a -baixo do pKa). Outras enzimas (por exemplo, carboidrato oxidase, álcooloxidase, etileno glicol oxidase, glicerol oxidase, aminoácido oxidase, etc.)que também podem gerar peróxido de hidrogênio também encontram usocom substratos de éster em combinação com as enzimas de peridrolase dapresente invenção para gerar perácidos. As enzimas que geram ácido desubstratos sem a geração de peróxido de hidrogênio também encontram usona presente invenção. Os exemplos de tais enzimas incluem, porém nãoestão limitados a esterases, lipases, fosfolipases, cutinases, protease. Emalgumas modalidades preferidas, os substratos de éster são selecionados deum ou mais dos seguintes ácidos: ácido fórmico, ácido acético, ácido propiô-nico, ácido butírico, ácido valérico, ácido capróico, ácido caprílico, ácido no-nanóico, ácido decanóico, ácido dodecanóico, ácido mirístico, ácido palmíti-co, ácido esteárico, e ácido oléico. Desse modo, como descrito aqui, a pre-sente invenção fornece vantagens definidas sobre os métodos e composi-ções atualmente usados.

Desse modo, é contemplado que dentes mais brancos serãoobtidos e serão mantidos sem mancha pelo uso das composições da pre-sente invenção. É contemplado que a peridrolase da presente invenção en-contrará uso em composições tal como pastas de dentes, géis dentais, en-xaguante antiplaca, líquidos para limpeza bucal, etc., para fornecer e manterdentes mais brancos. Em alguns formatos preferidos, os enxágües dentaiscompreendendo a peridrolase da presente invenção são usados para alcan-çar as áreas mais inacessíveis de superfícies de dente, como também forne-cer penetração no esmalte de dente para remover manchas intrínsecas.Também é contemplado que a presente invenção encontrará uso junto comescovação de dente regular, embora não seja pretendido que a presenteinvenção seja limitada ao uso adicional de escova de dente e/ou qualqueroutro método de manutenção dental.

Definições

A menos que definido de outro modo aqui, todos os termos téc-nicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como geralmenteentendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. Porexemplo, Singleton e Sainsbury, Dictionary of Microbiology and MolecularBiology, 2- Ed., John Wiley e Sons, NY (1994); e Hale e Marham, The Har-per Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) fornece aque-les de experiência na técnica com um dicionário geral de muitos dos termosusados na invenção. Embora qualquer método e material similar ou equiva-lente àqueles descritos aqui encontre uso na prática da presente invenção,os métodos e materiais preferidos são descritos aqui. Conseqüentemente,os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente descri-tos através de referência ao relatório descritivocomo um todo. Além disso,como usado aqui, os termos singulares "um", "uma", e " o", "a" incluem areferência plural a menos que o contexto indique claramente de outro modo.

A menos que de outro modo indicado, os ácidos nucléico são escritos daesquerda para direita em orientação 5' a 3'; as seqüências de aminoácidosão escritas da esquerda para direita em orientação de amino para carbóxi,respectivamente. Será entendido que esta invenção não é limitada à meto-dologia, protocolos, e reagentes particulares descritos, uma vez que estespodem variar, dependendo do contexto que é usado por aqueles de versa-dos na técnica.

É pretendido que cada limitação máxima numérica dada ao lon-go deste relatório descritivo inclua cada limitação numérica mais baixa, comose tais limitações numéricas mais baixas fossem escritas expressamenteaqui. Cada limitação numérica mínima dada ao longo deste relatório descriti-vo incluirá cada limitação numérica mais elevada, como se tais limitaçõesnuméricas mais elevadas fossem escritas expressamente aqui. Cada faixanumérica dada ao longo deste relatório descritivo incluirá cada faixa numéri-ca mais estreita que se inclui em tal faixa numérica mais ampla, como se taisfaixas numéricas mais estritas fossem todas expressamente escritas aqui.

Como usado aqui, os termos "branqueamento de dente" e "alve-jamento de dente" são alternadamente usados, para se referir à melhora dobrilho (por exemplo, branqueamento) de um dente ou dentes. É pretendidoque o termo abranja qualquer método adequado para embranquecer dentes,incluindo a presente invenção, como também tratamento químico, tratamen-to de ácido moderado, branqueamento de dente por abrasivo, e branquea-mento de dente a laser. Em modalidades particularmente preferidas, a pre-sente invenção fornece uma peridrolase e composições contendo peridrola-se adequadas para branquear dentes.

Como usado aqui, "manchas intrínsecas" em dentes se refere àcor resultante de cromógenos dentro do esmalte e dentina subjacente. A corintrínseca de dentes humanos tende a ficar mais amarela com o envelheci-mento, devido à redução do esmalte e escurecimento da dentina amarelasubjacente. A remoção de mancha intrínseca normalmente requer o uso deperóxidos ou outras substâncias químicas oxidantes, que penetram o esmal-te e descoloram os cromógenos internos.

Em contraste com as manchas intrínsecas, as "manchas extrín-secas" se formam na superfície dos dentes quando materiais cromogênicosexógenos se ligam ao esmalte, normalmente dentro da película que cobrenaturalmente os dentes. A maioria das pessoas acumula algum grau demanchas extrínsecas pouco apresentáveis nos seus dentes com o passar dotempo. Este processo de manchamento é promovido por tais fatores como:(1) a ingestão de comidas e bebidas contendo tanino tal como café, chá, ouvinho tinto; (2) o uso de produtos de tabaco; e/ou (3) exposição a certassubstâncias catiônicas (por exemplo, estanho, ferro, e clorexidina). Estassubstâncias tendem a se aderir a estrutura de hidroxiapatita do esmalte, queleva a descoloração de dente e uma redução concomitante na brancura dodente. Durante um período de anos, as manchas extrínsecas podem pene-trar a camada de esmalte e podem resultar em manchas intrínsecas.

