BRPI0708522A2 - vacina de mycoplasma hyopneumoniae - Google Patents
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Abstract
"VACINA DE MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE.A invenção proporciona um novo método de vacinação de um porco contra Mycoplasma hyopneumoniae pela administração a um leitão desmamado ou a uma porca de uma dose única de uma quantidade eficaz de uma vacina de Mycoplasma hyopneumoniae. A vacina de Mycoplasma hyopneumoniae pode ser uma preparação inativada ou viva modificada de células totais ou parciais, uma vacina de subunidade ou uma vacina de ácido nucléico ou de DNA.
Description
Relatório Descritivo para a Patente de invenção: "VACINACONTRA MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE"
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
Esse pedido reivindica beneficio do Pedido de PatenteProvisório Americano No. De Série 60/778.987, requerido em3 de março de 2006.
É feita referência aos Pedidos de Patente AmericanosNos. De Série 10/899.181, requerido em 26 de julho de 2004,USSN 09/232.279 requerido em 15 de janeiro de 1999, agoraPatente Americana No. 6.376.473 emitida em 23 de abril de2002. USSN 09/232.469 requerido em 15 de janeiro de 1999,agora Patente Americana No. 6.451.770 emitida em 17 desetembro de 2002. USSN 09/232.477 requerido em 15 dejaneiro de 1999, agora Patente Americana No. 6.228.846,emitida em 8 de maio de 2001. USSN 09/232.478 requerido emde janeiro de 1999, agora Patente Americana No.6.207.166, emitida em 27 de março de 2001, USSN 09/232.479requerido em 15 de janeiro de 1999, agora Patente AmericanaNo. 6.221.362 emitida em 24 de abril de 2001, USSN09/347.594 requerido em Io de julho de 1999, agora PatenteAmericana No. 6.217.883 emitida em 17 de abril de 2001,USSN 09/583.350 requerido em 31 de maio de 2000, agoraPatente Americana No. 6.517.843, emitida em 11 de fevereirode 2003, USSN 09/616.781 requerido em 14 de julho de 2000,agora Patente Americana No. 6.534.066, emitida em 18 demarço de 2003, USSN 09/680.228 requerido em 6 de outubro de2000, USSN 09/784.962 requerido em 16 de fevereiro de 2001,USSN 09/784.982 requerido em 16 de fevereiro de 2001, agoraPatente Americana No. 6.586.412, emitida em Io de julho de2003, USSN 09/784.990 requerido em 16 de fevereiro de 2001,agora Patente Americana No. 6.464.984 emitida em 15 deoutubro de 2002, USSN 09/785.055 requerido em 16 defevereiro de 2001, agora Patente Americana No. 6.558.674emitida em 6 de maio de 2003, USSN 10/077.489 requerido em15 de fevereiro 2002, agora Patente Americana No. 6.803.361emitida em 12 de outubro de 2004, USSN 10/085.519 requeridoem 28 de fevereiro de 2002, agora Patente Americana No.6.818.628 emitida em 16 de novembro de 2004, USSN10/211.502 requerido em 2 de agosto de 2002, USSN10/229.412, requerido em 28 de agosto de 2002, USSN10/238.114 requerido em 10 de setembro de. 2002, USSN10/368.861 requerido em 18 de fevereiro de 2003, USSN10/391.498 requerido em 18 de março de 2003, USSN10/406.686 requerido em 4 de abril de 2003, USSN 10/730.206requerido em 8 de dezembro de 2003, agora Patente AmericanaNo. 6.908.620 emitida em 21 de junho de 2005, USSN10/838.122 requerido em 3 de maio de 2004, USSN 10/983.928requerido em 8 de novembro de 2004, USSN 11.038.682requerido em 19 de janeiro de 2005, USSN 11/079.559requerido em 14 de março de 2005, USSN 11/106.780 requeridoem 15 de abril de 2005, agora Patente Americana No.6.998.127 emitida em 14 de fevereiro de 2006, USSN11/156.829 requerido em 20 de junho de 2005, USSN11/184.236 requerido em 19 de julho de 2005, USSN11/196.722 requerido em 3 de agosto de 2005, USSN11/211.983 requerido em 25 de setembro de 2005, USSN11/348.084 requerido em 6 de fevereiro de 2006, USSN60/151.564 requerido em 31 de agosto de 1999, USSN60/318.686 requerido em 12 de setembro de 2001, USSN60/366.014 requerido em 20 de março de 2002, USSN60/370.282 requerido em 5 de abril de 2002, USSN 60/432.298requerido em 9 de dezembro de 2002, USSN 60/490.345requerido em 24 de julho de 2003, USSN 60/519.571 requeridoem 13 de novembro de 2003, USSN 60/522.636 requerido em 12de março de 2004, USSN 60/576.771 requerido em 4 de julhode 2004, USSN 60/581.689 requerido em 15 de junho de 2004,USSN 60/581.698 requerido em 21 de junho de 2004, USSN60/627.878 requerido em 15 de novembro de 2004, USSN60/662.646 requerido em 17 de março de 2005 e USSN60/736.452 requerido em 14 de novembro de 2005.
Os pedidos precedentes e todos os documentos citadosnestes ou durante sua execução ("documentos citadosaplicados") e todos os documentos citados ou referenciadosnos documentos citados aplicados, e todos os documentosaqui citados ou referenciados ("documentos aqui citados"),e todos os documentos citados ou referenciados nosdocumentos aqui citados, juntamente com quaisquerinstruções, descrições, especificações de produto efolhetos de produto do fabricante para quaisquer produtosaqui mencionados ou em qualquer documento incorporado aquipor referência são por meio deste incorporados porreferência e podem ser empregados na prática da invenção.
CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção proporciona uma vacina de Mycoplasmahyopneumoniae e métodos para administrar a mesma.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Mycoplasma hyopneumoniae, a causa da pneumoniaenzoótica, permanece como um importante patógeno naindústria de suínos. Esse pequeno organismo complexocoloniza as células ciliadas do trato respiratório,resultando numa pequena exposição ao sistema imune. Aslesões do pulmão, geralmente observadas em porcos jovens,são caracterizadas por uma hiperplasia das célulasepiteliais e um acúmulo perivascular e peribronquiloaraumentados de células mononucleares. Após a infecção porMycoplasma hyopneumoniae, as reações imunes são observadase a resistência é induzida nos porcos (revisto, porexemplo, em Thacker, Anim Health Res Rev. Dez. 2004; 5 (2):317-20 e Kobisch & Friis, Rev Sci Tech. Dez. 1996; 15 (4):1569 - 605) . Os sintomas clínicos e o desenvolvimento dalesão são o resultado da capacidade patogênica do M.hyopneumoniae e as reações de defesa no pulmão. Arelevância econômica da pneumonia é influenciada em grandeparte por infecções secundárias comuns as quais seguem umainfecção M. Hyopneumoniae inicial. Estão disponíveisdiferentes testes para o diagnóstico de pneumonia nosporcos individualmente e em grupos. 0 tratamento e controlenão são simples, uma vez que a pneumonia enzoótica é umadoença multifatorial (revisto, por exemplo, em Maes et al.,Vet Q. Set. 1996; 18(3): 104-9).
m. Hyopneumoniae também está associada com o complexoda doença respiratória suína (PRDC) , uma síndromerespiratória multifatorial que inclui vários patógenosrespiratórios. Os patógenos mais comumente isolados deporcos com sinais clínicos de PRDC ou infectam as célulasdo sistema imune ou induzem uma significativaimunopatologia. Deste modo, PRRSV e M. hyopneumoniae, osdois patógenos mais comuns associados com PRDC, alteram acapacidade do sistema imune respiratório de responder àssuas presenças e à presença de outros patógenos. Pelaalteração do sistema imune respiratório, esses doispatógenos comuns aumentam a suscetibilidade a muitos outrospatógenos associados com PRDC (revisto, por exemplo, emThacker, Vet Clin North Am Food Anim Pract. Nov. 2001; 17(3) : 551-65).
A maioria das vacinas conhecidas contra M.hyopneumoniae foi baseada em preparações de célulasinteiras auxiliadas inativadas de M. Hyopneumoniae. Fontescomerciais incluem RESPIFEND (Fort Dodge, American HomeProducts), HYORESP (Merial Ltd), M+PAC (Schering Plough),PROSYSTEM M (Intervet), INGLEVAC M (Boehringer), RESPISURE(Pfizer Inc.) e STELLAMUNE MYC0PLASMA (Pfizer Inc.). WO03/003941 se refere a uma composição administrada comagulha.
Ainda permanece uma necessidade por uma vacina de M.hyopneumoniae eficaz num tratamento de dose única que sejafácil de ser administrada a um grande número de animais eque seja barata. A prevalência de várias doençasinfecciosas de suínos, tal como micoplasmose, durante osvários últimos anos tornou necessário desenvolver vacinas eacompanhar cronogramas de vacinação. Esses cronogramasincluem a vacinação de porcos antes da maturidade, os quaisapresentem dificuldades logísticas, isto é, a grandequantidade de porcos para vacinar, e que a vacinação,através de injeção com agulha, seja feita ou segurando osanimais, o que é extremamente trabalhoso, ou sem segurá-los, o que evita a infalibilidade assim como a eficácia daadministração da inoculação. Tal vacina poderia eliminar anecessidade por múltiplas dosagens e, deste modo, reduzirsignificativamente os custos e o trabalho associado com avacinação massiva mundial de rebanhos suínos.
A citação ou identificação de qualquer documento nessepedido não é uma consideração de que tal documento estejadisponível como técnica anterior à presente invenção.
RESUMO DA INVENÇÃO
A presente invenção proporciona um método para tratarou prevenir uma doença ou distúrbio num animal,vantajosamente um porco, causada por infecção comMycoplasma hyopneumoniae, o qual pode compreender aadministração a um animal, vantajosamente um porco, de umaquantidade eficaz de uma dose única de uma vacina de
Mycoplasma hyopneumoniae.
A vacina de M. hyopneumoniae pode compreender umapreparação de células totais ou parciais, tal como umapreparação viva modificada ou bacterina, uma subunidade devacina, tal como uma subunidade de vacina a qual possacompreender um ou mais polipeptídios ou proteínas derivadosde M. hyopneumoniae, fragmentos imunogênicos de taispolipeptidios, proteínas ou um ou mais genes de M.hyopneumoniae codificando tais proteínas, polipeptidios oufragmentos imunogênicos. Vantajosamente, a vacina de M.hyopneumoniae é uma vacina inativada. Em outra modalidadevantajosa, a vacina de M. hyopneumoniae pode aindacompreender um adjuvante.
