BRPI0708527A2 - tratamento da tendinopatia por inibição de moléculas que contribuem para a formação de cartilagem - Google Patents

Abstract

TRATAMENTO DA TENDINOPATIA POR INIBIçãO DE MOLéCULAS QUE CONTRIBUEM PARA A FORMAçãO DE CARTILAGEM. A presente invenção refere-se a métodos para tratar a tendinopatia. Os distúrbios tratados ou prevenidos incluem, por exemplo, tendinite, tendinose, paratendinite, tenossinovite, lesão por uso excessivo e trauma do tendão, perintendinite, e paratenonite, ou outros distúrbios degenerativos do tendão. Os métodos terapêuticos descritos incluem administrar para um paciente um inibidor de moléculas envolvidas na formação de cartilagem ou fibrocartilagem em tendão tendinopático, em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir um distúrbio degenerativo do tendão, deterioração lenta do tendão, restaurar a estrutura sadia do tendão, estimular a regeneração do tendão e 1 ou manter a massa do tendão e/ou a qualidade.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TRATAMENTODA TENDINOPATIA POR INIBIÇÃO DE MOLÉCULAS QUE CONTRIBUEMPARA A FORMAÇÃO DE CARTILAGEM".

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃOPEDIDOS DE PATENTE ANTERIORES

Este pedido de patente reivindica a prioridade para o Pedido dePatente Provisória Série N2 60/779.165, depositada em 3 de março de 2006,cujos conteúdos estão aqui a seguir incorporados por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

O campo técnico da invenção refere-se ao tratamento de tendi-nopatia pela redução da produção de cartilagem e / ou tecido de fibrocartila-gem em tendões lesionados. A invenção adicionalmente refere-se à inibiçãode moléculas envolvidas na produção de cartilagem e/ou fibrocartilagem emtendões lesionados.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Tendinopatia é um termo geral usado para descrever vários tiposde distúrbios do tendão. O termo "tendinite" — que significa "inflamação dotendão" — é muitas vezes usado para descrever problemas de tendão, po-rém a inflamação raramente é a causa de dor do tendão. Mais comumente, ador do tendão é realmente um sintoma de uma série de microrrompimentosno tecido conjuntivo, em ou ao redor do tendão, mais apropriadamente cha-mado tendinose. Outros distúrbios do tendão incluem dor no tendão devido àdegeneração do colágeno com desorientação da fibra, aumento da substân-cia básica mucóide no tendão, calcificação, superutilização do tendão, vas-cularização, envelhecimento, e fricção do tendão contra uma protuberânciado corpo. A tendinopatia é usada por um número cada vez maior de especia-listas em tendão para descrever coletivamente essas condições, em geralcaracterizadas como tendinite, tendinose, paratendinite, tenossinovite, para-tenonite, lesões por superutilização e trauma do tendão. Khan et al., SportsMed 27:393-408 (1999).

O tecido do tendão normal é composto de tecido conjuntivo a-condicionado densamente com feixes regularmente dispostos de fibras decolágeno correndo na mesma direção em feixes de fibras primários, secun-dários e terciários que têm alta resistência à tensão. Dispersos entre essasfibras estão os tenócitos planos, recobertos que sintetizam a matriz extrace-lular viscosa (ECM) rica em colágeno do tipo I. Os feixes de colágeno tipo Iprovêm a flexibilidade e o apoio estrutural do tendão. Em tendões sadios,existe um equilíbrio dinâmico entre síntese e degradação do ECM. Entretan-to, a tendinopatia afeta adversamente esse equilíbrio e resulta em reorgani-zação estrutural e desorganização das fibras de colágeno. A desorganizaçãodos feixes de colágeno dá para o tendão a aparência de cartilagem. Fibro-blastos, miofibroblastos, neovascularização e acumulação patológica de gli-cosaminoglicanos (GAGs) no ECM são claramente notados no tecido tendi-nopático. Tallon et al., Med Sci Sports Exerc 33(12): 1983-90 (2001); Khan etal., Sports Med 27(6) :393-408 (1999). Mudanças metabólicas e morfológi-cas de um tendão danificado resultam em dor e susceptibilidade à rompi-mentos e rupturas.

Atualmente, acredita-se que a degradação e remodelagem deum ECM de tendão danificado sejam causadas pela liberação de metalopro-teinases das células do tecido conjuntivo residente, e das células inflamató-rias invasoras que são capazes de degradar as macromoléculas da matriztais como agrecano, decorino, e biglicano. Essas metaloproteínases incluemMMPs (Metaloproteínases da Matriz), ADAMs (uma Disintegrina e Metalo-proteínase), e ADAMTs (uma Disintegrina e Metaloproteínase com Motivosde Trombospondina, tais como agrecanase). Riley G., Expert Rev Mol Med 7(5)-A -23 (2005); Rees et al., Biochem J 350: 180-188 (2000). Entretanto,experimentos clínicos de inibidores de largo espectro de MMPs não forambem-sucedidos no tratamento da osteoartrite, que tem similaridades patoló-gicas com a tendinopatia. Clark et al., Expert Opin Ther Targets 7(1 ):19-34(2003). Dessa maneira, não é provável que a inibição de metaloproteínasesseja eficaz para tratar a tendinopatia. Na realidade, em tendões altamentetensionados, tais como tendões de aquiles e supra-espinhais, um nível mí-nimo de atividade de metaloproteínase pode ser necessário para prover parao tendão um nível ideal de ECM. Riley G., Expert Rev Mol Mec/7(5):1-23(2005).

Presentemente, existem vários tratamentos não-operatórios eoperatórios padrão da tendinopatia. As medidas não-operatórias incluemrepouso, crioterapia, mudança de atividade, fisioterapia, fármacos antiinfla-matórios não-esteroidais (NSAIDs), e corticosteróides. Repouso e mudançade atividade podem ajudar os pacientes portadores de algumas dessas con-dições, mas ainda resta uma população clínica significativa que não é tratá-vel com essas terapias. A despeito do uso muito difundido, medicações anti-inflamatórias orais têm demonstrado, em estudos controlados, não seremúteis e podem ter efeitos colaterais indesejáveis. Alguns estudos ainda suge-rem que a medicação não-esteroidal pode realmente ter um efeito adversosobre o processo de cura, devido aliviarem a dor eles permitem que o paci-ente cedo ignore os sintomas da tendinopatia.

Os corticosteróides são normalmente usados para reduzir a in-flamação nos tecidos, mas o uso de tais fármacos para tratar a tendinopatianão é recomendado, particularmente porque os corticosteróides inibem asíntese do colágeno. Diversos estudos observaram uma melhoria a curtoprazo em pacientes tratados com cortisona, mas estudos que acompanha-ram pacientes durante mais de um ano revelaram uma taxa alta recorrênciados sintomas, e uma taxa de eficiência equivocada. As injeções de cortisonatambém acarretam o risco de ruptura infecção, despigmentação da pele eatrofia subdérmica do tendão. Em pacientes diabéticos, a injeção pode cau-sar hiperglicemia.

Medidas cirúrgicas para reparar o tendão incluem desbridamentoe reparo dos tendões danificados. Entretanto, cirurgia aberta ou artroscópicatem muitas complicações em potencial tais como infecção profunda, lesãodas estruturas neurovasculares e formação de cicatrizes. A cirurgia é tam-bém dispendiosa e acarreta riscos adicionais associados com anestesia re-gional ou geral.

Dessa maneira, ainda existe uma necesidade de protocolos paratratamento de lesões relacionadas ao tendão superior aos tratamentos exis-tentes. Lesões ou outros danos para tecidos de tendão flexíveis são lentospara curar, e pode durar meses ou até anos para reparar completamente.Lesões relacionadas ao tendão têm um impacto significativo na sociedade.Lesões por superutilização respondem por quase 7 por cento de todas asvisitas aos consultórios médicos relacionadas a lesões, nos Estados Unidos.

Woodwell et al., Adv Data 346:1-44 (2004). Com base nas informações doMinistério do Trabalho dos Estados Unidos, Departamento de Estatísticas doTrabalho (U.S. Department of Labor, Bureau of Labor Statistics), tais lesõeseqüivalem a perdas significativas de tempo de trabalho (videhttp://www.bls.gov/lif).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção provê uma abordagem nova para o tratamento datendinopatia. Ao realizar um perfil transcricional de tendões de rato superuti-lizados, foi agora descoberto que os níveis de expressão de genes específi-cos de cartilagem, tais como agrecano, versicano, Col2a1 (colágeno tipo II),e Sox9 estão aumentados nos tendões lesionados. Esse resultados sugeremque o tecido do tendão Iesionado é convertido em fibrocartilagem como reul-tado do uso excessivo. Ao contrário do tendão, que é composto de colágenodo tipo I principalmente, a fibrocartilagem contém colágeno tipo Il e grandesproteoglicanos, tais como agrecano e versicano. A formação de cartilagem efibrocartilagem dentro de um tendão é prejudicial para o reparo do tendãoporque o tecido da cartilagem rompe as fibras de colágeno tipo I do tendãocompactamente acondicionadas. Esse rompimento reduz a resistência à tra-ção do tendão e a elasticidade.

Desta maneira, a invenção provê métodos de tratar a tendinopa-tia em um paciente reduzindo a formação de proteoglicanos específicos decartilagem no tecido do tendão do paciente. A invenção também provê o usode compostos que reduzem a formação de proteoclicanos específicos decartilagem para a fabricação de medicamentos para tratar a tendinopatia.

Em algumas modalidades, os métodos e usos incluem reduzir aatividade de uma enzima envolvida na síntese de agrecano e/ou versicanono tecido do tendão do paciente. Em modalidades particulares, os métodos eusos incluem reduzir a atividade do sulfato de condroitina N-acetilgalactosaminiltransferase 1 (CS-GalNAcT-1) e/ou o polipeptídeo degalactosamina N- acetilgalactosaminiltransferase 1 (GalNT-1) no tecido dotendão do paciente. Em outras modalidades, os métodos e usos incluemreduzir a atividade de uma ou mais outras enzimas envolvidas na síntese deproteoglicano da cartilagem, incluindo, mas não limitado a, UDP-D-xilose:proteína de núcleo β-D-xilosiltransferase, Gal transferases, GIcAtransferases, GIcNAc transferases, sulfotransferases, sintase de sulfato decondroitina, e sulfotransferases de sulfato de heparano.

A atividade das enzimas e de outras proteínas envolvidas naprodução de proteínas estruturais da cartilagem pode ser reduzida por diretaou indiretamente inibir a função da enzima ou de outra proteína, ou pode serreduzida através da inibição da expressão das próprias enzimas ou de ou-tras proteínas.

A invenção também provê métodos de tratar a tendinopatia emum paciente reduzindo a expressão de proteínas estruturais específicas dacartilagem no tecido do tendão do paciente. A invenção ainda provê usos decompostos que reduzem a expressão de proteínas estruturais específicas dacartilagem para fabricação de um medicamento para tratar a tendinopatia.

Em algumas modalidades, a expressão de proteínas estruturais específicasda cartilagem, tais como, mas não limitadas a, agrecano, sindecano 3 (syn-3), versicano e do colágeno tipo II, está diretamente inibida. Em outras mo-dalidades, a atividade de fatores de transcrição envolvidos na expressão degenes específicos da cartilagem é reduzida. Esses fatores de transcrição eas proteínas de transdução de sinais incluem, por exemplo, Sox9.