Como usado aqui, o termo "peridrolase" se refere a uma enzimaque é capaz de catalisar uma reação que resulta na formação de quantida-des suficientemente elevadas de perácido adequado para branquear dentes.Em modalidades preferidas adicionais, as peridrolases da presente invençãosão caracterizadas tendo seqüências primárias e estrutura terciária distinta.Em modalidades particularmente preferidas, as peridrolases da presenteinvenção compreendem estruturas primárias e terciárias distintas. Em algu-mas modalidades particularmente preferidas, as peridrolases da presenteinvenção compreendem estruturas quaternárias distintas. Em algumas mo-dalidades preferidas, a peridrolase da presente invenção é a peridrolase deM. smegmatis, ao mesmo tempo em que em modalidades alternativas, aperidrolase é uma variante desta peridrolase, ao mesmo tempo em que emainda outras modalidades, a peridrolase é um homólogo desta peridrolase.Em outras modalidades preferidas, uma hidrolase monomérica é criada paraproduzir uma enzima multimérica que tem atividade de peridrolase melhor doque o monômero. Porém, não é pretendido que a presente invenção sejalimitada a esta peridrolase de M. smegmatis específica, variantes específicasdesta peridrolase, nem homólogos específicos desta peridrolase. Em moda-lidades particularmente preferidas, a peridrolase inclui aquelas descritas emUS04/40438 e Pedido de Patente U.S. nQ de Série 10/584.014, como (ambosdos quais estão aqui incorporados por referência em sua totalidade). Emalgumas modalidades particularmente preferidas, a peridrolase compreendea seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO:2 que em algumasmodalidades preferidas é codificada pela seqüência de DNA apresentadaem SEQ ID NO: 1, ambas das quais são apresentadas abaixo. Porém, não épretendido que a presente invenção seja limitada a estas seqüências especí-ficas, como variantes, homólogos e derivados também encontram uso napresente invenção. Realmente, o Pedido de Patente U.S. Nq de Série10/584.014 descreve numerosas variantes e homólogos que encontram usona presente invenção.

MAKRILCFGDSLTWGWVPVEDGAPTERFAPDVRWTGVLAQQLGADFEVIEEGLSARTTNIDDPTDPRLNGASYLPSCLATHLPLDL VIIMLGTNDTKA YFRRTPLDIALGMSVLVTQVLTSAGG VGTTYPAPKVLVVSPPPLAPMPHPWFQLIFEGGEQKTTELARVYSALASFMKVPFFDAGSVISTDGVDGIHFTEANNRDLGVALAEQVRSLL (SEQ ID NO:2). 5-

ATGGCCAAGCGAATTCTGTGTTTCGGTGATTCCCTGACCTGGGGCTGGGTCCCCGTCGAAGACGGGGCACCCACCGAGCGGTTCGCCCCCGACGTGCGCTGGACCGGTGTGCTGGCCCAGCAGCTCGGAGCGGACTTCGAGGTGATCGAGGAGGGACTGAGCGCGCGCACCACCAÀCATCGACGACCCCACCGATCCGCGGCTCAACGGCGCGAGCT ACCTGCCGTCGTGCCTCGCGACGCACCTGCCGCTCGACCTGGTGATCATCATGCTGGGCACCAACGACACCAAGGCCTACTTCCGGCGCACCCCGCTCGACATCGCGCTGGGCATGTCGGTGCTCGTCACGCAGGTGCTCACCAGCGCGGGCGGCGTCGGCACCACGTACCCGGCACCCAAGGTGCTGGTGGTCTCGCCGCCACCGCTGGCGCCCATGCCGCACCCCTGGTTCCAGTTGATCTTCGAGGGCGGCGAGCAGAAGACCACTGAGCTCGCCCGCGTGTACAGCGCGCTCGCGTCGTTCATGAAGGTGCCGTTCTTCGACGCGGGTTCGGTGATCAGCACCGACGGCGTCGACGGAATCCACTTCACCGAGGCCAACAATCGCGATCTCGGGGTGGCCCTCGCGGAACAGGTGCGGAGCCTGCTGTAA-3' (SEQ ID NO: 1)

Como usado aqui, "produtos de cuidado pessoais" significamprodutos usados na limpeza, alvejamento e/ou desinfecção de cabelo, pele,couro cabeludo, e dentes, incluindo, porém não limitados a xampus, loçõesde corpo, géis de banho, hidratantes tópicos, pasta de dentes, géis paradentes, líquidos para limpeza bucal, enxaguantes bucais, enxaguantes anti-placa, e/ou outros limpadores tópicos. Em algumas modalidades particular-mente preferidas, estes produtos são utilizados em seres humanos, aomesmo tempo em que em outras modalidades, estes produtos encontramuso com animais não humanos (por exemplo, em aplicações veterinárias).

Como usado aqui, "farmaceuticamente aceitáveis" significa queos fármacos, medicamentos e/ou ingredientes inertes que o termo descrevesão adequados para uso em contato com os tecidos de humanos e outrosanimais sem toxicidade imprópria, incompatibilidade, instabilidade, irritação,resposta alérgica, e outros, comensurável com uma relação de benefí-cio/risco razoável.

Como usado aqui, "composições de limpeza" e "formulações delimpeza" se referem às composições que acham uso na remoção de com-postos indesejados de dentes (líquidos para limpeza bucal, pastas de den-tes) etc. O termo abrange qualquer material/composto selecionado para otipo particular de composição de limpeza desejada e a forma do produto (porexemplo, líquido, pasta, gel, emulsão, grânulo, ou composição de spray),contanto que a composição seja compatível com a peridrolase e outra(s)enzima(s) usada(s) na composição.

Como usado aqui, "desempenho realçado" em uma composiçãocontendo peridrolase é definido como limpeza crescente de manchas sensí-veis a alvejantes comparada a outras composições, como determinado u-sando métodos-padrão na técnica dental. Em modalidades particulares, aperidrolase da presente invenção fornece desempenho aumentado na oxi-dação e remoção de manchas coloridas. Em outras modalidades, a peridro-lase da presente invenção fornece desempenho aumentado na descoloriza-ção e/ou remoção de manchas.

Como usado aqui, o termo "compatível", significa que os materi-ais de composição de limpeza não reduzem a atividade enzimática da peri-drolase a uma tal extensão que a peridrolase não seja efetiva como deseja-do durante situações de uso normais. Os materiais de composição de limpe-za específicos são exemplificados em detalhes em seguida.

