BRPI0708895A2 - uso de variante de junção de grelina para tratar caquexia e/ou anorexia e/ou anorexia-caquexia e/ou subnutrição e/ou lipodistrofia e/ou atrofia muscular e/ou estimulação do apetite - Google Patents

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Abstract

USO DE VARIANTE DE JUNçãO DE GRELINA PARA TRATAR CAQUEXIA E/OU ANOREXIA E/OU ANOREXIA-CAQUEXIA E/OU SUBNUTRIçãO E/OU LIPODISTROFIA E/OU ATROFIA MUSCULAR E/OU ESTIMULAçãO DO APETITE. A presente descrição refere-se, em um aspecto, ao uso de variante de junção de grelina ou um análogo da mesma para a preparação de um medicamento para um ou mais de: tratamento e/ou prevenção de perda de peso corporal e gordura corporal, profilaxia ou tratamento de caquexia, estimulação do apetite, estimulação da ingestão de alimento, estimulação de ganho de peso, ou aumentar a massa de gordura corporal, ou aumentar a massa magra corporal. Outro aspecto refere-se ao uso de um composto similar a variante de junção de grelina para a preparação de um medicamento para a profilaxia ou o tratamento de caquexia por câncer em um indivíduo que necessite de similar tratamento. Outro aspecto refere-se ao uso de um composto similar a variante de junção de grelina para a preparação de um medicamento para profilaxia ou tratamento de caquexia em um indivíduo administrando uma dosagem subcutânea do referido medicamento ao indivíduo. Um aspecto adicional refere-se ao uso de um composto similar a variante de junção de grelina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para a preparação de um medicamento para estimulação do apetite em um indivíduo administrando uma dosagem subcutânea do referido medicamento ao indivíduo. Um aspecto adicional refere-se a uma série de novos compostos similares a variante de junção de grelina e usos dos mesmos, bem como a composições farmacêuticas e embalagem medicinal compreendendo os novos compostos similares a variante de junção de grelina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DEVARIANTE DE JUNÇÃO DE GRELINA PARA TRATAR CAQUEXIA E/OUANOREXIA E/OU ANOREXIA-CAQUEXIA E/OU SUBNUTRIÇÃO E/OULIPODISTROFIA E/OU ATROFIA MUSCULAR E/OU ESTIMULAÇÃO DOAPETITE".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO
Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. No.60/781.860, depositado em 13 de março de 2006, incorporado aqui, pormeio de referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente descrição se refere a compostos para tratar ou pre-venir caquexia e/ou Iipodistrofia e/ou atrofia muscular e condições relaciona-das com as mesmas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Grelina é um peptídeo bioativo que induz consumo de alimento,ganho de peso corporal, e adiposidade em roedores (Tschop M. et aí., Natu-re 407:908-13 (2000); Wren A.M. et al., Diabetes 50:2540-47 (2001)). A ad-ministração aguda de grelina induz consumo de alimento em homens e mu-lheres saudáveis (Wren A.M. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 86:5992-95(2001); Druce M.R. et al., Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 29:1130-36(2005)) bem como em pacientes com câncer com anorexia (Neary N.M. etal., J. Clin. Endocrinol. Metab. 89:2832-36 (2004)). A administração repetidade grelina aumenta a massa magra corporal, o peso corporal e o consumode alimento em pacientes caquéticos com Doença Pulmonar Obstrutiva Crô-nica (COPD) (Nagaya N. et al., Chest 128:1187-93 (2005)) e atrofia muscularaprimorada em pacientes com falência cardíaca crônica (Nagaya N. et al.,Circulation 110:3674-79 (2004)). Um efeito similar também foi demonstradoem um modelo de camundongo (Hanada T. et al., Biochem. Biophys. Res.Commun. 301:275-79 (2003)).
O crescimento tumoral está associado com profundas alteraçõesmetabólicas e neuroquímicas, as quais podem levar ao início da síndromede anorexia-caquexia. Anorexia é definida como a perda do desejo de co-mer, ao passo que caquexia resulta de atrofia progressiva da massa muscu-lar esquelética e a uma menor extensão de tecido adiposo, ocorrendo mes-mo antes da perda de peso se tornar aparente. A síndrome de anorexia-caquexia do câncer é altamente prevalente entre pacientes com câncer, temum grande impacto sobre a morbidez e a mortalidade, e afeta a qualidade devida do paciente. No entanto, sua relevância clínica é freqüentemente des-prezada, e geralmente somente são tentados tratamentos durante estágiosavançados da doença (Laviano A. et ai, Nat. Clin. Pract. Oncol. 3:158-65(2005)).
Grelina é secretada na situação pré-refeição se iniciando 1 a 2horas antes da refeição resultando em um pico agudo de vida curta nos ní-veis plasmáticos de grelina antes da refeição e durante um curto tempo de-pois do início da refeição. Como a grelina é a única substância orexigênica(estimuladora do apetite) produzida perifericamente conhecida, acredita-seque o aumento nos níveis plasmáticos de grelina é crucial para a iniciaçãoda refeição.
Em seu papel como um iniciador chave do apetite, a grelina, li-berada pelas células endócrinas na mucosa do trato gastrointestinal (Gl),pode agir tanto localmente como uma substância parácrina quanto central-mente como um hormônio, conforme discutido infra na seção relacionadacom caquexia por câncer.
O gene GHRL (grelina) codifica uma variedade de produtos re-sultantes de transcriptos alternativamente unidos, vários tipos de clivagemdo prepropeptídeo, e várias modificações pós-translacionais (Kojima M. &Kangawa M., Physiol. Rev. 85:495-522 (2005); Zhang J.V. et ai, Science310:996-99 (2005)). ALém disso, diferentes produtos de degradação sãoproduzidos por vários tecidos (De Vriese C. et a!., Endocrinology 145:4997-5005 (2004)). Alguns destes produtos de GHRL são descritos aqui.
Grelina é um peptídeo de 28 aminoácidos portando uma cadeia lateral n-octanoíla na terceira serina, resultante da clivagem de sinal e pro-peptídeo da preprogrelina de 117 aminoácidos e um evento de acilação. ON-término acilado de grelina é essencial para as funções endócrinas (KojimaΜ. et ai, Nature 402:656-60 (1999); Bednarek M.A. et al., J. Med. Chem.43:4370-76 (2000)). Des-acil grelina, a qual carece das funções endócrinas,foi demonstrado que tem um efeito antagonista ao da grelina sobre a produ-ção de glicose in vitro (Gauna C. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 89:5035-42 (2004)). Um mRNA de grelina alternativamente unido codifica um prepro-peptídeo de 116 aminoácidos que é adicionalmente processado para umaDes-Glnl4-grelina e um peptídeo processado de 27 aminoácidos (Hosoda H.et ai, J Biol. Chem. 275:21995-22000 (2000)). Outro peptídeo, Obestatin1 éclivado a partir da preprogrelina e não tem nenhuma sobreposição de se-qüência com peptídeo de grelina processado. Foi demonstrado que estepeptídeo tem efeito antagonista à grelina acilada, inibindo o consumo de ali-mento e o ganho de peso corporal (Zhang J.V. et al., Science 310:996-99(2005)). Ainda outro peptídeo, o C-término de 66 aminoácidos da preprogre-lina, também pode ser funcional (Pemberton C. et al., Biochem. Biophys.Res. Comm. 310:567-73 (2003)). Uma variedade de isoformas, inclusive iso-formas codificadas por diferentes variantes de junção, são conhecidas poroutras proteínas, por exemplo, para fator de crescimento endotelial vascular(VEGF), onde diferentes isoformas compartilham funções como angiogêne-se, enquanto diferindo em algumas outras características, tais como afinida-de de ligação (Neufeld G. et al., FASEB J. 13:9-22 1999). Portanto, a varie-dade de produtos do gene GHRL pode refletir um controle similarmentecomplexo da ação endócrina e parácrina das isoformas de grelina.
Previamente, foi demonstrado que a administração de grelinapor infusões contínuas de doses de 5 pmol/kg/min por 270 minutos aumentao consumo de alimento em seres humanos saudáveis (Wren A.M. et al., J.Clin. Endocrinol. Metab. 86:5992-95 (2001)). Também foi demonstrado que ainfusão de grelina por 90 minutos pode aumentar o consumo de alimento por30% em pacientes com caquexia por câncer (Abstract P09, Digestive Hor-mones, Appetite and Energy Balance, Baylis and Starling meeting, London,June 2003). Recentemente, foi demonstrado que injeção subcutânea de 3,6nmol/kg de grelina acilada antes de uma refeição, deste modo assegurandoum aumento do consumo de energia por 27%, mímico próximo da situaçãopré-refeição natural. Também parece que a grelina reforça a palatabilidadepercebida do alimento oferecido (Druce M.R. et al., Int. J. Obes. Relat. Me-tab. Disord. 29:1130-36 (2005)).
Estes estudos demonstram que a administração parenteral degrelina pode aumentar do apetite tanto sobre sujeitos normais quanto empacientes com perda de apetite. Além disso, a requerente verificou que épossível obter um efeito significativo de ganho de peso corporal e um signifi-cativo aumento no consumo de alimentos com uma nova variante de junçãode grelina (vide o Pedido de Patente U.S. publicado copendente co- proprietário No. 2005/0059015, incorporado aqui, por meio de referência)quando administrada a um sujeito, em particular quando administrada por viasubcutânea antes de uma refeição, deste modo assegurando um mímicopróximo da situação pré-refeição natural. O efeito da nova variante de junçãode grelina da Requerente sobre o ganho de peso é essencialmente sobre a massa magra ao passo que o efeito da grelina sobre o ganho de peso é es-sencialmente sobre a massa de gordura.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Um aspecto é um composto similar a variante de junção de gre-lina tendo a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcionalmente presente; cada X1 é de modo independente selecionado en-tre um aminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético; X2 éselecionado entre um aminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácidosintético, o referido aminoácido sendo modificado com um grupo hidrofóbicovolumoso; cada X3 é de modo independente selecionado entre um aminoá-cido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, em que um ou maisde X1 e X3 opcionalmente podem ser modificados com um grupo hidrofóbicovolumoso; Z2 é um grupo protetor opcionalmente presente; m é um númerointeiro na faixa de a partir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a par-tir de 4 a 92; contanto que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1)m- (X2)-(X3)n-Z2 tenha 15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo80% de homologia com a SEQ ID NO: 1.
Outro aspecto é uma composição farmacêutica compreendendoo composto similar a variante de junção de grelina tendo a fórmula Z1-(X1 )m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcionalmente presen-te; cada X1 é de modo independente selecionado entre um aminoácido queocorre naturalmente e um aminoácido sintético; X2 é selecionado entre umaminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, o referidoaminoácido sendo modificado com um grupo hidrofóbico volumoso; cada X3é de modo independente selecionado entre um aminoácido que ocorre natu-ralmente e um aminoácido sintético, em que um ou mais de X1 e X3 opcio-nalmente podem ser modificados com um grupo hidrofóbico volumoso; Z2 éum grupo protetor opcionalmente presente; m é um número inteiro na faixade a partir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a partir de 4 a 92;contanto que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2tenha 15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo 80% de homolo-gia com a SEQ ID NO: 1.
Um aspecto adicional é um método para tratar caquexia com-preendendo administrar a um mamífero que necessite do mesmo uma quan-tidade farmaceuticamente aceitável de (a) variante de junção de grelina; (b)um composto similar a variante de junção de grelina tendo a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcionalmente presen-te; cada X1 é de modo independente selecionado entre um aminoácido queocorre naturalmente e um aminoácido sintético; X2 é selecionado entre umaminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, o referidoaminoácido sendo modificado com um grupo hidrofóbico volumoso; cada X3é de modo independente selecionado entre um aminoácido que ocorre natu-ralmente e um aminoácido sintético, em que um ou mais de X1 e X3 opcio-nalmente podem ser modificados com um grupo hidrofóbico volumoso; Z2 éum grupo protetor opcionalmente presente; m é um número inteiro na faixade a partir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a partir de 4 a 92;contanto que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2tenha 15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo 80% de homolo-gia com a SEQ ID NO: 1; ou (c) uma mistura dos mesmos.
Um aspecto adicional é um método para prevenir caquexiacompreendendo administrar a um mamífero que necessite do mesmo umaquantidade farmaceuticamente aceitável de (a) variante de junção de grelina;(b) um composto similar a variante de junção de grelina tendo a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcionalmente presen-te; cada X1 é de modo independente selecionado entre um aminoácido queocorre naturalmente e um aminoácido sintético; X2 é selecionado entre umaminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, o referidoaminoácido sendo modificado com um grupo hidrofóbico volumoso; cada X3é de modo independente selecionado entre um aminoácido que ocorre natu-ralmente e um aminoácido sintético, em que um ou mais de X1 e X3 opcio-nalmente podem ser modificados com um grupo hidrofóbico volumoso; Z2 éum grupo protetor opcionalmente presente; m é um número inteiro na faixade a partir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a partir de 4 a 92;contanto que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2tenha 15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo 80% de homolo-gia com a SEQ ID NO: 1; ou (c) uma mistura dos mesmos.
Um aspecto adicional é um método para a estimulação do apeti-te, consumo de alimento, e/ou ganho de peso compreendendo administrar aum mamífero que necessite do mesmo uma quantidade farmaceuticamenteaceitável de (a) variante de junção de grelina; (b) um composto similar a va-riante de junção de grelina tendo a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em queZ1 é um grupo protetor opcionalmente presente; cada X1 é de modo inde-pendente selecionado entre um aminoácido que ocorre naturalmente e umaminoácido sintético; X2 é selecionado entre um aminoácido que ocorre na-turalmente e um aminoácido sintético, o referido aminoácido sendo modifi-cado com um grupo hidrofóbico volumoso; cada X3 é de modo independenteselecionado entre um aminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácidosintético, em que um ou mais de X1 e X3 opcionalmente podem ser modifi-cados com um grupo hidrofóbico volumoso; Z2 é um grupo protetor opcio-nalmente presente; m é um número inteiro na faixa de a partir de 1 a 10; η éum número inteiro na faixa de a partir de 4 a 92; contanto que o composto deacordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 tenha 15 a 94 aminoácidosde extensão e tenha no mínimo 80% de homologia com a SEQ ID NO: 1; ou(c) uma mistura dos mesmos.
Outro aspecto é um método para tratar Iipodistrofia compreen-dendo administrar a um mamífero que necessite do mesmo uma quantidadefarmaceuticamente aceitável de (a) variante de junção de grelina; (b) umcomposto similar a variante de junção de grelina tendo a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcionalmente presente; cadaX1 é de modo independente selecionado entre um aminoácido que ocorrenaturalmente e um aminoácido sintético; X2 é selecionado entre um aminoá-cido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, o referido aminoá-cido sendo modificado com um grupo hidrofóbico volumoso; cada X3 é demodo independente selecionado entre um aminoácido que ocorre natural-mente e um aminoácido sintético, em que um ou mais de X1 e X3 opcional-mente podem ser modificados com um grupo hidrofóbico volumoso; Z2 é umgrupo protetor opcionalmente presente; m é um número inteiro na faixa de apartir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a partir de 4 a 92; contan-to que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 tenha15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo 80% de homologia coma SEQ ID NO: 1; ou (c) uma mistura dos mesmos.
Um aspecto adicional é um método para prevenir Iipodistrofiacompreendendo administrar a um mamífero que necessite do mesmo umaquantidade farmaceuticamente aceitável de (a) variante de junção de grelina;(b) um composto similar a variante de junção de grelina tendo a fórmula Z1-(X1 )m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcionalmente presen-te; cada X1 é de modo independente selecionado entre um aminoácido queocorre naturalmente e um aminoácido sintético; X2 é selecionado entre umaminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, o referidoaminoácido sendo modificado com um grupo hidrofóbico volumoso; cada X3é de modo independente selecionado entre um aminoácido que ocorre natu-ralmente e um aminoácido sintético, em que um ou mais de X1 e X3 opcio-nalmente podem ser modificados com um grupo hidrofóbico volumoso; Z2 éum grupo protetor opcionalmente presente; m é um número inteiro na faixade a partir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a partir de 4 a 92;contanto que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2tenha 15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo 80% de homolo-gia com a SEQ ID NO: 1; ou (c) uma mistura dos mesmos.
Outro aspecto é um método para tratar atrofia muscular com-preendendo administrar a um mamífero que necessite do mesmo uma quan-tidade farmaceuticamente aceitável de (a) variante de junção de grelina; (b)um composto similar a variante de junção de grelina tendo a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcionalmente presen-te; cada X1 é de modo independente selecionado entre um aminoácido queocorre naturalmente e um aminoácido sintético; X2 é selecionado entre umaminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, o referidoaminoácido sendo modificado com um grupo hidrofóbico volumoso; cada X3é de modo independente selecionado entre um aminoácido que ocorre natu-ralmente e um aminoácido sintético, em que um ou mais de X1 e X3 opcio-nalmente podem ser modificados com um grupo hidrofóbico volumoso; Z2 éum grupo protetor opcionalmente presente; m é um número inteiro na faixade a partir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a partir de 4 a 92;contanto que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2tenha 15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo 80% de homolo-gia com a SEQ ID NO: 1; ou (c) uma mistura dos mesmos.
Um aspecto adicional é um método para prevenir atrofia muscu-lar compreendendo administrar a um mamífero que necessite do mesmouma quantidade farmaceuticamente aceitável de (a) variante de junção degrelina; (b) um composto similar a variante de junção de grelina tendo a fór-mula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcionalmen-te presente; cada X1 é de modo independente selecionado entre um amino-ácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético; X2 é selecionadoentre um aminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, oreferido aminoácido sendo modificado com um grupo hidrofóbico volumoso;cada X3 é de modo independente selecionado entre um aminoácido que o-corre naturalmente e um aminoácido sintético, em que um ou mais de X1 eΧ3 opcionalmente podem ser modificados com um grupo hidrofóbico volu-moso; Z2 é um grupo protetor opcionalmente presente; m é um número intei-ro na faixa de a partir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a partir de4 a 92; contanto que o composto de acordo com a fórmula Ζ1 -(X1 )m-(X2)-(X3)n-Z2 tenha 15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo 80% dehomologia com a SEQ ID NO: 1; ou (c) uma mistura dos mesmos.
Um aspecto adicional é um método para tratar caquexia e/ouanorexia e/ou anorexia-caquexia e/ou subnutrição e/ou Iipodistrofia e/ou es-timulatção do apetite compreendendo administrar a um mamífero que ne-cessite do mesmo uma quantidade farmaceuticamente aceitável de um se-cretagogo compreendendo (a) variante de junção de grelina; (b) um compos-to similar a variante de junção de grelina tendo a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcionalmente presente: cadaX1__é de modo independente selecionado entre um aminoácido que ocorre natu-ralmente e um aminoácido sintético; X2 é selecionado entre um aminoácidoque ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, o referido aminoácidosendo modificado com um grupo hidrofóbico volumoso; cada X3 é de modoindependente selecionado entre um aminoácido que ocorre naturalmente eum aminoácido sintético, em que um ou mais de X1 e X3 opcionalmente po-dem ser modificados com um grupo hidrofóbico volumoso; Z2 é um grupoprotetor opcionalmente presente; m é um número inteiro na faixa de a partirde 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a partir de 4 a 92; contanto queo composto de acordo com a fórmula Ζ1 -(X1 )m-(X2)-(X3)n-Z2 tenha 15 a 94aminoácidos de extensão e tenha no mínimo 80% de homologia com a SEQID NO: 1; ou (c) uma mistura dos mesmos; em que tratamento é selecionadoentre o grupo consistindo em profilaxia ou tratamento de caquexia, profilaxiaou tratamento de lipodistrofia, estimulação do apetite, estimulação do con-sumo de alimento, estimulação de ganho de peso, aumentar a massa degordura corporal, aumentar a massa magra corporal, ou uma combinaçãodos mesmos.
Um aspecto adicional é um kit para administrar variante de jun-ção de grelina ou um composto similar a variante de junção de grelina com-preendendo (a) uma forma de dosagem compreendendo uma quantidadefarmaceuticamente aceitável de (1) variante de junção de grelina; (2) umcomposto similar a variante de junção de grelina tendo a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcionalmente presente; cadaX1 é de modo independente selecionado entre um aminoácido que ocorrenaturalmente e um aminoácido sintético; X2 é selecionado entre um aminoá-cido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, o referido aminoá-cido sendo modificado com um grupo hidrofóbico volumoso; cada X3 é demodo independente selecionado entre um aminoácido que ocorre natural-mente e um aminoácido sintético, em que um ou mais de X1 e X3 opcional-mente podem ser modificados com um grupo hidrofóbico volumoso; Z2 é umgrupo protetor opcionalmente presente; m é um número inteiro na faixa de apartir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a partir de 4 a 92; contan-to que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 tenha15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo 80% de homologia coma SEQ ID NO: 1; ou (3) uma mistura dos mesmos; e (b) opcionalmente, ins-truções para administrar (a).
Outro aspecto é para um método para produzir um compostosimilar a variante de junção de grelina, o referido método compreendendo:(a) proporcionar um cDNA compreendendo uma seqüência de polinucleotí-deos codificando um composto similar a variante de junção de grelina con-forme descrito acima; (b) inserir o referido cDNA em um vetor de expressãode tal modo que o cDNA seja encadeado operavelmente a um promotor; (c)introduzir o referido vetor de expressão em uma célula hospedeira por meiodo que a referida célula hospedeira produz o referido composto similar a va-riante de junção de grelina; e (d) opcionalmente recuperar o composto simi-lar a variante de junção de grelina produzido na etapa (c).
Outros objetivos e vantagens se tornarão evidentes para aque-les versados na técnica com referência à descrição detalhada que se seguenas partes seguintes.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS
SEQ ID NO: 1 representa variante de junção de grelina depoisda seqüência de sinalização prepro humana.
SEQ ID NO: 2 representa variante de junção de grelina humanade 22 aminoácidos.
SEQ ID NO: 3 representa variante de junção de grelina humanade 24 aminoácidos.
SEQ ID NO: 4 representa modificada variante de junção de gre-lina humana de 24 aminoácidos.
SEQ ID NO: 5 representa variante de junção de grelina humanade 29 aminoácidos.
SEQ ID NO: 6 representa um fragmento de variante de junçãode grelina humana de extensão total.
SEQ ID NO: 7 representa variante de junção de grelina depoisda seqüência de sinalização prepro de camundongo.
SEQ ID NO: 8 representa variante de junção de grelina depoisda seqüência de sinalização prepro de rato.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A Figura 1A é um gráfico de linhas mostrando o ganho de pesocorporal cumulativo de camundongos 129Sv tratados com variante de junçãode grelina acilada (SEQ ID NOs: 2 e 5) comparados com controles tratadoscom veículo. A variante de junção de grelina acilada induz ganho de pesocorporal em camundongos selvagens machos (n = 10 por grupo, P =0,0001). Em camundongos tratados uma vez ao dia por duas semanas comvariante de junção de grelina acilada (0,8 mg/kg, por via subcutânea), o ga-nho de peso cumulativo do grupo de SEQ ID NO: 2 acilada foi 3,4 vezesmaior do que os animais controle injetados com veículo. O ganho de pesocumulativo do grupo de SEQ ID NO: 5 acilada foi 2 vezes mais do que osanimais controle injetados com veículo. A Figura 1B é um gráfico de linhasmostrando consumo cumulativo de alimento de camundongos 129Sv trata-dos com variante de junção de grelina acilada (SEQ ID NOs: 2 e 5) compa-rados com controles tratados com veículo. O tratamento com variante dejunção de grelina acilada aumentou o consumo de alimemto em camundon-gos selvagens. Camundongos tratados uma vez ao dia por duas semanascom variante de junção de grelina acilada (0,8 mg/kg, por via subcutânea)comeram 13% mais do que os animais controle tratados com veículo (n = 10por grupo, P = 0,004).
A Figura 2A é um gráfico de linhas mostrando o ganho de pesocorporal cumulativo de camundongos 129Sv tratados com variante de junçãode grelina acilada (SEQ ID NOs: 2 e 4) e de SEQ ID NO: 5 não acilada com-parados com controles tratados com veículo. Variantes de junção de grelinaaciladas induzem ganho de peso corporal em camundongos selvagens ma-chos (n = 8 por grupo, P = 0,0001). Em camundongos tratados uma vez ao dia por sete dias com variante de junção de grelina acilada ou não acilada(7,2 mg/kg, por via subcutânea), o ganho de peso cumulativo do grupo deSEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4 foi 2,2 vezes mais do que os animais controleinjetados com veículo. O ganho de peso cumulativo do grupo de SEQ ID NO:5 não acilado foi 25% menor do que os animais controle injetados com veí- culo. A Figura 2B é um gráfico de linhas mostrando o consumo de alimentocumulativo de camundongos 129Sv tratados com variante de junção de gre-lina acilada (SEQ ID NOs: 2 e 4) e de SEQ ID NO: 5 não acilada compara-dos com controles tratados com veículo. Tratamento com variantes de jun-ção de grelina aciladas aumentou o consumo de alimento em camundongosselvagens. Camundongos tratados uma vez ao dia por sete dias com varian-tes de junção de grelina aciladas (7,2 mg/kg, por via subcutânea) comeram18% mais do que os animais controle injetados com veículo (n = 8 por gru-po). Camundongos tratados uma vez ao dia por sete dias com SEQ ID NO: 5(7,2 mg/kg, por via subcutânea) comeram 2% menos do que os animais con-trole injetados com veículo (n = 8 por grupo).
A Figura 3 é um gráfico de barras mostrando a concentraçãosérica de hormônio de crescimento depois da administração subcutânea devariante de junção de grelina acilada (SEQ ID NOs: 2, 4, 5) e SEQ ID NO: 5não acilada comparados com controles administrados com veículo. É mos-trado o efeito de salina ou variante de junção de grelina acilada (0,8 mg/kg,por via subcutânea) sobre o hormônio de crescimento plasmático em 10 mi-nutos e 20 minutos pós injeção em camundongos selvagens (n = 5 por gru-po).
A Figura 4 é um gráfico de barras mostrando a alteração nacomposição do corpo de camundongos 129Sv tratados com variante de jun-ção de grelina acilada (SEQ ID NOs: 2 e 4) e camundongos tratados comSEQ ID NO: 5 não acilada comparados com camundongos tratados com ve-ículo e grelina. É mostrado o efeito de sete dias de tratamento subcutâneodiário com salina, grelina ou variante de junção de grelina acilada (7,2mg/kg, por via subcutânea) sobre a massa corporal de gordura e magra con-
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
As requerentes incorporam especificamente o conteúdo inteirode todas as referências citadas nesta descrição. Além disso, quando umaquantidade, concentração, ou outro valor ou parâmetro é dado como ou umafaixa, faixa preferencial, ou uma lista de valores superiores preferenciais evalores inferiores preferenciais, isto deve ser entendido como revelando es-pecificamente todas as faixas formadas a partir de qualquer par de qualquervalor preferencial ou limite de faixa superior e qualquer valor preferencial oulimite de faixa inferior, independente se as faixas são reveladas separada-mente. Onde uma faixa de valores numéricos é mencionada aqui, a menosque determinado de modo diverso, a faixa pretende incluir os desfechos dasmesmas, e todos os inteiros e frações dentro da faixa. Não se pretende queo âmbito da invenção seja limitado aos valores específicos mencionadas aose definir uma faixa.
No contexto desta descrição, será utilizada uma série de termos.
"Afinidade" conforme usado aqui, significa a força de ligaçãoent4re receptores e seus ligantes, por exemplo, entre um anticorpo e seuantígeno.
"Resíduo aminoácido" conforme usado aqui, significa um ami-noácido formado na digestão química (hidrólise) de um polipeptídeo em suasligações peptídicas. Os resíduos aminoácidos descritos aqui, preferencial-mente estão na forma isomérica "L". No entanto, o aminoácido engloba todoaminoácido tal como L-aminoácido, D-aminoácido, alfa-aminoácido, beta-aminoácido, gama-aminoácido, aminoácido natural e aminoácido sintético ousimilares contanto que a propriedade funcional desejada seja conservadapelo polipeptídeo. NH2 se refere ao grupo amino livre presente no términoamino de um polipeptídeo. COOH se refere ao grupo carbóxi livre presenteno término carbóxi de um polipeptídeo. Abreviações de polipeptídeos de viapara resíduos aminoácidos são mostradas na Tabela 1.
Tabela 1
<table>table see original document page 15</column></row><table>
Deve ser observado que todas as seqüências de resíduos ami-noácidos representadas aqui, por fórmula têm uma orientação da esquerdapara a direita na direção convencional de término amino para término carbó-xi. Além disso, a expressão "resíduo aminoácido" é amplamente definidapara incluir os aminoácidos listados na Tabela 1 e aminoácidos modificadose que não ocorrem naturalmente. Além disso, deve ser observado que umtravessão no início ou no fim de uma seqüência de resíduos aminoácidosindica uma ligação peptídica a uma seqüência adicional de um ou mais resí-duos aminoácidos ou uma ligação covalente a um grupo amino-terminal talcomo NH2 ou acetil ou a um grupo carbóxi-terminal tal como COOH.
"Tratamento antineoplásico" conforme usado aqui, significa tra-tamento com objetivo de deter ou reduzir crescimento de tecido anormal (talcomo um neoplasma) em um indivíduo. Exemplos de similar tratamento in-cluem terapias contra câncer, tais como radioterapia ou quimioterapia.
"Apetite" em relação a um indivíduo é avaliado medindo a quan-tidade de alimento ingerido e avaliando o desejo de comer do indivíduo. A-qui, apetite (isto é, fome) é tipicamente avaliado com um questionário curtoadministrado aos indivíduos em uma base aleatória várias vezes por sema-na. Tipicamente, os indivíduos classificam sua fome, preocupação com ali-mento, e desejo de comer maiores quantidades e diferentes tipos de alimen- to respondendo as questões usando escalas análogas variando de 1 (demodo algum) até 5 (extremamente).
"índice de Massa Corporal" ou "BMI" é uma medida da propor-ção de altura para peso de um indivíduo. O BMI é determinado calculando opeso em quilogramas dividido pelo quadrado da altura em metros. A faixa de BMI "normal" é 18,5 a 25.
A "massa de gordura corporal" pode ser medida, por exemplo,pela técnica de dobra de gordura. Na técnica de dobra de gordura, um cali-brador do tipo tenaz é usado para medir a gordura subcutânea determinandoa espessura da dobra de pele em sítios representativos sobre o corpo. Estas medições de dobra de pele são então usadas para computar a gordura cor-poral ou adicionando os escores das várias medições, e usando este valorcomo uma indicação do grau relativo de gordura entre indivíduos, ou usandoas medições em equações matemáticas que foram deselvolvidas para pre-ver a percentagem de gordura corporal (Fogelholm M. & van Marken Lich-tenbelt W., Eur. J. Clin. Nutr. 51:495-503 (1997)).
"Concentração equivalente" conforme usado aqui, significa umadosagem equivalente de um composto similar a variante de junção de greli-na tendo in vitro e/ou in vivo a mesma resposta conforme avaliado a partir deum curva de dosagem-resposta da variante de junção de grelina.
"Constante de dissociação" ou "Kd" é uma medida descrevendoa força de ligação (ou afinidade ou avidez) entre receptores e seus ligantes,por exemplo, um anticorpo e seu antígeno. Quanto menor a Kd, mais forte aligação.
Um "polipeptídeo de fusão" é um polipeptídeo consistindo em nomínimo dois polipeptídeos e uma seqüência de ligação para ligar operativa-mente os dois polipeptídeos em one continuous polipeptídeo. Os dois poli-peptídeos encadeados em um polipeptídeo de fusão são tipicamente deriva-dos de duas fontes independentes, e portanto um polipeptídeo de fusãocompreende dois polipeptídeos encadeados não encontrados normalmenteencadeados na natureza.
"Grelina humana" conforme usado aqui, é um polipeptídeo tendoa seqüência de aminoácidos conforme determinado no GenBank® No. deAcesso NP_057446 ou Swiss-Prot Identifier GHRLJHUMAN. A preproteínade grelina humana tem 117 aminoácidos. Esta preproteína sofre o seguinteprocessamento pós-translacional. O peptídeo de sinal (aminoácidos 1-23) éremovido e os 94 aminoácidos remanescentes são clivados por uma protea-se para proporcionar uma grelina madura de 28 aminoácidos (aminoácidos24-51) ou uma grelina madura de 27 aminoácidos (aminoácidos 24-50) euma obestatina madura 23 aminoácidos (aminoácidos 76-98). Os peptídeosde grelina madura de 27 ou 28 aminoácidos podem ser adicionalmente mo-dificados na serina na posição 26 na preproteína ou por um grupo O-octanoíla ou por um grupo O-decanoíla. O peptídeo maduro de obestatinapode ser adicionalmente modificado na Iisina na posição 98 da preproteínapor um grupo amida. Uma preproteína de grelina adicional é conhecida, aqual carece da glutamina na posião 37 da preproteína.
"Variante de junção de grelina" é um polipeptídeo tendo a se-qüência de aminoácidos conforme determinado na SEQ ID NO: 1 ou qual-quer peptídeo de 15 aminoácidos ou mais de SEQ ID NO: 1 com ou semmodificação pós translacional, ou quaisquer homólogos de SEQ ID NO: 1conforme determinado na SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, e/ou qualquerpeptídeo de 15 aminoácidos ou mais de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8com ou sem modificação pós translacional.
"Composto similar a variante de junção de grelina" conforme u-sado aqui, se refere a qualquer composto o qual simula a função de variantede junção de grelina, em particular variante de junção de grelina humana,particularmente em termos das funções de variante de junção de grelina le-vando aos efeitos terapêuticos desejados descritos aqui, tais como estimula-ção do apetite e/ou tratamento e/ou profilaxia de caquexia e é definido pelaFórmula I: Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcio-nalmente presente; cada X1 é de modo independente selecionado entre umaminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético; X2 é sele-cionado entre um aminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sin-tético, o referido aminoácido sendo modificado com um grupo hidrofóbicovolumoso; cada X3 é de modo independente selecionado entre um aminoá-cido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, em que um ou maisde X1 e X3 opcionalmente podem ser modificados com um grupo hidrofóbicovolumoso; Z2 é um grupo protetor opcionalmente presente; m é um númerointeiro na faixa de a partir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a par-tir de 4 a 92; contanto que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 tenha 15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo80% (ou, em modalidades alternativas, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98%,99%, 100%) de homologia com a SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade prefe-rencial, o composto similar a variante de junção de grelina tem 22 a 29 ami-noácidos de extensão.
"Imunologicamente distintos" se refere à capacidade para dife-renciar entre dois polipeptídeos sobre a capacidade de um anticorpo paraligar especificamente um dos polipeptídeos e não ligar especificamente ooutro polipeptídeo.
Um "indivíduo" é um animal ou ser humano suscetível a umacondição, em particular uma condição caquética conforme definido aqui. Emmodalidades preferenciais, o indivíduo é um mamífero, incluindo mamíferoshumanos, e não-humanos tais como cães, gatos, porcos, vacas, carneiro,cabras, cavalos, ratos, e camundongos. Na modalidade mais preferencial, oindivíduo é um humano.
"Isolado" é usado para descrever os vários compostos similaresa variante de junção de grelina, isto é, polipeptídeos e nucleotídeos descritosaqui, que foram identificados e separados e/ou recuperados de um compo-nente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de um ambien-te natural são materiais que tipicamente interfeririam com usos diagnósticosou terapêuticos para o polipeptídeo, e podem incluir enzimas, hormônios, eoutros solutos proteináceos ou não-proteináceos. Em modalidades preferen-ciais, os compostos similares a variante de junção de grelina serão purifica-dos.
"Aminoácido modificado" conforme usado aqui, é um aminoáci-do em que um grupo arbitrário do mesmo é quimicamente modificado.
"Aminoácido não padrão" conforme usado aqui, é um aminoáci-do que não pertence aos 20 aminoácidos padrão. Aminoácidos não padrãosão geralmente formados através de modificações químicas para aminoáci-dos padrão. Também podem ser formados naturalmente como um compo-nente intermediário de um caminho metabólico ou por microorganismos e/ouplantas.
"Anticorpo Monoclonal", em suas várias formas gramaticais, serefere a uma população de moléculas de anticorpos que contém somenteuma espécie de sítio de combinação de anticorpo capaz de imunorreagircom um antígeno particular.
