BRPI0708900A2 - diagnàstico e prognàstico de estados màrbidos associados com dipeptidil peptidases - Google Patents

Abstract

DIAGNàSTICO E PROGNàSTICO DE ESTADOS MàRBIDOS ASSOCIADOS COM DIPEPTIDIL PEPTIDASES É proposto um método para o diagnóstico ou prognóstico de um estado mórbido, envolvendo a medição de um parâmetro de dipeptidil dipeptidases discriminadas a partir de uma amostra de paciente, e a correlação do parâmetro com uma doença.

Description

"DIAGNÓSTICO E PROGNÓSTICO DE ESTADOS MÓRBIDOS ASSOCIADOSCOM DIPEPTIDIL PEPTIDASES"

REFERÊNCIA CRUZADA

Este pedido reivindica o benefício da data de depósito do pedido provisório U.S. No.60/781.924 depositado em 13 de março de 2006 e intitulado "Method of Diagnosing Diseaseby Isoform Profiling", Pedido Provisório U.S. No. 60/804.397 depositado em 9 de junho de2006 e intitulado "Separation and Characterization of Dipeptidyl Peptidase IV Isoforms UsingFree Flow Electrophoresis (FFE)", e pedido provisório U.S. No. desconhecido (Registro doAgente No. P-7148) depositado em 2 de março de 2007 intitulado "Separation andCharacterization of Dipeptidyl Peptidase IV Isoforms and/or Isozymes Using Matrix |(FreeFlow) Electrophoresis", cujo conteúdo integral é incorporado ao presente documento a títulode referência

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção se refere em linhas gerais ao diagnóstico e prognóstico dedoenças ou condições

FUNDAMENTOS

Os métodos atuais para se avaliar o risco ou o diagnóstico de doençasfreqüentemente se apóia em um diagnóstico por atrito, um processo de eliminação ou porcirurgia invasiva ou biópsias. Mesmo depois de um diagnóstico definitivo ter sido obtido, oprognóstico é geralmente baseado em fatores subjetivos.

Em determinadas doenças, tais como doença metabólica, os métodos pelos quaispode ser feito um diagnóstico objetivo são freqüentemente trabalhosos, demorados e caros.O método primário para o diagnóstico de diabetes do tipo 2, por exemplo, é o teste deglicose do plasma em jejum, que avalia níveis de açúcar sangüíneos no plasma, este testeexige que o paciente esteja em jejum durante 8-14 horas, e freqüentemente exige umamultiplicidade de coletas de sangue durante um período de horas a dias. Além disso,embora o teste de glicose do plasma em jejum seja útil no diagnóstico da presença dediabetes do tipo 2, o teste é muito limitado na sua capacidade de proporcionar umprognóstico da doença.

Em medicina há uma busca constante por modos menos invasivos, menos penososfisicamente e mais precisos para se diagnosticar e tratar doenças ou condições. À medidaque se desenvolve uma maio compreensão de processos biológicos e a bioquímicaassociada com estes processos, determinadas teorias foram lançadas sobre quais ascomposições que poderiam ser identificadas como marcadores ou indicadores paradeterminadas doenças ou condições. As proteases e peptidases, como uma classe, foraminvestigadas para a sua utilidade no diagnóstico e como alvos para o tratamento depacientes.A título de fundamento geral, proteases/peptidases são tipicamente classificadaspor uma série de critérios, tais com sítio de ação, preferência por substrato e mecanismo. Asaminopeptidases, por exemplo, agem de preferência, nos resíduos de terminal N de umpolipeptídeo, as carboxipeptidases atuam, de preferência, no terminal C e asendopeptidases atuam nos sítios entre estes dois terminais.

As dipeptidil peptidases (DPPs) são peptidases que clivam especificamente umaunidade dipeptídeo, isto é, uma unidade de dois aminoácidos, dos seus substratosespecíficos. Há uma série de DPPs diferentes, e a preferência ao substrato éfreqüentemente expressa em termos do resíduo de aminoácido imediatamente terminal N aosítio de clivagem. DPP-I, por exemplo, (IUBMB Enzyme Nomenclature EC.3.4.14.1) é umapeptidase do tipo de cisteína lisossômica que libera um dipeptídeo de terminal N, Xaa-Yaa-|-Zaa- exceto quando Xaa é Arg ou Lys ou Yaa ou Zaa é Pro. DPP-II (IUBMB EnzymeNomenclature EC.3.4.14.2) é uma peptidase do tipo de serina lisossômica que libera umdipeptídeo de terminal N, Xaa-Yaa-|-,, de preferência quando Yaa é Ala ou Pro, DPP-III(IUBMB Enzyme Nomenclature EC.3.4.14.4) é uma peptidase citossólica que tem umaatividade ampla sobre peptídeos, embora seja extremamente seletiva para Arg-Arg-Z, emque Z é qualquer aminoácido, a pH 9,2. DPP-IV (IUBMB Enzyme NomenclatureEC.3.4.14.4) é uma peptidase do tipo serina ligada a membrana que libera um dipeptídeo determinal N de Xaa-Yaa-|-Zaa-, de preferência quando Yaa é Pro, desde que Zaa não sejanem Pro nem hidroxiprolina.

As DPPs estão envolvidas em uma ampla faixa de atividades fisiologicamenteimportante, e foram associadas com a regulação do sistema neurológico, sistema endócrino,sistema imune e sistema digestivo. A atividade de DPPs foi demonstrada em numerosasfunções intracelulares e extracelulares tais como a degradação de proteínas e ativação deenzimas.

No tocante aos DPPs específicos mencionados acima, a DPP-IV foi amplamenteestudada, juntamente com as suas isoformas correspondentes e isozimas ou homólogosestruturais, e aquelas proteínas que apresentam atividade semelhante à de DPP-IV. Asproteínas que apresentam uma atividade semelhante à de DPP-IV forma denominadashomólogos de dipeptidil peptidase IV quanto a atividade e/ou estrutura, ou "DASH". A DPP-IV é uma proteína de membrana do tipo Il a que se refere por uma série de nomes,incluindo, sem limitação, DPP4, DP4, DAP-IV, proteína 2 complexadora de adenosinadesaminase FAP β, proteína de ligação a adenosina desaminase (ADAbp), dipeptidilaminopeptidase IV; Xaa-Pro- dipeptidil-aminopeptidase; Gly-Pro naftilamidase; pós-prolinadipeptidil aminopeptidase IV; antígeno de linfócito CD26; glicoproteína GP110; dipeptidilpeptidase IV; glicilprolina aminopeptidase; glicilprolina aminopeptidase; X-prolil dipeptidilaminopeptidase; pep X; antígeno de leucócito CD26; glicilprolil dipeptidil aminopeptidase;dipeptidil-peptídeo hidrolase; glicilprolil aminopeptidase; dipeptidilaminopeptidase IV; DPPIV/CD26,- amino acil-prolil dipeptidil aminopeptidase; molécula desencadeador de célula TTp103; X-PDAP. (Burgess et al., patente U.S. No. 7.169.926).

Uma série de proteína DASH foi relatada, tal como seprase, proteína a de ativaçãode fibroblastos, DPP6, DPP8, DPP9, atractina, W dipeptidases I, II, e L ácidas ligadas a Ν-σ-acetiladas, prolina dipeptidase de célula quiescente, serina protease específica a timo eDPP IΜ-β (Busek et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 36:408-421 (2004)).

