BRPI0708733A2 - mÉtodo para o isolamento de polipeptÍdeos ricos em 4-hidroxiprolina, composiÇço, uso de uma composiÇço no campo agronâmico, composto, e, uso de polipeptÍdeos contendo 4-hidroxiprolina - Google Patents

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Maria Gabriella Colucci
Fabio Apone
Maarten J Chrispeels
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Arterra Bioscience S R L
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Abstract

MÉTODO PARA O ISOLAMENTO DE POLIPEPTÍDEOS RICOS EM 4-HIDROXIPROLINA, COMPOSIÇçO, USO DE UMA COMPOSIÇçO NO CAMPO AGRONâMICO, COMPOSTO, E, USO DE POLIPEPTÍDEOS CONTENDO 4-HIDROXIPROLINA. A presente invenção refere-se a um método para a preparação de 4-hidroxi-L-prolina ou de composições com alto teor deste aminoácido e ao uso do mesmo como agroquímico no campo agrícola e/ou como um intermediário de síntese de compostos químicos.

Description

"MÉTODO PARA O ISOLAMENTO DE POLIPEPTÍDEOS RICOS EM 4-HIDROXIPROLINA, COMPOSIÇÃO, USO DE UMA COMPOSIÇÃO NOCAMPO AGRONÔMICO, COMPOSTO, E, USO DE POLIPEPTÍDEOSCONTENDO 4-MDROXIPROLINA"
A presente invenção refere-se a um método para a preparaçãode uma composição com base em 4-hidroxiprolina e aos usos da mesma nocampo agrícola.
Especialmente, a presente invenção refere-se a um métodopara a preparação de 4-hidroxi-L-prolina e a composições com um alto teordeste aminoácido e ao uso da mesma como agroquímico no campo agrícola ecomo um intermediário de síntese para compostos químicos.
4-hidroxiprolina, um derivado hidroxilato (4-HO-Pro) deprolina, é um aminoácido de importância biológica considerável, que étipicamente encontrado em um colágeno.
A hidroxiprolina atualmente é obtida a partir de fontes deproteína de um animal, como os de origem suína ou bovina.
Os métodos para a obtenção de oligopeptídeos ricos emhidroxiprolina prevê que a fonte de proteína de origem animal sejainicialmente moída e conservada em ambiente de baixa temperatura até omomento do tratamento, que é composto das seguintes fases:
- Hidrólise ácida (a acidez é mantida elevada durante toda aoperação, para acelerar o processo e evitar qualquer tipo de racemização). Atemperatura varia de 70-100 °C;
- Filtração dos produtos insolúveis/decantação ou extraçãocom solventes dos componentes lipídicos ou lipofílicos;
- Purificação através de cromatografia de troca de íons. O teorde hidroxiprolina nas matrizes mais ricas pode alcançar, no máximo, 12 - 14%da massa de aminoácido, com a presença de quantidades semelhantes deaminoácidos, por exemplo, prolina (10 - 15%), que constituem os parâmetrosde operação para a separação crítica;
- Purificação/perda de cor com carvão ativo;
- Ultrafiltração;
- Cristalização repetida;
- Secagem.
No entanto, os processos atualmente utilizados têm váriasdesvantagens, tais como a obtenção de uma concentração total dehidroxiprolina livre ou de peptídeo menor do que 12 - 14% com relação àmassa de aminoácido presente, além do risco de contaminação por intermédiode peptídeos bioativos perigosos. Isto pode ser associado com riscos decontaminação por uma proteína modificada (com relação à forma "nãopatológica") chamada de "prion" responsável pelo desenvolvimento dealgumas patologias sérias, entre as quais a encefalopatia espongiforme bovina(BSE).
Estes riscos recentemente levaram a união européia a proibir ouso de proteínas hidrolisadas de origem animal ou derivação para uso emagricultura biológica.
Três grupos de glicoproteínas ricas em hidroxiprolina (glico-proteína-rica em hidroxila, HRGP), identificadas e caracterizadas em plantas,são descritas na literatura (Showalter AM and Varner JE (1988);Biochemistry of Plants, Vol.15, editado por Stumpf PK & Conn, EEAcademic Publisher, New York). Estes incluem:
i) "Proteínas arabinogalactan", principalmente localizadas namatriz extracelular e algumas vezes associadas com a membrana plasmática;
ii) lecitinas que pertencem à família Solanaceous; e
iii) extensinas, os principais componentes das paredescelulares principais onde elas ligam covalentemente a matriz de semi-celulosee as pectinas. Elas são especialmente abundantes nas paredes das células quecrescem em meios líquidos (Lamport, 1974; Cooper and Varner, 1983; Qi etal., 1995).
