BRPI0708660A2

BRPI0708660A2 - métodos para melhorar a performance de uma planta crescida em condições de alta densidade populacional, polinucleotìdeo isolado, cassete de expressão, planta, semente, método para modular a expressão de um polinucleotìdeo de interesse em uma planta

Info

Publication number: BRPI0708660A2
Application number: BRPI0708660-1A
Authority: BR
Inventors: Nicholas J Bate; Milo J Aukerman
Original assignee: Pioneer Hi Bred Int; Du Pont
Priority date: 2006-03-07
Filing date: 2007-03-07
Publication date: 2011-06-07
Also published as: CN101432431A; WO2007103956A2; AU2007223053A1; EP1991685A2; US20080235827A1; CA2646509A1; US20110078824A1; AR059775A1; WO2007103956A3; AU2007223053A2; ZA200807658B; MX2008011467A; EP1991685B1; US7868224B2

Abstract

MéTODOS PARA MELHORAR A PERFORMANCE DE UMA PLANTA CRESCIDA EM CONDIçõES DE ALTA DENSIDADE POPULACIONAL, POLINUCLEOTIDEO ISOLADO, CASSETE DE EXPRESSAO, PLANTA, SEMENTE, MéTODO PARA MODULAR A EXPRESSAO DE UM POLINUCLEOTIDEO DE INTERESSE EM UMA PLANTA. Composições e métodos para suprimir a resposta de evitar sombra das plantas e aprimorar a produção de plantas são fornecidos. Composições da invenção incluem um gene de florescimento precoce 3 (ELF3) de milho, o promotor para este gene, um fator de transcrição hélice-loop-hélice básico de Arabidopsis (bHLH-04 1), e fragmentos e variantes destes. A sequência do promotor do ELF3 é útil para dirigir a expressão de polinucleotideos de interesse em uma planta. As sequências da invenção ELF3 e bHLH-041, ou variantes e fragmentos destas, são fornecidas em cassetes de expressão para uso em manipulação da expressão dos genes ELF3 e bHLH-041. Aumentando a expressão do ELF3 e/ou suprimindo a expressão do bHLH-041, os métodos da invenção permitem respostas de uma planta à qualidade da luz alteradas e supressão do modo de desenvolvimento de sobrevivência comandado por alta densidade. A invenção deste modo fornece métodos para o crescimento de plantas em altas densidades populacionais para aumento da produção. Plantas transformadas possuindo o fenótipo de evitar sombra alterado da invenção, e sementes de tais plantas, são também fornecidas.

Description

MÉTODOS PARA MELHORAR A PERFORMANCE DE UMA PLANTA CRESCIDAEM CONDIÇÕES DE ALTA DENSIDADE POPULACIONAL,POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CASSETE DE EXPRESSÃO, PLANTA,SEMENTE, MÉTODO PARA MODULAR A EXPRESSÃO DE UMPOLINUCLEOTÍDEO DE INTERESSE EM UMA PLANTA

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção é desenhada para manipulaçãogenética de plantas, particularmente para manipular plantaspara aumentar a tolerância à alta densidade populacional.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A luz desempenha um papel vital no crescimento edesenvolvimento vegetal. Plantas percebem a luz noambiente usando um número de sistemas fotorreceptores quecontrolam processos de desenvolvimento, tais comogerminação, fotomorfogênese, florada, e senescência, assimcomo processos metabólicos, tais como fotossintese.

Células vegetais não apenas obtêm energia e distúrbiosquímicos de fótons, como também obtêm informações. Aexcitação de moléculas de clorofila por luz do espectrovisível provê a energia para a redução de CO2 e paramanutenção de atividades metabólicas.

Em ambientes com alta produtividade primária, odeterminante mais importante do clima de luz experimentadopor uma planta é mais freqüentemente suas vizinhas.Plantas se aclimatam morfologicamente e bioquimicamente aoambiente de luz de sua vizinhança. Elas buscam luz noespaço tridimensional do dossel usando uma bateria defotorreceptores de informações. Fitocromos representam umafamília de fotorreceptores que absorvem luz vermelha quepodem existir na forma Pr inativa fisiologicamente e naforma Pfr ativa. Pr e Pfr são inter-conversíveis para luzvermelha ou vermelho distante (far-red, FR),respectivamente. Esse perfil de absorção é extremamenteútil para a detecção de sombra ou a presença de plantasvizinhas. Em altas proporções de radiação FR Sob condiçõesde sombra ou em densas populações de plantas, ofotoequilíbrio é mudado na direção da forma Pr inativa.

Sob essas condições, plantas verdes exibem vários sintomasde resposta de evitar sombra, tais como promoção de caule ealongamento de pecíolo, espessura foliar reduzida, síntesede clorofila reduzida, e dominância apical aumentada. Aresposta de evitar sombra reduz a disponibilidade derecursos para armazenamento e reprodução.

A habilidade de plantas para ajustar sua morfologia emresposta a aumento de densidade é quase certamente umelemento chave para sucesso para a planta individual emambientes de alta produtividade primária. Aumentos emrendimento nas últimas décadas foram atribuídos amplamentea tolerância aumentada à densidade. Estratégiastransgênicas serão necessárias para aumentar mais aprodutividade de plantas além do que é possível pormelhoramento convencional. Assim, genes e métodos paramelhorar a resposta de plantas a densidade de plantio sãonecessários.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Composições e métodos para suprimir a resposta deevitar sombra de plantas e melhorar o crescimento erendimento vegetal são providos. Em particular, ascomposições e métodos da invenção alteram a resposta daplanta à qualidade de luz e aumentam a tolerância vegetal acondições de luz limitada, incluindo aqueles causados poralta densidade populacional. Composições da invençãoincluem um gene de floração precoce 3 (ELF3) de milho,assim como um fator de transcrição básico hélice-loop-hélice (bHLH-041) de Arabidopsis, e fragmentos e variantesdesses. O bHLH-041 é um membro de uma classe de fatores detranscrição envolvidos em um .-grande número de respostasvegetais, incluindo alguns membros que interagemdiretamente com fitocromos envolvidos na percepção de luz.

Os métodos da invenção envolvem manipular a expressão dosgenes de ELF 3 e bHLH-041 para alterar a resposta de umaplanta à qualidade de luz e suprimir o modo dedesenvolvimento de sobrevivência comandado por altadensidade. Particularmente, os métodos envolvem aexpressão ou super-expressão do gene de ELF3 em plantas eregulação negativa do gene de bHLH-041 ou gene codificandoum fator de transcrição similar para suprimir a resposta deevitar sombra. Plantas modificadas dessa forma irãotolerar condições de baixa luminosidade, tais como aquelasque ocorrem em locais fechados, em paisagens sombreadas, eem condições de alta densidade populacional. Em situaçõesde cultivo, a modificação resultará em maiores rendimentossob alta densidade de plantas, em relação a uma plantacontrole. Os polinucleotideos da invenção podem ser usadossozinhos, em combinação, ou com outros genes e mecanismospara aumentar o rendimento vegetal. A invenção provêmétodos para cultivar plantas de cultivo em altasdensidades populacionais para intensificação do rendimento.

Adicionalmente, uma seqüência promotora é provida. Aseqüência promotora de ELF3 de milho é útil para dirigir aexpressão de polinucleotideos de interesse em uma planta.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 mostra um alinhamento da seqüência daproteína ELF3 de milho (SEQ ID NO: 3) com a seqüência deELF3 de Arabidopsis thaliana (At2g25930; GenBank AccessionNo. NM_128153; SEQ ID NO: 7) e a seqüência de ELF3 de Oryzasativa (GenBank Accession No. BAA83571; SEQ ID NO: 8). Osresíduos conservados estão indicados na seqüência consenso(SEQ ID NO: 10).As figuras 2A e 2B mostram os efeitos da super-expressão de ZM-ELF3 no comprimento foliar (Figure 2A) enúmero de folhas na florada (Figure 2B) em Arabidopsistransgênica cultivada em alta densidade.

A figura 3A mostra elementos no promotor de ZM-ELF3que lembra o "elemento evening" presente em um número degenes associados com o relógio circadiano. As posições denucleotideos são relativas à seqüência de nucleotideosapresentada em SEQ ID NO: 4. 0 elemento evening deArabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 9) é apresentado paracomparação. A figura 3B mostra a seqüência acima do genede ZM-ELF3 com elementos evening putativos sublinhados emnegrito. Um CAAT box putativo está em itálico, e o sitiode iniciação de transcrição está em itálico e duplosublinhado. Os nucleotideos 1-459 são apresentados em SEQID NO: 4; nucleotideos 460-625 correspondem aosnucleotideos 1-166 de SEQ ID NO: 1.

A figura 4 mostra efeitos de densidade de plantas emArabidopsis. Plantas de tipo selvagem (Columbia) foramcultivadas sob uma variedade de densidades (1: uma plantaem 4 cm2; 2: uma planta em 3 cm2; 3 uma planta em 2 cm2; 4:uma planta em 1 cm2). Altura total de bolt (florescimentoprecoce) em cm na florada (p*ainel A), número de bolts naflorada (B), maior comprimento foliar (C) e comprimento desiliqua (D).A figura 5 mostra o efeito da densidade no tempo deflorada em Arabidopsis. Densidades crescentes da esquerdapara a direita diminuem o tempo para florada e tamanho deplanta na florada. Dez plantas foram medidas de cadatratamento.

A figura 6 descreve a marcação de ativação do mutanteELF3. 0 painel A provê um mapa de seqüência genômicacercando ELF3 e mostra a localização da marca de ativação35S. 0 painel B mostra a análise de três plantas positivase uma negativa demonstrando super-expressão de ELF3 naslinhagens marcadas por ativação (144-1 a 3). 0 painel Cmostra um Southern blot digerido por PstI de DNA isolado apartir de três linhagens ELF 3 marcadas por ativação,indicando que uma única cópia de T-DNA está presente.

A figura 7 mostra o efeito da densidade em linhagensmarcadas por ativação em um experimento de interplantio.Linhagens marcadas por ativação 50-1 (proteína·.bHLH-041) e144-1 (ELF3) possuem diferentes respostas a alta densidadede plantas como indicado por comprimento foliar (painelsuperior) e altura de bolt (painel inferior). Sementesmarcadas por ativação foram inter-plantadas com plantas dotipo selvagem na segunda maior densidade (uma planta em 2cm2) e medidas no meio da florada (estágio 6.5). 0interplantio envolveu semear plantas experimentais dentreplantas controle onde cada quinta planta era experimental.DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Composições e métodos para aumentar o rendimento emuma planta ou cultivo são providos. Em particular, ascomposições e métodos da invenção suprimem a resposta deevitar sombra da planta alterando a resposta da planta aqualidade de luz e aumentando a tolerância da planta adensidade. Dessa maneira, a planta pode ser cultivada euma disposição de densidade alta sem sacrificarrendimento, aumentando, assim, a produção total do cultivo.

Composições da invenção incluem o promotor de floraçãoprecoce 3 (ELF3) e a seqüência codificadora de milho, aseqüência codificadora para um fator de transcrição básicohélice-loop-hélice (bHLH-041) de Arabidopsis, e variantes efragmentos desses, assim como polinucleotideos econstructos para supressão da expressão do gene de bHLH-041e genes para fatores de transcrição similares em plantas.

A seqüência codificadora para o gene ELF3 de milho é-apresentada como os nucleotideos 167 até 2444 de SEQ ID NO:Ie como SEQ ID NO: 2, e a seqüência de aminoácidos para opolipeptideo ELF3 codificado é apresentada em SEQ ID NO: 3.

A seqüência promotora de ELF3 é apresentada em SEQ ID NO:4. A seqüência codificadora para o gene bHLH-041 deArabidopsis é apresentada em SEQ ID NO: 5, e a seqüência deaminoácidos para o polipeptideo bHLH-041 codificado éapresentada em SEQ ID NO: 6.Em particular, a presente invenção provêpolinucleotideos isolados compreendendo seqüências denucleotideos codificando as seqüências de aminoácidosapresentadas em SEQ ID NOS: 3 e 6. Ainda providos sãopolipeptideos tendo uma seqüência de aminoácidos codificadapor um polinucleotideo aqui descrito, por exemplo, aquelasapresentadas em SEQ ID NOS: 1, 2 e 5, e fragmentos evariantes dessas. A invenção também provê polinucleotideosisolados compreendendo a seqüência promotora para o gene deELF3 de milho, como apresentado em SEQ ID NO: 4. Moléculasde ácidos nucléicos compreendendo os complementos dessasseqüências de nucleotideos são também providas. Éreconhecido que a seqüência codificadora para o gene debHLH-041 (ver, SEQ ID NO: 5) pode ser expressa em umaplanta para super-expressão do fator de transcrição debHLH-041. Contudo, para propósitos de suprimir a respostade evitar sombra de uma planta, a seqüência codificadoraserá usada para projetar constructos para supressão deexpressão do fator de transcrição de bHLH-041. Assim,polinucleotideos, no contexto de suprimir a resposta deevitar sombra, referem-se a seqüências codificadoras deELF3 e a polinucleotideos que, quando expressos, suprimem ogene de bHLH-041, por exemplo, via supressão direta ouindireta, como notado aqui abaixo.

A expressão dos polinucleotideos da invenção emplantas previne aquelas plantas de passarem porreprogramação extensiva de seu desenvolvimento morfológicosob condições de luz limitadas, particularmente quandosombreadas por suas vizinhas ou quando cultivadas em altadensidade. Plantas procuram pela luz em dosséis usando umavariedade de sistemas fotossensoriais. A radiação vermelhadistante refletida por suas vizinhas é um sinal inicial decompetição que causa resposta de evitar sombras antecipada.

A resposta de evitar sombras inclui sintomas, tais comopromoção de caule e alongamento de peciolo, espessurafoliar reduzida, síntese de clorofila reduzida, floradaacelerada, e dominância apical aumentada. A resposta deevitar sombra reduz a disponibilidade de recursos paraarmazenamento e reprodução. Evitar sombras é um mecanismoonde plantas crescidas em grande proximidade respondem aradiação vermelho distante (FR) refletida das folhas deplantas vizinhas aumentado significativamente seucomprimento de caule em detrimento de desenvolvimento defolhas, frutos, e órgãos de armazenamento, afetando,contrariamente, o rendimento de componentes que podem sercolhidos. A=--resposta de evitar sombra pode ter tambémefeitos detrimentais em plantas ornamentais de ambientesfechados ou em áreas de luz limitada de uma paisagem.

A figura 4 mostra o efeito do aumento dadensidade populacional no desenvolvimento vegetativo ereprodutivo em Arabidopsis. Plantas do tipo selvagem(Columbia) foram cultivadas sob uma variedade de densidades(1: uma planta em 4 cm2; 2: uma planta em 3 cm2; 3 umaplanta em 2 cm2; 4: uma planta em 1 cm2). Com densidadeaumentada, a altura total de bolt na florada foi reduzida(painel A), o número de bolts na florada foi reduzido (B),o comprimento foliar foi reduzido (C), e o comprimento desiliqua foi reduzido (D).

A densidade plantas ou densidade populacional varia decultivo para cultivo, assim como de região de cultivo pararegião de cultivo e de ano para ano. 0 termo "altadensidade" ou "alta densidade populacional" é definido comouma densidade de plantas pelo menos cerca de 10% mais altado que a densidade de plantas média predominante de um dadocultivo ou dada região de cultivo. Em alguns avanços, aalta densidade populacional é pelo menos 20% mais alta,pelo menos 30% mais alta, pelo menos 40% mais alta, pelomenos 50% mais alta, pelo menos 60% mais alta, pelo menos70% mais alta, pelo menos 80% mais alta, pelo menos 90%mais alta, ou pelo menos 100% mais alta do que a densidademédia predominante para um dado cultivo na determinada áreade cultivo. A "densidade média predominante" é definidacomo a densidade média de plantas usadas por uma maioria defazendeiros em uma região. Por exemplo, de acordo com oServiço Nacional de Estatísticas Agrícolas (NationalAgricultural Statistics Service) do Departamento deAgricultura dos Estados Unidos (United States Department ofAgriculture), a densidade média predominante para milho emdez estados do meio-oeste em 2004 foi de 26.200 plantas poracre (ppa). Assim, para aquela região, alta densidadepopulacional é preferivelmente pelo menos cerca de 28.800,pelo menos 30.000, pelo menos 32.000, pelo menos 34.000,pelo menos 36.000, pelo menos 38.000 ou pelo menos 40.000plantas por acre. É reconhecido que a densidade deplantio, i.e., número de sementes plantadas, irá exceder apopulação de plantas desejada direcionada. Por exemplo, adensidade média de plantio para milho na América do Norteem 2004 foi de 28.590 plantas por acre.

As densidades médias predominantes de plantas decultivo selecionadas nos EUA incluem milho a 20.000-29.000plantas por acre, trigo a 1.000.000-1.500.000 plantas poracre, arroz a 650.000-900.000 plantas por acre, soja a150.000-200.000 plantas por acre, canola a 2 60.000-350.000plantas por acre, e girassol a 17.000-23.00 plantas poracre. Da mesma maneira, as densidades médias de qualquercultivo podem ser determinadas para qualquer região decultivo.

Por rendimento, pretende-se o resultado ou quantidadeproduzida por uma planta ou cultivo. Rendimento pode sermedido em termos de número e/ou tamanho de fruto, semente,ou outros tecidos colhidos. Tipicamente, o rendimento deplantas de cultivo é medido em uma base de alqueires poracre. O rendimento de grãos em cultivos agrícolas étipicamente medido em uma base de alqueires por acre ouquilograma por hectare.Uma mutação de floração precoce 3 ("early flowering 3mutation" - elf3) foi previamente identificada emArabidopsis. Foi proposto que ELF3 media uma interaçãoentre luz e o relógio circadiano. Defeitos na função deELF3 levam a arritmia dependente de luz. Ver, Covington,et al., (2001) Plant Cell 13:1305-1315, aqui incorporadopor referência. ELF3 aparenta ser um componente integralde entrada de luz para o relógio e provavelmente abre aentrada de luz para o relógio e indução aguda dosresultados circadianos restringindo a sensitividade à luzdessas vias no entardecer. A super-expressão da proteínaELF3 resulta em sensitividade diminuída ao estímulo derestabelecimento, sugerindo que ELF3 antagoniza a entradade luz para o relógio durante a noite. ELF3 poderepresentar um mecanismo pelo qual o oscilador modula orestabelecimento de luz. Adicionalmente, proteínas ELF3podem ser responsáveis pela regulação circadiana daatividade fotorreceptora.

A invenção provê seqüências de nucleotídeos de ELF3 demilho (SEQ ID NOS: 1 e 2) e uma proteína ELF3 codifica poressas (SEQ ID NO: 3) . A proteína ELF3 de milho (tambémreferida como ZM-ELF3) compartilha 19,4 % de identidade coma proteína ELF3 de Arabadopsis thaliana designada At2g25930(SEQ ID NO: 7; GenBank Accession No. NM_128153; ver também,SEQ ID NO: 2 de U.S. Patent No. 6.903.192), com quatroregiões conservadas através dessas duas seqüências (ver, oalinhamento na Figura 1; região I, correspondente aosresíduos 20-57 de SEQ ID NO: 3; região II, correspondenteaos resíduos 362 a 410 de SEQ ID NO: 3; região III,correspondente aos resíduos 516-535 de SEQ ID NO: 3; eregião IV, correspondente aos resíduos 728-754 de SEQ IDNO: 3) que são compartilhadas entre proteínas ELF3previamente identificadas (ver, Liu, et al., (2001) PlantCell 13:1293-1304, aqui incorporado por referência). Aanálise de PFAM revela um domínio na região II comsimilaridade para fator A de ligação de ribossomo (InterPROPS01319 IPR000238) sugerindo que ELF3 por efetuar funçõesrelacionadas a controle de síntese de proteínas.

A proteína ZM-ELF3 também compartilha homologia comoutras proteínas, por exemplo, a possível proteína defloração precoce 3 de Oryza sativa, incluída no alinhamentoapresentado na Figura 1 (SEQ ID NO: 8; ver também, GenBankAccession No. BAA83571; seqüência codificadora mostrada noGenBank Accession No. AP000399); possível proteína defloração precoce 3 de Oryza sativa (derivada de BAA83571;ver, GenBank Accession No. XP_493738; seqüênciacodificadora mostrada no GenBank Accession No. XM_493738);proteína hipotética designada P0697C12.15 de Oryza sativa(GenBank Accession No. NP_918455; seqüência codificadoramostrada no GenBank Accession No. NM_193566.1); proteínatipo proteína de resposta de nematódeo de Oryza sativa(GenBank No. BAD45081; seqüência codificadora mostrada noGenBank Accession No. AP003296); proteína de floraçãoprecoce 3 de Mesembryanthemum crystallinum (GenBankAccession No. AAQ73529; seqüência codificadora mostrada noGenBank Accession No. AY371292; a seqüência para umaproteína desconhecida de Arabidopsis thaliana (GenBankAccession No. AAM15042; seqüência codificadora mostrada noGenBank Accession No. AC005395) ; proteína hipotéticaAt3g21320 de Arabidopsis thaliana (GenBank Accession No.AAX23847; seqüência codificadora mostrada no GenBankAccession No. AY924772; proteína hipotética AT3G21320 deArabidopsis thaliana (GenBank Accession No. AAV68859;seqüência codificadora mostrada no GenBank Accession No.AY800623); proteína de resposta de nematódeo de Arabidopsisthaliana (GenBank Accession No. CAA72719; seqüênciacodificadora mostrada no GenBank Accession No. Y11994;homólogo de ELF3 de Lemna gibba (GenBank Accession No.BAD97872; seqüência codificadora mostrada no GenBankAccession No. AB210851; e um produto de proteína sem nomede Arabidopsis thaliana (GenBank Accession No. BAB01726;seqüência codificadora mostrada no GenBank Accession No.AB02304 5).

Os métodos da invenção incluem a expressão daseqüência de ELF3 da invenção em uma planta de interesse.

Enquanto não ligado por qualquer mecanismo de ação, aexpressão/super-expressão da seqüência de ELF3 inibe ousuprime a resposta de evitar sombra da planta. Dessamaneira, uma planta pode ser transformada com umaconstrução de DNA compreendendo um promotoroperacionalmente ligado a uma seqüência de nucleotídeoscompreendendo a seqüência codificadora de ELF3 (e.g.,nucleotideos 167-2443 de SEQ ID NO: 1, apresentada como SEQID NO: 2) ou fragmento ou variante dessa, aumentando onivel ou atividade do polipeptideo ELF3. Um promotor podeser escolhido para expressar a seqüência em tecidosseletos, em momentos seletos, ou para expressãoconstitutiva.

Em resposta a sombra, gradientes horizontais de luzazul guiam brotos da planta para espaços no dossel emvegetação agregada. Esses sinais de luz B são percebidospor fotorreceptores específicos. Plantas possuem pelomenos dois tipos de fotorreceptores cuja função fisiológicaé a aquisição de informação. Um desses, os fitocromos,absorve de forma máxima nas regiões vermelha (R) e vermelhodistante (FR) do espectro. Fitocromos são proteínasreguladoras que controlam a expressão gênica da planta emresposta a luz. Trabalhos recentes demonstraram aconservação da função fotorreceptora através de fronteirasevolucionárias divergentes.

Os fitocromos são de uma família de proteínasfotorreceptoras vegetais que controlam diversas estratégiasadaptativas de desenvolvimento. Por exemplo, os fitocromospercebem luz vermelho distante (comprimentos de onda entre700 e 800 nm) refletida ou dispersa a partir das folhas davegetação próxima. Isso provê um aviso inicial desombreamento potencial, e ativa uma série de respostas deevitar sombras pelas quais a planta tenta crescer mais doque suas vizinhas. O relógio circadiano abre essa rápidaresposta de evitar sombra. (Ver, e.g., Blazquez, et al.,(2000) J. Cell. Sei. 113:3547). Um dos genes rapidamenteresponsivos codifica uma proteína básica hélice-loop-hélice. O produto gênico é necessário para o crescimentoacelerado associado com a resposta de evitar sombra.

As proteínas básicas hélice-loop-hélice (bHLH) são umasuperfamília de fatores de transcrição que se ligam comodímeros a específicos sítios alvo de DNA. A família édefinida pelo domínio de assinatura bHLH, que consiste decerca de 60 aminoácidos com duas regiões funcionalmentedistintas. A região básica é localizada na extremidade Nterminal do domínio e é envolvida na ligação de DNA. Aregião básica consiste de cerca de 15 aminoácidos,incluindo um grande número de resíduos básicos. A regiãoHLH é localizada na extremidade C terminal e funciona comoum domínio de dimerização. A região HLH consisteprincipalmente de resíduos hidrofóbicos que formam duas a-hélices anfipáticas separadas por uma região Ioop deseqüência e comprimento variável. Fora do domínioconservado de assinatura bHLH, as proteínas exibemdivergência de seqüência considerável.

Os genes de bHLH foram estudados em Arabidopsis e maisde 140 genes foram identificados, constituindo uma dasmaiores famílias de fatores de transcrição em Arabidopsis.Ver, Toledo-Ortiz, et al., (2003) Plant Cell 15:1749-1770,aqui incorporado por referência. Vinte uma subfamiliasforam identificadas tendo motivos de seqüências deaminoácidos conservados fora do domínio de ligação de DNA.

É previsto que esta família de fatores de transcriçãopossua uma variação diversa de papéis no desenvolvimento decélula e tecido vegetal, assim como, metabolismo vegetal.Algumas proteínas bHLH (e.g., PIF3 e proteínas bHLHrelacionadas; ver, por exemplo, Ni, et al., (1998) Cell95(5): 657-667) fisicamente interagem com fitocromo. Alémdisso, uma bHLH relacionada, chamada PIL1, está envolvidano relógio circadiano (ver, por exemplo, Makino, et al.,(2002) Plant Cell Physiol. 43(l):58-69 e Salter, et al.,(2003) Nature 426(6967): 680-683).

A invenção provê a seqüência de nucleotídeos de bHLH-041 de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 5) e a proteínabHLH-041 codificada por essa (SEQ ID NO: 6). A proteínabHLH-041 compartilha homologia com um número de proteínasbHLH, incluindo, por exemplo, uma proteína tipo bHLH deOryza sativa (GenBank Accession No. BAD61929; seqüênciacodificadora mostrada no GenBank Accession No. AP005460); aproteína designada como B1112D09.4 de Oryza sativa (GenBankAccession No. NP_918505; seqüência codificadora mostrada noGenBank Accession No. NM_193616); outra proteína tipo bHLHde Oryza sativa (GenBank Accession No. BAD72434; seqüênciacodificadora mostrada em relatório para o GenBank AccessionNo. AP003417); a proteína designada como P0498B01.27 deOryza sativa (GenBank Accession No. NP_913134; seqüênciaeodifieadora mostrada no GenBank Aceession No. NM_188245);outra proteína tipo bHLH de Oryza sativa (GenBank AceessionNo. BAD72431; seqüência eodifieadora mostrada em relatóriopara o GenBank Accession No. AP003417); a proteínadesignada como P0498B01.20 de Oryza sativa (GenBankAccession No. NP_913129; seqüência eodifieadora mostrada noGenBank Accession No. NM_188240); outra proteína tipo bHLHde Oryza sativa (GenBank Accession No. BAD72430; seqüênciaeodifieadora mostrada em relatório para o GenBank AccessionNo. AP003417); a proteína designada como P0498B01.17 deOryza sativa (GenBank Accession No. NP_913126; seqüênciaeodifieadora apresentada como GenBank Accession No.NM_188237); a proteína tipo proteína de família bHLH deOryza sativa (GenBank Accession No. XP_464694; seqüênciaeodifieadora mostrada no GenBank Accession No. XM_464694);e a seqüência para uma proteína desconhecida de Arabidopsisthaliana (GenBank Accession No. AAM63723; seqüência-eodifieadora mostrada no GenBank Accession No. AY086666).

Enquanto não ligado por teoria ou mecanismo de ação,acredita-se que o fator de transcrição bHLH da invenção,bHLH-041 (apresentado em SEQ ID NO: 6), interage comfitocromos envolvidos na percepção de luz. Portanto, asupressão da expressão do gene ou genes de bHLH-041 paraoutros membros da classe de fatores de transcriçãopreveniriam a interação com fitocromos e suprimiram aresposta da planta de evitar sombra. Dessa maneira, ainvenção provê a supressão da expressão do gene ou genes debHLH-041 para fatores de transcrição similares que agem damesma maneira. Portanto, para propósitos de supressão daresposta de evitar sombra, polinucleotideos bHLH-041incluem aqueles polinucleotideos que, quando expressos emuma planta, suprimem a expressão do gene ou genes de bHLH-041 para fatores de transcrição similares que agem emfitocromos. A expressão do polinucleotideo reduz ouelimina o nivel ou atividade de bHLH-041 em uma planta. Aexpressão pode reduzir ou eliminar o nivel de bHLH-041 porqualquer de vários meios; por exemplo, influenciando onivel de transcrito de RNA de bHLH-041; influenciando atradução e afetando, dessa forma, o nivel do polipeptideobHLH-041 codificado; ou interferindo com a função dopolipeptideo bHLH-041 codificado, tal como por ligaçãocompetitiva a uma seqüência de DNA alvo.