A DPP-IV é expressa constitutivamente em células epiteliais e endoteliais de umavariedade de tecidos diferentes, incluindo intestinos, fígado, pulmão, rim e placenta (Hartelet al., Histochemistry 89 (2): 151-161 (1988); Yaron and Naider, Criticai Rev. Biochem. Mol.Biol. 28 (1) :31-81 (1993)). A DPP-IV é expressa em linfócitos T circulantes e mostrou sersinônima com antígeno de superfície de célula, CD-26 (Sedo et al., Arthritis Res. Ther.7:253-269 (2005)). Além da sua forma ligada a membrana, DPP-IV também existe em umaforma solúvel e a atividade de DPP-IV pode ser encontrada em fluidos corporais tais comono plasma sangüíneo e no fluido sinovial (Sedo et al., Arthritis Res. Ther. 7:253-269 (2005);Gorrell, Clinicai Sei. 108:277-292 (2005)).

Acredita-se que DPP-IV represente um papel importante no metabolismo deneuropeptídeos, na ativação de células T, na adesão celular, digestão de peptídeoscontendo prolina nos fins e nos intestinos, na infecção por HIV e na apoptose, e naregulação de tumorigenicidade de determinadas células de melanoma (Mattem et al., Scand.J. Immunol. 33:737 (1991); Pethiyagoda et al., Clin. Exp. Metastasis 18 (5): 391-400 (2000)).

Os substratos naturais de DPP-IV incluem diversos quimiocina, citocina,neuropeptídeos, hormônios circulantes e peptídeos bioativos (Lambeir et al., J. Biol. Chem.276 (32) :29839-29845 (2001)). Foi sugerido um papel regulador chave para DPP-IV nometabolismo de hormônios de peptídeos e no transporte de aminoácidos (Hildebrandt et al.,Clin. Sei. (Lond.) 99 (2): 93-104 (2000)).

A expressão de DPP-IV é aumentada em células T depois do estímulo mitogênicoou antigênico, sugerindo um papel no sistema imune (Mattem et al., Scand. J. Immunol.33:737 (1991)). Diversas outras funções de linfócitos T tais como a produção de citocinas,proliferação de células mediada por IL-2, e atividade de células b auxiliares tambémmostraram serem dependentes da atividade de DPP-IV (Schon et al ., Scand. J. Immunol.29:127 (1989)). Além disso, parece que DPP-IV tem uma função co-estimuladora durante aativação e proliferação de células T (von Bonin et al., Immunol. Rev. 161:43-53 (1998)).

A DPP-IV está envolvida em outros processos biológicos, incluindo uma função deancoragem de membrana para a localização da enzima extracelular adenosina desaminase(ADA) (Franco et al., Immunol. Rev. 161: 27-42 (1998)) e participação na adesão de matrizcelular por ligação a colágeno e fibronectina (Loster et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.217(1) :34l-348 (1995)).

Acredita-se também que a DPP-IV represente um papel na regulação endócrina ena fisiologia metabólica. A DPP-IV1 por exemplo, cliva o dipeptídeo His-Ala no terminalamino do peptídeo-1 semelhante a glucagon (GLP-1), gerando um antagonista de receptorde GLP-I e encurtando assim a resposta fisiológica a GLP-I. DPP-IV foi implicada nocontrole do metabolismo da glicose, pois seus substratos incluem os hormôniosinsulinotrópicos GLP-I e o peptídeo inibidor gástrico (GIP), que são inativados pela remoçãodos seus dois aminoácidos de terminal N. (Mannucci et al., Diabetologia 48:1168-1172(2005)).

Além da função fisiológica normal, as DPPs forma estudadas pelo seu papel emestados mórbidos, incluindo câncer, doença autoimune, doença cardiovascular, doençametabólica e doença infecciosa.

Foi sugerido, por exemplo, que DPP-IV é uma molécula de adesão para células decarcinoma da mama e da próstata metastáticas no pulmão (Johnson et al., J. Cell. Biol.121:1423 (1993)). Foi constatada uma alta atividade de DPP-IV nos homogenatos teciduaisde pacientes com hipertrofia benigna da próstata e nos prostatossomos (Vanhoof et al., Eur.J.. Clin. Chem. Clin. Biochem. 30:333 (1992)).

Altos níveis de expressão de DPP-IVforam descobertos nas células fibroblastos dapele humana de pacientes com a doença autoimune psoríase, artrite reumatóide (RA) elíquen plano (Raynaud et al., J. Cell. Physiol. 152:378 (1992)).

A DPP-IV foi associada com uma série de doenças metabólicas tais comoobesidade e regulação do apetite. Uma das doenças metabólicas associadas com DPP-IVmais extensamente associada com DPP-IV, por exemplo, é o diabetes do tipo 2. Mannucciet al., define e descrevem a relação ente hiperglicemia crônica e DPP-IV em diabetes. Estapesquisa concluiu que a atividade de DPP-IV circulante se correlaciona diretamente com ograu de hiperglicemia no diabetes do tipo II.

Outros estudos discutem a relação entre DPP-IV e diversos hormônios envolvidosna cascata de hormônios que regula os níveis sangüíneos de açúcar. Estes estudosconcluíram que DPP-IV degrada um hormônio que é importante para a secreção de insulina.Especificamente, foi sugerido que DPP-IV degrada o peptídeo 1 semelhante a glucagon(GLP-1) que resulta em uma redução na secreção de insulina e conseqüentemente em umaumento em açúcar sangüíneo. Com base neste fenômeno, estão sendo desenvolvidosinibidores de DPP-IV para o tratamento de diabetes do tipo Il (Green et al., Diab. Vasc. Dis.Res. 3 (3): 159-165 (2006)).

Aparentemente a DPP-IV é essencial para a penetração e a infectividade dos vírusHIV-I e HIV-2 em células T CD4* (Wakselman et al., J. Dermatol. Sei. 22:152-160 (2000)).Portanto, existe alguma sugestão que a supressão de DPP-IV possa também suprimir estemecanismo.

Recentemente, algumas vias de pesquisa de DPP se concentraram na manipulaçãode níveis de DPP como um meio para o desenvolvimento de tratamento e terapias para osestados e condições mórbidos associados com DPP. No entanto até agora poucostratamentos e terapias resultaram deste trabalho.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

O desenvolvimento de terapia e de ferramentas diagnosticas que sejam baseadasem DPP e em seu papel em processos biológicos ainda é procurado. Uma modalidade dainvenção descrita no presente documento é voltada a um método para o prognóstico oudiagnóstico de um estado ou condição mórbida associada com DPP. Mais especificamente,um ou mais parâmetros de porções discriminadas de um DPP específico é medido e amedida é correlacionada com a presença, ausência ou gravidade do estado ou condiçãomórbida.

Uma outra modalidade da invenção descrita no presente documento é voltada a ummétodo para o prognóstico ou diagnóstico de uma condição ou estado mórbido associadocom DPP. Mais especificamente, um ou mais parâmetros de porções de isoformas de DPPé medido e a medida é correlacionada com a presença, ausência ou gravidade da condiçãoou estado mórbido.

Uma outra modalidade da invenção descrita é voltada a um método para odiagnóstico ou prognóstico de diabetes do tipo II. Mais especificamente pelo menos umparâmetro de uma ou mais porções discriminadas de isoformas de DPP-IV de uma amostrade paciente é medida e a medição é correlacionada com a presença, ausência ou gravidadede diabetes do tipo II.