Algumas destas extensinas provenientes de culturas de célulasde cenoura foram amplamente caracterizadas em relação à sua funçãoimportante no controle da extensão da parede durante o crescimento celular(Lamport, 1969; Brysk and Chrispeels, 1972). Mais recentemente, novasproteínas semelhantes às extensinas, contendo 20% de prolina e 20% dehidroxil-prolina, foram extraídas de paredes de células de soja em uma culturalargamente caracterizada (Averyhart-Fullard et al., 1988; Hong and Nagao,1989).
A solubilização de HRGP das paredes das células foi
executada por vários grupos de pesquisa com métodos análogos. O primeirotrabalho é de 1969, quando foi executada uma primeira purificação eidentificação das proteínas ligadas na parede da célula (Lamport, 1969). Umprotocolo semelhante com base na remoção de cadeias de açúcar ligadas nasglicoproteínas da parede com ácido clorídrico e o tratamento conseqüentecom tripsina, foi aplicado posteriormente nas culturas das células de cenourapara o isolamento e a análise dos peptídeos ricos em hidroxiprolina derivadada hidrólise das glicoproteínas da parede (Cho and Chrispeels, 1976).
Os protocolos com base na tripsinização de glicoproteínas daparede foram também aplicados com sucesso em culturas de células dealgodão (QI et al., 1995).
Proteínas semelhantes às extensinas foram purificadas dasparedes das células de soja com processos baseados no forte tratamento comácido tricloroacético, o qual hidrolisa as ligações de glicosídeo destasglicoproteínas e também permite a sua separação da matriz de celulose, e emconseqüência, isoladas por técnicas HPLC mais modernas (Averyhart-Fullardet al., 1988). Um tratamento análogo com ácidos fortes e processos defiltração com gel foram também utilizados para o isolamento e acaracterização das extensinas da parede de culturas celulares de tomate(Brownleader and Dey5 1993).
Somente uns poucos estudos orientados na direção dacaracterização única das referidas glicoproteínas e verificações experimentaisda sua função na fisiologia vegetal, são atualmente conhecidos.
4-HO-Pro (Plant Physiology (1984), "Effects of the ProlineAnalog L-Thiazolidine-4-carboxilic Acid on Proline Metabolism", vol. 74,páginas 213 -218, 1984) é também conhecido como sendo capaz de aumentaro nível de prolina em tecidos vegetais, reforçando as respostas naturais daplanta para aliviar/opor-se aos efeitos causados pelos agentes de tensãoabiótica (por exemplo, temperaturas extremas, seca, salinidade do solo, mastambém a vários tipos de contaminações químicas), e também para auxiliar asrespostas da planta ou o efeito dos agentes fitoiátricos exógenos no controlede fitopatógenos.
4-HO-Pro proveniente de fontes animais de fato é jácomercializado para este fim, mas somente em uma mistura com outrosaminoácidos. Para estas aplicações, de fato ele é disponível somente na formadiluída em produtos hidrolisados de proteína, e especialmente, produtoshidrolisados provenientes de tratamento químico ou enzimático de epitélioanimal. Esta fonte, no entanto, representa um risco possível de contaminação,devido à presença potencial de vetores de encefalopatia espongiforme bovina(BSA).
No estado atual, a disponibilidade de fontes alternativas para aobtenção de 4-HO-Pro reduzindo os riscos de contaminação biológica,tornou-se necessária.
Um dos objetivos da presente invenção, portanto, consiste naapresentação de um método para a obtenção de 4-hidróxi-L-prolina oucomposições enriquecidas neste aminoácido na forma livre ou na forma deoligopeptídeos, que não têm riscos de contaminação biológica.
Um outro objetivo da presente invenção consiste nofornecimento de 4-hidroxi-L-prolina ou composições com base nesteaminoácidos que podem ser usadas como intermediários para a preparação deoutras substâncias químicas.
