BRPI0708785A2

BRPI0708785A2 - proteÍnas, Ácidos nuclÉicos e medicamentos

Info

Publication number: BRPI0708785A2
Application number: BRPI0708785-3A
Authority: BR
Inventors: Mark William James Ferguson; Phillip Mellor; Hugh Gerard Laverthy; Nick Occleston; Sharon O'kane; Emma Atkinson
Original assignee: Renovo Ltd
Priority date: 2006-03-11
Filing date: 2007-03-12
Publication date: 2011-06-14
Also published as: US20110105396A1; NO20084189L; MX2008011705A; IL193699A0; AU2007226345A1; WO2007104945A2; JP2009543542A; RU2008140119A; KR20080106450A; GB0604938D0; AR063947A1; SG170109A1; WO2007104945A3; EP2001904A2; CN101437846A; US7947264B2; CA2645344A1; US20090105146A1

Abstract

PROTEÍNAS, ÁCIDOS NUCLÉICOS E MEDICAMENTOS. A presente invenção refere-se a TGF-<225>3s, ou fragmentos ou derivados dos mesmos, em que domínio de formação alfa-hélice entre resíduos de aminoácidos (58) e (67) de TGF<225>3 de tipo selvagem comprimento total compreende pelo menos uma substituição alfa-hélice estabilizante. A invenção também provê TGF-<225>3s, ou fragmentos ou derivados dos mesmos, em que resíduo de glicina na posição (63) TGF-<225>3 de tipo selvagem comprimento total é recolocado por Prolina. Ainda adicionalmente, a invenção provê TGF-<225>3s, ou fragmentos ou derivados dos mesmos, compreendendo uma substituição do resíduo de ácido Glutamínico na posição (12) do TGF-<225>3 de tipo selvagem comprimento total e/ou o resíduo de Arginina na posição (52) do TGF-<225>3 de tipo selvagem comprimento total. A invenção também provê medicamentos e métodos de tratamento usando o TGF-<225>3s.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNAS, ÁCIDOS NUCLÉICOS E MEDICAMENTOS".

A presente invenção refere-se às proteínas derivadas de TGF-β3, para fragmentos biologicamente ativos de tais proteínas, e também paraácidos nucléicos codificando tais proteínas. A invenção fornece também de-rivados de tais proteínas ou fragmentos biologicamente ativos. A invençãotambém fornece medicamentos compreendendo as proteínas, fragmentos,derivados ou ácidos nucléicos da invenção, bem como métodos de trata-mento utilizando as proteínas, fragmentos, derivados ou ácidos nucléicos.

O fator de crescimento transformante beta (TGF-βε) é parte deuma superfamília de fatores de crescimento envolvidos na regulação de mui-tos processos celulares, incluindo proliferação, migração, apoptose, adesão,diferenciação, inflamação, imuno-supressão e expressão de proteínas extra-celular.

Há três isoformas mamíferas de TGF-β3 denominadas TGF-β1,TG-P2 e TGF-p3. TGF-βs são produzidos por uma ampla escala de tiposcelulares incluindo epiteliais, endoteliais, hematopoiéticos, neuronais, célulasdo tecido conectivo.

Os TGF-β3 têm utilidade em diversos contextos terapêuticos, e aisoforma TGF-Bs isoforma, em particular, tem muitas vantagens terapêuti-cas. Como um resultado do potencial terapêutico do TGF-B3 existe muitointeresse em suas aplicações farmacêuticas. A seqüência de aminoácidosde comprimento-total do tipo selvagem de TGF-Bs é estabelecida na Se-qüência ID No.1, e de cDNA codificando este TGF-Bs é definido na Seqüên-cia ID No. 2.

TGF-Bs é conhecido a desempenhar β um papel crucial na regulação da resposta à cicatrização de feridas. A atividade de TGF-B3s pode in-fluenciar a taxa de cicatrização de feridas, bem como a extensão da cicatrizque ocorre como resultado de cicatrização.

TGF-B3 também pode utilizado no tratamento de distúrbios fibró-ticos, fibrose pulmonar, cirrose hepática, esclerodermia, distúrbios angiogê-nicos, restenose, adesões, endometriose, distúrbios isquêmicos, indução decartilagens e osso, fertilização in vitro, mucosite oral, doença renal, preven-ção, redução ou inibição da cicatriz, melhoramento neuronal de reconexãono sistema nervoso central e periférico, prevenir, reduzir ou inibir as compli-cações da cirurgia ocular (tal como cirurgia LASIK ou PRK) ou cicatrizaçãona parte posterior do olho (tal como, Vitreorretinopatia proliferativa).

Os usos terapêuticos a que se prestam TGF-P3 têm estabeleci-do uma bem reconhecida necessidade de fontes de proteínas TGF-P3 biolo-gicamente ativas e numerosas tentativas têm sido feitas para produzir estavaliosa proteína por métodos recombinantes. No entanto, os processos exis-tentes para a produção de TGF-P3 são severamente limitados devido à ne-cessidade de redobramento do complexo protéico a fim de alcançar molécu-las biologicamente ativas.

TGF-ps existem naturalmente como proteínas homodiméricascompostas por duas subunidades de 112 aminoácidos. Cada uma destassubunidades TGF-p3 contém uma alfa-hélice formando domínio entre o 58°e o 67° resíduos do fragmento de peptídeo ativo. Além da alfa-hélice entreos resíduos 58 e 67, cada subunidade TGF-P3 contém também um númerode ligações intra-subunidade incluindo pontes de sal e ligações dissulfeto.

TGF-p3 é secretado como uma moléculas precursora inativa Ia-tente de 100 kDa (L TGF-p3). A molécula de LTGF-p3 consiste em:

i) peptídeo sinal dímero C-terminal 25kDa (fragmento ativo); e

ii) peptídeo latente-associado (LAP).

LTGF-β é ativado por dissociação do LAP do fragmento ativo.Clivagem da LTGF-ps pode ser mediada por ação de enzimas, tal como en-dopeptidases como furina, plasmina e trombina ou pela acidificação do es-paço pericelular. O fragmento dimérico TGF-β ativo é estabilizado por intera-ções hidrofóbicas e iônicas, em que são também reforçadas por uma inter-subunidade de ponte dissulfeto. Cada monômero compreende várias verten-tes de filamentos beta intrelaçados por três das quatro ligações intradissulfe-to e forma uma estrutura apertada conhecida como um "nódulo de cisteína".

Devido à complexidade de moléculas TGF-P3 biologicamenteativas (em que são, como acima referido, proteínas homodiméricas com 8ligações dissulfeto intracadeia e uma ligação dissulfeto intercadeia) foraminicialmente expressadas em organismos eucarióticos. No entanto, os níveisrelativamente baixos de expressão que podem ser alcançados utilizandosistemas de expressão eucarióticos, em combinação com elevados custosde tais processos, significam que o uso de hospedeiros microbianos foi in-vestigado, a fim de tentar melhorar a eficiência comercial da produção TGF-β3.

A desvantagem de usar hospedeiros microbianos como E.colipara expressar moléculas recombinantes, tal como, TGF-P3, que contêmmúltiplas ligações dissulfeto é que as proteínas produzidas são normalmenteincorretamente dobradas, e, muitas vezes, formam corpos de inclusão inso-lúveis. Estes corpos de inclusão requerem solubilização seguida por renatu-ração para permitir à proteína redobrar dentro de sua conformação ativa bio-lógica nativa. Para efetivamente renaturar homodímero TGF-P3, ligaçõescovalentes dissulfeto na orientação correta precisam ser regeneradas. Aprobabilidade de formar um correto homodímero TGF-p3 do processo deformação aleatória de ligação dissulfeto é baixo, dado que existem nove li-gações dissulfeto, permitindo 34.459.245 combinações possíveis de ligaçõesdissulfeto. Portanto, não é surpreendente que o redobramento de TGF-P3produzido recombinantemente pode severamente influir sobre sua fabrica-ção, visto que o redobramento pode levar até 144 horas, e tipicamente sóalcança voltar eficiências de redobramento na região de 20%.

É um objetivo da presente invenção evitar ou atenuar alguns dosproblemas associados com a técnica anterior. É um objetivo de certos as-pectos da presente invenção fornecer TGF-p3s (ou fragmentos ou derivadosdestes) que tenham melhorado a eficiência de redobramento em compara-ção com o tipo selvagem de TGF-p3. É outro objetivo de certos aspectos dainvenção fornecer agentes diferentes do tipo selvagem de TGF-p3 que têmatividade TGF-P3. Esses agentes podem fornecer valiosas alternativas anaturalmente ocorrência de TGF-p3.

Em um primeiro aspecto da presente invenção é fornecido TGF-β3 ou um fragmento ou derivado deste, onde o domínio de formação alfa-hélice entre os resíduos de aminoácidos 58 e 67 de comprimento total dotipo selvagem de TGF-P3 compreende pelo menos uma substituição alfa-hélice estabilizante. A invenção também fornece um ácido nucléico codifi-cando um TGF-p3, ou fragmento ou derivado destes, de acordo com o pri-meiro aspecto da invenção.

Os inventores têm surpreendentemente descoberto que o novoTGF-B3s descrito no primeiro aspecto da invenção partilha a mesma ativida-de biológica como naturalmente ocorrência TGF-B3, e tem eficiência de re-dobramento de proteína muito melhorada quando comparada com TGF-B3do tipo selvagem. Este aumento da eficiência de redobramento de proteínaconstitui uma vantagem marcada e importante visto que tanto simplifica ascondições de redobramento que podem ser utilizadas para produzir TGF-p3sbiologicamente ativo e também aumenta consideravelmente o rendimentodessas proteínas (ou fragmentos ou derivados dessas proteínas) que podemser produzidas utilizando sistemas de expressão de proteínas procarióticas.

Sem querer vincular por qualquer hipótese, os inventores acredi-tam que a introdução de substituições alfa-hélice estabilizantes dentro dedomínios alfa-hélice formadores vantajosamente diminui a flexibilidade dealfa-hélice formada por esse domínio. Essa flexibilidade diminuída ajuda apromover o próprio redobramento do TGF-p3s de acordo com o primeiro as-pecto da invenção para produzir proteínas biologicamente ativas (ou frag-mentos ou derivados destes). A flexibilidade diminuída transmitida pela esta-bilização da alfa-hélice através de substituições alfa-hélice estabilizantes ésuficiente para aumentar rendimentos de redobramento de TGF-p3 correta-mente (particularmente TGF-P3 dimérico redobrado), mas, surpreendente-mente, os inventores descobriram que tais substituições não alteram a ativi-dade biológica do TGF-p3s em conformidade com o primeiro aspecto da in-venção, e não retira sua eficácia terapêutica e biológica.

Exceto para o contexto em que exige o contrário, a numeraçãodos resíduos de aminoácido no presente relatório é baseda sob a seqüênciado aminoácido do peptídeo ativo das porções de TGF-B3s. Por exemplo, asreferências a "comprimento-total de TGF-P3 do tipo selvagem" devem ge-ralmente ser empregadas para referir a seqüência de aminoácido do peptí-deo ativo mostrada na Seqüência ID No. 1, eas referências ao domínio alfa-hélice-formador entre resíduos de aminoácido 58 e 67 são para ser construí-das em conformidade.

Uma substituição alfa-hélice estabilizante pode preferencialmen-te compreender uma substituição de resíduo de glicina na posição 63 decomprimento-total do TGF-p3 tipo selvagem. No entanto, substituições ade-quadas podem adicionalmente ou alternativamente compreender substitui-ções de, por exemplo, uma ou ambas de Treoninas na posição 60 ou 67 decomprimento-total de TGF-P3 do tipo selvagem ou de Asparagina na posição66 de comprimento-total TGF-p3 de tipo selvagem. Deve ser preferido quesubstituições alfa-hélice estabilizantes para uso com a invenção não com-preendam substituição da valina 61.

Uma substituição "alfa-hélice estabilizante", de acordo com apresente invenção deve ser entendida para ser uma substituição em que umdeterminado resíduo de aminoácido presente no TGF-P3 do tipo selvagem ésubstituído por resíduo trocado tendo uma maior propensão para a formaçãode alfa-hélice. Assim, a troca do resíduo de aminoácido introduzido na subs-tituição da alfa-hélice estabilizante não tem necessariamente que ser umaem que sua predisposição à integração estável dentro da alfa-hélice, mas sóprecisa ter uma maior propensão para integração estável do que faz o ami-noácido substituído. No entanto, pode geralmente ser preferido que uma tro-ca introduzida do aminoácido como parte de uma substituição da alfa-héliceestabilizante seja um resíduo de aminoácido que não favoreça uma integra-ção dentro da uma alfa-hélice.

Os inventores descobriram resíduos de aminoácido de troca pre-feridos que podem ser introduzidos nas substituições alfa-hélice estabilizan-tes de acordo com o primeiro aspecto da invenção pode ser qualquer um oucombinação de aminoácidos selecionados do grupo compreendendo: alani-na, serina, treonina, valina, leucina, isoleucina, metionina e fenilalanina. Es-tes resíduos de aminoácido de troca preferidos são todos considerados co-mo sendo adequados para uso em substituições alfa-hélice estabilizantes deresíduos de Glicina na posição 63 do comprimento-total do TGF-P3 de tiposelvagem. Dito isto, resíduos de aminoácido de troca selecionados a partirdeste grupo pode ser substituído em qualquer posição do domínio alfa-hélice-formador entre os resíduos de aminoácidos 58 e 67 em que se podemfornecer uma substituição alfa-hélice estabilizante.

Apesar dos resíduos de aminoácido listados acima representa-rem resíduos preferidos para uso nas substituições alfa-hélice estabilizantes,será apreciado um número de sistemas alternativos qualitativos e quantitati-vos em que a propensão de um resíduo de aminoácido para contribuir para aformação da alfa-hélice (e, deste modo, a adequação do resíduo para usoem uma substituição alfa-hélice estabilizante) pode ser medido, e que resí-duos de aminoácido adequados para uso em substituições alfa-hélice estabi-lizantes poderão ser selecionados com referência a qualquer um desses sis-temas, em combinação com o conhecimento da seqüência de TGF-P3.

A título de exemplo, um sistema qualitativo descrito por Chou eFasman identifica cinco diferentes classificações de resíduos de aminoáci-dos com base em sua propensão para a formação de alfa-hélice. Em ordem,estes são:

Formadores de hélice forte; Formadores dehélice fraca; FormadoresIndiferentes; Finalizadores de hélice fracae Finalizadores de hélice forte.

Para efeitos do presente relatório, os resíduos de aminoácido doácido glutâmico, histidina, triptofano, lisina, alanina, metionina, valina, isoleu-cina, leucina, Glutamina e fenilalanina podem ser considerados para seremformadores de hélice, com Glutamina, metionina, alanina e leucina constitu-indo formadores de hélice forte. Em contraste, asparagina, glicina e prolinapodem ser consideradas para constituir finalizadores de hélice, com glicina eprolina sendo finalizadores de hélice forte.

Assim, se a propensão para a formação de alfa-hélice é avaliadacom referência a esta escala qualitativa será reconhecido que, apesar deuma substituição alfa-hélice estabilizante pode preferencialmente ser um emque um resíduo de aminoácido seja trocado por um formador de hélice,substituição alfa-hélice estabilizante adequado pode alternativamente fazeruso de formas indiferentes ou até mesmo de finalizadores de hélice depen-dendo da natureza do resíduo de aminoácido que está a ser trocado. Porexemplo, no caso em que a forma indiferente do resíduo de aminoácido estápara ser o objeto de uma substituição alfa-hélice estabilizante, um resíduode aminoácido substituto adequado pode ser um formador de hélice forte ouum formador de hélice fraco. No caso em que um finalizador de hélice forteestá para ser o objeto da substituição alfa-hélice estabilizante o resíduo deaminoácido substituto pode ser um formador de hélice forte, um formador dehélice fraco, um aminoácido de forma indiferente ou finalizador de hélice fraco.

Assim, uma substituição alfa-hélice estabilizante de acordo coma presente invenção pode compreender a substituição de um finalizador dehélice forte com um finalizador de hélice fraco, ou um resíduo de aminoácidode forma indiferente, ou um formador de hélice fraco, ou um formador dehélice forte. Alternativamente ou adicionalmente, uma substituição alfa-héliceestabilizante adequada pode compreender a substituição de finalizador dehélice fraco com uma forma indiferente, um formador de hélice fraco ou umformador de hélice forte. Alternativamente ou adicionalmente, uma substitui-ção alfa-hélice estabilizante adequada pode compreender a substituição deum resíduo de aminoácido de forma indiferente com um formador de hélicefraco ou um formador de hélice forte. Alternativamente ou adicionalmente,uma substituição alfa-hélice estabilizante adequada pode compreender asubstituição de um formador de hélice fraco com um formador de hélice forte.

Uma alternativa de avaliação da propensão de um resíduo deaminoácido para formação de alfa-hélice, e, por conseguinte, a sua adequa-ção para ser utilizada como parte de uma substituição alfa-hélice estabilizan-te pode ser baseada em quaisquer do número de escalas quantitativas co-nhecidas por aqueles qualificados na técnica.

Um exemplo deste tipo de escala quantitativa que pode ser utili-zado para determinar um resíduo de aminoácido de adequação para o usoem uma substituição alfa-hélice estabilizante é estabelecido na Tabela 1.Esta tabela fornece valores, calibrado em kcal/mol, refletindo a propensãodos aminoácidos para contribuir para a formação da alfa-hélice. Um valorelevado na Tabela 1 está associado a uma baixa tendência para a formaçãoda alfa-hélice.

Assim, quando a adequação de um resíduo de aminoácido parauso em uma substituição alfa-hélice estabilizante como requerido pelo pri-meiro aspecto da invenção é avaliada usando uma escala quantitativa, talcomo a estabelecida na Tabela 1, uma substituição alfa-hélice estabilizanteadequada é uma em que um resíduo de aminoácido é substituído por umresíduo de aminoácido trocado que tem uma maior propensão à formaçãode hélice (indicados na Tabela 1 por um menor valor kcal/mol) do que o re-síduo a ser substituído.

Substituições adequadas que podem ser utilizadas de acordocom a invenção incluem aquelas que introduzem aminoácidos de substitui-ção artificial. Exemplos adequados de aminoácidos de substituições artifici-ais que podem ser utilizados para serem beneficialmente usados para esta-bilizar alfa-hélices incluem resíduos de aminoácido tendo cadeias retas hi-droxila e alquila.

Alanina representa particularmente um resíduo de aminoácidode substituição preferido adequado para uso em substituição alfa-hélice es-tabilizante. É mais preferido que um TGF-P3 ou fragmento ou derivado des-te, de acordo com o primeiro aspecto da invenção compreenda a substitui-ção de glicina na posição 63 do comprimento-total do TGF-P3 tipo selvagemcom alanina.

A seqüência de aminoácidos de um TGF-P3 preferido de acordocom o primeiro aspecto da invenção é estabelecida na Seqüência ID No. 3(Gly-63Ala), e DNA codificando TGF-p3 é definido na seqüência ID No. 4.Fragmentos ou derivados do TGF-P3 de Seqüência ID No. 3 contendo asubstituição alanina na posição 63 do comprimento-total TGF-P3 tipo selva-gem representam fragmentos ou derivados TGF-p3 preferidos de acordocom o primeiro aspecto da invenção.

Uma substituição adequada pode ser uma em que um ou maisresíduos de aminoácidos situados entre 58 e 67 do comprimento total deTGF-p3 do tipo selvagem são substituídos com um ou mais resíduos de a-minoácidos naturais ou artificiais. A título de esclarecimento adicional, substi-tuições adequadas podem envolver a substituição de um único resíduo deaminoácido com um ou mais resíduos substituídos, ou a substituição demais do que um resíduo de aminoácido com um ou mais resíduos substituí-dos. Uma substituição preferida pode ser uma em que o número de resíduosde aminoácido é conservado, ou seja, uma em que o número de resíduos deaminoácido substituído é o mesmo que o número de substituições de resí-duos de aminoácidos introduzidos.

Irá ainda ser apreciado que resíduo de aminoácido preferido (ouresíduos) para ser substituído pode ser selecionado com referência às esca-las qualitativas ou quantitativas discutidas acima. Assim, um aminoácido a-dequado a ser objeto de uma substituição alfa-hélice estabilizante pode serclassificado como um finalizador de hélice ou preferencialmente um forma-dor de hélice forte, com referência à escala qualitativa discutida acima. Comreferência à escala quantitativa estabelecida na Tabela 1, um aminoácidoadequado a ser objeto de uma alfa-hélice estabilizante pode preferencial-mente ser um com um valor de propensão de hélice igual ou superior a 0,50,mais preferencialmente uma com valor de propensão de hélice maior ou i-gual a 0,60, e mais preferencialmente com um valor de propensão de hélicede 1,00.

Os inventores acreditam que TGF-p3s ou fragmentos biologica-mente ativos ou derivados destes, de acordo com o primeiro aspecto da in-venção podem ser utilizados em todos os contextos em que se desejam fa-zer uso da atividade biológica do TGF-p3 do tipo selvagem. Estes particu-larmente incluem, mas não estão limitados a, usos terapêuticos. Em harmo-nia com este uso terapêutico a invenção também fornece o uso de TGF-P3ou um fragmento ou derivado deste, de acordo com o primeiro aspecto dainvenção como um medicamento.Será apreciado que, embora possa ser preferível que um frag-mento ou derivados de um TGF-B3 de acordo com o primeiro aspecto dainvenção compreenda o domínio formação alfa-hélice de comprimento totalcontendo substituição alfa-hélice estabilizante, este não tem que necessari-amente ser o caso. Um fragmento ou derivado adequado pode compreenderum domínio de formação alfa-hélice truncado, enquanto que este domínio deformação alfa-hélice truncado compreende pelo menos uma substituiçãoalfa-hélice estabilizante.

Em um segundo aspecto da invenção é fornecido um TGF-B3,ou um fragmento ou derivado deste, onde os resíduos de glicina na posição63 de comprimento-tola TGF-B3 do tipo selvagem são substituídos com pro-lina. A invenção fornece também uma molécula de ácidos nucléicos codifi-cando um TGF-p3 ou um fragmento ou derivado deste, de acordo com o se-gundo aspecto da invenção.