Como usado aqui, "quantidade efetiva de enzima peridrolase" serefere à quantidade de enzima peridrolase necessária para alcançar a ativi-dade enzimática requerida na aplicação específica. Tais quantidades efeti-vas são facilmente averiguadas por alguém versado na técnica e são combase em muitos fatores, tal como a variante de enzima particular usada, aaplicação de limpeza, a composição específica da composição de limpeza, ese uma composição líquida ou não líquida (por exemplo, emulsão) é requeri-da, e similares.

Como usado aqui, "composições de limpeza orais" se referemaos dentifrícios, pastas de dentes, géis de dentes, pós para dentes, líquidospara limpeza bucal, sprays de boca, géis de boca, chicletes, pastilhas, sa-chês, comprimidos, biogéis, pastas de profilaxia, soluções de tratamentodental, e similares. As composições de cuidado oral que encontram uso jun-to com a peridrolases da presente invenção são bem-conhecidas na técnica(Vide por exemplo, Patente U.S. nQ 5.601.750, 6.379.653, e 5.989.526 todasdas quais estão aqui incorporadas através de referência em sua totalidade).

Como usado aqui, "acila" é o nome geral para grupos de ácidoorgânico, que são os resíduos de ácidos carboxílicos após a remoção dogrupo -OH (por exemplo, cloreto de etanoíla, CH3CO-CI, é o cloreto de acilaformado de ácido etanóico, CH3COO-H). Os nomes dos grupos acila indivi-duais são formados substituindo o "-ico" do ácido por "-ila".

Como usado aqui, o termo "acilação" se refere à transformaçãoquímica que substitui o grupo acil (RCO -) grupo em uma molécula, geral-mente para um hidrogênio ativo de um grupo -OH.

Como usado aqui, o termo "transferase" se refere a uma enzimaque catalisa a transferência de compostos funcionais para uma faixa desubstratos.

Como usado aqui, " grupo de saída" se refere ao nucleófilo queé clivado do doador de acila em substituição por outro nucleófilo.

Como usado aqui, o termo "conversão enzimática" se refere àmodificação de um substrato por um intermediário ou a modificação de umintermediário por um produto final contatando-se o substrato ou intermediáriocom uma enzima. Em algumas modalidades, o contato é feito diretamenteexpondo o substrato ou intermediário à enzima apropriada. Em outras moda-lidades, contatar compreende expor o substrato ou intermediário a um orga-nismo que expressa e/ou excreta a enzima, e/ou metaboliza o substrato de-sejado e/ou intermedeia para o intermediário e/ou produto final desejado,respectivamente.

Como usado aqui, a frase, "estabilidade para proteólise" se refe-re à capacidade de uma proteína (por exemplo, uma enzima) de resistir àproteólise. Não é pretendido que o termo seja limitado ao uso de qualquerprotease particular para avaliar a estabilidade de uma proteína.

Como usado aqui, "estabilidade oxidativa" se refere à capacida-de de uma proteína de funcionar sob condições oxidativas. Em particular, otermo se refere à capacidade de uma proteína funcionar na presença de vá-rias concentrações de H2O2 e/ou perácido. A estabilidade sob várias condi-ções oxidativas ou pode ser medida por procedimentos-padrão conhecidospor aqueles versados na técnica e/ou pelos métodos descritos aqui. Umamudança significativa na estabilidade oxidativa é comprovada em pelo me-nos cerca de 5% ou maior aumento ou diminuição (na maioria das modali-dades, é preferivelmente um aumento) na meia-vida da atividade enzimática,quando comparado com a atividade enzimática presente na ausência decompostos oxidativos.

Como usado aqui, "estabilidade de pH" se refere à capacidadede uma proteína funcionar em um pH particular. Em geral, a maioria das en-zimas tem uma faixa de pH finita na qual elas funcionarão. Além das enzi-mas que funcionam em pHs de faixa média (isto é, em cerca de pH 7), háenzimas que são capazes de funcionar sob condições com pHs muito altosou muito baixos. A estabilidade em vários pHs pode ser medida ou por pro-cedimentos-padrão conhecidos por aqueles (versados na técnica e/ou pelosmétodos descritos aqui. Uma mudança significativa em estabilidade de pH écomprovada pelo menos em cerca de 5% ou maior aumento ou diminuição(na maioria das modalidades, é preferivelmente um aumento) na meia-vidada atividade enzimática, quando comparado à atividade enzimática no pHideal da enzima. Porém, não é pretendido que a presente invenção seja limi-tada a qualquer nível de estabilidade de pH nem faixa de pH.

Como usado aqui, "estabilidade térmica" se refere à capacidadede uma proteína funcionar em uma temperatura particular. Em geral, a maio-ria das enzimas tem uma faixa finita de temperaturas na quais elas funciona-rão. Além das enzimas que trabalham em temperaturas de faixa média (porexemplo, temperatura de quarto), há enzimas que são capazes de funcionarem temperaturas muito altas ou muito baixas. A estabilidade térmica podeser medida ou através de procedimentos conhecidos ou pelos métodos des-critos aqui. Uma mudança significativa em estabilidade térmica é comprova-da em pelo menos cerca de 5% ou maior aumento ou diminuição (na maioriadas modalidades, é preferivelmente um aumento) na meia-vida da atividadecatalítica de um mutante quando exposto a uma temperatura diferente (istoé, mais alta ou mais baixa) do que a temperatura ideal para atividade enzi-mática. Porém, não é pretendido que a presente invenção seja limitada aqualquer nível de estabilidade de temperatura nem faixa de temperatura.

Como usado aqui, o termo "estabilidade química" se refere àestabilidade de uma proteína (por exemplo, uma enzima) para substânciasquímicas que adversamente afetam sua atividade. Em algumas modalida-des, tais substâncias químicas incluem, porém não estão limitadas ao peró-xido de hidrogênio, perácidos, detergentes aniônicos, detergentes catiônicos,detergentes não iônicos, quelantes, etc. Porém, não é pretendido que a pre-sente invenção seja limitada a qualquer nível de estabilidade química parti-cular nem faixa de estabilidade química.