Outro objetivo da presente invenção consiste na apresentaçãode composições com base em hidroxiprolina que podem ser aplicadas nocampo agronômico e especialmente, na agricultura biológica.
Em vista dos objetivos acima, de acordo com um primeiroaspecto da presente invenção, é apresentado um método para a preparação deuma composição composta de 4-hidroxiprolina de acordo com a reivindicação1.
Outras características acessórias do método da invenção sãoindicadas nas reivindicações dependentes anexas 2-7.
O requerente verificou que partindo-se de culturas de célulasde plantas, e especialmente tratando-se adequadamente as paredes das célulasde várias espécies de plantas, é possível obter-se composições de aminoácidosricas em 4-hidroxi-L-prolina, substancialmente isentas de outroscontaminantes biológicos.
Especialmente, de acordo com uma realização da invenção, ascomposições enriquecidas em 4-hidroxi-L-prolina são obtidas através dafermentação de culturas de células de plantas, a separação e a lises dasparedes celulares das células.
De acordo com outra realização, o método da invençãotambém constitui a degradação de proteínas em peptídeos, com base em poli-4-HO-Pro liberado pela lises das paredes celulares quimicamente e/ouenzimaticamente, e a purificação opcional, parcial ou total, do 4-HO-Proassim obtido, como aminoácido livre.
De acordo com uma realização preferida da invenção, a culturacelular inicial é baseada em células BY2 de tabaco.
As características e vantagens de uma realização do método deacordo com a presente invenção ficarão mais evidentes a partir da seguintedescrição ilustrativa e não limitante, com referência ao seguinte esquema queé composto das seguintes fases:
a) fermentação de células BY2 em uma cultura líquida;
b) separação das células BY2 do meio de fermentação;
c) homogeneização, de preferência, com PBS, contendo 1% de TritonX-100;
d) precipitação das paredes celulares e lavagem subseqüente em PBSpara remover os componentes citoplasmáticos;
e) ebulição das paredes celulares em uma solução de 2 mM EDTApara a remoção das pectinas e do amido;
f) tratamento das paredes com uma solução ácida para separar osaçúcares ligados nas proteínas das paredes;
g) digestão das proteínas das paredes, em um meio ácido e/ouenzimaticamente;
h) separação através de cromatografia dos peptídeos e aminoácidos.
As fases a-h são convenientemente efetuadas de acordo com osseguintes procedimentos e condições:
a) fermentação das células vegetais, de preferência, de BY2 detabaco, em um meio líquido; a fermentação pode ser executada conformedescrito, por exemplo, por Kato et al, 1972, inoculando-se 50 ml de umacultura densa de células em 1 litro de meio de cultura, contendo 30 g/litro desacarose, 4,4 g/litro de mistura de sal basal Murashige/Skoog (sal MS,Sigma), 0,1 g/litro de Inositol, 1 mg/litro de tiamina e, 0,2 mg/litro de 2,4 D e,0,18 g/litro de KH2PO4 em um pH de 5,7.
A fermentação também pode acontecer em volumes diferentese meios de cultura modificados com relação àqueles propostos por Kato et ai.
b) a separação das células BY2: isto pode ser efetuado porsedimentação das células e filtração posterior do líquido através de umacamada de tecido Miracloth (Calbiochem), que retém as células mas permite apassagem da solução aquosa. De acordo com outra realização, ela pode serefetuada por centrifugação ou também por decantação simples do meio decultura. As células são então recolhidas com qualquer sistema derecolhimento, por exemplo, uma espátula, que pode ser conveniente e sãorecolocadas em suspensão em PBS (1,44 g/litro de NaH2PO4, 0,24 g/litro deKH2PO4, NaCl 8 g/l em um pH de 7,4) e contendo um detergente, porexemplo, dodecilsulfato de sódio (SDS) a 1%. A suspensão de soluçãotampão pode ser diferente do PBS, tanto com relação à composição químicacomo ao pH. O SDS pode ser substituído por outros detergentes que podemser mais adequados para a quantidade de células utilizadas.
c) homogeneização das células BY2: a homogeneização dascélulas pode ser efetuada em um recipiente adequado, como uma argamassacerâmica com um pilão também cerâmico. A quantidade de células e osvolumes relativos de solução tampão a serem utilizados varia em relação aoprocedimento previamente escolhido. A homogeneização também pode serefetuado com prensas do tipo mecânico ou hidráulico ou por outros aparelhosdisponíveis no mercado adequados para a quebra das células por fricção, sobcondições resfriadas e não resinadas.
