BRPI0708893A2 - composição, processos para aumentar a proporção de pmfs hidroxiladas para pmfs não hidroxiladas em um extrato de planta, e para preparar o extrato de planta, usos de uma pmf hidroxilada, e de uma composição, e, métodos para inibir a proliferação de uma célula cancerosa, para induzir apoptose em uma célula cancerosa, para reduzir a produção de nitrito em um macrófago, e para inibir a ativação de inos e/ou cox-2 em um macrófago - Google Patents

Abstract

COMPOSIçãO, PROCESSOS PARA AUMENTAR A PROPORçãO DE PMFS HIDROXILADAS PARA PMFS NãO HIDROXILADAS EM UM EXTRATO DE PLANTA, E PARA PREPARAR O EXTRATO DE PLANTA, USOS DE UMA PMIF HIDROXILADA, E DE UMA COMPOSIçãO, E, MéTODOS PARA INIBIR A PROLIFERAçãO DE UMA CéLULA CANCEROSA, PARA INDUZIR APOPTOSE EM UMA CéLULA CANCEROSA, PARA REDUZIR A PRODUçãO DE NITRITO EM UM MACRóFAGO, E PARA INIBIR A ATIVAçãO DE INOS E/OU COX-2 EM UM MACRóFAGO. São providas aqui composições enriquecidas em polimetoxiflavonas poli-hidroxiladas utilizáveis como suplementos dietéticos, aditivos alimentícios, composições nutracêuticas e composições cosméticas.

Description

"COMPOSIÇÃO, PROCESSOS PARA AUMENTAR A PROPORÇÃO DEPMFS HIDROXILADAS PARA PMFS NÃO HIDROXILADAS EM UMEXTRATO DE PLANTA, E PARA PREPARAR O EXTRATO DEPLANTA, USOS DE UMA PMF HIDROXIL AD A, E DE UMACOMPOSIÇÃO, E, MÉTODOS PARA INIBIR A PROLIFERAÇÃO DEUMA CÉLULA CANCEROSA, PARA INDUZIR APOPTOSE EM UMACÉLULA CANCEROSA, PARA REDUZIR A PRODUÇÃO DE NITRITOEM UM MACRÓFAGO, E PARA INIBIR A ATIVAÇÃO DE INOS E/OUCOX-2 EM UM MACRÓFAGO"

1. REFERÊNCIA CRUZADA

Este pedido reivindica o benefício relativamente ao PedidoProvisional dos E.U.A. n° 60/782.960, depositado em 15 de março de 2006,cujo teor é incorporado aqui integralmente por referência.

2. CAMPO DA INVENÇÃO

Proporciona-se aqui composições compreendendo pelo menos15% (peso/peso) ou mais de polimetoxiflavonas hidroxiladas (PMFs),processos de preparar composições enriquecidas com PMF hidroxilada, emétodos de usar composições enriquecidas com PMF hidroxilada.

3. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Numerosos estudos epidemiológicos e também estudos delaboratório sugerem que uma dieta rica em frutas e hortaliças tem um efeitopreventivo para uma variedade de cânceres e doença. Flavonóides de cítricostêm sido particularmente interessantes porque muitos destes flavonóidesapresentam um amplo espectro de atividade biológica, incluindo propriedadesantiinflamatórias, anti-carcinogênicas, anti-tumor, anti-virais, anti-oxidantes,anti-tromobogênicas e anti-aterogênicas. Determinados tipos de flavonóides,em particular polimetoxiflavonas (PMFs) incluindo 5,6,7,8,4'-pentametoxiflavona (tangeretina), 5,6,7,3',4'-pentametoxiflavona(sinensetina), 5,6,7,8,3',4'-hexametoxiflavona (nobiletina), entre outras PMFs,foram isolados de extratos de plantas cítricas, como extratos de casca delaranja. Ver, p. ex., WO 01/21137 Al, publicado em 29 de março de 2001;Manthey e Grohmann (2001) J. Agric. Food Chem. 49:3268-3273. Estudossugerem que PMFs, como tangeretina e nobiletina, são inibidores docrescimento de células de tumor, e podem apresentar propriedadesantiinflamatórias. Ver, p. ex., WO 01/21 137 Al, publicado em 29 de marçode 2001; Patente US n° 6.184.246; Manthy et ai. (1999) J. Nat. Prod. 62:441-444; Manthey e Guthrie (2002) J. Agric. Food Chem. 50:5837-5843. Noentanto, os mecanismos por meio dos quais PMFs exercem efeitosantiinflamatórios e anticâncer ainda permanecem amplamente inexplicados.Além disso, ainda resta ver quais características estruturais são importantespara conferir atividades benéficas que estão associadas com PMFs.

4. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, proporciona-se aqui composiçõescompreendendo polimetoxiflavonas hidroxiladas (PMFs). Em particular,proporciona-se aqui composições que compreendem pelo menos de 15%(peso/peso) a 95% (peso/peso), de preferência, pelo menos cerca de 20%(peso/peso) a cerca de 90% (peso/peso), de PMFs hidroxiladas. Ascomposições proporcionadas podem ser preparadas, por exemplo, de extratosde plantas, como um extrato de uma planta cítrica, tipicamente, um extrato decasca de laranja.

Em determinadas concretizações, proporciona-se aquicomposições de extratos de plantas compreendendo uma fração de PMFenriquecida com PMFs hidroxiladas. Em algumas concretizações, composiçãode extrato de planta compreende uma fração de PMF apresentando pelomenos 15% (peso/peso) a 95% (peso/peso) PMFs hidroxiladas.

Em determinadas concretizações, a composição é umsuplemento dietético, aditivo alimentício ou nutracêutico. Em algumasconcretizações, a composição é uma composição cosmética.Composições como proporcionadas aqui podem compreenderpelo menos duas ou mais PMFs hidroxiladas selecionadas dentre aquelaslistadas na Tabela 1. Em determinadas concretizações, as PMFs hidroxiladasde uma composição aqui proporcionada consistem substancialmente de pelomenos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelomenos seis, ou mais das PMFs hidroxiladas listadas na Tabela I.

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Em um aspecto, proporciona-se métodos para prepararcomposições como descritas aqui. Em particular, proporciona-se métodospara incrementar a proporção de PMFs hidroxiladas com relação a PMFs não-hidroxiladas em um extrato de planta. Em determinadas concretizações, osmétodos proporcionados compreendem adicionar ácido a um extrato de plantacompreendendo cerca de 10% (peso/peso) a cerca de 75% (peso/peso) dePMFs, em que as PMFs não-hidroxiladas são mais abundantes do que PMFshidroxiladas; e o aquecimento do extrato de planta acidificado é de cerca de40°C a cerca de 150°C durante cerca de 4 horas a cerca de 36 horas. Emdeterminadas concretizações, os métodos proporcionados compreendemadicionar ácido a um extrato de planta compreendendo cerca de 20%(peso/peso) a cerca de 75% (peso/peso) de PMFs, em que as PMFs não-hidroxiladas são mais abundantes do que PAlFs hidroxiladas; e o aquecimentodo extrato de planta acidificado é de cerca de 85°C a cerca de IOO0C durantecerca de 6 horas a cerca de 16 horas. Em algumas concretizações, adiciona-seum ácido de HCl a cerca de 1 N a cerca de 6 N ao extrato de planta.

Como demonstrado aqui, PMFs hidroxiladas, e composiçõesdas mesmas, são eficazes para aumentar a atividade de calpaína intracelulare/ou de caspase-12 intracelular em células de câncer que levam à apoptose dascélulas. Conseqüentemente, em um aspecto, proporciona-se métodos de inibira proliferação de uma célula de câncer. Em determinadas concretizações,proporciona-se métodos que compreendem administrar a um mamífero,incluindo um humano, que disto necessita, uma quantidade de uma PMFhidroxilada, ou composição da mesma, que é eficaz para inibir a proliferaçãoda célula de câncer.

Em outro aspecto, proporciona-se aqui usos de PMFshidroxiladas, e composições das mesmas, para a fabricação de drogas. Asdrogas são vantajosas para a administração a mamíferos incluindo humanos.Referidas drogas podem ser, por exemplo, para induzir apoptose em umacélula de câncer. Referidas drogas podem ser, por exemplo, para inibir oureduzir inflamação. Em determinadas concretizações [proporciona-se] usos dePMFs hidroxiladas, e composições das mesmas, para a fabricação de umamedicamento para reduzir produção de nitrito em um macrófago, ou parainibir ativação de iNOS e/ou COX-2 em um macrófago.

Em outro aspecto, proporciona-se métodos de induzir apoptoseem uma célula de câncer. Em algumas concretizações, métodos aquiproporcionados compreendem administrar a um mamífero, como um humano,que disto necessita, uma quantidade de uma PMF hidroxilada, ou composiçãoda mesma, que é eficaz para induzir apoptose de uma célula de câncer.

Nos métodos proporcionados, uma célula de câncer pode ser,por exemplo, uma célula de câncer de colo, célula de câncer de mama, célulade leucemia ou uma célula de câncer gástrico.

Em outro aspecto, proporciona-se métodos de inibir ou reduzirinflamação. Em determinadas concretizações, os métodos proporcionadoscompreendem administrar a um mamífero, como um humano, que distonecessita, uma quantidade de uma PMF hidroxilada, ou composição damesma, que é eficaz para inibir ou reduzir inflamação.

Em algumas concretizações, proporciona-se métodos parareduzir produção de nitrito em um macrófago, compreendendo contactar omacrófago com uma PMF hidroxilada ou composição da mesma.

Em determinadas concretizações, proporciona-se métodos deinibir ativação de iNOS e/ou COX-2 em um macrófago, os métodoscompreendendo contactar o macrófago com uma PMF hidroxilada oucomposição da mesma.

5. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 proporciona um perfil de HPLC exemplar de PMFshidroxiladas e não-hidroxiladas separadas de um extrato de casca de laranjaobtido comercialmente.

A Figura 2 proporciona resultados experimentais quedemonstram as propriedades antiinflamatórias mais eficazes de composiçõesenriquecidas com PMF hidroxilada, em comparação com (nobiletina) ouextrato de casca de laranja apresentando uma fração de predominantemente70% PMF não-hidroxilada.

A Figura 3 proporciona dados sobre os efeitos de PMFs sobreprodução de nitrito induzida com LPS em macrófagos RAW 264.7. *P < 0,05,**p < 0,01 e ***P <0,001 indicam diferenças estatisticamente significativasdo grupo tratado com LPS.

A Figura 4 proporciona uma comparação dos efeitos entrediferentes PMFs sobre níveis de expressão de iNOS, COX-2 e proteínas de β-actina em macrófagos estimulados com LPS.A Figura 5 proporciona efeitos observados de PMFs sobreatividades de promotor de NFKB induzidas com LPS em macrófagosRAW264.7 usando-se atividade de luciferase como um repórter. *P < 0,05,**P < 0,01 e ***P 0,001 indicam diferenças estatisticamente significativas dogrupo tratado com LPS.

A Figura 6 proporciona resultados experimentais quedemonstram que 20 μΜ de 5-hidróxi-3,6,7,8,3',4'-hexametoxiflavona inibema expressão de mRNA de COX-2 induzida com LPS em macrófagos.

A Figura 7 demonstra os efeitos inibidores do crescimento dePMFs em células MCF-7 tratadas com PMFs ou veículo durante 1 (A), 3 (B)ou 6 (C) dias. Resultados são médias de determinações em triplicata de doisexperimentos independentes.

A Figura 8 demonstra o efeito pró-apoptótico de PMFs emcélulas MCF-7 tratadas com PMFs ou veículo durante 1 (A), 3 (B) ou 6 (C)dias. Resultados são apresentados como unidades de intensidade defluorescência (FU) por IxlO3 células.

A Figura 9 demonstra morte de células induzida por PMFs emcélulas MCF-7 tratadas com PMFs ou veículo durante 1 (A), 3 (B) ou 6 (C)dias. Resultados são apresentados como unidades de intensidade defluorescência (FU) por 1x10 células.

A Figura 10 demonstra os efeitos de PMFs sobre níveis deCa intracelulares em células MCF-7 tratadas com PMFs ou veículo durante1 (A), 3 (B) ou 6 (C) dias.

A Figura 11 demonstra os efeitos de PMFs sobre o influxo de 9+Ca e a mobilização de Ca em células MCF-7. As respostas de mobilizaçãode Ca (A, B)são mostradas porque o máximo i eleva-se após a adição detapsigargina. As taxas de entrada de Ca2+ (C, D) são apresentadas comotangentes das porções lineares das curvas de extinção de fura-2. Dados nosquadros AeC são apresentados como médias ± SE [erro padrão] para célulasde controle ou células tratadas com PMFs 3 [durante] dias (barras pretas) ou 6dias (barras cinzas). Quadros BeD mostram traços representativos dosregistros de células individuais do influxo de Ca2+ e da mobilização de Ca2+,respectivamente, em que RFU significa unidades de fluorescência relativa [RFU].

A Figura 12 demonstra os efeitos de PMFs sobre a atividadede calpaína e caspase-12 em células MCF-7. As atividades de calpaína (A) ecaspase (B) foram medidas com substratos de peptídeos fluorogênicos no dia3 (barras pretas) ou dia 6 (barras cinza) e expressas como percentual dascélulas marcadas fluorescentemente (definido como células com intensidadede fluorescência de pelo menos 2,5 vezes acima da fluorescência de fundo dascélulas). Dados são apresentados como médias ± SE; (n.t.: erro padrão), p<0,05, como em comparação com o grupo de controle correspondente.

A Figura 13 demonstra a ativação de calpaína e caspase-12 emcélulas MCF-7 tratadas com PMF. Quadro A, o substrato de calpaína clivada;quadro B, a subunidade pequena de calpaína; quadro C, o substrato decaspase-12 clivada; e quadro D, a proteína de caspase-12. As células foramtratadas com PMFs durante 3 (A, B) ou 6 (C, D) dias. Fileiras superiores,imagens de fluorescência; fileiras inferiores, imagens de contraste de fase; a,controle; b, composto 4; c, composto 5; d, composto 6; e, composto 7.

A Figura 14 demonstra a assimetria da membrana plasmática ea fragmentação nuclear em células MCF-7 tratadas com PMF. A, célulasmarcadas com Anexina V; B, células marcadas com Hoesht 33342. As célulasforam tratadas com PMFs durante 6 (A) ou 3 (B) dias.

A Figura 15 proporciona perfis representativos de PffLC dePMFs hidroxiladas e não-hidroxiladas separadas da fração de material departida (A), fração de solvente de hexanos (B), e fração de solvente de acetatode etila (C) de um método exemplar para preparar uma composição de PAlFhidroxilada enriquecida descrita no Exemplo 9. Picos com números de 1 a 11correspondem àqueles para PMFs identificadas na Tabela 16.

6. TERMINOLOGIA

Abreviaturas usadas aqui incluem: COX-2, ciclo-oxigenase-2;G3PDH, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; HPLC, cromatografia líquidade alto desempenho; LPS5 lipopolissacarídeo; ΟΡΕ, extrato de casca delaranja; PCR, reação em cadeia de polimerase; e PMF5 polimetoxiflavona.

O termo "cerca de" como usado aqui refere-se a um valor quenão é modificado em mais de 10%, para cima ou para baixo, com relação aovalor do termo. Por exemplo, o termo "cerca de 5%" significa uma faixa de4,5% a 5,5%.

O termo "acidificado" usado aqui no contexto de uma mistura"acidificada", em que uma mistura pode ser um extrato ou material de partida,etc., significa uma mistura à qual se adicionou ácido, tornando a mistura maisácida do que antes da adição do ácido. Por exemplo, uma mistura ácida podeser acidificada por meio da adição de ácido à mistura ácida para preparar umamistura acidificada. Por exemplo, uma mistura neutra ou básica pode seracidificada por meio da adição de ácido à mistura neutra ou básica parapreparar uma mistura acidificada. Uma mistura acidificada apresenta um pHmenor do que a mistura antes da adição de ácido.

Como usado aqui, o termo "composição" é usadocompreendendo suplementos dietéticos, aditivos alimentícios, nutracêuticos,composições cosméticas, composições farmacêuticas e composiçõesfisiologicamente aceitáveis. Deve-se compreender que, onde um componente,por exemplo, uma flavona polimetoxilada (PMF), em uma "composição"também ocorre em uma fonte natural (para exemplo, casca de laranja), otermo "composição" não inclui a fonte natural (por exemplo, casca de laranja)do componente, porém, em determinadas concretizações, pode compreenderuma forma processada ou modificada fisicamente ou quimicamente da fontenatural, como um extrato da fonte natural.O termo "quantidade eficaz" como usado aqui refere-se àquantidade de um composto ou composição que é suficiente para produzir umefeito desejável ou benéfico quando administrado, por exemplo, a um sujeito.Em determinadas concretizações, uma "quantidade eficaz" de um compostoou composição em determinadas concretizações, um "quantidade eficaz" é aquantidade de um composto ou composição suficiente para reduzir oumelhorar a gravidade ou duração de um distúrbio (p. ex., um distúrbioproliferativo ou um distúrbio inflamatório) ou um ou mais sintomas damesma, para prevenir o avanço de um distúrbio (p. ex., um distúrbioproliferativo ou um distúrbio inflamatório), causam regressão de um distúrbio(p. ex., um distúrbio proliferativo ou um distúrbio inflamatório), prevenir arecorrência, desenvolvimento, ou início de um ou mais sintomas associadoscom um distúrbio (p. ex., um distúrbio proliferativo ou um distúrbioinflamatório), ou acentuar ou melhorar o(s) efeito(s) profilático(s) outerapêutico(s) de outra terapia.

Como usado aqui, o termo "isolado" no contexto de umcomposto ou composição que pode ser obtida de uma fonte natural, p. ex.,plantas, refere-se a um composto ou composição que é separada de um oumais componentes de sua fonte natural, de preferência, um composto oucomposição que é substancialmente isenta de material celular de fonte natural,p. ex., material celular de planta, ou materiais contaminantes da fonte natural,p. ex., fonte de células ou tecidos, da qual é obtido. A expressão"substancialmente isenta de material celular de fonte natural" ou"substancialmente isenta de material celular de planta" inclui preparações deum composto que foram separadas de componentes celulares das células deque é isolado. Assim, um composto ou composição "isolada" encontra-senuma forma tal que sua concentração ou pureza é maior do que em sua fontenatural. Por exemplo, em determinadas concretizações, um composto oucomposição "isolada" pode ser obtida purificando-se ou purificando-separcialmente o composto ou composição de uma fonte natural. Em algumasconcretizações, um composto ou composição "isolada" é obtida in vitro emuma mistura de reação química orgânica sintética, biossintética ousemissintética.

Como usado aqui, o termos "controlar", "controle", e"controle" referem-se aos efeitos benéficos que um sujeito deriva de umaterapia (p. ex., um agente profilático ou terapêutico), se não resultante emuma cura da doença. Em determinadas concretizações, um sujeito recebe aadministração de uma ou mais terapias (p. ex., um ou mais agentesprofiláticos ou terapêuticos) para "controlar" uma doença de forma a prevenira progressão ou piora da doença.

Como usado aqui, e exceto se indicado de outra forma, nocontexto em que é usado, um percentual ("%") de uma composição destina-sea significar percentual peso/peso.

O termo "polimetoxiflavona" ou "PMF" significa, exceto seindicado de outra forma, um composto apresentando a fórmulaem que pelo menos um carbono, de preferência, dois ou mais carbonos, nafórmula são substituídos por um grupo -OCH3 (em lugar de um ou maisátomos de hidrogênio, não ilustrados na fórmula) conforme o permite avalência. Como estará claro no contexto em que o termo PMF é usado, umaPMF pode ser opcionalmente substituída por substituintes, como, porexemplo, hidroxila, halogeneto, monossacarídeo, ou outros grupos, ligados aum ou mais carbonos não substituídos por um grupo metóxi. Por exemplo,uma "PMF hidroxilada" é uma PMF que compreende um ou mais gruposhidroxila ligados a um carbono não substituído por um grupo metóxi. Uma"PMF não-hidroxilada" é uma PMF que não contém grupos hidroxila. Comousado aqui, os termos "prevenir", "prevenindo" e "prevenção" referem-se àprevenção da recorrência, do início, ou do desenvolvimento de um distúrbioou de um sintoma do mesmo em um sujeito, resultante da administração deum composto ou composição ao sujeito.

Como usado aqui, a expressão "quantidade profilaticamenteeficaz" refere-se à quantidade de uma terapia (p. ex., agente profilático) que ésuficiente para resultar na prevenção do desenvolvimento, recorrência ouinício de um distúrbio ou de um sintoma do mesmo associado com umdistúrbio (p. ex., um distúrbio proliferativo, como um câncer, ou um distúrbioinflamatório), ou para acentuar ou melhorar o(s) efeito(s) profilático(s) deoutra terapia (p. ex., outro agente profilático).