DISCRIÇÃO SUCINTA DOS DESENHOS

A Figura 12 ilustra o fluxo de trabalho de uma separação por eletroforese de fluxolivre de isoformas.

As Figuras 2A e B são gráficos mostrando os resultados de um teste de atividadede DPP-IV porcina depois de IEF-FFE nativa. A Figura 2B mostra a atividade específica (Ude enzima/ng) de isoformas de DPP-IV porcina discriminadas.

A Figura 3 é um gel de acrilamida de IEF tingido com prata das frações 27 a 47provenientes da separação por FFE (pH 3-10) da DPP-IV porcina nativa.

As Figuras 4A e B mostram a análise por impressão digital da massa de peptídeode faixas de proteína tripsinizada excisadas de gel de IEF para as isoformas mais ácida (4A)e ligeiramente mais básica (4B). A análise por PMF identifica todas as isoformas como DPP-IV.As Figuras 5A e B mostram a confirmação de picos de DPP-IV selecionados comMALDI TOF/TOF.

As Figuras 6A e B mostram a atividade de DPP-IV de isoformas DPP-IVdiscriminadas por FFE provenientes do plasma humano em dois pacientes sadios.

A Figura 7 mostra o perfil de atividade de DPP-IV de isoformas discriminadas porFFE de um paciente humano normal.

A Figura 8 mostra o perfil de atividade de DPP-IV de isoformas discriminadas porFFE provenientes de um paciente humano diabético com um nível de glicose de 538 mg/dl_.

A Figura 9 mostra um exemplo do desvio de perfil de DPP-IV que resulta dadesialilação de isoformas discriminadas por FFE provenientes de um paciente humanosadio. A atividade é representada em RFU/min. As barras escuras representam a amostratratada; as barras tracejadas representam a amostra sem tratamento.

A Figura 10 mostra a comparação da atividade de DPP-IV entre isoformas de DPP-IV discriminadas por pl no plasma proveniente de um paciente sadio (barras claras) e umdiabético (barras escuras), assim como isoformas disialiladas provenientes de um pacientediabético (linha escura). A linha pontilhada represente o pH ao qual cada porção foidiscriminada.

A Figura 11 é um gráfico de ruptura dos hp por atividade de DPP-IV de isoformasde dpp discriminadas por pl provenientes de pacientes sadios e diabéticos. S04, S11, S07, eS02 são sadias; as restantes são diabéticas.

A Figura 12 é um gráfico do pH ao qual as isoformas de DPP-IV discriminadas porpl provenientes de cada paciente atingem uma atividade de 90% de DPP-IV. S04, S11, S07E S02 são sadias; as restantes são diabéticas.

A Figura 13 é um gráfico do pH ao qual as isoformas de DPP-IV discriminadas porpl provenientes de cada paciente atingem uma atividade de 60% de DPP-IV. S05, S11, S08E S02 são sadias; as restantes são diabéticas.

A Figura 14 é um gráfico ilustrando os diversos modos em que os parâmetrosmedidos de isoformas de DPP discriminadas podem ser correlacionadas com doença.

O MELHOR MODO DE SE COLOCAR EM PRÁTICA A INVENÇÃO

Os métodos descritos no presente documento proporcionam a avaliação de risco, odiagnóstico ou prognóstico de uma condição ou estado mórbido associado com dipeptidilpeptidase (DPP). Mais especificamente, os métodos descritos se referem a um método deavaliação de risco, diagnóstico ou prognóstico de uma condição ou estado mórbidoassociado com um parâmetro específico de DPP. De acordo com as modalidades dométodo descrito, é medido um parâmetro de uma porção de DPP discriminada. A medida éentão correlacionada com a presença, ausência ou gravidade da condição ou estadomórbido citado.Para os fins deste pedido, os termos "protease" e "peptidase" são usadosindiferentemente, e se referem a enzimas que catalisam a hidrólise de ligações amidapeptídicas. As dipeptidil peptidases (DPPs) são proteases que clivam uma unidadedipeptídica de um polipeptídeo.

Conforme empregado no presente, o termo "porções discriminadas de uma DPPespecífica" se refere a uma DPP específica (uma ou mais isoformas de uma famíliaespecífica de DPP, por exemplo, tais como DPP-I, DPP-II, DPP-III1 DPP-IV, por exemplo,etc.) de uma amostra de paciente que tenha sido distinguida, separada ou isolada uma daoutra de algum modo.

Em uma modalidade, a DPP específica é submetida à mesma condição quedistinguirá pelo menos uma isoforma da DPP específica de pelo menos uma outra isoformada DPP. Cada porção discriminada pode conter uma ou mais isoformas de DPP da DPPespecífica, e algumas porções podem não conter nenhuma isoforma de DPP. Em uma outramodalidade, a DPP (que pode incluir DPP de uma família ou de mais de uma família) ésubmetida à mesma condição que distinguirá pelo menos uma isoforma da DPP de pelomenos uma outra isoforma da DPP.

Mais especificamente, as isoformas individuais de DPP podem ser completamenteou somente parcialmente discriminadas em porções e entre si. Portanto, uma porçãodiscriminada pode conter uma ou mais isoformas, ou então cada porção discriminada podesomente conter uma isoforma. dE modo análogo, uma porção discriminada pode conter umaisoforma, ao passo que outras porções discriminadas podem conter mais de uma isoforma.Além disso, algumas porções discriminadas podem não conter nenhuma isoforma de DPP,desde que uma ou mais outras porções contenham uma ou mais isoformas de DPP.

A DPP específica pode ser um membro de qualquer família de DPP específica oufamília DASH, incluindo DPP-I, DPP-II, DPP-III ou DPP-IV. Nas modalidades exemplares, aDPP é DPP-IV. A DPP que não é designada como específica inclui tanto a DPP nãoespecífica como a específica.

Conforme empregado no presente, o termo "isoforma" de uma DPP se refere aqualquer uma de uma multiplicidade de formas de uma ou mais enzimas DPP que diferemde algum modo físico, mas que têm toda uma atividade catalítica característica comum,estrutura primária homóloga/seqüência de aminoácidos homóloga ou que derivam dosmesmos Ioci genéticos. A atividade catalítica de isoformas de DPP não precisa ser idênticaem grau ou velocidade de catálise, somente em um perfil de substrato comum. De modoanálogo, as estruturas primárias das isoformas não precisam ser idênticas, mas podem sero resultado de adições, deleções ou mutações menores na seqüência de aminoácidos daenzima.As isoformas podem ter estrutura primária similar ou a mesma estrutura primária epodem ter a mesma atividade catalítica ou diferente(s) atividade(s) catalítica(s). A estruturaprimária das isoformas pode diferir significativamente conservando ao mesmo tempo amesma atividade catalítica. As isoformas podem ter a mesma estrutura secundária, estruturaterciária e/ou estrutura quaternária ou diferentes, mas continuam a ser isoformas uma daoutra desde que conservem a mesma estrutura primária e/ou atividade enzimática ouestruturas primárias e/ou atividades enzimáticas similares e/ou sejam derivadas dosmesmos Ioci genéticos. As isoformas podem ser derivadas do mesmo Iocus genético ou dediferentes Ioci genéticos. Elas podem ser o resultado de diferentes alelos; de umamultiplicidade de Ioci genéticos, por recomposição alternativa de RNA mensageiro produzidodo mesmo gene; ou o resultado de modificação pós traducional, tal como adição depolissacarídeo fosfato, sulfidrila, ácido siálico ou outros grupos.