d) precipitação das paredes celulares: tão logo um lisatocelular homogêneo tenha sido obtido por intermédio da homogeneização, aamostra de células é centrifugada, por exemplo, a 3000 rotações por 15minutos aproximadamente, para precipitar as paredes celulares. Osobrenadante obtido da centrifugação é eliminado, enquanto que os grânulosdas paredes são lavados três vezes com uma solução tampão até que todos oscomponentes citoplasmáticos e detergentes tenham sido eliminados dosobrenadante.
e) ebulição das paredes celulares: as paredes celulares assimobtidas entram em ebulição na presença de um agente seqüestrante, porexemplo, EDTA 2mM, para eliminar as pectinas e amidos que contaminam apreparação da parede. Os grânulos assim obtidos são lavados outra vez em PBS.
f) tratamento das paredes com uma solução ácida: os grânulosdas paredes celulares são recolocados em suspensão em uma solução ácida,por exemplo, HCl 0,1 N (pH 1,0) e entram em ebulição, tipicamente durantecerca de 1 hora. Desta forma, todos os açúcares ligados covalentemente comas proteínas das paredes são separados e colocados em solução. As proteínasda parede são agora acessíveis ao ataque das enzimas proteolíticas quehidrolisam as mesmas em peptídeos e/ou aminoácidos simples.
g) digestão das proteínas das paredes: isto pode ser feitovantajosamente com meios ácidos ou enzimaticamente, ou utilizando ambosos métodos, alternando-se, por exemplo, a hidrólise enzimática com ahidrólise ácida. Para o tratamento ácido, são utilizados ácidos inorgânicos, porexemplo, ácido clorídrico, ácido sulfurico, ácido fosfórico, ácido nítrico; ouácidos orgânicos, tais como ácido acético, ácido trifluoroacético, ácidometanossulfônico, ácido trifluorometanossulfônico. Quando a referidadigestão é executada enzimaticamente, podem ser utilizadas enzimasproteolíticas, como por exemplo, tripsina (com métodos tipicamente descritosem Cho e Chrispeels, 1976) mais de preferência com pepsina, que permiteque o tratamento seja feito diretamente na solução ácida usada para a hidrólisedos açúcares, sem a necessidade de lavagens ou neutralizações adicionais combases.
h) separação dos aminoácidos por cromatografia: umapurificação adicional pode ser executada na mistura de peptídeos/aminoácidosextraídos das paredes para separar os componentes de proteínas tendo váriospesos moleculares dos açúcares, principalmente arabinoses. Isto pode ser feitocom cromatografia de troca de íons fraca ou com filtração por gel, utilizandocolunas Dowex50 (troca de íons) ou colunas de filtração por gel SephadexGlO ou Gl5 (filtração por gel).
De acordo com outro aspecto, é apresentada uma composiçãocom base em polipeptídeo, composta de 4- hidroxiprolina obtida de acordocom o método da invenção.
De acordo com outro aspecto, é apresentado o uso de 4-hidroxiprolina de uma composição de polipeptídeo composta de 4-hidroxiprolina, obtida de acordo com o método da invenção, no campoagronômico, especialmente para dar às safras uma tolerância maior às tensõesabióticas e/ou bióticas, i.e. causada pelos microorganismos fitopatógenos.
O requerente, de fato com surpresa, verificou que o 4-HO-Proe as composições contendo 4-HO-Pro, objeto da presente invenção, sãocapazes de induzir significativamente genes envolvidos na autodefesa deplantas, por exemplo, através da indução da proteína de defesa induzida pelosataques dos patógenos (Pathogen Related 1, PRl).
Especialmente, o requerente observou um efeito significativodas 4-hidroxi-L-prolina e das composições enriquecidas neste aminoácido,objeto da presente invenção, para o controle do desenvolvimento de agentesresponsáveis pelo estresse biótico, como microrganismos fitopatogênicos,através da indução de substâncias tendo uma atividade anti-fungicida, como aproteína de defesa PRl.