Como usado aqui, o termo "quantidade terapeuticamenteeficaz" refere-se àquela quantidade de uma terapia (p. ex., um agenteterapêutico) suficiente para resultar no melhoramento de um ou mais sintomasde um distúrbio (p. ex., um distúrbio proliferativo, como um câncer, ou umdistúrbio inflamatório), prevenir o avanço de um distúrbio (p. ex., umdistúrbio proliferativo ou um distúrbio inflamatório), causar regressão de umdistúrbio (p. ex., um distúrbio proliferativo ou um distúrbio inflamatório), oupara acentuar ou melhorar o(s) efeito(s) terapêutico(s) de outra terapia. Emuma concretização específica, com relação ao tratamento de câncer, umaquantidade eficaz refere-se à quantidade de uma terapia (p. ex., um agenteterapêutico) que inibe ou reduz a proliferação de células cancerosas, inibe oureduz o espalhamento de células de tumor (metástase), inibe ou reduz o início,desenvolvimento ou progressão de câncer ou de um sintoma do mesmo, oureduz o tamanho de um tumor. De preferência, uma quantidadeterapeuticamente eficaz de uma terapia (p. ex., um agente terapêutico) reduz aproliferação de células cancerosas ou o tamanho de um tumor em pelo menos5%, de preferência, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelomenos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%,pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelomenos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99%, relativa a um controle ouplacebo, como solução salina tamponada com fosfato ("PBS"). Em outraconcretização, com relação à inflamação, uma quantidade eficaz refere-se àquantidades de uma terapia (p. ex., um agente terapêutico) que reduz ainflamação de uma junta, órgão ou tecido. De preferência, uma quantidadeterapeuticamente eficaz de uma terapia (p. ex., um agente terapêutico) reduz ainflamação de uma articulação, órgão ou tecido em pelo menos 5%, depreferência, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%,pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelomenos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99%, relativamente a um controle ouplacebo, como solução salina tamponada com fosfato.

Como usado aqui, os termos "terapias" e "terapia" podemreferir-se a qualquer protocolo(s), método(s), e/ou agente(s) que pode(m) serusados na prevenção, tratamento, controle, ou melhoramento de um distúrbio(p. ex., um distúrbio proliferativo ou um distúrbio inflamatório) ou um oumais sintomas dos mesmos.

Como usado aqui, os termos "tratar", "tratamento" e "tratando"referem-se à redução ou ao melhoramento da progressão, gravidade e/ouduração de um distúrbio (p. ex., um distúrbio proliferativo ou um distúrbioinflamatório), ou ao melhoramento de um ou mais sintomas dos mesmosresultantes da administração de uma ou mais terapias (p. ex., um ou maisagentes terapêuticos, como um composto da invenção), em concretizaçõesespecíficas, referidos termos referem-se à inibição ou redução da proliferaçãode células cancerosas, à inibição ou redução da disseminação de células detumor (metástase), à inibição ou redução do início, desenvolvimento ouprogressão de câncer ou um sintoma do mesmo, à redução do tamanho de umtumor, ou ao melhoramento da ECOG de um paciente ou score de Karnofsky.Em outras concretizações, referidos termos referem-se a uma reação noinchaço de uma ou mais juntas, órgãos ou tecidos, ou a uma redução da dorassociada com um distúrbio inflamatório. Em outras concretizaçõesadicionais, referidos termos referem-se a uma redução do escore PASI de umhumano ou a um melhoramento do escore de avaliação global de um humano.

7. DESCRIÇÃO DETALHADA

7.1. Preparação de composições de polimetoxiflavina hidroxilada

Em um aspecto, proporciona-se aqui métodos de prepararcomposições de extrato de planta enriquecido com PMF hidroxilada. O termo"enriquecido", como usado aqui em conexão com uma composição de extratode planta "enriquecida com PMF hidroxilada", compreende uma composiçãode extrato de planta em que PMFs hidroxiladas na composição de extrato deplanta compreendem pelo menos 15% a cerca de 95% do peso total dacomposição de extrato de planta, e a proporção de PMFs hidroxiladasrelativamente às PMFs não-hidroxiladas na composição de extrato de planta émaior do que a proporção de PMFs hidroxiladas para PMFs não-hidroxiladasencontradas naturalmente na planta de que o extrato se deriva. Emdeterminadas concretizações, uma composição de extrato de planta"enriquecida com PMF hidroxilada" compreende pelo menos 15%, pelomenos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%,pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cercade 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menoscerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, ou pelomenos cerca de 95% de PMFs hidroxiladas do peso total da composição.

Materiais de partida para preparar composições de extrato deplanta enriquecido com PMF hidroxilada incluem tipicamente um extrato ouisolado de uma fonte natural que compreende PMFs. De uma forma geral,fontes de PMFs, como cascas de laranja, por exemplo, apresentam uma fraçãode PMF em que PMFs não-hidroxiladas são mais abundantes do que PMFshidroxiladas. Ver, p. ex., Exemplo 1, abaixo. Conseqüentemente, em algumasconcretizações, proporciona-se métodos para incrementar a proporção dePMFs hidroxiladas para PMFs não-hidroxiladas em um extrato de planta.

Os materiais de partida para os métodos aqui proporcionadospodem ser uma fonte natural, tipicamente uma planta, parte de planta, ouextrato de uma planta ou parte de planta, como um extrato de seiva, casca deárvore, casca de fruta, casca, semente, raiz, suco, folha, flor, broto, etc., deuma planta que contém naturalmente um componente de PMF mensurável.Produtos cítricos, por exemplo, são uma fonte facilmente obtenível para seobter PMFs. Em determinadas concretizações, o extrato de planta é umextrato de casca de laranja, por exemplo, um extrato de sólidos de óleo decasca de laranja prensada a frio. Em algumas concretizações, composiçõespara uso nos presentes métodos compreendem um extrato das variedades delaranja Valencia e Hamlin.

Extrato de casca de laranjas que compreendem tipicamenteentre cerca de 20% a cerca de 70% de PMFs são comercialmente obteníveisjunto a comerciantes, como Danisco USA, Inc. (Lakeland, FL, E.U.A.).Tipicamente, um extrato de casca de laranja (OPE) é preparado por meio deprensagem a frio de cascas de laranjas para se obter um óleo de cascas delaranjas. O óleo de casca de laranja contém cerca de 0,4% de PMFs, 98% deuma fração volátil leve e 2% de resíduo. É possível realizar um processo deseparação usando extração com solventes, seguido de secagem do extrato,dando um extrato de casca de laranja em forma de pó. Determinou-se asquantidades de PMFs hidroxiladas contidas em OPEs comercialmenteobteníveis, como descrito nos Exemplos abaixo.

Em determinadas concretizações, o material de partida para osmétodos de preparar uma composição enriquecida com PMF hidroxilada é umextrato de casca de laranja doce identificado no CAS Registry com n°068917-06-6.

Em determinadas concretizações, o material de partida é umextrato de casca de laranja apresentando cerca de 10% ou cerca de 20% acerca de 75% de PMFs. A fração de PMF pode consistir, por exemplo, dePMFs não-hidroxiladas ou compreendem PMFs não-hidroxiladas e PMFshidroxiladas. O material de partida pode ser, por exemplo, em uma formalíquida, como óleo ou suspensão, ou em uma forma seca, como um pó oupasta, e análogos.

Por exemplo, em determinadas concretizações, umacomposição enriquecida com PMF hidroxilada é preparado a partir de umextrato seco de casca de laranja apresentando de cerca de 10% a cerca de 75%de uma fração de PMF, contactando-se o extrato de casca de laranja com umsolvente para formar uma solução ou suspensão, adicionando-se ácido àsolução ou suspensão de modo a formar uma mistura acidificada, aquecendo-se a mistura acidificada e deixando-se a mistura resfriar, neutralizando-se amistura acidificada, e extraindo-se a mistura neutralizada para se obter acomposição enriquecida com PMF hidroxilada.

Nos métodos proporcionados, o componente de PMFhidroxilada da fração de PMF do material de partida é enriquecidoadicionando-se ácido ao material de partida e aquecendo-se a misturaacidificada. Uma mistura acidificada é uma mistura a que se adicionou ácido.

Em algumas concretizações, os métodos compreendemadicionar ácido ao material de partida compreendendo cerca de 10% ou 20%(peso/peso) a cerca de 75% (peso/peso) de PMFs, e aquecer o material departida acidificado durante um período prolongado, em que o períodoprolongado é mais superior a uma hora, tipicamente mais longo.

Em determinadas concretizações, o material de partida temuma fração de PMF apresentando uma abundância maior de PMFs não-hidroxiladas relativamente a PMFs hidrolisadas.

Em algumas concretizações, o material de partida a seracidificado é dissolvido ou dispersado em uma mistura de água e solventeorgânico. Em determinadas concretizações, o material de partida a seracidificado é dissolvido ou dispersado em água. Em algumas concretizações,o material de partida é dissolvido ou dispersado em um solvente orgânico.Solventes orgânicos são conhecidos por aqueles com prática na arte, ecompreendem solventes, usualmente líquidos, que contêm carbono. Solventesorgânicos exemplares incluem etanol, propanol, isopropanol, hexanol,tetraidrofurano etc. Em algumas concretizações, o solvente orgânico émiscível com água. Em determinadas concretizações, o solvente orgânico éum solvente polar. Solventes polares vantajosos incluem, por exemplo, água,metanol, etanol, 1-propanol, isopropanol, 1-butanol, isobutanol, e análogos,ou uma mistura de solventes polares.

E possível adicionar qualquer ácido para acidificar o materialde partida, incluindo, por exemplo, um ácido forte, como HCl, H2SO4, HNO3,etc; um ácido orgânico, como ácido fórmico, ácido trifluoroacético, ácidocítrico, ácido malônico, etc.; um ácido fraco, como ácido acético, ácidofosfórico, etc.; ou um ácido de Lewis, como BF3, BBr3, BCl3, etc.

Em algumas concretizações, o pH do material de partidaacidificado pode ser de cerca de 7,0, cerca de 6,5, cerca de 6,0, cerca de 5,5,cerca de 5,0, cerca de 4,5, cerca de 4,0, cerca de 3,5, cerca de 3,0, cerca de2,5, cerca de 2,0, cerca de 1,5, cerca de 1,0 ou cerca de 0,5.

O material de partida acidificado é aquecido para incrementara conversão de PMFs não-hidroxiladas a PMFs hidroxiladas. Emdeterminadas concretizações, o material de partida acidificado é aquecidoentre cerca de 30°C a cerca de 250°C. Em algumas concretizações, o materialde partida acidificado é aquecido entre cerca de 40°C a cerca de 200°C ouentre cerca de 50°C a cerca de 150°C. Em determinadas concretizações, omaterial de partida acidificado é aquecido a cerca de 60°C a cerca de 100°C.Em algumas concretizações, o material de partida acidificado é aquecido acerca de 60°C, cerca de 65°C, cerca de 70°C, cerca de 75°C, cerca de 80°C,cerca de 85°C, cerca de 90°C, cerca de 95°C, cerca de 100°C, ou cerca de105°C. Em algumas concretizações, o material de partida acidificado éaquecido a cerca de 85°C ou a cerca de 100°C. Em algumas concretizações, omaterial de partida acidificado é aquecido entre cerca de 40°C a cerca de150°C.

O tempo durante o qual o material de partida acidificado éaquecido pode ser, por exemplo, entre cerca de 1 a cerca de 48 horas. Emdeterminadas concretizações, o material de partida acidificado é aquecidoentre cerca de 5 minutos a cerca de 30 minutos, cerca de 30 minutos a cercade 1 hora, cerca de 1 hora a cerca de 5 horas, cerca de 5 horas a cerca de 10horas, cerca de 10 horas a cerca de 15 horas, ou cerca de 15 a cerca de 24horas. Em determinadas concretizações, o tempo ao longo do qual o materialde partida acidificado é aquecido pode ser de cerca de 1 hora, cerca de 2horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas,cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cercade 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, ou cerca de19 horas. Em algumas concretizações, o material de partida acidificado éaquecido durante cerca de 6 horas a cerca de 16 horas. Em algumasconcretizações, o material de partida acidificado é aquecido durante cerca de4 horas a cerca de 36 horas.

Tipicamente, após aquecimento do material de partidaacidificado, a mistura é deixada resfriar, usualmente à temperatura ambiente.A mistura pode então ser neutralizada com uma base. É possível usarqualquer base vantajosa conhecida por aqueles com prática na arte. Basesvantajosas incluem, por exemplo, hidróxido de sódio, carbonato de sódio,bicarbonato de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de potássio,bicarbonato de potássio, e análogos, ou misturas dos mesmos. O pH damistura neutralizada pode ser, por exemplo, entre cerca de 5,5 a cerca de 8,5.

Em determinadas concretizações, o pH da mistura neutralizada é de cerca de5,8, cerca de 6,0, cerca de 6,5, cerca de 7,0, cerca de 7,5 ou cerca de 8,0.

Em algumas concretizações, os métodos de prepararcomposições enriquecidas com PMF hidroxilada aqui proporcionadascompreendem adicionalmente extrair a composição produzida por meio deaquecimento do material de partida acidificado. Solventes apropriados paraextração são aqueles que não são miscíveis com o solvente em que o produtoé dissolvido ou dispersado. Por exemplo, em concretizações em que etanol é osolvente usado para dissolver ou dispersar o material de partida antes doaquecimento, é possível usar, depois, solventes, como acetato de etila, paraextrair o produto após aquecimento. Aqueles com prática na arte saberãoselecionar solventes apropriados.

Por exemplo, onde se usa acetato de etila para extrair umproduto adequadamente resfriado e neutralizado do material de partidaacidificado em uma solução aquosa, as PMFs hidroxiladas podem serrecolhidas na fração de acetato de etila.

Em outras concretizações, onde o produto do material departida acidificado se encontra numa solução aquosa, é possível usar umsolvente não-polar para extrair não-PMFs e/ou PMFs não-hidroxiladas dasolução aquosa, deixando uma fração de PMF hidroxilada enriquecida nafração aquosa. O solvente não-polar pode ser, por exemplo, um solvente dehidrocarboneto. Solventes não-polares vantajosos são aqueles que não sãomiscíveis com a solução aquosa contendo o produto do material de partidaacidificado. Solventes não-polares exemplares incluem, por exemplo, hexano,pentano, éteres de petróleo, heptanos, e análogos, ou uma mistura dosmesmos. Nestas concretizações, as PMFs hidroxiladas permanecem na faseaquosa que pode ser usada per se como uma composição enriquecida comPMF hidroxilada, ou pode ser processada adicionalmente, por exemplo, pormeio de uma segunda extração, para purificar adicionalmente a fração de PMF hidroxilada.

Por exemplo, em determinadas concretizações em que umasolução aquosa contendo o produto do material de partida acidificado foiextraída com um solvente não-polar para remover não-PMFs e/ou PMFs não-hidroxiladas da solução aquosa, a solução aquosa pode ser extraída com umsegundo solvente para remover as PMFs hidroxiladas da solução aquosa. Atítulo de exemplo, o produto do material de partida acidificado, diluído em umsolvente aquoso, pode ser extraído com hexanos, após o que a fração aquosa éextraída com acetato de etila, e as PMFs hidroxiladas podem ser obtidas nafração de acetato de etila.

Em algumas concretizações, os métodos de prepararcomposições enriquecidas com PMF hidroxilada aqui proporcionadascompreendem adicionalmente a secagem da composição. Por exemplo, ossolventes em que a composição é dissolvida ou dispersada podem serremovidos por meio de evaporação. Em determinadas concretizações, acomposição pode ser secada por meio de liofilização ou secagem porcongelamento.

Em algumas concretizações, uma composição enriquecida compolimetoxiflavona (PMF) hidroxilada, como descrito aqui, pode ser preparadaadicionando-se uma ou mais PMFs hidroxiladas isoladas a um produto natural, como, por exemplo, um extrato de planta.

Purificações exemplares de PMFs hidroxiladas individuais,como, por exemplo, aquelas listadas na Tabela 1, de composições e extratoscontendo PMF, são descritas nos Exemplos abaixo.7.2. ComposiçõesEm um aspecto, proporciona-se aqui composiçõesenriquecidas com polimetoxiflavona (PMF) hidroxilada.

Em algumas concretizações, a composição é uma composiçãode extrato de planta. Em determinadas concretizações, proporciona-secomposições de extrato de planta compreendendo uma fração depolimetoxiflavona (PMF) apresentando entre 10% ou 15% (peso/peso) a cercade 95% (peso/peso) de uma ou mais PMFs hidroxiladas. Em determinadasconcretizações, proporciona-se composições de extrato de plantacompreendendo pelo menos 15% (peso/peso) a 95% (peso/peso) de PMFshidroxiladas. Em algumas concretizações a composição de extrato de plantacompreende cerca de 20% a cerca de 90%, de cerca de 25% a cerca de 85%,de cerca de 40% a cerca de 85%, ou de cerca de 50% a cerca de 85% dePMFs hidroxiladas.

Como discutido na seção 7.1 acima, a planta de que acomposição de extrato de planta é derivada pode ser qualquer planta, ou partede planta da mesma, como seiva, casca de árvore, casca de fruta, casca,semente, raiz, suco, folha, flor, broto, etc., que contém naturalmente umcomponente de PMF mensurável.

Em determinadas concretizações, a fração de PMF hidroxiladanas composições proporcionadas compreendem pelo menos duas das PMFshidroxiladas listadas na Tabela 1. Em algumas concretizações, a fração dePMF hidroxilada compreende pelo menos três, pelo menos quatro, pelomenos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menosnove, pelo menos dez, pelo menos onze, pelo menos doze, pelo menos treze,pelo menos quatorze, pelo menos quinze, pelo menos dezesseis, ou pelomenos dezessete ou mais das PMFs hidroxiladas selecionadas do grupo queconsiste das PMFs hidroxiladas listadas na Tabela 1.

Em determinadas concretizações, a fração de PMF hidroxiladanas composições proporcionadas consiste essencialmente de duas das PMFshidroxiladas listadas na Tabela 1. Em algumas concretizações, a fração dePMF hidroxilada consiste substancialmente de três, quatro, cinco, seis, sete,oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete oudezoito PMFs selecionadas do grupo que consiste das PMFs hidroxiladaslistadas na Tabela 1.

Em determinadas concretizações, a fração de PMF hidroxiladanas composições proporcionadas compreendem pelo menos uma, pelo menosduas, pelo menos três, ou todas as quatro PMFs hidroxiladas selecionadas dogrupo que consiste de 3'-hidróxi-5,6,7,4'-tetrametoxiflavona, 5-hidróxi-3,6,7,8,3',4'-hexametoxiflavona, 5,3'-diidróxi-6,7,8,4'-tetrametoxiflavona e 4'-hidróxi-5,6,7,8,3'-pentametoxiflavona.

Em determinadas concretizações, a fração de PMF hidroxiladanas composições proporcionadas consiste substancialmente de pelo menosuma, pelo menos duas, pelo menos três, ou todas as quatro PMFs hidroxiladasselecionadas do grupo que consiste de 3'-hidróxi-5,6,7,4'-tetrametoxiflavona,5-hidróxi-3,6,7,8,3',4'-hexametoxiflavona, 5,3'-diidróxi-6,7,8,4'-tetrametoxiflavona e 4'-hidróxi-5,6,7,8,3'-pentametoxiflavona.

Em determinadas concretizações, as composiçõesproporcionadas aqui compreendem adicionalmente um membro selecionadodo grupo que consiste de 5-hidróxi-6,7,8,3',4'-pentametoxiflavanona, 2'-hidróxi-3,4,4',5',6'-pentametoxichalcona e 2'-hidróxi-3,4,3,,4',5',6'-pentametoxichalcona.

Dependendo do modo de uso, as composições da invençãopodem ser, embora sem limitação, em forma de um suplemento dietético, deum aditivo alimentício, de um nutracêutico, de uma composição cosmética oude uma composição farmacêutica.

7.2.1. Suplementos dietéticos. Aditivos alimentícios e Nutracêuticos

Em várias concretizações, dependendo do uso desejado e semlimitação, uma composição da invenção pode ser em forma de um suplementodietético, um aditivo alimentício ou nutracêutico. De uma maneira geral, umsuplemento dietético é consumido por um sujeito independentemente dequalquer composição alimentícia, diferentemente de um aditivo alimentícioque é incorporado em uma composição alimentícia durante o processamento,a fabricação, preparação, ou fornecimento da composição alimentícia, ouimediatamente antes de seu consumo. Assim, uma composição alimentícia dainvenção proporciona, adicionalmente à nutrição, uma função terapêutica ouprofilática ao consumidor. Um "nutracêutico", como usado aqui refere-se aum produto preparado, isolado ou purificado de um produto alimentíciousualmente não associado com alimento, como uma casca de laranja, porexemplo, destinado a ser administrado a um mamífero para proporcionarbenefício fisiológico ou para prevenir ou melhorar uma condição ou distúrbiono mamífero, ou seja, o nutracêutico proporciona um benefício diferente deum benefício nutricional, se de tudo.

Em várias concretizações, a composição da invençãocompreende tipicamente uma ou mais cargas ou suportes consumíveis. Otermo "consumível" significa que a carga ou o suporte que é geralmentevantajoso para, ou que é aprovado por uma agência reguladora do governofederal ou de um governo estadual, para consumo por parte de animais, e,mais particularmente, por parte de humanos. Em determinadasconcretizações, o significado do termo "suplemento dietético" ou "aditivoalimentício" tem o mesmo significado daqueles termos como definido poruma agência reguladora do governo federal ou estadual, incluindo a FDA,United States Food and Drug Administration.