"Isoformas", quando usado no presente documento, também incluem isozimas.Conforme empregado no presente, o termo "isozima" (alternativamente isoenzima) é um tipode isoforma que se refere a qualquer uma das múltiplas formas de uma enzima que seoriginam de uma diferença geneticamente determinada na estrutura primária/seqüência deaminoácidos.

Qualquer grupo de enzimas que compartilham a mesma atividade catalítica, Iocigenéticos ou estrutura primária são isoformas uma da outra. São conhecidas múltiplasisoformas de DPP. A DPP-I, por exemplo, existe em pelo menos 2 isoformas derivadas devariantes de transcrição que codificam do mesmo gene (Entrez Gene GenelD: 1075). Demodo análogo, foram relatadas múltiplas isoformas para DPP-II (DiCarIantonio et al.,Gamete Res. 15(2): 161 175 (2005)), DPP-III (Mazzocco et al., FEBS Journal 273 (5): 10561064 (2006)) e DPP-IV (Schmauser et al., Glycobiol. 9(12): 1295 1305 (1999)).

Qualquer enzima que cliva ligações dipeptídicas pós-prolina, por exemplo, é umaisoforma DPP-IV. Os versados na técnica observarão facilmente muitas isoformas de DPP.Nem todas as isoformas são identificadas no presente documento, a título de ilustração, enão de limitação as isoformas DPP-IV incluem, sem limitação, DPP-IV; as diversas formassialadas de DPP-IV; DPP-IV ligada a membrana; DPP-IV solúvel; e qualquer um doshomólogos por atividade e/ou por estrutura de dipeptidil peptidase IV (DASH), tais comoseprase, proteína a de ativação de fibroblastos, DPP6, DPP9, DPP9, atractina, dipeptidasesI, Il e L acidas ligadas em a N-acetiladas, prolina dipeptidase de célula quiescente, serinaprotease específica a timo e DPP-IV-/?.

Os parâmetros de DPP que podem ser medidos incluem a quantidade,concentração, atividade, expressão ou quantidade ou tipo de modificação pós-traducional.

"Quantidade" de DPP inclui a presença, ausência ou quantidade de DPP."Atividade" de DPP inclui a presença, ausência, quantidade, grau ou velocidade da atividadeenzimática incluindo a atividade específica. "Expressão" de DPP inclui a presença, ausência,velocidade ou quantidade de expressão de DPP. "Concentração" de DPP é a quantidade deisoforma de DPP por unidade de volume presente em uma porção

O parâmetro de DPP pode ser medido diretamente ou indiretamente e pode serqualitativo ou quantitativo.

A atividade de DPP pode ser medida usando-se qualquer ensaio que possa medirquantitativa ou qualitativamente medir a atividade de DPP. Os ensaios adequados para amedição da atividade de DPP incluem ensaios que detectam a presença ou quantidade deum produto de hidrólise de atividade de DPP sobre um substrato rotulado de modo detectável. O rótulo pode ser direta ou indiretamente detectável, e pode ser fluorogênico,quimioluminescente colorimétrico ou radioativo. Os rótulos fluorogênicos incluem 7-amino-4-metil cumarina (AMC) e 7-amino-4-triflúor metil cumarina (AFC).

Conforme os versados na técnica observarão, o modo de detecção do sinaldependerá do sistema de detecção exato utilizado no ensaio. O sistema de detecção podedetectar alterações em massa, alterações em seqüência de aminoácidos ou comprimento depeptídeo, alterações cromogênicas ou alterações fluorogênicas. O método de detecçãopode empregar esquemas de detecção secundários incluindo reações enzimáticassecundárias que resultam na alteração detectável, dentre uma ampla variedade deesquemas de detecção descritos na técnica.

Se um reagente de detecção rádio-rotulado for utilizado, por exemplo, o sinal serámedido usando-se uma tecnologia capaz de quantificar o sinal a partir da amostra biológicaou comparando-se o sinal proveniente da amostra biológica com o sinal proveniente de umaamostra de referência, tais como contagem de cintilações, auto-radiografia (combinadatipicamente com densitometria de varredura), e semelhantes. Se for usado um sistema dedetecção quimioluminescente, então o sinal tipicamente será detectado usando-se umluminômetro. Se for usado um sistema de detecção fluorescente, a fluorescência pode sermedida usando-se um espectrofluorômetro. Os métodos para detecção de sinal de sistemasde detecção são conhecidos na técnica.

Em algumas modalidades, a atividade de DPP é medida por meio de um ensaioque detecta a presença ou a quantidade de um produto de hidrólise de atividade de DPPsobre um substrato rotulado de modo detectável. A atividade de DPP-IV pode ser medidausando-se um ensaio que detecta a hidrólise de qualquer substrato rotulado de mododetectável que seria catalisado por DPP-IV, isto é, X-Y-R, em que X é um aminoácido; Y éPor (Prolina), Ala (AIanina) ou Arg (Arginina); e R é qualquer rótulo direta ou indiretamentedetectável.

A quantidade de DPP pode ser medida usando-se qualquer ensaio que possa medirquantitativa ou qualitativamente a quantidade de uma ou mais isoformas de DPP. Osensaios adequados para a medição da quantidade de DPP incluem, sem limitação, análisepor western blot, espectrofotometria de proteínas, rádio-imunoensaio, ensaios de ligaçãocompetitiva e ensaios ELISA. Neste sentido, os anticorpos que são específicos para uma oumais isoformas de DPP são especialmente úteis.

A concentração de DPP pode ser medida usando-se qualquer ensaio que possaquantitativa ou qualitativamente medir a concentração de uma ou mais isoformas. Osensaios adequados para a medição da concentração de DPP incluem análise por westernblot, espectrofotometria de proteínas, rádio-imunoensaio, ensaios de ligação competitiva eensaios ELISA. Neste sentido, os anticorpos que são específicos para uma ou maisisoformas de DPP são especialmente úteis.

A expressão de DPP pode ser medida usando-se qualquer ensaio que possaquantitativa ou qualitativamente medir a expressão de uma ou mais isoformas de DPP. Osensaios adequados para a medição da expressão de DPP geralmente detectam RNAm ouproteína de DPP e incluem análise por northern blot e análise por western blot ou suasvariações (Análise Far Western, por exemplo, chips de microconjunto).

O tipo o grau de modificação pós-traducional pode ser medido usando-se qualquerensaio que possa quantitativa ou qualitativamente medir a modificação de um ou maisisoformas DPP. Os ensaios adequados para a medição do tipo ou grau de modificação pós-traducional incluem ligação a lectina, análise por western blot, espectrofotometria deproteínas, radio-imunoensaio, ensaios de ligação competitiva, e ensaios ELISA.

Um ou mais de um parâmetro podem ser medidos. Um único parâmetro(quantidade, concentração, atividade, expressão, quantidade ou tipo de modificação pós-traducional, por exemplo), por exemplo, pode ser medido, podendo ser medidas, porexemplo, tanto a quantidade como a concentração, a quantidade e a atividade, a quantidadee a expressão, a concentração e a atividade, a concentração e a expressão ou a atividade ea expressão. De modo análogo, podem ser medidas quantidade, atividade e expressão;quantidade, concentração e expressão ou concentração, atividade e expressão.