Os inventores têm surpreendentemente encontrado que proteí-nas, de acordo com o segundo aspecto da invenção (ou seus fragmentos ouderivados) têm atividade biológica comparável à TGF-P3 do tipo selvagem.Esta constatação é inesperada, uma vez que pode ser pensado que a pre-sença de prolina em uma região de TGF-B3 normalmente associadoa comformação de alfa-hélice possa interferir com a estrutura secundária de taisproteínas e, assim, prejudicar a sua função biológica. Apesar da eficiênciado redobramento do TGF-p3s de acordo com o segundo aspecto da inven-ção é menor do que do TGF-B3 tipo selvagem o defeito antecipado da fun-ção surpreendentemente não ocorre.

Assim, proteínas, de acordo com o segundo aspecto da inven-ção (ou seus fragmentos ou derivados) fornecem uma valiosa contribuiçãopara a técnica, na medida em que expandem o repertório de compostos ca-pazes de exercer atividade TGF-B3 que estão à disposição de um versado.Tais compostos podem, por exemplo, ser utilizados nos contextos em que édesejado usar TGF-B3 de atividade terapêutica.

A seqüência de aminoácidos de um TGF-P3 preferido de acordocom o segundo aspecto da invenção é estabelecida na Seqüência ID No. 5(Gly-63Pro), e DNA codificando este TGF-(33 é estabelecido na SeqüênciaID No 6. Fragmentos ou derivados do TGF-B3 de Seqüência ID No. 5 con-tendo a substituição prolina na posição 63 do comprimento-total do TGF-B3tipo selvagem representam fragmentos ou derivados TGF-B3 preferidos, deacordo com o segundo aspecto da invenção.

Determinado que TGF-B3s, ou fragmentos ou derivados destes,de acordo com o segundo aspecto da invenção podem ser usados em con-textos em que é desejado utilizar a atividade biológica terapêutica do TGF-β3 de tipo selvagem será apreciado que também existe fornecer o uso deTGF-B3s, ou fragmentos ou derivados destes, de acordo com o segundoaspecto da invenção como medicamentos. Os inventores acreditam que taismedicamentos podem ser utilizados em todos os contextos clínicos em queseja conhecida para fazer uso da atividade biológica do TGF-B3.

Em um terceiro aspecto da invenção é fornecido um TGF-B3 ouum fragmento ou derivado deste compreendendo por uma substituição doresíduo de ácido glutâmico na posição 12 do comprimento-total do TGF-B3de tipo selvagem e/ou o resíduo de arginina na posição 52 do comprimento-total de TGF-B3 tipo selvagem. A invenção fornece também uma moléculade ácidos nucléicos codificando TGF-B3 ou um fragmento ou derivado deste,de acordo com o terceiro aspecto da invenção.

Será apreciado que o terceiro aspecto da invenção, então, en-globa TGF-p3s em que o ácido glutâmico na posição 12 do comprimento-total de TGF-P3 tipo selvagem é substituído, mas a arginina na posição 52do comprimento-total do TGF-B3 tipo selvagem é retido. O terceiro aspectoda invenção abrange também TGF-B3s em que o ácido glutâmico na posição12 do comprimento-total do TGF-p3 tipo selvagem é retido, mas a argininana posição 52 do comprimento-total de TGF-P3 tipo selvagem é substituída.

No entanto, é preferível que TGF-B3s de acordo com o terceiroaspecto da invenção compreenda substituições de ambos os resíduos deácido glutâmico na posição 12 do comprimento-total de TGF-B3 tipo selva-gem e os resíduos de arginina na posição 52 de comprimento-total TGF-B3do tipo selvagem.Os inventores têm surpreendentemente descoberto que proteí-nas de acordo com o terceiro aspecto da invenção também têm atividadebiológica comparável à do TGF-B3 do tipo selvagem. Esta constatação éinesperada, uma vez que a substituição de um ou de ambos resíduo de áci-do glutâmico na posição 12 do comprimento-total de TGF-P3 tipo selvageme/ou resíduo de Arginina na posição 52 de comprimento-total do TGF-B3 tiposelvagem interrompe a formação de uma subunidade-intra de pontes salinasnormalmente encontradas em TGF-B3 tipo selvagem. Esta falha para com-pletar a própria formação de ponte salina pode ser esperada para a diminui-ção da atividade biológica do TGF-p3s de acordo com o terceiro aspecto dainvenção, uma vez que, a atividade biológica de proteínas, tal como, TGF-β3geralmente é acreditado para ser dependente da sua conformação.

Além disso, os inventores têm também encontrado que TGF-B3, de acordo com o segundo aspecto da invenção, exibem uma eficiênciade êxito de redobramento de que é apenas mais elevada do que a observa-da para o TGF-P3 de tipo selvagem. Esta constatação é extremamente sur-preendente, uma vez que seria esperado pelos versados que a falta de for-mação de subunidade-intra de ponte salina que deve ter lugar no TGF-B3de acordo com o segundo aspecto da invenção poderia deletericamente in-fluenciar nas incidências de redobramento e, conseqüentemente, diminuir orendimento da atividade biológica do TGF-B3.

Assim, proteínas, de acordo com o terceiro aspecto da invençãoservem para expandir o repertório de compostos capazes de exercer ativi-dade TGF-B3 que estão à disposição dos versados. Tal como referido acima,a disponibilidade de tais compostos é importante em contextos, tais como,aqueles em que se deseja usar a atividade terapêutica TGF-B3.

Os inventores descobriram que uma ou outra do ácido glutâmicona posição 12 do comprimento-total do TGF-B3 tipo selvagem ou a Argininana posição 52 comprimento-total do TGF-B3 tipo selvagem pode ser substi-tuída por qualquer um resíduo de aminoácido (ou qualquer combinação deresíduos de aminoácidos) selecionados a partir do grupo composto em seri-na, alanina, treonina, valina, isoleucina, metionina, fenilalanina e leucina.É preferível que serina seja usada como um resíduo de aminoá-cido substituto em TGF-p3s ou fragmentos ou derivados destes, de acordocom o terceiro aspecto da invenção. Serina pode ser utilizada como umsubstituto para o ácido glutâmico na posição 12 do comprimento-total doΤΘΡ-β3 tipo selvagem ou a Arginina na posição 52 do comprimento-total deTGF-B3 tipo selvagem. A maior parte preferencialmente de serina é usadapara substituir tanto o ácido glutâmico na posição 12 do comprimento-totalTGF-B3 tipo selvagem e a arginina na posição 52 de comprimento-total doTGF-B3 tipo selvagem.

Um primeiro exemplo de um TGF-p3 preferido de acordo com oterceiro aspecto da invenção é estabelecido na Seqüência ID No.7. A inven-ção abrange fragmentos ou derivados biologicamente ativos de SeqüênciaID No. 7 compreendendo a substituição Glul2-Ser. cDNA codificando esteTGF-P3 preferido é estabelecido na Seqüência ID No. 8.

Um segundo exemplo de um TGF-p3 preferido de acordo com oterceiro aspecto da invenção é estabelecido na Seqüência ID No. 9. Frag-mentos ou derivados biologicamente ativos da Seqüência ID No. 9 compre-endendo a substituição Arg52-Ser constituem também fragmentos ou deri-vados preferidos, de acordo com a invenção. cDNA codificando este TGF-P3preferido é estabelecido na Seqüência ID No. 10.

Um terceiro exemplo de um TGF-B3 preferido, de acordo com oterceiro aspecto da invenção é estabelecido na Seqüência ID No. 11 frag-mentos ou derivados biologicamente ativo de Seqüência ID No. 11 que com-prendem tanto a substituição Glul2-Ser e a substituição Arg52-Ser constitu-em também fragmentos ou derivados preferidos, de acordo com a invenção.cDNA codificando este TGF-p3 preferido é estabelecido na Seqüência IDNo. 12.

Os inventores acreditam que TGF-p3s ou fragmentos ou derivados destes biologicamente ativos, de acordo com o terceiro aspecto da in-venção podem ser utilizados em todos os contextos em que se podem fazeruso da atividade biológica do TGF-p3 tipo selvagem. Estes incluem, mas nãoestão limitados a, usos terapêuticos do TGF-p3. Desta forma, a invençãotambém fornece a utilização de um TGF-P3 ou fragmento ou derivado des-tes, de acordo com o terceiro aspecto da invenção como um medicamento.

TGF-B3s da invenção ou fragmentos ou derivados destes biolo-gicamente ativos podem ser utilizados no tratamento de feridas (incluindoferidas crônicas, tais como, úlceras). Eles podem, particularmente, ser utili-zados para promover a cicatrização acelerada da ferida com prevenção, re-dução ou inibição da cicatriz, e/ou para promover a reepitelialização de feri-das. TGF-B3s da invenção pode também ser utilizado para efeitos de pre-venção ou tratamento de distúrbios fibróticos, em que pode ser selecionadoindependentemente do grupo compreendendo fibrose pulmonariana, cirrosehepática, esclerodermia e glomerulonefrite, fibrose pulmonar, fibrose hepáti-ca, fibrose da pele, fibrose muscular, fibrose por radiação, fibrose renal, Vi-treorretinopatia proliferante e fibrose uterina.

TGF-B3s da invenção pode ser utilizado no tratamento da escle-rodermia, distúrbios de angiogênese, restenose, adesões, endometriose,doença isquêmica, indução de cartilagens e osso indução, fertilização in vi-tro, mucosite oral e doença renal. A título de exemplo, a aplicação tópica dodimérico TGF-B3, tipo selvagem tem sido demonstrado, em modelos animaise clínicos, para acelerar a taxa de cicatrização crônica de úlceras por pres-são não cicatrizantes; reduz a incidência, severidade e duração da fase oralda mucosite e reduz os efeitos laterais adversos da radiação da síndromegastrointestinal resultante dos danos às células-tronco causados pela radio-terapia e quimioterapia durante o tratamento do câncer. Os inventores acre-ditam que TGF-p3s da invenção ou fragmentos ou seus derivados, benefici-almente podem ser utilizados em todas estas indicações.

TGF-B3s da invenção podem ser usados da mesma forma comoTGF-B3 de ocorrência naturalmente, por exemplo, para o tratamento de con-dições em que podem, por exemplo, ser selecionados independentementedo grupo compreendendo distúrbios fibróticos, esclerodermia, distúrbios deangiogênese, restenose, adesões, endometriose, doença isquêmica, indu-ção de cartilagens e osso, fertilização in vitro, mucosite oral, doença renal,prevenção, redução ou inibição da cicatriz, melhoramento da reconexão neu-ronal no sistema nervoso central e periférico e para prevenir, reduzir ou inibiras complicações da cirurgia ocular (tal como cirurgia de LASIK ou PRK).TGF^3s da invenção podem ser utilizados no tratamento de fissura de lábioe palato (por exemplo, em conjugação com a reparação cirúrgica de taiscondições) e, na redução ou inibição da cicatriz e cicatrização acelerada detendões. As formas mutantes de TGF-B3 descritas na presente invenção sãocapazes de promover a cicatrização acelerada e/ou evitar, reduzir ou inibir aformação da cicatriz da mesma maneira como TGF-B3 de ocorrência natural.Eles também são capazes de promover a regeneração epitelial em locais dedano epitelial.

O " TGF-B3 da invenção" e para ser empregado para emglobarqualquer TGF-B3 mutante, de acordo com qualquer um dos primeiro, segun-do ou terceiro aspectos da presente invenção. Será apreciado que TGF-P3sda invenção não engloba TGF-β ou TGF-B2. A identidade de um TGF-p3pode ser determinada com referência à sua seqüência ou, preferencialmentecom referência à sua atividade biológica. Assim, um TGF-p3 pode ser dife-renciado de um TGF-pi ou um TGF-P2 na base de que é capaz de reduzir aformação da cicatriz em uma ferida em que o TGF-B3 é administrado. TGF-β3ε, de acordo com a presente invenção pode preferncialmente ser TGF-p3snão natural.

Um TGF-B3, de acordo com qualquer aspecto da invenção podeser utilizado na preparação de um medicamento para o tratamento de qual-quer condição em que pode ser desejado a utilizar TGF-B3. Tais usos inclu-em, mas não se limitando a, tratamento de uma das condições consideradasno presente relatório. Pode ser preferível que TGF-B3, de acordo com a pre-sente invenção sejam utilizados na preparação de medicamentos para pro-mover a cicatrização acelerada das feridas e/ou a prevenção, redução ouinibição da cicatriz. Essas cicatrizes podem ser associadas com feridas e/oucom distúrbios fibróticos. Medicamentos fabricados com TGF-B3s da inven-ção podem preferencialmente ser para uso na pele ou nos olhos (por exem-plo, na aceleração da cicatrização da pele ou olhos, ou para a prevenção,redução ou inibição da cicatriz na pele ou olho).TGF-p3s, de acordo com a invenção podem ser tanto TGF-B3sativo ou latente (ou seja, quer com, ou sem, o peptídeo associado à latência).

Salvo para onde o contexto exigir outra forma todas as referên-cias ao TGF-p3s, de acordo com a invenção também devem ser tomadas deforma a abranger fragmentos ou derivados de tais TGF-B3s, onde essesfragmentos ou derivados são caracterizados em que eles compreendemsubstituições (de acordo com primeiro, segundo ou terceiro aspectos da in-venção conforme o caso) que diferenciá-los a partir de fragmentos ou deri-vados produzidos a partir do TGF-B3 tipo selvagem (as seqüências de ami-noácidos da qual é tido para o presente propósito para ser representada pelaSeqüência ID No. 1). Fragmentos ou derivados adequados de TGF-B3s deacordo com o primeiro, segundo ou terceiro aspecto da invenção podem sercompostos, de pelo menos, 10 resíduos de aminoácidos, preferencialmente,pelo menos, 40 resíduos de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo me-nos, 70 resíduos de aminoácidos, e mais preferencialmente ainda, pelo me-nos, 100 resíduos de aminoácidos.

Referências no presente relatório para TGF-B3s e fragmentos deTGF-B3s também englobam derivados de tais proteínas ou fragmentos, ex-ceto para onde o contexto requerer outra forma.

Sem limitações, exemplos adequados de formas adequadas dederivados podem ser selecionados do grupo consistindo em: derivados depeptídeo terapeuticamente eficaz do TGF-B3s da invenção (ou seus frag-mentos); fragmentos ou derivados terapeuticamente eficaz compreendendoou baseados no farmacóforo de TGF-B3s da invenção (ou seus fragmentos);derivados peptóides terapeuticamente eficaz de TGF-B3s da invenção (ouseus fragmentos); derivados de D-aminoácido terapeuticamente eficaz deTGF-B3s da invenção (ou seus fragmentos); peptidomiméticos terapeutica-mente eficaz baseado no TGF-B3s da invenção (ou seus fragmentos); aná-logos pépticos terapeuticamente eficaz de TGF-B3s da invenção (ou seusfragmentos); pseudopeptídeos terapeuticamente eficaz baseado no TGF-B3sda invenção (ou seus fragmentos); peptídeos retro-inverso terapeuticamenteeficaz baseado no TGF-p3s da invenção (ou seus fragmentos); derivativosdepsipeptídeo terapeuticamente eficaz baseados no TGF-B3s da invenção(ou seus fragmentos); derivados P-peptídeo terapeuticamente eficazes ba-seados no TGF-B3s da invenção (ou seus fragmentos), e derivados retro-peptóideos terapeuticamente eficaz baseados no TGF-B3s da invenção (ouseus fragmentos).

Será apreciado que, para efeitos da presente invenção "umTGF-B3" pode ser empregado para englobar tanto as formas monoméricas ediméricas de TGF-B3. Os inventores têm surpreendentemente encontradoque TGF-B3s de acordo com a presente invenção são capazes de exerceros seus efeitos biológicos, em ambos as formas monoméricas e diméricas.Isto contrasta surpreendentemente com o que foi previamente relatado noestado da técnica, onde é geralmente considerado que TGF-βε, tal como,TGF-B3 podem apenas exercer a atividade biológica, quando em sua formadimérica. Os inventores concluíram que TGF-B3s, de acordo com a presenteinvenção, podem ser utilizados na forma monomérica que proporciona gran-des vantagens na medida em que tais formas monoméricas podem ser ge-radas através de técnicas de dobramento relativamente simples (exemplosde que são discutidos mais adiante) deste modo, aumentando a velocidadecom a qual as moléculas biologicamente ativas podem ser geradas, aomesmo tempo, reduzindo os custos associados com a produção de tais mo-léculas.

Pode ser preferível que um TGF-P3 monomérico da invenção éum TGF-B3, tal como estabelecido no Seqüência ID N— 3, 5, 7, 9 ou 11, ouum fragmento ou derivado deste.

Um "medicamento da invenção" é para ser empregado paracompreender qualquer medicamento que compreenda um TGF-P3, de acor-do com a invenção. Um medicamento da invenção pode, adicionalmente oualternativamente ser um medicamento que compreenda um ácido nucléicocodificando um TGF-B3, de acordo com a invenção. Este engloba ambos osmedicamentos per se (ou seja, independentemente da utilização em que omedicamento é para ser posto), e medicamentos para uso em aplicaçõesterapêuticas específicas (por exemplo, no tratamento ou melhoria das condi-ções consideradas no presente relatório). É também entendido que medica-mentos da invenção devem ser entendidos para abranger medicamentosque compõem derivados ou fragmentos TGF-B3s adequados da invenção,ou ácidos nucléicos codificando tais fragmentos ou derivados.

Um "método de tratamento da invenção" (ou "método da inven-ção") é para ser empregado para compreender qualquer método de trata-mento que utiliza uma quantidade terapeuticamente eficaz de TGF-B3, deacordo com a invenção, ou um ácido nucléico codificando tal TGF-B3. É paraser entendido que os métodos de tratamento da invenção devem ser enten-didos para abranger métodos de tratamento que utilizam adequados frag-mentos ou derivado de TGF-B3s da invenção, ou ácidos nucléicos codifican-do tais fragmentos ou derivado.

Medicamentos compreendendo TGF-p3s da invenção ou frag- mentos ou derivados biologicamente ativos destes, podem ser utilizados notratamento de feridas (incluindo as feridas crônicas, tais como, úlceras). Elespodem particularmente ser usados para promover a cicatrização aceleradada ferida com a prevenção redução ou inibição da cicatriz e/ou para promo-ver o reepitelialização de feridas. TGF-B3s da invenção podem também serutilizados para efeitos de prevenção ou tratamento de distúrbios fibróticos,tais como, fibrose pulmonariana, cirrose e fibrose hepática, esclerodermia,glomerulonefrite, fibrose de pele, fibrose por radiação, fibrose renal, Vitreor-retinopatía proliferativa ou fibrose uterina.

TGF-B3s da invenção podem ser utilizados no tratamento decondições selecionadas independentemente do grupo constituído em: escle-rodermia, distúrbios de angiogênese, restenose, adesões, endometriose,doença isquêmica, indução de cartilagem e osso, fertilização in vitro, mucosi-te oral, doença renal, Fibrose pulmonar, cirrose e fibrose hepática, glomeru-lonefrite, fibrose de pele, fibrose por radiação, fibrose renal e fibrose uterina.A título de exemplo, a aplicação tópica de TGF-B3 dimérico, tipo selvagemtem sido demonstrada, em modelos animais e clínicos para acelerar a taxade cicatrização de úlceras por pressão não cicatrizante crônicas; reduzir aincidência, severidade e duração da mucosite oral e reduzir os efeitos late-rais adversos da radiação da síndrome gastrointestinal resultante de danosàs células tronco causados pela radioterapia e quimioterapia durante o tra-tamento do câncer. Os inventores acreditam que TGF-B3s da invenção oufragmentos ou derivados destes podem ser beneficialmente utilizados emtodas destas indicações.

A atividade biológica a ser exibida pelo TGF-B3 ou fragmento ouderivado deste, de acordo com a presente invenção pode preferencialmenteser atividade anticicatrizante de TGF-B3 e esta atividade pode preferencial-mente ser investigada in vivo.

Uma quantidade efetiva terapeuticamente de TGF-B3 ou umfragmento ou derivado deste, de acordo com a presente invenção é umaquantidade suficiente para causar uma exigida

i) aceleração na cura da ferida e/ou inibição de cicatrização; ou

ii) promoção da regeneração epitelial; ou

iii) prevenção e/ou tratamento de um distúrbio fibrótico.

A extensão da aceleração da cura da ferida e/ou inibição da ci-catriz ou regeneração epitelial que pode ser exigida será aparente, e certa-mente pode prontamente ser determinada por um clínico responsável para ocuidado do paciente. Uma avaliação adequada da extensão da aceleraçãoda cura da ferida e/ou inibição da cicatriz ou promoção da regeneração epi-telial pode ser determinada pelo clínico e pode ser com referência aos méto-dos de medição sugeridos descritos aqui.

TGF-B3s adequados de acordo com a invenção, bem comofragmentos ou derivados de tal TGF-B3s podem ser selecionados com refe-rência a qualquer ou todas as considerações descritas aqui.

A habilidade de TGF-B3s da invenção para acelerar a cura daferida pode ser rapidamente preciada e/ou medida com referência a proprie-dades exibidas pela feridas tratadas. Para o presente propósito uma "feridatratada" pode ser considerada ser uma ferida exposta a uma quantidade te-rapeuticamente eficaz do medicamento da invenção ou em que tenha rece-bido tratamento de acordo com os métodos da invenção.A aceleração da cicatrização de feridas tratadas pode ser ilus-trada por uma taxa aumentada de epitelialisação em comparação às feridasde controle. Assim os métodos e medicamentos da invenção promovem umareconstituição mais rápida de uma camada epitelial funcional sobre uma á-rea ferida do que, de outra maneira, seria o caso.

Alternativa ou adicionalmente, a cicatrização acelerada de feri-das tratadas pode ser ilustrada pela largura diminuída comparada às feridasde controle em pontos de tempo comparáveis. Será apreciado que esta re-dução na largura da ferida assegura que haja uma taxa relativamente maisrápida de fechamento da ferida (uma vez que há menos largura da ferida aestar fechada) e esteja indicativo da capacidade de tais medicamentos deacelerar a resposta de cicatrização. Feridas mais estreitas podem resultarem cicatrizes mais estreitas que sejam esteticamente preferíveis a cicatrizesmais largas.

Conseqüentemente, a cura da ferida acelerada no contexto dapresente invenção deve ser tomada para abranger todo o aumento na taxade cicatrização de uma ferida tratada em comparação à taxa de cicatrizaçãoque ocorre em feridas de controle tratadas ou não tratadas. Preferivelmentea aceleração da cura da ferida pode ser avaliada em relação à comparaçãoda taxa de reepitelialisação alcançada em feridas tratadas e de controle, ouà comparação da largura relativa de feridas tratadas e de controle em pontosde tempo comparáveis. Mais preferivelmente a cicatrização acelerada daferida pode ser definida como compreendendo ambas uma taxa aumentadade repitelialização e uma redução de largura de ferida comparada a feridasde controle em pontos de tempo comparáveis.