Em outras modalidades, a invenção inclui métodos de identifica-ção de um composto para tratar a tendinopatia compreendendo administrarum composto de teste para um sujeito com necessidade de tratamento emedir a capacidade do agente para inibir a atividade de uma enzima envol-vida na síntese de glicoglicosaminoglicanos (GAGs) no tecido do tendão.

Em certas modalidades, os métodos de identificação de umcomposto para tratar tendinopatia ou avaliar o tratamento comprendem: (1)prover pelo menos um componente de amostra selecionado do grupo con-sistindo em CS-GalNAcT-1 , CS- GalNAcT-2, sulfato de heparano (glucosa-mina) 3-0-sulfotransferase 1 (Hs3st1), GaINT- 1 , e Sox9; (2) combinar aamostra com um composto de teste; (3) medir a atividade do componente deamostra em resposta ao composto de teste ; e (4) determinar se o compostode teste inibe a atividade do componente de amostra.

Objetivos e vantagens adicionais da invenção serão demonstra-dos em parte na descrição a seguir, e em parte serão óbvios a partir da des-crição, ou podem ser aprendidos pela prática da invenção. Os objetivos e asvantagens da invenção serão realizados e alcançados por meio de elemen- tos e combinações particularmente salientados na descrição detalhada aseguir, e nas reivindicações em anexo.

Deve ficar entendido que ambas, a descrição geral anterior e adescrição detalhada a seguir, são exemplares e explanatórias e não são res-tritivas da invenção, como reivindicado.

As figuras anexas, que estão incorporadas em e constituem umaparte desta especificação, ilustram diversas modalidades da invenção e, jun-to com a descrição, servem para explicar os princípios da invenção.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Nas figuras 1 -7, SST quer dizer tendão superespinhal; PT signi-fica controle interno não-lesionado do tendão patelar; R significa animaissubmetidos ao protocolo de superuso (Soslowsky et al., J. Shoulder ElbowSurg. 9:79-84 (2000)); C significa animais de controle não submetidos aoprotocolo de superuso; tempo decorrido é 1 , 2, e 4 semanas; e BM significamedula óssea.

A figura 1 mostra os perfis de expressão de genes para Col2a1(colágeno tipo II), em tendões superusados (figura 1A) durante quatro sema-nas usando chips de gene 2,0 Affymetrix RAE230. Os níveis de expressãode genes Col2a1 foram também medidos em tecidos músculo-esqueléticosnormais como indicado (figura 1 B). Os perfis de expressão indicam queCol2a1 é altamente expresso em ambos, no tecido da cartilagem quandocomparado ao tecido do tendão normal, e no tecido do tendão superusado,quando comparado ao tecido de tendão normal.A figura 2 mostra perfis de expressão de gene para Agcl (agre-cano), em tendões superusados (figura 2A) durante quatro semanas usandochips de genes Affymetrix RAE230 2,0. Os níveis de expressão de genes deAgcl foram também medidos em tecidos músculo-esqueléticos normais co-mo indicado (figura 2B). Os perfis de expressão indicam que o Agcl é alta-mente expresso em ambos, no tecido da cartilagem quando comparado aotecido de tendão normal, e no tecido do tendão superusado quando compa-rado ao tecido do tendão normal.

A figura 3 mostra perfis de expressão de genes para Sox9 (caixa9 do grupo de alta mobilidade do tipo sry), em tendões superusados (figura3A) durante quatro semanas usando chips de gene Affymetrix RAE2302,0.Os níveis de expressão dos genes de Sox9 foram também medidos em teci-dos músculo-esqueléticos normais como indicado (figura 3B). Os perfis deexpressão indicam que Sox9 é altamente expresso em ambos, no tecido dacartilagem quando comparado ao tecido do tendão normal, e no tecido dotendão superusado quando comparado ao tecido do tensão normal.

A figura 4 mostra perfis de expressão de genes para Cspg2(versicano), em tendões superusados (figura 4A) durante quatro semanasusando chips de genes Affymetrix RAE230 2,0. Os níveis de expressão dogene de versicano foram também medidos em tecidos músculo-esqueléticosnormais como indicado (figura 4B). Os perfis de expressão indicam que oversicano é altamente expresso no tecido de cartilagem, quando comparadodo tecido de tendão normal e tecido de tendão superusado, quando compa-rado ao tecido de tendão normal.

A figura 5 mostra perfis de expressão de gene para sulfato decondroitina N-acetilgalactosaminiltransferase (CS-G al N AcT-1) em tendõessuperusados (figura 5A) durante quatro semanas usando chips de genesAffymetrix RAE230 2,0. A expressão niveis de gene CS-GalNAcT-1 foi tam-bém medida em tecidos músculo-esqueléticos normais como indicado (figura5B). Os perfis de expressão indicam que o CS- GalNAcT-1 é altamente ex-presso tanto no tecido da cartilagem, quando comparado ao tecido do ten-dão normal e tecido de tendão superusado, e em tecido de tendão superu-sado quando comparado ao tecido de tendão normal.

A figura 6 mostra perfis de expressão de genes para GalNT-1(GaINTI-UDP-N-acetil-alfa-D-galactosamina: polipeptídeo-N-acetilgalactosa-miniltransferase 1) em tendões superusados (figura 6A) durante quatro se-manas usando chips de genes Affymetrix RAE230 2,0. Os niveis de expres-são do gene de GalNT-1 foram também medidos em tecidos músculo-esqueléticos normais, como indicado (figura 6B). O índice de perfis de ex-pressão indicam que o GalNT-1 é altamente expresso em tecido de tendãosuperusado, quando comparado ao tecido de tendão normal.

A figura 7 mostra perfis de expressão de genes para Hs3st1 (sul-fato de heparano (glucosamina) 3-O-suIfotransferase 1) em tendões superu-sados (figura 7A) durante quatro semanas usando chips de gene AffymetrixRAE230 2,0. Os niveis de expressão do gene Hs3st1 foram também medi-dos em tecidos músculo-esqueléticos normais como indicado (figura 7B). Osperfis de expressão indicam que o Hs3st1 é altamente expresso em tendãosuperusado quando comparado ao tendão normal e em tecido de cartilagem,quando comparado ao tecido de tendão normal.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos de CS-GalNAcT-1estão disponíveis em Genbank sob os números de acesso a seguir: sereshumanos (NM_018371); camundongo (N IVM 72753); e rato (XIVL224757).

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos de CS-GalNAcT-2estão disponíveis em Genbank sob os números de acesso a seguir: sereshumanos (NM_018590); camundongo (NM_030165); e rato (XM_232316).

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos de GalNT-1 estãodisponíveis em Genbank sob os números de acesso a seguir: seres huma-nos (NM_020474); camundongo (NM_013814); e rato (NM_124373).

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos de agrecano es-tão disponíveis em Genbank sob os números de acesso a seguir: seres hu-manos (NM_001135); camundogo (NM_007427); e rato (NM_022190).

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos de Col2a1 estãodisponíveis em Genbank sob os números de acesso a seguir: seres huma-nos (NM_001844); camundongo (NM_031163) e rato (NM_012929).

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos de Sox9 estãodisponíveis em Genbank sob os números de acesso a seguir: seres huma-nos (NM_000346); camundongo (NM_011448); e rato (XM_343981).

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos de versicano es-tão disponíveis em Genbank sob os números de acesso a seguir: seres hu-manos (NM_004385); camundongo (XM_488510) e rato (XM_215451).

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos de sulfato de he-parano (glucosamina) 3-0-sulfotransferase 1 estão disponíveis em Genbanksob os números de acesso a seguir: seres humanos (NM_005114), camun-dongo (NML.010474), e rato (NM_053391).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção provê métodos para tratar a tendinopatiapela redução da atividade de uma ou mais moléculas envolvidas na forma-ção da cartilagem e/ou fibrocartilagem em tecidos de tendão.

Para a presente invenção ser mais prontamente compreendida,certos termos são primeiro definidos. Definições adicionais são estabeleci-das através de descrição detalhada da invenção.

Como usado aqui a seguir, o termo "tendinopatia" inclui todasas patologias que surgem em ou ao redor de tendões, incluindo, mas nãolimitado a, tendinites, tendonites, tendinoses, paratendinites, tenossinovites,lesão e trauma de superuso do tendão, perintendinites, e paratenonites.

Como usado aqui a seguir, o termo "defeito de tendão" refere-se aqualquer distúrbio no tendão incluindo, mas não limitado a, tendinopatia.

Como usado aqui a seguir, o termo "tendão danificado" refere-sea um tecido de tendão que sofre de tendinopatia ou de um defeito de tendão.

Como usado aqui a seguir, o termo tendão "superusado" refe-re-se a um tendão que está sofrendo de defeito de tendão ou tendinopatiacomo resultado de superuso, ao contrário do trauma direto.

Como usado aqui a seguir, o termo "paciente" ou "sujeito" re-fere-se a qualquer pessoa ou animal que é suscetível, sofre de ou está emprocesso de recuperação de um defeito de tendão e está com necessidadede tratamento.

Como usado aqui a seguir, o termo "tendinite" refere-se a ten-donite (uma ortografia alternativa), tendinopatia, ou inflamação do tendão.

Como usado aqui a seguir, o termo "tendinose" refere-se a ten-dinopatia ou qualquer condição degenerativa em que microrrompimentosocorrem no tendão que enfraquecem o tendão, geralmente causando dor,rigidez e perda da resistência.

Como usado aqui a seguir, o termo "lesão de tendão" refere-sea tendinopatia ou qualquer condição em que o tecido do tendão torna-se de-feituoso ou degenerativo.

Como usado aqui a seguir, o termo "molécula pequena" incluiqualquer porção química ou outra, que não são polipeptídeos e ácidos nu-cléicos, que podem atuar para afetar os processos biológicos.

Como usado aqui a seguir, os termos "tratar" ou "tratamento"referem-se a qualquer administração ou aplicação de remédios para doençaem um mamífero, incluindo um ser humano, e inclui a inibição da doença.Inclui interromper o desenvolvimento da doença e aliviar e doença, tal comocausando a regressão ou restaurando uma perda, falta ou função defeituosa,ou estimulando um processo ineficaz.

Como usado aqui a seguir, o termo "atividade" refere-se à fun-ção biológica de uma enzima ou uma proteína que pode ser inibida, reduzi-da, ou interferida por vários meios.

Como usado aqui a seguir, o termo "atividade enzimática" refe-re-se a uma ou mais atividades fisiológicas, catalíticas, reguladoras ou enzi-maticas associadas a uma enzima.

Como usado aqui a seguir, o termo "quantidade eficaz" significaa quantidade total de cada inibidor da presente invenção que é suficientepara mostrar um benefício significativo para o paciente, isto é, a cura da ten-dinopatia ou o aumento na taxa de cura e melhoria dos sintomas.