Como usado aqui, os termos "purificado" e "isolado" se referemà remoção de contaminantes de uma amostra. Por exemplo, as peridrolasessão purificadas por remoção de proteínas contaminantes e outros compostosdentro de uma solução ou preparação que não seja a peridrolase. Em algu-mas modalidades, as peridrolases recombinantes são expressas em célulashospedeiras bacterianas ou fúngicas e esta peridrolase recombinante é puri-ficada pela remoção de outros componentes de célula hospedeira; a porcen-tagem de polipeptídeos de peridrolase recombinante é desse modo aumen-tada na amostra.

Como usado aqui, "proteína" se refere a qualquer composiçãocompreendida de aminoácidos e reconhecida como uma proteína por aque-les versados na técnica. Os termos "proteína", "peptídeo" e "polipeptídeo"são aqui alternadamente usados. Onde um peptídeo é uma porção de umaproteína, aqueles versados na técnica entendem o uso do termo em contexto.

Como usado aqui, proteínas funcionalmente e/ou estruturalmen-te similares são consideradas serem "proteínas relacionadas". Em algumasmodalidades, estas proteínas são derivadas de uma espécie e/ou gênerodiferentes, incluindo diferenças entre classes de organismos (por exemplo,uma proteína bacteriana e uma proteína fúngica). Em algumas modalidades,estas proteínas são derivadas de uma espécie e/ou gênero diferentes, inclu-indo diferenças entre as classes de organismos (por exemplo, uma enzimabacteriana e uma enzima fúngica). Em modalidades adicionais, proteínasrelacionadas são fornecidas das mesmas espécies. Realmente, não é pre-tendido que a presente invenção seja limitada às proteínas relacionadas dequalquer fonte(s) particular. Além disso, o termo "proteínas relacionadas"abrange homólogos estruturais terciários e homólogos dè seqüência primária(por exemplo, a peridrolase da presente invenção). Nas modalidades adicio-nais, o termo abrange proteínas que são imunologicamente reagidas porcruzamento.

Como usado aqui, o termo "derivado" se refere a uma proteínaque é derivada de uma proteína por adição de um ou mais aminoácidos aqualquer uma ou ambas as extremidades de terminal de C e N, substituiçãode um ou mais aminoácidos em um ou vários sítios diferentes na seqüênciade aminoácido, e/ou deleção de um ou mais aminoácidos em qualquer umaou ambas as extremidades da proteína ou em um ou mais sítios na seqüên-cia de aminoácido. A preparação de um derivado de proteína é preferivel-mente obtida modificando uma seqüência de DNA que codifica para a prote-ína nativa, transformação daquela seqüência de DNA em um hospedeiroadequado, e expressão da seqüência de DNA modificada para formar a pro-teína derivada.

As proteínas relacionadas (e derivadas) compreendem "proteí-nas variantes". Em algumas modalidades preferidas, as proteínas variantesdiferem de uma proteína-origem e uma outra por um número pequeno deresíduos de aminoácido. O número de resíduos de aminoácido diferentespode ser um ou mais, preferivelmente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, oumais resíduos de aminoácido. Em algumas modalidades preferidas, o núme-ro de aminoácidos diferentes entre as variantes está entre 1 e 10. Em algu-mas modalidades particularmente preferidas, as proteínas relacionadas eparticularmente proteínas variantes compreendem pelo menos 35%, 40%,45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%,ou 99% de identidade de seqüência de aminoácido. Adicionalmente, umaproteína relacionada ou uma proteína variante como usado aqui, se refere auma proteína que difere de outra proteína relacionada ou uma proteína-origem no número de regiões proeminentes. Por exemplo, em algumas mo-dalidades, as proteínas variantes têm 1, 2, 3, 4, 5, ou 10 regiões proeminen-tes correspondentes que diferem da proteína-origem.

Vários métodos são conhecidos na técnica os quais são ade-quados para gerar variantes das enzimas de peridrolase da presente inven-ção, incluindo, porém não limitado a mutagênese de saturação de sítio, mu-tagênese de varredura, mutagênese insercional, mutagênese aleatória, mu-tagênese direcionada ao sítio, e evolução direcionada, como também váriasoutras abordagens recombinatórias.

Como usado aqui, o termo "seqüência análoga" se refere a umaseqüência dentro de uma proteína que fornece função similar, estrutura ter-ciária, e/ou resíduos conservados como a proteína de interesse (isto é, tipi-camente a proteína original de interesse). Por exemplo, nas regiões de epí-topo que contêm uma hélice alfa ou uma estrutura de folha beta, a substitui-ção de aminoácidos na seqüência análoga preferivelmente mantém a mes-ma estrutura específica. O termo também se refere às seqüências de nu-cleotídeo, como também seqüências de aminoácido. Em algumas modalida-des, as seqüências análogas são desenvolvidas tal que os aminoácidos desubstituição resultem em uma enzima variante que mostra uma função simi-lar ou melhorada. Em algumas modalidades preferidas, a estrutura terciáriae/ou resíduos conservados dos aminoácidos na proteína de interesse ficamsituados em ou próximo do segmento ou fragmento de interesse. Desse mo-do, onde o segmento ou fragmento de interesse contém, por exemplo, umaestrutura de alfa-hélice ou beta-folha, os aminoácidos de substituição prefe-rivelmente mantêm aquela estrutura específica.

Como usado aqui, "proteína homóloga" se refere a uma proteína(por exemplo, peridrolase) que tem ação e/ou estrutura similar a uma proteí-na de interesse (por exemplo, uma peridrolase de outra fonte). Não é pre-tendido que homólogos necessariamente estejam relacionados evolutiva-mente. Desse modo, é pretendido que o termo abranja a mesma ou enzi-ma(s) similar(es) (isto é, em termos de estrutura e função) obtida de espé-cies diferentes. Em algumas modalidades preferidas, é desejável identificarum homólogo que tem uma estrutura primária, terciária e/ou quaternária,similar à proteína de interesse, como substituição para o segmento ou frag-menta na proteína de interesse com um segmento análogo do homólogoreduzirá a disruptividade da mudança. Em algumas modalidades, as proteí-nas homólogas têm que induzir resposta(s) imunológicas similares comouma proteína de interesse.

