BRPI0708694A2

BRPI0708694A2 - métodos para aumentar a proporção de broto para raiz, a produção de sementes e a resistência a doenças

Info

Publication number: BRPI0708694A2
Application number: BRPI0708694-6A
Authority: BR
Inventors: Thomas Roitsch; Maria De La Cruz Gonzalez Garcia
Original assignee: Julius Maximilians Universitot Wuerzburg
Priority date: 2006-03-07
Filing date: 2007-03-07
Publication date: 2011-06-07
Also published as: CA2644947A1; EP2004816A2; AU2007222601A1; WO2007101678A3; US20090293142A1; WO2007101678A2

Abstract

MéTODOS PARA AUMENTAR A PROPORçãO DE BROTO PARA RAIZ, A PRODUçãO DE SEMENTES E A RESISTêNCIA A DOENçAS. A presente invenção refere-se a um método para aumentar a proporção de broto para raiz de uma planta compreendendo a etapa de inibir a atividade de uma invertase no tecido da raiz da referida planta.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSPARA AUMENTAR A PROPORÇÃO DE BROTO PARA RAIZ, A PRODU-ÇÃO DE SEMENTES E A RESISTÊNCIA A DOENÇAS".

A presente invenção refere-se a métodos para aumentar a pro-porção de broto para raiz, produção de sementes e resistência a doenças.

Além disso a presente invenção se refere a novas invertases eao uso das mesmas.

A proporção de broto para raiz, a produção de sementes e a re-sistência a patógenos em plantas são particularmente ligadas ao metabolis-moo dos carboidratos. Mais especificamente, em plantas superiores, o cres-cimento e o metabolismo de tecidos enterrados (sink tissues) é sustentadopelos carboidratos sintetizados em folhas fonte e transportados, essencial-mente sob a forma de sacarose, através do floema para dentro dos tecidosenterrados. Foi demonstrado que as relações fonte-enterrado se alteram com o crescimento e o desenvolvimento das plantas e em resposta a dife-rentes stresses bióticos e abióticos. De fato, a aquisição de carbono fixadodo broto pelas raízes parece ser determinada tanto pela disponibilidade de,quanto pela necessidade de, assimilados no broto e raiz respectivamente(Farrar e Jones, 2000). O uso de sacarose nos tecidos enterrados requerclivagem da ligação glicosídica, catalisada tanto por sacarose sintase quantoinvertases. A sacarose sintase cliva a sacarose em UDP-glucose e frutose,ao passo que a invertases hidrolisa sacarose nos monômeros de hexose.Três tipos de isoenzimas invertase são diferenciadas com base na solubili-dade, localização sub-celular, pH ótimo e ponto isoelétrico (Roitsch e Gonzá-lez, 2004). Entre estas, foi demonstrado que invertases ligadas à parede ce-lular têm uma função crucial no particionamento dos carboidratos e supri-mento de fotoassimilados para tecidos enterrados (Tang et al., 1999; Goetzet al., 2001; Weschke et al., 2003). A cliavagem de sacarose no sítio de des-carregamento de floema e o transporte das hexoses geradas para dentrodas células enterradas, através da ação combinada de invertases da paredecelular e transportadores de hexose, produz diferenças na pressão osmóticaque dirige o transporte de sacarose no floema. Um descarregamento apoplásmico de sacarose é não somente característica de tecidos simplasmica-mente isolados mas também de tecidos ativamente em crescimento, comopontas da raiz primária de milho, onde a demanda de fotoassimilados nãopode ser satisfeita somente pelo descarregamento simplásmico (Bret-Hartee Silk, 1994). A alta atividade de invertase reportada em pontas de raiz esítio de emergência de raízes secundárias corrobora uma função da inverta-se da parede celular no crescimento ativo deste tecido enterrado (Eschrich,1980). Em Arabidopsis thaliana, o padrão de expressão de invertases daparede celular e vacuolares na raiz durante o desenvolvimento e em respos-ta a diferentes condições de cultura sugere que a invertase da parede celularestá envolvida no particionamento da sacarose em condições com algumasaltas demandas assimiladas neste tecido. Em raízes maduras, no entanto, aexpressão de invertase da parede celular não é detectada e a expressão deinvertase vacuolar seria responsável pela entrada de sacarose (Tymowska-Lalanne e Kreis1 1998). O descarregamento de floema em raízes madurasentão se adequaria ao modelo proposto por Sturm et al. (1995), onde a forçapropulsora para descarregamento de sacarose resulta da clivagem do açú-car por sacarose sintase e invertase vacuolar no citosol. Em raízes de carrottap, o efeito da inibição anti-sentido de invertases vacuolares e da paredecelular sobre o fenótipo da planta sugere um papel importante no particio-namento da sacarose (Tang et al., 1999). Além disso, a invertase vacuolarpode ser um regulador chave da expansão celular, devido ao duplo potencialosmótico gerado por clivagem de sacarose no vacúolo.

Dada esta interação altamente complexa de elementos do me-tabolismo de carboidratos vegetais, o problema subjacente à presente in-venção é identificar métodos para aumentar a proporção de broto para raiz,a produção de sementes e a resistência a doenças em plantas.

O problema subjacente à presente invenção é resolvido em umprimeiro aspecto por um método para aumentar a proporção de broto pararaiz de uma planta compreendendo a etapa de

inibir a atividade de uma invertase no tecido da raiz da referida planta.O problema subjacente à presente invenção é resolvido em umsegundo aspecto por um método para aumentar a produção de semente deuma planta compreendendo a etapa deinibir a atividade de uma invertase no tecido da raiz da referidaplanta.

O problema subjacente à presente invenção é resolvido em umterceiro aspecto por um método para aumentar a resistância a uma doençade uma planta compreendendo a etapa deinibir a atividade de uma invertase no tecido da raiz da referidaplanta.

EM uma modalidade de acordo com o primeiro, o segundo e oterceiro aspecto da presente invenção a atividade da invertase é inibida oupor

(a) um knock-down da invertase ou

(b) nocaute da invertase, ou

(c) um inibidor para a invertase.

Deve ser observado que caso não indicado ao contrário, quais-quer das modalidades seguintes é uma modalidade do primeiro, do segundoe do terceiro aspecto da presente invenção.

Em uma modalidade o inibidor é ativo no tecido da raiz da plan-ta.

Em uma modalidade o inibidor é um polipeptídeo.

Em uma modalidade o inibidor é codificado por um ácido nucléi-co.

Em uma modalidade o ácido nucléico está sob o controle de umelemento de transcrição e/ou um elemento de translação, por meio da qual oreferido elemento de transcrição e/ou o referido elemento de translação pos-sibilita a específica transcrição e/ou translação do ácido nucléico em tecidoda raiz.

Em uma modalidade o elemento de transcrição é um promotor,preferencialmente um promotor específico para raiz.

Em uma modalidade o promotor é um promotor indutível.Em uma modalidade o promotor é selecionado entre o grupocompreendendo promotor pyk10, promotor T80-críptico, e promotor WRKY6.

Em uma modalidade o promotor é promotor T80-críptico.

Em uma modalidade o inibidor é selecionado entre o grupocompreendendo inibidores de invertase do tabaco e inibidores de invertasede Arabidopsis, por meio da qual, preferencialmente, os inibidores de inver-tase do tabaco são selecionados entre o grupo compreendendo NT-CIF1,Y12805; Nt-VIF, AY145781, e/ou, preferencialmente, os inibidores de inver-tase de Arabidopsis são selecionados entre o grupo compreendendoAtC/VIF1, At1g47960; AtC/VIF2, At5g64620, e AtC/VIF3, At3g17130.

Em uma modalidade o knock-down é causado por silenciamentogenético pós-transcricional e/ou co-supressão.

Em uma modalidade a invertase é uma invertase selecionadaentre o grupo compreendendo uma invertase solúvel, uma invertase vacuo-lar, uma invertase neutra / alcalina e uma invertase citoplasmática.

Em uma modalidade a invertase é uma invertase selecionadaentre o grupo compreendendo uma invertase ligada à parede celular, e umainvertase extracelular, apoplásmica mas não ligada à parede celular, pormeio da qual preferencialmente a invertase é uma invertase ligada à paredecelular.

Em uma modalidade a invertase é uma invertase tendo uma se-qüência de aminoácidos, por meio da qual a seqüência de aminoácidos écodificada por um ácido nucléico o qual é selecionado entre o grupo de se-qüências de ácido nucléico compreendendo seqüências de ácido nucléico deSEQ. ID. N9 23 a 36.

Em uma modalidade a invertase é uma invertase tendo uma se-qüência de aminoácidos, por meio da qual a seqüência de aminoácidos écodificada por um ácido nucléico o qual é selecionado entre o grupo de se-qüências de ácido nucléico compreendendo seqüências de ácido nucléico deSEQ. ID. Ns 1 a 22.

Em uma modalidade a doença da planta é uma doença envol-vendo ou afetando o tecido da raizEm uma modalidade a doença da planta é transferida ou causa-da por um patógeno.

Em uma modalidade o patógeno é selecionado entre o grupocompreendendo Plasmodiophora brassicacae, Verticillium e nematódeos,por meio da qual o nematódeo preferencialmente é Heterodera schachtii S-chm.

Em uma modalidade a doença é selecionado entre o grupocompreendendo doenças as quais são causadas por ou associadas com umorganismo selecionado entre o grupo compreendendo Pythium aphanider-matum, Pythium ultimum, Phytophthora syringae P. undulata, Oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, Meloidogyne hapla, Phytophtora quercina e Rhizocto-nia solani Kühn.

Em uma modalidade a planta é um membro da família de Bras-sicacae.

Em uma modalidade a planta é selecionado entre o grupo com-preendendo colza, repolho e couve chinesa.

O problema subjacente à presente invenção é resolvido em umquarto aspecto por uma molécula de ácido nucléico, preferencialmente codi-ficando para uma invertase, tendo uma seqüência de ácido nucléico, pormeio da qual a seqüência de ácido nucléico é selecionada entre o grupo deseqüências de ácido nucléico de SEQ. ID. Ne 1 a 36, ou um ácido nucléicoessencialmente complementar a estas.

O problema subjacente à presente invenção é resolvido em umquinto aspecto por uma molécula de ácido nucléico a qual hibridiza, prefe-rencialmente sob condições estringentes, à seqüência de ácido nucléico deacordo com o quarto aspecto da presente invenção.

O problema subjacente à presente invenção é resolvido em umsexto aspecto por uma molécula de ácido nucléico a qual, porém para a de-generação do código genético, hibridizaria, preferencialmente sob condiçõesestringentes, ao ácido nucléico de acordo com o quarto ou o quinto aspectoda presente invenção.

O problema subjacente à presente invenção é resolvido em umsétimo aspecto por um polipeptídeo, preferencialmente uma invertase, codi-ficado por uma molécula de ácido nucléico de acordo com qualquer um doquarto, do quinto e do sexto aspecto da presente invenção.

O problema subjacente à presente invenção é resolvido em umoitavo aspecto por um vetor compreendendo uma molécula de ácido nucléi-co de acordo com qualquer um do quarto, do quinto e do sexto aspecto dapresente invenção.

Em uma modalidade o vetor é um vetor de planta, mais prefe-rencial um vetor de expressão vegetal.

Em uma modalidade o vetor compreende um promotor específi-co para raiz.

O problema subjacente à presente invenção é resolvido em umnono aspecto por uma célula, preferencialmente uma célula de planta, com-preendendo molécula de ácido nucléico de acordo com qualquer um doquarto, do quinto e do sexto aspecto da presente invenção e/ou um vetor deacordo com o oitavo aspecto da presente invenção.

O problema subjacente à presente invenção é resolvido em umdécimo aspecto por um tecido e/ou um órgão compreendendo uma moléculade ácido nucléico de acordo com qualquer um do quarto, do quinto e do sex-to aspecto da presente invenção e/ou um vetor de acordo com o oitavo as-pecto da presente invenção e/ou uma célula de acordo com o nono aspectoda presente invenção.

Em uma modalidade do décimo aspecto o tecido é um tecido daraiz e/ou o órgão é uma raiz.

O problema subjacente à presente invenção é resolvido em umdécimo primeiro aspecto por um organismo, preferencialmente uma planta,compreendendo uma molécula de ácido nucléico de acordo com qualquerum do quarto, do quinto e do sexto aspecto da presente invenção e/ou umvetor de acordo com o oitavo aspecto da presente invenção e/ou uma célulade acordo com o nono aspecto da presente invenção.

O problema subjacente à presente invenção é resolvido em umdécimo segundo aspecto pelo uso de um constructo de ácido nucléico para amodificação do genoma de uma planta, por meio da qual o constructo com-preende

(a) um promotor específico para raiz; e

(b) um ácido nucléico codificando para um inibidor de inver-tase,

em que o promotor e o ácido nucléico codificando para a inver-tase são encadeados operavelmente um ao outro.

O problema subjacente à presente invenção é resolvido em umdécimo terceiro aspecto pelo uso de um constructo de ácido nucléico parainibir a atividade ou presença de uma invertase, preferencialmente uma in-vertase em raiz e/ou tecido da raiz, por meio da qual o constructo compre-ende

(c) um promotor específico para raiz; e

(d) um ácido nucléico codificando para um inibidor de inver-tase,

O problema subjacente à presente invenção é resolvido em umdécimo quarto aspecto pelo uso de um constructo de ácido nucléico paraaumentar a proporção de broto para raiz, produção de sementes e/ou resis-tência a doença de uma planta, por meio da qual o constructo compreende

(e) um promotor específico para raiz; e

(f) um ácido nucléico codificando para um inibidor de inver-tase,

O problema subjacente à presente invenção é resolvido em umdécimo quinto aspecto pelo uso de um constructo de ácido nucléico para afabricação de um medicamento para o tratamento de uma planta doença,por meio da qual o constructo compreende

(g) um promotor específico para raiz; e

(h) um ácido nucléico codificando para um inibidor de inver-tase,

Em uma modalidade do décimo quinto aspecto da presente in-venção o medicamento é para terapia genética de uma planta.

Em uma modalidade do décimo quinto aspecto da presente in-venção a planta é uma célula de planta ou um tecido de planta, preferenci-almente antes de regeneração para uma planta madura.

O problema subjacente à presente invenção é resolvido em umdécimo sexto aspecto pelo uso de um constructo de ácido nucléico para aprodução de uma planta transgênica, por meio da qual a planta transgênicapreferencialmente apresenta um ou mais de um aumento na proporção debroto para raiz, aumento na produção de sementes e aumento na resistênciaa patógenos e/ou doenças.

O problema subjacente à presente invenção é resolvido em umdécimo sétimo aspecto pelo uso de um polipeptídeo de acordo com o sétimoaspecto da presente invenção como uma molécula alvo.

Em uma modalidade do décimo sétimo aspecto o polipeptídeo éuma molécula alvo para um inibidor in vitro e/ou in vivo.

Em uma modalidade do décimo sétimo aspecto molécula alvo é

uma molécula alvo no tecido da raiz de uma planta.

Em uma modalidade do décimo sétimo aspecto da presente in-venção a molécula alvo é usada em um método de triagem para a identifica-ção de um agente de proteção vegetal.

Em uma modalidade do décimo sétimo aspecto da presente in-venção a molécula alvo é usada em um método de triagem para a identifica-ção de um promotor de crescimento vegetal.

Os presentes inventores descobriram surpreendentemente queinvertases e mais especificamente a atividade de invertase de raiz é um alvoadequado para resolver os problemas subjacentes à presente invenção.Mais especificamente, o presente inventor decobriu que a inibição da ativi-dade de invertase e mais particularmente a atividade de invertase em raiz etecido da raiz, respectivamente, é um meio adequado para aumentar, emplantas, a proporção de broto para raiz, a produção de sementes e resistên-cia a doença em geral e a doenças relacionadas com raiz ou associadascom raiz em particular. Ao contrário do que pode ter sido esperado por aque-le versado na técnica, uma atividade de invertase reduzida na raiz produziuum ligeiro aumento ao invés de uma redução no peso fresco da raiz. No en-tanto, o efeito mais pronunciado da inibir a atividade de invertase em raiz foiobservados nos brotos, isto é, um aumento na biomassa com respeito aplantas controle e um aumento associado na proporção de broto para raiz. Oaumento do crescimento da parte areai da planta resultou em um aumentoda produção de brotos e número de síliqua e, em conseqüência, um aumen-to da produção de sementes neste tipo de planta. Em outras palavras, acompressão ou inibição raiz-específica de uma invertase é adequada paradisparar estes efeitos. À medida que o ensinamento técnico da presente in-venção é reduzir a atividade de uma invertase, preferencialmente uma inver-tase na raiz e no tecido da raiz, respectivamente, de uma planta para a qualsão desejáveis os efeitos mencionados acima. Em princípio, há uma série demeios e modos disponíveis para reduzir a atividade de invertase em tecidode planta e mais especificamente em tecido da raiz. Um meio semelhante éum knock-down do mRNA codificando para semelhante invertase, outromeio é uso de um inibidor para a invertase por meio da qual o referido inibi-dor é administrado à planta a ser tratada, preferencialmente por meio de en-genharia genética.

Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a inibi-ção da atividade de invertase ocorre no nível pós-translacional. Isto propor-ciona a opção de que a atividade de invertase total seja factualmente reduzi-da ou inibida o que está em contraste com o fenômeno observado freqüen-temente com knock-down de um único gene codificante de invertase, ondeas plantas tipicamente reagem regulando para cima um gene de invertasediferente.