O suplemento dietético, aditivo alimentício ou nutracêuticocomo proporcionado aqui pode ser usado como um agente antiinflamatório.Assim, ele pode ser usado, por exemplo, para aliviar qualquer condição desaúde adversa que é mediada por ativação de NF-κΒ, translocação nuclear deNF-κΒ, e/ou ligação de NF-κΒ ao DNA, como, embora sem limitação,distúrbios proliferativos e distúrbios inflamatórios. Ele pode ser usado paraaliviar qualquer condição de saúde adversa que é mediada pela ação de iNOSe/ou COX-2, incluindo, embora sem limitação, artrite, cefaléia, asma, erupçãocutânea alérgica, síndrome do intestino inflamatório, dor nas articulações,fadiga crônica, fibromialgia e análogos. O suplemento dietético, aditivoalimentício ou nutracêutico pode ser usado, por exemplo, para inibir aativação de macrófagos, incluindo, por exemplo, produção de nitrito.

Como proporcionado aqui, o suplemento dietético, aditivoalimentício ou nutracêutico pode ser usado como um agente anticâncer. Porexemplo, ele pode ser usado como um antioxidante em qualquer condição queenvolve a ação destes radicais livres. Ele pode ser usado, por exemplo, parainduzir apoptose em uma célula de câncer. A célula de câncer pode ser, porexemplo, uma célula de câncer de colo, célula de câncer de mama, célula deleucemia, célula de câncer gástrico. Ele pode ser usado, por exemplo, paraativar atividade de calpaína intracelular e/ou caspase-12 intracelular em umacélula de câncer.

Tipicamente, um suplemento dietético, aditivo alimentício ounutracêutico como proporcionado aqui destina-se a ser tomado ou consumidooralmente. O suplemento dietético, aditivo alimentício ou nutracêutico podeencontrar-se em uma forma sólida ou em uma forma líquida.

Por exemplo, uma composição como proporcionada aqui,como um suplemento dietético, aditivo alimentício ou nutracêutico, pode serum pó reconstituível que, quando reconstituído com um líquido, como águapotável, pode proporcionar uma bebida. Em outra concretização, umacomposição como proporcionada aqui pode ser incorporada em outro tipo dealimento, como, embora sem limitação, óleo para cozimento, óleo de fritura,óleo de salada, margarina, maionese ou manteiga de cacau. Óleos contendo oscompostos da invenção podem ser emulsificados e usados em uma variedadede alimentos à base de água, como bebidas. Assim, em uma concretização,uma composição alimentícia pode ser uma bebida, como, embora semlimitação, água mineral fortificada, água destilada fortificada, uma bebida àbase de suco de fruta, uma bebida batida, uma bebida à base de leite, umabebida à base de produto lácteo, uma bebida à base de iogurte, uma bebida àbase de água carbonatada, uma bebida alcoólica, uma bebida à base de café,uma bebida à base de chá verde, uma bebida à base de chá preto, uma bebidaà base de grãos, uma bebida à base de soja, ou uma bebida à base de extratosde plantas.

Além de bebidas, as composições da presente invenção podemser usadas como um aditivo alimentício a ser combinados com outro produtoalimentício, por exemplo, xaropes, amidos, grãos, ou farinha de grãos.Referida composição alimentícia fortificada com os compostos desta invençãopode ser usada na preparação de produtos alimentícios, como produtoscozidos, produtos de carne com enchimentos (p. ex., hambúrgueres, salsichas,etc.), cereais, pastas, e sopas.

As composições enriquecidas com PMF hidroxilada podem serincluídas em composições alimentícias que também contêm uma variedade deoutros componentes benéficos. Exemplos não-limitantes de referidoscomponentes opcionais são ácidos graxos substanciais, vitaminas e minerais.Estes componentes são bem conhecidos por aqueles com prática na arte.Revelação adicional descrevendo os teores e a produção de composiçõesalimentícias compreendendo referidos componentes pode ser encontrada, porexemplo, nas Patentes US nums. 5.834.048; 5.817.350; 5.792.461; 5.707.657e 5.656.312, em que cada uma destas é incorporada aqui integralmente porreferência, e análogos. Ácidos graxos essenciais estão envolvidos na saúdecardiovascular e também no suporte do sistema imunológico. Umdesequilíbrio nestes ácidos graxos essenciais pode levar a um baixometabolismo do colesterol. Adicionalmente, a função do sistema imunológicopode ser prejudicada, levando a inflamação.Em concretizações em que as composições da invenção sãosuplementos dietéticos ou aditivos alimentícios, é possível adicionar àscomposições vitaminas, precursores, e derivados dos mesmos, minerais, eaminoácidos.

Em outras concretizações, as composições da invenção podemser adicionadas diretamente em alimentos, de tal forma que uma quantidadeeficaz do composto é ingerida durante refeições normais. É possível usarquaisquer métodos conhecidos por aqueles conhecidos na arte para adicionarou incorporar as composições ou compostos em alimentos naturais ouprocessados para preparar a composição alimentícia da invenção. Outroscomponentes opcionais em um aditivo alimentício da invenção incluem,embora sem limitação, agente anti-incrustação, dessecante, conservantesalimentícios, colorantes alimentícios, adoçante artificial, etc.

7.2.2. Composições cosméticas

Em algumas concretizações, proporciona-se aqui composiçõescosméticas compreendendo PMFs hidroxiladas como descrito acima. Inclui-setambém uma descrição não-exclusiva de diversos componentes opcionais epreferidos úteis em concretizações da presente invenção. Como usado aqui,"quantidade segura e eficaz" significa uma quantidade de um composto,componente, ou composição (conforme aplicável) suficiente para induzirsignificativamente um efeito positivo (p. ex., conferir um benefício cosméticoobservável), porém suficientemente baixo para evitar efeitos secundáriossérios, (p. ex., reação alérgica ou toxicidade indevida), i.e., para proporcionaruma relação razoável risco-benefício, dentro do escopo da avaliação médicaabalizada.

As composições cosméticas da presente invenção sãovantajosas para proporcionar benefícios de saúde, terapêuticos ou estéticos àpele e/ou o cabelo, ou proporcionando e mantendo higiene corporal e/ou docabelo. Agentes cosméticos vantajosos incluem, embora sem limitação,aqueles selecionados do grupo que consiste de absorventes, agentes anti-acne,agentes anti-incrustação, agentes anti-celulite, agentes anti-espumação,agentes anti-fungicos, agentes antiinflamatórios, agentes antimicrobianos,antioxidantes, agentes antiperspirantes/desodorantes, agentes anti-atrofia dapele, agentes antiviróticos, agentes anti-rugas, agentes de bronzeamentoartificial e aceleradores, adstringentes, agentes de reparo de barreira, ligantes,agentes tamponadores, agentes avolumadores, agentes quelantes, colorantes,corantes, enzimas, óleos essenciais, formadores de película, flavorizantes,fragrâncias, umectantes, hidrocolóides, difusores de luz, agentesopacificadores, branqueadores ópticos, modificadores ópticos, particulados,perfumes, ajustadores de pH, agentes seqüestrantes,condicionadores/umidificadores da pele, modificadores da sensação na pele,protetores da pele, agentes sensoriais de pele, agentes para tratamento da pele,agentes exfoliadores de pele, agentes clareadores da pele, agentesamaciadores da pele e/ou restauradores da pele, detergentes para a pele,espessantes da pele, agentes de bloqueio solar, anestésicos tópicos, vitaminas,e combinações dos mesmos.

As composições cosméticas da presente invenção tambémpodem compreender um veículo cosmeticamente aceitável e quaisquer componentes opcionais. Veículos vantajosos são bem conhecidos na arte esão selecionados com base na aplicação final. Por exemplo, veículos dapresente invenção incluem, embora sem limitação, aqueles vantajosos paraaplicação na pele. De preferência, os veículos da presente invenção sãovantajosos para aplicação na pele (p. ex., filtros solares, cremes, leites, loções, máscaras, soros, etc.) e unhas (p. ex., esmaltes, tratamentos, etc.). Referidosveículos são bem conhecidos por alguém com prática ordinária na arte, epodem incluir um ou mais veículos ou diluentes de carga sólida ou líquidacompatíveis, que são vantajosos para aplicação na pele e nas unhas. Aquantidade exata de veículo dependerá do nível do agente de ligação e dequaisquer outros ingredientes opcionais que alguém com prática na artepoderá classificar como diferentes do veículo (p. ex., outros componentesativos). As composições da presente invenção compreendem, de preferência,de cerca de 75% a cerca de 99,999%, mais preferivelmente de cerca de 85% acerca de 99,99%, ainda mais preferivelmente de 90% a cerca de 99%, e, daforma mais preferível, de cerca de 93% a cerca de 98%, em peso dacomposição, de um veículo.

O veículo e composições ali contidas podem ser formulados dediversas maneiras, incluindo, embora sem limitação, emulsões (na tecnologiadas emulsões, uma composição compreendendo uma "fase dispersa" e uma"fase contínua"; em que a fase dispersa existe como pequenas partículas ougotículas que são suspensas em, e circundadas por, uma fase contínua). Porexemplo, emulsões vantajosas incluem emulsões óleo-em-água, água-em-óleo, água-em-óleo-em-água, óleo-em-água-em-óleo, e óleo-em-água-em-silicone. Composições preferidas compreendem uma emulsão óleo-em-água.

As composições cosméticas da presente invenção podem serformuladas numa ampla variedade de tipos de produtos, incluindo cremes,ceras, pastas, loções, leites, musses, géis, óleos, tônicos, e sprays.Composições preferidas são formuladas em loções, cremes, géis, e sprays.Estas formas de produto podem ser usadas para uma quantidade deaplicações, incluindo, embora sem limitação, sabões, xampus, loções paracabelos, mãos e corpo, cremes frios, umidificadores faciais, preparações anti-acne, analgésicos tópicos, maquiagens/cosméticos incluindo basescosméticas, sombra para os olhos, batons para os lábios, e análogos.Quaisquer componentes adicionais requeridos para formular referidosprodutos variam de acordo com o tipo de produto, e podem ser selecionadosrotineiramente por alguém com prática na arte.

Se composições da presente invenção forem formuladas comoum aerosol e aplicadas na pele como um produto para ser aplicado porpulverização [spray-on], adiciona-se um propelente à composição. Exemplosde propelentes vantajosos incluem hidrocarbonetos clorofluorados com baixopeso molecular. Uma descrição mais completa de propelentes úteis aqui podeser encontrada em Sagarin, Cosmetics Science and Technology, 2a edição, vol.2, pp. 443-465 (1972).

As composições da presente invenção podem conter umavariedade de outros componentes, como os que são usadosconvencionalmente em um dado tipo de produto, desde que não alterem deforma inaceitável os benefícios da invenção. Estes componentes opcionaisdeveriam ser vantajosos para aplicação na pele mamífera, ou seja, quandoincorporados nas composições, eles são vantajosos para uso em contato com apele humana sem indevida toxicidade, incompatibilidade, instabilidade,resposta alérgica, e análogos, dentro do escopo da abalizada avaliação médicaou do formulador. O manual CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, segundaedição (1992) descreve uma ampla variedade de ingredientes farmacêuticos ecosméticos não-limitantes comumente usados na indústria de tratamento dapele, que são vantajosos para uso nas composições da presente invenção.Exemplos destas classes de ingredientes incluem: enzimas, tensoativos,abrasivos, agentes exfoliadores da pele, absorventes, componentes estéticos,como fragrâncias, pigmentos, colorantes/corantes, óleos essenciais, agentessensoriais de pele, adstringentes, etc. (p. ex., óleo de trevo, mentol, cânfora,óleo de eucalipto, eugenol, lactato de mentila, destilado de hamamélis),agentes anti-acne (p. ex., resorcinol, enxofre, ácido salicílico, eritromicina,zinco, etc.), agentes anti-incrustação, agentes antiespumação, agentesantimicrobianos (p. ex., butilcarbamato de iodopropila), antioxidantes,ligantes, aditivos biológicos, agentes tamponadores, agentes avolumadores,agentes quelantes, aditivos químicos, colorantes, adstringentes cosméticos,biocidas cosméticos, desnaturadores, adstringentes de drogas, analgésicos,pérolas de polímero, formadores de película, fragrâncias, umectantes, agentesopacificadores, ajustadores de pH, propelentes, agentes de redução,seqüestrantes, agentes branqueadores da pele (ou agentes despigmentadores,branqueadores) (p. ex., hidroquinona, ácido azeláico, ácido caféico, ácidokójico, ácido ascórbico, ascorbil fosfato de magnésio, ascorbil glucosamina),agentes acalmadores da pele e/ou restauradores da pele (p. ex., pantenol ederivados (p. ex., etil pantenol), aloe vera, ácido pantotênico e seus derivados,alantoína, bisabolol, e glicirrizinato de dipotássio), espessantes, hidrocolóides,zeólitos particulares, e vitaminas e seus derivados (p. ex. tocoferol, acetato detocoferol, beta caroteno, ácido retinóico, retinol, retinóides, palmitato deretinila, niacina, niacinamida, e análogos).

Exemplos adicionais de componentes opcionais incluemagentes umectantes; emolientes; agentes umidificadores, como glicerol, PEG400, tiamorfolinano e derivados dos mesmos, ou uréia; agentes anti-seborréia,como S-carboximetilcisteína, S-benzilcisteamina, os sais e derivados dosmesmos; antibióticos, como eritromicina e ésteres dos mesmos, neomicina,clindamicina e ésteres dos mesmos, e tetraciclinas; agentes antifungicos,como quetoconazol ou 4,5-polimetileno-3-isotiazolidonas; agentes parapromover o crescimento renovado do cabelo, como minoxidila (2,4-diamino-5-piperidinopiridina 3-óxido) e derivados dos mesmos, diazóxido (7-cloro-3-metil-1,2,4-benzotiadiazine 1,1 -dióxido) e fenitoína (5,4-difenilimidazolidina-2,4-diona); agentes antiinflamatórios não-esteróides; carotenóidese e, emparticular, b-caroteno; agentes anti-psoriáticos, como antralina e seusderivados. As composições cosméticas de acordo com a invenção tambémpodem conter agentes acentuadores de sabor, agentes conservantes, comoésteres do ácido para-hidroxibenzóico, agentes estabilizadores, reguladores deumidade, reguladores de pH, modificadores de pressão osmótica, agentesemulsificantes, agentes de filtro UV-A e UV-B, e antioxidantes, como butil-hidroxianisol ou butil-hidroxitolueno.

As composições da presente invenção podem incluircomponentes-veículo, como são conhecidos na arte. Referidos veículospodem incluir um ou mais veículos ou diluentes de carga sólida ou líquidacompatíveis que são vantajosos para aplicação na pele e/ou no cabelo.

7.2.3. Composições farmacêuticas

Em determinadas concretizações, proporciona-se aquicomposições compreendendo uma fração de PMF hidroxilada, como descritoacima, ou mais tipicamente, um composto de PMF hidroxilada, como, porexemplo, uma PMF hidroxilada selecionada dentre aquelas listadas na Tabela1, em que a composição é uma composição farmacêutica. Composiçõesfarmacêuticas da invenção compreendem uma quantidade profilaticamente outerapeuticamente eficaz de uma composição ou composto aqui descrita, etipicamente um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamenteaceitáveis.

Neste contexto, o termo "farmaceuticamente aceitável"significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadualou listado na Farmacopéia dos E.U.A. ou em outra farmacopéia geralmentereconhecida para uso em animais, e, mais particularmente, em humanos. Otermo "veículo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente, ou veículocom o qual a terapêutica é administrada. Referidos veículos farmacêuticospodem ser líquidos estéreis, como água e óleos, incluindo aqueles de petróleo,de origem animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja,óleo mineral, óleo de gergelim e análogos. Água é um veículo preferidoquando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa.

Também é possível empregar soluções salinas e glicerol e dextrose aquosas,como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Exemplosde veículos farmacêuticos vantajosos são descritos por Remington: Scienceand Practice of Pharmacy, 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia PA (2005) e AnseVs Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems, 8a ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia PA(2004).

Composições farmacêuticas típicas compreendem um ou maisexcipientes. Excipientes vantajosos são bem conhecidos por aqueles comprática na arte da farmácia, e exemplos não-limitantes de excipientesvantajosos incluem amido, glucose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz,farinha, greda, sílica-gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco,cloreto de sódio, leite em pó desnatado, glicerol, propileno, glicol, água,etanol e análogos. Se um excipiente particular for vantajoso para incorporaçãoem uma composição farmacêutica depende de uma variedade de fatores bemconhecidos na arte, incluindo, embora sem limitação, a maneira pela qual aforma de dosagem será administrada a um paciente, e os ingredientes ativosespecíficos na forma de dosagem. Se desejado, a composição farmacêuticatambém pode conter quantidades menores de agentes umectantes ouemulsificantes, ou agentes tamponadores de pH.

Esta invenção compreende adicionalmente composiçõesfarmacêuticas anidras e formas de dosagem compreendendo ingredientesativos, porque a água pode facilitar a degradação de alguns compostos.

Uma composição farmacêutica da invenção é formulada demodo a ser compatível com sua via de administração desejada. Exemplos devias de administração incluem, embora sem limitação, administraçãoparenteral, p. ex., intravenosa, intradérmica, subcutânea, oral (p. ex.,inalação), intranasal, transdérmica (tópica), transmucosal, intra-tumoral, intrasinovial e retal. Em uma concretização específica, a composição é formuladade acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêuticaadaptado para administração intravenosa, subcutânea, intramuscular, oral,intranasal ou tópica a seres humanos. Em uma concretização preferida, umacomposição farmacêutica é formulada de acordo com procedimentos de rotinapara a administração subcutânea a seres humanos. Tipicamente, composiçõespara administração intravenosa são soluções em tamponador aquoso isotônicoestéril. Onde necessário, a composição também pode incluir um agentesolubilizador e um anestésico local, como lignocamne para reduzir a dor nosítio da injeção. Exemplos de formas de dosagem incluem, embora semlimitação: tabletes; cápsulas pequenas; cápsulas, como cápsulas de gelatinaelástica mole; pílulas revestidas; pastilhas; losangos; dispersões; supositórios;ungüentos; cataplasmas (cataplasmas); pastas; pós; dressings/curativos?;cremes; emplastros; soluções; adesivos; aerossóis (p. ex., sprays nasais ouinaladores); géis; formas de dosagem líquidas vantajosas para administraçãooral ou mucosal a um paciente, incluindo suspensões (p. ex., suspensõeslíquidas aquosas ou não-aquosas, emulsões óleo-em-água, ou a emulsõeslíquidas água-em-óleo), soluções, e elixires; formas de dosagem líquidasvantajosas para administração parenteral a uma paciente; e sólidos estéreis (p.ex., sólidos cristalinos ou amorfos) que podem ser reconstituídos paraproporcionar formas de dosagem líquidas vantajosas para administraçãoparenteral a um paciente.

De uma maneira geral, os ingredientes de composiçõesfarmacêuticas como proporcionados aqui são fornecidos separadamente oumisturados entre si em forma de dosagem unitária, por exemplo, como um póliofilizado seco ou concentrado isento de água em um recipiente fechadahermeticamente, como uma ampola ou sachê indicando a quantidade deagente ativo. Onde a composição é administrada por infusão, ela pode serdispensada com um frasco de infusão contendo solução salina ou água estérilde classe farmacêutica. Onde a composição é administrada por injeção, pode-se proporcionar uma ampola de água estéril para injeção ou solução salinapara que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.Formas de dosagem típicas das composições farmacêuticas compreendendoum composto de PMF hidroxilada, ou um sal, solvato ou hidratofarmaceuticamente aceitável do mesmo, situam-se dentro da faixa de cerca de1 mg a cerca de 1000 mg por dia, dadas como uma dose simples uma vez aodia, pela manhã, mas, de preferência, em doses divididas ao longo do dia,ingeridas com o alimento.

7.2.4. Formas de dosagem unitárias

Em algumas concretizações, as composições comoproporcionadas aqui, ou seja, em qualquer seção ou subseção da Seção 7.1,podem ser em uma forma de dosagem unitária. De preferência, uma forma dedosagem unitária é uma composição nutracêutica ou farmacêutica. Formas dedosagem unitárias da invenção compreendem uma quantidadeprofilaticamente ou terapeuticamente eficaz de uma ou mais PMFshidroxiladas ou composições das mesmas, e, tipicamente, um ou maisexcipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis ou consumíveis e/oufisiologicamente aceitáveis.

Em determinadas concretizações, formas de dosagem unitáriacompreendem uma quantidade de uma ou mais PAlFs hidroxiladas, oucomposições das mesmas, eficaz para inibir a ativação de iNOS e/ou COX-2em uma célula, de preferência um macrófago.

Em algumas concretizações, formas de dosagem unitáriacompreendem uma quantidade de uma ou mais PMFs hidroxiladas, oucomposições das mesmas, eficazes para inibir produção de nitrito em umamacrófago.

Em determinadas outras concretizações, formas de dosagemunitária compreendem uma quantidade de uma ou mais PMFs hidroxiladas,ou composições das mesmas, eficazes para induzir apoptose em uma célula decâncer.

Em algumas concretizações, formas de dosagem unitáriacompreendem uma quantidade de uma ou mais PMFs hidroxiladas, oucomposições das mesmas, eficaz para ativar calpaína e/ou capase 12 em umacélula de câncer.

A invenção compreende adicionalmente formas de unidade34que compreendem um ou mais compostos que reduzem a taxa com que umingrediente ativo se decomporá. Referidos compostos, que são referidos aquicomo "estabilizadores", incluem, embora sem limitação, antioxidantes, comoácido ascórbico, tamponadores de pH, ou tamponadores de sal.