I. Os Componentes de Tendão e Cartilaaem

O tendão é composto de uma hierarquia ordenada de colágenotipo I, que é dispersa em pequenas quantidades de colágeno tipo III, tenóci-tos tipo Fibroblastos, e fibrocondrócitos tipo condrócito. O colágeno tipo I éacondicionado em fibras de colágeno densas, que provêm o tendão comforça e firmeza, enquanto ele é esticado e puxado pelos músculos acopla-dos. Em contraste, a cartilagem é composta de colágeno tipo Il e proteogli-canos, e é projetada para suportar a compressão, não tensão. A fibrocartila-gem é uma mistura de tecidos de tendão e cartilagem, e é principalmenteencontrada na interface entre tendão e osso. A formação de cartilagem efibrocartilagem dentro de um tendão é prejudicial à função do tendão porqueele rompe as fibras do colágeno do tipo I acondicionadas firmemente e reduza resistência à tração do tendão. Dessa maneira, os métodos da invençãopodem ser empregados para prevenir ou reduzir a formação de cartilagem e/ ou fibrocartilagem em tecido de tendão danificado ou lesionado.

Uma indicação de formação de cartilagem em tendão é a pre-sença de níveis de proteoglicanos aumentados no tecido, muitas vezes de-tectada pela presença das cadeias laterais de glicosaminoglicano (GAG) deproteoglicanos. Proteoglicanos são uma família de glicoproteínas caracteri-zada por uma proteína de núcleo que tem uma ou mais cadeias lineares deGAG, que são feitas da repetição de unidades de dissacarídeos. Proteogli-canos de sulfato de condroitina, tais como agrecano e versicano, são especí-ficos da cartilagem. O agrecano é o componente estrutural principal da carti-lagem e é responsável pela força compressora e elasticidade da cartilagem.

A hidratação e agregação de moléculas de agrecano criam um gel viscosoque absorve a carga compressora em tecidos de cartilagem. Watanabe etal., J. Biochem 124(4):687-93 (1998). Outros proteoglicanos presentes notecido da cartilagem incluem proteoglicanos de sulfato de heparano, tais co-mo, por exemplo, sindecano 3 (syn-3). Kirn-Safran et al., Birth Defects Res72(Part C):69- 88 (2004).

II. Moléculas que Promovem Cartilagem e Fibroformacão de cartilagem

A invenção está baseada, em parte, na descoberta de que a ex-pressão de genes específicos de cartilagem (por exemplo, agrecano, versi-cano, e colágeno tipo II) aumenta em tendões lesionados. Esse resultado,usando perfis de expressão de genes obtidos em um modelo de superuso detendão de rato descrito em Soslowsky et al., J Shoulder Elbow Surg. 9:79-84 (2000), sugere que o tendão Iesionado é convertido em fibrocartilagemcomo um resultado do superuso.

A invenção é também baseada, em parte, na descoberta de quea expressão de enzimas envolvidas na síntese de glicosaminoglicano (GAG)cadeias laterais de proteoclicanos específicos de cartilagem, é aumentadanos tendões de superuso. A descoberta de que enzimas específicas de carti-lagem são reguladas a montante em tendões danificados, provê um meca-nismo para a acumulação de GAGs observada em tendões gravemente da-nificados. Khan et al., Sports Med 27:393-408 (1999) e Tallon et al., Med SclSports Exerc 33(12):1983-90 (2001). Esses níveis de GAG aumentados indi-cam que níveis de proteoglicanos tais como agrecano, versicano, e syn-3aumentam em tendões danificados. Dessa maneira, a tendinopatia pode sertratada prevenindo a acumulação de proteoclicanos específicos de cartila-gem, reduzindo a atividade das enzimas responsáveis pela produção dessesproteoglicanos.

A. Moléculas que Promovem a Formação de Cartilaaem são Reguladas àMontante em Tendinopatia

O sistema Affymetrix GeneChip® foi usado para identificar dife-renças em expressão de genes entre tendão normal e tendão submetido aum protocolo de superuso. Os perfis de expressão de genes renderam maisde 400 genes que são diferencialmente regulados no tendão superespinhalapós o superuso. Por 4 semanas de superuso, 107 genes foram regulados àmontante e 27 genes foram infra-regulados. Alguns dos genes mais altamen-te supra-regulados são genes específicos de cartilagem, incluindo cadeia decolágeno alfa-1 do tipo 2 (Col2a1), Sox9, versicano, e agrecano. Outros ge-nes supra-regulados incluem aqueles envolvidos na formação de cadeiaslaterais de GAG em proteoglicanos de cartilagem, incluindo CS-GalNAcT-1,GalNT-1, e Hs3st1. Com base nesses resultados, é provável que essaspróprias moléculas, ou outras moléculas responsáveis pela iniciação ou ma-nutenção da atividade dessas moléculas ou expressão dos genes que codifi-cam essas moléculas, podem estar envolvidas na formação de cartilageme/ou fibrocartilagem em tendões de superuso. Essas moléculas podem inclu-ir enzimas, fatores de transcrição, e fatores de transdução de sinal, comolistado abaixo:

1. Enzimas

Um método para inibir a produção de cartilagem ou fibrocartila-gem no tecido do tendão é inibir a expressão ou atividade das enzimas en-volvidas na síntese de proteoglicanos. Para uma lista completa de enzimasenvolvidas na síntese da cadeia de GAG de proteoglicanos, vide Silbert etal., IUBMB Life 54:177-186 (2002) e Sugahara et al., IUBMB Life 54:163-17510 (2002). Essas enzimas incluem proteínas cuja expressão é aumentada emtendões de superuso (Exemplo 1). Dessa maneira, uma modalidade da in-venção envolve inibir a expressão ou atividade de qualquer uma das enzi-mas a seguir:

CS-GaINAcT-1 e CS-GalNAcT-2 (EC 2.4.1.174 e EC 2.4.1.175),envolvidas na iniciação e alongamento de cadeias laterais GAG de sulfatode condroitina. CS- GalNAcT-1 é envolvida na iniciação e alongamento deGAGs de condroitina, enquanto que CS-GalNAcT-2 é envolvida no alonga-mento daquelas mesmas GAGs de condroitina. Para uma descrição deta-lhada dessas enzimas, por favor vide Uyama et al., J. Biol. Chem,277(11):8841 -8846 (2002); Gotoh et al., J. Biol. Chem. 277(41 ):38189-38196 (2002); Sato et al. J. Biol. Chem. 278(5) :3063-3071 (2003); Uyama etal., J. Biol. Chem. 278(5) :3072-3078 (2003).

UDP-D-xilose: proteína do núcleo β-D-xilosiltransferase (EC2.4.2.269), envolvida na adição da porção inicial de Xyl sobre uma proteínado núcleo de proteoglicano, uma das primeiras etapas da síntese de cadeialateral de GAG.

Transferases de Gal (EC 2.4.1.133 e EC 2.4.1.134), envolvidasna adição de resíduos de galactose sobre a porção Xyl das novas cadeiasLateriais de GAG.

Transferases de GIcA (EC 2.4.1.135, EC 2..4.1.226, e EC2.4.1.225), envolvidas na adição de porções de GIcA sobre resíduo de ga-lactose de novas cadeias laterais de GAG.Transferases de GIcNAc (EC 2.4.1.223 e EC 2.4.1.224), envolvi-das na adição de porções de GIcNAe para as porções de GaINAe de sulfatode condroitina GAGs adicionada pelas enzimas CS-GaINAeT.

Sulfotransferases (EC 2.8.2.5 e EC 2.8.2.1), envolvidas na trans-ferência de GAGs de resíduos de sulfato em sulfato de condroitina.

Sintases de sulfato de condroitina (EC 3.1.6.4 e EC 3.1.6.12),envolvidas na adição inicial de resíduos de sulfato para GAGs de sulfato decondroitina.

GaINT-1 (E.C.2.4.1.41) cataliza a primeira etapa na formação decadeias laterais de oligossacarídeos O- ligados em glicoproteínas. White etal., J Biol Chem 270(41 ):24156-65 (1995).

Hs3st1 (EC 2.8.2.23) cataliza a adição de resíduos de sulfatosobre GAGs de sulfato de heparano. Shworak et al., J Biol Chem 272(44):28008-19 (1997).

Inibir a atividade de qualquer uma dessas enzimas, seja diretaou indiretamente, reduzirá a formação de proteoglicanos. Os métodos parainibição dessas enzimas são discutidos abaixo.

2. Expressão de Gene

Um método alternativo para prevenir a formação de cartilagem e/ ou fibrocartilagem é prevenir a expressão de proteínas específicas de carti-lagem no tecido do tendão danificado, quer direta ou indiretamente. Por e-xemplo, a expressão de versicano ou agrecano, proteoclicanos específicosde cartilagem, pode ser reduzida por diversos métodos de transcrição outradução dos genes que codificam agrecano ou versicano, ou previnem aexpressão ou função de fatores de transcrição envolvidos na expressão dosgenes de agrecano ou versicano que teriam o resultado de prevenir a trans-crição desses genes.

Quando praticar a invenção, é importante invenção garantir quea inibição de fatores específicos da cartilagem seja localizada para o tendãodanificado, porque muitos fatores específicos da cartilagem, incluindo prote-oglicanos e colágeno tipo II, são elementos importantes da cartilagem articu-lar funcional e outros tecidos.Um método para inibir a formação de cartilagem e / ou fibrocarti-Iagem no tecido do tendão é inibir a atividade ou expressão de proteínasnão-enzimáticas envolvidas na expressão de proteínas estruturais da cartila-gem. Inibindo a expressão ou atividade desses genes, a pessoa pode indire-tamente inibir a expressão das proteínas que constituem a cartilagem e/outecido da fibrocartilagem. Proteínas envolvidas na expressão de proteínasestruturais da cartilagem incluem, mas não estão limitadas a Sox9.

Outros métodos para inibir a formação de cartilagem ou fibrocar-tilagem no tecido do tendão envolvem inibir diretamente a expressão (aocontrário da atividade) das principais proteínas estruturais da cartilagem, taiscomo, por exemplo, agrecano, versicano, colágeno do tipo II. Os genes aseguir foram descoberto como sendo supra-regulados no tecido do tendãodanificado e são ligados à formação de cartilagem.

a) Sox9 ·

Sox9 (estojo 9 do grupo de mobilidade alta do tipo sry) é um fa-tor de transcrição envolvido no desenvolvimento de cartilagem. Sox9 é ex-presso em condrócitos, coincidindo com a expressão do gene de colágenoalfa 1 (II) (Col2a1). Sox9 regula a condrogênese ativando ou aumentando atranscrição de genes que expressam as protéinas da estrutura da cartilagemtais como o colágeno do tipo II. Shum et al., Arthritis Res. 4(2):94-106(2002); Bi et al., Nat. Genet. 22(1):85-9 (1999).

b) Col2a1

Col2a1 codifica a cadeia alfa 1 do colágeno tipo II, o principalcomponente da cartilagem. Cheah et al., Proc Natl Acad Sci U S A25 82(9):2555-9 (1985).

c) Aacl

Agcl codifica a proteína do núcleo do proteoglicano agrecano,Doege et al., Extracellular Matrix Genes (Sandel, L J.; Boyd, C. D., eds.) A-cademic Press (New York) 137-152 (1990). Como usado aqui a seguir, otermo "agrecano" refere-se a um grande proteoglicano específico dos teci-dos da cartilagem. O agrecano é composto de um núcleo de proteína reves-tido com numerosas porções de GAG de sulfato de condroitina. O agrecanoé o principal componente estrutural da cartilagem e é capaz de ligar a água eformar uma substância viscosa do tipo gel. Essa hidratação provê o tecidoda cartilagem com sua elasticidade e força compressora.d) Cspq2

Cspg2 codifica a proteína do núcleo do proteoglicano versicano.