É reconhecido que a supressão de seqüências de RNA,como discutido abaixo, pode ser desenhada para visarespecificamente à expressão do gene de bHLH-041 oualternativamente direcionar genes para aqueles fatores detranscrição compartilhando homologia com bHLH-041. Dessamaneira, para supressão seletiva da proteína bHLH-041,seqüências de supressão serão projetadas baseadas emseqüências fora do domínio conservado de assinatura bHLHdesta proteína, que reside nos resíduos 287-339 de SEQ IDNO: 6. bHLH é um fator de transcrição hélice-loop-hélice ecomo tal possui uma região básica (P FAM: PF00010;IPR001092) que determina a especificidade de interação comregiões reguladoras de genes alvo. No caso de bHLH-041, aregião básica (SERKRREKLN; resíduos 293-302 de SEQ ID NO:6) é a mais conservada e é diagnostica desse grupo defatores de transcrição.

Os polinucleotídeos de ELF3 e bHLH-041 da invençãopode ser usados sozinhos ou em combinação para dimiuir oureduzir a resposta de evitar sombra da planta em plantas eaumentar o rendimento em plantas. Isto é, os métodos dainvenção previnem a resposta de evitar sombra de plantas econtrabalanceiam os efeitos da competição assimétrica porluz. Os métodos possuem importantes implicações para asrelações rendimento-densidade e produtividade-densidade deplantas. As plantas da invenção exibem fotomorfogênesealterada e rendimento melhorado, mas não exibem ascaracterísticas de plantas típicas crescidas emconfigurações de alta densidade.

A invenção engloba composições de polinucleotídeos, ouproteínas, isolados ou substancialmente purificados. Umpolinucleotídeo "isolado" ou "purificado" ou proteína, ouporção biologicamente ativa desse, é substancialmente ouessencialmente livre de componentes que normalmenteacompanham ou interagem com o polinucleotídeo ou proteína,como encontrada em seu ambiente ocorrente. Assim, umpolinucleotídeo isolado ou purificado, ou proteína, ésubstancialmente livre de outro material celular, ou meiode cultura quando produzido por técnicas recombinantes, ousubstancialmente livre de precursores químicos ou outrosquímicos quando quimicamente sintetizado. Otimamente, umpolinucleotídeo "isolado" é livre de seqüências (otimamenteseqüências codificando proteínas) que naturalmenteflanqueiam o polinucleotídeo (i.e., seqüências localizadasnas extremidades 5' e 3' do polinucleotídeo) no DNAgenômico do organismo do qual o polinucleotídeo é derivado.Por exemplo, em vários avanços, o polinucleotídeo isoladopode conter menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de seqüência de nucleotídeos quenaturalmente flanqueiam o polinucleotídeo no DNA genômicoda célula da qual o polinucleotídeo é derivado. Umaproteína que é substancialmente livre de material celularinclui preparações de proteína tendo menos do que cerca de30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (por peso seco) de proteínacontaminante. Quando a proteína da invenção ou porçãobiologicamente ativa dessa é produzida de formarecombinante, otimamente, meio de cultura representa menosdo que cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (por peso seco) deprecursores químicos ou químicos que não a proteína deinteresse.

Fragmentos e variantes dos polinucleotídeos descritos,e proteínas, codificados dessa forma são também englobadospela presente invenção. Por "fragmento" pretende-se umaporção do polinucleotídeo ou uma porção da seqüência deaminoácidos e, assim, proteína codificada dessa forma.Fragmentos de um polinucleotideo podem codificar fragmentosde proteínas que retêm a atividade biológica da proteínanativa e, assim, possuem a atividade de proteína ELF3 ouproteína bHLH-041. A medição da atividade de proteínabHLH-041 é aqui descrita em outra parte. Alternativamente,fragmentos de um polinucleotideo que são úteis como sondasde hibridização geralmente não codificam proteínasfragmento retendo atividade biológica. Assim, fragmentosde uma seqüência de nucleotídeos podem variar de pelo menoscerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cercade 100 nucleotídeos, e até o comprimento total dopolinucleotideo codificando as proteínas da invenção.

Um fragmento de um polinucleotideo de ELF3 quecodifica uma porção biologicamente ativa de uma proteínaELF3 da invenção codificará pelo menos 15, 25, 30, 50, 100,150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700,750 aminoácidos contíguos ou até o número total deaminoácidos presente em uma proteína ELF3 de comprimentototal da invenção (por exemplo, 759 aminoácidos para SEQ IDNO: 3). Em alguns avanços, um fragmento de umpolinucleotideo de ELF3 que codifica uma porçãobiologicamente ativa de uma proteína ELF3 da invençãocodificará um fragmento de polipeptídeo ELF3 compreendendopelo menos a região I, correspondente aos resíduos 20-57 deSEQ ID NO: 3, pelo menos a região II, correspondente aosresíduos 362 a 410 de SEQ ID NO: 3, pelo menos a regiãoIII, correspondente aos resíduos 516-535 de SEQ ID NO: 3,pelo menos a região IV, correspondente aos resíduos 728-754de SEQ ID NO: 3), ou qualquer combinação das regiões I, II,III, e IV de SEQ ID NO: 3, onde cada uma dessas regiões écodificada pelos códons correspondentes apresentados em SEQID NO: 2 ou códons alternativos devido à degeneração docódigo genético. Assim, por exemplo, o fragmento depolipeptídeo ELF3 codificado poderia compreender resíduoscorrespondentes às regiões I e II de SEQ ID NO: 3, regiõesI e III de SEQ ID N0:3, regiões I e IV de SEQ ID N0:3,regiões I, II, e III de SEQ ID NO: 3, regiões I, III, e IVde SEQ ID NO: 3, regiões I, II, III, e IV de SEQ ID NO: 3,regiões II e III de SEQ ID NO: 3, regiões II e IV de SEQ IDNO: 3, regiões II, III, e IV de SEQ ID NO: 3, ou regiõesIII e IV de SEQ ID NO: 3, onde cada uma dessas regiões écodificada pelos códons correspondentes apresentados em SEQID NO: 2 ou códons alternativos devido à degeneração docódigo genético.

Contudo, fragmentos de um polinucleotídeoda invenção que são úteis como sondas de hibridização ouprimers de PCR geralmente não precisam codificar uma porçãobiologicamente ativa de uma proteína ELF3.

Um fragmento de um polinucleotídeo de bHLH-041 quecodifica uma porção biologicamente ativa de uma proteínabHLH-041 da invenção codificará pelo menos 15, 25, 30, 50,100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 aminoácidoscontíguos, ou até o número total de aminoácidos presentesem uma proteína bHLH-041 de comprimento total da invenção(por exemplo, 466 aminoácidos para SEQ ID NO: 6). Emalguns avanços, um fragmento de um polinucleotídeo bHLH-041que codificar uma porção biologicamente ativa de umaproteina bHLH-041 da invenção codificará um fragmento depolipeptideo bHLH-041 compreendendo pelo menos a regiãobásica do domínio de assinatura bHLH, onde a região básicacorresponde aos resíduos 293-302 de SEQ ID NO: 6, pelomenos a região HLH do domínio de assinatura bHLH, onde odomínio de assinatura bHLH corresponde aos resíduos 287-339de SEQ ID NO: 6, ou ambas as regiões, onde cada uma dessasregiões é codificada pelos códons correspondentesapresentados em SEQ ID NO: 5 ou códons alternativos devidoà degeneração do código genético. Em outros avanços, umfragmento de um polinucleotídeo de bHLH-041 que codificauma porção biologicamente ativa de uma proteína bHLH-041 dainvenção codificará um polipeptideo compreendendo o domíniode assinatura bHLH, correspondente aos resíduos 287-339 deSEQ ID NO: 6, onde essa região é codificada pelos códonscorrespondentes apresentados em SEQ ID NO: 5 ou códonsalternativos devido à degeneração do código genético.

Contudo, fragmentos de um polinucleotídeo da invenção quesão úteis como sondas de hibridização ou primers de PCRgeralmente não precisam codificar uma porção biologicamenteativa de uma proteína bHLH-041.

Assim, um fragmento de um polinucleotídeo de ELF3 oubHLH-041 pode codificar "uma porção biologicamente ativa deuma proteína ELF3 ou bHLH-041, respectivamente, ou pode serum fragmento que pode ser usado como sonda de hibridizaçãoou primer de PCR usando métodos descritos abaixo. Umaporção biologicamente ativa de uma proteína ELF3 ou bHLH-041 pode ser preparada isolando uma porção de um dospolinucleotídeos de EL F 3 ou bHLH-041 da invenção,respectivamente, expressando a porção codificada daproteína ELF3 ou bHLH-041 (e.g., por expressão recombinantein vitro), e avaliando a atividade da porção codificada dopolipeptídeo ELF3 ou bHLH-041. Polinucleotídeos que sãofragmentos de uma seqüência de nucleotídeos de ELF3 oubHLH-041 compreendem pelo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150,200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800,900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300 ou 1.400 nucleotídeoscontíguos, ou até o número de nucleotídeos presentes em umpolinucleotídeo de ELF3 ou bHLH-041 de comprimento totalaqui descrito (por exemplo, nucleotídeos 2496, 2277, e 1401para SEQ ID NOS: 1, 2 e 5, respectivamente).

"Variantes" devem significar seqüênciassubstancialmente similares. Para polinucleotídeos, umvariante compreende uma deleção e/ou adição de um ou_maisnucleotídeos em um ou mais sítios no polinucleotídeo nativoe/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em um oumais sítios no polinucleotídeo nativo. Como aqui usado, umpolinucleotídeo ou polipeptídeo "nativo" compreende umaseqüência de nucleotídeos ou seqüência de aminoácidosnaturalmente ocorrente, respectivamente. Parapolinucleotídeos, variantes conservativos incluem aquelasseqüências que, por causa da degeneração do códigogenético, codificam a seqüência de aminoácidos de um dospolipeptideos ELF3 ou bHLH-041 da invenção. Variantesalélicos naturalmente ocorrentes, tais como estes, podemser identificados com o uso de técnicas de biologiamolecular bem conhecidas, como, por exemplo, com reação decadeia de polimerase (PCR) e técnicas de hibridização comodestacado abaixo. Polinucleotideos variantes tambémincluem polinucleotideos derivados sinteticamente, taiscomo aqueles gerados, por exemplo, usando mutagênese sítio-direcionada, mas que ainda codificam uma proteína ELF3 oubHLH-041 da invenção. Geralmente, variantes de umpolinucleotídeo da invenção em particular (por exemplo, SEQID NO: 1, SEQ ID NO: 2, ou SEQ ID NO: 5) terá pelo menoscerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais deidentidade de seqüência àquele polinucleotídeo emparticular, como determinado por programas de alinhamentode seqüência e parâmetros aqui descritos em outra parte.

Variantes de um polinucleotídeo da invenção, emparticular (i.e., o polinucleotídeo referência) podem sertambém avaliados por comparação da identidade de seqüênciapercentual entre o polipeptídeo codificado por umpolinucleotídeo variante e o polipeptídeo codificado pelopolinucleotídeo referência. Assim, por exemplo, umpolinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo comuma dada identidade de seqüência percentual em relação aopolipeptídeo ELF3 ou bHLH-041 de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO:6, respectivamente, é descrito. A identidade de seqüênciapercentual entre quaisquer dois polipeptídeos pode sercalculada usando programas de alinhamento de seqüências eparâmetros aqui descritos em outra parte. Onde qualquerdado par de polinucleotídeos da invenção é avaliado porcomparação da identidade de seqüência percentualcompartilhada pelos polipeptídeos que codificam, aidentidade de seqüência percentual entre os polipeptídeos éde pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%,75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,99% ou mais de identidade de seqüência.

Proteína "variante" deve significar uma proteínaderivada da proteína nativa por deleção ou adição de um oumais aminoácidos em um ou mais sítios na proteína nativae/ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou maissítios na proteína nativa. Proteínas variantes englobadaspela presente invenção são biologicamente ativas, isto é,elas continuam a possuir a atividade desejada biológica daproteína:- nativa,- isto é, atividade de fator de transcriçãopara bHLH-041 e regulação de atividade fotorreceptora paraELF3 como aqui descrito. Tais variantes podem resultar de,por exemplo, polimorfismo genético ou de manipulaçãohumana. Variantes biologicamente ativos de uma proteínaELF3 ou bHLH-041 nativa da invenção terão pelo menos cercade 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%,91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais deidentidade de seqüência em relação à seqüência deaminoácidos para a proteína nativa, como determinado porprogramas de alinhamento de seqüências e parâmetros aquidescritos em outra parte. Um variante biologicamente ativode uma proteína da invenção pode diferir daquela proteínapor tão pouco quanto 1-15 resíduos de aminoácidos, tãopouco quanto 1-10, tal como 6-10, tão pouco quanto 5, tãopouco quanto 4, 3, 2 ou até 1 resíduo de aminoácido.

As proteínas da invenção podem ser alteradas de váriasmaneiras, incluindo substituições, deleções, truncações, einserções de aminoácido. Métodos para tais manipulaçõessão geralmente conhecido na técnica. Por exemplo,variantes e fragmentos de seqüências de aminoácidos dasproteínas ELF3 e bHLH-041 podem ser preparados por mutaçõesno DNA. Métodos para mutagênese e alterações depolinucleotídeos são bem conhecidos na técnica. Ver, porexemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkel, et al., (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; U.S. Patent No. 4, 873, 192; Walker and Gaastra, eds.(1983) - -Techniques in Molecular Biology (MacMillanPublishing Company, New York) e as referências aí cicadas.

Diretrizes para substituições aminoácido apropriadas quenão afetam a atividade biológica da proteína de interessepodem ser encontradas no modelo de Dayhoff, et al., (1978)Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res.Found., Washington, D.C.), aqui incorporado por referência.Substituições conservativas, tais como trocar um aminoácidopor outro tendo propriedades similares, podem ser ótimas.Assim, os genes e polinucleotideos da invenção incluemambas as seqüências naturalmente ocorrentes, assim comoformas mutantes. Da mesma forma, as proteínas da invençãoenglobam tanto proteínas naturalmente ocorrentes comovariações e formas modificadas dessas. Tais variantescontinuarão a possuir a atividade desejada. Obviamente, asmutações que serão feitas no DNA codificando o variante nãodevem posicionar a seqüência fora do fase de leitura e,otimamente, não criar regiões complementares que poderiamproduzir estruturas de mRNA secundárias. Ver, EP PatentApplication Publication No. 75.444.

As deleções, inserções, e substituições das seqüênciasde proteínas aqui englobadas não são esperadas por produzirmudanças radicais nas características da proteína.

Contudo, quando é difícil prever o efeito exato dasubstituição, deleção, ou inserção antes de fazê-lo, alguémespecialista na técnica irá ponderar que o efeito seráavaliado por testes de rastreamento de rotina. Isto é, aatividade pode ser avaliada por análise de plantatransgênica de rotina, observado como um rompimento naresposta a densidade de plantas ou aparência de uma mudançade fenótipo desejada, tal como inibição da resposta deevitar sombra e tolerância aumentada à densidade deplantas.

Polinucleotideos e proteínas variantes também englobamseqüências e proteínas derivadas de um procedimentomutagênico e recombinogênico, tal como embaralhamento deDNA. Com tal procedimento, uma ou mais seqüênciasdiferentes codificadoras de ELF3 ou bHLH-041 podem sermanipuladas para criar uma nova proteína ELF3 ou bHLH-041possuindo as propriedades desejadas. Dessa maneira,bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas apartir de uma população de polinucleotídeos de seqüênciarelacionados compreendendo regiões de seqüência que possuemidentidade de seqüência substancial e podem serhomologamente recombinados in vitro ou in vivo. Porexemplo, usando essa abordagem, motivos de seqüênciacodificando um domínio de interesse podem ser embaralhadosentre o gene de ELF3 ou bHLH-041 da invenção e outros genesde fator de transcrição ELF3 ou bHLH conhecidos,respectivamente, para obter um novo gene codificando umaproteína com uma propriedade de interesse melhorada.

Estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidasna técnica. Ver, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 91:107 47-10751; Stemmer (1994) Nature370:389-391; Crameri, et al., (1997) Nature Biotech.15:436-438; Moore, et al., (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang, et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA94:4504-4509; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288-291; eU.S. Patent Nos. 5.605.793 e 5.837.458.

As composições da invenção também incluem moléculas deácidos nucléicos isoladas compreendendo a seqüência denucleotídeos do promotor de ELF3 de milho (também referidocomo promotor de ZM-ELF3) apresentada em SEQ ID NO: 4. Por"promotor" pretende-se uma região reguladora de DNAcompreendendo usualmente um TATA box capaz de direcionar aRNA polimerase II para iniciar a síntese de RNA no sítio desítio de iniciação de transcrição para uma seqüênciacodificadora em particular. Um promotor pode compreender,adicionalmente, outras seqüências de reconhecimentogeralmente posicionadas acima ou 5' em relação ao TATA box,referida como elementos promotores acima, que influenciam ataxa de iniciação de transcrição. Tais elementos incluemum possível elemento CAAT presente nos nucleotídeos 402-405de SEQ ID NO: 4. Além disso, seis motivos de seqüência comaproximadamente 50% de identidade em relação ao "motivoelemento evening", que está correlacionado com o controlecircadiano de genes vegetais, estão presentes na seqüênciade ZM-ELF3 acima. Ver, Figura 3.

É reconhecido que tendo identificado a seqüência denucleotídeos para a região promotora - aqui descrita, está noestado da técnica isolar e identificar elementosreguladores adicionais na região 5' não traduzida acima, apartir da região promotora em particular aqui definida.

Assim, por exemplo, a região promotora aqui descrita podecompreender ainda elementos reguladores acima que conferemexpressão preferencial de tecidos de seqüências denucleotídeos heterólogas operacionalmente ligadas àseqüência promotora descrita. Ver particularmente,Australian Patent No. AU-A-77751/94 e U.S. Patent Nos.5.466.785 e 5.635.618.

Fragmentos e variantes da seqüência de nucleotideospromotora de ZM-ELF3 descrita são também englobados pelapresente invenção. Por "fragmento" pretende-se uma porçãoda seqüência de nucleotideos. Fragmentos de uma seqüênciade nucleotideos promotora podem reter atividade biológicae, assim, reter sua atividade reguladora de transcrição.

Assim, por exemplo, menos do que toda a seqüência promotoraaqui descrita pode ser utilizada para dirigir a expressãode uma seqüência de nucleotideos de interesseoperacionalmente ligada, tal como uma seqüência denucleotideos codificando uma proteína heteróloga.

Alternativamente, fragmentos de uma seqüência denucleotideos promotora que são úteis como sondas dehibridização geralmente não retêm atividade biológica.

Assim, fragmentos de uma seqüência de nucleotideospromotora podem variar de pelo menos cerca de 20nucleotideos, cerca de 50 nucleotideos, cerca de 100nucleotideos, e até a seqüência de nucleotideos promotorade comprimento total da invenção.

Assim, um fragmento de uma seqüência de nucleotideospromotora de ELF 3 pode codificar uma porção biologicamenteativa do promotor de ELF3, ou pode ser um fragmento quepode ser usado como sonda de hibridização ou primer de PCRusando métodos descritos abaixo. Uma porção biologicamenteativa de um promotor de ELF3 pode ser preparada isolandouma porção de uma das seqüências de nucleotídeos promotorasde ELF3 da invenção, e avaliando a atividade da porção dopromotor de ELF3. Moléculas de ácidos nucléicos que sãofragmentos de uma seqüência de nucleotídeos promotora deELF3 compreendem pelo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200,250, 300, 350, 400, 450 nucleotídeos ou até o número denucleotídeos presentes em uma seqüência de nucleotídeospromotora de ELF3 aqui descrita (por exemplo, 459nucleotídeos para o promotor de ZM-ELF3 apresentado em SEQID NO: 4). Testes para determinar a atividade de umaseqüência promotora são bem conhecidos na técnica. Porexemplo, um fragmento promotor de ELF3 ou variante pode seroperacionalmente ligado à seqüência de nucleotídeoscodificando qualquer proteína repórter, tal como a proteínaβ-glicuronidase (repórter GUS) ou a proteína luciferase. Aconstrução de DNA é inserida no genoma de uma planta oucélula vegetal, e o nível de mRNA ou proteína da seqüênciarepórter é determinado. Ver, por exemplo, Eulgem, et al.,(1999) EMBO Journal 18:4689-4699.

Os polinucleotídeos dã invenção podem ser usados paraisolar seqüências correspondentes de outros organismos,particularmente outras plantas, mais particularmente outrasmonocotiledôneas. Dessa maneira, métodos, tais como PCR,hibridização, e similares, podem ser usados paraidentificar tais seqüências baseado em sua homologia deseqüência em relação às seqüências aqui apresentadas.Seqüências isoladas baseadas em sua identidade de seqüênciaem relação às seqüências de ELF3 ou bHLH-041 inteiras aquiapresentadas ou a variantes e fragmentos dessas sãoenglobadas pela presente invenção. Tais seqüências incluemseqüências que são ortólogas das seqüências descritas.

"Ortólogos" deve significar genes derivados de um geneancestral comum e que são encontrados em diferentesespécies como resultado de especiação. Genes encontradosem diferentes espécies são considerados ortólogos quandosuas seqüências de nucleotideos e/ou suas seqüências deproteínas codificadas compartilham pelo menos 60%, 70%,75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,99% ou mais de identidade de seqüência. As funções deortólogos são freqüentemente altamente conservadas entre asespécies. Assim, polinucleotídeos isolados que codificamuma proteína ELF3 ou bHLH-041, ou polinucleotídeos isoladosque conferem atividade promotora, e que hibridizam sobcondições estringentes às respectivas seqüências denucleotideos de ELF3 ou bHLH-041 aqui descritas, ou avariantes ou fragmentos dessas, são englobados pelapresente invenção.

Em uma abordagem de PCR, primers de oligonucleotídeospodem ser projetados para uso em reações de PCR paraamplificar seqüências DNA correspondentes de cDNA ou DNAgenômico extraído de qualquer planta de interesse. Métodospara projetar tais primers de PCR e clonagem de PCR sãogeralmente conhecidos na técnica e são descritos emSambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A LaboratoryManual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview, New York). Ver também, Innis, et al., eds.(1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995)PCR Strategies (Academic Press, New York); e Innis andGelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press,New York). Métodos de PCR conhecidos incluem, mas não selimitam a, métodos usando primers pareados, primers derefúgio, primers simples específicos, primers degenerados,primers gene-específicos, primers vetor-especificos,primers parcialmente sem correspondência, e similares.

Em técnicas de hibridização, todo ou parte de umpolinucleotídeo é usada como uma sonda que hibridizaseletivamente a outros polinucleotídeos correspondentespresentes em uma população de fragmentos de DNA genômicosou fragmentos de clonados (i.e., bibliotecas de DNAgenômico ou cDNA) de um organismo escolhido. As sondas dehibridização - podem ser fragmentos de DNA genômico,fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA, ou outrosoligonucleotídeos, e podem ser rotulados com um grupodetectável tal como 32P, ou qualquer outro marcadordetectável. Assim, por exemplo, sondas para hibridizaçãopodem ser feitas rotulando-se oligonucleotídeos sintéticosbaseados nos polinucleotídeos de ELF3 ou bHLH-041 dainvenção. Métodos para preparação de sondas parahibridização e para construção de bibliotecas genômicas ede c DNA são geralmente conhecidos na técnica e sãodescritos em Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: ALaboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Plainview, New York).

Por exemplo, um polinucleotideo de ELF3 ou bHLH-041inteiro aqui descrito, ou uma ou mais porções desse, podeser usado como sonda capaz de hibridizar especificamente apolinucleotideos de elf3 ou bHLH-041 correspondentes e RNAsmensageiros. Para alcançar hibridização especifica sob umavariedade de condições, tais sondas incluem seqüências quesão únicas dentre seqüências de polinucleotideos de ELF3 oubHLH-041 e são otimamente pelo menos cerca de 10nucleotideos em comprimento, e mais otimamente pelo menoscerca de 20 nucleotideos em comprimento. Tais sondas podemser usadas para amplificar polinucleotideos correspondentesde uma planta escolhida por PCR. Essa técnica pode serusada para isolar seqüências codificadoras adicionais apartir de uma planta desejada ou como um teste diagnósticopara determinar a presença de seqüências codificadoras ,emuma planta. Técnicas de hibridização incluem rastreamentode hibridização de bibliotecas de DNA plaqueado (tantoplacas ou colônias; ver, por exemplo, Sambrook, et al.,(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., ColdSpring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

A hibridização de tais seqüências pode ser conduzidasob condições estringentes. Por "condições estringentes"ou "condições de hibridização estringentes" pretende-secondições sob as quais uma sonda hibridizará a suaseqüência alvo a um grau detectavelmente maior do que aoutras seqüências (e.g., pelo menos 2 sobre a base).

Condições estringentes são dependentes de seqüência e serãodiferentes em diferentes circunstâncias. Controlando aestringência das condições de hibridização e/ou lavagem,seqüências alvo que são 100% complementares à sonda podemser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente,condições de estringência podem ser ajustadas para permitiralguma falta de correspondência em seqüências de forma quegraus menores de similaridade sejam detectados (sondagemheteróloga). Geralmente, uma sonda é menor que cerca de1000 nucleotideos em comprimento, otimamente menos do que500 nucleotideos em comprimento.

Tipicamente, condições estringentes serão aquelas nasquais a concentração de sais é menor do que cerca de 1,5 Mde ions de Na, tipicamente concentração de cerca de 0,01 a1,0 M de -ions de Na (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e atemperatura é de pelo menos cerca de 30 0C para sondascurtas (e.g., 10 a 50 nucleotideos) e de pelo menos 60 0Cpara sondas longas (e.g., maiores que 50 nucleotideos).

Condições estringentes podem ser alcançadas, também, com aadição de agentes desestabilizantes, tais como formamida.

Condições exemplares de baixa estringência incluemhibridização com uma solução tampão de 30 a 35% deformamida, NaCl 1 M, SDS 1% (sódio dodecil sulfato) a 37 C,e uma lavagem em SSC IX a 2X (SSC 20X = NaCl 3,0 M /trissódio citrato 0,3 Μ) a 50 a 55°C. Condições exemplaresde estringência moderada incluem hibridização em 40 a 45%formamida, NaCllfO M, SDS 1% a 37 C, e uma lavagem em SSC0, 5X a IX a 55 a 60°C. Condições exemplares deestringência elevada incluem hibridização em 50% formamida,NaCl 1 M, SDS 1% a 37 °C, e uma lavagem em SSC 0,1X a 60 a65°C por pelo menos 30 minutos. Opcionalmente, tampões delavagem podem compreender SDS a cerca de 0,1% a cerca de1%. A duração de hibridização é geralmente menos do quecerca de 24 horas, usualmente cerca de 4 a cerca de 12horas. A duração do tempo de lavagem será pelo menos deuma extensão de tempo suficiente para alcançar oequilíbrio.

A especificidade é tipicamente a função de lavagenspós hibridização, os fatores críticos sendo a força iônicae temperatura da solução de lavagem final. Para híbridosDNA-DNA, o ponto térmico de derretimento (Tm) pode seraproximado, a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984)Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) +0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; onde M é a molaridadede cátions monovalentes, %GC é a porcentagem denucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % form é aporcentagem de formamida na solução de hibridização, e L éo comprimento do híbrido em pares de bases. A Tm' é atemperatura (sob definidas força iônica e pH) na qual 50%de uma seqüência alvo complementar hibridiza a uma sondaperfeitamente correspondente. A Tm é reduzida em cerca de1 C para cada 1% de falta de correspondência; assim,condições de Tm, hibridização, e/ou lavagem podem serajustadas para hibridizar a seqüências da identidadedesejada. Por exemplo, se seqüências com >90% deidentidade são procuradas, a Tm pode ser diminuída em IO0C.

Por exemplo, se seqüências com >90% de identidade sãoprocuradas, a Tm pode ser diminuída em 10°C. Geralmente,condições estringentes são selecionadas para serem cerca de5 cC menores do que o ponto térmico de derretimento (Tm)para a seqüência específica e seu complemento em umadefinida força iônica e pH. Contudo, condições severamenteestringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a1, 2, 3, ou 4 C menor do que o ponto térmico dederretimento (Tm); condições moderadamente estringentespodem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9ou IO0C menor do que o ponto térmico de derretimento (Tm) ;condições de baixa estringência podem utilizar umahibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20°Cmenor do que o ponto térmico de derretimento (Tm). Usandoa equação, composições de hibridização e lavagem, e Tmdesejada, aqueles de habilidade ordinária entenderão quevariações na estringência de soluções de hibridização e/oulavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado defalta de correspondência resulta em uma Tm de menos do que45 C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), épreferível aumentar a concentração de SSC de forma que umamaior temperatura possa ser usada. Um guia extensivo paraa hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Aeid Probes, Part I,Chapter 2 (Elsevier, New York); e Ausubel, et al., eds.(1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Ver,Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A LaboratoryManual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview, New York).

Os seguintes termos são usados para descrever asrelações de seqüência entre dois ou mais polinucleotideosou polipeptideos: (a) "seqüência referência", (b) "janelade comparação", (c) "identidade de seqüência", e (d)"porcentagem de identidade de seqüência".