Como usado aqui, "genes homólogos" se referem a pelo menosum par de genes de espécies diferentes, cujos genes correspondem a cadaoutro e que são idênticos ou bem-parecidos com cada outro. O termo abran-ge genes que são separados através de especiação (isto é, o desenvolvi-mento de novas espécies) (por exemplo, genes ortólogos), como tambémgenes que foram separados por duplicação genética (por exemplo, genesparálogos). Estes genes codificam "proteínas homólogas".

Como usado aqui, "ortólogo" e "genes de ortólogos" se referemaos genes em espécies diferentes que evoluíram de um gene ancestral co-mum (isto é, um gene homólogo) através dé especiação. Tipicamente, osortólogos retêm a mesma função durante o curso de evolução. A identifica-ção de ortólogos encontra uso na predição segura de função de gene emgenomas recentemente seqüenciados.

Como usado aqui, "parálogo" e "genes parálogos" se referemaos genes que são relacionados através de duplicação em um genoma. Aomesmo tempo em que ortólogoss retêm a mesma função pelo curso de evo-lução, os parálogos desenvolvem funções novas, embora algumas funçõessejam relacionadas freqüentemente ao original. Os exemplos de genes pará-logos incluem, porém não estão limitados aos genes que codificam tripsina,quimiotripsina, elastase, e trombina que são todas as proteinases de serinae ocorrem juntas dentro das mesmas espécies.

Como usado aqui, proteínas "tipo silvestre" e "nativas" são aque-las encontradas na natureza. Os termos "seqüência tipo silvestre", e "genetipo silvestre" são aqui alternadamente usados, para se referir a uma se-qüência que é nativa ou de ocorrência natural em uma célula hospedeira.Em algumas modalidades, a seqüência tipo silvestre se refere a uma se-qüência de interesse que é o ponto de partida de um projeto de criação deproteína. Os genes que codificam a proteína de ocorrência natural podemser obtidos de acordo com os métodos gerais conhecidos por aqueles ver-sados na técnica. Os métodos geralmente compreendem sintetizar sondasrotuladas que têm seqüências putativas codificando regiões da proteína deinteresse, preparar bibliotecas genômicas de organismos que expressam aproteína, e avaliar as bibliotecas quanto ao gene de interesse por hibridiza-ção para as sondas. Os clones positivamente hibridizantes são então mape-ados e seqüenciados.

O termo "molécula de DNA recombinante" como usado aqui serefere a uma molécula de DNA que é compreendida de segmentos de DNAunidos por meio de técnicas biológicas moleculares.

EXPERIMENTAL

Os seguintes exemplos são fornecidos para demonstrar e tam-bém ilustrar certas modalidades e aspectos preferidos da presente invençãoe não serão interpretados como Iimitantes do escopo desta.Na descrição experimental que segue, as seguintes abreviaçõesse aplicam: 0C (graus Centígrado); rpm (revoluções por minuto); H2O (água);HCI (ácido clorídrico); aa (aminoácido); bp (par de base); kb (par de quiloba-se); kD (quilodáltons); gm (gramas); pg e ug (microgramas); mg (miligra-mas); ng (nanogramas); μΙ e ul (microlitros); ml (mililitros); mm (milímetros);nm (nanômetros); pm e um (micrômetro); M (molar); mM (milimolar); μΜ euM (micromolar); U (unidades); V (voltes); MW (peso molecular); s (segun-do); min (minuto/minutos); hr (hora/horas); MgCI2 (cloreto de magnésio);NaCI (cloreto de sódio); OD420 (densidade óptica a 420 nm); ABTS (2,2'-azino-di)3-etilbenztiazolina-6-sulfonato; substrato para peroxidase); PAGE(eletroforese de gel de poliacrilamida); EtOH (etanol); PBS (solução salinatamponada de fosfato [NaCI a 150 mM, tampão de fosfato de sódio a 10 mM,pH 7,2]); SDS (dodecila sulfato de sódio); Tris(tris(hidroximetil)aminometano); TAED (Ν,Ν,Ν'Ν - tetraacetiletilenodiamina);w/v (peso para volume); v/v (volume para volume); Per (peridrolase); per(gene de peridrolase); Ms (M. smegmatis), MS (espectroscopia de massa);Amersham (Amersham Life Science, Inc., Arlington Heights, IL); ICN (ICNPharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA); Pierce (Pierce Biotechnology,Rockford, IL); Amicon (Amicon, Inc., Beverly, MA); ATCC (American TypeCulture Collection, Manassas, VA); Amersham (Amersham Biosciences, Inc.,Piscataway, NJ); Becton Dickinson (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park,NJ); BioRad (BioRad, Richmond, CA); Clontech (CLONTECH Laboratories,Palo Alto, CA); Difco (Difco Laboratories, Detroit, Ml); GIBCO BRL ou GibcoBRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); Sigma (Sigma ChemicalCo. St. Louis, MO); Sorvall (Sorvall Instruments, uma subsidiária de DuPontCo., Biotechnology Systems, Wilmington, DE); SPSS (SPSS Inc., Chicago,IL); Microsoft (Microsoft, Inc., Redmond, WA); Agilent (Agilent Tecnologias,Palo Alto, CA); Minolta (Konica Minolta, Ramsey, NJ); e Continental (Conti-nental Diamond Tool Corp., New Haven, IN).