O versicano e outro proteoglicano grande com numerosas cadeias lateraisde sulfato de condroitina. Como o agrecano, o versicano liga a água e formaum gel viscoso que aumenta a resistência e elasticidade do tecido. Knudsonet al., Sem Cell Dev Biol 12:69-78 (2001). B. Tratamento de Tendinopatia por Inibicão de Moléculas Que Promovem a

Formação de Cartilagem

A invenção provê métodos para tratamento ou prevenção detendinopatia reduzindo a expressão e/ou atividade das moléculas listadasacima. A invenção ainda provê métodos de administrar um inibidor das mo-léculas listadas acima para tratar ou prevenir a tendinopatia.

1. Estratégia de Tratamento

A invenção do momento é baseada, em parte, na descoberta deque os níveis de expressão dos genes que codificam agrecano, versicano,Sox9, colágeno tipo II, CS-GalNAcT-1 , GaINT-1 , e HS3st1 são aumentadossignificativamente nos tecidos do tendão superusado quando comparadosaos tecidos de controle (figuras 1-7). Esse resultado indica que a expressãode enzimas aumentada, ou outras moléculas envolvidas na via da síntese deproteoglicanos leva à conversão do tecido do tendão Iesionado em cartila-gem e / ou fibrocartilagem. Dessa maneira, em uma modalidade, a invençãoinclui métodos para tratar a tendinopatia que compreendem reduzir a forma-ção de cartilagem e/ou fibrocartilagem no tecido do tendão, inibindo a ativi-dade, expressão, ou acumulação de enzimas ou outras moléculas envolvi-das na síntese de cartilagem e/ou fibrocartilagem.

Inibidores que podem bloquear a atividade das enzimas ou deoutras moléculas envolvidas em formação de cartilagem ou fibrocartilagemno tendão são úteis na invenção. Inibidores úteis nos métodos da invençãosão opcionalmente glicosilados, peguilados, ou ligados a outro polímero não-proteináceo. Os inibidores podem ser modificados para ter um padrão deglicosilação alterado (isto é, alterado a partir do padrão de glicosilação origi-nal ou nativo). Como usado aqui a seguir, "alterado" significa ter uma oumais porções de carboidrato adicionadas ou deletadas, e / ou ter um ou maissítios de glicosilação adicionados ou deletados quando comparado ao inibi-dor original. A adição de sítios de glicosilação para os inibidores pode serrealizada pela alteração da seqüência de aminoácidos para conter seqüên-cias de consenso dos sítios de glicosilação bem-conhecidas na técnica. Ou-tros meios de aumentar o número de porções de carboidratos é acoplandoglicosídeos químicos ou enzimáticos aos resíduos de aminoácidos do inibi-dor. Esses métodos são descritos em WO 87/05330, e em Aplin et al., CritRev Biochem 22:259-306 (1981 ). A remoção de quaisquer porções de car-boidratos presentes no substrato pode ser realizada quimicamente ou enzi-maticamente como descrito por Sojar et al., Arch Biochem Biophys 259:52-57 (1987); Edge et al., Anal Biochem 118:131 -137 (1981); e por Thotakuraet al., Meth Enzymol 138:350-359 (1987).

Inibidores de proteináceos e não-proteináceos incluindo, por e-xemplo, peptídeos, moléculas pequenas e ácidos nucléicos, podem ser tam-bém usados nos métodos da invenção.

a) Peptídeos e Moléculas Pequenas

Inibidores úteis nos métodos da invenção incluem peptídeos emoléculas orgânicas pquenas, e moléculas inorgânicas pequenas. Essespeptídeos e moléculas pequenas incluem inibidores de ocorrência naturalsintéticos e purificados. Os métodos para identificar peptídeos e moléculaspequenas que especificamente alvejam uma proteína de interesse são bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, peptídeo e/ou bibliotecas de moléculaspequenas podem ser rastreados para inibição das proteínas alvo, tais como,por exemplo, CS-GalNAcT-1, CS- GalNAcT-2, GaINT-1, e / ou Sox9, usan-do um ensaio da função enzimática e/ou biológica da proteína alvo. Em outramodalidade, a molécula pequena e/ou as bibliotecas de peptídeos podemser rastreadas em um ensaio ligando radioligante competitivo de uma proteí-na alvo, tal como CS-GalNAcT-1, CS-GalNAcT-2, GaINT-1, e/ou Sox9, comseus substratos ou ligantes.

Alternativamente, ensaios baseados na transferência de energiade ressonância fluorescente (FRET), tais como o ensaio de FRET de Reso-lução por Hora (TR-FRET), podem ser usados para identificar um inibidor.

Em uma modalidade exemplar, a proteína do núcleo de um proteoglicano érotulada com um marcador His ou GST e um anticorpo anti-His ou GST aco-plado ao Europium, um fluoróforo, é usado para rotular a proteína. Alternati-vamente, a proteína do núcleo é rotulada não-especificamente com Europi-um sobre resíduos de Iisina ou cisteína. A molécula doadora de açúcar érotulada com Cy5, um corante fluorescente. Uma lista de moléculas de doa-dores e aceitantes úteis nesse ensaio pode ser encontrada na Tabela I deUyama et al., J Biol Chem 278(5):3072-78 (2003).

As moléculas de doador e aceitante são combinadas em propor-ções diferentes, com e sem a enzima alvo. O ensaio de TR-FRET é realiza-do excitando o sistema a 340 nm, medindo a emissão de Europium e Cy5 a615 e 665 nm, respectivamente, e calculando a proporção de emissão deCy5 para a emissão de Europium.

Quando não há enzima presente, as moléculas doadoras e acei-tantes não entram em proximidade estreita umas com as outras, e não existeextinção da forescência individual das moléculas de Cy5 e Europium, resul-tando em uma proporção a nível de linha de base. Quando a enzima alvo éadicionada ao sistema de ensaio, a molécula doadora de açúcar é transferi-da para a proteína aceitante, e a fluorescência do sistema é extinguida. Arelação de Cy5 para a florescência de Europium aumenta com a quantidadede moléculas de açúcar transferida até um máximo.

Para identificar inibidores da enzima alvo, peptídeos ou molécu-las pequenas são adicionadas ao sistema de ensaio. Quando um compostode teste é capaz de inibir a transferência do açúcar para a proteína, a extin-ção da fluorescência diminui. Se o composto de teste é capaz de inibir 100%da atividade de transferência da enzima, a proporção de missão de Cy5 paraemissão de Europium está em níveis da linha de base. Compostos que ini-bem pelo menos 50% da atividade da enzima nesse ensaio são depois ava-liados em sistemas baseados em células para avaliar sua capacidade parareduzir a síntese de GAG (descrita abaixo).

A invenção também provê o uso de ensaios de rastreamentoadicionais, por exemplo ensaios secundários e terciários, para ainda identifi-car o efeito de tais moléculas sobre a morfologia do tendão, por exemplo,usando os ensaios descritos em detalhes acima.

b) Mutantes Negativos Dominantes

Em certas modalidades da invenção, as proteínas CS-GaINAcT-1, CS- GalNAcT-2, GalNT-1, Hs3st1, ot Sox9 mutantes podem ser usadascomo inibidoras nos métodos da invenção. Por exemplo, uma variante deocorrência natural, ou um homólogo mecânico que tem efeito negativo domi-nante sobre a atividade das moléculas mencionadas acima, tanto in vivo e invitro, podem ser usados nos métodos da invenção.

c) Ácidos Nucléicos

Os ácidos nucléicos que podem bloquear a atividade das molé-culas alvo listadas acima, são úteis nesta invenção. Tais inibidores podemcodificar proteínas que interagem com, por exemplo, CS-GalNAcT-1, CS-GalNAcT-2, GalNT-1, Hs3st1, ou Sox9. Alternativamente, tais inibidorespodem codificar proteínas que podem interagir com substratos ou Iigantes damolécula alvo (tal como GaINAc) e podem ser eficazes nos métodos da in-venção, se as proteínas codificadas bloquearem a ligação da molécula alvopara seu substrato ou ligante, ou se elas bloquearem a atividade do substra-to ou ligante após a ligação da molécula alvo. Inibidores, naturalmente, po-dem codificar proteínas que interagem com a molécula alvo e seu substratoou ligante ao mesmo tempo. Tais ácidos nucléicos podem ser usados paraexpressar, por exemplo, inibidores de CS-GaINAcT- 1, CS-GalNAcT-2,Hs3st1, GalNT-1, ou Sox9 para uso nos métodos da invenção.

Os métodos da invenção também abrangem o uso de moléculasde RNA interferente ("RNAi"), incluindo, mas não limitado a, RNAs de pe-quena interferência (siRNA), RNAs de grampo curto (shRNA), e RNA rastre-ada de duplo curto (sdsRNA), para reduzir a expressão de qualquer uma dasmoléculas listadas acima ou seus parceiros de ligação de proteínas. A RNAipode ser iniciada pela introdução de moléculas de ácido nucléico, por exem-plo agentes que interferem em siRNAs RNA de intereferência curta sintética,para inibir ou silenciar a expressão de genes alvo. Vide, por exemplo, Paten-te Norte Americana Publicações Nos. 2003/0153519 e 2003/01674901 , Pa-tente Norte Americana Nos. 6.506.559, e 6.573.099.

O siRNA pode ser quimicamente sintetizado, produzido portranscrição in vitro, ou produzido dentro de uma célula hospedeira. Tipica-mente, um siRNA tem pelo menos 15-50 nucleotídeos de comprimento, porexemplo, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucleotídeos de com-primento. O siRNA pode ser um RNA duplo rastreado (dsRNA) de cerca de15 a cerca de 40 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, cerca de 15 acerca de 28 nucleotídeos de comprimento, incluindo cerca de 19, 20, 21 , ou22 nucleotídeos de comprimento, e podem conter um a 3' e/ou 5' inversosem cada filamento tendo de cerca de 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 nucleotídeos. OsiRNA pode inibir um gene alvo silenciando os transcritos. Preferivelmente osiRNA é capaz de promover a interferência do RNA através de degradaçãoou SiIenciamentO de genes pós-transcritos específicos (PTGS) do RNA men-sageiro alvo.

Os siRNAs usados nos métodos da invenção também incluemRNAs de grampo pequeno (shRNAs). Os shRNAs são compostos de umpequeno (por exemplo cerca de 19 a cerca de 25 nucleotídeos) filamentoantisentido, seguido por um Ioop de nucleotídeo de cerca de 5 a cerca de 9nucleotídeos, e o filamento de sentido análogo. Alternativamente, o filamentode sentido pode preceder a estrutura de Ioop do nucleotídeo e o filamentoantisentido pode seguir. Esses shRNAs podem estar contidos em plasmí-deos e vetores virais.