(a) Como aqui usado, "seqüência referência" é umaseqüência definida usada como base para comparação deseqüências. Uma seqüência referência pode ser um subgrupoou a totalidade de uma seqüência especificada; por exemplo,como um segmento de um cDNA ou seqüência gênica decomprimento total, ou o cDNA ou seqüência gênica completos.

(b) Como aqui usado, "janela de comparação" fazreferência a um segmento contíguo e específico de umaseqüência de polinucleotideos, caracterizado pelo fato deque a seqüência de polinucleotideos na janela de comparaçãopode compreender adições ou deleções (i.e., espaços)comparada à seqüência referência (que não compreendeadições ou deleções) para ótimo alinhamento dos doispolinucleotideos. Geralmente, a janela de comparação é depelo menos 20 nucleotideos contíguos em comprimento, eopcionalmente podem ser de 30, 40, 50, 100, ou mais longa.

Aqueles especialistas na técnica entendem que evitar umaalta similaridade para uma seqüência referência devido àinclusão de espaços (gaps) na seqüência depolinucleotideos, uma penalidade por espaço é tipicamenteintroduzida e subtraída do número de correspondências.

Métodos de alinhamento de seqüências para comparaçãosão bem conhecidos na técnica. Assim, a determinação deidentidade de seqüência percentual entre quaisquer duasseqüências pode ser alcançada usando um algoritmomatemático. Exemplos não limitantes preferidos de taisalgoritmos matemáticos são algoritmo de Myers and Miller(1988) CABIOS 4:11-17; o algoritmo de alinhamento local deSmith, et al., (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; o algoritmode alinhamento global de Needleman and Wunseh (1970) J.Mol. Biol. 48:443-453; o algoritmo de Pearson and Lipman(1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85: 2444-2448; o algoritmode Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA87:2264, modificado como em Karlin and Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877.

Implementações de computador desses algoritmosmatemáticos podem ser utilizadas para comparação deseqüências para determinar a identidade de seqüência. Taisimplementações incluem, mas não são limitadas a: CLUSTAL noprograma PC/Gene (disponível da Intelligenetics, MountainView, Califórnia); o programa ALIGN (Version 2.0); e GAP,BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA no pacote de softwareWisconsin Geneties Software Paekage of Geneties ComputerGroup, Version 10 (disponibilizado pela Accelrys, 9685Seranton Road, San Diego, CA, 92121, USA). Alinhamentosusando esses programas podem ser realizados usando osparâmetros padrão. 0 programa CLUSTAL é bem descrito porHiggins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins etal. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) NucleicAcids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; e Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:301-331. 0programa ALIGN é baseado no algoritmo de Myers and Miller(1988) supra. Uma tabela de peso de resíduos PAM120, umapenalidade por comprimento de espaço de 12, e umapenalidade por espaço de 4 podem ser usadas com o programaALIGN quando comparando seqüências de aminoácidos. Osprogramas BLAST de Altschul et al.. (1990) J. Mol. Biol.215:403 são baseados no algoritmo de Karlin and Altschul(1990) supra. As buscas de nucleotídeos BLAST podem serrealizadas com o programa BLASTN, pontuação = 100, tamanhode palavra = 12, para obter seqüências de nucleotídeoshomólogas a uma seqüência de nucleotídeos codificando umaproteína da invenção. Buscas por proteína BLAST podem serefetuadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, tamanho depalavra = 3, para obter seqüências de aminoácidos homólogasa uma proteína ou polipeptídeo da invenção. Para obteralinhamentos com espaços para propósitos de comparação,Gapped BLAST (em BLAST 2.0) pode ser utilizado comodescrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389. Alternativamente, PSI-BLAST (em BLAST 2.0) podeser usado para efetuar uma busca iterada que detectarelações distantes entre moléculas. Ver Altschul et al.(1997) supra. Quando usando BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST,os parâmetros padrão dos respectivos programas (e.g.,BLASTN para seqüências de nucleotideos, BLASTX paraproteínas) podem ser usados. Ver, www.ncbi.nlm.nih.gov. 0alinhamento pode ser também realizado manualmente porinspeção.

A menos que declarado ao contrário, os valores deidentidade de seqüência/similaridade aqui providos referem-se ao valor obtido usando o programa GAP version 10 usandoos seguintes parâmetros: % identidade e % similaridade parauma seqüência de nucleotideos usando GAP Weight de 50 eLength Weight de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp;% identidade e % similaridade para uma seqüência deaminoácidos usando GAP Weight de 8 e Length Weight de 2, ea matriz de pontuação BLOSUM62.

GAP usa o algoritmo de Needleman and Wunsch (1970) J.Mol. Biol. 48:443-453, para encontrar o alinhamento de duasseqüências completas que maximiza o número decorrespondências e minimiza o número de espaços. GAPconsidera todas as posições de alinhamento e de espaçospossíveis e cria o alinhamento com o maior número de basescom correspondência e o menor de espaços. Isto permite aprovisão de uma penalidade de criação de espaços e umapenalidade de extensão de espaços em unidades de bases comcorrespondência. GAP deve fazer um saldo de número depenalidade de criação de espaços de correspondências paracada espaço que insere. Se uma penalidade por extensão deespaço maior que zero é escolhida, GAP deve,adicionalmente, fazer um saldo para cada espaço inserido docomprimento do espaço vezes a penalidade por extensão deespaço. Valores padrão de penalidade de criação de espaçose valores de penalidade de extensão de espaços na Versão 10do pacote de software Wisconsin Genetics Software Packagepara seqüências de proteínas são 8 e 2, respectivamente.Para seqüências de nucleotídeos, a penalidade padrão paracriação de espaço é de 50, enquanto a penalidade padrão porextensão de espaço é de 3. As penalidades de criação eextensão de espaços podem ser expressas como um númerointeiro selecionado do grupo de números -..inteirosconsistindo de 0 a 200. Assim, por exemplo, as penalidadesde criação e extensão de espaços podem ser 0, 1, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,65 ou maiores.

GAP apresenta um membro da família de alinhamentosótimos. Podem existir vários membros dessa família, masnenhum outro membro possui uma melhor qualidade. GAPapresenta quatro figuras de mérito para alinhamentos:qualidade, proporção, identidade, e similaridade. Aqualidade é a métrica maximizada para alinhar asseqüências. Proporção é a qualidade dividida pelo númerode bases no segmento mais curto. Porcentagem de identidadeé o percentual dos símbolos que de fato se correspondem.

Porcentagem de similaridade é o percentual dos símbolos quesão similares. Símbolos que estão através dos espaços sãoignorados. Uma similaridade é pontuada quando o valor damatriz de pontuação para um par de símbolos é maior ouigual a 0,50, o limite de similaridade. A matriz depontuação usada na Versão 10 do pacote de software GCGWisconsin Genetics Software Package é BLOSUM62 (ver,Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA89:10915).

(c) Como aqui usado, "identidade de seqüência", ou"identidade" no contexto de duas seqüências depolinucleotídeos ou polipeptídeos, faz referência aosresíduos nas duas seqüências que são a mesma quandoalinhadas para correspondência máxima sobre uma janela decomparação específica. Quando a porcentagem de identidadede seqüência é usada em referência a proteínas, éreconhecido que posições de resíduos, que não sãoidênticos, freqüentemente diferem por substituições deaminoácidos conservativas, onde os resíduos de aminoácidossão substituídos por outros resíduos de aminoácidos compropriedades químicas similares (e.g., carga ouhidrofobicidade) e, portanto, não mudam as propriedadesfuncionais da molécula. Quando seqüências diferem emsubstituições conservativas, a identidade de seqüênciapercentual pode ser ajustada para cima para corrigir anatureza conservativa da substituição. Seqüências quediferem por tais substituições conservativas são ditastendo "similaridade de seqüência" ou "similaridade". Meiosde fazer esse ajuste são bem conhecidos daquelesespecialistas na técnica. Tipicamente, isso envolve pontuaruma substituição conservativa como uma parcial, ao invés deuma falta de correspondência completa, aumentando, dessaforma, a porcentagem de identidade de seqüência. Assim,por exemplo, onde um aminoácido idêntico recebe umapontuação de 1 e uma substituição não conservativa recebeuma pontuação de zero, uma substituição conservativa recebeuma pontuação entre zero e 1. A pontuação de substituiçõesconservativas é calculada, e.g., como implementado noprograma PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View,Califórnia).

(d) Como aqui usado, "porcentagem de identidade deseqüência" significa o valor determinado comparando-se duasseqüências otimamente alinhadas por uma janela decomparação, caracterizado pelo fato de que a porção daseqüência de polinucleotideos na janela de comparação podecompreender adições ou deleções (i.e., espaços), secomparada à seqüência referência (que não compreendeadições ou deleções) para alinhamento ótimo das duasseqüências. A porcentagem é calculada determinando-se onúmero de posições nas quais a base de ácido nucléico ouresíduo de aminoácido ocorre em ambas seqüências parapermitir o número de posições com correspondência,dividindo o número de posições com correspondência pelonúmero total de posições na janela de comparação, emultiplicando o resultado por 100 para produzir aporcentaqem de identidade de seqüência.

O uso do termo "polinucleotídeo" não pretendelimitar a presente invenção a polinucleotídeoscompreendendo DNA. Aqueles de conhecimento ordinário natécnica reconhecerão que polinucleotídeos podem compreenderribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos edesoxirribonucleotídeos. Tais desoxirribonucleotídeos eribonucleotídeos incluem ambas moléculas naturalmenteocorrentes e análogas sintéticas. Os polinucleotídeos dainvenção também englobam todas as formas de seqüênciasincluindo, mas não se limitando a, formas de fita simples,formas de dupla---<fita, hairpins, estruturas stem-and-loop, esimilares.

Os polinucleotídeos de ELF3 e bHLH-041 podem serprovidos em cassetes de expressão para expressão na plantade interesse. Como indicado acima, para supressão daresposta de evitar sombra, para manipulação de níveis deELF3, os cassetes irão prover a expressão do polipeptídeoELF3, ao mesmo tempo em que a manipulação dos níveis debHLH-041, os constructos serão preparados para suprimir aexpressão do polipeptideo bHLH-041 em linhagenstransgênicas. O cassete incluirá as seqüências reguladoras5' e 3' operacionalmente ligadas a uma seqüênciacodificadora de ELF3 ou um polinucleotideo que, quandoexpresso, é capaz de reduzir ou eliminar a expressão dopolipeptideo bHLH da invenção ou fator de transcrição bHLHrelacionado. "Operacionalmente ligado" deve significar umaligação funcional entre dois ou mais elementos. Porexemplo, uma ligação operacional entre um polinucleotideode interesse e uma seqüência reguladora (i.e., um promotor)é uma ligação funcional que permite a expressão dopolinucleotideo de interesse. Elementos operacionalmenteligados podem ser contíguos ou não contíguos. Quandousados para referir-se à junção de duas regiõescodificadoras de proteína, por operacionalmente ligadopretende-se que as regiões codificadores estejam na mesmafase de leitura. 0 cassete pode conter, adicionalmente,pelo menos um gene adicional a ser co-transf ormado noorganismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(is)pode ser provido em múltiplos cassetes de expressão. Talcassete de expressão é provido com uma pluralidade desítios de restrição e/ou sítios de recombinação parainserção do polinucleotideo a estar sob regulaçãotranscricional das regiões reguladoras. O cassete deexpressão pode conter adicionalmente genes marcadores deseleção.O cassete de expressão incluirá, geralmente, nadireção 5'-3' de transcrição, uma região de iniciaçãotranscricional e de iniciação de tradução (i.e., umpromotor), um polinucleotideo da invenção, e uma região determinação transcricional e terminação de tradução (i.e.,região de terminação) funcional em plantas. As regiõesreguladoras (i.e., promotores, regiões reguladoras detranscrição, e regiões de terminação de tradução) e/ou opolinucleotideo da invenção pode ser nativo/análogo àcélula hospedeira ou uma à outra. Alternativamente, asregiões reguladoras e/ou o polinucleotideo da invençãopodem ser heterólogos à célula hospedeira ou uma à outra.

Como aqui usado, "heteróloga" em referência a uma seqüênciaé uma seqüência que se origina de uma espécie estrangeira,ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificada desua forma nativa em composição e/ou lócus genômico porintervenção humana deliberada. Por exemplo, um promotoroperacionalmente ligado a um polinucleotideo heterólogo éde uma espécie diferente ~. da espécie da qual opolinucleotideo foi derivado, ou, se da mesma/análogaespécie, um ou ambos são substancialmente modificados desua forma original e/ou lócus genômico, ou o promotor não éo promotor nativo para o polinucleotideo operacionalmenteligado. Como aqui usado, um gene quimérico compreende umaseqüência codificadora operacionalmente ligada a uma regiãode iniciação de transcrição que é heteróloga à seqüênciacodificadora.Enquanto pode ser ótimo expressar as seqüências usandopromotores heterólogos, as seqüências promotoras nativaspodem ser usadas. Tais constructos podem mudar os níveisde expressão de ELF3 ou bHLH-041 na planta ou célulavegetal. Assim, o fenótipo da planta ou célula vegetalpode ser alterado.

A região de terminação pode ser nativa em relação àregião de iniciação de transcrição, pode ser nativa emrelação ao polinucleotídeo operacionalmente ligado deinteresse, pode ser nativa em relação à planta hospedeira,ou pode ser derivada de outra fonte (i.e., estrangeira ouheteróloga ao promotor, o polinucleotídeo de interesse, aplanta hospedeira, ou qualquer combinação desses. Regiõesde terminação convenientes são disponibilizadas a partir doplasmídio Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões determinação de octopina sintase e nopalina sintase. Vertambém, Guerineau, et al. , (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64-,:.671-674,\ Sanfacon, et al.,(1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen, et al., (1990) PlantCell 2:1261-1272; Munroe, èt al., (1990) Gene 91:151-158;Bailas, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7 8 91-7 903; eJoshi, et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639.

Onde apropriado, os polinucleotídeos podem serotimizados para expressão aumentada na planta transformada.Isto é, os polinucleotídeos podem ser sintetizados usandocódons preferenciais de planta para expressão melhorada.Ver, por exemplo, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol.92:1-11 para uma discussão de uso de códon preferido dehospedeiro. Métodos estão disponíveis na técnica parasintetizar genes preferidos de plantas. Ver, por exemplo,U.S. Patent Nos. 5.380.831, e 5.436.391, e Murray, et al.,(1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, aqui incorporados porreferência.

Modificações adicionais de seqüência são conhecidaspor intensificar a expressão gênica em um hospedeirocelular. Essas incluem a eliminação de seqüênciascodificando sinais de poliadenilação falsos, sinais desítio de splice éxon-íntron, repetições tipo transposon, eoutras tais seqüências bem caracterizadas que podem serdeletérias à expressão gênica. 0 conteúdo G-C da seqüênciapode ser ajustado a níveis médios para um dado hospedeirocelular, como calculado por referência para genesconhecidos expressos na célula hospedeira. Quandopossível, a seqüência é modificada para evi-tar estruturashairpin secundárias de mRNA previstas.

Os cassetes de expressão podem conter adicionalmenteseqüências líder 5'. Tais seqüências líder podem atuarpara intensificar a tradução. Líderes de tradução sãoconhecidos na técnica e incluem: líderes de picornavírus,por exemplo, líder de EMCV (região 5' não codificadora deEncefalomiocardite) (Elroy-Stein, et al., (1989) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 86:6126-6130); líderes de potivírus,por exemplo, líder de TEV (Vírus Etch de Tabaco) (Allisonet al. (1986) Virology 154:9-20); líder de MDMV (Vírus deMosaico do Milho Anão); proteína ligante de imunoglobulinahumana de cadeia pesada (BiP) (Macejak et al. (1991)Nature 353:90-94); líder não traduzido de proteína de capade mRNA de vírus de mosaico de alfafa (AMV RNA 4) (Joblinget al. (1987) Nature 325:622-625); líder de vírus demosaico de tabaco (TMV) (Gallie, et al., (1989) inMolecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp.237-256); e líder de vírus clorótico de milho (MCMV)(Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Ver, também,Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology 84:965-968.

No preparo do cassete de expressão, os váriosfragmentos de DNA podem ser manipulados, de forma a proveras seqüências de DNA na orientação correta e, seapropriado, na fase de leitura correta. Nesse sentido,adaptadores ou ligantes podem ser empregados para juntar osfragmentos de DNA, ou outras manipulações, podem serenvolvidos para prover sítios de restrição convenientes,remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição,ou similares. Para este propósito, mutagênese in vitro,reparo de primer, restrição, anelamento, re-substituições,e.g., transições e transversões, podem ser envolvidos.

Um número de promotores pode ser usado na prática dainvenção, incluindo o promotor nativo da seqüência depolinucleotídeos de interesse. Os promotores podem serselecionados baseado no resultado desejado. Isto é, osácidos nucléicos podem ser combinados com promotoresconstitutivos, promotores preferenciais de tecidos,incluindo, mas não se limitando a, promotores preferenciaisde folhas, promotores levemente regulados ou levementeinduzidos, promotores regulados por relógio circadiano, ououtros promotores para expressão em plantas. Promotoresconstitutivos ou preferenciais de tecido vegetativo seriampreferidos.

Tais promotores constitutivos incluem, por exemplo, opromotor núcleo do promotor de Rsyn7 e outros promotoresconstitutivos descritos em WO 99/43838 e U.S. Patent No.6.072.050; o promotor núcleo de CaMV 35S (Odell, et al. ,(1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy, etal., (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen,et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen,et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last, et- al., (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten,et al., (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (U.S.Patent No. 5,659,026), e similares. Outros promotoresconstitutivos incluem, por exemplo, U.S. Patent Nos.5. 608.14 9; 5.608.144; 5.604 .121; 5.569.597; 5.4 66.7 85;5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; 6.177.611; 6.670.467; e6.504.083.

Promotores preferenciais de tecidos podem serutilizados para direcionar a expressão em um tecido vegetalem particular. Promotores preferenciais de tecidos incluemYamamoto, et al., (1997) Plant J. 12 (2) :255-265; Kawamata,et al., (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen,et al., (1997) Mol. Gen Genet. 254(3) :337-343; Russell, etal., (1997) Transgenic Res. 6(2) :157-168; Rinehart, et al.,(1996) Plant Physiol. 112(3) :1331-1341; Van Camp, et al.,(1996) Plant Physiol. 112 (2):525-535; Canevascini, et al.,(1996) Plant Physiol. 112(2) :513-524; Yamamoto, et al.,(1994) Plant Cell Physiol. 35 (5) : 773-778; Lam (1994)Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco, et al.,(1993) Plant Mol Biol. 23 (6) : 1129-1138; Matsuoka, et al.,(1993) Proc Natl. Acad. Sei. USA 90 (20) :9586-9590; eGuevara-Garcia, et al., (1993) Plant J. 4(3):495-505. Taispromotores podem ser modificados, se necessário, para fracaexpressão.

Promotores preferenciais de folhas são conhecidos natécnica. Ver, por exemplo, Yamamoto, et al., (1997) PlantJ. 12(2):255-265; Kwon, et al., (1994) Plant Physiol.105:357-67; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol.35 (5) :773-778; Gotor, et al. , (1993) Plant J. 3:509-18;Orozco, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 23 (6) :1129-1138; eMatsuoka, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA90(20) :9586-9590.

Promotores regulados por luz ou induzidos por luzprovêm a expressão de seqüências de nucleotideosoperacionalmente ligadas em resposta a quantidade e/ouqualidade de luz no ambiente da planta. Promotoresregulados por luz são conhecidos na técnica, incluindo, masnão limitados a, promotores de genes de subunidade pequenade ribulose bisfosfato carboxilase (Rubisco) (rbcS)oriundos de uma variedade de espécies (ver, por exemplo,Kyozuka, et al., (1993) Plant Physiol. 102:991-1000discutindo os promotores de rbcS de arroz e tomate; Bansal,et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. 89:3654-3658, eSchaffner and Sheen (1991) Plant Cell 3 (9) : 997-1012, ambosdiscutindo o promotor de rbcS de milho; e Timko, et al.,(1985) Nature 318:579-582, e Coruzzi, et al., (1984) EMBOJ. 3(8) :1671-1679, ambos discutindo o promotor de rbcS deervilha); promotores de genes de fosfoenolpiruvatocarboxilase (PEPC) (ver, por exemplo, Matsuoka, et al.,(1994) Plant J. 6(3):311-319 discutindo o promotor de PEPCde milho); promotores de genes de proteína de ligação declorofila a/b (ver, por exemplo, Bansal, et al., (1992)Proc. Natl. Acad. Sei. 89:3654-3658 discutindo seqüênciapromotora de eab-ml de..milho); e similares.

Outros promotores de interesse incluem, mas não estãolimitados a, promotores que são responsivos a ritmoscircadianos, aqui referidos como promotores regulados porrelógio circadiano. Exemplos incluem, mas não estãolimitados, promotores de genes do complexo de coleta de luz(LHC) (ver, por exemplo, Piechulla (1998) Chronobiol. Int.16(2) : 15-128 e Piechulla, et al., (1998) Plant Mol. Biol.38(4):655-662); promotores de chalcona sintase (CHS) (ver,por exemplo, Thain, et al., (2002) Plant Physiol.130(1):102-110); promotores de genes de fitocromo ecriptocromo (ver, por exemplo, Tóth, et al., (2001) PlantPhysiol. 127:1607-1616; e similares.

O cassete de expressão pode também compreender um genemarcador de seleção para a seleção de célulastransformadas. Genes marcadores de seleção são utilizadospara a seleção de células ou tecidos transformados. Genesmarcadores incluem genes codificando resistência aantibióticos, tais como aqueles codificando neomicinafosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase(HPT), assim como genes conferindo resistência a compostosherbicidas, tais como amônio glifosinato, bromoxinil,imidazolinonas, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D).

Marcadores de seleção adicionais incluem marcadoresfenotipicos, tais como β-galactosidase e proteínasfluorescentes, tais como proteína verde fluorescente (GFP)(Su, et al., (2*0 0 4) Biotechnol Bioeng 85:610-9 e Fetter, etal., (2004) Plant Cell 16:215-28), proteínacianofluorescente (CYP) (Bolte, et al., (2004) J. CellScience 117:943-54 e Kato, et al., (2002) Plant Physiol.129:913-42), e proteína amarelo fluorescente (PhiYFP™ daEvrogen, ver, Bolte, et al., (2004) J. Cell Science117:943-54). Para marcadores de seleção adicionais, ver,em geral, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511;Christopherson, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA89:6314-6318; Yao, et al., (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff(1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley, et al., (1980)The Operon, pp. 177-220; Hu, et al., (1987) Cell 48:555-566; Brown, et al., (1987) Cell 49:603-612; Figge, et al.,(1988) Cell 52:713-722; Deuschle, et al., (1989) Proc.Natl. Acad. Aci. USA 8 6:54 00-54 04; Fuerst, et al., (1989)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8 6:254 9-2553; Deuschle, et al.,(1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis,University of Heidelberg; Reines, et al., (1993) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 90:1917-1921; Labow, et al., (1990)Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti, et al., (1992)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8 9:3952-3956; Baim, et al.,(1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:5072-507 6; Wyborski,et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:4 647-4 653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162;Degenkolb, et al., (1991) Antimicrob. Agents Chemother.35:1591-1595; Kleinschnidt, et al., (1988) Biochemistry27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University ofHeidelberg; Gossen, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 89:5547-5551; Oliva, et a-1., (1992) Antimicrob. AgentsChemother. 36:913-919; Hlavka, et al., (1985) Handbook ofExperimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag,Berlin); Gill, et al., (1988) Nature 334:721-724. Taisdescrições são aqui incorporadas por referência.

A lista acima de genes marcadores de seleção não éfeita para ser limitante. Qualquer gene marcador deseleção pode ser usado na presente invenção.Os métodos da invenção envolvem introduzir umpolipeptideo ou polinucleotídeo em uma planta."Introduzir" deve significar apresentar à planta opolinucleotídeo ou polipeptideo de maneira que a seqüênciaganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Osmétodos da invenção não dependem de um método em particularpara introduzir uma seqüência em uma planta, apenas que ospolinucleotídeos ou polipeptídeos ganhem acesso ao interiorde pelo menos uma célula da planta. Métodos paraintroduzir polinucleotídeos ou polipeptídeos em plantas sãoconhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a,métodos de transformação estável, métodos de transformaçãotransiente, e métodos mediados por vírus.

"Transformação estável" deve significar que aconstrução de nucleotídeo introduzido em uma planta seintegra no genoma da planta e é capaz de ser herdado pelaprogênie desta. "Transformação transiente" deve significarque um polinucleotídeo é introduzido na planta e não seintegra no genoma da planta ou um polipeptideo éintroduzido em uma planta.

Protocolos de transformação, assim como protocolospara introduzir polipeptídeos ou seqüências depolinucleotídeos em plantas podem variar dependendo do tipode planta ou célula vegetal, i.e., monocotiledônea oudicotiledônea, visada para transformação. Métodos adequadosde introduzir polipeptídeos e polinucleotídeos em célulasvegetais incluem microinjeção (Crossway, et al., (1986)Biotechniques 4 :320-334), eletroporação (Riggs, et al.,(1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5602-5606,transformação mediada por Agrobacterium (U.S. Patent No.5.563.055 e U.S. Patent No. 5.981.840), transferênciadireta de gene (Paszkowski, et al., (1984) EMBO J.3:2717-2722), e aceleração balística de partículas (ver,por exemplo, U.S. Patent Nos. 4.945.050; U.S. Patent No.5.879.918; U.S. Patent No. 5.886.244; e, 5.932.782; Tomes,et al., (1995) in Plant Cellf Tissue, and Organ Culture:Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe, et al., (1988) Biotechnology6:923-926); e transformação Lecl (W0 00/28058). Vertambém, Weissinger, et al., (1988) Ann. Rev. Genet.22:421-477; Sanford, et al., (1987) Particulate Science andTechnology 5:27-37 (cebola); Christou, et al., (1988) PlantPhysiol. 87:671-674 (soja); McCabe, et al., (1988)Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer and McMullen (1991)In vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (soja).;. Singh, et al.,(1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta, etal., (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein, et al.,(1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:4305-4309 (milho);Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559-563 (milho); U.S.Patent Nos. 5.240.855; 5.322.783; e, 5.324.646; Klein, etal., (1988) Plant Physiol". 91 : 440-444 (milho); Fromm, etal., (1990) Biotechnology 8:833-839 (milho); Hooykaas-VanSlogteren, et al., (1984) Nature (London) 311:763-764; U.S.Patent No. 5.736.369 (cereais); Bytebier, et al., (1987)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); DeWet, et al., (1985) in The Experimental Manipulation ofOvule Tissues, ed. Chapman, et al., (Longman, New York),pp. 197-209 (pólen); Kaeppler, et al., (1990) Plant CellReports 9:415-418 e Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl.Genet. 84:560-566 (transformação mediada por fios decarboneto de silício); D1Halluin, et al., (1992) Plant Cell4 :1495-1505 (eletroporação); Li, et al., (1993) Plant CellReports 12:250-255 e Christou and Ford (1995) Annals ofBotany 75:407-413 (arroz); Osjoda, et al., (1996) NatureBioteehnology 14:745-750 (milho via Agrobacteriumtumefaciens); todos os quais são aqui incorporados porreferência.

Em outros avanços, um polinucleotídeo da invenção podeser introduzido em plantas levando as plantas em contatocom um vírus ou ácidos nucléicos virais. Geralmente, taismétodos envolvem incorporar uma construção de nucleotídeoda invenção em uma molécula de DNA ou RNA viral. Éreconhecido que uma proteína ELF3 ou bHLH-041 da invençãopode ser inicialmente sintetizada como parte de umapoliproteína viral, a qual pode ser processada mais tardepor proteólise in vivo ou in vitro para produzir a proteínarecombinante desejada. Ainda, é reconhecido que promotoresda invenção também englobam promotores utilizados paratranscrição por RNA polimerases virais. Métodos paraintroduzir polinucleotídeos em plantas e expressar umaproteína aí codificada, envolvendo moléculas de DNA ou RNAviral, são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo,U.S. Patent Nos. 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785,5.589.367, 5.316.931, e Porta, et al., (1996) MolecularBiotechnology 5:209-221; aqui incorporados por referência.

Métodos são conhecidos na técnica para a inserçãodirecionada de um polinucleotideo em uma localidadeespecifica no genoma da planta. Em um avanço, a inserçãodo polinucleotideo em uma localidade genômica desejada éalcançada usando um sistema de recombinação sítio-especifico. Ver, por exemplo, WO 99/25821, WO 99/25854, WO99/25840, WO 99/25855, e WO 99/25853, todas as quais sãoaqui incorporadas por referência. Resumidamente, opolinucleotideo da invenção pode estar contido em umcassete de transferência flanqueado por dois sítios derecombinação não recombinogênicos. 0 cassete detransferência é introduzido em uma planta tendo incorporadoestavelmente em seu genoma um sítio alvo que é flanqueadopor dois sítios de recombinação não recombinogênicos quecorrespondem aos sítios do cassete de transferência. Umarecombinase apropriada é provida e o cassete detransferência é integrado no sítio alvo. 0 polinucleotideode interesse é, dessa forma, integrado em uma posiçãocromossômica específica no genoma da planta.

