BRPI0708519A2 - vesìcula semelhante ao virossoma, composição farmacêutica, uso de pelo menos uma vesìcula semelhante ao virossoma, método de tratamento e/ou profilaxia de uma infecção por hiv, e, kit para induzir uma resposta imune contra uma proteìna gp41 de um vìrus da imunodeficiência humana - Google Patents

Abstract

VESìCULA SEMELHANTE AO VIROSSOMA, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, USO DE PELO MENOS UMA VESìCULA SEMELHANTE AO VIROSSOMA, METODO DE TRATAMENTO E/OU PROFILAXIA DE UMA INFECçãO POR HIV, E, KIT PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNE CONTRA UMA PROTE1NA GP4ì DE UM VìRUS DA IMUNODEFICJêNCIA HUMANA. A presente invenção diz respeito a uma vesícula semelhante ao virossoma que compreende pelo menos um antígeno derivado de gp4 1 ou um análogo deste, o dito antigeno derivado de gp4 1 estando localizado na superficie externa de e/ou encapsulado dentro da dita vesícula e estando em uma configuração conveniente para conferir a dita vesícula semelhante ao virossoma com uma capacidade de induzir uma resposta imune contra uma proteína gp4í de um vírus da imunodeficiéncia humana (HIV).

Description

"VESÍCULA SEMELHANTE AO VIROSSOMA, COMPOSIÇÃOFARMACÊUTICA, USO DE PELO MENOS UMA VESÍCULASEMELHANTE AO VIROSSOMA, MÉTODO DE TRATAMENTO E/OUPROFILAXIA DE UMA INFECÇÃO POR HIV, E, KIT PARA INDUZIRUMA RESPOSTA IMUNE CONTRA UMA PROTEÍNA GP41 DE UMVÍRUS DAIMUNODEFICIÊNCIA HUMANA"

A presente invenção diz respeito a uma nova vesículasemelhante ao virossoma adequado para induzir uma resposta imune contraum vírus da imunodeficiência humana (HTV), composições farmacêuticas quecompreendem as ditas vesícuias semelhantes ao virossoma, método detratamento e kit para a indução de uma resposta imune contra um vírus daimunodeficiência humana.

O HIV é um retrovírus que destrói gradualmente o sistemaimune e leva, ultimamente, à Síndrome da Imunodeficiência Adquirida(AIDS).

O HIV existe sob muitas versões diferentes como membros deuma grande família.

Sequenciando-se os genomas virais, os pesquisadores foramcapazes de mapear a árvore familiar do HTV. Na raiz da árvore, existem trêsgrupos denominados Μ, N e O, o grupo M sendo responsável pela AIDSpandêmica corrente.

O grupo M é dividido em nove subtipos genéticos, tambémdenominado nove ciados (denominados de A até K, sem nenhum E ou I). adefinição original de ciados foi fundamentada em seqüências genômicascurtas, a maioria dentro da proteína do envelope de HIV (Env: gpl60).

Estes nove ciados têm padrões de distribuição geográficos nãouniformes. O Ciado C circula na África do Sul, índia e partes da China. OCiado AeD são comuns na África Oriental e o Ciado B é comum na Américado Norte e do Sul e Europa Ocidental. De acordo com as estatísticas, osquatro ciados A, Β, C e D responde por mais de 90 % de toda a infecçãomundial e o Ciado C representa o HIV dominante no mundo por si só (>60%).

Até recentemente, o desenvolvimento da vacina foi focalizadanas cepas de Ciado B, que dominam a epidemia nos países industrializadosmas causam apenas cerca de 12 % de infecções globalmente.

A maioria dos métodos de vacina contra HIV-I alvejaram asglicoproteínas do envelope viral (Env) porque estes são os antígenos desuperfície principais expressados em vírions e pelas células infectadas porHIV-1. A glicoproteína de envelope de HIV-I natural é um heterodímerocontendo três proteínas gpl20 não covalentemente ligadas associadas comtrês glicoproteínas gp41.

Os três anticorpos neutralizadores de HIV-I mais potentes atéagora identificados, bl2, 2G12 e 2F5, tem uma afinidade alta quanto aotrímero natural.

Existe esforço crescente em desenvolver proteínasrecombinantes como vacinas candidatas que sejam imitações antigênicasmelhores do que o complexo de glicoproteína de envelope natural tal como ogpl20/gp41.

Entretanto, devido a numerosas homologias moleculares (pelomenos quinze) entre gpl 20/gp41 e as moléculas do sistema imune, muitoseventor reativos cruzados potenciais podem ocorrer levando a possíveisfenômenos autoimunes nocivos.

Várias estratégias foram descritas a fim de diminuir aquelasreatividades cruzadas para a obtenção de vacinas anti-HIV sem nenhuma oucom menos reatividades cruzadas com as proteínas humanas como aintrodução de mutações e/ou anulações em várias partes das proteínas gp41como descrito na US 6.455.265 e WO 2005/010033.

Entretanto, ainda existe uma necessidade quanto a uma vacinaque permita a indução de uma resposta imune versátil contra a infecção porHTV e, em infecção por HIV do tipo 1.

Também existe uma necessidade quanto ao desenvolvimentode vacinas que não de Ciado B, tais como, por exemplo, cepas de Ciado C.

Também existe a necessidade quanto ao desenvolvimento deuma vacina com espectro inibidor amplo permitindo a inibição de Ciadocruzada.

Existe uma necessidade quanto a uma vacina que permite aindução de uma resposta imune humoral e/ou celular contra a infecção por HIV.

Existe uma necessidade quanto a uma vacina que permite aindução de uma resposta imune contra a infecção por HIV no nível dasuperfície mucosal e no nível do corpo.

Existe uma necessidade quanto a uma vacina adequada parainduzir anticorpos slgA mucosais e anticorpos IgG sistêmicos capazes deinterferir com a entrada de HIV através da mucosa e infecção celular precocesob a mucosa.

Existe uma necessidade quanto a uma vacina adequada parainibir ou reduzir a entrada de HIV através de tecidos da mucosa através devários mecanismos, tais como a transcitose.

É um objetivo da invenção satisfazer a todas aquelasnecessidades mencionadas acima.

Portanto, de acordo com um primeiro aspecto, a presenteinvenção está relacionada com uma vesícula semelhante ao virossoma quecompreende pelo menos um antígeno derivado de gp41 ou um análogo deste,o dito antígeno derivado de gp41 estando localizado na superfície externa dee/ou encapsulado dentro da dita vesícula e estando em uma configuraçãoconveniente para conferir a dita vesícula semelhante ao virossoma com umacapacidade de induzir uma resposta imune contra uma proteína gp41 de umvírus da imunodeficiência humana (HTV).

em particular, o HIV pode ser do tipo 1.

Surpreendentemente, os inventores observaram que foipossível induzir uma resposta imune no nível da superfície mucosal bemcomo uma resposta imune sistêmica imunizando-se coelhos intra-muscular ouintra-nasalmente com vesículas semelhantes ao virossoma que compreendeum antígeno derivado de gp41 na superfície externa.

Mais particularmente, os inventores observaram a presença deproteína anti-gp41 de anticorpos específicos (IgA e IgG mucosal) emsecreções cervico-vaginal e intestinal de coelhos seguindo a imunização intra-muscular ou intranasalmente.

Os anticorpos IgG anti-HIV específicos também foramidentificados nos soros daqueles coelhos.

Adicionalmente, aqueles anticorpos específicos foram capazesde inibir a transcitose de HIV em experimentos diferentes.

Os inventores também observaram que os anticorpos anti-gp41(IgA e IgG mucosal) podem ser obtidos em secreções vaginais e lavagensretais de macacos fêmea com uma vacina da invenção administradaintramuscular e/ou intranasalmente.

As secreções e as lavagens foram demonstradas como inibindosignificantemente a transcitose de HIV de vários ciados primários (B e C) emum modelo de epitélio humano.

Portanto, uma vacina contra HtV de acordo com a invençãoapresentam, como uma propriedade, uma capacidade de evocar respostasimunes (CTL e/ou anticorpos) no corpo, bem como, bem como o local deentrada primário que são os tratos reprodutivo-genital e tecidos mucosaisintestino/retal.

Esta propriedade é particularmente vantajosa, porque ainfecção HIV pode compreender uma etapa de transcitose viral na superfíciemucosal que facilita a translocação e a disseminação viral no corpo.

O sêmen e as secreções cervico-vaginais pode transmitirpotencialmente o HTV aos tratos gastrointestinal, anorretais e genito-urináriosporque estes contém partículas de HIV isenta de células e célulasmononucleares infectadas por HIV numerosas.

Também acredita-se que o local principal de replicação viralprecoce em pacientes infectados por HTV é o intestino e outros locais demucosa. Isto ocorre principalmente, por causa da vasta maioria de célulassuscetíveis (células CD4+ T intestinais) reside em tecidos mucosais e dentrodas primeiras cinco semanas pós-exposição ao HIV, estas células sãodestruídas.

Dentro do significado da invenção, a expressão "vesículasemelhante ao virossoma" é pretendida significar uma vesícula quecompreende, pelo menos em parte, proteína de lipídeos e fusão virossomal oufragmentos destes, os ditos fragmentos tendo a atividade de fusão ecaracterísticas de proteína de fusão completa, pelo menos em uma extensãoque serve para a fusão com uma membrana biológica da célula alvo.

O WO 2004/07800 propôs vesículas semelhantes ao virossomacomo vetores para antígenos de malária reticuladas para a superfície externadas ditas vesículas.

Dentro do significado da invenção, a expressão "antígenoderivado de gp41" é pretendido referir-se a qualquer parte ou fragmento, bemcomo a proteína total, de uma proteína de gp41 de ocorrência natural emqualquer cepa de HTV ou que compreende qualquer modificação (mutação deaminoácido ou modificação química) que não afeta substancialmente suaspropriedades antigênicas.