E possível aplicar diferentes quantidades eficazes paradiferentes condições. Formas de dosagem unitária podem apresentar, porexemplo, a forma de soluções, suspensões, emulsão, tabletes, pílulas,cápsulas, pós, formulações de liberação sustentada e análogos. Formulaçãooral pode incluir veículos convencionais, como classes farmacêuticas demanitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose,carbonato de magnésio, etc. Referidas composições e formas de dosagemconterão uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de umagente profilático ou terapêutico, de preferência em forma purificada, emconjunto com uma quantidade vantajosa de veículo de forma a proporcionar aforma para administração apropriada ao paciente. A formulação deveriaadequar-se ao modo de administração. Em uma concretização preferida, asformas de dosagem unitária são estéreis e encontram-se numa formaapropriada para administração a um sujeito, de preferência, um sujeito animal,mais preferivelmente um sujeito mamífero, e, da forma mais preferível, umsujeito humano.

A composição, forma, e tipo das formas de dosagem dainvenção variarão tipicamente dependendo de seu uso. Por exemplo, umaforma de dosagem usada no tratamento agudo de inflamação ou de umdistúrbio relacionado, pode conter quantidades maiores de um ou mais dosingredientes ativos que ele compreende do que uma forma dosagem usada notratamento crônico da mesma doença. A forma de dosagem profilaticamente eterapeuticamente eficaz também pode variar entre diferentes tipos de câncer.De forma análoga, uma forma parenteral pode conter quantidades menores deum ou mais dos ingredientes ativos que compreende, do que uma forma dedosagem oral usada para tratar a mesma doença ou distúrbio. Estas e outrasmaneiras em que formas de dosagem específicas compreendidas por estainvenção variarão, serão facilmente percebidas por aqueles versados na arte.Ver, p. ex., Remington: Science and Practice of Pharmacy, 21a ed., LippincottWilliams & Wilkins, Philadelphia PA (2005); AnseVs Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems, 8a ed., Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia PA (2004).

Em algumas concretizações, proporciona-se um artigo defabricação que pode simplificar a administração de uma ou mais PMFshidroxiladas ou composições das mesmas a um sujeito. Um artigo típico defabricação da invenção compreende uma forma de unidade de dosagem deuma composição ou composto da invenção. Em uma concretização, a formade unidade de dosagem é um recipiente, de preferência, um recipiente estéril,contendo uma quantidade eficaz de uma composição ou composto dainvenção e um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável. O artigo defabricação pode compreender adicionalmente uma etiqueta ou instruçõesimpressas relativas ao uso da composição ou composto ou outro materialinformativo que orienta o dieticista, médico, técnico, consumidor, sujeito, oupaciente sobre como prevenir ou tratar apropriadamente a doença ou distúrbioem questão. Em outras palavras, o artigo de fabricação inclui meios deinstrução que indicam ou sugerem um regime de dosagem incluindo, emborasem limitação, doses eficazes, procedimentos de monitoramento, e outrainformação de monitoramento. Em uma concretização específica, o artigo defabricação compreende um recipiente contendo uma quantidade eficaz de umacomposição ou composto da invenção e um excipiente ou veículofarmaceuticamente aceitável. Como ocorre com qualquer produtofarmacêutico e suplemento dietético, o material de embalagem e o recipienteincluído no artigo de fabricação são projetados para proteger a estabilidade doproduto durante o armazenamento e o transporte.Artigo de fabricação da invenção pode compreenderadicionalmente dispositivos que são úteis para administrar as formas dedosagem unitária. Exemplos de referidos dispositivos incluem, embora semlimitação, seringas, bolsas de gotejamento, adesivos, e inaladores.

Artigos de fabricação da invenção podem compreenderadicionalmente veículos farmaceuticamente aceitáveis e veículos consumíveisque podem ser usados para administrar um ou mais ingredientes ativos (p. ex.,um composto da invenção). Por exemplo, se um ingrediente ativo éproporcionado em uma forma sólida que precisa ser reconstituída paraadministração parenteral ou oral/enteral, o artigo de fabricação podecompreender um recipiente fechado hermeticamente de um veículo vantajosoem que o ingrediente ativo pode ser dissolvido. Para administração parenteral,prefere-se uma solução estéril isenta de particulados. Exemplos de veículosfarmaceuticamente aceitáveis incluem, embora sem limitação: Água parainjeções USP; veículos aquosos, como, embora sem limitação, injeção deCloreto de Sódio, injeção de Ringer, injeção de Dextrose, injeção de Dextrosee Cloreto de Sódio, e injeção de Ringer Lactada; veículos miscíveis em água,como, embora sem limitação, álcool de etila, polietileno glicol, epolipropileno glicol; e veículos não aquosos, como, embora sem limitação,óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo degergelim, oleato de etila, miristato de isopropila, e benzoato de benzila.

7.2.5. Formas de dosagem oral

Composições como proporcionadas aqui podem ser vantajosas,por exemplo, para administração oral, e composições consumíveis oralmente,incluindo, embora sem limitação, suplementos dietéticos da invenção, podemser apresentadas como formas de dosagem distintas, como, embora semlimitação, tabletes (p. ex., tabletes mastigáveis), cápsulas pequenas, cápsulas,e líquidos (p. ex., xaropes aromatizados). Referidas formas de dosagemcontêm quantidades predeterminadas de ingredientes ativos, e podem serpreparadas por meio de métodos da farmácia bem conhecidos por aquelesversados na arte. Ver, para uma visão geral, Remington: Science and Practiceof Pharmacy, 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia PA(2005); AnseVs Pharmaeeutieal Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 8aed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia PA (2004).

Formas de dosagem orais típicas da invenção são preparadascombinando-se o(s) ingrediente(s) ativo(s) em uma mistura íntima com pelomenos um excipiente de acordo com técnicas convencionais de compostaçãofarmacêutica. Excipientes pode apresentar uma ampla variedade de formas,dependendo da forma de preparação desejada para administração. Porexemplo, excipientes vantajosos para uso em formas de dosagem líquidas ouem aerossol orais incluem, embora sem limitação, água, glicóis, óleos,alcoóis, agentes flavorizantes, conservantes, e agentes colorantes. Exemplosde excipientes vantajosos para uso em formas de dosagem orais sólidas (p.ex., pós, tabletes, cápsulas, e cápsulas pequenas) incluem, embora semlimitação, amidos, açúcares, celulose microcristalina, diluentes, agentes degranulação, lubrificantes, ligantes, e agentes desintegradores. Outrosingredientes que podem ser incorporados no suplemento dietético oucomposições farmacêuticas da presente invenção, podem incluir, embora semlimitação, vitaminas, aminoácidos, um antioxidante, um extrato botânico, saismetálicos, e minerais.

Em virtude de sua facilidade de administração, tabletes ecápsulas representam as formas de unidade de dosagem mais vantajosas, emque, neste caso, emprega-se excipientes sólidos. Se desejado, tabletes podemser revestidos por meio de técnicas convencionais aquosas ou não-aquosas.Referidas formas de dosagem podem ser preparadas por meio de qualquer umdos métodos da farmácia. De uma forma geral, composições farmacêuticas eformas de dosagem são preparadas misturando-se uniformemente eintimamente os ingredientes ativos com veículos líquidos, veículos sólidosfinamente divididos, ou ambos, e, depois, modelando-se o produto naapresentação desejada, se necessário.

Por exemplo, é possível preparar um tablete por meio decompressão ou moldagem. Tabletes comprimidos podem ser preparadoscomprimindo-se, em uma máquina vantajosa, os ingredientes ativos em umaforma de fluxo livre, como pó ou grânulos, opcionalmente misturados comum excipiente. Tabletes moldados podem ser preparados por meio demoldagem, em uma máquina vantajosa, uma mistura do composto em póumidificado com um diluente líquido inerte.

Exemplos de excipientes que podem ser usados em formas dedosagem orais da invenção incluem, embora sem limitação, ligantes, cargas,desintegrantes, e lubrificantes. Ligantes vantajosos para uso em composiçõesfarmacêuticas/nutracêuticas e formas de dosagem incluem, embora semlimitação, amido de milho, amido de batata, ou outros amidos, gelatina,gomas naturais ou sintéticas, como acácia, alginato de sódio, ácido algínico,outros alginatos, tragacanto em pó, goma guar, celulose e seus derivados (p.ex., etil celulose, acetato de celulose, carboximetil celulose de cálcio,carboximetil celulose de sódio), polivinil pirrolidona, metil celulose, amidopré-gelatinizado, hidroxipropil metil celulose, (p. ex., nums. 2208, 2906,2910), celulose microcristalina, e misturas dos mesmos.

Exemplos de cargas vantajosas para uso nas composiçõesfarmacêuticas, suplementos dietéticos, e formas de dosagem aqui reveladasincluem, embora sem limitação, talco, carbonato de cálcio (p. ex., grânulos oupó), celulose microcristalina, celulose em pó, dextratos, caulim, manitol,ácido silícico, sorbitol, amido, amido pré-gelatinizado, e misturas dosmesmos. O ligante ou carga em composições farmacêuticas da invenção estápresente tipicamente em de cerca de 50 a cerca de 99 porcento em peso dacomposição farmacêutica, suplemento dietético, ou forma de dosagem.

Formas vantajosas de celulose microcristalina incluem,embora sem limitação, os materiais comercializados como AVICEL-PH-101,AVICEL-PH-103 AVICEL RC-581, AVICEL-PH- 105 (obteníveis da FMCCorporation, American Viscose Division, Avicel Sales, Marcus Hook, PA), emisturas dos mesmos. Um ligante específico é uma mistura de celulosemicrocristalina e carboximetil celulose de sódio comercializada comoAVICEL RC-581. Aditivos ou excipientes anidros ou com baixo teor deumidade vantajosos incluem AVICEL-PH-103™ e amido Starch 1500 LM.

Desintegrantes são usados nas composições da invenção deforma a proporcionar tabletes que se desintegram quando expostos a umambiente aquoso. Tabletes que contêm demais desintegrante podemdesintegrar-se ao armazenamento, enquanto que aqueles que contêm poucodemais, podem não desintegrar-se numa taxa desejada ou nas condiçõesdesejadas. Assim, uma quantidade suficiente de desintegrante que nem édemais, nem de menos, para alterar prejudicialmente a liberação dosingredientes ativos deveria ser usada para formar formas de dosagem sólidasorais da invenção. A quantidade de desintegrante usada varia com base notipo de formulação, e é facilmente discernível por aqueles com práticaordinária na arte. Composições farmacêuticas típicas compreendem de cercade 0,5 a cerca de 15 porcento em peso de desintegrante, particularmente decerca de 1 a cerca de 5 porcento em peso de desintegrante.

Desintegrantes que podem ser usados em composiçõesfarmacêuticas, suplementos dietéticos e formas de dosagem da invençãoincluem, embora sem limitação, agar-agar, ácido algínico, carbonato decálcio, celulose microcristalina, croscarmelose sódio, crospovidona,polacrilina potássio, glicolato de amido sódico, amido de batata ou de tapioca,amido pré-gelatinizado, outros amidos, argilas, outras alginas, outrasceluloses, gomas, e misturas dos mesmos.

Lubrificantes que podem ser usados em composiçõesfarmacêuticas, suplementos dietéticos, e formas de dosagem da invençãoincluem, embora sem limitação, estearato de cálcio, estearato de magnésio,óleo mineral, óleo mineral leve, glicerina, sorbitol, manitol, polietileno glicol,outros glicóis, ácido esteárico, lauril sulfato de sódio, talco, óleo vegetalhidrogenado (p. ex., óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo desemente de girassol, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho, e óleo desoja), estearato de zinco, oleato de etila, lauretato de etila, agar, e misturas dosmesmos. Lubrificantes adicionais incluem, por exemplo, um sílica-gel silóide(AEROSIL 200, fabricado pela W.R. Grace Co. of Baltimore, MD), umaerossol coagulado de sílica sintética (comercializado pela Degussa Co. dePiano, TX), CAB-O-SIL (um produto de dióxido de silício pirogênicocomercializado pela Cabot Co. de Boston, MA), e misturas dos mesmos. Seusados, lubrificantes são empregados tipicamente numa quantidade inferior acerca de 1 porcento em peso das composições farmacêuticas, suplementosdietéticos, ou formas de dosagem em que eles são incorporados.

Em determinadas concretizações, uma ou mais PMFshidroxiladas em uma composição como proporcionada aqui podem encontrar-se em uma forma de liberação retardada. Por exemplo, o ingrediente ativopode ser administrado via meios de liberação controlada ou de dispositivos defornecimento que são bem conhecidos como descritos nas Patentes US nums.:3.845.770; 3.916.899; 3.536.809; 3.598.123; e 4.008.719, 5.674.533,5.059.595, 5.591.767, 5.120.548, 5.073.543, 5.639.476, 5.354.556, e5.733.566, em que cada uma destas é incorporada aqui integralmente porreferência.

7.2.6. Formas de dosagem parenteral

Formas de dosagem parenteral podem ser administradas apacientes por meio de várias vias, incluindo, embora sem limitação,subcutânea, intravenosa (incluindo injeção de bolo), intramuscular, e intra-arterial. Como a sua administração tipicamente contorna as defesas naturaisdos pacientes contra contaminantes, formas de dosagem parenterais são, depreferência, estéreis ou podem ser esterilizadas antes da administração a umpaciente. Exemplos de formas de dosagem parenteral incluem, embora semlimitação, soluções prontas para injeção, produtos secos prontos para seremdissolvidos ou suspensos em um veículo farmaceuticamente aceitável parainjeção, suspensões prontas para injeção, e emulsões.

Veículos vantajosos que podem ser usados para proporcionarformas de dosagem parenteral da invenção são bem conhecidas por aquelesversados na arte. Exemplos incluem, embora sem limitação: Água paraInjeção USP; veículos aquosos, como, embora sem limitação, Injeção deCloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Dextrose, Injeção de Dextrosee Cloreto de Sódio, e Injeção de Ringer Lactada; veículos miscíveis em água,como, embora sem limitação, álcool de etila, polietileno glicol, epolipropileno glicol; e veículos não-aquosos, como, embora sem limitação,óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo degergelim, oleato de etila, miristato de isopropila, e benzoato de benzila.Compostos que aumentam a solubilidade de um ou mais dos ingredientesativos aqui revelados também podem ser incorporados nas formas de dosagemparenteral da invenção.

7.2.7. Formas de dosagem transdérmicas, tópicas e mucosais

Formas de dosagem transdérmicas, tópicas, e das mucosasincluem, embora sem limitação, soluções oftálmicas, sprays, aerossóis,cremes, loções, ungüentos, géis, soluções, emulsões, suspensões, ou outrasformas conhecidas por alguém com prática na arte. Ver, p. ex., Remington:Science and Practice of Pharmacy, 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia PA (2005); AnseVs Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems, 8a ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia PA(2004). Formas de dosagem vantajosas para tratar tecidos das mucosas nacavidade oral podem ser formuladas como enxaguantes bucais ou como géisorais. Adicionalmente, formas de dosagem transdérmicas incluem adesivos de"tipo reservatório" ou "tipo matriz" que podem ser aplicados na pele e usadosdurante um período específico para permitir a penetração de uma quantidadedesejada de ingredientes ativos.

Excipientes vantajosos (p. ex., veículos e diluentes) e outrosmateriais que podem ser usados para proporcionar formas de dosagemtransdérmicas, tópicas, e mucosais compreendidas por esta invenção são bemconhecidos por aqueles versados nas artes farmacêuticas, e dependem dotecido particular em que se deseja aplicar uma dada composição farmacêuticaou forma de dosagem. Com tal fato em mente, excipientes típicos incluem,embora sem limitação, água, acetona, etanol, etileno glicol, propileno glicol,butano-l,3-diol, miristato de isopropila, palmitato de isopropila, óleo mineral,e misturas dos mesmos para formar loções, tinturas, cremes, emulsões, géisou ungüentos, que não são tóxicos e farmaceuticamente aceitáveis. Também épossível adicionar umidificadores ou umectantes a composiçõesfarmacêuticas e formas de dosagem, se desejado. Exemplos de referidosingredientes adicionais são bem conhecidos na arte. Ver, p. ex., Remington1SPharmaceutical Sciences, 16a e 18a edições, Mack Publishing, Easton PA(1980 & 1990).

Dependendo do tecido específico a ser tratado, é possível usarcomponentes adicionais antes de, em conjunto com, ou subseqüentemente a,tratamento com ingredientes ativos da invenção. Por exemplo, é possível usaracentuadores de penetração para contribuir no fornecimento dos ingredientesativos no tecido. Acentuadores de penetração vantajosos incluem, emborasem limitação: acetona; diversos alcoóis, como etanol, oleíla, e tetraidrofurila;sulfóxidos de alquila, como sulfóxido de dimetila; dimetil acetamida; dimetilformamida; polietileno glicol; pirrolidonas, como polivinilpirrolidona; classesde Kollidona (Povidona, Polividona); uréia; e vários ésteres solúveis em águaou insolúveis em açúcar, como Tween 80 (polissorbato 80) e Span 60(monoestearato de sorbitol).7.3. Métodos em que se usa PMFs hidroxiladas e composições dasmesmas

Em um aspecto, proporciona-se aqui métodos de usar as PMFshidroxiladas e composições das mesmas como agentes antiinflamatórios ouagentes anti-proliferação. Como demonstrado nos Exemplos abaixo,demonstra-se que PMFs hidroxiladas apresentam efeitos antiproliferativos,incluindo, por exemplo, indução de apoptose em células de câncer. Alémdisso, PMFs hidroxiladas podem inibir inflamação, por exemplo, inibir aprodução de iNOS e/ou COX-2 e/ou produção de nitrito em células, comomacrófagos envolvidos em uma resposta inflamatória.

Em um aspecto, proporciona-se aqui usos de PMFshidroxiladas e composições das mesmas para a fabricação de drogasapresentando uma efeito antiinflamatório ou efeito anti-proliferação. Asdrogas são vantajosas para administração a mamíferos incluindo humanos.Referidas drogas podem ser, por exemplo, para induzir apoptose em umacélula de câncer, como uma célula de câncer do colo, célula de câncer demama, célula de leucemia a célula de câncer gástrico, etc. Referidas drogaspode ser, por exemplo, para inibir ou reduzir inflamação. Em determinadasconcretizações, usos de PMFs hidroxiladas, e composições das mesmas, paraa fabricação de uma medicamento para reduzir a produção de nitrito em ummacrófago, ou para inibir a ativação de iNOS e/ou COX-2 em um macrófago.

Condições de saúde adversas, doenças e distúrbios que podemser prevenidos, tratados, controlados, ou melhorados por meio deadministração de uma quantidade eficaz de um ou mais compostos oucomposições da invenção incluem, embora sem limitação, distúrbiosproliferativos e distúrbios inflamatórios, e sintomas dos mesmos.

7.3.1. Distúrbios proliferativos

E possível usar uma ou mais PMF hidroxilada ou composiçãoda mesma para prevenir, tratar, controlar, ou melhorar um distúrbioproliferativo ou um ou mais sintomas do mesmo. Em determinadasconcretizações, aqui proporcionadas, compreende-se métodos para prevenir,tratar, controlar, ou melhorar um ou mais sintomas de um distúrbio não-canceroso associado com hiperproliferação celular, particularmente de células epiteliais (p. ex., como na asma, COPD, fibrose pulmonar, hipér-responsividade bronquial, psoríase, distúrbio linfo-proliferativo, e dermatiteseborréica), e células endoteliais (p. ex., como na restenose, doença vascularhiperproliferativa, síndrome de Behcet, aterosclerose, e degeneraçãomacular), em que referidos métodos compreendem administrar a um sujeitoque disto necessita, uma ou mais PMF hidroxilada ou composição da mesma.

Em uma concretização específica, a invenção proporcionamétodos para prevenir, controlar, tratar, ou melhorar um distúrbio não-canceroso associado com hiperproliferação celular (p. ex., síndrome deBehcet, sarcoidose, quelóides, fibrose pulmonar, e fibrose renal) ou um ou mais sintomas disso, em que referidos métodos compreendem administrar aum sujeito que disto necessita, uma quantidade profilaticamente outerapeuticamente eficaz de uma ou mais PMF hidroxilada ou composição damesma.

A presente invenção proporciona métodos para prevenir, tratar, controlar, ou melhorar câncer ou um ou mais sintomas dos mesmos, em quereferidos métodos compreendem administrar uma ou mais PMF hidroxiladaou composição da mesma a um sujeito que necessita disto.

Em uma concretização específica, a invenção proporciona ummétodo de prevenir, tratar, controlar, ou melhorar câncer ou um ou maissintomas do mesmo, em que referido método compreende administrar a umsujeito que disto necessita uma dose de uma quantidade profilaticamente outerapeuticamente eficaz de uma ou mais PMF hidroxilada ou composições damesma.