Preferivelmente, a promoção da cicatrização acelerada da feridapode causar uma taxa de cura da ferida que é de pelo menos 5%, 10%, 20%ou 30% maior do que a taxa de cicatrização que ocorre em uma ferida decontrole ou não tratada. Mais preferivelmente a promoção da cicatrizaçãoacelerada da ferida pode causar uma taxa de cicatrização que é de pelo me-nos 40%, 50% ou 60% maior do que a cicatrização em uma ferida de contro-le. É ainda mais preferível que a promoção da cicatrização acelerada da fe-rida pode causar uma taxa de cicatrização que é de pelo menos 70%, 80%,ou 90% maior do que aquela que ocorre em feridas de controle, e mais pre-ferivelmente a promoção da cicatrização acelerada da ferida pode causaruma taxa de cicatrização que é de pelo menos 100% maior do que a taxaque ocorre em feridas de controle.

Existe uma larga escala de distúrbios de cicatrização de feridaque são caracterizados, ou pelo menos caracterizados parcialmente, porfalha, pelo atraso ou retardo inapropriado da resposta de cura da ferida nor-mal. A capacidade de determinados métodos e medicamentos da invençãode promover a cicatrização acelerada da ferida é, assim, de utilidade na pre-venção ou tratamento de tais distúrbios.

Uma vez que determinados métodos e medicamentos da inven-ção são capazes de causar a aceleração da cura da ferida através da pro-moção de uma resposta de reepitelialisação estimulada (que aumenta, des-se modo, a taxa na qual a ferida se fecha) se apreciado que estes métodos emedicamentos da invenção são particularmente vantajosos para tratamentodas feridas de pacientes que podem, de outra maneira, tender para repitelia-lisação defeituosa, atrasada ou, de outra maneira, prejudicada. Por exemplo,é bem-conhecido que feridas cutâneas na velhice exibem uma resposta dereepitelialisação menos vigorosa do que aquelas de indivíduos jovens. Hátambém muitas outras circunstâncias ou distúrbios em que a cura da ferida éassociada à reepitelialisação atrasada ou de outra maneira prejudicada. Porexemplo, pacientes que sofrem de diabetes, pacientes com polifármaco (porexemplo, em conseqüência da idade avançada), mulheres com pós-menopausa, pacientes suscetíveis a danos de pressão (por exemplo, para-plégicos), pacientes com doença venosa, pacientes clinicamente obesos,pacientes que recebem quimioterapia, pacientes que recebem radioterapia,pacientes que recebem o tratamento esteróide ou pacientes imunocompro-metidos podem todos sofrer de cicatrização de ferida com reepitaiização pre-judicada. Em muitos casos a falta de uma resposta de reepitalialização a-propriada contribui para o desenvolvimento de infecções no local da ferida,que pode, por sua vez, contribuir para a formação de feridas crônicas, taiscomo úlceras. Conseqüentemente, será apreciado que tais pacientes sãoparticularmente prováveis de serem beneficiados de métodos ou medica-mentos adequados da invenção.

Feridas crônicas são talvez o exemplo mais importante de dis-túrbios associados com uma resposta atrasada de cura da ferida. Uma feridapode ser definida como crônica se não mostra nenhuma tendência de cica-trização dentro de oito semanas a partir da formação quando sujeita a trata-mento terapêutico (convencional) apropriado. Exemplos bem-conhecidos deferidas crônicas incluem úlceras venosas, úlceras diabéticas e úlceras decu-bitus, porém as feridas crônicas podem surgir de outros danos agudos nor-mais a qualquer hora. Feridas tipicamente crônicas podem surgir como re-sultado de infecção do local da ferida, tratamento inadequado da ferida, oucomo um segmento de transtorno de tecido progressivo causado por doençavascular metabólica, arterial ou venosa, pressão, dano de radiação, ou tu-mor.

Será apreciado que métodos e medicamentos da invenção ca-pazes de acelerar a cura da ferida podem ser utilizados no tratamento deferidas crônicas existentes a fim de promover sua cicatrização. Tais métodose medicamentos podem promover a reepitelização de feridas crônicas, des-se modo, causando cicatrização e fechamento do distúrbio. Métodos e medi-camentos preferidos da invenção (tais como aqueles utilizando TGF-p3scompreendendo seqüências ID N— 3,5,7,9 e 11) podem também inibir a ci-catriz associada com cura da ferida. A prevenção da cicatriz em tais contex-tos pode ser particularmente vantajosa, uma vez que feridas crônicas tipica-mente se estendem sobre porções relativamente grandes do corpo do paciente.

Além disso, ou alternativamente, para seu uso no tratamento deferidas crônicas existentes, métodos e medicamentos adequados da inven-ção podem ser usados para prevenir feridas agudas de pacientes pré-dispostos para a cicatrização de ferida enfraquecida desenvolvendo-se emferidas crônicas. Uma vez que métodos e medicamentos adequados da in-venção são capazes de promover cobertura epitelial do local danificado, elessão capazes de reduzir a probabilidade de uma ferida tratada se tornar infec-tada. Similarmente, esta promoção de reepitalização pode beneficiar o tra-tamento de feridas crônicas que surgem como resultado de outras condiçõestais como diabetes ou doença venosa.

Um grupo adicional de pacientes que podem derivar benefícioparticular dos métodos e medicamentos da invenção é aqueles em que osistema imunológico é comprometido (por exemplo, pacientes que se sub-metem à quimioterapia ou à radioterapia, ou aqueles que sofrem de infecçãopor HIV). É bem-reconhecido que feridas de pacientes imunocomprometidos,que podem não ser capazes de montar uma resposta inflamatória normalapós ferimento, tendem a ser associados com resultados de cicatrizaçãofracos. Tais pacientes podem tirar proveito do tratamento com métodos emedicamentos adequados da invenção.

A capacidade de TGF-p3 da invenção tal como aquela compre-endendo as seqüências ID N9 3, 5, 7, 9 ou 11 para promover a cicatrizaçãoacelerada de ferida, enquanto prevenindo, reduzindo ou inibindo a cicatriz étambém de uso em mais contextos clínicos gerais. Os exemplos destes be-nefícios adicionais podem ser considerados com referência à cicatrização deferidas pela intenção primária, secundária ou terciária, como descrita abaixo.

Para as finalidades da presente invenção, cicatrização pela in-tenção primária pode ser considerada para envolver o fechamento por meioscirúrgicos (tais como suturas, tiras ou grampos adesivos) de bordas opostasde uma ferida. Cicatrização pela intenção primária é empregada tipicamenteno tratamento de incisões cirúrgicas ou em outras feridas limpas, e é associ-ada com níveis mínimos de perda de tecido. A pessoa versada reconheceráque uma vez que TGF-p3, de acordo com a invenção (tal como, aquelescompreendendo a seqüência ID Ne 3, 5, 7, 9 ou 11) são capazes de reduzira largura da ferida, eles também facilitam a junção de bordas opostas daferida, e assim pode ser benéfico na cicatrização de ferida pela intençãoprimária. Além disso, tais métodos ou medicamento podem (como descritomais abaixo) resultar na prevenção, redução ou inibição de cicatriz que podede outra maneira ocorrer em tal cicatrização. Os inventores acreditam que otratamento, desse modo, pode ter um impacto tanto na aparência macroscó-pica e microscópica das cicatrizes formadas das feridas tratadas; macrosco-picamente as cicatrizes podem ser menos visíveis e misturam-se com a pelecircunvizinha, microscopicamente as cicatrizes podem exibir uma regenera-ção de uma estrutura de pele mais normal.

Para os propósitos da presente invenção, cicatrização pela in-tenção secundária pode ser considerada para constituir o fechamento dasferidas pelo processo de cura da ferida, sem intervenção cirúrgica direta. Asferidas a serem cicatrizadas pela intenção secundária podem ser sujeitas acuidado contínuo (por exemplo, o curativo e o recurativo da ferida assim co-mo a aplicação de medicamentos adequados), mas são os processos natu-rais de formação do tecido de granulação e reepitelialização que causam ofechamento da ferida. Será apreciado que, uma vez que, os TGF-p3s da in-venção (tais como, aqueles que utilizam compreendem seqüência ID Nes 3,5,7,9 ou 11) são capazes de aumentar a taxa de reepitalização quandocomparados àquelas que ocorrem em feridas de controle, eles têm utilidadena promoção de cicatrização de ferida por intenção secundária.

Cicatrização pela intenção terciária pode ser considerada paracompreender o fechamento cirúrgico de uma ferida que foi deixada previa-mente aberta para permitir pelo menos a formação parcial do tecido de gra-nulação e reepitelialisação. As propriedades de métodos e medicamentospreferidos da invenção que os fazem adequados para uso na cicatrizaçãopela intenção primária ou secundária são também benéficos no contexto depromover a cura da ferida pela intenção terciária.

O uso de TGF-p3s da invenção utilizando tais como seqüênciaID Ne 3, 5, 7, 9 ou 11 para estimular reepitelialização (como parte de suapromoção de cicatrização acelerada de ferida) enquanto inibindo a cicatriz étambém particularmente eficaz no tratamento de feridas associadas a proce-dimentos de enxerto. O tratamento usando tais métodos e medicamentos dainvenção é benéfico para tanto no local doador de enxerto (onde pode ajudarno restabelecimento de uma camada epitelial funcional ao prevenir, reduzirou inibir a formação de cicatriz), e também em locais de destinos de enxerto(onde os efeitos da anticicatriz do tratamento inibem a formação de cicatriz,enquanto a cicatrização acelerada promove integração do tecido enxertado).Os inventores acreditam que os métodos e os medicamentos da invençãoconferem vantagens nos contextos de pele que utilizam enxerto, pele artifici-al, ou substitutos da pele.

Os inventores descobriram que os métodos e medicamentos dáinvenção que utilizam TGF-p3s compreendendo seqüência ID N5S 3, 5, 7, 9ou 11 são capazes de promover a cicatrização acelerada da ferida com inibi-ção da cicatriz quando administrados tanto antes do ferimento ou uma vezque uma ferida já tenha sido formada.

Os inventores descobriram que métodos Ou medicamentos dainvenção que utilizam TGF-p3s, tais como aqueles que compreendem se-qüências ID NQs 3, 5, 7, 9 e 11 são capazes de promover a regeneração epi-telial. A promoção da regeneração epitelial dentro do contexto da presenteinvenção pode ser compreendida para abranger qualquer aumento na taxada regeneração epitelial em comparação à regeneração que ocorre em umepitélio de controle tratado ou não tratado.

A taxa de regeneração epitelial fixada usando métodos ou medi-camentos adequados de acordo com a invenção pode prontamente ser comparada com àquela que ocorre no epitélio de controle tratado ou nãotratado usando qualquer modelo adequado de regeneração epitelial conhe-cido na técnica. Por exemplo, a taxa na qual os locais de dano epitelial expe-rimental tendo regeneração de áreas conhecidas podem ser comparadosusando modelos in vivo bem-conhecidos em camundondos, ratos, coelhosou porcos, tais como, aqueles descritos em Tomlinson e Ferguson (2003),Davidson e outros (1991) e Paddock e outros (2003).

Sem desejar limitar-se por qualquer hipótese, os inventores a-creditam que a promoção da regeneração epitelial alcançada por TGF-P3sda invenção é mediada por sua promoção da migração celular epitelial. Ascélulas epiteliais (a migração de que foi promovida) são desse modo capa-zes de repovoar e regenerar mais rapidamente o epitélio danificado do queocorre na ausência de tratamento.Será apreciado que a promoção de regeneração epitelial usandoTGF-B3s da invenção pode ser de uso para induzir reepitelialisação eficaznos contextos em que a resposta de reepitelialisação é prejudicada, inibida,retardada ou de outra maneira, defeituosa. A promoção de regeneração epi-telial pode também ser efetuada para acelerar a taxa de respostas de rege-neração epitelial defeituosa ou normal em pacientes que sofrem de danoepitelial.

Há muitos contextos em que a resposta de reepitelialisação docorpo pode ser defeituosa. Por exemplo, reepitelialisação defeituosa na peleé associada com condições tais como pênfigo, doença de Hailey-Hailey(pênfigo benigno familiar), necrólise epidérmica tóxica (TEN)/síndrome deLyell, epidermólise bolhosa, Ieishmaniose cutânea e ceratose actínica. Ree-pitelialisação defeituosa dos pulmões pode ser associada com fibrose pul-monar idiopática (IPF) ou doença de pulmão intersticial. Reepitelialisaçãodefeituosa do olho pode ser associada com condições tais como deficiênciade célula de tronco Iimbal parcial ou erosões córneas. Reepitelialisação de-feituosa do cólon ou trato gastrointestinal pode ser associada com condiçõestais como fissura anal crônica (fissura in ano), colite ulcerosa ou doença deCrohn, e outros distúrbios inflamatórios de intestino.

Como foi exposto acima, TGF-p3s da presente invenção podemprevenir, reduzir ou, de outra maneira, inibir a cicatriz. Esta inibição da cica-triz pode ser efetuada em qualquer local do corpo e em qualquer tecido ouórgão, incluindo a pele, o olho, os nervos, os tendões, os ligamentos, o mús-culo, e a cavidade oral (incluindo os lábios e o palato), assim como órgãosinternos (tais como o fígado, o coração, o cérebro, a cavidade abdominal, acavidade pélvica, a cavidade torácica, os intestinos e o tecido reprodutivo).Na pele, o tratamento pode melhorar a aparência macroscópica e microscó-pica de cicatrizes; macroscpicamente as cicatrizes podem ser menos visíveise misturam-se com a pele circunvizinha, microscopicamente as fibras de co-lágeno dentro da cicatriz podem ter a morfologia e a organização que é maissimilar àquelas na pele circunvizinha. A prevenção, redução ou inibição decicatrização dentro do contexto da presente invenção deve ser compreendi-da para abranger qualquer grau de prevenção, redução ou inibição em cica-trização em comparação ao nível de cicatrização que ocorre em uma feridade controle tratada ou não tratada (como definido em outra parte no relatóriodescritivo). Exceto onde o contexto exige, de outra maneira, referências à"prevenção", "redução" ou "inibição" de cicatrização podem ser tomadas pa-ra serem mecanismos equivalentes que são todos manifestados em ativida-de anticicatrização.

A prevenção, redução ou inibição da cicatriz cutânea usandométodos e medicamentos da invenção pode ser avaliada e/ou medida comreferência à aparência microscópica ou, preferivelmente, macroscópica deuma cicatriz tratada em comparação à aparência de uma cicatriz não trata-da. Mais preferivelmente a prevenção, redução ou inibição de cicatrizaçãopode ser avaliada com referência à aparência macroscópica e microscópicade uma cicatriz tratada. Para as presentes finalidades uma "cicatriz tratada"pode ser definida como uma cicatriz formada na cicatrização de uma feridatratada, visto que uma "cicatrização não tratada" pode ser definida como acicatriz formada na cicatrização de uma ferida não tratada, ou uma feridatratada com placebo ou cuidado-padrão. Cicatrizes de comparação adequa-das podem preferivelmente ser combinadas com cicatriz tratada com refe- rência à idade, local, tamanho e paciente da cicatriz.

Em consideração à aparência macroscópica de uma cicatriz re-sultando de uma ferida tratada, a extensão de cicatrização, e então a magni-tude de qualquer prevenção, inibição ou redução na cicatriz alcançada, podeser avaliada com referência a qualquer de vários parâmetros.

Parâmetros adequados para a avaliação macroscópica de cica-trizes podem incluir:

i) Cor da cicatriz. Como notado acima, as cicatrizes podem tipi-camente ser hipopigmentada ou hiperpigmentada no que refere-se à pelecircunvizinha. A inibição ou a redução de cicatrização pode ser demonstradaquando a pigmentação de uma cicatriz tratada se aproxima mais daquela dapele não cicatrizada do que a pigmentação de uma cicatriz não tratada. Simi-larmente, as cicatrizes podem ser mais vermelhas do que a pele circunvizi-nha. Neste caso a inibição ou a redução de cicatrização pode ser demons-trada quando a vermelhidão de uma cicatriz tratada se desvanece mais ce-do, ou mais completamente, ou assemelha-se mais proximamente à aparên-cia da pele circunvizinha, comparada a uma cicatriz não tratada.

ii) Altura da cicatriz. As cicatrizes podem tipicamente ser altas oubaixas em comparação à pele circunvizinha. A inibição ou a redução de cica-trização pode ser demonstrada quando a altura de uma cicatriz tratada seaproxima mais daquela da pele não cicatrizada (isto é nem está mais altanem mais baixa) do que a altura de uma cicatriz não tratada.

iii) Textura de superfície da cicatriz. As cicatrizes podem ter su-perfícies que são relativamente mais lisas do que a pele circunvizinha (quecausa uma cicatriz com uma aparência "lustrada") ou que são mais ásperasdo que a pele circunvizinha. A inibição ou a redução de cicatrização pode serdemonstrada quando a textura de superfície de uma cicatriz tratada se apro-xima mais daquela da pele não cicatrizada do que a textura de superfície deuma cicatriz não tratada.

iv) Rigidez da cicatriz. A composição e a estrutura anormais dascicatrizes significam que é normalmente mais dura do que a pele não danifi-cada que cerca a cicatriz. Neste caso, a inibição ou a redução de cicatriza-ção pode ser demonstrada quando a rigidez de uma cicatriz tratada se apro-xima mais daquela da pele não cicatrizada do que a rigidez de uma cicatriznão tratada.

Uma cicatriz tratada demonstrará preferivelmente prevenção,inibição ou redução da cicatriz como avaliada com referência a pelo menosum dos parâmetros para avaliação macroscópica exposta acima. Mais prefe-rivelmente uma cicatriz tratada pode demonstrar cicatriz prevenida, inibidaou reduzida com referência a pelo menos dois dos parâmetros, mais preferi-velmente a pelo menos três dos parâmetros, e mais preferivelmente todos osquatro destes parâmetros. Uma avaliação total de cicatrização pode ser feitausando, por exemplo, uma Escala Analógica Visual ou uma escala de avali-ação digital.

Parâmetros adequados para avaliação microscópica de cicatri-zes podem incluir:

i) Espessura de fibras de matriz extracelular (ECM). Cicatrizestipicamente contêm fibras mais finas de ECM do que são encontradas napele circunvizinha. Esta propriedade é ainda mais pronunciada no caso dequelóide e de cicatrizes hipertróficas. A inibição ou a redução de cicatrizaçãopode ser demonstrada quando a espessura de fibras de ECM em uma cica-triz tratada se aproxima mais da espessura de fibras de ECM encontradasna pele não cicatrizada do que a espessura de fibras encontradas em umacicatriz não tratada.

ii) Orientação de fibras de ECM. Fibras de ECM encontradas emcicatrizes tendem a exibir um maior grau de alinhamento uma com as outrasdo que aquelas encontradas na pele não tratada (que têm uma orientaçãoaleatória denominada freqüentemente como "cesta de basquete"). A ECM decicatrizes patológicas tais como quelóides e de cicatrizes hipertróficas podeexibir orientações ainda mais anômalas, formando freqüentemente grandes"redemoinhos" ou "cápsulas" de moléculas de ECM. Conseqüentemente, ainibição ou a redução de cicatrização pode ser demonstrada quando a orien-tação de fibras de ECM em uma cicatriz tratada se aproxima mais da orien-tação de fibras de ECM encontradas na pele não cicatrizada do que a orien-tação de tais fibras encontradas em uma cicatriz não tratada.

iii) Composição de ECM da cicatriz. A composição de moléculasde ECM presentes em cicatrizes mostra diferenças daquela encontrada napele normal, com uma redução na quantidade de elastina presente em ECMde cicatrizes. Assim a inibição ou a redução de cicatrização pode ser de-monstrada quando a composição de fibras de ECM na derme de uma cica-triz tratada se aproxima mais da composição de tais fibras encontradas napele não tratada do que a composição encontrada em uma cicatriz não tra-tada.

iv) Celularidade da cicatriz. As cicatrizes tendem a conter relati-vãmente menos células do que a pele não cicatrizada. Conseqüentemente,será apreciado que a inibição ou a redução de cicatrização pode ser de-monstrada quando a celularidade de uma cicatriz tratada se aproxima maisda celularidade da pele não cicatrizada do que a celularidade de uma cicatriznão tratada.

Uma cicatriz tratada demonstrará preferivelmente prevenção,redução ou inibição da cicatriz como avaliada com referência a pelo menosum dos parâmetros para avaliação microscópica exposto acima. Mais prefe-rivelmente uma cicatriz tratada, pode demonstrar prevenção, redução ouinibição da cicatriz com referência a pelo menos dois dos parâmetros, maispreferivelmente pelo menos três dos parâmetros, e mais preferivelmente to-dos os quatro destes parâmetros.

Prevenção, redução ou inibição da cicatriz de uma ferida tratadapode adicionalmente ser avaliada com referência a parâmetros adequadosusados no:

i) Avaliação clínica macroscópica de cicatrizes, particularmenteavaliação de cicatrizes sobre um sujeito;

ii) Avaliação de imagens fotográficas de cicatrizes;

iii) Avaliação de moldes de silicone ou de moldes de gesso posi-tivo feitos de moldes de silicone de cicatrizes; e

iv) Avaliação microscópica de cicatrizes, por exemplo, por análi-se histológica da estrutura microscópica de cicatrizes.

Será apreciado que prevenção, redução ou inibição da cicatrizde uma ferida tratada pode ser indicada pela melhoria de um ou mais de taisparâmetros adequados, e que no caso de prevenção, redução ou inibiçãocomo avaliado com referência a um número de parâmetros que estes parâ-metros podem ser combinados de esquemas diferentes de avaliação (porexemplo, redução, inibição ou melhoria em pelo menos um parâmetro usadona avaliação macroscópica e em pelo menos um parâmetro usado na avali-ação microscópica).

Prevenção, redução ou inibição da cicatriz pode ser demonstra-da por uma melhoria em um ou mais parâmetros que indicam que uma cica-triz tratada se aproxima mais da pele não cicatrizada com referência aos pa-râmetros selecionados do que uma cicatriz não tratada ou de controle.

Parâmetros adequados para a medição e avaliação clínicas decicatrizes podem ser selecionados baseados em uma variedade de medi-ções ou avaliações que incluem aquelas descritas por Beausang e outros(1998) e Van Zuijlen e outros (2002).