Se duas ou mais medições forem efetuadas, as medidas podem ser tiradasconcomitante ou consecutivamente. A quantidade pode ser medida simultaneamente com aatividade, por exemplo. Alternativamente, a quantidade pode ser medida antes ou depois daatividade. Se forem feitas três ou mais medições, as medidas podem ser tiradas consecutivaou concomitantemente. A quantidade pode ser medida antes do tipo da modificação pós-traducional e da atividade, sendo o tipo da modificação pós-traducional e a atividademedidas concomitantemente, ou então a quantidade, tipo de modificação pós-traducional eatividade são medidas concomitante ou consecutivamente uma em relação a outra. Demodo análogo, se mais medições forem efetuadas, as medidas serão tiradas concomitanteou consecutivamente uma em relação a outra, ou ser agrupadas em cada modo possível, demodo tal que cada grupo seja tomado concomitante ou consecutivamente em relação atodos os outros grupos. Em outras palavras, cada uma das medições pode ser agrupada emum modo fatorial ou distributivo e cada grupo pode ser medido no tocante a todos os outrosgrupos, quer consecutiva quer concomitantemente.

Além das medições múltiplas, qualquer medida dada, quer de um ou maisparâmetros, pode ser tirada mais de uma vez, isto é, ser repetida, para qualquer amostra depaciente dada.

Além disso, pode ser tirada qualquer combinação de medidas no tocante àsporções. Um único parâmetro pode ser medido para uma porção, algumas ou todas asporções, por exemplo. De modo análogo pode ser medido mais de um parâmetro para umaporção, para algumas ou para todas as porções. Um único parâmetro pode ser medido parauma porção ou algumas porções. A quantidade pode ser medida para uma porção somente,por exemplo, ao passo que a atividade de todas as porções pode ser medida. De modoanálogo, pode ser medida a atividade de somente uma porção, ao passo que pode sermedida a quantidade de todas as porções.

Quando se mede um ou mais parâmetros de DPP, a amostra de paciente pode serdividida em uma série de alíquotas, sendo alíquotas separadas usadas para medirparâmetros de DPP diferentes ou para conduzir medições em réplicas. Além disso, oualternativamente, cada uma das porções discriminadas de DPP pode ser dividida em umasérie de alíquotas para a medição de diferentes parâmetros de DPP ou para medições emréplicas. As medições em réplicas não são necessárias aos métodos da invenção, masmuitas modalidades da invenção utilizarão testes em réplicas, especialmente testes emduplicata e triplicata.

Alternativamente, a amostra do paciente ou uma alíquota dele pode ser testadapara se determinar os níveis de múltiplos parâmetros de DPP em uma única reação usando-se um ensaio capaz de medir os níveis individuais de parâmetros diferentes de DPP em umúnico ensaio, tal como um ensaio do tipo de conjuntos ou ensaio que utiliza tecnologia dedetecção multiplexada (um ensaio utilizando reagentes de detecção rotulados comdiferentes marcadores de corante fluorescente, por exemplo).

Conforme empregado no presente, o termo "condição ou doença associada comDPP" se refere àquelas condições ou doenças que são caracterizadas por uma diferençaem um ou mais parâmetros específicos mensuráveis de DPP. As doenças ou condiçõesassociadas com DPP não são necessariamente causadas por uma alteração em DPP, maspodem ser diagnosticadas ou monitoradas medindo-se um ou mais parâmetros de DPP.

As condições e estados mórbidos associados com DPP incluem, sem limitação,doença metabólica, doença autoimune, câncer e infecções virais.A(s) doença(s) metabólica(s), conforme o termo é empregado no presente, sãodistúrbios do metabolismo e incluem tanto doenças adquiridas com as genéticas. Uma sériedelas é descrita em Harrison's Principies of Internai Medicine, em geral, as doençasmetabólicas são divididas em três classes principais, doença de armazenagem d glicogênio(isto é, aquelas doenças que afetam o metabolismo de carboidratos, tais como diabetes dotipo II), distúrbios da oxidação dos ácidos graxos (isto é, aqueles distúrbios que afetam ometabolismo de componentes graxos, tais como a Doença de Fabry) e distúrbiosmitocondriais (isto é, aqueles distúrbios que afetam as mitocôndrias, tais como o síndromede Leigh).

Os estados mórbidos metabólicos que podem ser detectados com a presenteinvenção incluem, sem limitação, diabetes do tipo II, hipoglicemia, hiperglicemia, doença deGraves, Síndrome de Cushing1 alcaptonúria, albinismo, histidinemia, hiperornitinemia,doença de Wilson, doença de Tay Sachs, doença de Niemann-Pick, doença de Krabbe,doença de Paget, doença de urina em xarope de bordo ou fenilcetonúria. Em umamodalidade exemplar a DPP é DPP-IV e a doença é diabetes do tipo II.

As doenças autoimunes que podem ser detectadas com a presente invençãoincluem, sem limitação: artrite reumatóide, líquen plano, psoríase, uveíte, anemiashemolíticas, febre reumáticas, doença de Crohn, síndrome de Guillain-Barre, psoríase,tireoidite, doença de Graves, miastenia grave, glomerulonefrite, hepatite autoimune ou lúpuseritematoso sistêmico, em determinadas modalidades, a doença autoimune é psoríase,artrite reumatóide ou líquen plano e a DPP é DPP-IV.

Os cânceres que podem ser detectados com a presente invenção incluem, semlimitação; tumores sólidos primários e metastáticos e carcinomas da mama; cólon; reto;pulmão; orofaringe; hipofaringe; esôfago; estômago; pâncreas; fígado, vesícula biliar; dutosbiliares; intestino delgado; trato urinário incluindo rim, bexiga e urotélio; trato genitalfeminino, incluindo cerviz, útero, ovários, coriocarcinoma e doença trofoblástica gestacional;trato genital masculino incluindo próstata, vesículas seminais, testículos e tumores decélulas germinativas; glândulas endócrinas incluindo tireóide, adrenal e pituitária; peleincluindo hemangiomas, melanomas, sarcomas que se originam de tecidos ósseos oubrancos e sarcoma de Kaposi; tumores do cérebro, nervos, olhos e meninges incluindoastrocitomas, gliomas, glioblastomas, retinoblastomas, neuromas, neuroblastomas,Schwannomas e meningiomas; tumores sólidos se originando de malignidadeshematopoiéticas, tais como Ieucemias e incluindo cloromas, plasmacitomas, placas etumores de micose fungóide e linfoma/leucemia cutânea de células T; linfomas incluindotanto Iinfoma de Hodgkin como não de Hodgkin.

Infecções virais que podem ser detectadas com a presente invenção incluem, semlimitação, aquelas infecções causadas por famílias virais que são patogênicas para sereshumanos e outros animais tais como: Adenoviridae, Birnaviridae Bunyaviridae,Coronaviridae Flaviviridae, Herpesviridae1 Orthomyxoviridae Papovaviridae1 ParvoviridaePicornaviridae Reoviridae Retroviridae (HIV, por exemplo), Rhabovirdae1 ou Togaviridae. Emdeterminadas modalidades, a DPP é DPP-IV e a doença viral é HIV.

Conforme empregado no presente, o termo "paciente" se refere a qualquerorganismo viso, que tenha necessidade de um diagnóstico, prognóstico, monitoração doprogresso da doença ou avaliação de risco de uma condição ou estado mórbido associadocom DPP e em que o paciente possui a fisiologia associada com a expressão de DPP. Taispacientes incluem, sem limitação, humanos, primatas superiores, outros mamíferos(mamíferos domesticados tais como gatos, cães, cavalos, roedores tais como ratos ecamundongos, por exemplo, e animais selvagens tais como leões, tigres e ursos), aves(galinhas, periquitos, por exemplo) e outros animais.