Um "composto similar a variante de junção de grelina não adia-do" é um composto similar a variante de junção de grelina, conforme definidoaqui, o qual não contém um grupo acila fixado a quaisquer de seus aminoá-cidos constituintes.
"Tratamento paliativo" é um tratamento o qual alivia ou mitiga ossintomas de uma doença ou distúrbio mas sem um efeito de cura.
"Anticorpos policlonais" são uma mistura de moléculas de anti-corpos reconhecendo um dado antígeno específico; portanto, anticorpos po-liclonais podem reconhecer diferentes epitopes dentro do referido antígeno.
"Polipeptídeo" se refere a uma molécula compreendendo resí-duos aminoácidos os quais não contêm ligações diferentes de ligações ami-da entre resíduos aminoácidos adjacentes.
"Grelina processada" significa a grelina acilada de 27 ou 28 re-síduos aminoácidos (o produto pós-translacional de clivagem e acilação delonga preprogrelina de 116 e 117 resíduos aminoácidos, respectivamente(por exemplo, SWISS-PROT Q9UBU3 GHRL_HUMAN)).
Um "receptor" é uma molécula, tal como um proteína, glicoprote-ína e similares, que pode ligar especificamente (não aleatoriamente) a outramolécula.
Um "secretagogo" é uma substância estimuladora de liberaçãode hormônio do crescimento, tal como grelina ou um composto similar a gre-lina. Um secretagogo de acordo com a presente descrição pode ser, por e-xemplo, selecionado entre L-692-429 e L-692-585 (compostos de benzoelac-tama; disponíveis na Merck & Co, Inc., Whitehouse Station, NJ), MK677 (es-piroindaner; disponíveis na Merck) G-7203, G-7039, G-7502 (peptidomiméti-co de ácido isonipecótico; disponíveis na Genentech, Inc., South San Fran-cisco, Calif.), NN703 (Novo Nordisk Inc., Princeton, NJ), ou ipamorelina. Emparticular, o secretagogo é um composto similar a variante de junção de gre-lina, incluindo uma variante de junção de grelina humana de 29 aminoácidos,uma variante de junção de grelina humana de 24 aminoácido, ou uma vari-ante de junção de grelina humana de 22 aminoácidos (por exemplo, SEQ IDNO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 5). O secretagogo dehormônio do crescimento em uma modalidade pode ser não acilado, por e-xemplo, uma forma não acilada de variante de junção de grelina ou um com-posto similar a variante de junção de grelina não acilado.Uma "molécula tensoativa" é uma molécula compreendendouma parte hidrofóbica e uma parte hidrofílica; isto é, uma molécula capaz deestar presente na interfase entre uma fase lipofílica e uma fase hidrofílica.
Indicações
A presente descrição se refere ao uso de um secretagogo, talcomo um composto similar a variante de junção de grelina, no tratamento ouprofilaxia de condições, por exemplo, relativas a perda de peso patológica ouperda de massa magra e/ou de gordura incluindo a) profilaxia ou tratamentode caquexia, e/ou b) profilaxia ou tratamento de lipodistrofia, e/ou c) estimu-lação do apetite, e/ou d) estimulação do consumo de alimento, e/ou e) esti-mulação de ganho de peso, e/ou f) aumento da massa de gordura corporal,e/ou g) aumento da massa magra corporal. Em particular, a presente descri-ção se refere ao tratamento ou profilaxia de caquexia e/ou a estimulação doapetite, estimulação da palatabilidade, aumento da qualidade de vida, o maispreferencialmente a profilaxia ou o tratamento de caquexia.
Caquexia
Caquexia é um dos sintomas mais extenuantes e devastadoresde várias doenças graves, tais como câncer, privando os indivíduos de suaenergia, sensação de bem-estar, qualidade de vida e aumentando sua de-pendência dos outros. A caquexia freqüentemente acompanha malignidadesdo pâncreas, estômago, esôfago, pulmão, e intestinos.
O primeiro sinal de caquexia é perda de peso, não somente detecido graxo, mas também de tecido muscular e mesmo osso. Este tecidonão graxo também é conhecido como "massa corporal magra". Além disso,há perda de apetite (anorexia), fraqueza (astenia), e uma queda no nível dehemoglobina (anemia).
O tratamento de caquexia não é simplesmente uma questão decomer mais. Mesmo se o indivíduo deseja comer, mesmo se o indivíduo ten-ta comer, mesmo se são administrados ao indivíduo nutrientes através deum tubo estomacal ou por via intravenosa, a condição normalmente não serárevertida.
Estudo recente revelou que a condição é agora consideradacomo parte de uma reação do corpo à presença da doença subjacente. (La-viano A. et al., Nat. Clin. Pract. Oncol. 2:158-65 (2005)). Estudo recentetambém indica que, em alguns casos, os próprios tumores produzem subs-tâncias que induzem caquexia. (Esper D.H. & Harb W.A., Nutr. Clin. Pract.20:369-76 (2005)).
Caquexia, ou atrofia, conforme também pode ser denominada, évista com várias doenças, tais como AIDS, câncer, depois de fratura do qua-dril, falência cardíaca crônica, doença pulmonar crônica tal como doença dopulmão obstrutiva crônica (N.T.: em inglês, COLD) e doença pulmonar obs-trutiva crônica (N.T.: em inglês, COPD), cirrose hepática, falência renal, do-enças autoimunes tais como artrite reumatóide e lúpus sistêmico, septicemi-a, tuberculose, fibrose cística, Doença de Crohn, e infecção severa. Alémdisso, também é vista atrofia no envelhecimento.
Embora a caquexia represente a síndrome metabólica complexaque é vista em similares pacientes, comumente é reconhecida como umaperda de peso progressiva com depleção das reservas de tecido adiposo ede músculo esquelético do hospedeiro.
Caquexia por Câncer
O núcleo da síndrome de caquexia por câncer se refere ao pro-blema de crescimento progressivo do tumor e aos efeitos colaterais catabóli-cos da terapia anti-neoplásica convencional. Estes dois fenômenos dão ori-gem a alterações no sistema neuro-endócrino, à produção de uma variedadede citocinas pró-inflammatórias, e à liberação de fatores caquéticos câncer-específicos. Por sua vez, estes mediadores causam uma redução no con-sumo de alimento, anormalidade no metabolismo, ou uma combinação des-tes dois.
Foi reportado que ocorre caquexia por câncer em cerca de me-tade de todos os pacientes com câncer e está associada com mais de 20 porcento das mortes por câncer (Tisdale M.J., Nat. Rev. Câncer 2:862-71(2002)). A condição freqüentemente ocorre durante câncer avançado, emparticular quando tumores metastáticos estão presentes no corpo. A caque-xia também é mais comum em crianças e pacientes idosos. Cânceres espe-cíficos também são consistentemente identificados onde a freqüência decaquexia por câncer é particularmente elevada: cânceres do trato gastroin-testinal superior (incluindo: pâncreas, estômago, esôfago, e fígado) (BrueraE., Br. Med. J. 315:1219-22 (1997); Palesty J.A. et aí., Dig. Dis. 21:198-213(2003)); câncer do pulmão, em particular câncer pulmonar de células peque-nas; câncer de cabeça e pescoço; câncer colorretal; outros tumor sólidos(Bruera E., Br. Med. J. 315:1219-22 (1997)). A perda de peso involuntária(N.T.: em inglês, IWL) tem sido associada com uma queda aproximada de50% na sobrevida e redução da tolerância de terapyia de câncer (Laviano A.et al., Nat. Clin. Pract. Oncol. 2:158-65 (2005)). Os sítios de câncer associa-dos com os maiores riscos para perda de peso são aqueles afetando o tratoaerodigestivo (pulmão, cabeça e pescoço, e esôfago) e o sistema gastroin-testinal, especialmente pâncreas, estômago, e fígado. Além disso, no mo-mento do diagnóstico, 80% de todos os pacientes com câncer no trato gas-trointestinal superior e 60% de todos os pacientes com câncer pulmonar jáexperimentaram substancial perda de peso (Bruera E., Br. Med. J. 315:1219-22 (1997)). Na média, a prevalência de caquexia aumenta a partir da percen-tagem de 50% até mais de 80% antes da morte e, em mais de 20% dos pa-cientes, caquexia é a principal causa de morte (Bruera E., Br. Med. J.315:1219-22(1997)).
Detecção de Caquexia por Câncer
O estado nutricional é avaliado com uma combinação de avalia-ção clínica, testes antropométricos (peso corporal, espessura de dobra dapele e circunferência média do braço) e estudo por imagens (varredura porDEXA, varredura por ressonância magnética, varredura por tomografia com-putadorizada e medição da impedância bioelétrica). Caquexia é geralmentesuspeita se for observada uma perda de peso involuntária de mais de 5% dopeso pré-mórbido dentro de um período de seis meses — especialmentequando combinada com atrofia muscular.
O parâmetro laboratorial mais comumente usado é albumina sé-rica. No entanto é um parâmetro inespecífico. Outros marcadores são prote-ínas com uma meia-vida curta; também têm sido usadas transferrina e trans-tiretina.
Outros marcadores de caquexia são IGF-1, IGFBP-3, ALP (fos-fatase alcalina), e testosterona.
Relação Entre Câncer e Caquexia por Câncer
Câncer pode causar caquexia através de uma variedade de me-canismos, inclusive indução de anorexia e/ou aumento ou alteração do me-tabolismo, conforme descrito abaixo:
Anorexia
Foi demonstrado que o consumo de energia está substancial-mente reduzido entre pacientes com câncer perdendo peso. Os pacientescom câncer freqüentemente podem sofrer de obstrução física do trato gas-trointestinal, dor, depressão, constipação, malabsorção, debilidade ou osefeitos colaterais do tratamento (tais como, por exemplo, tratamentos comopiáceos, radioterapia ou quimioterapia), os quais também podem todos re-duzir o consumo de alimento (Barber M.D. et al., Surg. Oncol. 8:133-41(1999)). A hipercalcemia associada com câncer também pode induzir náu-sea, vômito e perda de apetite.
No entanto, continua a existir um grande número de pacientescom câncer nos quais não há causa clínica óbvia de redução do consumo dealimento.
O mecanismo central de anorexia induzida por câncer e caque-xia é complexo e inclui muitas citocinas diferentes, hormônios e outros fato-res produzidos pelas células cancerígenas.
Leptina
Em situações fisiológicas normais, a Ieptina tem um papel impor-tante em disparar a resposta adaptiva à fome, uma vez que a perda de pesofaz com que os níveis de Ieptina caiam em proporção à perda de gorduracorporal. No entanto, em pacientes com câncer, um aumento do nível decitocinas (por exemplo, IL-I, IL-6, TNF-a, INF-γ) produzidas pelas célulascancerígenas pode estimular a expressão e/ou a liberação de leptina. Outromecanismo possível das citocinas é que simulam o efeito hipotalâmico desinalização de feedback negativo excessivo de leptina, levando à prevençãodo mecanismo compensatório normal referente ao consumo de alimento eao peso corporal.
NPY (Neuropeptídeo Y)
O sistema NPY hipotalâmico é um dos caminhos neurais chaverompidos em anorexia e câncer induzido por IL-1 ou outras citocinas. As ci-tocinas reduzem a sensibilidade para NPY. Foi mostrado que NPY é um fa-tor regulador de crescimento para tumores neuroendócrinos, agindo tantopor ativação autócrina da proliferação de células tumorais ou apoptose e porangiogênese (Kitlinska J et al., Câncer Res. 65:1719-28 (2005)). Além disso,foi visto que Y1 e Y2 receptores são expressados em carcinomas de mama,glândula adrenal e tumores relacionados, carcinomas de células renais, ecânceres ovarianos tanto em células tumorais quanto em vasos sangüíneosassociados com tumor. Sua ampla expressão em células cancerígenas pos-sibilita que os mesmos mediem efeitos do NPY sobre a proliferação de célu-Ias tumorais e o suprimento sangüíneo tumoral (para uma revisão videKórner M & Reubi JC, Peptides 28:419-25 (2007)).
Melanocortinas
A sinalização de melanocortina aberrante pode ser um fator con-tribuinte tanto na anorexia quanto na caquexia. Apesar de acentuada perdade peso corporal a qual normalmente se esperaria que regulasse para baixoo sistema de sinalização de melanocortina anorexigênica como um modopara conservar as reservas de energia, o sistema de melanocortina perma-nece ativo durante caquexia induzida por câncer. O bloqueio de melanocor-tina central por AgRP (peptídeo Agouti-relacionado) ou outros antagonistasreverteu anorexia e caquexia nos modelos animais, sugerindo uma funçãopatogênica deste sistema (Wisse B.E. et al., Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 994:275-81 (2003)). Além disso, recentes experimentos mostram que o bloqueio dasinalização de melanocortina usando antagonistas para o receptor de mela-nocortina MC(4) atenua anorexia e atrofia associadas com doença em mo-delos de câncer e falência renal em roedores (DeBoer MD & Marks DL, Nat.Clin. Pract. Endocrinol. Metab. 2:459-66 (2006)).
MetabolismoHiper metabolismo é definido como uma elevação do gasto deenergia em repouso (REE) e é uma característica fundamental da caquexia.O gasto de energia total envolve REE (aproximadamente 70%) e gasto deenergia voluntário (aproximadamente 25%) e gasto de energia na digestão(5%). O gasto de energia voluntário pode ser reduzida na caquexia a qualpode se manifestar clinicamente como apatia, fadiga e depressão.
Sabe-se que os sinais orexigênicos e os anorexigênicos redu-zem e aumentam respectivamente a atividade nervosa simpática, os quaisregulam REE ativando a termogênese no tecido adiposo marrom em roedo-res e possivelmente em músculo em seres humanos, através de indução dasproteínas não acoplantes mitocondriais (UCP) (Alvarez R et al., J. Biol.Chem. 270:5666-73 (1995)). Foi sugerido que a ativação de UCP em múscu-lo e em tecido adiposo branco por citocinas pode ser um dos mecanismosmoleculares subjacentes ao aumento na produção de calor e atrofia muscu-lar (lnui A., CA Câncer J. Clin. 52:72-91 (2002); Fearon K.C. & Moses A.G.,Int. J. Cardiol. 85:73-81 (2002)).
O metabolismo nutricional alterado também foi descrito em paci-entes com câncer. Tumores sólidos produzem grandes quantidades de Iacta-to, o qual é convertido de volta em glicose através de um processo que usa grandes quantidades de ATP e é muito ineficiente em energia, deste modoaumentando adicionalmente o gasto de energia. Além disso, foi mostradoque o fator de mobilização de lipídeo derivado de tumor (LMF) age direta-mente sobre adipócitos e causa aumento da lipólise, levando a liberação deácido graxo livre e glicerol (Islam-Ali B. et al., Br. J. Câncer 85:758-63(2001)), e atenuando a toxicidade de radicais livres nas células tumorais(Sanders PM & Tisdale MJ1 Br. J. Câncer 90:1274-78 (2004)).
Também foi sugerido que o aumento do nível de citocinas podeinduzir catabolismo de proteínas musculares indiretamente afetando os pro-cessos de restauração muscular (Islam-Ali B. et al., Br. J. Câncer 85:758-63(2001)).
O Fundamento Lógico para Usar Secretagoqos no Tratamentode Caguexia por CâncerSem ser limitado pela teoria, o fundamento lógico para o trata-mento com um secretagogo, em particular um composto similar a variante dejunção de grelina se baseia no seguinte: variante de junção de grelina libe-rada pelas células endócrinas na mucosa do trato gastrointestinal pode agirtanto localmente como uma substância parácrina e centralmente como umhormônio. Localmente, a variante de junção de grelina pode agir como uminiciador de atividade aferente em, por exemplo, neurônios vagais aferentes.
Os neurônios referidos retransmitirão o estímulo de variante de junção degrelina para centros no sistema nervoso central tais como o nucleus tractussolitarirus (NTS) o qual adicionalmente comunica com centros reguladoresdo apetite e da homeostase de energia tais como o núcleo paraventricular eo núcleo arqueado no hipotálamo. Como um hormônio, acreditaose que avariante de junção de grelina aja sobre o apetite central regulando POMC(proopiomelanocortina) e neurônios NPY/AgRP, os quais expressam recep-tores de variante de junção de grelina.
Recentemente foi descrito que grelina é transportada através dabarreira sangüínea cerebral (Banks W.A. et ai, J. Pharmacol. Exp. Ther.302:822-27 (2002)). É importante notar que, no centro regulador do apetitecentral, por exemplo, nos neurônios NPY/AgRP — isto é, o primeiro nível deneurônios no ramo estimulador do controle do apetite — grelina agindo atra-vés de receptores de grelina estimulatórios é o único input estimulatório co-nhecido da periferia. Todos os outros hormônios e neurotransmissores co-nhecidos, por exemplo, leptina, insulina, PYY3-36, a-MSH, e etc., agem co-mo inibidores sobre os neurônios NPY/AgRP neste importante centro de "ga-te keeping de apetite". Como o sistema NPY é regulado para baixo durantecaquexia induzida por câncer, a estimulação deste sistema por grelina podeser capaz de normalizar a condição. Similarmente, a melanocortina que éativa durante caquexia induzida por câncer pode ser inibida por grelina evariante de junção de grelina através de estimulação de AgRP.
Foi mostrado que o aumento na concentração de grelina aumen-ta o ACTH (hormônio adrenocorticotrópico) com um aumento resultante nonível de cortisol. Esta ação pode ter importantes implicações benéficas parao tratamento de caquexia, uma vez que o cortisol reduz o nível de citocinas(por exemplo, IL-1, IL-6, TNF-a, IFN-a). A administração de glucocorticóidesjá é amplamente usada no cenário paliativo para sintomas associados comcâncer (lnui A., CA Câncer J. Clin. 52:72-91 (2002)). Além disso, foi demons-trado que injeção ICV de grelina reduz a temperatura corporal central emroedores, a qual indica uma redução na REE (Lawrence C.B. et al., Endocri-nology 143:155-62 (2002)). Novamente, sem ser limitado pela teoria, se es-pera que variante de junção de grelina, similar a grelina selvagem, venha areverter o aumento na REE, o qual é uma característica importante de ca-quexia conforme descrito acima.
O secretagogo, em particular um composto similar a variante dejunção de grelina, pode ser administrado usando qualquer regime adequado,levando em conta o conhecimento do progresso do câncer esperado bemcomo o regime da terapia anti-neoplásica.
Em uma modalidade, é previsto que, de acordo com a presentedescrição, um secretagogo pode ser administrado a qualquer indivíduo so-frendo de qualquer tipo de câncer, independente da etiologia, para tratarcom sucesso, reduzir, ou prevenir caquexia por câncer.
Portanto, em uma modalidade preferencial, o tratamento de umindivíduo com um secretagogo, tal como variante de junção de grelina ou umcomposto similar a variante de junção de grelina, é para o tratamento ouprevenção de caquexia por câncer causada, por exemplo, por um ou maisdos seguintes tipos de câncer: Leucemia Linfoblástica Aguda, Leucemia Mie-lóide Aguda, Carcinoma Adrenocortical, Cânceres Relacionados com AIDS,Linfoma Relacionado com AIDS, Câncer Anal, Astrócitoma, Astrocitoma Ce-rebelar da Infância, Carcinoma Celular Basal Cerebral da Infância, Câncerde Duto Biliar Extrahepático, Câncer de Bexiga, Câncer Ósseo, Osteossar-coma/Histiocitoma Fibroso Maligno, Glioma do Tronco Cerebral, Tumor Ce-rebral, Câncer de Mama, Adenomas Bronquiais Masculinos/Carcinóides, Lin-foma de Burkitt, Tumor Carcinóide, Carcinoma de Primário Desconhecido,Linfoma do Sistema Nervoso Central, Astrocitoma Cerebral Primário/GliomaMaligno, Câncer Cervical, Cânceres de Infância, Leucemia Linfocítica Crôni-ca, Leucemia Mielogênica Crônica, Distúrbios Mieloproliferativos Crônicos,Câncer de Cólon, Linfoma de Células T Cutâneo, Câncer Endometrial, E-pendimoma, Câncer de Esôfago da Infância, Família de Tumores de Ewing,Tumor de Células Germinativas Extracranial, Tumor de Células GerminativasExtragonadal da Infância, Câncer de Olho, Câncer de Olho de MelanomaIntraocular, Retinoblastoma, Câncer da Vesícula Biliar, Câncer Gástrico (deEstômago), Tumor Carcinóide Gastrointestinal, Tumor Trofoblástico Gesta-cional, Glioma, Leucemia de Células Cabeludas, Câncer de Cabeça e Pes-coço, Câncer Hepatocelular (Fígado), Linfoma de Hodgkin, Câncer Hipofa-ringeal, Glioma do Caminho Hipotalâmico e Visual, Melanoma Intraocular,Carcinoma de Células da Ilhota (Pâncreas Endócrino), Sarcoma de Kaposi,Câncer dos Rins (Células Renais), Câncer de Laringe, Câncer dos Lábios eda Cavidade Oral, Câncer de Pulmão, Câncer Pulmonar de Células Não Pe-quenas, Llnfoma de Células Pequenas, Linfoma Relacionado com AIDS,Linfoma de Células T Cutâneo, Macroglobulinemia Não de Hodgkin, Histioci-toma Fibroso Maligno de Waldenstrõm de Osso/Osteossarcoma, Medulo-blastoma, Melanoma da Infância Carcinoma de Células de Merkel, Mesoteli-oma, Mesotelioma Maligno do Adulto, Câncer de Pescoço Escamoso Metas-tático da Infância com Síndrome de Neoplasia Endócrina Múltipla PrimáriaOculta, Mieloma Múltiplo da Infância/Neoplasma Celular Plasmático, MicoseFungóide, Síndromes Mielodisplásicas, Doenças Mielodisplási-cas/Mieloproliferativas, Mieloma, Distúrbios Mieloproliferativos Crônicos Múl-tiplos, Câncer da Cavidade Nasal e o Seio Paranasal, Câncer Nasofaringea-no, Câncer Nasofaringeano, Neuroblastoma da Infância, Câncer Orofaringe-ano, Osteossarcoma/Histiocitoma Fibroso Maligno de Osso, Câncer Ovaria-no, Câncer Epitelial Ovariano da Infância, Tumor de Células GerminativasOvariano, Tumor Potencial de Baixa Malignidade Ovariano, Câncer Pancreá-tico, Câncer do Seio Paranasal e da Cavidade Nasal, Câncer de Paratiróide,Câncer Senil, Feocromocitoma, Pineoblastoma e Tumores Neuroectodérmi-cos Primitivos Supratentoriais, Tumor da Pituitária da Infância, BlastomaPleuropulmonar, Câncer de Próstata, Câncer de Uréter e da Pelve Renal,Câncer Celular Transicionais Retinoblastoma, Rabdomiossarcoma, Câncerde Glândulas Salivares da Infância, Sarcoma de Tecidos Moles de Início A-dulto, Sarcoma, Sarcoma Uterino da Infância, Síndrome de Sezary, Câncerde Pele (Não-Melanoma), Carcinoma de Pele, Câncer de Intestino Delgadode Células de Merkel, Tumores Neuroectodermais Primitivos Supratentoriais,Linfoma de Células T Cutâneo da Infância, Câncer Testicular, Timoma eCarcinoma Tímico, Câncer de Tiróide , Câncer Celular Transicional da PelveRenal e do Uréter, Tumor Trofoblástico, Câncer Gestacional do Uréter e daPelve Renal, Câncer Celular Transicional, Câncer Uretral1 Câncer UterinoEndometrial, Sarcoma Uterino, Câncer Vaginal, Glioma Hipotalâmico e do Caminho Visual, Macroglobulinemia de Waldenstróm da Infância, Tumor deWilms.
Conforme discutido acima, caquexia por câncer pode ser devidoa um distúrbio catabólico, por exemplo, um estado hipermetabólico conformedescrito acima, quer resultante do crescimento progressivo do tumor ou dos efeitos colaterais catabólicos da terapia anticancerígena. No entanto, a ca-quexia por câncer também pode ser devida a um distúrbio anorético, tal co-mo é o caso quando o indivíduo sofrendo do câncer não tem apetite ou aposição do tumor reduz ou evita o consumo de alimento.
Por conseguinte, uma modalidade é para o tratamento ou pre-venção com um secretagogo, tal como um composto similar a variante dejunção de grelina, de caquexia por câncer causada por um distúrbio catabó-lico. Isto é particularmente adequado quando o câncer é um câncer do tratogastrointestinal, especialmente câncer do trato gastrointestinal superior (de-ve ser entendido aqui, que o termo "câncer do trato gastrointestinal superior"também engloba câncer pancreático), câncer do pulmão (em particular cân-cer pulmonar de célulsa não pequenas), e/ou câncer do fígado (deve serentendido aqui, que o termo "câncer do fígado" também engloba processosde câncer metastático no fígado).
Outra modalidade é para o tratamento ou prevenção com umsecretagogo, tal como um composto similar a variante de junção de grelina,de caquexia por câncer causada por um distúrbio anorético.
Ainda outra modalidade é para o tratamento ou prevenção comum secretagogo, tal como um composto similar a variante de junção de gre-lina, de caquexia por câncer independente de como o câncer induziu a ca-quexia, bem como para caquexia causada por uma combinação do distúrbiocatabólico e o distúrbio anorético.
Em uma modalidade preferencial, um secretagogo, tal como va-riante de junção de grelina ou um composto similar a variante de junção degrelina, é usado no tratamento ou na prevenção de caquexia por câncercausado por um tumor sólido.
Outro sub-grupo de cânceres são aqueles com anorexia causa-da por desregulação do centro regulador do apetite central no hipotálamo,onde outras razões possíveis para comer menos são excluídas.
Em particular indivíduos em estados terminais de câncer onde éimpossível tratamento anticancerígeno adicional, tratamento com variante dejunção de grelina como um tratamento paliativo para aumentar o consumode alimento, melhorar a digestão, e melhorar o metabolismo pode ser bené-fico. Por conseguinte, outro aspecto se refere ao tratamento paliativo paraaumentar o consumo de alimento, melhorar a digestão, e melhorar o meta-bolismo em um indivíduo que necessite do mesmo, tal como em que o refe-rido indivíduo está sofrendo de câncer em estágio avançado, particularmentecâncer terminal.
De acordo com o acima, os compostos descritos aqui, são parti-cularmente adequados para tratar or prevenir caquexia em um indivíduo so-frendo das seguintes formas de câncer do trato aerodigestivo: câncer pan-creático; câncer do trato gastrointestinal superior, tal como câncer de estô-mago e/ou câncer do esôfago; câncer de cabeça e pescoço, em particularcâncer da tiróide ou câncer das glândulas salivares; e câncer pulmonar, emparticular câncer pulmonar de células pequenas.
Em outra modalidade preferencial, um secretagogo, tal como va-riante de junção de grelina ou um composto similar a variante de junção degrelina, é usado no tratamento ou na prevenção de caquexia por câncercausada por câncer gastro intestinal inferior, tal como cânceres colorretais,em particular por câncer do cólon.Em outra modalidade preferencial, um secretagogo, tal como va-riante de junção de grelina ou um composto similar a variante de junção degrelina, é usado no tratamento ou na prevenção de caquexia por câncercausado por um câncer endócrino, isto é, um câncer em um órgão endócrinodo corpo de um indivíduo.
Os compostos descritos aqui, também são úteis para tratar indi-víduos sofrendo de câncer dos ovários ou de câncer de mama.
Em um adicional modalidade preferencial, um secretagogo, talcomo variante de junção de grelina ou um composto similar a variante dejunção de grelina, é usado no tratamento ou na prevenção de caquexia porcâncer causado no todo ou em parte por tratamento anticancerígeno, tal co-mo quimioterapia ou radioterapia ou combinações das mesmas.
Em uma modalidade preferencial, o indivíduo tratado para ca-quexia por câncer é idoso, tal como 60 a 120 anos de idade, tal como 70 a120 anos de idade, tal como 80 a 120 anos de idade, tal como 90 a 120 anosde idade. Igualmente preferenciais são modalidades onde o referido indiví-duo é uma criança, tal como de 0 a 20 anos de idade, tal como 0 a 15 anosde idade, tal como 0 a 10 anos de idade, tal como 0 a 5 anos de idade, talcomo 0 a 1 ano de idade, tal como um bebê recém-nascido com menos de 2meses de idade.
Em uma modalidade, é preferencial que o secretagogo, tal comoum composto similar a variante de junção de grelina, seja administrado profi-Iaticamente para prevenir um estado caquético. Nesta modalidade, o trata-mento pode ser iniciado antes de se iniciar qualquer tratamento anti-neoplásico. O secretagogo pode ser administrado continuamente durante otratamento anti-neoplásico, ou pode ser administrado em intervalos, por e-xemplo, entre períodos com a terapia anti-neoplásica. Administrando durantee em particular entre os períodos de terapia anti-neoplásica, o risco de que oindivíduo tratado adquira infecções e/ou outras complicações pode ser redu-zido devido às melhores condições de saúde do indivíduo.
O tratamento de caquexia por câncer usando um secretagogo,tal como variante de junção de grelina ou um composto similar a variante dejunção de grelina, pode ser realizado usando qualquer método de adminis-tração conhecido na técnica. Preferencialmente, o tratamento pode ser reali-zado usando quaisquer dos métodos de administração descritos aqui, maispreferencialmente usando administração intravenosa ou subcutânea, o maispreferencialmente usando métodos de administração subcutânea.
Lipodistrofia
Em outro aspecto, a presente descrição se refere ao uso de umsecretagogo, tal como variante de junção de grelina ou um composto similara variante de junção de grelina conforme definido acima, para o tratamento de uma síndrome lipodistrófica, ou para a fabricação de um medicamentopara o tratamento de uma síndrome lipodistrófica. Síndromes lipodistróficasenglobam um grupo heterogêneo de distúrbios raros caracterizados por per-da parcial ou generalizada de depósitos de tecido adiposo (Garg A., Am. J.Med. 108:143-52 (2000)). Há vários tipos diferentes de lipodistrofias, e o grau de perda de gordura pode variar de áreas deprimido muito pequenasaté ausência quase completa de tecido adiposo. Alguns pacientes podem tersomente problemas cosméticos, enquanto outros também podem ter váriascomplicações metabólicas tais como dislipidemia, esteatose hepática, e gra-ve resistência a insulina (Reitman M.L. et al., Trends Endocrinol. Metab.11:410-16 (2000)). Estes distúrbios podem ou ser hereditários (lipodistrofiasfamiliais ou genéticas) ou podem ocorrer secundárias a vários tipos de do-enças ou fármacos (lipodistrofias adquiridas). Lipodistrofias hereditárias sãocausadas por mutações em um gene.
Foram identificados vários genes responsáveis por diferentes ti-pos de lipodistrofias hereditárias. Estes incluem AGPAT2 (1 -acilglicerol-3-fosfato-O-aciltransferase 2), BSCL2 (lipodistrofia congênita 2 de Berardinelli-Seip), na Lipodistrofia Generalizada Congênita (CGL), gene Lamin A/C (LM-NA) na variedade de Dunnigan da Lipodistrofia Parcial Familial (Lipodistrofiaparcial familial), e gene PPARG (gama receptor ativado por proliferador do peroxissoma) em lipodistrofia parcial familial. Vários outros genes candidatosestão atualmente sob investigação para outras variedades de lipodistrofiashereditárias.Lipoclistrofias adquiridas são, por exemplo, Lipodistrofia induzidapor HAART (terapia antirretroviral altamente ativa)/HIV em pacientes infecta-dos com HIV (LD-HIV), Lipodistrofia Generalizada Adquirida (AGL)1 Lipodis-trofia Parcial Adquirida (APL), e Iocalized lipodistrofia. Lipodistrofias adquiri-das não têm uma base genética direta. Ao invés, muitos mecanismos podemestar envolvidos. Um mecanismo similar pode ser uma reação autoimuneque destrói células de gordura normais (Misra A. et ai, Medicine (BaItimore)83:18-34 (2004)).
Lipodistrofia induzida por HAART/HIV se tornou a forma adquiri-da mais comum de Lipodistrofia generalizada. A incidência global destasanormalidades físicas é cerca de 50% depois de 12 a 18 meses de terapiacom inibidores de protease. A diferença entre os presentes relatórios variade 18% a 83% por cento devido a fatores frustrantes tais como tipo e dura-ção da terapia retroviral. Tem sido sugerido que a síndrome de lipodistrofiaassociada com inibidores de protease pode ser devido a analogia parcialentre proteínas reguladoras de lipídeos e adipócitos e o sítio catalítico deprotease do HIV-1 ao qual os inibidores de protease ligam (Carr A. et ai,Lancet 351:1881-83 (1998)).
Lipodistrofias localizadas são definidas como um perda Iocaliza-da de gordura subcutânea de pequenas áreas ou de partes de um membro.Podem ser lesões únicas ou múltiplas, caracterizadas por áreas deprimidascorrespondentes à perda de gordura subcutânea. Em alguns casos, podeestar associada com nódulos moles, e doloroso na pele. Geralmente, ocorreem pacientes diabéticos no local das injeções de insulina. Em alguns pacien-tes, ocorre perda de gordura de áreas onde é aplicada pressão freqüente-mente (por exemplo, pressionando uma coxa contra uma mesa de maquilagem).
A patogênese da lipodistrofia é largamente desconhecida. Noentanto, pontos de evidência acumulando em um defeito mitocondrial comoum dos fatores para um aumento da indução de apoptose nos adipócitos.(Misra A. et ai, Medicine (BaItimore) 83:18-34 (2004)). Várias proteínas codi-ficadas por HIV-1 disparam apoptose induzindo a permeabilização da mem-brana mitocondrial. Vários análogos nucleosídicos usados clinicamente notratamento do HIV-1 inibem a replicação do DNA mitocondrial (mtDNA) e/ouaumentam a freqüência de mutações de mtDNA. Ambos estes fatores po-dem causar grave mitocondriopatia e contribuem para lipodistrofia. Um tra-tamento que pode inibir a apoptose dos adipócitos pode ser um tratamentomuito útil e especialmente prevenção para o desenvolvimento de Iipodistrofi-a, em particular na forma induzida por HIV/HAART.
As conseqüências metabólicas da lipodistrofia são extremamen-te importantes para a saúde geral e a sobrevida. O fato de que a resistênciaà insulina e a conseqüente progressão para o diabetes podem resultar ou deobesidade ou de lipodistrofia reflete o papel crucial do tecido adiposo no me-tabolismo dos carboidratos e lipídeos. Na ausência de adequada capacidadede adipócitos, o excesso de calorias não pode ser desviado para seu depósi-to de armazenamento normal; ao invés estas se acumulam como aumentodas reservas de triglicerídeos no fígado, no músculo esquelético e cardíaco,e em células β pancreáticas. Esta acumulação de lipídeos extra-adiposos,através de meios ainda não claros, está associada com ação prejudicada dainsulina e, freqüentemente, diabetes.
Além de seu papel passivo como depósitos de armazenamento,adipócitos normais secretam uma série de peptídeos ("adipocinas") que po-dem influenciar a sensibilidade à insulina e/ou o balanço de energia (KahnB.B. & Flier J.S., J. Clin. Invest. 106:473-81 (2000); Berg A.H. et ai, TrendsEndocrinol. Metab. 13:84-89 (2002)). Estes incluem potenciais sensibilizado-res de insulina, tais como Ieptina e Acrp30 (também conhecido como adipo-nectina), e antagonistas de insulina, incluindo TNF-α, IL-6, e possivelmeneresistina. A resistência à insulina da lipodistrofia portanto pode ser o resulta-do de fluxos de lipídeos alterados e/ou anormalidades da secreção de adi-pocina.
Tem sido reportado que a terapia com rhGH causa redução notamanho da "protuberância de búfalo" e da gordura troncular em um peque-no número de pacientes. No entanto, a perda de gordura e anormalidadesde lipídeos não aumentou e o controle da glicose sangüínea piorou (Lo J.C.et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 86:3480-87 (2001)).
Tratamento de Iipodistrofia usando um secretagogo, tal comovariante de junção de grelina ou um composto similar a variante de junçãode grelina, pode ser obtido usando qualquer administração método de co-nhecimento na técnica. Preferencialmente, tratamento pode ser obtido usan-do quaisquer dos métodos de administração descritos aqui, mais preferenci-almente usando administração intravenosa ou subcutânea, o mais preferen-cialmente usando métodos de administração subcutânea.