As propriedades antigênicas das vesículas semelhantes aovirossoma da invenção seguem da configuração conveniente do antígenogp41 encapsulados dentro e/ou localizados na superfície das ditas vesículas.O WO 2004/045582 descreve a preparação de vesículassemelhantes ao virossoma que pode compreender a proteína gp41/gpl20, masque não são relacionados com as propriedades antigênicas desta proteína masapenas com sua propriedade fusogênica.

De acordo com um outro de seus aspectos, a presente invençãoé direcionada a uma composição que compreende vesículas semelhantes aovirossoma de acordo com a invenção.

De acordo com um outro de seus aspectos, a presente invençãotambém está relacionada ao uso de pelo menos uma vesícula semelhante aovirossoma de acordo com a presente invenção para a fabricação de umacomposição farmacêutica pretendendo induzir uma resposta imune adaptativae/ou uma resposta imune inata direcionada contra uma proteína gp41 de umvírus da imunodeficiência humana.

De acordo com uma forma de realização, um objetivo dainvenção é induzir um IgG e IgA mucosal. O IgA mucosal pode ser umamistura entre IgA e IgA secretor.

De acordo com uma outra forma de realização, um objetivo dainvenção é inibir ou reduzir a transcitose de HIV, em particular no nívelmucosal.

Dentro do significado da invenção, a expressão "respostaimune adaptativa" é pretendida referir-se a uma resposta imune conta com aativação do componente do sistema imune implicando na especificidade ememória com respeito a um antígeno ou um patogênio.

Uma tal resposta pode ser altamente específica com respeito aum antígeno ou um patogênio e é mais eficaz no segundo encontro ousubsequente, com o antígeno ou patogênio.

Tais respostas imunes adaptativas podem contar com aativação de linfócitos, tais como as células T ou células B.

Dentro do significado da invenção, a expressão "respostaimune inata" é pretendida a uma resposta que conta com o sistema derecognição não específica e não altera no encontro subsequente com oantígeno ou patogênio.

Tal sistema pode contar com as células imunes tais como, porexemplo, macrófagos de monócitos ou células matadoras naturais (NK).

De acordo com um outro de seus aspectos, a presente invençãotambém é direcionada a um método de tratamento e/ou profilaxia de umainfecção de HIV que compreende pelo menos uma etapa de administração aum indivíduo em necessidade deste, de uma quantidade eficaz de vesículassemelhantes ao virossoma de acordo com a invenção.

De acordo com um outro destes aspectos, a presente invençãotambém é direcionada a um kit para induzir uma resposta imune contra umaproteína gp41 de um vírus da imunodeficiência humana que compreende:

-pelo menos uma primeira vesícula semelhante aovirossoma de acordo com a invenção que compreende pelo menos umprimeiro antígeno derivado de gp41 e

-pelo menos uma segunda vesícula semelhante aovirossoma de acordo com a invenção que compreende pelo menos umsegundo antígeno derivado de gp41,

o dito primeiro e segundo antígenos derivados de gp41 sendodiferentes um do outro.

VESÍCULA SEMELHANTE AO VIROSSOMA

A vesícula semelhante ao virossoma adequada para a presenteinvenção compreende pelo menos lipídeos virossomais e apresentapropriedades de membrana de fusão.

De acordo com uma forma de realização, a vesículasemelhante ao virossoma da invenção pode compreender uma bicamada delipídeo unilamelar.

De acordo com uma forma de realização, a vesículasemelhante ao virossoma da invenção pode ser uma vesícula bi- ou umamultilamelar.

De acordo com uma forma de realização, a vesículasemelhante ao virossoma pode ter um diâmetro, no geral, na faixa de 100 a600 mn e, em particular um diâmetro de 100 nm a 300 nm e, em particular de200 nm a 400 mu.

As vesículas semelhantes ao virossoma da invenção podem servesículas unilamelares específicas com um diâmetro médio comaproximadamente 150 nm.

As vesículas semelhantes ao virossoma compreendemincorporados nas proteínas de fusão de bicamada de lipídeo ou fragmentosdestes.

A expressão "proteínas de fusão ou fragmentos deste" épretendida referir-se às proteínas ou fragmentos destes capazes de induzire/ou promover uma reação de fusão entre uma vesícula semelhante àmembrana de virossoma e uma membrana biológica da célula alvo.

Por exemplo, as proteínas de fusão podem ser asglicoproteínas de membrana de influenza, tais como hemaglutinina (HA).

De acordo com uma forma de realização, pelo menos duasproteínas de fusão diferentes ou fragmentos destes podem ser usados,podendo apresentar a característica de fusão distinta.

De acordo com uma outra forma de realização, ascaracterísticas de fusão distinta pode ser, por exemplo, sensibilidade diferenteà temperatura, à concentração de íon, à acidez, ao tipo celular e àespecificidade do tipo de tecido.

De acordo com uma forma de realização, a vesículasemelhante ao virossoma pode conter proteínas de fusão que mediam a fusãoem duas temperaturas distintas.

De acordo com uma outra forma de realização, as proteínas defusão de hemaglutinina viral (HA) diferentes podem ser usadas para construiruma vesícula semelhantes ao virossoma.

Como um exemplo, as moléculas de HA tanto de vírions X-31quanto de PR8/34 podem ser capazes de catalisar duas reações de fusãodistintas em temperaturas distintas.

As proteínas de fusão com características de fusão diferentespodem ser derivadas de cepas de influenza diferentes, como outros vírus, taiscomo a proteína El do vírus da estomatite vesicular (VSV)5 a proteína El dovírus da floresta de Seliki (SFV) ou a proteína F do vírus Sendai.

O mecanismo de fusão específico das vesículas semelhantes aovirossoma permite o alvejamento do Complexo de HistocompatibilidadePrincipal classe I (MHC I) ou classe II (MHC II).

Um antígeno localizado na superfície externa da vesículasemelhante ao virossoma pode ser degradado na fusão endossomal dentro daendossoma e pode ser apresentado ao sistema imune pelos receptores de classe II MHC.

Um antígeno encapsulado dentro da vesícula semelhante aovirossoma pode ser liberado ao citosol durante o evento de fusão e pode entrarno caminho da classe I MHC.

Portanto, a vesícula semelhante ao virossoma pode ser capazde induzir uma resposta humoral e/ou uma resposta imune celular.

Em particular, a vesícula semelhante ao virossoma pode sercapaz de induzir IgA, tal como IgA secretor, bem como IgG.

Os protocolos de preparação são bem conhecidos pelaspessoas habilitadas na técnica. Os protocolos adequados para a invenção sãodescritos, por exemplo, no WO 2004/045582 ou EP 0 538 437, que sãoincorporados neste por referência.

De acordo com uma forma de realização, a vesículasemelhante ao virossoma de acordo com a invenção pode ser obtida a partirde um virossoma como tal ou de uma vesícula que resulta da fusão de umavesícula de virossoma com uma vesícula de lipossoma.

A preparação de vesículas de virossoma pode ser feita porqualquer um dos métodos conhecidos da pessoa habilitada na técnica, talcomo descrito por Bron et ai., Methods Enzymol. 22 0: 313-331, 30 19 93,incorporados neste por referência.

As vesículas de Virossoma, por exemplo, podem serreconstituídas a partir de lipídeos de membrana viral original e glicoproteínasde pico após a solubilização de, por exemplo, vírus influenza intacto com étermonodecílico de octaetilenoglicol, sedimentação do nucleocapsídeo (asglicoproteínas e os lipídeos virais permanecerão no sobrenadante) e aremoção do detergente no sobrenadante com resina hidrofóbica (Big-BeadsSM2) (Stegmann et al., Traffic 1: 598-604, 1987).

A preparação de virossomas contendo HAs de diferentes cepasde vírus, pode ser realizadas com quantidades iguais de proteínas daquelesvírus solubilizados com o éter monodecílico de octaetilenoglicol detergentenão iônico.

Após a remoção do detergente com Bio-Beads SM2, vesículassemelhantes ao virossoma contendo tipos diferentes de proteínas de fusãopodem ser formadas.

De acordo com uma forma de realização, a vesículasemelhante ao virossoma de acordo com a invenção pode ser obtida a partirde uma fusão de uma vesícula de virossoma com uma vesícula de lipossoma.

Portanto, de acordo com uma forma de realização, a vesículasemelhante ao virossoma da invenção pode compreender lipídeosvirossômicos ou lipossômicos.

De acordo com uma forma de realização, a vesículasemelhante ao virossoma da invenção pode compreender uma bi-camada delipídeo que compreende lipídeos escolhidos a partir de lipídeos catiônicos,lipídeos sintéticos, glicolipídeos, fosfolipídeos, glicerofosfolipídeos,galactosilceramida semelhantes a glicosfingolipídeos, esfingolipídeos,colesterol e derivados destes.

Tais lipídeos podem ser usados para imitar melhor amembrana viral e microdomínio de transporte a fim de favorecer osoligômeros de gp41 ótimas, tais como di-, tri- ou tetrâmeros.

De acordo com uma outra forma de realização, as vesículassemelhantes ao virossoma de acordo com a invenção podem compreenderlipídeos que favorecem a dobra de um antígeno derivado de gp41 a fim demais eficazmente imitar a dobra natural dos ditos antígenos.

Os fosfolipídeos podem compreender, em particular,fosfatidilcolina, esfingomielina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina,fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, cardiolipina e fosfatidilinositol comcomposições de acila graxa variadas.

Os lipídeos catiônicos pode ser escolhidos a partir de DOTMA(cloreto de N-[l-(2,3-dioleilaxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio), DOTAP(cloreto de N-[l-(2,3-dioleoilóxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio, DODAC(cloreto de N,N-dioleil-N,N,- dimetilamônio), DDAB (brometo dedidodecildimetilamônio) e estearilamina ou outras aminas alifáticas e outros.