A região alvejada das moléculas siRNA pode ser selecionada apartir de uma dada seqüência alvo. Por exemplo, seqüências de nucleotí-deos podem começar a partir de cerca de 25-100 nucleotídeos a jusante docódon de partida. As seqüência de nucleotídeos pode conter 5' ou 3' regiõesnão traduzidas, como também regiões próximas do códon de partida. Méto-dos para o projeto e preparação de moléculas de siNRA são bem-conhecidos na técnica, incluindo uma variedade de regras para selecionarseqüências como reagentes de RNAi. Vide, por exemplo, Boese et al., Mé-todos Enzymol 392:73-96 (2005).

O siRNA pode ser produzido usando técnicas padrão como des-crito em Hannon et al., Nature 418:244-251 (2002); McManus et al., Nat Re-views 3:737-747 (2002); Heasman et al., Dev Biol 243:209-214 (2002); Steinet al., J Clin Invest, 108:641 -644 (2001); e Zamore et al., Nat Struct Biol 8(9): 746-750 (2001 ). Os siRNAs preferidos são 5' fosforiladas.

Os inibidores de siRNA podem ser usados para alvejar, por e-xemplo, CS-GalNAcT-1 , CS-GalNAcT-2, GaINT-1 , Hs3st1 , Sox9, Agd ,Cspgi , ou Col2a1, ou outras moléculas listadas acima, como também subs-tratos ou ligantes.

Os ácidos nucléicos podem ser obtidos, isolados, e / ou purifica-dos a partir de seu ambiente natural, em forma substancialmente pura ouhomogênea. Sistemas para clonagem e expressão de um polipeptídeo emuma variedade de células hospedeiras diferentes são bem-conhecidos. Célu-las hospedeiras apropriadas incluem bactária, célula de mamíferos, levedu-ra, e sistemas de baculovírus. As linhas de células de mamíferos disponíveisna técnica para expressão de um peptídeo heterólogo incluem, por exemplo,células de ovário de hamster chinês, células HeLa, células de rim de hams-ter recém-nascido, células de melanoma de camundongo NSO e muitas ou-tras. Para outras células apropriadas para produzir proteínas de ácidos nu-cléico, vide Gene Expression Systems, Eds. Fernandez et al., AcademicPress (1999). As moléculas de RNAi podem ser quimicamente sintetizadasou expressas a partir de seqüências de DNA codificadas as seqüências desiRNA ou shRNA.

Para a produção de mutantes negativos dominantes das molécu-las listadas acima, podem ser escolhidos ou construídos vetores apropria-dos, contendo seqüências reguladoras apropriadas, incluindo seqüênciaspromotoras, seqüências terminadoras, seqüências de poliadenilação, se-qüências intensificadoras, genes de seleção ou marcadores e outras se-qüências como apropriado. Os vetores podem ser plasmídeos ou virais, porexemplo, bacteriófago, ou fagemídeo, como apropriado. Para detalhes adi-cionais vide, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sam-brook et al., 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Muitastécnicas e protocolos conhecidos para a manipulação de ácido nucléico, porexemplo, na preparação de construtos de ácido nucléico, mutagênese, se-qüenciamento, introdução de DNA em células e expressão de genes, e aná-lise de proteínas, são descritos com detalhes em Current Protocols in Mole-cular Biology, Eds. Ausubel et al., 2nd ed., John Wiley & Sons (1992).

Um ácido nucléico pode ser fundido a outras seqüências codifi-cando seqüências de polipeptídeos adicionais, por exemplo, seqüências quefuncionam como um marcador ou relator. Exemplos de genes marcadoresou relatores incluem lactamase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), ade-nosina de aminase (ADA), aminoglicosídeo fosfotransferase (responsávelpela resistência à neomicina (G418)), diidrofolato reductase (DHFR), higro-micin-B-fosfotransferase (HPH), timidina cinase (TK), IacZ (codificando -galactosidase), xantina guanina fosforibossiltransferase (XGPRT), luciferase.

Muitos outros são bem-conhecidos na técnica.

2. Inibicão da Atividade Enzimática

Em particular as modalidades da invenção, os métodos para tra-tamento de tendinopatia compreendem reduzir, inibir ou infra-regular a ativi-dade de enzimas envolvidas na biossíntese de proteoglicanos, tais comoaquelas envolvidas na adição de sulfato de condroitina de GAGs para agre-cano e / ou versicano. Essas enzimas incluem, por exemplo, CS-GalNAcT-1CS-GalNAcT-2, UDP-D-xilose: proteína de núcleo β-D-xilosiltransferase,Gal transferases, GIcA transferases, GIcNAc transferases, sulfotransferases,síntese de sulfato de condroitina, Hs3st1 , e GalNT-1.

Em uma modalidade exemplar, a invenção inclui métodos parareduzir, inibir ou infra-regular a atividade de CS-GalNAcT-1, CS-GaINAcT-2, GalNT-1, e / ou enzimas Hs3st1 em tendões danificados. Em outras mo-dalidades, a invenção inclui métodos para reduzir, inibir ou infra-regular aatividade de Xyl transferase, Gal transferase, GIcA transferase, GaINActransferase, GIcNAc transferase, sulfotransferase, ou sintase de sulfato decondroitina em tendões danificados. O peptídeo ou inibidores de moléculaspequenas descritos acima podem ser usados para praticar esses métodos.a) Identificar Inibidores de Atividade de Enzima

A invenção ainda compreende métodos de identificar e avaliar aeficácia de agentes que podem atuar como inibidores de CS-GalNAcT-1 ,CS-GalNAcT-2, GaINT-1 , Hs3st1 , Xyl transferase, Gal transferase, GIcAtransferase, GaINAc transferase, GIcNAc transferase, suIfotransferase, e/ousintase de sulfato de condroitina no tecido do tendão danificado.

Tais inibidores bloqueiam ou reduzem a atividade das enzimasenvolvidas na cartilagem ou formação de fibrocartilagem no tendão. Essesinibidores incluem substratos solúveis modificados, proteínas, moléculas pe-quenas, e ácidos nucléicos.

Os métodos de identificação de um agente para tratar tendinopa-tia envolvem ensaiar o efeito de cada agente individual na atividade da en-zima, interação da proteína alvo, ou interação proteína-proteína das enzimaslistadas acima. Vários ensaios in vivo ou in vitro podem ser usados paradeterminar a eficácia de um inibidor para tratar a tendinopatia. Em uma mo-dalidade exemplar, as moléculas pequenas são avaliadas in vitro por suautilidade terapêutica potencial ensaiando sua capacidade de afetar, por e-xemplo, a atividade da enzima, ligação alvo ou interações proteína-proteínadas enzimas listadas acima através de um método do tipo rastreamento deprodutividade operacional alta (HTS).

Em um ensaio de HTS típico, o efeito inibidor de um compostocandidato, por exemplo, na atividade da enzima, ligação ligante-receptor eos similares, pode ser medido pela comparação do ponto final do ensaio napresença de uma concentração conhecida do candidato para uma referênciaque é realizada na ausência do candidato, e / ou na presença de um inibidorcomposto conhecido. Geralmente, moléculas de corante convencional, fluo-rescentes ou radioativas são usadas para monitorar o efeito do candidatocomposto. Dessa maneira, por exemplo, um candidato composto pode seridentificado que inibe a ligação de um Iigante e seu receptor, ou que inibe aatividade da enzima, diminuindo a renovação do processo enzimático.Uma modalidade exemplar da presente invenção provê um mé-todo in vitro de identificação de um agente para tratar a tendinopatia com-preendendo: (1) prover uma amostra de pelo menos um componente da a-mostra selecionado do grupo que consiste em CS-GalNAcT-1, CS-GalNAcT-2, GaINT-1, e Hs3st1; (2) combinar o componente de amostracom pelo menos um agente de teste; (3) medir a atividade do componentede amostra em resposta ao agente de teste; e (4) determinar se o agente deteste inibe a atividade do componente de amostra.

Em uma modalidade exemplar, um método in vitro de identifica-ção de um agente para tratar tendinopatia envolve tratar um explante de car-tilagem, uma cultura de pélete de condrócito primário, ou um linha de célulasde condrócito com uma proteína BMP-2 ou um adenovírus, expressandouma proteína BMP-2. A BMP-2 estimula ECM e a síntese de GAG. Um com-posto de teste é depois adicionado à cultura e o efeito do inibidor sobre asíntese de GAG é avaliada por mensuração de incorporação 35S nas cadei-as laterais de GAG e/ou através do ensaio de DMMB. O efeito do compostode teste será comparado aos controles do veículo apropriado.

Um ensaio in vivo de um inibidor de enzima potencial podecompreender: (1) administrar um inibidor de teste repetidamente para ummamífero (por exemplo, um rato Sprague-Dawley) durante um período depelo menos 2, 4, 6, ou 8 semanas; (2) submeter um mamífero a um protoco-lo de corrida em declive a 17 m/min durante 1 h/dia, 5 dias/semana (Exem-plo 1); e (3) determinar o efeito do inibidor sobre o tendão superespinhal porensaio de DMMB ou AB ou através do traçado do perfil de expressão de ge-ne, em que uma diminuição da degeneração do tendão (por exemplo, anor-malidades celulares e morfológicas) é considerada para ser atribuída ao ini-bidor, e indica que o inibidor é eficaz para tratamento de um distúrbio dege-nerativo do tendão.

Deverá ficar entendido que um inibidor de teste útil nos métodosda invenção pode ser avaliado em um ou mais modelos animais de distúr-bios degenerativos de tendão e/ou em seres humanos.

Vários ensaios para a atividade de mensuração da enzima napresença de um inibidor in vivo e in vitro são conhecidos na técnica. E-xemplos de alguns do ensaios usados mais freqüentemente incluem espec-trofotometria, espectrofluorimetria, dicroismo circular, procedimentos espec-trofotométrico e espectrofiuorimétricos automático, ensaios acoplados, titula-ção automática de ácido ou base, procedimentos radioativos, deteção ópticalivre de marcas, e ensaio de inibição de enzima. Em modalidades exempla-res, a atividade da enzima de CS-GalNAcT-1 e/ou CSGalNAcT-2 é medidacomo descrito em Uyama et al., J Biol Chem 277(11):8841 -46 (2002). Emoutra modalidade exemplar, a atividade da enzima de GalNT-1 é medidacomo descrito em White et al., J Biol Chem 270 (41 ):24156-65 (1995).

Inibidores de enzima úteis nos métodos da invenção, por exem-plo, podem interagir com as enzimas que eles inibem. Alternativamente, ini-bidores podem interagir com um substrato de enzima (tal como GalNAc) ououtros parceiros de ligação, por exemplo. Inibidores podem reduzir ou e po-dem ser eficazes na invenção se eles bloquearem a ligação da enzima paraseu substrato e/ou se eles bloquearem a atividade do substrato depois daligação da enzima. Inibidores, naturalmente, podem interagir com a enzima eum segundo fator, tal como seu substrato. A este repeito, os inibidores CS-GaINAcT-1 , CS-GalNAcT-2, GaINT-1 , e/ou Hs3st1 incluem, por exemplo,substratos solúveis modificados, outras proteínas (incluindo aquelas que seligam à enzima e / ou um subtrato de enzima), formas modificadas da enzi-ma ou fragmentos das mesmas, propeptídeos, peptídeos, e miméticos detodos esses inibidores.