O termo knock-down conforme usado aqui, neste requerimentode patente, preferencialmente também compreende a atividade de nocauteda invertase. Em conesão com a presente invenção, um knock-down ou no-caute portanto é acompanhado por uma atividade reduzida da invertase aqual é derrubada (knocked-down) ou arrasada (knocked-out). A referida re-dução da atividade de uma invertase é tipicamente no mínimo uma reduçãoem cinco, mais preferencialmente 10, mais preferencialmente 20 ou mais porcento da atividade comparada com a atividade não arrasada. Será reconhe-cido por aqueles versados na técnica que um nocaute ou knock-down dainvertase também pode ser realizado por um nocaute ou um knock-down deum ativador ou outro fator proporiconando a atividade e/ou expressão dainvertase.

A atividade de uma invertase é preferencialmente definida comoa hidrólise de sacarose nos monômeros de hexose. Sistemas de teste res-pectivos para medir a atividade de invertases são de conhecimento daquelesversados na técnica, e são descritos, por exemplo, em Roitsch et al. (1995)(Roitsch T., Bittner M., Godt D E. (1995). Induction of apoplastic invertase ofChenopodium rubrum by D-glucose and a glucose analog and tissue-specificexpression suggest a role in sink-source regulation. Plant Physiol. 108, 285-294).

Basicamente, a prova de invertase é realizada em uma modali-dade como se segue. Um extrato de proteína solúvel é obtido por homogeni-zação do tecido em um tampão de homogenização. Uma fração de proteínainsolúvel é obtida agitando o pélete insolúvel em tampão de alto teor de salde um dia para o outro. Depois de diálise destas frações, a atividade de in-vertase vacuolar, neutra e extracelular nas frações correspondentes sãomedidas determinando a quantidade de glucose liberada em uma reaçãocom sacarose como um substrato e no pH correspondente por uso de umtampão. A glucose liberada é medida por uso de um ensaio acoplado comatividades enzimáticas de glucose oxidase e peroxidase. A concentração deglucose liberada na reação é calculada a partir do valor OD por meio do usode uma curva de calibração. Em todos os casos, são realizadas reações decontrole usando o mesmo volume de água ao invés de sacarose na misturada reação. A atividade da invertase para cada amostra é preferencialmentedeterminada em triplicata e normalizada para a concentração de proteína naprova determinada pelo método de Bradford (1976) com o kit Bio Rad.

Um modo preferencial para knock-down uma invertase o qualpreferencialmente significa degradar o mRNA codificando para a invertase, ésilenciamento genético pós-transcricional em plantas tal como, por exemplo,por um constructo anti-sentido. Este tipo de tecnologia é descrito, entre ou-tros, em Mol J.N. et al. (Mol J.N., van der Krol A.R., van Tunen A.J., van Blo-kland R., de Lange P. e Stuitje A.R. (1990). Regulation of plant gene expres-sion by antisense RNA. FEBS Lett. 268, 427-430).

Outra possibilidade para knock-down uma invertase é usandotecnologia de interferência de RNA conforme descrito, por exemplo, por Ku-saba M. (Kusaba M. (2004). RNA interference in crop plants. Curr. Opin. Bio-technol. 15, 139-143) ou por Matzke M.A. et al (Matzke M.A., Matzke A.J.,Pruss G.J. and Vance V.B. (2001). RNA-based silencing strategies in plants.Curr.Opin. Genet. Dev. 11, 221 -227).

Ainda uma outra possibilidade para knock-down uma invertase éusando co-supressão conforme descrito, por exemplo, por Vaucheret H.(Vaucheret H., Béclin C. e Fagard. Post-transcriptional gene silencing inplants. J.Cell Sei. 114, 3083-3091), ou por Vance V. (Vance V. e VaucheretH. (2001). RNA Silencing in Plants- Defense and Counterdefense. Science292, 2277-2280).

Uma segunda abordagem para inibir ou reduzir a atividade deuma invertase é por um inibidor para a referida invertase. Os referidos inibi-dores para invertases são, em princípio, de conhecimento de uma pessoaversada na técnica. Está dentro da presente invenção que preferencialmentepode ser usado qualquer inibidor de invertase em conexão com a presenteinvenção, mais preferencialmente qualquer inibidor de invertase com a con-dição de que o respectivo inibidor deve inibir a atividade de uma invertase, omais preferencialmente uma invertase expressada ou ativa no tecido da raizde uma planta, por meio da qual o percurso do tecido conforme usado aqui,neste requerimento de patente, preferencialmente significa tanto intercelularao tecido da raiz bem como extracelular ao tecido da raiz.Em uma modalidade preferencial, o inibidor de uma/da invertaseé um polipeptídeo. Conforme preferencialmente usado aqui, neste requeri-mento de patente, um polipeptídeo é um polímero compreendendo no míni-mo dois aminoácidos os quais são ligados um ao outro por uma ligação pep-tídeo. Mais preferencialmente, o polipeptídeo compreende 6, 10, 25 ou maisaminoácidos, por meio da qual a faixa superior é preferencialmente 50, 100,200 e 500 aminoácidos. Em conexão com a presente invenção, o termo poli-peptídeo e proteína são usados em uma maneira sinônima. Preferencial-mente, o tamanho dos inibidores de invertase é de aproximadamente 500nucleotídeos e 166 a 192 aminoácidos, respectivamente, de acordo comuma comparação feita por Rausch e Greiner (2004) (Rausch T. e Greiner S.(2004). Plant protein inhibitors of invertases. Biochim. Biophys. Acta 1696,253-261), e o peso molecular é de aproximadamente 18 kDa. A seqüênciade proteína não é bem conservada, embora seja observada uma conserva-ção de seqüência mais forte na parte de N-terminal do que nos C-terminais,e inibidores de invertase extracelular e vacuolar da mesma espécie partilhamsomente 47% de identidade no nível da seqüência, com quatro cisteínas emposições conservadas em todos os inibidores de invertase descritos até omomento.

Inibidores de invertase adicionais os quais podem ser usadosem uma modalidade da presente invenção são descritos em Greiner S. et al.(Greiner S., Krausgrill S. and Rausch T. (1998). Cloning of a tobacco apo-plasmic invertase inhibitor. Proof of function of the recombinant protein andexpression analysis during plant development. Plant Physiol. 116, 733-742);Greiner S. et al. (Greiner S., Rausch T., Sonnewald U. and Herbers K.(1999). Ectopic expression of a tobacco invertase inhibitor homolog preventscold-induced sweetening of potato tubers. Nature Biotech. 17, 708-711),Krausgrill S. et al. (Krausgrill S., Sander A., Greiner S., Weil M. and RauschT. (1996). Regulation of cell wall invertase by a proteinaceous inhibitor. J.Exp. Bot. 47, 1193-1198), Krausgrill S. et al. (Krausgrill S., Greiner S., KõsterU., Vogel R. and Rausch T. (1998). In transformed tobacco cells the apo-plasmic invertase inhibitor operates as a regulatory switch of cell wall inver-tase. Plant J. 13, 275-280), Link Μ. et al. (Link M., Rausch T. and Greiner S.(2004). In Arabidopsis thaliana, the invertase inhibitors AtC/VIF1 and 2 exhi-bit distinct target enzyme specificities and expression profiles. FEBS Lett.573, 105-109), Rausch T. and Greiner S. (2004). Plant protein inhibitors ofinvertases. Biochim. Biophys. Acta 1696, 253-261), Sander A. et al. (SanderA., Krausgrill S., Greiner S., Weil M. and Rauseh T. (1996). Suerose protectscell wall invertase but not vacuolar invertase against proteinaceous inhibitors.FEBS Lett. 385, 171-175), Weil M. et al. (Weil M., Krausgrill S., Sehuster A.and Rauseh T. (1994). A 17-kDa Nicotiana tabacum cell-wall peptide acts asin-vitro inhibitor of the cell-wall isoform of acid invertase. Planta 193, 438-445) and Wolf S. et al (Wolf S., Grsic-Rauseh S., Rauseh T. and Greiner S.(2003). Identification of pollen-expressed pectin methylesterase inhibitors inArabidopsis. FEBS Lett. 555, 551-555).

Inibidores de invertase adicionais os quais são úteis na práticada presente invenção, são descritos em Gerrits, N. et al. (Gerrits, N., Turk,S., van Dun, K., Hulleman, S., Visser, R., Weisbeek, P., Smeekens, S. Su-crose Metabolism in Plastids. Plant Physiol. 2001 Feb; 125(2):926-934), Ko-ch, K. (Koch, K. Sucrose metabolism: regulatory mechanisms and pivotalroles in sugar sensing and plant development. Curr Opin Plant Biol. 2004Jun; 7(3):235-246.); Plant invertase inhibitors: Expression in cell culture andduring plant development AU: Greiner1-Steffen [Author]; Koster,-UIrike[Author]; Lauer,-Katja [Author]; Rosenkranz,-Heiko [Author]; Vogel1-Rolf[Author]; Rauschl-Thomas [Reprint-author] SO: Australian-Journal-of-Plant-Physiology. 2000; 27(8-9): 807-814, Hothorn1 M. et al. (Hothorn, M.,D'Angelo, I., Marquez, J. A., Greiner, S., Scheffzek, K. The invertase inhibitorNt-CIF from tobacco: a highly thermostable four-helix Bundle with an unusualN-terminal extension. J Mol Biol. 2004 Jan 23; 335(4):987-995), Hothorn, M.et al. (Hothorn, M., Wolf, S., Aloy, P., Greiner, S., Scheffzek, K. Structuralinsights into the target specificity of plant invertase and pectin methylesteraseinhibitory proteins. Plant Cell. 2004 Dec; 16(12):3437-3447), Sonnewald, U.et al. (Sonnewald, U., Brauer, M., von Schaewen, A., Stittj M., Willmitzer, L.Transgenic tobacco plants expressing yeast-derived invertase in either thecytosol, vacuole or apoplast: a powerful tool for studying sacarose metabo-Iism and sink/source interactions. Plant J. 1991 Jul; 1 (1 ):95-106), Bate NJ etal. (Bate NJ1 Niu X, Wang Y, Reimann KS, Helentjaris TG. An invertase inhi-bitor from maize localizes to the embryo surrounding region during early ker-nel development. Plant Physiol. 2004 Jan;134(1):246-54), Scognamiglio MAet al. (Scognamiglio MA, Ciardiello MA, Tamburrini M, Carratore V, RauschT, Camardella L. The plant invertase inhibitor shares structural propertiesand disulfide bridges arrangement with the pectin methylesterase inhibitor. JProtein Chem. 2003 May;22(4):363-9), Sayago JE et al. (Sayago JE, Vattuo-ne MA, Sampietro AR, Isla Ml. An invertase inhibitory protein from Pteris de-flexa link fronds. J Enzyme Inhib. 2001 Dec;16(6):517-25), Sayago JE et al. (:Sayago JE, Vattuone MA, Sampietro AR, Isla Ml. Proteinaceous inhibitorversus fructose as modulators of Pteris deflexa invertase activity. J EnzymeInhib Med Chem. 2002 Apr; 17(2): 123-30), Ordonez RM et al. (Ordonez RM,Isla Ml, Vattuone MA, Sampietro AR. Invertase proteinaceous inhibitor of Cy-phomandra betacea Sendt fruits. J Enzyme Inhib. 2000;15(6):583-96), eCheng SH et al. (Cheng SH, Liu J, Song BT, Xie CH. Related Articles, [Clo-nagem de St-inh cDNA de inibidor de invertase de batata e sua expressãoem E. coli e análise funcional] Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 2004Aug;37(4):269-75. Chinês).

Em uma modalidade preferencial, o inibidor é codificado por umácido nucléico. Será reconhecido por aqueles versados na técnica que, combase na seqüência de aminoácidos de um inibidor de uma invertase, emprincípio a seqüência codificante para o inibidor pode ser percebida por a-quele versado na técnica. Devido à generacy do código genético, no entanto,é posível verdadeiramente uma série de seqüências diferentes. Em vistadisto uma pessoa versada na técnica levará em consideração o uso de có-don preferencial da planta ou espécie vegetal na qual o inibidor da invertasedeve ser introduzido, preferencialmente deve ser introduzido por meio detransferência do ácido nucléico codificando para o referido inibidor. Mais pre-ferencialmente, o ácido nucléico codificando para o referido inibidor será umácido nucléico codificando para o inibidor, por meio da qual o referido inibi-dor é preferencialmente isolado de fontes bacterianas, fúngicas e vegetais.

Entre a variedade de inibidores de invertase conhecidos osquais são, em princípio, adequados para uso na presente invenção, o inibi-dor de invertase da parede celular do tabaco conforme descrito por Greineret al. 1998, um inibidor de invertase da parede celular (At5g46940), tambémreferido aqui, neste requerimento de patente, como AtC/VIF2 e um inibidorde invertase vacuolar At1g47960, também referido aqui, neste requerimentode patente, como AtC/VIF1 ambos de Arabidopsis, são particularmente ade-quados para a prática da presente invenção. É sabido que AtC/VIF1(At1g47960) inibe especificamente a atividade da invertase vacuolar, aopasso que AtC/VIF2 (At5g46940) inibe ambas, isto é, a atividade da inverta-se vacuolar bem como a a atividade da invertase da parede celular, emboratenha uma afinidade dez vezes maior para invertase vacuolar do que parainvertase da parede celular (Link et al., 2004). Um inibidor de invertase ade-quado adicional é Nt-inh1 conforme descrito no requerimento de patente in-ternacional No. WO 98/04722.

À parte dos inibidores de invertase específicos mencionados a-cima, inibidores de invertase adicionais estão disponíveis e em princípio sãoadequados para a prática da presente invenção. Mais especificamente, osreferidos inibidores de invertase são aqueles derivados dos 14 genes do ge-noma de Arabidopsis thaliana com identidade de seqüência com inibidoresde invertase vacuolar e da parede celular do tabaco. Destes, dois genes,At1g47960 e At3g17130, agrupam com os inibidores de invertase do tabaco,e dois mais, At1g48020 e At3g17220, com inibidores de metilesterase depectina. At2g31430, At3g55680, At5g64620, At3g12880 e At5g50070 nãoagrupam com quaisquer destes em uma árvore filogenética, ao passo queAt5g46940/70/60/80 formam um subgrupo ligado sobre o cromossoma 5(Rausch e Greiner, 2004, supra).

É determinada a atividade de inibidor de invertase em uma mo-dalidade preferencial por meio do uso de frações de proteína purificada tantopara o inibidor de invertase quanto a atividade de invertase correspondente.Para a determinação de atividade de inibidor de invertase, as preparaçõesde invertase e inibidor de invertase são misturadas e pré-incubadsa a 37SCpor 1 hora. Depois desta pre-incubação, sacarose é adicionada para umaconcentração de 20 mM e a reação é incubada a 269C durante 30 minutos.A quantidade de glucose liberada na prova é determinada enzimaticamenteconforme descrito em Weil M. et al. (Weil et al., 1994 ; Weil M., Krausgrill S.,Schuster A. e Rausch T. (1994). A 17-kDa Nicotiana tabacum cell-wall pepti-de acts as in-vitro inhibitor of the cell-wall isoform of acid invertase. Planta193, 438-445), ou Greiner S. et al. (Greiner S., Krausgrill S. and Rausch T.(1998). Cloning of a tobacco apoplasmic invertase inhibitor. Proof of functionof the recombinant protein and expression analysis during plant develop-ment. Plant Physiol. 116, 733-742), or Link M. et al. (Link M., Rausch T. andGreiner S. (2004). In Arabidopsis thaliana, the invertase inhibitors AtC/VIF1and 2 exhibit distinct target enzyme specificities and expression profiles.FEBS Lett. 573, 105-109).

Na determinação da atividade de inibidor de invertase podemsurgir complicações pelo fato de não serem usados extrato purificados masextratos brutos, contendo além disso atividades enzimáticas de invertase.Pode existir complicação adicional no fato de que o complexo formado entrea invertase e o inibidor podem, em princípio, se dissociar durante a prepara-ção dos extratos. Por estas razões, preferencialmente se usa uma prova de"extrato misto" na qual uma alíquota do extrato de raiz de uma planta trans-gênica, portanto expressando o inibidor de invertase, é misturada com umaalíquota de um extrato de folha de uma planta selvagem. A mistura, feita notampão de pH apropriado, é incubada 30 min a 37QC para a formação docomplexo entre a invertase e o inibidor de invertase. Depois da pré-incubação, sacarose é adicionada em uma concentração final de 5 mM e areação é incubada por 30 min a 26QC. A reação é interrompida em gelo e aglucose liberada é determinada por teste GOD e comparada com o valoradicionado dos extratos independentes incubados separadamente. Conside-rando que raízes controle dão valores ainda maiores do que os valores adi-cionados correspondentes, uma redução de até 50% dos valores adiciona-dos é obtida para raízes transgênicas.É óbvio para uma pessa versada na técnia que a expressão doácido nucléico codificando para o inibidor deve ser controlado por elementosde controle. Preferencialmente, os elementos de controle referidos são ati-vos no nível de transcrição e/ou no nível de translação. Em associação coma presente invenção foi visto que é particularmente adequado ter um ele-mento transcricionalmente ativo tal um promotor para controlar a disponibili-dade e a atividade, respectivamente, do inibidor em uma célula e tecido,respectivamente, de modo a inibir a atividade de invertase. De modo a pro-porcionar a especificidade para tecido de inibição de invertase como objetopara uma modalidade preferencial dos vários aspectos da presente inven-ção, a saber, especificidade para tecido da raiz, e deste modo aumentar aproporção de broto para raiz, a produção de sementes e a resistência a umadoença, o promotor é um promotor específico para raiz. O promotor referidoé preferencialmente ligado operavelmente ao ácido nucléico codificando pa-ra o inibidor.