Amostras de Dente

Nos seguintes Exemplos, dentes permanentes humanos foramobtidos com manchas intrínsecas naturais de cirurgiões orais. A seleção dedentes apropriados foi com base na presença de mancha intrínseca apósremoção de manchas exógenas usando métodos conhecidos na técnica queenvolvem o uso de polimento de copo de borracha com uma suspensão depúmice aquosa. Uma guia de sombra dental VITA® foi usada como uma refe-rência para seleção de dente. Somente espécimes com um escore de som-bra A3 ou mais escuro após a secagem foram usadas nestas experiências.As espécimes de teste foram compreendidas de cilindros de esmalte huma-no de 3 mm em diâmetro montados em uma base acrílica preta de 10-mmde diâmetro. Os pedaços circulares de esmalte humano foram cortados u-sando uma broca de núcleo a diamante de 3-mm (Continental). Para cortar oesmalte, os dentes humanos foram primeiro montados dentro blocos qua-drados de 2-cm de acrílico dental de autocura com a superfície Iabial expos-ta. Cada bloco foi então preso em um "vise" pequeno e imerso em um reci-piente de água para impedir o esmalte de queimar durante o processo cor-tante. Cada dente imerso foi posicionado diretamente sob e perpendicular àponta da broca de núcleo a diamante montada na ponta de uma máquina defurar elétrica. Em alta velocidade, a broca de núcleo a diamante foi abaixadasobre o dente e pressão suave foi aplicada quando a ponta da broca cortouatravés do esmalte e dentina. O pedaço de 3-mm de esmalte cortado foi en-tão removido da ponta da broca de núcleo a diamante e embutido com a a-juda de um molde circular em acrílico dental de autocura preto, fornecendoblocos circulares de 10 mm de diâmetro. Isto foi feito de uma tal maneira queas áreas de substância de dente expostas pelo processo de perfuração fo-ram lacradas pelo acrílico, ao mesmo tempo em que o esmalte de superfíciede 3-mm foi deixado exposto. Os espécimes de dente acabados foram exa-minados sob um microscópio dissecante. Os espécimes com imperfeiçõesforam descartados. Os espécimes aceitáveis foram enxaguados completa-mente com água destilada, e refrigerados em um humidificante até uso.

EXEMPLO 1

Medida da Mancha

Nestas experiências, a mancha nos dentes foi medida usando oseguinte método. A quantidade da mancha intrínseca dentro dos dentes foimedida tomando-se as leituras de cor com um Spectrofotômetro Minolta Cm-503i com iluminação difusa/ângulo de visão de 8o e 3mm de abertura. Asmedições sobre o espectro de cor visível inteiro foram obtidas usando a es-cala de cor CIELAB (Commission Internationale L1EcIairage Recommendati-ons on Uniform Color Spaces. Color Difference Equations. Psychometric co-lor Terms, Suppl. 2 para CIE publicação 15 (E-13,1) 1971/(TC-1.3), 1978,Paris: Bureau Central de Ia CIE, 1978). Esta escala quantifica a cor de acor-do com 3 parâmetros, L * (valor de claridade-escuridão), a* (croma verme-Iho-verde), e b * (croma amarelo-azul). Para obter leituras reproduzíveis, osespécimes de esmalte foram permitidos secar em ar em temperatura ambi-ente durante 30 minutos antes das medidas de cor serem tomadas. Quandoos espécimes foram expostos ao ar, os dentes ficaram mais brancos umavez que eles secam dentro dos primeiros minutos e os parâmetros de cormudam dramaticamente, porém estabilizaram após 30 minutos.

As medições foram obtidas alinhando-se o centro do segmentocircular de 3- mm de esmalte diretamente sobre a abertura-alvo de 3 -mm doespectrofotômetro de Minolta, que permitiu o posicionamento exato dos es-pécimes para cada teste. Uma média de 3 leituras de cor usando a escalaL*a*b * foi tomada para cada espécime.

EXEMPLO 2

Tratamento de Dentes

Neste Exemplo, são descritos métodos para tratar as amostrasde dente. Antes do tratamento, os escores de cor de L*a*b * de valor de refe-rência dos espécimes de dente foram determinados e usados para estratifi-car as amostras de dentes em grupos equilibrados de 8 espécimes cada.Para testar, cada espécime de dente foi imerso em 20 ml da solução de tes-te respectiva durante 30 minutos. As soluções de teste foram agitadas a 60rpm com um agitador mecânico durante a duração da exposição.

Seguinte cada período de tratamento de 30-minutos, os espéci-mes foram enxaguados e então colocados de volta na solução de teste fres-ca. Os tratamentos foram conduzidos consecutivamente com leituras de cortomadas após 1, 2, 4, 8, 16, e 24 horas. Como um grupo de controle, 8 den-tes foram tratados semelhantemente em água destilada.

Os cálculos de mancha foram feitos como descrito abaixo. A di-ferença entre o valor de referência e leituras pós-teste para cada fator de cor(L *, a *, e b *) representam a capacidade das soluções de teste de removera mancha intrínseca e desse modo embranquecer os dentes. Os dados fo-ram calculados e foram definidos como segue:

Mancha intrínseca removida = leitura de cor após tratamentomenos leitura da cor do dente de valor de referência.

A mudança total na cor dos dentes foi calculada usando a equa-ção de CIELAB ΔΕ = [(AL*)2 + (Aa*)2 + (Ab*)2]1'2. Os componentes individuaisda escala L*a*b * também foram analisados separadamente para determinaras mudanças específicas na brancura (L*), faixa de cor vermelho-verde (a*),e faixa de cor amarelo-azul (b*).

A significação estatística dos dados obtidos em cada categoriafoi determinada por análise de variância. Os dados foram tabulados usandoum programa de planilha EXCEL® (a Microsoft) e computador PC e analisa-dos usando o programa de estatísticas SPSS® (SPSS). Todas as compara-ções foram feitas usando um teste de 2-caudas.

Os grupos de teste usados nestas experiências foram :

Grupo 1 - 0,20% de ácido peracético em 100 mmolar de tampãode fosfato (pH 7,5 - 0,0).

Grupo 2 - 0,10% de ácido peracético em 100 mmolar de tampãode fosfato (pH 7,5 - 0,0).

Grupo 3 - 0,05% de ácido peracético em 100 mmolar de tampãode fosfato (pH 7,5 - 0,0).

Grupo 4 - 0,02% de ácido peracético em 100 mmolar de tampãode fosfato (pH 7,5 - 0,0).

Grupo 5-100 mmolar de tampão de fosfato (controle de veículo).