Conforme empregado no presente, o termo "amostras de paciente" ou "amostrabiológica" se refere a qualquer amostra tirada de um paciente ou proveniente de umpaciente que possa se esperar que contenha a enzima alvo, e inclui tanto amostrascelulares e acelulares. As amostras de pacientes incluem, sem limitação, tecidos, tais comomuscular, hepático, pulmonar, esplênico, adiposo, mamário e tumoral; sangue e produtossangüíneos, tais como sangue integral, plasma, soro e células sangüíneas; e outros fluidosbiológicos, tais como urina, saliva, lágrimas, muco, fluido amniótico, fluido cérebro-espinhal,fluido sinovial de juntas e fluido seminal. As amostras de pacientes podem também conteruma combinação de fluidos e/ou tecidos.

As amostras podem ser obtidas de um paciente por qualquer método clinicamenteaceitável tal como venipuntura, coleta espinhal, amniocêntese e biópsia de tecido.

Embora as amostras possam ser usadas diretamente no estado em que foramobtidas do paciente, um aspecto da invenção contempla o processamento de amostrasantes da discriminação da DPP em porções (discriminação das isoformas de DPP emporções, por exemplo) ou da medição do parâmetro de DPP. O processamento inclui, semlimitação, homogeneização, diluição, concentração, sonicação, congelamento, mistura comum conservante ou outro agente ou suas combinações.

Além disso, as amostras que contêm células ou outros tecidos em que se possaesperar que a DPP esteja ligada a membrana podem ser processadas de modo a liberar aDPP da membrana celular, permitindo assim que elas sejam utilizadas em qualquer um dosmétodos reconhecidos na técnica para a separação/isolamento de proteínas/enzimas deuma amostra. Os métodos de liberação de proteínas ligadas a membrana são bemconhecidos na técnica e incluem congelamento/descongelamento, homogeneização,sonicação e liberação química ou enzimática da enzima ativa da membrana.Em aLguns exemplos, a amostra de paciente é coletada em um recipiente quecompreende EDTA1 inibidores de protease ou algum outro componente adequado para otransporte, conservação e tratamento de uma amostra biológica.

Quando a amostra de paciente constitui um fluido, o processamento pode incluir aforma de eliminação de células nucleadas e/ou não nucleadas, tais como eritrócitosjleucócitos, e plaquetas em amostras de sangue (a fim de obter plasma, por exemplo), oupode também incluir a eliminação de determinadas proteínas, tal como determinadasproteínas de cascata de coagulação provenientes do sangue (para obter soro, por exemplo).O sangue pode ser coletado em um recipiente com heparina, citrato ou inibidores deprotease, por exemplo, ou colocados em contato com heparina, citrato ou inibidores deproteases depois da coleta. O processamento adicional pode incluir a concentração ou adiluição de uma amostra, de modo a normalizar, por exemplo, o teor total de proteína antesda discriminação ou medição. Os protocolos para a condução destas atividades sãoconhecidos na técnica.

Depois da correlação entre a medição do parâmetro de DPP com estado oucondição mórbida ter sido feita, o resultado pode ser comunicado a um operador. Oresultado inclui a presença, ausência ou severidade de uma condição ou estado mórbido.

Um "operador" pode ser um médico, enfermeira, assistente do clínico, técnicomédico, técnico laboratorial ou qualquer pessoa que opere uma máquina ou aparelho queconduza uma ou mais etapas da invenção, ou qualquer um que possa receber asinformações sobre diagnóstico ou prognóstico incluindo o paciente. As informações sobre odiagnóstico ou prognóstico, por exemplo, podem ser automaticamente comunicadas aopaciente ou ao representante de paciente por meio de fac-símile, telefone, mensagem detexto ou por correio eletrônico.

Qualquer meio para comunicação do resultado pode ser usado, e incluir, semlimitação, a exibição do estado mórbido em um meio tal como um monitor eletrônico, ummonitor digital ou um substrato para impressão; a efetuação de um sinal audível, tal comouma sineta, um sino, uma voz eletronicamente gerada ou uma voz gravada; por meio detelefone, mensagem de texto, correio eletrônico ou fac-símile.

As isoformas de DPP podem ser parcial ou completamente discriminadas emporções de DPP antes da medição de qualquer parâmetro de DPP ou simultaneamente coma medição. Presumindo-se que haja mais de dois tipos de isoformas de DPP presentes emuma amostra, por exemplo, as isoformas podem ser discriminadas me duas porçõessomente, incluindo cada uma mais de um tipo de isoforma (isto é, parcialmentediscriminada); ou as isoformas podem ser discriminadas em porções em que cada porçãosomente contém um tipo de isoforma (isto é, completamente discriminada). De modoanálogo, as isoformas podem ser parcialmente discriminadas em duas ou mais porções,uma porção contendo somente um tipo de isoforma e outras porções contendo mais de umtipo de isoforma.

As porções de DPP podem ser discriminadas por qualquer modo, incluindo porseparação ou isolamento físico ou por outros métodos de identificação ou distinção deisoformas uma da outra.

A discriminação pode ser baseada na diferença em propriedades bioquímica, porexemplo, tais como mobilidade eletroférica ou ponto isoelétrico (pl); estabilidade térmica;peso molecular, seqüência de aminoácidos no caso de isoformas que diferem em estruturaprimária; afinidade ou avidez de anticorpo; extensão ou tipo de modificações póstraducionais; e propriedades cinéticas, tais como Km ou constante de velocidade.

Os anticorpos ou Iectinas específicas para diferentes isoformas de DPP podem serusados ou para separar fisicamente as porções de DPP ou para distinguir as porções semseparação física. Os anticorpos específicos para cada isoforma diferente de DPP, porexemplo, podem portar um rótulo diferente detectável, não exigindo nenhuma separaçãofísica para discriminar as porções. Alternativamente, os anticorpos podem ser usados sobreum suporte ou coluna para separar fisicamente isoformas diferentes de DPP em porções.

Os métodos para a separação incluem focalização isoelétrica, que produz aseparação com base no pl; métodos eletroforéticos, ou em uma matriz tal como um gel oufiltro, ou isenta de gel, que podem fazer a distinção com base na carga elétrica e/ou no pesomolecular; a extensão de ligação a Iectina ou variedade de Iectinas que têm afinidade comas isoformas; ligação a anticorpos; e métodos cromatográficos de discriminação porafinidade ou por tamanho.

Conforme empregado no presente, o termo "ponto isoelétrico" (pl) é o pH ao qualuma molécula não porta nenhuma carga elétrica pura. O pl é também denominado um pHisoelétrico. Portanto, para os fins do presente documento, o termo "pl" e "pH isoelétrico" sãousados indiferentemente. Em uma modalidade exemplar, as porções de DPP sãodiscriminadas com base em pl e a DPP específica é DPP-IV.

Os métodos de focalização isoelétrica incluem eletroforese de luxo livre,eletroforese por focalização isoelétrica, ou concentração cromatográfica ou outra separaçãomediada por fase sólida facilitada por se fazer escorrer pela fase sólida um sistema detampão que tem o seu pH alterando com o decorrer do tempo.

Na eletroforese de focalização isoelétrica, uma amostra de interesse é injetada ouadministrada diretamente em uma placa de gel, filtro ou outro meio contendo um gradientede pH imobilizado.