Qualidade de Vida
Em todas as modalidades, é preferencial que o método de tra-tamento e/ou composições farmacêuticas e/ou compostos da presente des-crição sejam capazes de proporcionar ao indivíduo tratado deste modo umamelhora da Qualidade de Vida, por exemplo, conforme é evidenciado pormelhora do apetite e/ou peso corporal e/ou estado nutricional e/ou função física. Portanto, um aspecto se refere a melhoras na Qualidade de Vida u-sando um secretagogo, tal como variante de junção de grelina ou um com-posto similar a variante de junção de grelina conforme definido acima.
Em outra modalidade, a melhora referida na Qualidade de Vidade um indivíduo é avaliada usando um questionário da "Qualidade de Vida", conforme é de conhecimento de uma pessoa versada na técnica.
Dois exames da Qualidade de Vida validados preferenciais parauso na avaliação da QOL aprimorada conforme provocado pela administra-ção dos compostos descritos aqui, são como se segue: (i) o Medicai Outco-mes Study Short-Form Health Survey (SF-36) e (ii) o questionário EORTC QLQ-C30 (+3). SF-36 contém 36 questões que avaliam oito aspectos daQualidade de Vida do paciente: funcionamento físico (PF), funcionamentofísico de parte (RP), dor corporal (BP), saúde geral (GH), vitalidade (VT),funcionamento social (SF), funcionamento emocional de parte (RE), e saúdemental (MH). De acordo com o manual e guia de interpretação, respostas aperguntas dentro de escalas são somadas e transformadas linearmente paraescores de escalas que variam de 0 (representando pobre estado de saúde)até 100 (representando ótimo estado de saúde). A versão sueca tem sidovalidada e dados normativos foram apresentados para a população suecageral (Sullivan M. et al., "Hãlsoenkàt: Svensk Manual och Tolkningsguide"(SF-36 Health Survey, Swedish Manual and Interpretation Guide), Gõteborg,Sahigrenska University Hospital, 1994).
EORTC QLQ-C30 (versão 3.0) é um questionário de núcleo de30 itens pretendido para avaliação da Qualidade de Vida entre pacientes(desenvolvido pelo grupo de estudo da Qualidade de Vida EORTC (EORTCQuaIityofLife Study group), vide o website dos National Institutes of Health evide, por exemplo, uma amostra do EORTC QLQ-C30 (versão 3.0, disponí-vel no website EORTC e incorporada aqui, a este pedido de patente, pormeio de referência). A primeira versão foi validada em pacientes com câncere foram publicados dados de referência de populações gerais. O questioná-rio compreende cinco escalas funcionais: funcionamento físico (cinco ques-tões), funcionamento de parte (duas questões), funcionamento emocional(quatro questões), funcionamento cognitivo (duas questões) e funcionamen-to social (duas questões). Há três escalas de sintomas: fadiga (três ques-tões), náusea e vômito (duas questões), e dor (duas questões). Há seis itensúnicos sobre dispnéia, insônia, perda de apetite, constipação, diarréia e difi-culdades financeiras. Duas questões globais são arguidas sobre o estado desaúde do paciente e a Qualidade de Vida global. Todas as escalas e medi-das de item único variam em escore de O a 100. Um alto escore para as es-calas de funcionamento e o estado de saúde e a Qualidade de Vida globaisrepresenta um alto nível de funcionamento/estado de saúde e Qualidade deVida. Um alto escore para as escalas de sintomas/itens representa um altonível de sintomas/problemas. Os escores da Qualidade de Vida podem sercalculados de acordo com o manual de classificação EORTC QLQ-C 30.
Questionários preferenciais para avaliar a qualidade de vida a-primorada de um paciente depois de tratamento com um ou mais secretago-go compostos são dados no Exemplo 9, abaixo.
Em modalidades preferenciais, o tratamento de um pacientecom uma ou mais condições descritas aqui, resulta em uma melhora signifi-cativa na Qualidade de Vida do paciente. Preferencialmente, o tratamentoresulta em um aumento significativo na Qualidade de Vida conforme medidausando qualquer método para testar a Qualidade de Vida incluindo, mas nãolimitado a, os questionários acima mencionados, por exemplo, um aumentono(s) escore(s) da Qualidade de Vida, ou um escore da Qualidade de Vidacomposto, conforme apropriado para a ferramenta de medição do indivíduo,ou uma redução em escore(s) relacionado(s) com os sintomas e/ou proble-mas, respectivamente.
Este aumento ou redução, respectivamente, preferencialmenteestá 1% acima do escore obtido antes do início do tratamento, mais prefe-rencialmente 2% acima, ainda mais preferencial 5%, tal como 10%, aindamais preferencial 20%, 50% ou 75% acima do escore pré-tratamento. Emoutra modalidade, o tratamento resulta em aumentos mensuráveis no escoreda Qualidade de Vida de tal modo que o escore depois do tratamento é igualao escore médio encontrado em um grupo de sujeitos saudáveis compará-veis, ou próximo a um escore "normal" similar, isto é, mais de 50% do esco-re, ainda mais preferencialmente 60% do escore, ou mais preferencialmente75% do escore. Além disso, em outra modalidade, o tratamento resulta emuma redução no um ou mais escores relacionados com os sintomas e/ouproblemas de no mínimo 1%, mais preferencialmente 3%, ainda mais prefe-rencialmente 5% ou mais preferencial 10%, 20%, 30% ou 50% do um oumais escores antes do início do tratamento. Estes aumentos ou reduções,respectivamente, podem se referir a um, vários, ou todos os aspectos daferramenta de medição da qualidade de vida do indivíduo, ou um escorocomposto quando apropriado.
Estimulacão do Apetite. Consumo de Alimento, Ganho de Peso,Aumento da Massa Magra Corporal, Aumento da Massa de Gordura Corporal
Conforme discutido acima, facilitar um ganho de peso ou facilitara manutenção do peso, em particular em indivíduos sofrendo de uma perdade peso patológica, é não somente uma questão de estimular o apetite e/ouo consumo de alimento mas ao invés também uma correção do desequilíbrioentre a captação de energia e o consumo de energia, isto é, o metabolismocorporal total. No entanto, alguns indivíduos ainda se beneficiarão de estimu-lação do apetite, particularmente aqueles indivíduos para os quais um pro-cesso patológico tem levado a um apetite reduzido, o qual naturalmente le-vará a uma perda de peso doentia. Portanto, um aspecto se refere à estimu-lação do apetite administrando um secretagogo, tal como um composto simi-lar a variante de junção de grelina. A estimulação do apetite pode ser medi-da usando por exemplo um escala análoga visual para medir o apetite, asensação de fome ou o nível de saciedade. Em uma modalidade preferenci-al, a estimulação é de no mínimo 5% comparada com antes do tratamento,tal como 10% maior, mais preferencialmente 20% maior ou ainda mais prefe-rencialmente 30%, 40% ou 50% maior.
A estimulação do apetite não leva necessariamente a um au-mento no consumo de alimento, e por conseguinte, a presente descriçãoadicional se refere a outro aspecto: a estimulação do consumo de alimento administrando um secretagogo, tal como um composto similar a variante dejunção de grelina.
O consumo de alimento pode ser medido usando um série detécnicas incluindo auto-relatório usando, por exemplo, diários ou questioná-rios, medições do consumo de calorias de uma refeição de buffet, usando pesagem do alimento antes da ingestão, ou pesagem e análise de quantida-des pareadas de alimento. O consumo de alimento pode ser medido em umabase por refeição, uma base diária, uma base semanal ou uma base mensal.Em uma modalidade preferencial, o tratamento resulta em um aumento de1 % no consumo de alimento, tal como um aumento de 2%, mais preferenci-almente de 3%, ou 5% ou 7%, e ainda mais preferencial de 10% acima doconsumo de alimento médio antes do início do tratamento. Em outra modali-dade, o tratamento leva a aumento no consumo de calorias independente dealterações no consumo de alimento, uma vez que a quantidade de alimentoingerido pode não estar diretamente relacionada com o consumo de calorias ingeridas, uma vez que os vários itens alimentares tais como gordura, car-boidratos e proteínas contêm diferentes quantidades de calorias por quanti-dade de alimento. Em uma modalidade preferencial, o tratamento resulta emum aumento de 1% no consumo de calorias, tal como um aumento de 2%,mais preferencialmente de 3%, ou 5% ou 7%, e ainda mais preferencial de10% no consumo de calorias.
Outro aspecto se refere à estimulação de ganho de peso oumanutenção de um peso corporal estável administrando um composto simi-lar a variante de junção de grelina.
Preferencialmente, o secretagogo, tal como um composto similara variante de junção de grelina, é útil para estimular o consumo de alimentoe o ganho de peso. Mais preferencialmente o secretagogo, tal como umcomposto similar a variante de junção de grelina, é útil para estimular ganhode peso ou para manter estável o peso corporal.
Conforme discutido abaixo, é preferencial que o secretagogo, talcomo um composto similar a variante de junção de grelina, é administradoantes de uma refeição, tal como dentro de 180 minutos antes de uma refei-ção, tal como dentro de 150 minutos antes de uma refeição, tal como dentrode 120 minutos antes de uma refeição, tal como dentro de 100 minutos an-tes de uma refeição, tal como dentro de 80 minutos antes de uma refeição,tal como dentro de 60 minutos antes de uma refeição, tal como dentro de 45minutos antes de uma refeição, tal como dentro de 30 minutos antes de umarefeição, tal como dentro de 15 minutos antes de uma refeição. Além disso,é preferencial que o composto similar a variante de junção de grelina é ad-ministrado por via subcutânea.
Além disso, um secretagogo, tal como um composto similar avariante de junção de grelina pode ser administrado para facilitar manuten-ção do funcionamento físico e/ou facilitar recuperação de função física, porexemplo, na recuperação de indivíduos de cirurgias maiores, tais como in-serção de uma prótese de quadril, amputações, fraturas ósseas, e cirurgiade coração aberto.
Em particular, um secretagogo, tal como um composto similar avariante de junção de grelina, é útil para tratamento de sujeitos abaixo dopeso, ou para prevenir perda de peso para um estágio de abaixo do peso.Sujeitos abaixo do peso incluem aqueles tendo um peso corporal de cercade 3%, 5% ou menos, 10% ou menos, 20% ou menos, ou 30% ou menos, doque a extremidade inferior da faixa de peso "normal" ou BMI. Faixas de peso"normal" são de conhecimento geral na técnica e levam em conta fatores taiscomo a idade de um paciente, a altura, e o tipo de corpo. Além disso, oscompostos descritos aqui, são adequados para tratar pacientes que sofre-ram uma perda de peso involuntária antes do início do tratamento, tal comoum perda de peso de 1% por mês, 2% ou menos por mês, ou 5% ou menospor 6 meses.
Aumentar o peso ou o apetite pode ser útil para um pacientetendo uma doença ou sofrendo tratamento que afeta o peso ou o apetite.Além disso, por exemplo, animais de criação tais como porcos, vacas e gali-nhas podem ser tratados para ganhar peso.
Um aumento na massa de gordura corporal de um indivíduo po-de ser prontamente avaliado pela pessoa versada usando uma série de téc-nicas conhecidas. Uma modalidade se refere a um aumento na massa degordura corporal sem o indivíduo ganhar peso global. Uma modalidade pre-ferencial leva a um aumento na gordura corporal de 2% comparado com an-tes do início do tratamento, mais preferencialmente de 4%, tal como de 5%,e 8% e 10%, ainda mais preferencialmente de 20% ou 40% acima dos valo-res pré-tratamento.
Condições adicionais de um indivíduo capazes de serem tratá-veis de acordo com a presente descrição são bulimia nervosa, anorexia, dis-função erétil masculina, disfunção sexual feminina, melhora de nervo isquê-mico ou de lesão muscular, bem como lúpus eritematoso sistêmico.
Administração Subcutánea
É importante notar que grelina e variante de junção de grelina a-tivam os GHS receptores e adicionalmentes receptores ainda a serem identi-ficados. Estes receptores são encontrados sobre células produtoras de GH,nos centros hipotalâmicos para controle do apetite e em uma série de locaisadicional no organismo. No sistema nervoso central, estes receptores sãosintonizados para receber sinais de neurônios contendo variantes de junçãode grelina locais. Variantes de junção de grelina secretadas perifericamenteou administradas artificialmente atingirão os sítios referidos e passarão abarreira sangüínea cerebral ativando especificamente os receptores apropri-ados e disparando um caminho específico. No entanto, os "denominados"secretagogos GH atualmente disponíveis, os quais são pequenos compostos orgânicos tais como MK-0677 (Merck), geralmente orientados para ligar oGHS receptor passarão a barreira sangüínea cerebral e também atingirãoestes sítios, ativando vários caminhos relacionados com GHS receptores econseqüentemente tendo o perigo de causar efeitos colaterais indesejadostais como vertigem, náusea, emagrecimento, insulina e glicose séricas emjejum elevadas, e visão turva. Portanto, os compostos referidos os quais têma vantagem de serem, por exemplo, oralmente ativos não serão otimizadospara simular a pré-refeição natural, aumento de indutor de apetite de varian-te de junção de grelina, uma vez que ativarão não especificamente todos oscaminhos relacionados com GHS receptores no corpo. Em contraste, usan- do o peptídeo natural, a própria variante de junção de grelina, ou homólogosdos mesmos, e administrando este perifericamente — como em uma moda-lidade preferencial — é assegurado que somente os receptores de variantede junção de grelina regulando o apetite e caminhos relevantes são atingi-dos e estimulados.
Qualquer forma de administração parenteral assegurará que osreceptores de variante de junção de grelina os quais normalmente são o alvopara variante de junção de grelina produzida perifericamente na situaçãopré-refeição serão expostos a níveis suficientes da forma bioativa de varian-te de junção de grelina para assegurar estimulação do apetite robusta e a- propriada, sem causar dessensibilização do sistema, pode ser parte de umamodalidade da presente descrição. No entanto, levando em conta que osindivíduos a serem tratados possivelmente terão de receber tratamento porum período mais longo, tal como semanas ou meses, é preferencial que aforma de administração seja conveniente para os mesmos. Por conseguinte,é preferencial que o secretagogo, tal como um composto similar a variantede junção de grelina, seja administrado por via subcutânea em uma quanti-dade possibilitando níveis suficientes da forma bioativa de variante de junçãode grelina, isto é, a forma acilada, para atingir os receptores antes da próxi-ma refeição.
A presente descrição preferencialmente lida com métodos paraadministrar um secretagogo, tal como variante de junção de grelina, em ummodo o qual simula a situação pré-refeição fisiologicamente tão próximoquanto possível ainda proporciona a pacientes que necessitem de aumentodo consumo de alimento, por exemplo, idosos frágeis, pacientes no pós-operatório, e/ou pacientes com perda de apetite como parte de caquexia porexemplo, precipitada por câncer, doença cardíaca, e etc., com um input extraestimulatório suficiente para seus receptores de variante de junção de greli-na reguladores do apetite, os quais normalmente são atingidos por variantede junção de grelina na situação pré-refeição.
Administração de Bolo
Além disso, de um ponto de vista farmacológico molecular, éimportante notar que foi visto que o receptor de grelina, e portanto o receptorde variante de junção de grelina, normalmente é exposto a picos de vida cur-ta na concentração de grelina. O GHS-R 1a receptor (receptor de secretago-go de hormônio do crescimento 1a) pertence à classe de receptores acopla-dos a proteína G ou 7TM receptores, os quais na exposição continuada a umagonista serão dessensibilizados, internalizados, e regulados para baixo.Estes mecanismos, os quais são inerentes para o sistema de transdução desinal global, envolvem processos tais como fosforilação do receptor (a qual,por si só, reduz a afinidade do receptor para o agonista) e ligação de proteí-nas inibitórias tais como arrestina (as quais bloqueiam estericamente a Iiga-ção de moléculas de transdução de sinal tais como proteínas G). Outra partedo processo de dessensibilização mediado por agonista é internalização dereceptor (isto é, remoção física do receptor da superfície celular onde podeligar o agonista) bem como regulação para baixo do receptor (isto é, reduçãoda produção/expressão do receptor). A internalização de receptores pode,depois de exposição de vida curta do receptor a agonista, ser seguida porum processo de ressensibilização, onde o receptor é desfosforilado e reci-clado para a superfície celular para ser usado novamente. Sem ser limitadopela teoria, acredita-se que, na estimulação prolongada que ocorreria, porexemplo, durante uma infusão contínua e duradoura do agonista, o processode regulação para baixo do receptor assegura que a célula alvo é ajustadaem seu sistema de transdução de sinal para esta situação.
Administração Otimizada
A presente descrição também proporciona um procedimento pa-ra uma administração otimizada de variante de junção de grelina aos pacien-tes de modo a obter uma resposta máxima e a evitar, por exemplo, meca-nismos de dessensibilização.
Por conseguinte, um aspecto se refere à administração de umsecretagogo, tal como um composto similar à variante de junção de grelina,em bolo, preferencialmente um bolo antes de cada refeição principal. Foivisto que, ao contrário dos processos de administração prolongada da técni-ca anterior, que a administração de um bolo leva não somente à estimulaçãodo apetite, mas também à estimulação do consumo de alimento e mais im-portante à estimulação de ganho de peso. Sem ser limitado pela teoria, a-credita-se que injeção subcutânea pré-refeição, injeção intravenosa, ou infu-sões de curta duração de doses apropriadas de um secretagogo, tal comovariante de junção de grelina ou um composto similar a variante de junçãode grelina, assegurarão que serão obtidos alguns receptores de variante dejunção de grelina indutores de forte estimulação do apetite com mínima res-trição para, por exemplo, a mobilidade do paciente. Portanto, por exemplo,pacientes com fraturas do quadril podem, na situação do pós-operatório, sertratados no período pré-refeição e, caso requerido durante a refeição comotal, ser livres para mover de um lado para o outro e participar dos importan-tes regimes fisicoterapêuticos do pós-operatório. Em uma modalidade prefe-rencial, um secretagogo tal como variante de junção de grelina ou um com-posto similar a variante de junção de grelina é administrado como um boloem uma quantidade equivalente a 10 pg por kg de peso corporal.
Composto Similar a Variante de Junção de Grelina
Qualquer secretagogo, tal como variante de junção de grelina ouum composto similar a variante de junção de grelina, pode ser usado nosmétodos presentemente descritos. Um tipo preferencial de composto similara variante de junção de grelina descrito aqui, é um composto compreenden-do uma estrutura definida pela Fórmula I: Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em queZ1 é um grupo protetor opcionalmente presente; cada X1 é de modo inde-pendente selecionado entre um aminoácido que ocorre naturalmente e umaminoácido sintético; X2 é selecionado entre um aminoácido que ocorre na-turalmente e um aminoácido sintético, o referido aminoácido sendo modifi-cado com um grupo hidrofóbico volumoso; cada X3 é de modo independenteselecionado entre um aminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácidosintético, em que um ou mais de X1 e X3 opcionalmente podem ser modifi-cados com um grupo hidrofóbico volumoso; Z2 é um grupo protetor opcio-nalmente presente; m é um número inteiro na faixa de a partir de 1 a 10; η éum número inteiro na faixa de a partir de 4 a 92; contanto que o composto deacordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 tenha 15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo 80% (ou, em modalidades alternativas, 85%,90%, 93%, 95%, 97%, 98%, 99%, 100%) de homologia com a SEQ ID NO:1. Em uma modalidade preferencial, o composto similar a variante de junçãode grelina tem 22-29 aminoácidos de extensão.
Por conseguinte, o termo "secretagogo" inclui a variante de jun-ção de grelina humana de 29 aminoácidos que ocorre naturalmente, cujaseqüência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO: 5, bem como a vari-ante de junção de grelina humana de 22 aminoácidos que ocorre natural-mente, cuja seqüência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO: 2, e avariante de junção de grelina humana de 24 aminoácidos que ocorre natu-ralmente, cuja seqüência é mostrada na SEQ ID NO: 3.
A presente descrição inclui diastereômeros bem como suas for-mas racêmicas e resolvidas enantiomericamente puras. Secretagogos po-dem conter D-aminoácidos, L-aminoácidos, alfa-aminoácido, beta-aminoácido, gama-aminoácido, aminoácido natural e/ou aminoácido sintéticoou similares ou uma combinação dos mesmos. Preferencialmente, aminoá-cidos presentes em um composto similar a variante de junção de grelina sãoos L-enantiômeros.O composto similar a variante de junção de grelina preferenci-almente compreende um aminoácido modificado com um grupo hidrofóbicovolumoso. O número de aminoácidos N-terminal ao aminoácido modificadopreferencialmente está dentro da faixa de a partir de 1 a 9. Por conseguinte,m é preferencialmente um inteiro na faixa de a partir de 1 a 9, tal como de apartir de 1 a 8, tal como de a partir de 1 a 7, tal como de a partir de 1 a 6, talcomo de a partir de 1 a 5, tal como de a partir de 1 a 4, tal como de a partirde 1 a 3, tal como de a partir de 1 a 2, tal como 2.
É mais preferencial que o número de aminoácidos N-terminalmente ao aminoácido modificado seja baixo, tal como de a partir de1 a 3, tal como de a partir de 1 a 2. O mais preferencialmente 2 aminoácidosestão posicionados N-terminal ao aminoácido modificado.
Em uma modalidade preferencial, (X1)m tem um resíduo Gly naparte N-terminal da seqüência. Por conseguinte, em modalidade preferenci-al, (X1)m é selecionado entre as seqüências: Gly, Gly-Ser, Gly-Cys, Gly-Lys,Gly-Asp, Gly-GIu, Gly-Arg, Gly-His, Gly-Asn, Gly-Gln, Gly-Thr, e Gly-Tyr.Mais preferencialmente (X1)m é selecionado entre Gly-Ser, e Gly-Cys; omais preferencialmente (X1)m é Gly-Ser.
Em outras palavras, em uma modalidade preferencial o compos-to similar a variante de junção de grelina é selecionado entre Z1-Gly-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 (Fórmula II), Z1-Gly-Ser-(X2)-(X3)n-Z2 (Fórmula III), e Zl-Gly-(X2)-(X3)n-Z2 (Fórmula IV). Mais preferencialmente, o composto similar avariante de junção de grelina tem Fórmula III.
Conforme descrito acima, X2 pode ser qualquer aminoácidomodificado com um grupo hidrofóbico volumoso. Em particular, X2 é selecio-nado entre o grupo consistindo em Ser modificado, Cys modificado, Asp mo-dificado, Lys modificado, Trp modificado, Phe modificado, Ile modificado, eLeu modificado. Mais preferencialmente, X2 é selecionado entre o grupoconsistindo em Ser modificado, Cys modificado, e Lys modificado; o maispreferencialmente X2 é Ser modificado.
Além disso, (X1)m-(X2) é preferencialmente Gly-Xaa-Ser* ouGly-Xaa-Cys*, em que Xaa é qualquer aminoácido, mais preferencialmente(X1)m-(X2) é Gly-Ser-Ser* or Gly-Ser-Cys*, em que * indica que o resíduoaminoácido é modificado com um grupo hidrofóbico volumoso.
(X3)n preferencialmente compreende uma seqüência a qual éum fragmento de variante de junção de grelina, tal como variante de junçãode grelina humana. Por conseguinte, (X3)n preferencialmente compreendeum fragmento da seguinte seqüência (SEQ ID NO: 6): Phe Leu Ser Pro GluHis Gln Arg Val Gln Val Arg Pro Pro His Lys Ala Pro His Val Val Pro Ala LeuPro Leu Ser Asn Gln Leu Cys Asp Leu Glu Gln Gln Arg His Leu Trp Ala SerVal Phe Ser Gln Ser Thr Lys Asp Ser Gly Ser Asp Leu Thr Val Ser Gly ArgThr Trp Gly Leu Arg Val Leu Asn Arg Leu Phe Pro Pro Ser Ser Arg Glu ArgSer Arg Arg Ser His Gln Pro Ser Cys Ser Pro Glu Leu.
Em uma modalidade preferencial, a extensão do composto simi-lar a variante de junção de grelina é substancialmente similar à extensão degrelina humana processada, isto é, 29 aminoácidos. Por conseguinte, η épreferencialmente um inteiro na faixa de a partir de 4 a 25, tal como de apartir de 4 a 24, tal como de a partir de 4 a 22, tal como de a partir de 4 a 15,tal como de a partir de 4 a 10, tal como de a partir de 10 a 25, tal como de apartir de 10 a 24, tal como de a partir de 15 a 25, tal como de a partir de 15 a24. O mais preferencialmente, um composto similar a variante de junção degrelina é a variante de junção de grelina humana de 29 aminoácidos, cujaseqüência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO: 5; é a variante dejunção de grelina humana de 22 aminoácidos, cuja seqüência de aminoáci-dos é mostrada na SEQ ID NO: 2; é a variante de junção de grelina humanade 24 aminoácidos, cuja seqüência de aminoácidos é mostrada na SEQ IDNO: 3; ou é a variante de junção de grelina humana de 24 aminoácidos ten-do um resíduo ácido 2,3-diaminopropiônico (Dpr) na terceira posição, cujaseqüência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO: 4.
Funcionalidade
Os secretagogos descritos aqui, são ativos no receptor paraGHS conforme descrito acima, isto é, o receptor GHS-R 1a. Os compostospodem ligar a GHS-R 1a, e preferencialmente, estimulam atividade de recep-tor. Em algumas modalidades, os compostos podem ligar outros receptorese, opcionalmente, estimular sua atividade.
A atividade de receptor pode ser medida usando diferentes téc-nicas tais como detectando uma alteração na conformação intracelular doreceptor, nas atividades ligadas a proteína G, e/ou nos mensageiros intrace-lulares. Uma simples medida da capacidade de um composto similar a vari-ante de junção de grelina para ativar o receptor de variante de junção degrelina é medir sua EC50, isto é, a dose na qual o composto é capaz de ati-var a sinalização do receptor até metade do efeito máximo do composto. Aomedir, por exemplo, a EC50, o receptor pode ou ser expressado endogena- mente sobre culturas de células primárias, por exemplo, células da pituitária,ou expressado heterologamente sobre células transfectadas com o receptorde grelina. Provas de células inteiras ou provas usando membranas prepa-radas a partir de quaisquer destes tipos de células podem ser usadas de-pendendo do tipo de teste.
Como se acredita que o receptor geralmente seja essencialmen-te ligado ao caminho de sinalização Gq, pode ser usada qualquer prova a-dequada a qual monitore a atividade no caminho de sinalização Gq/G11, porexemplo:
1) Uma prova medindo a ativação de Gq/G11 realizada,20 por exemplo, por medição de ligação de GTPgS combinada com, por exem-plo, precipitação de anticorpos anti-G-alfa-q ou -11 de modo a aumentar aproporção de sinal para ruído. Esta prova também pode detectar ligação aoutras proteínas G diferentes de Gq/11.
2) Uma prova a qual mede a atividade de fosfolipase C(PLC), uma das primeiras moléculas efetoras a jusante no caminho, por e-xemplo, medindo a acumulação de fosfato de inositol o qual é um dos produ-tos de PLC.
3) Mais a jusante na cascata de sinalização está a mobili-zação de cálcio a partir das reservas intracelulares, as quais podem ser me-didas por qualquer método conhecido por uma pessoa de conhecimento re-gular na técnica.
4) Ainda mais a jusante, sinalização de moléculas tal comoa atividade de diferentes tipos de MAP quinases (p38, jun, e etc.), transloca-ção de NFkB e transcrição genética orientada por CRE também podem sermedidas.
5) Ligação de arrestina, etiquetada com fluorescente, aoreceptor de grelina ativado.
Exemplos de protocolos adequados para uso na determinaçãoda funcionalidade de secretagogos são dados no Exemplo 4, abaixo.
Em uma modalidade, a ligação de um composto ao GHS-R 1areceptor pode ser medida pelo uso do teste descrito acima aqui.
Um composto similar a variante de junção de grelina preferenci-almente tem no mínimo cerca de 50%, no mínimo cerca de 60%, no mínimocerca de 70%, no mínimo cerca de 80%, ou no mínimo cerca de 90%, deatividade funcional relativa à grelina selvagem humana de 28 aminoácidosconforme determinado usando um teste descrito acima aqui, e/ou uma EC50maior do que cerca de 1.000, maior do que cerca de 100, ou maior do quecerca de 50, ou maior do que cerca de 10. Maior do que se refere a potênciae portanto indica que uma quantidade menor é necessária para obter inibi-ção da ligação.
Em uma modalidade, o composto tem potência (EC50) sobre oGHS-R 1a de menos de 500 nM. Em outra modalidade o composto tem umpotência (EC50) sobre o GHS-R 1a de menos de 100 nM, tal como menosde 80 nM, tal como menos de 60 nM, tal como menos de 40 nM, tal comomenos de 20 nM, tal como menos de 10 nM, tal como menos de 5 nM, talcomo menos de 1 nM, tal como menos de 0,5 nM, tal como menos de 0,1nM, tal como menos de 0,05 nM, tal como menos de 0,01 nM.
Em um adicional modalidade, a constante de dissociação (Kd)do composto é menos de 500 nM. Em ainda uma modalidade adicional aconstante de dissociação (Kd) do Iigante é menos de 100 nM, tal como me-nos de 80 nM, tal como menos de 60 nM, tal como menos de 40 nM, tal co-mo menos de 20 nM, tal como menos de 10 nM, tal como menos de 5 nM,tal como menos de 1 nM, tal como menos de 0,5 nM, tal como menos de 0,1nM, tal como menos de 0,05 nM, tal como menos de 0,01 nM.Provas de ligação podem ser realizadas usando polipeptídeosreceptores produzidos de modo recombinante presentes em diferentes am-bientes. Os ambientes referidos incluem, por exemplo, extratos celulares eextratos celulares purificados contendo o polipeptídeo receptor expressado apartir de ácido nucleico recombinante ou ácido nucleico que ocorre natural-mente, e também incluem, por exemplo, o uso de um polipeptídeo receptorde GHS purificado produzido por meios recombinantes ou de ácido nucleicoque ocorre naturalmente o qual é introduzido em um ambiente diferente.
Usar um receptor de GHS expressado de modo recombinanteoferece várias vantagens, tais como a capacidade de expressar o receptorem um sistema celular definido, de modo que uma reação a um composto noreceptor pode ser mais prontamente diferenciada de reações a outros recep-tores. Por exemplo, o receptor pode ser expressado em um linhagem celulartal como HEK 293, COS 7, e CHO não expressando normalmente o receptorpor um vetor de expressão, em que a mesma linhagem celular sem o vetorde expressão pode agir como um controle.
Identidade e Homologia
O termo "identidade" ou "homologia" será considerado para sig-nificar a percentagem de resíduos aminoácidos na seqüência candidata quesão idênticos ao resíduo de uma seqüência correspondente à qual é compa-rada, depois de alinhar as seqüências e introduzir intervalos, caso necessá-rio para obter a máxima percentagem de identidade para a seqüência inteira,e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte daidentidade da seqüência. Nem extensões de N- ou C-terminal nem inserçõesdevem ser consideradas como reduzindo a identidade ou homologia. Méto-dos e programas de computador para o alinhamento são de conhecimentogeral na técnica. A identidade de seqüência pode ser medida usando pro-grama de análise de seqüência (por exemplo, Sequence Analysis SoftwarePackage, Genetics Computer Group, University of Wisconsin BiotechnologyCenter, Madison, Wis.). Este software combina seqüências similares atribu-indo graus de homologia a várias substituições, eliminações, e outras modifi-cações.Um homólogo de variante de junção de grelina de uma ou maisdas seqüências especificadas aqui, pode variar em um ou mais aminoácidoscomparado com as seqüências definidas, mas é capaz de realizar a mesmafunção, isto é, um homólogo pode ser considerado como um equivalentefuncional de uma seqüência predeterminada.
Um homólogo de variante de junção de grelina é preferencial-mente um composto similar a variante de junção de grelina conforme defini-do acima.
Conforme descrito acima, um homólogo de quaisquer das se-qüências predeterminadas aqui, pode ser definido como i) homólogos com-preendendo uma seqüência de aminoácidos capaz de ser reconhecida porum anticorpo, o referido anticorpo também reconhecendo a variante de jun-ção de grelina humana de 22 aminoácidos e/ou a de 24 aminoácidos e/ou avariante de junção de grelina humana de 29 aminoácidos, preferencialmentea variante de junção de grelina humana acilada de 22 aminoácido e/ou a de24 aminoácidos e/ou a variante de junção de grelina humana de 29 aminoá-cidos, e/ou ii) homólogos compreendendo uma seqüência de aminoácidoscapaz de ligar seletivamente a GHS-R 1a, e/ou iii) homólogos tendo um mai-or afinidade de ligação ou substancialmente para GHS-R 1a do que a varian- te de junção de grelina humana de 22 aminoácidos e/ou a de 24 aminoáci-dos e/ou a variante de junção de grelina humana de 29 aminoácidos, prefe-rencialmente a variante de junção de grelina humana acilada de 22 aminoá-cidos e/ou a de 24 aminoácidos e/ou a variante de junção de grelina humanade 29 aminoácidos. (A variante de junção de grelina humana de 22 samino-ácido e/ou a de 24 aminoácidos e/ou a de 29 aminoácidos podem ter a se-qüência mostrada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, ou SEQID NO: 5, e, quando acilada, é acilada na posição 3.)
Os anticorpos usados aqui, podem ser anticorpos ligando a re-gião N-terminal de variante de junção de grelina ou a região C-terminal devariante de junção de grelina, preferencialmente a região N-terminal. Os an-ticorpos podem ser anticorpos conforme descrito em Ariyasu H. et ai, Endo-crinology 143:3341-50 (2002).Homólogos típicos compreendem uma ou mais substituições deaminoácidos conservativas incluindo uma ou mais substituições de aminoá-cidos conservativas dentro do mesmo grupo de aminoácidos predetermina-dos, ou um pluralidade de substituições de aminoácidos conservativas, emque cada substituição conservativa é gerada por substituição dentro de umgrupo diferente de aminoácidos predeterminados. Homólogos portanto po-dem compreender substituições conservativas independentes umas das ou-tras, em que no mínimo uma glicina (GIy) do referido homólogo é substituídacom um aminoácido selecionado entre o grupo de aminoácidos consistindoem Ala, Vai, Leu, e lie, e independentemente dos mesmos, homólogos, emque no mínimo uma das referidas alaninas (Ala) do referido homólogo dosmesmos é substituída com um aminoácido selecionado entre o grupo de a -minoácidos consistindo em Gly, Vai, Leu, e lie; e, independentemente dosmesmos, homólogos em que no mínimo uma valina (Val) do referido homó-logo dos mesmos é substituída com um aminoácido selecionado entre ogrupo de aminoácidos consistindo em Gly, Ala, Leu, e lie; e, independente-mente dos mesmos, homólogos em que no mínimo uma das referidas Ieuci-nas (Leu) do referido homólogo dos mesmos é substituída com um aminoá-cido selecionado entre o grupo de aminoácidos consistindo em Gly, Ala, Vai,e lie; e, independentemente dos mesmos, homólogos em que no mínimouma isoleucina (IIe) do referido homólogos dos mesmos é substituída comum aminoácido selecionado entre o grupo de aminoácidos consistindo emGly, Ala, Val e Leu; e, independentemente dos mesmos, homólogos em queno mínimo um dos referidos ácidos aspárticos (Asp) do referido homólogodos mesmos é substituído com um aminoácido selecionado entre o grupo deaminoácidos consistindo em Glu, Asn, e Gln; e, independentemente dosmesmos, homólogos em que no mínimo uma das referidas fenilalaninas(Phe) do referido homólogos dos mesmos é substituída com um aminoácidoselecionado entre o grupo de aminoácidos consistindo em Tyr, Trp, His, ePro, e preferencialmente selecionada entre o grupo de aminoácidos consis-tindo em Tyr e Trp; e, independentemente dos mesmos, homólogos em queno mínimo uma das referidas tirosinas (Tyr) do referido homólogos dosmesmos é substituída com um aminoácido selecionado entre o grupo de a-minoácidos consistindo em Phe1 Trp, His, e Pro1 preferencialmente um ami-noácido selecionado entre o grupo de aminoácidos consistindo em Phe eTrp; e, independentemente dos mesmos, homólogos em que no mínimo umadas referidas argininas (Arg) do referido fragmento é substituída com um a-minoácido selecionado entre o grupo de aminoácidos consistindo em Lys eHis; e, independentemente dos mesmos, homólogos em que no mínimo umaIisina (Lys) do referido homólogos dos mesmos é substituída com um ami-noácido selecionado entre o grupo de aminoácidos consistindo em Arg e His;e, independentemente dos mesmos, homólogos em que no mínimo uma dasreferidas asparaginas (Asn) do referido homólogos dos mesmos é substituí-da com um aminoácido selecionado entre o grupo de aminoácidos consistin-do em Asp, Glu, e Gln; e, independentemente dos mesmos, homólogos emque no mínimo uma glutamina (GIn) do referido homólogos dos mesmos ésubstituída com um aminoácido selecionado entre o grupo de aminoácidosconsistindo em Asp, Glu, e Asn; e, independentemente dos mesmos, homó-logos em que no mínimo uma prolina (Pro) do referido homólogos dos mes-mos é substituída com um aminoácido selecionado entre o grupo de amino-ácidos consistindo em Phe, Tyr, Trp, e His; e, independentemente dos mes-mos, homólogos em que no mínimo uma das referidas cisteínas (Cys) doreferido homólogos dos mesmos é substituída com um aminoácido selecio-nado entre o grupo de aminoácidos consistindo em Asp, Glu, Lys, Arg, His,Asn, Gln, Ser, Thr, e Tyr.