Outra modalidade da presente invenção é um método devacinação contra M. hyopneumoniae, o qual pode compreendero passo de administrar a um animal, vantajosamente umporco, uma quantidade eficaz de uma vacina de M.hyopneumoniae usando um injetor sem agulha de jato líquido,cuja administração elicia uma resposta imune segura eprotetora contra M. hyopneumoniae. Outro objeto é um kit oujogo de vacinação, o qual pode compreender tal injetor semagulha de jato líquido e pelo menos um frasco de vacinacontendo uma vacina de M. hyopneumoniae, operativamentemontado para efetuar a administração da vacina a um animal,vantajosamente um porco, e para eliciar uma resposta imunesegura e protetora contra M. hyopneumoniae.
É notado que nessa descoberta e particularmente nasreivindicações e/ou parágrafos, termos tais como"compreende", "compreendido", "compreendendo" e semelhantespodem ter o significado atribuído a eles na lei de PatentesAmericana; por exemplo, eles podem significar "inclui","incluído", "incluindo" e semelhantes; e que termos taiscomo "consistindo essencialmente de" e "consisteessencialmente de" têm o significado atribuído a eles nalei de Patentes Americana, por exemplo, eles permitemelementos não explicitamente relatados, porém excluemelementos que são encontrados na técnica anterior ou queafetam uma característica nova ou básica da invenção.
Essas e outras modalidades são reveladas ou são óbviasa partir de e englobadas pela seguinte Descrição Detalhada.
DESCRIÇÃO DETALHADA
A presente invenção proporciona um método detratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio numanimal, vantajosamente um porco, causado por uma infecçãocom Mycoplasma hyopneumoniae, o qual pode compreender aadministração a um animal, vantajosamente um porco, de umaquantidade eficaz de uma dose única de uma vacina deMycoplasma hyopneumoniae.
Conforme aqui utilizado, o termo "animal" inclui todosos animais vertebrados incluindo humanos. Ele também incluium animal individual em todos os estágios dedesenvolvimento, incluindo os estágios embrionário e fetal.Particularmente, o termo "animal vertebrado" inclui, porémnão está limitado, a humanos, caninos (por exemplo,cachorros), felinos (por exemplo, gatos); eqüinos (porexemplo, cavalos), bovinos (por exemplo, gado), suínos (porexemplo, porcos), assim como aviários. 0 termo "aviário",conforme aqui utilizado, se refere a qualquer espécie ousubespécie da classe taxonômica ava, tais como, porém nãolimitadas, a galinhas (reprodutoras, de grelha epoedeiras), perus, patos, ganso, codorniz, faisões,papagaios, tentilhões, falcões, gaios e ratitas incluindoavestruz, casuares e casuares.
Conforme aqui utilizado, o termo "porco" se refere aum animal de origem suina. O termo "varrão" se refere a umporco macho puro com mais de seis meses destinado a ser umprogenitor. O termo "leitoa" se refere a uma porca fêmeanova a qual não tenha produzido a primeira ninhada até oprimeiro parto. O termo "porco" se refere a um porco machocastrado. O termo "leitão" se refere a um porco jovem. Otermo "porco cevado" se refere a uma criação de porcoscriados para fornecer bons cortes de carne suina. O termo"gêneros" se refere a um porco o qual possa ser de cerca de10 a 12 semanas de idade. O termo "porca" se refere a umafêmea de idade e capacidade reprodutiva ou uma porca fêmeadepois dela ter tido a sua primeira ninhada. O termo"leitão desmamado" ou "filhote recém-desmamado" se refere aum porco jovem o qual possa ter de cerca de 11 até cerca de24 dias de idade, de cerca de duas até três semanas deidade, de cerca de três até cinco semanas de idade ou decerca de cinco até oito semanas de idade.
Conforme aqui utilizado, o termo "virulento" significaum isolado que retém sua capacidade de ser infeccioso numhospedeiro animal.
Conforme aqui utilizado, o termo "vacina inativada"significa uma composição de vacina contendo um organismoinfeccioso ou patógeno que não seja mais capaz de sereplicar ou crescer. 0 patógeno pode ser de origembacteriana, viral, protozoária ou fúngica. A inativaçãopode ser efetuada por uma variedade de métodos incluindocongelamento seguido por descongelamento, tratamentoquímico (por exemplo, tratamento com timerosal ouformalina), submissão ao ultra-som, radiação, calor ouqualquer outra forma convencional suficiente para prevenira replicação ou crescimento do organismo enquanto se mantéma sua imunogenicidade.
Conforme aqui utilizado, o termo "resposta imune" serefere a uma resposta eliciada num animal. Uma respostaimune pode se referir à imunidade celular (CMI); imunidadehumoral ou pode envolver ambos. A presente invenção tambémcontempla uma resposta limitada a uma parte do sistemaimune. Por exemplo, uma composição de vacina da presenteinvenção pode induzir especificamente uma resposta deinterferon gama intensificada.
Conforme aqui utilizado, o termo "antigeno" ou"imunógeno" significa uma substância que induz uma respostaimune especifica num animal hospedeiro. 0 antigeno podecompreender um organismo completo, morto, atenuado ou vivo;uma subunidade ou porção de um organismo; um vetorrecombinante contendo um polinucleotideo codificando umimunógeno capaz de induzir uma resposta imune naapresentação a um animal hospedeiro; uma proteína, umpolipeptidio, um peptideo, um epitopo, um hapteno ouqualquer combinação desses.
Conforme aqui utilizado, o termo "multivalente"significa uma vacina contendo mais de um antigeno dediferentes gêneros ou espécies de microrganismos (porexemplo, uma vacina compreendendo antigenos de Pasteurellamultocida, Salmonella, Escherichia coli, Haemophilus somnuse Clostridium).
Conforme aqui utilizado, o termo "adjuvante" significauma substância adicionada a uma vacina para aumentar aimunogenicidade de uma vacina. 0 mecanismo de como umadjuvante opera não é totalmente conhecido. Acredita-se quealguns adjuvantes intensifiquem a resposta imune pela lentaliberação do antigeno, enquanto que outros adjuvantesapresentem o imunógeno ao sistema imune do hospedeiro demodo mais eficiente ou eficazmente para estimular aprodução de citosinas especificas.
Conforme aqui utilizado, os termos "carreadorfarmaceuticamente aceitável" e "veiculo farmaceuticamenteaceitável" são intercambiáveis e se referem a um veiculofluido para conter antigenos de vacina que possam serinjetados num hospedeiro sem efeitos adversos. Veículosfarmaceuticamente aceitáveis adequados conhecidos natécnica incluem, porém não estão limitados, a água estéril,salina, glicose, dextrose ou soluções tamponadas.Carreadores podem excluir agentes auxiliares incluindo,porém sem se limitar, a diluentes, estabilizantes (isto é,açúcares e aminoácidos), conservantes, agentes deumidificação, agentes emulsificantes, agentes tamponantesde pH, aditivos intensificadores de viscosidade, corantes esemelhantes .
Conforme aqui utilizado, o termo "composição devacina" inclui pelo menos um antígeno ou imunógeno numveículo farmaceuticamente aceitável útil para induzir umaresposta imune num hospedeiro. Composições de vacina podemser administradas em doses e por técnicas bem conhecidaspelas pessoas versadas nas técnicas médicas ouveterinárias, levando-se em consideração fatores tais comoidade, sexo, peso, espécie e condição do animal receptor, ea via de administração. A via de administração pode serpercutânea, por exemplo, intradérmica, intramuscular,subcutânea. As composições de vacina podem seradministradas sozinhas, ou podem ser co-administradas ouseqüencialmente administradas com outros tratamentos outerapias. As composições podem conter substânciasadjuvantes tais como agentes umidificantes ouemulsificantes, agentes tamponantes de pH, adjuvantes ouaditivos intensificadores de viscosidade, conservantes,corantes e semelhantes, dependendo da via de administraçãoe da preparação desejada. Textos farmacêuticos padrões,tais como "Remington's Pharmaceutical Sciences," 1990,podem ser consultados para preparar preparações adequadas,sem experimentação indevida.
A vacina de M. hyopneumoniae pode compreender umapreparação de células totais ou parciais e/ou osobrenadante, tal como uma preparação viva modificada ou debacterina, uma vacina de subunidade, tal como uma vacina desubunidade a qual possa compreender um ou maispolipeptidios ou proteínas derivados de M. hyopneumoniae,fragmentos imunogênicos de tais polipeptidios, proteínas,ou um ou mais genes de M. hyopneumoniae codificando taisproteínas, polipeptidios e fragmentos imunogênicos dessesgenes ou ácidos nucléicos. Vantajosamente, a vacina de M.hyopneumoniae é uma vacina inativada. Em outra modalidadevantajosa, a vacina de M. hyopneumoniae pode aindacompreender um adjuvante.
Para obter uma composição de vacina ou inativadoimunológico, o patógeno é produzido num meio capaz desuportar o crescimento de Mycoplasma. 0 meio de culturaselecionado pode incluir meios conhecidos pelas pessoasversadas na técnica para propagar Mycoplasma, tal conformedescrito em R. Ross et al AM. J. Vet. Res. 1984, 45, 1899-1905, B. Kristensen et al AM. J. Vet. Res. 1981, 42, 784-788, WO 91/18627, Patente Americana No. 5.338.543 ou outrasreferências similares. 0 Mycoplasma é preferivelmenteinativado depois da coleta e, opcionalmente, submetido àclarificação através de um tratamento químico usando, porexemplo, formalina ou formaldeído, beta-propiolactona,etilenimina, etilenimina binária (BEI), timerosal esemelhantes, e/ou um tratamento físico (por exemplo, umtratamento térmico ou de ultra-som). Métodos para ainativação são bem conhecidos pelas pessoas versadas natécnica. A bactéria de Mycoplasma hyopneumoniae pode serinativada pelo tratamento com formaldeído (Ross R. F. etal. , AM. J. Vet. Res., 1984, 45: 1899-1905), poretilenimina ou tratamento com BEI (ver, por exemplo, WO91/18627), ou por tratamento com timerosal (PatentesAmericanas Nos. 5.968.525 e 5.338.543). O agente inativantepode ser neutralizado ou removido por um passo depuri ficação.