Grupo 6 - 3% de peróxido (controle positivo)

Grupo 7 - água destilada (controle negativo)

Grupo 8 - enzima, substrato e peróxido em 100 mmolar de tam-pão de fosfato (pH 7,5-8,0).

Grupo 9 - substrato e peróxido em 100 mmolar de tampão defosfato (pH 7,5 - 0,0).

O ácido acético e peracético em solução de matéria-prima deperácido foi titulado com NaOH para obter o pH dos grupos de teste (pH 7,5-8,0). Quando necessário, NaOH foi adicionado antes do ácido peracético tersido adicionado.

A solução de matéria-prima de ácido peracético de 0,2% foi pre-parada adicionando 0,56 mL 12,5M de NaOH a IOOmL de tampão antes deadicionar 0,62ml de ácido peracético a 32% (contendo 40-45% de ácido acé-tico). As soluções de ácido peracético restantes foram preparadas fazendodiluições consecutivas sucessivas de 50mL de solução de perácido em50mL de tampão. Como as soluções de perácido estavam instáveis, elasforam usadas dentro de uma hora de preparação (isto é, para dois tratamen-tos de 30 minutos consecutivos). A enzima usada nestas experiências foi aperidrolase de M. smegmatis descrita em US04/40438 (incorporado aqui porreferência em sua totalidade). O protocolo usado para preparar os grupos deenzima está abaixo:

Condições de Reação:

Fosfato de sódio a 100mM pH 7,90,17% de H2O2 (50mM)

Diacetato de propileno glicol a 0,42% (25mM)± 4ppm de enzima (peridrolase)

Preparo e Mistura:

50 mL de fosfato de sódio a 200mM pH5,7mL de H2O2 a 3%

420 uL de diacetato de propilenoo glicol a 100% (PGDA)~44ml_ de H2O destilada (para IOOmL de volume final em frasco volumétrico)2X de Diluição de Enzima:

Adicionar 60uL 16.000ppm de matéria-prima de enzima (peridrolase) a 60uLde tampão de fosfato

A solução de teste de enzima de matéria-prima e 2X de diluiçõesde enzima foram preparadas. Em seguida, 20 ml de solução de teste foramcolocados em 2 béqueres. Os espécimes de dente foram então colocadosem cada solução de teste e 10 uL de diluição de enzima foram adicionados aum béquer de solução de teste de 20 mL e misturado por turbilhonamento. Aagitação de batedeira e o cronômetro foram então iniciados. As soluçõesforam preparadas em quantidades exatas para as experiências programadasdurante cada dia, uma vez que as soluções foram constatadas serem está-veis para uso ao longo de um dia inteiro (isto é, aproximadamente 8 horas)de experiências.

As concentrações de ácido peracético foram determinadas comodescrito abaixo:Reaqentes:

Ácido cítrico a 125 mM ajustado para pH 5 com KOH (tampão de citrato)Kl a 250 mM em água (armazenado fora da luz direta)ABTS a 100 mM (substrato) em água (dividido em alíquotas de 1 mL em tu-bos de Eppendorf marrons e congelado @ -80°C; descongelado a 25°C debanho de água)

Ácido peracético fresco (PAA; Sigma a 32%) foi armazenado a4°C. O ácido peracético pode variar para 35% e pode mudar com tempo. Sedesejado, pode ser titulado para precisão elevada.

As soluções foram preparadas fazendo uma matéria-prima detrabalho de Kl a 25 mM por diluição de matéria-prima em água. Então, 10mL de ABTS a 100 mM e 2 mL de Kl 25 mM foram adicionados por mL detampão de citrato. Esta solução ("reagente de ABTS") foi preparada quandonecessário, incluindo em volumes maiores como uma matéria-prima de tra-balho. Ela é útil durante até dois dias, quando mantida escura a toda hora ea temperatura ambiente.

A curva-padrão foi preparada como descrito abaixo. Uma maté-ria-prima de trabalho de PAA foi preparada diluindo-se 32% de 104-dobraspara água a 0,4 mM (nota: matéria-prima conteve ácido acético). Uma sériede diluição foi preparada da matéria-prima de trabalho de água a 0,4 mM(concentrações-padrão de PAA preparadas em B(OH)3, pH 8,5 de tampãohidrolisado com uma meia-vida de 25 minutos). A temperatura ambiente, 50a 100 uL de diluição de PAA padrão foram adicionados a 1 mL do reagentede ABTS. A solução foi bem-místurada e incubada a temperatura ambientedurante 3 minutos. A absorbância a 420nm (ou outro comprimento de ondaescolhido) foi então medida. Foi constatado que não houve nenhum pontono espectro que pudesse ser subtraído para uma correção de troca de valorde referência, uma vez que ABTS absorve luz sobre a faixa de comprimentode onda inteira do UV no infravermelho próximo.

Um ensaio de curso de tempo também foi administrado. A rea-ção de enzima foi determinada e então a enzima foi adicionada à mistura.Em vários pontos de tempo, 50 a 100 ul de alíquotas de mistura de reaçãode enzima foram removidos e adicionados a 1mL de reagente de ABTS. Aabsorbância a 420nm foi então observada.

Descobriu-se que o ensaio de ABTS discrimina bem entre PAA eH2O2. As execuções de curva-padrão não foram completamente linear, vari-ando em resposta de extinção molar de 61,9*103 a 44 * 103 indo de 19 a0,59 mM, respectivamente quando lido a 420 nm (dois moles de ABTS oxi-daram por mol de PAA). Se desejado, a absorbância é lida em comprimen-tos de onda adicionais com coeficiente de extinção um pouco mais baixo. Areação de ABTS com PAA foi rápida e completada em cerca de 1,5 minutos.

Com base nestas experiências, o tempo de desenvolvimento de cor sugeridofoi fixado em 3 minutos. As amostras foram lidas de uma maneira consisten-te para produzir desvio mais baixo de resultados. Para minimizar os errosdevido a não linearidade aparente, os valores de absorbância deveriam estaracima de 0,1 OD420. Os resultados são fornecidos nas seguintes Tabelas.