Substituições conservativas podem ser introduzidas em qual-quer posição de uma seqüência predeterminada preferencial. No entantotambém pode ser desejável introduzir substituições não-conservativas, parti-cularmente, mas não limitadas a, uma substituição não-conservativa emqualquer uma ou mais posições.
Uma substituição não-conservativa levando à formação de umhomólogo funcionalmente equivalente das seqüências aqui, iriam, por exem-plo, i) diferir substancialmente em polaridade, por exemplo, um resíduo comuma cadeia lateral não-polar (Ala, Leu, Pro, Trp, Vai, lie, Gly, Leu, Phe ouMet) substituída por um resíduo com uma cadeia lateral polar tal como Ser,Thr1 Cys1 Tyr, Asn, ou Gln ou um aminoácido carregado tal como Asp, Glu,Arg, ou Lys1 ou substituindo um carregado ou um resíduo polar por um resí-duo não-polar; e/ou ii) diferir substancialmente em seu efeito sobre a orien-tação da espinha dorsal do polipeptídeo tal como substituição de ou para Proou Gly por outro resíduo; e/ou iii) diferir substancialmente em carga elétrica,por exemplo, substituição de um resíduo negativamente carregado tal comoGlu ou Asp por um resíduo positivamente carregado tal como Lys, His ouArg (e vice-versa); e/ou iv) diferir substancialmente em volume estérico, porexemplo, substituição de um resíduo volumoso tal como His, Trp, Phe ou Tyrpor um tendo uma cadeia lateral menor, por exemplo, Ala, Gly ou Ser (e viceversa).
A substituição de aminoácidos pode em uma modalidade ser fei-ta com base em seus valores de hidrofobicidade e hidrofilicidade e a relativasimilaridade dos substituintes da cadeia lateral de aminoácidos, inclusivecarga, tamanho, e similares. Substituições de aminoácidos típicas as quaistomam várias das características precedentes em consideração são de co-nhecimento geral daqueles versados na técnica e incluem, por exemplo, ar-ginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e aspara-gina; e valina, leucina, e isoleucina.
Em uma modalidade preferencial, o domínio de ligação compre-ende um homólogo tendo uma seqüência de aminoácidos no mínimo 60%homóloga à SEQ ID NO: 1. Mais preferencialmente a homologia é de no mí-nimo 65%, tal como no mínimo 70% homóloga, tal como no mínimo 75%homóloga, tal como no mínimo 80% homóloga, tal como no mínimo 85%homóloga, tal como no mínimo 90% homóloga, tal como no mínimo 95%homóloga, tal como no mínimo 98% homóloga à SEQ ID NO: 1. Em umamodalidade mais preferencial, as percentagens mencionadas acima se refe-rem à identidade da seqüência de um homólogo comparado com a SEQ IDNO: 1. Homólogos para a SEQ ID NO: 1 podem ser variante de junção degrelina humana de 22 aminoácidos (SEQ ID NO: 2), variante de junção degrelina humana de 24 aminoácidos (SEQ ID NO: 3), ou variante de junçãode grelina humana de 29 aminoácidos (SEQ ID NO: 5). Outros homólogossão as variantes descritas na patente européia No. EP 1 197 496 (Kanga-wa), incorporada aqui, a este pedido de patente, por meio de referência.
Grupo Hidrofóbico Volumoso
O grupo hidrofóbico volumoso de secretagogos descrito aqui, équalquer grupo hidrofóbico volumoso capaz de proporcionar a grelina selva-gem humana de 28 aminoácidos desacilada, ou um análogo da mesma, comafinidade de ligação para GHS-R 1a e ou GS-R-lb. Qualquer aminoácidoadequado pode ser modificado com qualquer grupo hidrofóbico volumosoadequado. Em uma modalidade preferencial, um resíduo Ser (preferencial-mente, aminoácido número 3 na cadeia de aminoácidos da variante de jun-ção de grelina) é modificado com o grupo hidrofóbico volumoso. Quando oaminoácido sendo modificado contém, por exemplo, -OH, -SH, -NH ou -NH2como um grupo substituinte em uma cadeia Iareral do mesmo, um grupoformado acilando um grupo substituinte similar é preferencial. O modo deligação portanto pode ser selecionado entre o grupo consistindo em éster,éter, tioéster, tioéter, amida e carbamida. Por exemplo, se o aminoácido mo-dificado for serina, treonina, tirosina ou oxiprolina, o aminoácido tem um gru-po oxidrila na cadeia lateral. Se o aminoácido modificado for cisteína, o ami-noácido tem um grupo mercapto na cadeia lateral. Se o aminoácido modifi-cado for lisina, arginina, histidina, triptofano, prolina ou oxiprolina, tem umgrupo amino ou grupo imino na cadeia lateral.
O grupo hidroxila, grupo mercapto, grupo amino e grupo iminodescritos acima podem portanto ser quimicamente modificados. Isto é, ogrupo oxidrila ou grupo mercapto pode ser, por exemplo, eterificado, esterifi-cado, tioeterifiçado ou tioesterificado. O grupo imino pode ser, por exemplo,iminoeterificado, iminotioeterificado ou alquilado. O grupo amino pode ser,por exemplo, amidado, tioamidado ou carbamidado. Além disso, o grupomercapto pode ser, por exemplo, dissulfidado; o grupo imino pode ser, porexemplo, amidado ou tioamidado; e o grupo amino pode ser, por exemplo,alquilado ou tiocarbamidado.
Em uma modalidade preferencial, o aminoácido modificado éSer acoplado através de uma ligação éster ao grupo hidrofóbico ou, em ou-tra modalidade preferencial, o aminoácido modificado é Dpr acoplado atra-vés de uma ligação amida ao grupo hidrofóbico.
O grupo hidrofóbico pode ser qualquer grupo com um grupo al-quila ou acila saturado ou insaturado contendo um ou mais átomos de car-bono. Em uma modalidade, o grupo hidrofóbico volumoso é um grupo acila,incluindo grupos formados removendo um grupo oxidrila de um ácido carbo-xílico orgânico, ácido sulfônico orgânico ou ácido fosfórico orgânico. O ácidocarboxílico orgânico inclui, por exemplo, ácidos graxos, e o número de áto-mos de carbono dos mesmos é preferencialmente de 1 a 35. No ácido sulfô-nico orgânico ou ácido fosfórico orgânico, o número de átomos de carbonodos mesmos é preferencialmente de 1 a 35.
Por conseguinte, o grupo acila é preferencialmente selecionadoentre um grupo C1-C35 acila, tal como um grupo C1-C20 acila, tal como umgrupo C1-C15 acila, tal como um grupo C6-C15 acila, tal como um grupo C6-C12 acila, tal como um grupo C8-C12 acila. Mais preferencialmente, o grupoacila é selecionado entre o grupo consistindo em grupo C7 acila, grupo Ceacila, grupo C9 acila, grupo C10 acila, grupo Cn acila, e grupo C12 acila. Ogrupo acila referido pode ser formado de ácido octanóico (preferencialmenteácido caprílico), ácido decanóico (preferencialmente ácido cáprico), ou ácidododecanóico (preferencialmente ácido láurico), bem como ácidos graxos demonoeno ou polieno dos mesmos.
Além disso, o aminoácido modificado pode ser qualquer amino-ácido em que um grupo é modificado conforme descrito na patente européiaNo. EP 1 197 496 (Kangawa), a qual é por este incorporada por meio de re-ferência.
Grupo Protetor
O composto similar a variante de junção de grelina de acordocom a presente descrição pode compreender um grupo protetor no N-término ou no C-término ou em ambos. Um grupo protetor ligado de modocovalente ao grupo amino N-terminal reduz a reatividade do término aminosob condições in vivo. Grupos protetores amino incluem, por exemplo, C1-Cio alquila, C1-C10 alquila substituído, C2-C10 alquenila, C2-C10 alquenilasubstituído, arila, C1-C6 alquila arila, C(0)-(CH2)-(C1-C6 alquila)-COOH,C(0)-(C1-C6 alquila), C(0)-arila, C(0)-0-(C1-C6-alquila), ou C(0)-0-arila. Pre-ferencialmente, o grupo protetor de término amino é acetila, propila, succini-la, benzila, benzilaoxicarbonil ou t-butiloxicarbonil.
Um grupo protetor ligado de modo covalente ao grupo carbóxide C-terminal reduz a reatividade do término carbóxi sob condições in vivo.O grupo protetor de término carbóxi é preferencialmente fixado ao grupo a-carbonil do último aminoácido. Grupos protetores de término carbóxi inclu-em, por exemplo, amida, metilamida, e etilamida.
Conjugados
O secretagogo, tal como um composto similar a variante de jun-ção de grelina, pode ser proporcionado sob a forma de um conjugado desecretagogo, isto é, uma molécula compreendendo o secretagogo conjugadoa outra entidade. A outra entidade pode ser qualquer substância que é capazde conferir propriedades aprimoradas ao secretagogo, por exemplo, em ter-mos de aprimorada estabilidade, meia-vida, e etc. Exemplos de entidadesadequadas são descritos a seguir. Por exemplo, o secretagogo pode serconjugado a um peptídeo, tal como um peptídeo tendo efeito sobre receptorde nociceptina ORL1. Em uma modalidade, o conjugado é um conjugado devariante de junção de grelina ou um derivado ou homólogo do mesmo e umpeptídeo tendo efeito sobre ORL1, por exemplo, o peptídeo Ac-RYY (RK)(WI) RK)-NH2, onde os parênteses mostram variação adequada de resíduosaminoácidos. Exemplos de outros peptídeos adequados são encontrados noPedido de Patente U.S. Publicado Nos. 2003/040472 e 2002/004483, e naPatente U.S. No. 5.869.046, cada um dos quais é incorporado aqui, por refe-rência.
Em outra modalidade, um secretagogo, tal como variante dejunção de grelina ou um composto similar a variante de junção de grelina, éconjugado a uma molécula de polímero. A molécula de polímero pode serqualquer molécula de polímero adequada, tal como um polímero natural ousintético, tipicamente com um peso molecular na faixa de cerca de 1 a 100kDa, tal como cerca de 3 a 20 kDa, tal como 5 a 10 kDa. O polímero é fixadoa um grupo reativo presente sobre o secretagogo, por exemplo, um grupoamina ou um grupo tiol. Exemplos de moléculas de polímeros adequadasincluem moléculas de polímeros selecionadas entre o grupo consistindo emóxido de polialquileno (PAO), incluindo polialquileno glicol (PAG), tal comopolietileno glicol linear ou ramificado (PEG) e polipropileno glicol (PPG); ál-cool polivinílico (PVA); policarboxilato; poli-(vinilpirolidona); polietileno-eo-maléico ácido anidrido; poliestireno-co-maléico ácido anidrido; e dextrano,incluindo carboximetil-dextrano. Preferencialmente, a molécula de polímero éum PEG molécula, em particular um PEG monofuncional, tal como metoxipo-Iietileno glicol (mPEG). Moléculas PEG ativadas adequadas estão disponí-veis, por exemplo, na Nektar Therapeutics Inc. (Huntsville, Ala.) ou Valentis,Inc. (Burlingame, Cal.). Alternativamente, as moléculas de polímeros podemser ativadas por métodos convencionais conhecidos na técnica, por exem-pio, conforme descrito na publicação de patente internacional No. WO90/13540, incorporada aqui, por meio de referência. Exemplos específicosde polímeros PEG ativados incluem os seguintes PEGs lineares: NHS-PEG(por exemplo, SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, e SCM-PEG), NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG, eMAL-PEG, e PEGs ramificados tais como PEG2-NHS e aqueles descritosnas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.932.462 e 5.643.575, ambas asquais são incorporadas aqui, a este pedido de patente, por meio de referên-cia.
A PEGuilação (isto é, conjugação do polipeptídeo secretagogo ea molécula de polímero ativada) é conduzida de acordo com procedimentosestabelecidos, por exemplo, conforme descrito nas seguintes referências (asquais também descrevem métodos adequados para ativação de moléculasde polímeros): R.F. Taylor, (1991), "Protein Immobilization. Fundamentaisand Applications", Mareei Dekker, N. Y.; S.S. Wong, (1992), "Chemistry ofProtein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G.T. Her-manson et ai, (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", AcademicPress, Ν. Y.).
Também é contemplado de acordo com a presente descriçãoacoplar as moléculas de polímeros ao secretagogo através de um encadea-dor. Encadeadores adequados são de conhecimento geral da pessoa versa-da. Um exemplo preferencial é cloreto cianúrico (Abuchowski A. et ai, J. Bi-ol. Chem. 252:3578-81 (1977); Patente U.S. No. 4.179.337; Shafer et ai, J.Polym. Sei. Polym. Chem. Ed. 24:375-78 (1986)).
Em ainda outra modalidade, o secretagogo é conjugado a umamolécula de oligossacarídeo, tal como dextrano, glicano, transferrina, e etc.A conjugação referida pode ser obtida de acordo com tecnologias estabele-cidas, por exemplo, as disponíveis na Neose Technologies, Inc. (Horsham,PA).
Em ainda outra modalidade, o secretagogo é conjugado a umaregião Fc de uma molécula de IgG, tipicamente sob a forma de uma proteínade fusão. Por exemplo, um epítope de ligação de receptor de salvamento daregião Fc de uma IgG (isto é, a porção Fc de uma imunoglobulina da IgGisótipo) é incorporado no secretagogo de modo a aumentar sua meia-vidacirculatória, mas de modo a não perder sua atividade biológica. Isto podeocorrer por quaisquer meios, tais como por mutação da região apropriada nosecretagogo para simular a região Fc ou incorporando o epítope em umaetiqueta de peptídeo que é em seguida fundido ao secretagogo em qualquerextremidade ou no meio ou por síntese de DNA ou de peptídeo.
O epítope de ligação de receptor de salvamento é qualquer epí-tope similar adequado conforme de conhecimento de uma pessoa versadana técnica, e sua natureza dependerá, por exemplo, do tipo de secretagogosendo modificado. O epítope é introduzido no secretagogo de tal modo que aatividade biológica do secretagogo é mantida, isto é, o epítope não afeta demodo adverso a conformação do secretagogo ou afeta sua ligação a Iigantesque confere sua atividade biológica.
Alternativamente a proporcionar o secretagogo sob a forma deum conjugado, o secretagogo pode ser modificado para incluir grupos reati-vos adequados, por meio do que o secretagogo modificado deste modo écapaz de formar um conjugado in vivo (depois de ter sido administrado a umindivíduo) através de ligação covalente com funcionalidades reativa disponí-veis sobre componentes do sangue. A presente descrição também se referea similares secretagogos modificados, e a métodos para seu uso. Além dis-so, a presente descrição se refere a conjugados formados in vitro entre umsecretagogo modificado conforme descrito acima e um componente do san-gue. Os conjugados formados de acordo com esta modalidade são contem-plados para ter um aumento da meia-vida in vivo comparados com o secre-tagogo não-modificado correspondente.
De acordo com esta modalidade, o secretagogo é modificadocom um grupo quimicamente reativo (entidade reativa). A entidade reativapode, por exemplo, ser selecionada entre a ampla variedade de grupos car-boxila ativos, particularmente ésteres, onde a porção oxidrila é fisiologica-mente aceitável. Os grupos referidos podem ser selecionados entre o grupoconsistindo em N-hidroxissuccinimida (NHS), N-hidróxi-sulfosuccinimida (sul-fo-NHS), maleimida-benzoil-succinimida (MBS), éster gama-maleimido-butirilóxi succinimida (GMBS) e ácido maleimidopropiônico (MPA). Os princi-pais alvos para este grupo de entidades são aminas primárias sobre o com-ponente do sangue. Outro grupo de entidades ativas é constituído por umgrupo contendo maleimido tal como MPA e gama-maleimida-butrilamida(GMBA). Os grupos referidos reagem com grupos tiol presentes sobre ocomponente do sangue (Lee V.H.L. in "Peptide and Protein Drug Delivery",New York, Ν. Y., M. Dekker, 1990).
O componente do sangue com o qual o secretagogo modificadoé designado para reagir pode ser qualquer componente do sangue tendo umgrupo alvo disponível, por exemplo, um grupo amina ou um tiol, e o qual éadequado como um veículo para ligar o secretagogo modificado in vivo edeste modo prolongar a meia-vida circulante do mesmo. Exemplos de simila-res componentes do sangue são albumina sérica e IgG.
Conforme mencionado acima, a ligação covalente de um secre-tagogo modificado a um componente do sangue pode ser realizada in vivopor administração do secretagogo modificado diretamente ao paciente. Aadministração pode ser feita em qualquer forma adequada, tal como sob aforma de um bolo ou introduzido lentamente com o tempo por infusão usan-do fluxo medido ou similar. Alternativamente, o conjugado de secretago-go/componente do sangue também pode ser preparado ex vivo combinandosangue com o secretagogo modificado, possibilitando ligação covalente dosecretagogo modificado a funcionalidades reativas sobre componentes dosangue e em seguida retornando ou administrando o sangue conjugado aoindivíduo.
Além disso, o acima também pode ser realizado primeiro purifi-cando um componente ou número limitado de componentes do sangue doindivíduo, tais como hemácias, imunoglobulinas, albumina sérica, ou simila-res, e combinando o componente ou componentes ex vivo com os secreta-gogos quimicamente reativos.
Produção de Compostos Similares a Variantes de Junção deGrelina
Compostos similares a variantes de junção de grelina podem serproduzidos usando técnicas de conhecimento geral na arte. Por exemplo,uma região polipeptídica de um composto similar a variante de junção degrelina pode ser quimicamente ou bioquimicamente sintetizada e modificada.Técnicas para síntese química de polipeptídeos são de conhecimento geralna arte (vide, por exemplo, Lee V.H.L. in "Peptide and Protein Drug Deli-very", New York, Ν. Y., M. Dekker, 1990). Exemplos de técnicas para síntesebioquímica envolvendo a introdução de um ácido nucléico em uma célula eexpressão de ácidos nucléicos são proporcionados em Ausubel F.M. et ai.,"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley, 1987-1998, e Sambro-ok J. et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2d Edition, Cold S-pring Harbor Laboratory Press, 1989, cada um dos quais é incorporado aqui,a este pedido de patente, por meio de referência. Outra técnica típica, des-crita na Patente U.S. No. 5.304.489, incorporada aqui, a este pedido de pa-tente, por meio de referência, é o uso de alguns mamíferos transgênicostendo mutações tendo por alvo a glândula mamária as quais resultam naprodução e secreção de composto similar a variante de junção de grelinasintetizado no leite do mamífero transgênico.
Os compostos similares a variante de junção de grelina tambémpodem ser produzidos de modo recombinante usando métodos de expres-são de via conhecidos na técnica. O polinucleotídeo codificando o compostosimilar a variante de junção de grelina desejado é encadeado operavelmentea um promotor em um vetor de expressão adequado para qualquer hospe-deiro conveniente. Tanto sistemas de hospedeiro eucariótico quanto procari-ótico são usados na formação de compostos similares a variante de junçãode grelina recombinantes. O composto similar a variante de junção de greli-na é então isolado das células Iisadas ou do meio de cultura e purificado atéa extensão necessária para seu uso pretendido.
Conseqüentemente, uma modalidade adicional é para um méto-do para produzir um composto similar a variante de junção de grelina, o refe-rido método compreendendo as etapas de: (a) proporcionar um cDNA com-preendendo uma seqüência de polinucleotídeos codificando um compostosimilar a variante de junção de grelina; (b) inserir o referido cDNA em umvetor de expressão de tal modo que o cDNA seja encadeado operavelmentea um promotor; e (c) introduzir o referido vetor de expressão em uma célulahospedeira por meio do que a referida célula hospedeira produz o referidocomposto similar a variante de junção de grelina.
Em um aspecto desta modalidade, o método adicional compre-ende a etapa de recuperar o composto similar a variante de junção de greli-na produzido na etapa (c). Outra modalidade é um composto similar a vari-ante de junção de grelina obtenível pelo método descrito no parágrafo pre-cedente. O vetor de expressão é quaisquer dos sistemas de expressão ma-míferos, de levedura, de inseto, ou bacterianos conhecidos na técnica. Veto-res e sistemas de expressão disponíveis comercialmente estão disponíveis apartir de uma variedade de fornecedores inclusive Genetics Institute (Cam-bridge, Mass.), Stratagene (La Jolla, Calif.), Promega (Madison, Wis.), e Invi-trogen (San Diego, Calif.). Caso desejado, para reforçar a expressão e facili-tar adequado dobramento de proteína, o contexto de códons e pareamentode códons da seqüência é otimizado para o organismo de expressão emparticular no qual o vetor de expressão é introduzido, conforme explicado naPatente U.S. No. 5.082.767, cuja descrição é por este incorporada por meiode referência em sua totalidade.
Em outra modalidade, freqüentemente é vantajoso adicionar aopolinucleotídeo recombinante uma ou mais seqüências de nucleotídeos adi-cionais as quais codificam para seqüências secretoras ou líderes, pró-seqüências, seqüências as quais ajudam na purificação, tais como múltiplosresíduos histidina, ou uma seqüência adicional para estabilidade duranteprodução recombinante.
A introdução de um polinucleotídeo codificando um compostosimilar a variante de junção de grelina em uma célula hospedeira pode serefetuada por transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DE-AE-dextrano, transfecção mediada por lipídeo catiônico, eletroporação,transdução, infecção, ou outros métodos. Os métodos referidos são descri-tos em muitos manuais laboratoriais de via, tais como Davis et aí., (1986)Basic Methods in Molecular Biology1 ed., Elsevier Press, NY, cuja descriçãoé por este incorporada por meio de referência em sua totalidade. É especifi-camente contemplado que os compostos similares a variante de junção degrelina descritos aqui, podem de fato ser expressados por uma célula hos-pedeira carecendo de um vetor recombinante ou produzidos naturalmentepor uma célula.
Compostos similares a variante de junção de grelina podem serrecuperqados e purificados a partir de culturas celulares recombinantes pormétodos de conhecimento geral incluindo extração diferencial, precipitaçãode sulfato de amônio ou etanol, extração de ácido, cromatografia de permutaaniônia ou catiônica, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de inte-ração hidrofóbica, cromatografia por afinidade, cromatografia de hidroxilapa-tita e cromatografia de Iectina (vide, por exemplo, "Methods in Enzymology:Aqueous Two-Phase Systems", Walter H et ai (eds.), Academic Press(1993), incorporado aqui, a este pedido de patente, por meio de referência,para uma variedade de métodos para purificar proteínas). Em uma modali-dade, cromatografia líquida de alta performance ("HPLC") é empregada parapurificação. Uma versão produzida de modo recombinante de um compostosimilar a variante de junção de grelina pode ser substancialmente purificadausando técnicas descritas aqui, ou conhecidas de modo diverso na arte, talcomo, por exemplo, pelo método de uma etapa (one-step) descrito em Smith& Johnson, Gene 67:31 40 (1988), cuja descrição é por este incorporada pormeio de referência em sua totalidade. Compostos similares a variante dejunção de grelina também podem ser purificados a partir de fontes recombi-nantes usando anticorpos dirigidos contra os compostos similares a variantede junção de grelina, tais como as descritas aqui, em métodos os quais sãode conhecimento geral na técnica de purificação de proteína.
Em uma modalidade, o composto similar a variante de junção degrelina expressado de modo recombinante é purificado usando técnicas devia de imunocromatografia. Em similares procedimentos, uma solução con-tendo o composto similar a variante de junção de grelina de interesse, talcomo o meio de cultura ou um extrato celular, é aplicada a uma coluna tendoanticorpos contra o composto similar a variante de junção de grelina fixado àmatriz de cromatografia. O composto similar a variante de junção de grelinarecombinante é deixado para ligar a coluna de imunocromatografia. Depoisdisso, a coluna é lavada para remover proteínas não especificamente Iiga-das. O composto similar a variante de junção de grelina secretado ligadoespecificamente é então liberado na coluna e recuperado usando técnicasde via.
Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento deprodução recombinante, os compostos similares a variante de junção de gre-Iina podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados. Além disso, poli-peptídeos da invenção também podem incluir um resíduo metionina modifi-cado inicial, em alguns casos como um resultado de processos mediadospor hospedeiro. Portanto, é de conhecimento geral na técnica que a metioni-na de N-terminal codificada pelo códon de iniciação de translação geralmen-te é removida com alta eficiência de qualquer proteína depois de translaçãoem todas as células eucarióticas. Apesar da metionina de N-terminal sobre amaioria das proteínas também ser removida eficientemente na maioria dosprocariotas, para algumas proteínas, este processo de remoção procarióticaé ineficiente, dependendo da natureza do aminoácido ao qual a metionina deN-terminal é ligada de modo covalente.
Composições Farmacêuticas
Apesar de ser possível para os compostos ou sais da presentedescrição serem administrados como o químico bruto, é preferencial apre-sentar os mesmos sob a forma de uma composição farmacêutica. Por con-seguinte, um aspecto se refere a uma composição farmacêutica compreen-dendo um composto similar a variante de junção de grelina conforme defini-do na Fórmula I.
Outra modalidade se refere a uma composição farmacêuticacompreendendo uma mistura de no mínimo dois compostos diferentes simi-lares a variante de junção de grelina, tais como uma mistura de um compos-to similar a variante de junção de grelina acilado com um Ce acila e um com-posto similar a variante de junção de grelina acilado com um Ci0 acila. Semser limitado pela teoria, acredita-se que uma mistura similar terá uma meia-vida mais longa no plasma.
Em ainda outra modalidade, a composição farmacêutica com-preende compostos similares a variante de junção de grelina acilados, op-cionalmente compostos tendo diferentes extensões de cadeia acila preferen-cialmente selecionados entre o grupo consistindo em grupo C7 acila, grupoC9 acila, e grupo C11 acila, opcionalmente em combinação com um compos-to similar a variante de junção de grelina desacilado.
Outro aspecto se refere a uma composição farmacêutica com-preendendo qualquer secretagogo, tal como qualquer composto similar avariante de junção de grelina conforme definido acima ou um sal farmaceuti-camente aceitável do mesmo e veículos, veículos e/ou excipientes farma-cêuticos aceitáveis; a referida composição compreendendo adicionalmentemoléculas de transporte. As moléculas de transporte são essencialmenteadicionadas de modo a aumentar a meia-vida do composto acilado, preve-nindo desacilação prematura, uma vez que a variante de junção de grelinadesacilada pode não ser ativa no GHS-R 1a.As moléculas de transporte agem tendo incorporado em ou an-corado a estas um composto descrito aqui. Pode ser usada qualquer molé-cula de transporte adequada de conhecimento da pessoa versada. Exem-plos de moléculas de transporte são as descritas na seção de conjugado,supra. Outros exemplos preferenciais são lipossomas, micelas, e/ou micros-feras.
Lipossomas convencionais são tipicamente compostos de fosfo-lipídeos (neutros ou negativamente carregados) e/ou colesterol. Os liposso-mas são estruturas vesiculares baseadas em bicamada lipídica circundandocompartimentos aquosos. Podem variar em suas propriedades fisioquímicastais como tamanho, composição lipídica, número e carga superficial, e flui-dez da bicamada de fosfolipídeos. Os lipídeos mais freqüentemente usadospara formação de lipossomas são: 1,2-Dilauroil-sn-Glicero-3-Fosfocolina(DLPC), 1,2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina (DMPC), 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina (DPPC), 1,2-Distearoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina(DSPC), 1,2- Dioleoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina (DOPC)1 1,2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-Fosfoetanolamina (DMPE), 1,2-Dipaimitoil-sn-Glicero-3-Fosfoetanolamina (DPPE), 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-Fosfoetanolamina (DO-PE), 1,2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-Fosfato (Sal Monossódico) (DMPA), 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-Fosfato (Sal Monossódico) (DPPA), 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-Fosfato (Sal Monossódico) (DOPA), 1,2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-rac-(l-glicerol)] (Sal de Sódio) (DMPG), 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-rac-(l-glicerol)) (Sal de Sódio) (DPPG), 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-rac-(l-glicerol)] (Sal de Sódio) (DOPG), 1,2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina] (Sal de Sódio) (DMPS), 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina] (Sal de Sódio) (DPPS), 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina](Sal de Sódio) (DOPS), 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-Fosfoetanolamina-N-(glutaril) (Sal de Sódio) e 1,1'^^'-Tetramiristoil Cardiolipin (Sal de Amônio).Formulações compostas de DPPC em combinação com outro lipídeo ou mo-dificadores de lipossomas são preferenciais, por exemplo, em combinaçãocom colesterol e/ou fosfatidilcolina.
Lipossomas de circulação programada são caracterizados porsua capacidade para extravasar em locais do corpo onde a permeabilidadeda parede vascular está aumentada. Um modo preferencial para produzirIipossomas de circulação programada é fixar polímero hidrofílico polietilenoglicol (PEG) de modo covalente à superfície externa do lipossoma. Algunsdos lipídeos preferenciais são: 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-Fosfoetanolamina-N-[Metoxi (Polietileno glicol)-2000] (Sal de Amônio), 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-Fosfoetanolamina-N-[Metoxi (Polietileno glicol)-5000](Sal de Amônio), 1,2-Dioleoil-3-Trimetilamônio-Propano (Sal de Cloreto)(DOTAP).
Lipídeos possíveis aplicáveis para Iipossomas são fornecidospela Avanti Polar Lipids, Inc., (Alabaster, AL). Adicionalmente, a suspensãode Iipossomas pode incluir agentes protetores de lipídeos os quais protegemlipídeos contra radicais livres e danos lipídeo-peroxidativo no armazenamen-to. Extintores de radicais livres lipofílicos, tais como alfa-tocoferol e quelado-res ferro-específicos hidrossolúveis, tais como ferrioxianina, são preferenci-ais.
Uma variedade de métodos estão disponíveis para preparar Ii-possomas, conforme descrito, por exemplo, em Szoka F. & PapahadjopolousD., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467-508 (1980); nas Patentes dos EstadosUnidos Nos. 4.235.871, 4.501.728 e 4.837.028; todas as quais são incorpo-radas aqui, a este pedido de patente, por meio de referência. Outro métodoproduz vesículas multilamelares de tamanhos heterogêneos. Neste método,os lipídeos formadores de vesículas são dissolvidos em um solvente orgâni-co adequado ou sistema solvente e secados a vácuo ou em um gás inertepara formar um filme lipídico delgado. Caso desejado, o filme pode ser re-dissolvido em um solvente adequado, tal como butanol terciário, e em segui-da Iiofilizado para formar uma mistura lipídica mais homogênea a qual estáem uma forma similar a pó mais facilmente hidratada. Este filme é cobertocom uma solução aquosa do fármaco orientado e o componente de orienta-ção e deixado para hidratar, tipicamente durante um período de 15 a 60 mi-nutos com agitação. A distribuição de tamanho das vesículas multilamelaresresultantes pode ser desviada para tamanhos menores hidratando os lipí-deos sob condições de agitação mais vigorosas ou adicionando detergentessolubilizantes tais como deoxicolato.
Micelas são formadas por tensoativos (moléculas que contêmuma porção hidrofóbica e um ou mais grupos iônicos ou de modo diversofortemente hidrofílicos) em solução aquosa. À medida que a concentraçãode um tensoativo sólido aumenta, suas monocamadas adsorvidas na interfa-ce ar/água ou vidro/água se tornam tão firmemente comprimidas que ocupa-ção adicional requer excessiva compressão das moléculas tensoativas jánas duas monocamadas. Incrementos adicionais na quantidade de tensoati-vo dissolvido além desta concentração faz com que quantidades equivalen-tes às novas moléculas agreguem em micelas. Este processo se inicia emum concentração característica denominada "concentração de micela críti-ca".
A forma das micelas formadas em soluções de tensoativo diluí-do é aproximadamente esferical. Os grupos de ponta polares das moléculastensoativas são arranjados em uma concha esférica externa enquanto suascadeias de hidrocarboneto são orientadas para o centro, formando um nú-cleo esférico para a micela. As cadeias de hidrocarboneto são espiraladasaleatoriamente e emaranhadas e o interior micelar tem um caráter não-polar,similar a líquido. Nas micelas de detergentes não-iônicos polioxietilados, asporções de polioxietileno são orientadas para fora e permeadas por água.Esta disposição é energeticamente favorável uma vez que os grupos de pon-ta hidrofílicos estão em contato com água e as porções de hidrocarbonetosão removidas do meio aquoso e parcialmente protegidas do contato comágua pelos grupos de ponta polares. As caudas de hidrocarboneto das mo-léculas tensoativas, localizadas no interior da micela, interagem umas comas outras por forças fracas de van der Waals.
O tamanho de uma micela ou seu número de agregação é go-vernado largamente por fatores geométricos. O raio do núcleo de hidrocar-boneto não pode exceder a extensão da cadeia de hidrocarboneto estendi-dada molécula tensoativa. Portanto, aumentando a extensão de cadeia ouséries homólogas ascendentes aumenta o número de agregação de micelasesféricas. Se a concentração de tensoativo aumentada além de uns poucospor cento e se forem adicionados eletrólitos (no caso de tensoativos iônicos)ou a temperatura for aumentada (no caso de tensoativos não-iônicos), asmicelas aumentam de tamanho. Sob estas condições, as micelas são gran-des demais para permanecerem esféricas e se tornam elipsoidais, cilíndridi-cas ou finalmente de forma lamelar.
Tensoativos comuns de conhecimento geral de uma pessoaversada na técnica podem ser usados nas micelas da presente descrição.
Tensoativos adequados incluem Iaureato de sódio, oleato de sódio, Iaurilsulfato de sódio, éter monododecílico de octaoxietileno glicol, octoxinol 9 ePLURONIC® F-127 (BASF Corp., Florham Park, NJ). Tensoativos preferen-ciais são detergentes de polioxietileno e polioxipropileno não-iônicos compa-tíveis com injeção intravenosa tais como, TWEEN®-80, PLURONIC® F-68,n-octil-beta-D-glucopiranosídeo, e similares. Além disso, fosfolipídeos, taiscomo os descritos para uso na produção de lipossomas, também podem serusados para formação de micelas.
Em outra modalidade preferencial, os compostos descritos aqui,são formulados conforme descrito na literatura para uma via de administra-ção selecionada entre: liberação bucal, liberação sublingual, liberação trans-dérmica, inalação e injeção livre de agulha, tal como usando os métodosdesenvolvidos por Powderjet.
Para inalação, os compostos descritos aqui, podem ser formula-dos usando métodos conhecidos daqueles versados na técnica, por exem-plo, um aerossol, pó seco ou solubilizado tal como em microgotículas, prefe-rencialmente em um dispositivo pretendido para liberação similar (tal comodisponível comercialmente na Aradigm Corp. (Hayward, Cal.), Alkermes, Inc.(Cambridge, Mass.), ou Nektar Therapeutics (San Carlos, Cal.)).