Os compostos da invenção podem ser usados in vitro ou exvivo para o controle, tratamento ou melhoramento de determinados cânceres,incluindo, embora sem limitação, leucemias e linfomas, em que referidotratamento envolve, por exemplo, transplantes de células-tronco autólogas.Isto pode envolver um processo de múltiplas etapas em que as células-troncohematopoiéticas autólogas de um sujeito são colhidas e purgadas de todas ascélulas de câncer, em que a população de células de medula óssearemanescente de um paciente é erradicada então via a administração de umaalta dose de um composto da invenção com ou sem terapia acessóriaenvolvendo alta dose de radiação, e o enxerto de células-tronco é infundido devolta no sujeito. Proporciona-se então tratamento de suporte enquanto afunção da medula óssea é restaurada e o sujeito se recupera.

Em concretizações adicionais, cânceres que podem serprevenidos, controlados, tratados ou melhorados de acordo com os métodosda invenção incluem, embora sem limitação, neoplasmas, tumores (malignose benignos) e metástases, ou qualquer doença ou distúrbio caracterizado porcrescimento descontrolado de células. O câncer pode ser um câncer primárioou metastático. Exemplos específicos de cânceres que podem ser prevenidos,controlados, tratados ou melhorados de acordo com os métodos da invençãoincluem, embora sem limitação, câncer da cabeça, pescoço, olho, boca,garganta, esôfago, peito, osso, pulmão, colo, reto, estômago, próstata, mama,ovários, rim, fígado, pâncreas, e cérebro. Cânceres adicionais incluem,embora sem limitação, os seguintes: leucemias, como, embora sem limitação,leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemias mielocíticas agudas,como leucemias mieloblástias, promielocíticas, mielomonocíticas,monocíticas, eritroleucemia e síndrome mielodisplástica, leucemias crônicas,como, embora sem limitação, leucemia mielocítica (granulocítica) crônica,leucemia linfocítica crônica, leucemia de células peludas; policitemia vera;linfomas, como, embora sem limitação, doença de Hodgkin, doença não-Hodgkin; mielomas múltiplos, como, embora sem limitação, mielomamúltiplo abrasador, mieloma não-secretador, mieloma osteosclerótico,leucemia de células plasmáticas, plasmacitoma solitário e plasmacitomaextramecular; câncer de mama incluindo, embora sem limitação,adenocarcinoma, carcinoma lobular (células pequenas), carcinomaintraductal, câncer de mama medular, câncer de mama mucinoso, câncer demama tubular, câncer de mama papilar, doença de Paget, e câncer de mamainflamatório; cânceres gástricos ou do estômago, como, embora semlimitação, adenocarcinoma, ferida maligna (polipóide), ulceradora,espalhamento superficial, espalhamento difuso, linfoma maligno,lipossarcoma, fibrossarcoma, e carcinossarcoma; cânceres do colo; cânceresretais; cânceres do fígado, como, embora sem limitação, carcinomahepatocelular e hepatoblastoma. Para uma revisão de referidos distúrbios, verFishman et al., 1985, Medicine, 2a edição, J.B, Lippincott Co., Philadelphia eMurphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of CâncerDiagnosis, Treatment, andRecovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A.,Inc., Estados Unidos da América, em que cada uma destas referências éincorporada aqui integralmente por referência.

Em determinadas concretizações, os métodos proporcionadoscompreendem contactar uma célula de câncer com uma quantidade de PMFhidroxilada ou composição da mesma eficaz para induzir apoptose na célulade câncer. Em algumas concretizações, a apoptose ativada é uma apoptosemediada com cálcio.

Em determinadas concretizações, os métodos proporcionadoscompreendem contactar uma célula de câncer com PMF hidroxilada oucomposição da mesma numa quantidade eficaz para ativar calpaína e/oucaspase-12.

7.3.2. Inflamação

Uma ou mais PMF hidroxilada ou composição da mesma podeser usada para prevenir, tratar, controlar, aliviar, ou melhorar um distúrbioinflamatório ou um ou mais sintomas do mesmo.

A uma ou mais PMF hidroxilada ou composição da mesmapode ser usada para prevenir, reduzir, ou eliminar os sintomas e condiçõesassociadas com inflamação. Uma característica comum de inflamaçãocompreende as liberações de citocinas ou de outros agentes que ativampotencialmente ciclo-oxigenase induzível 2 (COX-2) e óxido nítrico sintaseinduzível (iNOS). Gilman A, Rail T, Nies A, Taylor P eds, Goodman eGilman's The Pharmacological Basis of Therapeuties, New York, PergamonPress, 1990, Robak J, Gryglewski R J, Bioaetivity of flavonoids, Pol JPharmacol, 1996, 48:555-564. Em determinadas concretizações dos métodosproporcionados, a expressão de COX-2 e/ou iNOS é inibida em uma célulapor meio de contato da célula com uma ou mais PMF hidroxilada oucomposição da mesma.

Em uma concretização específica, a invenção proporciona ummétodo de prevenir, tratar, controlar, ou melhorar uma condição associadacom inflamação (p. ex., um distúrbio inflamatório) ou um ou mais sintomasda mesma, em que referido método compreende contactar, ou administrar, aum sujeito que disto necessita, uma dose de uma quantidade profilaticamenteou terapeuticamente eficaz de um ou mais PMFs hidroxiladas ou composiçãodas mesmas.

Exemplos dos distúrbios inflamatórios que podem serprevenidos, controlados, tratados, ou melhorados de acordo com os métodosda invenção, incluem, embora sem limitação, asma, reações alérgicas,distúrbios alérgicos, distúrbios inflamatórios caracterizados por inflamação mediada por tipo 1, distúrbios inflamatórios caracterizados por inflamaçãomediada de tipo 2, doença fibrótica (p. ex., fibrose pulmonar), psoríase,esclerose múltipla, lúpus sistêmico eritematoso, doença pulmonar obstrutivacrônica (COPD), encefalite, doença do intestino inflamatório (p. ex., doençade Crohn e colite ulcerativa), lesão de reperfusão isquêmica, gota, doença de48Behcet, choque séptico, espondiloartropatia não-diferenciada, artropatia não-diferenciada, artrite, artrite reumatóide (juvenil e adulta), osteoartrite, artritepsoriática, osteólise inflamatória, sepsia, meningite, e inflamação crônicaresultante de infecções bacterianas ou virais crônicas.

Em uma concretização específica, administra-se umaquantidade de uma ou mais PMFs hidroxiladas ou composição das mesmas aum sujeito, e que é eficaz para tratar, controlar ou melhorar asma.

7.3.3. Dosagem e freqüência de administração

A quantidade da uma ou mais PMFs hidroxiladas oucomposição das mesmas que será eficaz na prevenção, tratamento, controle,alívio, ou melhoramento de uma condição de saúde adversa, um distúrbio (p.ex., um distúrbio proliferativo ou um distúrbio inflamatório), ou um ou maissintomas da mesma variarão de acordo com a natureza e a gravidade dadoença ou condição, e a via pela qual o ingrediente ativo e é administrado. Afreqüência e a dosagem também variarão de acordo com fatores específicospara cada sujeito ou paciente, dependendo da terapia específica (p. ex.,agentes terapêuticos ou profiláticos) administrada, da gravidade do distúrbio,doença, ou condição, da via de administração, e também da idade, corpo,peso, resposta, e história médica do paciente. Doses eficazes podem serextrapoladas a partir de curvas dose-resposta derivadas de sistemas de testeem modelos animais ou in vitro. Alguém com prática na arte será capaz deselecionar regimes vantajosos considerando referidos fatores e seguindo, porexemplo, dosagens reportadas na literatura e recomendadas na obraPhysician1's Desk Reference (57a ed., 2003).

Doses exemplares de uma molécula pequena incluemquantidades em miligramas ou microgramas da molécula pequena porquilograma o sujeito ou do peso da amostra (p. ex., cerca de 1 microgramapor quilograma a cerca de 500 miligramas por quilograma, cerca de 100microgramas por quilograma a cerca de 5 miligramas por quilograma, oucerca de 1 micrograma por quilograma a cerca de 50 microgramas porquilograma).

De uma forma geral, a faixa de dosagem diária recomendadade uma ou mais PMFs hidroxiladas ou composição das mesmas para ascondições aqui descritas situa-se na faixa de cerca de 0,01 mg da uma ou maisPMF hidroxilada a cerca de 1000 mg de um ou mais PMF hidroxilada por dia.Estas quantidades pode ser fornecidas, por exemplo, como uma dose simplesadministrada uma vez ao dia ou como doses divididas ao longo do dia. Emuma concretização, a dose diária é administrada duas vezes ao dia em dosesigualmente divididas. Especificamente, uma faixa de dose diária poderia serde cerca de 5 mg a cerca de 500 mg por dia, mais especificamente, entre cercade 10 mg e cerca de 200 mg por dia. No controle do sujeito ou do paciente, aterapia deveria ser iniciada numa dose inferior, talvez de cerca de 1 mg acerca de 25 mg, e incrementada, se necessário, até cerca de 200 mg a cerca de1000 mg por dia, seja como uma dose simples ou em doses divididas,dependendo da resposta global do sujeito ou paciente. Em alguns casos, podeser necessário usar dosagens do ingrediente ativo fora das faixas aquidivulgadas como será compreensível por aqueles com prática ordinária naarte. Observa-se adicionalmente que o dieticista, clínico ou médicoresponsável saberá como e quando interromper, ajustar, ou terminar a terapiaem conjunto com condições e respostas do paciente individual, como operceberá facilmente alguém com prática na arte. De maneira análoga,quantidades suficientes para prevenir, controlar, tratar ou melhorar referidosdistúrbios, mas insuficientes para causar, ou suficientes para reduzir, efeitosadversos associados com os compostos da invenção também sãocompreendidas pelas quantidades de dosagem descritas e os programas dedosagem que determinam a freqüência de dosagem. Adicionalmente, quandoum sujeito ou paciente recebe dosagens múltiplas de um composto dainvenção, nem todas as dosagens precisam ser iguais. Por exemplo, adosagem administrada ao sujeito ou paciente pode ser incrementada paramelhorar o efeito profilático ou terapêutico do composto ou pode serdiminuída para reduzir um ou mais efeitos secundários que um sujeito oupaciente particular está experimentando.

Em uma concretização específica, a dosagem da uma ou maisPMFs hidroxiladas ou composição das mesmas administrada para prevenir,tratar, controlar ou melhorar um distúrbio (p. ex., um distúrbio proliferativoou um distúrbio inflamatório), ou um ou mais sintomas da mesma em umpaciente é de cerca de 150 μg/kg, de preferência, cerca de 250 μg/kg, cerca de500 μg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de25 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, cerca de 75 mg/kg, cerca de 100 mg/kg, cercade 125 mg/kg, cerca de 150 mg/kg, ou cerca de 200 mg/kg ou mais do pesocorporal de um paciente. Em outra concretização, a dosagem da uma ou maisPMFs hidroxiladas ou composição das mesmas administrada para prevenir,tratar, controlar, ou melhorar um distúrbio (p. ex., um distúrbio proliferativoou um distúrbio inflamatório), ou um ou mais sintomas da mesma em umpaciente é uma dose unitária de 0,1 mg a 20 mg, 0,1 mg a 15 mg, 0,1 mg a 12mg, 0,1 mg a 10 mg, 0,1 mg a 8 mg, 0,1 mg a 7 mg, 0,1 mg a 5 mg, 0,1 a 2,5mg, 0,25 mg a 20 mg, 0,25 a 15 mg, 0,25 a 12 mg, 0,25 a 10 mg, 0,25 a 8 mg,0,25 mg a 7m g, 0,25 mg a 5 mg, 0,5 mg a 2,5 mg, 1 mg a 20 mg, 1 mg a 15mg, 1 mg a 12 mg, 1 mg a 10 mg, 1 mg a 8 mg, 1 mg a 7 mg, 1 mg a 5 mg, ou1 mg a 2,5 mg.

7.4. Ensaios biológicos

Diversos aspectos da uma ou mais PMFs hidroxiladas oucomposições das mesmas podem ser testados in vitro, em um sistema decultura de células, e em um organismo de modelo animal, como um sistemade modelo animal de roedor, para a atividade terapêutica desejada antes douso em humanos. Por exemplo, ensaios que podem ser usados para determinarse a administração de uma composição específica é indicada incluem ensaiosde cultura de células em que uma amostra de tecido do paciente édesenvolvida em cultura, e exposta a, ou de outra forma, contactada com umacomposição, e observa-se o efeito de referida composição sobre a amostra detecido. A amostra de tecido pode ser obtida por meio de biópsia do paciente.

Este teste permite a identificação da terapia terapeuticamente mais eficaz (p.ex., agente(s) profilático(s) ou terapêutico(s)) para cada paciente individual.Em diversas concretizações específicas é possível realizar ensaios in vitrocom células representativas de tipos de células envolvidos em um distúrbio (p.ex., células imunes ou células de câncer), para determinar se uma composiçãoda invenção exerce um efeito desejado sobre referidos tipos de células. Comouma alternativa ao uso de tecido, amostras de tecido, é possível usar linhas decélulas de câncer em ensaios in vitro. Exemplos de linhas de células de câncerque podem ser usados em ensaios in vitro incluem, embora sem limitação, alinha de células de câncer de mama MCF-7, a linha de células de câncer demama resistente a múltiplas drogas MCF-7/ADR, a linha de células demelanoma humano HTl 14, a linha de células de sarcoma uterino humanoresistente a doxorrubiceno MES/DOX, a linha de células colo-retal humanaHT29, a linha de células colo-retal humana HCT-116, a linha de células decarcinoma do pulmão humano A549 e a linha de células de adenocarcinomaprimário de pâncreas humano BXPC-3, incluindo linhas de células descritasnos Exemplos abaixo.

A uma ou mais PMFs hidroxiladas ou composições dasmesmas pode se analisada quanto a sua capacidade de modular a ativação devários tipos de células imunes (incluindo células T, células B, células NK,macrófagos, e células dendríticas). A ativação de células imunes pode serdeterminada medindo-se, p. ex., alterações no nível de expressão e/oufosforilação de citocinas, e/ou marcadores de superfície celular. Técnicasconhecidas por aqueles com prática na arte, incluindo, embora sem limitação,imunoprecipitação seguida de análise de Western Blotting, ELISAs,citometria de fluxo, análise de Northern blotting, e RT-PCR, podem serusadas para medir a expressão de citocinas e marcadores de superfície celularindicativos da ativação da célula imune.

A uma ou mais PMFs hidroxiladas ou composições dasmesmas podem ser analisadas quanto a sua capacidade de induzir a expressãoe/ou ativação de um produto gênico (p. ex., proteína celular ou RNA) e/ou deinduzir transdução de sinal em células imunes, células de câncer, e/ou célulasendoteliais. A indução da expressão ou ativação de um produto gênico ou aindução das vias de transdução de sinal em células imunes, células de câncer (em particular células de câncer resistentes a agente de ligação de tubulina)e/ou células endoteliais, pode ser analisada por meio de técnicas conhecidaspor aqueles com prática na arte, incluindo, p. ex., ELISAs, citometria defluxo, análise de Northern blotting, análise de Western Blotting, ensaios deRT-PCR quinase e ensaios de deslocamento de mobilidade eletroforética. Auma ou mais PMFs hidroxiladas ou composições das mesmas também podemser analisadas quanto a sua capacidade de modular proliferação de célulasimunes, proliferação de células de câncer e endoteliais. Técnicas conhecidaspor aqueles na arte, incluindo, embora sem limitação, incorporação de 3H-timidina, contagens de células de azul tripano, e análise de separação decélulas ativadas com fluorescência (FACS) ("FACS"). A uma ou mais PMFshidroxiladas ou composições das mesmas também podem ser analisadasquanto a sua capacidade de induzir citólise. A citólise pode ser avaliada pormeio de técnicas conhecidas por aqueles com prática na arte, incluindo,embora sem limitação, análise de liberação de 51Cr.

A uma ou mais PMFs hidroxiladas ou composições dasmesmas podem ser testadas em sistemas de modelos animais vantajosos antesdo uso em humanos. Referidos sistemas de modelo animais incluem, emborasem limitação, ratos, camundongos, frangos, vacas, macacos, porcos, cães,coelhos, etc. É possível usar qualquer sistema animal bem conhecido na arte.Em uma concretização específica da invenção, as composições e compostosda invenção são testados em um sistema de modelo de camundongo.Referidos sistemas de modelo são amplamente usados e são bem conhecidospela pessoa versada na arte. Composições farmacêuticas da invenção podemser administradas repetidamente. Diversos aspectos do procedimento podemvariar, incluindo, embora sem limitação, regime temporal para aadministração da uma ou mais PMFs hidroxiladas ou composições dasmesmas.

A atividade anticâncer da uma ou mais PMFs hidroxiladas oucomposições das mesmas pode ser determinada usando-se qualquer modeloanimal vantajoso, incluindo, embora sem limitação, camundongos SCID comum tumor ou injetados com células malignas. Exemplos de modelos animaisde câncer do pulmão incluem, embora sem limitação, modelos animais decâncer do pulmão descritos por Zhang & Roth (1994, in vivo 8(5):755-69) eum modelo de camundongo transgênico com função p53 disrompida (ver, p.ex., Morris et ai, 1998, JLa State Med Soc 150(4): 179-85). Um exemplo deum modelo animal para câncer de mama inclui, embora, um camundongotransgênico que superexpressa ciclina Dl (ver, p. ex., Hosokawa et aL, 2001,Transgenie Res 10(5):471-8). Um exemplo de um modelo animal para câncerdo colo inclui, embora sem limitação, um camundongo com a expressãoinibida dupla para TCR b e p53 (ver, p. ex., Kado et ai., 2001, Câncer Res61(6):2395-8). Exemplos de modelos animais para carcinomas colo-retaisincluem, embora sem limitação, modelos de camundongo de Apc (ver, p. ex.,Fodde & Smits, 2001, Trends Mol Med 7(8):369-73 e Kuraguchi et ai., 2000,Oncogene 19(50):5755-63).

A atividade antiinflamatória da uma ou mais PMFshidroxiladas ou composições das mesmas pode ser determinada por meio douso de vários modelos animais experimentais de artrite inflamatóriaconhecidos na arte e descritos por Crofford L.J. e Wilder R.L., nArthtritis andAutoimmunity in Animais", em Arthtritis and Allied Conditions: A Textbook ofRheumatology, McCarty et ai. (eds.), capítulo 30 (Lee e Febiger, 1993).

Modelos animais de asma também podem ser usados paraavaliar a eficácia das composições e compostos da invenção. Um exemplo deum modelo do tipo referido é o modelo de transformação adotiva murina emque a provocação com aeroalérgeno de camundongos recipientes de THl ouTH2 resulta em migração de células efetoras de TH para as vias aéreas, e estáassociada com uma intensa resposta inflamatória mucosal neutrofílica (THl)e eosinofílica (TH2) do pulmão (Cohn et al., 1997, J. Exp. Med. 1861737-1747).

Adicionalmente, é possível usar muitos ensaios conhecidos poraqueles versados na arte para avaliar a utilidade profilática e/ou terapêutica dauma ou mais PMFs hidroxiladas ou composições das mesmas para osdistúrbios aqui indicados.

A toxicicidade e/ou eficácia da uma ou mais PMFshidroxiladas ou composições das mesmas pode ser determinada por meio deprocedimentos farmacêuticos convencionais em culturas de células ouanimais experimentais, p. ex., para determinar a LD 50 (a dose letal para 50%da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% dapopulação). A relação de doses entre efeito tóxico e terapêutico é o índiceterapêutico e pode ser expressa como a relação LD50ZED50. Prefere-se PMFshidroxiladas que apresentam grandes índices terapêuticos.

Os dados obtidos dos ensaios de cultura de células e estudosanimais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem dascomposições e compostos da invenção para uso em humanos. A dosagem dereferidos agentes situa-se, de preferência, em uma faixa de concentraçõescirculantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicicidade. Adosagem pode variar dentro desta faixa, dependendo da forma de dosagemempregada e da via de administração usada. Para qualquer agente usado nométodo da invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimadainicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode serformulada em modelos animais para se obter uma faixa de concentraçãocirculante no plasma que inclui a IC5o (i.e., a concentração do composto de teste que proporciona uma inibição semi-máxima dos sintomas) comodeterminado em cultura de células. Referida informação pode ser usada maisprecisamente para determinar doses úteis em humanos. Níveis no plasmapodem ser medidos, por exemplo, por meio de cromatografia líquida de altodesempenho (HPLC) e ensaio rádio-imunológico (RIA, radioimmunoassay).

A farmacocinética de uma profilática ou terapêutica pode ser determinada, p.ex., medindo-se parâmetros, como níveis plasmáticos de pico (Cmax), área soba curva (AUC, que é medida plotando-se a concentração plasmática do agenteversus o tempo, e reflete a biodisponibilidade), meia-vida do composto (t1/2), etempo na concentração máxima.

A eficácia na prevenção ou no tratamento de um distúrbioproliferativo, como câncer, pode ser demonstrada, p. ex., detectando-se acapacidade das composições e compostos da invenção de reduzir um ou maissintomas do distúrbio proliferativo, para reduzir a proliferação de célulascancerosas, para reduzir a disseminação de células cancerosas, ou para reduziro tamanho de um tumor. A eficácia na prevenção ou no tratamento de umdistúrbio inflamatório pode ser demonstrado, p. ex., detectando-se acapacidade das composições e compostos da invenção de reduzir um ou maissintomas do distúrbio inflamatório, para diminuir a ativação de células T, paradiminuir a proliferação de células T, para modular um ou mais perfis decélulas T, para diminuir a proliferação de células T, para modular um ou maisperfis de citocinas, para reduzir a produção de citocina, para reduzirinflamação de uma articulação, órgão ou tecido, ou para melhorar a qualidadede vida. Alterações da atividade da doença inflamatória podem ser avaliadaspor meio de contagem de articulações macias e inchadas, escores globais depaciente e médico para dor e atividade doença, e a ESR/CRP. A progressãodo dano estrutural na junta pode ser avaliada por meio de classificaçãoquantitativa de raios-X de mãos, pulsos, e pés (método de Sharp). Alteraçõesdo status funcional em humanos com distúrbios inflamatórios podem seravaliados usando-se o Questionário de Avaliação da Saúde (HAQ), e asalterações na qualidade de vida são avaliadas com o SF-36.