Os lipídeos usados na invenção podem ser formulados comolipossomas unilamelares pequenas em uma mistura com DOPE(dioleilfosfatidil etanolamina) que é amplamente usado como lipídeo ajudantepara facilitar o rompimento da membrana endossômica.

De acordo com uma forma de realização, os lipídeoslipossômicos dos lipossomas pode compreender POPC/DDAB.

De acordo com uma outra forma de realização, o agente de co-emulsificação também pode ser usado a fim de melhorar a rigidez e/ou oselamento das vesículas.

Como exemplo do agente de co-emulsificação, menção podeser feita de colesterol e derivados, como, por exemplo, éster de colesterolcarregado ou neutro como o sulfato de colesterol; derivado com estruturaprincipal de colesterol, como, por exemplo, derivados a partir de origemvegetal como fitosterol (sitosterol, sigmasterol,...); ceramidas; e misturasdestes.

Um antígeno derivado de gp41 pode ser incorporado dentrodas vesículas de lipossoma antes da infusão com os virossomas.

A encapsulação de pelo menos um antígeno e/ou adjuvantecomo indicado abaixo como lipossomas pode ser realizado por qualquermétodo conhecido na técnica, incluindo os procedimentos descritos emMonnard et al., Biochim. Biophys.; Acta 1329: 39-50; 1997, em Wagner etai., J. Liposorne Res., 12(3) 271-283, 2002 ou em Oberholzer et al., Biochim.Biophys. Acta 1416: 57-68Í 1999, entre muitos outros métodos bemconhecidos.

Em uma forma de realização particular, as eficiências deencapsulação lipossômica altas podem ser atingidos pela técnica decongelamento/descongelamento usada para a preparação de vesículas delipídeo puras.

De acordo com uma forma de realização da invenção, osprodutos de reação de uma reação de fusão de virossoma-lipossoma podemser submetidos a uma etapa de extrusão de nucleoporo a fim de reduzir seu tamanho.

Como, por exemplo, extrusão através de poros de 200 nm podeproduzir vesículas de aproximadamente metade do tamanho original.

A maioria das partículas pode variar de 100 a 300 nm.

Após o redimensionamento, os produtos da fusão delipossoma-virossoma pode ser vesículas semelhantes a virossoma que podemcompreender um antígeno derivado de gp41 em sua cavidade interna e aindapode ser capaz de sofrer uma segunda etapa de fusão, sob condiçõesdiferentes, com membranas biológicas a fim de liberar o dito antígeno.

Um antígeno derivado de gp41 pode estar localizado nasuperfície externa de e/ou encapsulado dentro de uma vesícula da invençãocomo descrito abaixo.

De acordo com uma forma de realização, a vesículasemelhante ao virossoma da invenção ainda pode compreender uma porçãoalvejante que alveja a dita vesícula a uma célula ou tecido específicos.

Uma porção alvejante adequada pode ser escolhida a partir deum receptor de superfície celular, uma quimiocina, uma citocina, um fator dedesenvolvimento, um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, umaseqüência de peptídeo com especificidade ou carga específica complementar auma molécula de adesão, tal como uma integrina.

Uma molécula alvejante pode ser incorporada em, ou ligada àbicamada de lipídeo da dita vesícula, por quaisquer técnicas conhecidas dapessoa habilitada na técnica.

De acordo com uma outra forma de realização, a vesículasemelhante ao virossoma de acordo com a invenção ainda pode conter umantígeno adicional.

De acordo com uma forma de realização, a vesículasemelhante ao virossoma de acordo com a invenção ainda pode compreenderde um a dez antígenos adicionais e, em particular, de 2 a 4 antígenosadicionais.

Os antígenos adicionais podem ser escolhidos a partir depeptídeos derivados de HIV e, em particular, peptídeos derivados de proteínasestruturais como codificado por genes env (gpl20, gp41), gag (p9, ρ 17, p24) epol (p66, p32) e a partir de proteínas reguladoras como codificado pelos genesnef, rev ou tat e misturas destes.

ANTÍGENO DERIVADO DE GP41

Um antígeno derivado de gp41 adequada para a presenteinvenção pode ser qualquer parte da proteína gp41, bem como a proteína gp41em seu todo e análogos deste.

Dentro do significado da invenção, a expressão "análogodeste" com respeito a um antígeno derivado de gp41 pretende referir-se a umpeptídeo tendo identidade ou homologia de seqüência de aminoácidosubstancial (pelo menos 85 %, em particular pelo menos 90 % e maisparticularmente pelo menos 95 %) (isto é, resíduo de aminoácido substituídopor um resíduo de aminoácido da mesma família, de polaridade ou cargasimilar, por exemplo) com a seqüência de aminoácido do dito antígenoderivado de gp41 e que tem propriedades biológicas similares ou conservadas,em particular com respeito à porção de antígeno de ligação de imunoglobulinadirecionada à proteína gp41.

De acordo com uma forma de realização, um antígenoderivado de gp41 adequado para a invenção pode ser desprovido propriedadefusogênica com respeito à membrana celular.

De acordo com uma forma de realização, um peptídeoderivado de gp41 localizado na superfície externa da vesícula semelhante aovirossoma da invenção pode ser:

- covalentemente ligado com um lipídeo de vesícula semelhante ao virossoma ou

- intercalado em uma bi-camada de lipídeo da dita vesículasemelhante ao virossoma por um domínio de transmembrana de peptídeodistinto de um domínio transmembrana de peptídeo selvagem de uma proteínagp41 do tipo selvagem.

Conseqüentemente, um antígeno covalentemente ligadoderivado de gp41 pode compreender qualquer modificação requerida para alocalização do dito antígeno derivado de gp41 na superfície externa de umavesícula semelhante ao virossoma de acordo com a invenção.

As modificações de um antígeno de gp41 para a invenção émétodos para a reticulação do dito antígeno de gp41 modificado na superfícieexterna de uma vesícula semelhante ao virossoma podem ser como aquelasdescritas em WO 2004/078099.

De acordo com uma forma de realização, um antígenoderivado de gp41 pode ser covalentemente ligado à superfície externa de umavesícula semelhante ao virossoma pela reticulação com um lipídeo ou umfosfolipídeo.

De acordo com uma outra forma de realização, um antígenoderivado de gp41 pode ser covalentemente ligado à superfície externa de umavesícula semelhante ao virossoma pela reticulação com um carboidrato.

De acordo com uma forma de realização, um antígenocovalentemente ligado derivado de gp41 pode compreender pelo menos umresíduo de reticulação posicionado de terminal N ou C.

Por exemplo, o resíduo e reticulação pode ser escolhido decisteína (Cys) ou lisina (Lys).

De acordo com uma outra forma de realização, um antígenocovalentemente ligado derivado de gp41 ainda pode compreender pelo menosum resíduo espaçador entre os ditos resíduos de reticulação posicionados noterminal N ou C e uma extremidade de antígeno de terminal N ou Ccorrespondente derivado de gp41.

Um resíduo espaçador adequado pode ser escolhido, porexemplo, a partir de resíduos de Gly (glicina), Ala (alanina), Ser (serina), Asp(aspartato), Lys (lisina), Gln (glutamina), His (histidina), Ile (isoleucina) eLeu (leucina).

De 2 a 12, em particular de 3 a 10 e mais particularmente de 4a 8, resíduos espaçadores podem ser ligados para a formação das seqüênciasespaçadoras.

As seqüências espaçadoras adequadas podem ser escolhidas,por exemplo, de Gly-Gly ou Lys-Gly.A reticulação de um antígeno derivado de gp41 à superfície deuma vesícula semelhante ao virossoma pode ser, por exemplo, realizada pelouso de derivados de PEG anfifílicos, um fosfatidiletanolamina (PE), umfosfatidilcolina (PC), um fosfatidilserina, um colesterol ou uma misturadestes, facilmente incorporados na bicamada de lipídeos.

A reticulação de um antígeno derivado de gp41 a um lipídeoda vesícula semelhante ao virossoma da invenção pode ser realizada porqualquer método conhecido por aqueles habilitados na técnica.

A reticulação pode ser operada em uma solução de lipídeo e oconjugado de lipídeo-peptídeo pode ser subseqüentemente incorporada emuma vesícula semelhante ao virossoma.

De acordo com uma forma de realização da invenção, umantígeno derivado de gp41 pode ser ligado a um lipídeo da vesícula dainvenção, por exemplo, por um ligador de succinato bifiincional, emparticular um N-hidroxissuccinimida éster do ácido γ-maleinidobutírico ouum Ν-γ-maleimidobutitilóxi-succinimido-éster.

De acordo com uma forma de realização, um antígenoderivado de gp41 e mais particularmente um antígeno derivado de gp41intercalado, pode ser desprovido de seu domínio transmembrana de peptídeo.

Um antígeno intercalado adequado derivado de gp41 pode terdomínio de transmembrana de peptídeo substituído por um domíniotransmembrana de peptídeo distinto.

Tal antígeno derivado de gp41 modificado pode ser umaproteína quimérica.

Dentro do significado da invenção, a expressão "proteínaquimérica" refere-se a uma proteína que contém uma ou mais regiões de umaproteína ou uma ou mais regiões de uma ou mais outras proteínas distintas.

Para o propósito da invenção, qualquer domíniotransmembrana de qualquer proteína pode ser adequado para intercalar umantígeno derivado de gp41 na bicamada de lipídeo de uma vesículasemelhante a virossoma da invenção.

De acordo com uma forma de realização, pode-se usardomínios transmembrana que podem favorecer a oligomerização (a fim deobter dímeros, trímeros ou tetrâmeros) tais como transmembrana dereceptores do fator de desenvolvimento ou proteínas de envelope de vírus.