Administração
Regimes de dosagem adequados para os vários compostos emétodos da presente descrição são preferencialmente determinados levandoem conta fatores de conhecimento geral na técnica incluindo, por exemplo, otipo de sujeito sendo dosado; a idade, peso, sexo e condição médica do su-jeito; a via de administração; a função renal e hepática do sujeito; o efeitodesejado; e o composto em particular empregado. Preferencialmente, acomposição compreenderá cerca de 0,5% a 75% em peso de um secretago-go descrito aqui, com o restante consistindo em excipientes farmacêuticosadequados.
A precisão otimizada para obter concentrações de fármaco den-tro da faixa que produz eficácia sem toxicidade requer um regime baseadona cinética da disponibilidade do fármaco para os sítios alvo. Isto envolveuma consideração da distribuição, do equilíbrio, e da eliminação de um fár-maco.
Conforme descrito acima, em um aspecto, o secretagogo, talcomo variante de junção de grelina ou um composto similar a variante dejunção de grelina, é administrado por via subcutânea.
Em outro aspecto, o secretagogo, tal como variante de junçãode grelina ou um composto similar a variante de junção de grelina, é admi-nistrado como um bolo pré-refeição, em que a forma de administração podeser qualquer forma parenteral adequada. Em uma modalidade preferencial, osecretagogo, tal como variante de junção de grelina ou um composto similara variante de junção de grelina, é administrado por via subcutânea em umbolo pré-refeição.
O secretagogo, tal como variante de junção de grelina ou umcomposto similar a variante de junção de grelina, também pode ser adminis-trado durante uma refeição como um bolo. O modo de administração duranteuma refeição inclui administração subcutânea, tal como um bolo administra-do por via subcutânea.
Composições farmacêuticas para administração parenteral in-cluem soluções, dispersões, suspensões ou emulsões injetáveis, estéreis,aquosas e não aquosas, bem como pós estéreis a serem reconstituídos emsoluções ou dispersões injetáveis estéreis antes do uso. Outras formas deadministração adequadas incluem supositórios, sprays, pomadas, cremes,géis, inalantes, emplastros dérmicos, implantes, pílulas, comprimidos, pasti-lhas e cápsulas.Uma dosagem típica é em uma concentração equivalente a de10 ng a 10 mg de variante de junção de grelina por kg de peso corporal. Asconcentrações e quantidades aqui, são dadas em equivalentes de quantida-de de variante de junção de grelina, em que a variante de junção de grelinaé uma variante de junção de grelina humana de 22 aminoácidos (SEQ IDNO: 2) e/ou uma variante de junção de grelina humana de 29 aminoácidos(SEQ ID NO: 5) e/ou uma variante de junção de grelina humana de 24 ami-noácidos (SEQ ID NO: 3) e/ou uma variante de junção de grelina humana de24 aminoácidos tendo um resíduo Dpr na terceira posição (SEQ ID NO: 4).
Equivalentes podem ser testados conforme descrito na seção intitulada"Funcionalidade", acima.
Em uma modalidade preferencial, o medicamento é administra-do em uma concentração equivalente a de 0,1 pg a 1 mg de variante de jun-ção de grelina por kg de peso corporal, tal como de 0,5 pg a 0,5 mg de vari-ante de junção de grelina por kg de peso corporal, tal como de 1,0 pg a 0,1mg de variante de junção de grelina por kg de peso corporal, tal como de 1,0pg a\ 50 pg de variante de junção de grelina por kg de peso corporal, tal co-mo de 1,0 pg a 10 pg de variante de junção de grelina por kg de peso corporal.
Conforme descrito acima, o secretagogo, tal como variante dejunção de grelina ou um composto similar a variante de junção de grelina, épreferencialmente administrado como um bolo. Por conseguinte, em umamodalidade o medicamento é administrado como um bolo antes de uma re-feição, o referido bolo compreendendo uma quantidade do secretagogo ouum sal do mesmo equivalente a de 0,3 pg a 600 mg de variante de junção degrelina. Mais preferencialmente, o medicamento é administrado como umbolo antes de uma refeição, o referido bolo compreendendo uma quantidadedo secretagogo ou um sal do mesmo equivalente a de 2,0 pg a 200 mg devariante de junção de grelina, tal como de 5,0 pg a 100 mg de variante dejunção de grelina, tal como de 10 pg a 50 mg de variante de junção de greli-na, tal como de 10 pg a 5 mg de variante de junção de grelina, tal como de10 pg a 1,0 mg de variante de junção de grelina.Deve ser observado que a reação similar a variante de junçãode grelina normal que ocorre antes de uma refeição é um pico de vida curtanas concentrações plasmáticas de variante de junção de grelina e que, devi-do à meia-vida relativamente curta do peptídeo, uma injeção intravenosa de5 variante de junção de grelina assegurará que pode ser obtido um pico devida curta similar sobre as concentrações de variante de junção de grelina. Avia de administração deve assegurar que a forma bioativa não-degradada dopeptídeo será a forma dominante na circulação, a qual atingirá e estimularáa receptores de variante de junção de grelina.
Portanto, de modo a obter o efeito máximo do medicamento,preferencialmente é administrado a partir de uma até três vezes ao dia, cadaadministração sendo dentro de 45 minutos de uma refeição, tal como dentrode 30 minutos de uma refeição, tal como dentro de 25 minutos de uma refei-ção, tal como dentro de 20 minutos de uma refeição, tal como dentro de 15minutos de uma refeição, tal como dentro de 10 minutos de uma refeição, talcomo dentro de 5 minutos de uma refeição. Mais preferencialmente, o medi-camento é administrado antes de cada refeição principal, tal como adminis-trado três vezes ao dia.
Compostos descritos aqui, também podem ser formulados paraadministração nasal. As soluções ou suspensões são aplicadas diretamentena cavidade nasal por meios convencionais, por exemplo, com um gotejador,pipeta ou spray. As composições podem ser proporcionadas em uma formaúnica ou multidose. No último caso de um gotejador ou pipeta, isto pode serrealizado pelo paciente administrando um volume predeterminado apropria-do da solução ou suspensão. No caso de um spray, isto pode ser realizado,por exemplo, por meio de uma bomba de spray de atomização dosada.
Os compostos descritos aqui, podem ser formulados para admi-nistração por aerossol, particularmente para o trato respiratório e incluindoadministração intranasal. O composto geralmente terá um tamanho de partí-cuia pequeno, por exemplo, da ordem de 5 micra ou menos. Um tamanho departícula similar pode ser obtido por meios conhecidos na técnica, por e-xemplo, por micronização. O ingrediente ativo é proporcionado em um paco-te pressurizado com um propelente adequado tal como um hidrofluoroalcano(HFA), por exemplo, hidrofluoroalcano-134a e hidrofluoroalcano-227, dióxidode carbono ou outro gás adequado. O aerossol também pode conter conve-nientemente um tensoativo tal como lecitina. A dose de fármaco pode sercontrolada por uma válvula dosada. Alternativamente, os ingredientes ativospodem ser proporcionados em uma forma de um pó seco, por exemplo, umamistura de pó do composto em uma base de pó adequada tal como lactose,amido, derivados de amido tais como hidroxipropilmetil celulose e polivinilpir-rolidina (PVP). O veículo de pó formará um gel na cavidade nasal. A compo-sição de pó pode ser apresentada em forma de unidade de dose, por exem-plo, em cápsulas ou cartuchos de, por exemplo, gelatina ou embalagens tipoblister a partir dos quais o pó pode ser administrado por meio de um inalador.
Composições administradas por aerosóis podem ser prepara-das, por exemplo, como soluções em salina, empregando álcool benzílico ououtros conservantes adequados, promotores de absorção para reforçar abiodisponibilidade, empregando fluorocarbonos, e/ou empregando outrosagentes solubilizantes ou dispersantes.
Compostos descritos aqui, também podem ser formulados paraadministração por caneta de injeção em um modo similar ao hormônio decrescimento encapsulado (GH) ou Insulina. O cartucho contém compostosdescritos aqui, em solventes. A caneta de injeção, a qual é basicamente umagulha, seringa e frasco em uma peça, é operada por um movimento girató-rio e permite que sejam administradas diferentes doses. Este dispositivo ofe-rece simplicidade, conveniência, e aumentadas características de segurançapara liberação de compostos. Proporciona um design de dispositivo simples,poucas etapas de administração e um botão de dose de uma etapa de dialback. A caneta de injeção referida pode ser obtida por meios conhecidos natécnica. Por exemplo, vários fabricantes oferecem canetas de injeção paradesenvolvedores de fármacos a serem usadas com os compostos dos de-senvolvedores de fármacos (BD - Medicai - Pharmaceutical Systems, Inc.;Owen Mumford Inc. etc.).Composições para Administração Oral
Os tipos de secretagogos capazes de permanecerem biologica-mente ativos em um indivíduo depois de administração oral (tais como, porexemplo, moléculas pequenas e peptídeos curtos) podem ser formulados em uma ampla gama de formas de dosagens para administração oral. As com-posições farmacêuticas e formas de dosagens podem compreender os com-postos descritos aqui, ou seu sal ou formas de cristal dos mesmos farmaceu-ticamente aceitáveis como o componente ativo.
Os conservantes farmacêuticos aceitáveis podem ser ou sólidosou líquidos. Preparações de formas sólidas incluem pós, comprimidos, pílu-las, cápsulas, cacheis, supositórios, e grânulos dispersíveis. Um veículo só-lido pode ser uma ou mais substâncias as quais também podem agir comodiluentes, agentes aromatizantes, solubilizantes, lubrificantes, agentes desuspensão, aglutinantes, conservantes, agente umectantes, agentes desin- tegrantes de comprimidos, ou um material encapsulante.
Para administração oral, os excipientes referidos incluem, porexemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de mag-nésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glicose, gelatina, sucrose, carbona-to de magnésio, e similares.
Em pós, o veículo é um sólido finamente dividido o qual é umamistura com o componente ativo finamente dividido. Em comprimidos, ocomponente ativo é misturado com o veículo tendo a capacidade de ligaçãonecessária em proporções adequadas e compactado na forma e tamanhodesejados. Os pós e comprimidos preferencialmente contendo a partir de umaté cerca de setenta por cento do composto ativo. Conservantes adequadossão carbonato de magnésio, estearato de magnésio, talco, açúcar, lactose,pectina, dextrina, amido, gelatina, tragacanto, metilcelulose, carboximetilce-Iulose de sódio, uma cera de baixo ponto de fusão, manteiga de cacau, esimilares. O termo "preparação" pretende incluir uma composição compre-endendo um composto ativo descrito aqui, com material encapsulante comoveículo proporcionando uma cápsula na qual o componente ativo, com ousem veículos, é circundado por um veículo, o qual está em associação comeste. Similarmente, são incluídas cápsulas e pastilhas.
Comprimidos, pós, cápsulas, pílulas, cachets, e pastilhas podemser como formas sólidas adequadas para administração oral.
Gotas podem compreender soluções ou suspensões aquosasou oleosas, estéreis ou não estéreis, e podem ser preparadas dissolvendo oingrediente ativo em uma solução aquosa adequada, opcionalmente incluin-do um agente bactericida e/ou fungicida e/ou qualquer outro veículo ade-quado, e opcionalmente incluindo um agente ativo na superfície. A soluçãoresultante pode ser então clarificada por filtração, transferida para um recipi-ente adequado o qual é em seguida selado e esterilizado por autoclave oumantendo em 98 a 10O 0C por meia hora. Alternativamente, a solução podeser esterilizada por filtração e transferida para o recipiente asseticamente.Exemplos de agentes bactericidas e fungicidas adequados para inclusão nasgotas são nitrato ou acetato fenilmercúrico (0,002%), cloreto de benzalcônio(0,01%) e acetato de clorexidina (0,01%). Solventes adequados para a pre-paração de uma solução oleosa incluem glicerol, álcool diluído e propilenoglicol.
Também incluídas são preparações de formas sólidas as quaissão pretendidas para serem convertidas, logo antes do uso, para prepara-ções de formas líquidas para administração oral. As formas líquidas referidasincluem soluções, suspensões, e emulsões. Estas preparações podem con-ter, além do componente ativo, colorantes, aromatizantes, estabilizantes,tampões, adoçantes artificiais e naturais, dispersantes, espessantes, agen-tes solubilizantes, e similares.
Outras formas adequadas para administração oral incluem pre-parações de formas líquidas incluindo emulsões, xaropes, elixires, soluçõesaquosas, suspensões aquosas, pasta de dentes, dentifrício em gel, goma demascar, ou preparações de formas sólidas as quais são pretendidas paraserem convertidas logo antes do uso em preparações de formas líquidas.Emulsões podem ser preparadas em soluções em soluções aquosas de pro-pileno glicol ou podem conter agentes emulsificantes tais como lecitina, mo-nooleato de sorbitano, ou acácia. Soluções aquosas podem ser preparadasdissolvendo o componente ativo em água e adicionando colorantes, aromati-zante, agentes estabilizantes e espessantes adequados. Suspensões aquo-sas podem ser preparadas dispersando o componente ativo finamente divi-dido em água com material viscoso, tal como gomas naturais ou sintéticas,resinas, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, e outros agentes desuspensão de conhecimento geral. Preparações de formas sólidas incluemsoluções, suspensões, e emulsões, e podem conter, além do componenteativo, colorantes, aromatizantes, estabilizantes, tampoões, adoçantes artifi-ciais e naturais, dispersantes, espessantes, agentes solubilizantes, e similares.
Composições para Administração Parenteral
Os compostos descritos aqui, podem ser formulados para admi-nistração parenteral (por exemplo, por injeção, por exemplo, injeção de boloou infusão contínua) e podem ser apresentados em forma de unida de doseem ampulos, seringas pré-enchidas, infusão de pequeno volume ou em reci-pientes multidose com um conservante adicionado. As composições podemtomar formas tais como suspensões, soluções, ou emulsões em veículosoleosos ou aquosos, por exemplo, soluções em polietileno glicol aquoso.
Exemplos de veículos, diluentes, solventes ou veículos oleosos ou não-aquosos incluem propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais (por e-xemplo, azeite de oliva), e ésteres orgânicos injetáveis (por exemplo, oleatode etila), e podem conter agentes formulatórios tais como agentes veículos,umectantes, emulsificantes ou de suspensão, estabilizantes e/ou dispersan-tes. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar em forma de pó, serobtido por isolamento assético de sólido estéril ou por liofilização de soluçãopara constituição antes do uso com um veículo adequado, por exemplo, á-gua estéril, livre de pirogênio. As soluções aquosas devem ser conveniente-mente tamponadas caso necessário, e o diluente líquido primeiro tornadoisotônico com suficiente salina ou glicose. As soluções aquosas são particu-larmente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, subcu-tânea e intraperitoneal. Os meios aquosos estéreis empregados estão todosprontamente disponíveis por meio de técnicas de via conhecidas daquelesversados na arte.
Soluções de variante de junção de grelina ou um composto simi-lar a variante de junção de grelina ou sal farmacêutico aceitável dos mesmos(e, por exemplo, epítopes antigênicos e inibidores de protease) podem serpreparadas em água ou salina, e opcionalmente misturadas com um tensoa-tivo não-tóxico. Composições para administração intravenosa ou intra-arterial podem incluir soluções aquosas estéreis que também podem contertampões, lipossomas, diluentes e outros aditivos adequados.
Óleos úteis em composições parenterais incluem óleos de petró-leo, animais, vegetais, ou sintéticos. Exemplos específicos de óleos úteis emsimilares composições incluem amendoim, soja, gergelim, algodão, milho,oliva, petrolato, e mineral. Ácidos graxos adequados para uso em composi-ções parenterais incluem ácido oléico, ácido esteárico, e ácido isoesteárico.Oleato de etila e isopropil miristato são exemplos de ésteres de ácido graxoadequados.
Sabões adequados para uso em composições parenterais inclu-em sais de metais de álcali graxo, de amônio, e de trietanolamina, e deter-gentes adequados incluem (a) detergentes catiônicos tais como, por exem- pio, haletos de dimetil dialquil amônio, e haletos de alquil piridínio; (b) deter-gentes aniônicos tais como, por exemplo, sulfonatos de alquila, de arila, e deolefina, sulfatos de alquila, de olefina, de éter, e de monoglicerídeo, e sulfos-succinatos; (c) detergentes não-iônicos tais como, por exemplo, óxidos deamina graxa, alcanolamidas de ácido graxo, e copolímeros de polioxietileno-polipropileno; (d) detergentes anfotéricos tais como, por exemplo, alquil-beta-aminopropionatos, e sais de amônio de 2-alquil-imidazolina quaternária;e (e) misturas dos mesmos.
As composições parenterais tipicamente conterão a partir decerca de 0,5 até cerca de 25% em peso do ingrediente ativo em solução.Podem ser usados veículos e tampões. De modo a minimizar ou eliminarirritação no sítio de injeção, as composições referidas podem conter um oumais tensoativos não-iônicos tendo um balanço hidrófilo-lipófilo (HLB) de apartir de cerca de 12 até cerca de 17. A quantidade de tensoativo em simila-res composições tipicamente variarão a partir de cerca de 5 até cerca de15% em peso. Tensoativos adequados incluem ésteres de ácido graxo desorbitano de polietileno, tais como monooleato de sorbitano e os adutos dealto peso molecular de oxido de etileno com uma base hidrofóbica, formadapela condensação de oxido de propileno com propileno glicol. As composi-ções parenterais podem ser apresentadas dentro de recipientes selados deunidade de dose ou multi-dose, tais como ampolas e frascos,, e podem serarmazenadas em uma condição seca por congelamento (IiofiIizada) reque-rendo somente a adição de excipiente líquido estéril, por exemplo, água, pa-ra injeções, imediatamente antes do uso. Soluções e suspensões para inje-ção extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós, grânulos, e com-primidos estéreis do tipo previamente descrito.
As formas de dosagens farmacêuticas adequadas para injeçãoou infusão podem incluir soluções ou dispersões aquosas estéreis compre-endendo o ingrediente ativo que são adaptadas para administração por en-capsulação em lipossomas. Em todos os casos, a forma de dosagem finaldeve ser estéril, fluida e estável sob as condições de fabricação e armaze-namento.
Soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando vari-ante de junção de grelina ou um composto similar a variante de junção degrelina ou sal farmacêutico aceitável dos mesmos na quantidade requeridano solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados aci-ma, conforme necessário, seguidos por, por exemplo, esterilização por filtro.
Composições para Administração Tópica
Os compostos descritos aqui, também podem ser liberados topi-camente. Regiões para administração tópica incluem a superfície da pele etambém tecidos das membranas mucosas do reto, nariz, boca, e garganta.Composições para administração tópica através da pele e membranas mu-cosas não devem dar origem a sinais de irritação, tais como tumefação ouvermelhidão.
A composição tópica pode incluir um conservante farmacêuticoaceitável adaptado para administração tópica. Portanto, a composição podetomar a forma de, por exemplo, uma suspensão, solução, pomada, loção,creme, espuma, aerossol, spray, supositório, implante, inalante, comprimido,cápsula, pó seco, xarope, bálsamo ou pawtilha. Métodos para preparar ascomposições referidas são de conhecimento geral na indústria farmacêutica.
Os compostos descritos aqui, podem ser formulados para admi-nistração tópica na epiderme como pomadas, cremes ou loções, ou comoum emplastro transdérmico. Pomadas e cremes podem ser formulados, porexemplo, com uma base aquosa ou oleosa com a adição de agentes espes-santes e/ou gelificantes adequados. Loções podem ser formuladas com umaaquosa ou oleosa e em geral também conterão um ou mais agentes emulsi-ficantes, agentes estabilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspen-são, agentes espessantes, ou agentes colorantes. Composições adequadaspara administração tópica na boca incluem pastilhas compreendendo agen-tes ativos em uma base aromatizada, geralmente sucrose e acacia ou traga-canto; pastilhas compreendendo o ingrediente ativo em uma base inerte talcomo gelatina e glicerina ou sucrose e acacia; e enxágües bucais compre-endendo o ingrediente ativo em um veículo líquido adequado.
Cremes, pomadas ou pastas de acordo com a presente descri-ção são composições semi-sólidas para aplicação externa compreendendo oingrediente ativo. Podem ser preparados misturando o ingrediente ativo emforma finamente dividida ou pulverizada, sozinho ou em solução ou suspen-são em um fluido aquoso ou não-aquoso, com o auxílio de mecanismo ade-quado, com uma base graxa ou não graxa. A base pode compreender hidro-carbonetos tais como parafina dura, mole ou líquida, glicerol, cera de abelha,um sabão metálico; uma mucilagem; um óleo de origem natural tal como ó-Ieo de amêndoas, milho, araquis, de rícino ou de oliva; gordura de lã ou seusderivados; ou um ácido graxo tal como ácido estérico ou oléico junto com umálcool tal como propileno glicol ou um macrogel. A composição pode incor-porar qualquer agente ativo na superfície adequado tal como um tensoativoaniônico, catiônico ou não-iônico tal como um éster de sorbitano ou um deri-vado de polioxietileno dos mesmos. Agentes de suspensão tais como gomasnaturais, derivados celulósicos ou materiais inorgânicos tais como sílicassilicáceas, e outros ingredientes tais como lanolina, também podem ser in-cluídos.
Loções de acordo com a presente descrição incluem aquelas adequadas para aplicação na pele ou olho. Uma loção ocular pode compre-ender uma solução aquosa estéril contendo opcionalmente um bactericida epode ser preparada por meio de métodos similares àqueles para a prepara-ção de gotas. Loções ou Iinimentos para aplicação na pele também podemincluir um agente para secagem rápida e para esfriar a pele, tal como umálcool ou acetona, e/ou um umidificante tal como glicerol ou um óleo tal co-mo óleo de rícino ou óleo de arachis.
Os compostos descritos aqui, podem ser administrados por viatransdérmica. A administração transdérmica tipicamente envolve a liberaçãode um agente farmacêutico para passagem percutânea do fármaco para acirculação sistêmica do paciente. Os sítios da pele incluem regiões anatômi-cas para administrar por via transdérmica o fármaco e incluem o antebraço,abdômen, tórax, dorso, nádega, área mastoidal, e similares.
A liberação transdérmica é realizada expondo uma fonte docomposto ativo à pele de um paciente por um período de tempo prolongado. Emplastros transdérmicos têm a vantagem adicional de proporcionar libera-ção controlada de um complexo de composto no corpo (vide TransdermalDrug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft andGuy (eds.), Mareei Dekker, Inc., (1989); Controlled Drug Delivery: Funda-mentais and Applications, Robinson and Lee (eds.), Mareei Dekker Inc.,(1987); e Transdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, Kydonieus and Berner(eds.), CRC Press, (1987)). As formas de dosagens referidas podem serpreparadas dissolvendo, dispersando, ou incorporando de modo diverso umcomposto descrito aqui, em um meio apropriado, tal como um material dematriz elastomérica. Também podem ser usados reforçadores da absorçãopara aumentar o fluxo do composto atravéa da pele. A taxa de similar fluxopode ser controlada ou proporcionando uma membrana controladora da taxaou dispersando o composto em uma matriz ou gel de polímero.Uma variedade de tipos de emplastros transdérmicos encontraráuso nos métodos descritos aqui. Por exemplo, um emplastro adesivo simplespode ser preparado a partir de um material de suporte e um adesivo de acri-lato. O composto ativo e qualquer reforçador são formulados na solução defundição adesiva e deixados para misturar completamente. A solução é fun-dida diretamente sobre o material de suporte e o solvente de fundição é e-vaporado em um forno, deixando um filme adesivo. O revestimento de libe-ração pode ser fixado para completar o sistema.
Alternativamente, um emplastro de emplastro de matriz de poliu-retano pode ser empregado para liberar um composto descrito aqui. As ca-madas deste emplastro compreendem um suporte, uma matriz de poliureta-no de fármaco/reforçador, uma membrana, um adesivo, e um revestimentode liberação. A matriz de poliuretano é preparada usando um pré-polímerode poliuretano curando em temperatura ambiente. A adição de água, álcool,e complexo ao pré-polímero resulta na formação de um elastômero firmeviscoso que pode ser fundido diretamente somente o material de suporte.
Uma modalidade adicional utilizará um emplastro de matriz dehidrogel. Tipicamente, a matriz de hidrogel compreenderá álcool, água, fár-maco, e vários polímeros hidrofílicos. Esta matriz de hidrogel pode ser incor-porada em um emplastro transdérmico entre o suporte e a camada adesiva.
Um emplastro de reservatório líquido também encontrará usonos métodos descritos aqui. Este emplastro compreende um material de su-porte impermeável ou semipermeável, selável por calor, uma membrana se-lável por calor, um adesivo de pele sensível a pressão à base de acrilato, eum revestimento de liberação siliconizado. O suporte é selado por calor àmembrana para formar um reservatório o qual pode ser então enchido comuma solução do complexo, reforçadores, agente de gelificação, e outros ex-cipientes.
Emplastros de matriz de espuma são similares em design ecomponentes ao sistema de reservatório líquido, exceto que a solução gelifi-cada de agente farmacêutico-modificador químico seja limitada em uma ca-mada de espuma delgada, tipicamente um poliuretano. Esta camada de es-puma é situada entre o suporte e a membrana os quais devem ser seladospor calor na periferia do emplastro.
Para sistemas de liberação passivos, a taxa de liberação é tipi-camente controlada por uma membrana colocada entre o reservatório e apele, por difusão a partir de um dispositivo monolítico, ou pela própria peleservindo como uma barreira de controle da taxa no sistema de liberação (Vi-de as Patentes dos Estados Unidos NQs 4.816.258; 4.927.408; 4.904.475;4.588.580, 4.788.062; e similares, todas as quais são incorporadas aqui, aeste pedido de patente, por meio de referência). A taxa de liberação de fár-maco será dependente, em parte, da natureza da membrana. Por exemplo,a taxa de liberação de fármaco através das membranas dentro do corpo égeralmente maior do que através de barreiras dérmicas. A taxa na qual ocomposto ativo é liberado a partir do dispositivo para a membrana é maisvantajosamente controlada pelo uso de membranas limitadoras da taxa asquais são colocadas entre o reservatório e a pele. Presumindo que a pele ésuficientemente permeável ao composto ativo (isto é, a absorção através dapele é maior do que a taxa de passagem através da membrana), a membra-na servirá para controlar a taxa de dosagem experimentada pelo paciente.
Materiais de membranas permeáveis adequados podem ser se-lecionados com base no grau de permeabilidade desejado, da natureza docomposto ativo, e das considerações mecânicas relacionadas com a cons-trução do dispositivo. Materiais de membranas permeáveis típicos incluemuma ampla variedade de polímeros naturais e sintéticos, tais como polidime-tilsiloxanos (borrachas de silicone), copolímero de etilenovinilacetato (EVA),poliuretanos, copolímeros de poliuretano-polieter, polietilenos, poliamidas,polivinilcloretos (PVC), polipropilenos, policarbonatos, politetrafluoroetilenos(PTFE), materiais celulósicos, por exemplo, triacetato de celulose e nitra-to/acetato de celulose, e hidrogéis, por exemplo, 2-hidroxietilmetacrilato (HE-MA).
Outros itens podem ser contidos no dispositivo, tais como outroscomponentes convencionais de produtos terapêuticos, dependendo das ca-racterísticas de dispositivos desejados. Por exemplo, as composições reve-Iadas aqui, também podem incluir um ou mais agentes veículos ou bacterios-táticos, por exemplo, hidroxibenzoato de metila, hidroxibenzoato de propila,clorocresol, cloretos de benzalcônio, e similares. Estas composições farma-cêuticas também podem conter outros ingredientes ativos tais como agentesantimicrobianos, particularmente agentes antibióticos, anestésicis, analgési-cos, e antipruríticos.
Composições para Administração como Supositórios
Os compostos descritos aqui, podem ser formulados para admi-nistração como supositórios. Um supositório típico é produzido proporcio-nando uma cera de baixo ponto de fusão, tal como uma mistura de glicerí-deos de ácidos graxos ou manteiga de cacau, isto é primeiro fundida e ocomponente ativo é dispersado homogeneamente na mesma, por exemplo,por agitação. A mistura homogênea fundida é em seguida vertida em moldesdimensionados convenientes, deixada para esfriar, e para solidificar.
O composto ativo pode ser formulado em um supositório com-preendendo, por exemplo, cerca de 0,5% a cerca de 50% de um compostodescrito aqui, disposto em um veículo de polietileno glicol (PEG) (por exem-plo, PEG 1000 [96%] e PEG 4000 [4%]).
Formulação
Um aspecto preferencial contempla composições farmacêuticasúteis para praticar os métodos terapêuticos descritos aqui. Composiçõesfarmacêuticas podem conter um veículo fisiologicamente tolerável junto comno mínimo uma espécie de um secretagogo, tal como variante de junção degrelina ou um composto similar a variante de junção de grelina conformedescrito aqui, dissolvido ou dispersado nas mesmas como um ingredienteativo. Em uma modalidade preferencial, a composição farmacêutica é nãoimunogênica quando administrada a um indivíduo humano para fins terapêu-ticos, a menos que a finalidade seja induzir uma resposta imune.
Um aspecto se refere a uma composição farmacêutica compre-endendo no mínimo um secretagogo, tal como variante de junção de grelinaou um composto similar a variante de junção de grelina conforme definidoacima na Fórmula I. Em uma modalidade preferencial, a composição farma-cêutica compreende no mínimo dois compostos diferentes similares a varian-te de junção de grelina conforme definido acima na Fórmula I de modo aaumentar o efeito do tratamento. A diferença pode ser, por exemplo, com-postos tendo diferentes acilações conforme discutido acima.
Conforme usado aqui, os termos "farmaceuticamente aceitável","fisiologicamente toleráveis" e variações gramaticais dos mesmos, quandose referem a composições, veículos, diluentes e reagentes, são usados demodo intercambiável e representam que os materiais são capazes de admi-nistração a ou em um humano sem a produção de efeitos fisiológicos inde- sejáveis tais como náusea, vertigem, indisposição gástrica e similares.
A preparação de uma composição farmacológica que contémingredientes ativos dissolvidos ou dispersados na mesma é bem entendidana técnica. Tipicamente, as composições referidas são preparadas comoinjetáveis estéreis ou como soluções ou suspensões líquidas, aquosas ounão aquosas; no entanto, formas sólidas adequadas para solução, ou sus-pensões, em líquido antes do uso também podem ser preparadas. A prepa-ração também pode ser emulsificada.
O ingrediente ativo pode ser misturado com excipientes os quaissão farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo e em quantidades adequadas para uso nos métodos terapêuticos descritosaqui. Excipientes adequados são, por exemplo, água, salina, dextrose, glice-rol, etanol ou similares e combinações dos mesmos. Além disso, caso dese-jado, a composição pode conter quantidades menores de substâncias auxili-ares tais como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes de tampo-namento de pH e similares os quais reforçam a eficácia do ingrediente ativo.É preferencial que a formulação tenha um pH dentro da faixa de 3.5 a 8, talcomo na faixa de 4.5 a 7.5, tal como na faixa de 5.5 a 7, tal como na faixa de6 a 7.5, o mais preferencialmente em torno de 7.3. No entanto, conforme éentendido por uma pessoa versada na técnica, a faixa de pH pode ser ajus-tada de acordo com o indivíduo tratado e o procedimento de administração.Por exemplo, alguns secretagogos, tais como variante de junção de grelina ehomólogos de variante de junção de grelina, podem ser facilmennte estabili-zado em um menor pH; portanto, em outra modalidade preferencial, a formu-lação tem um pH dentro da faixa de 3.5 a 7, tal como 4 a 6, tal como 5 a 6,tal como 5.3 a 5.7, tal como 5.5.
Composições farmacêuticas reveladas aqui, podem incluir saisfarmaceuticamente aceitáveis dos compostos nas mesmas. Estes sais serãosais os quais são aceitáveis em sua aplicação para um uso farmacêutico,significando que o sal conservará a atividade biológica do composto de ori-gem e o sal não terá efeitos inconvenientes ou nocivos em sua aplicação euso no tratamento de doenças.
Sais farmaceuticamente aceitáveis são preparados em uma ma-neira de via. Se o composto de origem for um base, é tratado com um ex-cesso de um ácido orgânico ou inorgânico em um solvente adequado. Se ocomposto de origem for um ácido, é tratado com uma base inorgânica ouorgânica em um solvente adequado.
Os compostos descritos aqui, podem ser administrados sob aforma de um sal de metal de alcalino ou metal de álcali terroso dos mesmos,concorrentemente, simultaneamente, ou junto com um veículo ou diluentefarmaceuticamente aceitável, especialmente e preferencialmente sob a for-ma de uma composição farmacêutica dos mesmos, quer por via, por exem-pio, oral, retal, ou parenteral (inclusive subcutânea), em uma quantidade eficaz.
Exemplos de sais de adição ácidos farmaceuticamente aceitá-veis para uso na presente composição farmacêutica da invenção incluemsais derivados de ácidos minerais, tais como, por exemplo, ácidos clorídrico,bromídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico e sulfúrico, e ácidos orgânicos,tais como, por exemplo, ácidos tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fu-márico, benzóico, glicólico, glucônico, succínico, p-toluenossulfônico, e aril-sulfônico.
Outros sais farmaceuticamente aceitáveis adequados incluemos sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres do polipep-tídeo). Outros exemplos de sais incluen sais de adição ácidos farmaceutica-mente aceitáveis, sais de metais farmaceuticamente aceitáveis, sais de a-mônio e sais de amônio alquilados. Sais de adição de ádido incluem sais deácidos inorgânicos bem como ácidos orgânicos. Exemplos típicos de ácidosinorgânicos adequados incluem ácidos clorídrico, bromídrico, iodídrico, fosfó-rico, sulfúrico e nítrico e similares. Exemplos típicos de ácidos orgânicos a-dequados incluem ácidos fórmico, acético, tricloroacético, trifluoroacético,propiônico, benzóico, cinâmico, cítrico, fumárico, glicólico, láctico, maléico,málico, malônico, mandélico, oxálico, pícrico, pirúvico, salicílico, succínico,metanossulfônico, etanossulfônico, tartárico, ascórbico, pamóico, bismetilenosalicílico, etanodissulfônico, glucônico, citracônico, aspártico, esteárico, pal-mítico, tetraacético de diamina de etileno (EDTA)1 p-aminobenzóico, glutâmi-co, benzenossulfônico, e p-toluenossulfônico e similares. Exemplos adicio-nais de sais de adição de ácido inorgânicos ou orgânicos farmaceuticamenteaceitáveis incluem os sais farmacêutico aceitáveis listados em Berge S.M. etaí., J. Pharm. Sei. 66:1-19 (1977), o qual é incorporado aqui, a este pedidode patente, por meio de referência. Exemplos de sais de metais incluem saisde lítio, sódio, potásso e magnésio e similares.
Exemplos de sais de amônio e amônio alquilado incluem sais deamônio, metilamônio, dimetilamônio, trimetilamônio, etilamônio, hidroxietila-mônio, dietilamônio, butilamônio e tetrametilamônio e similares.
Sais formados com os grupos carboxila livres também podemser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos desódio, de potássio, de amônio, de cálcio ou férrico, e bases orgânicas simila-res como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaínae similares.
Também incluídos dentro do âmbito de compostos ou sais deadição de ácidos farmacêutico aceitáveis dos mesmos no contexto da pre-sente descrição são quaisquer hidratos (formas hidratadas) dos mesmos.
Para administração parenteral, podem ser empregadas soluçõesdos presentes compostos em solução aquosa estéril, propileno glicol aquosoou óleo de gergelim ou de amendoim. As soluções aquosas referidas devemser convenientemente tamponadas caso necessário, e o diluente líquidoprimeiro tornado isotônico com salina ou glicose suficientes. As soluçõesaquosas são particularmente adequadas para administração intravenosa,intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. Os meios aquosos estéreis em-pregados estão todos prontamente disponíveis por meio de técnicas de viaconhecidos daqueles versados na arte.
Composições líquidas também podem conter fases líquidas emadição a e para a exclusão de água. Típicos de similares fases líquidas adi-cionais são glicerina, óleos vegetais tais como óleo de algodão, ésteres or-gânicos tais como oleato de etila, e emulsões de água-óleo.