Promotores adequados para semelhante finalidade são, emprincípio, de conhecimento de uma pessoa versada na técnica. Promotoresmais preferenciais são os seguintes: o promotor pPyklO o qual é um promo-tor de uma Arabidopsis mirosinase (Nitz et al., 2001 e também descrito norequerimento de patente internacional No. WO 01/44454 e no requerimentode patente alemã No. DE 19960843) e o promotor críptico também referidoaqui, neste requerimento de patente, como promotor T80-críptico conformedescrito no requerimento de patente européia NO. EP 1 196 581 e em Molli-er et al. 2000, Plant-Cell-Reports, 19, 1076-1083, os quais são ambos pro-motores específicos para raiz de Arabidopsis. Outros promotores os quais,em princípio, são adequados na prática da presente invenção são os promo-tores específicos para raiz descritos no requerimento de patente internacio-nal No. WO 02/040687 o qual descreve diferentes promotores específicostecido para isolados de beterrabas sacarinas, especialmente dois promoto-res específicos para raiz 2-1-48 e 2-1-36 e os promotores descritos no re-querimento de patente internacional No. WO 00/77187. Os promotores des-critos no requerimento de patente internacional No. WO 00/77187 são isola-dos de tomate e tabaco o qual é tanto específico para tapetum quanto espe-cífico para tabaco.

Adicionalmente, podem ser usados promotores indutíveis taiscomo aqueles os quais são indutíveis por esteróides conforme descrito, porexemplo, por Zuo et al. (Zuo et al., 2002).

Está dentro da presente invenção, que a invertase é na verdadequalquer atividade de invertase a qual esteja preferencialmente presente emraízes e/ou tecido da raiz e a qual possa ser visada pelos métodos reveladosaqui, neste requerimento de patente, a saber por knock-down e/ou atividadede um inibidor. Será reconhecido por aquele versado na técnica que a espe-cificidade do inibidor para uma invertase tem de ser dada no mínimo na me-dida que o inibidor seja adequado para inibir a ou parte da atividade de umaatividade de invertase em raízes e tecido da raiz, respectivamente. Inverta-ses preferenciais as quais podem portanto ser visadas são aquelas descritasaqui, neste requerimento de patente, e mais especificamente a invertasetendo uma seqüência de ácido nucléico de acordo com a SEQ. ID. Nq 15 oua SEQ. ID. Nq 26. A tabela seguinte representa várias invertases de Arabi-dopsis as quais são adequadas na prática da presente invenção como alvos

<table>table see original document page 19</column></row><table>

Nesta tabela o nível de RNAm é categorizado como se segue:++++:indica um nível muito alto de RNAm+++:indica um alto nível de RNAm

++:indica um alto nível moderado de RNAm

+:indica um baixo nível relativo de RNAm

-:nenhum RNAm detectável

À parte de aumentar, conforme resumido aqui, neste requeri-mento de patente, a proporção de broto para raiz e a produção de sementesinibindo a atividade de uma invertase, mais preferencialmente de uma inver-tase de raiz, também doenças de plantas podem ser tratadas e prevenidas,respectivamente. O fundamento lógico subjacente a este método para o tra-tamento de uma planta sofrendo de uma doença de planta é por meio daredução do suprimento de carboidrato para a raiz cujos patógenos que sealimentam dos carboidratos da raiz, são privados de sua fonte de energia. Àmedida que várias doenças causadas por vários patógenos podem ser trata-das por meio da qual o termo tratamento conforme preferencialmente usadoaqui, neste requerimento de patente, também compreende prevenção desemelhante doença e portanto proteção de plantas contra a doença referidaas quais são, em princípio, suscetíveis à doença referida ou estão em riscode sofrer de semelhante doença. Será óbvio para uma pessoa versada natécnica que uma série de doenças e patógenos pode ser então prevenida etratada, respectivamente. Entre outros, um patógeno é o fungo Plasmodio-phora brassicacae o qual está causando doença de raiz deformada (clubroot). Este fungo penetra na raiz de brassicacae, em conseqüência do queas raízes mostram um importante crescimento afetando em uma maneiranegativa tanto a captação de água quanto de nutrientes pela planta. Emconseqüência, as plantinhas crescem pobremente e as folhas mais velhasamarelecem. Os esporos do fungo podem sobreviver no solo até 20 anos demodo que este tipo de doença é estimulado por uma intensa rotação e co-lheita. Plantas particularmente afetadas são plantas cultivadas tais comocolza, repolho, rabanete, mostarda e crucíferas, bem como plantas ornamen-tais, cada uma preferencialmente da família brassicacae.

Outro patógeno o qual pode ser portanto prevenido e/ou tratadode acordo com a presente invenção é o fungo Verticillium o qual causa, entreoutros, braquiomicose e afeta uma série de plantas, inclusive plantas orna-mentais, árvores ornamentais, árvores frutíferas, legumes, verduras e plan-tas do campo. Portanto, as doenças as quais podem ser prevenidas e/outratadas de acordo com a presente invenção são aquelas causadas por ouassociadas com Verticillium.

Um grupo de patógenos adicionais os quais podem ser portantoprevenidos e/ou tratados de acordo com a presente invenção são nemató-deos os quais se alimentam de carboidratos das raízes de plantas hospedei-ras. As plantas particularmente afetadas por teste tipo de patógeno são mi-lho, cereais e outras monocotiledôneas e dicotiledôneas. Portanto, as doen-ças as quais podem ser prevenidas e/ou tratadas de acordo com a presenteinvenção são aquelas causadsa por ou associadas com nematódeos.

Em uma modalidade preferencial, a invertase a qual é inibidapelo inibidor de invertase de modo a aumentar a proporção de broto pararaiz, produção de sementes e resistência de uma planta a uma doença, maisparticularmente quaisquer das doenças descritas aqui, neste requerimentode patente, é uma invertase de acordo com a presente invenção.

As invertases de acordo com a presente invenção são definidaspor sua seqüência de ácido nucléico conforme revelado aqui, neste requeri-mento de patente. As invertases em geral, têm a seguinte seqüência de a-minoácidos em seu centro catalítico: cisteína (C) - prolina (P) - asparagina(D) a qual, no nível de ácido nucléico, corresponde a TGT/C - CCT/C/A/G -GAT/C em caso de invertases da parede celular, e cisteína (C) - valina (V) -asparaginas (D), ou no nível de ácido nucléico, TGT/C, GTT/C/A/G - GAT/Cpara invertases vacuolares.

As invertases da parede celular conforme revelado aqui, nesterequerimento de patente, podem ser comparadas com as seis seqüências deinvertases de Arabidopsis conhecidas (AtcwINV 1 - 6) e foi visto que a inver-tases da parede celular pode ser ligada às invertases 1 a 4 de Arabidopsisconforme representado na tabela 1.

As invertases vacuolares da presente invenção podem ser ali-nhadas a registros do banco de dados cujo resultado está representado natabela 2.

Também está dentro da presente invenção que são compreen-didas moléculas de ácido nucléico as quais são hibridizadas às seqüênciasde ácido nucléico de acordo com a SEQ. ID. NO 1 a Z1 preferencialmentesob condições estringentes. As condições estringentes referidas são, porexemplo, descritas em Sambrook J., Fritsch E.F. e Maniatis T. (1989). Mole-cular cloning. A Iaboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold S-pring Harbor New York.

Mais preferencialmente amostras de RNA são fracionadas emgéis de agarose de formaldeído, transferidas para membranas de nitrocelu-Iose e hibridizadas a cDNA marcado com P32 do gene correspondente sobcondições de rotina (Sambrook et al., 1989), preferencialmente a 42°C.

Além disso, está dentro a presente invenção que a invenção serefere a uma molécula de ácido nucléico a qual, porém para a degeneraçãodo código genético, hibridizaria, preferencialmente sob condições estringen-tes, à molécula de ácido nucléico revelada aqui, neste requerimento de pa-tente, cada uma preferencialmente codificando para invertase.

Também está dentro a presente invenção que a molécula de á-cido nucléico respectiva ou codificando para um inibidor de uma invertase oucodificando para a invertase de acordo com a presente invenção, são clona-das em um vetor. Preferencialmente o vetor referido é um vetor de expres-são. Para a finalidade de produzir qualquer polipeptídeo codificado pelosácidos nucléicos de acordo com a presente invenção ou aqueles descritosaqui, neste reqúerimento de patente, um vetor de expressão é usado, pormeio da qual o vetor de expressão referido é um vetor viral, microbiano, ve-getal ou animal, preferencialmente um vetor de planta. Também está dentroa presente invenção que o vetor referido é inserido em uma célula, por meioda qual a cécula referida é preferencialmente uma célula de planta. Tambémestá dentro a presente invenção que a célula vegetal é cultivada em umaplanta madura. Em uma modalidade adicional a célula e a planta madurageram uma semente contendo o vetor referido ou uma célula contendo ovetor referido. Preferencialmente a semente e/ou a planta é uma planta hí-brida a qual preferencialmente não é capaz de ser propagada por meios bio-lógicos comuns, isto é, cruzamento e propagação.

Também está dentro a presente invenção que o vetor contémum promotor específico para raiz conforme preferencialmente descrito aqui,neste requerimento de patente.

Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um constructode ácido nucléico o qual compreende um promotor específico para raiz e umácido nucléico codificando para um inibidor de invertase. O promotor especí-fico para raiz pode ser quaisquer dos promotores descritos aqui, neste re-querimento de patente. O inibidor de invertase é preferencialmente qualquerinibidor de invertase descrito aqui, neste requerimento de patente. Similar aovetor, o promotor específico para raiz e o ácido nucléico codificando para oinibidor de invertase são encadeados operavelmente um ao outro possibili-tando a expressão do inibidor de invertase. Este constructo de ácido nucléi-co pode ser introduzido em um vetor e uma célula, respectivamente, confor-me definido acima. Preferencialmente a célula referida é regenerada paraum tecido e planta, respectivamente e uma planta regenerada ou obtida daítanto por meios de engenharia genética bem como por propagação conven-cional. A planta referida pode ser qualquer planta e qualquer espécie e famí-lia ou gênero, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente.

Métodos para a introdução deste constructo genético e vetor,respectivamente, em uma célula de planta, a qual é preferencialmente umacélula de planta embrionária, são de conhecimento de uma pessoa versadana técnica e são descritos, por exemplo, em Clough S.J. e Bent A.F. (1998).Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana. Plant J. 16, 735-743. Métodos de transformações pre-ferenciais são Agro, bombardeamento de partículas, e banho floral. Maispreferencialmente, plantas de Arabidopsis são transformadas por banho flo-ral de acordo com o método de Clough e Bent (1998). As plantas são culti-vadas sob dias longos até a florescência e podadas para estimular a prolife-ração de ramos secundários. Uma cepa de Agrobacterium, carregandp oconstructo em um vetor binário, é cultivada em uma grande cultura em YEBa 289C. Subseqüentemente, o Agrobacterium é centrifugado e ressuspendi-do para uma OD6oonm=0,8 em solução de sacarose a 5%. Silwett é adiciona-do a uma concentração de 0,05% e as flores são banhadas por imersão nasolução por 2 a 3 segundos. As plantas banhadas são cobertas com envoltó-rio de saran durante 24 horas e no escuro, para manter elevada umidade.Subseqüentemente, são descobertas e cultivadas normalmente. A irrigaçãoé interrompida à medida que as sementes amadurecem e as sementes sãoselecionadas em placas contendo antibiótico.

Em outro aspecto, a invenção também se refere a este tipo deplanta a qual é preferencialmente uma planta transgênica. Em uma modali-dade particularmente preferencial, o constructo genético está sob controle deum promotor indutível conforme de conhecimento de uma pessoa versadana técnica. Promotores indutíveis particularmente prefereenciais são, porexemplo, mas não limitados a, um promotor indutível de dexametasona talcomo descrito em Aoyama T., et al. (Aoyama T. and Chua N.H. (1997). Aglucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.PIant J. 11, 605-612), ou McNeIIis T.W. et al. (McNeIIis T.W., Mudgett M.B.,Li K., Aoyama T., Horvath D., Chua N.-H. and Staskawicz B.J. (1998). Glu-cocorticoid-inducible expression of a bacterial avirulence gene in transgenicArabidopsis induced hypersensitive cell death. Plant J. 14, 247-257), ou umpromotor indutível de esteróide tal como descrito em Schena M. et al. (Sche-na M., Lloyd A.M. and Davis R.W. (1991). A steroid-inducible gene expres-sion system for plant cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 10421-10425), ouZuo J. et al. (Zuo J., Niu Q.W. and Chua N.H. (2000). An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene expression intransgenic plants. Plant J. 24, 265-273).

Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a se-mentes derivadas da planta referida, preferencialmente planta recombinante.

Em um aspecto adicional da presente invenção, os ácidos nu-cléicos, vetores, células e plantas bem como outros organismos contendo osvetores referidos codificando para quaisquer das invertases conforme reve-lado aqui, neste requerimento de patente, são usados para a produção dainvertase respectiva. Para semelhante finalidade, as células respectivas ex-pressando o ácido nucléico codificando para a invertase são cultivadas emum recipiente de reação apropriado contendo um meio apropriado e subse-qüentemente a invertase é isolada e/ou purificada. Os métodos de cultivo eisolamento / purificação referidos são de conhecimento de uma pessoa ver-sada na técnica.

Em um aspecto ainda adicional a presente invenção se refere aouso de quaisquer das invertases conforme revelado aqui, neste requerimen-to de patente, como uma molécula alvo. Uma molécula alvo conforme usadoaqui, neste requerimento de patente, é uma molécula a qual é ou visada invivo ou in vitro ou in silico. O direcionamento referido pode significar, emuma modalidade preferencial, que a invertase é objeto para um processo detriagem, preferencialmente um processo de triagem in vitro ou um processode triagem in silico.

Em associação com o processo de triagem in vitro, a moléculaalvo como tal é proporcionada e um ou vários compostos, preferencialmentetaken from uma biblioteca, são testados tipicamente contactando o compostocom a molécula alvo, quer ou não quaisquer dos compostos tenham um im-pacto sobre o alvo, preferencialmente quer ou não haja um aumento ou re-dução na atividade do alvo, isto é, a atividade de invertase. Como a molécu-la alvo é uma invertase, são de conhecimento de uma pessoa versada natécnica provas para avaliar se um composto, também referido aqui, nesterequerimento de patente, como um composto candidato, tem um efeito inibi-tório ou de ativação sobre a invertase. As moléculas referidas podem seradicionalmente usadas como um candidato, orientação ou composto para afabricação de um produto agroquímico. Preferencialmente o produto agro-químico reefrido é um agroquímico adequado para aumentada proporção debroto para raiz, produção de sementes e/ou aumentar a resistência, prefe-rencialmente se mostrar um efeito inibitório sobre a invertase.

Em uma triagem in silico, a molécula alvo, isto é, quaisquer dasinvertases conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, é usadacomo uma molécula contra a qual o ajuste de outras moléculas é testado ououtras moléculas são designadas por meio de análise e design computacio-nal de modo a ajustar à molécula alvo preferencialmente tal como para inibirou promover a atividade da molécula alvo. Preferencialmente o ajuste referi-do se refere ao centro ativo da invertase. O composto identificado deste mo-do, quer identificado por triagem in vitro e/ou por triagem in silico pode seressencialmente usado em associação com os métodos revelados aqui, nes-te requerimento de patente. O composto identificado deste modo pode serentão um promotor de crescimento vegetal ou um agente protetor de planta,particularmente no caso do composto referido na verdade estar reduzindo aatividade de uma invertase, mais preferencialmente uma invertase de raiz esua atividade, respectivamente, de acordo com a presente invenção.

Em uma modalidade preferencial de qualquer aspecto da pre-sente invenção a invertase é uma invertase de planta, e um inibidor parauma invertase é um inibidor para invertase de planta, por meio da qual o ini-bidor é uma planta ou um inibidor derivado de planta.

A invenção é agora adicionalmente ilustrada pelas figuras ane-xadas, exemplos e a listagem de seqüência a partir das quais podem serobtidas características, modalidades e vantagens adicionais.