O patógeno inativado pode ser concentrado por técnicasde concentração convencionais, particularmente porultrafiltração, e/ou purificado por meios de purificaçãoconvencionais, particularmente usando técnicas decromatografia incluindo, porém sem se limitar, a filtraçãoem gel ou por ultrafiltração. Conforme aqui utilizado, otermo "imunogenicidade" significa capaz de produzir umaresposta imune num animal hospedeiro contra um antigeno ouantigenos. Essa resposta imune forma a base da imunidadeprotetora eliciada por uma vacina contra um organismoinfeccioso especifico.
o método da presente invenção pode ser praticadousando vacinas de subunidade com proteínas, polipeptídios efragmentos imunogênicos de M. hyopneumoniae, de taisproteínas e polipeptídios. Tais proteínas e polipeptídiospodem ser preparados usando técnicas conhecidas na arte.Além disso, métodos bem conhecidos pelas pessoas versadasna técnica podem ser usados para determinar a pureza ouhomogeneidade da proteína, tal como eletroforese em gel depoliacrilamida de uma amostra, seguido pela visualização deuma única banda de polipeptídio num gel de manchamento. Umaresolução mais elevada pode ser determinada usando HPLC ououtros métodos similares bem conhecidos na técnica. Numamodalidade especifica, a vacina usada na presente invençãocompreende pelo menos uma proteína de M. hyopneumoniae talcomo, porém não limitada, a P46, P65, P97, P102, P70, P50 eP4 4. Para uma seqüência do genoma de M. hyopneumoniae, éfeita referência a Minion et al., J Bacteriol. Nov 2004;186(21): 7123-33.
Em outras modalidades, a vacina usada no método dapresente invenção compreende uma bacterina de M.hyopneumoniae (célula inteira ou parcial inativada ou vivamodificada) ou uma proteína ou polipeptídio ou fragmentoimunogênico seu de M. hyopneumoniae e pelo menos mais umimunógeno (célula inteira ou parcial inativada ou vivamodificada), uma proteína, polipeptídio ou fragmentoimunogênico ou antigênico seu, e é pref erivelmente umpolipeptídio parasítico, bacteriano ou viral. Numa outramodalidade específica, os fragmentos imunogênicos de taisproteínas ou polipeptídios têm uma seqüência compreendendopelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25,pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 45,pelo menos 50, pelo menos 55, pelo menos 60, pelo menos 65,pelo menos 70, pelo menos 75, pelo menos 80, pelo menos 85,pelo menos 90, pelo menos 95 ou pelo menos 100 aminoácidoscontíguos das proteínas e polipeptídios imunogênicos usadosno método da presente invenção incluindo, porém sem selimitar, a P46, P65, P97, P102, P70, P50 e P44.
Além disso, as proteínas de M. hyopneumoniae para usonas vacinas são substancialmente puras ou homogêneas. Ométodo da presente invenção usa proteínas ou polipeptídiosque são tipicamente purificados a partir de célulashospedeiras expressando seqüências de nucleotídeorecombinantes codificando essas proteínas. Tal purificaçãode proteína pode ser efetuada por uma variedade de métodosbem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as técnicasdescritas em "Methods In Enzymology", 1990, Academic Press,Inc., San Diego, "Protein Purification: Principies andpractice", 1982, Springer-Verlag, Nova Iorque.
A invenção ainda engloba pelo menos um imunógeno de M.hyopneumoniae contido numa molécula de vetor ou num vetorde expressão e operativamente ligado a um elemento promotore opcionalmente a um intensificador.
Numa modalidade vantajosa, o promotor é o promotor dogene inicial imediato de citomegalovírus (CMV).
Em outra modalidade, os intensificadores e/oupromotores incluem vários promotores específicos de célulasou tecidos (por exemplo, de músculo, célula endotelial,fígado, célula somática ou célula tronco), váriosintensificadores e promotores virais. Exemplos depromotores e intensificadores musculares específicosdescritos são conhecidos por uma pessoa versada na técnica(ver, por exemplo, Li et al., Gene Ther. Dezembro de 1999;6 (12): 2005-1 1; Li et al., Nat Biotechnol. Março de 1999;17(3): 241-5 e Loirat et al., Virology. 20 de julho de1999; 260 (1) : 74-83; as descobertas dos quais sãoincorporadas por referência nas suas totalidades).
Promotores e intensificadores que podem ser empregadosna presente invenção incluem, porém não estão limitados, aoLTR ou ao vírus sarcoma Rous, TK ou HSV-I, o promotorinicial ou tardio de SV40, adenovírus principal tardio(MLP) , fosfoglicerato quinase, metalotioneina, alfa—antitripsina, albumina, colagenase, elastase I, beta-actina, beta-globina, gama-globina, alfa-fetoproteína,queratina quinase muscular.
Um "vetor" se refere a um plasmídeo ou vírus de DNA ouRNA recombinante que compreende um polinucleotídeoheterólogo a ser distribuído para uma célula alvo, seja invitro ou in vivo. 0 polinucleotídeo heterólogo podecompreender uma seqüência de interesse para propósitos deterapia, e pode estar opcionalmente na forma de um cassetede expressão. Conforme aqui utilizado, um vetor não precisaser capaz de se replicar no indivíduo ou célula alvo final.O termo inclui vetores de clonagem, também são incluídos osvetores virais.
O termo "recombinante" significa um polinucleotídeosemi-sintético, ou de origem sintética, o qual ou nãoocorre na natureza ou está ligado a outro polinucleotídeonuma disposição não encontrada na natureza.
"Heterólogo" significa derivado de uma entidadegeneticamente distinta do resto da entidade à qual ele estásendo comparado. Por exemplo, um polinucleotídeo pode sercolocado por técnicas de engenharia genética num plasmídeoou vetor derivado de uma fonte diferente, e é umpolinucleotídeo heterólogo. Um promotor removido de suaseqüência codificante natural e operativamente ligado a umaseqüência codificadora diferente da seqüência natural é umpromotor heterólogo.
Os polinucleotídeos da invenção podem compreenderseqüências adicionais, tais como seqüências codificadorasadicionais na mesma unidade de transcrição, elementoscontroladores tais como promotores, sítios de ligação deribossomo, sítios de poliadenilação, unidades detranscrição adicionais sob o controle do mesmo ou de umdiferente promotor, seqüências que permitem a clonagem,expressão, recombinação homóloga e transformação de umacélula hospedeira, e qualquer tal constructo conforme podeser desejável para proporcionar as modalidades dessainvenção.
A presente invenção engloba um vetor expressando oimunógeno de M. hyopneumoniae ou variantes ou análogos oufragmentos. Elementos para a expressão do imunógeno de M.hyopneumoniae estão vantajosamente presentes num vetor dainvenção. No mínimo, ele compreende, consisteessencialmente de, ou consiste de um códon de iniciação(ATG), um códon de parada e um promotor, e tambémopcionalmente uma seqüência de poliadenilação para certosvetores, tais como plasmídeo e certos vetores virais, porexemplo, vetores virais diferentes de poxvírus. Quando opolinucleotídeo codifica um fragmento de poliproteína, porexemplo, um imunógeno de M. hyopneumoniae, vantajosamente,no vetor, um ATG é colocado na porção 5' em relação àestrutura de leitura e um códon de parada é colocado em 3' .Outros elementos para controlar a expressão podem estarpresentes, tais como seqüências intensificadoras,seqüências estabilizadoras, tais como seqüências de sinal eíntron permitindo a secreção da proteína.
Métodos para fazer e/ou administrar um vetor ourecombinantes ou plasmídeo para a expressão dos produtos degene ou genes da invenção, in vivo ou in vitro_podem serquaisquer métodos desejados, por exemplo, um método o qualé por, ou análogo aos métodos revelados em, ou revelados
nos documentos citados nas Patentes Americanas Nos.4 . 603 . 112; 4 .769 .330; 4 .394 .448; 4. 722. 848; 4.745. 051;4 . 769 . 331; 4 . 945 . 050; 5 .494 .807; 5. 514 . 375; 5.744. 14 0;5 . 744 .141; 5 .756 . 103; 5 .762 .938; 5. 766. 599; 5.990. 091;5. 174 . 993; 5 .505 . 941; 5 .338 .683; 5. 494 . 807; 5.591. 639;5 . 589 .4 66; 5 . 677 . 178; 5 .591 .439; 5. 552. 143; 5.580. 8 59;6. 130 .0 66; 6 .004 .777; 6 . 130 .066; 6. 497 . 883; 6.464. 984;6. 451 .770; 6 .391 .314; 6 . 387 .37 6; 6. 376. 473; 6.368. 603;6. 348 . 196; 6 . 306 .4 00; 6 .228 . 846; 6. 221. 362; 6.217 . 883;6. 207 .166; 6 . 207 . 165; 6 . 159 . 477; 6. 153. 199; 6.090. 3 93;6. 074 .64 9; 6 . 045 .803; 6 . 033 . 670; 6. 485. 72 9; 6.103. 526;6. 224 . 882; 6. 312 682; 6. 348 . 450 e 6 . 312 .68 3; Pedido de
Patente Americana No. De Série 920.197, requerido em 16 deoutubro de 1986; WO 90/01543; WO 91/11525; WO 94/16716; WO96/39491; WO 98/33510; EP 265785; EP 0370573; Andreansky etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996; 93: 11313-11318;Ballay et al., EMBO J. 1993; 4: 3861-65; Felgner et al., J.
Biol. CheM. 1994; 269: 2550-2561; Frolov et al., Proc.Natl. Acad. Sei. USA 1996; 93: 11371-11377; Graham, Tibtech1990; 8: 85-87; Grunhaus et al., SeM. Virol. 1992; 3: 237-52; Ju et al., Diabetologia 1998; 41: 736-739; Kitson etal., J. Virol. 1991; 65: 3068-3075; MeClements et al.,Proc. Nati. Acad. Sei. USA 1996; 93: 11414-11420; Moss,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996; 93: 11341-11348; Paoletti,Proe. Natl. Acad. Sei. USA 1996; 93: 11349-11353; Pennocket al., Mol. Cell. Bioi. 1984; 4: 399406; Riehardson (Ed),Methods in Molecular Biology 1995; 39, "BaculovirusExpression Protocols," Humana Press Inc; Smith et al.(1983) Mol. Cell. Biol. 1983; 3: 2156-2165; Robertson etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996; 93: 11334-11340;Robinson et al., SeM. Immunol. 1997; 9: 271; e Roizman,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996; 93: 11307-11312. Destemodo, o vetor na invenção pode ser qualquer vetor de virusou virus recombinante adequado, tal como poxvirus (porexemplo, virus vaccinia, virus avipox, virus canarypox,virus fowlpox, virus raccoonpox, virus swinepox, etc.),adenovirus (por exemplo, adenovirus humano, adenoviruscanino), herpesvirus (por exemplo, herpesvirus canino),baculovirus, retrovirus, etc. (como nos documentos aquiincorporados por referência); ou o vetor pode ser umplasmideo. Os documentos aqui citados e aqui incorporadospor referência, além do fornecimento de exemplos de vetoresúteis na prática da invenção, também podem proporcionarfontes para imunógenos que não M. hyopneumoniae, porexemplo, imunógenos que não M. hyopneumoniae, peptideos deimunógenos de M. hyopneumoniae ou fragmentos seus,citosinas, etc. para serem expressos por vetor ou vetoresem, ou incluídos nas composições da invenção.