Tipicamente, parâmetros adequados podem incluir:

1. Avaliação com relação à classificação de cicatriz da EscalaAnalógica Visual (VAS).

Prevenção, redução ou inibição da cicatriz pode ser demonstra-da por uma redução na classificação de VAS de uma cicatriz tratada quandocomparada a uma cicatriz de controle. Uma VAS adequada para o uso naavaliação de cicatrizes pode ser baseada no método descrito por Beausange outros (1998).

2. Altura de cicatriz, largura de cicatriz, perímetro de cicatriz, á-rea de cicatriz ou volume de cicatriz.

A altura e a largura de cicatrizes podem ser medidas diretamen-te sobre o sujeito, por exemplo, por uso de dispositivos de medição manuaistais como compassos de calibre. Largura de cicatriz, perímetro e área po-dem ser medidos sobre o sujeito ou por análise da imagem de fotografias dacicatriz. A pessoa versada também estará ciente de métodos e dispositivosnão invasivos adicionais que podem ser usados para investigar parâmetrosadequados, incluindo molde de silicone, ultra-som, profilimetria tridimensio-nal óptica e Imagem de Ressonância Magnética de alta resolução.

Prevenção, redução ou inibição da cicatriz pode ser demonstra-da por uma redução na altura, largura, área ou volume, ou qualquer combi-nação dos mesmos, de uma cicatriz tratada em comparação a uma cicatriznão tratada.

3. Aparência e/ou cor de cicatriz comparada à pele não cicatri-zada circunvizinha.

Aparência ou cor de uma cicatriz tratada pode ser comparadaàquela da pele não cicatrizada circunvizinha, e as diferenças (eventualmen-te) comparadas com a diferença entre a aparência e cor de cicatrizes nãotratadas e pele não cicatrizadas. Tal comparação pode ser feita com baseem uma avaliação visual das respectivas cicatrizes e pele não cicatrizada. Aaparência de uma cicatriz pode ser comparada com a pele não cicatrizadacom referência a se a cicatriz é mais clara ou mais cicatrização do que a pe-le não cicatrizada. As respectivas cores das cicatrizes e da pele podem per-feitamente ser combinadas a uma outra, ligeiramente descombinada, obvia-mente descombinada ou rudemente descombinada.

Alternativa ou adicionalmente para avaliação visual, há um nú-mero de dispositivos colorimétricos não invasivos que podem fornecer dadoscom relação à pigmentação de cicatrizes e pele não cicatrizada, assim comoa vermelhidão da pele (que pode ser um indicador do grau de vascularidadepresente na cicatriz ou na pele). Exemplos de tais dispositivos incluem o Mi-nolta Chronameter CR-200/300; Labscan 600; Dr. Lange Micro Color; Espec-trômetro Derma; Medidor de fluxo de laser Doppler; e espaço de Análise in-tracutânea Espectrofotométrica (SIA).

Prevenção, redução ou inibição de cicatriz pode ser demonstra-da por uma magnitude menor de diferença entre a aparência ou cor de cica-trizes tratadas e pele não cicatrizada do que entre cicatrizes não tratadas epele não cicatrizadas.

4. Distorção de cicatriz e desempenho mecânico

Distorção de cicatriz pode ser avaliada pela comparação visualde uma cicatriz e de uma pele não cicatrizada. Uma comparação adequadapode classificar uma cicatriz selecionada como a causa de nenhuma distor-ção, distorção suave, distorção moderada ou distorção severa.

O desempenho mecânico de cicatrizes pode ser avaliado usan-do um número de métodos e dispositivos não invasivos baseados em suc-ção, pressão, torsão, tensão e acústica. Exemplos adequados incluídos nosdispositivos conhecidos capazes de uso na avaliação do desempenho me-cânico de cicatrizes incluem Indentômetro, Cutômetro, Reviscômetro, análiseViscoelástica de pele, Dermaflex, Durômetro, Medidor de Torque Dérmico,Elastômetro.

Prevenção, redução ou inibição da cicatriz pode ser demonstra-da por uma redução na distorção causada por cicatrizes tratadas em compa-ração àquela causada por cicatrizes não tratadas. Será apreciado tambémque prevenção, redução ou inibição da cicatriz pode ser demonstrada pelodesempenho mecânico da pele não tratada que é mais similar àquele decicatrizes tratadas do que de cicatrizes não tratadas.

5. Contorno de cicatriz e textura de cicatriz.Contorno de cicatriz pode ser investigado por meios de avalia-ção visual. Parâmetros adequados para considerar em tal avaliação incluemse uma cicatriz é ou não nivelada com a pele circunvizinha, ligeiramentepresumida, ligeiramente penetrada, hipertrófica ou quelóide. A textura deuma cicatriz pode ser avaliada com referência à aparência de cicatriz, e estapode também ser comprometida por uma avaliação visual se a cicatriz for,por exemplo, opaca ou brilhante ou tem uma aparência áspera ou lisa emcomparação à pele não cicatrizada.

A textura de cicatriz pode adicionalmente ser avaliada com refe-rência a se a cicatriz tem a mesma textura que a pele não cicatrizada (textu-ra normal), é apenas palpável, firme ou dura comparada à pele não cicatri-zada. A textura de cicatrizes pode também ser avaliada com referência àescala de Hamilton (descrita em Crowe e outros, 1998).

Além das técnicas expostas acima, há um número de dispositi-vos profilimétricos não invasivos que usam métodos óticos ou mecânicospara avaliação do contorno da cicatriz e/ou textura. Tais avaliações podemser realizadas no corpo do sujeito ou, por exemplo, em impressões de moldede silicone de cicatrizes, ou moldes de gesso positivo feitos de tais impres-sões.

Prevenção, redução ou inibição da cicatriz pode ser demonstra-da em eventos que cicatrizes tratadas tiverem perfis e texturas de cicatrizmais comparáveis à pele não cicatrizada do que cicatrizes não tratadas.Avaliações Fotográficas.Painel de Posição Independente.

Avaliação fotográfica de cicatrizes tratadas e não tratadas podeser executada por um painel de configuração independente de assessoresque usam fotografias calibradas e padronizadas das cicatrizes. As cicatrizespodem ser avaliadas por um painel de configuração independente para for-necer dados categóricos de classificação (por exemplo, que uma dada cica-triz tratada é "melhor", "pior" ou "indiferente" quando comparada a uma cica-triz não tratada) e aos dados quantitativos usando uma escala de AnalógicaVisual (VAS) baseada no método descrito por Beausang e outros (1998). Acaptação destes dados pode preparar o uso de software adequado e/ou sis-temas eletrônicos como descritos no pedido de patente co-pendente do re-querente.

Painel de Perito

Avaliação fotográfica de cicatrizes tratadas e não tratadas podealternativa ou adicionalmente ser executada por um painel dos assessoresde perito que usam fotografias calibradas e padronizadas das cicatrizes aserem avaliadas. O painel de peritos pode preferivelmente consistir nos indi-víduos adequados versados na técnica tal como cirurgiões plásticos e cien-tistas de fundamentos adequados.

Tal avaliação pode fornecer dados categóricos, como descritosacima ou com relação à comparação de um curso de tempo de imagens decicatrizes tratadas e não tratadas selecionadas.Avaliações adequadas a serem feitas podem incluir:

Identificação da melhor cicatriz, que para as finalidades da pre-sente invenção pode ser considerada a cicatriz que mais se assemelha àpele circunvizinha. Mais uma vez a melhor cicatriz foi identificada, a magni-tude da diferença entre cicatrizes pode ser considerada, por exemplo, é adiferença entre cicatrizes pequenas ou óbvias. Parâmetros adicionais quepodem ser considerados incluem o tempo mais anterior depois que a forma-ção da cicatriz em que uma diferença entre cicatrizes pode ser detectada, otempo após formação em que a diferença entre cicatrizes é a mais óbvia (oualternativamente a descoberta que a diferença continua após o último pontode tempo avaliado), assim como considerar se a melhor cicatriz permaneceou não consistentemente melhor.

A consideração pode também ser dada se uma cicatriz for con-sistentemente mais vermelha do que a outra, e se a vermelhidão se desva-nece sobre os pontos de tempo considerados (ou continua após o últimoponto de tempo) e se, assim, em qual tempo após a formação da cicatriz.Um painel de perito pode também considerar em qual tempo após formaçãoqualquer diferença na vermelhidão se torna detectável, assim como apósformação do tempo em que a diferença na vermelhidão é mais óbvia.

Um painel de perito pode também considerar se uma de umacicatriz tratada ou não tratada é ou não consistentemente mais branca doque a outra, ou mais branca do que a pele não cicatrizada. Caso uma dife-rença na brancura seja detectável a consideração pode ser dada ao tempoapós a formação da cicatriz em que a diferença pode ser detectada, ao tem-po em que a diferença é mais óbvia, e ao tempo em que a diferença desapa-rece.

Um parâmetro adicional que pode ser avaliado por um painel deperito é a textura de cicatrizes tratadas e não tratadas. Na comparação decicatrizes tratadas e não tratadas o painel de perito pode considerar qual dascicatrizes tem a melhor textura de pele, o tempo mais anterior após a forma-ção da cicatriz em que qualquer diferença presente pode ser detectada, otempo após formação em que qualquer diferença é mais óbvia, e o tempoem que qualquer diferença desaparece.

Comparação de cicatrizes tratadas e não tratadas pode adicio-nalmente avaliar qual das cicatrizes é a mais estreita, e qual das cicatrizes éa mais curta. A consideração pode também ser dada à forma da cicatriz e àproporção da margem da cicatriz que é distingüível da pele circunvizinha.Como anteriormente descrito as avaliações visuais e avaliações de cor, apresença, grau e localização de hiperpigmentação podem também ser con-siderados.

Como notado acima, uma das maneiras em que a qualidade decicatrizes tratadas e não tratadas pode ser comparada é por avaliação mi-croscópica. A avaliação microscópica da qualidade da cicatriz pode tipica-mente ser realizada usando seções histológicas de cicatrizes. O processomicroscopicamente avalia e mede cicatrizes que podem levar em considera-ção dados categóricos baseados nos seguintes parâmetros adequados:

1. Restituição epidérmica. Atenção particular pode ser dada aograu de restauração de cadeias de rede, e à espessura da epiderme restau-rada.

2. Angiogênese e Inflamação. Consideração pode ser dada aonúmero de vasos sangüíneos presentes, ao tamanho dos vasos sangüíneospresentes e à evidência de inflamação, incluindo uma avaliação de qualquernível de inflamação presente.

3. Organização do colágeno. Na avaliação à referência de orga-nização do colágeno pode ser feita à orientação das fibras de colágeno pre-sentes na cicatriz, à densidade de tais fibras e à espessura da fibra de colá-geno na derme de papila e reticular.

4. A avaliação da escala analógica visual (VAS) da organizaçãode colágeno para a derme de papila e para a derme reticular pode tambémfornecer um índice útil de qualidade da cicatriz.

5. Outras características que podem ser levadas em considera-ção ao avaliar a qualidade microscópica das cicatrizes incluem elevação oudepressão da cicatriz relativa à pele não cicatrizada circunvizinha, e a proe-minência ou visibilidade da cicatriz na interface cutânea normal.

6. Será visto que as avaliações descritas acima permitem a ge-ração de dados de classificação de cicatriz que podem não fornecer umaindicação se uma cicatriz tratada é melhor, pior ou indiferente comparada auma cicatriz de controle, não tratada ou a outra cicatriz para comparaçãoadequada.

Além dos dados categóricos, dados quantitativos (preferivelmen-te em relação aos parâmetros acima) podem ser gerados usando análise deimagem em combinação com técnicas adequadas de visualisação. Exem-plos de técnicas adequadas de visualisação que podem ser empregadaspara avaliar a qualidade da cicatriz são manchas histológicas específicas oude imunorrotulagem, onde o grau da mancha ou rotulagem presente podeser quantitativamente determinado por análise de imagem.

Dados quantitativos podem ser úteis e prontamente produzidoscom relação aos seguintes parâmetros:

1. Largura, altura, elevação, volume e área de cicatriz.2. Espessura e cobertura epitelial (por exemplo, a área da epi-derme presente em uma cicatriz ou a proporção de uma ferida com cobertu-ra epidérmica).

3. Número, tamanho, área, (isto é, seção transversal) e Iocaliza-ção de vasos sangüíneos.

4. Grau de inflamação, número, localização e populações / tiposde células inflamatórias presentes.

5. Organização de colágeno, espessura da fibra de colágeno,densidade da fibra de colágeno.

Prevenção, redução ou inibição de cicatrização pode ser de-monstrada por uma mudança em quaisquer dos parâmetros consideradosacima, tal que, uma cicatriz tratada se assemelha mais à pele não cicatriza-da do que uma cicatriz de controle ou não tratada (ou outro comparador a -dequado).

As avaliações e os parâmetros discutidos são adequados paracomparações dos efeitos de peptídeos ou medicamentos da invenção emcomparação a controlar, placebo ou tratamento de cuidado-padrão em ani-mais ou seres humanos. Testes estatísticos adequados podem ser usadospara analisar conjuntos de dados gerados de tratamentos diferentes a fim deinvestigar o significado dos resultados.

Preferivelmente prevenção, redução ou inibição da cicatriz podeser demonstrada com referência a mais de um parâmetro. Mais preferivel-mente prevenção, redução ou inibição da cicatriz pode ser demonstrada comreferência, (isto é, observado no sujeito) a um parâmetro clínico e a um pa-râmetro fotográfico. Ainda mais preferivelmente prevenção, redução ou inibi-ção de cicatrização pode ser demonstrada com referência a um parâmetroclínico, a um parâmetro fotográfico, e também a um parâmetro de avaliaçãomicroscópica (por exemplo, um parâmetro histológico). Mais preferivelmenteprevenção, redução ou inibição de cicatrização pode ser demonstrada comreferência a uma classificação clínica de VAS, contagem e classificação deVAS de painel de configuração externa (a partir de imagens fotográficas) econtagem de VAS microscópica da derme reticular.O uso de métodos e medicamentos adequados da invenção écapaz de ocasionar uma melhora rápida na aparência cosmética de umaárea ferida então tratada. Considerações cosméticas são importantes emvários contextos clínicos, particularmente quando as feridas são formadasem locais proeminentes do corpo tais como a face, o pescoço e as mãos.Conseqüentemente a inibição de cicatrização (que pode preferivelmente serem combinação com a cicatrização de ferida acelerada) em tais locais ondese deseja melhorar a aparência cosmética da cicatriz formada representauma modalidade preferida da invenção.

Além de seu impacto cosmético, a cicatriz da pele é responsávelpor um número de efeitos deletérios que afligem aqueles que sofrem de talcicatriz. Por exemplo, a cicatriz da pele pode ser associada com a reduçãoda função física e mecânica, particularmente no caso de cicatrizes contráteis(tais como, cicatrizes hipertróficas) e/ou situações em que as cicatrizes sãoformadas através das junções. Nestes casos as propriedades mecânicasalteradas da pele cicatrizada, ao contrário da pele não cicatrizada, e os efei-tos da contração da cicatriz podem levar ao movimento dramaticamente res-trito de uma junção (articulação) assim que efetuado. Conseqüentemente, éuma modalidade preferida que os medicamentos e métodos adequados dainvenção sejam usados para prevenir, reduzir ou inibir cicatriz de junções decobertura de feridas do corpo (preferivelmente também acelerando a cicatri-zação de tais feridas). Em outra modalidade preferida os medicamentos emétodos adequados da invenção podem ser usados para promover a cicatri-zação acelerada da ferida e/ou prevenir, reduzir ou inibir a cicatriz de feridasem maior risco de formar uma cicatriz contrátil.

A extensão de formação da cicatriz, e então a extensão de preju-ízo cosmético ou outro prejuízo que pode ser causado pela cicatriz, podetambém ser influenciada por fatores, tais como, a tensão do local em que aferida é formada. Por exemplo, sabe-se que a pele sob tensão relativamenteelevada (tal como, aquela que se estende sobre o peito, ou associada comas linhas de tensão) pode ser inclinada para formação de cicatrizes maisseveras do que em outros locais do corpo. Assim em uma modalidade prefe-rida medicamentos e métodos adequados da invenção podem ser usadospara promover a cicatrização acelerada da ferida e/ou para prevenir, reduzirou inibir cicatriz de feridas situadas em locais de tensão elevada da pele. Hámuitos procedimentos cirúrgicos que podem ser usados na revisão da cica-triz para permitir o realinhamento de feridas e cicatrização tal que elas sãosujeitas à tensão reduzida. Provavelmente o mais conhecido destes é "Z-plastia" em duas abas de pele em forma de V são transpostas para permitirrotação de uma linha de tensão. Assim em uma modalidade mais preferidatais medicamentos e métodos da invenção são usados para promover a ci-catrização acelerada da ferida e/ou prevenir, reduzir ou inibir cicatrização deferidas durante a revisão cirúrgica de cicatrizes desfiguradas.

Cicatriz patológica pode ter mais efeitos prejudiciais pronuncia-dos do que os que surgem mesmo em conseqüência de cicatriz normal rela-tivamente severa. Exemplos comuns de cicatrizes patológicas incluem que-lóides e cicatrizes hipertróficas. É reconhecido que determinados tipos deferida, ou determinados indivíduos podem ser predispostos à formação decicatriz patológica. Por exemplo, indivíduos de heranças afro-cáribenhas,japonesa ou mongolóides, ou daquelas que têm uma história familiar de ci-catriz patológica podem ser considerados para estar em maior risco de for-mação de quelóide ou cicatriz hipertrófica. Feridas em crianças, e particu-larmente feridas de queimadura em crianças, são associadas também comformação de cicatriz hipertrófica aumentada. Conseqüentemente é uma mo-dalidade preferida da invenção que medicamentos e métodos adequadossejam usados para promover a cicatrização acelerada da ferida e/ou preve-nir, reduzir ou inibir cicatriz de feridas em que há um risco aumentado deformação de cicatriz patológica.

Embora indivíduos já sujeitos à cicatriz patológica sofram deuma predisposição à formação de cicatriz excessiva adicional é freqüente anecessidade clínica de revisar cirurgicamente quelóides ou cicatrizes hiper-tróficas, com um risco presente de conseqüente formação de cicatriz patoló-gica. Assim é uma modalidade preferida adicional da invenção que os medi-camentos e métodos adequados sejam usados para promover a cicatrizaçãoacelerada da ferida e/ou prevenir, reduzir ou inibir cicatriz de feridas produzi-da por revisão cirúrgica de cicatrizes patológicas.

É reconhecido que feridas resultantes de ferimentos de queima-duras (que para as finalidades da presente invenção podem ser tomadostambém para abranger ferimentos de queimadura que envolvem líquidos ougases quentes) podem se estender sobre grandes áreas de um indivíduoentão afligido. Conseqüentemente, as queimaduras podem causar a forma-ção de cicatriz cobrindo uma grande proporção do corpo de um paciente,desse modo, aumentando o risco que a cicatriz formada cobrirá áreas deimportância cosmética elevada (tais como a face, o pescoço, os braços ouas mãos) ou de importância mecânica (particularmente as regiões cobrindoou que cercam junções). Os ferimentos de queimaduras causados por líqui-dos quentes freqüentemente são sofridos por crianças (por exemplo, comoresultado de frigideiras derramadas, chaleiras ou semelhantes) e, devido aotamanho do corpo relativamente menor das crianças, são particularmenteprováveis de causar dano extensivo sobre uma proporção elevada da áreado corpo. É uma modalidade preferida adicional da invenção que os medi-camentos e métodos adequados sejam usados para promover a cicatrizaçãoacelerada da ferida e/ou prevenir, reduzir ou inibir cicatriz de feridas produzi-da por ferimentos de queimaduras.

Como notado acima, a cura da ferida em resposta aos ferimen-tos de queimaduras é associada freqüentemente aos resultados de cicatri-zação adversos, tais como a formação de cicatrizes hipertróficas. Uma con-seqüência adicional do tamanho relativamente grande dos ferimentos dequeimaduras é que são particularmente suscetíveis a complicações tais co-mo infecção e dessecação que surgem devido à falta de uma camada epite-lial funcional. Tendo em vista o que precede será apreciado que os métodose medicamentos adequados da invenção podem ser usados no tratamentode ferimentos de queimadura para reduzir o nível de cicatrização isso ocorreem conseqüência de ferida e/ou aceleração da reconstituição de uma barrei-ra epitelial funcional.

Os inventores descobriram que métodos e medicamentos dainvenção que utilizam TGF-p3s da invenção são capazes de promover a re-epitalização. Conseqüentemente tais métodos e medicamentos são particu-larmente efetivos no tratamento de todos os ferimentos envolvendo dano àcamada epitelial. Tais ferimentos são exemplificados, mas não limitados a,ferimentos na pele, em que a epiderme é danificada. Será, entretanto, apre-ciado que tais métodos e medicamentos da invenção são também aplicáveisa outros tipos de feridas em que o epitélio é danificado, tais como ferimentosenvolvendo o epitélio respiratório, epitélio digestivo, ou epitélio envolvendotecidos ou órgãos internos (tal como, o epitélio do peritônio).

A cicatrização de feridas que envolve o peritônio (a coberturaepitelial dos órgãos internos, e/ou o interior da cavidade do corpo) pode fre-qüentemente causar adesões. Tais adesões são uma conclusão comum dacirurgia envolvendo tecidos ginecológicos ou intestinais. Os inventores acre-ditam que a capacidade dos métodos e medicamentos da invenção (utilizan-do como aqueles que compreendem TGF-p3s estabelecidos na seqüênciaID N9 3, 5, 7, 9 ou 11) para acelerar a regeneração do peritônio enquantoreduzindo a cicatriz pode reduzir a incidência de anexos impróprios de por-ções de um peritônio a outro, e desse modo, reduzir a ocorrência de ade-sões. Conseqüentemente, o uso de tais métodos e medicamentos da inven-ção para prevenir a formação de adesões intestinais ou ginecológicas repre-senta uma modalidade preferida da invenção. Certamente o uso de tais mé-todos ou medicamentos da invenção na cicatrização de todas as feridas queenvolvem o peritônio é uma modalidade preferida.