Fig. 1 mostra a tabela 1 atribuindo as invertases da presente in-venção a invertases de Arabidopsis conhecidas;

Fig. 2mostra a tabela 2 atribuindo as invertases da presente in-venção a invertases conhecidas indicando os registros do banco de dadostendo a maior homologia com as invertases de acordo com a presente invenção;

Fig. 3é um diagrama indicando a distribuição de plantas comouma função da proporção de broto para raiz para as várias plantas transgê-nicas (AT) e as plantas selvagens correspondentes (WTCoIO) cultivadas emmeio contendo 1 % de sacarose, por meio da qual o número total de plantasde uma variedade distinta é ajustado para 1 (100 %) e é indicada a porçãorelativa de plantas as quais têm uma proporção específica de broto para raiz;

Fig. 4é o resultado de uma análise Northern blot representandoa expressão de RNA de inibidores de invertase em raízes de plantas trans-gênicas em comparação com plantas selvagens controle;

Fig. 5é o resultado de uma análise Northern blot da expressãode RNA de Cin 1 em raízes de plantas transgênicas;

Fig. 6é um diagrama, similar ao diagrama da Fig. 3, indicando adistribuição de plantas como uma função da proporção de broto para raizpara as várias plantas transgênicas (AT) e as plantas selvagens correspon-dentes (WTCoIO) cultivadas em perlita;

Fig. 7é o resultado de uma análise Southern blot de diferenteslinhagens independentes contendo diferentes número de cópias e sítios deinserção para AtC/Vif1(At1g47960);

Fig. 8é um diagrama, similar ao diagrama da Fig. 3, indicando adistribuição de plantas como uma função da proporção de broto para raizpara várias plantas transgênicas (AT) e as plantas selvagens corresponden-tes (WTCoIO) inicialmente cultivadas em meio contendo 1 % de sacarose esubseqüentemente transferidas para perlita;

Fig. 9é uma fotografia do fenótipo de plantas selvagens e trans-gênicas depois de 49 dias de crescimento em condições de dia longo;

Fig. 10é uma fotografia do fenótipo de plantas selvagens etransgênicas depois de pré-crescimento em meio de seleção contendo glu-cose e transferência para perlita depois de 14 dias tirada depois de 43 diasde crescimento em condições de dia curto ;

Fig. 11é uma fotografia do fenótipo de plantas selvagens etransgênicas depois de pré-crescimento em meio de seleção contendo glu-cose e transferência para perlita depois de 14 dias, por meio da qual as foto-grafias foram tiradas depois de 30 dias de crescimento em condições de dialongo;

Fig. 12é uma fotografia do fenótipo de plantas selvagens etransgênicas depois de pré-crescimento em meio de seleção contendo glu-cose e transferência para perlita depois de 14 dias, por meio da qual as foto-grafias foram obtidas depois de 40 dias de crescimento em condições de dialongo;

Fig. 13indica as referências internas e as seqüências de ácidonucléico das invertases de acordo com a presente invenção;

Fig. 14mostra uma tabela indicando o nível de expressão de di-ferentes invertases de colza em diferentes órgãos da planta indicando queinvertase da parede celular Inv 3(A1) e invertase E6 são invertases particu-Iarmente preferenciais para a prática da presente invenção;

Fig. 15mostra um mapa de restrição para plasmídeos pmcg2 epmcg3;

Fig. 16é a planilha de plasmídeos para MCG-4;

Fig. 17é a planilha de plasmídeos para MCG-5;

Fig. 18é a planilha de plasmídeos para MCG-3;

Fig. 19 é um diagrama esquemático ilustrando a produção depmcg4;

Fig. 20é um diagrama esquemático ilustrando a produção depmcgõ;

Fig. 21 é a planilha de plasmídeos para MCG-6;

Fig. 22é a planilha de plasmídeos para MCG-7;

Fig. 23é um diagrama esquemático ilustrando a produção depmcg6;

Fig. 24é um diagrama esquemático ilustrando a produção depmcg7;

Fig. 25é a planilha de plasmídeos para MCG-8;

Fig. 26é a planilha de plasmídeos para MCG-9;

Fig. 27é um diagrama esquemático ilustrando a produção depcmg 11-9;

Fig. 28é a planilha de plasmídeos para MCG-13

Fig. 29é um diagrama esquemático ilustrando a produção depmcg 12-1

Fig. 30é a planilha de plasmídeos para MCG-19;

Fig. 31 é um diagrama esquemático ilustrando a produção depcmg 8;

Fig. 32é a planilha de plasmídeos para MCG-10;

Fig. 33é a planilha de plasmídeos para MCG-11;Fig. 34 é uma fotografia mostrando exemplos representativos deuma infecção de plantas selvagens (CoIumbia) e plantas transgênicas ex-pressando o inibidor de invertase de Arabidopsis AtC/VIF2, At5g46940 sobcontrole do promotor pyk10 (pykl Oiinibidor de invertase) por Plasmodiophorabrassicae; ao passo que as raízes das plantas selvagens mostram gravessintomas de doença tais como extensiva protuberância (esquerda ), as raí-zes das plantas transgênicas são essencialmente livres de sintomas excetopela região do hipocótilo, uma região onde o promotor não é expressado.(A);

e uma tabela indicando o índice de doença de acordo com Sie-mens et al. (Siemens et al., 2002) uma quantificação do grau de sintomas,de várias cepas de A. thaliana recombinantes onde infectadas por Plasmodi-ophora brassicae; em comparação com plantas controle selvagens (índicede doença 1) as plantas de linhagens transgênicas individuais expressandoo inibidor de invertase de Arabidopsis AtC/VIF2 ou sob controle do promotorpyk10 ou do promotor críptico-T80 são fortemente afetadas; os dados indi-cam uma correlação positiva entre número de cópias e proteção (B);

Fig. 35representa uma tabela onde o efeito de nocautes (KO) deúnica invertase sobre o índice de doença é indicado para várias linhagenscelulares;

Fig. 36mostra diagramas indicando a atividade de várias inver-tases (Figs. 36 A; B;), o teor de glucose e frutose das raízes (Fig. 36 C), aproporção dos teores de glucose e frutose para o teor de sacarose das raí-zes (Fig. 36 D), o grau de micorrização (Fig. 36 E), cada um depois de 3,5 e5 semanas, respectivamente, de infecção com G. intraradices em linhagemselvagem e duas linhagens de planta de A. thaliana, por meio da qual Invlnhsignifica inibidor de invertase, e uma microfotografia de estrutura fúngica co-rada com tinta em uma linhagem selvagem e uma das linhagens celularessubmetida à Fig. 36 A a E (Fig. 36 F);

Fig. 37mostra um diagrama indicando o resultado de uma análi-se de biomassa apra duas linhagens de tabaco recombinante diferentes ex-pressando o inibidor de invertase AtC/VIF2 (98-1-10, 98-1-4) e plantas detabaco selvagens; e por meio da qual a Fig. mostra a proporção de raiz parabroto; e

Fig. 38mostra vários diagramas indicando os resultados da de-terminação das atividades de diferentes isoenzimas invertase tais como in-vertase apoplástica, invertase vacuolar, e invertase citosólica, em raízes efolhas de plantas de tabaco selvagens (wt) e duas linhagens de tabaco re-combinante diferentes expressando o inibidor de invertase AtC/VIF2 (98-1-10,98-1-4).

Exemplo 1:Produção de células de planta transgênica

Nesta abordagem, a invertase da parede celular de Chenopodi-um rubrum foi usada de modo a prevenir possível inibição de genes de Ara-bidopsis thaliana pelos inibidores de invertase de plantas. Diferentes inibido-res de invertase foram usados para a redução da atividade de invertase deplanta na raiz: um inibidor de invertase da parede celular do tabaco (Greineret al., 1998), e dois genes de Arabidopsis com maior homologia para inibidorde invertase da parede celular (At5g46940) e vacuolar (At1g47960). Comoforam obtidos resultados similares para os inibidores de invertase do tabacoe de Arabidopsis, nós enfocamos os dois genes de Arabidopsis para todasas abordagens subseqüentes. Recentemente, foi obtida evidência de com-provação de função in vitro para estes dois inibidores de invertase, comAtCA/lF1 (At1g47960) especificamente inibindo a atividade de invertase va-cuolar, ao passo que AtC/VIF2 (AT5g46940) inibe ambas embora com umaafinidade dez vezes maior paa invertase vacuolar do que para invertase daparede celular (Link et al., 2004). Mas até o momento, não foi demonstradacomprovação de atividade in vivo. Os genes mencionados foram produzidossob o controle de dois promotores específicos para raiz de Arabidopsis dife-rentes descritos na literatura: o promotor pyk10 de uma mirosinase de Arabi-dopsis (Nitz et al., 2001), e um promotor críptico reportado por Mollier et al.(2000) o qual também é referido aqui, neste requerimento de patente, como"crípticoT80" ou promotor T80-críptico. Além disso, um sistema indutível noqual a expressão do transgene é induzida por esteróides também foi usadopara a produção de plantas transgênicas (Zuo et al., 2000). Constructos paraa expressão destes genes bem como um gene repórter (β-glucuronidase ouproteína verde fluorescente) foram produzidos osb o controle dos três pro-motores, deste modo produzindo um total de 12 constructos. Linhagenstransgênicas foram obtidas por transformação de plantas de Arabidopsiscom os constructos correspondentes por imersão floral. Com a exceção depyk10:At1g47960, todos os experimentos de transformação deram origem alinhagens transgênicas independentes. Plantas transgênicas controle cor-respondentes foram, além disso, produzidas por transformação de plantasselvagens com os plasmídeos vazios correspondentes (pBINHygTX, paraexpressão específica para raiz, e pER8, para expressão indutível por este-róide), embora não tenham sido usados nas caracterizações descritas aqui.Ao invés, plantas de Arabidopsis selavegem CoIO foram usadas para compa-ração com nossas plantas transgênicas.

Construção de plasmídeo

Inibidores de invertase da parede celular (At5g46940) e vacuola-res (At1 g47960) putativos foram inicialmente clonados em pBluescript SK+,entre sítio Acc65l e Xbal. Os produtos de PCR correspondentes, obtidos poruso de primers específicos contendo sítios de restrição para as etapas declonagem subseqüentes (Acc65l e Xhol para o primer 5' e Apal e Xbal parao primer 3'), foram digeridos com Acc65l e Xbal e clonados em pBluescriptdando origem a pmcg2 e pmcg3 (Fig. 15) respectivamente (planilhas deplasmídeos (PDS) MCG-4 (Fig. 16) e 5 (Fig. 17)).

Foram usados os seguintes primers:

Atcwinh-1: 5'-ctgaggtacctcgagcctgaaatggcttcttctc-3'

Atcwinh-2: 5- ctgatctagagggccctcattcaacaaggcgatc-3'

Atvinh-1: 5'-ctgaggtaccctcgagaagatgaagatgatgaagg-3'

Atvinh-2: 5'-gatctctagagggccctcaaagcaacattctcac-3'

Mais especificamente, e com referência à Fig. 16, o cDNA codi-ficando para um inibidor de invertase da parede celular de Arabidopsis thali-ana (At5g46940) foi amplificado a partir de RNA isolado de folhas por usodos primers Atcwinh-1 (5'-CTAGGGTACCTCGAGCCTGAAATGGCTTCTTCTC-3'), e Atcwinh-2 (5'-CTGATCTAGAGGGCCGTCAJTCAACAAGGCGATC-3'), que geraram ossítios de restrição Acc65l/Xhol e Xbal/Apal na extremidade 5' e 3', respecti-vamente. O produto gerado foi cortado com Acc65l e Xbal e clonado entreos sítios correspondentes do plasmídeo de clonagem pBluescript KS(+), ge-rando o plasmídeo pmcg2.

Além disso, e com referência à Fig. 17, o cDNA codificando paraum inibidor de invertase vacuolar de Arabidopsis thaliana (At1g47960) foiamplificado a partir de RNA isolado de folhas por uso dos primers Atvinh-1(5'-CTGAGGT/4CC7~CGy4GAAGATGAAGATGATGAAGGT-3'), e Atvinh-2 (5'-GATCTCTAGAGGGCCCTCAAAGCAACATTCTCAC-3'), os sítios de restri-ção gerados Acc65l/Xhol e Xbal / Apal na extremidade 5' e 3', respectiva-mente. O produto gerado foi cortado com Acc65l e Xbal e clonado entre ossítios correspondentes do plasmídeo de clonagem pBluescript KS(+), geran-do o plasmídeo pmcg3.

Primeiros constructos para uma expressão específica para raizdo inibidor de invertase usaram o promotor pyk10 específico para raiz deuma mirosinase de Arabidopsis. O promotor PykIO foi primeiro amplificadopor PCR de DNA genômico, isolado de folhas de Arabidopsis, com os pri-mers pykl O-FORW e pyk10-REV. O produto desta primeira reação de PCRfoi usado para uma reação de PCR aninhado com os primers pyk10-C epyk10-F2, designado como em Nitz et al. (2001), contendo sítios de restriçãoAcc65l. O produto de PCR final foi restringido com Acc65l e clonado empTF2-6 (inibidor de invertase da parede celular de Nicotiana tabacum empBINHygTx), dando origem a pmb1 (PDS MCG-3 (Fig. 18)). Foram usadosos seguintes primers:

pykl O-FORW: 5'-gatgtacacgttttggtgtggg-3'pykl 0-REV: 5'-gcttacgtgtttagggaaatgg-3'pyk10-C: 5'-ggacggtaccctgcaacgaagtgtacc-3'pykl 0-F2: 5'-gcaggtaccgtaattctgattttattcaag-3'

Mais especificamente, e com referência à Fig. 18, um constructopara expressão específica para raiz de inibidor de invertase da parede celu-lar de Nicotiana tabacum foi gerado em duas etapas. 0 promotor do genepyk10 (AJ292756; Nitz et al., 2001), codificando para uma mirosinase espe-cífica para raiz, foi amplificado por duas reações de PCR seqüenciais. Naprimeira reação, os primers pykl O-FORW (5'-GATGTACACGTTTTGGTGTGGG-3') e pykl O-REV (5'- GCTTACGTGTT-TAGGGAAATGG -3') foram usados para amplificação de DNA genômicoisolado de folhas de Arabidopsis thaiiana. O produto desta reação foi usadoem uma reação de PCR aninhado com os primers pyk10-C (5'-GGACGGT/4CCCTGCAACGA AGTGTACC -3') e pyk10-F2 (5'-GCAGGr>4CCGTAATTCTGATTTTATTCAAG-3'), ambos contendo um sítiode restrição Acc65l. O produto desta reação de PCR foi cortado com Acc65le clonado no sítio correspondente do plasmídeo pTF2-6, o qual correspon-deu a um inibidor de invertase da parede celular (Y12805) clonado no plas-mídeo binário pBINHygTx (Gatz e Lenk, 1998) entre os sítios de restriçãoAcc65l e Xbal. A orientação correta do promotor em pmb1 foi verificada porrestrição com diferentes enzimas.

Para a expressão dos inibidores de invertase sob controle dopromotor pyk10, At5g46940 e At1g47960 foram cortados de pmcg2 epmcg3, respectivamente, e clonados em pTF2-6 por restrição com Acc65l eXbal, dando origem a pmcg4 (Fig. 19) e pmcgõ (Fig. 20) (PDS MCG-6 (Fig.21) e MCG-7 (Fig. 22)). O promotor foi inserido na frente dos genes em am-bos os constructos por digestão de pmb1 com Acc65l, isolamento do frag-mento promotor pyk10 e clonagem em Acc65l restrito pmcg4 e pmcg5, pro-duzindo pmcg6 (Fig. 23) e pmcg7 (Fig. 24) (PDS MCG-8 (Fig. 25) e MCG-9(Fig. 26)).

Mais especificamente, e com referência à Fig. 21, o cDNA codi-ficando para um inibidor de invertase da parede celular de Arabidopsis thaii-ana (At5g46940) foi cortado do plasmídeo pmcg2 por restrição com Acc65leXbal, e clonado entre os sítios correspondentes de pTF2-6. Para isto, oplasmídeo pTF2-6 foi primeiro cortado com estas enzimas e a banda corres-pondente ao plasmídeo binário pBINHygTx foi isolada. Foi gerado o plasmí-deo pmcg4, correspondente a um inibidor de invertase da parede celularcDNA de Arabidopsis thaliana em pBINHygTx.

Mais especificamente, e com referência à Fig. 22, o cDNA codi-ficando para um inibidor de invertase vacuolar de Arabidopsis thaliana(At1g47960) foi cortado do plasmídeo pmcg3 por restrição com Acc65l eXbal , e clonado entre os sítios correspondentes de pTF2-6. Para isto, oplasmídeo pTF2-6 foi primeiro cortado com estas enzimas e a banda corres-pondentes ao plasmídeo binário pBINHygTx foi isolada. Foi gerado o plas-mídeo pmcg5, correspondente a um cDNA de inibidor de invertase vacuolarde Arabidopsis thaliana em pBINHygTx.

Mais especificamente, e com referência à Fig. 25, o constructopara a expressão específica para raiz de um inibidor de invertase da paredecelular de Arabidopsis thaliana (At5g46940) no plasmídeo binário pBI-NHygTx foi gerado em duas etapas. O primeiro promotor pyk10 foi cortadode pmb1 com Acc65l e isolado de um gel agarose. O promotor foi clonadoentre os sítios correspondentes de pmcg4, para gerar pmcg6.

Mais especificamente, e com referência à Fig. 26, um constructopara a expressão específica para raiz de um inibidor de invertase vacuolarde Arabidopsis thaliana (At1g47960) no plasmídeo binário pBINHygTx foigerado em duas etapas. O primeiro promotor pyk10 foi cortado de pmb1 comAcc65l e isolado de um gel agarose. O promotor foi clonado entre os sítioscorrespondentes de pmcg5, para gerar pmcg7.