O gradiente de pH corre paralelo à direção do campo elétrico e a(s) proteína(s) naamostra são separadas uma da outra por migração, em uma direção, através dos ambientesde pH diferentes antes de atingir o ambiente de pH que é equivalente ao seu pl.Uma vez atingido o seu pl, a proteína se imobilizará no interior do material dematriz. Neste ponto, uma amostra pode ser obtida do material de matriz e ser utilizada emanálises adicionais tais como eletroforese sobre gel poliacrilamida de dodecil sulfato desódio (SDS-PAGE) (Zuo et al.. Analytical Biochem. 284:266-218 (2000)), uma separação desegunda dimensão em um chip plano, (Becker et al., J. Micromech. Microeng. 8:24 28(1998)), um ensaio para a detecção da atividade enzimática tal como fluorometria, ou umensaio adequado para a medição de qualquer um dos parâmetros de DPP.

A eletroforese de fluxo livre é um método de eletroforese que não usa nenhumamatriz sólida tal como géis de acrilamida na eletroforese tradicional ou as fases deseparação usadas em cromatografia. Em vez disso, os análitos são separados de acordocom a sua carga e/ομ mobilidade eletroforética em um fluxo laminar contínuo ou em soluçãotampão em um campo elétrico aplicado perpendicularmente à direção do fluxo.

Um exemplo de uma máquina que executa a eletroforese de fluxo livre é o BD™Free Flow Electrophoresis System (Becton Dickenson modelo #441117). Com a utilizaçãodeste sistema, as amostras discriminadas são coletadas em 96 capilares na extremidade deuma câmara de separação, que permite que o fracionamento contínuo flua para dentro deuma divisão de coleta em que a corrente que sai permanece fisicamente separada em umamultiplicidade de frações. Este método é adequado para a separação de amostras por meiode pelo menos três princípios de separação: focalização isoelétrica (IEF), Eletroforese zonal(ZE) e isotacoforese (ITP). Uma vez coletadas, as frações podem ainda serem analisadaspor meio de qualquer um dos ensaios descritos para uso depois da focalização isoelétrica,isto SDS-PAGE, separação de segunda dimensão em um chip plano e ensaios de atividadeenzimática.

A discriminação e a medição não são limitadas a qualquer ordem específica. Adiscriminação pode ter lugar antes ou depois da medição do parâmetro, ouconcomitantemente com a medição. A DPP específica, por exemplo, pode ser fisicamenteseparada em porções usando-se um método tal como eletroforese, podendo então sermedido um ou mais parâmetros de algumas ou de todas as porções.

Alternativamente, quando a medição e a discriminação são conduzidasconcomitantemente, a DPP específica pode ser discriminada em porções colocando-se aamostra de paciente, por exemplo, em contato com anticorpos específicos para isoformasdiferentes de DPP, ligado cada um dos anticorpos a um rótulo diferente detectável,enquanto os sinais provenientes dos rótulos detectáveis estão sendo medidos.

Em uma outra modalidade, as porções ou isoformas podem ser discriminadasusando-se um sistema de detecção dual. As isoformas de DPP podem ser colocadas emcontato, por exemplo, com um anticorpo ligado a uma fase sólida que se liga a todas asisoformas de DPP ou à maioria delas e um ou mais anticorpos ou Iectinas específicos parauma porção menor de isoformas de DPP. Cada um dos anticorpos mais específicos oulectinas contém um rótulo detectável singular. As isoformas podem ser colocadas emcontato tanto com os anticorpos como com o anticorpo e Iectinas simultaneamente, ou emqualquer série, colocados em contato com o anticorpo ligado e em seguida com oanticorpo/lectina mais específico ou com o anticorpo/lectina mais específico e em seguidacom o anticorpo ligado.

A DPP pode ser discriminada em duas ou mais porções. O número de porçõesdepende do grau de discriminação desejado e do método de discriminação conduzido. Nãohá uma limitação ao número de porções em que a DPP pode ser discriminada, mas, a DPPpode ser discriminada, por exemplo, em 2 ou mais porções, tais como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 18, 24, 36, 48, 96, 100, 200, 300, 384, 400, 500 ou 1536 porções. Em algumasmodalidades, por exemplo, é conveniente se discriminar as isoformas de DPP em 96porções, por exemplo, para permitir o manuseio e medição de parâmetros em placas padrãode 96 poços.

Para uma discriminação completa de isoformas, cada porção de DPP deve conternão mais de uma isoforma de DPP e algumas porções podem não conter nenhuma isoformade DPP. Para a discriminação parcial de isoformas, pelo menos uma porção de DPP deveconter mais de uma isoforma de DPP, ao passo que as demais porções podem não conternenhuma isoforma de DPP, uma isoforma de DPP ou mais de uma isoforma de DPP.

Em determinadas modalidades da invenção, as amostras de pacientes são obtidasde um indivíduo em mais de um ponto no tempo. Tal coleta de amostras "em série" é muitoadequada para a determinação do aparecimento precoce de uma doença, antes daocorrência de anormalidades médicas típicas, e facilita, portanto, estratégias terapêuticasremediais mais precoces que podem levar a um controle mais efetivo da doença ou mesmoa evitar a doença. Tal coleta de amostras em série é também muito adequada para osaspectos da invenção relacionado com a monitoração do progresso de uma doença, dediabetes do tipo II, por exemplo, em um paciente. Isto é especialmente útil para se avaliar aeficácia de qualquer tratamento ao qual o paciente pode ser submetido em conexão com adoença. A coleta de amostras em série, ou a coleta repetida de amostras pode também serútil para a determinação do risco individual para o desenvolvimento da doença ou condição.

A coleta em série de amostras pode ser conduzida em qualquer regime de tempodesejado, tal como em regime horário, semi-diário, diário, semanal, mensal, trimestral (istoé, a cada três meses), semi-anual, anual, bienal, ou menos freqüentemente, a comparaçãoentre os níveis medidos e o nível de referência pode ser conduzida a cada vez em que umanova amostra é medida, os dados referentes aos níveis podem ser mantidos para umaanálise menos freqüente.A medição ou a discriminação tem lugar, de preferência, ex vivo ou in vitro. em umamodalidade, tanto a medição como a discriminação tem lugar ex vivo.

Conforme observarão os versados na técnica, os métodos descritos no presentedocumento podem incluir a medição de qualquer uma de uma variedade de parâmetros deDPP ou não de DPP (que podem ser ou não parâmetros relacionados com a doença) parase determinar a integridade e/ou as características da amostra de paciente. Os níveis deestrogênio que são geralmente mais altos em mulheres, por exemplo, podem ser medidoscomo marcadores de gênero ou outras medições químicas do sangue tais como níveis decolesterol.

Outros parâmetros não de DPP relacionados com doença podem ser medidos, paraa confirmação do diagnóstico ou do prognóstico. Em algumas modalidades, o parâmetro nãode DPP é nível de hemoglobina A1C e a doença é diabetes. Os níveis de hemoglobina A1Cabaixo de 7% da hemoglobina total indicam a ausência de diabetes; níveis acima de 7% dahemoglobina total indicam a presença de diabetes. O parâmetro não de DPP pode sermedido antes ou depois do parâmetro de DPP ou ele pode ser medido simultaneamente.