Os métodos ou medicamentos da invenção podem ser usadosprofilaticamente, por exemplo, nos locais onde nenhuma ferida existe, masonde uma ferida que, de outra maneira, daria surgimento a uma cicatriz ouferida crônica deve ser formada. Como exemplo, os medicamentos de acor-do com a invenção podem ser administrados aos locais que estão sob feri-mento como um resultado de procedimentos eletivos (tais como cirurgia), ouaos locais que se acredita estarem sob risco elevado de ferimento. Pode serpreferido que os medicamentos da invenção sejam administrados ao localaproximadamente na época do ferimento, ou imediatamente antes da forma-ção de uma ferida (por exemplo, no período até seis horas antes de se ferir)ou os medicamentos podem ser administrados em uma hora anterior ao fe-rimento (por exemplo, até 48 horas antes que uma ferida seja formada). Apessoa versada apreciará com o tempo que os mais preferidos de adminis-tração antes da formação de uma ferida serão determinados com referênciaa um número de fatores, incluindo a formulação e a rota de administração domedicamento selecionado, a dosagem do medicamento a ser administrado,o tamanho e a natureza da ferida a ser formados, e o status biológico do pa-ciente (que pode ser determinado com referência aos fatores tais como aidade, saúde, e predisposição do paciente às complicações de cicatrizaçãoou cicatrização adversa). O uso profilático de métodos e medicamentos deacordo com a invenção é uma modalidade preferida da invenção, e é parti-cularmente preferido na promoção da cicatrização e/ou prevenção aceleradada ferida, a redução ou a inibição de cicatriz no contexto de feridas cirúrgicas.

Os métodos e medicamentos da invenção também são capazesde promover a cicatrização acelerada da ferida e/ou cicatriz inibida se admi-nistrados depois que uma ferida foi formada. É preferido que tal administra-ção deva ocorrer o mais cedo possível após a formação da ferida, mas osagentes da invenção são capazes de promover a cicatrização acelerada daferida e/ou prevenir, reduzir ou inibir a cicatriz a qualquer hora acima até queo processo de cicatrização esteja terminado, (isto é, mesmo em caso deuma ferida já parcialmente cicatrizada, os métodos e medicamentos da in-venção podem ser usados para promover a cicatrização acelerada da feridae/ou para prevenir, reduzir ou inibir a cicatriz em relação à porção não cica-trizada restante). Será apreciado que a "janela" na qual os métodos e medi-camentos da invenção podem ser usados para promover a cicatrização ace-lerada e/ou prevenir, reduzir ou inibir a cicatriz da ferida é dependente danatureza da ferida em questão (que inclui o grau de dano que ocorreu, e otamanho da área ferida). Assim, no caso de uma grande ferida, os métodose medicamentos da invenção podem ser administrados relativamente tarde,na resposta de cicatrização ainda podem promover a cicatrização aceleradae/ou prevenir, reduzir ou inibir a cicatriz da ferida. Os métodos e medicamen-tos da invenção podem, por exemplo, preferivelmente ser administradosdentro das primeiras 24 horas depois que uma ferida é formada, mas podemainda promover a cicatrização acelerada da ferida e/ou prevenir, reduzir ouinibir cicatrização se administrados até dez, ou mais dias após o ferimento.

Os métodos e medicamentos da invenção podem ser adminis-trados em uma ou mais ocasiões como necessário a fim de promover a cica-trização acelerada da ferida e/ou prevenir, reduzir ou inibir a cicatriz. Por e-xemplo, terapeuticamente as quantidades eficazes dos medicamentos po-dem ser administradas a uma ferida tão freqüentemente quanto necessárioaté que o processo de cicatrização esteja terminado. Como exemplo, os me-dicamentos da invenção podem ser administrados diariamente ou duas ve-zes por dia a uma ferida por pelo menos os primeiros três dias que seguemà formação da ferida.

Mais preferivelmente, os métodos ou medicamentos da invençãopodem ser ambos administrados antes e depois da formação de uma ferida.Os inventores descobriram que a administração de medicamentos da inven-ção imediatamente antes da formação de uma ferida, seguida pela adminis-tração diária de tais agentes nos dias que seguem o ferimento, são particu-larmente eficazes em promover a cura acelerada da ferida e/ou prevenir,reduzir ou inibir a cicatriz.

Para as finalidades do presente relatório descritivo "agente" ou"agente da invenção" significa TGF-p3 biológico ou terapeuticamente ativoda invenção; e/ou fragmentos TGF-p3 biológico ou terapeuticamente ativo;e/ou derivados TGF-P3 biológico ou terapeuticamente ativo da invenção.Agentes da invenção podem também incluir ácidos nucléicos codificandoTGF-p3s da invenção (ou fragmentos ou derivados destes). Será apreciadoque todos tais agentes podem ser incorporados em medicamentos de acor-do com a invenção e podem ser usados em métodos ou usos da invenção.

Será apreciado que a quantidade de um medicamento da inven-ção que deve ser aplicada a uma ferida depende de vários fatores tais comoa atividade biológica e a biodisponibilidade do agente presente no medica-mento, que depende, por sua vez, entre outros fatores, da natureza do agen-te e do modo de administração do medicamento. Outros fatores para deter-minar uma quantidade terapêutica adequada de um medicamento podemincluir:

A) A meia-vida do agente no sujeito sendo tratado.Β) A condição específica a ser tratada (por exemplo, ferida agu-da ou feridas crônicas).C) A idade do sujeito.

A freqüência da administração será influenciada também pelosfatores acima mencionados e particularmente pela meia-vida do agente es-colhido dentro do sujeito sendo tratado.

Geralmente quando medicamentos de acordo com a invençãosão usados para tratar feridas existentes o medicamento deve ser adminis-trado assim que a ferida ocorrer (ou no caso de feridas que não são imedia-tamente aparentes como aquelas em local interno no corpo, assim que aferida for diagnosticada). A terapia com métodos ou medicamentos de acor-do com a invenção deve continuar até que o processo de cicatrização estejaacelerado, e/ou cicatriz prevenida, reduzida ou inibida, a uma satisfação doclínico.

Freqüência de administração dependerá da meia-vida biológicado agente usado. Tipicamente um creme ou uma pomada contendo um a-gente da invenção deve ser administrado a um tecido-alvo, tal que, a con-centração do agente em uma ferida seja mantida em nível adequado para terum efeito terapêutico. Isto pode exigir administração diária ou mesmo diver-sas vezes ao dia.

Medicamentos da invenção podem ser administrados por qual-quer via adequada capaz de alcançar o efeito desejado de promover a curada ferida e/ou prevenir, reduzir ou inibir a cicatriz, mas é preferido que osmedicamentos sejam administrados localmente em um local da ferida.

Os inventores descobriram que a promoção da cicatrização ace-lerada da ferida e/ou prevenção, redução ou inibição da cicatriz pode serefetuada pela administração de um agente da invenção por injeção no localda ferida. Por exemplo, no caso das feridas cutâneas, os agentes da inven-ção podem ser administrados por meio de injeção intradérmica. Assim ummedicamento preferido de acordo com a invenção compreende uma soluçãoinjetável de um agente da invenção (por exemplo, para injeção em torno dasmargens de um local de dano epitelial ou de um local que provavelmentedeve ser danificado). Formulações adequadas para o uso nesta modalidadeda invenção são consideradas abaixo.

Alternativamente ou adicionalmente, os medicamentos da inven-ção podem também ser administrados em uma forma tópica para promovera cicatrização acelerada da ferida e/ou prevenir, reduzir ou inibir a cicatriz.Tal administração pode ser efetuada como parte do cuidado inicial e/ou decontinuação para a área ferida.

Os inventores descobriram que a promoção da cicatrização ace-lerada da ferida e/ou prevenção, redução ou inibição da cicatriz é particular-mente melhorada pelo tratamento tópico de um agente da invenção parauma ferida (ou, no caso de aplicação profilática, a um tecido ou local ondeuma ferida deve ser formada).

Composições ou medicamentos contendo agentes da invençãopodem tomar um número de formas diferentes dependendo, em particular damaneira em que devem ser usadas. Assim, por exemplo, pode ser sob aforma de um líquido, pomada, creme, gel, hidrogel, pó ou aerossol. Todastais composições são adequadas para o tratamento tópico a uma ferida, quesão meios preferidos de administrar agentes da invenção a um sujeito (pes-soa ou animal) necessitando de tratamento.

Os agentes da invenção podem ser fornecidos em uma ataduraou curativo estéril, que possam ser usados para cobrir uma ferida ou outrolocal de dano epitelial a ser tratado.

Será apreciado que o veículo de uma composição compreen-dendo agentes da invenção deve ser um que seja bem-tolerado pelo pacien-te e permita a liberação do agente à ferida. Tal veículo é preferivelmente bi-odegradável, biossolúvel, biorreabsorvível e/ou não inflamatório.

Medicamentos e composições compreendendo agentes da in-venção podem ser usados de várias maneiras. Assim, por exemplo, umacomposição pode ser aplicada na e/ou em volta de uma ferida a fim de pro-mover a cura acelerada da ferida e/ou prevenir, reduzir ou inibir a cicatriz. Sea composição é para ser aplicada a uma ferida "existente", então o veículofarmaceuticamente aceitável será um que seja relativamente "suave", isto é,um veículo que seja biocompatível, biodegradável, biossolúvel e não infla-matório.

Um agente da invenção, ou um ácido nucléico codificando talagente (como considerado mais abaixo), pode ser incorporado dentro de umdispositivo de liberação lento ou prolongado. Tais dispositivos podem, porexemplo, ser colocados sobre ou introduzidos sob a pele e o agente ou áci-do nucléico pode ser liberado durante dias, semanas ou mesmo meses. Taldispositivo pode ser particularmente útil para pacientes (tais como aquelesque sofrem de feridas crônicas) que requerem promoção em longo prazo dacicatrização acelerada da ferida e/ou prevenção, redução ou inibição de ci-catrização. Os dispositivos podem ser particularmente vantajosos quandousados para a administração de um agente ou de um ácido nucléico quenormalmente exigiria administração freqüente (por exemplo, pelo menosadministração diária por outras vias).

As doses diárias de um agente da invenção podem ser dadascomo uma única administração (por exemplo, uma aplicação diária de umaformulação tópica ou de uma injeção diária). Alternativamente, o agente dainvenção pode exigir a administração duas ou mais vezes durante um dia.Em uma alternativa adicional, um dispositivo de liberação lento pode ser u-sado para fornecer doses ideais de um agente da invenção a um pacientesem a necessidade de administrar doses repetidas.

Em uma modalidade um veículo farmacêutico para administra-ção de um agente da invenção pode ser um líquido e uma composição far-maceuticamente adequada, seria sob a forma de uma solução. Em outramodalidade, o veículo farmaceuticamente aceitável é um sólido e uma com-posição adequada é sob a forma de um pó ou comprimidos. Em uma moda-lidade adicional o agente da invenção pode ser formulado como uma partede um emplastro transdérmico farmaceuticamente aceitável.

Um veículo sólido pode incluir uma ou mais substâncias que po-dem também atuar como agentes flavorizantes, lubrificantes, solubilizadores,agentes de suspensão, preenchedores, agentes deslizantes, bandagem decompressão, aglutinantes ou agentes de desintegração em comprimido; po-de também ser um material de encapsulação. Em pós, o veículo é um sólidofinamente dividido que está misturado com o agente finamente dividido dainvenção. Em comprimidos, o agente da invenção é misturado com um veí-culo tendo as propriedades necessárias de compressão em proporções ade-quadas, e comprimido na forma e no tamanho desejados. Os pós e compri-midos contêm preferive Imente até 99% do agente da invenção. Veículos só-lidos adequados incluem, por exemplo, fosfato de cálcio, estearato de mag-nésio, talco, açúcares, lactose, dextrina, amido, gelatina, celulose, polivinil-pirrolidina, ceras de baixa fusão e resinas de troca iônica.

Veículos líquidos podem ser usados para preparar soluções,suspensões, emulsões, xaropes, elixires e composições pressurizadas. Oagente da invenção pode ser dissolvido ou suspenso em um veículo líquidofarmaceuticamente aceitável, tal como, água, um solvente orgânico, umamistura de ambos ou óleos ou gorduras farmaceuticamente aceitáveis. Oveículo líquido pode conter outros aditivos farmaceuticamente adequadostais como solubilizantes, emulsificantes, tampões, conservantes, adoçantes,agentes aromatizantes, agentes de suspensão, agentes de espessamento,cores, reguladores de viscosidade, estabilizantes ou osmo-reguladores. E-xemplos adequados de veículos líquidos para administração oral e parente-ral incluem água (que contêm parcialmente aditivos como acima, por exem-plo, derivados da celulose, preferivelmente solução carboximetil celulose desódio), álcoois (incluindo álcoois monohídricos e álcoois polihídricos, por e-xemplo, glicóis) e seus derivados, e óleos (por exemplo, óleo de coco fracio-nado e óleo de amendoim). Para administração parenteral, o veículo podetambém ser um éster oleoso tal como oleato de etila e miristato de isopropi-la. Veículos líquidos estéreis são úteis em composições em forma líquidaestéril para administração parenteral. O veículo líquido para composiçõespressurizadas pode ser hidrocarboneto halogenado ou outro propelente far-maceuticamente aceitável.

Composições farmacêuticas líquidas que são soluções estéreisou suspensões podem ser utilizadas por, por exemplo, injeção intramuscular,intratecal, epidural, intraperitoneal, intradérmica, intrastromal (córnea) ou asubcutânea. Soluções estéreis podem também ser administradas intraveno-samente. O agente da invenção pode ser preparado como uma composiçãosólida estéril que pode ser dissolvida ou suspensa na hora da administraçãousando a água estéril, solução salina, ou o outro meio injetável estéril ade-quado. Pretende-se incluir aos veículos aglutinantes inertes e necessários,agentes de suspensão, lubrificantes e conservantes.

Na situação em que se deseja administrar um agente da inven-ção por meio da ingestão oral, será apreciado que o agente escolhido serápreferivelmente um agente tendo um grau elevado de resistência à degrada-ção. Por exemplo, o agente da invenção pode ser protegido (por exemplo,usando as técnicas descritas acima) de modo que sua taxa de degradaçãono trato digestivo seja reduzida.

Composições de agentes da invenção são adequadas para se-rem usadas para promover a cicatrização acelerada da ferida e/ou inibir acicatriz na córnea. Feridas de córneas podem resultar do trauma ao olho quesurge como resultado de ferimento acidental (como considerado acima) oucomo resultado de operações cirúrgicas (por exemplo, cirurgia à laser nacórnea). Neste caso um medicamento preferido da invenção pode ser sob aforma de um colírio.

Agentes da invenção podem ser usados em uma escala de feri-das "internas" (isto é, feridas que ocorrem dentro do corpo, em vez de emuma superfície externa). Assim, por exemplo, os medicamentos de acordocom a invenção podem ser formulados para inalação para uso em feridasque surgem nos pulmões ou em outro epitélio respiratório.

Procedimentos conhecidos, tais como, aqueles empregadosconvencionalmente pela indústria farmacêutica (por exemplo, experimentosin vivo, ensaios clínicos etc.), podem ser usados para estabelecer formula-ções específicas de composições compreendendo agentes da invenção epara dietas terapêuticas precisas para administração de tais composições(tais como doses diárias do agente ativo e a freqüência da administração).

Uma dose diária adequada de um agente de acordo com a in-venção capaz de promover a cicatrização acelerada da ferida e/ou prevenir,reduzir ou inibir cicatrização depende de uma escala de fatores que incluem(mas não limitados a) a natureza do tecido ferido, área e/ou profundidade daferida a ser tratada, a severidade da ferida, e a presença ou a ausência defatores que predispostos à cicatriz patológica ou à formação crônica da feri-da.

Como exemplo, a quantidade de um agente ativo que pode seradministrado a uma ferida ou local de dano epitelial em uma única incidênciade tratamento pode preferivelmente estar na região de 50ng/100 (μΙ_ porcentímetro linear da ferida ou dano epitelial. Tal dose pode ser determinadauma vez ao dia por até 3 dias, deste modo fornecendo uma dose total de150ng/centímetro linear de ferida ou dano epitelial.

No caso de aplicação tópica às feridas ou locais agudos de danoepitelial, uma quantidade adequada de um agente ativo pode preferivelmen-te estar na região de 100ng/cm2. Tal dose pode ser dada uma vez por diapor até 3 dias, desse modo, fornecendo uma dose total de 300ng/ cm2 deferida ou de dano epitelial.

Como exemplo, a quantidade preferida de um agente ativo quepode ser administrado diariamente à ferida ou local de dano epitelial em umaincidência única do tratamento pode ser na região de 50ng/cm2 de ferida oudano epitelial ou 10Ong/cm2 de ferida ou dano epitelial (se administrado topi-camente).

Como outro exemplo, a quantidade de um agente ativo que podeser administrado à ferida ou local de dano epitelial em uma incidência únicado tratamento pode preferencialmente ser na região de 50-200ng/centímetrolinear de ferida ou dano epitelial ou 100-300ng/cm2 de ferida ou dano epitelial(se administrado topicamente).

A quantidade de um agente, de acordo com a invenção, exigidapara o tratamento de feridas ou outros locais de dano epitelial estarão tipi-camente dentro da escala de 1 pg a 1 mg do agente administrado por centí-metro linear de ferida ou dano epitelial por 24 horas, embora esta figura pos-sa ser modificada para cima ou para baixo em resposta aos fatores esboça-dos acima. O agente pode preferivelmente ser fornecido sob a forma de umasolução de 1pg/100μL-1mg/100μL do agente, e 100μL de tal solução admi-nistrada por centímetro linear de ferida ou dano epitelial durante um períodode 24 horas.

O agente pode mais preferivelmente ser administrado como umasolução de 10pg/100μL-100μL7100μL com 100μL de tal solução administra-da por centímetro linear de ferida ou dano epitelial durante um período de 24horas.

Mais preferivelmente o agente pode ser administrado como umasolução de 1ng/100μL-1000ng/100μL com 100μL de tal solução administra-da por centímetro linear de ferida ou dano epitelial durante um período de 24horas.

Geralmente, as composições compreendendo agentes da inven-ção devem ser formuladas, tal que, quando administradas a uma ferida umaconcentração do agente entre 0,79pM e 0,79mM por centímetro linear deferida ou dano epitelial seja alcançada. Preferivelmente o agente pode serfornecido em concentrações entre 7,9pM e 0,079mM por centímetro linear.

Um agente da invenção (tal como, o peptídeo da seqüência IDNq 3 a 8) pode ser administrado em uma concentração entre 0,79pM e0,79mM. Preferivelmente um agente da invenção pode ser administrado emuma concentração entre 7,9pM e 0,079mM. Mais preferivelmente um agenteda invenção pode ser administrado em uma concentração entre 0,79nM e0,79μΜ.

Puramente como exemplo, uma solução injetável contendo entre10pg/100μL e 100μg/100μL de um agente da invenção (tal como, um TGF-β3 de seqüência ID N— 3, 5, 7, 9 ou 11) é adequada para que a aplicaçãopromova a cicatrização acelerada da ferida da derme e/ou inibição de cica-triz quando administrada como uma injeção intradérmica e dosada comIOOjuL por cm linear de margem de ferida.

No caso de um TGF-p3 de seqüência ID N2 3, dosagens preferi-das para administração a uma ferida podem ser na região de lng/ΙΟΟμΙ.-1000ng/100μΙ_, e 100μΙ_ de tal solução administrada por cm linear de mar-gem de ferida.

No caso de um TGF-p3 de seqüência ID N2 5, dosagens preferi-das para administração a uma ferida podem ser na região de lng/ΙΟΟμΙ.-1000ng/100μΙ_, e 100μΙ_ de tal solução administrada por cm linear de mar-gem de ferida.

No caso de um TGF-P3 de seqüência ID N9 7, dosagens preferi-das para administração a uma ferida podem ser na região de lng/ΙΟΟμΙ--IOOOng/ΙΟΟμΙ-, e 100μΙ_ de tal solução administrada por cm linear de mar-gem de ferida.

No caso de um TGF-p3 de seqüência ID Ns 9, dosagens preferi-das para administração a uma ferida podem ser na região de lng/ΙΟΟμΙ--1000ng/100μΐ_, e 100μΙ_ de tal solução administrada por cm linear de mar-gem de ferida.

No caso de um TGF-p3 de seqüência ID N9 11, dosagens prefe-ridas para administração a uma ferida podem ser na região de lng/ΙΟΟμΙ--1000ng/100μΙ_, e 100μ!_ de tal solução administrada por cm linear de mar-gem de ferida.

Os agentes da invenção podem ser usados para promover a ci-catrização acelerada da ferida e/ou prevenir, reduzir ou inibir cicatrizaçãocomo uma monoterapia (por exemplo, com o uso dos medicamentos da in-venção sozinho). Alternativamente, os métodos ou medicamentos da inven-ção podem ser usados em combinação com outros compostos ou tratamen-tos para a promoção da cura da ferida ou inibição da cicatriz. Tratamentosadequados que podem ser usados como parte de tais terapia de combina-ção serão conhecidos por aqueles versados na técnica.

Os inventores descobriram que TGF-p3 de acordo com a pre-sente invenção podem vantajosamente ser formulados na presença de umaçúcar. Este açúcar pode ser um açúcar de redução ou não redução e/ouum fosfato ou do fosfonate derivado do mesmo. Exemplos de tais açúcarespodem ser selecionados de, mas não são limitados a, grupo consistindo emmaltose, manose, trehalose, arabinose, mainitol, sacarina, frutose, dextrosee glicose. Os açúcares preferidos podem ser selecionados do grupo consis-tindo em maltose e trehalose.

Será apreciado que peptídeos contendo TGF-p3 da invençãopodem representar agentes favoráveis a ser administrados pelas técnicasque envolvem expressão celular de seqüências de ácido nucléico que codifi-cam tais moléculas. Tais métodos de expressão celular são particularmenteadequados para uso médico em que os efeitos terapêuticos dos peptídeossão exigidos durante um período prolongado, por exemplo, nos contextosonde é desejável aumentar durante um período de tempo uma resposta decicatrização de ferida de outra maneira defeituosa. É particularmente preferi-do que TGF-p3 para ser adminstrado via expressão celular compreende a -queles peptídeos definidos pela seqüência ID NsS 3, 5, 7, 9 ou 11 ou frag-mentos ou derivados destes. Ácidos nucléicos codificando esses peptídeossão definidos na seqüência ID Nos 4, 6, 8,10 ou 12.

Muitos métodos conhecidos de administrar agentes de peptídeoda invenção aos tecidos tais como feridas têm a desvantagem que pode serdifícil alcançar níveis sustentados de agente da invenção no local do trata-mento durante o curso mesmo de alguns dias porque os agentes de peptí-deo podem ter meia-vida curta in vivo. As meias-vidas dos agentes podemser curtas por várias razões que incluem:

(i) Degradação por proteases e semelhantes.(ii) Liberação por proteínas de ligação.(iii) Ligação e inibição de atividade de agente por moléculas dematriz extracelular.