Conservantes farmacêuticos adequados incluem diluentes ou enchimentos sólidos inertes, solução aquosa estéril e vários solventes orgâ-nicos. Exemplos de veículos sólidos são lactose, terra alba, sucrose, ciclo-dextrina, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, estearato de magnésio, ácidoesteárico ou éteres de alquila inferior de celulose. Exemplos de veículos lí-quidos são xarope, óleo de amendoim, azeite de oliva, fosfolipídeos, ácidos graxos, aminas de ácidos graxos, polioxietileno ou água. Podem ser prepa-radas formulações de aerossol nasal ou para inalação, por exemplo, comosoluções em salina, empregando álcool benzílico ou outros conservantesadequados, promotores de absorção para reforçar a biodisponibilidade, em-pregando fluorocarbonos, e/ou empregando outros agentes solubilizantes ou dispersantes.
As composições farmacêuticas formadas combinando os com-postos descritos aqui, e os conservantes farmacêuticos aceitáveis são emseguida prontamente administrados em uma variedade de formas de dosa-gens adequadas para as vias de administração reveladas. As formulaçõespodem ser apresentadas convenientemente em forma de unidade de dosa-gem por métodos conhecidos na técnica de farmácia.
Em uma modalidade preferencial, a formulação compreende osecretagogo ou um sal do mesmo como um liofilizado, e a formulação adi-cionalmente compreende um solvente, o referido liofilizado e o referido sol-vente estando em compartimentos separados até a administração. Em outramodalidade, a formulação é uma solução do secretagogo ou um sal domesmo. Em qualquer modalidade, o solvente pode ser qualquer solventeadequado, tal como os descritos aqui, e preferencialmente o solvente é salina.
Outro aspecto se refere a um método para preparar um medi-camento ou composição farmacêutica compreendendo um composto descri-to aqui, o método compreendendo misturar no mínimo um composto similara variante de junção de grelina, conforme definido acima na Fórmula I, comum veículo fisiologicamentre aceitável. Um aspecto adicional se refere a umacomposição farmacêutica compreendendo, como um ingrediente ativo, umcomposto conforme definido acima na Fórmula I ou um sal farmaceutica-mente aceitável do mesmo junto com um veículo farmaceuticamente aceitá-vel. Por conseguinte, a formulação pode incluir adicionalmente as moléculasde transporte conforme descrito acima.
Tratamentos de Combinação
Em um aspecto adicional, os presentes compostos podem seradministrados em combinação com adicional substâncias farmacologica-mente ativas ou outro material farmacologicamente ativo e/ou podem seradministrados em combinação com outro método terapêutico. Pela expres-são "em combinação com outra uma ou mais substâncias e/ou um ou maismétodos terapêuticos" se indica aqui, que a referida outra uma ou maissubstâncias e/ou um ou mais métodos terapêuticos é administrado ao indiví-duo tratado deste modo antes, durante (inclusive concorrentemente com)e/ou depois de tratamento de um indivíduo com um secretagogo. Em todosos casos de tratamento de combinação descritos aqui, a combinação podeser sob a forma de sistemas de kit-in-part, em que as substâncias ativascombinadas podem ser usadas para administração simultânea, seqüencialou separada. Em todos os casos, é preferencial que quaisquer dos medica-mentos mencionados aqui sejam administrados em quantidades farmaceuti-camente eficazes, isto é, uma administração envolvendo uma quantidadetotal de.cada componente ativo do medicamento ou composição farmacêuti-ca ou método que é suficiente para mostrar um benefício significativo para opaciente.
Nas seções seguintes, terapias de combinação para uso emmodalidades preferenciais são agrupadas como se segue:
1) Combinações em que todos os ingredientes ativos sãoagentes reguladores do apetite ou em outro modos úteis para tratar caquexiae/ou lipodistrofia.
Um ou mais secretagogos de acordo com a presente descriçãopodem ser administrados em combinação com outros agentes reguladoresdo apetite, incluindo mais de um tipo de secretagogo de hormônio do cres-cimento, tal como outro composto similar a variante de junção de grelina, talcomo um composto similar a variante de junção de grelina compreendendouma estrutura definida pela Fórmula I, descrita aqui. Outros secretagogosadequados para administração de combinação com outro composto de se-cretagogo são quaisquer dos compostos de secretagogo descritos aqui. Emuma modalidade preferencial, variante de junção de grelina (o mais prefe-rencialmente variante de junção de grelina humana) é administrada emcombinação com um composto diferente similar a variante de junção de gre-lina — é tencionado que esta combinação reforce e/ou prolongue o efeitodos secretagogos sobre o receptor de grelina. Em um modo similar, váriossecretagogos diferentes podem ser administrados a um indivíduo para au-mentar a eficácia sobre o receptor de grelina, tal como mais de 2 tipos desecretagogos diferentes, tal como 3, tal como 4, tal como 5, tal como 6, talcomo 7, tal como mais de 8 tipos de secretagogos diferentes. O secretagogode acordo com a presente descrição, tal como variante de junção de grelinaou um composto similar a uma ou mais variantes de junção de grelina tam-bém pode ser administrado em combinação com uma quantidade farmaceu-ticamente eficaz de um hormônio do crescimento, inclusive hGH.
Em uma modalidade preferencial, o secretagogo, tal como vari-ante de junção de grelina ou um composto similar a variante de junção degrelina, pode ser administrado em combinação com IGF-1, IGFBP-3, ouALP, preferencialmente com IGF-1. O fundamento lógico por trás deste tra-tamento de combinação é aumentar o nível de IGF-1, IGFBP-3, e/ou ALPconsiderado baixo em indivíduos caquéticos.
Em uma modalidade adicional, os secretagogos, tais como vari-ante de junção de grelina ou um composto similar a variante de junção degrelina, podem ser administrados em combinação com compostos conheci-dos por estimular o apetite, tais como grelina, antagonistas de receptores demelanocortina, agonistas de receptores de neuropeptídeo Y incluindo ago-nistas seletivos para subtipos individuais dos receptores de neuropeptídeo Y,Ieptina ou agonistas de receptores de leptina, canabinóides incluindo maco-nha e derivados de maconha, antipsicóticos, especialmente antipsicóticoatípicos tais como sertindol, Sufpirid, Clozapine, Risperidone, Quetiapin, A-misulpride, Ziprasidon, e Olanzapine.
2) Combinações do secretagogo, tal como variante de jun-ção de grelina ou um composto similar a variante de junção de grelina, comum ingrediente ou terapia ativos contra uma doença causando ou sendo as-sociada com a doença ou condição tratada com o secretagogo, tal como va-riante de junção de grelina ou um composto similar a variante de junção degrelina.
Particularmente em relação com caquexia por câncer, a admi-nistração de um secretagogo, tal como um composto similar a variante dejunção de grelina, pode ser realizada em combinação com qualquer terapiaanticancerígena, incluindo quimioterapia antineoplásica, radioterapia e tra-tamento cirúrgico. Em particular, é usada em combinação com quimioterapiae radioterapia. Portanto, uma modalidade se refere a um método para tratarcâncer compreendendo administrar uma quantidade eficaz de radioterapia euma quantidade eficaz de um secretagogo, tal como um composto similar avariante de junção de grelina de acordo com a presente descrição. O trata-mento com o secretagogo, tal como um composto similar a variante de jun-ção de grelina, pode ser iniciado antes do tratamento com radioterapia seiniciar. Pode ser administrado continuamente durante a radioterapia ou podeser administrado em intervalos, por exemplo, entre períodos com terapia deradioterapia.
Outra modalidade se refere a um método para tratar câncercompreendendo administrar uma quantidade eficaz de quimioterapia antine-oplásica e uma quantidade eficaz de um secretagogo, tal como um compos-to similar a variante de junção de grelina de acordo com a presente descri-ção. O tratamento com o secretagogo, tal como um composto similar a vari-ante de junção de grelina, pode ser iniciado antes do tratamento com quimio-terapia se iniciar. Pode ser administrado continuamente durante a quimiote-rapia, ou pode ser administrado em intervalos, por exemplo, entre períodoscom terapia de quimioterapia.
Além disso, o tratamento de combinação pode ser co-formulações do secretagogo, tal como um composto similar a variante dejunção de grelina, e a quimioterapia antineoplásica.
Um secretagogo de acordo com a presente descrição, tal comovariante de junção de grelina ou um composto similar a variante de junçãode grelina, também pode ser administrado em combinação com uma quanti-dade farmaceuticamente eficaz de glucocorticóides esteróides e tratamentoprocinético bem como oujtro tratamento usado em terapia contra câncer.
Portanto, em outra modalidade preferencial, um secretagogo de acordo coma presente descrição, tal como variante de junção de grelina ou um compos-to similar a variante de junção de grelina, é administrado em combinaçãocom uma quantidade farmacêutica eficaz de um ou mais de: drogas proges-tacionais, tais como megastrol e/ou ciproheptadinas (e/ou outros antagonis-tas de 5-HT receptores); e/ou aminoácidos de cadeia ramificada; e/ou oxan-dralin; e/ou agentes anti-TNF-α, tais como infliximab, etanercept, ou adali-mumab; e/ou testosterona; e/ou um "coquetel" compreendendo fármacos deimunonutrição, antioxidantes e inibidores de COX2; e/ou canabinóides; e/ouácido eicosapentaenóico; e/ou melatonina; e/ou talidomida; e/ou um fármacoβ2 adrenérgico; o mais preferencialmente para o tratamento de caquexia, talcomo caquexia por câncer.
Em ainda outra modalidade, o secretagogo, tal como um com-posto similar a variante de junção de grelina, é administrado em combinaçãocom compostos anti-inflamatórios, preferencialmente um NSAID, tal comoindometacina, e inibidores de COX1 ou inibidores de COX2; e/ou compostosanti-TNF-α tais como infliximab, etanercept, ou adalimumab. Outra combina-ção pode ser com eritropoietina/EPO. Outra combinação pode ser com a-gentes de redução de angiotensina II, tais como Vitor. Outra combinaçãopode ser com um ou mais moduladores de receptores de androgênio seleti-vos. Outra combinação pode ser com um ou mais de leptina, agonistas dosistema renina-angiotensina, agonistas de receptores opióides ou gama a-gonistas de receptores ativados por proliferador do peroxissoma.
Em relação a tratamento de lipodistrofia, outra modalidade se re-fere a um tratamento em que um secretagogo, tal como variante de junçãode grelina, mais preferencialmente um composto similar a variante de junçãode grelina, é administrado em combinação com um tratamento de Iipodistro-fia, tal como um ou mais dos tratamentos ou compostos descritos aqui, ade-quados para tratar uma síndrome lipodistrófica.
Portanto, outras substâncias farmacologicamente ativas que po-dem ser administradas em combinação com o referido secretagogo, tal comoum composto similar a variante de junção de grelina, nos métodos da pre-sente descrição compreendem:
(a) Leptina: Foi mostrado que leptina tem um efeito positivosobre as anormalidades metabólicas associadas com lipodistrofia (Oral E.A.et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 91:621-28 (2006)). Este tratamento secomprovou benéfico tanto para os pacientes que sofrem de um baixo nívelplasmático de leptina e para aqueles que têm um nível normal.
(b) Agonistas de receptores ativados por proliferador do pe-roxissoma (PPAR-γ) : foi demonstrado em vários estudos que PPAR-γ é im-portante para metabolismo de adipócitos e síndrome metabólica, e é propos-to que PPAR-γ agonistas reduzirão os sintomas de lipodistrofia (Semple R.K.et al., J. Clin. Invest. 116:581-89 (2006)).
(c) Agonistas do sistema renina-angiotensina: Foi mostradoque tratamento com HAART aumenta a atividade de ACE nas células T, aqual significa que agonistas do sistema renina-angiotensina podem melhorarlipodistrofia induzida por HAART (Hegele R.A. & Leff T., J. Clin. Invest.114:163-65(2004)).
(d) Antagonistas de receptores opióides: Foi mostrado queantagonistas de receptores opióides, tais como Naloxone e Naltrexone, pro-Iongam o período de tempo de tratamento com inibidor de protease para de-senvolvimento dos primeiros sintomas de Iipodistrofia (AIDS Patient CareSTDS 14:283 (2000)).
(e) Variante de junção de grelina des-acil: Foi visto que va-riante de junção de grelina em combinação com variante de junção de greli-na des-acil reduz a resistência à insulina, a qual é uma característica impor-tante da síndrome de Iipodistrofia (Koutkia P. et ai, Am. J. Physiol. Endocri-nol. Metab. 286:E296-303 (2004)).
(f) Tratamento anti-diabético e adiponectina incluindo ou-tros compostos para o tratamento e/ou a prevenção de resistência à insulinae doenças em que resistência à insulina é o mecanismo patofisiológico.
(g) Tem sido reportado que terapia com rhGH causa redu-ção no tamanho de "protuberância de búfalo", da gordura troncular e aumen-ta a massa magra corporal em um pequeno número de pacientes (Lo J.C. eta/., J. Clin. Endocrinol. Metab. 86:3480-87 (2001)). No entanto, perda degordura e anormalidades lipídicas não melhoraram e o controle da glicosesangüínea piorou. Exemplos de síndromes tratadas com hGH incluem HIV1AIDS e câncer. Sem ser limitado pela teoria, acredita-se que tratamento comvariante de junção de grelina ou um análogo da mesma manteria e/ou au-mentaria a gordura corporal em pacientes sendo tratados com hGH, destemodo neutralizando de modo eficaz ou no mínimo reduzindo Iipodistrofiacausada por hGH. Portanto, uma modalidade preferencial se refere ao usode variante de junção de grelina ou composto similar a variante de junção degrelina em combinação com um hormônio do crescimento, preferencialmenteem indivíduos sofrendo de HIV ou AIDS e/ou caquexia por câncer. O trata-mento referido com variante de junção de grelina ou um análogo da mesmapode ser antes, e/ou durante e/ou depois do indivíduo ser submetido a tra-tamento com um hormônio do crescimento. O hormônio do crescimento refe-rido é preferencialmente hGH.
(h) Tratamento com combinações de diferentes secretago-gos conforme descrito acima em grupo 1), acima.
3) Combinações do secretagogo, tal como variante de jun-ção de grelina ou um composto similar a variante de junção de grelina, comum ingrediente ativo ou terapia contra sintomas associados com a doençaou condição tratada com o secretagogo, tal como variante de junção de gre-lina ou um composto similar a variante de junção de grelina.
Um aspecto se refere a tratamento de combinação, em que umdos ingredientes na combinação é usado para tratar sintomas ou condiçõesque podem ser encontrados em indivíduos sofrendo de caquexia. Portanto,usos e tratamentos de combinação envolvendo administração de um secre-tagogo, tal como o composto similar a variante de junção de grelina de acor-do com a presente descrição, também podem envolver tratamento em com-binação com um ou mais de
a) profilaxia e/ou alívio e/ou tratamento de uma depressãoclínica, cujo tratamento de combinação adicionalmente compreende adminis-trar um antidepressivo, um pró-fármaco do mesmo, ou um sal farmacêuticoaceitável do referido antidepressivo ou o referido pró-fármaco. No tratamentode combinação acima, o antidepressivo é preferencialmente um inibidor derecaptação de norepinefrina (NERI), um inibidor de recaptação de serotoninaseletivo (SSRI), um inibidor de monoamina oxidase (ΜΑΟ), um NERI/SSRIcombinado, ou um antidepressivo atípico, um pró-fármaco do referido anti-depressivo ou um sal farmaceuticamente aceitável do referido antidepressivoou a referida pró-fármaco. Antidepressivos preferenciais são SSRI, um pró-fármaco dos mesmos ou um sal farmacêutico aceitável do referido SSRI oua referida pró-fármaco. O SSRI é preferencialmente citalopram, escitalo-pram, femoxetina, fluoxetina, fluvoxamina, indalpina, indeloxazina, milnaci-pran, paroxetina, sertralina, sibutramina ou zimeldina, um pró-fármaco doreferido SSRI ou um sal farmacêutico aceitável do referido SSRI ou da refe-rida pró-fármaco. Dos acima, citalopram e escitalopram, um pró-fármaco ouum sal farmacêutico aceitável dos mesmos, são preferenciais em algumasmodalidades de tratamentos de combinação.
b) profilaxia e/ou alívio e/ou tratamento de uma condiçãoemética, incluindo náusea e vômito, cujo tratamento de combinação adicio-nalmente compreende administrar um agente antiemético, um pró-fármacodo mesmo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do referido agente antie-mético ou da referida pró-fármaco. Agentes antieméticos preferenciais usa-dos em tratamentos de combinação de acordo com a presente descriçãoincluem cloridrato de meclizina, proclorperazina, prometazina, cloridrato detrimetobenzamida e cloridrato de ondansetron. Em particular, vômito podeser causado por câncer, quer devido ao tratamento anticancer ou devido àdoença de câncer como tal.
c) profilaxia e/ou alívio e/ou tratamento de uma condiçãopsicótica, cujo tratamento de combinação adicionalmente compreende admi-nistrar um agente antipsicótico, um pró-fármaco do mesmo ou um sal farma-cêutico aceitável do referido agente antipsicótico ou da referida pró-fármaco.Agentes antipsicóticos preferenciais usados em tratamentos de combinaçãode acordo com a presente descrição incluem clorpromazina, haloperidol, clo-zapina, loxapina, cloridrato de molindona, tiotixeno, olanzapine, ziprasidone,cloridrato de ziprasidone, proclorperazine, perfenazine, cloridrato de trifluo-perazine e risperidona.
d) profilaxia e/ou alívio e/ou tratamento de ansiedade, cujotratamento de combinação adicionalmente compreende administrar um a-gente antiansiedade, um pró-fármaco do mesmo ou um sal farmacêutico a-ceitável do referido agente antiansiedade ou da referida pró-fármaco. Agen-tes antiansiedade preferenciais usados em tratamentos de combinação deacordo com a presente descrição incluem alprazolam, clonazepam, Ioraze-pam, oxazepam, cloridrato de clordiazepóxido, diazepam, cloridrato de bus-pirona, cloridrato de doxepina, pamoato de hidroxizina e clonazepam.
Logicamente, combinações dos grupos (1-3) acima também es-tão dentro do âmbito desta descrição.
Embalagem Medicinal
Os compostos descritos aqui, podem ser administrados sozi-nhos ou em combinação com veículos ou excipientes farmaceuticamenteaceitáveis, ou em doses únicas ou múltiplas.
As formulações podem ser apresentadas convenientemente emforma de unidade de dosagem por métodos conhecidos daqueles versadosna técnica.
É preferencial que os compostos de acordo com a presentedescrição sejam proporcionados em um kit. Um kit similar tipicamente con-tém um composto ativo em formas de dosagens para administração. Umaforma de dosagem contém uma quantidade suficiente de composto ativo detal modo que pode ser obtido um efeito desejável quando administrado a umsujeito, preferencialmente antes de no mínimo uma refeição por dia, maispreferencialmente antes de cada refeição principal, tal como três vezes aodia, durante o curso de 1 ou mais dias. Portanto, é preferencial que a emba-Iagem medicinal compreende uma quantidade de unidades de dosagem cor-respondentes ao regime de dosagem relevante. Por conseguinte, em umamodalidade, a embalagem medicinal compreende uma composição farma-cêutica compreendendo um composto conforme definido acima ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo e veículos, veículos e/ou excipientesfarmaceuticamente aceitáveis, a referida embalagem tendo de 7 a 21 unida-des de dosagem, ou múltiplos das mesmas, deste modo tendo unidades dedosagem para uma semana de administração ou várias semanas de admi-nistração.
Em uma modalidade, a embalagem medicinal é para administra-ção uma vez ao dia em uma semana, e compreende 7 unidades de dosa-gem, em outra modalidade a embalagem medicinal é para administraçãoduas vezes ao dia, e compreende 14 unidades de dosagem. Em ainda outramodalidade mais preferencial, a embalagem medicinal é para administraçãotrês vezes ao dia, e compreende 21 unidades de dosagem.
As unidades de dosagem são conforme definido acima, isto é,uma unidade de dosagem preferencialmente compreende uma quantidadedo composto similar a variante de junção de grelina ou um sal do mesmoequivalente a de 0,3 pg a 600 mg de variante de junção de grelina, tal comode a partir de 2,0 pg a 200 mg de variante de junção de grelina, tal como de5,0 pg a 100 mg de variante de junção de grelina, tal como de 10 pg a 50 mgde variante de junção de grelina, tal como de 10 pg a 5 mg de variante dejunção de grelina, tal como de 10 pg a 1,0 mg de variante de junção de greli-na.
A embalagem medicinal pode estar em qualquer forma adequa-da para administração parenteral, em particular subcutânea. Em uma moda-lidade preferencial, a embalagem está na forma de um cartucho, tal comoum cartucho para uma caneta de injeção, a caneta de injeção sendo tal co-mo uma caneta de injeção conhecida do tratamento com insulina ou do tra-tamento com hGH.
Quando a embalagem medicinal compreende mais de uma uni-dade de dosagem, é preferencial que a embalagem medicinal seja propor- cionada com um mecanismo para ajustar cada administração a uma unidadede dosagem somente.
Preferencialmente, um kit contém instruções indicando o uso daforma de dosagem para obter um efeito desejável e a quantidade da formade dosagem a ser tomada durante um período de tempo especificado. Porconseguinte, em uma modalidade a embalagem medicinal compreende ins-truções para administrar a composição farmacêutica. Em particular as instru-ções referidas podem incluir instruções referentes a administração da referi-da composição farmacêutica ou durante uma refeição, ou preferencialmenteno máximo 45 minutos antes de uma refeição, tal como no máximo 30 minu-tos antes de uma refeição, tal como no máximo 25 minutos antes de umarefeição, tal como no máximo 20 minutos antes de uma refeição, tal como nomáximo 15 minutos antes de uma refeição, tal como no máximo 10 minutosantes de uma refeição, tal como no máximo 5 minutos antes de uma refei-ção.
Método para Monitorar o Efeito do Tratamento com Variante de Junção deGrelina e/ou um Composto Similar a Variante de Junção de Grelina
Outro aspecto se refere a um método para monitorar o efeito daadministração de um secretagogo, tal como os compostos similares a varian-te de junção de grelina descritos aqui, em um método para a presente des-crição, compreendendo medir um ou mais marcadores, em particular marca-dores, selecionados entre GH, IGF-1, IGFBP-3, ALP (acidífera marcada),hormônios tiroidianos, hormônios sexuais, e albumina; mais preferencial-mente selecionados entre IGF-I, IGFBP-3, ALP (acidífera marcada); aindamais preferencialmente IGF-1. Estes marcadores estão todos baixos em pa-cientes caquéticos e se espera que aumentem depois de tratamento comvariante de junção de grelina. Outros marcadores que se espera que aumen-tem depois de tratamento com variante de junção de grelina são o nível san-güíneo de GH e o peso corporal. Além disso, espera-se que a composiçãocorporal se altere, e se espera que a massa magra corporal aumente. Asalterações da composição corporal podem ser avaliadas usando MRI ouRMN.
Portanto, uma modalidade se refere a um método para monito-rar o efeito de quaisquer dos tratamentos de um indivíduo com um secreta-gogo descrito aqui, o referido método compreendendo medir o nível sangüí-neo de o referido indivíduo de um ou mais de: (i) IGF-1 e/ou (ii) IGFBP-3e/ou (iii) ALP e/ou (iv) um ou mais hormônios tiroidianos e/ou (v) um ou maishormônios sexuais e/ou (vi) albumina ou, mais preferencialmente, um oumais de: (i) IGF-1 e/ou (ii) IGFBP-3 e/ou (iii) ALP e/ou (iv) GH e/ou (v) pesocorporal e/ou (vi) composição corporal.
Métodos para medir substâncias no nível do sangue de um indi-víduo são de conhecimento geral na técnica. Como um exemplo, uma amos-tra de sangue isolada pode ser testada por métodos tais como Western blotou por ensaio ligado a enzima (ELISA).
EXEMPLOS
A presente descrição é adicionalmente definida nos seguintesExemplos. Deve ser entendido que estes Exemplos, enquanto indicandomodalidades preferenciais, são dados a título de ilustração somente. A partirda discussão acima e destes Exemplos, uma pessoa versada na técnica po-de determinar as características preferenciais desta descrição, e sem se a-fastar do espírito e do âmbito da mesma, pode fazer várias alterações e mo-dificações para adaptar a mesma a vários usos e condições.
Os Exemplos 2, 5, 6, 7, 8, e 9 são exemplos de trabalho. Os E-xemplos 1, 3, 4, 10, e 11 são exemplos proféticos.
Exemplo 1Provas de Ligação de Competição
Células COS-7 transfectadas são transferidas para lâminas decultura um dia depois de transfecção em uma densidade de 1x105 célulaspor cavidade tendo por objetivo 5 a 8% de ligação do Iigante radioativo. Doisdias depois da transfecção, são realizados experimentos de ligação de com-petição por 3 horas a 4 0C usando 25 pM de [125IJGreIina (GE Healthcare,Piscataway, NJ, EUA). Provas de ligação são realizadas em 0,5 ml de umtampão Hepes a 50 mM, pH 7.4, suplementado com 1 mM de CaCI2, 5 mMde MgCI2, e 0,1% (em peso/vol) de albumina sérica bovina, 40 pg/ml de ba-citracina. A li8gação não específica é determinada como a ligação na pre-sença de 1 micromol de variante de junção de grelina não marcada. As célu-las são lavadas duas vezes em 0,5 ml de tampão gelado e 0,5 a 1 ml detampão de Iise (8 M de Uréia, 2% de NP40 em 3 M de ácido acético) é adi-cionado e é contada a radioatividade ligada. As determinações são feitas emduplicata.
Exemplo 2
Produção Sintética de Composto Similar a Variante de Junçãode Grelina
Derivados de aminoácidos e reagentes de síntese podem serobtidos a partir de fontes comerciais. A extensão de cadeias peptídicas podeser realizada usando o sintetizador Applied Biosystem 433A produzido pelaPerkin Elmer, e uma resina derivada de peptídeo protegido pode ser constru-ída pelo método Boc ou Fmoc. A resina de peptídeo protegido obtida pelométodo Boc é desprotegida com fluoreto de hidrogênio anídrico (HF) na pre-sença de p-cresol deste modo liberando o peptídeo, o qual é em seguidapurificado. A resina de peptídeo protegido obtida pelo método Fmoc é des-protegida com ácido trifluoroacético (TFA) ou TFA diluído contendo váriosextratores, e o peptídeo liberado é purificado. A purificação é realizada emHPLC de fase reversa sobre uma coluna de C4 ou C18. A pureza do produtopurificado pode ser confirmada por HPLC de fase reversa, e sua estruturapode ser confirmada por análise da composição de aminoácidos e espec-trometria de massa.Peptídeos descritos aqui, podem ser produzidos por um métodode síntese de peptídeo convencional. Especificamente, a síntese de peptí-deos acilados ou alquilados é exemplificada abaixo.
Abreviações: "resina HMP" significa resina de 4-hidroximetila- fenoximetila; "resina de Fmoc amida" significa resina de 4-(2',4'-dimetoxifenila-Fmoc-aminometila) fenoxiacetamido-etila; "resina PAM" signi-fica resina de fenilaacetoamidometila; "HBTU" significa de hexafluorofosfato2-(1H-benzotriazol-1-ila)-1,1,3,3-tetrametilaurônio; "TBTU" significa de tetra-fluoroborato 2-(1H-benzotriazol-1-ila)-1,1,3,3-tetrametilaurônio; "HOBt" signi- fica 1-hidroxibenzotriazol; "DCC" significa diciclohexilacarbodiimida; "DIPCI"significa diisopropilacarbodiimida; "TFA" significa ácido trifluoroacético; "Dl-PEA" significa diisopropilaetilaamina; "TIPS" significa triisopropilasilaano;"Fmoc" significa fluorenilametoxicarbonila; "Boc" significa t-butilaoxicarbonila;"Trt" significa tritila; "Bu" significa t-butila; "Pmc" significa 2,2,5,7,8-pentametilacroman-6-sulfonila; "Prl" significa propionila; "PhPrl" significa feni-lapropionila; "Bzl" significa benzila; "Bom" significa benzilaoximetila; "Tos"significa toluenossulfonila; "Cl-Z" significa 2-cloro-benzilaoxicarbonila; "Pis"significa 2-fenilaisopropila; "Mtt" significa 4-metilatritila; "DMF" significa N,N-dimetilaformamida; "NMP" significa N-metilapirrolidona; "DMAP" significa 4- dimetilaaminopiridine; "HOSu" significa N-hidroxissuccinimida; "Adod" signifi-ca ácido 2-aminododecanóico; "Aib" significa ácido 2-aminoisobutílico; "Ape"significa ácido 5-aminopentanóico; "Cha" significa ciclohexilaalanina; "Dap"significa ácido 2,3-diaminopropiônico; "Nal" significa naftilaalanina; "Nie" sig-nifica norleucina.
Aminoácidos de proteção os quais podem ser usados no métodoFmoc de síntese: Boc-Gly, Fmoc-Gly, Fmoc-Ser (Bu), Fmoc-Ser (Trt), Fmoc-Glu (OBu), Fmoc-His (Boc), Fmoc-Gln (Trt), Fmoc-Arg (Pmc), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Pro, Fmoc-Leu, Fmoc-Ala, Fmoc-Val, Fmoc-Phe, Fmoc-Phe,Fmoc-Ser (n-C8H17), Fmoc-Ser (n-C8Hi7), Fmoc-Cys (n-C8Hi7), Fmoc-Asp(OPis), Fmoc-Ser (Bzl), Fmoc-Cys (Trt), Fmoc-Dap (Octanoyl), Fmoc-2-Nal,Fmoc-2-Nal, Fmoc-NIe, Fmoc-Lys (Mtt), Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Asp (O-C7H15).Boc method: Boc-Gly, Boc-Ser (Bzl), Boc-Ser (Ac), Boc-Ser (Prl), Boc-Glu(OBzI), Boc-His (Bom), Boc-Gln, Boc-Arg (Tos), Boc-Lys (Cl-Z), Boc-Pro,Boe-Leu, Boe-Ala, Boe-Val, Boe- Phe, Boe-Cys (n-CaHiy), Boc-Ape, Boe-Ser(n-C8H17)
Unidades usadas:
(a) Unidade de sistema de HPLC Analítica: Shimadzu LC-10A System; Coluna: YMC PROTEIN-RP (4,6 mm χ 150 mm); Temperaturada coluna: 40 °C; Eluente: Um gradiente linear de a partir de 0 a 50% de a-cetonitrila por 20 minutos em 0,1% de ácido trifluoroacético; Taxa de fluxo: 1mL/min; Detecção: UV (210 nm); volume de injeção: 10 a 100 mu I.
(b) Unidade de sistema de HPLC Preparativa: Waters 600Multisolvent Delivery System; Colunas: YMC-Pack-ODS-A (5 mu m, 20 mm χ250 mm) YMC-Pack-PROTEIN-RP (5 mu m, C4, 10 mm χ 250 mm) YMC-Pack PROTEIN-RP (5 mu m, C4, 20 mm χ 250 mm) YMC PROTEIN-RP (4,6mm χ 150 mm); Eluente: Um gradiente linear adequado de concentração deacetonitrila em 0,1% de ácido trifluoroacético; Taxa de fluxo: 10 mL/min. (pa-ra colunas de um diâmetro interno de 20 mm), 3 mL/min. (para a coluna deum diâmetro interno de 10 mm), 1 mUmin. (para a coluna de um diâmetrointerno de 4,6 mm); Detecção: 210 nm, 260 nm; injeção: 10 a 2000 mu I(2000 mu I ou mais foi injetado através de uma bomba)
(c) Unidade de espectrômetro de massa: Finnigan MATTSQ700; fonte de íons: ESI; Modo iônico de detecção: Spray Positivo; Volta-gem: 4,5 kV; Temperatura capilar: 250 0C; Fase móvel: Uma mistura de0,2% de ácido acético e metanol (1:1); Taxa de fluxo: 0,2 mL/min; Faixa devarredura: m/z 300 até 1.500
(d) Unidade de análise da seqüência de aminoácidos: Ap-plied Biosystem 477A, seqüenciador modelo 492 fabricado pela Perkin Elmer(e) Unidade de análise da composição de aminoácidos: a-nalisador de aminoácidos modelo L-8500 fabricado pela Hitachi, Co., Ltd.;Amostra: A menos que especificado de modo diverso, a amostra é hidrolisa-da com 6 M de HCI a 110 0C por 24 horas dentro de um tubo selado.
Exemplo de Síntese de um Derivado Tendo Variante de Junçãode Grelina de Acil Serina (Método Fmoc. Derivados de Amida de Carboxila-Terminal)
GSS (CO-C7H15) FLSPEHQRVQVRPPHKAPH Fmoc-His (Pmc)-HMP-resina (403 mg, 0,25 mmol, ABI Co., Ltd.) é tratada com 20% de pipe-razina por 20 minutos e submetida repetidamente à introdução de aminoáci- do Fmoe por HBTU/HOBt e eliminação de Fmoe por piperazina seqüencial-mente para construir Fmoc-Ser (Bu)-Ser (Trt)-Phe-Leu-Ser (tBu)-Pro-Glu(OBu)-His (Boc)-GIn (Trt)-Arg (Pmc)-VaI-GIn-VaI (Trt)-Arg (Pmc)-Pro-Pro-His(Boc)-Lys (Boc)-AIa (Boc)-Pro (Boc)-Pro-His (Pmc)-resina. Depois de Boc-Gly ser finalmente introduzido por DCC/HOBt, a resina de peptídeo protegidoresultante (1,3 g) é tratada com 1% de TFA-5% de TIPS-solução de cloretode metileno (15 mL) por 30 minutos.
A resina de peptídeo é filtrada, lavada várias vezes com cloretode metileno (30 mL), e lavada com 5% de Dl EA (10 mL) e em seguida comcloreto de metileno (30 mL). A resina de peptídeo de-Trt resultante (cerca de 1,3 g) é dilatada com NMP (10 mL), e ácido octanóico (144,2 mg, 1,0 mmol)e DIPCI (126,2 mg, 1,0 mmol) são adicionados a isso na presença de DMAP(61,1 mg, 0,5 mmol) e deixados para reagir por 8 horas. A resina é recupe-rada por filtração e lavada com NMP e em seguida com cloreto de metileno,seguida por secagem sob vácuo para dar cerca de 1,2 g de resina de peptí- deo protegido em que a cadeia lateral da terceira serina é octanoilada. Aeste produto é adicionado um reagente de desproteção (10 mL) consistindoem 88% de TFA-5% de fenol-2% de TIPS-5% de H2O, e a mistura é agitadaem temperatura ambiente por 2 horas. A resina é removida por filtração, e ofiltrado é concentrado seguido por adição de éter aos resíduos resultantes para formar precipitados. Os precipitados são recuperados por filtração esecados para dar cerca de 550 mg de peptídeo bruto. 200 mg deste produtosão dissolvidos em 10 mL de água e aplicado a YMC-Pack PROTEIN-RP(C4, 20 mm χ 250 mm) e elutriado com um gradiente linear (taxa de fluxo: 10mL/min.) por 60 minutos de a partir de 0 até 54% de acetonitrila em 0,1% deácido trifluoroacético. As frações desejadas são coletadas e Iiofilizadas paradar cerca de 120 mg do produto desejado.