A presente invenção também se refere a preparaçõescompreendendo vetores, tais como vetores de expressão, porexemplo, composições terapêuticas. As preparações podemcompreender, consistir essencialmente de ou consistir de umou mais vetores, por exemplo, vetores de expressão, taiscomo vetores de expressão in vivo compreendendo,consistindo essencialmente de ou consistindo de (evantajosamente expressando) um ou mais imunógenos de M.hyopneumoniae. Vantajosamente, o vetor contém e expressa umpolinucleotídeo que inclui, consiste essencialmente de ouconsiste de uma região codificante codificando um ou maisimunógenos de M. hyopneumoniae, um carreador, excipiente ouveículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.
Deste modo, de acordo com uma modalidade da invenção, ooutro vetor ou vetores na preparação compreende, consisteessencialmente de ou consiste de um polinucleotídeo quecodifica, e sob circunstâncias apropriadas o vetor expressauma ou ais proteínas de um imunógeno de M. hyopneumoniae ouum fragmento seu.
De acordo com outra modalidade, o vetor ou vetores napreparação compreendem, consistem essencialmente de, ouconsistem de polinucleotídeos codificando uma ou maisproteínas ou fragmento(s) seu(s) de um imunógeno de M.hyopneumoniae, o vetor ou vetores tendo a expressão do(s)poiinucleotídeo(s). A preparação inventiva vantajosamentecompreende, consiste essencialmente de ou consiste de pelomenos dois vetores compreendendo, consistindoessencialmente de ou consistindo de, e vantajosamentetambém expressando, vantajosamente in vivo sob condiçõesapropriadas ou condições adequadas ou numa célulahospedeira adequada, polinucleotídeos de diferentesisolados de M. hyopneumoniae codificando as mesmasproteínas e/ou para diferentes proteínas, porémvantajosamente para as mesmas proteínas. Preparaçõescontendo um ou mais vetores contendo, consistindoessencialmente de ou consistindo de polinucleotídeoscodificando, e vantajosamente expressando, vantajosamente,in vivo, peptídeo de M. hyopneumoniae, a proteína de fusãoou um epítopo seu.
De acordo com uma modalidade da invenção, o vetor deexpressão é um vetor viral, particularmente um vetor deexpressão in vivo. Numa modalidade vantajosa, o vetor deexpressão é um vetor de adenovírus. Vantajosamente, oadenovírus é um vetor Ad5 humano, um El-deletado e/ou umadenovírus E3-deletado.Numa modalidade particular, o vetor viral é umpoxvírus, por exemplo, um virus vaccinia ou um vírusvaccinia atenuado (por exemplo, MVA, uma linhagem Ankaramodificada obtida depois de mais de 570 passagens dalinhagem de vacina Akara em fibroblastos de embrião degalinha; ver Stickl & Hochstein-Mintzel, Munch. Med.Wschr., 1971, 113, 1149-1153; Sutter et al., Proc. Natl.Acad. Sei. U.S.A., 1992, 89, 10847-10851; disponível comoATCC VR-I508; ou NYVAC, ver Patente Americana No.5.4 94.807, por exemplo, os Exemplos de 1 a 6 e a seqüênciada Patente Americana No. 5.494.807, o qüal discute aconstrução de NYVAC, assim como variações de NYVAC com ORFsadicionais deletadas do genoma de vírus vaccinia dalinhagem Copenhagen, assim como a inserção de moléculas deácido nucléico codificando heterólogos em sítios desserecombinante, e também o uso de promotores emparelhados;ver também W096/40241), um vírus avipox ou um vírus avipoxatenuado (por exemplo, canarypox, fowlpox, dovepox,pigeonpox, quailpox, ALVAC ou TROVAC; ver, por exemplo, asPatentes Americanas Nos. 5.505.941, 5.494.807), swinepox,raccoonpox, camelpox, ou vírus da mixomastose.
De acordo com outra modalidade da invenção, o vetorpoxvírus é um vírus canarypox ou um vetor de vírus fowlpox,vantajosamente um vírus canarypox atenuado ou vírusfowlpox. Sob esse aspecto, o canarypox é tornado disponívelda ATCC sob o número de acesso VR-Ill. Vírus canarypoxatenuados são descritos na Patente Americana No. 5.756.103(ALVAC) e WOOl/05934. Várias linhagens de vacinação devírus fowlpox também são disponíveis, por exemplo, alinhagem DIFTOSEC CT comercializada por MERIAL e a vacinaNOBILIS VARIOLE comercializada pela INTERVET; e é tambémfeita referência à Patente Americana No. 5.766.599, a qualpertence à linhagem fowlpox atenuada TROVAC.
Para informação no método para gerar seusrecombinantes e como administrar seus recombinantes, oartesão habilitado pode se referir a documentos aquicitados e à W090/12882, por exemplo, como menção ao vírusvaccinia é feita das Patentes Americanas Nos. 4.769.330,4.722.848, 4.603.112, 5.110.587, 5.494.807 e 5.762.938inter alia; como ao fowlpox, é feita menção das PatentesAmericanas Nos. 5.174.993, 5.505.941 e à Patente AmericanaNo. 5.7 66.599 inter alia; como ao canarypox é feita mençãoda Patente Americana No. 5.756.103 inter alia; como aoswinepox menção é feita da Patente Americana No. 5.382.425inter alia; e, como ao raccoonpox, é feita menção daWOOO/03030 inter alia.
Quando o vetor de expressão é um vírus vaccinia, osítio ou sítios de inserção para o polinucleotídeo oupoiinucleotideos a serem expressos estão vantajosamente nogene ou sitio de inserção da timidina quinase (TK), no geneou sitio de inserção da hemaglutinina (HA), na regiãocodificando o corpo de inclusão do tipo A (ATI) ver todosos documentos aqui citados, especialmente aquelespertencendo ao virus vaccinia. No caso do canarypox,vantajosamente o sitio ou sítios de inserção são ORF(s) C3,C5 e/ou C6; ver também os documentos aqui citados,especialmente aqueles ao vírus canarypox. No caso defowlpox, vantajosamente o sítio ou sítios de inserção sãoORFs F7 e/ou F8; ver também os documentos aqui citados,especialmente aqueles pertencentes ao vírus fowlpox. 0sítio ou sítios de inserção da área do vírus MVAvantajosamente como em várias publicações, incluindoCarroll M. W. et al., Vaccine, 1997, 15 (4), 387-394;Stittelaar K. J. et al., J. Virol., 2000, 74 (9), 4236-4243; Sutter G. et al., 1994, Vaccine, 12 (11), 1032-1040;e, sob esse aspecto, também é notado que o genoma MVAcompleto é descrito em Antoine G., Virology, 1998, 244,365-396, o qual permite que o artesão habilitado use outrossítios de inserção ou outros promotores.
Vantajosamente, o polinucleotíeo a ser expresso éinserido sob o controle de um promotor de poxvírusespecífico, por exemplo, o promotor vaccinia de 7,5 KDa(Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35), o promotorvaccinia I3L (Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434), o promotor vaccinia HA (Shida, Virology, 1986, 150,451-457), o promotor cowpox ATI (Funahashi et al., J. Gen.
Virol., 1988, 69, 35-47), o promotor vaccinia H6 (Taylor J.et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. et al. J. Virol.,1989, 63, 4189-4198; Perkus M. et al., J. Virol., 1989, 63,3829-3836), inter alia.
Numa modalidade particular, o vetor viral é umadenovirus, tal como um adenovirus humano (HAV) ou umadenovírus canino (CAV).
Numa modalidade, o vetor viral é um adenovirus humano,particularmente um adenovirus de sorotipo 5, tornadoincompetente para replicação por uma deleção na região Eldo genoma viral, particularmente aproximadamente donucleotideo 459 até aproximadamente o nucleotideo 3510 porreferência à seqüência do hAd5 revelado no Genbank sob onúmero de acesso M73620, e na publicação referenciada J.Chroboczek et al Virol. 1992, 186, 280-285. 0 adenovirusdeletado é propagado n° 293 expressando El (F. Graham et alJ. Gen. Virol. 1977, 36, 59-72) ou nas células PER,particularmente a PER.C6 (F. Falloux et al Human GeneTherapy 1998, 9, 1909-1917). 0 adenovirus humano pode serdeletado na região E3, particularmente desdeaproximadamente o nucleotideo 28592 até aproximadamente onucleotideo 30470. A deleção na região El pode ser feitajuntamente com uma deleção na região E3 (ver, por exemplo,Shriver et al. Nature, 2002, 415, 331-335, F. Graham etal Methods in Molecular Biology Vol .7: Gene Transfer andExpression Protocols Editado por E. Murray, The Human PressInc, 1991, ρ 109-128; Y. Ilan et al Proc. Natl. Acad. Sei.1997, 94, 2587-2592; Patente Americana No. 6.133.028;Patente Americana No. 6.692.956; S. Tripathy et al Proc.Natl. Acad. Sei. 1994, 91, 11557-11561; B. Tapnell Adv.Drug Deliv. Rev. 1993, 12, 185-199; X. Danthinne et al GeneTherapy 2000, 7, 1707-1714; K. Berkner Bio Techniques 1988,6, 616- 629; K. Berkner et al Nucl. Acid Res. 1983, 11,6003-6020; C. Chavier et al J. Virol. 1996, 70, 4805-4810).
Os sitios de inserção podem ser os locais (região) El e/ouE3 eventualmente após uma deleção parcial ou completa dasregiões El e/ou E3. Vantajosamente, quando um vetor deexpressão é um adenovirus, o polinucleotideo a ser expressoé inserido sob o controle de um promotor funcional emcélulas eucarióticas, tal como um promotor forte,preferivelmente um promotor do gene inicial imediato decitomegalovirus (promotor CMV-IE), particularmente a regiãointensificadora/promotora desde aproximadamente onucleotideo -734 até aproximadamente o nucleotideo +7 em M.Boshart et al Cell 1985, 41, 521-530, ou a regiãointensificadora/promotora do vetor pCI da Promega Corp. Opromotor CMV-IE é vantajosamente de origem murina ouhumana. O promotor do fator de alongamento l.alfa tambémpode ser usado. Numa modalidade particular um promotorregulado por hipóxia, por exemplo, o promotor HRE descritoem K. Boast et al Human Gene Therapy 1999, 13, 2197-2208)pode ser usado. Um promotor especifico de músculo tambémpode ser usado (X. Li et al Nat. Biotechnol. 1999, 17, 241-245). Promotores fortes também são aqui discutidos emrelação a vetores de plasmídeo. Numa modalidade, umaseqüência de união pode ser estar localizada à jusante daregião intensificadora/promotora. Por exemplo, o intron 1isolado do gene CMV-IE (R. Stenberg et al J. Virol. 1984,4 9, 190), o intron isolado do gene da beta-globina humanaou de coelho, particularmente o intron 2 do gene da b-globina, o intron isolado do gene da imunoglobulina, umaseqüência de união do gene inicial SV40 ou a seqüência dointron quimérica isolada do vetor pCI da Promege Corp.,compreendendo a seqüência doadora beta-globina humanafundida à seqüência aceptora de imunoglobulina decamundongo (desde aproximadamente o nucleotideo 8 90 atéaproximadamente o nucleotideo 1022 no Genbank sob o númerode acesso CVU47120) . Uma seqüência poli (A) e uma seqüênciaterminadora podem ser inseridas à jusante dopolinucleotideo a ser expresso, por exemplo, um gene dohormônio de crescimento bovino, particularmente desdeaproximadamente o nucleotideo 2339 até aproximadamente onucleotideo 2550 no Genbank sob o número de acesso BOVGHRH,um gene beta-globina de coelho ou um sinal depoliadenilação de gene tardio SV40.