Além disso, agentes usados para promover a cicatrização acele-rada da ferida e/ou prevenção, redução ou inibição de cicatriz precisam seradministrados em um veículo adequado e são freqüentemente fornecidoscomo uma composição que compreende o agente e o veículo. Como discuti-do, tais veículos são preferivelmente não inflamatórios, biocompatíveis, bior-reabsorvíveis e não devem degradar ou inativar o agente (no armazenamen-to ou no uso). Entretanto, pode freqüentemente ser difícil fornecer um veícu-lo satisfatório para entregar agentes a um tecido com uma ferida a ser trata-da.

Uma maneira conveniente em que estes problemas podem serprevenidos ou mitigados é fornecer uma quantidade terapeuticamente eficazde um agente da invenção em uma área a ser tratada por meio da terapiagênica.

De acordo com um quarto aspecto da presente invenção é for-necido um sistema de distribuição para o uso em uma técnica de terapia gê-nica, o dito sistema de distribuição compreendendo uma molécula de DNAcodificando um peptídeo selecionado do grupo constituído por aqueles defi-nidos pela Seqüência ID No. 3, Seqüência ID N e 5, Seqüência ID No. 7, Se-qüência ID No. 9 e Seqüência ID No. 11, a dita molécula de DNA sendo ca-paz de ser transcrita para levar à expressão do peptídeo escolhido.

De acordo com um quinto aspecto da presente invenção é for-necido o uso de um sistema de distribuição, tal como definido no parágrafoanterior, para uso na fabricação de um medicamento para uso na promoçãoda cura acelerada da ferida e/ou prevenção, redução ou inibição da cicatriz.

No sexto aspecto da presente invenção é fornecido o uso de umsistema de distribuição, tal como definido acima, para uso na fabricação deum medicamento para uso na promoção da regeneração epitelial.

De acordo com um sétimo aspecto da presente invenção é for-necido um método de promover a cura acelerada da ferida e/ou prevenção,redução ou inibição da cicatriz, o método compreende administrar a um pa-ciente com necessidade de tal tratamento uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um sistema de distribuição, tal como definido pelo nono aspecto dainvenção.

De acordo com um oitavo aspecto da presente invenção é forne-cido um método de promover a regeneração epitelial, o método compreendeadministrar a um paciente com necessidade de tal tratamento uma quantida-de terapeuticamente eficaz de um sistema de distribuição, tal como definidopelo nono aspecto da invenção.

Devido à degeneração do código genético, é claro que as se-qüências de ácido nucléico que codificam os agentes adequados para o usode acordo com a invenção podem ser variadas ou mudadas sem substanci-almente afetar a seqüência do produto codificado, desse modo, fornecendouma variação funcional da mesma. As seqüências de ácidos nucléicos pos-síveis que podem ser usadas para codificar peptídeos definidos pela se-qüência ID N— 3, 5, 7, 9 ou 11 serão prontamente aparentes à pessoa ver-sada, e a pessoa versada será capaz de fazer referência aos exemplos for-necidos como seqüência ID N2 4, 6, 8, 10 ou 12, respectivamente.

Sistemas de distribuição de acordo com a invenção são altamen-te adequados para alcançar níveis sustentados de um agente da invençãoem uma ferida durante um período mais longo de tempo do que é possívelpara a maioria dos sistemas de distribuição convencionais. Os agentes dainvenção adequados para promover a cura acelerada da ferida e/ou cicatrizinibida podem continuamente ser expressos de células em um local da feridaque foi transformado com a molécula de DNA descrita no quarto aspecto dainvenção. Conseqüentemente, mesmo se o agente da invenção tivesse umameia-vida muito curta in vivo, quantidades terapeuticamente eficazes do a-gente podem continuamente ser expressas do tecido tratado.

Além disso, os sistemas de distribuição da invenção podem serusados para fornecer a molécula de DNA (e desse modo, o agente da inven-ção) sem a necessidade de usar veículos farmaceuticamente convencionais,tais como, aqueles requeridos em pomadas ou cremes que entram em con-tato com a ferida.

Um sistema de distribuição da presente invenção é preferivel-mente, tal que, a molécula de DNA é capaz de ser expressa (quando o sis-tema de distribuição é administrado a um paciente) para produzir um peptí-deo definido pelo grupo consistindo na seqüência ID N9 3, 5, 7, 9 ou 11 ouum fragmento ou derivado de tal peptídeo. A molécula de DNA pode estarcontida dentro de um vetor adequado para formar um vetor recombinante. Ovetor pode, por exemplo, ser um plasmídeo, cosmídeo ou fago. Tais vetoresrecombinantes são altamente úteis em sistemas de distribuição da invençãopara células de transformação com moléculas de DNA adequadas.

Vetores recombinantes podem também incluir outros elementosfuncionais. Por exemplo, os vetores recombinantes podem ser projetados, talque, o vetor autonomamente replica no núcleo da célula. Neste caso, os e-lementos que induzem a replicação do DNA podem ser requeridos no vetorrecombinante. Alternativamente o vetor recombinante pode ser projetado, talque, o vetor e a molécula de DNA recombinante integram no genoma deuma célula. Neste caso as seqüências de DNA que favorecem a integraçãoalvo (por exemplo, por recombinação homologa) são desejáveis. Os vetoresrecombinantes podem também ter codificação de DNA para genes que po-dem ser usados como marcadores selecionáveis no processo de clonagem.

O vetor recombinante pode também adicionalmente compreen-der um promotor ou regulador para controlar a expressão do gene conformeexigido.

A molécula de DNA pode (mas não necessariamente) ser umaque se torne incorporada no DNA de células do sujeito sendo tratado. Célu-las não diferenciadas podem ser estavelmente transformadas levando à pro-dução de células filhas geneticamente modificadas. Quando este for o caso,regulação de expressão no sujeito pode ser exigida, por exemplo, com fato-res de transcrição específicos, ativadores de gene ou mais preferivelmentecom promotores induzíveis que transcrevem o gene em resposta a um sinalespecificamente encontrado em uma ferida. Alternativamente, o sistema dedistribuição pode ser projetado para favorecer a transformação instável outransiente de células diferenciadas no sujeito que está sendo tratado. Nesteexemplo, a regulação de expressão pode ser menos importante porque aexpressão da molécula de DNA parará quando as células transformadasmorrerem ou pararem de expressar a proteína (idealmente quando a promo-ção da cura acelerada da ferida com a formação da cicatriz reduzida for efe-tuada).

O sistema de entrega pode fornecer a molécula de DNA a umsujeito sem ele ser incorporado em um vetor. Por exemplo, a molécula deDNA pode ser incorporada dentro de uma partícula de Iipossoma ou vírus.Alternativamente, a molécula de DNA "nu" pode ser introduzida em uma cé-lula do sujeito por meios adequados, por exemplo, percepção endocitóticadireta.

A molécula de DNA pode ser transferida às células de um sujeitoa ser tratado por transfecção, infecção, microinjeção, fusão de célula, fusãode protoplasta ou bombardeio balístico. Por exemplo, transferência pode serpor transfecção balística com partículas de ouro revestidas, Iipossomas con-tendo a molécula de DNA, vetores virais (por exemplo, adenovírus) e meiosde fornecer percepção de DNA direta (por exemplo, endocitose) por aplica-ção de DNA de plasmídeo diretamente a uma ferida tópica ou por injeção.

A expressão celular do agente da invenção pode ser por célulasna borda da área não danificada que cerca a ferida, ou pode alternativamen-te ser por células introduzidas terapeuticamente na ferida (por exemplo, cé-lulas cultivadas endógenas ou exógenas envolvidas na resposta de cura daferida).

Será apreciado que células que devem ser introduzidas terapeu-ticamente para promover a cura acelerada da ferida e/ou prevenção, redu-ção ou inibição da cicatriz podem ser manipuladas ex vivo, tal que, expres-sem os níveis aumentados de um agente da invenção, e então introduzidasna área da ferida. Tais células podem preferivelmente ser células cultivadasex vivo para uso na preparação ou fabricação de pele artificial ou de substi-tuição de pele para ser usada na promoção da cura da ferida. As células po-dem mais preferivelmente ser células autólogas, embora será apreciado quetodas as células adequadas podem ser usadas.

Conseqüentemente, em um nono aspecto da invenção, é forne-cido um medicamento que compreende células induzidas para expressar umagente da presente invenção.

A indução de expressão celular de um agente da invenção podeser efetuada por meios de incorporação nas células de ácidos nucléicos cau-sando a expressão de agentes adequados para uso de acordo com a invenção.A invenção será agora adicionalmente descrita como exemplocom referência aos seguintes protocolos e estudos experimentais e acom-panhados das figuras nas quais:

Tabela 1 apresenta valores indicativos de resíduos de aminoáci-do à propensão para envolvimento na formação de alfa-hélice;

Tabela 2 define detalhes de nomenclatura utilizada em referên-cia ao TGF-p3s mutante da invenção;

Tabela 3 define a eficiência do redobramento do tipo-selvagemde TGF-p3 e TGF-p3s da invenção;

Tabela 4 compara a atividade biológica do tipo selvagem deTGF-p3 e Gly63-Ala (uma proteína TGF-P3 da invenção), como avaliada pe-lo ensaio da inibição do crescimento celular;

Tabela 5 define as concentrações dos reagentes utilizados emestudos in vivo de cura da ferida;

Tabela 6 define as concentrações de reagentes utilizados emestudos in vivo de cura da ferida;

figura 1 mostra um cromatograma de TGF-Beta 3 "tipo selva-gem" em uma coluna Fenil-Sefarose;

figura 2 mostra um cromatograma de TGF-Beta 3 monomérico e

Dimérico "tipo selvagem" na coluna UNO-S1;figura 3 mostra uma comparação de proteínas mutante de TGF-Beta 3 e TGF-Beta 3 "tipo selvagem" por SDS-PAGE corado com Coomas-sie Blue (observe que a troca de tampão de Gly63-Ala e proteínas mutanteGly63-Pro resultou em algumas amostras perdidas, por conseguinte, a con-centração real adicionada ao gel particularmente menos do que 3μg decla-rado);

figura 4 mostra o modelo utilizado para ferimento excisional;figura 5 mostra média de 3 dias para a classificação da avalia-ção macroscópica para feridas incisionais (A e B) tratadas com TGF-Beta 3tipo selvagem ou TGF-j83s da invenção, onde "*" indica aumento significati-vo da cura em comparação a feridas ingênuas (p <0,05);

figura 6 média microscopia de 3 dias da largura de feridas exci-sionais (C, D) tratada com proteínas TGF-Beta3 'tipo selvagem1 e mutantes;figura 7 mostra o modelo utilizado para ferimento incisional;figura 8 ilustra classificação macroscópica da cicatriz (dia 70)para os ferimentos tratados com TGF-Beta 3 'tipo selvagem', Gly63-Ala eGly63-Pro;

figura 9 ilustra imagens macroscópicas de cicatriz (dia 70) paraos ferimentos tratados com TGF-Beta 3 'tipo selvagem', Gly63-Ala e Gly63-Pro;

figura 10 ilustra classificação macroscópica da cicatriz (dia 70)para os ferimentos tratados com TGF-Beta 3 'tipo selvagem', Glul2-Ser emutante de dupla Serina (Glul2-Ser & Arg52-ser), onde "+" indica diminuiçãosignificativa das cicatrizes comparada às feridas tratadas com placebo (p<0,05);

figura 11 ilustra imagens macroscópicas da cicatriz (dia 70) paraos ferimentos tratados com TGF-Beta 3 'tipo selvagem', Glul2-Ser e mutantede dupla Serina (Glul2-Ser & Arg52-Ser);

figura 12 ilustra imagens microscópicas da cicatriz representativade ferimentos tratados com TGF-Beta 3 'tipo selvagem', Gly63-Pro e proteí-na mutante Gly63-Ala (70 dias de Pós-Ferimento); e

figura 13 ilustra imagens microscópicas da cicatriz representativade ferimentos tratados com Glul2-Ser e mutante de dupla serina (Glul2-Ser eArg 52-Ser) após 70 dias de pós-ferimento.

Detalhes das seqüências de interesse particular são fornecidosna seção "Informações de Seqüência".

Protocolos Experimentais e Resultados

1. Geração, produção, redobramento e purificação de TGF-p3 de acordocom os primeiro e segundo aspectos da invenção.

1.1 Geração de cDNA

O RNA total de uma ferida incisional humana (tomada no dia 5após o ferimento) foi tratado com DNA-Iivre (Ambion) para remover qualquercontaminação de DNA. Usando o RNA total como um modelo, cDNA TGFbe-ta-3 foi gerado por Reação em Cadeia por Polimerase-Transcriptase reversa(RT-PCR). A mistura principal de RT-PCR foi preparada do kit de reagenteQRT-PCR core da Brilliant®, 1 etapa (Stratagene). Um micrograma de RNAfoi adicionado a 50μΙ_ de uma solução contendo: Um tampão QRT-PCR daetapa-um, 0,2mM de dNTPs, 3,5mM de MgCI2, 1μΙ_ de transcriptase reversaStratascript, 2,5 unidades de tagpolimerase, 0,4μΜ iniciador senso (51 GATATA CCA TGG CTT TGG ACA CCA ATT ACT ACT GC 3'), 0,4μΜ de inicia-dor senso (5'-CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCA GCT ACA TTT ACA AGAC 3'). A reação foi colocada em um circulador térmico (Hybaid PCR Express)e realizada sob as sequintes condições: 30 min. a 45°C, 10 min. a 95°C, en-tão 40 ciclos de 95°C por 30s, 65°C por 1 min. e 72°C por 1 min. A etapafinal de 72°C por 10 min. Amostras PCR foram corridas em 2% (p/v) de gelde agarose para verificar o tamanho da banda e purificadas usando Kit dePrep. PCR Wizard (Promega).1.2 Construção de Plasmídeo

O vetor pET-3d é derivado do vetor pBR322 e contém um pro-motor 17 sob controle de LacUV5 e um gene marcador resistente à ampicili-na. O fragmento cDNA de TGF-beta 3 (gerado na Seção 3.2) foi subclonadodentro de pET-3d nos locais Hl Bam e Nco I (5'-3' respectivamente). A liga-ção resultante foi então transformada dentro de células XL10 Gold (Strata-gene) e análise de colônia PCR foi realizada para localizar clones contendouma inserção. O clone final foi crescido e DNA plasmídico extraído na águausando Kit Qiaprep®Spin Miniprep (Qiagen). O plasmídeo foi seqüenciado everificado usando iniciador promotor T7 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAGGG-3') e iniciador terminal T7 (5'-GTC AGT TAT TGC TCA GCG G-3').1.3 Mutagênese direcionada a local

O constructo TGF-Beta 3 'tipo selvagem' da Seção 1.2 subme-teu-se à mutagênese direcionada a local para gerar dois constructos mutan-tes codificantes para proteínas mutantes TGF-Beta 3. A nomenclatura mu-tante/constructo e mudança de seqüência nucleotídica estão resumidas naTabela 2. As posições nucleotídicas que submeteram-se à mutagênese sãomostradas na seção Informação de Seqüência.

A metodologia de mutagênese direcionada a local in-vitro foi ba-seada no kit direcionado a mutagênese de Stratagene1S Quick Change® Si-te. 100ng de plasmídeo (da Seção 1.2) foram adicionados a uma soluçãocontendo: 2.5μΙ_ 10 χ tampão de multirreação Quick Change®, soluçãoQuick, 100ng de iniciador Mutagênico Primer, ImL de mistura de dNTP, PfUTurbo DNA polimerase (Stratagene), feito até um volume final de 2,5 ml como dobro de água destilada. A reação foi colocada em um ciclador térmico(Hybaid PCR Expresses) e executada sob as seguintes condições: Imin a95°C, 30 ciclos de Imin a 95°C, 55°C por 1 min e uma etapa final de 65°Cpor 2 min. Uma vez que a ciclagem térmica foi completada as reações foramcolocadas no gelo por 2 min para reduzir a temperatura abaixo de 37°C. ΙμΙ_de enzima de restrição Dpnl (10 U/μΙ-) foi adicionado a cada reação e cuida-dosamente misturada. A mistura de reação foi centrifugada (Imin 10.000 rpmem um Sorvall Biofuge) e depois incubada a 37°C para digerir os ds-DNAparenteral. Ι-5μΙ_ de Dpnl-tratados de DNA de cada mutagênica reação fo-ram adicionados 45μΙ_ de E.coli XLI-BIue ressucitado (Stratagene) e 2μΙmistura de β-ΜΕ (Stratagene). A suspensão foi misturada e incubada emgelo durante 30 minutos. A suspensão foi aquecida a 42°C num banho deágua por 30 segundos. A mistura foi incubada em gelo por mais 2min. 0,5 mlcaldo NZY+ preaquecido (42°C) foi adicionado em cada célula em suspen-são. O caldo de transformação foi incubado durante 1 hora com agitação a225-250rpm. Ιμί, 10μί e 100μί do caldo de transformação de cada reaçãode mutagênese foram espalhados sobre placas ágar LB contendo 100μg/mLde Ampicilina (Sigma), 80μg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-inodlil-p-D-galactopiranranosida (X-gal, Stratagene), 20mM de isopropil β-D-Tiogalactopiranranosida (IPTG, Sigma) e incubados durante 18 horas a37°C. As colônias azuis continham o plasmídeo mutante. Uma única colôniade cada tipo mutante foi selecionada do ágar e usada para inocular 10mL domeio LB contendo 100μg/mL de Ampicilina. O plasmídeo foi isolado utilizan-do QIAprep® Spin Miniprep Kit (Qiagen). Os plasmídeos foram seqüencia-dos e verificados para a mutação correta utilizando iniciadores pQE for epQE Rev.

1.4 Transformação e Clonagem10μL (50 ng por μL) de DNA plasmídeo (da Seção 1.2 e 1.3) fo-ram adicionados a 1mL de células de E.coli BL21 competentes frias (4°C)(DE3) Singles® pLysS (Novagen). Após 20 min as células foram aquecidaschocadas por incubação por 30 s a 42°C em banho de água. 100μL de meioPsi foram adicionados à mistura de célula/plasmídeo e agitados a 37°C por90 min. Alíquotas de 50μL e 100μL foram plaqueadas em placas ágar LBcontendo 100 μg/mL de ampicilina (Sigma) e incubadas por 18 horas a 37°C.Colônias únicas foram cultivadas e estoques de células congeladas geradase armazenadas a -80°C. DNA plasmídeo foi analisado a partir de estoquesde células para verificar transformação correta.

1.5 Expressão

Uma Ampola de células de E.coli transformadas congeladas (daSeção 1.4) foram recuperadas e inoculadas em frascos de Erlenmeyer comdefletores, contendo 100mL de meio LB e 100μg/mL de ampicilina. Os fras-cos foram incubados com agitação, durante a noite a 37°C. 5mL desta cultu-ra noturna foram adicionados a um frasco de Erlenmeyer de 2 litros (500mLde meio LB/100μg/ml)) e incubados com agitação a 37°C. 2mL de amostrasde caldo foram tomados de hora em hora para rastrear o crescimento e aexpressão de proteína mutante e tipo selvagem de TGF-Beta 3. O cresci-mento foi determinado medindo a absorbância em um espectrofômetro, emum comprimento de onda de 600nm. Quando a absorbância mediu 0,6 Absas células foram induzidas para expressar proteína TGF-Beta 3 mutante etipo selvagem pela adição de isopropil β-D-Tiogalctopiranosida (IPTG, Sig-ma) para uma concentração final de 1 mM. As culturas foram incubadas porumas 4 horas adicionais. 0,5mL de amostras de caldo foram peletizados porcentrifugação (10min 10,000 rpm em um Sorvall Biofuge) e o sobrenadantedescarregado. O pélete foi ressuspenso em 50uL de tampão de amostra dedodecil sulfato de sódio (SDS) - poliacrilamida gel-electroforese (PAGE) eaquecido por 10 minutos em banho de água a 95°C. Amostras de 10μί fo-ram carregadas em SDS-PAGE. SDS-PAGE e coloração de Coomassie Blueforam realizados (como descrito em A.T Andrews, 1986) usando um Hoe-feKDMighty Small SE 245 Dual Gel Caster (Amersham). Os géis eram de1mm de espessura e continham 15% (v/v) de gel de poliacrilamida.

1.6 Colheita da célula e isolamento de corpos de inclusão

As células da seção 1.5 foram peletizadas pela centrifugação em5000g por 10 min uma centrifugada Hettich Rotina 46R com um Rotor 4315.

O rompimento da célula e a recuperação do insolúvel (corpos de inclusão)de proteínas TGF-Beta 3 foram realizados a 4°C. As células foram suspen-sas em 50ml_ de IOOmM Tris/HCI (Sigma), 10mM EDTA (Sigma) pH 8,3 eforam interrompidas por sonicação usando um Sanjo Soniprep 150. 0,2%(p/p) de Triton X-100 (Sigma) foi adicionado à suspensão e agitado por umahora. A suspensão foi centrifugada em 15.OOOg por 40 min. Os péletes foramressuspensos em 50mL de 100mMTris/HCI, 10mM EDTA pH 8,3 à tempera-tura ambiente antes de ser centrifugada por 40 min em 12.000g.

1.7 Solubilização de Corpos de Inclusão

O sedimento da seção 1.6 foi ressuspenso em 40mL de 8M deUréia 1% (p/p) DL-DitioteitroI (DTT) e interrompido em um homogeinizadorHeidolph Diax 900. A suspensão foi coberta e deixada em agitação por 1hora para solubilizar os corpos de inclusão e reduzir proteínas TGF-Beta 3mutantes e tipo selvagem a suas formas monoméricas. A suspensão foi en-tão centrifugada em 15.000g por 30 min. O sobrenadante foi dialisados paratrocar o tampão de 8M de Uréia (ICN biomédica) para 10% (v/v) de ácidoacético. As proteínas de E.coli que ficaram solúveis em 8M de uréia se pre-cipitaram da solução quando o tampão foi trocado para ácido acético 10%(v/v). 1% (p/v) DTT (Sigma) foi adicionado à suspensão, coberto e deixadoem agitação por 30 min para reduzir qualquer ligação de dissulfeto que pos-sa ter se formado entre monômeros TGF-p3 durante a troca de tampão. Asuspensão foi centrifugada a 12.OOOg por 40 min para separar as proteínassolúveis e não solúveis. Amostras foram tomadas da solubilização da uréia eetapas de troca de tampão (material solúvel e não solúvel de ácido acético),e então analisadas usando SDS-PAGE.