As células que foram transformadas podem sercultivadas em plantas de acordo com meios convencionais.

Ver, por exemplo, McCormick, et al., (1986) Plant CellReports 5:81-84. Essas plantas podem ser, então,cultivadas e tanto polinizadas com a mesma linhagemtransformada ou linhagens diferentes, e a progênieresultante tendo expressão da. característica fenotípicadesejada identificada. Duas ou mais gerações podem sercultivadas para assegurar que a expressão da característicafenotípica desejada seja estavelmente mantida e herdada e,então, sementes colhidas para assegurar que a expressão dacaracterística fenotípica desejada foi alcançada. Dessamaneira, a presente invenção provê semente transformada(também referidas como "semente transgênica") tendo umpolinucleotídeo da invenção, por exemplo, um cassete deexpressão da invenção, incorporado estavelmente em seugenoma.

Como aqui usado, o termo célula vegetal incluiprotoplastos vegetais, assim como células em culturas detecido vegetal das quais plantas podem ser regeneradas,- incluindo calos vegetais e moitas. Células vegetais podemestar intactas em plantas ou partes de plantas, tais comoembriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, galhos,fruto, grãos, espigas, sabugos, cascas, talos, raízes,pontas de raízes, anteras, e similares.

Grão deve significar a semente madura produzida porcultivadores comerciais para propósitos que não de cultivarou reproduzir a espécie.Progênie, variantes, e mutantes das plantasregeneradas são também incluídos no escopo da invenção,provido que essas partes compreendem os polinucleotídeosintroduzidos.

A presente invenção pode ser usada para transformaçãode quaisquer espécies vegetais, incluindo, mas não selimitando a, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplosde espécies vegetais de interesse incluem, mas não sãolimitados a, milho (Zea mays), Brassica sp. (e.g., B.napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelasespécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente,alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio(Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare),milhete (e.g., milheto (Pennisetum glaucum)), painço(Panicum miliaceum), painço português (Setaria italica),capim (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus),cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum),soja (Glycin& max), - tabaco (Nicotiana tabacum), batata(Solanum tuberosum), amendoins (Arachis hypogaea), algodão(Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata-doce(Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café(Cofea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananascomosus), árvores cítricas (Citrus spp.), cacau (Theobromacacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.),abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba(Psidium guajava), manga (Mangifera indica), azeitona (OIeaeuropaea), mamão-papaia (Carica papaya), caju (Anacardiumoccidentale) , macadâmia (Macadamia integrifolia) , amêndoa(Prunus amygdalus), beterraba (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum spp.), aveias, cevada, verduras, plantasornamentais, e coniferas.

Verduras incluem tomates (Lycopersicon esculentum),alface (e.g., Lactuca sativa), feijões (Phaseolus vulgarise Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.), e membrosdo gênero Cueumis, tais como pepino (C. sativus), cantalupo(C. eantalupensis), e melão (C. melo). Plantas ornamentaisincluem azaléia (Rhododendron spp.), hortênsia (Maerophyllahydrangea), hibisco (Hibiseus rosasanensis), rosas (Rosaspp.), tulipas (Tulipa spp.), narcisos (Nareissus spp.),petúnias (Petunia hybrida), cravo (Dianthus earyophyllus),bico-de-papagaio (Euphorbia puleherrima), e crisântemo.

Coniferas que podem ser empregadas na prática dapresente invenção incluem, por exemplo, pinheiros tais comopinheiro da variedade- loblolly (Pinus taeda), pinheiroslash (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinusponderosa), pinheiro lodgepole (Pinus eontorta), e pinheirode Monterey (Pinus radiata); Pseudotsuga (Pseudotsugamenziesii); cicuta do oeste (Tsuga eanadensis); espruceSitka (Pieea glauca); sequóia (Sequoia sempervirens);abetos verdadeiros, tais como abeto prateado (Abiesamabilis) e bálsamo (Abies balsamea); e cedros, tais comocedro vermelho (Thuja plieata) e cedro-amarelo do Alasca(Chamaeeyparis nootkatensis). Em avanços específicos,plantas da presente invenção são plantas de cultivo (porexemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão,cártamo, amendoim, sorgo, trigo, milhete, tabaco, etc.). Emoutros avanços, plantas de milho e soja são ótimas, e aindaem outros avanços plantas de milho são ótimas.

Uma "planta objeto" ou "célula vegetal objeto" é umana qual a alteração genética, tal como transformação, foiefetuada como para um gene de interesse, ou é uma planta oucélula vegetal que descende de uma planta ou célula vegetalassim alterada e que compreende a alteração. Um "controle"ou "planta controle" ou "célula vegetal controle" provê umponto de referência para medir mudanças na planta ou célulavegetal objeto.

Uma planta controle ou célula vegetal controle podecompreender, por exemplo: (a) uma planta ou célula vegetalde tipo selvagem, i.e., do mesmo genótipo que o materialinicial para a alteração genética que. resultou na plantaobjeto ou célula vegetal objeto; (b) uma planta ou célulavegetal do mesmo genótipo que o material inicial, mas quenão foi transformada com uma construção nula (i.e. com umaconstrução que não possui efeito no traço de interesse, talcomo uma construção compreendendo um gene marcador); (c)uma planta ou célula vegetal que é um segregante nãotransformado dentre a progênie de uma planta objeto oucélula vegetal objeto; (d) uma planta ou célula vegetalgeneticamente idêntica à planta objeto ou célula vegetalobjeto, mas que não é exposta a condições ou estímulos queinduziria a expressão do gene de interesse; ou (e) a plantaobjeto ou célula vegetal objeto propriamente, sob condiçõesnas quais o gene de interesse não é expresso.

Em certas espécies, tais como milho, as plantascontrole e plantas referência podem representar doishíbridos, onde o primeiro híbrido é produzido a partir deduas linhagens parentais entrecruzadas, e o segundo híbridoé produzido a partir das mesmas duas linhagens parentaisentrecruzadas exceto que uma das linhagens parentaisentrecruzadas contém uma construção de DNA recombinante. Odesempenho do segundo híbrido seria medido, tipicamente,relativo ao primeiro híbrido.

Ainda, onde uma planta compreendendo uma construção deDNA recombinante é avaliada ou medida em relação a umaplanta controle não compreendendo o DNA recombinante, mastendo, ao ^invés, uma base genética comparável à planta, aplanta controle e referência pode compartilhar pelo menos90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% deidentidade de seqüência de material genético nuclear.

Existem várias técnicas baseadas em laboratório disponíveispara análise, comparação e caracterização de basesgenéticas vegetais; dentre essas estão eletroforese deisoenzima, Polimorfismos de comprimento de fragmento derestrição (RFLPs), DNAs polimórficos randomicamenteamplificados (RAPDs), reação de cadeia de polimerasearbitrariamente iniciada (AP-PCR), Fingerprinting poramplificação de DNA (DAF), Regiões de SeqüênciaCaracterizadas Amplificadas (SCARs), Polimorfismos deComprimento de Fragmento Amplificado (AFLPs), e repetiçõesde seqüências simples (SSRs) que são também referidas comomicrossatélites.

No presente caso, por exemplo, em vários avanços,mudanças na atividade de ZmELF3 ou bHLH-041, e/ou mudançasem um ou mais traços, tais como tamanho ou formato defolha, produção de sementes, alongamento de caule oupeciolo, síntese de clorofila, ou ramificação poderiam sermedidas comparando-se uma planta objeto ou célula vegetalobjeto em relação a uma planta controle ou célula vegetalcontrole.

Um método é provido para modular a concentração e/ouatividade do polipeptídeo ELF3 da presente invenção, i.e.atividade de proteína ZmELF3, em uma planta. Em geral, aconcentração e/ou atividade é aumentada em pelo menos 1%,5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% relativaa uma planta controle nativa, parte de planta, ou célulavegetal que não possui a seqüência da invenção introduzida.

Modulação na presente invenção pode ocorrer em um padrãotemporal ou de desenvolvimento. Em avanços específicos," ospolipeptídeos da presente invenção são aumentados emplantas de cultivo.O nível de expressão do polipeptideo ELF3 pode sermedido diretamente, por exemplo, testando o nível dopolipeptideo ELF3 na planta ou célula vegetal, ouindiretamente, por exemplo, determinando-se o efeito em umaplanta transgênica em nível fenotípico, i.e., por análisede planta transgênica, observado como um rompimento naresposta a densidade de plantas ou a aparência de umamudança fenotípica desejada, tais como inibição da respostade evitar sombra e tolerância aumentada à densidade deplantas.

Em avanços específicos, o polipeptideo ou opolinucleotídeo da invenção é introduzido na célulavegetal. Subseqüentemente, uma célula vegetal tendo aseqüência da invenção introduzida é selecionada usandométodos conhecidos daqueles especialistas na técnica, taiscomo, mas não limitados a, análise de Southern blot,seqüenciamento de DNA, análise de PCR, ou análisefenotípica. Uma planta-. ou parte de planta alterada oumodificada pelos avanços precedentes é cultivada sobcondições de formação vegetal por um tempo suficiente paramodular a concentração e/ou atividade dos polipeptídeos dapresente invenção na planta. Condições de formação vegetalsão bem conhecidas na técnica e aqui discutidas em outraparte.

Em alguns avanços, a atividade do polipeptideo bHLH-041 da invenção, ou seu ortólogo, é reduzida ou eliminadatransformando uma célula vegetal com um cassete deexpressão que expressa um polinucleotideo que inibe aexpressão de bHLH-041. O polinucleotideo pode inibir aexpressão de bHLH-041 diretamente, prevenindo a transcriçãoou tradução do RNA mensageiro de bHLH-041, ouindiretamente, codificando um polipeptideo que inibe atranscrição ou tradução de um gene codificando bHLH-041, oucodificando um polipeptideo que interfere com a função daproteína bHLH-041 endógena. Métodos para inibir oueliminar a expressão de um gene em uma planta são bemconhecidos na técnica, e qualquer tal método pode ser usadona presente invenção para inibir a expressão de bHLH-041,alterando, dessa forma, a atividade de proteína bHLH-041.

De acordo com a presente invenção, a expressão de umgene de bHLH-041 é inibida se o nível de proteína de bHLH-041 for estatisticamente menor do que o nível de proteínado mesmo bHLH-041 em uma planta que não foi geneticamentemodificada òu mutagenizada para inibir a expressão daquelebHLH-041. Em avanços da invenção em particular, o nível deproteína do bHLH-041 em uma planta modificada de acordo coma invenção é menor do que 95%, menor do que 90%, menor doque 80%, menor do que 70%, menor do que 60%, menor do que50%, menor do que 40%, menor do que 30%, menor do que 20%,menor do que 10%, ou menor do que 5% do nível de proteínado mesmo bHLH-041 em uma planta que não é uma mutante ouque não foi geneticamente modificada para inibir aexpressão daquele bHLH-041. O nível de expressão de bHLH-041 pode ser medido diretamente, por exemplo, testando onivel de bHLH-041 expresso na célula vegetal ou planta, ouindiretamente, por exemplo, observando o efeito em umaplanta transgênica no nivel fenotipico, i.e., por análisede planta transgênica, observado como um rompimento naresposta a densidade de plantas ou aparência de uma mudançafenotipica desejada, tais como inibição da resposta deevitar sombra e tolerância aumentada à densidade deplantas.

Além disso, ou como alternativa, o nivel de expressãode bHLH-041 pode ser medido indiretamente monitorando onivel de expressão de genes cuja expressão é modulada pelaexpressão de bHLH-041. Dessa maneira, mudanças no nivel deexpressão desses genes relacionados seriam indicativas demudanças no nivel de expressão de bHLH-041, e, assim, essesgenes relacionados poderiam servir como marcadores paraatividade de bHLH-041. Sem estar ligado a qualquer teoria,exemplos-- de tais genes relacionados poderiam incluir opróprio ELF3 ou genes de luz e ritmo circadiano (porexemplo, fitocromos, cataláse, nitrato redutase).

Em outros avanços da invenção, a atividade de bHLH-041é reduzida ou eliminada transformando uma célula vegetalcom um cassete de expressão compreendendo umpolinucleotideo codificando um polipeptideo que inibe aatividade de bHLH-041. A atividade de um bHLH-041 éinibida de acordo com a presente invenção se a atividade debHLH-041 é estatisticamente menor do que a atividade domesmo bHLH-041 em uma planta que não foi geneticamentemodificada para inibir a atividade daquele bHLH-041. Emavanços da invenção em particular, a atividade de bHLH-041em uma planta modificada de acordo com a invenção é demenos que 95%, menos que 90%, menos que 80%, menos que 70%,menos que 60%, menos que 50%, menos que 40%, menos que 30%,menos que 20%, menos que 10% ou menos que 5% da atividadedo mesmo bHLH-041 em uma planta que não foi geneticamentemodificada para inibir a expressão daquele bHLH-041. Aatividade de um bHLH-041 é "eliminada" de acordo com ainvenção quando não é detectável pelos métodos de testeaqui descritos em outra parte.

Em outros avanços, a atividade de bHLH-041 pode serreduzida ou eliminada rompendo-se o gene codificando aproteína bHLH-041. A invenção engloba plantasmutagenizadas que carregam mutações em genes de bHLH-041,onde as mutações reduzem a expressão do gene de bHLH-041 ouinibem a atividade do bHLH-041 codificado.

Assim, vários métodos podem ser usados para reduzir oueliminar a atividade de um bHLH-041. Mais de um métodopode ser usado para reduzir a atividade de um único bHLH-041 vegetal. Exemplos não limitantes de métodos de reduzirou eliminar a expressão de um bHLH-041 vegetal sãofornecidos abaixo.Em alguns avanços da presente invenção, uma célulavegetal é transformada com um cassete de expressão que écapaz de expressar um polinucleotideo que inibe a expressãode bHLH-041. O termo "expressão", como aqui usado, refere-se à biossintese de um produto gênico, incluindo atranscrição e/ou tradução de dito produto gênico. Porexemplo, para os propósitos da presente invenção, umcassete de expressão capaz de expressar um polinucleotideoque inibe a expressão de pelo menos um bHLH-041 é umcassete de expressão capaz de produzir uma molécula de RNAque inibe a transcrição e/ou tradução de pelo menos umbHLH-041. A "expressão" ou "produção" de uma proteína oupolipeptídeo a partir de uma molécula de DNA refere-se àtranscrição e tradução da seqüência codificadora paraproduzir a proteína ou polipeptídeo, enquanto que a"expressão" ou "produção" de uma proteína ou polipeptídeo apartir de uma molécula de RNA refere-se à tradução daseqüência de RNA codificadora para produzir a proteína oupolipeptídeo.

Exemplos de polinucleotídeos que inibem a expressão deum bHLH-041 são fornecidos abaixo.

Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressãode bHLH-041 pode ser obtida por supressão ou co-supressãosenso. Para co-supressão, um cassete de expressão éprojetado para expressar uma molécula de RNA correspondendoa todo ou parte de um RNA mensageiro codificando um bHLH-041 na orientação "senso". A super-expressão da moléculade RNA pode resultar em expressão reduzida do gene nativo.Dessa maneira, múltiplas linhagens vegetais transformadascom o cassete de expressão de co-supressão são rastreadaspara se identificar aquelas que apresentam a maior inibiçãoda expressão de bHLH-041.

O polinucleotideo usado para co-supressão podecorresponder a toda ou parte da seqüência codificando bHLH-041, toda ou parte da região não traduzida 5' e/ou 3' de umtranscrito de bHLH-041, ou toda ou parte de ambasseqüências codificadora e regiões não traduzidas 5' e/ou 3'de um transcrito codificando bHLH-041. Em alguns avançosonde o polinucleotideo compreende toda ou parte da regiãocodificadora para a proteína bHLH-041, o cassete deexpressão é projetado para eliminar o códon de iniciação dpolinucleotideo de forma que nenhum produto de proteínaseja transcrito.

Co-supressão pode ser usada para inibir a expressão degenes vegetais para produzir plantas tendo níveis deproteína indetectáveis para as proteínas codificadas poresses genes. Ver, por exemplo, Broin, et al., (2002) PlantCell 14:1417-1432. Co-supressão pode ser também usada parainibir a expressão de múltiplas proteínas na mesma planta.Ver, por exemplo, U.S. Patent No. 5.942.657. Métodos parausar co-supressão para inibir a expressão de genesendógenos em plantas são descritos em Flavell, et al. ,(1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:3490-3496; Jorgensen,et al., (1996) Plant Mol. Biol. 31:957-973; Johansen andCarrington (2001) Plant Physiol. 126:930-938; Broin, etal., (2002) Plant Cell 14:1417-1432; Stoutjesdijk, et al.,(2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Yu, et al., (2003)Phytochemistry 63:753-763; e U.S. Patent Nos. 5.034.323,5.283.184, e 5.942.657; cada qual é aqui incorporado porreferência. A eficiência de co-supressão pode seraumentada incluindo-se um região poli-dT no cassete deexpressão na posição 3' em relação à seqüência senso e 5'do sinal de poliadenilação. Ver, U.S. Patent PublicationNo. 2002/0048814, aqui incorporada por referência.

Tipicamente, tal seqüência de nucleotideos possuiidentidade de seqüência substancial em relação à seqüênciado transcrito do gene endógeno, otimamente maior do quecerca de 65% de identidade de seqüência, mais otimamentemaior do que cerca de 85% de identidade de seqüência, maisotimamente maior do que cerca de 95% de identidade deseqüência. Ver, U.S. Patent Nos. 5.283.184 e 5.034.323;aqui incorporadas por referência.

Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressãode bHLH-041 pode ser obtida por supressão anti-senso. Parasupressão anti-senso, o cassete de expressão é projetadopara expressar uma molécula de RNA complementar a todo ouparte de um RNA mensageiro codificando o polipeptideo bHLH-041. A super-expressão da molécula de RNA anti-senso poderesultar em expressão reduzida do gene nativo. Dessaforma, múltiplas linhagens vegetais transformadas com ocassete de expressão de supressão anti-senso são rastreadaspara se identificar aquelas que apresentam a maior inibiçãoda expressão de bHLH-041.

O polinucleotideo para uso em supressão anti-sensopode corresponder a todo ou parte do complemento daseqüência codificando bHLH-041, todo ou parte docomplemento da região não traduzida 5' e/ou 3' dotranscrito bHLH-041, ou todo ou parte do complemento deambas seqüências codificadora e regiões não traduzidas deum transcrito codificando bHLH-041. Além disso, opolinucleotideo anti-senso pode ser totalmente complementar(i.e., 100% idêntico ao complemento da seqüência alvo) ouparcialmente complementar (i.e., menos de 100% idêntico aocomplemento da seqüência alvo) em relação à seqüência alvo.

Supressão anti-senso pode ser usada para inibir a expressãode múltiplas proteínas na mesma planta. Ver, por exemplo,U.S. Patent No. 5.942.657... Adicionalmente, porções dosnucleotídeos anti-senso podem ser usadas para romper aexpressão do gene alvo. Geralmente, seqüências de pelomenos 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos,300, 400, 450, 500, 550 ou maiores podem ser usadas.

Métodos para usar supressão anti-senso para inibir aexpressão d*è genes endógenos em plantas são descritos, porexemplo, em Liu, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743 e U.S. Patent Nos. 5.759.829 e 5.942.657, cada qual éaqui incorporado por referência. A eficiência de supressãoanti-senso pode ser aumentada incluindo uma região poli-dTno cassete de expressão na posição 3' em relação àseqüência anti-senso e 5' do sinal de poliadenilação. Ver,U.S. Patent Publication No. 2002/0048814, aqui incorporadapor referência.

Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressãode bHLH-041 pode ser obtida por interferência de RNA dedupla-fita (dsRNA). Para interferência de dsRNA, umamolécula de RNA senso como aquela descrita acima para co-supressão e uma molécula de RNA anti-senso que é totalmenteou parcialmente complementar à molécula de RNA senso sãoexpressas na mesma célula, resultando em inibição daexpressão do RNA mensageiro endógeno correspondente.

A expressão das moléculas senso e anti-senso pode serconseguida projetando o cassete de expressão paracompreender tanto uma seqüência senso e uma seqüência anti-senso. Alternativamente, cassetes de expressão separadospodem ser usados para as seqüências senso e anti-senso.

Múltiplas linhagens vegetais transformadas com o cassete deexpressão de interferência de dsRNA, ou cassetes deexpressão, são então rastreadas para se identificar aslinhagens vegetais que apresentam a maior inibição daexpressão de.bHLH-041. Métodos para usar interferência dedsRNA para inibir a expressão de genes vegetais endógenossão descritos em Waterhouse, et al., (1998) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 95:13959-13964, Liu, et al. , (2002) PlantPhysiol. 129:1732-1743, e WO 99/49029, WO 99/53050, WO99/61631, e WO 00/49035; cada qual é aqui incorporado porreferência.

Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressãode bHLH-041 pode ser obtida por interferência de RNAhairpin (hpRNA) ou interferência de RNA hairpin contendointron (ihpRNA). Esses métodos são altamente eficientes eminibir a expressão de genes endógenos. Ver, Waterhouse andHelliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38 e as referenciasai citadas.

Para interferência de hpRNA, o cassete de expressão éprojetado para expressar uma molécula de RNA que hibridizaa si mesma para formar uma estrutura hairpin que compreendeuma região Ioop de fita simples e uma ramificação basepareada. A região de ramificação base pareada compreendeuma seqüência senso correspondendo a todo ou parte do RNAmensageiro endógeno codificando o gene .cuja expressão épara ser inibida, e uma seqüência anti-senso que étotalmente ou parcialmente complementar à seqüência senso.

Assim, a região de ramificação base pareada da moléculageralmente determina a especificidade da interferência deRNA. Moléculas de hpRNA são altamente eficientes em inibira expressão de genes endógenos, e a interferência de RNAque induz é herdada por subseqüentes gerações de plantas.Ver, por exemplo, Chuang and Meyerowitz (2000) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 97:4 98 5-4 990; Stoutjesdijk, et al. , (2002)Plant Physiol. 129:1723-1731; e Waterhouse and Helliwell(2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38. Métodos para usarinterferência de hpRNA para inibir ou silenciar a expressãode genes são descritos, por exemplo, em Chuang andMeyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:4985-4990;Stoutjesdij k, et al., (2002) Plant Physiol. 12 9:1723-17 31;Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38;Pandolfini, et al., BMC Biotechnology 3:7, e U.S. PatentPublication No. 20030175965; cada qual é aqui incorporadopor referência. Um teste transiente para a eficiência deconstructos de hpRNA para silenciar a expressão gênica invivo foi descrito por Panstruga, et al., (2003) Mol. Biol.Rep. 30:135-140, aqui incorporado por referência.

Para ihpRNA, as moléculas interferentes possuem amesma estrutura geral como para hpRNA, mas a molécula deRNA compreende adicionalmente um intron que é capaz de sercortado (spliced) na célula na qual o ihpRNA é expresso. 0uso de um intron minimiza o tamanho do Ioop na molécula deRNA hairpin após splicing, e isso aumenta a eficiência deinterferência. Ver, por exemplo, Smith, et al., (2000)Nature 407:319-320. Na verdade, Smith, et al. , mostram100% de supressão de expressão de gene endógeno usandointerferência mediada por ihpRNA. Métodos para usarinterferência de ihpRNA para inibir a expressão de genesvegetais endógenos são descritos, por exemplo, em Smith, etal., (2000) Nature 407:319-320; Wesley, et al. , (2001)Plant J. 27:581-590; Wang and Waterhouse (2001) Curr. Opin.Plant Biol. 5:146-150; Waterhouse and Helliwell (2003) Nat.Rev. Genet. 4:29-38; Helliwell and Waterhouse (2003)Methods 30:289-295, e U.S. Patent Publication No.2003/0180945, cada qual é aqui incorporado por referência.

0 cassete de expressão para interferência de hpRNApode ser também projetado de forma que a seqüência senso ea seqüência anti-senso não correspondam a um RNA endógeno.

Neste avanço, a seqüência senso e anti-senso flanqueiam umaseqüência Ioop que compreende uma seqüência de nucleotideoscorrespondendo a todo ou parte do RNA mensageiro endógenodo gene alvo. Assim, é a região Ioop que determina aespecificidade da interferência de RNA. Ver, por exemplo,WO 02/00904, aqui incorporada por referência.

0 silenciamento transcricional de gene (TGS) pode serconseguido através do uso de constructos de hpRNA,caracterizado pelo fato de que a repetição invertida dohairpin compartilha identidade de seqüência com a regiãopromotora de um gene a ser silenciado. 0 processamento dohpRNA em RNAs curtos que podem interagir com a regiãopromotora homóloga pode iniciar a degradação ou metilaçãopara resultar no silenciamento (Aufsatz, et al., (2002)PNAS 99 (Suppl. 4):16499-16506; Mette, et al., (2000) EMBOJ 19(19) :5194-5201).

Cassetes de expressão amplicon compreendem umaseqüência derivada de virus vegetal que contém todo ouparte do gene alvo, mas geralmente nem todos os genes dovírus nativo. As seqüências virais presentes no produto detranscrição do cassete de expressão permitem que o produtode transcrição direcione sua própria replicação. Ostranscritos produzidos pelo amplicon podem ser tanto sensoou anti-senso em relação à seqüência alvo (i.e., o RNAmensageiro para bHLH-041). Métodos de usar amplicons parainibir a expressão de genes vegetais endógenos sãodescritos, por exemplo, em Angell and Baulcombe (1997) EMBOJ. 16:3675-3684, Angell and Baulcombe (1999) Plant J.20:357-362, e U.S. Patent No. 6.646.805, cada qual é aquiincorporado por referência.

Em alguns avanços, o polinucleotideo expresso pelocassete de expressão da invenção é RNA catalítico ou possuiatividade de ribozima específica para o RNA mensageiro debHLH-041. Assim, o polinucleotideo causa a degradação doRNA mensageiro endógeno, resultando em expressão reduzidade bHLE-041. Este método é descrito, por exemplo, em U.S.Patent No. 4.987.071, aqui incorporada por referência.

Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressãode bHLH-041 pode ser obtida por interferência de RNA porexpressão de um gene codificando um micro RNA (miRNA).miRNAs são agentes reguladores consistindo de cerca- de 22ribonucleotídeos. miRNAs são altamente eficientes eminibir a expressão de genes endógenos. Ver, por exemplo,Javier et al., (2003) Nature 425: 257-263, aqui incorporadopor referência.

Para interferência de miRNA, o cassete de expressão éprojetado para expressar uma molécula de RNA que é modeladaem um qene de miRNA endógeno. 0 gene de miRNA codifica umRNA que forma uma estrutura hairpin contendo uma seqüênciade 22 nucleotideos que é complementar a outro gene endógeno(seqüência alvo). Para supressão da expressão de bHLH-041,a seqüência de 22 nucleotideos é selecionada a partir deuma seqüência de transcrito de bHLH-041 e contém 22nucleotideos de dita seqüência de bHLH-041 na orientaçãosenso e 21 nucleotideos de uma seqüência anti-sensocorrespondente que é complementar à seqüência senso.

Moléculas de miRNA são altamente eficientes em inibir aexpressão de genes endógenos, e a interferência de RNA queinduzem é herdada por subseqüentes gerações de plantas.

Em um avanço, o polinucleotideo codifica uma proteínadedo de zinco que se liga a um gene codificando bHLH-041,resultando em expressão reduzida do gene. Em avanços emparticular, a proteína dedo de zinco se liga a uma regiãoreguladora de um gene de bHLH-041. Em outros avanços, aproteína dedo de zinco se liga a um RNA mensageirocodificando um bHLH-041 e previne sua tradução. Métodos deselecionar sítios para direcionamento por proteínas dedo dezinco foram descritos, por exemplo, em U.S. Patent No.6.453.242, e métodos para usar proteínas dedo de zinco parainibir a expressão de genes em plantas são descritos, porexemplo, em U.S. Patent Publication No. 2003/0037355; cadaqual é aqui incorporado por referência.

Em alguns avanços da invenção, o polinucleotideocodifica um anticorpo que se liga a pelo menos um bHLH-041,e reduz a atividade de bHLH-041. Em outro avanço, aligação do anticorpo resulta em recuperação aumentada docomplexo anticorpo-bHLH-041 por mecanismos celulares decontrole de qualidade. A expressão de anticorpos emcélulas vegetais e a inibição de vias moleculares porexpressão e ligação de anticorpos a proteínas em célulasvegetais são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo,Conrad and Sonnewald (2003) Nature Biotech. 21:35-36, aquiincorporados por referência.

Em outros avanços, uma abordagem negativa dominantepara regulação negativa é empregada, caracterizado pelofato de que uma planta é transformada com umpolinucleotideo codificando um fator de transcrição parcialde bHLH-041. 0 fator de transcrição parcial codificado,que pode estar sem o domínio de ligação de DNA ou o domíniotrans-ativador, compete por sítios de ligação, reduzindo oefeito funcional do fator de transcrição nativo. Ver, porexemplo, Kuhlmann, et al., (2003) J. Biol. Chem.278 (10) :8786-8794; Heinekamp, et al., (2004) Plant J.38:298-309; King, et al., (1999) Internat'l. Immun.11(8):1203-1215.Em alguns avanços da presente invenção, a atividade debHLH-041 é reduzida ou eliminada rompendo o genecodificando bHLH-041. O gene codificando bHLH-041 pode serrompido por qualquer método conhecido na técnica. Porexemplo, em um avanço, o gene é rompido por marcação detransposon. Em outro avanço, o gene é rompido por plantasmutagenizando através de mutagênese aleatória oudirecionada, e selecionando plantas que possuem atividadede bHLH-041 reduzida.