De acordo com uma realização, o uso é previsto no campoagronômico, especialmente em safras agrícolas biológicas de composiçõescompostas de 4-HO-Pro na presença de polissacarídeos, tipicamente cadeiasde arabinose, presentes nas paredes das células BY2 de tabaco, opcionalmenteseparadas da matriz de proteína, mas não removidas da referida composição.
Além disso, o 4-HO-Pro obtido com o método da invençãotambém permite que sejam obtidas associações diferentes, como por exemplo,com aminoácidos predeterminados, ou com polissacarídeos ou comosmoprotetores de uma natureza química e/ou ação mecânica variada, etambém facilita as operações de separação do 4-HO-Pro com um alto grau depureza para usos sintéticos (como para a produção de peptídeos com estruturas quaternárias especificas).
Outra realização prevê o uso agronômico das paredescelulares, de preferência, de células BY2 de tabaco, através da assimilação doprocesso de degradação descrito acima para o seu metabolismo naturalproduzido sobre ou dentro da planta, ou no solo, pela ação demicroorganismos ou pela própria planta, e o efeito sinérgico que ocomponente de hidroxiprolina e o componente arabinosídeo produz paralimitar ou aliviar os efeitos causados pelo estresse abiótico e biótico.
A hidroxiprolina e/ou as composições baseadas nesteaminoácido obtidas de acordo com o método da invenção podem ser usadaspara o tratamento de toda a planta, ou de uma porção da mesma. Eles,portanto, podem ser aplicados nas folhas, mas também no tronco ou caule, ounas raízes, através da aspersão de soluções ou suspensões ou pelaincorporação de grânulos ou pós no solo. As sementes também podem sertratadas convenientemente com os compostos objeto da patente atual, comoresultado das propriedades osmoprotetoras mostradas.
A hidroxiprolina e as composições obtidas de acordo com ainvenção podem ser aplicadas em todos os tipos de safras, monocotiledôneaou dicotiledônea, e em conseqüência, produzirem uma assistência excelentepara o cultivo, por exemplo, de cereais, árvores frutíferas, legumes, safras"solanaceous", vários tipos de vegetais, mas também plantas ornamentais,plantas oleaginosas para usos não alimentícios, gramados, etc.
As referidas composições podem ser utilizadas sozinhas ou emuma mistura com qualquer outro produto utilizado tradicionalmente emagronomia, em qualquer proporção o procedimento aplicativo, ambos para aproteção de safras (fungicidas, herbicidas, inseticidas,, nemoticidas,bioestimulantes), mas também para a sua nutrição (adubos, vários tipos defertilizantes, microelementos).
Um objetivo da invenção também se refere a composições combase em 4-HO-Pro, derivadas do processo descrito acima e com grausdiferentes de pureza, opcionalmente contendo sacarídeos associados.
As doses de aplicação, expressas como uma relação com oconteúdo em peso de 4-HO-Pro presente em 1 litro ou kg de composição dainvenção, pode variar, por exemplo, de 0,005 de 4-HO-Pro a 5.000 g de 4-HO-Pro/hl, de preferência, de 0,05 g de 4-HO-Pro/hl a 500 g de 4-HO-Pro /hl,ainda mais de preferência, de 0,5 g de 4-HO-Pro/hl a 100 g de 4-HO-Pro/hl.Este aminoácido e as composições enriquecidas do mesmo têm a vantagemadicional de serem isentos de contaminantes biológicos e em conseqüência,de serem capazes de serem utilizados livremente no campo da agriculturabiológica.
De acordo com outro aspecto da invenção, prevê-se o uso de4-HO-Pro ou de polipeptídeos contendo 4-hidroxiprolina como intermediáriospara a preparação de moléculas de síntese.
Para ilustração mas não para fins de limitação da presenteinvenção, são apresentados alguns exemplos abaixo, relativos à preparação decomposições enriquecidas em 4-HO-Pro de acordo com a invenção e aatividade biológica dos mesmos.
EXEMPLO 1
Isolamento de peptídeos ricos em hidroxiprolina das paredesdas células BY2.