1.8 U Itrafi Itração

O material de ácido acético 10% (v/v) da seção 1.7 se submeteuà ultrafiltração com uma membrana IOkDa em um VivofIowSO (Vivascience).A finalidade disto era reduzir o volume de suspensão de ácido acético 10%(v/v) para 3mL e remover as proteínas de baixo peso molecular.

1.9 Gel filtração

A amostra da Seção 1.7 cromatografada em uma coluna de altaresolução Hiprep 26/60 Sephacryl S-100 (Amersham, 320mL) em 10% (v/v)de ácido acético a uma razão de fluxo de 1.5ml_/min. Frações contendoTGF-Beta 3 monomérico desnaturado (que eluído entre 100 min e 140 min),foram agregadas.

1.10 Liofilização

As frações agregadas contendo TGF-Beta 3 monomérico desna-turado foram Iiofilizadas usando um secador de congelamento TEC Lyoprep-3000 para retirar o ácido acético e água da amostra.

1.11 Redobramento

O TGF-Beta 3 monomérico, liofilizado, da Seção 1.10 foi solubili-zado em uréia 8M contendo 10mM de DTT até a concentração final de TGF-Beta 3 de 10mg/mL foi alcançado. A solução de TGF-Beta 3 foi adicionadalentamente, enquanto agitando a solução de redobramento (1M sulfonato 3-(Piiidino)-I-propano (NDSB-201), 20% (v/v) sulfóxido de demitila (DMSO,Sigma), 2% (p/v) 3-(3-colamidopropil)dimetilamônio-1-propanossulfonato(CHAPS), 1M NaCI (Sigma), l% (p/v) glutationa reduzida (GSH, Sigma),0.05M ® Trizma Base (Sigma) pH 9,3), até uma concentração final de0.2mg/mL de TGF-Beta 3 seja alcançada. É importante que o pH seja manti-do dentro de um intervalo de 9,2-9,4 utilizando concentrado de NaOH/HCI. Asolução foi coberta com Parafilme, em que foi perfurada para permitir a oxi-dação do TGF-Beta 3 monomérico e colocada sob agitação em 8°C. Após144 horas, a solução foi centrifugada a 15.000g por 40 minutos para removero precipitado formado e o pH foi ajustado para pH 3,5 com ácido acético gla-cial. O sobrenadante continha TGF-Beta 3 dimérico ligado a dissulfeto, oqual foi determinado por SDS-PAGE (não-reduzido) e Western Blotting. OSDS-PAGE foi realizado conforme descrito na Seção 2.1.

Para o Western Blotting, amostras foram carregadas sob 1mmde espessura, 15% (v/v) de gel de poliacrilamida. Uma vez que a eletrofore-se foi concluída, as proteínas dentro do gel foram eletroforeticamente entãotransferidas para o papel de nitrocelulose (Sigma), utilizando o aparelho deWestern Blotting TE22 (Pharmacia), conforme descritas no manual de ins-truções. Locais de ligações não-específicos sobre a nitrocelulose foram en-tão bloqueados com tampão de bloqueio (5% (p/v) de leite desnatado em pó,1% (v/v) de monolaurato de Polioxietilenossorbitano (Tween 20, Sigma), emsolução salina tamponada com fosfato (Invitrogen)). A nitrocelulose foi, emseguida, lavada em tampão de lavagem (PBS, 0,1% Tween 20). A nitrocelu-lose foi, em seguida, incubada durante 1 h com o anticorpo primário(MAB643 (P & D sistemas)) diluído a 1:500 com 0,1% (v/v) Tween 20, emPBS. A nitrocelulose foi novamente lavada antes de incubação por 1 horacom o anticorpo secundário de anticorpo de cabra anticamundongo (abe-cam) diluído a 1:3000 com 0,1% (v/v) Tween 20, em PBS. A nitroceluloserecebeu uma última lavagem antes da adição do reagente de ECL (Amer-sham) para visualizar os complexos antígeno-anticorpo. Em um quarto escu-ro o filme de raio-X foi exposto à nitrocelulose antes de ser imerso em solu-ções desenvolvedores, fixas e de parada. A nitrocelulose foi então deixadasecar. O redobramento das proteínas monoméricas de TGF-Beta 3 tipo-selvagem' e mutante mostraram níveis variados de formação de dímeros. Aporcentagem de recuperação corretamente do redobramento dimérico deoutros redobramentos incorretos ou proteínas TGF-Beta 3 não diméricas sãoapresentados na Tabela 3.

Curiosamente as substituições de aminoácidos dentro da alfahélice de proteínas TGF-Beta 3 que causou maior impacto sobre o rendi-mento de redobramento (formação do dímero). Estabilização do alfa hélicepela substituição de Glicina com Arginina aumentou os rendimentos de re-dobramento de 20% para 50%). Inversamente a ruptura da alfa hélice pelasubstituição de Glicina com prolina resultou em uma percentagem muitomais baixa de formação de dímero. Isto indica que a hélice alfa desempenhaum papel importante na mudança do dobramento na correta molécula deTGF-Beta 3. Substituição dos aminoácidos envolvidos na formação da "pon-te salina" não produz efeito de rendimentos de redobramento.1.12 Cromatografia de interação hidrofóbica

A solução de renaturação da Seção 1.11 foi concentrada a 50mLpor ultrafiltração com um IOkDa de membrana (peso molecular isolado) noVivoflow50 (Vivascience). A solução de renaturação foi diluída a 1:1 comuma solução de sulfato de amônio 2 M (Sigma) e 10% (v/v) de ácido acético.

Uma coluna Biorad 2ml preenchida com Fenil-Sefarose de fluxo rápido (A-mersham) foi equilibrada com tampão A (1,0M de sulfato de amônio e 10%(v/v) de ácido acético). 20mL da solução de renaturação diluída foram apli-cados a esta coluna a uma razão de fluxo ImL/min (essa razão de fluxo foiutilizada durante todo o procedimento). A coluna foi então lavada em tampãoaté a leitura de absorbância em 280nm atingida a nível basal (10mL). 100%do tampão B (10% (v/v) de ácido acético 30% (v/v) de isopropanol) foramaplicados à coluna. O primeiro pico, que contém proteínas TGF-Beta 3 tantonas formas monoméricas e diméricas, foi agrupado (vide figura 1).

1.13 Cromatografia de troca catiônica

Cromatografia de troca catiônica foi usada para isolar as proteí-nas TGF-Beta 3 diméricas das monoméricas. Uma coluna 2 UNO-SI 2mL(Biorad) foi equilibrada com um tampão contendo 10% (v/v) de ácido acético,30% (v/v) de isopropanol). As frações agrupadas da Seção 3.12 foram apli-cadas em uma razão de fluxo de ImL/min sobre a coluna UNO-S1. A colunafoi então lavada em tampão A até a leitura de absorbância em 280nm tenhaatingida nível basal (5 min). Um gradiente linear foi executado durante 5 mi-nutos finalizando com uma mistura de 60% de tampão A e 40% de tampão B(10% (v/v) em ácido acético, 30% (v/v) de isopropanol e 1M NaCI). A aplica-ção desta mistura tampão foi mantida por mais um 15 minutos. TGF Beta-3monomérico foi eluído da coluna após IOmin seguinte a injeção da amostra.Um segundo gradiente linear foi aplicado durante 5 minutos finalizando com100% de tampão B e mantido por 10 minutos. TGF-Beta 3 dimérico foi eluídoda coluna 30 minutos após a injeção da amostra (vide figura 2).1.14 Ultrafiltração/diafiltração

As frações contendo moléculas TGF-Beta 3 monoméricas e di-méricas purificadas da Seção 1.13 foram submetidas à ultrafiltra-ção/diafiltração para trocar o tampão a 20mM em ácido acético, 20% (v/v) deisopropanol e concentrado a amostra a ~ 10mg/mL (concetração de TGF-Beta 3 foi determinada por espectrometria UV). Um VivoflowSO (Vivascience)com uma 10kDa isolado foi usado na troca de tampão e concentrado as a-mostras.

2. Caracterização in vitro de TGF-p3s da invenção.

2.1. Análise SDS-PAGE de TGF-p3s purificados da invenção.

Proteínas mutantes TGF-Beta 3 purificadas (da Seção 1.14) fo-ram avaliadas por SDS-PAGE para determinar a pureza e peso molecular.Devido ao baixo pH nas amostras mutantes TGF-Beta 3 das Seções 3.14 foitrocado o tampão utilizando colunas rotativas de salinização protéica (Pier-ce) em amostra tampão SDS-PAGE. 3/xg de proteínas TGF-Beta 3 mutantepurificadas (amostras reduzida e não-reduzida), 3μς de controle positivo deTGF-Beta 3 tipo selvagem (reduzida e não reduzido) e 10/iL de filamentos depeso molecular Mark 12 foram carregados sobre gel de poliacrilamida (10% -20% (v/v) de gradiente de acrilamida). Uma vez que a eletroforese tenhasido completada o gel foi corado com Coomassie Blue.

Tal como esperado o TGF-Beta 3 "tipo selvagem" e a proteínamutante Gly63-Ala correram para posições idênticas sobre o gel ( amostrasde~ 13kDa para reduzida e 25kDa para não-reduzida). Curiosamente ne-nhuma banda de proteína mutante Gly63-Pro foi detectada sobre o gel nãoreduzido, mas foi detectada no gel reduzido. Como a eficiência do redobra-mento da Gly63-Pro foi muito baixa (<1%) é provável que várias espéciesredobradas foram produzidas, os quais foram a níveis inferiores aos detectá-veis por Coomassie (>μς). No entanto, quando estas espécies foram reduzi-das à concentração de monômero Gly63-Pro reduzido foi acima de 1μρ nolimite de detecção da coloração por Coomassie e, por conseguinte, Gly63-Pro pode ser visto no gel reduzido. A posição da banda de proteína Gly63-Pro reduzida foi ligeiramente mais elevada do que a banda de TGF-Beta 3'tipo selvagem". Como era de se prever a substituição de Glicina 63 parauma prolina feita a proteína mutante Gly63-Pro uma molécula maior do queTGF-Beta 3 do "tipo selvagem" (vide figura 3).2.2 Ensaio de Inibição do crescimento celular para comparar a ativida-de biológica do TGF-p3s da invenção com o TGF-p3 de tipo selvagem

Ensaio de inibição do crescimento celular (A Meager, 1991), éum teste para a atividade biológica in-vitro para moléculas TGF-Beta. O en-saio colorimétrico é baseado no efeito inibitório de moléculas TGF-Beta nocrescimento das células epiteliais Pulmão Mink (MLEC). 100μΙ de suspensãocelular contendo: 1 x104 MLEC células/mL e meio completo (DMEM (Invitro-gen), 0.01 M tampão Hepes (Invitrogen), 2mM de L-Glutamina (Invitrogen), L-Arginina (Invitrogen), L-asparagina (Invitrogen), 100 unidades/mL de penicili-na (Invitrogen), 50μg/mL de estreptomicina (Invitrogen) e 5% soro fetal devitelo (Invitrogen)) foram adicionados a cada cavidade das 96 cavidades daplaca de cultura de tecido. Após incubação a noite toda a 37°C, 5% de CO2,100μί serialmente diluídos (10pg/mL a 500pg/mL) de amostras mutantesTGF-Beta 3 diméricas (Seção 3.14) foram adicionados à placa. Cavidadesde controle receberam 200μί de médio completo e 10% (v/v) 0,25 M malto-se. As placas foram incubadas por mais 120h e 50μί de 2mg/mL, de brome-to de 3-[4,5-dimetiltiazonil-2-il]-2,5-difeniltetrazolio: tiazolila azul (MTT; Sig-ma) foi adicionado a cada cavidade. As placas foram incubadas por mais 4horas e o meio foi então removido. 100μί de 0.05M de HCI (BDH), isopro-panol absoluto (BDH) foi adicionado a cada cavidade e o resultante solubili-zado formado foi quantificado em 570 nm usando um leitor de microplacas(Victor2 1420).

Gly63-Ala, um TGF-p3 da invenção, teve um efeito inibidor sobrecélulas MLEC durante um intervalo de concentração de 0-500pg/mL. Comose pode vide na Tabela 4, proteína mutante Gly63-Ala tinha uma IC50 de34pg/mL comparado ao TGF-Beta 3 "tipo selvagem" com uma IC50 de 26pg/ml.

2.3 Análise de seqüência de Aminoácidos

Cinqüenta microlitros de amostras TGF-Beta 3 mutantes e tiposelvagem purificados da Seção 3.14 foram secos sob vácuo e, em seguida,ressuspensos em 20μί de uma solução contendo 50mM de NH4HCO3 e10% (v/v) de acetonitrila. 20μg de Tripsina de grau de seqüenciamento(Promega) foram ressuspensos em IOuL do kit fornecido do tampão de res-suspensão (Promega) para dar uma concentração de tripsina 2μg/μL. Estafoi, então, diluída em 50mM. 50mM de NH4HCO3 e 10% (v/v) de acetonitrilapara dar uma concentração de tripsina final de 0.2ug/μL A digestão foi reali-zada durante a noite toda pela adição de tripsina em uma razão 1:20 (p/p)com proteínas TGF-Beta 3 mutantes e "tipo selvagem". A digestão foi finali-zada pela adição de ácido fórmico (Fluka), para uma concentração final de0,1% (v/v). As amostras foram então diluídas para Ipmol/UL. Os peptídeosforam então analisados por um processo de nano-fluxo RPLC-MS (UltimateSystem, Dionex online to a Q-ToF2, Micromass). A cromatografia foi realiza-da em uma coluna 75μm C18 (LC packings) utilizam um gradiente de 45 min5% (v/v) de acetonitrila a 55% (v/v) de acetonitrila. A análise MS teve para osdados de análise dependente onde o instrumento da medida m/z dos íonspeptídicos eluídos do LC e selecionamento adequado de íons para análiseMS-MS onde a decomposição induzida colisionalmente foi empregada parafragmentar íons de peptídeo para tornar informação da seqüência.

3. Caracterização in vivo de TGF-p3 da invenção

Os efeitos biológicos de proteínas TGF-Beta 3 mutantes e tiposelvagem ativas redobradas foram investigados em cura de feridas excisio-nal e incisional (3 dias de pós-ferimento) e cicatriz (70 dias de pós-ferimento), em ratos machos adultos.

3.1 Comparação dos efeitos de TGF-P3 tipo selvagem e TGF-p3s da in-venção na cura de feridas

Ratos machos (Sprague Dawley) são anestesiados com halota-no e suas costas raspadas. Posições dos ferimentos foram marcadas utili-zando um modelo padrão com tinta de marcação de pele como mostrado nafigura 4. Amostras foram diluídas em tampão de veículo estéril contendo0.25M de maltose (Sigma), 0,002% (v/v) de ácido acético e 0,33% (v/v) deálcool isopropílico a concentrações descritas na Tabela 4. Todas as amos-tras foram esterilizadas a filtro e livre de endotoxina. Quatro ratos foram usa-dos para cada grupo de tratamento. 100/uL da amostra de cada grupo (Ta-bela 4) foram injetados intradermicamente nas posições de feridas marcadasA e B (exceto os ratos que não recebem tratamento (naive)). Nas posiçõesde feridas AeB uma punção de biópsia foi feita. Todos os animais estavamem gaiolas em separado. Após 24 horas os animais receberam uma segun-da dose da amostra. Depois de 3 dias as feridas foram fotografadas e anali-sadas através de um sistema de Contagem Analógica Visual (modificado deBeausang, E et al 1998). A análise estatística dos dados foi realizada utili-zando testes Mann Whitney U/Student T. Um valor de ρ <0,05 foi considera-do significativo.

3.2 Avaliação das feridas incisional de 3 dias tratadas com TGF-B3 tiposelvagem ou TGF~B3s da invenção na cura de feridas utilizando umaescala analógica visual macroscópia

Feridas incisionais foram examinadas após 3 dias usando umaescala macroscópica visual analógica (VAS). Na escala de 10 pontos, umapontuação O representa uma ferida bem curada e uma pontuação de 10 re-presenta uma ferida muito mal curada. Os dados mostram que:

O tratamento com 50ng/100μL ou 100ng/100μl- do tipo-selvagem de TGF-Beta 3 diminui a pontuação VAS (ou seja, melhora a apa-rência macroscópica da ferida) em comparação com nenhum tratamento(controle naive). O tratamento com dose de 100ng/100μL melhorou significa-tivamente (p <0,05) a aparência de feridas comparadas a nenhum tratamen-to (controle naive) isto é, cura acelerada.

O tratamento com 50ng/100μL ou 100ng/100μL de Gly63-Alamutante diminui a pontuação VAS, em comparação com nenhum tratamento(controle naive), e são comparáveis aos ferimentos tratados com TGF-Beta 3do "tipo selvagem" ou seja, não atrapalhou a cura.

O tratamento com 50ng/100μL ou 100ng/100μL do GlyB3 ~ Promutante diminui a pontuação VAS, em comparação com nenhum tratamento(controle naive), e é comparável aos ferimentos tratados com TGF-Beta 3 dotipo selvagem, isto é, não prejudicou a cura.

3.3 Avaliação Microscópica da largura da Ferida para o 3 dia de feridaexcisional tratado com proteínas TGF-Beta 3 mutante e "tipo selvagem"Largura de ferida excisional foi avaliada microscopicamente a-pós 3 dias. Todas as feridas tratadas com proteínas TGF-Beta 3 "tipo selva-gem" e mutante mostraram largura de ferida comparável ao placebo e con-troles de nenhum tratamento (naive), confirmando que proteínas TGF-Beta 3mutante não têm efeitos adversos na cura (figura 6).

3.4 Efeitos de proteínas TGF-Beta 3 "tipo selvagem" e mutante na Cica-triz (Dia 70 de ferimento).

Ratos machos (Sprague Dawley) são anestesiados com halota-no e suas costas raspadas. As posições dos ferimentos foram marcadas uti-lizando um modelo padrão com uma tinta de marcação de pele como mos-trado na figura 7. As amostras foram diluídas em tampão de veículo estérilcontendo 0.25M maltose (Sigma), 0,002% (v/v) de ácido acético e 0,33%(v/v) de álcool isopropílico a concentrações descritas na Tabela 5. Todas asamostras foram esterilizadas, livre de endotoxina e livre de pirogênios. Qua-tro ratos foram usados para cada grupo de tratamento. 100/\iL da amostrade cada grupo de tratamento (Tabela 6) foram injetados intradermicamentenas posições A e B de feridas marcadas (exceto ratos que não receberamtratamento (naive)). Nas posições de feridas AeB de espessura total de 1centímetro, as incisões foram feitas com uma lâmina de bisturi nQ 11. Todosos animais estavam em gaiolas em separado. Após 24 horas os animais re-ceberam uma segunda dose da amostra. Após 70 dias as cicatrizes foramfotografadas e analisadas utilizando um sistema macroscópio de contagemanalógica visual (modificado de Beausang, E et al 1998). As feridas foramexcisadas e colocadas em solução salina tamponada com 10% antes de serprocessada em um bloco de cera. Os blocos foram cortados em cera seçõesserial de 5μΜ e colocados em lâminas. As lâminas foram coradas com Mas-sons Trichrome e analisados. A análise estatística dos dados foi realizadautilizando testes Mann Whitney U/ Students T. Um valor de ρ <0,05 foi con-siderado significativo.

3.5 Avaliação de feridas incisionais de 70 dias usando macroscópicaVAS.

Feridas incisionais foram examinadas após 70 dias usando umsistema macroscópico VAS. Uma pontuação de 10 indica uma má cicatriz euma pontuação de 0 é a pele normal (figura 8). Análise por VAS de feridasdo dia 70 mostra que:

TGF-Beta 3 "tipo selvagem" (em doses de 50ng/10(^L eIOOng/ΙΟΟμΙ-) reduziu a cicatriz em comparação com o placebo tratado eferida naive. Para ambas as doses esta redução é estatisticamente significa-tiva (p <0,05) em comparação com feridas tratadas com placebo.

Gly63-Ala mutante (em doses de 50ng/100μL e 100ng / 100μΙ_)reduziu a cicatriz em comparação com o placebo tratado e ferida naive. Paradose de 50ng/100μL esta redução é estatisticamente significativa (p <0,05)em comparação com as feridas tratadas com placebo.

Gly63 Pro-mutante (em doses de 50ng/100μL e 100ng/100μL)reduziu a cicatriz em comparação com o placebo tratado e ferida naive.

Glul2-Ser mutante (em doses de 50ng/100μL e IOOng/ΙΟΟμΙ-doses) reduziu a cicatriz em comparação com o placebo tratado e ferida nai-ve. Para a dose de 50ng/100μΙ_ esta redução é estatisticamente significativa(p <0,05) em comparação com feridas tratadas com placebo.

Mutante de dupla serina (Glul2-Ser & Arg52-SER) em doses de50ng/100μL e IOOng/ΙΟΟμΙ- reduziram a cicatriz em comparação com o pla-cebo tratado e ferida naive.

3.6 Análise microscópica do dia 70 de feridas incisional.

Os efeitos macroscópicos notados utilizando o sistema de esco-re VAS foram confirmados por análise histológica. Exemplos representativosde lâminas histológicas são mostrados nas figuras 12 e 13. As fotomicrogra-fias histológicas mostram que adição de proteínas TGF-P3 de acordo com ainvenção induz uma melhoria semelhante à observada com TGF-P3 do "tiposelvagem". As proteínas da invenção induzem as fibras de colágeno dentroda cicatriz a ter morfologia semelhante àquelas em torno da pele normal.

4 Conclusões

A flexibilidade da alfa hélice (entre resíduos de aminoácido 58-67) influencia sobre a formação TGF-Beta 3 dimérica redobrada corretamen-te funcional durante o redobramento. Estabilização da alfa hélice pela substi-tuição de Glicina63 com alamina aumenta significativamente a eficiência deredobramento como desestabilizando a alfa hélice pela substituição de Glici-na63 com prolina tem o efeito oposto.

Substituindo a Glicina 63 com Alanina ou Prolina não altera acura de feridas, em comparação com TGF-Beta 3. "tipo selvagem"

Gly63-Ala e Gly63-Pro reduziram as cicatrizes comparadas àsferidas tratadas e não-tratadas com placebo.

A criação da "ponte salina" (entre Arg52 e Glul2) não altera aeficácia do redobramento de TGF-Beta 3.

Glul2-Ser e o Mutante de dupla Serina reduzem a cicatriz com-parada às feridas tratadas e não tratadas com placebo.