Em outra modalidade, o vetor viral é o adenoviruscanino, particularmente um CAV-2 (ver, por exemplo, L.Fischer et al. Vaccine, 2002, 20, 3485-3497; PatenteAmericana No. 5.529.780; Patente Americana No. 5.688.920;Pedido PCT No. W095/14102). Para CAV, os sítios de inserçãopodem estar na região E3 e/ou na região localizada entre aregião E4 e a região ITR à direita (ver a Patente AmericanaNo. 6.090.393; Patente Americana No. 6.156.567). Numamodalidade, a inserção está sob o controle de um promotor,tal como um promotor do gene inicial intermediário decitomegalovírus (promotor CMV-IE) ou um promotor jádescrito para um vetor de adenovirus humano. Uma seqüênciapoli (A) e a seqüência terminadora podem ser inseridas àjusante do polinucleotideo a ser expresso, por exemplo, umgene do hormônio do crescimento bovino ou um sinal depoliadenilação do gene beta-globina de coelho.Em outra modalidade particular o vetor viral é umherpesvirus, tal como um vírus da pseudo-raiva (PRV) . Parao PRV, os sítios de inserção podem estar particularmente nogene da timidina quinase, no gene gE ou em ORF UL43 (ver WO96/13575, WO 87/04463). Numa modalidade, o polinucleotídeoa ser expresso é inserido sob o controle de um promotorfuncional em células eucarióticas, vantajosamente umpromotor CMV-IE (murino ou humano). Numa modalidadeparticular, um promotor regulado por hipóxia, por exemplo,o promotor HRE descrito em K. Boast et al Human GeneTherapy 1999, 13, 2197-2208) pode ser usado. Uma seqüênciapoli (A) e uma seqüência terminadora podem ser inseridas àjusante do polinucleotídeo a ser expresso, por exemplo, ohormônio de crescimento bovino ou um sinal depoliadenilação do gene beta-globina de coelho.
Ainda de acordo com outra modalidade da invenção, ovetor de expressão é um vetor de plasmídeo ou um vetor deplasmídeo de DNA, particularmente um vetor de expressão invivo. Num exemplo específico e não-limitativo, o pVR1020 ouo plasmídeo 1012 (VICAL Inc.; Luke C. et al-, Journal ofInfectious Diseases, 1997, 175, 91-97; Hartikka J. et al.,Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217, ver, por exemplo,as Patentes Americanas Nos. 5.846.946 e 6.451.769) podemser utilizados como um vetor para a inserção de umaseqüência cie polinucleotídeo. 0 plasmídeo pVR1020 éderivado de pVR1012 e contém a seqüência de sinal tPAhumana. Numa modalidade, o sinal tPA humano compreendedesde o aminoácido M(I) até o aminoácido S (23) no Genbanksob o número de acesso HUMTPAl4. Em outro exemploespecifico não-limitativo, o plasmideo utilizado como umvetor para a inserção de uma seqüência de polinucleotídeopode conter a seqüência peptídeo sinal do IGFl eqüino doaminoácido M(24) até o aminoácido A(48) no Genbank sob onúmero de acesso U28070. Informações adicionais sobreplasmídeos de DNA, as quais podem ser consultadas ouempregadas na prática são encontradas, por exemplo, nasPatentes Americanas Nos. 6.852.705; 6.818.628; 6.586.412;6.57 6.243; 6.558.674; 6.464.984; 6.451.770; 6.376.473 e6.221.362.
O termo plasmideo cobre qualquer unidade detranscrição de DNA compreendendo um polinucleotídeo deacordo com a invenção e os elementos necessários para a suaexpressão in vivo numa célula ou células do hospedeiro oualvo desejado; e, sob esse aspecto, é notado que umplasmídeo circular, superenovelado ou não-superenovelado,assim como sua forma linear, são tencionados a estaremdentro do escopo da invenção.Cada plasmideo compreende, contém ou consisteessencialmente de, ou além ao polinucleotideo codificando oimunógeno de M. hyopneumoniae ou um variante, análogo oufragmento seu, operativamente ligado a um promotor ou sob ocontrole de um promotor ou dependente de um promotor. Emgeral, é vantajoso empregar um forte promotor funcional emcélulas eucarióticas. 0 promotor forte preferido é opromotor de citomegalovirus inicial imediato (CMV-IE) deorigem murina ou humana, ou opcionalmente com outra origemtal como de rato ou porquinho-da-india. O promotor CMV-IEpode compreender a parte promotora de fato, a qual pode ounão estar associada com a parte intensificadora. Pode serfeita referência à EP-A-260 148, EP-A-323 597, PatentesAmericanas Nos. 5.168.062, 5.385.839 e 4.968.615, assimcomo ao pedido PCT No. W087/03905. 0 promotor CMV-IE évantajosamente um CMV-IE humano (Boshart M. et al., Cell.,1985, 41, 521-530) ou CMV-IE murino.
Em termos mais gerais, o promotor tem origem viral oucelular. Um promotor viral forte diferente de CMV-IE quepode ser utilmente empregado na prática da invenção é opromotor inicial/tardio do virus SV40 ou do promotor LTR dovirus de sarcoma Rous. Um forte promotor celular que podeser utilmente empregado na prática da invenção é o promotorde um gene do citoesqueleto, tal como, por exemplo, opromotor desmina (Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18,2337-2344), ou o promotor actina (Miyazaki J. et al., Gene,1989, 79, 269-277).
Subfragmentos funcionais desses promotores, isto é,porções desses promotores que mantêm uma atividadepromotora adequada estão incluídos na presente invenção,por exemplo, promotores CMV-IE cortados de acordo com oPedido PCT No. W098/00166 ou a Patente Americana No.6.156.567 podem ser usados na prática da invenção. Umpromotor na prática da invenção, conseqüentemente, incluiderivados e subfragmentos de um promotor de comprimentototal que mantém uma atividade promotora adequada e, destemodo, funciona como um promotor, preferivelmente promovendoa atividade de modo substancialmente similar àquele dopromotor de comprimento total do qual o derivado ousubfragmento é derivado, por exemplo, semelhante àatividade dos promotores CMV-IE cortados da PatenteAmericana No. 6.156.567 à atividade dos promotores CMV-IEde comprimento total. Deste modo, um promotor CMV-IE na prática da invenção pode compreender ou consistiressencialmente de ou consistir da porção promotora dopromotor de comprimento total e/ou da porçãointensificadora do promotor de comprimento total, assimcomo derivados e subfragmentos.Preferivelmente, os plasmideos compreendem ouconsistem essencialmente de outros elementos de controle deexpressão. É particularmente vantajoso incorporarseqüência (s) estabilizante(s), por exemplo, seqüências(s)de intron(s), preferivelmente o primeiro intron do Hcmv-ie(Pedido PCT No. W089/01036), o intron II do gene de b-globina de coelho (van Ooyen et al., Science, 1979, 206,337-3.44) .
Como para o sinal de poliadenilação (poliA) para osplasmideos e vetores virais diferentes de poxvirus, o usopode ser mais feito do sinal poli (A) do gene do hormônio decrescimento bovino (bGH) (ver Patente Americana No.5.122.458) ou o sinal poli (A) do gene da beta-globina decoelho ou o sinal poli (A) do virus SV40.
De acordo com outra modalidade da invenção, os vetoresde expressão são vetores de expressão usados para aexpressão in vitro de proteínas num sistema celularapropriado. As proteínas expressas podem ser colhidas no oudo sobrenadante da cultura após, ou não, a secreção (se nãohouver secreção, uma Iise celular tipicamente ocorre ou éefetuada), opcionalmente concentrada pelos métodos deconcentração tais como ultrafiltração e/ou purificadas pormeios de purificação, tal como métodos cromatográficos porafinidade, troca iônica ou tipo gel-filtração.As células hospedeiras que podem ser usadas napresente invenção incluem, porém não estão limitadas, acélulas musculares, queratinócitos, mioblastos, células deovário de hâmster chinês (CHO), células vero, BHK21,células sf9 e semelhantes. É entendido por uma pessoaversada na técnica que as condições para cultivar umacélula hospedeira variam de acordo com o gene particular eque a experimentação rotineira é necessária em momentospara determinar as condições ótimas para cultivar M.hyopneumoniae dependendo da célula hospedeira.
Uma "célula hospedeira" denota uma célula procarióticaou eucariótica que tenha sido geneticamente alterada, ouque seja capaz de ser geneticamente alterada pelaadministração de um polinucleotideo exógeno, tal como umvetor ou plasmideo recombinante. Ao se referir às célulasgeneticamente alteradas, o termo se refere tanto à célulaoriginalmente alterada quanto à sua progenia.
Polinucleotideos compreendendo uma seqüência desejadapodem ser inseridos num vetor de expressão ou cloneadequado, e o vetor, por sua vez, pode ser introduzido numacélula hospedeira adequada para replicação e amplificação.Polinucleotideos podem ser introduzidos em célulashospedeiras por quaisquer formas conhecidas na arte. Osvetores contendo os polinucleotideos de interesse podem serintroduzidos na célula hospedeira por qualquer uma de umavariedade de formas apropriadas, incluindo absorção direta,endocitose, transfecção, emparelhamento f, eletroporação,transfecção empregando cloreto de cálcio, cloreto derubidio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrana ou outrassubstâncias; bombardeamento com microprojétil; lipofecção;e infecção (onde o vetor é infeccioso, por exemplo, umvetor retroviral) . A escolha por introduzir vetores oupolinucleotideos irá geralmente depender dascaracterísticas da célula hospedeira.