<table>table see original document page 28</column></row><table><table>table see original document page 29</column></row><table>

escore médio ± desvio-padrão, η = 8. Valores designados com umaletra diferente são estatisticamente diferentes em ρ < 0,05 com baseem ANOVA e teste SNK. Os valores designados com a mesma letranão são estatisticamente diferentes.

Os dentes foram tratados com 20 ml de solução durante intervalos de30 minutos. <table>table see original document page 29</column></row><table><table>table see original document page 30</column></row><table>

+ escore médio ± desvio-padrão, η = 8. Valores designados com umaletra diferente são estatisticamente diferentes em ρ < 0,05 com baseem ANOVA e teste SNK. Os valores designados com a mesma letranão são estatisticamente diferentes.

* Os dentes foram tratados com 20 ml de solução durante intervalos de30 minutos.

Como indicado nas Tabelas acima, uma dose-resposta signifi-cante foi observada para as soluções de ácido peracético durante as primei-ras quatro horas de tratamento, ao mesmo tempo em que um efeito de dose-resposta numérico foi observado até 16 horas de tratamento.

O tratamento de enzima não foi estatisticamente diferente dasvárias soluções de controle de placebo/negativa após 1 hora, porém houveum efeito de branqueamento de dente significante após 2 ou mais casas.

Realmente, após 8 horas, a enzima e toda a solução de ácido peracéticotestada foram estatisticamente equivalentes ao controle positivo de peróxidode hidrogênio e diferente dos vários controles/placebo negativos. Como asorientações de Associação Dental Americana consideram um branqueamen-to de dente delta E muda com uma magnitude de pelo menos quatro paraser clinicamente significante, os sistemas fornecidos pela presente invençãofornecem branqueamento de dente notável de dentes humanos.

Todas as patentes e publicações mencionadas no relatório des-critivo são indicativas dos níveis daqueles versados na técnica à qual a in-venção pertence. Todas as patentes e publicações são aqui incorporadaspor referência na medida em que como se cada publicação individual fosseespecificamente e individualmente indicada ser incorporada por referência.

Tendo descrito as modalidades preferidas da presente invenção,será evidente para aqueles ordinariamente versados na técnica que váriasmodificações podem ser feitas para as modalidades descritas, e que taismodificações são pretendidas estarem dentro do escopo da presente inven-ção.

Aqueles versados na técnica facilmente apreciarão que a pre-sente invenção é bem-adaptada para realizar os objetivos e obter os fins evantagens mencionadas, como também aqueles inerentes aqui. As compo-sições e métodos descritos aqui são representativos de modalidades preferi-das, são exemplares, e não são pretendidos como limitações no escopo dainvenção. É facilmente evidente para alguém versado na técnica que podemser feitas substituições e modificações variadas à invenção descrita aquisem afastar-se do escopo e espírito da invenção.

A invenção ilustrativamente descrita aqui pode ser praticada a-dequadamente na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitaçãoou limitações que especificamente não sejam descritas aqui. Os termos eexpressões que foram empregados são usados como termos de descrição enão de limitação, e não há nenhuma intenção no uso de tais termos e ex-pressões de excluir qualquer equivalente das características mostradas edescritas ou parte destas, porém é reconhecido que várias modificações sãopossíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. Desse modo, deve serentendido que embora a presente invenção tenha sido especificamente des-crita por modalidades preferidas e características opcionais, modificação evariação dos conceitos aqui descritos podem ser recorridos por aqueles ver-sados na técnica, e é considerado que tais modificações e variações inclu-em-se no escopo desta invenção como definido pelas reivindicações anexas.

A invenção foi descrita amplamente e genericamente aqui. Cadauma das espécies e agrupamentos subgenéricos mais restritos que se inclu-em na descrição genérica também fazem parte da invenção. Isto inclui adescrição genérica da invenção com uma condição ou limitação negativaque remove qualquer assunto do gênero, embora o material cortado seja ounão especificamente mencionado aqui.

Claims

1. Composição de cuidado oral, que compreende pelo menosuma enzima peridrolase.

2. Composição de cuidado oral, de acordo com a reivindicação-1, em que a referida composição é um produto de cuidado oral que é sele-cionado de dentifrícios, pastas de dentes, pó para dente, lavagens de boca,pré-enxaguantes, produtos de branqueamento de dentes, e agentes de lim-peza de dentadura.

3. Composição de cuidado oral, de acordo com a reivindicação-1, em que a referida composição compreende uma quantidade da referidapelo menos uma peridrolase suficiente para branquear dentes.

4. Composição de cuidado oral, de acordo com a reivindicação-1, em que a referida composição também compreende um sistema de gera-ção de peróxido de hidrogênio.

5. Composição de cuidado oral, de acordo com a reivindicação-1, em que a referida composição também compreende peróxido de hidrogênio.

6. Composição de cuidado oral, de acordo com a reivindicação-1, em que a referida composição também compreende um sistema de geração de perácido.

7. Composição de cuidado oral, de acordo com a reivindicação-1, em que a referida composição também compreende um ácido selecionadode ácido peracético e ácido acético.

8. Método para alvejar dentes compreendendo contatar os refe-ridos dentes com a composição de cuidado oral, como definida na reivindi-cação 1, sob condições adequadas para alvejar os referidos dentes.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, em que a referidacomposição de cuidado oral é um produto de cuidado oral selecionado dedentifrícios, pastas de dentes, pó para os dentes, lavagens de boca, pré-enxaguantes, produtos de branqueamento de dentes, e agentes de limpezade dentadura.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, em que a referidacomposição de cuidado oral compreende uma quantidade da referida pelomenos uma peridrolase suficiente para branquear os dentes.

11. Método, de acordo com a reivindicação 8, em que a referidacomposição de cuidado oral também compreende um sistema de geração deperóxido de hidrogênio.

12. Método, de acordo com a reivindicação 8, em que a referidacomposição de cuidado oral também compreende peróxido de hidrogênio.

13. Método, de acordo com a reivindicação 8, em que a referidacomposição de cuidado oral também compreende um sistema de geração deperácido.

14. Método, de acordo com a reivindicação 8, em que a referidacomposição de cuidado oral também compreende um ácido selecionado deácido peracético e ácido acético.