5. Protocolos preferidos para a produção de TGF-b3s monoméricos ediméricos de acordo com a presente invenção.

Condições preferidas para a geração de TGF-Beta 3s monomé-ricos corretamente redobrados de acordo com a presente invenção, são asseguintes:

0.7M de ácido 2-(ciclohexilamino) etanossulfônico (CHES), 2mMde glutationa reduzida (GSH), 0,4mM glutationa oxidada (GSSG),0,12mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8 ° C.

30mM de Taurodeoxicolato, 0,7M de CHES, 2mM de GSH,0,4mM de GSSG, 0,12mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8 ° C.

1M de NDSB-201, 2mM de glutationa reduzida (GSH), 2mM deglutationa oxidada (GSSG), 0,12mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8 ° C.

0,7M de CHES, 2mM de glutationa reduzida (GSH), 2mM de glu-tationa oxidada (GSSG), 0,12mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8 °C.

30mM de Taurodeoxicolato mais 1M NDSB-221, 2mM de glutati-ona reduzida (GSH), 2mM de glutationa oxidada(GSSG), 0,12mg/ml_deTGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8 °C.

30mM de Taurodeoxicolato mais 0,7M CHES, 2mM de glutationareduzida (GSH), 2mM de glutationa oxidada (GSSG), 0,12mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8 ° C.

30mM de Taurodeoxicolato, 0,7M de CHES, 2mM de GSH1 2mMde GSSG, 0,12mg/mL TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8 ° C.Em geral um TGF^3, de acordo com a presente invenção podeser dobrado em uma forma biologicamente ativa, dimérica através de ummétodo compreendendo a adição de TGF-p3 monomérico desdobrado solu-bilizado a uma solução contendo:

(i) ácido 2-(cilcohexilamino)-etlianossulfônico (CHES) ou umanálogo funcional deste; e

(ii) um sistema redox sulfidrila/dissulfeto de baixo peso molecu-lar; e incubando o fator de crescimento na solução até TGF-P3 dimérico bio-logicamente ativo seja formado.

Condições preferidas para a geração de TGF-Beta 3s diméricoscorretamente redobrados de acordo com a presente invenção, são as se-guintes:

0,7M de ácido 2-(cilcohexilamino) etanossulfônico (CHES), 2mMde glutationa reduzida (GSH), 0,4mM de glutationa oxidada (GSSG),0,12mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8 ° C.

30mM de Taurodeoxicolato, 0,7M de CHES, 2mM de GSH, 2mMde GSSG, 0,12mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C.

CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS PREFERIDAS:

5.1 VETOR DE CLONAGEM E TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULA HOSPEDEIRA.

O vetor PET-24d é derivado do vetor pBR322 e contém um pro-motor T7 sob controle de LacUVS e um gene marcador de resistência à ca-namicina.

DNA codificando TGF-p3s da invenção pode ser digerido com o0,75μl de Ncol (New England Biolabs) e 0,75μl de BamHI (New EnglandBiolabs) com tampão 1 X BamHI (New England Biolabs) em uma reação de15μl (Nuclease Free Water1 Novagen) a 37°C por 4 horas. Um microlitro deplasmídeo pET-24d (Novagen) pode ser digerido da mesma maneira. O cD-NA digerido e o grande fragmento de plasmídeo são purificados e recupera-dos em gel de garose usando o Kit de extração de DNA SpinPrep Gel (No-vagen).

Os fragmentos de plasmídeo e cDNA purificado foram ligadosusando o Kit de ligase T4 (Novagen). O cDNA / plasmídeo ligado foi trans-formado em HMS174 (DE3) (kit de transformação Novagen HMS174 (DE3)).

Os transformantes foram selecionados por plaqueamento nas placas ágar decaldo de Luria (LB) contendo 50pg/mL de Canamicina (Invitrogen). Clonesadequados foram selecionados para restrição de digestão e/ou expressão.

5.2 Seleção de Clone para Produto de Expressão

Os clones foram crescidos em culturas de frasco de agitação de"Caldo Terrific" de meia resistência (6g/L de fitona petona (Becton Dickin-son), 12g/L de extrato de fermento (Becton Dickinson), 2g/L de glicerol (JTBaker), 1,16g/L de fosfato de potássio monobásico (JT Baker), 6,25g/L defosfato de potássio dibásico (JT Baker), QS para 1 litro com água destilada)e induzidos na fase exponencial em OD600 entre 0,65 e 0,85 com 1mM deisopropil beta-D-tiogalactopiranosida (IPTG). As amostras de pós-induçãoforam tomadas 3 horas após a adição de IPTG e analisadas por eletroforesede gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) para indução eexpressão de produto. As amostra de clones adequados foram funcionaliza-dos sobre gel NuPAGE@ Novex 12% Bis-Tris, 1,0mm (Invitrogen) por apro-ximadamente 40-50 minutos em 120milliAmps e 200 volts e então coradoscom Coomassie Blue. Expressão de TGF-p3s de acordo com a invençãopode então ser induzida nessas culturas.

5.3 Estoque de Célula Congelada

Os clones são crescidos em frascos de agitação em Caldo Terri-fie de meia resistência para um OD600 de aproximadamente 1 e armazena-dos como estoques de glicerol pela adição de glicerol a 20% (v/v). 1,2mL decaldo foi dosado em criovasos de 12 χ 2mL (que continham 0,3mL de glice-rol) e então armazenado a -70°C.

5.4 Confirmação de Seqüência de Gene de TGF-Beta 3

As amostras das culturas usadas para estoques de célula con-gelada foram tomadas antes da adição de glicerol e usadas para o isolamen-to de plasmídeo usando um Qiagen MiniPrep Kit. O plasmídeo isolado foiseqüenciado e verificado usando um iniciador promotor T7 (5'- TAA TACGAC TCA CTA TAG GG-3') e um iniciador terminal T7 (5'- GCT AGT TATTGC TCA GCG G-3').

5.5 Cultura Semeada

Um clone adequado selecionado é inoculado dentro de um fras-co de Erlenmeyer com defletores de 2 Litros, contendo 500mL de meio Hy-Soy (12g/L Hy-Soy (Quest International), 24g/L de extrato de levedura (Bec-ton Dickinson), 10g/L de NaCI (Sigma), 10g/L de glicerol (Sigma) e 5C^g/mLde canamicina. O frasco foi incubado com agitação a 37°C e 200rpm e a-mostrado periodicamente para medir OD550. Quando o OD da cultura alcan-çou 3,21 U/mL (após 7 horas) o caldo de célula foi usado para semear umfermentador 150L (100 litros de volume de funcionamento).

5.6 Fermentação

Novecentos mililitros de caldo celular (da seção 3.6) foram usa-dos para inocular 150L de fermentador (WHE) contendo 90L de Meios deCultura em Batelada (0,6g/L K2HPO4, 0,4g/L KH2HPO4, 1,25g/L NH4SO4,12g/L HY-Soy, 24g/L de extrato de levedura, 10g/L de glicerol). Os parâme-tros de funcionamento de fermentação foram controlados como segue: pontode ajuste de temperatura, 37°C; ponto de ajuste de pH, 7,0 (mantidos usan-do 4N de hidróxido de amônio e 4N de ácido fosfórico), e; oxigênio dissolvido(DO) inicialmente calibrado a 100%. A pressão da cabeça do vaso era0,4914 kgf/cm2 (7 psi), e a agitação e o fluxo de ar eram 200-400rpm comum volume de ar por volume de meio por minuto (vvm ou slpm), respectiva-mente. DO foi mantido acima de 20% ajustando os parâmetros do ponto deajuste de fermentação na seguinte prioridade: Agitação (máximo de400rpm), aeração (máximo de 1,5 wm), suplemento de oxigênio (máximo33,3 lpm), e contrapressão (máximo de 0,8424 kgf/cm2 (12 psi)). Espumaçãofoi controlada com Pluronic L-61 (25% v/v). Quando o OD da cultura alcan-çou 10U/mL uma alimentação de glicerol (50% v/v) foi iniciada em uma taxade fluxo de 45mL/min. Quando o OD alcançou 40 U/mL, as células foraminduzidas com a adição de IPTG à concentração final de 0,2mM.

5.7 ColheitaApós 4 horas de pós-indução, o fermentador foi refrigerado a10°C e o fluxo de ar e a agitação foram reduzidos a 0,3vvm e IOOrpm res-pectivamente. A espuma e os controles de pH foram terminados e a contra-pressão foi ajustada a 127 kPa (3psi). A cultura foi colhida por centrifugaçãocontínua com um centrifugador contínuo Westfalia CSA 8 a 10°C. O centrifu-gador foi operado em 15,000 rpm e uma taxa de fluxo de 3 litros por minutoe pastas fluidas celulares colhidas.

5.8 Lise de célula e Recuperação de IB

A pasta celular de fermentação (da seção 5.7) foi diluída em 1:5com Tampão de lise(6,1g/L de TrizmaBase (Tris), 3,7g/L de ácido etilenodi-aminatetraacético (EDTA), 58,44L de NaCI e 10g/L de Triton X-100, pH 8,0)e ressuspensa usando um homogeneizador manual. A pasta celular ressus-pensa foi passada duas vezes através de um homogeneizador de alta pres-são (parâmetros: pressão, 60 Mpa (10.000psig); taxa de fluxo, 450mUmin; etemperatura, 15°C). O Iisato celular homogeneizado foi então centrifugado(centrifugador de cubeta, rotor de ângulo fixo) em 5,OOOxg por 20 minutos a4°C. O sobrenadante foi descarregado deixando o TGF-B3 (corpos de inclu-são) insolúvel. O pélete do corpo de inclusão (IB) foi ressuspenso em Tam-pão de lavagem (6,1 g/L Tris e 3,72g/L EDTA, pH 8,0) usando um homoge-neizador manual e centrifugado (5,000 xg por 20 minutos a 4°C).

5.9 Solubilização de Corpo de Inclusão

O sedimento da seção 5.8 foi diluído em 1:10 com Tampão deSolubilização (6,1 g/L Tris, 15,4g/L DL-ditiotreitol (DTT) e Uréia 360,4g/L, pH8,0) e ressuspenso usando um homogeneizador manual. A suspensão foicoberta e deixada em agitação por 60-75 minutos, na temperatura ambientepara solubilizar os corpos de inclusão e reduzir TGF-P3 para sua forma mo-nomérica. O pH do pélete ressuspenso foi ajustado ao pH 9,4-9,6 com Na-OH/ácido acético antes da incubação por uma segunda vez por 60-75 minu-tos.

5.10 Clarificação/Ultrafiltração e Diafiltração

O material Solubilizado da seção 5.9 foi clarificado, concentradoe diafiltrado em um sistema de Filtração de Fluxo Tangencial (TFF) (millipo-re). Clarificação e concentração iniciais foram alcançadas com uma mem-brana TFF de clarificação pré-condicionada (peneira V Millipore Pellicon1000kDa, Regenerated Cellulose). O TGF-p3 clarificado foi coletado no per-meado. Comutando a uma membrana de Ultrafiltração/Diafiltração (UF/DF)(peneira C Millipore Pellicon 5kDa, Regenerated Cellulose), o TGF-P3 foientão lavado em 6 diavolumes de Tampão de Solubilização (6,1 g/L Tris,15,4g/L DTT e 360,4g/L de uréia, pH 9,5).

5.11 Ultrafiltração/Cromatografia Interações hidrofóbicas.

A solução de redobramento selecionada é concentrada em 5dobras por ultrafiltração (a membrana pode ser uma folha plana-MilliporePellicon 5kDa, 0,1 m.2, celulose regenerada, tela). O pH do concentrado domaterial redobrado é então ajustado a um pH de 2,5-2,8 utilizando ácidoacético glacial antes de ser diluído 1:1 em tampões de diluição (2.72g / L deacetato de sódio, 264,28g/L de sulfato de amônio, 100g /L de ácido acético,e 210.7g /L de cloridrato de arginina pH 3,3). Uma coluna de fluxo Rápidobutil Sefarose 4 (Amersham, 16 cm Bed Altura) é equilibrada com quatrovolumes de coluna de Tampão A (2,72g / L de acetato de sódio, 132,14g / Lde sulfato de amônio e 100g / L de ácido acético pH 3.3). O material redo-brado é filtrado através de 0,22/μΜ de membrana (Millipore Millipark Filter)antes sendo carregada sobre coluna de Butil Sefarose em razão de fluxo de100cm/h (esta razão de fluxo foi usada durante todo o processo). A coluna éentão lavada em tampão A por quatrovolumes de coluna. As proteínas TGF-Beta 3 são eluídas da coluna usando tampão B (2,72g/L de acetato de sódio,100g/L de ácido acético e 300g/L de etanol pH 3,3) P primeiro pico, no qualcontinha proteínas TGF-P3 tanto nas formas monoméricas e diméricas é a -grupado, antes a separação das proteínas monoméricas e diméricas.Seqüência de informação

TGF-β 3 (Seqüência ID No. 1)

ALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADTTES T VLGL YNTLN PEASAS PCCVPQ DLE PLTILY YVGRT PKVEQL SNMWKSCKCSMutante TGF-Í3 3 "Gly63-Ala" (Seqüência ID No. 3)

ALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHÉPKGYYANFCSGPCPYLRSADTTHSTVLALYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS

Mutante TGF-β 3 "Gly63-Pro" (Seqüência D3 No. 5)

ALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADTTHSTVLPLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMWKSCKCS

Mutante TGF-β 3 "Glul2-Ser" (Seqüência ID No. 7)

ALDTNYCFRNLSENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADT

THSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMWKSCKCS

Mutante TGF-β 3 "Arg52-Ser" (Seqüência ID No. 9)

ALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLSSADTTHSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMWKSCKCS

Mutante TGF-O 3 "Glul2-Ser/Arg52-Ser" (Seqüência e ID No. 11)ALDTNYCFRNLSENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLSSADT

THSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMWKSCKCSSeqüência ID No. 2 - DNA codificando TGF-/S3 humno tipo selvagem

GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC TGC TGT GTG CGCCCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG GTC CAT GAA CCTAAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC CCA TAC CTC CGC AGT GCAGAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCATCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TACTAT GTT GGG AGG ACC CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCTTGT AAA TGT AGC

Seqüência ID No. 4 - DNA codificando Gly63-Ala mutante

GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC TGC TGT GTG CGCCCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG GTC CAT GAA CCTAAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC CCA TAC CTC CGC AGT GCAGAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GCA CTG TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCATCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TACTAT GTT GGG AGG ACC CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCTTGT AAA TGT AGC

Seqüência ID No. 6 - DNA codificando Gly63-Pro mutante

GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC TGC TGT GTG CGCCCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG GTC CAT GAA CCTAAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC CCA TAC CTC CGC AGT GCAGAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG CCA CTG TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCATCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TACTAT GTT GGG AGG ACC CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCTTGT AAA TGT AGC

Seqüência ID No. 8 - DNA codificando Giul2-Ser mutanteGCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG TCG GAG AAC TGC TGT GTG CGCCCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG GTC CAT GAA CCTAAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC CCA TAC CTC CGC AGT GCAGAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCATCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TACTAT GTT GGG AGG ACC CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCTTGT AAA TGT AGC

Seqüência ID No. 10 - DNA codificando Arg52-Ser mutante

GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC TGC TGT GTG CGCCCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG GTC CAT GAA CCTAAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC .TGC TCA GGC CCT TGC CCA TAC CTC AGC AGT GCAGAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCATCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TACTAT GTT GGG AGG ACC CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCTTGT AAA TGT AGC

Seqüência ID No. 12 - DNA codificando Glul2-Ser/Arg52-Ser mutante

GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG TCG GAG AAC TGC TGT GTG CGC

CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG GTC CAT GAA CCT

AAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC CCA TAC CTC AGC AGT GCA

GAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCATCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TACTAT GTT GGG AGG ACC CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCTTGT AAA TGT AGC

Tabela 1 Escala de propensão à hélice baseada em estudos de experimen-

tos de proteínas e peptídeos

Aminoácido Propensão à hélice (kcal/mol)Ala O1OOGlu0 0,16Leu 0,21Met 0,24Arg+ 0,21Lys+ 0,26Gln 0,39Glu 0,40He 0,41Asp0 0,43Ser 0,50Trp 0,49Tyr 0,53Phe 0,54Val 0,61Tlir 0,66His0 0,56<table>table see original document page 81</column></row><table>

Tabela 2

<table>table see original document page 81</column></row><table>

Tabela 3

Eficiência de redobramento do TGF-33 tipo selvagem e TGF-P3s da inven-

<table>table see original document page 81</column></row><table>Tabela 4

Atividade Biológica de TGF-P3 tipo selvagem e Gly63-Ala (uma proteínaTGF-fi3 da invenção) Avaliada pelo Ensaio de Inibição do Crescimento Celular

<table>table see original document page 82</column></row><table>

Tabela 5 Tratamento no local da ferida.

<table>table see original document page 82</column></row><table>

Tabela 6 Tratamento no local da ferida.

<table>table see original document page 82</column></row><table>

Claims

1. TGF-B3, ou fragmento ou derivado do mesmo, em que o do-mínio de formação alfa-hélice entre resíduos de aminoácidos 58 e 67 deTGF-B3 de tipo selvagem de comprimento total compreende pelo menosuma substituição de alfa-hélice estabilizante.

2. TGF-B3, ou fragmento ou derivado do mesmo, de acordo coma reivindicação 1, em que o resíduo de glicina na posição 63 do TGF-B3 detipo selvagem de comprimento total é recolocado com um resíduo de amino-ácido alfa-hélice estabilizante.

3. TGF-B3, ou fragmento ou derivado do mesmo, de acordo coma reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que a substituição de alfa-héliceestabilizante compreende introdução de um resíduo selecionado do grupoconsistindo em Alanina, Serina, Treonina, Valina, Leucina, lsoleucina; Metio-nina e Fenilalanina.

4. TGF-B3, ou fragmento ou derivado do mesmo, de acordo coma reivindicação 3, em que o resíduo de glicina na posição 63 do TGF-B3 detipo selvagem de comprimento total é recolocado com alanina.

5. TGF-B3, de acordo com a reivindicação 4 compreende Se-qüência de ID N9 3, ou fragmento ou derivado do mesmo.

6. TGF-B3, ou fragmento ou derivado do mesmo, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 5, que não compreende uma substitui-ção do resíduo de Valina na posição 61 de TGF^3 de tipo selvagem decomprimento total.

7. TGF-B3, ou fragmento ou derivado do mesmo, de acordo coma reivindicação 1, em que o resíduo de glicina na posição 63 do TGF-P3 detipo selvagem de comprimento total é recolocado com Prolina.

8. TGF-B3, de acordo com a reivindicação 7, compreende Se-qüência de ID Nq 5, ou fragmento ou derivado do mesmo.

9. TGF-B3, ou fragmento ou derivado do mesmo, compreenden-do uma substituição do resíduo de ácido Glutamínico na posição 12 do TGF-β3 de tipo selvagem de comprimento total e/ou resíduo de Arginina na posi-ção 52 do TGF-p3 de tipo selvagem de comprimento total.

10. TGF-(33, ou fragmento ou derivado do mesmo, de acordocom a reivindicação 9, em que a substituição ou substituições, é com resí-duo de aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Serina; Alanina;Treonina; Valina; lsoleucina; Metionina: Fenilalanina e Leucina.

11. TGF-P3, ou fragmento ou derivado do mesmo, de acordocom a reivindicação 9 ou reivindicação 10, em que o resíduo do ácidos Glu-tamínico na posição 12 do TGF-33 de tipo selvagem de comprimento total ésubstituído por Serina.

12. TGF-p3, ou fragmento ou derivado do mesmo, de acordocom qualquer uma das reivindicações 9 a 11, em que o resíduo de Argininana posição 52 do TGF-33 de tipo selvagem de comprimento total é substituí-do por Serina.

13. TGF-p3 selecionado do grupo consistindo em Seqüência deID Nq 7, Seqüência de ID Ns 9 e Seqüência de ID N2 11, ou fragmento ouderivado do mesmo.

14. TGF-p3 monomérico, ou fragmento ou derivado do mesmo,de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13.

15. TGF-p3 dimérico, ou fragmento ou derivado do mesmo, deacordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13.

16. Uso de um TGF-p3, ou fragmento de TGF-p3, ou um deriva-do de TGF-P3, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, co-mo um medicamento.

17. Uso de um TGF-p3, ou fragmento ou derivado do mesmo,como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, na preparação deum medicamento para uso na aceleração de cura de ferida e/ou prevenção,redução ou inibição de cicatriz.

18. Uso de um TGF-p3, ou fragmento ou derivado do mesmo,como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, na preparação deum medicamento para uso na preparação de um medicamento de regenera-ção epitelial.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 17 ou reivindicação 18,em que o medicamento é para uso na pele.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 17 ou reivindicação 18,em que o medicamento é para uso no olho.

21. Uso de um TGF-p3, ou fragmento ou derivado do mesmo,como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, na preparação deum medicamento para uso na prevenção e/ou tratamento de distúrbios fibró-ticos.

22. Uso de acordo com a reivindicação 21, em que o distúrbiofibrótico é selecionado do grupo consistindo em fibrose pulmonar, fibrose defígado, escleroderma, fibrose de pele, fibrose muscular, fibrose de radiação,fibrose de rim, vitreorretinopatia proliferativa e fibrose uterina.

23. Uso de um TGF-p3, ou fragmento ou derivado do mesmo,como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, na preparação deum medicamento para o tratamento de distúrbios angiogênicos, restenose,adesões, endometriose, doença isquêmica, mucosite oral e doença renal.

24. Uso de um TGF^3, ou fragmento ou derivado do mesmo,como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, na preparação deum medicamento para uso na indução de osso e cartilagem, ou fertilizaçãoin vitro.

25. Ácido nucléico codificando um TGF-p3, ou fragmento ou de-rivado do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a15.

26. Método de aceleração de cura de ferida, e/ou prevenção,redução ou inibição de cicatriz, o método compreendendo prover uma quan-tidade terapeuticamente eficaz de um TGF-P3, ou um fragmento ou derivadodo mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, a umpaciente necessitado do mesmo.

27. Método de prevenção e/ou tratamento de um distúrbio fibró-tico, o método compreendendo prover uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um TGF-p3, ou um fragmento ou derivado do mesmo, como defini-do em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, a um paciente necessitadode tal prevenção e/ou tratamento.

28. Método de acordo com a reivindicação 26 ou reivindicação- 27, em que TGF-p3, ou um fragmento ou derivado do mesmo, é provido paraa pele do paciente.

29. Método de acordo com a reivindicação 26 ou reivindicação 27, em que TGF-p3, ou um fragmento ou derivado do mesmo, é provido parao olho do paciente.