O promotor críptico foi amplificado por PCR de plasmídeo X7-KS, proporcionado por Mollier et al. (2000), por uso de primers cryp-F/R,contendo um sítio de restrição Acc65l em ambas as extremidades. O frag-mento de PCR foi clonado em pmcg6-1 (pyk10:At5g56940 no plasmídeopBINHygTx) dando origem a pmcgl 1 (Fig. 27) (PDS MCG-13 (Fig. 28)). Paraa produção de uma fusão de promotor críptico a At1 g47960, o fragmento dePCR descrito acia para o promotor foi restrito com Acc65l e clonado empmcg7-5 (pykl 0:At1 g47960 e, pBINHygTx) dando origem a pmcgl2 (Fig. 29)(PDS MCG-14 (Fig. 30)). Em ambos os plasmídeos o promotor pyk10 pre-sente em pmcg6 e pmcg7 foi removido por restrição com Acc65l e isolamen-to da banda de plasmídeo.Foram usados os seguintes primers:

cryp-F: 5'-gatcggtacctcgaattgtgatatattgtaagc-3'

cryp-R: 5'-catggggtaccctgattaattagcaattagtgg-3'

Mais especificamente, e com referência à Fig. 28, um constructopara expressão específica para raiz de um inibidor de invertase da paredecelular de Arabidopsis thaliana (At5g46940) foi gerado em duas etapas. Opromotor de um gene críptico específico para raiz (AX063411) foi amplifica-do por PCR usando os primers cryp-F (5'-: GATCGG7V\CCTCGAATTGTGA-TATATTGTAAGC-3') e cryp-R (5'-CATGGGGT>4CCCTGATTAATTAGCAATTAGTGG-3'), ambos contendo umsítio de restrição Acc65l, do plasmídeo X7-KS proporcionado por Mollier etal. (2000). O produto desta reação de PCR foi cortado com Acc65l e clonadono sítio correspondente de pmcg6. pmcg6 foi primeiro cortado e a bandacorrespondente ao plasmídeo pBINHygTx contendo o inibidor de invertaseda parede celular isolado de um gel agarose. A orientação correta do promo-tor em pmcg11 foi verificada por restrição com diferentes enzimas.

Mais especificamente, e com referência à Fig. 30, um constructocontrole para uma expressão indutível por estrógeno da proteína verde fluo-rescente repórter (GFP) foi obtido da Dirk Becker (Lehrstuhl für Pflanzenphy-siologie und Pflanzenbiophysik, Universitát Würzburg) e transformado emAgrobacterium para usá-lo para transformação vegetal.

Os constructos correspondentes em um sistema indutível porestrógeno, pmcg8 (Fig. 31) e pmcg9 (PDS MCG-10 (Fig. 32) e MCG-11 (Fig.33)) foram obtidos por restrição do plasmídeo pER8 e pmcg2 ou pmcg3 comXhol e Apal e ligação do plasmídeo digerido ao fragmento isolado corres-pondente ao gene.

Mais especificamente, e com referência à Fig. 32, um constructopara uma expressão, indutível por estrógeno, de um inibidor de invertase daparede celular de Arabidopsis thaliana (At5g46940) foi gerado por isolamen-to do cDNA correspondente de pmcg2, por restrição com Xhol e Apal, e clo-nagem entre os sítios correspondentes do plasmídeo binário pER8.

Mais especificamente, e com referência à Fig. 33, um constructopara uma expressão, indutível por estrógeno, de um inibidor de invertasevacuolar de Arabidopsis thaliana (At1 g47960) foi gerado por isolamento docDNA correspondente de pmcg3, por restrição com Xhol e Apal, e clonagementre os sítios correspondentes do plasmídeo binário pER8.

Vide também Molier et al. (Mollier et al.(2000). Tagging of acryptic promoter that confers root-specific gus expression in Arabidopsis tha-liana. Plant Cell Rep. 19, 1076-1083.); Nitz I. et al. (Nitz I., Berkefeld H., Pu-zio P.S. and Grundler F.M.W. (2001). Pyk\0, a seedling and root specificgene and promoter from Arabidopsis thaliana. Plant Sei. 161, 337-346.); andZuo J. et al. (Zuo J., Niu Q.W. and Chua N.H. (2000). An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene expression intransgenic plants. Plant J. 24, 265-273.)

Exemplo 2:Crescimento de plantas transgênicas em meio de culturacontendo 1 % de sacarose

Caracterização inicial das linhagens transgênicas geradas con-forme descrito no exemplo 1, foi feita com plantas crescendo em vidrosWeck contendo meio MS mais vitaminas, MES1 sacarose a 1% e gelrita a0,3% para polimerização. As mudas foram pré-cultivadas primeiro em meiode seleção com a mesma composição, mas contendo glucose a 1% ao invésde sacarose e incluindo 50 mg/L de higromicina para seleção de transgêni-cas mas não para plantas controle selvagens. Depois de aproximadamente14 dias de crescimento, as mudas foram transferidas para o meio de culturadescrito acima.

Mais especificamente, sementes de Arabidopsis foram pré-cultivadas em meio MS0222 contendo 0,5g/L de MES, 1% de glucose e0,3% de gelrita, e incluindo higromicina no caso de seleção para mudastransgênicas. Depois de 14 dias, as mudas foram transferidas para vidrosWeck contendo um meio similar mas com sacarose a 1% ao invés de gluco-se e sem antibiótico. O peso fresco de broto e raiz foram quantificados e aproporção de broto para raiz foi determinada para 6 plantas de cada linha-gem independente. WTCoIO, Arabidopsis selvagem; AT4-11,pyk10:At5g46940·, AT10-3 e 20, cryptic:At5g4694a, AT11-9A, cryp-tic:At1 g4796Ct, AT15, pyk10:Cin1. Para os experimentos de Northern blot,RNA foi extraída das raízes de cada planta individual de modo independen-te.

A quantificação do peso fresco de broto e raiz na planta mostra-ram que, interessantemente, a inibição da atividade de invertase na raiz nãoresultou em uma redução do peso da raiz mas em um peso não alterado ouligeiramente aumentado, acompanhado por um aumento mais acentuado nopeso do broto essencialmente devido a um aumento no número de folhas ebrotos de roseta. Portanto, proporção de broto para raiz e biomassa vegetalinteira foi aumentada nas plantas inibidoras de invertase. O efeito da expres-são de inibidor de invertase sobre a proporção de broto para raiz e o fenótipoda planta foi mais evidente no caso de expressão orientada por promotorcríptico conforme representado na Fig. 3, muito embora a expressão genéti-ca fosse claramente mais reforçada com o promotor pyk10 conforme repre-sentado na Fig. 4.

Mais especificamente, a Fig. 3 representa a distribuição normalda proporção de broto para raiz em plantas selvagens (WT) e as diferenteslinhagens transgênicas, a Fig. 4 mostra expressão de RNA1 determinada porNorthern blot, dos inibidores de invertase correspondentes em raízes deplantas transgênicas em comparação com plantas selvagens controle, e aFig. 5 mostra expressão de RNA de Cinl em raízes de plantas transgênicas.

O aumento da atividade de invertase na raiz pela expressão te-cido específica de um gene de invertase (Cinl) resultou em uma alta variabi-lidfade de crescimento entre plantas da mesma linhagem transgênica, nãoproporcionando um fenótipo claro em comparação com plantas selvagens.No entanto, em plantas cultivadas no meio de cultura foi observada uma di-ferença no fenótipo em comparação com plantas de controle, com uma au-mento da biomassa de raiz (0,33 ± 0,21 em relação a 0,19 ± 0,08) e broto(1,50 ± 0,50 em relação a 1,00 ± 0,25) para uma extensão similar, portantonão produzindo uma grande diferença na proporção de broto para raiz emrelação a plantas de controle (Fig. 3). Nesta condição de crescimento, tam-bém houve algum grau de variabilidade no fenótipo de plantas transgênicas,algumas das mesmas apresentando proliferação anormal de estruturas ver-des semelhantes a calos indiferenciados ao invés de folhas diferenciadas enão florescendo, ao passo que outras floriram e apresentaram um númeroaumentado de folhas differenciadas (não mostrado). Estas estruturas tam-bém aparecem am alguns das plantas inibidoras de invertase, embora folhase inflorescências apropriadas tenham se desenvolvido nestas plantas tam-bém. Formação prejudicada de órgão apropriado, levando ao aparecimentode estruturas verdes pobremente diferenciadas, foi previamente descrita emembriões de cenoura anti-sentido de invertase cultivados sobre meio con-tendo sacarose. Este efeito foi atribuído à sinalização errônea produzida pelonível alterado de sacarose para hexose nas plantinhas, uma vez que podeser compensado pela adição de glucose e frutose, os produtos da reação deinvertase (Tang et al., 1999). Quando plantas pyk10:Cin1 foram cultivadasem diferentes condições (solo ou perlita) foi observada uma maior variabili-dade no fenótipo das plantas. Em alguns casos as plantas apresentaramuma aumentada proporção de broto para raiz, ao passo que outras plantasdas mesma linhagem apresentaram uma proporção reduzida. Em conse-qüência, o desvio padrão calculado para a proporção de broto para raiz dasplantas independentes em um único experimento de caracterização foi emalguns casos tão elevado quanto o valor médio. Esta variação pode ser atri-buível a uma degradação do mensageiro correspondente na planta, confor-me observado por estudos por Northern blot para plantas cultivadas em meiode cultura (Fig. 5).

Exemplo 3:Crescimento de plantas transgênicas em perlita

Em um segundo experimento de caracterização, as plantas fo-ram cultivadas em perlita e irrigadas com solução de Hoagland durante 36dias em condições de dia longo (16 horas de luz / 8 horas de escuridão),depois do pré-crescimento inicial em placas de seleção. O peso fresco deraiz e broto e a proporção de broto para raiz, bem como o peso de sementepor planta foram determinados para as diferentes linhagens em estudo.Mais especificamente, sementes de Arabidopsis foram pré-cultivados emmeio de seleção por 14 dias e em seguida transferidas para perlita e cultiva-das por 36 dias em condições de dia longo. O peso fresco de broto e raiz foiquantificado e a proporção de broto para raiz foi determinada para 8 plantasde cada linhagem independente. WTCoIO, Arabidopsis selvagem; AT4-11,pyk 10:At5g4694Ct, AT10-3, 6.2 e 20, cryptic:At5g46940, AT11-3, 7 e 9A,cryptic.At1g47960, AT15, pyk10:Cin1.

Os resultados são mostrados na Fig. 6.

Conforme pode ser visto a partir da Fig. 6, plantas da linhagemtransgênica pyk10:Cin1 agiram de um modo diferente com respeito ao expe-rimento anterior. A proporção de broto para raiz estava aumentada nestasplantas, o peso fresco da raiz estava reduzido (0,017 ± 0,007 em relação a0,038 ± 0,027 em plantas selvagens) e o peso fresco de broto ligeiramenteaumentado (0,20 ± 0,09 em relação a 0,16 ± 0,07 em plantas selvagens) emrelação a plantas controle. Para o inibidor de invertase, expressão de inibidorde invertase, orientada por pyk10, resultou em uma tendência mais clarapara uma aumentada proporção de broto para raiz do que no meio de cultu-ra, embora o aumento fosse novamente mais claro em linhagens onde a ex-pressão do inibidor de invertase estava sob controle do promotor críptico(Fig. 6).

O aumento desta proporção foi essencialmente devido a umpeso fresco de broto aumentado nestas linhagens, como um resultado deum número de broto aumentado, ao passo que a massa de raiz foi somenteaumentada em uma das linhagens (AT11-3) analisadas para cryptic:At1g47960, mas não nas outraas linhagens independentes para o mesmoconstructo. De modo interessante, a análise do peso de semente por plantatambém mostrou uma importante diferença entre produção de sementes deplantas transgênicas e selvagens. A produção de sementes estava clara-mente aumentada nas diferentes linhagens de inibidor de invertase, ao pas-so que na linhagem pyk10:Cin1 estava ligeiramente reduzida com respeitoao controle apesar do ligeiro aumento na biomassa de broto (Tabela 3).Tabela 3: Teste de alcance múltiplo de Duncan para valores médios de plan-tas: As plantas são agrupadas em grupos de importância designados poruma letra. As linhagens com a mesma letra não são significativamente dife-rentes.

LinhagemPeso fresco de raiz (g) Peso fresco de broto (g)Broto / raiz Pesode semente (mg) / planta

WTColOO,038750 bcd 0,158750 d 4,722500 e 4,712500 efAT150,016875 d 0,203750 d12,271250 bc 2,462500 fAT4-110,063750 b 0,630000 bc 10,526251 cd 13,425000 bcdAT10-30,056250 bc 0,671250 b12,902500 bc 17,562500 bAT10-6,20,046250 bcd 0,337500 d 7,753750 de 12,049999 cdAT10-200,026875 cd 0,408750 cd 15,785000 ab 16,600000 bcAT11-30,108750 a 1,318750 a 13,961250 abe 8,705000 deAT11-70,044375 bcd 0,755000 b 17,344999 a 27,634998 aAT11-9A0,062500 b 0,778750 b 13,515000 abe 23,212500 aCoef. Var.57,292% 39,766%32,203% 35,891%

O fenótipo mais claro, com respeito a produção de semente eproporção de broto para raiz, foi obtido nas linhagens expressando AtC/VIF1(At1g47960) sob o controle do promotor críptico. Portanto estas linhagens,designadas como AT11, foram usadas para uma caracterização detalhada.Duas linhagens independentes para este constructo (AT11-7 e AT11-9), quecontinham diferente número de cópias e sítios de inserção, conforme mos-trado por experimentos de Southern blot (Fig. 7), foram usadas para as ca-racterizações detalhadas.

Para preparar o Southern blot de três linhagens independentespara AT11 (cryptic:At1g47960), 2 pg de gDNA de cada linhagem foram dige-ridos com enzimas de restrição BamYW (B)1 EcoRI (E), Hind\\\ (H) e Xba\ (X)que não cortam dentro da seqüência de sonda. DNA digerido foi analisadopor eletroforese em 0,7% de gel agarose e manchado sobre uma membranade nitrocelulose. O filtro foi hibridisado com uma sonda marcada radioativacorrespondente ao gene HPTII.

Como um experimento de caracterização final, as plantas foramcultivadas nas condições previamente descritas, em perlita durante aproxi-madamente 49 dias em condições de dia longo (16 horas de luz / 8 horas deescuridão). Neste caso, o pré-crescimento foi feito em meio de seleção con-tendo sacarose a 1 % ao invés de glucose, para estudar a influência do açú-car neste meio sobre o crescimento subseqüente das plantas. O tempo decrescimento foi aumentado de 36 para 49 dias para analisar se as diferençasentre linhagens são mais claras depois de períodos de crescimento maislongos. Novamente, o peso fresco de raiz e broto e a proporção de brotopara raiz foram determinados para as diferentes linhagens em estudo, masneste caso os valores para produção de sementes correspondem a pesoseco de síliqua. A principal diferença entre este experimento e o experimentoprecedente é que plantas AT15 (pyk10:Cin1) têm comportamento mais simi-lar a plantas selvagens, com uma proporção de broto para raiz mais similar aplantas selvagens do que no experimento anterior (Fig. 8). Novamente, oaumento desta proporção em linhagens de inibidor de invertase foi devida aum peso fresco de broto aumentado. Somente foi observada uma reduçãono peso fresco da raiz em relação a plantas de controle em AT10-20 (cryp-tic:At5g4694), acompanhada por um peso de broto ligeiramente reduzido emrelação a plantas selvagens, mas com uma aumentada proporção de brotopara raiz. Em todas as outras linhagens analiadas, a proporção de broto pa-ra raiz foi aumentada em relação ao controle, embora para AT15 as diferen-ças com WTCoIO não fossem estatisticamente significantes de acordo com oteste de Duncan (Tabela 4).

Para semelhante finalidade, sementes de Arabidopsis foram pré-cultivadas conforme descrito anteriormente, exceto que a glucose foi substi-tuído por sacarose a 1%, e em seguida transferidas para perlita e cultivadaspor 49 dias em condições de dia longo. O peso fresco de broto e raiz foramquantificados e a proporção de broto para raiz foi determinada para 7 plantasde cada linhagem independente. WTCoIO, Arabidopsis selvagem; AT4-11,pyk10:At5g46940\ AT10-6.2 e 20, cryptic:At5g46940\ AT11-7 e 9A, cryp-tic:At1g4796a, AT15, pyk10:Cin1.

Com respeito à produção de semente, determinada como pesoseco de síliqua por planta, linhagens de inibidor de invertase mostraram umaumento significativo deste parâmetro. Neste caso, plantas AT15(pyk10:Cin1) mostraram um aumento ligeiro, mas não estatisticamente signi-ficativo, da produção de semente com respeito ao tipo selvagem. A diferençafenotípica mais acentuada foi novamente observada para a expressão deinibidor de invertase orientada por promotor críptico, ao passo que diferen-ças para controle não foram tão acentuadas com o promotor pyk10. As Ii-nhagens AT11 -7 e AT11-9A foram novamente as linhagens apresentando adiferença mais significativa, na proporção de broto para raiz e produção desementes, em relação aos controles.

Tabela 4: Test de alcance múltiplo de Duncan para valores mé-dios de plantas: As plantas são agrupadas em grupos de significância desig-nados por uma letra. As linhagens com a mesma letra não são significativa-mente diferentes.