Numa modalidade vantajosa, a invenção proporciona aadministração de uma quantidade terapeuticamente eficaz deuma formulação para a distribuição e expressão do imunógenode M. hyopneumoníae numa célula alvo. A determinação daquantidade terapeuticamente eficaz é a experimentaçãorotineira para uma pessoa normalmente versada na técnica.Numa modalidade, a formulação compreende um vetor deexpressão compreendendo um polinucleotídeo que expressa umimunógeno M. hyopneumoníae e um carreador, veículo ouexcipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.Numa modalidade vantajosa, o carreador, veículo ouexcipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitávelfacilita a transfecção e/ou melhora a conservação do vetorou proteína.Os carreadores, veículos ou excipientesfarmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis são bemconhecidos por uma pessoa versada na técnica. Por exemplo,um carreador, veículo ou excipiente farmaceuticamente ouveterinariamente aceitável pode ser uma solução de NaCl0,9% (por exemplo, salina) ou um tampão fosfato. Outrocarreador ou veículo ou excipiente farmaceuticamente ouveterinariamente aceitável que pode ser usado para osmétodos dessa invenção incluem, porém não estão limitados,a poli(L-glutamato) ou polivinilpirrolidona. 0 carreador,veículo ou excipientes farmaceuticamente ouveterinariamente aceitáveis podem ser qualquer composto oucombinações de compostos que facilitam a administração dovetor (ou proteína expressa a partir de um vetor dainvenção in vitro); vantajosamente, o carreador, veículo ouexcipiente pode facilitar a transfecção e/ou melhorar aconservação do vetor (ou proteína). Doses e volumes dedoses são aqui discutidos na descrição geral e também podemser determinadas pelo artesão habilitado a partir dessadescoberta lida juntamente com o conhecimento na técnica,sem qualquer experimentação indevida.
Os lipídeos catiônicos contendo um sal de amônioquaternário, os quais são vantajosamente, porém nãoexclusivamente adequados para plasmideos, são
vantajosamente aqueles com a seguinte fórmula:
<formula>formula see original document page 42</formula>
Em que Ri é um radical alifático de cadeia linearsaturado ou insaturado com de 12 a 18 átomos de carbono, R2é outro radical alifático contendo de 2 a 3 átomos decarbono e X é uma amina ou grupo hidroxila, por exemplo, oDMRIE. Em outra modalidade o lipideo catiônico pode estarassociado com um lipideo neutro, por exemplo, DOPE.
Dentre esses lipideos catiônicos, é dada preferênciaao DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradecilóxi)-1-propanoamônio; W096/34109) ,vantajosamente associado com um lipideo neutro,vantajosamente DOPE (dioleoilfosfatidiletanolamina) ; BehrJ. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389), paraformar DMRIE-DOPE.
Vantajosamente, a mistura de plasmideos com oadjuvante é formada extemporaneamente e vantajosamentecontemporaneamente com a administração da preparação ouimediatamente antes da administração da preparação; porexemplo, exatamente antes ou depois da administração, amistura de plasmideo e adjuvante é formada, vantajosamentede forma a proporcionar tempo suficiente antes daadministração para a mistura formar um complexo, porexemplo, entre cerca de 10 e cerca de 60 minutos antes daadministração, tal como aproximadamente 30 minutos antes daadministração.
Quando DOPE está presente, a proporção molarDMRIE.DOPE é vantajosamente de cerca de 95: cerca de 5 atécerca e 5: cerca de 95, mais vantajosamente cerca de 1:cerca de 1, por exemplo, 1:1.
As composições imunogênicas e vacinas de acordo com ainvenção vantajosamente compreendem ou consistemessencialmente de um ou mais adjuvantes. Adjuvantesadequados para uso na prática da presente invenção são (1)polímeros do ácido acrílico ou metacrílico, anidridomaléico e polímeros derivados de alquenila, (2) seqüênciasimunoestimulantes (ISS), tais como seqüênciasoligodesoxirribonucleotídeo com uma ou mais unidades CpGnão metiladas (Klinman D. M. et al., Proc. Natl. Acad.Sci., USA, 1996, 93, 2879-2883; W098/16247), (3) umaemulsão óleo em água, tal como a emulsão SPT descrita na ρ147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach"publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, e aemulsão MF59 descrita na ρ 183 do mesmo trabalho, (4)lipídeos catiônicos contendo um sal de amônio quaternário,(5) citosinas, (6) hidróxido de alumínio ou fosfato dealumínio ou (7) saponina, (8) brometo de
dimetildioctadecilamônio (Vaccine Design p. 157), (9)Aridina (Vaccine Design p. 148) outros adjuvantesdiscutidos em qualquer documento citado e incorporado porreferência no presente pedido, ou (8) quaisquer combinaçõesou misturas suas.
A emulsão óleo em água (3), a qual é especialmenteapropriada para vetores virais, pode ser baseada em: óleode parafina líquida claro (tipo Farmacopéia Européia), óleode isoprenóide tal como esqualeno, esqualeno, óleoresultante da oligomerização de alquenos, por exemplo,isobuteno ou deceno, ésteres de ácidos ou alcoóis com umgrupo alquil de cadeia linear, tais como óleos vegetais,oleato de etila, propilenoglicol, di(caprilato/caprato),tri(caprilato/caprato) de glicerol e dioleato depropilenoglicol, ou ésteres de alcoóis ou ácidos graxosramificados, especialmente ésteres do ácido isoesteárico.
o óleo é usado juntamente com emulsificantes paraformar uma emulsão. Os emulsificantes podem ser tensoativosnão-iônicos, tais como: ésteres de por um lado sorbitan,manida (por exemplo, oleato de anidromanitol) , glicerol,poliglicerol ou propilenoglicol e, por outro lado, ácidosoléico, isoesteárico, ricinoléico ou hidroxiesteárico, osreferidos ésteres sendo opcionalmente etoxilados, ou blocosde copolímero de polioxipropileno-polioxietileno, tal comoPluronic, por exemplo, L121.
Os polímeros do ácido acrílico ou metacrílico (1) sãopreferivelmente reticulados, particularmente com éteres depoliaIqueniIa de açúcares ou polialcoóis. Esses compostossão conhecidos sob o termo carbômero (Pharmeuropa vol. 8,No. 2, Junho de 1996). As pessoas versadas na técnicatambém podem se referir à Patente Americana No. 2.909.462,descrevendo tais polímeros acrílicos reticulados com umcomposto poliidroxilado com pelo menos 3 grupos hidroxila,preferivelmente não mais do que 8, os átomos de hidrogêniode pelo menos três hidroxilas sendo substituídas comradicais alifáticos insaturados com pelo menos 2 átomos decarbono. Os radicais preferidos são aqueles contendo de 2 a4 átomos de carbono, por exemplo, grupos vinilas, alilas eoutros etilenicamente insaturados. Os radicais insaturadospodem por si só conter outros substituintes, tais comometila. Os produtos vendidos com o nome Carbopol™ (BFGoodrich, Ohio, EUA) são particularmente apropriados. Elessão reticulados com uma alilsacarose ou comalilpentaeritritol. Dentre eles, podem ser mencionados o.Carbopol™ 974P, 934P e 971P.Dentre os copolímeros do anidrido maléico e dederivados de alquenila, os copolímeros EMA™ (Monsanto) , osquais são copolímeros de anidrido maléico e de etileno, osquais são lineares ou reticulados, por exemplo, reticuladoscom éter divinílico, são preferidos. Pode ser feitareferência a J. Fields et al., Nature, 186: 778-780, 4 dejunho de 1960.
As proporções de adjuvantes, as quais serão úteis, sãobem conhecidas e prontamente disponíveis para uma pessoaversada na técnica. A título de exemplo, as concentraçõesde polímeros de ácido acrílico ou metacrílico ou deanidrido maléico e copolímeros de alquenila na composiçãode vacina final serão de 0,01% até 1,5% p/v, maisparticularmente de 0,05 até 1% p/v, preferivelmente de 0,1até 0,4% p/v.
Numa modalidade vantajosa, o adjuvante é um adjuvanterevelado no pedido de Patente Americana No. De Série10/899, 181 requerido em 26 de julho de 2004, e publicadocomo publicação de patente americana No. 2005/0079185 em 14de abril de 2005. Numa modalidade vantajosa, o adjuvante éum adjuvante TS6.
Opcionalmente, a vacina usada de acordo com o métododa invenção pode conter uma citocina. A citocina pode estarpresente como uma proteína ou como um gene codificando essacitocina inserida num vetor recombinante viral. Ascitosinas podem ser selecionadas dentre as citosinasfelinas, por exemplo, interleucina 18 felina (fIL-18)(Taylor S. et al., DNA Seq., 2000, 10 (6), 387-394), flL-16(Leutenegger C. M. et al., DNA Seq., 1998, 9 (1), 59-63),flL-12 (Fehr D. et al. , DNA Seq., 1997, 8 (1-2), 77-82;Imamura T. et al., J. Vet. Med. Sci., 2000, 62 (10), 1079-1087) e GM-CSF felino (fator estimulador de colônia degranulócito-macrófago) (GenBank AF053007).
Numa modalidade especifica, a composição farmacêuticaé diretamente administrada in vivo, e o produto codificadoé expresso pelo vetor no hospedeiro. Vantajosamente, ascomposições, formulações farmacêuticas e/ou terapêuticas deacordo com a invenção compreendem, consistem essencialmentede ou consistem de uma quantidade eficaz para eliciar umaresposta terapêutica de um ou mais vetores de expressãoe/ou polipeptidios conforme aqui discutido; e umaquantidade eficaz pode ser determinada a partir dessadescoberta, incluindo os documentos aqui incorporados e oconhecimento da técnica, sem experimentação indevida.
No caso de composições terapêuticas e/ou farmacêuticasbaseadas num vetor de plasmideo, uma dose pode compreender,consistir essencialmente de ou consistir de, em termosgerais, de cerca de 1 μg até cerca de 2000 μg,vantajosamente de cerca de 50 μg até cerca de 1000 μg e,mais vantajosamente, de cerca de 100 μς até cerca de 800 μςde plasmideo expressando um imunógeno da M. hyopneumoniae.Quando as composições terapêuticas e/ou farmacêuticasbaseadas num vetor de plasmideo são administradas comeletroporação, a dose de plasmideo é geralmente entre cercade 0,1 μς e 1 mg, vantajosamente entre cerca de 1 μg e 100μς, vantajosamente entre cerca de 2 μg e 50 μg. Acomposição terapêutica e/ou farmacêutica contém por dose decerca de IO4 até cerca de IO11, vantajosamente de cerca de105 até cerca de IO10 e, mais vantajosamente, de cerca de106 até cerca de IO9 partículas virais de adenovírusrecombinante expressando um imunógeno de M. hyopneumoniae.
No caso das composições terapêuticas e/ou farmacêuticasbaseadas em poxvírus, uma dose pode estar entre cerca de10^2 UFC e cerca de IO9 UFC. A composição farmacêuticacontém por dose desde cerca de IO5 até IO9, vantajosamentede cerca de IO6 até IO8 pfu de poxvírus ou herpesvírusrecombinante expressando um imunógeno de M. hyopneumoniae.