Em um avanço da invenção, marcação de transposon éusada para reduzir ou eliminar a atividade de bHLH-041.

Marcação de transposon compreende inserir um transposon eum gene de bHLH-041 endógeno para reduzir ou eliminarexpressão de bHLH-041. "Gene de bHLH-041" deve significaro gene que codifica um bHLH-041 de acordo com a invenção.

Neste avanço, a expressão de bHLH-041 é reduzida oueliminada inserindo um transposon e uma região reguladoraou região codificadora do gene codificando bHLH-041. Umtransposon que está em um éxon, intron, seqüência nãotraduzida 5' ou 3', um promotor, ou qualquer outraseqüência reguladora de um gene de bHLH-041, pode ser usadopara reduzir ou eliminar a expressão e/ou atividade dobHLH-041 codificado.

Métodos para a marcação de transposon de genesespecíficos em plantas são bem conhecidos na técnica. Ver,por exemplo, Maes, et al., (1999) Trends Plant Sei. 4:90-96; Dharmapuri and Sonti (1999) FEMS Microbiol. Lett.179:53-59; Meissner, et al., (2000) Plant J. 22:265-274;Phogat, et al., (2000) J. Biosci. 25:57-63; Walbot (2000)Curr. Opin. Plant Biol. 2:103-107; Gai, et al., (2000)Nucleic Aeids Res. 28:94-96; Fitzmauriee, et al., (1999)Geneties 153:1919-1928). Além disso, o processo TUSC paraselecionar inserções Mu em genes selecionados foi descritoem Bensen, et al., (1995) Plant Cell 7:75-84; Mena, et al.,(1996) Science 274:1537-1540; e U.S. Patent No. 5,962,764;cada qual é aqui incorporado por referência.

Métodos adicionais para diminuir ou eliminar aexpressão de genes endógenos em plantas são tambémconhecidos na técnica e podem ser similarmente aplicados àatual invenção. Esses métodos incluem outras formas demutagênese, tais como mutagênese induzida por etilmetanossulfonato, mutagênese por deleção, e mutagênese pordeleção rápida de nêutron, usada, em um senso genéticoreverso (com PCR) para identificar linhagens vegetais nasquais o gene endógeno foi deletado. Como exemplos dessesmétodos, ver Ohshima, et al., (1998) Virology 243:472-481;Okubara, et al., (1994) Genetics 137:867-874; e Quesada, etal., (2000) Genetics 154:421-436; cada qual é aquiincorporado por referência. Além disso, um método rápido eautomatizado para rastreamento para mutações induzidasquimicamente, TILLING (Targeting Induced Local Lesions InGenomes), usando HPLC desnaturante ou digestão seletiva porendonuclease de produtos de PCR selecionados é tambémaplicável à atual invenção. Ver, McCallum, et al., (2000)Nat. Biotechnol. 18:455-457, aqui incorporado porreferência.

Em outro avanço desta invenção, mutantes dominantespodem ser usados para iniciar o silenciamento de RNA devidoà inversão e recombinação de genes de um lócus gênicoduplicado. Ver, por exemplo, Kusaba, et al., (2003) PlantCell 15:1455-1467.

A invenção engloba métodos adicionais para reduzir oueliminar a atividade de bHLH-041. Exemplos de outrosmétodos para alterar ou mutar uma seqüência de nucleotideosgenômica em uma planta são conhecidos na técnica e incluem,mas não são limitados a, o uso de vetores RNA: DNA, vetoresmutacionais RNA:DNA, vetores de reparo RNA:DNA,oligonucleotideos duplos misturados, oligonucleotideosRNA:DNA autocomplementares,, e oligonucleobasesrecombinogênicas. Tais vetores e métodos de uso sãoconhecidos na técnica. Ver, por exemplo, U.S. Patent Nos.5.565.350; 5.731.181; 5.756.325; 5.760.012; 5.795.972; e5.871.984; cada qual é aqui incorporada por referência.Ver também, WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821, eBeethamf 'et al., (Γ999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:8774-8778; cada qual é aqui incorporado por referência.Em certos avanços os polinucleotideos da presenteinvenção podem ser arranjados com qualquer combinação deseqüências de polinucleotideos de interesse para criarplantas com um traço desejado. Um traço, como aqui usado,refere-se ao fenótipo derivado de uma seqüência emparticular ou grupos de seqüências. Por exemplo, ospolinucleotideos da presente invenção podem ser arranjadoscom quaisquer outros polinucleotideos codificandopolipeptideos tendo atividade pesticida e/ou inseticida,tais como outras proteínas tóxicas de Bacillusthuringiensis (descritas em U.S. Patent Nos. 5.366.892;5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser, etal., (1986) Gene 48 :109), lecitinas (Van Damme, et al.,(1994) Plant Mol. Biol. 24:825, pentina (described in U.S.Patent No. 5.981.722), e similares. As combinações geradaspodem incluir também múltiplas cópias de qualquer um dospolinucleotideos de interesse. Os polinucleotideos dapresente invenção podem ser também arranjados com qualqueroutro gene ou combinação de genes para produzir plantas comuma variedade de combinações de traços desejados incluindo,mas não se limitando a, traços para alimentação animal,tais como genes para alto conteúdo de óleo (e.g., U.S.Patent No. 6.232.529); aminoácidos balanceados (e.g.,hordotioninas (U.S. Patent Nos. 5.990.389; 5.885.801;5.885.802; e 5.703.409); alto conteúdo de lisina de cevada(Williamson, et al., (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; eWO 98/20122) e proteínas com alto conteúdo de metionina(Pedersen, et al., (1986) J. Biol. Chem. 261:6279;Kirihara, et al., (1988) Gene 71:359; e Musumura, et al.,(1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); digestibilidade aumentada(e.g., proteínas de armazenamento modificadas (U.S.Application Serial No. 10/053,410, preenchida em 7 denovembro de 2001); e tiorredoxinas (U.S. Application SerialNo. 10/005,429, preenchida em 3 de dezembro de 2001)); asdescrições das quais são aqui incorporadas por referência.

Os polinucleotídeos da presente invenção podem sertambém arranjados com traços desejáveis para resistência adoenças ou herbicidas (e.g., genes de desintoxicação defumonisina (U.S. Patent No. 5.792.931); genes deavirulência e resistência a doenças (Jones, et al., (1994)Science 266:789; Martin, et al., (1993) Science 262:1432;Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1089); mutantes deacetolactato sintase (ALS) que levam a resistência aherbicidas, tais como as mutações S4 e/ou Hra; inibidoresde glutamina sintase, tais como fosfinotricina ou basta(e.g., gene bar); e resistência a glifosato (EPSPS gene));e traços desejáveis para processamento ou processo deprodutos tais como alto conteúdo de óleo (e.g., U.S. PatentNo. 6.232.529 ); óleos modificados (e.g., genes dedessaturase de ácidos graxos (U.S. Patent No. 5.952.544; WO94/11516)); amidos modificados (e.g., ADPG pirofosforilases(AGPase), sintases de amido (SS), enzimas de ramificação deamido (SBE), e enzimas de quebra de ramificação de amido(SDBE)); e polímeros ou bioplásticos (e.g., U.S. Patent No.5.602.321; beta-cetotiolase, polihidroxibutirato sintase, eacetoacetiI-CoA redutase (Schubert, et al., (1988) J.Bacteriol. 170:5837-5847) facilitar a expressão depolihidroxialcanoatos (PHAs)); as descrições das quais sãoaqui incorporadas por referência. Pode-se também combinaros polinucleotideos da presente invenção compolinucleotideos provendo traços agronômicos, tais comoesterilidade masculina (e.g., ver U.S. Patent No.5.583.210), força de talo, tempo de florada, ou traços detecnologia de transformação, tais como regulação de ciclocelular ou direcionamento de genes (e.g., WO 99/61619, WO00/17364, e WO 99/25821); as descrições das quais são aquiincorporadas por referência.

Essas combinações arranjadas podem ser criadas porqualquer método incluindo, mas não se limitando a,cruzamento de plantas por qualquer metodologia convencionalou de TopCross, ou transformação genética. Se asseqüências são arranjadas transformando as plantasgeneticamente, as seqüências de polinucleotideos deinteresse podem ser combinadas a qualquer momento e emqualquer ordem. Por exemplo, uma planta transgênicacompreendendo um ou mais traços desejados pode ser usadacomo alvo para introduzir traços adicionais portransformação subseqüente. Os traços podem ser introduzidossimultaneamente em um protocolo de co-transformação com ospolinucleotideos de interesse providos por qualquercombinação de cassetes de transformação. Por exemplo, seduas seqüências serão introduzidas, as duas seqüênciaspodem estar contidas em cassetes de transformação separados(trans) ou contidas no mesmo cassete de transformação(eis). A expressão das seqüências pode ser dirigida pelomesmo promotor ou por promotores diferentes. Em certoscasos, pode ser desejável introduzir um cassete detransformação que irá suprimir a expressão dopolinucleotideo de interesse. Isso pode ser combinado comqualquer combinação de outros cassetes de supressão oucassetes de super-expressão para gerar a combinaçãodesejada de traços na planta. É ainda reconhecido queseqüências de polinucleotideos podem ser arranjados em umalocalidade genômica desejada usando um sistema derecombinação sitio-especifico. Ver, por exemplo,W099/25821, W099/25854, W099/25840, W099/25855, eW099/25853, todas são aqui incorporadas por referência.

A seqüência de nucleotideos para o promotor de ELF3descrita na presente invenção, assim como variantes efragmentos- dessa, é útil na manipulação genética dequalquer planta quando reunida com uma construção de DNA,de forma que a seqüência promotora seja operacionalmenteligada a uma seqüência de nucleotideos codificando umaproteína heteróloga de interesse. Dessa maneira, aseqüência de nucleotideos do promotor de ELF3 da invenção éprovida em cassetes de expressão junto com seqüências denucleotideos heterólogas para expressão na planta de interesse.O promotor para o gene de ELF3 pode regular aexpressão de seqüências de nucleotideos operacionalmenteligadas de uma maneira induzida. Isto é, a expressão dasseqüências de nucleotideos operacionalmente ligadas em umacélula vegetal pode ser induzida em resposta a um estimulo.Por "estimulo" pretende-se um químico, que pode seraplicado externamente ou pode se acumular em resposta aoutro estímulo externo; ou outro fator, tal como dicasambientais, incluindo, mas não se limitando a, qualidade deluz e quantidade de luz.

Regiões promotoras híbridas sintéticas são conhecidasna técnica. Tais regiões compreendem elementos promotoresacima de uma seqüência de nucleotideos operacionalmenteligada ao elemento promotor de outra seqüência denucleotideos. Em um avanço da invenção, a expressão degene heterólogo é controlada por um promotor híbridosintético compreendendo a seqüência promotora de ELF3 dainvenção, ou -.um variante ou fragmento dessa,operacionalmente ligada a elemento(s) promotor(es) acima deum promotor heterólogo. Elementos promotores acima foramidentificados e podem ser usados para gerar um promotorsintético. Ver, por exemplo, Rushton, et al., (1998) Curr.Opin. Plant Biol. 1:311-315. Alternativamente, umaseqüência promotora de ELF3 sintética pode compreenderduplicações dos elementos promotores acima encontrados naseqüência promotora de ELF3. Tais elementos incluem osseis motivos de seqüência com aproximadamente 50% deidentidade ao "elemento evening" que estão presentes naseqüência de ZM-ELF3 acima, como aqui notado acima (Figura3). É reconhecido que a seqüência promotora da invençãopode ser usada com sua seqüência codificadora de ELF3nativa. Uma construção de DNA compreendendo o promotor deZM-ELF3 operacionalmente ligado com sua seqüência nativa deELF3 pode ser usado para transformar qualquer planta deinteresse para trazer uma mudança fenotipica desejada, talcomo inibição da resposta de evitar sombra e tolerânciaaumentada a densidade de plantas. Onde o promotor e seugene nativo são naturalmente ocorrentes na planta, i.e., emmilho, transformação da planta com essas seqüênciasoperacionalmente ligadas também resulta tanto em umamudança em fenótipo, tal como inibição da resposta deevitar sombra e tolerância aumentada a densidade deplantas, ou a inserção de seqüências operacionalmenteligadas em uma região diferente do cromossomo, alterando,dessa forma, o genoma da planta.

Em outro avanço da invenção, cassetes de expressãocompreenderão uma região de iniciação de transcriçãocompreendendo a seqüência de nucleotideos promotora de ZM-ELF3 aqui descrita, ou variante ou fragmento dessa,operacionalmente ligada à seqüência de nucleotideoshéteróloga cuja expressão deve ser controlada pelo promotorde ZM-ELF3 da invenção.A seqüência de nucleotideos promotora e métodos aquidescritos são úteis para regular a expressão de qualquerseqüência de nucleotideos heteróloga em um hospedeirovegetal para variar o fenótipo de uma planta. Váriasmudanças em fenótipo são de interesse, incluindo modificara composição de ácidos graxos em uma planta, alterar oconteúdo de aminoácidos de uma planta, alterar o mecanismode defesa a patógenos da planta," e similares. Essesresultados podem ser alcançados provendo a expressão deprodutos heterólogos ou expressão aumentada de produtosendógenos em plantas. Alternativamente, os resultadospodem ser alcançados provendo uma redução de expressão deum ou mais produtos endógenos, particularmente enzimas ouco-fatores na planta. Essas mudanças resultam em umamudança em fenótipo da planta transformada.

EXPERIMENTAL

Exemplo 1: Identificação e„_,Clonagem de Genes de ZM-ELF3 e bHLH-041

Marcação por ativação pode ser usada para identificargenes com a habilidade de afetar um traço de interesse.Inserções de elementos intensificadores de transcriçãopodem ativar e/óü elevar de forma dominante a expressão degenes endógenos próximos. Fazendo uma população grandedesses elementos intensificadores inseridos aleatoriamenteno genoma, pode-se avaliar a habilidade de quase todo genemodificar o traço de interesse. Esta abordagem foi usadade forma bem-sucedida na espécie vegetal modelo Arabidopsisthaliana. (Weigelf et al., 2000 Plant Physiol. 122:1003-1013). O isolamento de genes associados com resposta adensidade seguiu protocolos estabelecidos para marcação porativação (Aukerman and Sakai (2003) Plant Cell 15(11) :2730-2741).

Uma construção binária de 18,4kb baseada em T-DNA,pHSbarENDs, que contém quatro elementos intensificadoresmultimerizados derivados do promotor 35S de Virus demosaico de couve-flor, correspondendo aos nucleotideos -341a -64, como definido por Odell, et al., (1985) Nature313:810-812. A construção também contém seqüências vetores(pUC9) para permitir o resgate de plasmidios, seqüênciastransposon (Ds) para remobilizar o T-DNA, e o gene bar quepermite apenas a seleção de glifosinato de plantastransgênicas. A principio, apenas o segmento de 10,8 kb apartir do limite direito (RB) para o limite esquerdo (LB)inclusive será transferido no genoma do hospedeiro vegetal.Como os elementos intensificadores estão localizados pertodo RB, eles podem induzir a cis-ativação de Ioci genômicosapós a integração de T-DNA.

Duas populações de Arabidopsis marcadas por ativaçãoforam criadas por transformação de Agrobacterium de plantainteira: População 1 e População 2.Para a População 1, a construção pHSbarENDs foitransformada na linhagem C58 de Agrobacterium tumefaciens,cultivada em LB a 25°C para C>D600~1,0. As células foram,então, empelotadas por centrifugação e ressuspensas em umvolume igual de 5% de sacarose/0,05% Silwet L-77 (OSISpecialties, Inc.). Em florescimento precoce (bolting)inicial, plantas de Arabidopsis thaliana ecotipo Col-Ocultivadas em solo foram regadas com a suspensão deAgrobacterium. Uma semana depois, as mesmas plantas foramnovamente regadas com a mesma linhagem de Agrobacterium emsacarose/Silwet. As plantas foram, então, deixadas porsemear normalmente. As sementes Tl resultantes foramsemeadas em solo, e plântulas Tl transgênicas foramselecionadas por borrifamento com glifosinato (Finale®;Agrevo; Bayer Environmental Science). Sementes T2 foramcoletadas de aproximadamente 35.000 plantas Tl individuaisresistentes a glifosinato. Plantas T2 foram cultivadas evolumes iguais de sementes T3 de 96 linhagensT2 separadasforam retiradas, criando 360 sub-populações.

Para a População 2, o plasmídio foi alterado levementepara adicionar sitios de restrição e renomeadas comopHSbarENDs2. Transformação da cepa de Agrobacterium eplantas de Arabidopsis foram efetuadas como descrito para aPopulação 1.Um total de 100.000 plântulas Tl resistentes aglifosinato foi selecionado. Sementes T2 de cada linhagemforam mantidas separadas.

Um rastreamento para marcação por ativação foiefetuado com uma população de Arabidopsis contendoinserções transgênicas projetadas para ativar genespróximos, para entender a resposta de plantas a populaçõesde alta densidade, assim como isolar genes que conferem umfenótipo insensível a densidade. A população marcada porativação foi rastreada para variantes em resposta adensidade plantando-se sementes em solo em uma densidade deaproximadamente uma planta por centímetro. Plantasindividuais que diferiram significativamente de suasvizinhas em termos de morfologia de planta geral e fenótipovisual foram selecionadas no estágio da florada. Assementes dessas plantas foram rastreadas novamente em umsegundo experimento de densidade sob condições similares.

Seqüência flanqueando contígua com a marca de ativação foiisolada por resgate de plasmídio. Southern blotting,Northern blotting e PCR foram usados para verificar que alinhagem variante marcada por ativação continha uma únicamarca e que o gene flanqueando mais próximo foi ativado.Diversas linhagens marcadas por ativação foram isoladas, amaioria das quais foi de florada tardia. Ver Aukerman eSakai (2003) Plant Cell 15 (11) : 2730-2741.Dois genes foram caracterizados a partir de plantascom fenótipo alterado quando cultivadas sob alta densidadede plantas. Um gene correspondeu a um gene de relógiocircadiano, ELF3, indicando que a manipulação de genesenvolvidos no ritmo circadiano é um meio para intensificarde forma transgênica o rendimento de plantas cultivadas emalta densidade. Ver Figura 6.

O homólogo ELF3 de milho foi clonado e é descrito aqui(seqüência codificadora apresentada em SEQ ID NO: 1,polipeptideo apresentado em SEQ ID NOs: 2 e 3, seqüênciareguladora acima apresentada em SEQ ID NO: 4). A seqüênciade proteína ELF3 (At-ELF3) de Arabidopsis foi usada paraidentificar homólogos de milho usando tBLASTn (Gish andStates (1993) Nature Genet. 3:266-272) para rastrearbibliotecas EST proprietárias. Uma seqüência parcial demilho foi identificada com homologia a At-ELF3, e o Zm-ELF3de comprimento total foi clonado projetando-se primers deoligonucleotídeos para os terminais N e C da proteína eamplificando uma seqüência codificadora completa. 0 genede Zm-ELF3 foi subseqüentemente clonado em um vetor detransformação vegetal e transferido em Arabidopsis pelométodo floral dip (Clough and Bent (1998) Plant Journal16 (6) :735-743).

A segunda linhagem marcada por ativação teve umaresposta hipersensível a densidade: plantas foram menosvigorosas sob alta densidade, mas amplamente nãomodificadas em baixa densidade. A clonagem do gene apartir desta linhagem marcada por ativação isolou um fatorde transcrição básico hélice-loop-hélice não caracterizado,bHLH-041 (seqüência codificadora apresentada em SEQ ID NO:5, polipeptideo apresentado em SEQ ID NO: 6; ver tambémGenBank accession BAA97026). Esta classe de fatores detranscrição está envolvida em um grande número de respostasvegetais, incluindo alguns membros que interagemdiretamente com fitocromos, envolvida em percepção de luz.Uma seqüência contígua de Arabidopsis com a marca deativação foi clonada por resgate de plasmídio e análise deseqüência revelou a marca de 807 pb inserida a partir doinício de tradução de bHLH-041. A ativação foi confirmadanessa linhagem por RT-PCR.

Exemplo 2: Super-expressão de ZM-ELF3 em ArabidopsisTransgênica Confere Tolerância a Densidade

Um ZM-ELF3 de comprimento total foi super-expresso emArabidopsis transgênica usando o promotor SCP (U.S. PatentNo. 6.555.673). As plantas foram transformadas usando ométodo floral dip (Clough and Bent (1998) Plant Journal16(6) :735-743) . Dessa maneira, as plantas forammergulhadas em uma cultura de Agrobacterium transformadascom um vetor co-integrado contendo o gene de ZM-ELF3.Plantas transgênicas foram identificadas por resistência aglifosinato e cultivadas para até a geração subseqüente,onde sementes foram coletadas. Diversas linhagenstransgênicas e plantas de tipo selvagem (WT) foram testadaspara tolerância a densidade determinando-se seu rendimentoe desempenho vegetal sob plantio de alta densidade. Altadensidade nesta tela foi de uma planta por cm2, o que écerca de quatro vezes a densidade de crescimento ótimo paraArabidopsis.

Plantas transgênicas foram menos susceptíveis adecréscimos em comprimento foliar induzido por altadensidade de plantas (Figura 2A) e número de folhas naflorada (Figura 2B).

ZmELF-3 transgênicos foram também avaliados em umexperimento de plantio retardado no qual um grid de plantascontrole foi semeado em alta densidade. Após dez dias, omaterial experimental foi plantado entre as plantascontrole como uma avaliação do quão bem as plantas poderiamcompetir com plantas vizinhas bem à frente nodesenvolvimento. A linhagem marcada por ativação sobre-expressando ZmELF3 produziu plantas que foram maiores etinham fenótipo mais vigoroso do que o tipo selvagem.

Exemplo 3: Transformação e Regeneração de PlantasTransgênicas de Milho Sobre-expressando a Proteína ZM-ELF3

Embriões imaturos de milho de plantas de doadores deestufa são bombardeados com um plasmídio contendo aseqüência de nucleotídeos de ZM-ELF3 de SEQ ID NO: 1 ou 2operacionalmente ligada ao promotor de ubiquitina-1 (UBIl)de milho e o gene marcador de seleção PAT (Wohlleben, etal., (1988) Gene 70:25-37), que confere resistência aoherbicida Bialaphos. Alternativamente, o gene marcador deseleção é provido em um plasmídio separado. A transformaçãoé efetuada como a seguir. As receitas de meio sequem abaixo.

Preparação de Tecido Alvo

As espigas são descascadas e a superfície esterilizadaem 30% de alvejante Clorox mais 0,5% de Micro detergentepor 20 minutos, e enxaguadas duas vezes com água estéril.Os embriões imaturos são excisados e colocados com o eixodo embrião virado para baixo (lado do escutelo para cima),25 embriões por placa, em meio 560Y por 4 horas e, então,alinhados na zona alvo de 2,5cm em preparação para obombardeamento.

Um vetor de plasmídio compreendendo a seqüência denucleotídeos de ZM-EL F 3 de SEQ ID NO: 1 ou 2operacionalmente ligada a um promotor de ubiquitina-1(UBIl) de milho é feito. Este DNA de plasmídio mais DNA deplasmídio contendo um marcador selecionável PAT éprecipitado em pelotas de tungstênio 1,1 um (diâmetromédio) usando um procedimento de precipitação de CaC12 comose segue: 100 μl de preparado de partículas de tungstênioem água; 10 μl (1 pg) de DNA em tampão Tris EDTA (1 pg DNAtotal); 100 μΐ de CaC12 a 2,5 M; e, 10 μΐ de espermidina a0,1 M.

Cada reagente é adicionado seqüencialmente à suspensãode partículas de tungstênio, enquanto mantido no misturadortipo vórtex multitubo. A mistura final é sonicadabrevemente e deixada incubando sob agitação constante por10 minutos. Após o período de precipitação, os tubos sãocentrifugados brevemente, o líquido removido, lavados com500 ml de etanol 100%, e centrifugados por 30 segundos.

Novamente, o líquido é removido, e 105 μΐ de etanol 100%são adicionados à pelota de partículas de tungstênio final.Para a pistola de bombardeamento de partículas, aspartículas de tungstênio/DNA são sonicadas brevemente e 10μΐ colocados no centro de cada macro-carregador e deixadossecando por cerca de 2 minutos antes do bombardeamento.

As placas de amostra são'bombardeadas no nível #4 napistola de partículas. Todas as amostras recebem ,um únicotiro em 650 PSI, com um total de dez alíquotas tiradas decada tubo de preparado de partículas/DNA.

Após o bombardeamento, os embriões são mantidos emmeio 560Y por 2 dias, então transferidos para meio deseleção 560R contendo Bialaphos 'a 3 mg/litro, e sub-cultivados a cada 2 semanas. Após aproximadamente 10semanas de seleção, clones de calos resistentes a seleçãosão transferidos para meio 288J para iniciar a regeneraçãovegetal. Após o amadurecimento do embrião somático (2-4semanas), embriões somáticos bem desenvolvidos sãotransferidos para meio para germinação e transferidos paraa sala de cultura iluminada. Aproximadamente 7-10 diasdepois, as plântulas em desenvolvimento são transferidaspara meio 272V sem hormônio em tubos por 7-10 dias até queas plântulas estejam bem estabelecidas. As plantas são,então, transferidas para inserções em fendas (equivalente apote de 2,5") contendo solo de pote e crescidas por 1semana em uma câmara de crescimento, crescidassubseqüentemente por 1-2 semanas adicionais na estufa,então transferidas para potes clássicos 600 (1,6 galões) ecultivadas até a maturidade. As plantas são monitoradaspara tolerância a densidade determinando seu rendimento edesempenho vegetal sob plantio de alta densidade.

Meio de bombardeamento (560Y) compreende 4,0 g/l desais basais N6 (SIGMA C-1416) , 1,0 ml/l de mistura deVitamina Eriksson's (IOOOx SIGMA-1511), 0,5 mg/l de HCltiamina, 120,0 g/l de sacarose, 1,0 mg/1 de 2,4-D, e 2,88g/l de L-prolina (levado ao volume com H20 dl seguindo oajuste para pH 5,8 com KOH) ; 2,0 g/l Gelrite™ (adicionadoapós levar ao volume com H20 dl); e 8,5 mg/l de nitrato deprata (adicionados após esterilizar o meio e resfriar paratemperatura ambiente). Meio de seleção (560R) compreende4,0 g/l de sais basais N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l demistura de vitamina Eriksson's (lOOOx SIGMA-1511), 0,5 mg/lde HCl tiamina, 30,0 g/l de sacarose, e 2,0 mg/l de 2,4-D(levados ao volume com H20 dl seguindo o ajuste para pH 5,8com KOH) ; 3,0 g/l de Gelrite™ (adicionado após levar aovolume com H20 dl); e 0,85 mg/l de nitrato de prata e 3,0mg/l de Bialaphos (ambos adicionados após esterilizar omeio e resfriar para temperatura ambiente).

Meio de regeneração vegetal (288J) compreende 4,3 g/lde sais MS (GIBCO 11117-074), 5, 0 ml/l de solução deestoque de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotinico, 0,02g/l de HCl tiamina, 0,10 g/l de HCl piridoxina, e 0,40 g/lde glicina levados ao volume com H20 dl polida) (Murashigeand Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/l de mio-inositol, 0,5 mg/l de zeatina, 60 g/l de sacarose, e 1,0ml/l de 0,1 mM ácido abscisico (levados ao volume com H20dl polida após ajustar para pH 5,6); 3,0 g/l de Gelrite™(adicionados após levar ao volume com H20 dl); e 1,0 mg/lde ácido indoloacético e 3,0 mg/l de Bialaphos (adicionadosapós esterilizar o meio e resfriar para 60°C) . Meio semhormônios (272V) compreende 4,3 g/l de sais MS (GIBCO11117-074), 5,0 ml/l de solução de estoque de vitaminas MS(0,100 g/l de ácido nicotinico, 0,02 g/l de HCl tiamina,0,10 g/l de HCl piridoxina, e 0,40 g/l de glicina levadosao volume com H20 dl polida), 0,1 g/l de mio-inositol, e40,0 g/l de sacarose (levados ao volume com H20 dl polidaapós ajustar o pH para 5,6); e 6 g/l de Bacto-ágar(adicionado após levar ao volume com H20 dl polida),esterilizados e resfriados a 60° C.Exemplo 4: Super-expressão de ZM-ELF3 em MilhoTransqênico

Um ZM-ELF3 de comprimento total é super-expresso emmilho transgênico. Para transformação de milho mediada porAgrobacterium com a seqüência de nucleotideos de ZM-ELF3(SEQ ID NO: 1 ou 2), o método de Zhao é empregado (U.S.Patent No. 5.981.840, e PCT patent publication W098/32326;os conteúdos das quais são por aqui incorporados porreferência). Resumidamente, embriões imaturos são isoladosde milho e os embriões levados ao contato com uma suspensãode Agrobacterium, onde as bactérias são capazes detransferir a seqüência de nucleotideos de ZM-ELF3 de SEQ IDNO: 1 ou 2 a pelo menos uma célula de pelo menos um dosembriões imaturos (etapa 1: a etapa de infecção). Osembriões são co-cultivados por um tempo com asAgrobacterium (etapa 2: a etapa de co-cultivo). Após esseperíodo de co-cultivo, uma etapa de "descanso" opcional écontemplada. Nessa etapa de descanso, os embriões sãoincubados na presença de pelo menos um antibióticoconhecido por inibir o crescimento de Agrobacterium sem aadição de um agente seletivo para transformantes vegetais(etapa 3: etapa de descanso). Em seguida, embriõesinoculados são cultivados em meio contendo um agenteseletivo e calos transformados crescidos são recuperados(etapa 4: a etapa de seleção). 0 calo é, então, regeneradoem plantas (etapa 5: a etapa de regeneração), e os caloscrescidos em meio seletivo são cultivados em meio sólidopara regenerar as plantas. O efeito de super-expressão daproteína ZM-ELF3 em resposta a densidade de plantas éavaliado determinando-se o rendimento de planta transgênicae desempenho vegetal sob plantio de alta densidade.