Linhagem Peso fresco de raiz (g) Peso fresco de broto (g)Broto/ raiz Peso seco de síliqua (mg)/planta

WTCol00,137143 ab 0,980429 cd 6,892000 c 20,857143 cAT150,204286 a 2,257143 abi 1,454286 bc 45,571429 bcAT4-110,101429 bc 1,580000 bc 15,611428 ab 44,714286 bcAT10-6,20,102857 bc 1,547143 bc 16,541429 ab 66,571429 bAT10-200,061429 c 0,704286 d 12,191428 b 46,571429 bcAT11-70,181429 a 2,867143 a 18,045714 a 122,285714 aAT11-9A0,147143 ab 2,425714a 17,930000a 111,571429a

Coef. Var.47,798% 37,007%31,532% 51,972%

Para semelhante finalidade, sementes de Arabidopsis foram pré-cultivadas em meio de seleção contendo sacarose por 14 dias e em seguidatransferidas para perlita e cultivadas por 49 dias em condições de dia longo.O peso fresco de broto e raiz foram quantificados e a proporção de brotopara raiz foi determinada para 7 plantas de cada linhagem independente. 0peso de síliqua por planta foi determinado uma vez que as síliquas estavamsecas. WTCoIO1 Arabidopsis selvagem; AT4-11, pyk10:At5g46940\ AT10-6.2e 20, cryptic:At5g46940; AT11 -7 e 9A, cryptic:At1 g4796a, AT15, pyk10:Cin1.

Como um exemplo do fenótipo das linhagens de inibidor de in-vertase, fotografias de AT11-7 e 9A são mostradas na Fig. 9, corresponden-do ao último experimento de caracterização descrito. As imagens mostramque plantas das linhagens transgênicas são maiores e têm um número maiorde folhas e brotos do que as plantas selvagens. Embora o peso de broto es-teja aumentada em plantas das linhagens transgênicas, o aumento na pro-dução de semente não é somente devido à massa de broto aumentada masalém disso o número de síliqua e conseqüentemente o peso de síliqua porpeso fresco de broto está aumentado. Como um exemplo, no experimentoanalisado na Tabela 4, o peso seco de síliqua (mg)/ peso fresco de broto (g)foi aumentado de 21,28 em plantas selvagens para 42,76 e 46,10 em AT11 -7 e AT11 -9A respectivamente. Por esta razão, nós determinamos em umexperimento independente o número de síliqua por peso fresco de broto emplantas selvagens e transgênicas pré-cultivadas em placas de glucose, nos-sas condições de pré-crescimento de rotina, e subseqüentemente cultivadasem perlita por 40 dias. Os resultados do teste de Duncan para estes doisparâmetros são mostrados na Tabela 5.

Tabela 5: Teste de alcance múltiplo de Duncan para valores médios dasplantas: As plantas são agrupadas em grupos de significância designadospor uma letra. As linhagens com a mesma letra não são significativamentediferentes.

Linhagem Número de síliqua / peso fresco de broto Peso seco de síliqua(mg) / peso fresco de broto (g)

<table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44</column></row><table>

Para semelhante finalidade, sementes de Arabidopsis foram pré-cultivadas em meio de seleção contendo glucose pfor 14 dias e em seguidatransferidas para perlita e cultivadas por 40 dias em condições de dia longo.O número e o peso seco de síliqua foram quantificados, e o número de síli-qua / peso fresco de broto e peso seco de síliqua / peso fresco de broto fo-ram determinados para 20 plantas de cada linhagem independente. O pesoseco de síliqua foi determinado uma vez que" as síliquas estavam secas.WTCoIO, Arabidopsis selvagem; AT11-7 e 9A, cryptic:At1 g47960\ AT15,pyk10:Cin1.

Na Fig. 9 o fenótipo de plantas independentes de WTCoIO,AT11-7 e AT11-9A. Para semelhante finalidade, plantas de Arabidopsisio-ram pré-cultivadas em meio de seleção contendo sacarose e transferidaspara perlita depois de 14 dias. Foram obtidas fotografias depois de 49 diasde crescimento em condições de dia longo, no momento da coleta do mate-rial da planta.

Exemplo 4: Fenótipo de plantas transgênicas em outras condições decrescimento

De modo a estudar se o fenótipo das linhagens transgênicas foiassociado às condições de crescimento particulares usadas nos experimen-tos de caracterização, as plantas foram cultivadas em diferentes condiçõesde crescimento e o fenótipo foi analisado em termos de peso fresco de brotoe da raiz, proporção de broto para raiz e produção de sementes. Plantas dasduas linhagens transgênicas selecionadas, AT11-7 e AT11-9A, e plantasCoIO selvagens foram cultivadas em condições de dia longo no solo, condi-ções de dia curto em perlita e as condições previamente descritas, condi-ções de dia longo em perlita, para comparação.

1. Crescimento das plantas em perlita e condições de dia curto

Para a análise do fenótipo da planta em condições de dia curto(8 h de luz/16 h de escuridão), as sementes foram pré-cultivadas em meiode seleção com glucose por 14 dias em condições de dia longo, e em segui-da transferidas para perlita em condições de dia curto por 43 dias. Nestahora foram medidos o peso fresco de broto e de raiz e a produção de se-mente. Conforme mostrado na Fig. 10 (Foram obtidas fotografias depois de43 dias de crescimento em condições de dia curto, no momento da coleta dematerial da planta. 10 plantas de cada linhagem foram usadas neste experi-mento). Plantas das duas linhagens transgênicas em análsise são ligeira-mente maiores e têm um número aumentado de folhas em relação aos tiposselvagens. Além disso, uma alta percentagem das plantas transgênicas flo-resceu (100% em AT11-7 e 70% de AT11-9A) e apresentou algumas síli-quas, ao passo que somente 40% das plantas selvagens floresceram e a-presentaram um número reduzido de síliquas.

A análise estatística foi difícil de realizar devido à alta variabili-dade do número e do peso fresco de síliqua entre plantas da mesma linha-gem. No entanto, a proporção de broto para raiz foi aumentada de 12,73 ±2,62 em tipos selvagens para 17,80 ± 4,18 e 15,06 ± 3,30 em AT11-7 eAT11-9A respectivamente. Este aumento foi significativo de acordo com oteste de Duncan. O número de síliqua por peso fresco de broto foi 2,04 ±2,69 em tipos selvagens, 12,98 ± 7,06 e 5,60 ± 6,42 em AT11-7 e AT11-9Arespectivamente, considerando todas as plantas. A alta variabilidade no tiposelvagem e AT11-9A foi devida à presença de algumas plantas que não ti-nham produzido qualquer síliqua no momento analisado. A análise de perío-dos de crescimento mais longos pode resultar em uma diferença mais clarano fenótipo, revelando diferenças na produção de sementes entre o tipo sel-vagem e transgênicas uma vez que todas as plantas floriram, e possibilitan-do uma análise estatística mais confiável dos diferentes parâmetros em es-tudo.

2.Crescimento de plantas no solo e em condições de dia longo

Plantas cultivadas sobre o solo em condições de dia longo (16horas de luz / 8 horas de escuridão) apresentaram crescimento aceleradocom relação a perlita e portanto o tempo de crescimento para a análise feno-típica foi reduzido para 30 dias. Plantas transgênicas apresentaram cresci-mento reduzido em comparação com plantas cultivadas com perlita, comuma extensão ligeiramente reduzida com relação a plantas selvagens e au-mentada ramificação de brotos, mas ainda foi observada uma diferença naproporção de broto para raiz em relação aos tipos selvagens (Fig. 11: Fenó-tipo de plantas de WTCoIO, AT11 -7 e AT11-9A. Plantas de Arabidopsis fo-ram pré-cultivadas em meio de seleção contendo glucose e transferidas paraperlita depois de 14 dias. Foram obtidas fotografias depois de 30 dias decrescimento em condições de dia longo, no momento da coleta do materialda planta. Foram analisadas 6 plantas de cada uma das linhagens em estu-do.). Esta diferença foi essencialmente devida a um peso das raízes signifi-cativamente reduzido em relação às plantas selvagens e um peso de brotonão alterado significativamente (Tabela 6). Não obstante, estes dados de-vem ser cuidadosamente considerados, uma vez que a recuperação dasraízes do solo é difícil em comparação com a perlita e pode ocorrer algumaperda de material durante a coleta das raízes.

A análise dos dados de acordo com o teste de Duncan mostrouque embora não houvesse variação significativa do número ou peso de síli-qua por planta entre tipos selvagens e transgênicos, o número e o peso fres-co de síliqua por grama de peso fresco de broto foi significativamente au-mentado, sendo aproximadamente duas vezes o valor obtido em plantasselvagens (Tabela 6).Tabela 6: Teste de alcance múltiplo de Duncan para valores médios de plan-tas: As plantass são agrupadas em grupos de significência designados poruma letra. As linhagens com a mesma letra não são significativamente dife-rentes.

<table>table see original document page 47</column></row><table>5 ...........................................................................-.........................

WTCoIO 0,186000 a 1,688333 a 9,848333 b 21,060000 b 67,346670 bAT11-7 0,075000 b 1,310000 ab 17,589999 a 43,741664 a

148,926666 a

AT11 -9A 0,065000 b 0,948333 b 16,048333 a 45,190002 a158,349996 a

Coef. Var. 42,75% 28,58%34,61% 33,90% 36,07%

Para semelhante finalidade, sementes de Arabidopsis foram pré-cultivadas em meio de seleção contendo glucose por 14 dias e em seguidatransferidas para o solo e cultivadas por 30 dias em condições de dia longo.O número e o peso fresco de síliqua foram quantificados, e o número de síli-qua / peso fresco de broto e peso fresco de síliqua / peso fresco de brotoforam determinados para 6 plantas de cada linhagem independente. O pesofresco de síliqua foi determinado na hora da coleta . WTCoIO, Arabidopsisselvagem; AT11 -7 e 9A, cryptic:At1 g47960.

Este experimento de caracterização mostra que embora o tama-nho das plantas transgênicas seja reduzido no solo com relação às plantasselvagen, ao invés de aumentado conforme observado em perlita, a propor-ção de broto para raiz e a produção de sementes por peso fresco de brotoainda estão aumentados.

3.Crescimento de plantas em perlita e condições de dia longoComo uma comparação para crescimento, plantas de WTCoIO eas duas linhagens transgênicas foram cultivadas como em experimentosanteriores. Mudas pré-cultivadas em placas de seleção contendo glucoseforam transferidas para perlita e cultivadas por 40 dias adicionais. Foramdeterminados o peso fresco de broto, raízes e síliqua bem como o númerode síliqua e os parâmetros correspondentes sob análise foram calculados(incluídos na Tabela 7). Para semelhante finalidade, sementes de Arabidop-sis foram pré-cultivadas em meio de seleção contendo glucose por 14 dias eem seguida transferidas para perlita e cultivadas por 40 dias em condiçõesde dia longo. O peso fresco de broto e raízes foram medidos em 20 plantasde cada linhagem independente. O peso fresco de síliqua foi determinado nahora da coleta. WTColO, Arabidopsis selvagem; AT11-7 e 9A, cryp-tic:At1 g47960. Mais especificamente, sementes de Arabidopsis foram pré-cultivadas em meio de seleção contendo glucose por 14 dias e em seguidatransferidas para perlita e cultivadas por 40 dias em condições de dia longo.

O número e peso fresco de síliqua por planta foram medidos na hora da co-leta. WTColO, Arabidopsis selvagem; AT11-7 e 9A, cryptic:At1 g47960.Tabela 7: Teste de alcance múltiplo de Duncan para valores médios de plan-tas: As plantass são agrupadas em grupos de significência designados poruma letra. As linhagens com a mesma letra não são significativamente dife-rentes.

<table>table see original document page 49</column></row><table>

Conforme observados nos experimentos de caracterização ante-riores, a proporção de broto para raiz foi significativamente aumentada emplantas transgênicas em relação aos tipos selvagens muito embora, confor-me aconteceu com a caracterização em solo prévia, esta proporção fossemaior em plantas selvagens neste experimento do que em caracterizaçõesanteriores com plantas cultivadas em perlita (Tabelas 3 e 4). Ainda o aumen-to na proporção de broto para raiz é devido ao aumentado peso fresco debroto em plantas transgênicas, ao passo que o peso fresco da reiz não foisignificativamente alterado. Os valores do peso de broto em linhagens trans-gênicas foram comparáveis com os obtidos em experimentos de caracteriza-ção anteriores em condições similares (Tabela 3.1), mas no caso de plantasselvagens foi produzido um aumento em relação a outras caracterizaçõesresultando no aumento mencionado na proporção de broto para raiz. Estesresultados também confirmam que o crescimento global das plantas estáaumentado tanto no tipo selvagem quanto nas linhagens transgênicas quan-do é feito pré-crescimento em placas de seleção contendo sacarose em re-lação à glucose (vide dados na Tabela 3.4 em comparação com a Tabela 3 e 7).

Com relação à produção de sementes, foi observado um signifi-cativo aumento no número ou no peso fresco de síliqua por pero fresco debroto com respeito às plantas selvagens para as duas independent linha-gens transgênicas sob análise (Tabela 7). Os aumentos com respeito ao tiposelvagem são proporcionais aos observados em um experimento anteriorfeito nas mesmas condições (vide a Tabela 5 para comparação), levando emconta que no experimento anterior foi determinado o peso seco de síliqua aoinvés de peso fresco. Neste caso, muito embora não tenham sido mostradosos resultados, as alterações do peso fresco de síliqua por peso fresco debroto foram proporcionais às mostradas para peso seco na Tabela 5Tabela 8: Teste de alcance múltiplo de Duncan para valores médios de plan-tas: As plantass são agrupadas em grupos de significência designados poruma letra. As linhagens com a mesma letra não são significativamente dife-rentes.

<table>table see original document page 50</column></row><table>

O número e o peso fresco de síliqua por planta também estãoaumentados em relação a tipos selvagens no experimento real (Tabela 7) demodo diferente das plantas cultivadas no solo, embora o aumento fosse me-nor do que em plantas pré-cultivadas em sacarose. O fenótipo das plantas émostrado na Fig. 12 (Fenótipo das plantas de WTCoIO, AT11-7 e AT11-9Adepois de 40 dias de crescimento em condições de dia longo. Plantas deArabidopsis foram pré-cultivadas em meio de seleção contendo glucose etransferidas para perlita depois de 14 dias. Foram obtidas fotografias depoisde 40 dias de crescimento em condições de dia longo.)Exemplo 5:Determinação de atividade de inibidor de invertase em raí-zes de plantas transgênicas

Conforme mostrado aqui, neste requerimento de patente, análi-se Northern blot demonstrou que efetivamente as linhagens transgênicastêm um aumento da expressão do inibidor de invertase correspondente comrelação às plantas selvagens. Este aumento reflete o acúmulo de RNA men-sageiro para o gene correspondente, mas não comprova a atividade da en-zima sobre a inibição de invertases. A determinação da inibição da atividadede invertases em raízes pelo inibidor em um teste "in vitro" apresenta a difi-culdade de que o teste geralmente é realizado em condições ótimas onde aconcentração de açúcar não é a concentração real presente na raiz, além doefeito de proteção descrito da sacarose sobre inibição de invertase em umaconcentração menor do que aquela usada na prova de atividade (Rausch eGreiner, 2004). Além disso, a determinação da atividade de invertase em umdeterminado estágio de crescimento pode não apresentar necessariamentediferenças entre tipos transgênicos e selvagens, devido à atividade espaço-temporal do promotor usado para orientar a expressão genética. Ao invés,alterações da atividade de invertase em estágios iniciais de desenvolvimentopodem alterar o crescimento da planta e assimilam particionamento, resul-tando nos fenótipos observados. Além disso, Greiner et al. (1999) reporta-ram que a estabilidade dos complexos formados entre invertases e os inibi-dores durante a preparação pode depender de fatores tecido específicos. Aanálise de atividade de invertase vacuolar em plantas de batata transgênicasque expressaram ectopicamente um inibidor de invertase de tabaco mostrouuma reduzida atividade nas folhas mas não em tubérculos transgênicos(Greiner et al., 1999), muito embora os níveis de transcriptos de inibidor deinvertase fossem claramente aumentadas em ambos os órgãos em relação aplantas controle. Este resultado foi explicado pelos autores com base emuma diferente estabilidade do complexo em tubérculos em relação às folhas.Por esta razão, a determinação dos níveis de proteína do inibidor de inverta-se por uso de um anticorpo específico seria de interesse. No entanto, até omomento não há bom anticorpo disponível. Portanto, nós agora temos porobjetivo obter anticorpos contra o inibidor de invertase por expressão heteró-loga do At1g47960em E.coli.