8. EXEMPLOS

Os exemplos a seguir destinam-se apenas a ilustraradicionalmente a invenção, sem limitar o seu escopo como definido pelasreivindicações.

8.1. Exemplo 1

Este exemplo apresenta uma análise do teor de PAlFhidroxilada de extratos de casca de laranja comercialmente obteníveis.

Extratos de cascas de laranjas foram obtidos comercialmente, edeterminou-se que apresentam uma fração de PMF como a seguir: extrato A,70% de fração de PMF; extrato B, 40% de fracao de PMF; extrato C, 40% defração de PMF; extrato D, 20% de fração de PMF.

Usou-se cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC,)para separar PMFs hidroxiladas de PMFs não-hidroxiladas em extratos decascas de laranjas. Para cada um dos quatro extratos de cascas de laranjasdissolveu-se uma amostra em cloreto de metileno em uma concentração de 2mg/ml. As soluções dissolvidas foram analisadas com um sistema de HPLC(Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD, E.U.A.) com auto-injetorfornecido pelo fornecedor (SIL-10 AD vp), detector de UV-Vis (SPD-10Avp), bombas duplas (LC/-10 AT vp) e componentes de controlador de sistema(SCL-10A vp) com uma coluna analítica de sílica NO VA-P AK® (3,9x150mm, 5 μηι) (Waters Corp., Milford, MA, E.U.A.) usando-se uma fase móvelde gradiente de 15% de acetato de etila e 85% de hexanos a 50% de acetato deetila e 50% de hexanos em operações de 15 min, com uma taxa de fluxo de 2ml/min. O monitoramento da absorbância de UV foi ajustado em 280 nm. AFigura 1 ilustra um perfil de separação de HPLC exemplar de um extrato decasca de laranja comercialmente obtenível onde picos correspondentes aPMFs hidroxiladas e PMFs não-hidroxiladas são como indicados. Frações depico de HPLC foram caracterizadas como PMFs hidroxiladas ou PMFs não-hidroxiladas por meio de coleta e concentração das frações de pico e análisedas amostras concentradas por meio de espectrometria de massa-ionização depulverização de elétrons-HPLC (HPLC-ESI-MS).

Em resumo, realizou-se HPLC-ESI-MS em um controlador desistema HP 1090, com um detector de comprimento de onda de UV variávelde 190-500 nm, um detector ELSD (detector evaporativo por espalhamento deluz de laser) e um detector de ESI-MS de um analisador de massa VGPLATFORM II (Micromass, Beverly, MA, E.U.A.). Condições de ESI-MSforam como a seguir: modo de aquisição, ESI-positiva; faixa de varredura demassa, 100-800 amu; taxa de escanemaneto, 0,4 s; voltagem do cone, 25volts; temperatura da fonte: 150°C; temperatura da sonda: 550°C. Condiçõesde HPLC analítica em HPLC-MS: coluna: CHROMABOND WR C18, 3 μπι,120Â; comprimento χ O.D.: 30 χ 3,2 mm; volume de injeção, 15 μΐ; taxa defluxo: 2 ml/min; tempo de operação: 3 min. Fase móvel consistiu deacetonitrila e H2O com 0,05% de TFA, usando-se um gradiente típico de 10 a 90% de acetonitrila.

A Tabela 2 proporciona percentuais (peso/peso) da fraçãoindicada relativamente ao extrato de casca de laranja para cada um dos quatroextratos analisados.TABELA 2:

Concentrações de PMFs hidroxiladas em POEs comercialmenteobteníveis

<table>table see original document page 59</column></row><table>

8.2. Exemplo 2

Este exemplo descreve a caracterização de compostoshidroxilados exemplares isolados de um extrato de casca de laranjacomercialmente obtenível. Em particular, oito flavonas hidroxiladas, umaflavanona hidroxilada e duas chalconas hidroxiladas foram isoladas de umextrato de casca de laranja doce e caracterizadas.

Extrato de casca de laranja doce foi obtido da Florida FlavorsCo. Placas de cromatografia de camada fina (TLC) e colunas pré-empacotadas com sílica-gel (60Â, 32-63 fim), cujos tamanhos são de 4 g, 12g, 40 g, 80 g, 120 g e 330 g, para cromatografia de fase normal e sílica-gel (60Â) derivatizada de octadecila (Ci8) para cromatografia de cintilação de faseinvertida, foram adquiridas da Teledyne Isco, Inc. (Lincoln, NE, E.U.A.).

Sistema de coluna de vaporização instantânea. Usou-se umsistema de cromatografia de cintilação automatizado (modelo Foxy 200,sgl00, ISCO Inc., Lincoln, NE, E.U.A.) equipado com uma coluna devaporização instantânea pré-empacotada com 330 g de sílica-gel (tamanhodas partículas de 35 a 60 μηι) da Teledyne Isco Inc. A fase móvel para colunade vaporização instantânea de fase normal consistiu de acetato de etila ehexanos ou de isopropanol e hexanos em relações variáveis, e a taxa de fluxofoi ajustada em 90 ml/min. O eluente foi monitorado com um detector de UVde canal simples com um comprimento de onda de 254 nm.

Sistema de HPLC. Usou-se um cromatógrafo decromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) equipado com uma bomba(bomba de fornecimento Waters Delta Prep 4000, Milford, MA), detector deUV-vis (detector de absorbância ajustável Waters 486, Milford, MA) e uminjetor (injetor Waters U6K, Milford, MA). Usou-se uma coluna Regis Welk-O 1 R,R 450 gramas (Regis Technologies, Inc., Morton Grove, IL) para osistema de HPLC. A fase móvel para o sistema de HPLC foi de 35% de etanolabsoluto e 65% de hexanos com uma taxa de fluxo ajustada em 85 ml/min. Oeluente foi detectado com um comprimento de onda de UV a 326 nm.

Instrumento de RMN. Espectros de RMN foram registradosem um espectrômetro Varian 300 e Varian 500 (Varian Inc., Palo Alto, CA).Com padrão de interno de TMS, RMN 1H foi registrada a 300 MHz e 500MHz; RMN 13C a 75 MHz e 125 MHz; RMN 2D (HMBC, HSQC, HMQC eROESY) a 125 MHz.

Espectrômetro de massa. Espectros de ESI-MS foramobtidos em um analisador de massa Micromass VG Platform II (Micromass,Beverly, MA). Espectros de ESI-MS foram obtidos em um MicroMassAutoSpec HF (Micromass, Beverly, MA). Condições de MS: faixa devarredura de masa: 100-1500 amu; taxa de varredura: 0,4 s (ESI-MS);voltagem do cone: 36 volts (ESI-MS); voltagem corona: 3,59 K Volts (ESI-MS); temperatura da fonte: 150°C (ESI-MS); 250°C (EI-MS).

Métodos analíticos adicionais, incluindo HPLC-ESI-MS,foram realizados de forma similar àqueles descritos na SEÇÃO 8.1, acima.

Para separar componentes no extrato de casca de laranja, oextrato (10 g) foi dissolvido em uma mistura de cloreto de metileno (2 ml) ehexanos (2 ml) e carregado em uma coluna de vaporização instantânea desílica-gel pré-condicionada (tamanho: 330 g). O gradiente foi iniciado com10% de acetato de etila e 90% de hexanos e foi a 40% de acetato de etila e60% de hexanos dentro de 35 min. Em seguida, a fase móvel isocrátia foiaplicada durante 15 min. As frações que apresentaram absorbância de UV a254 nm foram analisadas com LC/MS e cromatografia de camada fina (TLC)com um sistema de solvente de 40% de acetato de etila e 60% de hexanos. Asfrações foram combinadas em vários grupos de acordo com seu pesomolecular obtidos com análise LC/MS. Realizou-se separação adicional decada grupo.

As frações que contêm PMFs hidroxiladas caracterizadas porLC/MS foram concentradas e o resíduo foi dissolvido em acetonitrila e água.A solução dissolvida foi carregada em um sistema de HPLC de fase invertidaC18. Usou-se um método de gradiente de 25% de acetonitrila a 60% deacetonitrila em 25 min. As frações foram analisadas por meio de LC/MS.Tanto as misturas como os compostos puros foram recolhidos. As fraçõespuras [determinadas por] HPLC e MS foram combinadas e concentradas ouliofilizadas para remover o acetonitrila. Os compostos foram analisadas pormeio de MS e RMN. As misturas foram concentradas em rotovapor edissolvidas em quantidade mínima de cloreto de metileno. A solução foicarregada no sistema de HPLC equipado com a coluna Regis (Welk-O 1 R5R450 gramas). A monitoração da absorbância de UV foi ajustada em 280 nm.As frações foram recolhidas e concentradas respectivamente. Realizou-se MSe RMN para estas frações.

A Tabela 3 ilustra as PMFs hidroxiladas isoladas do extrato decasca de laranja.

Tabela 3:

Polimetoxiflavonas hidroxiladas isoladas de extrato de casca de laranja doce

<table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table>

Adicionalmente a polimetoxiflavonas hidroxiladas, osseguintes três compostos foram isolados e caracterizados a partir de extrato decasca de laranja:

<formula>formula see original document page 62</formula>

8.3. Exemplo 3

Este exemplo proporciona processos exemplares para apreparação de composições a partir de extrato de casca de laranja de modo aconterem mais de 15% (peso/peso) de PMFs hidroxiladas.

Tratamento com HCl IN. Um grama de extrato de casca delaranja apresentando 70% de PMFs foi dissolvido em 5 ml de etanol. Emseguida, adicionou-se 5 ml de HCl IN à solução, que foi então refluxada aIOO0C durante 12 horas. A mistura de reação foi extraída duas vezes com 30ml acetato de etila. O solvente foi removido com evaporador rotativo para seobter uma composição seca denominada "PMF 1 N".

Mediante análise, verificou-se que a composição de PMF 1 Ncontinha cerca de 25,78% de PMFs hidroxiladas. Estimou-se queaproximadamente 31% da nobiletina no extrato de casca de laranja de partidafoi convertida a 5-Wdróxi-6,7-8,3',4'-pentametoxiflavona (5-demetilnobiletina) durante o processo para preparar a composição de PMF 1 N.

Tratamento com HCl 6 N. Um grama de extrato de casca delaranja apresentando 70% de PMFs foi dissolvido em 5 ml de etanol. Emseguida, adicionou-se 5 ml de 6 N HCl à solução, que foi então refluxada a100°C durante 12 horas. A mistura de reação foi extraída duas vezes com 30ml acetato de etila. O solvente foi removido com evaporador rotativo para seobter uma composição seca denominada "PMF 6 N".

Mediante análise, verificou-se que a composição de PMF 6 Ncontinha cerca de 84,42% de PMFs hidroxiladas. Estimou-se queaproximadamente 81% da nobiletina no extrato de casca de laranja de partidaforam convertidos a 5-hidróxi-6,7,8,3',4'-pentametoxiflavona (5-demetilnobiletina) durante o processo para preparar a composição de PMF 6 N.

8.4. Exemplo 4

Este exemplo descreve materiais e métodos, incluindo ensaiospara identificar atividades biológias de compostos e composições.

Culturas de células. Linhas de células de carcinoma de colohumano COL0205 e HT-29 (American Type Culture Collection (ATTC),Manassas, VA) e a linhas de células de leucemia HL-60 foram mantidas a37°C em ar com 5% de CO2 em meio RPMI 1640 suplementado com 10% desoro bovino fetal inativado com calor (Gibco BRL, Grand Island, NY), 100unidades/ml de penicilina, 100 μL/ml de estreptomicina e 2 mM de 1-glutamina. A linha de células de carcinoma gástrico humano AGS (CCRC60102), obtida do Food Industry Research and Development Institute(Hsinchu, Taiwan), foi mantida como descrito acima, exceto que DMEM/F12foi usado como o meio ao invés do meio RPMI 1640. A linha de células decarcinoma de mama humano MCF-7 (ATTC) foi cultivada em meio RPMI1640 suplementado com 5% de soro de bezerro fetal a 37°C em umaatmosfera umidificada de ar com 5% de CO2. A linha de células de macrófagode camundongo RAW 264,7 foi mantida em RPMI 1640 suplementado com100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, e 10% de soro debezerro fetal inativado com calor.

Ensaio de sobrevivência de células. Células de câncer (2x105)foram plaqueadas em discos de Petri de 12 poços. No dia seguinte, o meio foitrocado e tratado com concentrações diferentes dos compostos oucomposições de teste durante 24 h. Onde se pretende testar compostosindividuais, preparou-se soluções de consumo do composto de forma a conter200 μΜ da PMF hidroxilada individual ou PMF não-hidroxilada em sulfóxidode dimetila (DMSO). Células de controle foram tratadas com DMSO a umaconcentração final de 0,05% (v/v). Dependendo do objetivo do experimentoparticular, células foram tratadas com composto ou composição de testedurante 1, 3 ou 6 dias. Ao término da incubação, células foram colhidas paracontagem de células usando-se um hemocitômetro e medindo-se o teor totalde ácido nucleico celular com o kit de ensaio de proliferação de células CyQUANT (Molecular Probes).

Determinação da relação apoptótica (%) e distribuição dociclo celular. As células de câncer humanas (2x10) foram cultivadas emdiscos de Petri de 60 mm e incubadas durante 24 h. Após tratamento comcompostos de teste durante 24 h, as células foram então colhidas, lavadas comPBS ressuspenso em 200 μΐ de PBS, e fixadas em 800 μΐ de etanol gelado a100% a -20°C. Após deixar descansar de um dia para o outro, os pellets decélulas foram coletados por meio de centrifugação, ressuspensos em 1 ml detamponador hipotônico (0,5% de Triton X-100 em PBS e 0,5 μ&/πύ deRNase) e incubados a 37°C durante 30 min. Em seguida, adicionou-se 1 ml desolução de iodeto de propídio (50 μg/ml), e a mistura foi deixada descansarsobre gelo durante 30 min. A fluorescência emitida do complexo de iodeto depropídio-DNA foi quantificada após excitação do corante fluorescente comcitometria FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Ensaio de nitrito. Compostos ou composições foram testadasquanto aos efeitos antiinflamatórios monitorando-se a produção de nitrito emcélulas RAW 264.7 ativadas com LPS. Após tratamento das células com LPSou LPS e substância de teste, sobrenadantes foram colhidos e a quantidade denitrito, um indicador da síntese de NO, foi medida por meio de reação deGriess. Em resumo, sobrenadantes (100 μΐ) foram misturados com o mesmovolume de reagente de Griess (1% de sulfanilamida em 5% de ácido fosfóricoe 0,1% de dicloridrato de naftiletilenodiamina em água) em duplicata emplacas de 96 poços. Após incubação à temperatura ambiente durante 10 min,mediu-se a absorbância a 570 nm com uma leitora ELISA (ThermoLabsystems Multiskan Ascent, Finlândia).

Western Blotting. Proteínas foram isoladas das células apóstratamento com compostos de teste durante 24 h. A proteína total foi extraídacom adição de 200 μΐ de tamponador de Iise de ouro (50 mM de Tris-HCl, pH7,4; 1 mM de NaF; 150 mM de NaCl; 1 mM de EGTA; 1 mM de fluoreto defenilmetanossulfonila; 1% de NP-40; e 10 μg/ml de leupeptina), aos pellets decélulas, que são mantidos sobre gelo durante 30 minutos, seguido decentrifugação a 10.000 xg durante 30 min a 4°C. As concentrações deproteína da fração citosólica (sobrenadante) foram medidas com o ensaio deproteína BIO-RAD (Bio-Rad Laboratories, Munich, Alemanha). Amostrascontendo 50 μg de proteína foram separadas eletroforeticamente por meio deSDS-PAGE e transferidas para membrana de PVDF (Millipore Corp.,Bedford, MA) usando procedimentos convencionais. Ver Burnette (1981)Anal. Biochem. 112:195-203. Proteínas transferidas foram visualizadas pormeio de quimioluminescência com reagentes do kit de detecção ECL(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK) de acordo com oprotocolo do fabricante usando anticorpos primários anti-iNOS, anti-P-actinae anti-COX-2 da Transduction Laboratories (Lexington, QUI) e anticorposecundário conjugado com peroxidase de rabanete (HRP) da ZymedLaboratories (San Francisco, CA).

Plasmídeos, transfecção transiente e ensaio de luciferase.Células RAW264.7 foram semeadas em discos de 6 mm. Quando as célulasforam confluentes, o meio foi substituído por Opti-MEM isento de soro(Gibco-BRL). Em seguida, as células foram transfectadas com o gene repórterde plasmídeo p-NFkB-Luc usando reagente de LIPOFECTAMINE™(Invitrogen). Após 6 h de incubação, o meio foi substituído por meiocompleto. Após 24 h, as células foram tripsinizadas, e números iguais decélulas foram plaqueadas em placas de cultura de tecido de 24 poços durante6 h. Células foram então tratadas com LPS (100 ng/ml) sozinhas ou comPMFs (10 ou 30 (J.M) durante 12 h. Cada poço foi lavado duas vezes com PBSfrio e colhido em 100 μΐ de DMEM isento de soro, e avaliou-se a atividade deluciferase com o kit de ensaio de gene repórter de luciferase LUCILITE(PerkinElamer). A luminescência foi medida em um contador deluminescência (Molecular Devices, LMaxII) em modo de contagem de fótonsimples durante 2 s/poço, após 5 min de adaptação no escuro.

Análise estatística. A significância estatística de diferençasentre amostras de controle e amostras tratadas foi calculada com o teste f deStudent (Sigmaplot 8.0). p< 0,05 foi considerado significante. Exceto seindicado de outra forma, todos os dados mostrados no estudo para inibição docrescimento de células, apoptose quantitativa, distribuição de fase de ciclocelular, inibição de nitrito, e inibição da atividade de luciferase sãorepresentativos de 2 a 3 estudos independentes.

8.5. Exemplo 5

Este exemplo demonstra as atividades antiproliferativa eindutora de apoptose, incrementadas, de extratos de cascas de laranjasenriquecidos com PMF hidroxilada relativamente à nobiletina ou a extratos decascas de laranjas apresentando 70% de PMFs predominantemente não-hidroxiladas ("70% de PMF ΟΡΕ").

Atividades antiproliferativas de células de câncer e indutor ade apoptose. Composições de PMF 1 N e PMF 6 N contendo PMFshidroxiladas, preparadas como descrito na Seção 8.3 acima, 70% de PMFOPE e 5,6,7,8,3',4'-hexametoxiflavona (nobiletina) foram testadas quanto àatividade antiproliferativa e à atividade indutora de apoptose em células HL-60, AGS e COL0205 como descrito na Seção 8.4 acima. Atividadesantiproliferativa e indutora de apoptose foram derivadas como valores de IC50e AC5o, respectivamente, onde AC5o é a concentração requerida para 50% de apoptose.

Os resultados, mostrados na Tabela 4, indicam que tanto ascomposições de PMF hidroxilada enriquecida com PMF 1 N como tambémcom PMF 6 N apresentam atividades antiproliferativas mais potentes do que anobiletina ou 70% de PMF ΟΡΕ.

Tabela 4:

Atividades antiproliferativa (IC50) e indutora de apoptose (AC5o) decomposições enriquecidas com PMF hidrolisada nas células HL-60, AGS,

<table>table see original document page 67</column></row><table>

Distribuição de ciclo celular. Estudou-se os efeitos dascomposições enriquecidas com PMF hidrolisada, nobiletina e 70% de PMFOPE sobre a distribuição do ciclo celular, de acordo com os procedimentosdescritos na Seção 8.4. Resultados para a distribuição de ciclo celular emcélulas HL-60, células COL0205 e células AGS são fornecidos na Tabela 5,Tabela 6 e Tabela 7, respectivamente. Tratamento de células HL-60,COL0205, e AGS durante 24 horas resultou em interrupção do crescimentoenvolvendo múltiplas fases de ciclos celulares. Em células HL-60, ainterrupção de G2/M predominou em células tratadas com concentrações dePMF 6N > 5 μΜ e com concentrações de PMF IN > 25 μΜ. Em célulasCOL0205, a interrupção de G2/M predominou com concentrações de PMFIN PMF >25 μΜ, enquanto que se observou interrupção de G0/G1 comconcentrações de OPE > 25 μΜ. A uma elevada concentração de PMF IN (>25 μΜ) predominou interrupção de G2/M e S, enquanto que, a concentraçõesmenores de PMF 6N (> 5 μΜ), observou-se G2/M em células AGS.