Como exemplo de domínio transmembrana que pode reunir-secom a presente invenção, menção pode ser feita de domínio transmembranaobtido do receptor de semelhante ao receptor de superfície celular (porexemplo, como apresentado na SEQ ID N0 5), receptor de citocona, como porexemplo receptor de IL-1, receptor de EGF, receptor de VEGF, quaisquerreceptores ligados à proteína G, quaisquer receptores de tirosina cinase,domínio transmembrana viral derivado das proteínas de envelope de vírus,tais como os vírus da família rhabdovírus ou da família poxvírus. As proteínasvirais adequadas para a invenção podem ser, por exemplo, a proteína G dovírus da estomatite vesicular (VSV-G).

Tais domínios transmembrana são bem conhecidos na técnicae podem ser facilmente identificados por uma pessoa habilitada na técnica.

Uma proteína quimérica A adequada para a presente invençãopode ser obtida por quaisquer técnicas de engenharia genética conhecidas pelapessoa habilitada na técnica, tal como descrito em "Molecular Cloning - ALaboratory Manual" (2o Ed.) Sanbrook et al., 1990, Coldspring HarborLaboratory, Coldspring Harbor Press N.Y. (Sambrook).

De acordo com uma outra forma de realização, um antígenoderivado de gp41 podem ser fornecidos pela superfície externa da vesículasemelhante ao virossoma sob um mono-, di-, tri- e mais particularmente sobuma forma tetramérica e misturas destes.

Portanto, a quantidade de antígeno derivado de gp41 a serusada para a preparação de uma vesícula semelhante ao virossoma de acordocom a invenção pode ser ajustada por qualquer protocolo de rotina conhecidopela pessoa habilitada na técnica para obter a forma mono ou multiméricadesejada.

De acordo com uma forma de realização, um antígenoderivado de gp41 pode estar localizado na superfície externa por suaextremidade de terminal N ou C.

De acordo com uma forma de realização, um antígenoderivado de gp41 pode estar localizado na superfície externa por suaextremidade de terminal C.

De acordo com uma forma de realização, um antígenoderivado de gp41 pode estar localizado na superfície externa por suaextremidade de terminal N.

De acordo com uma forma de realização, um antígenoderivado de gp41 pode estar encapsulado dentro de uma vesícula semelhanteao virossoma da invenção.

Um antígeno derivado de gp41 pode ser encapsulado por umvirossoma, pelos métodos bem conhecidos na técnica.

Por exemplo, uma solução de hemaglutinina A/Singapore deinfluenza purificada obtida como descrita previamente por J. J. Skehe andG.C. Schild (The polypeptide composition of influenza A viruses. Virology44 (1971) 396-408) pode ser preparada pela dissolução de um grânulo dehemaglutinina centrifugada em uma solução de PBS-OEG (fosfatidilcolina(PC), fosfatidiletanolamina (PE) dissolvida em PBS contendo éteroctanotilenoglicolmonodecílico (OEG).

Os antígenos derivados de gp41 e fosfolipídeos podem seradicionados à solução de hemaglutinina, misturada, sonificada e depoiscentrifugada. Os virossomas podem ser então formados, como previamentedescrito, pela remoção de detergente, por exemplo, usando-se BioRad SMBio-Beads.De acordo com um outro exemplo, um antígeno derivado degp41 pode ser encapsulado em lipossomas usando-se métodos, tais comodescritos previamente ou como descrito em Christodoulides et ai.,Microbiology 144:3027-3037 (1998), antes da fusão das ditas vesículas delipossoma com vesículas de virossomas.

De acordo com uma outra forma de realização, quandoencapsulado em uma vesícula semelhante ao virossoma da invenção, umantígeno derivado de gp41 também pode ser fornecido sob uma forma mono-ou multimérica como previamente indicado.

De acordo com uma forma de realização, um antígenoderivado de gp41 que pode ser usado na presente invenção pode ser escolhidode quaisquer ciados de HTV.

Os ciados de HIV adequados para invenção podem ser, porexemplo, HIV dos ciados A, B, C ou D.

Mais particularmente, um antígeno derivado de gp41 podemser dos ciados do tipo C de HTV.

Um antígeno derivado de gp41 adequado pode compreender,em parte, qualquer substituição de aminoácido conservadora (e/ou inserçãoe/ou anulação) e/ou modificação química (tal como ciclização) com respeito àocorrência natural do antígeno derivado de gp41, cuja implementação podecontar com a habilidade de rotina de uma pessoa habilitada na técnica.

De acordo com uma forma de realização, um antígenoderivado de gp41 que pode reunir-se para implementar a presente invençãopode ser um peptídeo de seqüência de aminoácidos representado em todo ouem parte por uma seqüência apresentada como a SEQ ID N0 1, obtida da cepade HIV-I HxB2 ou um análogo deste.

Em uma forma de realização, um antígeno derivado de gp41pode ser uma proteína de arco projetada de gp41 a partir das seqüências deaminoácido do tipo selvagem das glicoproteínas gp41 de HIV.Como exemplo de antígenos derivados de gp41 que podem serúteis para realizar a presente invenção, menção pode ser feita de antígenosderivados de gp41 obtidos pela introdução, nas regiões imunodominantes, dealgumas mutações (anulação, substituição e/ou inserção) a fim de reduzir ahomologia com a interleucina-2 (IL-2) humana a fim de evitar ou reduzir orisco de disparar uma reação autoimune. Tais antígenos derivados de gp41são, em particular descritos no WO 2005/010033, que são incorporados nestepor referência.

No presente pedido, "mutação" refere-se a qualquermodificação de uma região (opcionalmente a um resíduo de aminoácidosimples) de um polipeptídeo, por meios físicos, meios químicos (modificaçãocovalente ou não covalente) e/ou meios biológicos (mutações porsubstituição, anulação e/ou inserção de um ou mais aminoácidos), que levamà modificação dos potenciais funcionais dos aminoácidos constituintes da ditaregião, denominado "região mutada". Por meio de exemplo, é possívelrealizar mutações que levam à modificação de uma aminoácido da série L nasérie D, a abolição, aquisição e/ou modulação das propriedades de pontes debissulfito, ligações de hidrogênio, interações eletrostáticas e/ou interaçõeshidrofóbicas, a modificação da capacidade de uma proteína formar umheterocomplexo ou alternativamente, no caso de uma proteína oligomérica, amodificação doestado de oligomerização ou da estabilidade do oligômero.

A modificação das regiões imunodominantes podem resultarna introdução ou substituição de parte do arco com um ligador flexívelhidrofílico, fracamente imunogênico ou não e opcionalmente com aintrodução de mutações.

Ao antígeno derivado de Gp4 lpode incluir, além disso, pelomenos uma mutação em sua região imunodominante, que dá, in vitro, umareação cruzada, do tipo B e/ou do tipo T, com uma proteína hospedeira e, emparticular com IL-2.Algumas das mutações decisivas para impactar esta mudançana antigenicidade são divulgadas em US 6.455.265 e WO 2005/010033 cujasexplicações são incorporadas por referência em sua totalidade.

De acordo com uma forma de realização, um antígenoderivado de gp41 adequado para a presente invenção pode ser um peptídeodenominado Pl e pode ser um peptídeo de seqüência de aminoácidorepresentada em todo ou parte por uma seqüência escolhida da SEQ ID N0 2,SEQ ID N0 3 ou um análogo deste.

O peptídeo Pl corresponde a uma seqüência de aminoácidopresente no ectodomínio da proteína de envelope de HTV gp41 que élocalizado no domínio das partículas virais antes dos vírus interagirem com ascélulas alvo. Como exemplo, na cepa de HIV-I HxB2, esta seqüência écompreendida de aminoácido 649 ao aminoácido 683 da proteína gp41 dotipo selvagem.

Um antígeno derivado de gp41 útil para a invenção tambémpode incluir modificações, tais como truncação de uma parte da seqüência deaminoácido nas extremidades de terminal N ou C ou adição de uma seqüênciade peptídeo para a produção de proteína quimérica, como descrito no WO2005/010033 ou como previamente descrito.

Como exemplo de um antígeno derivado de gp41 adequadopara invenção, pode ser prevista a seqüência de peptídeo Pl que compreendeuma adição de um espaçador Lys-Gly-Cys na posição de terminal C, como,por exemplo, apresentado como SEQ ID N0 4.

ADJUVANTES

De acordo com uma forma de realização, o efeitoimunoestimulador de vesículas semelhantes ao virossoma da invenção aindapode ser aumentado pela associação destas vesículas semelhantes aovirossoma com pelo menos um adjuvante.

O dito adjuvante pode ser encapsulado dentro e/ouincorporado na bicamada de lipídeo de, e/ou livremente combinado com a ditavesícula.

De acordo com uma forma de realização, a vesículasemelhante ao virossoma pode, adicionalmente, compreender pelo menos umadjuvante que intensifica ou media uma resposta imune escolhida a partir deuma resposta imune inata e/ou uma resposta imune adaptativa.

Uma resposta imune adaptativa pode ser escolhida de umaresposta imune Tm e/ou TH2-

Os adjuvantes utilizáveis podem intensificar a respostaimunológica pela ativação das células que apresentam antígeno (APC),macrófagos e/ou séries específicas estimuladoras de linfócitos.

Um adjuvante que pode reunir-se com a presente invençãopode ser qualquer ligando adequado para a ativação de um receptor dereconhecimento de patogênio (PRR) expressado em e nas células dentríticas(DCs) ou outras células que apresentam antígenos.

Os ligandos que ativam os receptores semelhantes a Toll(TLRs) também podem reunir-se para os propósitos da invenção, aquelesreceptores são membros da família PRR e são amplamente expressados emuma variedade de células imunes inatas, incluindo DCs, macrófagos,mastócitos e neutrófilos.