Conforme previamente mencionado, dos dois inibidores de in-vertase de Arabidopsis usados nestes estudos AtC/VIF1 (At1g47960) inibeespecificamente a atividade de invertase vacuolar em provas in vitro, aopasso que AtC/VIF2 (At5g46940) inibe ambas embora com uma maior afini-dade para invertase vacuolar do que para invertase da parede celular (Linket al., 2004). No entanto, até o momento a localização intracelular destasproteínas não foi analisada. Como uma tentativa de analisar o efeito do inibi-dor de invertase sobre a atividade de invertase nas raízes, nós inicialmentemedimos a atividade de invertase total em extratos de raízes de plantas sel-vagens e transgênicas das duas linhagens selecionadas, AT11-7 e AT11-9A(AtC/VIF1), e AT4-11 (AtC/VIF2). Os resultados mostraram que não houvevariação significativa da atividade de invertase da parede celular entre asraízes de plantas controle e plantas transgênicas, nem tampouco para ativi-dade de invertase vacuolar embora com um ligeiro aumento nas plantas deinibidor de invertase AtC/VIF1 (dados não mostrados). Conforme menciona-do anteriormente, alguma dissociação do complexo formado entre a inverta-se e o inibidor correspondente pode ocorrer durante a preparação dos extra-tos e a estabilidade deste complexo pode depender de fatores tecido especí-ficos presentes na raiz. De modo a evitar possíveis problemas de estabilida-de do complexo durante o procedimento de isolamento, foi desenvolvidauma prova de extrato misto na qual uma alíquota de um extrato de raízes deuma planta transgênica foi misturado com uma alíquota de um extrato defolhas de uma planta selvagem. Esta mistura foi feita em um volume final de570 μΙ em tampão de fosfato pH 4,5, e incubada por 30 minutos a 37QC paraa formação do complexo entre a invertase e o inibidor proteináceo. Depoisda incubação, foi adicionada sacarose em uma concentração final de 5 mMe a reação foi incubada a 26QC durante 30 min, para degradação de sacaro-se mediada por invertase. Deste modo, a adição de sacarose depois da eta-pa de pré-incubação deve prevenir possível efeito de proteção da sacarosesobre a inibição da invertase (Weil et al., 1994; Greiner et al., 1998). Depoisda incubação, a reação foi interrompida em gelo e a glucose liberada foi me-dida por uso do reagente GOD (Roitsch et al., 1995). A atividade de inverta-se na mistura foi comparada com o valor adicionado do extrato de folhas edo extrato de raízes incubados separadamente. Embora somente tenhamsido feitos até o momento testes preliminares, os resultados mostraram umefeito inibidor de invertase dos extratos de raízes transgênicas. Como umexemplo, a incubação da fração solúvel de um extrato de folhas com a fra-ção solúvel de um extrato de raízes das linhagens At1g47960 resultou em79% de atividade de invertase com respeito ao valor adicionado. Para a fra-ção solúvel de At5g46940, os valores na prova de extratos mistos foram86% do valor adicionado dos extratos correspondentes. Em uma prova mistacom um extrato de proteína solúvel de raízes selvagens o valora da ativida-de de invertase foi 123% do valor adicionado. Os resultados sugerem queefetivamente a atividade do inibidor de invertase está aumentada na fraçãosolúvel de raízes transgênicas. Mas até o momento, devido à limitação dematerial disponível, não foram feitos testes com a fração da parede celularde material de raízes transgênicas.

Estes resultados sugeriram que as provas de extratos mistospodem ser um modo para determinar a atividade de inibidor de invertase emraízes de linhagens transgênicas. No entanto, a limitação do material de raí-zes disponível torna difícil melhorar as condições na prova. Como uma fer-ramenta para estabelecer a prova, foram usadas folhas de plantas de tabacotransgênicas expressando um inibidor de invertase apoplásmico (Greiner etal., 1998) sob controle de um promotor indutível de citocinina (Lin6), usadasno projeto de pesquisa previamente descrito sobre o papel da invertase so-bre o retardo da senescência mediado por citocinina (Balibrea-Lara et al.,2004). As folhas foram infiltradas com uma solução de MS-SiIwet contendocinetina (30 pg/L) e as proteínas foram extraídas 3 h depois de infiltração.Foi mostrado que o inibidor de invertase expressado nestas plantas está Io-calizado na parede celular (Weil et al., 1994), portanto foi usada fração deproteína insolúvel nas provas. A fração solúvel foi usada como um controleonde não deve ser observado efeito sobre valores adicionados de extratosincubados independentemente. A disponibilidade de maiores quantidades dematerial neste caso possibilitou a concentração de proteínas através de umacoluna Centricon 10K, com um fator de concentração de 11,6 e 21,7 na fra-ção solúvel e insolúvel das folhas tratadas, respectivamente. Extratos mistosde fração da parede celular de folhas selvagens e da fração da parede celu-lar concentrada de folhas transgênicas infiltradas apresentaram 70% de ati-vidade de invertase com respeito ao valor adicionado de reações indepen-dentes correspondentes (consideradas como 100%). Foi observada reduçãosimilar com uma fração da parede célula não concentrada de folhas transgê-nicas infiltradas, mas com uma proporção de 4:1 de volume da fração inso-lúvel transgênica com respeito à fração solúvel selvagem. Não foram obtidasdiferenças com respeito ao valor adicionado quando frações solúveis de fo-lhas transgênicas foram usadas em combinação com a fração da paredecelular de folhas selvagens, de acordo com a localização do transgene nafração da parede celular. Até o momento, a concentração de sacarose naprova para atividade de invertase foi de 5 mM, bastante acima da Km de in-vertases para sacarose, de modo a medir a atividade de invertase máxima.

Nós realizamos as provas na presença de uma concentração menor de sa-carose, 1 mM, de modo a ver se o efeito do inibidor sobre a atividade de in-vertase é mais claramente detectado. A atividade de invertase de uma fra-ção da parede celular de folhas selvagens combinada com uma fração daparede celular concentrada de folhas transgênicas foi 58% do valor adicio-nado, ao passo que não foram observadas diferenças para os valores adi-cionados para uma fração solúvel concentrada de folhas transgênicas.

Quando foi usado um extrato transgênico de parede celular não concentra-do, os valores na prova mista foram de 55 a 72% do valor adicionado. Extra-tos mistos com uma fração solúvel concentrada / não concentrada de folhastransgênicas, em combinação com fração da parede celular de folhas selva-gens, não apresentaram diferença na atividade de invertase com respeitoaos valores adicionados. Estes resultados sugerem que este método podeser adequado para a determinação da inibição de invertase por inibidor deinvertase. A atividade do inibidor de invertase será avaliada nas diferenteslinhagens transgênicas por uso de extratos mistos, deste modo possibilitan-do não somente a determinação da inibição da atividade de invertase mastambém a localização da proteína para a parede celular ou fração solúvel,embora os resultados obtidos até o momento indiquem a presença de ativi-dade inibitória na fração solúvel para ambos os inibidores de invertase usa-dos nos transgênicos.

Exemplo 6:Aumentada resistência de raízes de Arabidopsis thalianatransgênica contra infecção por Plasmodiophora brassicae

Plantas de A. thaliana transgênica expressando

a) Promotor pyk10:AtC/VIF2; ou

b) crypticT80: AtC/VIF2

foram geradsa de acordo com o procedimento experimental re-sumido no exemplo 1.

Resistência das raízes das duas cepas de A. thaliana foram tes-tadas como se segue:

Plantas de quatorze dias de idade cultivadas sob condições deestufa ou sob ambiente controlado (21 °C, 16 h de luz, 100 Imol fótons/s/m2)foram inoculadas rotineiramente injetando o solo em torno de cada plantacom 2 ml de uma suspensão de esporos em repouso do patógeno com umaoncentração padrão de 106 esporos / ml de acordo com Fuchs e Sacristan(1996). Foram escolhidos outros momentos de inoculação para os experi-mentos respectivos e são dados na seção de resultados.

Os sintomas de doenças foram avaliados 28 dias depois da ino-culação (dai) usando uma escala consistindo de cinco classes de acordocom Klewer et al. (2001): O (sem sintomas), 1 (deformações (clubs) muitopequenas, essencialmente sobre raízes laterais que não prejudicam a raizprincipal), 2 (pequenas deformações cobrindo a raiz principal e poucas raí-zes laterais), 3 (deformações de tamanho médio a maiores, também incluin-do a raiz principal, o crescimento da planta pode ser prejudicado), 4 (váriasdeformações em raiz lateral, principal ou roseta, finas raízes completamentedestruídas, o crescimento da planta é afetado). O índice de doença (Dl) foicalculado usando a escala de cinco graus de acordo com a fórmula: Dl =(1 n1 + 2·η2 + 3·η3 + 4·η4) · 100/4 . Nt, onde η1 a η4 é ο número de plantas naclasse indicada e Nt é o número total de plantas testadas.

Os resultados são representados nas Figs. 34 e 35. Conformepode ser deduzido a partir da Fig. 34, as raízes de plantas transgênicas in-fectadas por Plasmodiophora brassicae apresentaram um aumento na resis-tência.

Em contraste, linhagens KO únicas não foram afetadas significa-tivamente conforme representado na Fig. 35.

Exemplo 7:lnfecção de raízes de tabaco (Nicotiana tabacum) pelo fungomycorhiza Glomus intraradices: Efeito sobre a micorrização

Arbuscular mycorrhiza (AM) representa uma associação de in-terdependência disseminada entre fungos transportados pelo solo do filoGlomeromycota e a maioria das plantas da terra.

Nós estudamos o impacto de uma reduzida disponibilidade dehexose sobre a micorrização de N. tabacum ou M. truncatula. Foi obtido re-duzido teor de hexose nas raízes por expressão, específica para raiz, deinibidor de invertase de A. thaliana. Inibindo especificamente a atividade deinvertase da raiz, pode ser documentada a necessidade de suprimento dehexose suficiente para crescimento de AM. Plantas de N. tabacumpyk10::lnvlnh com reduzida atividade de invertase ácida nas raízes apresen-taram uma micorrização diminuída. À medida que esta amostra proporcionaoutro exemplo de evidência de que a interação entre microorganismos eplantas pode ser afetada em uma maneira negativa. Com base nesta obser-vação também a interação entre plantas e patógenos de plantas tais comoPlasmodiophora pode ser afetada e portanto é proporcionada uma estratégiapara a proteção de plantas com base na inibição da atividade de invertase.Construções de plasmídes, transformação de planta estável e determinaçãode atividades de invertases de planta

O promotor pyk10 foi amplificado por PCR usando DNA genômi-co e subclonado no vetor pTF2-6 (T. Fatima e T. Roitsch, não publicado)para gerar pMB1-18. O cDNA codificando AtC/VIF2 (at5g64620) foi amplifi-cado por RT-PCR usando RNA total, inicialmente clonado no vetor pBlues-cript KS+ para gerar pMCG2, e subseqüentemente subclonado do mesmocomo fragmento Acc65l-Kpnl no vetor binário pTF2-6 para gerar o plasmídeopMCG4. Para gerar uma fusão transcricional entre o promotor pyk10 e ocDNA codificando AtC/VIF2, um fragmento de promotor pyk10 de 1467 bp foisubclonado como fragmento Acc65l de pMB1-18 no vetor binário pMCG4,Iinearizado por Acc65l, para pMCG6 gerado. O constructo pyk10::lnvlnh foitransformado em tabaco (Nicotiana tabacum cv. SR1) usando Agrobacteriumtumefaciens cepa LBA4404 e procedimentos de transformação de rotina(Horsch et al. 1985). Linhagens transgênicas expressando a fusãopyk10::lnvlnh foram caracterizadas por PCR (M. Gonzalez e T. Roitsch, nãopublicado).

Os resultados deste tipo de experimentos são representadosnas Fig. 36 a 38. Mais especificamente, a Fig. 36 mostra o resultado de umaanálise de plantas de tabaco transgênicas com expressão, específica pararaiz, de um inibidor de invertase. AeB, Atividade de invertase da paredecelular (A) e vacuolar (B) em raízes de plantas SR1 selvagens e plantas NTpyk10::lnvlnh de duas linhagens independentes (98-1-10 e 98-4-1) 3,5 e 5semanas depois de inoculação com G. intraradices. C, Teor de glucose efrutose das raízes. D, Proporção dos teores de glucose e frutose para o teorde sacarose das raízes. E, Grau de micorrização. Para possibilitar a análiseestatística, o grau de micorrização em percentagem da extensão da raiz foideterminado para cada sistema de raiz em 50 a 100 peças de raiz de cada 1cm de extensão. As plantas foram em dois experimentos independentes ino-culadas com G. intraradices ou 2,5 semanas depois da semeadura e colhi-das 3,5 semanas depois ou inoculadas 4 semanas depois da semeadura ecolhidas 5 semanas depois. Os dados são apresentados como valores mé-dios + desvio padrão (em 3,5 semanas: η = 5; em 5 semanas: η = 3). Os da-dos das linhagens transgênicas foram pareados comparados com as selva-gens pelo teste ide Student. *P<0,05, **P<0,01. F, Estruturas fúngicas cora-das com tinta em uma planta selvagem e uma planta NT pyk10::lnvlnh dalinhagem 98-1-10, cada uma 5 semanas depois da inoculação. As barrasrepresentam 100 pm.A Fig. 38 mostra o resultado de uma análise de biomassa deplantas NT pyk10::lnvlnh. A proporção de raiz para broto do peso fresco deplantas SR1 selvagens não-micorrizais de 6 semanas de idade e plantas deduas linhagens NT pyk10::lnvlnh independentes (98-1-10 e 98-4-1). São da-dos os valores médios + desvio padrão, (n £ 33).

A Fig. 38 mostra o resultado de determinar atividades de inver-tase em plantas não-micorrizais e micorrizais NT pyk10::lnvlnh. A, Atividadesde invertase ligada à parede celular em raízes. B, Atividades de invertasevacuolar invertase activities em raízes. C, Atividades de invertase citosólicainvertase activities em raízes. D, Atividades de invertase apoplásica em fo-lhas. Plantas SR1 selvagens e plantas das duas linhagens de NTpyk10::lnvlnh 98-1-10 e 98-4-1 foram inoculadas com G. intraradices 4 se-manas depois da semeadura e colhidas 3 e 5 semanas depois. Os dadossão apresentados como valores médios + desvio padrão (n = 3). Os dadosdas plantas transgênicas não-micorrizais e micorrizais foram comparadoscom as plantas selvagens não-micorrizais e micorrizais, respectivamente,usando o teste ide Student. *P<0,05, **P<0,01.

Conforme confirmado e ilustrado, respectivamente, pelos resul-tados indicados nas Figs. 36 a 38, devido a um subsuprimento geral da raizcom carbono por carga de floema defeituosa resultou em reduzida micorri-zação, a análise de plantas com reduzida atividade de invertase e reduzidodescarregamento de floema complementam este estudo. Este aspecto foiimplementado expressando o gene de Arabidopsis AtC/VIF2 codificando pa-ra um inibidor de invertases ácidas (Link et al., 2004) sob controle do promo-tor pyk10 de Arabidopsis específico para raiz e para muda (Nitz et al., 2001)em plantas transgênicas de N. tabacum (NT pyk10::lnvlnh). Foi visto queproteína AtC/VIF2 recombinante afeta atividades de invertases apoplásica evacuolar in vitro (Link et al, 2004). Plantas das duas linhagens NTpyk10::lnvlnh independentes, 98-1-10 e 98-4-1, apresentaram reduzidas ati-vidades de invertase apoplásica na raiz (Fig. 36 A). A atividade de invertasevacuolar foi inibida in vitro somente em uma linhagem nos estágios de de-senvolvimento posteriores (Fig. 36 B). Os níveis de atividade de invertasecitosólica neutra não foram afetados; o mesmo foi verdade para invertasesem folhas (Fig. 38). Plantas não-micorrizais mostraram uma característicasimilar de atividades de invertase (Fig. 38). De acordo com a reduzida ativi-dade de invertase apoplásica, as raízes tiveram menors teores de glucose efrutose (A Fig. 36 C mostra a soma de ambas hexoses) e uma proporçãoreduzida de ambas hexoses para sacarose (Fig. 36 D). No entanto, em con-traste com tabaco rolC::ppa, plantas com superexpressão específica pararaizde inibidor de invertase não foram alteradas em seu crescimento vegeta-tivo e sua biomassa de raiz ou broto comparada com plantas selvagens, pormeio da qual a Fig. 37 mostra a proporção de raiz para broto do peso frescoconforme determinado em princípio, conforme descrito na parte de exemplosaqui, neste requerimento de patente. Não obstante, correspondendo aosmenores níveis de hexose nas raízes de plantas pyk10::lnvlnh nós desco-brimos um menor nível de micorrização com G. intraradices (Fig. 36 E). Alémdisso, raízes colonizadas de plantas NT pyk10::lnvlnh apresentaram umamenor densidade de estruturas fúngicas comparadas com o tipo selvagem(Fig. 36 F) refletida por uma significativa redução no rRNA específico de fun-go 5 semanas depois de inoculação (dados não mostrados). Isto indica queo suprimento de carbono na interação AM depende da atividade de inverta-ses apoplásicas que liberam hexoses.

Referências:

Do início ao fim da presente especificação foram citadas as se-guintes referências cuja descoberta é incorporada aqui, a este requerimentode patente, por meio de referência em sua totalidade.

Balibrea Lara M.E., González Garcia M.-C., Fatima T., EhnessR., Lee T.K., Proles R., Tanner W. and Roitsch T. (2004). Extracellular inver-tase is an essential component of cytokinin-mediated delay of senescence.PIantCeII 16, 1276-1287.

Bret-Harte M. and Silk W.K. (1994). Nonvascular, symplasmicdiffusion of sacarose cannot satisfy the carbon demands of growth in theprimary root tip of Zea mays L. Plant Physiol. 105, 19-33.

Eschrich W. (1980). Free space invertase, its possible role in p-hloem unloading. Ber. Deutsch. Bot. Ges. Bd. 93, S363-378.