Tabela 5:

Distribuições de ciclo celular de HL-60

<table>table see original document page 68</column></row><table>Tabela 6:

Distribuições de ciclos celulares de COL0205<table>table see original document page 69</column></row><table>

Tabela 7:

Distribuições de ciclos celulares de AGS<table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table>

Atividade antiinflamatória. As atividades antiinflamatórias dascomposições enriquecidas com PMF hidrolisada, nobiletina e 70% de PMF OPEforam estudadas usando o protocolo para o ensaio de nitrito descrito na Seção 8.4.Ambas as composições enriquecidas com PMF hidrolisada, PMF INe PMF 6 N,apresentaram maior atividade antiinflamatória do que nobiletina ou 70% de PMFΟΡΕ, como observado na Figura 2. Estes resultados demonstram que ascomposições enriquecidas com PMF hidroxilada são composiçõesantiinflamatórias mais potentes do que nobiletina apenas ou OPE apresentandopredominantemente uma fração de PMF não-hidroxilada de 70%.

8.6. Exemplo 6

Este exemplo compara atividades antiinflamatórias eanticâncer de PMFs hidroxiladas individuais uma contra a outra, e contraPMFs não-hidroxiladas individuais. Usou-se onze compostos, como mostradona Tabela 8 abaixo, que são referidos neste exemplo pela denominação deuma letra só, como indicado na tabela.

Tabela 8

<table>table see original document page 70</column></row><table><table>table see original document page 71</column></row><table>

Atividades antiproliferativa de células cancerosas e indutorade apoptose. Os compostos de PMF foram avaliados in vitro quanto à inibiçãodo crescimento celular e quanto a sua capacidade de induzir apoptose emdiversas células de câncer humanas, incluindo células HL-60, AGS, COLO205, e HT-29, usando métodos descritos na Seção 8.4 acima. A atividadeantiproliferativa (IC50) e indutora de apoptose (AC50) de PMFs nas célulasHL-60, AGS, COLO 205, e HT-29 são reportadas na Tabela 9, em que *P <0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001 indicam diferenças estatisticamentesignificativas do grupo de controle.

Tabela 9:

Atividades antiproliferativa (IC50) e indutora de apoptose (AC50) de PMFs

<table>table see original document page 71</column></row><table>De uma maneira global, estes resultados demonstram quePMFs variam quanto a suas capacidades de inibir proliferação e induzirapoptose. Em muitos casos, PMFs hidroxiladas individuais apresentarammaior efetividade em sua atividade de inibir proliferação e/ou induzirapoptose do que PMFs não-hidroxiladas. Por exemplo, estes dados indicamque composto C é um agente antiproliferativo efetivo em células HL-60 eAGS e exerce potente atividade indutora de apoptose em células de carcinomaAGS. Composto K é efetivo como um agente anti-proliferativo em célulasHL-60, AGS, COLO 205, e HT-29 com valores IC50 de 10,02, 9,61, 11,15, e40,02 μΜ, respectivamente. Composto G é efetivo como um agente anti-proliferativo em células HT-29 com IC5o de 45,82 μΜ.

Distribuição de ciclo celular. Compostos de A a K foramavaliados em termos de seus efeitos sobre a interrupção da progressão dociclo celular por meio da observação da distribuição das fases do ciclo celularem células tratadas com os compostos. Células foram tratadas com 5, 10, 25,50, e 100 μΜ de um dos compostos de A a K ou DMSO (controle) durante 24h e submetidas a análise citométrica de fluxo após manchamento de seu DNA,como descrito acima. Resultados dos efeitos de PMFs sobre a distribuição deciclo celular em células de leucemia humana HL-60 são mostrados na Tabela 10.

Tabela 10:

Distribuições de ciclos celulares de HL-60

<table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table>A Tabela 10 mostra que compostos não-hidroxilados A, D, F,e compostos hidroxilados CeH em concentrações de 25 a 100 μΜ causaramuma significativa interrupção de Gl às expensas da população de células defase S e G2/M após 24 h de tratamento em células HL-60. No caso de 25 μΜde composto C este aumento da interrupção de Gl foi acompanhado por umaumento da população de células de fase G2/M após 24 h de tratamento.

Realizou-se estudos similares de distribuição de fases de cicloscelulares em células AGS, COL0205, e HT-29 em resposta a PMFsindividuais, com resultados reportados nas Tabelas 11, 12 e 13,respectivamente.

Tabela 11:

Distribuições de ciclos de células AGS de carcinoma gástrico humano

<table>table see original document page 74</column></row><table><table>table see original document page 75</column></row><table>

*P <0,05, **P<0,01, ***P <0,001

Tabela 12:

Distribuições de ciclos celulares de carcinoma de colo humano CQL0205

<table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table>Tabela 13:

Distribuições de ciclos celulares de carcinoma de colo humano HT-29

<table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table>

*P <0,05, **P<0,01, ***P <0,001

Composto C (5-100 μΜ) apresentou uma diminuição dainterrupção de Gl acompanhada por um incremento da população de célulasde fase de G2/M 24 h após o tratamento em células AGS e COLO 205.

Composto A (50 μΜ) e composto I (100 μΜ) apresentaram tendências deinterrupção de Gl após 24 h de tratamento como observado em células COLO205, Como mostrado na Tabela 13, uma exposição de 24 h de células HT-29 acomposto A, C, D, F, G, e I (5-100 μΜ) resultou em acúmulo significativo decélulas em fase Gl que foi acompanhada por uma diminuição de células comfase G2/M. Tratamento com composto K nos quatro tipos de células humanaspotencializaram fortemente a interrupção de ciclo de células G2/M.

Considerados em conjunto, estes dados sugerem efeito considerável sobre aextensão e também sobre a natureza da interrupção de ciclo celular em célulasde câncer quando anel de PMFs é modificado por meio de substituição emposição diferente com diferentes porções metoxila e hidroxila. Estes dadosobtidos corroboram a conclusão de que estas PMFs conferem atividadeanticâncer em diferentes graus em células de câncer humanas, como célulasHL-60, AGS, COLO 205, e HT-29.

Atividade antiinflamatória. Os efeitos antiinflamatórios decompostos de A a K foram testados medindo-se a produção de nitrito emmacrófagos RAW 264.7 ativados com LPS, como descrito na Seção 8.4acima. Macrófagos foram tratados com 100 ng/ml de LPS apenas ou LPS ePMF (10 ou 30 μΜ) durante 24 h. Ao término do tempo de incubação, 100 μΐdo meio de cultura foram recolhidos para o ensaio de nitrito. Resultados sãomostrados na Figura 3.

Os resultados indicam que, quando as PMFs são comparadas auma concentração de 30 μΜ, determinadas PMFs hidroxiladas foram as maiseficazes para inibir a produção de nitrato induzida com LPS. As PMFs comefeitos inibidores podem ser classificadas de acordo com sua potênciainibidora como composto H>G>K>C>I>B, todos PMFs hidroxiladas. Entreestes, composto HeG são os inibidores mais potentes para a produção denitrito em macrófagos.

Análise de Western Blotting da inibição de expressão deproteína de iNOS e COX-2 induzida com LPS, por PMFs foi analisada,seguindo-se os procedimentos descritos acima. Em resumo, células demacrófagos foram tratadas com LPS (100 ng/ml) apenas ou com PMFs (10 ou30 μΜ) durante 24 h. Quantidades iguais de proteínas totais (50 μg) foramsubmetidas a 10% de SDS-PAGE, e expressão de proteína da iNOS, COX-2 eβ-actina foi detectada por meio de Western Blotting usando-se anticorposespecíficos. Como mostrado na Figura 4, entre as PMFs selecionadas,composto K (30 μΜ) foi o inibidor mais potente da expressão de iNOS emmacrófagos ativados com LPS, enquanto que o composto H (30 μΜ) foi oinibidor mais potente de expressão de COX-2.

As análises de deleção e mutação demonstraram que o fator detranscrição de NFKB está envolvido na ativação de iNOS e COX-2 por meiode LPS. Para confirmar se PMFs selecionadas inibiram a atividade de ligaçãode NFKB em macrófagos induzidos com LPS, a avaliação da expressão deluciferase em células transfectadas transientemente com plasmídeo repórter deluciferase dependentes de NFkB foi analisada de acordo com osprocedimentos descritos acima na Seção 8.4.

Como mostrado na Figura 5, composto H inibiu a atividadetranscricional de NFKB induzida com LPS de uma maneira dependente daconcentração. Na concentração de 30 μΜ, o composto H apresentou a maiorpotência inibidora de PMFs testadas, seguido de composto K, composto C,composto I e J. Estes resultados indicam que o composto H bloqueia aativação de NFKB induzida com NFKB por meio da inibição da atividade deIKK, que poderia perturbar a degradação de ΙκΒα e ΙκΒβ. Espera-se que ainibição da degradação de IKBa e ΙκΒβ leve à inibição da expressão de iNOSe COX-2 induzida com LPS.

Considerados em conjunto, estes resultados demonstram quePMFs hidroxiladas apresentam significativas propriedades antiinflamatórias.

8.7. Exemplo 7

Este exemplo demonstra a atividade antiinflamatória de umaPMF hidroxilada exemplar usando um ensaio de expressão de COX-2.

COX-2, uma enzima de importância central na viabiossintética da prostaglandina intracelular, é facilmente regulada-para-cimadurante o curso da inflamação, após estresses celulares, e em resposta afatores de crescimento, promotores de tumor, hormônios, endotoxinasbacterianas e citocinas inflamatórias. Ensaios que monitoram a expressão deCOX-2 são ferramentas reconhecidas na arte para a identificação demoduladores de inflamação.

A expressão de COX-2 induzida com lipopolissacarídeo (LPS)bacteriano foi monitorada em macrófagos RAW264.7, como descritopreviamente. De maneira resumida, a expressão de COX-2 foi determinadaem células não-tratadas e em células tratadas com 100 ng/ml de LPS, seja naausência ou na presença de 20 μΜ 5-hidróxi-3,6,7,8,3',4'-hexametoxiflavona.

Os níveis de mRNA de COX-2 foram determinados por meio de PCR emtempo-real quando os valores obtidos foram relativos à expressão degliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (G3PDH).

A Figura 6 proporciona resultados experimentais quedemonstram que 20 μΜ de S-hidróxi-3,6,7,8,3',4'-hexametoxiflavona inibema expressão de mRNA de COX-2 induzida com LPS em macrófagos. Estesdados exemplificam as atividades antiinflamatórias das composições aquiproporcionadas.

8.8. Exemplo 8

Este exemplo demonstra que PMFs induzem apoptose mediadacom Ca em células de câncer de mama. Os compostos usados, mostrados naTabela 14 abaixo, são referidos nestes exemplo pela denominação numéricaindicada na tabela.

Tabela 14

<table>table see original document page 81</column></row><table>

Elevações sustentadas de Ca2+ intracelular (i) e uma via desinalização dependente de calpaína/caspase-12 mediada com Ca2+ mostraramque levam à apoptose em células de câncer de mama. Ver, p. ex., Reed (2003)Câncer Cell 3:17-22; Sergeev (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun.321:462-467; Sergeev (2005) J. Steroid Biochem. Mol. Biol 97:145-151;Mathiasen et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:3078-30745.

8.8.1. Métodos e Materiais

Ensaio de apoptose. Células MCF-7 foram mantidas eanalisadas como descrito na Seção 8.4 acima. A apoptose foi avaliada pelamembrana de plasma e alterações nucleares como descrito previamente porSergeev (2004) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 89-90:419-425. Em resumo,usou-se um ensaio de Anexina V (ALEXA FLUOR 488 kit de ensaio deAnexina V; Molecular Probes) para a detecção da membrana plasmáticaapoptótica (perda de assimetria da membrana devido à translocação defosfatidilserina). Fluorescência (excitação a 485 nm, emissão de 530 nm) dascélulas marcadas com Anexina V desenvolvidas em placas de 96 poços foimedida em placas de 96 poços foi medida na leitora de placas FLx800 com oprograma KC (BioTek) e expressa em unidades de fluorescência por IxlO3células. Usou-se absorção de iodeto de propídio para avaliar morte celularnão-apoptótica e apoptótica (o corante permeia a membrana plasmática emancha ácidos nucleicos tanto de células necróticas como nas apoptóticastardias). A fluorescência (530 nm de excitação, 620 nm de emissão) dascélulas marcadas com iodeto de propídio também foi medida na leitoraFLx800. Adicionalmente, empregou-se Anexina V ALEXA FLUOR 488 eHOECHST 33342 para visualizar núcleos apoptóticos (fragmentação nuclear)e a membrana plasmática apoptótica, respectivamente. Microscopia defluorescência de células marcadas com Anexina V e HOECHST 33342 foirealizada como descrito abaixo para o diagnóstico por imagem deimunofluorescência e de Ca2+ celular.

Medição do cálcio intracelular. A concentração de Ca2+ livreintracelular (i) foi medida com indicadores de Ca2+ fura-2 e fluo-3, comodescrito previamente de forma detalhada, por exemplo, por Sergeev (2004) J.Steroid Biochem. Mol. Biol. 89-90:419-425. Para medições de i com fluo-3,células desenvolvidas nas placas de 96 poços, de paredes pretas, foramcarregadas com 2 μΜ de fluo-3/ΑΜ (Molecular Probes) em PBS da Dulbecco(D-PBS) suplementado com 0,1% de DMSO durante 40 min a 37°C. Afluorescência (485 nm de excitação, 530 nm de emissão) foi medida na leitorade placas FLx800, como descrito acima. Para medições de i com fura-2,células desenvolvidas sobre tampas de vidro foram carregadas com 1 μΜ defura-2/ΑΜ (Molecular Probes) em D-PBS suplementado com 0,1% de DMSOe 0,01% de Pluronic F-127 durante 40 min a 37°C. A dinâmica do Ca2+intracelular foi avaliada com células na câmara de microincubação (37,0 ±0,2°C) em um microscópio invertido NIKON ECLIPSE TE-300 equipadopara formação de imagem digital, raciométrica, de epifluorescência. Asimagens foram capturadas usando objetiva SUPERFLUOR 40X 1,3 NA deimersão em óleo (Nikon) e câmara CCD digital COOLSNAPFX(Photometrics), dividida numa relação (340/380 nm de excitação, 510 nm deemissão) em base pixel-a-pixel, e armazenadas para análise. A análise deimagem foi realizada usando-se o programa METAFLUOR 6.3 (MolecularDevices/Universal Imaging).

Para avaliar o influxo de Ca2+ a partir do espaço extracelular,mediu-se a taxa de entrada de Mn2+, como um repórter de influxo de Ca2+. Asimagens foram registradas a uma excitação de 360 nm (o ponto isosbéstico defura-2) e 2 mM de Mn2+ extracelular. As taxas de entrada de Ca2+ foramestimadas a partir da inclinação da porção linear das curvas da extinção defluorescência fura-2 por meio de Mn2+. Para avaliar a liberação de Ca2+ dosreservatórios intracelulares, células desenvolvidas sobre tampas de vidroforam colocadas em D-PBS, e o mobilizador dos reservatórios de Ca2+ doretículo endoplasmático, tapsigargina (1 μΜ), foi adicionado após registro doi basal. Os valores de pico do incremento de i, indicando o nível deenchimento dos reservatórios de Ca2+, foram medidos com fura-2.

Ensaios de atividades de calpaína e caspase-12. As atividadesde calpaína e caspase-12 foram medidas com os substratos de peptídiofluorogênicos permeáveis a células t-Boc-Leu-Met-CMAC (50 μΜ; CMAC,7-amino-4-clorometil cumarina; Molecular Probes) e Ala-Thr-Ala-Asp-AFC(50 μΜ; AFC, 7-amino-4-trifluorometil cumarina; kit de ensaio fluorométricode Caspase-12, BioVision), respectivamente. Ver, p. ex., Roser e Gores(2000) Meth. Mol. Biol. 144:2452-2466. Usou-se anticorpos policlonaisdirigidos contra caspase-12 (BioVision) e anticorpos monoclonais dirigidoscontra a subunidade pequena de calpaína (clivada) (Chemicon), para avaliar aativação destas proteases. Para marcação de imunofluorescência, aspreparações de células fixadas e permeabilizadas foram pré-incubadas comsoro não-específico durante 20 min, incubadas durante lha 37°C ou de umdia para o outro a 4°C com os anticorpos primários, e durante 1 h à temperatura ambiente com anticorpos secundários usando-se anticorpos decamundongo de amplificação de sinal ALEXA FLUOR-488 (MolecularProbes) e IgG anti-camundongo e anti-coelho conjugado com FITC ou comvermelho Texas Red (Molecular Probes). A microscopia de fluorescência foirealizada como descrito acima para diagnóstico por imagem com Ca2+.Realizou-se análise por imagem e medição da intensidade de fluorescênciausando o programa MetaMorph 6.3 (Molecular Devices/Universal Imaging),como descrito previamente por Sergeev (1996) Endocrine 5: 335-340.

8.8.2. Resultados

Crescimento celular e apoptose. Compostos 4, 5, 6, e 7 inibiram a proliferação da linhas de células de câncer de mama MCF-7 deuma maneira dependente da dose e dependente do tempo, conforme avaliadopor meio de contagem dos números de células e determinação de um aumentodo teor de ácido nucleico total celular. A Figura 7 apresenta dados de númerosde células, em que os números de células tratadas relativamente a PMFs sãoapresentados como um percentual de células de controle. Os valores de IC5opara inibição da proliferação de células são apresentados na Tabela 15 em quea concentração que inibe o crescimento celular em 50%, IC50, é apresentadacomo a média das determinações do dia 3 e do dia 6. As concentraçõeseficazes mínimas aparentes, ECmin, para indução de morte celular, apoptose, eo aumento de i também são indicados.Tabela 15:

Concentrações eficazes de PMFs em células de câncer de mama MCF-7

<table>table see original document page 85</column></row><table>

Eficácia relativa dos compostos testados para a atividadeantiproliferativa foi classificada como a seguir: 4 > 5 » 6 > 7. Compostosnão-hidroxilados 6 e 7 apresentaram uma atividade antiproliferativa muitobaixa em comparação com compostos hidroxilados 4 e 5. Os compostostestados não exerceram o efeito citotóxico, como é evidente por ausência dealterações nos números de células viáveis após um tratamento de 1 dia (verFigura 8).

Compostos 4 e 5 induziram apoptose em células de câncer demama MCF-7 no dia 3 e 6 do tratamento de uma maneira dependente da dosecomo medido com a sonda fluorescente ALEXA FLUOR 488 Anexina V. VerFigura 8A, B. As concentrações eficazes foram similares àquelas para aatividade antiproliferativa (ver Tabela 15). Composto 6 demonstrou baixaatividade pró-apoptótica em concentrações maiores (de 25 a 100 μΜ) no dia 6do tratamento. O composto 7 apresentou apenas uma tendência de induzirapoptose no dia 6 do tratamento (de 50 a 100 μΜ). Critérios morfológicos(fragmentação nuclear) confirmaram apoptose nas células tratadas comcompostos 4, 5 e 6, como discutido abaixo.

Compostos hidroxilados 4 e 5 induziram a morte de células decâncer de mama MCF-7 como avaliado com o iodeto de propídio. Ver Figura9. A intensidade de fluorescência basal elevada no dia 1 (Figura 9A) indicamaior permeabilidade da membrana plasmática ao iodeto de propídio porparte de células que se recuperam após tripsinização. A morte celular foievidente no dia 6 do tratamento relativo a PMFs. Compostos não-hidroxilados6 e 7 não foram efetivos para induzir morte celular não-apoptótica.Ca2+ intracelular. Os efeitos de PMFs sobre os níveis de Ca2+intracelular em células MCF-7. i foi medido com fluo-3/ΑΜ, como descritoacima. Ver Figura 10. Compostos hidroxilados 4 e 5 induziram um aumentono nível basal de i em células de câncer de mama no dia 3 e 6 do tratamentode uma maneira dependente da dose. Concentrações eficazes foram similaresàquelas para as atividades antiproliferativas e proapoptóticas (ver Tabela 15).

Compostos não-hidroxilados 6 e 7 apresentaram apenas uma tendência detratamento de níveis de Ca intracelular em concentrações maiores (de 50 a100 μΜ) no dia 6 (Figura 10C) de tratamento.

Para investigar o mecanismo de um aumento sustentado de iapós tratamento com PMFs, as taxas do influxo de Ca2+ de fundo do espaçoextracelular e as magnitudes da liberação de Ca2+ dos depósitos do retículoendoplasmático com tapsigargina foram medidas nas células tratadas usando-se métodos descritos acima. Resultados são mostrados na Figura 11.

As Figuras de 1IA até 11D, a concentração para cada PMF foicomo a seguir: composto 4: 6,25 μΜ; composto 5: 12,5 μΜ; composto 6: 25μΜ; e composto 7: 25 μΜ. As respostas de mobilização de Ca2+ apresentadascomo uma média ± SE [n.t.: erro padrão] para a máxima i aumentam após aadição de tapsigargina em células de controle ou células tratadas com PMFsdurante 3 dias (barras pretas) ou 6 dias (barras cinza) são ilustradas no quadroA. O quadro B mostra traços representativos de registros de células simplesdo influxo de Ca para células não tratadas ou tratadas com os compostos. Astaxas de entrada de Ca (C, D) são apresentadas como tangentes das porçõeslineares das curvas de extinção de fura-2. Dados no quadro C sãoapresentados como médias ± SE para células de controle ou células tratadascom PMFs durante 3 dias (barras pretas) ou 6 dias (barras cinza). Quadro Dmostra traços representativos dos registros de células simples da mobilizaçãode Ca2*+ . Adicionou-se Mn2*+ ou tapsigargina após registro do nível basal defluorescência ou i basal durante de 30 a 60 s.A resposta de mobilização de Ca2+ foi significativamentediminuída em células tratadas com compostos hidroxilados 4 e 5 (1,5 vez e1,35 vez, respectivamente), indicando que os compostos testados depletaramdepósitos de Ca intracelular. Figura 11A, Β. A menor resposta demobilização de Ca do composto 4 no dia 6 do tratamento, em comparaçãocom a resposta no dia 3, implica em que os depósitos de Ca2+ foramdepletados cronicamente em momento ulterior. Compostos 6 e 7 não afetaramo enchimento dos depósitos de Ca2+ no retículo endoplasmático.