Exemplo de Síntese de um Derivado Tendo Variante de Junção de Grelinade Acil Serina (Método Fmoc. Compostos de Amida de Carboxila-Terminal)(1-22)-NHg
GSS (CO-C7Hi5) FLSPEHQRVQVRPPHKAPH-NH2 Fmoc-amida-resina (403 mg, 0,25 mmol, ABI Co., Ltd.) é tratada com 20% de pipe-razina por 20 minutos e submetida repetidamente a introdução de Fmoc-aminoácido por HBTU/HOBt e eliminação de Fmoc por piperazina seqüenci-almente para construir Fmoc-Ser (Bu)-Ser (Trt)-Phe-Leu-Ser (Bu)-Pro-GIu(OBu)-His (Boc)-GIn (Trt)-Arg (Pmc)-VaI-GIn-VaI (Trt)-Arg (Pmc)-Pro-Pro-His(Boc)-Lys (Boc)-AIa (Boc)-Pro (Boc)-Pro-His (Boc)-resina. Depois de Boe-Glyser finalmente introduzido por DCC/HOBt, a resina de peptídeo protegidoresultante (cerca de 550 mg) é tratada com 1% de TFA-5% de TIPS-soluçãode cloreto de metileno (10 mL) por 30 minutos. A resina de peptídeo é recu-perada por filtração, lavada várias vezes com cloreto de metileno (30 mL), elavada com 5% de DIEA (10 mL) e em seguida com cloreto de metileno (30mL). A resina de peptídeo de-Trt resultante (cerca de 750 mg) é dilatadacom NMP (10 mL), e ácido octanóico (144,2 mg, 1,0 mmol) e DIPCI (126,2mg, 1 mmol) são adicionados a isso na presença de DMAP (61,1 mg, 0,5mmol) e deixados para reagir por 4 horas. A resina é recuperada por filtraçãoe lavada com NMP e em seguida com cloreto de metileno, seguido por se-cagem sob vácuo para dar cerca de 800 mg de resina de peptídeo protegidoem que a cadeia lateral da terceira serina é octanoilada. TFA (10 mL) é adi-cionado a este produto e agitado em temperatura ambiente por 30 minutos.
A resina é removida por filtração, e o filtrado é em seguida concentrado se-guido por adição de éter aos resíduos resultantes para formar precipitados.
Os precipitados são recuperados por filtração e secados para dar cerca de250 mg de peptídeo bruto. Cerca de 200 mg deste produto é dissolvido em10 mL de ácido acético aquoso a 30% e aplicado a YMC-Paek PROTEIN-RP(C4, 20 mm χ 250 mm) e elutriado com um gradiente linear (taxa de fluxo: 10mL/min.) por 60 minutos de a partir de 0 a 54% de acetonitrila em 0,1% deácido trifluoroacético. As frações desejadas são coletadas e em seguida Iiofi-Iizadas para dar cerca de 150 mg do produto desejado.
Exemplo de Síntese de um Derivado Tendo Acil Serina (Método Boc) fSer3(Propionil)]-Variante de Junção de Grelina (1-22)
Resina de variante de junção de grelina protegida com GSS(CO-CH2CH3) FLSPEHQRVQVRPPHKAPH (4-22) é construída a partir deresina Boc-His (Tos)-Pam (0,75 g, 0,5 mmol) por química Boc, e Boc-Ser(CO-CH2CH3)-OH, Boc-Ser (BzI)-OH e Boc-GIy-OH são condensados commetade (1,4 g) da resina. A resina resultante, 1,5 g, é em seguida tratadacom uma mistura de HF e p-cresol (8,5 mL:1,5 mL) em 0°C por 1 hora, e oHF é evaporado. Éter é adicionado aos resíduos, por meio do que 671 mgde peptídeo bruto é obtido. Esta amostra é em seguida dissolvida em 50%de ácido acético (AcOH) e aplicada a uma coluna de preparativo YMC-Pack-ODS-A (5 mu m, 20 mm χ 250 mm) e elutriada em uma taxa de 10 mL/minpor um gradiente de a partir de 0 a 95% de concentração de acetonitrila emsolução a 0,1% de TFA por 75 minutos. As frações contendo o produto dese-jado são Iiofilizadas para dar aproximadamente 135,8 mg de peptídeo bruto.
Uma parte (0,5 mg) deste produto é aplicado a coluna YMC-A-302 (C18, 4,6mm χ 150 mm) e elutriada em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. por um gradi-ente de a partir de 15 a 19% de concentração de acetonitrila. Este procedi-mento de purificação é em seguida repetido e as frações desejadas sãocombinadas para dar aproximadamente 0,41 mg do produto desejado.
Outros compostos de acordo com a presente descrição podemser produzidos do mesmo modo.
O método acima foi usado para sintetizar SEQ ID NO: 2, SEQ IDNO: 4, e SEQ ID NO: 5 aciladas e não aciladas.
Exemplo 3
Um Estudo de Crossover Randomizado, de Centro Único, de Quatro Perío-dos para Investigar a Biodisponibilidade Absoluta de Variante de Junção deGrelina Administrada por Via Intravenosa e Variante de Junção de GrelinaAdministrada por Via Subcutànea em Três Doses Únicas Diferentes em Su-jeitos Saudáveis.
Objetivos:
Primário: Investigar a biodisponíbilidade absoluta de três dosesdiferentes de variante de junção de grelina administradas como doses únicasintravenosa e subcutânea.
Secundário:
1) Investigar a linearidade da dose (proporcionalidade dadose) das doses ascendentes.
2) Investigar e comparar os perfis farmacodinâmicos entreos tratamentos.
3) Avaliar a segurança e a tolerabilidade local.
Design do Estudo: Um estudo de crossover randomizado, decentro único, de design de bloco não balanceado, de quatro períodos parainvestigar a biodisponibilidade absoluta entre variante de junção de grelinaadministrada por via intravenosa e variante de junção de grelina administra-da por via subcutânea em três diferentes doses únicas em sujeitos saudá-veis. Três doses serão usadas para cada modo de administração: baixa,média e alta. Para reduzir o número de dosagens para cada indivíduo e des-te modo reduzir a duração do estudo, cada sujeito somente receberá quatrodoses do total de seis doses, isto é, dois níveis de doses administradas co-mo intravenosa e subcutânea, respectivamente. O design de bloco não ba-lanceado assegurará que todos os três níveis de doses serão cobertos destemodo embora nem todos os sujeitos venham a receber todos os níveis dedoses. Um período de desgaste suficiente será colocado entre os períodosde dosagem individuais.
Desfechos:
Farmacocinética de variante de junção de grelina: AUC0-t, AUC,Cmax. tmaxi t , C|/f, M2JU Q1 V2, XyzMRT Farmacodinâmica: GH: AUC, Cmax e tmax produção Cardía-ca, avaliação da fome, consumo de alimento/energia, grau de prazer relacio-nado com o consumo de alimento, massa corporal, gasto de energia, DEXA.
Segurança: A segurança e a tolerabilidade local serão avaliadasdo início ao fim do estudo por avaliações clínicas (exame físico e sinais vi-tais), eletrocardiografia e testes laboratoriais (hematologia e química clínica).
População do estudo e cálculo da potência: Sujeitos do sexomasculino saudáveis, com idades de 18 a 45 anos com um índice de massacorporal (BMI) de 19 a 26 kg/m2 (ambos inclusive).
O objetivo primário deste estudo é investigar a biodisponibilida-de absoluta de variante de junção de grelina administrada através de admi-nistração intravenosa e subcutânea. Um design de bloco não balanceadoserá aplicado para reduzir o tempo do período do estudo e reduzir o númerode dosagens por indivíduo. O número de sujeitos necessários para realizaruma análise estatística da biodisponibilidade absoluta por níveis de dosebem como uma análise da linearidade da dose entre doses será calculadocom base em dados da literatura existente.
Produtos do estudo: variante de junção de grelina para adminis-tração intravenosa e subcutânea.
Exemplo 4
Testes Funcionais sobre o Receptor de Grelina
Transfecções e cultura de tecido-células COS-7 são cultivadasem meio de Eagle modificado por Dulbecco 1885 suplementado com 10% desoro de feto de vitela, 2 mM de glutamina e 0,01 mg/ml de gentamicina. Ascélulas são transfectadas. usando método de precipitação de fosfato de cál-cio com adição de cloroquina conforme previamente descrito (Holst B. et a!.,Mol. Pharmacol. 53:166-175 (1998)). Para experimentos de dose genética,são usadas quantidades variáveis de DNA. A quantidade de cDNA (20 pg/75cm2) resultante em sinalização máxima é usada para curvas de dose respos-ta. Células HEK-293 são cultivadas em meio D-MEM, meio de Eagle modifi-cado por Dulbecco 31966 com alto teor de glicose suplementado com 10%de soro de feto de vitela, 2 mM de glutamina e 0,01 mg/ml de gentamicina.As células são transfectadas com Lipofectamine® 2000 (Invitrogen Corp.,Carlsbad, Cal.).
Turnover de fosfatidilinositol: Um dia depois da transfecção, cé-lulas COS-7 são incubadas por 24 horas com 5 pCi de [3H]-myo-inositol (GEHealthcare, Piscataway, NJ) em 1 ml de meio suplementado com 10% desoro de feto de vitelo, 2 mM de glutamina e 0,01 mg/ml de gentamicina porcavidade. As células são lavadas duas vezes em tampão, 20 mM de HE-PES, pH 7.4, suplementado com 140 mM de NaCI, 5 mM de KCI, 1 mM deMgSO4, 1 mM de CaCI2, 10 mM de glicose, 0,05% (em peso/vol) de sorobovino; e são incubadas em 0,5 ml de tampão suplementado com 10 mM deLiCI em 37 0C por 30 min Depois de estimulação com várias concentraçõesde peptídeo por 45 min em 37 °C, as células são extraídas com 10% de áci-do perclórico gelado seguido por incubação sobre gelo por 30 min Os so-brenadantes resultantes são neutralizados com KOH em tampão HEPES, eo fosfato de [3H]-inositol gerado é purificado sobre resina de permuta aniôni-ca Bio-Rad AG 1-X8 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Cal.) seguindo as ins-truções do fabricante. As determinações são feitas em duplicatas.
Prova de CRE, SRE e NF-κ-Β repórter: células HEK293 (30.000células/cavidade) semeadas em lâminas de 96 cavidades são transfectadastransitoriamente. Em caso da prova de CRE repórter, as células são trans-fectadas com uma mistura de plasmídeo repórter pFR-Luc e pFA2-CREB(PathDetect CREB trans-Reporting System, Stratagene, La Jolla1 Cal.) ouSRE-Luc (PathDetect SRE Cis-Reporting System, Stratagene, La Jolla, Cal.)e as quantidades indicadas de DNA receptor. Depois de transfecção, as cé-lulas são mantidas em baixo nível de soro (2,5%) do início ao fim dos expe-rimentos e são tratadas com o respectivo inibidor de caminhos de sinaliza-ção intracelular. Um dia depois da transfecção, as células são tratadas comos Iigantes respectivos em um volume de teste de 100 μΙ de meio por 5 ho-ras. O teste é terminado lavando as células duas vezes com PBS e adiçãode 100 μΙ de reagente de teste Luciferase® (LucLite®, PerkinEImer, Inc.,Wellesley, Mass.). A luminescência é medida em um TopCounter (Top CountNETT, Packard Instrument Co., Meriden, Conn.) por 5 segundos. Os valoresda luminescência são dados como unidades de luz relativa (RLU).
Estudo de MAP quinase: Células COS 7 (densidade de sermea-dura 150.000 células/cavidades) são transfectadas nas lâminas de teste.Dois dias depois da transfecção, a concentração indicada de Iigante é adi-cionada ao meio de teste sem qualquer soro e incubada por 10 min em 37°C. A reação é interrompida removendo o meio e duas etapas de lavagemcom PBS gelado. As células são Iisadas em tampão da amostra e separadassobre 10% de SDS-PAGE de acordo com Laemmli U.K., Nature 227:680-85(1970). Proteínas são transferidas para nitrocelulose e análise Western bloté realizada usando uma diluição a 1:5000 de anticorpo antifosfo-ERK1/2monoclonal de camundongo (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz,Cal.). Proteína ERK total é determinada usando uma diluição a 1:10000 deanticorpo anti-ERK (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, Cal.). Osblots são sondados com anticorpos secundários conjugados à peroxidase deraiztábano silvestre anticamundongo, visualizados usando reagente de qui-miluminescência reforçado (GE Healthcare, Piscataway, NJ) e quantificadospor análise densiométrica. Fosforilação ERK1/2 é normalizada de acordocom a carga de proteína expressando os dados como uma proporção defosfoERK1/2 sobre ERK1/2 total. Os resultados são expressados como per-centagem do valor obtido em células pseudo transfectadas não-estimuladas.
Exemplo 5
Eficácia da Administração Subcutânea de Variante de Junção deGrelina Acilada sobre o Ganho de Peso e o Consumo de Alimento
Variante de junção de grelina acilada (20 pg (Figura 1A e 1B) ou180 pg (Figura 2A e 2B)) ou o Veículo (1,6% de manitol) foi administradouma vez ao dia por 14 dias sucessivos (Figura 1A e 1B) ou 7 dias sucessi-vos (Figura 2A e 2B), através da via subcutânea (SC), a grupos compreen-dendo η = 10 (Figura 1A e 1B) ou η = 8 (Figura 2A e 2B) camundongos ma-chos 129Sv. Não ocorreu mortalidade em quaisquer dos animais durantetodo o período do estudo. Não foram observados sinais clínicos em quais-quer dos animais durante todo o período do estudo. Todos os animais foramsubmetidos à sangria terminal, sob anestesia com CO2, imediatamente antesda eutanásia. Coleta de sangue terminal foi realizada serialmente pelo nú-mero do animal, e não por grupo.
Bioquímica: Sangue para análise bioquímica foi coletado em tu-bos pré-etiquetados não revestidos. Os tubos foram pré-etiquetados e conti-nham as seguintes informações: Número do estudo, número do grupo, nú-mero do animal e data. Depois de coagulação, o sangue de cada animal foicentrifugado, e o soro foi coletado em dois tubos pré-etiquetados e submeti-do a análise como se segue: Soro, 250 μΙ, foi mantido em 2 a 8 0C até análi-se. As amostras foram submetidas aos seguintes testes listados usando umsistema Hitachi 917: Creatinina1 Bilirrubina total, Glicose, Triglicerídeos, Co-lesterol, HDL, LDL, Proteína total, Globulina, Albumina, Uréia, Potássio, Fós-foro, Cálcio, Sódio, Cloreto, sGOT, sGPT, ALP.
Urinálise: Urina foi coletada em tubos pré-etiquetados (conformeacima) de todos os animais (onde possível) antes e/ou depois de eutanásia.Para todos os animais sobreviventes, foi realizada coleta de urina serialmen-te pelo número do animal, e não por grupo. Foi feita uma tentativa de atingira quantidade máxima possível para realizar os testes listados abaixo. Uriná-Iise é realizada usando uma haste de teste comercial (Bayer, Multistix®10SG) aplicada à amostra de urina e avaliando os seguintes parâmetros:glicose, cetona, valor do pH, leucócitos, sangue, densidade, nitrito, bilirrubi-na, urobilinogênio e proteína.
Procedimentos de Necrópsia e Exame Macroscópico: Todos osanimais foram submetidos a uma necrópsia detalhada completa. Para todosos animais sobreviventes, foi realizada necrópsia serialmente pelo númerodo animal, e não por grupo, imediatamente depois da sangria terminal pro-gramada. Na necrópsia, é feito um exame completo e qualquer anormalida-de ou alterações patológicas macroscópicas em tecidos e/ou órgãos sãoobservadas e registradas.
Coleta de Órgãos/Tecidos: Os seguintes órgãos e tecidos: Cé-rebro, Fígado, Rim, Estômago, Pâncreas, Pulmões, Baço, Coração, WATEpididimal, WAT Retroperitoneal, BAT Interescapular foram excisados e pe-sados a úmido tão logo possível depois de excisão e remoção da gordurafixada e outros tecidos conjuntivos. Todos os órgãos de um animal foramcoletados em um recipiente, pré-etiquetados com a seguinte informação:Número do estudo, número do grupo, número do animal e data.
Avaliação da composição corporal: No primeiro e no último diado tratamento usou-se RMN de modo a analisar a alteração ou na gorduraou na massa magra corporal (Figura 4).
Resultados: O ganho de peso corporal cumulativo dos camun-dongos 129Sv tratados com variante de junção de grelina acilada foi signifi-cativamente maior (ρ = 6E~05) do que os controles tratados com Veículo (2,2g e 0,7 g, respectivamente). Vide a Figura 1A. O consumo de alimento cu-mulativo dos camundongos 129Sv tratados com variante de junção de greli-na acilada foi significativamente maior (p = 0,04) do que os controles trata- dos com Veículo (53,2 g e 47,21 g, respectivamente). Vide a Figura 1B. Nãoforam notadas incidência de mortalidade e nenhuma evidência quanto a si-nais clínicos óbvios em reação ao tratamento entre quaisquer dos animaisde teste durante todo o período do estudo. Com base nos resultados do es-tudo acima, variante de junção de grelina humana acilada estimula significa-tivamente ganho de peso corporal e consumo de alimento.
Exemplo 6
Efeito da Administração Subcutânea de Variante de Junção deGrelina Acilada Sobre a Liberação de GH
Variantes de junção de grelina aciladas (20 pg) ou o Veículo(1,6% de manitol) foram administradas por uma injeção de bolo subcutâneo(Correspondente a 0,3 μιηοΙ/kg) a 5 camundongos cada. O sangue foi amos-trado em 10 e 20 min depois de injeção. Amostras de soro foram armazena-das a -70 2C e analisadas pelo kit ELISA DSL-10-72100 ACTIVE® Mou-se/Rat Growth Hormone (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Webster,Texas).
Resultados: A concentração sérica de hormônio do crescimento10 minutos depois de administração subcutânea de variante de junção degrelina acilada ou o Veículo foi 2 a 14 vezes maior no grupo de variante dejunção de grelina em comparação com o grupo de veículo (vide a Figura 3).
Exemplo 7
Farmacocinética de Finder de Alcance de Variante de Junção deGrelina Acilada em Rato
Foi realizada administração subcutânea de variantes de junçãode grelina em três níveis de dose de 0,5, 2,5 e 10 mg/kg correspondendo aconcentrações de 0,1, 0,5 e 2 mg/ml, respectivamente, e em uma dosagemde volume constante de 5 ml/kg. Foi realizada injeção intravenosa em umnível de dose de 0,5 mg/kg correspondendo a uma concentração de 0,1mg/ml e uma dosagem de volume constante de 5 ml/kg também. O estudocompreendeu 9 machos e 9 fêmeas de ratos Sprague-Dawley® (SD®) pornível de dose e via de administração.
O design da amostragem de sangria foi confinado a 9 momentosde sangria para cada nível de dose: pré-dosagem, 5, 15, 30, 60 e 90 min, 3,5 e 24 horas, pós-dosagem. Cada grupo foi dividido em 3 sub-grupos, cadaum sendo atribuído 3 momentos de sangria específicos, de modo a receber3 amostras individuais/ponto de tempo/grupo (total de 27 amostras individu-ais/grupo). Os valores médios do peso corporal dos grupos no início do es-tudo foram similares entre todos os grupos e não excederam ±20% do pesomédio por gênero. Amostras de sangue totais foram mantidas sobre gelo apartir do momento da coleta de sangue até a hora da centrifugação. As a-mostras de plasma obtidas foram rapidamente congeladas em nitrogêniolíquido e mantidas sobre gelo seco até remoção para -70°C.
As Concentrações do Item de Teste em plasma foram determi-nadas por LC/MS/MS (cromatografia líquida/espectrometria de mas-sa/espectrometria de massa). A análise farmacocinética da Variante de Jun-ção de Grelina foi baseada em perfis do tempo de concentração plasmáticamédia para cada grupo de dose conforme obtido por análise Farmacocinéti-ca Não-compartimental, gerada pelo uso do programa de computador: "PKSolutions 2.0" (Summit Research Services, CO, EUA).
Análise farmacocinética para a via SC mostrou que os valoresda AUCo-=O foram similares para machos e fêmeas administrados com a dosebaixa (6,1 e 5,2 mcg*min/ml, respectivamente) e a dose média (18,8 e 20,8mcg*min/ml, respectivamente). Na dose alta, os valores da AUC das fêmeasforam substancialmente menores (49,1 mcg*min/ml) do que os dos machos(79,2 mcg*min/ml). A Tmax ocorreu em 5 minutos pós-dosagem para todos osgrupos de dose. Os valores de Tv2 variaram de 17,4 a 26,4 minutos pararatos machos e 10,7 a 28,9 minutos para ratos fêmeas.
Exemplo 8
Efeito de dose única de administração subcutânea aguda de va-riante de junção de qrelina acilada sobre a toxicidade em RatosVariante de junção de grelina acilada (2,5; 15 e 75 pg) ou o Veí-culo (salina) foram administrados uma vez através da via subcutânea (SC), agrupos compreendendo η = 6 ratos Sprague-Dawley® (SD™). Não ocorreumortalidade em quaisquer dos animais durante todo o período do estudo.
Não foram observados sinais clínicos em quaisquer dos animais durante to-do o período do estudo. Todos os animais foram submetidos à sangria ter-minal, sob anestesia com CO2, imediatamente antes de eutanásia.
Sinais Clínicos:
Os animais foram observados individualmente depois de dosa-gem no mínimo uma vez durante os primeiros 30 minutos, periodicamentedurante as primeiras 24 horas, com especial atenção durante as primeiras 4horas, e os sinais clínicos são registrados. Depois disso, os animais foraminspecionados e os sinais clínicos foram registrados uma vez ao dia por umtotal de 14 dias. As observações incluíram alterações na pele, pelo, olhos,membranas mucosas, ocorrência de secreções e excreções (por exemplo,diarréia) e atividade autônoma (por exemplo, lacrimejamento, salivação, pi-loereção, tamanho da pupila, padrão respiratório incomum). Alterações namarcha, postura e reação ao manuseio, bem como a presença de compor-tamento bizarro, tremores, convulsões, sono e coma também foram incluídos.
Peso Corporal:
Foi feita determinação dos pesos corporais individuis dos ani-mais logo antes da administração da variante de junção de grelina (Dia 0), 2,7 e 14 dias depois da dosagem. As medições do peso corporal em jejumforam feitas logo antes da necrópsia.
Patologia Clínica:
Os parâmetros de hematologia, bioquímica e coagulação lista-dos abaixo foram determinados a partir de todos os animais sobreviventesantes da eutanásia programada.
Hematologia: Amostras de sangue foram obtidas depois de pri-vação de alimento de um dia para o ourto. Amostras de sangue (no mínimo500 μΙ de sangue total) foram colhiads em tubos revestidos com EDTA préetiquetados contendo a seguinte informação: Número do estudo, número dogrupo, número do animal e data. As amostras foram mantidas até análise em2 a 8 °C. Os parâmetros de hematologia que são testados usando ADVIA120 Hematology System (Beyer) são: leucócitos, hemácias, HGB, HCT1MCV, MCH1 MCHC, Plaquetas, contagem diferencial. Os reticulócitos foramcontados manualmente.
Bioquímica: Sangue para análise bioquímica foi colhido em tu-bos pré-etiquetados não revestidos. Os tubos foram pré-etiquetados e conti-nham as seguintes informações: Número do estudo, número do grupo, nú-mero do animal e data. Depois da coagulação, o sngue de cada animal foicentrifugado, e 300 μΙ de soro foi colhido em dois tubos pré-etiquetados esubmetidos a análise, enquanto mantendo em 2 a 8 0C até análise. As a-mostras foram submetidas aos seguintes testes listados usando um sistemaHITACHI MODULAR P-800: Creatinina1 Cálcio, Glicose, Colesterol, ProteínaTotal, Globulina, LDH, Potássio, Aspartato, Aminotransferase (AST), CPK,Fósforo, Uréia, Albumina, Bilirrubina Total, Alanina, Aminotransferase (ALT),Sódio, Y-Glutamil Transpeptidase (GGT), Cloreto, Triglicerídeos, Lipoproteí-na de Alta Densidade (HDL), Lipoproteína de Baixa Densidade (LDL), Fosfa-tase Alcalina (ALP).
Parâmetros de coagulação: Sangue para análise da coagulaãofoi colhido por sangria sinusal retro-orbital sob anestesia com CO2 em tubosrevestidos com citrato tri-sódico. Depois de completamento da coleta desangue, todas as amostras de sangue e soro foram mantidas em 2 a 8QC atéanálise adicional. As amostras foram submetidas aos seguintes testes Iista-dos usando o sistema Sysmex CA-1500: PT, APTT.
Urinálise:
Amostras individuais de urina esvaziada foram colhidas de todosos animais (caso aplicável), antes do término do estudo programado ou an-tes do sacrifício no caso de remoção do estudo por razões de bem-estar doanimal, ou pressionando a área abdominal sobre a bexiga ou colhendo aurina esvaziada, de modo diverso, diretamente da bexiga por cistocentese. Aanálise foi realizada usando um kit de teste comercial (Bayer Multistix® 10SG) aplicado para esvaziar amostra de urina e avaliar os seguintes parâme-tros: glicose, cetona, pH, leucócito, sangue, densidade, nitrito, bilirrubina,urobilinogênio e proteína.
Procedimentos de Necrópsia e Exame Macroscópico:
Todos os animais foram submetidos à necrópsia macroscópicadepois da eutanásia programada. Na necrópsia, todos os animais foramsubmetidos a exame completo, incluindo a superfície externa do corpo, to-dos os orifícios, cavidades cranial, torácica e abdominal e seus conteúdos.Qualquer anormalidade ou alterações macroscópicas patológicas em tecidos10 e/ou órgãos são observadas e registradas. É observado se uma anormalida-de macro patológica ocorre sobre a superfície corporal externa que está lo-calizada em ou próxima ao local da injeção. Os seguintes tecidos e/ou ór-gãos incluindo aqueles com anormalidades macroscópicas são preservadosem solução a 4% de formaldeído: Adrenais, Aorta torácica, Cérebro, Ceco,Cólon, Duodeno, Epidídimo, Olhos, Glândulas Harderianas, Coração, Fêmure articulação do joelho, íleo, Jejuno, Rins, Glândulas lacrimais, Fígado, Pul-mões, Linfonodos - cervicais superficiais, Linfonodos - mesentéricos, Glân-dula Mamária + pele, Esôfago, Nervos óticos, Ovários, Pâncreas, Pituitária,Próstata, Reto, Glândulas Salivares, Nervo ciático, Vesículas seminais, Mús-culo esquelético (coxa), Pele - sítio de injeção, Baço, Medula Espinhal (cer-vical, torácica, lombar), Esterno (medula óssea), Estômago, Testículos, Ti-mo, tiróide (com paratiróide caso aplicável), Língua, Traquéia, Bexiga uriná-ria, Útero com colo uterino, Vagina.
Pesagem de Órgãos/Tecidos, e Fixação de Órgãos/Tecidos:
São realizadas pesagem e fixação de órgãos/tecidos para todosos animais. Os órgãos listados acima foram pesados a úmido tão logo pos-sível depois de dissecção e remoção da gordura e dos tecidos conjuntivosanexados (no caso de órgãos pareados, os pesos individuais foram determi-nados mas apresentados como o peso médio do órgão). Todos os ór- gãos/tecidos são então fixados e preservados em solução a 4% de formalde-ído (excluindo os olhos, nervos óticos e glândulas harderianas as quais sãofixadas em solução de Davidson) por período de fixação de no mínimo 48horas antes de liberação dos tecidos. Além disso, quaisquer outros ór-gãos/tecidos com alterações macroscópicas grosseiras foram preservadostambém em solução a 4% em formaldeído. Os órgãos/tecidos por animal sãoembalados em recipientes de plástico nos quais cada recipiente é identifica-do pelo No. do Estudo, No. do Grupo, No. do Animal e Data de necrópsia. Éobtida a medula óssea de um único fêmur, umidificada por um soro fetal bo-vino para permitir um apropriado cisalhamento e cisalhada sobre uma lâminade vidro limpa e etiquetada pelo uso de uma segunda lâmina de vidro. De-pois disso, as lâminas são deixadas ao ar livre para secar e mergulhadas emMetanol por cerca de 5 minutos para fixação apropriada. São preparadas nomínimo 2 lâminas por animal.
Resultados: Não foram observadas incidência de mortalidade enenhuma evidência quanto a sinais clínicos óbvios em reação ao tratamentoentre quaisquer dos animais de teste durante todo o período do estudo.
Exemplo 9
Efeito de dose única de administração subcutânea aguda de va-riante de junção de arelina acilada sobre a toxicidade e toxicocinética emminiporcos
Tendo por alvo estabelecer uma dose máxima tolerada (MTD)representando a maior dose não causando toxicidade inaceitável ou umadose máxima viável (MFP), são administradas a 2 miniporcos Siwi-ne/HsdScr:Sinclair de um grupo de teste preliminar doses incrementais atéum máximo de 75 mg/kg de variante de junção de grelina acilada. Com basenos efeitos observados no teste preliminar uma maior dose única adequa-damente selecionada é selecionada e administrada a animais do estudoprincipal através da via subcutânea (SC), a grupos compreendendo n=2 mi-niporcos. No dia 1 (dia de dosagem) amostras de sangue para ensaios bioa-nalíticos são colhidas em um total de 9 momentos: Ό' - basal pré-teste, 5,15, 30, 60, 90 min, 3, 5 e 24 horas pós-dosagem. São obtidas avaliação dedados de parâmetros farmacocinéticos de via (Cmax, Tmax, T1/2, AUC). Os mi-niporcos são adicionalmente observados por um período de observação de14 dias adicionais.Todos os parâmetros farmacocinéticos foram obtidos e não o-correu mortalidade em qualquer um dos animais durante todo o período doestudo. Não foram observados sinais clínicos em quaisquer dos animais du-rante todo o período do estudo. Todos os animais foram submetidos à san-gria terminal, sob anestesia com CO2, imediatamente antes de eutanásia.
Sinais Clínicos:
Os animais são observados individualmente depois de dosagemno mínimo uma vez durante os primeiros 30 minutos, periodicamente duran-te as primeiras 24 horas, com especial atenção dada durante as primeiras 4horas, e os sinais clínicos são registrados. Depois disso, os animais são ins-pecionados e os sinais clínicos são registrados uma vez ao dia por um totalde 14 dias. As observações incluem alterações na pele, pelo, olhos, mem-branas mucosas, ocorrência de secreções e excreções (por exemplo, diar-réia) e atividade autônoma (por exemplo, lacrimejamento, salivação, piloere-ção, tamanho da pupila, padrão respiratório incomum). Alterações na mar-cha, postura e reação ao manuseio, bem como a presença de comportamen-to bizarro, tremores, convulsões, sono e coma também foram incluídos.
Peso corporal:
A determinação dos pesos corporais individuais dos animais éfeita logo antes da administração do Item de Teste (Dia 0), 2, 7 e 14 diasdepois da dosagem. Medições do peso corporal em jejum são feitas logoantes da necrópsia. Em caso de mortos, o peso corporal é determinado tãopróximo quanto possível da morte.
Patologia Clínica:
Os parâmetros de hematologia, bioquímica e coagulação lista-dos abaixo são determinados a partir de todos os animais sobreviventes an-tes da eutanásia programada.
Hematologia: Amostras de sangue são obtidas depois de priva-ção de alimento de um dia para o outro. As amostras de sangue (no mínimo500 μΙ de sangue total) são colhidas em tubos revestidos com EDTA pré-etiquetados contendo a seguinte informação: Número do estudo, número dogrupo, número do animal e data. As amostras são mantidas até liberação eanálise em 2 a 8 °C. Os parâmetros hematológicos que são testados usandoADVIA 120 Hematology System
(Beyer) são: leucócitos, hemácias, HGB, HCT1 MCV, MCH1 M-CHC, Plaquetas, contagem diferencial. Reticulócitos são contados manual-mente.
Bioquímica: O sangue para análise bioquímica é coletado emtubos pré-etiquetados não revestidos. Os tubos são pré-etiquetados e conti-nham a seguinte informação: Número do estudo, número do grupo, númerodo animal e data. Depois de coagulação, o sangue de cada animal é centri-fugado, e no mínimo 300 μΙ de soro é coletado em dois tubos pré-etiquetados e submetidos à análise, enquanto mantido em 2 a 8 0C até aná-lise. As amostras são submetidas aos seguintes testes listados usando osistema HITACHI MODULAR P-800: Creatinina, Cálcio, Glicose, Colesterol,Proteína Total, Globulina, LDH, Potássio, Aspartato, Aminotransferase(AST), CPK, Fósforo, Uréia, Albumina, Bilirrubina Total, Alanina, Aminotrans-ferase (ALT), Sódio, γ-Glutamyl Transpeptidase (GGT), Cloreto, Triglicerí-deos, Lipoproteína de Alta Densidade (HDL), Lipoproteína de Baixa Densi-dade (LDL), Fosfatase Alcalina (ALP).
Parâmetros de coagulação: Sangue para análise da coagulação é coletado por sangria sinusal retro-orbital sob anestesia com CO2 em tubosrevestidos com citrato tri-sódico. Depois de completamento da coleta desangue, todas as amostras de sangue e soro são mantidas em 2 a 89C atéanálise adicional. As amostras são submetidas aos seguintes testes listadosusando o sistema Sysmex CA-1500: PT, APTT.
Urinálise: Amostras individuais de urina esvaziada são coletadasde todos os animais (caso aplicável), antes do término do estudo programa-do ou antes de sacrifício em caso de remoção do estudo por razões de bem-estar do animal, ou pressionando a área abdominal sobre a bexiga ou cole-tando urina esvaziada, de modo diverso, diretamente da bexiga por cistocen-tese. É realizada análise usando um kit de teste comercial (Bayer Multistix®10 SG) aplicado para esvaziar amostra de urina e avaliando os seguintesparâmetros: glicose, cetona, pH, leucócito, sangue, densidade, nitrito, bilirru-bina, urobilinogênio e proteína.
Procedimentos de Necrópsia e Exame Macroscópico:
Todos os animais são submetidos a necrópsia macroscópicadepois da eutanásia programada. Na necrópsia, todos os animais são sub-metidos a exame completo, incluindo a superfície externa do corpo, todos osorifícios, cavidades cranial, torácica e abdominal e seus conteúdos. Qual-quer anormalidade ou alterações patológicas macroscópicas em tecidos e/ouórgãos são observadas e registradas. É observado se uma anormalidadepatológica macroscópica ocorre sobre a superfície corporal externa que estálocalizada em ou próxima do sítio de injeção. Os seguintes tecidos e/ou ór-gãos incluindo aqueles com anormalidades macroscópicas são preservadosem solução a 4% de formaldeído: Adrenais, Aorta torácica, Cérebro, Ceco,Cólon, Duodeno, Epidídimo, Olhos, Glândulas Harderianas, Heart, Fêmur earticulação do joelho, íleo, Jejuno, Rins, Glândulas Lacrimais, Fígado, Pul-mões, Linfonodos - cervicais superficiais, Linfonodos - mesentéricos, Glân-dula Mamária + pele, Esôfago, Nervos óticos, Ovários, Pâncreas, Pituitária,Próstata, Reto, Glândulas Salivares, Nervo ciático, Vesículas seminais, Mús-culo esquelético (coxa), Pele - sítio de injeção, Baço, Medula Espinhal (cer-vical, torácica, lombar), Esterno (medula óssea), Estômago, Testículos, Ti-mo, Tiróide (com paratiróide caso aplicável), Língua, Traquéia, Bexiga uriná-ria, Útero com colo uterino, Vagina.
Pesagem de Órgãos/Tecidos e Fixação de Órgãos/Tecidos:São realizadas pesagem e fixação de órgãos/tecidos para todosos animais. Os órgãos listados acima são pesados a úmido tão logo possíveldepois de dissecção e remoção da gordura e dos tecidos conjuntivos anexa-dos (no caso de órgãos pareados, os pesos individuais são determinadosmas apresentados como o peso médio do órgão). Todos os órgãos/tecidossão então fixados e preservados em solução a 4% de formaldeído (excluindoos olhos, nervos óticos e glândulas harderianas as quais são fixadas em so-lução de Davidson) por período de fixação de no mínimo 48 horas antes deliberação dos tecidos. Além disso, quaisquer outros órgãos/tecidos com alte-rações macroscópicas grosseiras são preservados também em solução a4% em formaldeído. Os órgãos/tecidos por animal são embalados em recipi-entes de plástico nos quais cada recipiente é identificado pelo No. do Estu-do, No. do Grupo, No. do Animal e Data de necrópsia. É obtida a medulaóssea de um único fêmur, umidificado por um soro fetal bovino para permitirum apropriado cisalhamento e cisalhada sobre uma lâmina de vidro limpa eetiquetada pelo uso de uma segunda lâmina de vidro. Depois disso, as lâmi-nas são deixadas ao ar livre para secar e mergulhadas em Metanol por cer-ca de 5 minutos para fixação apropriada. São preparadas no mínimo 2 lâmi-nas por animal.
Resultados: Não foram observadas incidência de mortalidade enenhuma evidência quanto a sinais clínicos óbvios em reação ao tratamentoentre quaisquer dos animais de teste durante todo o período do estudo.