Exemplo 5: Transformação de Embrião de Soja paraSuper-expressão de ZM-ELF3

Condições de Cultura

Culturas em suspensão embriogênicas de soja (cv. Jack)são mantidas em 35 ml de meio líquido SB196 (ver, receitasabaixo) em um agitador de rotação, 150 rpm, 26°C com luzesfrias brancas fluorescentes em fotoperíodo de 16:8 hrdia/noite em intensidade de luz de 60-85 pE/m2/s. Asculturas são subcultivadas a cada 7 dias até duas semanasinoculando-se aproximadamente 35 mg de tecido em 35 ml demeio líquido fresco SB196 (o intervalo de subcultivopreferido é a cada- 7 dias).

Culturas em suspensão embriogênicas de soja sãotransformadas com os plasmídios e fragmentos de DNAdescritos nos exemplos a seguir pelo método debombardeamento de partículas por pistola (Klein, et al.,(1987) Nature 327:70).

Iniciação de Cultura em Suspensão Embriogênica de SojaCulturas de soja são iniciadas duas vezes a cada mêscom 5-7 dias entre cada iniciação.

Vagens com sementes imaturas de plantas de sojadisponíveis 45-55 dias após o plantio são escolhidas,removidas de suas bases e colocadas em uma caixaesterilizada de cor magenta. As sementes de soja sãoesterilizadas misturando as por 15 minutos em uma soluçãode Clorox 5% com 1 gota de sabão de marfim (95 ml de águadestilada autoclavada mais 5 ml de Clorox e 1 gota desabão). Misturar bem. As sementes são enxaguadas usando 2garrafas de 1-litro de água destiladas estéril e aquelasmenores do que 4 mm são colocadas em slides individuais demicroscópio. A extremidade pequena da semente é cortada eos cotilédones apertados para fora da capa da semente. Oscotilédones são transferidos para placas contendo meio SBl(25-30 cotilédones por placa). As placas são embaladas comfita de fibra e armazenadas por 8 semanas. Após essetempo, embriões secundários são- cortados e colocados emmeio líquido SB196 por 7 dias.

Preparação de DNA para Bombardeamento

Tanto um plasmídio intacto ou um fragmento de DNA deplasmídio contendo a seqüência de nucleotídeos de ZM-ELF3de SEQ ID NO: 1 ou 2, operacionalmente ligada ao promotorde interesse, e o gene marcador de seleção, são usados parabombardeamento. DNA de plasmídio para bombardeamento érotineiramente preparado e purificado usando o métododescrito em PromegaTM Protocols and Applications Guide,Second Edition (página 106). Fragmentos dos plasmidioscarregando a seqüência de nucleotideos de ZM-ELF3 de SEQ IDNO: 1 ou 2, operacionalmente ligada ao promotor deinteresse, e o gene marcador de seleção, são obtidos porisolamento de gel de plasmidios duplamente digeridos. Emcada caso, 100 ^g de DNA de plasmidio são digeridos em 0,5ml da mistura de enzima especifica que é apropriada para oplasmidio de interesse. Os fragmentos de DNA resultantessão separados por eletroforese de gel em 1% SeaPlaque GTGagarose (BioWhitaker Molecular Applications) e osfragmentos de DNA contendo a seqüência de nucleotideos deZM-ELF3 de SEQ ID NO: 1 ou 2, operacionalmente ligada aopromotor de interesse, e o gene marcador de seleção, sãocortados do gel de agarose. DNA é purificado d agaroseusando a enzima de digestão GELase seguindo o protocolo dofabricante.

Uma aliquota de 50 μΐ de água destilada estérilcontendo 3 mg de partículas de ouro são adicionados a 5 μΐde uma solução de DNA a 1 μς/μΐ (tanto plasmidio intacto oufragmento de DNA preparado como descrito acima), 50 μΐ 2, 5MCaCl2 e 20 μΐ de 0,1 M espermidina. A mistura é agitadapor 3 min no nível 3 de um agitador tipo vortex e giradapor 10 seg em uma microcentrífuga de bancada. Após umalavagem com 400 μΐ de etanol 100% a pelota é suspensa porsonicação em 40 μΐ de etanol 100%. Cinco μΐ de suspensãode DNA são dispensados em cada disco dos discos deinstrumento Biolistic PDS1000/HE. Cada alíquota de 5 μΐcontém aproximadamente 0,37 5 mg de ouro por bombardeamento(i.e., por disco).

Preparação de Tecido e Bombardeamento com DNA

Aproximadamente 150-200 mg de culturas em suspensãoembriônicas de 7 dias de idade são colocados em uma placade petri vazia, estéril de 60 χ 15 mm e a placa coberta commalha plástica. Tecido é bombardeado com 1 ou 2 tiros porplaca com pressão de ruptura de membrana estabelecida em1100 PSI e a câmara evacuada a um vácuo de 27-28 polegadasde mercúrio. O tecido é colocado a aproximadamente 3,5polegadas da tela de retenção/parada.

Seleção de Embriões Transformados

Embriões transformados são selecionados usando tantohigromicina (quando o gene de higromicina fosfotransferase,HPT, é usado como o marcador de seleção) ou clorsulfuron(quando o gene de acetolactato sintase, ALS, é usado como omarcador de seleção).

Seleção por Higromicina (HPT)

Após o bombardeamento, o tecido é colocado em meiofresco SB196 e cultivado como descrito acima. Seis diaspós-bombardeamento, o meio SB196 é mudado com por SB196fresco contendo um agente de seleção de 30 mg/Lhigromicina. O meio de seleção é trocado semanalmente. Dequatro a seis semanas pós-seleção, tecido verdetransformado pode ser observado crescendo a partir deagrupamentos embriogênicos necróticos não transformados.Tecido verde isolado é removido e inoculado em placasmultipoço para gerar novas culturas em suspensãoembriogênicas transformadas, propagadas clonalmente.

Seleção por Clorsulfuron (ALS)

Após o bombardeamento, o tecido é divido entre 2frascos com meio fresco SB196 e cultivado como descritoacima. De seis a sete dias pós-bombardeamento, SB196 émudado para SB196 fresco contendo agente de seleção deClorsulfuron a 100 ng/ml. 0 meio de seleção é trocadosemanalmente. De quatro a seis semanas pós-seleção, tecidoverde transformado pode ser observado crescendo a partir deagrupamentos embriogênicos necróticos não transformados.Tecido verde isolado é removido e inoculado em placasmultipoço contendo SB196 para gerar novas culturas emsuspensão embriogênicas transformadas, propagadas clonalmente.

Regeneração de Embriões Somáticos de Soja em plantasPara obter plantas inteiras a partir de culturas emsuspensão embriogênicas, o tecido deve ser regenerado.

Maturação de Embrião

Embriões são cultivados por 4-6 semanas a 26°C e SB196sob lâmpadas brancas frias fluorescentes (Phillips coolwhite Econowatt F40/CW/RS/EW) e Agro (Phillips F40 Agro)(40 watts) em um fotoperiodo de 16:8 hr com intensidade deluz de 90-120 μΕ/ιη23. Após esse tempo, agrupamentos deembriões são removidos para um meio de agar sólido, SB166,por 1-2 semanas. Agrupamentos são, então, subcultivadospara meio SB103 por 3 semanas. Durante esse período,embriões individuais podem ser removidos dos agrupamentos erastreados para expressão de ZM-ELF3. Deveria ser notadoque qualquer fenótipo detectável, resultante da expressãodos genes de interesse, deveria ser rastreado nesteestágio.

Dessecação e Germinação de Embrião

Embriões individuais amadurecidos são dessecadoscolocando-os em uma placa de petri pequena (35 χ 10 mm)vazia por aproximadamente 4-7 dias. As placas são seladascom fita de fibra (criando uma câmara de pequena umidade).

Embriões dessecados são plantados em meio SB71-4 onde foramdeixados para germinar sob as mesmas condições de culturadescritas acima. Plântulas germinadas são removidas domeio de germinação e enxaguadas com água e, então,plantadas em uma bandeja de 24 células Redi-Earth in 24-cell pack tray, coberta com uma cúpula plásticatransparente. Após 2 semanas, a cúpula é removida e asplantas endurecidas por uma semana adicional. Se asplântulas pareciam endurecidas, elas são eramtransplantadas e o efeito de super-expressão da proteínaZM-ELF3 em resposta a densidade de plantas é avaliadodeterminando-se o rendimento de planta transgênica edesempenho vegetal sob plantio de alta densidade.

Receitas de meio

SB 196 - Meio liquido de proliferação FN Lite (por litro) -

MS FeEDTA - IOOx Stock 1 10 ml

MS Sulfato - IOOx Stock 2 10 ml

FN Lite Haletos - IOOx Stock 3 10 ml

FN Lite Ρ,B,Mo - IOOx Stock 4 10 ml

B5 vitaminas (lml/L) 1,0 ml

2,4-D (concentração final de 10 mg/L) 1,0 ml

KNO3 2,83 gm

(NH4)2SO4 0, 4 63 gm

Asparagina 1,0 gm

Saearose (1%) 10 gmpH 5,8Soluções de Estoque FN Lite

<table>table see original document page 112</column></row><table>

* Adicionar primeiro, dissolver em uma garrafa escura enquantoagitando

<table>table see original document page 112</column></row><table>

Meio sólido SBl compreende (por litro): 1 pkg. de sais(Gibco/ BRL - Cat# 11117-066); 1 ml de estoque devitaminas B5 1000X; 31,5 g de sacarose; 2 ml de 2,4-D(concentração final de 20 mg/L); pH 5,7; e 8 g de TC ágar.

Meio sólido SB 166 compreende (por litro): 1 pkg. desais MS (Gibco/ BRL - Cat# 11117-066) ; 1 ml de estoque devitaminas B5 1000X; 60 g de maltose; 750 mg de MgCl2hexahidrato; 5 g de carvão ativado; pH 5,7; e , 2 g degelrite.

Meio sólido SB 103 compreende (por litro) : 1 pkg. desais MS (Gibco/BRL - Cat# 11117-066) ; 1 ml de estoque devitaminas B5 1000X; 60 g de maltose; 750 mg de MgCl2hexahidrato; pH 5,7; e 2 g de gelrite.

Meio sólido SB 71-4 compreende (por litro): 1 garrafade sais Gamborg's B5 c/ sacarose (Gibco/BRL - Cat# 21153-036); pH 5,7; e, 5 g de TC ágar.

2,4-D stock Λ obtido pré-fabricado da Phytotech cat#D 295 - a concentração é de 1 mg/ml.

Estoque de Vitaminas B5 (pos 100 ml) que é armazenadoem alíquotas a -20°C compreende: 10 g de mio-inositol; 100mg de ácido nicotínico; 100 mg de piridoxina HCl; e, 1 g detiamina. Se a solução não dissolve rápido o suficiente,aplicar um nivel baixo de calor via a placa de agitaçãoquente. Estoque de Clorsulfuron compreende lmg/ml emHidróxido de Amônio a 0,01 N.Exemplo 6: Transformação de Girassol

Tecidos de meristema de girassol são transformados comum cassete de expressão contendo a seqüência denucleotideos de ZM-ELF3 de SEQ ID NO: 1 ou 2operacionalmente ligada ao promotor de interesse, como sesegue (ver também, European Patent Number EP 0 486233, aquiincorporada por referência, e Malone-Schoneberg, et al.,(1994) Plant Science 103:199-207). Sementes maduras degirassol (Helianthus annuus L.) são descascadas usando umadebulhadora de cabeça de trigo simples. Sementes têm suassuperfícies esterilizadas por 30 minutos em uma soluçãoalvejante de Clorox 20% com a adição de duas gotas de Tween20 por 50 ml de solução. As sementes são enxaguadas comágua destilada estéril.

Explantes de eixo embriônico dividido são preparadospor uma modificação de procedimentos descrita porSchrammeijer, et al., (Schrammeijer, et al., (1990) PlantCell Rep. 9:55-60). Sementes são embebidas em águadestilada por 60 minutos após o procedimento deesterilização da superfície. Os cotilédones de cadasemente são, então, quebrados, produzindo uma fratura limpano plano do eixo embriônico. Após a excisão da ponta daraiz, os explãiites são bisseccionados longitudinalmenteentre as folhas primordiais. As duas metades sãocolocadas, cortadas com a superfície para cima, em meio GBAconsistindo de Murashige and Skoog elementos minerais(Murashige, et al., (1962) Physiol. Plant., 15:473-497),adições de vitamina de Shepard (Shepard (1980) EmergentTechniques for the Genetic Improvement of Crops Universityof Minnesota Press, St. Paul, Minnesota), adenina sulfato40 mg/l, sacarose 30 g/l, 6-benzil-aminopurina (BAP) 0,5mg/l, ácido índolo-3-acético (IAA) 0,25 mg/l, ácidogiberélico (GA3), pH 5,6, e Phytagar 8 g/l.

Os explantes são sujeitos a bombardeamento pormicroprojéteis antes do tratamento com Agrobacterium(Bidney, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:301-313). Detrinta a quarenta explantes são colocados em um circulo nocentro de uma placa de 60 X 20 mm para este tratamento.Aproximadamente 4,7 mg de microprojéteis de tungstênio de1,8 mm são ressuspensos em 25 ml de tampão TE estéril (10mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) e alíquotas de 1,5 ml sãousadas por bombardeamento. Cada placa é bombardeada duasvezes através de uma tela nytex de 150 mm posicionada 2 cmacima das amostras em um dispositivo de aceleração departículas PDS 1000®.

A linhagem desarmada de Agrobacterium tumefaciensEHA105 é usada em todos os experimentos de transformação.Um vetor de plasmídio binário compreendendo o cassete deexpressão que contém a seqüência de nucleotídeos de ZM-ELF3de SEQ ID NO: 1 ou 2 operacionalmente ligada ao promotor deinteresse é introduzida em Agrobacterium linhagem EHA105via congelamento e descongelamento como descrito porHolsters, et al., (1978) Mol. Gen. Genet. 163:181-187.

Esse plasmidio compreende ainda um gene marcador de seleçãopara canamicina (i.e., nptll). Bactéria Bactérias paraexperimentos de transformação vegetal são cultivadas de umdia para o outro (28°C e 100 RPM de agitação continua) emmeio liquido YEP (estrato de levedura a 10 gm/1,Bactopeptona a 10 gm/1, e NaCl a 5 gm/1, pH 7,0) com osantibióticos apropriados necessários para manutenção delinhagem bacteriana e plasmidio binário. A suspensão éusada quando alcança uma DOôoo de cerca de 0,4 a 0,8. Ascélulas de Agrobacterium são empelotadas e ressuspendidas auma ϋΟεοο final de 0,5 em um meio de inoculação compreendidode MES 12,5 mM pH 5,7, NH4Cl 1 gm/1, e MgSO4 0,3 gm/1.

Explantes frescos bombardeados são colocados em umasuspensão de Agrobacterium, misturados, e deixados semperturbação por 30 minutos. Os explantes são, então,transferidos para meio GBA e co-cultivados, cortados com asuperfície para baixo, a 26°C e dias de 18_horas. Apóstrês dias de co-cultivo, os explantes são transferidos para374B (meio GBA sem reguladores de crescimento e um nívelreduzido de sacarose de 1%) suplementado com cefotaxime 250mg/l e sulfato de canamicina 50 mg/l. Os explantes sãocultivados por duas a cinco semanas em seleção e, então,transferidos para meio fresco 374B sem canamicina por uma aduas semanas de desenvolvimento continuado. Explantes comáreas de crescimento diferenciadas resistentes aantibióticos que não produziram brotos adequados paraexcisão são transferidos para meio GBA contendo 250 mg/lcefotaxime por um segundo tratamento de 3 dias com fitohormônio. Amostras de folhas de brotos verdes resistentesa canamicina são testadas para a presença de NPTII porELISA e para a presença de expressão transgene testando-sea atividade de ZM-ELF3.

Brotos positivos para NPTII são transplantados paraestoque de raiz de plântulas de girassol Pioneer® hybrid6440 cultivadas in vitro. Sementes com a superfícieesterilizada são germinadas em meio 48-0 (sais Murashigeand Skoog meia-força, sacarose 0,5%, gelrite 0,3%, pH 5,6)e cultivadas sob condições descritas para cultivo deexplantes. A porção superior da plântula é removida, umafatia vertical de 1 cm é feita no hipocótilo, e o brototransformado inserido no corte. A área toda é embalada comparafilme para segurar o broto. Plantas enxertadas podemser transferidas para solo após uma semana de cultivo invitro. Enxertos em solo são mantidos sob condições de altaumidade, seguido por uma aclimatação lenta ao ambiente deestufa. Setores transformados de plantas To (geraçãoparental) amadurecendo na estufa são identificados porNPTII ELISA e/ou por análise de atividade de ZM-ELF3 deextratos de folha, enquanto sementes transgênicas colhidasde plantas T0 positivas para NPTII são identificadas poranálise de atividade de ZM-ELF3 de pequenas porções decotilédone de semente seca.Um protocolo de transformação de girassol alternativopermite a recuperação de progênie transgênica sem o uso depressão de seleção química. Sementes são debulhadas e têma superfície esterilizada por 20 minutos em uma soluçãoalvejante de Clorox 20% com a adição de duas a três gotasde Tween 20 por 100 ml de solução, então enxaguadas trêsvezes com água destilada. Sementes esterilizadas sãoembebidas no escuro a 26°C por 20 horas em filtro de papelmolhado com água. Os cotilédones e radicais de raiz sãoremovidos, e os explantes de meristema são cultivados em374E (meio GBA consistindo de sais MS, vitaminas Shepard,sulfato de adenina 40 mg/l, sacarosev 3%, 6-BAP 0,5 mg/l,IAA 0,25 mg/l, GA 0,1 mg/l, e Phytagar 0,8% em pH 5,6) por24 horas no escuro. As folhas primárias são removidas paraexpor o meristema apical, em torno de 40 explantes sãocolocados com a cúpula apical voltadas para cima em umcírculo de 2 cm no centro de 37 4M (meio GBA com Phytagar a1,2%), e, então, cultivados em meio por 24 horas no escuro.

Aproximadamente 18,8 mg de partículas de tungstênio de1,8 pm são ressuspensos em 150 μΐ de etanol absoluto. Apósa sonicação, 8 μΐ são colocados no centro da superfície domacrocarregador. Cada placa é bombardeada duas vezes comdiscos de ruptura a 650 psi na primeira estante a 26 mm deHg de vácuo de hélio.

O plasmídio de interesse é introduzido emAgrobacterium tumefaciens linhagem EHA105 via congelamentoe descongelamento como descrito previamente. A pelota debactérias cultivada de um dia para o outro a 280C em ummeio liquido YEP (extrato de leveduras 10 g/l, Bactopeptona10 g/l, e NaCl 5 g/l, pH 7,0) na presença de canamicina 50μg/l é ressuspendida em um meio de inoculação (ácidoetanossulfônico 12,5 mM 2-mM 2-(N-morpholino), MES, NH4Cl 1g/l e MgSO4 0,3 g/l em pH 5,7) para alcançar umaconcentração final de 4,0 em OD 600. Explantesbombardeados com partículas são transferidos para meio GBA(374E), e uma gotícula de suspensão de bactérias é colocadadiretamente em cima do meristema. Os explantes são co-cultivados em meio por 4 dias, após os quais os explantessão transferidos para meio 374C (GBA com sacarose 1% e semBAP, IAA, GA3 e suplementado com cefotaxima 250 μg/ml). Asplântulas são cultivadas no meio por cerca de duas semanassob dias condições de incubação de 16 horas e 26°C.

Explantes (em torno de 2 cm de comprimento) de culturade duas semanas em meio 374C são rastreados para atividadede ZM-ELF3 usando testes conhecidos na técnica. Apósexplantes positivos serem identificados (i.e., paraexpressão de ZM-ELF3), aqueles brotos que falharam emexibir atividade de ZM-ELF3 são descartados, e cadaexplante positivo é subdividido em explantes nodais. Umexplante nodal contém pelo menos um nodo potencial. Ossegmentos nodais são cultivados em meio GBA por três aquatro dias para promover a formação de botões auxiliares apartir de cada nodo. Então, eles são transferidos parameio 374C e deixados se desenvolver por quatro semanasadicionais. Botões em desenvolvimento são separados ecultivados por quatro semanas adicionais em meio 374C.

Amostras de folhas tiradas de cada broto recém recuperadosão rastreadas novamente pelo teste de atividade deproteína apropriado. Neste momento, os brotos positivosrecuperados a partir de um único nodo terão sido geralmenteenriquecidos no setor transgênico detectado no testeinicial antes da cultura nodal.

Brotos recuperados positivos para expressão de ZM-ELF3são enxertados para estoque de raiz de plântulas degirassol Pioneer hybrid 6440 cultivadas in vitro. Osestoques de raiz são preparados da seguinte maneira.

Sementes são debulhadas e têm a superfície esterilizada por20 minutos em uma solução alvejante de Clorox 20% com aadição de duas a três gotas de Tween 20 por 100 ml desolução, e são enxaguadas três vezes com água destilada.

As sementes esterilizadas são germinadas no filtro molhadocom água por três dias, então, elas são transferidas emmeio 48 (sal MS meia-força', sacarose 0,5%, gelrite 0,3% pH5,0) e cultivadas a 26°C no escuro por três dias, entãoincubadas em condições de cultivo de dias de 16 horas. Aporção superior de plântulas selecionadas é removida, umafatia vertical é feita em cada hipocótilo, e um brototransformado é inserido em um corte em V. A área de corte éembalada com parafilme. Após uma semana de cultivo nomeio, as plantas enxertadas são transferidas para solo.Nas primeiras duas semanas, elas são mantidas sob condiçõesde alta umidade para se aclimatar a um ambiente de estufa.

Os artigos "um" e "uma" são usados aqui para referir-se a um ou mais do que um (i.e., a pelo menos um) do objetogramatical do artigo. Por meio de exemplo, "um elemento"significa um ou mais elementos.

Todas as publicações e aplicações de patentesmencionadas na especificação são indicativas do níveldaqueles especialistas na técnica a qual esta invençãopertence. Todas as publicações e aplicações de patentessão aqui incorporadas por referência na mesma extensão comose cada publicação ou aplicação de patente individual fosseespecificamente e individualmente indicada para seremincorporadas por referência.

Apesar de a invenção precedente ter sido descrita emalgum detalhe- por meio de ilustração e exemplo parapropósitos de claridade de entendimento, será óbvio quecertas mudanças e modificações podem ser praticadas noescopo das reivindicações em anexo.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Requerente: PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, INC.E. I. DUPONT DE NEMOURS AND COMPANY

<120> Titulo: MÉTODOS PARA MELHORAR A PERFORMANCE DE UMA PLANTACRESCIDA EM CONDIÇÕES DE ALTA DENSIDADE POPULACIONAL, POLINUCLEOTÍDEOISOLADO, CASSETE DE EXPRESSÃO, PLANTA, SEMENTE, MÉTODO PARA MODULAR AEXPRESSÃO DE UM POLINUCLEOTÍDEO DE INTERESSE EM UMA PLANTA

<130> Referência do documento: P1416

<150> Documento de prioridade: US 60/779,720<151> Data de depósito: 07-03-2007

<160> Quantidade de SEQ ID NOs.: 10

<170> Software: FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> SEQ ID NO: 1<211> Comprimento: 2496<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:<221> Nome/Chave: CDS<222> Localização: (167)... (2444)<223> Outras informações: Zm-ELF3

<400> Seqüência: 1

ggccgcggta gcagctgtgc gcctgcaccc cggcctcccc catcgccggc cctgacactg 60ggtaaacgtg gtggctgaag ctgctgctga ggattcggga tcttcttgct gccgccacga 120gctgcctgcg tgatattgac acggcgcgct cccctggctc ctgggc atg acg agg 175

Met Thr Arg1

gga ggc ggt gga caa gga ggc aag gag gag ccg ggg aag gtg atg ggt 223Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Lys Glu Glu Pro Gly Lys Val Met Gly5 10 15

ccg ctg ttc ccg cgg ctc cac gtc age gac gea ggc aag ggc ggc ggc 271Pro Leu Phe Pro Arg Leu His Val Ser Asp Ala Gly Lys Gly Gly Gly20 25 30 35

ccg cgg gct ccg ccc agg aac aag atg gcg ctc tac gag cag ttc acc 319Pro Arg Ala Pro Pro Arg Asn Lys Met Ala Leu Tyr Glu Gln Phe Thr

40 45 50

gtg ccg tcc aac cgc ttc age tcc ccc gcc gcc tcc gcc cgc gcc gcg 367Val Pro Ser Asn Arg Phe Ser Ser Pro Ala Ala Ser Ala Arg Ala Ala55 60 65ggg gcc age ctc gtg ccc tcc acg gcg gct gcc cag gtt tat ggt tat 415

Gly Ala Ser Leu Val Pro Ser Thr Ala Ala Ala Gln Val Tyr Gly Tyr

70 75 80

gac agg acg ctg ttc cag ccc ttc gat gtg cct tca aat gag cct cct 463

Asp Arg Thr Leu Phe Gln Pro Phe Asp Val Pro Ser Asn Glu Pro Pro

85 90 95

cgt tca tet gaa aag ttc aaa gga aac act ate aac gga cag tet aat 511

Arg Ser Ser Glu Lys Phe Lys Gly Asn Thr Ile Asn Gly Gln Ser Asn

100 105 110 115

agt aca aga aga gaa cct ttg agg atg tcc tca cag acc aag aac aag 559

Ser Thr Arg Arg Glu Pro Leu Arg Met Ser Ser Gln Thr Lys Asn Lys

120 125 130

gac gtc tgt gct tca aaa tca att gcc aag tgc acc tca cag cat aga 607

Asp Val Cys Ala Ser Lys Ser Ile Ala Lys Cys Thr Ser Gln His Arg

135 140 145

gtg ggc aac acc ate atg tet tet ggg aag aaa gtg gtc agt gat gat 655

Val Gly Asn Thr Ile Met Ser Ser Gly Lys Lys Val Val Ser Asp Asp

150 155 160

gaa ttt atg gtt cct tcc ate tgt tat cct aga ttt tat cga cag tet 703

Glu Phe Met Val Pro Ser Ile Cys Tyr Pro Arg Phe Tyr Arg Gln Ser

165 170 175

act caa gat cat gea gat aaa tca aaa ccc caa tet act aca aac cca 751

Thr Gln Asp His Ala Asp Lys Ser Lys Pro Gln Ser Thr Thr Asn Pro

180 185 190 195

cac aaa agt cct gea atg tcc aaa tca tet gta gag tgc tat agt act 799

His Lys Ser Pro Ala Met Ser Lys Ser Ser Val Glu Cys Tyr Ser Thr

200 205 210

gtg aac aag cac ttg gac aaa ate aat gaa gct ggt agg agg tta atg 847

Val Asn Lys His Leu Asp Lys Ile Asn Glu Ala Gly Arg Arg Leu Met

215 220 225

aac tet cca aag gtt aag gag aaa gaa gea gtg caa gga tca aaa ggt 895

Asn Ser Pro Lys Val Lys Glu Lys Glu Ala Val Gln Gly Ser Lys Gly

230 235 240

gtg gaa gtt aaa gaa aag agt tca tca ttt cag gea tca gaa aat ttc 943

Val Glu Val Lys Glu Lys Ser Ser Ser Phe Gln Ala Ser Glu Asn Phe

245 250 255

aaa gac aaa tat gct aag cta tgt caa atg agg aat aag gea agt aat 991

Lys Asp Lys Tyr Ala Lys Leu Cys Gln Met Arg Asn Lys Ala Ser Asn

260 265 270 275

ata aat cat tgt gac aac aac ggt tgc caa cct gea age gtg aat gga 1039

Ile Asn His Cys Asp Asn Asn Gly Cys Gln Pro Ala Ser Val Asn Gly

280 285 290aat ttc aca gaa gca aag aac cct aca gca gct aga aat aca tct ttc 1087

Asn Phe Thr Glu Ala Lys Asn Pro Thr Ala Ala Arg Asn Thr Ser Phe

295 300 305

tgt aaa cca tgt act gat gta gat age tct aac agg aag tct aat tta 1135

Cys Lys Pro Cys Thr Asp Val Asp Ser Ser Asn Arg Lys Ser Asn Leu

310 315 320

ctg gaa aga age cca cgg gaa gtt ggt gct aag aga aaa aga gga cat 1183

Leu Glu Arg Ser Pro Arg Glu Val Gly Ala Lys Arg Lys Arg Gly His

325 330 335

cac aat gga gag caa aat gat gat tta tct gac tcc tca gtg gaa tgc 1231

His Asn Gly Glu Gln Asn Asp Asp Leu Ser Asp Ser Ser Val Glu Cys

340 345 350 355

ata cct ggg gag gag-'at"c tct cca gat gaa att gtt gct gct att ggt - 1279-

Ile Pro Gly Glu Glu Ile Ser Pro Asp Glu Ile Val Ala Ala Ile Gly

360 365 370

cca aag cat ttc tgg aaa gcg aga aga gct att cag aat cag cag agg 1327

Pro Lys His Phe Trp Lys Ala Arg Arg Ala Ile Gln Asn Gln Gln Arg

375 380 385

gtt ttt gct gtc caa gtg ttc gag ctg cat aag ctg ata aaa gtg cag 1375

Val Phe Ala Val Gln Val Phe Glu Leu His Lys Leu Ile Lys Val Gln

390 395 400

aag tta ate gcg gca tct cca cat ctg ctt att gaa ggt gat cct gtc 1423

Lys Leu Ile Ala Ala Ser Pro His Leu Leu Ile Glu Gly Asp Pro Val

405 410 415

ctt ggc aat gca tta aca gga aaa agg aac aag ctt cct aaa gga aat 1471

Leu Gly Asn Ala Leu Thr Gly Lys Arg Asn Lys Leu Pro Lys Gly Asn

420 425 430 435

tcg aaa gtt cgg acc ctg tca ate aca aac aaa gat gat ate cag cca 1519

Ser Lys Val Arg Thr Leu Ser Ile Thr Asn Lys Asp Asp Ile Gln Pro

440 445 450

acc cta gag caa cca gag tta tca aaa caa gac aca gaa gga aac tta 1567

Thr Leu Glu Gln Pro Glu Leu Ser Lys Gln Asp Thr Glu Gly Asn Leu

455 460 465

ttg gcc cat tct cat gat ggt gga ctt ggt gac aac cat cat aat caa 1615

Leu Ala His Ser His Asp Gly Gly Leu Gly Asp Asn His His Asn Gln

470 475 480

gct gca aca aat gaa ate ttt aca agt aac cct cca gct atg cct gtt 1663Ala Ala Thr Asn Glu Ile Phe Thr Ser Asn Pro Pro Ala Met Pro Val485 490 495gct cct gac aac aaa cag aat aac tgg tgc atg aat cca ccg cag aat 1711