Como exemplo de ligandos que ativam TLR, menção pode serfeita com respeito a TLR4 de LPS de E. coli, taxol, proteína de fusão RSV eproteínas de choque por calor de hospedeiro 60 e 70, com respeito de TLR2de peptidoglicano de Staphylococcus aureus, lipoproteínas de M. tuberculosise zimosan de Sacharomyces cerevisiae, e LPS de P. gingivalis altamentepurificado, com respeito de TLR3 de dsRNA, com respeito de TLR5 deflagelina, com respeito ao TLR7 de imidazoquinolinas de compostossintéticos e com respeito de TLR9 de certos tipos de DNA ricos em CpG.

Outros adjuvantes auxiliares para a invenção podem ser osepítopos auxiliares Τ.

Um epítopo auxiliar T é um peptídeo usualmente derivado deproteína exógenas que sofreram a degradação proteolítica e o processamentodentro do caminho endocítico de células que apresentam antígeno (APCs).

Naquelas células, o Complexo de Histocompatibilidade Principal II (MHC II)transportadas ao endossomas do caminho endocítico associam-se com aquelespeptídeos. Este complexo transportado para a superfície dos APCs podeinteragir com um receptor de célula T de CD4+ que levam à sua ativação.

De acordo com um epítopo auxiliar, a resposta de célula Tpode ser do tipo THi e/ou Tm-

Os epítopos THi que favorecem uma resposta de CTL e osepítopos Th2 que favorecem uma resposta humoral são conhecidos na técnica.

Como o exemplo de epítopo de resposta orientada por Tmmenção pode ser feita dos peptídeos derivados de melitina identificados noWO 2005/049647.

Como exemplo de outros epítopos de resposta orientados porTH2 pode-se mencionar o epítopo de célula T auxiliar pan DR (PADRE). Esteepítopo é projetado para ligar-se às moléculas de HLA-DR mais comuns comalta afinidade e para atuar como um imunogênio poderoso. O epítopo PADREHTL foi mostrado aumentar a potência de vacinas projetadas para estimularuma resposta imune celular (Alexander J. et al, Immunol Res. 1998; 18(2):79-92).

De acordo com uma forma de realização, um adjuvante quepode ser usados com as vesículas semelhantes ao virossoma da presenteinvenção pode ser escolhido de sais de alumínio, géis de fosfato de alumínio,micobactérias, tais como BCG, M. Vaccae ou corynebacterium parvum,peptídeos, hemocianina de lapa buraco de fechadura, dipeptídeos de muramilae derivados de tripeptídeo, lipídeo A de monofosforila, interleucina-2 (IL-2),IL-12, GM-CSF, ligandos da família da quimiocina, tais como RANTES(Regulado na Ativação de célula T Normal Expressada e Secretada), umalipoproteína de bactéria de Gram+, um componente da parede da célula delevedura, um RNA de filamento duplo, um lipopolissacarídeo de bactérias deGram", flagelina, um RNA viral de filamento simples rico em U, um DNAcontendo CpG, um RNA que interfere com a citocina sinalizadora pequena 6fsupressora (SOCS siRNA), peptídeos derivados de melitina, um epítopo depan DR (PADRE) e misturas destes.

PREPARAÇÕES FARMACÊUTICAS

De acordo com a forma de realização, a vesícula semelhanteao virossoma de acordo com a invenção pode ser usada para a preparação deuma composição farmacêutica que pretende induzir uma resposta imune deadaptação e/ou uma resposta imune natural direcionada contra uma proteínagp41 de um vírus de imunodeficiência humana.

Tal composição farmacêutica pode compreender uma soluçãoda vesícula semelhante ao virossoma colocada em suspensão em umcarregador farmaceuticamente aceitável, por exemplo um carregador aquoso.

Uma variedade de veículos aquosos podem ser usados porexemplo, água, água tamponada, 0,4 % de solução salina, 0,3 % de glicina,ácido hialurônico e outros. Uma composição farmacêutica pode seresterilizada por técnicas de esterilização convencional bem conhecidas, oupodem ser filtradas estéreis.

As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para ouso como é, ou liofilizadas, a preparação liofilizada sendo combinada comuma solução estéril antes da administração.

Uma composição farmacêutica pode conter substânciasauxiliares farmaceuticamente aceitáveis como requerida por condiçõesfisiológicas aproximadas, tal como ajuste de pH e agentes de tamponação,agentes de ajuste da tonicidade, agentes de umectação e outros, por exemplo,acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloretode cálcio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, entre muitosoutros.

Tais preparações podem rotineiramente conter concentraçõesfarmaceuticamente aceitável de sal, agentes de tamponação, antioxidantes,preservantes, veículos compatíveis, adjuvantes como previamente descritos eopcionalmente outros agentes terapêuticos.

A vesícula semelhante ao virossoma da invenção, e emparticular composições farmacêuticas que compreende estes pode seradministrados pela injeção ou por uma via mucosal, ou uma combinação destes.

A via de injeção pode ser, por exemplo, via intramuscular ouintravascular subcutânea, intradérmica, intraperitoneal.

Qualquer via mucosal pode ser usada, tal como viageniturinário como por exemplo via vaginal, via gastro-intestinal, viaanorretal, via respiratória, tecido superior mucosal, via boca-nasal e misturadestes.

Em uma forma de realização, uma composição farmacêuticada invenção pode ser fornecida como formas de dosagem oral, tais comotabletes, cápsulas (cada uma incluindo o tempo de liberação e formulação deliberação sustentada), pílulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, soluções,suspensões, xaropes e emulsões.

Todas estas formas são bem conhecidos aqueles de habilidadescomuns nas técnicas farmacêuticas.

Em uma forma de realização, uma vesícula semelhante aovirossoma pode ser usada para a preparação de uma composição farmacêuticaa ser administrada na forma de uma vacina. Quaisquer protocolos deimunização padrão na técnica podem ser usados.

De acordo com uma forma de realização, uma composiçãofarmacêutica da invenção pode compreender vesículas que compreendem umantígeno derivado de gp41 localizado à superfície externa das ditas vesícuiase vesí cuias que compreendem um antígeno derivado de gp41 encapsuladodentro das ditas vesículas, como uma preparação combinada para o usoseqüencial, separado ou simultâneo em imunoterapia.

De acordo com uma outra forma de realização, umacomposição farmacêutica da invenção pode compreender ainda uma vesículasemelhante ao virossoma adicional que compreende um antígeno distinto apartir do dito antígeno derivado de gp41 como uma preparação combinadapara o uso seqüencial, separado ou simultâneo em imunoterapia.

Tais antígenos distintos podem ser previamente descritos.Uma composição farmacêutica da invenção pode compreenderuma vesícula semelhante ao virossoma da invenção em uma quantidadeeficaz.

Uma quantidade eficaz que é uma quantidade da vesículasemelhante ao virossoma que só ou junto com doses adicionais podemsimular a resposta desejada. Uma quantidade eficaz pode depender davariedade de fatores, tal como a via para administração, se a administração éem dose simples ou múltiplas, e parâmetros de paciente individuais queincluem idade, condição física, tamanho, peso, e o estágio da doença. Estesfatores são bem conhecidos daqueles de habilidade comum na técnica e podeser denominado não mais do que experimentação de rotina.

Portanto, de acordo com a forma de realização, umacomposição farmacêutica pode compreender uma vesícula semelhante aovirossoma da invenção sozinho ou um combinação como pelo menos umadjuvante, como previamente descrito.

De acordo com um outro aspecto, uma presente invenção étambém direcionada ao método de tratamento e/ou profilaxia de uma infecçãode HIV que compreende pelo menos uma etapa de administração por umindivíduo em necessidade deste, uma quantidade eficaz da vesículasemelhante ao virossoma de acordo com a presente invenção.

De acordo com uma forma de realização, a vesículasemelhante ao virossoma de acordo com a invenção pode ser administradopela injeção ou uma via mucosal, ou uma combinação deste comopreviamente indicado.

De acordo com uma outra forma de realização, a vesículasemelhante ao virossoma que pode ser usada de acordo com uma presenteinvenção que pode ser uma vesícula semelhante ao virossoma quecompreende um antígeno derivado de gp41 localizado à superfície externa euma vesícula semelhante ao virossoma que compreende um antígeno derivadode gp41 encapsulado dentro das ditas vesículas como uma preparaçãocombinada para o uso seqüencial, separado ou simultâneo em imunoterapia.

De acordo com uma outra forma de realização a vesículasemelhante ao virossoma que pode ser usado no método de acordo com ainvenção pode ser administrado em uma combinação com um antígenoadicional distinto a partir do dito antígeno derivado de gp41.

Como exemplo do antígeno adicional que pode reunir para apresente invenção, a referência pode ser feita dos antígenos distintos citadospreviamente.

De acordo com um outro aspecto, uma presente invençãotambém relata um equipamento para indução de uma resposta imune contrauma proteína gp41 de um vírus de imunodeficiência humana que compreende:

pelo menos uma primeira vesícula semelhante aovirossoma de acordo com a invenção, que compreende pelo menos umprimeiro antígeno derivado de gp41, e

pelo menos uma segunda vesícula semelhante aovirossoma da invenção que compreende pelo menos um segundo antígenoderivado de gp41,

os ditos primeiro e segundo antígenos derivado de gp41 sendodiferente um do outro.

De acordo com uma forma de realização, um primeiroantígeno derivado de gp41 pode ser um peptídeo de seqüência aminorepresentada em total ou partes pela seqüência escolhida a partir da SEQ EDN0 2, SEQ ID N0 3, ou um análogo deste.

De acordo com uma outra forma de realização, um segundoantígeno derivado de gp41 pode ser um peptídeo da seqüência aminorepresentada em total ou partes pela seqüência apresentada como SEQ ID N01, ou um análogo deste.

Uma presente invenção será ainda entendida com os seguintesexemplos que são representados por propósitos ilustrativos e não deve serinterpretados como limitantes do escopo da presente invenção.