Deve ser entendido por uma pessoa versada na técnicaque a descoberta aqui é fornecida a título de exemplo e quea presente invenção não está limitada a ela. A partir dadescoberta aqui e do conhecimento na técnica, o artesãohabilitado pode determinar a quantidade de administrações,a via de administração e as doses a serem usadas para cadaprotocolo de injeção, sem qualquer experimentação indevida.
A presente invenção contempla pelo menos umaadministração a um animal de uma quantidade eficaz dacomposição terapêutica feita de acordo com a invenção. 0animal pode ser macho, fêmea, fêmea grávida e recém-nascido. Essa administração pode ser através de várias viasincluindo, porém sem se limitar, a injeção intramuscular(IM), intradérmica (ID) ou subcutânea (SC) ou através deadministração intranasal ou oral. A composição terapêuticade acordo com a invenção também pode ser administrada porum aparelho sem agulha (como, por exemplo, com um aparelhoPigj et, Biojector ou Vitajet (Bioject, Oreg. EUA)). Outraabordagem para administrar composições de plasmídeo é o usoda eletroporação (ver, por exemplo, S. Tollefsen et al.Vaccine, 2002, 20, 3370-3378; S. Tollefsen et al. Scand. J.Immunol., 2003, 57, 229-238; S. Babiuk et al., Vaccine,2002, 20, 3399-3408; Pedido PCT No. WO 99/01158). Em outramodalidade, o plasmídeo é distribuído ao animal por umaarma de gene ou bombardeamento de partículas de ouro. Numamodalidade vantajosa, o animal é um porco.
Vantajosamente, a vacina de M. hyopneumoniae éadministrada a um porco desmamado (cerca de duas a trêssemanas de idade). O porco pode ser de cerca de 10, cercade 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 15,cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19 dias,cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22, cerca de 23, cercade 2 4 dias de idade. Uma informação incentivadora pode serfeita, caso necessário, por volta de 3 a 5 semanas depoisda primeira administração. Em outra modalidade vantajosa, avacina de M. hyopneumoniae da presente invenção éadministrada a uma porca, de modo que os leitões adquiramimunidade contra M. hyopneumoniae. A administração édérmica (epiderme e derme) ou subdérmica (hipoderme e/ousubcutânea e/ou intramuscular), vantajosamente no pescoço,mais vantajosamente na região do pescoço caudal à orelha.
Essa via de administração pode permitir alvejar o imunógenoàs células dendriticas de Langerhan.
Injetores sem agulha de jato líquidos são dispositivosefetuando injeções de certa quantidade de líquido sob altaspressões através de um minúsculo orifício. Asespecificações mecânicas do injetor podem ser ajustadas ouselecionadas para controlar a profundidade de penetraçãonos tecidos. Administrações de um líquido usando umaseringa ou um injetor sem seringa terminam numadistribuição diferente do líquido nos tecidos. 0 uso de umaseringa acaba numa massa ou reunião localizada. O uso de uminjetor acaba numa distribuição difusa nas camadas dostecidos alvejados, conforme ilustrado em WO-A-Ol/13975.Numa modalidade vantajosa, a injeção sem agulha é umsistema vacinador transdérmico DERMA-VAC NF.
A profundidade de penetração é principalmentecontrolada pela pressão do liquido. Essa pressão do liquidoestá dependendo das especificações mecânicas do injetor,tais como a força da mola ou qualquer outro meio depropulsão e o diâmetro do pistão e o orifício do bocal.Isso esta prontamente disponível para uma pessoa versada natécnica.
A profundidade da injeção pode ser facilmentedeterminada pela dissecação do tecido no sítio de injeção(correspondendo preferivelmente ao local onde a vacina estásendo administrada, e o teste é vantajosamente efetuado numanimal da mesma espécie e idade do que a população a servacinada) depois da administração de um líquido coloridocom preferivelmente a mesma viscosidade do que a vacinatencionada. Esse teste pode ser efetuado diretamente com avacina tencionada contendo ainda um corante. Esse testepermite que uma pessoa versada na técnica ajuste asespecificações mecânicas de um injetor.
O injetor sem agulha pode ser equipado com uma cabeçacompreendendo um de vários bocais. 0 uso de vários bicospermite aumentar o padrão de dispersão da vacina numa áreamaior. Pode haver de 1 a 10 bicos, preferivelmente de 1 a 6.
Vários injetores estão disponíveis no comércio. 0Vitajet™ 3 (Bioject Inc.) é particularmente adaptado para ométodo de acordo com a invenção.
É vantajoso usar um injetor equipado com meios quepermitam o ajuste no injetor de um frasco ou ampola padrãode modo direto. Além disso, o frasco da vacina podecompreender várias doses de vacina permitindo váriosdisparos de vacina e/ou vacinação de vários animais usandoo injetor e o mesmo frasco. Deste modo, o injetor épreferivelmente capaz de efetuar injeções sucessivas apartir de um mesmo frasco.
Num aspecto da invenção, a vacinação contra M.hyopneumoniae pode estar associada com uma vacinação contraoutra doença suína. A vacina compreende a vacina de M.hyopneumoniae de acordo com a invenção e um componente devacina capaz de proteger contra outras doenças suínas.
O volume de dose injetada pode ser de cerca de 0,1 mLaté cerca de 1,0 mL, pref erivelmente de cerca e 0,1 mL atécerca de 0,8 mL, mais pref erivelmente de cerca de 0,2 mLaté cerca de 0,5 mL. Por definição, o volume de uma dosesignifica o volume total da vacina administrada de umaúnica vez a um animal.
A vacina pode conter de cerca de IO4'5 até cerca de10^8'0 TCIDso/dose (50% de dose infecciosa de cultura pordose de vacina) e preferivelmente de cerca de IO5'5 atécerca de IO6'5 TCID50/dose.
Opcionalmente, a administração pode ser repetida, comoadministração de reforço, em intervalos adequados caso sejanecessário ou desejável, por exemplo, de cerca de 2 atécerca de 8 semanas depois da primeira administração, epreferivelmente de cerca de 3 até cerca de 5 semanas depoisda primeira administração. Uma administração de reforçotambém pode ser repetida a cada ano, especialmente para asporcas.
Outro objeto da invenção é o uso de uma quantidadeeficaz de uma vacina M. hyopneumoniae conforme descritoacima e de um veiculo ou diluente aceitável para o preparode uma vacina projetada para ser administrada a um animalusando um injetor sem agulhas de jato liquido conformedescrito acima, e resultando na indução de uma respostaimune segura e protetora contra M. hyopneumoniae.
Outro objeto é um kit ou jogo de vacinaçãocompreendendo tal injetor sem agulhas de jato liquido epelo menos um frasco de vacina contendo uma vacina M.hyopneumoniae, operativamente montada para efetuar aadministração da vacina a um animal da família dos suínos.A distribuição da vacina é essencialmente feita na derme ena hipoderme.
Tal kit ou jogo de vacinação é capaz de eliciar umaresposta imune segura e protetora contra M. hyopneumoniae.
A invenção será agora adicionalmente descrita a títulodos seguintes exemplos não limitativos.
EXEMPLO 1: Eficácia e segurança da distribuiçãotransdérmica sem agulhas de uma nova bacterina deMycoplasma hyopneumoniae.
Mycoplasma hyopneumoniae permanece entre os agentesprincipais de doenças respiratórias em suínos. A vacinaçãoé agora parte de práticas de gerenciamento padrãoglobalmente. Quaisquer melhorias que passam melhorar aeficiência global dos programas de vacinação são muitodesejáveis. Essas poderiam incluir a eficácia de vacinamelhorada através de novas formulações e apresentações deantigenos, consentimento melhorado, segurança melhoradapara o animal e o vacinador e eliminação do risco deagulhas no produto final (ver, por exemplo, Almond G. W. ej. D. Roberts, 2004, Assessment of a Needleless InjectionDevice for Iron Dextran administration to piglets,Proceedings of the IPVS, 618; Houser Τ. A., J. G. Sebranek,Τ. J. Baas, Β. J. Thacker, D. Nilubol e E. L. Thacker,2002, Feasibility of Transdermal, Needleless Injections forPrevention of Pork Carcass Defectshttp: //www, ipic. iastate.edu/reports/02swinereports/asl-1814.pdf; Meredith M. J., 2004, AASV New archive, Needle-pree Vaccinationhttp: //www, aasp.org/news/stroy.php?id=1279; Sweat J. M., M.Abdy, B. G. Weniger, R. Harrington, B. Coyle, R. A.Abuknesha e Ε. P. J. Gibbs, 2000, Safety Testing of NeedleFree, Jet Injection Devices to Detect Contamination withBlood and Other Tissue Fluids, Annals of the New YorkAcademy of Sciences 916: 681- 682 e Willson P., 2004,Council Research News, Needle-Free Immunization asEffective as Needle and Syringe Methodhttp://www.manitobapork.com/admin/docs/research news ly.pdf).
A eficácia e segurança prolongada de uma novaformulação especificamente projetada para ser administradatransdermicamente usando o sistema vacinador transdérmicoDERMA-VAC™ NF é apresentada nesse Exemplo, A administraçãosem agulhas tem o potencial de endereçar aspectos tanto desegurança quanto de qualidade desses objetivos, assim comoproporcionar uma apresentação otimizada da vacina aosistema imune (ver, por exemplo, Charreyre C, F. Milward,R. Nordgren e G. Royer, 2005, Demonstration of efficacy inpigs of Mycoplasma hyopneumoniae experimental vaccines byan innovative needle-free route, Proceedings of theAmerican Association of Swine Veterinarians) .
Quarenta e oito porcos convencionais, de dezesseis adezenove dias de idade, foram obtidos a partir de fêmeasconvencionais originando um rebanho com baixa incidência deMycoplasma hyopneumoniae.
As vacinações foram efetuadas como o Sistema VacinadorTransdérmico DERMA-VAC NF. Esse dispositivo usa arcomprimido para distribuir 0,5 mL de uma bacterinaespecialmente formulada. Os porcos foram vacinados naregião do pescoço caudal à orelha com bacterina deMycoplasma hyopneumoniae formulada para a administração semagulha. A vacina foi administrada no mesmo dia que osanimais chegaram ao sitio de experimentação (dia 0).
Os porcos foram confinados em replicata com todos osmembros da replicata consistindo de "colegas de ninhada".Os porcos foram aleatorizados ao grupo de tratamento nareplicata de modo que cada grupo de tratamento foiigualmente representado na replicata:
• Grupo 1 (24 porcos) consistiu de controles nãovacinados.