Um inibidor de enzima pode, por exemplo, ser um inibidor diretode enzima; fazer a ligação para, e neutralizar a atividade da enzima; diminuiros niveis de expressão de enzima; afetar a estabilidade ou conversão damolécula precursora para a forma ativa, madura; interferir na ligação da en-zima para um ou mais de seus substratos; ou pode interferir nas funçõesintracelulares da enzima.

3. Inibicão da Atividade do Fator de TranscriçãoInibidores de fatores de transcrição úteis nos métodos da inven-ção podem inibir ou reduzir a atividade dos fatores diretamente através deligação, ou indiretamente ao interferir nas suas interações proteína-proteínae/ou propriedades de ligação. A esse respeito, inibidores de Sox9 podemincluir Iigantes solúveis modificados ou moléculas alvo, moléculas pequenase ácidos nucléicos.

Ensaios para medir a atividade de Sox9 na presença de um ini-bidor in vivo e in vitro são conhecidos na técnica. Exemplos de alguns dosensaios mais freqüentemente usados para inibidores de Sox9 incluem o sis-tema bihibrído de levedura, gene de repórter de luciferase; ensaios de PCRpara determinar os níveis de expressão de genes específicos de condrócito(por exemplo, Col2a1, Agd ) na presença de um inibidor de Sox9, análisede western blot de Sox9 ou genes específicos de condrócito, transfecçãotransiente, ensaios de acetiltransferase de cloranfenicol (CAT) e análies denorthern-blot.

Vários ensaios de interação proteína-proteína ou proteína-ácidonucléico, baseados na transferência de energia de ressonância de f Iuores-cência (FRET), podem ser utilizados para ensaiar os efeitos de inibidoressobre as interações de Sox9 com seus parceiros de ligação. Por exemplo,um pode usar o ensaio homogêneo de proximidade de luminescência ampli-ada AlphaScreen™ (de PerkinElmer®) ou Trasferência de Energia de Res-sonância de Bioluminescência (BRET™ de PerkinElmer®) que pode ser em-pregado para realizar um ensaio in vitro para inibidores que interferem nasinterações de ligação de Sox9.

Em uma modalidade, a presente invenção provê um método pa-ra um ensaio in vitro a fim de identificar um agente para tratar a tendinopatiaque compreende: (1) prover uma molécula alvo listada acima fundida a umamolécula fluorogênica doadora; combinar a molécula alvo com um agente deteste; (3) adicionar o parceiro de ligação da molécula alvo fundido a umamolécula fluorescente receptora; (4) medir os niveis de transferência de e-nergia de fluorescência entre a molécula alvo e seu parceiro de ligação; e (5)determinar se o agente de teste inibe a interação da molécula alvo com seuparceiro de ligação.

Um inibidor pode interferir na ligação de uma molécula alvo paraseu parceiro de ligação e subseqüentemente afetar os níveis de FRET entreos dois. Por conseguinte, as mensurações de FRET podem ser usadas paraidentificar inibidores de eficiência diversa. Uma vez identificado in vitro uminibidor de uma molécula alvo, um teste in vivo adicional pode ser realizadopara determinar a eficácia e aplicabilidade do inibidor para prevenir a forma-ção de cartilagem e fibrocartilagem no tendão.

4. Inibicão de Expressão de Proteína

Em outra modalidade, os métodos para tratar tendinopatia com-preendem reduzir, inibir ou infra-regular a expressão e/ou acumulação degenes tais como CS-GalNAcT-1, CS-GalNAcT-2, GalNT-1, Hs3st1, Col2a1,Cspgi, Agcl e/ou Sox9, e seus polipeptídeos ou proteínas codificadas. Com-posições úteis para inibir a expressão desses genes incluem, por exemplo,moléculas que interferem no RNA, que estão descrita na Seção N(B)(1)(c)acima.

Esses inibidores podem ser administrados de qualquer maneira,porém em modalidades particulares, o DNA que expressa um inibidor deRNAi é incorporado em um vetor de adenovírus, que é depois injetado emum paciente com necessidade de reparo do tendão. Em modalidades exem-plares, a seqüência de nucleotídeos codificando o RNAi é posicionada a ajusante de um promotor polll, como descrito em Wahdwa et al., Curr OpinMol Ther 6(4):367-72 (2004). Métodos para inserir siRNA e shRNA em veto-res de adenovírus são bem-conhecidos na técnica e estão descritos, por e-xemplo, em Krom et al., BMC Biotech 6(11):[e-published ahead of print]. Al-ternativamente, o inibidor de RNAi é injetado diretamente no tecido do ten-dão Iesionado e transportado em células através de electroporação, comodescrito em Schiffelers et al., Arthritis & Rheumatism 52(4):1314-18 (2005).

5. Condições para Tendinopatia

Os métodos da invenção podem ser usados para tratar ou pre-venir uma tendinopatia em qualquer mamífero com necessidade de tal tra-tamento, incluindo seres humanos, primatas, macacos, roedores, carneiros,coelhos, cães, porcos da índia, cavalos, vacas e gatos. Os distúrbios quepodem ser tratados ou prevenidos incluem, por exemplo, tendinite, tendonite,tendinose, paratendinite, tenocinovite, lesões por superuso do tendão, trau-ma de tendão, perintendinite, paratenonite, e quaisquer outras condições dafamília de condições de "tendinopatia".

A tendinopatia pode ser causada por superuso e movimentosrepetidos, uma lesão súbita (variando de benigna até grave), uma degenera-ção gradual ou por envelhecimento. A maioria das lesões de tendão consisteem uma série de microrrompimentos de cura lenta (tendinose) que enfra-quecem o tendão, muitas vezes causando dor, rigidez e perda da resistên-cia. As tendinopatias usualmente requerem diversas semanas de tratamen-to, atividade reduzida ou modificada, e repouso. Voltar a usar o tendão Iesi-onado muito cedo pode provocar mais dano no tendão, tornando o tendãoIesionado mais suscetível a rompimentos ou rupturas. Da mesma maneira,os distúrbios tratados ou prevenidos pela presente invenção incluem distúr-bios degenerativos, tanto agudos como crônicos, que são associados aosuperuso, lesões e traumas relacionados a esporte ou acidente, deficiênciasnutricionais e idade avançada.

Um exemplo de tendinopatia é a epicondilite lateral, também co-nhecida como "cotovelo de tenista," um distúrbio ortopédico e bem-conhecido da medicina esportiva. Uma patologia que é subjacente ao distúr-bio está relacionada ao superuso e microrompimento de um tendão carpiradialis brevis do extensor do cotovelo. O corpo tenta reparar esses micror-rompimentos mas em muitos casos o processo de cura é incompleto. Espé-cies patológicas de pacientes que se submetem a cirurgia devido a epicondi-lite lateral crônica revelam uma displasia angiofibroblástica desorganizadano tendão danificado. Essa tentativa de reparo incompleta resulta em tecidodegenerado, imaturo e vascularizado. O tecido reparado de maneira incom-pleta é mais fraco do que o tecido do tendão normal e não tem força parafuncionar normalmente. Esse tecido enfraquecido também limita o pacientepor devido causar dor e impactar negativamente a qualidade de vida. Reparoincompleto similar pode estar presente em outros tipos de tendão relaciona-dos a lesões ou danos, tais como tendinite patelar (Joelho de Jumper), ten-dão de Aquiles (comum em corredores), e tendinite de manguito rotator (co-mumente vista em atletas "aéreos" tais como arremessadores de beisebal).

A tendinopatia pode também ser causada, por exemplo, por ida-de avançada, dieta deficiente, atividades eportivas, trauma, lesões, ou fár-macos tais como pefloxacina. Por exemplo, a tendinopatia induzida por pros-taglandina E1 (PGE1)-, prostaglandina E2 (PGE2)- ou pefloxacina é um mo-delo animal bem-estabelecido de tendinopatia de ser humano. Em uma mo-dalidade, a invenção provê métodos para tratar ou prevenir a tendinopatiainduzida por fármacos tais como a tendinopatia induzida por pefloxacina emum indivíduo. Em outras modalidades exemplares, a invenção provê méto-dos para tratar ou prevenir a tendinopatia induzida por lesões e traumas re-lacionados ao superuso, esporte ou acidente, deficiências nutricionais e ida-de avançada.

A presente invenção ainda provê métodos para tratar ou prevenirdistúrbio degenerativo do tendão, lenta deterioração do tendão, restaurar aqualidade do tendão, manter a saúde do tendão, tratar ou prevenir a degene-ração hipóxica dos tecidos do tendão, tratar ou prevenir a degeneração hiali-na dos tecidos do tendão, tratar ou prevenir a degeneração mucóide ou mi-xóide dos tecidos do tendão, tratar ou prevenir a degeneração fibrinóide dostecidos do tendão, tratar ou prevenir a degeneração lipóide dos tecidos dotendão, tratar ou prevenir a calcificação de tecidos do tendão, tratar ou pre-venir a fibrocartilaginose e metaplasia óssea de tecidos do tendão, manter aintegridade microestrutural do tendão, manter a estrutura da fibra do tendão,manter a disposição da fibra no tendão, manter a vascularização normal dotendão, manter a celularidade normal em tecidos do tendão, restaurar o con-teúdo ECM normal em tecidos do tendão, reduzir a acumulação patológicade GAG no tecido do tendão; e/ou manter a massa do tendão, a resistênciade tração e/ou a qualidade da flexibilidade através da administração para ummamífero de um inibidor da atividade e/ou expressão de moléculas tais co-mo CS-GaINAcT-1 , CS-GalNAcT-2, GaINT-1 , Xyl transferase, Gal transfe-rase, GIcA transferase, GaINAc transferase, GIcNAc transferase, sulfotrans-ferase, sintase de sulfato de condroitina, Col2a1 , agrecano, versicano,Hs3st1 , e/ou Sox9 em uma quantidade eficaz para prevenir ou reduzir a ati-vidade e/ou expressão de tais moléculas em tecidos tendinopáticos.

6. Avaliação de Tratamento e Modelos Animais

Os métodos da invenção podem ser usados para tratar tendino-patia ou microdefeitos em tecidos do tendão. A qualidade do tendão em se-guida ou durante um tratamento pode ser determinada, por exemplo, asses-sando a integridade microestrutural do tendão, imaculabilidade do colágenodo tendão, variação na celularidade do tecido do tendão, vascularização detendão, e/ou conteúdo de GAG. Métodos para avaliação da saúde do tendãoem seguida ou durante um tratamento são conhecidos na técnica e incluem,mas não estão limitados a, imagem de ressonância magnética (MRI), ultras-sonografia, e avaliações de dor e/ou funcional. Alternativamente, a saúde dotendão pode ser medida pela avaliação dos níveis de GAG no tecido do tendão.

Um ensaio para determinar o conteúdo de GAG do tendão é oensaio de azul de 1 ,9- dimetilmetileno (DMMB) para a mensuração de con-centrações de glicosaminoglicano sulfatado (GAG) no tendão. Outro ensaiopara determinar o conteúdo de GAG do tendão é a tintura de azul Alcian his-tológico (AB) que pode ser usada para detectar o aumento da quantidade deGAG nos tecidos do tendão.