Os vários aspectos de uma presente invenção será aindailustrado pelos seguintes exemplos, que não devem em qualquer caso seremconstruídos como limitantes do escopo da presente invenção.

LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1: ilustra uma seqüência de antígeno derivado de gp41a partir de vírus de ciado B HxB2 (SEQ ID N0 1, SEQ ID N0 3, SEQ ID N0 4)e a partir de ciado C fflV (SEQ ID N0 2).

Figura 2: ilustra uma seqüência de domínio de transmembranade molécula CD4+ (SEQ ID N0 5).

Figura 3: ilustra dosagem de anticorpos totais, IgG e slgA emsecreções cervico-vaginal a partir de coelhos imunizados com vesículas P-Isemelhante ao virossoma do exemplo 1, sem adjuvante (36 & 37, via intra-muscular), com hRANTES (61, via intra-nasal) ou com toxina instável aocalor (64 & 65, via intra-nasal) na semana O, 14, 18, 23 e 28.

Figura 4: ilustra dosagem de anticorpos totais, IgG e IgA nossoros a partir de coelhos imunizados com vesículas P-I semelhante aovirossoma do exemplo 1, sem adjuvante (36 & 37, via intra-muscular), comhRANTES (61, via intra-nasal) ou com toxina instável ao calor (64 & 65, viaintra-nasal) na semana 0, 14, 18, 23 e 28.

Figura 5: ilustra a inibição de transitose de HTV-I através decélulas HT-29, usando PBMC infectado com vírus primário e secreçõescervico-vaginal (diluição 1/50) obtido como descrito no exemplo 2 (semanas14, 18 e 23, vesículas P-I semelhante ao virossoma sem adjuvante 36 & 37,via intramuscular, com hRANTES 61 & 63, via intra-nasal ou com toxinainstável ao calor 64 & 65, via intra-nasal).

Figura 6: ilustra dosagem por ELISA de IgG em secreçõesvaginal de macacos fêmeas vacinadas com a vesícula P-I semelhante aovirossoma do exemplo 1 a 40 μg/dose na semana 0, 4, 12 e 24.

Figura 7: ilustra dosagem por ELISA de IgA em secreçõesvaginal de macacos fêmeas vacinadas com a vesícula P-I semelhante aovirossoma do exemplo 1 a 40 μg/dose a 0, 4, 12 e 24.

Figura 8: ilustra dosagem por ELISA de IgA na lavagem retalde macacos fêmeas vacinadas com a vesícula P-1 semelhante ao virossoma doexemplo 1 a 40 μg/dose na semana 0, 4, 12 e 24.

Figura 9: ilustra a inibição de cepas R5 HIV (ciado B HIVprimário V29 a partir do ciado C HIV primário V25 ou NIH a partir do NIH)através de células HT-29 usando PBMC infectado com V29 ou V25 comsecreções vaginais a partir de 25 semanas (diluição 1/25) obtido comodescrito no exemplo 4.

Figura 10: ilustra a inibição de cepas R5 HIV (ciado B HIVprimário V29 a partir do ciado C HIV primário V25 ou NlH a partir do NIH)através de células HT-29 usando PBMC infectado com V29 ou V25 comlavagens retais a partir de 25 semanas (diluição 1/25) obtido como descrito noexemplo 4.

EXEMPLOS

Exemplo 1:Preparação de vesículas semelhantes ao virossoma quecompreende um antígeno derivado por gp-41 localizado à superfície externa

Uma vesícula semelhante ao virossoma foi preparado comodescrito em WO 2004/045582.

Brevemente, 32 mg de fosfatidilcolina de ovo (PC) e 8 mg defosfatidiletanolamina (PE) foram dissolvidos em 2 ml de PBS contendo 100mM de éter octaetilenoglicolmonodecílico (OEG) (PBS/OEG).

A hemaglutinina influeza A/Singapore (HA) foi purificadocomo descrito (Skehel and Schild, Virology 44:396-408, 1971) em fosfato desolução salina tamponada (PBS) 4 mg de hemaglutinina (HA) foi centrifugadaa 100.000 χ g por 30 minutos e o grânulo foi dissolvido em 1,33 ml de PBScontendo 100 mM de OEG.

Um antígeno derivado de gp41 modificado (Pl) com umespaçador de Gly-Lys-Cys na posição terminal C (SEQ ID N0 4) foiconjugado através um ligador de succinato em terminal N a um regioisômerode fosfatidiletanolamina (PE) como seguintes.

O fosfatidiletanolamina (PE) foi dissolvido em metanol e 0,1% (v/v) trietilamina foi adicionado. A solução foi então misturada com oheterobifuncional reticulado Ν-γ-maleimidobutiriloxi-succinimida-éster(GMBS), (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) (razão PE: GMBS = 5:1)que foi previamente dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) (20 μΐ). Após aincubação durante 30 minutos em temperatura ambiente, os solventes foramevaporados por 1 hora sob vácuo em uma centrífuga speedvac. O GMBS-PEfoi então dissolvido em 1 ml de PBS contendo 100 me de octaetilenoglicol(OEG) (Fluke Chemicals, Switzerland), (PBS-OEG) e o antígeno derivado degp41 Pl modificado (SEQ ID N0 4) foi adicionado (razão PE-GMBS:peptídeo = 5:1). Nesta etapa, o fosfatidiletanolamina-GMBS atua com umacisteína de terminal C livre do peptídeo Pl modificado. Após o tempo deincubação de 30 minutos, a cisteína livre foi adicionada, a fim de GMBS livreinativo (razão Cisteína: GMBS = 10:1).

Os conjugados de peptídeo Pl-fosfatidiletanolamina (4 mg),fosfatidilcolina (32 mg; Lipóide, Ludwigshafen, Alemanha) e fosfatidil-etanolamina (6 mg) foram dissolvidos em um volume total de 2,66 ml dePBS-OEG. Os fosfolipídeos e as soluções de hemaglutinina foram misturadose sonificados por 1 minuto.

Esta solução foi centrifugada por 1 hora a 100.000 g e osobrenadante foi esterilizado pela filtração. Os virossomas foram formadospela remoção detergente (SM BioBeads, BioRad, Glattbrugg, Switzerland).

Exemplo 2:

Imunização de coelhos com uma composição de vacina quecompreende vesícula semelhante ao virossoma com antígeno derivado por gp-41 peptídeo PI localizado na superfície externa

Três grupos de coelhos fêmeas brancos New-Zealand forampreparados para receber a vesícula semelhante ao virossoma fabricado comoapresentado no exemplo 1.

A vesícula semelhante ao virossoma foram sem qualqueradjuvante administrado intra-muscularmente (coelhos 36 e 37), ouadministrado intra-nasal com hRANTES (coelhos 61 e 63), ou administradointra-nasal com toxina instável por calor (HLT) (coelhos 64 e 65).

O seguinte regime de administração foi aplicado.

Quatro semanas antes da primeira administração depreparações, os coelhos recebidos de injeções intra-muscular da influenza Ainativada (100 μl de influenza A inativada, 0,01 mg/ml).

À seguir, os coelhos recebem a administração da vesículasemelhante ao virossoma (20 μg, 100 μl) na semana 0, 4 e 12, e recebeu umaintensificação intra-muscular (10 μg) na semana 16 e 22.

Os animais foram sacrificados na semana 28 e várias amostrasforam coletados para estudo de funções de resposta de anticorpos.As amostras pré-imune (retiradas antes da semana 0) foramusados como controles.

As amostras de secreções vaginais e sangue foram retiradas nasemana 14, 18, 23 e 28.

As vesícula semelhante ao virossoma HLT de coelhosvacinados foram usados como controle com respeito ao hRANTES a vesículasemelhante ao virossoma de coelhos vacinados.

O nível de anticorpos totais, IgG e IgA foram medidos deacordo com o seguinte protocolo ELISA.

O peptídeo Pl (100 ng/100 μΐ/reservatórios, SEQ ID N0 3) emum tampão de bicarbonato 50 mM, pH 9,6 foi usado para revestir as placasNunc durante a noite a 4°C.

As placas foram saturadas com BSA 3 % ou leite 5 % por 2horas/37°C, então lavado com PBS de 0,5 % de tampão de Tween.

As amostras de soros diluídos 1/1000 com BSA 3 % ousecreção cervico-vaginal diluída 1/50 com BSA 3 % foram incubadas por 2horas a 37°C.

As placas foram à seguir enxaguadas com PBS de 0,5 % detampão de Tween, e incubado com anticorpos primários.

Para detecção de anticorpos totais, um anticorpo de cabra Igtotal anti-coelho rotulado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (1/4000)foi usado.

Para detecção de IgA coelho, um anticorpo de cabra IgG anti-coelho (Vector, France) (1/20.000) foi usado seguido com uma incubaçãocom estreptavidina-HRP (Immunotech) diluído 1/50.000.

Para a detecção de anticorpo de coelho IgG, um anticorpo decabra IgA de anti-coelho (Sigma) (1/20.000) foi usado seguido com umaincubação com um anticorpo anti-cabra rotulado por biotina (Vector)(1/1000), e revelado com estreptavidina-HRP (1/50.000).Um anticorpo monoclonal 2F5-IgG foi usado como controlepositivo, seguido com uma incubação com um IgA anti-humano rotulado porFab'2 de cabra de biotina, (1/5000) (Caltag) e revelado com estreptavidina-HRP (1/50.000).

Um anticorpo monoclonal 2F5-IgA foi usado como controlepositivo, seguido com um Fab'2 de cabra de IgG anti-humano (1/20.000) erevelado com estreptavidina-HRP (1/50.000). Os anticorpos foram incubadospor 1 hora a 37°C.

A reação colorimétrica foi disparada pela adição do substratoTMB, e interrompida pela adição de H2PO4 1M.

A densidade óptica (OD) foi lida a 450 nm.

Os resultados obtidos são ilustrados na Figura 3 (secreçãocervico-vaginal) e Figura 4 (soros).