Compostos não-hidroxilados 6 e 7 não aumentaramsignificativamente o influxo de Ca2+, enquanto que compostos 4 e 5aumentaram marcantemente o influxo de Ca2+ (1,8 vez e 1,6 vez,respectivamente), conforme avaliado pelas taxas de entrada de Ca2+ via oscanais de Ca de baixa condutância. Figura 11C,D. O retorno do i aos níveisbasais após tratamento com tapsigargina foi menor em células tratadas comcompostos 4 e 5 do que em controles e células tratados com compostos 6 e 7(ver Figura 11B). A fase prolongada de "i decrescente" da resposta àtapsigargina em soluções contendo Ca2+ indica entrada de Ca2+, o que éconsistente com a observação de que compostos 4 e 5 aumentam o influxo deCa2+.

Estas verificações indicam que um i elevado nas célulastratadas com compostos hidroxilados 4 e 5 resulta tanto do influxo de Ca2+ doespaço extracelular como da depleção dos depósitos de Ca2+ intracelular.

Calpaína e caspase-12. Um aumento sustentado de i emcélulas MCF-7 tratadas com compostos hidroxilados 4 e 5 foi acompanhadopor meio de ativação das proteases apoptóticas dependentes de Ca2+, μ-calpaína e caspase-12. A ativação da calpaína foi demonstrada por meio declivagem do peptídio fluorogênico e substrato de calpaína t-Boc-Leu-Met(Figura 12 A e Figura 13 A) e a presença da subunidade pequena de calpaínanas células (Figura 13B). A ativação de Caspase-12 em células tratadas comcompostos 4 e 5 foi observada com o substrato de peptídio ATAD (Figura12B e Figura 13C) e demonstrada com os anticorpos monoclonais quereconhecem caspase-12 truncada (Figura 13D). Não se detectou ativaçãosignificativa de calpaína e caspase-12 em células tratadas com compostosnão-hidroxilados 6 e 7, embora o composto 6 demonstrasse uma tendência deaumentar o número de células com calpaína ativada no dia 3 do tratamento[ver Figura 12A,B e Figura 13A,B)· Caspase-12 não foi expressa nas célulasnão-apoptóticas MCF-7 (ver Figura 13C,D).

Estes resultados implicam em que compostos hidroxilados 4 e5 induzem ativação de calpaína e caspase-12 dependente de Ca

Considerados em conjunto, os resultados descritos acimaevidenciam a atividade antiproliferativa e proapoptótica depolimetoxiflavonas em células de câncer de mama. Estes dados corroboramque o aumento sustentado de i induzido com PMF está associado com aindução de apoptose nestas células, e implicam em que a indução de apoptosecom PMFs requer a ativação da μ-calpaína dependente de Ca e da caspase-12 dependente de Ca /calpaína. Além disso, os resultados indicam quehidroxilações de PMFs são críticas para aumentar sua atividade pro-apoptótica.

8.9. Exemplo 9

Este exemplo proporciona um processo de fabricaçãoexemplar para a preparação de uma composição enriquecida com PMFshidroxiladas.

Tratamento com hidrólise ácida. Extrato de casca de laranja(OPE) (50 g) contendo uma fração de 30% de PMF foi dissolvido em 95% deetanol (50 ml) em um frasco de fundo redondo e volume de 500 ml.

Adicionou-se no mesmo HCl 6 N (50 ml) enquanto se agitavacuidadosamente. Após 5 minutos, o frasco foi colocada em um banho de óleoa 105°C e a amostra de OPE foi refluxada durante 18 h.Neutralização. Após a OPE hidrolisada com ácido (AH-OPE)ter resfriado à temperatura ambiente, o volume de AH-OPE foi reduzido emum rotor evaporador com um banho de água ajustado em 50°C. Após nãohaver mais condensação de líquido do condensador, AH-OPE foi neutralizadacom NaOH 3N. O pH final foi em torno de 6 como testado com papelindicador de pH. Adicionou-se água (50 ml) à AH-OPE antes de umaextração sucessiva com solventes.

Extrações com solvente:

1. Extração com hexanos. Adicionou-se hexanos (50 ml) aAH-OPE aquosa e isto foi misturado, e a mistura foi despejada em um funilde separação. Camadas líquidas contendo a fração de hexanos (AH-OPE-Hx)e fração aquosa de AH-OPE foram separadas e coletadas. Este processo foirepetido três vezes. Guardou-se para análise uma amostra das fraçõescombinadas de hexanos, AH-OPE-Hx, e o restante de AH-OPE-Hx foidescartado. Usou-se a fração aquosa de AH-OPE na etapa de extraçãoseguinte.

2. Extração com acetato de etila. Após extração comhexanos, adicionou-se 50 ml de acetato de etila à AH-OPE e isto foimisturado. Repetiu-se o mesmo procedimento como mencionado acimausando acetato de etila em lugar de hexanos, e coletou-se separadamente umafração de acetato de etila (AH-OPE-Ea) e uma fração aquosa.

Realizou-se análise das frações de ΟΡΕ, AH-OPE-Hx e AH-OPE-Ea para polimetoxiflavonas (PMFs) e polimetoxiflavonas hidroxiladas(OH-PMFs) como explicado abaixo. Resultados:

As frações de ΟΡΕ, AH-OPE-Hx e AH-OPE-Ea descritasacima foram submetidas a HPLC de acordo com um protocolo similar àqueledescrito no Exemplo 2, acima, usando-se absorbância de UV a 280 nm paraavaliar as concentrações relativas de PMFs e OH-PMFs nas frações. Oscromatogramas mostrados na Figura 15 correspondem àqueles da OPE(Figura 15A), AH-OPE-Hx (Figura 15B), e AH-OPE-Ea (Figura 15B). Picosnumerados de 1 a 11 nos cromatogramas mostrados na Figura 15 A-Ccorrespondem às seguintes OH-PMFs e PMFs mostradas na Tabela 16.

Tabela 16

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Para cada cromatograma mostrado na Figura 15, 15 μl deamostra foram carregados, em que as concentrações das frações foram como aseguir: ΟΡΕ, 12,85 mg/ml; AH-OPE-Hx, 25,40 mg/ml; AH-OPE-Ea, 11,20mg/ml. Como mostrado na Figura 15A, o material de partida de OPEapresentou um componente relativamente grande de PMF não-hidroxilada(picos de 7 a 11) em comparação com o componente hidroxilado (picos de 1 a6). O método de acidificar e extrair o material de partida descrito acima foimuito efetivo para produzir uma fração enriquecida com PMF hidroxilada(picos de 1 a 6 em AH-OPE-Ea, Figura 15C), com relativamente pouca perdadurante a remoção de não-PMFs (AH-OPE-Hx, Figura 15B).

Todas as publicações, patentes e pedidos de patentesmencionados nesta descrição são incorporados aqui por referência nadescrição, no mesmo grau como se cada publicação, patente ou pedido depatente individual houvesse sido indicado especificamente e individualmentecomo incorporado aqui por referência. A citação ou discussão de umareferência aqui não deve ser interpretada como uma admissão de que é arteanterior para a presente invenção.

Embora a invenção tenha sido descrita em termos de váriasconcretizações preferidas, a pessoa versada na arte perceberá que é possívelrealizar várias modificações, substituições, omissões, e alterações sem afastar-se do espírito da invenção. Assim, pretende-se que o escopo da presenteinvenção seja limitado apenas pelo escopo das reivindicações a seguir,incluindo seus equivalentes.

Claims (54)

1. Composição de extrato de planta, caracterizada pelo fato decompreender uma fração de polimetoxiflavona (PMF) tendo entre 15%(peso/peso) a cerca de 95% (peso/peso) de uma ou mais PMFs hidroxiladas.

2. Composição de extrato de planta de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a fração de PMF compreendeentre cerca de 50% (peso/peso) a cerca de 95% (peso/peso) de uma ou maisPMFs hidroxiladas.

3. Composição de extrato de planta de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a fração de PMF compreendeentre cerca de 50% (peso/peso) a cerca de 90% (peso/peso) de uma ou maisPMFs hidroxiladas.

4. Composição de extrato de planta de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a fração de PMF compreendeentre cerca de 50% (peso/peso) a cerca de 85% (peso/peso) de uma ou maisPMFs hidroxiladas.

5. Composição de extrato de planta de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a fração de PMF aindacompreende uma ou mais PMFs não hidroxiladas.

6. Composição de extrato de planta de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que uma ou mais PMFshidroxiladas consistem de PMFs hidroxiladas selecionados dentre as listadasna tabela 1.

7. Composição, caracterizada pelo fato de compreender entrepelo menos 15% (peso/peso) a cerca de 95% (peso/peso) polimetoxiflavonashidroxiladas (PMFs).

8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizadapelo fato de ser uma composição de extrato de planta.

9. Composição de extrato de planta de acordo com areivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a composição compreendeentre cerca de 20% (peso/peso) a cerca de 90% (peso/peso) de PMFshidroxiladas.

10. Composição de extrato de planta de acordo com areivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a composição compreendeentre cerca de 40% (peso/peso) a cerca de 85% (peso/peso) de PMFshidroxiladas.

11. Composição de extrato de planta de acordo com areivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a composição de extrato deplanta é um extrato de casca de laranja.

12. Composição de extrato de planta de acordo com areivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a composição de extrato deplanta é um suplemento dietético, aditivo alimentício ou nutracêutico.

13. Composição de extrato de planta de acordo com areivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a composição de extrato deplanta é uma composição cosmética.

14. Composição de extrato de planta de acordo com areivindicação 11, caracterizada pelo fato de que as PMFs hidroxiladascompreendem pelo menos duas PMFs hidroxiladas selecionadas dentre ogrupo consistindo de- 3 -hidróxi-5,6,7,4'-tetrametoxiflavona,- 3-hidróxi-5,6,7,8,4'-pentametoxiflavona,- 3- hidróxi-5 6,7,8,3',4'- hexametoxiflavona>- 5-hidróxi-3,6,7,3',4'-pentametoxiflavona- 5-hidróxi-3,6,7,8,3',4'-hexametoxiflavona,- 5-hidróxi-3,7,8,3',4'-pentametoxiflavona,- 5-hidróxi-3,7,3',4'-tetrametoxiflavona,- 5-hidróxi-6,7,8,3',4'-pentametoxiflavona,- 5 -hidróxi-6,7,8,3' ,4', 5 '-hexametoxiflavona,-5-hidróxi-6,7,8,4'-tetrametoxiflavona,-5-hidróxi-6,7,3',4'-tetrametoxiflavona-5-hidróxi-6,7,4'-trimetoxiflavona-5,3'-di-hidróxi-6,7,8,4'-tetrametoxiflavona,-5-hidróxi-7,8,3',4'-tetrametoxiflavona,-5,7-di-hidróxi-6,8,3',4'-tetrametoxiflavona,-7-hidróxi-3,5,6,8,3 ',4'-hexametoxiflavona,-7-hidróxi-3,5,6,3',4'-pentametoxiflavona,-3'-hidróxi-5,6,7,4'-tetrametoxiflavona,-3'-hidróxi-5,6,7,8,4'-pentametoxiflavona-3,,4'-di-hidróxi-5,6,7,8-tetrametoxiflavona, e-4,-hidróxi-5,6,7,8,3'-pentametoxiflavona.

15. Composição de extrato de planta de acordo com areivindicação 11, caracterizada pelo fato de que as PMFs hidroxiladasconsistem essencialmente de duas PMFs hidroxiladas selecionadas dentre ogrupo consistindo das relacionadas na tabela 1.

16. Composição de extrato de planta de acordo com areivindicação 15, caracterizada pelo fato de que pelo menos duas PMFshidroxiladas são 3'-hidróxi-5,6,7,4'-tetrametoxiflavona e 5-hidróxi--3,6,7,8,3 ',4'-hexametoxiflavona.

17. Composição de extrato de planta de acordo com areivindicação 11, caracterizada pelo fato de que as PMFs hidroxiladascompreendem pelo menos três PMFs hidroxiladas selecionadas dentre ogrupo consistindo das relacionadas na tabela 1.

18. Composição de extrato de planta de acordo com areivindicação 11, caracterizada pelo fato de que as PMFs hidroxiladascompreendem pelo menos quatro PMFs hidroxiladas selecionadas dentre ogrupo consistindo das relacionadas na tabela 1.

19. Composição de extrato de planta de acordo com areivindicação 11, caracterizada pelo fato de que as PMFs hidroxiladascompreendem pelo menos cinco PMFs hidroxiladas selecionadas dentre ogrupo consistindo das relacionadas na tabela 1.

20. Composição de extrato de planta de acordo com areivindicação 11, caracterizada pelo fato de que as PMFs hidroxiladascompreendem pelo menos seis PMFs hidroxiladas selecionadas dentre ogrupo consistindo das relacionadas na tabela 1.

21. Composição de extrato de planta de acordo com areivindicação 9, caracterizada pelo fato de ainda compreender um membroselecionado dentre o grupo consistindo 5-hidróxi-6,7,8,3',4'-pentametoxiflavanona, 2'-hidróxi-3,4,4',5',6,-pentametoxicalcona e 2'-hidróxi--3,4,3,,4',5',6'-pentametoxicalcona.

22. Processo para aumentar a proporção de PMFs hidroxiladaspara PMFs não hidroxiladas em um extrato de planta, o processocaracterizado pelo fato de compreendera) adicionar ácido a um extrato de planta compreendendo cercade 10% (peso/peso) a cerca de 75% (peso/peso) PMFs; eb) aquecer o extrato de planta acidificado na etapa (a) a cercade 40°C a cerca de 150°C durante cerca de 4 horas a cerca de 36 horas.

23. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que o extrato de planta é um extrato de casca de laranja doce,CAS Reg. No. 068917-06-6.

24. Processo para preparar o extrato de planta como definidona reivindicação 9, o processo caracterizado pelo fato de compreendera) adicionar um ácido a um extrato de casca de laranjacompreendendo cerca de 20% a cerca de 75% PMFs, em que as PMFs nãohidroxiladas estão em uma maior abundância com relação às PMFshidrolisadas no extrato de casca de laranja; eb) aquecer o extrato de planta acidificado na etapa (a) a cercade 40°C a cerca de 150°C durante cerca de 4 horas a cerca de 36 horas.

25. Processo de acordo com a reivindicação 22 ou 24,caracterizado pelo fato o extrato de planta acidificado é aquecido na etapa (b)a cerca de 85 0C a cerca de IOO0C durante cerca de 6 horas a cerca de 16horas.

26. Processo de acordo com a reivindicação 22 ou 24,caracterizado pelo fato de que o extrato é acidificado em um solventeorgânico.

27. Processo de acordo com a reivindicação 22 ou 24,caracterizado pelo fato de que o extrato de planta acidificado é aquecido acerca de IOO0C durante cerca de 12 horas.

28. Processo de acordo com a reivindicação 22 ou 24,caracterizado pelo fato de que o extrato é acidificado com cerca de 1 N acerca de 6 N HCl.

29. Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de ainda compreenderc) extrair uma solução aquosa compreendendo o produto daetapa (b) com hexanos para obter uma solução aquosa tratada com hexanos.

30. Processo de acordo com a reivindicação 29, aindacaracterizado pelo fato de compreenderd) extrair a solução aquosa tratada com hexanos da etapa (C)com acetato de etila para obter uma fração solúvel em acetato de etila.

31. Processo de acordo com a reivindicação 30, aindacaracterizado pelo fato de compreendere) secar o produto após a etapa (d).

32. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações22-31, caracterizado pelo fato de o produto compreender cerca de 40% acerca de 85% de PMFs hidroxiladas.

33. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações- 22-31, caracterizado pelo fato de que o produto produzido é um suplementodietético, aditivo alimentício ou nutracêutico.

34. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações- 22-31, caracterizado pelo fato de o produto produzido é uma composiçãocosmética.

35. Uso de uma PMF hidroxilada, caracterizado pelo fato deser na fabricação de um medicamento para inibir a proliferação de uma célulacancerosa em um mamífero em necessidade do mesmo.

36. Uso de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelofato de o medicamento compreender cerca de 150 a cerca de 10 mg/kgda PMF hidroxilada em uma forma de dosagem unitária para administraçãoao mamífero.

37. Uso de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelofato de a PMF hidroxilada é selecionada dentre o grupo consistindo dasrelacionadas na tabela 1.

38. Uso de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelofato de que a PMF hidroxilada é selecionada dentre o grupo consistindo de 5-hidróxi-3,6,7,8,3',4'-hexametoxiflavona; 5,3'-di-hidróxi-6,7,8,4'-tetrametoxi-flavona; 3'-hidróxi-5,6,7,4'-tetrametoxiflavona; e 4'- hidróxi-5,6,7,8,3'-pentametoxiflavona.

39. Uso de uma composição como definida em qualquer umadas reivindicações 1-7, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de ummedicamento para inibir a proliferação de uma célula cancerosa em ummamífero em necessidade do mesmo.

40. Uso de uma PMF hidroxilada, caracterizado pelo fato deser na fabricação de um medicamento para induzir apoptose em uma célulacancerosa em um mamífero em necessidade do mesmo.

41. Uso de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelofato de cerca de 150 μg/kg a cerca de 10 mg/kg da PMF hidroxilada seradministrado ao mamífero.

42. Uso de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelofato de que a PMF hidroxilada é selecionada dentre o grupo consistindo de 5-hidróxi-3,6,7,8,3',4'-hexametoxiflavona; 5,3'-di-hidróxi-5,6,7,4'-tetrametoxiflavona; 3'-hidróxi-5,6,7,8-tetrametoxiflavona; e 4'-hidróxi--5,6,7,8,3 '-pentametoxiflavona.

43. Uso de uma composição como definida em qualquer umadas reivindicações 1 -7, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de ummedicamento para induzir apoptose em uma célula cancerosa em ummamífero em necessidade do mesmo.

44. Uso de uma PMF hidroxilada, caracterizado pelo fato deser na fabricação de um medicamento para reduzir a severidade de umaresposta inflamatória em um mamífero em necessidade do mesmo.

45. Uso de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelofato de cerca de 150 a cerca de 10 mg/kg da PMF hidroxilada sãoadministrados ao mamífero.

46. Uso de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelofato de a PMF hidroxilada é selecionada dentre o grupo consistindo de 5-hidróxi-3,6,7,8,3',4'-hexametoxiflavona; 5,3'-di-hidróxi- 3'-hidróxi-5,6,7,4'-tetrametoxiflavona; 3',4'-di-hidróxi-5,6,7,8-tetrametoxiflavona; 3'-hidróxi--5,6,7,8,4'- pentametoxiflavona; 3-hidróxi-5,6,7,8.3'>4'-hexametoxiflavona e-4'-hidróxi- 5,6,7,8,3 '-pentametoxiflavona.

47. Uso de uma composição como definida em qualquer umadas reivindicações 1 -7, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de ummedicamento para reduzir a severidade de uma resposta inflamatória em ummamífero em necessidade do mesmo.

48. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 33--47, caracterizado pelo fato de o mamífero ser um humano.

49. Método para inibir a proliferação de uma célula cancerosa,caracterizado pelo fato de compreender contatar a célula cancerosa com umacomposição como definida em qualquer uma das reivindicações 1-7 ou umcomposto selecionado dentre os relacionados na tabela I, em que a célulacancerosa é contatada in vitro ou em um animal não humano.

50. Método para induzir apoptose em uma célula cancerosa,caracterizado pelo fato de compreender contatar uma célula cancerosa comuma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1-7 ouum composto selecionado dentre os relacionados na tabela 1, em que a célulacancerosa é contatada in vitro ou em um animal não humano.

51. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 35--43, caracterizado pelo fato a célula cancerosa é uma célula cancerosa decólon, uma célula cancerosa de mama, uma célula de leucemia ou uma célulacancerosa gástrica.

52. Método para reduzir a produção de nitrito em ummacrófago, caracterizado pelo fato de que compreende contatar o macrófagocom uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1-7ou um composto selecionado dentre os relacionados na tabela I sob condiçõesque poderiam provavelmente aumentar a produção de nitrito no macrófago naausência da composição ou composto, em que o macrófago é contatado invitro ou em um animal não humano.

53. Método para inibir a ativação de iNOS e/ou COX-2 em ummacrófago, caracterizado pelo fato de compreende contatar o macrófago comuma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1-7 ouum composto selecionado dentre os relacionados na tabela I sob condiçõesapropriadas para inibir a ativação de iNOS e/ou COX-2, em que o macrófagoé contatado in vitro ou em um animal não humano.

54. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizadopelo fato de que o composto ou composição aumenta a atividade de calpaínaintracelular e/ou caspase-12 intracelular.