Ala Pro Asp Asn Lys Gln Asn Asn Trp Cys Met Asn Pro Pro Gln Asn

500 505 510 515

caa tgg ctt gtc cca gtt atg tcg cct tct gaa ggt ctt gtc tat aag 1759

Gln Trp Leu Val Pro Val Met Ser Pro Ser Glu Gly Leu Val Tyr Lys

520 525 530

cct ttt gcc ggc cct tgt ccc cca gtt gga aat ctg ctg aca cca ttt 1807

Pro Phe Ala Gly Pro Cys Pro Pro Val Gly Asn Leu Leu Thr Pro Phe

535 540 545

tac gcc aac tgt act ccg tta agg ctg cct tct aca cca tat ggc gtt 1855

Tyr Ala Asn Cys Thr Pro Leu Arg Leu Pro Ser Thr Pro Tyr Gly Val550 555 560

cct att cct cac cag cca cag cac atg gtc cct cct ggt—gcc cct gcc 1903

Pro Ile Pro His Gln Pro Gln His Met Val Pro Pro Gly Ala Pro Ala565 570 575

atg cat atg aac tac ttc ccg cct ttc agt atg cca gtg atg aat cca 1951

Met His Met Asn Tyr Phe Pro Pro Phe Ser Met Pro Val Met Asn Pro

580 585 590 595

gga aca cca gca tct gca gtg gaa caa ggg age cat gct gct gcg cca 1999

Gly Thr Pro Ala Ser Ala Val Glu Gln Gly Ser His Ala Ala Ala Pro

600 605 610

cag cct cat ggg cac atg gac cag cag tcg ctg ate tcc tgt aac atg 2047

Gln Pro His Gly His Met Asp Gln Gln Ser Leu Ile Ser Cys Asn Met

615 620 625

tca cac ccg agt ggc gtt tgg agg ttt ctt gca tca agg gac age gag 2095

Ser His Pro Ser Gly Val Trp Arg Phe Leu Ala Ser Arg Asp Ser Glu630 635 640

cca cag gcc age age gcc acc age cct ttc gac agg ctc caa gtc caa 2143

Pro Gln Ala Ser Ser Ala Thr Ser Pro Phe Asp Arg Leu Gln Val Gln645 650 655

ggt gat gga agt gct ccg ttg tca ttg ttg tca ttc ttt ccc acg gct 2191

Gly Asp Gly Ser Ala Pro Leu Ser Leu Leu Ser Phe Phe Pro Thr Ala

660 665 670 675

tca gct ccg aat gtc cag cct ccg ccc tca tct gga ggc tgg gac cgg 2239

Ser Ala Pro Asn Val Gln Pro Pro Pro Ser Ser Gly Gly Trp Asp Arg

680 685 690

gac cag cag aac cat gta ate agg gtt gtt ccg cgt aac gcc cag act 2287

Asp Gln Gln Asn His Val Ile Arg Val Val Pro Arg Asn Ala Gln Thr

695 700 705

gct tca gtc ccg aaa gcc caa cct cag ccg tca tcc gga ggc cgg gacAla Ser Val Pro Lys Ala Gln Pro Gln Pro Ser Ser Gly Gly Arg Asp710 715 720

2335caa aag aac cat gta ate agg gtt gtt ccg cat aac gcg cag act gct 2383

Gln Lys Asn His Val Ile Arg Val Val Pro His Asn Ala Gln Thr Ala

725 730 735

tcg gag tca gea gcg tgg ate ttc cgg tca ata caa atg gag agg aac 2431

Ser Glu Ser Ala Ala Trp Ile Phe Arg Ser Ile Gln Met Glu Arg Asn

740 745 750 755

caa aat gat tcg t agctggttac catatacttt cgtgtcatcc gatggcagaa 2484

Gln Asn Asp Ser

aagggcgaat tc 2496

<210> SEQ ID NO: 2

<211> Comprimento: 2277

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:<221> Nome/Chave: CDS<222> Localização: (1)...(2277)<223> Outras informações: ZmELF3

<400> Seqüência: 2

atg acg agg gga ggc ggt gga caa gga ggc aag gag gag ccg ggg aag 48

Met Thr Arg Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Lys Glu Glu Pro Gly Lys1 5 10 15

gtg atg ggt ccg ctg ttc ccg cgg ctc cac gtc age gac gea ggc aag 96Val Met Gly Pro Leu Phe Pro Arg Leu His Val Ser Asp Ala Gly Lys20 25 30

ggc ggc ggc ccg cgg gct ccg ccc agg aac aag atg gcg ctc tac gag 144Gly Gly Gly Pro Arg Ala Pro Pro Arg Asn Lys Met Ala Leu Tyr Glu35 40 45

cag ttc acc gtg ccg tcc aac cgc ttc age tcc ccc gcc gcc tcc gcc 192Gln Phe Thr Val Pro Ser Asn Arg Phe Ser Ser Pro Ala Ala Ser Ala50 55 60

cgc gcc gcg ggg gcc age ctc gtg ccc tcc acg gcg gct gcc cag gtt 240Arg Ala Ala Gly Ala Ser Leu Val Pro Ser Thr Ala Ala Ala Gln Val65 70 75 80

tat ggt tat gac agg acg ctg ttc cag ccc ttc gat gtg cct tca aat 288Tyr Gly Tyr Asp Arg Thr Leu Phe Gln Pro Phe Asp Val Pro Ser Asn

85 90 95

gag cct cct cgt tca tet gaa aag ttc aaa gga aac act ate aac gga 336Glu Pro Pro Arg Ser Ser Glu Lys Phe Lys Gly Asn Thr Ile Asn Gly100 105 110cag tct aat agt aca aga aga gaa cct ttg agg atg tcc tca cag acc 384

Gln Ser Asn Ser Thr Arg Arg Glu Pro Leu Arg Met Ser Ser Gln Thr

115 120 125

aag aac aag gac gtc tgt gct tca aaa tca att gcc aag tgc acc tca 432

Lys Asn Lys Asp Val Cys Ala Ser Lys Ser Ile Ala Lys Cys Thr Ser130 135 140

cag cat aga gtg ggc aac acc ate atg tct tct ggg aag aaa gtg gtc 480

Gln His Arg Val Gly Asn Thr Ile Met Ser Ser Gly Lys Lys Val Val145 150 155 160

agt gat gat gaa ttt atg gtt cct tcc ate tgt tat cct aga ttt tat 528

Ser Asp Asp Glu Phe Met Val Pro Ser Ile Cys Tyr Pro Arg Phe Tyr

165 170 175

cga cag tct act caa. gat cat gea gat aaa. tca aaa ccc caa tct act 57 6

Arg Gln Ser Thr Gln Asp His Ala Asp Lys Ser Lys Pro Gln Ser Thr180 185 190

aca aac cca cac aaa agt cct gea atg tcc aaa tca tct gta gag tgc 624

Thr Asn Pro His Lys Ser Pro Ala Met Ser Lys Ser Ser Val Glu Cys

195 200 205

tat agt act gtg aac aag cac ttg gac aaa ate aat gaa gct ggt agg 672

Tyr Ser Thr Val Asn Lys His Leu Asp Lys Ile Asn Glu Ala Gly Arg210 215 220

agg tta atg aac tct cca aag gtt aag gag aaa gaa gea gtg caa gga 720

Arg Leu Met Asn Ser Pro Lys Val Lys Glu Lys Glu Ala Val Gln Gly225 230 235 240

tca aaa ggt gtg gaa gtt aaa gaa aag agt tca tca ttt cag gea tca 768

Ser Lys Gly Val Glu Val Lys Glu Lys Ser Ser Ser Phe Gln Ala Ser

245 250 255

gaa aat ttc aaa gac aaa tat gct aag cta tgt caa atg agg aat aag 816

Glu Asn Phe Lys Asp Lys Tyr Ala Lys Leu Cys Gln Met Arg Asn Lys260 265 270

gea agt aat ata aat cat tgt gac aac aac ggt tgc caa cct gea age 864

Ala Ser Asn Ile Asn His Cys Asp Asn Asn Gly Cys Gln Pro Ala Ser

275 280 285

gtg aat gga aat ttc aca gaa gea aag aac cct aca gea gct aga aat 912

Val Asn Gly Asn Phe Thr Glu Ala Lys Asn Pro Thr Ala Ala Arg Asn290 295 300

aca tct ttc tgt aaa cca tgt act gat gta gat age tct aac agg aag 960

Thr Ser Phe Cys Lys Pro Cys Thr Asp Val Asp Ser Ser Asn Arg Lys305 310 315 320

tct aat tta ctg gaa aga age cca cgg gaa gtt ggt gct aag aga aaa 1008

Ser Asn Leu Leu Glu Arg Ser Pro Arg Glu Val Gly Ala Lys Arg Lys

325 330 335aga gga cat cac aat gga gag caa aat gat gat tta tct gac tcc tca 1056

Arg Gly His His Asn Gly Glu Gln Asn Asp Asp Leu Ser Asp Ser Ser

340 345 350

gtg gaa tgc ata cct ggg gag gag ate tct cca gat gaa att gtt gct 1104

Val Glu Cys Ile Pro Gly Glu Glu Ile Ser Pro Asp Glu Ile Val Ala

355 360 365

gct att ggt cca aag cat ttc tgg aaa gcg aga aga gct att cag aat 1152

Ala Ile Gly Pro Lys His Phe Trp Lys Ala Arg Arg Ala Ile Gln Asn370 375 380

cag cag agg gtt ttt gct gtc caa gtg ttc gag ctg cat aag ctg ata 1200

Gln Gln Arg Val Phe Ala Val Gln Val Phe Glu Leu His Lys Leu Ile385 390 395 400

aaa gtg cag aag tta ate gcg gea tct cca cat ctg ctt att gaa ggt 1248

Lys Val Gln Lys Leu Ile Ala Ala Ser Pro His Leu Leu Ile Glu Gly

405 410 415

gat cct gtc ctt ggc aat gea tta aca gga aaa agg aac aag ctt cct 1296

Asp Pro Val Leu Gly Asn Ala Leu Thr Gly Lys Arg Asn Lys Leu Pro

420 425 430

aaa gga aat tcg aaa gtt cgg acc ctg tca ate aca aac aaa gat gat 1344

Lys Gly Asn Ser Lys Val Arg Thr Leu Ser Ile Thr Asn Lys Asp Asp

435 440 445

ate cag cca acc cta gag caa cca gag tta tca aaa caa gac aca gaa 1392

Ile Gln Pro Thr Leu Glu Gln Pro Glu Leu Ser Lys Gln Asp Thr Glu450 455 460

gga aac tta ttg gcc cat tct cat gat ggt gga ctt ggt gac aac cat 1440

Gly Asn Leu Leu Ala His Ser His Asp Gly Gly Leu Gly Asp Asn His465 470 475 480

cat aat caa gct gea aca aat gaa ate ttt aca agt aac cct cca gct 1488

His Asn Gln Ala Ala Thr Asn Glu Ile Phe Thr Ser Asn Pro Pro Ala

485 490 495

atg cct gtt gct cct gac aac aaa cag aat aac tgg tgc atg aat cca 1536

Met Pro Val Ala Pro Asp Asn Lys Gln Asn Asn Trp Cys Met Asn Pro

500 505 510

ccg cag aat caa tgg ctt gtc cca gtt atg tcg cct tct gaa ggt ctt 1584

Pro Gln Asn Gln Trp Leu Val Pro Val Met Ser Pro Ser Glu Gly Leu

515 520 525

gtc tat aag cct ttt gcc ggc cct tgt ccc cca gtt gga aat ctg ctg 1632

Val Tyr Lys Pro Phe Ala Gly Pro Cys Pro Pro Val Gly Asn Leu Leu530 535 540

aca cca ttt tac gcc aac tgt act ccg tta agg ctg cct tct aca cca 1680Thr Pro Phe Tyr Ala Asn Cys Thr Pro Leu Arg Leu Pro Ser Thr Pro545 550 555 560tat ggc gtt cct att cct cac cag cca cag cac atg gtc cct cct ggt 1728Tyr Gly Val Pro Ile Pro His Gln Pro Gln His Met Val Pro Pro Gly

565 570 575

gcc cct gcc atg cat atg aac tac ttc ccg cct ttc agt atg cca gtg 1776Ala Pro Ala Met His Met Asn Tyr Phe Pro Pro Phe Ser Met Pro Val580 585 590

atg aat cca gga aca cca gca tct gca gtg gaa caa ggg age cat gct 1824Met Asn Pro Gly Thr Pro Ala Ser Ala Val Glu Gln Gly Ser His Ala595 600 605

gct gcg cca cag cct cat ggg cac atg gac cag cag tcg ctg ate tcc 1872Ala Ala Pro Gln Pro His Gly His Met Asp Gln Gln Ser Leu Ile Ser610 615 620

tgt aac atg tca cac ccg agt ggc gtt tgg agg ttt ctt gca tca agg 1920Cys Asn Met Ser His Pro Ser Gly Val Trp Arg Phe Leu Ala Ser Arg625 630 635 640

gac age gag cca cag gcc age age gcc acc age cct ttc gac agg ctc 1968Asp Ser Glu Pro Gln Ala Ser Ser Ala Thr Ser Pro Phe Asp Arg Leu

645 650 655

caa gtc caa ggt gat gga agt gct ccg ttg tca ttg ttg tca ttc ttt 2016Gln Val Gln Gly Asp Gly Ser Ala Pro Leu Ser Leu Leu Ser Phe Phe660 665 670

ccc acg gct tca gct ccg aat gtc cag cct ccg ccc tca tct gga ggc 2064Pro Thr Ala Ser Ala Pro Asn Val Gln Pro Pro Pro Ser Ser Gly Gly675 680 685

tgg gac cgg gac cag cag aac cat gta ate agg gtt gtt ccg cgt aac 2112Trp Asp Arg Asp Gln Gln Asn His Val Ile Arg Val Val Pro Arg Asn690 695 700

gcc cag act gct tca gtc ccg aaa gcc caa cct cag ccg tca tcc gga 2160Ala Gln Thr Ala Ser Val Pro Lys Ala Gln Pro Gln Pro Ser Ser Gly705 710 715 720

ggc cgg gac caa aag aac cat gta ate agg gtt gtt ccg cat aac gcg 2208Gly Arg Asp Gln Lys Asn His Val Ile Arg Val Val Pro His Asn Ala

725 730 735

cag act gct tcg gag tca gca gcg tgg ate ttc cgg tca ata caa atg 2256Gln Thr Ala Ser Glu Ser Ala Ala Trp Ile Phe Arg Ser Ile Gln Met740 745 750

gag agg aac caa aat gat tcg 2277

Glu Arg Asn Gln Asn Asp Ser755<210> SEQ ID NO: 3<211> Comprimento: 759<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays

<400> Seqüência: 3

Met Thr Arg Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Lys Glu Glu Pro Gly Lys1 5 10 15 Val Met Gly Pro Leu Phe Pro Arg Leu His Val Ser Asp Ala Gly Lys 20 25 30 Gly Gly Gly Pro Arg Ala Pro Pro Arg Asn Lys Met Ala Leu Tyr Glu 35 40 45 Gln Phe Thr Val Pro Ser Asn Arg Phe Ser Ser Pro Ala Ala Ser Ala 50 55 60 Arg Ala Ala Gly Ala Ser Leu Val Pro Ser Thr Ala Ala Ala Gln Val65 70 75 80JTyr Gly Tyr Asp Arg- Thr Le.u- -Phe Gln- -Bro Phe Asp- -Val Pro- -Ser Asn 85 90 95 Glu Pro Pro Arg Ser Ser Glu Lys Phe Lys Gly Asn Thr Ile Asn Gly 100 105 110 Gln Ser Asn Ser Thr Arg Arg Glu Pro Leu Arg Met Ser Ser Gln Thr 115 120 125 Lys Asn Lys Asp Val Cys Ala Ser Lys Ser Ile Ala Lys Cys Thr Ser 130 135 140 Gln His Arg Val Gly Asn Thr Ile Met Ser Ser Gly Lys Lys Val Val145 150 155 160Ser Asp Asp Glu Phe Met Val Pro Ser Ile Cys Tyr Pro Arg Phe Tyr 165 170 175 Arg Gln Ser Thr Gln Asp His Ala Asp Lys Ser Lys Pro Gln Ser Thr 180 185 190 Thr Asn Pro His Lys Ser Pro Ala Met Ser Lys Ser Ser Val Glu Cys 195 200 205 Tyr Ser Thr Val Asn Lys His Leu Asp Lys Ile Asn Glu Ala Gly Arg 210 215 220 Arg Leu Met Asn Ser Pro Lys Val Lys Glu Lys Glu Ala Val Gln Gly225 230 235 240Ser Lys Gly Val Glu Val Lys Glu Lys Ser Ser Ser Phe Gln Ala Ser 245 250 255 Glu Asn Phe Lys Asp Lys Tyr Ala Lys Leu Cys Gln Met Arg Asn Lys 260 265 270 Ala Ser Asn Ile Asn His Cys Asp Asn Asn Gly Cys Gln Pro Ala Ser 275 280 285 Val Asn Gly Asn Phe Thr Glu Ala Lys Asn Pro Thr Ala Ala Arg Asn 290 295 300 Thr Ser Phe Cys Lys Pro Cys Thr Asp Val Asp Ser Ser Asn Arg Lys305 310 315 320Ser Asn Leu Leu Glu Arg Ser Pro Arg Glu Val Gly Ala Lys Arg Lys 325 330 335 Arg Gly His His Asn Gly Glu Gln Asn Asp Asp Leu Ser Asp Ser Ser 340 345 350 Val Glu Cys Ile Pro Gly Glu Glu Ile Ser Pro Asp Glu Ile Val Ala 355 360 365 Ala Ile Gly Pro Lys His Phe Trp Lys Ala Arg Arg Ala Ile Gln Asn 370 375 380 Gln Gln Arg Val Phe Ala Val Gln Val Phe Glu Leu His Lys Leu Ile385 390 395 400Lys Val Gln Lys Leu Ile Ala Ala Ser Pro His Leu Leu Ile Glu Gly 405 410 415 Asp Pro Val Leu Gly Asn Ala Leu Thr Gly Lys Arg Asn Lys Leu Pro 420 425 430 Lys Gly Asn Ser Lys Val Arg Thr Leu Ser Ile Thr Asn Lys Asp Asp 435 440 445 Ile Gln Pro Thr Leu Glu Gln Pro Glu Leu Ser Lys Gln Asp Thr Glu 450 455 460 Gly Asn Leu Leu Ala His Ser His Asp Gly Gly Leu Gly Asp Asn His465 470 475 480His Asn Gln Ala Ala Thr Asn Glu Ile Phe Thr Ser Asn Pro Pro Ala 485 490 495 Met Pro Val Ala Pro Asp Asn Lys Gln Asn Asn Trp Cys Met Asn Pro 500 505 510 Pro Gln Asn Gln Trp Leu Val Pro Val Met Ser Pro Ser Glu Gly Leu 515 .. . ___ J520 _________ 525 ------- Val Tyr Lys Pro Phe Ala Gly Pro Cys Pro Pro Val Gly Asn Leu Leu 530 535 540 Thr Pro Phe Tyr Ala Asn Cys Thr Pro Leu Arg Leu Pro Ser Thr Pro545 550 555 560Tyr Gly Val Pro Ile Pro His Gln Pro Gln His Met Val Pro Pro Gly 565 570 575 Ala Pro Ala Met His Met Asn Tyr Phe Pro Pro Phe Ser Met Pro Val 580 585 590 Met Asn Pro Gly Thr Pro Ala Ser Ala Val Glu Gln Gly Ser His Ala 595 600 605 Ala Ala Pro Gln Pro His Gly His Met Asp Gln Gln Ser Leu Ile Ser 610 615 620 Cys Asn Met Ser His Pro Ser Gly Val Trp Arg Phe Leu Ala Ser Arg625 630 635 640Asp Ser Glu Pro Gln Ala Ser Ser Ala Thr Ser Pro Phe Asp Arg Leu 645 650 655 Gln Val Gln Gly Asp Gly Ser Ala Pro Leu Ser Leu Leu Ser Phe Phe 660 665 670 Pro Thr Ala Ser Ala Pro Asn Val Gln Pro Pro Pro Ser Ser Gly Gly 675 680 685 Trp Asp Arg Asp Gln Gln Asn His Val Ile Arg Val Val Pro Arg Asn 690 695 700 Ala Gln Thr Ala Ser Val Pro Lys Ala Gln Pro Gln Pro Ser Ser Gly705 710 715 720Gly Arg Asp Gln Lys Asn His Val Ile Arg Val Val Pro His Asn Ala 725 730 735 Gln Thr Ala Ser Glu Ser Ala Ala Trp Ile Phe Arg Ser Ile Gln Met 740 745 750 Glu Arg Asn Gln Asn Asp Ser 755

<210> SEQ ID NO: 4<211> Comprimento: 459<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:<221> Nome/Chave: promoter<222> Localização: (1)...(459)<223> Outras informações: região

<400> Seqüência: 4cgaggggctc ctattttcgg accgtgctcgcagcactaga catgacatta ccatctgtagatttttcact ataaacttca ctattggtaaataaccttaa aaagagtaag ttgttagaacaccccaaaaa aacctgcttg cacatactcatctcatggtg gagcccacct ccgcctttgtttccctggca tcagaatcaa acgtgtccccgctctcacgg tttgatttcc ctttcagttg

regulatória "upstream" ZmELF3

tgctggcccg aaaagtccgg cccatattcc 60cagtttacct aaaatttatc taaaaacact 120aatagagttt aaatattggt gagtttgaag 180ttagaagcaa cctcaccgcc taattaacac 240accgccagcg tctccactct ccggtctccc 300ggatcagagc gagcattcct ttcccttccc 360gcagacgctc ccaatcccat gcgcccctct 420ggccgccat 459

<210> SEQ ID NO: 5

<211> Comprimento: 1401

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Arabidopsis thaliana

<220> Características:<221> Nome/Chave: CDS<222> Localização: (1)...(1401)<223> Outras informações: bHLH041

<400> Seqüência: 5

atg atg cat ttg att ttg age tgc age tat tta ata tca atg gat gga 48

Met Met His Leu Ile Leu Ser Cys Ser Tyr Leu Ile Ser Met Asp Gly1 5 10 15

tat tac aat gaa gct tet gaa gaa cct tet tcg tet tet tet tet gga . 96Tyr Tyr Asn Glu Ala Ser Glu Glu Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly20 25 30

agt tta gct agg age ttg ttc cat gag tat cgc caa tcc gtt ate ccg 144Ser Leu Ala Arg Ser Leu Phe His Glu Tyr Arg Gln Ser Val Ile Pro35 40 45

ctc caa aat ggg cat gtg cca age atg gcg ttc atg aac aat ctt cca 192Leu Gln Asn Gly His Val Pro Ser Met Ala Phe Met Asn Asn Leu Pro50 55 60

tac gta gaa att cga cca caa gag agt caa aga ctt gct ttt aac gac 240Tyr Val Glu Ile Arg Pro Gln Glu Ser Gln Arg Leu Ala Phe Asn Asp65 70 75 80

aca caa cgt ctc ttc tat cag atg aaa att gaa gea agt ctt cga gaa 288Thr Gln Arg Leu Phe Tyr Gln Met Lys Ile Glu Ala Ser Leu Arg Glu

85 90 95

tgg ttc cct gaa gat ttc aat aga aag tet tet ccg gea aac tcc gat 336Trp Phe Pro Glu Asp Phe Asn Arg Lys Ser Ser Pro Ala Asn Ser Asp100 105 110tat ctc cgg cca cct cat tat ccc tct tca tcg tct tct tct ctt agt 384

Tyr Leu Arg Pro Pro His Tyr Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser

115 120 125

ccc aac aac ate tcc gaa tat tcc tct ctt ttg ttc cca ctc ate cct 432

Pro Asn Asn Ile Ser Glu Tyr Ser Ser Leu Leu Phe Pro Leu Ile Pro130 135 140

aaa cct tca acg acg act gag gcc gtt aac gtt ccg gta ctt cca ccg 480

Lys Pro Ser Thr Thr Thr Glu Ala Val Asn Val Pro Val Leu Pro Pro145 150 155 160

cta gct ccg ate aat atg ate cat cca cag cat caa gag cct tta ttc 528

Leu Ala Pro Ile Asn Met Ile His Pro Gln His Gln Glu Pro Leu Phe

165 170 175

cgt aac cgt caa cgt gag gaa gaa gea atg acg caa gea ate tta gcg 57 6

Arg Asn Arg Gln Arg Glu Glu Glu Ala Met Thr Gln Ala Ile Leu Ala

180 185 190

gtt tta acg ggg cca tca agt cct ccg tca act tct tcc tcg ccg cag 624

Val Leu Thr Gly Pro Ser Ser Pro Pro Ser Thr Ser Ser Ser Pro Gln

195 200 205

cgt aaa gga aga gcc acc gct ttt aag aga tat tac tcc atg att agt 672

Arg Lys Gly Arg Ala Thr Ala Phe Lys Arg Tyr Tyr Ser Met Ile Ser210 215 220

gac cgc ggt aga gcc ccg ctt ccg agt gtt cgg aag caa agt atg atg 720

Asp Arg Gly Arg Ala Pro Leu Pro Ser Val Arg Lys Gln Ser Met Met225 230 235 240

aca aga gcg atg tcc ttc tac aat agg ctt aac att aac cag aga gag 768

Thr Arg Ala Met Ser Phe Tyr Asn Arg Leu Asn Ile Asn Gln Arg Glu

245 250 255

cgt ttt act agg gaa aac gct act aca cac ggc gag gga age ggt gga 816

Arg Phe Thr Arg Glu Asn Ala Thr Thr His Gly Glu Gly Ser Gly Gly

260 265 270

agt gga ggg ggt gga cgt tat act age ggg cca age gea acg caa ctg 8 64

Ser Gly Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Ser Gly Pro Ser Ala Thr Gln Leu