A presença de anticorpos foi observada em secreção cervico-vaginal e soros de coelhos imunizados com um pico na semana 14 ou 18 deacordo com as condições de imunização.

Exemplo 3:

Inibição de transcitose de HIV com secreção cervico-vaginalobtido a partir de coelhos imunizados do exemplo 2

A transitose de HIV-I através das células epiteliais eneutralização de transcitose por anticorpos foram realizados em linha celularHT-29 epitelial que desenvolve uma firme, monocamada polarizada por 7dias em um suporte de filtro permeável (tamanho de poro de 0,45 mícron)formando uma interface entre duas câmaras independentes, quanto mais alto obanho maior a superfície apical (Iuminal) da monocamada epitelial e quantomais baixo o banho menor a superfície basolateral (serosal).

Principalmente, os PBMC foram obtidos e preparados comodescrito em Lagaye et al., (J. Virol, 2001, 75:4780). Então os PBMCs foramativados com fitoemaglutinina (PHA) por 48 horas e inoculados comprincipalmente ciado C HIV-I e usados em 7 dias pós-infecção.

As secreções cervico-vaginal (diluição 1/50) obtidas comodescrito no exemplo 2 (semanas 14, 18 e 23, vesículas P-I semelhante aovirossoma sem adjuvante 36 & 37 i.m., com hRANTES 61 & 63 i.n. ou comtoxina instável ao calor 64 &65 i.n.) contendo anticorpos foram incubados a18°C por 1 hora com 1,106 HIV-I+ PBMC.

Para iniciar a transcitose do vírus, 2, IO6 HIV-I+ PBMC comanticorpos foram adicionados à câmara apical. O contato entre HTVr-I+ PBMCe a monocamada celular epitelial resulta no enxerto rápido de vírions de HIV-1, seguido pela sua transcitose do pólo apical para o basolateral de célulasepiteliais.

Após 2 horas, a inibição de transcitose pelo anticorpo foideterminado pela detecção da proteína p24 de HIV no meio basolateral porELISA (Coulter, France or PASTEUR SANOFI, FRANCE). O nível de p24na ausência da secreção vaginal ou na presença de um Pl de Fab nãoespecífico ou na presença do controle IgA 2F5 foi medido como controlenegativo ou positivo respectivamente. O valor do controle negativo foideixado como 100 % de transcitose e usado para expressar os resultados.

Os experimentos foram realizados pelo menos duas vezes.

Os resultados obtidos mostrados na Figura 5.

Os resultados indicam que as secreções cervico-vaginal apartir de coelhos imunizados com vesículas P-I semelhantes ao virossomasem adjuvante (36 e 37), ou com RANTES humanos (61 e 63), ou com atoxina instável por calor (HLT) (64 e 65) obtido como descrito no exemplo 2foram capaz de reter a transcitose de HIV-I dos ciados C através das célulasHT-29.

Sem adjuvante e com HLT, uma inibição de 70 a 90 % foiobservada com secreção cervico-vaginal a partir da semana 18.

Com hRANTES uma inibição de 85 a mais do que 90 % foiobservada com secreção cervico-vaginal a partir da semana 23.

Exemplo 4:

Imunização de macacos com a composição de vacina quecompreende vesícula semelhante ao virossoma com antígeno derivado por gp-41 peptídeo Pl localizado na superfície externa.

Três grupos de 5 a 6 macacos fêmeas com idade de cerca de 5anos foram preparados para receber a vesícula semelhante ao virossomafabricado como apresentado no exemplo 1.

A vesícula semelhante ao virossoma foi administrada intra-muscularmente (macacos Gl.l a Gl.5), ou administrado intra-nasal (macacosG2.1 a G2.5), ou intramuscularmente e administradas intra-nasal (macacosG3.1 a G3.6).

O seguinte regime de administração foi aplicado.

Quatro semanas antes da primeira administração depreparações, os macacos receberam injeções intra-muscular da influenza Ainativada (100 μΐ de influenza A inativada, 0,01 mg/ml).

À seguir, os macacos receberam a administração da vesículasemelhante ao virossoma (40 μg, 100 μΐ) na semana 0, 4, 12 e 24.

As amostras de lavagens retais e secreções vaginais foramretiradas na semana 25 e 26. O nível de anticorpos totais, IgG e IgA forammedidos de acordo com o seguinte protocolo ELISA.

O peptídeo Pl (100 ng/100 μΐ/reservatórios, SEQ ID N0 3) emum tampão de bicarbonato 50 mM, pH 9,6 foi usado para revestir as placasNunc durante a noite a 4°C.

As placas foram saturadas com BSA 2 % / PBST 0,1 % por 1hora a 30/37°C, então lavado com PBS de 0,1% de tampão de Tween.

As amostras de lavagens retais não diluídas ou secreçõesvaginais diluídas 1/2 com 0,1% de PBST foram incubadas durante a noite a4°C.As placas foram à seguir enxaguadas com PBS de 0,1% detampão de Tween, e incubadas com anticorpos primários diluídos em 2% deBSA / 0,1% de PBST.

Para detecção dos macacos IgG5 um anticorpo de cabra IgGanti-macaco (Rockland) (1/15.000) foi usado seguido com uma incubaçãocom estreptavidina-HRP (Immunotech) diluído 1/50.000.

Para a detecção de anticorpo de IgA macacos, um anticorpo decabra IgA anti-macaco (Rockland) 1/15.000) foi usado seguido com umaincubação com estreptavidina-HRP (Immunotech) diluído 1/50.000.

Um anticorpo monoclonal 2F5-IgA foi usado como controlepositivo, seguido com uma incubação com um IgA anti-humano rotulado porFab'2 de cabra de biotina, (0,14 μg/ml final) (Caltag H 14015) e reveladocom estreptavidina-HRP (1/50.000).

Um anticorpo monoclonal 2F5-IgG foi usado como controlepositivo, seguido com uma Fab'2 de cabra de IgG anti-humano (0,1 μg/mlfinal) (Rockland 609106123) e revelado com estreptavidina-HRP (1/50.000).

Os anticorpos foram incubados por 1 hora a 37°C.

A reação colorimétrica foi disparada pela adição do substratoTMB, e interrompida pela adição de H2PO4IM.

A densidade óptica (OD) foi lida a 450 nm.

Os resultados obtidos são ilustrados na Figura 6 e 7 (secreçõesvaginais IgG e IgA) e Figura 8 (lavagens retais).

Os resultados mostram que 90 a 95 % dos macacos fêmeas tembons níveis de níveis de anticorpos IgG e IgA específicos anti-gp41 na suasecreção genital, e mais do que 95 % tem anticorpos IgA específicos anti-gp41nas suas lavagens retais.

Em conclusão, a presença de IgG bem como anticorpos IgAfoi observada em secreções vaginais e lavagens retais de macacos fêmeasimunizadas.Os resultados relevados que uma resposta imune comanticorpos mucosal podem ser obtidos com uma vacina da invenção.

Adicionalmente, é observado que os anticorpos IgA e IgGpodem ser redistribuídos nos compartimentos intestinais e genitais cada umapós a vacinação pela injeção intramuscular na ausência de adjuvantemucosal.

Exemplo 5:

Inibição de transcitose de HTV com secreções vaginais elavagens retais obtidos de macacos imunizados do exemplo 4

A transcitose de cepas R5 HTV-I (V29 principalmente ciado BfflV de NIH e V25 de principalmente ciado C HTV de NIH) através dascélulas epiteliais e neutralização de transcitose por anticorpos foramrealizadas em linha celular HT-29 epitelial que desenvolve uma firme,monocamada polarizada por 7 dias em um suporte de filtro permeável(tamanho do poro de 0,45 μιη) formando uma interface entre duas câmarasindependentes, quanto mais alto o banho maior a superfície apical (Iuminal)da monocamada epitelial e quanto menor o banho menor a superfíciebasolateràl (serosal).

Principalmente, os PBMC foram obtidos e preparados comodescrito em Lagaye et al., (J. Virol, 2001, 75:4780). Então os PBMCs foramativados com fitohemaglutinina (PHA) por 48 horas e inoculados comprincipalmente ciado B de HtV-I (V29) ou principalmente ciado C HIV-I(V25) e usados em 7 dias pós-infecção.

As secreções vaginais (diluição 1/25) ou lavagens retais(diluição 1/25) obtidas como descrito no exemplo 4, a partir de 25 semanascontendo anticorpos foram incubadas a 18°C por 1 hora com 1,106 HIV-I+PBMC.

Para iniciar transcitose do vírus, 2, IO6 HIV-I+ PBMC (V29 ouV25) com anticorpos foram adicionados à câmara apical. O contato entreHTV-I+ PBMC e uma monocamada celular epitelial resulta no enxerto rápidode vírions HTV-1, seguido pela sua transcitose do polo apical para obasolateral de células epiteliais.

Após 2 horas, a inibição de transcitose pelo anticorpo foideterminado pela detecção da proteína p24 do HTV no meio basolateral porELISA (Coulter, France or PASTEUR SANOFI, FRANCE). O nível de p24na ausência da secreção vaginal ou na presença de um Pl Fab não específicoou na presença do controle IgA 2F5 foi medido como controle negativo oupositivo respectivamente. O valor do controle negativo foi deixado como 100% de transcitose e usado para expressar os resultados.

Os experimentos foram realizados pelo menos duas vezes.

Os resultados obtidos mostrados na Figura 9 (secreçõesvaginais) e na Figura 10 (lavagens vaginais).

Os resultados indicam que os anticorpos foram capazes deprevenir pelo menos 60 % de entrada do HTV através de um modelo epitéliomucosal humano in vitro, e até 98 % em dois do dezesseis animais.

Portanto, uma vacina da invenção é capaz de disparar um IgGbem como uma reposta imune IgA mucosal. A resposta imune mucosal écapaz de reduzir significantemente a trascitose mucosal do HIV, a partir deciados de HIV diferentes.