As células BY2 foram obtidas por meio de fermentaçõesexecutadas conforme descrito por Kato et al., 1972. 50 ml de uma cultura decélulas densa foram utilizados como o material inicial para a inoculação de 1litro de meio de cultura, contendo 30 g/litro de sacarose, 4,4 g/litro de misturade sal basal Murashige/Skoog (sal MS, Sigma), 0,1 g/litro de Inositolj. 1mg/litro de tiamina, 0,2 mg/litro de 2,4 D, 0,18 g/litro de KH2PO4 em um pHde 5,7. A cultura é então incubada a 27 °C, no escuro, sob agitação orbitalconstante (110 rpm) e após 8 dias as células são filtradas através de umacamada de tecido Miracloth (Calbiochem), e homogeneizadas em umaargamassa na presença de SDS (dodecil sulfato de sódio) 1% (ou Triton Χ-Ι 00, 1%) em uma solução tampão PBS (solução tampão salina de fosfato:1,44 g/litro de NaH2PO4, 0,24 g/litro de KH2PO4, NaCl 8 g/litro em um pH de7,4). O lisato resultante é primeiramente fervido na presença de EDTA,tratado com HCl 0,1 N e então é digerido com pepsina em um ambiente ácido.Este procedimento leva à solubilização da fração de proteína presente nasparedes das células, quantificável com o teste Bradford (Bradford, 1976) oucom a adição de ninhidrina.
Mais especificamente:
Células BY2 (300 g), derivadas de 1 litro de cultura sãohomogeneizadas em uma argamassa com cerca de 300 ml de PBS contendo1% de SDS (Triton X-100). O lisato obtido é centrifugado a 3000 rpm paraprecipitar as paredes das células que são então lavadas com quantidadesadicionais de PBS para a remoção dos componentes citoplasmáticos.
O produto obtido, definido como composição número 1, podeser usado para aplicações agronômicas.
A ebulição adicional das paredes das células em 150 ml deEDTA 2mM permite a remoção das pectinas e do amido. As paredes sãoentão tratadas com HCl 0, IN (150 ml) para separar os açúcares ligados nasproteínas das paredes, obtendo a composição número 2 a qual, tão logo sejaneutralizada com NaOH e diluída de forma adequada, pode ser usada paraaplicações agronômicas.
Pepsina (1 mg/ml) é então adicionada para a digestão dasproteínas das paredes, mantendo o pH em um valor de 1,0, em um volume de150 ml. A quantidade de proteínas obtidas da digestão é medida com ométodo Bradford, utilizando BSA (albumina de soro bovino) como padrão.
Os peptídeos assim obtidos (cerca de 120 - 130 mg) emsolução ácida que também contêm a fração de sacarídeos, são liofilizados erecolocados em suspensão em uma solução tampão (pH 6) para o testebiológico (composição n° 3).
EXEMPLO 2
Purificação adicional dos peptídeos ricos em hidroxiprolinadas paredes das células BY2: Separação por cromatografia dos aminoácidos.
A composição n° 3, derivada da digestão das paredes com
ácido e pepsina, foi liofilizada e recolocada em suspensão em 10 - 15 ml deuma solução tampão de formiato de piridina 10 mM, pH 3,3, a ser aplicadaem uma coluna cromatográfica previamente lavada e balanceada com umasolução tampão de piridina ImM.
Colunas contendo um resina Dowex 50WX2-400 (Sigma),
usada em cromatografia de troca de íons fraca, são carregadas com materialderivado das digestões ácida e de proteína das paredes. A coluna carregadadessa forma é primeiramente eluída com formiato de piridina ImM, pH 3,3, eposteriormente com uma solução tampão de piridina a 750 mM. As moléculascarregadas, tais como aminoácidos e peptídeos, são retiradas pela coluna enão são eluídas com a primeira eluição de formiato de piridina. A soluçãotampão ImM elui somente as moléculas neutras ou carregadas fracamente,como os açúcares. A eluição com uma solução tampão de piridina emconcentrações mais elevadas também permite que as moléculas com carga,tais como os aminoácidos e os peptídeos, sejam eluídas.
Em uma cromatografia de filtração por gel, as colunas,contendo a resina Sephadex GlO (Sigma), permitem que sejam separadas asmoléculas com um peso molecular menor do que 700 Da. A filtração por gelexplora a dimensão das moléculas para a separação, as moléculas maiores,tais como fragmentos de proteína e peptídeos mais volumosos sendoprimeiramente eluídos, de forma diferente das moléculas pequenas, tais comoaminoácidos ou açúcares simples, que são retidos pela porosidade da resina, esão eluídos com volumes maiores de solução tampão. A mesma soluçãotampão de formiato de piridina em um pH de 3,3 também pode ser aplicadanas colunas Sephadex para eluir os peptídeos e posteriormente osaminoácidos sozinhos derivados da hidrólise das proteínas das paredes dascélulas.