Exemplo 10
Exemplo de Administração Subcutânea de Dose de Repetiçãode 7, 10. 28 Dias ou 3, 6. 9 Meses de Variante de Junção de Grelina Aciladaem Ratos/Cães/Miniporcos
Variante de junção de grelina acilada em várias doses (0,2, 1,0,e 5 pmols/kg, todas em 100 μΙ de veículo) ou o Veículo (em salina) são ad-ministrados uma vez ao dia por várias extensões de dias sucessivos (7, 10,28 dias ou 3, 6, 9 meses), através da via subcutânea (SC), a grupos com-preendendo η = 10 ratos ou cães beagle ou sujeitos humanos com caquexia.
O consumo de alimento, o ganho de peso e a atividade Iocomotora espontâ-nea são medidos por 20 h depois da injeção.
Exemplo 11
Exemplos de Diários/Questionários Avaliando a Qualidade deVida do Paciente
A) EORTC QLQ-C30 (Aaronson et ai, J. Natl. Câncer Inst. 85:365-76 (1993)), vide o website do National Institutes of Health e vide, porexemplo, uma amostra de EORTC QLQ-C30 (version 3.0), disponível nowebsite EORTC e incorporada aqui, a este pedido de patente, por meio dereferência.
Estar-se-á interessados em informações relativas a você e a suasaúde. Favor responder as questões que se seguem marcando o númeroque melhor se aplica a você. Não há respostas "certas" ou "erradas". Estainformações serão tratadas com confidencialidade.
Questões: Vide amostra de EORTC QLQ-C30 (versão 3.0), dis-ponível no website EORTC e incorporada aqui, a este pedido de patente, pormeio de referência).
Exemplo 12
Exemplos de Formulações Adequadas para Preparar Composi-ções
Farmacêuticas para Uso na Presente Descrição
Solução a 4% de Manitol é preparada dissolvendo D-Manitol emÁgua para Injeção para obter concentração final de 40 mg/ml. Solução deMatéria-Prima de Variante de Junção de Grelina é preparada dissolvendovariante de junção de grelina em sal de TFA ou em Acetato (5 mg) em 10 mlde solução a 4% de Manitol, divided em alíquotas e mantida congelada (-70°C) até a hora do uso.
Solução de Dosagem de Variante de Junção de Grelina: Em ca-da dia da dosagem, a quantidade requerida de cada item de teste é degela-da e diluída com Salina Fisiológica para uma concentração de 0,2 mg/ml.
Solução de Dosagem de Item Controle: Preparada em cada diade dosagem, diluindo Solução a 4% de Manitol com Salina Fisiológica namesma proporção que a Solução de Dosagem de Variante de Junção deGrelina.
Pacientes: Pacientes com caquexia por câncer documentada ecaquexia por câncer documentada com importante perda de peso no períodoprecedente e apetite reduzido. A caquexia pode ser causada por qualquertipo de câncer, inclusive, por exemplo, de esôfago, pulmonar, de mama, gás-trico, pancreático, neurológico e do trato urinário, ósseo, hematológico, dotrato reprodutivo, de glândula exócrina, de glândula endócrina, múltiplos ne-oplasmas endocrinológicos, testicular, de próstata, nefrológico, de pele, detiróide, do fígado, e do cólon.
A eficácia da ação de variante de junção de grelina será avalia-da de acordo com avaliações clínicas:
(1) Consumo agudo de alimento: Consumo de alimentoavaliado por dietista nutricional durante a infusão.
(2) Consumo crônico de alimento: Um relatório diário daquantidade de alimento consumido durante o dia, e avaliação do prazer rela-cionado com o consumo de alimento. Esta será validada por excreção denitrogênio urinário, com base em dieta diária de 4 dias.
(3) Peso corporal: Padrão e escala calibrada será usada naclínica.
(4) Gato de energia em repouso (REE) é uma medida muitoimportante, uma vez que é afetado tanto pelo estado da doença quanto pelopeso corporal.
(5) Teste de exercício: Actigraph é usado de acordo comprotocolo de via descrito no website Actigraph.
(6) QOL relacionada com saúde usando formulários de viaconforme descrito acima.
(7) Avaliações para-clínicas:
(i) Excreção de nitrogênio na urina: a coleta de urina de 24horas deve ser usada como validação do consumo de alimento reportado.
(ii) Glicose plasmática, FFA plasmática, triglicerídeos plas-máticos, glicerol plasmático e aminoácidos plasmáticos: Substratos plasmá-ticos medidos para assegurar que o consumo de alimento reportado está deacordo com a quantidade de consumo de alimento absorvido.
(iii) Massa corporal magra e massa de gordura avaliada por espessura de dobra da pele (TSF) e circunferência média do braço comouma medição da composição corporal.
(iv) A gordura corporal total (e massa livre de gordura) seráavaliada por varredura DEXA, usando o software 1.31 para o DPX-L lunar(Scanexport Medicai, Helsingborg, Suécia).
(v) Leptina Plasmática: Leptina é produzida por e secretadapor células de gordura. O nível plasmático de Ieptina dá uma estimativa dacarga de células de gordura total.(vi) Grelina Plasmática: O nível de grelina basal tende a es-tar aumentado em pacientes caquéticos.
(vii) GH Plasmático: Em estudos prévios, o GH tem sido me-dido como um controle para o efeito da administração de grelina (EnomotoM .et ai, Clin. Sei. (Lond). 105:431 -35 (2003)).
(viii) IGF-I: Uma única determinação do IGF-I resume 24 ho-ras de secreção de GH. Isto tem sido demonstrado em voluntários saudáveisonde foi demonstrado que os níveis de IGF-I circulante se correlacionamcom secreção de GH espontânea (Rose S.R. et ai, N. Engl. J. Med.319:201-07 (1988)). IGF-I também pode aumentar independentemente doaumento de GH por estado nutricional aprimorado.
(ix) IGFBP-3: Uma das proteínas veículoas para IGF-I. Au-menta em paralelo com IGF-I mas com uma menor taxa de resposta.
(x) Albumina: É um indicador do estado nutricional.
(xi) Pré-albumina: Indicador do estado nutricional, com res-posta mais rápica a alterações do que a albumina.
(xii) Cortisol: Foi demonstrado que a administração de greli-na aumenta o nível de cortisol sérico (Broglio F. et al., J. Clin. Endocrinol.Metab. 88:1537-42 (2003)). Foi demonstrado que os corticosteróides têm umsignificativo efeito antináusea e melhoram o controle de astenia e dor, o quepode ser benéfico para os pacientes com câncer caquéticos. No entanto,nunca foi demonstrado que o cortisol aumenta o peso em paciente com cân-cer caquéticos.
(xiii) CRP e ESR: Proteínas de fase aguda e ESR são fre-qüentemente bons indicadores de inflamação sistêmica relacionada com oprocesso de câncer (lnui A., CA Câncer J. Clin. 52:72-91 (2002)).
Exemplo 13
Tratamento de Pacientes com Anorexia/Caquexia Relacionadacom Câncer
Acredita-se que pacientes com câncer avançado sofrendo dasíndrome de anorexia/caquexia (ACS), tais como pacientes com qualquertipo de avanços, câncer incurável, se beneficiem da presente descrição emtermos de aumento da qualidade de vida, aumento do apetite, aumento doconsumo de alimento, manutenção ou ganho de peso, prazer do alimento,e/ou deposição de gordura.
Os pacientes receberão administração subcutânea de dose de10 pg/kg de variante de junção de grelina e placebo. O protocolo se iniciaráàs 08 horas depois de um jejum durante a noite. Um cateter calibre 22 seráinserido em uma veia antecubital para amostragem de sangue. Depois deum período de equilibração de 30 min, variante de junção de grelina (10pg/kg) ou placebo (0,9% de salina) será administrada por via subcutânea.
Tratamento Experimental: Variante de junção de grelina estarádisponível em GMP-quality dentro de frascos preparados de 10 pg/kg daBACHEM AG, Suíça ou NeoMPS Inc., EUA. Placebo consiste de salina nor-mal (ou do veículo usado para dissolver a substância do estudo), que seráproporcionada pela farmácia de um hospital. Variante de junção de grelina édissolvida em salina, e uma dose de 10 pg/kg de variante de junção de greli-na será administrada ao paciente.
Avaliações da eficácia:
(1) Sintomas relacionados com alimentação: avaliados u-sando uma versão adaptada do questionário "Functional Assessment of Ap-petite and Cachexia Therapy" (FAACT) ; o questionário EORTC-QLQ-30 A-norexia/Caquexia (vide, por exemplo, uma amostra do EORTC QLQ-C30(versão 3.0), disponível no website EORTC e incorporada aqui, a este pedi-do de patente, por meio de referência); o questionário NCCTG-Anorexia/Cachexia (vide o website do National Institutes of Health) e/ou aescala de avaliação de sintomas de Edmonton (Edmonton Symptom) (videBruera E et ai, J. Palliat. Care 7:6-9 (1991)).
(2) Qualidade de vida: será avaliada usando o questionárioEORTC-QLQ-C30 (vide exemplo 9).
(3) Consumo nutricional e preferências alimentares: a medi-ção do consumo de alimento será por cálculo da percentagem de produtosalimentícios consumida em cada refeição pelo paciente, o dietista clínicoavaliará as preferências alimentares como parte de suas avaliações de via.(4) Prazer da comida: será avaliado depois do almoço u-sando escalas análogas visuais, seguindo âncoras estabelecidas.
(5) Apetite percebido, fome, náusea e saciedade: serãoavaliados de manhã, antes da infusão, e antes e depois do almoço usandoescala análoga visual, seguindo âncoras estabelecidas. O requerente tam-bém aplicará um questionário de sabor ad hoc reduzido.
(6) Hormônio do crescimento (GH): como o hormônio docrescimento reflete diretamente a função biológica de grelina, com um rápidoaumento do hormônio do crescimento depois de injeções de grelina, O re-querente também monitorará os níveis de hormônio do crescimento nosmesmos momentos que grelina. Será usada uma prova de grelina padrão.
(7) Composição corporal: composições corporais serão ava-liadas pelo índice de massa corporal, por análise da bioimpedância e ab-sorptiometria de fótons dual/absorptiometria de raios X de energia dual (DEXA).
(8) Os níveis de albumina e transferrina serão determinadoscomo parâmetros para estado nutricional.
(9) Função autônoma cardiovascular: para a triagem de dis-túrbios autonômicos, será realizado um Holter EKG de 20 minutos, e o valorde SDNN será determinado.
(10) Mediadores da síndrome de anorexia primária/caquexiamediadores da reação proinflamatória (CRP, IL-6, TNF-α), o metabolismoativado (ácidos graxos livres, triglicerídeos, insulina, glicose, leptina), o eixointestinal-cerebral (grelina), e o eixosomatotrófico (IGF-1, testosterona livre)será determinado como basal na primeira semana. Uma amostra de urinaserá reservada para avaliação de fator de indução de proteólise (PIF), ummediator da síndrome de anorexia/caquexia paraneoplásica.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> Mintz, Liat
<120> USO DE VARIANTE DE JUNÇÃO DE GRELINA PARA TRATARCAQUEXIA E/OU ANOREXIA E/OU ANOREXIA-CAQUEXIA E/OU SUBNU-TRIÇÃO E/OU LIPODISTROFIA E/OU ATROFIA MUSCULAR E/OU ESTI-MULAÇÃO DO APETITE.
<130> 28238-022<150> US 60/781,860<151 >2006-03-13<160> 8
<170> Patentln version 3.3<210> 1<211> 94<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 1
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Val Arg Pro1 5 10 15
Pro His Lys Ala Pro His Val Val Pro Ala Leu Pro Leu Ser Asn Gln20 25 30
Leu Cys Asp Leu Glu Gln Gln Arg His Leu Trp Ala Ser Val Phe Ser35 40 45
Gln Ser Thr Lys Asp Ser Gly Ser Asp Leu Thr Val Ser Gly Arg Thr50 55 60
Trp Gly Leu Arg Val Leu Asn Gln Leu Phe Pro Pro Ser Ser Arg Glu30 65 70 75 80
Arg Ser Arg Arg Ser His Gln Pro Ser Cys Ser Pro Glu Leu85 90<210> 2<211 >22<212> PRT<213> Homo sapiens<400>2
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Val Arg Pro1 5 10 15
Pro His Lys Ala Pro His20
<210> 3<211 >24<212> PRT<213> Homo sapiens<400>3
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Val Arg Pro1 5 10 15
20 Pro His Lys Ala Pro His Val Val
<210> 4<211 >24<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221 > MISC_FEATURE<222> (3)..(3)<223> Xaa is Dpr<400>4
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Val Arg Pro1 5 10 15Pro His Lys Ala Pro His Val Val20
<210> 5<211 >29<212> PRT<213> Homo sapiens<400>5
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Val Arg Pro1 5 10 15
Pro His Lys Ala Pro His Val Val Pro Ala Leu Pro Leu20 25
<210> 6<211 >91<212> PRT<213> Homo sapiens<400>6
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Val Arg Pro Pro His Lys1 5 10 15
Ala Pro His Val Val Pro Ala Leu Pro Leu Ser Asn Gln Leu Cys Asp20 25 30
Leu Glu Gln Gln Arg His Leu Trp Ala Ser Val Phe Ser Gln Ser Thr35 40 45
Lys Asp Ser Gly Ser Asp Leu Thr Val Ser Gly Arg Thr Trp Gly Leu50 55 60
Arg Val Leu Asn Gln Leu Phe Pro Pro Ser Ser Arg Glu Arg Ser Arg65 70 75 80Arg Ser His Gln Pro Ser Cys Ser Pro Glu Leu85 90
<210> 7<211> 181<212> PRT<213> Mus musculus<400>7
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Val Ser Gln1 5 10 15
Ser Val Ser Leu Ser Pro His Ile Tyr Pro Asp Leu Cys Val Cys Val20 25 30
Arg Glu Arg Glu Arg Glu Pro Ser Phe Pro Phe Gln Gln Arg Lys Glu35 40 45
Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Ala Leu Glu Gly Trp50 55 60
Leu His Pro Glu Asp Arg Gly Gln Ala Glu Glu Thr Glu Glu Glu Leu65 70 75 80
Glu Ile Arg Val Cys Thr Gln Ala Pro Ala Cys Ser Tyr Asn Ser Lys85 90 95
Gly Val Gly Val Trp Arg Val Ser His Met Leu Ala Phe Gln Ala Thr100 105 110
Gln Gly Leu Glu Ser Ser Thr Asn Ser Ser Thr Arg Gly Ser Glu Ser115 120 125
Pro Ser Gln Glu Val Thr Val Ser Arg Val Ala Arg Glu Gln Gln Thr130 135 140
Cys Ala Gln Lys Thr Lys Gln Ile Glu Gly Ser Gln Glu Pro Gly Ser145 150 155 160
Thr Asp Gly Tyr Arg Asn Arg Arg Lys Pro Cys Leu Ser Gln Asp Leu165 170 175
Ser Gly Leu Pro Trp180
<210> 8<211> 90<212> PRT
<213> Rattus norvegicus<400>8
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Val Ser Leu1 5 10 15
Ser Pro Gln Val Pro His Leu Ser Trp Ser Val Val Cys Ser Phe Pro20 25 30
Phe Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro35 40 45
Arg Ala Leu Glu Gly Trp Leu His Pro Glu Asp Arg Gly Gln Ala Glu50 55 60
Glu Ala Glu Glu Glu Leu Glu Ile Arg Val Gly Pro Arg Ala Pro Ala65 70 75 80
Tyr Ser Cys Asn Ser Lys Gly Phe Gly Val85 90

Claims (67)

1. Composto similar a variante de junção de grelina tendo a fór-mula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcionalmen-te presente; cada X1 é de modo independente selecionado entre um amino-ácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético; X2 é selecionadoentre um aminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, oreferido aminoácido sendo modificado com um grupo hidrofóbico volumoso;cada X3 é de modo independente selecionado entre um aminoácido que o-corre naturalmente e um aminoácido sintético, em que um ou mais de X1 eX3 opcionalmente podem ser modificados com um grupo hidrofóbico volu-moso; Z2 é um grupo protetor opcionalmente presente; m é um número intei-ro na faixa de a partir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a partir de-4 a 92; contanto que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 tenha 15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo 80% dehomologia com a SEQ ID NO:1.
2. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom a reivindicação 1, em que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1 )m-(X2)-(X3)n-Z2 tem no mínimo 85% de homologia com a SEQ ID NO:1.
3. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom a reivindicação 2, em que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 tem no mínimo 90% de homologia com a SEQ ID NO:1.
4. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom a reivindicação 3, em que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1 )m-(X2)-(X3)n-Z2 tem no mínimo 95% de homologia com a SEQ ID NO:1.
5. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom a reivindicação 4, em que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1 )m-(X2)-(X3)n-Z2 tem no mínimo 98% de homologia com a SEQ ID NO:1.
6. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o composto tem 22 a 29aminoácidos de extensão.
7. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o grupo hidrofóbico vo-lumoso é um grupo acila ou um grupo ácido graxo.
8. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom a reivindicação 7, em que o grupo acila é um grupo CrC35 acila.
9. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom a reivindicação 8, em que o grupo acila é um grupo C7-C12 acila.
10. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o composto tem a fór-mula Z1 -Gly-(X1 )m-(X2)-(X3)n-Z2, Z1-Gly-Ser-(X2)-(X3)n-Z2, ou Zl-Gly-(X2)-(X3)n-Z2.
11. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que (X1)m é Gly, Gly-Ser,Gly-Cys, Gly-Lys1 Gly-Asp, Gly-GIu, Gly-Arg, Gly-His, Gly-Asn1 Gly-Gln, Gly-Thr, ou Gly-Tyr.
12. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que (X2) é Ser modificada,Cys modificada, Asp modificada, Lys modificada, Trp modificado, Phe modi-ficada, Ile modificada, ou Leu modificada.
13. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que (X1)m-(X2) é Gly-Xaa-Ser*, Gly-Xaa-Dpr*, ou Gly-Xaa-Cys*, em que * indica que o resíduo amino-ácido é modificado com um grupo hidrofóbico volumoso e Xaa é qualqueraminoácido que ocorre naturalmente ou aminoácido sintético.
14. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom a reivindicação 13, em que Xaa é Ser.
15. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que (X3)n compreende umfragmento de SEQ ID NO:6.
16. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom a reivindicação 1, em que o composto tem a seqüência de aminoácidosdeterminada na SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, ou SEQ IDNO:5.
17. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom a reivindicação 16, em que o segundo ou terceiro aminoácido do com-posto é modificado com um grupo octanoíla.
18. Composto similaar a variante de junção de grelina de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 16 a 17, em que Z1 é sele-cionado entre o grupo consistindo em C1-C10 alquila, C1-C10 alquila substituí-do, C2-C10 alquenila, C2-C10 alquenila substituído, arila, CrC6 alquila arila,C(C)MCH2MCrC6 alquila)-COOH, C(0)-(C1-C6 alquila), C(0)-arila, C(O)-O-(C1-C6-alquila), e C(0)-0-arila.
19. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 16 a 17, em que Z2 é sele-cionado entre o grupo consistindo em amida, metilamida, e etilamida.
20. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 16 a 17 o qual liga ao GHSreceptor GHS-R 1a.
21. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom a reivindicação 20, em que o composto tem uma potência de EC50 so-bre o GHS-R 1a de menos de 500 nM.
22. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom a reivindicação 20, em que o composto tem uma constante de dissocia-ção de menos de 500 nM.
23. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 16 a 17, em que o compostotem no mínimo cerca de 50% da atividade funcional de grelina.
24. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom a reivindicação 23, em que atividade funcional é ativação de Gq/G11,acumulação de fosfato de inositol, mobilização de cálcio de reservas intrace-lulares, ativação ou desativação de MAP quinases, translocação de NFkB,transcrição genética orientada por CRE, ligação de arrestina a receptor degrelina, ou uma combinação das mesmas.
25. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 16 a 17, em que o compostoé conjugado a uma molécula de polímero.
26. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom a reivindicação 25, em que a molécula de polímero é selecionada entreo grupo consistindo em oxido de polialquileno, polialquileno glicol, álcool poli-vinílico, poli-carboxilato, poli-(vinilpirolidona), polietileno-co-maléico ácidoanidrido, poliestireno-co-maléico ácido anidrido, e dextrano.
27. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 16 a 17, em que o compostoé modificado com um grupo quimicamente reativo.
28. Composto similar a variante de junção de grelina de acordocom a reivindicação 27, em que o grupo quimicamente reativo é selecionadoentre o grupo consistindo em N-hidroxissuccinimida, N-hidróxi-sulfossuccinimida, maleimida-benzoil-succinimida, éster de gama-maleimido-butirilóxi succinimida, e ácido maleimidopropiônico.
29. Composição farmacêutica compreendendo Composto similara variante de junção de grelina como definido em qualquer uma das reivindi-cações 1 a 5 ou 16 a 17.
30. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 29,compreendendo adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável,um veículo, um excipiente, uma molécula de transporte, um agente umectan-te, agente emulsificante,agente de tamponamento de pH, ou uma combina-ção dos mesmos.
31. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 29,compreendendo uma mistura de no mínimo dois compostos diferentes simi-lares a variante de junção de grelina.
32. Método para tratar caquexia compreendendo administrar aum mamífero que necessite do mesmo uma quantidade farmaceuticamenteaceitável de:(a) variante de junção de grelina;(b) um composto similar a variante de junção de grelina tendo afórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcional-mente presente; cada X1 é de modo independente selecionado entre umaminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético; X2 é sele-cionado entre um aminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sin-tético, o referido aminoácido sendo modificado com um grupo hidrofóbicovolumoso; cada X3 é de modo independente selecionado entre um aminoá-cido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, em que um ou maisde X1 e X3 opcionalmente podem ser modificados com um grupo hidrofóbicovolumoso; Z2 é um grupo protetor opcionalmente presente; m é um númerointeiro na faixa de a partir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a par-tir de 4 a 92; contanto que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 tenha 15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo- 80% de homologia com a SEQ ID NO:1; ou(c) uma mistura dos mesmos.
33. Método para a reivindicação 32, em que composto similar avariante de junção de grelina é SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4,ou SEQ ID NO:5.
34. Método para a reivindicação 32, em que a variante de junçãode grelina é SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, ou um peptídeo deaminoácidos ou mais dos mesmos, adicionalmente em que a variante dejunção de grelina opcionalmente tem no mínimo uma modificação pós trans-lacional.
35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32a 34, em que variante de junção de grelina ou composto similar a variante dejunção de grelina é formulado para administração subcutânea, oral, intrave-nosa, intranasal, tópica, ou transdérmica.
36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32a 34, em que variante de junção de grelina ou composto similar a variante dejunção de grelina é administrado antes de ou durante uma refeição.
37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32a 34, em que variante de junção de grelina ou composto similar a variante dejunção de grelina é administrado em uma concentração equivalente em umafaixa de a partir de 10 ng a 10 mg de variante de junção de grelina ou com-posto similar a variante de junção de grelina por kg de peso corporal.
38. Método para a reivindicação 37, em que variante de junçãode grelina ou composto similar a variante de junção de grelina é administra-do em uma concentração equivalente em uma faixa de a partir de 0,1 pg a 1mg de variante de junção de grelina ou composto similar a variante de jun-ção de grelina por kg de peso corporal.
39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 34, em que variante de junção de grelina ou composto similar a variante dejunção de grelina é administrado como um bolo antes de ou durante uma re-feição, o referido bolo compreendendo uma quantidade da variante de junçãode grelina ou dComposto similar a variante de junção de grelina ou de um saldos mesmos equivalente em uma faixa de a partir de 0,3 pg a 6 g.
40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32a 34, em que variante de junção de grelina ou composto similar a variante dejunção de grelina é administrado a partir de uma até três vezes ao dia, cadaadministração sendo durante uma refeição ou no máximo 180 minutos antesde uma refeição.
41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32a 34, em que a caquexia é causada por um distúrbio catabólico ou um dis-túrbio anorético.
42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32a 34, em que o mamífero está sofrendo de um câncer selecionado entre ogrupo consistindo em câncer pulmonar, câncer pancreático, câncer do fíga-do, câncer endócrino, câncer de ovário, câncer de mama, leucemia, e cânce-res do trato gastrointestinal.
43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32a 34, em que a caquexia é causada por um tumor sólido.
44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32a 34, em que variante de junção de grelina ou composto similar a variante dejunção de grelina é administrado em combinação com um agente reguladordo apetite.
45. Método de acordo com a reivindicação 44, em que o agenteregulador do apetite é GH, IGF-1, IGFBP-3, ou ALP.
46. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32a 34, em que variante de junção de grelina ou composto similar a variante dejunção de grelina é administrado em combinação com um medicamento dequimioterapia, terapia de radiação, ou tratamento cirúrgico.
47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32a 34, em que administração de variante de junção de grelina ou compostosimilar a variante de junção de grelina leva a estimulação do apetite, estimu-lação da ingestão de alimento, estimulação de ganho de peso ou manuten-ção do peso, aumento da massa de gordura corporal, aumento da massamagra corporal, ou uma combinação dos mesmos.
48. Método de acordo com a reivindicação 47, em que a estimu-lação do apetite é medida por uma escala análoga visual para medir apetite,sensação de fome, ou nível de saciedade.
49. Método de acordo com a reivindicação 47, em que a estimu-lação do apetite produz um apetite no mínimo 5% maior comparado com oapetite antes da estimulação.
50. Método de acordo com a reivindicação 47, em que a estimu-lação da ingestão de alimento produz ingestão de alimento no mínimo 1%maior comparada com a ingestão de alimento antes da estimulação.
51. Método de acordo com a reivindicação 47, em que a estimu-lação da ingestão de alimento produz ingestão de calorias no mínimo 1%maior comparada com a ingestão de calorias antes da estimulação.
52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a-34, compreendendo adicionalmente administrar uma quantidade farmaceuti-camente aceitável de um fármaco progestacional; um aminoácido de cadeiaramificada; oxandralina; um agente anti-TNF-α; testosterona; um coquetelcompreendendo fármacos de imunonutrição, antioxidantes, e inibidores deCOX2; um canabinóide; ácido eicosapentaenóico; melatonina; talidomida; umfármaco β2 adrenérgico; um composto anti-inflamatório; eritropoietina; um a-gente redutor de angiotensina II; um modulador de receptores androgênicos;leptina; um agonista de receptores opióides; um gama agonista de receptorativado por proliferador do peroxissoma; ou uma mistura dos mesmos.
53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32a 34, compreendendo adicionalmente administrar uma quantidade farmaceu-ticamente aceitável de um antidepressivo, um agente antiemético, um agen-te antipsicótico, um agente ansiolítico, ou uma mistura dos mesmos.
54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32a 34 compreendendo, depois da etapa de administração, a etapa adicionalde monitorar o efeito da administração dos compostos (a), (b), ou (c).
55. Método de acordo com a reivindicação 54, em que o monito-ramento é realizado medindo no mínimo um marcador de variante de junçãode grelina ou composto similar a variante de junção de grelina atividade.
56. Método de acordo com a reivindicação 55, em que o no mí-nimo um marcador é selecionado entre o grupo consistindo em GH, IGF-I,IGFBP-3, ALP, hormônios tiroidianos, hormônios sexuais, nível de insulina,nível de glicose, e albumina.
57. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32a 34, em que o mamífero é um humano.
58. Método para prevenir caquexia compreendendo administrara um mamífero que necessite do mesmo uma quantidade farmaceuticamen-te aceitável de:(a) variante de junção de grelina;(b) um composto similar a variante de junção de grelina tendo afórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcional-mente presente; cada X1 é de modo independente selecionado entre umaminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético; X2 é sele-cionado entre um aminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sin-tético, o referido aminoácido sendo modificado com um grupo hidrofóbicovolumoso; cada X3 é de modo independente selecionado entre um aminoá-cido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, em que um ou maisde X1 e X3 opcionalmente podem ser modificados com um grupo hidrofóbicovolumoso; Z2 é um grupo protetor opcionalmente presente; m é um númerointeiro na faixa de a partir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a par-tir de 4 a 92; contanto que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 tenha 15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo- 80% de homologia com a SEQ ID NO:1; ou(c) uma mistura dos mesmos.
59. Método para a estimulação do apetite, ingestão de alimento,e/ou ganho de peso compreendendo administrar a um mamífero que neces-site do mesmo uma quantidade farmaceuticamente aceitável de:(a) variante de junção de grelina;(b) um composto similar a variante de junção de grelina tendo afórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcional-mente presente; cada X1 é de modo independente selecionado entre umaminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético; X2 é sele-cionado entre um aminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sin-tético, o referido aminoácido sendo modificado com um grupo hidrofóbicovolumoso; cada X3 é de modo independente selecionado entre um aminoá-cido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, em que um ou maisde X1 e X3 opcionalmente podem ser modificados com um grupo hidrofóbicovolumoso; Z2 é um grupo protetor opcionalmente presente; m é um númerointeiro na faixa de a partir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a par-tir de 4 a 92; contanto que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 tenha 15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo- 80% de homologia com a SEQ ID NO:1; ou(c) uma mistura dos mesmos.
60. Método para tratar Iipodistrofia compreendendo administrar aum mamífero que necessite do mesmo uma quantidade farmaceuticamenteaceitável de:(a) variante de junção de grelina;(b) um composto similar a variante de junção de grelina tendo afórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcional-mente presente; cada X1 é de modo independente selecionado entre umaminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético; X2 é sele-cionado entre um aminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sin-tético, o referido aminoácido sendo modificado com um grupo hidrofóbicovolumoso; cada X3 é de modo independente selecionado entre um aminoá-cido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, em que um ou maisde X1 e X3 opcionalmente podem ser modificados com um grupo hidrofóbicovolumoso; Z2 é um grupo protetor opcionalmente presente; m é um númerointeiro na faixa de a partir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a par-tir de 4 a 92; contanto que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 tenha 15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo-80% de homologia com a SEQ ID NO:1; ou(c) uma mistura dos mesmos.
61. Método para prevenir Iipodistrofia compreendendo adminis-trar a um mamífero que necessite do mesmo uma quantidade farmaceutica-mente aceitável de:(a) variante de junção de grelina;(b) um composto similar a variante de junção de grelina tendo afórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcional-mente presente; cada X1 é de modo independente selecionado entre umaminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético; X2 é sele-cionado entre um aminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sin-tético, o referido aminoácido sendo modificado com um grupo hidrofóbicovolumoso; cada X3 é de modo independente selecionado entre um aminoá-cido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, em que um ou maisde X1 e X3 opcionalmente podem ser modificados com um grupo hidrofóbicovolumoso; Z2 é um grupo protetor opcionalmente presente; m é um númerointeiro na faixa de a partir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a par-tir de 4 a 92; contanto que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 tenha 15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo-80% de homologia com a SEQ ID NO:1; ou(c) uma mistura dos mesmos.
62. Método de acordo com a reivindicação 61, compreendendoadicionalmente administrar uma quantidade farmaceuticamente aceitável deleptina, um agonista de receptor ativado por proliferador de peroxissoma, umagonista de renina-angiotensina, um agonista de receptores opióides, varian-te de junção de grelina des-acil, adiponectina, hGH, ou uma mistura dosmesmos.
63. Método para tratar caquexia e/ou anorexia e/ou anorexia-caquexia e/ou malnutrition e/ou Iipodistrofia e/ou estimulatção do apetite com-preendendo administrar a um mamífero que necessite do mesmo uma quanti-dade farmaceuticamente aceitável de um secretagogo compreendendo:(a) variante de junção de grelina;(b) um composto similar a variante de junção de grelina tendo afórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcional-mente presente; cada X1 é de modo independente selecionado entre umaminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético; X2 é sele-cionado entre um aminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sin-tético, o referido aminoácido sendo modificado com um grupo hidrofóbicovolumoso; cada X3 é de modo independente selecionado entre um aminoá-cido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, em que um ou maisde X1 e X3 opcionalmente podem ser modificados com um grupo hidrofóbicovolumoso; Z2 é um grupo protetor opcionalmente presente; m é um númerointeiro na faixa de a partir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a par-tir de 4 a 92; contanto que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 tenha 15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo- 80% de homologia com a SEQ ID NO:1; ou(c) uma mistura dos mesmos;em que tratamento é selecionado entre o grupo consistindo emprofilaxia ou tratamento de caquexia, profilaxia ou tratamento de lipodistrofia,estimulação do apetite, estimulação da ingestão de alimento, estimulação deganho de peso, aumentar a massa de gordura corporal, aumentar a massamagra corporal, ou uma combinação dos mesmos.
64. Método para tratar atrofia muscular compreendendo adminis-trar a um mamífero que necessite do mesmo uma quantidade farmaceutica-mente aceitável de:(a) variante de junção de grelina;(b) um composto similar a variante de junção de grelina tendo afórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcional-mente presente; cada X1 é de modo independente selecionado entre umaminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético; X2 é sele-cionado entre um aminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sin-tético, o referido aminoácido sendo modificado com um grupo hidrofóbicovolumoso; cada X3 é de modo independente selecionado entre um aminoá-cido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, em que um ou maisde X1 e X3 opcionalmente podem ser modificados com um grupo hidrofóbicovolumoso; Z2 é um grupo protetor opcionalmente presente; m é um númerointeiro na faixa de a partir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a par-tir de 4 a 92; contanto que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 tenha 15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo-80% de homologia com a SEQ ID NO:1; ou(c) uma mistura dos mesmos.
65. Método para prevenir atrofia muscular compreendendo ad-ministrar a um mamífero que necessite do mesmo uma quantidade farma-ceuticamente aceitável de:(a) variante de junção de grelina;(b) um composto similar a variante de junção de grelina tendo afórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcional-mente presente; cada X1 é de modo independente selecionado entre umaminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético; X2 é sele-cionado entre um aminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sin-tético, o referido aminoácido sendo modificado com um grupo hidrofóbicovolumoso; cada X3 é de modo independente selecionado entre um aminoá-cido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, em que um ou maisde X1 e X3 opcionalmente podem ser modificados com um grupo hidrofóbicovolumoso; Z2 é um grupo protetor opcionalmente presente; m é um númerointeiro na faixa de a partir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a par-tir de 4 a 92; contanto que o composto de acordo com a fórmula Ζ1 -(X1 )m-(X2)-(X3)n-Z2 tenha 15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo-80% de homologia com a SEQ ID NO:1; ou(c) uma mistura dos mesmos.
66. Kit para administrar variante de junção de grelina ou umcomposto similar a variante de junção de grelina compreendendo:(a) uma forma de dosagem compreendendo uma quantidadefarmaceuticamente aceitável de(1) variante de junção de grelina;(2) um composto similar a variante de junção de grelina tendo afórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, em que Z1 é um grupo protetor opcional-mente presente; cada X1 é de modo independente selecionado entre umaminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético; X2 é sele-cionado entre um aminoácido que ocorre naturalmente e um aminoácido sin-tético, o referido aminoácido sendo modificado com um grupo hidrofóbicovolumoso; cada X3 é de modo independente selecionado entre um aminoá-cido que ocorre naturalmente e um aminoácido sintético, em que um ou maisde X1 e X3 opcionalmente podem ser modificados com um grupo hidrofóbicovolumoso; Z2 é um grupo protetor opcionalmente presente; m é um númerointeiro na faixa de a partir de 1 a 10; η é um número inteiro na faixa de a par-tir de 4 a 92; contanto que o composto de acordo com a fórmula Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 tenha 15 a 94 aminoácidos de extensão e tenha no mínimo- 80% de homologia com a SEQ ID NO:1; ou(3) uma mistura dos mesmos; e(b) opcionalmente, instruções para administrar (a).
67. Método para produzir um composto similar a variante de jun-ção de grelina, o referido método compreendendo:(a) proporcionar um cDNA compreendendo uma seqüência depolinucleotídeos codificando um composto similar a variante de junção degrelina como definido na reivindicação 1;(b) inserir o referido cDNA em um vetor de expressão de tal mo-do que o cDNA seja encadeado operavelmente a um promotor;(c) introduzir o referido vetor de expressão em uma célula hos-pedeira por meio do que a referida célula hospedeira produz o referidCom-posto similar a variante de junção de grelina; e(d) opcionalmente recuperar Composto similar a variante de jun-ção de grelina produzido na etapa (c).
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