Claims (35)

1. Vesícula semelhante ao virossoma, caracterizada pelo fatode que compreende pelo menos um antígeno derivado de gp41 ou um análogodeste, o dito antígeno derivado de gp41 estando localizado na superfícieexterna de e/ou encapsulado dentro da dita vesícula e estando em umaconfiguração conveniente para conferir a dita vesícula semelhante aovirossoma com uma capacidade de induzir uma resposta imune contra umaproteína gp41 de um vírus da imunodeficiência humana (HIV).

2. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com areivindicação precedente, caracterizada pelo fato de que o dito antígenoderivado de gp41 é desprovido de propriedade fiisogênica com respeito àmembrana celular.

3. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o dito antígeno derivadode gp41 localizado na superfície externa é:- covalentemente ligado com um lipídeo da dita vesículasemelhante ao virossoma ou- intercalado em uma bi-camada de lipídeo da dita vesículasemelhante ao virossoma por um domínio de transmembrana de peptídeodistinto de um domínio transmembrana de peptídeo do tipo selvagem de umaproteína gp41 do tipo selvagem.

4. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com areivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o dito antígenoderivado de gp41 covalentemente ligado compreende pelo menos um resíduode reticulação posicionado de terminal N ou C.

5. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com areivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o dito resíduo dereticulação é escolhido de Cys ou Lys.

6. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com areivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que o dito antígeno derivadode gp41 covalentemente ligado ainda compreende pelo menos um resíduoespaçador entre os ditos resíduos de reticulação posicionados no terminal Nou C e uma extremidade de antígeno derivado de gp41 de terminal C ou Ncorrespondente.

7. Vesicuia semelhante ao virossoma de acordo com areivindicação precedente, caracterizada pelo fato de que o dito resíduoespaçador é escolhido dentre resíduos de Gly5 Ala, Ser, Asp, Lys, Gln, His, Ilee Leu.

8. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com qualqueruma das reivindicações de 3 a 7, caracterizada pelo fato de que o dito lipídeoé escolhido de derivados de PEG anfifílicos, uma fosfatidiletanolamina (PE),uma fosfatidilcolina, uma fosfatidilserina, um colesterol ou uma misturadestes.

9. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com areivindicação precedente, caracterizada pelo fato de que o dito antígenoderivado de GP41 covalentemente ligado é ligado ao dito lipídeo por umligador de succinato bifuncional, em particular um N-hidroxissuccinimidaéster do ácido γ-maleinidobutírico ou um Ν-γ-maleimidobutiriloxi-succinimida-éster.

10. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com qualqueruma das reivindicações de 3 a 9, caracterizada pelo fato de que o ditoantígeno derivado de gp41 é desprovido de seu domínio transmembrana depeptídeo.

11. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o ditoantígeno derivado de gp41 localizado na superfície externa é localizado porsua extremidade de terminal C.

12. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o ditoantígeno derivado de gp41 está sob uma forma de um mono, um di, um tri ouum tetrâmero e misturas destes.

13. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o ditoantígeno derivado de gp-41 antigênico é escolhido dos ciados tipo A, B, C ouD de HIV.

14. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o ditoantígeno derivado de gp41 é um peptídeo de seqüência de aminoácidosrepresentados em todo ou em parte por uma seqüência apresentada como SEQID N0 1 ou um análogo deste.

15. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com qualqueruma das reivindicações de 1 a 13, caracterizada pelo fato de que o ditoantígeno derivado de gp41 é um peptídeo de seqüência de aminoácidosrepresentados em todo ou em parte por uma seqüência escolhida de SEQ IDN0 2, SEQ ID N0 3 ou um análogo deste.

16. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a ditavesícula fusogênica compreende uma bi-camada de lipídeo que compreendelipídeos escolhidos a partir de lipídeos catiônicos, lipídeos sintéticos,glicolipídeos, fosfolipídeos, glicerofosfolipídeos, glicoesfingolipídeos,esfingolipídeos, colesterol e derivados destes.

17. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que estacompreende adicionalmente pelo menos um adjuvante que intensifica e/oumedia uma resposta imune escolhida de uma resposta imune inata ou umaresposta imune adaptativa.

18. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com areivindicação precedente, caracterizada pelo fato de que a resposta imuneadaptativa é escolhida de uma resposta imune Th1 e/ou uma Th2.

19. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com areivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o dito adjuvante éescolhido de sais de alumínio, géis de fosfato de alumínio, micobactérias, taiscomo BCG, M. Vaccae ou corynebacterium parvum, peptídeos, hemocianinade lapa buraco de fechadura, dipeptídeos de muramila e derivados detripeptídeo, Lipídeo A de monofosforila, interleucina-2 (IL-2), IL-12, GM-CSF, ligandos da família da quimiocina, tais como RANTES (Regulado naAtivação de célula T Normal Expressada e Secretada), uma lipoproteína debactéria de Gram+, um componente da parede da célula de levedura, um RNAde filamento duplo, um lipopolissacarídeo de bactérias de Gram", flagelina,um RNA viral de filamento simples rico em U, um DNA contendo CpG, umRNA que interfere com a citocina sinalizadora pequena 6f supressora (SOCSsiRNA), peptídeos derivados de melitina, um epítopo de pan DR (PADRE) emisturas destes.

20. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com qualqueruma das reivindicações de 17 a 19, caracterizada pelo fato de que o ditoadjuvante é encapsulado dentro da dita vesícula, e/ou incorporado nabicamada de lipídeo da dita vesícula e/ou livremente combinado com a ditavesícula.

21. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com qualqueruma das reivindicações reivindicação precedentes, caracterizada pelo fato deque ainda compreende uma porção alvejante específica de célula ou de tecidode um receptor de superfície celular, uma quimiocina, uma citocina, um fatorde desenvolvimento, um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, umaseqüência de peptídeo com especificidade ou complementaridade de cargaespecífica a uma molécula de adesão.

22. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com areivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o dito tecido ouporção alvejante específica de célula é incorporado em ou ligado à bicamadade lipídeo da dita vesícula.

23. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que estacompreende de um a dez antígenos adicionais.

24. Vesícula semelhante ao virossoma de acordo com areivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que os ditos antígenosadicionais são escolhidos de peptídeos de HIV derivados de proteínasestruturais como codificado por genes env (gpl20, gp41), gag (p9, 07, p24) epol (p66, p32) e de proteínas reguladoras como codificado pelos genes nef,rev ou tat e misturas destes.

25. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende vesículas semelhantes ao virossoma como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 24.

26. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicaçãoprecedente, caracterizada pelo fato de que esta compreende um antígenoderivado de gp41 localizado na superfície externa das ditas vesículas evesículas que compreendem que compreende um antígeno derivado de gp41encapsulado dentro da dita vesículas, como uma preparação combinada para ouso simultâneo, separado ou seqüencial na imunoterapia.

27. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicaçãoou 26, caracterizada pelo fato de que ainda compreende vesículassemelhantes adicionais ao virossoma' que compreende um antígeno diferentedo dito antígeno derivado de gp41 como uma preparação combinada para ouso simultâneo, separado ou seqüencial na imunoterapia.

28. Uso de pelo menos uma vesícula semelhante ao virossomacomo definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24, caracterizadopelo fato de ser para a fabricação de uma composição farmacêutica pretendidapara induzir uma resposta imune adaptativa e/ou uma resposta imune inatadirecionada contra uma proteína gp41 de um vírus da imunodeficiênciahumana.

29. Método de tratamento e/ou profilaxia de uma infecção porHIV, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma etapa deadministração a um indivíduo em necessidade deste, de uma quantidadeeficaz de vesículas semelhantes ao virossoma como definido em qualqueruma das reivindicações de 1 a 24.

30. Método de acordo com as reivindicações precedentes,caracterizado pelo fato de que as ditas vesículas semelhantes ao virossomasão administradas por injeção ou por uma via mucosal ou uma combinaçãodestas.

31. Método de acordo com a reivindicação precedente,caracterizado pelo fato de que a dita via mucosal é escolhida do trato genito-urinário, trato gastro-intestinal, via anorretal, trato respiratório, tecidomucosal superior, via boca-nasal e misturas destes.

32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-29 a 31, caracterizado pelo fato de que as ditas vesículas semelhantes aovirossoma compreendem vesículas que compreende antígeno derivado degp41 localizado na superfície externa e vesículas que compreendem antígenoderivado de gp41 encapsulado dentro da dita vesícula como uma preparaçãocombinada para o uso simultâneo, separado ou seqüencial na imunoterapia.

33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-29 a 32, caracterizado pelo fato de que as ditas vesículas semelhantes aovirossoma são administradas em combinação com um antígeno adicionaldistinto do dito antígeno derivado de gp41.

34. Kit para induzir uma resposta imune contra uma proteínagp41 de um vírus da imunodeficiência humana, caracterizado pelo fato de quecompreende:- pelo menos um primeira vesícula semelhante ao virossomacomo definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 que compreendepelo menos um primeiro antígeno derivado de gp41 e- pelo menos uma segunda vesícula semelhante ao virossomacomo definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 que compreendepelo menos um segundo antígeno derivado de gp41,o dito primeiro e segundo antígenos derivados de gp41 sendodiferentes um do outro.

35. Kit de acordo com a reivindicação precedente,caracterizado pelo fato de que o dito primeiro antígeno derivado de gp41 é umpeptídeo da seqüência de aminoácidos representada em todo ou em parte pelaseqüência escolhida da SEQ ID N0 2, SEQ ID N0 3 ou um análogo deste e odito segundo antígeno derivado de gp41 é um peptídeo de seqüência eaminoácidos representado em todo ou em parte pela seqüência apresentadacomo a SEQ ID N0 1 ou um análogo deste.