Em ambos os casos, a vantagem de utilização de uma soluçãotampão de formiato de piridina é a sua volatilidade elevada, que permite que amesma seja facilmente eliminada após a liofilização, para recuperar ocomponente de peptídeo livre de contaminações por sais ou outras moléculasorgânicas.
EXEMPLO 3
Expressão dos genes anti-estresse abióticos e bióticos PDH,GSTF7, PRl após o tratamento de plantas com as composições contendohidroxiprolina.
A composição número 3, derivada da digestão das paredescom ácido e pepsina, foi liofilizada e recolocada em suspensão em 15 ml deuma solução a 250 mM de NaOH, para ter um pH final igual a 6,0. 1 ml destasolução foi adicionalmente diluído em 10 ml de água destilada, para serutilizada diretamente sobre plantas de Arabidopsis thaliana. As plantasArabidopsis, ecotipo Columbia, cultivadas em solo durante 3-4 semanas eexpostas à luz durante um período de 16h, foram aspergidas na superfície dasfolhas com a composição número 3. Depois de 24h, algumas das folhas foramremovidas de cada amostra e o RNA total foi extraído com o kit da Sigma. OcDNA foi sintetizado utilizando-se os produtos Promega e Fermentas.
Foram executadas experiências quantitativas de PCR sobrevários genes envolvidos em resposta de defesa da planta utilizando-se um kit
comprado da__companhia Ambion, no qual___dois pares__de
iniciadores/competímeros são utilizados para a amplificação do gene de RNAribossomal 18S, que representa o padrão de controle.
A análise da expressão do gene foi executada em três genes,que representam marcadores moleculares excelentes para revelarem equantificarem a resposta de defesa da planta com relação, tanto ao estresseabiótico como ao biótico. Os genes analisados são aqueles que codificam aenzima desidrogenase prolina (PDH), descrita por Hua et al., 2001, aquela deglutationa s-transferase (GST-F7) (Bechtold et al., 1993), e aquela da proteínaPRl (proteína 1 relacionada com patogênese) (Lebel et al., 1998). Osprimeiros dois genes são envolvidos na resposta de defesa de plantas paraestressar o tipo abiótico, que geralmente é induzido por um aumento deprolina na planta.
O último gene, por outro lado, é envolvido na resposta aoestresse do tipo biótico, i.e., ele é ativado após o ataque dos organismospatogênicos e induz uma resposta geralmente mediada pelo ácido salicílico.
Em várias experiências, é demonstrado como o tratamentocom a composição número 3 leva a uma indução significativa de ambos osgenes PDH e GST-F7 (resposta ao estresse abiótico) e também ao gene PRl(resposta ao estresse biótico).
EXEMPLO 4
Sinergia da presença de açúcares na expressão dos genesresponsáveis pelo alívio do estresse abiótico e biótico.
As experiências de indução do mesmo gene foram executadas,utilizando-se o material da composição número 3 fracionado em uma colunaDowex50. As frações diferentes, obtidas por eluições com uma soluçãotampão de formiato de piridina 1 mM principalmente contendo açúcares,foram testadas nas plantas nas mesmas condições descritas acima eproduziram um fraco efeito indutivo. Os componentes de proteína, ambos asfrações maiores de peptídeos e os aminoácidos sozinhos (principalmenterepresentados pela hidroxiprolina) produziram uma respostasignificativamente mais elevada na expressão do gene marcador de estresse.
O efeito sobre a expressão do gene produzido pela composição número 3 émaior com relação àquele produzido pelos componentes fracionadossozinhos, isto sugerindo uma ação sinérgica do componente glicosídeojuntamente com o componente de proteína. Foi avaliado o efeito da respostade plantas ao estresse através de analisar também outros genes, marcadoresimportantes de ambos o estresse abiótico e o biótico. Os outros genesanalisados, que produziram resultados análogos, são o SAG29 (SenescenceAssociated Gene 29), SAG12 (Senescence Associated Gene 12), WHYl(Whirly 1), TGA2 ( fator de transcrição), COR47 ( envolvido em estresse eseca salinos),CAT3 (codificação para uma catalase), LOX2 e ERFl (ambosenvolvidos na resposta ao estresse biótico).