III. Métodos de Tratamento e Composições Farmacêuticas

Inibidores úteis nos métodos da invenção podem ser administra-dos localmente ou sistemicamente através de meio tópico, oral, intravenoso,intraperitoneal, intramuscular, intracavidade, subcutâneo, implante, ou trans-dérmico.

Em modalidades exemplares, a administração de um inibidorpara um indivíduo pode também ser realizada por meio de terapia de genes,em que uma seqüência de ácido nucléico codificando o inibidor é adminis-trada para o paciente in vivo. Em uma modalidade exemplar, um ácido nu-cléico compreendendo uma seqüência promotora e uma seqüência codifi-cando um inibidor de ácido nucléico útil nos métodos da invenção, é inseridoem um vetor de expressão de adenovírus. O adenovírus é depois injetadodiretamente no tendão de um paciente, onde o inibidor de ácido nucléico éexpresso. Exemplos de distribuição, mediada por adenovírus, de ácidos nu-cléicos para o tecido do tendão são descritos, por exemplo, em Mehta et al.,J Hand Surg 30A(1): 136-41 (2005); Lou et al., J Orthoped Res 19:1199-1202(2001), e Lou, Clin Orthopaed Rel Res 379S:S252- 55 (2000).

Em outras modalidades exemplares, o inibidor de ácido nucléicoé incorporado em outros vetores de expressão viral, tais como, por exemplo,lentivírus, herpesvírus, e adeno-associados-vírus. O vetor apropriado podeser escolhido pela avaliação da infectividade in vitro de cada tipo de vírusem células primárias do tendão.

Alternativamente, um inibidor de ácido nucléico é injetado notecido do tendão diretamente, e transferido para as células por electropora-ção, como descrito em Schiffelers et al., Arthritis & Rheumatism 52(4):1314-18 (2005).

Em outras modalidades exemplares, inibidores de peptídeos oude molécula pequena úteis nos métodos da invenção podem ser revestidosem placas transdérmicas e aplicados diretamente na pele cobrindo o tecidodo tendão, como descrito em Paoloni et al., J Bone Joint Surg 86A(5):916-22(2004).

Métodos de administração de moléculas para o tratamento detendinopatia são conhecidos na técnica. A "Administração" não está limitadaa qualquer sistema de distribuição particular e pode incluir, sem limitação,parenteral (incluindo injeção subcutânea, intravenosa, intramedular, intrarti-cular, intramuscular, intracavidade, ou intraperitoneal) retal, tópica, trans-dérmica, ou oral (por exemplo, em cápsulas, suspensões, ou comprimidos).A administração para um indivíduo pode ocorrer localmente ou sistemica-mente em uma dose única ou em administrações repetidas contínuas ouintermitentes, e em qualquer uma dentre uma variedade de formas de salaceitáveis fisiologicamente, e/ou com um veículo farmacêutico aceitável e/ouaditivo como parte de uma composição farmacêutica (descrita antes). For-mas de sal aceitáveis fisiologicamente e técnicas e excipientes de formula-ção farmacêutica padrão são bem-conhecidos das pessoas versadas natécnica. Vide, por exemplo, Physicians' Desk Reference (PDR) 2003, 57thed., Medicai Economics Company, 2002; e Remington: The Science andPractice of Pharmacy, eds. Gennado et al., 20th ed, Lippincott1 Williams &Wilkins1 2000).

Inibidores úteis nos métodos da invenção podem ser administra-dos em uma dosagem de cerca de 1 pg/kg a cerca de 20 mg/kg, dependen-do da gravidade dos sintomas e do progresso da doença. A dose eficaz a-propriada é selecionada através de tratamento clínico a partir das seguintesvariações: cerca de 1 pg/kg a cerca de 20 mg/kg, cerca de 1 pg/kg a cercade 10 mg/kg, cerca de 1 pg/kg a cerca de 1 mg/kg, cerca de 10 pg/kg a cer-ca de 1 mg/kg, cerca de 10 pg/kg a cerca de 100 pg/kg, cerca de 100 pg acerca de 1 mg/kg, e cerca de 500 pg/kg a cerca de 1 mg/kg, por exemplo.

Em outra modalidade exemplar, um inibidor é administrado repe-tidamente por um período de pelo menos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 20, ou 40 sema-nas ou por pelo menos 1 , 1,5, ou 2 anos ou até o tempo de vida do sujeitocomo, por exemplo, para o tratamento de tendinopatia. Em outra modalidadeda invenção, um inibidor pode ser administrado em uma dose única, por e-xemplo para estimulatar a restauração da estrutura e composição normaisdo tendão.

Geralmente, inibidores úteis nos métodos da invenção podemser administrados em uma dose entre 10-8 e 10-7; 10-7 e 10-6; 10-6 e 10-5;ou 10-5 e 10-4 g/kg. Dosagens terapeuticamente eficazes alcançadas emum modelo animal podem ser convertidas para uso em outro animal, incluin-do seres humanos, usando fatores de conversão conhecidos na técnica. Vi-de, por exemplo, Freireich et al., Câncer Chemother Reports 50(4):219-244(1966).

A dosagem exata de um inibidor para ser usada nos métodos dainvenção é determinada empiricamente com base no(s) resultado(s) deseja-do^). Resultados exemplares incluem: (1) o distúrbio degenerativo do ten-dão é tratado ou prevenido; (2) a deterioração do tendão é diminuída; (3) aqualidade do tendão é restaurada; (4) a saúde do tendão é mantida; (5) adegeneração hipóxica do tendão é tratada ou prevenida; (6) a degeneraçãohialina do tendão é tratada ou prevenida; (7) a degeneração mucóide ou mi-xióide do tendão é tratada ou prevenida; (8) a degeneração fibrinóide dotendão é tratada ou prevenida; (9) a degeneração lipóide do tendão é tratadaou prevenida; (10) a calcificação do tendão é tratada ou prevenida; (11) ametaplasia fibrocartilaginosa e óssea do tendão é tratada ou prevenida; (12)a estrutura da fibra do tendão é mantida; (13) a disposição das fibras no ten-dão é mantida; (14) a vascularidade normal do tendão é mantida; (15) a ce-Iularidade normal do tendão é mantida; (16) o contéudo ECM normal do ten-dão é restaurado; e/ou (17) a qualidade de massa, resistência à tração e/ouflexibilidade do tendão é mantida. Por exemplo, um inibidor é administradoem uma quantidade eficaz para diminuir a deterioração do tendão (por e-xemplo, perda de massa do tendão, formação estrutural e/ou susceptibilida-de a microrrompimentos e dor) por pelo menos 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300,400, ou 500%.

Em algumas modalidades, as composições usadas nos métodosda invenção ainda compreendem um excipiente farmaceuticamente aceitá-vel. Como usado aqui a seguir, a frase "excipiente farmaceuticamente acei-tável" refere-se a qualquer um ou todos os solventes, meios de dispersão,revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos ede retardo da absorção, e os similares, que são compatíveis com a adminis-tração farmacêutica. O uso de tais meios e agentes para substâncias farma-ceuticamente ativas são bem-conhecidos na técnica. As composições po-dem também conter outros compostos ativos que provêm funções suplemen-tares, adicionais ou terapêuticas aumentadas. As composições farmacêuti-cas podem também ser incluídas em um recipiente, compressa, ou dispen-sador, junto com as instruções para administração.

Uma composição farmacêutica para ser administrada em conjun-to com os métodos da invenção deverá ser formulada para ser compatívelcom suas vias de administração pretendidas. Exemplos de tais formulaçõesincluem formulações de proteína cristalina, provida só ou em combinaçãocom polímeros biodegradáveis (por exemplo, PEG, PLGA).

Um inibidor útil nos métodos da invenção pode ser administradocomo uma composição farmacêutica em conjunto com géis e matrizes deveículo ou outras composições usadas para a regeneração de osso orienta-da, e / ou substituição do osso. Exemplos de tais matrizes incluem polietilenoglicol sintético (PEG), hidroxiapatita, matrizes de colágeno e baseadas emfibrina, goma de fibrina Tisseel® etc.

Em certas modalidades os inibidores podem ser administradosem combinação ou concomitantemente com outros compostos terapêuticos,tais como, por exemplo, NSAIDs, corticosteróides, oxido nítrico, testostero-na, estrógeno, fatores de crescimento (por exemplo, BMP-12, BMP-13, eMP52).

Inibidores úteis nos métodos da invenção podem ser revestidossobre, ou incorporados nos implantes de tendão, matrizes, e sistemas dedepósito de modo a promover o tratamento ou a prevenção de lesões detendão.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Tendão Supra-espinhal de Rato Expressa Formadores de Carti-Lagem Com Superuso

A resposta do tendão supra-espinhal do rato ao superuso foi es-tudada a nível molecular usando perfis transcricionais. Um modelo de tendãode rato de superuso foi anteriormente descrito, Soslowsky et al., J ShoulderElbow Surg 9:79-84 (2000). Foi mostrado que formadores angiogênicos einflamatórios são alterados nesse modelo (Perry et al., J Shoulder ElbowSurg 14:79S-83S (2005)), porém uma abordagem mais ampla foi empreen-dida para compreender os eventos em torno da lesão por superuso.

Vinte e quatro ratos machos Sprague-Dawley (400-450 g) foramsubmetidos a um protocolo de superuso do tendão supra-espinhal (SST)1 por1 semana (n=8), 2 semanas (n=8), e 4 semanas (n=8). O protocolo consisteno funcionamento em declive (10% de graus) a 17 m/min por 1 hora/dia, 5dias/semana. Um adicional de seis ratos foi usado como controles de ativi-dade em gaiola (0 hora). Em cada ponto do tempo, dois ratos adicionais, quenão corriam, foram usados para controles de bando combinados por idade.

Na necropsia, os tendões supra-espinhais de cada ombro e ostendões patelares (PT) de cada joelho foram removidos. O tendão patelarserviu como um controle interno do efeito do exercício, porque ele não mos-trou sinais grosseiros de superuso com este protocolo. Os tendões colhidosforam pesados e congelados instantaneamento em nitrogênio líquido. Ostecidos foram congelados-fraturados e extraídos com o reagente TRIzoI (In-vitrogen). O RNA foi isolado da fase aquosa do extrato usando um kit RNe-asy (QIAGEN). As concentrações de RNA foram determinadas usando umespectrofotômetro. O perfil transcricional para monitorar o nível de expres-são de mais de 30.000 transcritos foi realizado com uma rede de 230 2,0genomas de rato Affymetrix. Todas as imagens da rede foram visualmenteinspecionadas para verificar defeitos e qualidade. Redes com altos antece-dentes, intensidade de sinal baixa ou maiores defeitos foram eliminadas deanálises adicionais. Os valores de sinal foram determinados usando GeneChip Operating System 1,0 (GCOS, Affymetrix). Para cada rede, os valoresestatísticos foram normalizados para um valor de intensidade de sinal médiode 100. Os valores estatísticos do GCOS foram usados para todas as análi-ses. Um gene era considerado detectável se a expressão do meio em qual-quer tecido fosse maior do que 100 unidades de sinal, e a percentagem deamostras com uma chamada Presente (P) como determinado pelos ajustesde padrão de GCOS foi maior ou igual a 66%. Valores de sinal normalizadosforam transformados para base de Iog 10. Um gene era considerado comosendo diferencialmente expresso se o valor de ρ de um teste de ANOVAfosse <0,01 e a diferença entre corrida e controle, pelo menos 2 vezes emqualquer ponto de tempo.