Farrar J.F. and Jones D.L. (2000). The control of carbon acquisi-tion by roots. New Phytol. 147, 43-53.

Fuchs, H., M. D. Sacristan (1996): Identification of a gene in A-rabidopsis thaliana controlling resistance to clubroot (Plasmodiophora brassi-cae) and characterization of the resistance response. Mol. Plant Microbe In-teract. 9, 91-97.

Gatz C, Lenk I (1998) Promoters that respond to chemical indu-cers. Trends in Plant Science 3, 352-358.

Goetz M., Godt D.E., Guivarc'h A., Kahmann U., Chriqui D. andRoitsch T. (2001). Induetion of male sterility in plants by metabolic enginee-ring of the carbohydrate supply. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 98, 6522-6527.

Greiner S., Krausgrill S. and Rausch T. (1998). Cloning of a to-bacco apoplasmic invertase inhibitor: Proof of function of the recombinantprotein and expression analysis during plant development. Plant Physiol.116,733-742.

Greiner S., Rauseh T., Sonnewald U. and Herbers K. (1999). Ec-topic expression of a tobacco invertase inhibitor homolog prevents cold-induced sweetening of potato tubers. Nature Biotech. 17, 708-711.

Heyer A.G., Raap M., Sehroeer B., Marty B. and Willmitzer L.(2004). Cell wall invertase expression at the apical meristem alters floral, ar-chitectural, and reproductive traits in Arabidopsis thaliana. Plant J. 39, 161-169.

Klewer A., H. LuerBen, H. Graf, J. Siemens (2001): RFLP mar-kers to characterise Plasmodiophora brassicae single-spore-isolates withdifferent virulence patterns. J. Phytopathol. 149, 1-7.

Link M, Rauseh T, Greiner S (2004) In Arabidopsis thaliana, theinvertase inhibitors AtC/VIF1 and 2 exhibit distinct target enzyme specificitiesand expression profiles. FEBS Lett 27: 105-109.

Link M., Rauseh T. and Greiner S. (2004). In Arabidopsis thalia-na, the invertase inhibitors AtC/VIF1 and 2 exhibit distinct traget enzymespecificities and expression profiles. FEBS Lett. 573, 105-109.Miller Ε.Μ. and Chourey P.S. (1992). The maize invertase-deficient miniaturei seed mutation is associated with aberrant pedicel andendosperm development. Plant Cell 2, 1107-1119.

Nitz I, Berkefeld H, Puzio PS, Grundler FM (2001) Pyk10, a see-dling and root specific gene and promoter from Arabidopsis thaliana. PlantSci 161: 337-346.·

Rausch T. and Greiner S. (2004). Plant protein inhibitors of in-vertases. Biochim. Biophys. Aeta 1696, 253-261.

Roitseh T., Bittner M. and Godt D.E. (1995). Induetion of apo-plastic invertase of Chenopodium rubrum by D-glucose and a glucose analo-gue and tissue-specific expression suggest a role in sink-source regulation.Plant Physiol. 108, 285-294.

Roitseh T. and González M.-C. (2004). Funetion and regulationof plant invertases: sweet sensations. Trends Plant Sei. 9, 606-613.

Siemens, J., Nagel1 M., Ludwig-Müller, J., and Sacristán, M. D.2002. The interaction of Piasmodiophora brassicae and Arabidopsis thaliana:Parameters for disease quantification and screening of mutant lines. J. Phy-topath. 150:592-605.

Sturm A., Sebkova V., Lorenz K., Hardegger M., Lienhard S. andUnger C. (1995). Development- and organ-specific expression of the genesfor sacarose synthase and three isoenzymes of acid β-fructosidase in carrot.Planta 195, 601-610.

Tang G.-Q., Lüscher M. and Sturm A. (1999). Antisense repres-sion of vacuolar and cell wall invertase in transgenic carrot alters early plantdevelopment and sacarose partitioning. Plant Cell 11, 177-189.

Tymowska-Lalanne Z. and Kreis M. (1998). Expression of theArabidopsis thaliana invertase gene family. Planta 207, 259-265.

Von Schweinichen and Büttner M. (2005). Expression of a plantcell wall invertase in roots of Arabidopsis Ieads to early flowering and an in-crease in whole plant biomass. Plant Biol. 7, 469-475.

Weber H., Borisjuk L., Heim U., Sauer N. and Wobus U. (1997).A role for sugar transporters during seed development: molecular characteri-zation of a hexose and a sacarose carrier in fava bean seeds. Plant Cell 9,895-908.

Weil M., Krausgrill S., Schuster A. and Rausch T. (1994). A 17-kDa Nicotiana tabacum cell-wall peptide acts as in-vitro inhibitor of the cell-wall isoform of acid invertase. Planta 193, 438-445.

Wesehke W., Panitz R., Gubatz S., Wang Q., Radehuk R., We-ber H. and Wobus U. (2003). The role of invertases and hexose transportersin controlling sugar ratios in maternal and filial tissues in barley caryopsesduring early development. Plant J. 33, 395-411.

Wobus U. and Weber H. (1999). Sugars as signal molecules inplant seed development. Biol. Chem. 380, 937-944.

As características das presente invenção reveladas na especifi-cação, nas reivindicações e/ou nos desenhos podem ser tanto separada-mente quanto em qualquer combinação das mesmas ser material para reali-zar a invenção em várioas formas da mesma.

Listagem de Seqüência

<110> Julius-Maximilians-universitát würzburg

<i20> Métodos para aumentar a proporção de broto para raiz, a produçãode sementes e a resistência a doenças

<130> U 10022 PCT

<150> EP 06004640.6

<151> 2006-03-07

<160> 46

<170> Patentln version 3.1

<210> 1

<211> 407<212> DNA

<213> Brassica napus<400> 1

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<213> Brassica napus

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<400> 34

tccttcactt gttttaccag tataaccctg attcagctat ttggggaaat atcacatggg 60 gccatgcaat atccacggac ttgatccatt ggctttactt gcccttcgcc ttggttcctg 120 atcaatggta cgatatcaac ggtgtctgga ccgggtccgc gaccttccta cccgacggtc 180 agatcatgat gttatacacc ggtgatacca atgattacgt gcaggtgcaa aatcttgcgt 240 accccgccaa cttatcggat cccctcctca tcgactgggt caagtaccgg ggcaacccgg 300 tcatggttcc accacccggc attggtgtca aggactttag agacccaacg actgcttgga 360 ccggaccaca aaacgggcag tggctgctta ccatcgggtc caagattggt aaaacgggta 420 ttgcaattgt ttatggtact tccaacttca caaactttaa gctattggat ggagttttgc 480 atgcggttcc gggtacgggt atgtgggagt gtgtggactt ttacccggta tcaaccgatg 540 aggcaaacgg gttggacaca tcatataacg ggccaggtat aaagcatgtg ttaaaagcaa 600 gtttagatga cgataagcat gattactatg ctattgggac atatgacccg gtaaagaaca 660 aatggactcc tgataacccg caattggatg tgggtatcgg gttgagactg gactacggga 720 aatactacgc atccaaaacc ttcttcgaaa gga 753 <210> 35 <211> 753 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 35 tccttcactt gttctatcag tataaccctg attcagctat ttggggaaat atcacatggg 60 gccatgcaat atccacggac ttgatccatt ggctttactt gcccttcgcc ttggttcctg 120 atcaatggta cgatatcaac ggtgtctgga ccgggtccgc gaccttccta cccgacggtc 180 agatcatgat gttatacacc ggtgatacca atgattacgt gcaggtgcaa aatcttgcgt 240 accccgccaa cttatcggat cccctcctca tcgactgggt caagtaccgg ggcaacccgg 300 tcatggttcc accacccggc attggtgtca aggactttag agacccaacg actgcttgga 360 ccggaccaca aaacgggcag tggctgctta ccatcgggtc caagattggt aaaacgggta 420 ttgcaattgt ttatggtact tccaacttca caaactttaa gctattggat ggagttttgc 480 atgcggttcc gggtacgggt atgtgggagt gtgtggactt ttacccggta tcaaccgatg 540 aggcaaacgg gttggacaca tcatataacg ggccaggtat aaagcatgtg ttaaaagcaa 600 gtttagatga cgataagcat gattactatg ctattgggac atatgacccg gtaaagaaca 660 aatggactcc tgataacccg caattggatg tgggtatcgg gttgagactg gactacggga 720aatactacgc ttccaaaacc ttctacgaaa gga<210> 36<211> 753<212> DNA<213> Brassica napus<400> 36

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<210> 37

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<400> 46

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Claims

1. Método para aumentar a proporção de broto para raiz de umaplanta compreendendo a etapa deinibir a atividade de uma invertase no tecido da raiz da referidaplanta.

2. Método para aumentar a produção de semente de uma plantacompreendendo a etapa deinibir a atividade de uma invertase no tecido da raiz da referidaplanta.

3. Método para aumentar a resistância a uma doença de umaplanta compreendendo a etapa deinibir a atividade de uma invertase no tecido da raiz da referidaplanta.

4. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 3,em que a atividade da invertase é inibida ou por(d) um knock-down da invertase ou(e) nocaute da invertase, ou(f) um inibidor para a invertase.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o inibidor éativo no tecido da raiz da planta.

6. Método de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que o inibi-dor é um polipeptídeo.

7. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 4 a 6,em que o inibidor é codificado por um ácido nucléico.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o ácido nu-cléico está sob o controle de um elemento de transcrição e/ou um elementode translação, por meio da qual o referido elemento de transcrição e/ou oreferido elemento de translação possibilita a transcrição e/ou translação es-pecífica do ácido nucléico em tecido da raiz.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, por meio da qual oelemento de transcrição é um promotor, preferencialmente um promotor es-pecífico para raiz.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, por meio da qual opromotor é um promotor indutível.

11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, por meio daqual o promotor é selecionado entre o grupo compreendendo promotorpykl 0, promotor T80-críptico, e promotor WRKY6.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, por meio da qualo promotor é promotor T80-críptico.

13. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 4 a 12,em que o inibidor é selecionado entre o grupo compreendendo inibidores deinvertase de tabaco e inibidores de invertase de Arabidopsis, por meio daqual, preferencialmente, os inibidores de invertase de tabaco são seleciona-dos entre o grupo compreendendo NT-CIF1, Y12805; Nt-VIF, AY145781e/ou os inibidores de invertase de Arabidopsis são selecionados entre o gru-po compreendendo AtC/VIF1, At1g47960; AtC/VIF2, At5g64620, e AtC/VIF3, At3g17130.

14. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o knock-down é causado por silenciamento e/ou co-supressão de gene pós-transcricional.

15. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 14,em que a invertase é uma invertase selecionada entre o grupo compreen-dendo uma invertase solúvel, uma invertase vacuolar, uma invertase neutra /alcalina e uma invertase citoplasmática.

16. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 14,por meio da qual a invertase é uma invertase selecionada entre o grupocompreendendo uma invertase ligada à parede celular, e uma invertase ex-tracelular, apoplásmica mas não ligada à parede celular, por meio da qualpreferencialmente a invertase é uma invertase ligada à parede celular.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a inverta-se é uma invertase tendo uma seqüência de aminoácidos, por meio da quala seqüência de aminoácidos é codificada por um ácido nucléico o qual é se-lecionado entre o grupo de seqüências de ácido nucléico compreendendoseqüências de ácido nucléico SEQ. ID. Ng 1 a 14.

18. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a inverta-se é uma invertase tendo uma seqüência de aminoácidos, por meio da quala seqüência de aminoácidos é codificada por um ácido nucléico o qual é se-lecionado entre o grupo de seqüências de ácido nucléico compreendendoseqüências de ácido nucléico SEQ. ID. Nq 15 a 36.

19. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 4 a 18na extensão em que as reivindicações se referem à reivindicação 3, em quea doença da planta é uma doença envolvendo ou afetando o tecido da raiz

20. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 4 a 19na extensão em que as reivindicações se referem à reivindicação 3, em quea doença da planta é transferida ou causada por um patógeno.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o pató-geno é selecionado entre o grupo compreendendo Plasmodiophora brassi-cacae, Vertlcillium e nematódeos, por meio da qual o nematódeo preferenci-almente é Heterodera schachtii Schm.

22. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 19 a-21, em que a doença é selecionada entre o grupo compreendendo doençasas quais são causadas por ou associadas com um organismo selecionadoentre o grupo compreendendo Pythium aphanidermatum, Pythium ultimum,Phytophthora syringae P. undulata, Oxysporum f. sp. radicis-lycopersici, Me-Ioidogyne hapla, Phytophtora quercina e Rhizoctonia solani Kühn.

23. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 22,em que a planta é um membro da família de Brassicacae.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que a planta éselecionada entre o grupo compreendendo colza, repolho e couve chinesa.

25. Molécula de ácido nucléico, preferencialmente codificandopara uma invertase, tendo uma seqüência de ácido nucléico, por meio daqual be a seqüência de ácido nucléico é selecionada entre o grupo de se-qüências de ácido nucléico SEQ. ID. Nq 1 a 36, ou um ácido nucléico essen-cialmente complementar a essas.

26. Molécula de ácido nucléico a qual hlbridiza, preferencialmen-te sob condições estringentes, à seqüência de ácido nucléico de acordo coma reivindicação 25.

27. Molécula de ácido nucléico a qual, para para a degeneraçãodo código genético, hibridizaria, preferencialmente sob condições estringen-tes, ao ácido nucléico de acordo com a reivindicação 25 ou 26.

28. Polipeptídeo, preferencialmente uma invertase, codificadopor uma molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindi-cações 25 a 27.

29. Vetor compreendendo uma molécula de ácido nucléico deacordo com quaisquer das reivindicações 25 a 27.

30. Vetor de acordo com a reivindicação 29, por meio da qual ovetor é um vetor de planta, mais preferencial um vetor de expressão vegetal.

31. Vetor de acordo com a reivindicação 30, em que o vetorcompreende um promotor específico para raiz.

32. Célula, preferencialmente uma célula de planta, compreen-dendo molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindica-ções 25 a 27 e/ou um vetor de acordo com quaisquer das reivindicações 29a 31.

33. Tecido e/ou um órgão compreendendo uma molécula de á-cido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 25 a 27 e/ou umvetor de acordo com quaisquer das reivindicações 29 a 31 e/ou uma célulade acordo com a reivindicação 32.

34. Tecido e/ou órgão de acordo com a reivindicação 33, emque o tecido é um tecido da raiz e/ou o órgão é uma raiz.

35. Organismo, preferencialmente uma planta, compreendendouma molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindica-ções 25 a 27 e/ou um vetor de acordo com quaisquer das reivindicações 29a 31 e/ou uma célula de acordo com a reivindicação 32.

36. Uso de um constructo de ácido nucléico para a modificaçãodo genoma de uma planta, por meio da qual o constructo compreende(i) um promotor específico para raiz; e(j) um ácido nucléico codificando para um inibidor de inver-tase,em que o promotor e o ácido nucléico codificando para a inver-tase são encadeados operaveimente um ao outro.

37. Uso de um constructo de ácido nucléico para inibir a ativida-de ou presença de uma invertase, preferencialmente uma invertase em raize/ou tecido da raiz, por meio da qual o constructo compreende(k) um promotor específico para raiz; e(l) um ácido nucléico codificando para um inibidor de inver-tase,em que o promotor e o ácido nucléico codificando para a inver-tase são encadeados operaveimente um ao outro.

38. Uso de um constructo de ácido nucléico para aumentar aproporção de broto para raiz, produção de sementes e/ou resistência a do-ença de uma planta, por meio da qual o constructo compreende(m) um promotor específico para raiz; e(n) um ácido nucléico codificando para um inibidor de invertase,em que o promotor e o ácido nucléico codificando para a inver-tase são encadeados operaveimente um ao outro.

39. Uso de um constructo de ácido nucléico para a fabricação deum medicamento para o tratamento de uma planta doença, por meio da qualo constructo compreende(o) um promotor específico para raiz; e(p) um ácido nucléico codificando para um inibidor de inver-tase,em que o promotor e o ácido nucléico codificando para a inver-tase são encadeados operaveimente um ao outro.

40. Uso de acordo com a reivindicação 39, por meio da qual omedicamento é para terapia genética de uma planta.

41. Uso de acordo com a reivindicação 40, por meio da qual aplanta é uma célula de planta ou um tecido de planta, preferencialmente an-tes de regeneração para uma planta madura.

42. Uso de um constructo de ácido nucléico para a produção deuma planta transgênica, por meio da qual a planta transgênica preferencial-mente apresenta um ou mais de um aumento na proporção de broto pararaiz, aumento na produção de sementes e aumento na resistência a patóge-nos e/ou doenças.

43. Uso de um polipeptídeo de acordo com a reivindicação 28como uma molécula alvo.

44. Uso de acordo com a reivindicação 43, em que o polipeptí-deo é uma molécula alvo para um inibidor in vitro e/ou in vivo.

45. Uso de acordo com a reivindicação 43 ou 44, em que a mo-lécula alvo é uma molécula alvo no tecido da raiz de uma planta.

46. Uso de acordo com a reivindicação 43, em que a moléculaalvo é usada em um método de triagem para a identificação de um agentede proteção vegetal.

47. Uso de acordo com a reivindicação 43, em que a moléculaalvo é usada em um método de triagem para a identificação de um promotorde crescimento vegetal.