EXEMPLO 5
Alívio dos efeitos do estresse abiótico em plantas de feijão.
As plantas de feijão cultivadas em um meio de salinidadeelevada foram tratadas com a composição número 3, aplicando-se uma doseigual a 50 g/hl de componente de aminoácido-proteína por planta (tese 2).Estas plantas foram comparadas com as plantas cultivadas no mesmo meiosalino, mas que não foram tratadas (tese 3) com as plantas cultivadas em ummeio com a mesma composição mas que não era salina (tese 1). foramutilizadas 4 plantas para cada tese, mantidas em uma estufa durante 8 dias eentão comparadas visualmente. A tese 3, não tratada, tinha uma necroseextensa dos tecidos, enquanto que a tese 2 tinha uma redução elevada dosefeitos causados pela salinidade elevada, tendo um desenvolvimento econdição semelhantes ao da planta cultivada na ausência de salinidade edemonstrando a capacidade da composição número 3 de alívio dos efeitoscausados pelo estresse abiótico típico.
A mesma experiência foi obtida com as composições número 1e n° 2, outra vez com uma dose de 50 g/hl de componente de aminoácido-proteína, obtendo resultados análogos.

Claims (14)

1. Método para a preparação de uma composição com base em-4-hidroxiprolina, caracterizado pelo fato de ser composto da fermentação deuma cultura de célula vegetal, a separação e Iise subseqüente tantoquimicamente quanto enzimaticamente das paredes das células vegetais.
2. Método de acordo com a reivindicação 1 . caracterizado pelofato de ser composto das seguintes fases:a) fermentação de uma cultura de células de origem vegetal;b) separação das células vegetais do meio de fermentação;c) homogeneização das células vegetais;d) ebulição das paredes da célula para remover as pectinas e osamidos;e) tratamento das paredes celulares com uma solução ácidapara separar os açúcares ligados nas proteínas das paredes.
3. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de ser composto, entre as fases c) e d), de uma fase deprecipitação das paredes celulares e a lavagem para a remoção doscomponentes citoplasmáticos celulares.
4. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1-3,caracterizado pelo fato de ser composto de uma fase adicional de hidrólise f)das proteínas das paredes em um meio ácido e/ou enzimaticamente.
5. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1-4,caracterizado pelo fato de ser composto de uma fase adicional de separação g)por cromatografia dos peptídeos e aminoácidos.
6. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1-5,caracterizado pelo fato da referida cultura de células de origem vegetal serderivada de uma planta escolhida do grupo composto de plantas de tabaco,Arabidopsis, soja, cenoura, milho, batata e tomate.
7. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1-6,caracterizado pelo fato da referida cultura de célula ser uma cultura de célulasde tabaco BY2.
8. Composição, caracterizado pelo fato de ser baseada em 4-hidroxiprolina obtida de acordo com o método como definido em qualquerdas reivindicações 1-7.
9. Composição de acordo com a reivindicação S1CaraCterizadapelo fato de ser composta de uma ou mais unidades de polissacarídeo.
10. Composição de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato da referida unidade de polissacarídeo ser arabinose ouuma fração da mesma.
11. Uso de uma composição como definida em qualquer dasreivindicações 9-10 no campo agronômico, caracterizado pelo fato de ser parafazer com que as safras tenham uma tolerância maior ao estresse abiótico e/oubiótico.
12. Composto, caracterizado pelo fato de ser 4-hidroxiprolinana forma de um aminoácido livre ou incorporada em um polipeptídeo, obtidade acordo com o método como definido em qualquer das reivindicações 1-7.
13. Uso de 4-hidroxiprolina ou de polipeptídeos contendo 4-hidroxiprolina como definido na reivindicação 12, caracterizado pelo fato deser como intermediária para a preparação de moléculas de síntese.
14. Uso de 4-hidroxiprolina ou de polipeptídeos contendo 4-hidroxiprolina como definido na reivindicação 13 no campo agronômico,caracterizado pelo fato de ser para fornecer às safras uma tolerância maior aoestresse abiótico e/ou biótico.
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