Mais de 400 genes foram diferencialmente regulados no tendãosupra-espinhal depois do superuso. Por 4 semanas de corrida 107 genesforam supra-regulados e 27 genes foram infra-regulados. Do topo de genessupra-regulados, muitos são altamente expressos em tecidos de cartilagem,incluindo colágeno tipo Il alfa 1, versicano, e agrecano. Esses resultadossugerem que o tendão superusado foi convertido em um fenótipo de fibrocar-tilagem. Esses mesmos genes não foram supra-regulados nos tendões pate-Iares dos animais que estavam correndo (vide figuras 1-7).Exemplo 2: Preparação de Inibidor de siRNA,

Um siRNA é selecionado introduzindo a seqüência de nucleotí-deos em CS- GaINAcT-1, GaINT-1, ou Hs3st1 em um "website" comercialpara projetar siRNAs específicos (por exemplo sirnawizard.com ou Ambion®siRNA Target Finder). As diretrizes para seleção de seqüências estão embu-tidas nessas ferramentas.

A eficácia do siRNA é medida ao transfectá-la para dentro decélulas de condrócitos C- 20/A4 e/ou C-28/I2 e monitorando a expressão deCS- GalNAcT-1 e/ou GaINT-1 em tempo real RT-PCR. A mistura apropriadade siRNA com a mesma composição de nucleotídeo é usada em controleexperimental.

Exemplo 3: Sistema de Ensaio In vitro para Inibidor de Síntese de Proteoglicano

Se o siRNA é capaz de reduzir a expressão de CS-GalNAcT-1,GaINT-1, ou Hs3st1 nas células de condrócitos C-20/A4 e/ou C-28/I2, suacapacidade de reduzir a produção de cadeias laterais de GAG de proteogli-cano é depois testada. As células de condrócitos C- 20/A4 e / ou C-28/I2 sãotratadas com a proteína BMP-2 ou um adenovírus expressando BMP-2 paraestimular a matriz extracelular e a síntese de GAG. O siRNA ou, alternativa-mente, a molécula pequena inibidora de síntese de GAG, é adicionada paraa cultura, e o efeito do inibidor é avaliado por comparar 35S incorporaçõesem proteoglicanos na presença ou ausência do inibidor. Alternativamente, oefeito do inibidor é avaliado por comparar os níveis de GAG na presença ouausência do inibidor com o ensaio DMMB, como descrito em Arai et al., Os-teoarthritis and Cartilagem 12:599-613 (2004).

Exemplo 4: Protocolo para Tratamento de Tendinopatia por Inibição de siR-NA de CS-GaINAcT-1, GaINT-1, ou Hs3st1

A tendinopatia é induzida em ratos ou com um protocolo de su-peruso exaustivo (Exemplo 1) ou injeção local de PGE1, PGE2 ou Pefloxa-cina (300 mg/ml), cinco vezes por semana durante 1 semana.

Uma vez descoberto um siRNA para reduzir a atividade de CS-GalNAcT-1, GalNT-1, ou Hs3st1 in vitro, ele é convertido «m shRNA e aseqüência de shRNA é clonada e inserida em um adenovírus, como descrito,por exemplo, em Krom et al., BMC Biotech 6(11):[e-pubiished]. O adenovírusé usado para a expressão in vivo do shRNA e inibição subseqüente da ex-pressão de CS-GaINAcT-1 e / ou GalNT-1. Os métodos de infecção são oti-mizados em células de tendão primárias.

O adenovírus funcional que expressa o shRNA é diretamenteinjetado no tendão Iesionado (Mehta et al., J Hand Surg 30A(1): 136-41(2005)) para localmente reduzir a expressão dos genes CS-GalNAcT-1 e/ouGaINT- 1. As seqüências de misturas são incluídas como controles experi- mentais. A quantidade de formação de tecido de cartilagem nos tendões éavaliada por níveis de avaliação de GAG. A tintura Azul Histológica Alciana éusada para detectar quantidades aumentadas de glicosaminoglicano (GAG)no tecido do tendão. O reagente DMMB é usado para quantificar a quantida-de e GAGs sulfatados extraídos do tendão.

Avaliações in vivo do efeito da inibição de CS-GalNAcT-1 e/ouGaiNT-1 em tendinopatia são determinadas por histologia e teste mecânicoou funcional da resistência do tendão. Um inibidor é considerado eficaz seos níveis de GAG são significativamente reduzidos quando comparados comcontroles não tratados e / ou são reduzidos para níveis similares até nor-mais, no tendão danificado. Alternativamente, um inibidor é considerado efi-caz se os testes funcionais ou mecânicos demonstram função melhoradae/ou redução da dor, quando comparado com controles que não foram tratados.

Claims (42)

1. Método de tratar tendinopatia em um paciente compreenden-do reduzir a formação de proteoglicanos específicos de cartilagem no tecidodo tendão do paciente.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o paciente éum ser humano.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o paciente éselecionado do grupo que consiste em primatas, macacos, roedores, carnei-ros, coelhos, cães, porquinhos-da-índia, cavalos, vacas e gatos.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo re-duzir a atividade de uma enzima envolvida na síntese de um proteoglicanoselcionado do grupo que consiste em agrecano, versicano, e sindecano-3 notecido do tendão do paciente.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo re-duzir a atividade do sulfato de condroitina N-acetilgalactosaminiltransferase1 (CS-GalNAcT-1) e / ou polipeptídeo de galactosamina N-acetilgalactosa-miniltransferase 1 (GalNT-1) no tecido do tendão do paciente.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a atividade éreduzida por inibir a atividade enzimática de CS-GalNAcT-1, CS-GalNAcT-2,Hs3st1, e/ou GalNT-1.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a atividade éreduzida por inibir a expressão dos genes de CS-GalNAcT-1, CS-GalNAcT-2,Hs3st1, e/ou GaINT-1.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo re-duzir a atividade de um fator de transcrição envolvido na produção de carti-lagem.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, compreendendo re-duzir a atividade de Sox9.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a atividadeé reduzida por inibir a capacidade de Sox9 para aumentar a expressão degenes específicos da cartilagem.

11. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a atividadeé reduzida pela inibição da expressão do gene Sox9.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoreduzir a expressão de proteínas específicas da cartilagem.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, compreendendoreduzir a expressão de um proteoglicano selcionado do grupo que consisteem agrecano, versicano, e sindecano-3.

14. Método de acordo com a reivindicação 12, compreendendoreduzir a expressão de Col2a1.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a tendino-patia é tendinite.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a tendino-patia é tendinose.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a tendino-patia é uma lesão do tendão.

18. Método de tratar tendinopatia em um paciente compreen-dendo administrar um inibidor de CS-GalNAcT-1, CS-GalNAcT-2, GalNT-1,Hs3st1, e/ou Sox9 para o tecido do tendão em um paciente.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o inibidorreduz a atividade enzimática de CS-GalNAcT-1 e/ou GalNT-1.

20. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o inibidorreduz a expressão de CS-GaINAcT-1 e/ou GalNT-1.

21. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o inibidoré administrado localmente.

22. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o inibidorcompreende a interferência de uma molécula de RNA.

23. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o inibidorcompreende uma molécula pequena.

24. Método de tratar tendinopatia em um paciente compreen-dendo reduzir a expressão de proteínas específicas da cartilagem no tecidodo tensão do paciente.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, compreendendoinibir a expressão de agrecano, versicano, e / ou colágeno tipo II.

26. Método de acordo com a reivindicação 24, compreendendoinibir a expressão de Sox9.

27. Método de acordo com a reivindicação 24, compreendendoinibir a atividade de Sox9.

28. Método para identificar um agente para tratar tendinopatiacompreendendo administrar um agente de teste para um sujeito com neces-sidade de tratamento, e mensuração da capacidade do agente para inibir aatividade de uma enzima envolvida na biossíntese de glicoglicosaminoglica-nos (GAGs) em tecido de tendão.

29. Método de identificar um composto útil no tratamento de ten-dinopatia compreendendo administrar um composto de teste para um sujeitocom necessidade de tratamento e mensuração da capacidade do compostopara inibir a atividade de uma enzima envolvida na síntese de glicoglicosa-minoglicanos em tecido de tendão.

30. Método de acordo com a reivindicação 29 compreendendoadicionalmente as etapas de(a) prover pelo menos um componente de amostra selcionadodo grupo que consiste em CS-GalNAcT-1, CS-GalNAct-2, sulfato de hepari-na (glucosamina) 3-O-sulfotransferase 1, GalNT-1, e Sox9;(b) combinar a amostra com um composto de teste;(c) medir a atividade do componente de amostra em resposta aocomposto de teste; e(d) determinar se o composto de teste inibe a atividade do com-ponente de amostra.

31. Uso de um composto que reduz a formação de proteoglica-nos específicos da cartilagem na fabricação de um medicamento para tratartendinopatia.

32. Uso de acordo com a reivindicação 31, em que o compostoreduz a atividade de uma enzima, ou outra proteína, envolvida na síntese dacartilagem.

33. Uso de acordo com a reivindicação 32, em que o compostodireta ou indiretamente inibe a função da enzima ou proteína.

34. Uso de acordo com a reivindicação 32 ou 33, em que o com-posto inibe a expressão da enzima ou proteína.

35. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a-34, em que a enzima é selecionada do grupo que consiste em UDP-D-xilose:proteína de núcleo β-D- xilosiltransferases, Gal transferases, GIcA transfera-ses, GIcNAc transferases, sulfotransferases, sintase de sulfato de condroiti-na e sulfotransferases de sulfato de heparina.

36. Uso de acordo com a reivindicação 35, em que a enzima éselecionada do grupo que consiste em sulfato de condroitina N-acetilgalacto-saminiltransferase 1 (CS-Gal NAcT-1), sulfato de condroitina N-acetilgalacto-saminiltransferase 2 (CS- GalNAcT-2), polipeptídeo de galactosamina N-ace-tilgalactosaminiltransferase 1 (GalNAcT-1), e sulfato de heparina (glucosa-mina) 3-O-sulfotransferase 1 (Hs3st1).

37. Uso de acordo com a reivindicação 31, em que o compostoreduz a expressão de uma proteína estrutural específica da cartilagem.

38. Uso de acordo com a reivindicação 31, em que o compostoreduz a atividade de fatores de transcrição envolvidos na expressão da pro-teína estrutural específica da cartilagem.

39. Uso de acordo com a reivindicação 38, em que o fator detranscrição é Sox9.

40. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a-39, em que o proteoglicano é selecionado do grupo consistindo de agrecano,versicano, sindecano-3, e colágeno tipo II.

41. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a-40, em que a tendinopatia é selecionada do grupo consistindo em tendonite,tendinite, tendinose, paratendinite, tenossinovite, lesão de tendão, trauma detendão, perintendinite, e paratenonite.

42. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a-41, em que o medicamento que é administrado para um paciente é selecio-nado do grupo que consiste em primatas, macacos, roedores, carneiros,coelhos, cães, porquinhos-da-índia, cavalos, vacas e gatos.