275 280 285

caa cat atg ata tcg gag agg aaa cgg cga gag aag ctt aat gag age 912

Gln His Met Ile Ser Glu Arg Lys Arg Arg Glu Lys Leu Asn Glu Ser290 295 300

ttt caa gea ttg aga tct ctc ctt cct ccc gga act aag aaa gat aaa 960

Phe Gln Ala Leu Arg Ser Leu Leu Pro Pro Gly Thr Lys Lys Asp Lys305 310 315 320

gea tcg gtc ctc tcc att gea aga gag caa cta tct tct ttg caa ggt 1008

Ala Ser Val Leu Ser Ile Ala Arg Glu Gln Leu Ser Ser Leu Gln Gly

325 330 335gag att tcg aaa cta cta gag aga aat cgg gag gta gag gca aag cta 1056

Glu Ile Ser Lys Leu Leu Glu Arg Asn Arg Glu Val Glu Ala Lys Leu

340 345 350

gca gga gaa aga gag att gaa aat gat tta cga ccc gaa gag agg ttt 1104

Ala Gly Glu Arg Glu Ile Glu Asn Asp Leu Arg Pro Glu Glu Arg Phe

355 360 365

aac gtt cgt ata aga cat ata cct gaa tca aca tct aga gag agg act 1152

Asn Val Arg Ile Arg His Ile Pro Glu Ser Thr Ser Arg Glu Arg Thr

370 375 380

ttg gat cta cga gtt gtt cta agg gga gac ate att agg gtt gat gat 1200

Leu Asp Leu Arg Val Val Leu Arg Gly Asp Ile Ile Arg Val Asp Asp

385 390 395 400

ttg atg ata aga_ctt_ctc gaa t.t_c_ti.g. aag caa ate aac aat gtg age 1248

Leu Met Ile Arg Leu Leu Glu Phe Leu Lys Gln Ile Asn Asn Val Ser

405 410 415

tta gtg tca ate gaa gct cga act cta gct aga gca gag ggg gat act 1296

Leu Val Ser Ile Glu Ala Arg Thr Leu Ala Arg Ala Glu Gly Asp Thr420 425 430

tca att gtt ctt gtg ate age tta agg ctc aag att gag ggt gaa tgg 1344

Ser Ile Val Leu Val Ile Ser Leu Arg Leu Lys Ile Glu Gly Glu Trp435 440 445

gac gaa tca gcc ttc caa gaa gca gtc aga agg gtt gtt gct gac ttg 1392

Asp Glu Ser Ala Phe Gln Glu Ala Val Arg Arg Val Val Ala Asp Leu450 455 460

gct cac tga 1401

Ala His *

465

<210> SEQ ID NO: 6<211> Comprimento: 466<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Arabidopsis thaliana·

<220> Características:<221> Nome/Chave: DOMAIN<222> Localização: (287) ... (339)<223> Outras informações: domínio bHLH

<400> Seqüência: 6

Met Met His Leu Ile Leu Ser Cys Ser Tyr Leu Ile Ser Met Asp Gly

15 10 15

Tyr Tyr Asn Glu Ala Ser Glu Glu Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly

20 25 30

Ser Leu Ala Arg Ser Leu Phe His Glu Tyr Arg Gln Ser Val Ile Pro35 40 45Leu Gln Asn Gly His Val Pro Ser Met Ala Phe Met Asn Asn Leu Pro

50 55 60

Tyr Val Glu Ile Arg Pro Gln Glu Ser Gln Arg Leu Ala Phe Asn Asp65 70 75 80

Thr Gln Arg Leu Phe Tyr Gln Met Lys Ile Glu Ala Ser Leu Arg Glu

85 90 95

Trp Phe Pro Glu Asp Phe Asn Arg Lys Ser Ser Pro Ala Asn Ser Asp

100 105 110

Tyr Leu Arg Pro Pro His Tyr Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser

115 120 125

Pro Asn Asn Ile Ser Glu Tyr Ser Ser Leu Leu Phe Pro Leu Ile Pro

130 135 140

Lys Pro Ser Thr Thr Thr Glu Ala Val Asn Val Pro Val Leu Pro Pro145 150 155 160

Leu Ala Pro Ile Asn Met Ile His Pro Gln His Gln Glu Pro Leu Phe

165 170 175

_Arg Asn Arg Gln Arg _Glu Glu .G.l_u_Ala Met Thr Gln Ala^Ile Leu AXa

180 185 190

Val Leu Thr Gly Pro Ser Ser Pro Pro Ser Thr Ser Ser Ser Pro Gln

195 200 205

Arg Lys Gly Arg Ala Thr Ala Phe Lys Arg Tyr Tyr Ser Met Ile Ser

210 215 220

Asp Arg Gly Arg Ala Pro Leu Pro Ser Val Arg Lys Gln Ser Met Met225 230 235 240

Thr Arg Ala Met Ser Phe Tyr Asn Arg Leu Asn Ile Asn Gln Arg Glu

245 250 255

Arg Phe Thr Arg Glu Asn Ala Thr Thr His Gly Glu Gly Ser Gly Gly

260 265 270

Ser Gly Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Ser Gly Pro Ser Ala Thr Gln Leu

275 280 285

Gln His Met Ile Ser Glu Arg Lys Arg Arg Glu Lys Leu Asn Glu Ser

290 295 300

Phe Gln Ala Leu Arg Ser Leu Leu Pro Pro Gly Thr Lys Lys Asp Lys305 310 315 320

Ala Ser Val Leu Ser Ile Ala Arg Glu Gln Leu Ser Ser Leu Gln Gly

325 330 335

Glu Ile Ser Lys Leu Leu Glu Arg Asn Arg Glu Val Glu Ala Lys Leu

340 345 350

Ala Gly Glu Arg Glu Ile Glu Asn Asp Leu Arg Pro Glu Glu Arg Phe

355 360 365

Asn Val Arg Ile Arg His Ile Pro Glu Ser Thr Ser Arg Glu Arg Thr

370 375 380

Leu Asp Leu Arg Val Val Leu Arg Gly Asp Ile Ile Arg Val Asp Asp385 390 395 400

Leu Met Ile Arg Leu Leu Glu Phe Leu Lys Gln Ile Asn Asn Val Ser

405 410 415

Leu Val Ser Ile Glu Ala Arg Thr Leu Ala Arg Ala Glu Gly Asp Thr

420 425 430

Ser Ile Val Leu Val Ile Ser Leu Arg Leu Lys Ile Glu Gly Glu Trp

435 440 445

Asp Glu Ser Ala Phe Gln Glu Ala Val Arg Arg Val Val Ala Asp Leu

450 455 460

Ala His4 65<210> SEQ ID NO: 7<211> Comprimento: 695<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Arabidopsis thaliana

<400> Seqüência: 7

Met Lys Arg Gly Lys Asp Glu Glu Lys Ile Leu Glu Pro Met Phe Pro1 5 10 15 Arg Leu His Val 20 Asn Asp Ala Asp Lys 25 Gly Gly Pro Arg Ala 30 Pro ProArg Asn Lys 35 Met Ala Leu Tyr Glu 40 Gln Leu Ser Ile Pro 45 Ser Gln ArgPhe Gly 50 Asp His Gly Thr Met 55 Asn Ser Arg Ser Asn 60 Asn Thr Ser ThrLeu Val His Pro Gly Pro Ser Ser Gln Pro Cys Gly Val Glu Arg Asn65 70 75 Leu Ser Val Gln His 85 Leu Asp Ser Ser Ala 90 Ala Asn Gln Ala Thr 95 GluLys Phe Val Ser 100 Gln Met Ser Phe Met 105 Glu Asn Val Arg Ser 110 Ser AlaGln His Asp 115 Gln Arg Lys Met Val 120 Arg Glu Glu Glu Asp 125 Phe Ala ValPro Val 130 Tyr Ile Asn Ser Arg 135 Arg Ser Gln Ser His 140 Gly Arg Thr LysSer Gly Ile Glu Lys Glu Lys His Thr Pro Met Val Ala Pro Ser Ser145 150 155 160His His Ser Ile Arg 165 Phe Gln Glu Val Asn 170 Gln Thr Gly Ser Lys 175 GlnAsn Val Cys Leu 180 Ala Thr Cys Ser Lys 185 Pro Glu Val Arg Asp 190 Gln ValLys Ala Asn 195 Ala Arg Ser Gly Gly 200 Phe Val Ile Ser Leu 205 Asp Val SerVal Thr 210 Glu Glu Ile Asp Leu 215 Glu Lys Ser Ala Ser 220 Ser His Asp ArgVal Asn Asp Tyr Asn Ala Ser Leu Arg Gln Glu Ser Arg Asn Arg Leu225 230 235 240Tyr Arg Asp Gly Gly 245 Lys Thr Arg Leu Lys 250 Asp Thr Asp Asn Gly 255 AlaGlu Ser His Leu 260 Ala Thr Glu Asn His 265 Ser Gln Glu Gly His 270 Gly SerPro Glu Asp 275 Ile Asp Asn Asp Arg 280 Glu Tyr Ser Lys Ser 285 Arg Ala CysAla Ser 290 Leu Gln Gln Ile Asn 295 Glu Glu Ala Ser Asp 300 Asp Val Ser AspAsp Ser Met Val Asp Ser Ile Ser Ser Ile Asp Val Ser Pro Asp Asp305 310 315 320Val Val Gly Ile Leu 325 Gly Gln Lys Arg Phe 330 Trp Arg Ala Arg Lys 335 AlaIle Ala Asn Gln 340 Gln Arg Val Phe Ala 345 Val Gln Leu Phe Glu 350 Leu HisArg Leu Ile 355 Lys Val Gln Lys Leu 360 Ile Ala Ala Ser Pro 365 Asp Leu LeuLeu Asp 370 Glu Ile Ser Phe Leu 375 Gly Lys Val Ser Ala 380 Lys Ser Tyr ProVal Lys Lys Leu Leu Pro Ser Glu Phe Leu Val Lys Pro Pro Leu Pro385 390 395 400His Val Val Val Lys Gln Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Asp Gln His 405 410 415 Lys Met Glu Ser Ser Ala Glu Asn Val Val Gly Arg Leu Ser Asn Gln 420 425 430 Gly His His Gln Gln Ser Asn Tyr Met Pro Phe Ala Asn Asn Pro Pro 435 440 445 Ala Ser Pro Ala Pro Asn Gly Tyr Cys Phe Pro Pro Gln Pro Pro Pro 450 455 460 Ser Gly Asn His Gln Gln Trp Leu Ile Pro Val Met Ser Pro Ser Glu465 470 475 480Gly Leu Ile Tyr Lys Pro His Pro Gly Met Ala His Thr Gly His Tyr 485 490 495 Gly Gly Tyr Tyr Gly His Tyr Met Pro Thr Pro Met Val Met Pro Gln 500 505 510 Tyr JHis Pro Gly _Met Gly Phe- - Pro Pro Pro -Gly-Asn Gly Tyr- -Phe Pro 515 520 525 Pro Tyr Gly Met Met Pro Thr Ile Met Asn Pro Tyr Cys Ser Ser Gln 530 535 540 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Asn Glu Gln Met Asn Gln Phe Gly His545 550 555 560Pro Gly Asn Leu Gln Asn Thr Gln Gln Gln Gln Gln Arg Ser Asp Asn 565 570 575 Glu Pro Ala Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Thr Lys Ser Tyr Pro Arg 580 585 590 Ala Arg Lys Ser Arg Gln Gly Ser Thr Gly Ser Ser Pro Ser Gly Pro 595 600 605 Gln Gly Ile Ser Gly Ser Lys Ser Phe Arg Pro Phe Ala Ala Val Asp 610 615 620 Glu Asp Ser Asn Ile Asn Asn Ala Pro Glu Gln Thr Met Thr Thr Thr625 630 635 640Thr Thr Thr Thr Arg Thr Thr Val Thr Gln Thr Thr Arg Asp Gly Gly 645 650 655 Gly Val Thr Arg Val Ile Lys Val Val Pro His Asn Ala Lys Leu Ala 660 665 670 Ser Glu Asn Ala Ala Arg Ile Phe Gln Ser Ile Gln Glu Glu Arg Lys 675 680 685 Arg Tyr Asp Ser Ser Lys Pro 690 695

<210> SEQ ID NO: 8<211> Comprimento: 760<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Oryza sativa<400> Seqüência: 8

Met Ala Thr Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Glu Ala Lys

15 10 15

Gly Lys Val Met Gly Pro Leu Phe Pro Arg Leu His Val Asn Asp Ala

20 25 30

Ala Lys Gly Gly Gly Pro Arg Ala Pro Pro Arg Asn Lys Met Ala Leu35 40 45Tyr Glu Gln Phe Thr Val Pro Ser His Arg Phe Ser Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Gly Gly Gly Val Gly Gly Ser Pro Ala His Ser Thr Ser Ala Ala Ser65 70 75 80Gln Ser Gln Ser Gln Ser Gln Val Tyr Gly Arg Asp Ser Ser Leu Phe 85 90 95 Gln Pro Phe Asn Val Pro Ser Asn Arg Pro Gly His Ser Thr Glu Lys 100 105 110 Ile Asn Ser Asp Lys Ile Asn Lys Lys Ile Ser Gly Ser Arg Lys Glu 115 120 125 Leu Gly Met Leu Ser Ser Gln Thr Lys Gly Met Asp Ile Tyr Ala Ser 130 135 140 Arg Ser Thr Ala Glu Ala Pro Gln Arg Arg Ala Glu Asn Thr Ile Lys145 150 155 160Ser Ser Ser Gly Lys Arg Leu Ala Asp Asp Asp Glu Phe Met Val Pro 165 170 175 Ser Val Phe Asn Ser _Arg Phe Pro Gln Tyr_ Ser _T.hr_ JS.ln. Glu Asn Ala 180 185 190 Gly Val Gln Asp Gln Ser Thr Pro Leu Val Ala Ala Asn Pro His Lys 195 200 205 Ser Pro Ser Thr Val Ser Lys Ser Ser Thr Lys Cys Tyr Asn Thr Val 210 215 220 Ser Lys Lys Leu Glu Arg Ile His Val Ser Asp Val Lys Ser Arg Thr225 230 235 240Pro Leu Lys Asp Lys Glu Met Glu Ala Ala Gln Thr Ser Lys Asn Val 245 250 255 Glu Val Glu Lys Ser Ser Ser Phe His Ala Ser Lys Asp Met Phe Glu 260 265 270 Ser Arg His Ala Lys Val Tyr Pro Lys Met Asp Lys Thr Gly Ile Ile 275 280 285 Asn Asp Ser Asp Glu Pro His Gly Gly Asn Ser Gly His Gln Ala Thr 290 295 300 Ser Arg Asn Gly Gly Ser Met Lys Phe Gln Asn Pro Pro Met Arg Arg305 310 315 320Asn Glu Ile Ser Ser Asn Pro Ser Ser Glu Asn Thr Asp Arg His Tyr 325 330 335 Asn Leu Pro Gln Gly Gly Ile Glu Glu Thr Gly Thr Lys Arg Lys Arg 340 345 350 Leu Leu Glu Gln His Asp Ala Glu Lys Ser Asp Asp Val Ser Arg Leu 355 360 365 Leu Glu Gln His Asp Ala Glu Asn Ile Asp Asp Val Ser Asp Ser Ser 370 375 380 Val Glu Cys Ile Thr Gly Trp Glu Ile Ser Pro Asp Lys Ile Val Gly385 390 395 400Ala Ile Gly Thr Lys His Phe Trp Lys Ala Arg Arg Ala Ile Met Asn 405 410 415 Gln Gln Arg Val Phe Ala Val Gln Val Phe Glu Leu His Lys Leu Val 420 425 430 Lys Val Gln Lys Leu Ile Ala Ala Ser Pro His Val Leu Ile Glu Ser 435 440 445 Asp Pro Cys Leu Gly Asn Ala Leu Leu Gly Ser Lys Asn Lys Leu Val 450 455 460 Glu Glu Asn Leu Lys Ala Gln Pro Leu Leu Val Ala Thr Ile Asp Asp465 470 475 480Val Glu Pro Ser Leu Gln Gln Pro Glu Val Ser Lys Glu Asn Thr Glu 485 490 495 Asp Ser Pro Pro Ser Pro His Asp Thr Gly Leu Gly Ser Gly Gln Arg 500 505 510 Asp Gln Ala Ala Thr Asn Gly Val Ser Lys Ser Asn Arg Arg Ala Thr 515 520 525 Pro Val Ala Ser Asp Asn Lys Gln Asn Asn Trp Gly Val Gln Leu Gln 530 535 540 Pro Pro Gln Asn Gln Trp Leu Val Pro Val Met Ser Pro Leu Glu Gly545 550 555 560Leu Val Tyr Lys Pro Tyr Ser Gly Pro Cys Pro Pro Ala Gly Ser Ile 565 570 575 Leu Ala Pro Phe Tyr Ala Asn Cys Thr Pro Leu Ser Leu Pro Ser Thr 580 585 590 Ala Gly Asp Phe Met Asn Ser Ala Tyr Gly Val Pro Met Pro His Gln 595 600 605 Pro Gl n_ Jiis Met Gly Ala Pro _Gly Pro Pro Ser. -Met -Pro Met Asn Tyr 610 615 620 Phe Pro Pro Phe Ser Ile Pro Val Met Asn Pro Thr Ala Pro Ala Pro625 630 635 640Val Val Glu Gln Gly Arg His Pro Ser Met Pro Gln Pro Tyr Gly Asn 645 650 655 Phe Glu Gln Gln Ser Trp Ile Ser Cys Asn Met Ser His Pro Ser Gly 660 665 670 Ile Trp Arg Phe His Ala Ser Arg Asp Ser Glu Ala Gln Ala Ser Ser 675 680 685 Ala Ser Ser Pro Phe Asp Arg Phe Gln Cys Ser Gly Ser Gly Pro Val 690 695 700 Ser Ala Phe Pro Thr Val Ser Ala Gln Asn Asn Gln Pro Gln Pro Ser705 710 715 720Tyr Ser Ser Arg Asp Asn Gln Thr Asn Val Ile Lys Val Val Pro His 725 730 735 Asn Ser Arg Thr Ala Ser Glu Ser Ala Ala Arg Ile Phe Arg Ser Ile 740 745 750 Gln Met Glu Arg Gln Arg Asp Asp

755 760

<210> SEQ ID NO: 9<211> Comprimento: 20<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Arabidopsis thaliana

<220> Características:

<221> Nome/Chave: misc_signal

<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras informações: elemento noturno

<400> Seqüência: 9gtcccgtcaa aatatctcgc<210> SEQ ID NO: 10

<211> Comprimento: 473

<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Artificial Sequence

<220> Características:

<223> Outras informações: Consenso

<400> Seqüência: 10

Gly Gly Lys Glu Asp Gly Lys Val Met Gly Pro Leu Phe Pro Arg Leu

1 5 10 15

His Val Asn Asp Ala Ala Lys Gly Gly Gly Pro Arg Ala Pro Pro Arg

20 25 30

Asn Lys Met Ala Leu Tyr Glu Gln Phe Thr Val Pro Ser Asn Arg Phe

35 40 45Ser Gly Ala Ala Ala Gly Thr Ser Ser Leu Val Ser Ala Ala Ser Gln50 55 60

Val Tyr Gly Asp Arg Ser Leu Phe Gln Pro Phe Val Pro Ser Asn Pro65 70 75 80

Ser Ser Glu Lys Ile Asn Ser Arg Lys Glu Leu Ser Ser Gln Thr Lys

85 90 95

Asp Ile Ala Ser Lys Ser Ile Ala Ser Gln Arg Val Asn Thr Ile Ser

100 105 110

Ser Gly Lys Lys Val Asp Asp Asp Glu Phe Met Val Pro Ser Ile Asn

115 120 125

Ser Arg Phe Gln Ser Thr Gln Asp Ala Gly Ile Asp Lys Ser Thr Pro

130 135 140

Leu Val Ala Asn Pro His Lys Ser Pro Met Ser Lys Ser Ser Thr Cys145 150 155 160

Tyr Asn Thr Val Lys Leu Asp Lys Ile Glu Ala Lys Leu Lys Lys Lys

165 170 175

Glu Glu Ala Gln Ser Lys Val Glu Val Glu Ser Ser Ser Asp Phe Asp

180 185 190

Lys His Ala Leu Gln Lys Tyr Ile Asn His Asn Gly Gln Ser Asn Gly

195 200 205

Ala Ser Asn Pro Ala Arg Asn Ser Pro Ser Asp Asp Ser Arg Lys Ser

210 215 220

Asn Leu Glu Gly Lys Arg Lys Leu Leu Ile Asp Asp Ile Pro Ser Leu225 230 235 240

Gln Pro Glu Leu Ser Lys Glu Asn Thr Glu Gly Leu Ala His Asp Gly

245 250 255

Leu Gly His Gln Ala Ala Thr Asn Ile Phe Ser Asn Pro Pro Ala Ser

260 265 270

Pro Val Ala Asp Asn Lys Gln Asn Asn Trp Met Asn Pro Gln Asn Gln

275 280 285

Trp Leu Val Pro Val Met Ser Pro Ser Glu Gly Leu Val Tyr Lys Pro

290 295 300

His Ala Gly Pro Cys Pro Pro Ala Gly Ile Leu Pro Phe Tyr Ala Asn305 310 315 320

Cys Thr Pro Leu Leu Pro Ser Thr Tyr Gly Val Pro Ile Pro His Gln

325 330 335

Pro Gln His Met Pro Pro Gly Pro Ala Met Met Asn Tyr Phe Pro Pro

340 345 350

Phe Ser Met Pro Val Met Asn Pro Pro Ala Val Glu Gln Gly His Ala355 360 365Pro Gln Pro His Gly Asn Met Asp Gln Gln Ser Ile Ser Cys Asn Met 370 375 380 Ser His Pro Ser Gly Ile Trp Arg Phe Ala Ser Arg Asp Ser Glu Gln385 390 395 400Ala Ser Ser Ala Thr Ser Pro Phe Asp Arg Gln Ser Gly Gly Ser Ser 405 410 415 Pro Leu Ser Phe Pro Thr Ala Ser Ala Asn Gln Pro Ala Asn Asn Thr 420 425 430 Ser Lys Gln Pro Ser Ser Arg Asp Asn Thr Val Ile Lys Val Val Pro 435 440 445 His Asn Ala Lys Thr Ala Ser Glu Ser Ala Ala Arg Ile Phe Arg Ser 450 455 460 Ile Gln Met Glu Arg Asn Arg Asp Ser 465 470

Claims

1. Método para melhorar a performance de uma plantacrescida em condições de alta densidade populacional,caracterizado por compreender:a) transformar uma célula vegetal com uma construçãocompreendendo um polinucleotideo ELF3; eb) regenerar uma planta a partir da referida célulavegetalonde a expressão do polipeptideo codificado pelopolinucleotideo ELF3 é aumentada na planta regeneradaou em sua progênie transformada, em relação a expressãoem uma planta controle.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a performance melhorada é medida emrendimento aumentado de grão, em relação a uma plantacontrole.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a performance melhorada é medida emprodução aumentada de biomassa, em relação a uma plantacontrole.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato que o polinucleotideo ELF3 é selecionado apartir do grupo consistindo de:(a) seqüência de nucleotídeos definida em SEQ ID NO: 1ou SEQ ID NO: 2;(b) seqüência de nucleotídeos codificando umpolipeptídeo que compreende a seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO: 3;(c) seqüência de nucleotídeos que compreende pelomenos 90% de identidade de seqüência com aseqüência definida em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, em que a referida ,seqüência de polinucleotí-deo-codifica um polipeptídeo que apresenta atividadede proteína ELF3; e(d) seqüência de nucleotídeos que codifica umpolipeptídeo apresentando uma seqüência deaminoácidos com pelo menos 90% de identidade comSEQ ID NO: 3, onde o referido polipeptídeocodificado apresenta atividade de proteína ELF3.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o referido polinucleotídeo estáoperacionalmente ligado a um promotor selecionado apartir do grupo consistindo de: um promotorconstitutivo, um promotor preferencial de folha, umpromotor regulado por luz, e um promotor regulado porritmo circadiano.

6. Método para melhorar a performance de uma plantacrescida em condições de alta densidade populacional,caracterizado por compreender:(a) transformar uma célula vegetal com um cassete deexpressão que reduz o nível ou a atividade de umpolinucleotídeo bHLH-041 nativo ou do polipeptídeopor este codificado; e(b) regenerar uma planta a partir da referida célulavegetal transformada,onde o nível ou a atividade do polipeptídeo codificadopelo polinucleotídeo bHLH-041 nativo é reduzida naplanta regenerada ou em sua progênie_ transformada, emrelação a expressão em uma planta controle

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que a performance melhorada é medida emrendimento aumentado de grão, em relação a uma plantacontrole.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que a performance melhorada é medida emprodução aumentada de biomassa, em relação a uma plantacontrole.

9. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que o referido cassete de expressãocompreende uma seqüência selecionada a partir do grupoconsistindo de:(a) seqüência de nucleotídeos definida em SEQ ID NO:5,ou o complemento desta;(b) seqüência de nucleotídeos que codifica umpolipeptideo compreendendo a seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO: 6;(c) seqüência de nucleotídeos que compreende pelomenos 90% de identidade de seqüência com aseqüência definida em SEQ ID NO: 5, ou ocomplemento desta;(d) seqüência de nucleotídeos que compreende pelomenos __ 10 _ nucleotídeos - consecutivos de umaseqüência de (a), (b), ou (c); e(e) seqüência de nucleotídeos que compreende pelomenos 10 nucleotídeos consecutivos de umaseqüência de (a), (b), ou (c); e os nucleotídeoscomplementares a estas.

10. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que o referido polinucleotídeo estáoperacionalmente ligado a um promotor selecionado apartir do grupo consistindo de: um promotorconstitutivo, um promotor preferencial de folha, umpromotor regulado por luz, e um promotor regulado porritmo circadiano.

11. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que o referido cassete de expressãocompreende:(a) seqüência sense compreendendo pelo menos 19nucleotídeos correspondendo a um mRNA que codifica oreferido polipeptideo bHLH-041;(b) seqüência apresentando pelo menos 94% deidentidade com o complemento da seqüência sense de (a);e(c) um promotor operacionalmente ligado que conduz aexpressão em uma célula vegetal.

12. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que o referido cassete de expressãocompreende um polinucleotideo que codifica umpolipeptideo com um domínio bHLH incompleto.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que a região básica do domínio bHLH éretida.

14. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de ainda aumentar o nível ou a atividade deum polipeptideo ELF3 na referida planta.

15. Polinucleotideo isolado caracterizado por compreenderuma seqüência de nucleotídeos selecionada a partir dogrupo consistindo de:(a) seqüência de nucleotídeos definida em SEQ ID NO: 1ou SEQ ID NO: 2;(b) seqüência de nucleotídeos definida em SEQ ID NO: 5;(c) seqüência de nucleotídeos codificando umpolipeptideo que compreende a seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 6;(d) seqüência de nucleotideos que compreende pelomenos 90% de identidade de seqüência com aseqüência definida em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO:-2, em que a referida seqüência de polinucleotideocodifica um polipeptideo que apresenta atividadede proteína ELF3;(e) seqüência de nucleotideos que compreende pelomenos 90% de identidade de seqüência com aseqüência definida em SEQ ID NO: 5, em que areferida seqüência de polinucleotideo codifica umpolipeptideo que apresenta atividade de proteínabHLH-041;(f) seqüência de nucleotideos compreendendo pelo menos-15 nucleotideos consecutivos de SEQ ID NO: 1, SEQID NO: 2, ou SEQ ID NO: 5 ou um complementodestas;(g) seqüência de nucleotideos que codifica umpolipeptideo apresentando uma seqüência deaminoácidos com pelo menos 90% de identidade comSEQ ID NO: 3, onde o referido polipeptideocodificado apresenta atividade de proteína ELF3; e(h) seqüência de nucleotideos que codifica umpolipeptideo apresentando uma seqüência deaminoácidos com pelo menos 90% de identidade comSEQ ID NO: 6, onde o referido polipeptideocodificado apresenta atividade de proteína bHLH--041.

16. Cassete de expressão caracterizado por compreender opolinucleotideo de acordo com a reivindicação 15operacionalmente ligado com um promotor que conduz aexpressão em uma célula vegetal.

17. Planta caracterizada por compreender o cassete deexpressão de acordo com a reivindicação 16.

18. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizadapelo fato de que a referida planta é umamonocotiledônea.

19. Planta de acordo com a reivindicação 18, caracterizadapelo fato de que a referida monocotiledônea é milho,trigo, arroz, cevada, sorgo, ou centeio

20. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizadapelo fato de que a referida planta é uma dicotiledônea.

21. Planta de acordo com a reivindicação 20, caracterizadapelo fato de que a referida dicotiledônea é soja,Brassica, girassol, algodão, ou alfafa.

22. Semente da planta de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de que a referida sementecompreende o referido cassete de expressão.

23. Polinucleotideo caracterizado pelo fato de apresentar aseqüência definida em SEQ ID NO: 4.

24. Método para modular a expressão de um polinucleotídeode interesse em uma planta, caracterizado porcompreender:(a) transformar uma célula vegetal com um cassete deexpressão compreendendo o polinucleotídeo deinteresse operacionalmente ligado a umpolinucleotídeo de SEQ ID NO: 4 ou um fragmentooperacional desta; e (b) regenerar uma planta a partir da célula vegetal,onde a expressão do polinucleotídeo de interesse émodulada.