• Grupo 2 (24 porcos) foi vacinado pela via transdérmica.Os porcos foram colocados em construçõesambientalmente controladas as quais foram apropriadas paraas suas idades e tamanho. Do dia O até o dia 21, os porcosforam alojados num pré-viveiro em pavimentos suínoscomerciais fendidos plásticos elevados em cercados de ladosólido. Do dia 21 até o dia 51 os porcos foram alojados numviveiro convencional. O facility do viveiro utilizoupavimento suíno comercial fendido plástico numa cova com umchiqueiro com portão trancado de metal galvanizado. Do dia51 até a necrópsia (dias 189, 190 ou 191) os porcos foramalojados numa última estrutura a qual utilizou tiras deconcreto numa cova com um chiqueiro com portão trancado demetal galvanizado. 0 confinamento da replicata foi mantidopor todo o estudo. Ação e água estavam disponíveis adlibítuM.
Amostras de sangue foram coletadas no dia -2 (for dosítio), nos dias 21, 42, 125, 155 (pré-desafio) e nos dias189, 190 ou 191 (o dia da necrópsia). Soros das amostras desangue foram testados para a determinação de títulos deanticorpo de ELISA de Mycoplasma hyopneumoniae.
Nos dias 160 e 161, todos os porcos foram desafiadosintranasalmente com 25 mL de homogenato de pulmão deMycoplasma hyopneumoniae numa diluição de 1/100 com Frns(cepa de Mycoplasma hyopneumoniae 232) . No dia 162, osporcos receberam 20 mL de uma cultura previamente congeladada cepa de Mycoplasma hyopneumoniae SC2 através da viaintranasal. 0 material desafiado foi administrado em ambasas aberturas das narinas com uma seringa num porco vivomanualmente dominado.
Na necrópsia, os pulmões foram removidos, fotografadose classificados quanto à porcentagem de tecido pneumônicocaracterístico de Mycoplasma hyopneumoniae. Os pulmõesforam independentemente classificados por dois indivíduosdiferentes os quais foram "cegos" quanto à atribuição dotratamento. Especificamente, a porcentagem total de pulmãoafetado com lesões foi determinada para cada animal. Aporcentagem de tecido pneumônico foi estimada porobservação visual das superfícies dorsal e ventral doslobos cranial, mediano e caudal e todas as superfíciesvisíveis do lobo acessório. 0 cálculo da porcentagem delesões no tecido pneumônico foi baseado na porcentagem demassa pulmonar total representada por cada lobo conformeindicado na Tabela 1.
Tabela 1: Porcentagem de massa pulmonar totalrepresentada por cada lobo para o cálculo da porcentagem delesões no tecido pneumônico.
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Num estudo de segurança de campo separado, seiscentose sessenta e três porcos em sítios comerciais localizadosem três diferentes regiões geográficas (MO, PA, NC) dos EUAforam vacinados com de um a dois diferentes seriais de pré-licença de bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae de Merialformulados para administração sem agulha. A bacterina foiadministrada usando o sistema vacinador transdérmico DERMA-VAC NF. Os porcos foram observados por eventos sistêmicosadversos pós-injeção. Os sítios de injeção foram observadosvisualmente e pelo apalpamento nos dias 1, 3, 7, 14 e 21 emtodos os porcos e nos dias 34 ou 35 nos porcos comintumescência no sítio de injeção persistente.
No estudo de eficácia, um porco do Grupo 1 foiremovido no dia 162 subseqüente a uma injúria. Aspontuações do pulmão de um porco adicional no Grupo 1 nãoforam incluídas na análise devido à presença de adesõesexcessivas. Os tamanhos do grupo final foram:• Grupo 1, controles não-vacinados, 23 porcos(sorologia), 22 porcos (pontuações de pulmão).
• Grupo 2, teste de vacina transdérmica, 24 porcos.Os títulos de ELISA médios aos anticorpos de
Mycoplasma hyopneumoniae permaneceram em valoresconsiderados negativos até após o desafio no grupo decontrole. Os porcos de teste vacinados se soroconverteramao status de positivo ao anticorpo no dia 21 após avacinação, permaneceram positivos até o dia 125,mergulhando num status suspeito no dia 155, sangraram eapresentaram uma resposta anamnéstica pós-desafiosubstancial (Tabela 2).
Tabela 2. Títulos de anticorpo ELISA de Mycoplasma.hyopneumoniae médios no decorrer do tempo.
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A porcentagem média de tecido pneumônico no grupo decontrole foi de 4,35% versus 1,72% para o grupo vacinado(Tabela 3). Os porcos vacinados com a bacterina deMycoplasma hyopneumoniae administrada através da viatransdérmica exibiram uma porcentagem significativamentemais baixa (p < 0,05) de lesões de pulmão pneumônicas doque foram observadas nos controles não vacinados.
Durante o estudo de segurança de campo, nenhum eventosistêmico adverso associado com a vacinação foi observado.Inchaços no sitio de injeção palpável foram típicos debacterinas auxiliadas e foram reduzidos até níveisnegligíveis por volta do dia 35 após a vacinação.
Tabela 3. Porcentagem média e desvio padrão do -tecidopneumônico nos pulmões.
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* (p < 0,05)
A bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae administradausando o sistema vacinador transdérmico DERMA-VAC NFprotegeu os porcos de modo seguro e significativamentecontra o desfio de Mycoplasma hyopneumoniae 160 dias apósuma única injeção da vacina administrada antes de 3 semanasde idade. A segurança global da bacterina de Mycoplasmahyopneumoniae administrada com o sistema vacinadortransdérmico DERMA-VAC NF também foi demonstrada nascondições de campo numa grande quantidade de animais. 0novo sistema vacinador transdérmico DERMA-VAC NFproporciona uma apresentação única de uma vacina deMycoplasma hyopneumoniae especialmente formulada para o usosem agulhas, realizando um protocolo de vacinação seguro,conveniente e eficaz.
EXEMPLO 2:
Uma bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae formuladacom uma emulsão TS6 óleo em água de acordo com o Pedido dePatente Americano No. 2005/0079185, em diferentes doses deimunógeno determinadas por ELISA foi administrada emleitões de 16 a 19 dias de idade ou por via intramuscular(IM) com uma seringa e uma agulha (2 mL) ou por viatransdérmica (ID) com um dispositivo sem seringa (0,5 mL)na região do pescoço. 0 injetor sem seringa foi um sistemavacinador transdérmico DERMA-VAC NF com um bico #3. Osporcos foram desafiados 35 dias após a imunização pelaadministração intratraqueal de 10 mL de um homogenato depulmão de Mycoplasma hyopneumoniae (cepa 232) numa diluiçãode 1/100 com meio Friis e aos 36 dias após a imunizaçãopela administração de 10 mL da mesma suspensão pela viaintranasai. De 61 a 62 dias após a imunização, os porcosforam submetidos à necropsia e as lesões do pulmão foramclassificadas conforme descrito no Exemplo 1.
Tabela 4.
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Nos grupos correspondendo a cada uma das vacinas de 1a 3, a porcentagem de tecido pulmonar pneumônico foisignificativamente reduzida (p < 0,0001) em comparação como grupo de controle. As classificações das lesões nosgrupos vacinados 1, 2 e 3 não foram diferentes. O uso de uminjetor sem agulha permitiu uma redução de 1/4 na dose deimunógeno na vacina.
A invenção é adicionalmente descrita pelos seguintesparágrafos numerados:
1. Método de indução de uma resposta imune segura eprotetora contra Mycoplasma hyopneumoniae, compreendendo aadministração de uma única dose de uma vacina compreendendoMycoplasma hyopneumoniae inativado e um adjuvante, emsuinos com um injetor sem agulha de jato liquido.
2. Método, de acordo com o parágrafo 1, em que oadjuvante é um adjuvante TS6.
3. Método, de acordo com o parágrafo 1 ou 2, em quesuino é um leitão desmamado.
4. Método, de acordo com o parágrafo 3, em que oleitão desmamado tem de cerca de 11 até cerca de 24 dias deidade.
5. Método, de acordo com o parágrafo 3, em que oleitão desmamado tem de cerca de duas até cerca de trêssemanas de idade.
6. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafosde 1 a 5, em que o suino é uma porca.
7. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos
1 a 5, em que o injetor sem agulha é um injetor DERMA-VAC NF.8. Kit ou jogo de vacinação compreendendo um injetorsem agulha de jato liquido e pelo menos um frasco de vacinacontendo vacina de Mycoplasma hyopneumoniae, operativamentemontado para efetuar a administração da vacina a um suino epara induzir uma resposta imune segura e protetora contraMycoplasma hyopneumoniae.
9. Kit ou jogo de vacinação, de acordo com oparágrafo 8, compreendendo as composições de qualquer umdos parágrafos de 1 a 7 e as instruções para efetuarqualquer um dos métodos dos parágrafos 1 a 7.
* * *
Tendo deste modo descrito em detalhes as modalidadespreferidas da presente invenção, é para ser entendido que ainvenção definida pelos parágrafos acima não é para estarlimitada a detalhes particulares estabelecidos na descriçãoacima, uma vez que muitas variações aparentes suas sãopossíveis sem que se saia do espírito do escopo da presenteinvenção.
Claims (15)
1. Método de indução de uma resposta imune segura eprotetora contra Mycoplasma hyopneumoniae caracterizadopelo fato de compreender a administração de uma única dosede uma vacina compreendendo Mycoplasma hyopneumoniaeinativado e um adjuvante, em suínos com um injetor semagulha de jato líquido.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o adjuvante é um adjuvante TS6.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o suíno é um leitãodesmamado.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o suíno é um leitãodesmamado.
5. Método, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que o suíno é um leitãodesmamado.
6. Método, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que o leitão desmamado tem decerca de 11 até cerca de 24 dias de idade.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que o leitão desmamado tem decerca de 11 até cerca de 24 dias de idade.
8. Método, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que o leitão desmamado tem decerca de duas até cerca de três semanas de idade.
9. Método, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que o leitão desmamado tem decerca de duas até cerca de três semanas de idade.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o suino é uma porca.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o injetor sem agulha é uminjetor DERMA-VAC NF.
12. Kit ou jogo de vacinação caracterizado pelo fatode compreender um injetor sem agulha de jato liquido e pelomenos um frasco de vacina contendo vacina de Mycoplasmahyopneumoniae, operativamente montado para efetuar aadministração da vacina a um suino e para induzir umaresposta imune segura e protetora contra Mycoplasmahyopneumoniae.
13. Kit ou jogo de vacinação, de acordo com areivindicação 12, caracterizado pelo fato de que oadjuvante é um adjuvante TS6.
14. Kit ou jogo de vacinação, de acordo com areivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o injetorsem agulha é um injetor DERMA-VAC NF.
15. Kit ou jogo de vacinação, de acordo com areivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o injetorsem agulha é um injetor DERMA-VAC NF.
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