Para se correlacionar o parâmetro de DPP medido com um estado ou condiçãomórbido, o parâmetro de DPP medido pode ser comparado com uma referência, isto é, umcom um controle padrão ou com um controle interno. Um aumento, redução ou desvio noparâmetro de DPP, quer individual quer aditivamente, em comparação a uma referência,quer positiva quer negativa, pode ser correlacionado com um estado mórbido.Alternativamente, o parâmetro de DPP de uma porção das enzimas discriminadas pode sercomparado com o parâmetro de uma outra porção de enzimas discriminadas ou ele podeser comparado com a medição total de duas ou mais porções discriminadas.

Naturalmente, o parâmetro medido deve ser comparado com um parâmetrocorrespondente. Se for medida a quantidade de DPP, por exemplo, então o valor para aquantidade de DPP deve ser comparado com o valor para a quantidade de DPP de umareferência ou de uma outra porção. Se for medida a expressão de DPP, ela deve sercomparada com a expressão de DPP de uma referência ou de uma outra porção.

Em determinadas modalidades, é medido o parâmetro de uma faixa contínua deporções. Para isoformas separadas com base no ponto isoelétrico, por exemplo, podem sermedidos um ou mais parâmetros de duas ou mais porções que se separam em pHs oupontos isoelétricos adjacentes.

Um perfil do(s) parâmetro(s) medido(s) pode ser obtido com base na faixa contínuade porções. Alternativamente, pode ser obtido um perfil do(s) parâmetro(s) medidos combase nas medições de uma faixa não contínua de porções. O perfil pode ser baseado emtodas as porções, ou ele pode ser baseado em um subconjunto de porções. As diversascomparações que podem ser feitas entre as diversas porções para determinar a correlaçãocom o estado mórbido são numerosas. As técnicas para a análise dos dados para os quaiso parâmetro medido ou para a comparação dos dados com outros dados são bemconhecidas dos versados na técnica. Conseqüentemente, todas tais técnicas não sãodiscutidas em detalhes no presente documento. Uma técnica exemplar para a análise dosdados para se tirar a conclusão desejada (isto é, a presença ou ausência de um estadomórbido) é ilustrada referindo-se ao gráfico na Figura 14. Na Figura 14, o eixo de y ilustra onível de um parâmetro de DPP (atividade, expressão, quantidade, concentração, tipo ouquantidade de modificação pós-traducional). O eixo de χ ilustra a dimensão de discriminação(pl, pH, ou tipo de isoforma, por exemplo).

Com referência ao gráfico, são destacadas três áreas, a área "a", a área "b" e aárea "c". Para cada área, a medição total dentro de certos limites (área sob a curva parauma faixa dada, por exemplo) pode ser medida dando-se valores "a" e "b", totalizando ovalor "c". Outros valores que podem ser medidos incluem valor de pico dentro dedeterminados limites,ponto ao qual o valor de pico é atingido dentro de determinados limites,atividade específica em qualquer ponto dentro dos limites (a um pl ou pH específico, porexemplo), os pontos nos quais o parâmetro medido aumenta ou diminui (um ponto deinflexão, por exemplo), desvios em parâmetro medido ao longo do eixo de χ em comparaçãocom outras medições e qualquer combinação sua. Os valores podem ser calculados combase em um perfil obtido por medição de uma faixa contínua de porções ou eles podem sercalculados com base nas medições de uma única porção ou de uma multiplicidade deporções.

A fim de se correlacionar um estado mórbido com uma das medições, poder-se-iacomparar um valor(es) de faixa "a" com o(s) valor(es) de faixa "b"; o(s) valor(es) da faixa "a"com o(s) valor(es) da faixa "c"; o(s) valor(es) da faixa "b" com o(s) valor(es) da faixa "c"; o (s)valor(es) da faixa "a" com um controle interno ou padrão; o(s) valor(es) "b" com um controleinterno ou padrão; e/ou o(s) valor(es) da faixa "c" com um controle interno ou padrão.

Alternativamente, medições quantitativas descontínuas dentro de quaisquer limitesou qualquer relação de tais medições quantitativas associadas com uma dimensão dada oudimensões dadas de discriminação podem ser feitas e comparadas a valores de referênciaconhecidos ou faixas de valores conhecidos para tais medições, tendo a faixa de referênciasido estabelecida por testes clínicos para fornecer uma escala pela qual se determina apresença, ausência ou gravidade da doença. As medições quantitativas podem também sersuplementadas pela inclusão de um padrão interno ou externo, conduzidas ousimultaneamente ou em série com a dimensão de discriminação (discriminações deisoformas, por exemplo) que pode ser usado para normalizar a leitura quantitativa com asfaixas de referência pré-estabelecidas.Conforme empregado no presente, o termo "padrão" se refere a um valor,geralmente uma média, valor médio ou mediano, obtido de um segmento da população. Opadrão pode ser um padrão positivo, ou um padrão negativo e pode ser obtido de umapopulação de mesma idade. As populações de mesmas idades (a partir das quais podemser obtidos valores padrão) são idealmente da mesma idade que os indivíduos que estãosendo testados, mas são também aceitáveis populações com as aproximadamente iguais.

As populações com as idades aproximadamente iguais podem se encontrar dentro de umatolerância de 1-20 anos, incluindo, aproximadamente 1, aproximadamente 5,aproximadamente 10, aproximadamente 15 ou aproximadamente 20 anos de distância daidade do indivíduo testado, ou podem consistir em grupos de diferentes idades queabranjam a idade do indivíduo que estiver sendo testado. As populações com as idadesaproximadamente iguais podem ser em incrementos de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 anos (umgrupo com um incremento de 5 anos, por exemplo, que serve de fonte para os valorespadrão para um indivíduo de 62 anos de idade, inclui indivíduos de 58-62 anos de idade,indivíduos de 59-63 anos de idade, indivíduos de 60-64 anos de idade, indivíduos de 61-65anos de idade, ou indivíduos de 62-66 anos de idade).

Um padrão positivo se refere a um valor, um valor médio, por exemplo, que é obtidode um segmento da população com o estado mórbido específico. Um padrão negativo serefere a um valor, um valor médio, por exemplo, que é obtido de um segmento da populaçãosem o estado mórbido específico.

Conforme empregado no presente, o termo "controle interno" se refere a um valorobtido de uma amostra ou amostras de um único paciente ou grupo de pacientes cujoestado mórbido é conhecido. Um controle interno pode ser um controle positivo, um controlenegativo ou um controle de mesmo paciente. O controle interno pode ser um controlepositivo, por exemplo, de um paciente ou pacientes com o estado mórbido específico; ou elepode ser um controle negativo proveniente de um paciente ou de pacientes com o estadomórbido específico. Finalmente, um controle interno pode ser um valor obtido do pacientepara ser diagnosticado, ou de uma amostra derivada de um sítio físico diferente (isto é,sangue contra fígado, por exemplo), em um ponto diferente no tempo para se medir oprogresso da doença ou de duas ou mais amostras que tenham sido diferentementeprocessadas antes da medição ou coletadas em recipientes separados que possam ser domesmo tipo ou de tipos diferentes (dois tubos de plasma com EDTA, por exemplo, ou umtubo de plasma com EDTA e um tubo de soro).

O valor de controle interno pode ser obtido concomitante ou simultaneamente coma medição para o paciente a ser diagnosticado ou pode ser obtido em qualquer outraocasião.Os resultados da comparação entre o(s) valor(es) medido(sa) ou entre o(s)valor(es) medido(s) e o (s) valor(es) de referência são usados para diagnosticar ou auxiliarno diagnóstico ou prognóstico de uma doença, para estratificar pacientes de acordo com agravidade da sua doença ou para monitorar o progresso de uma doença em um pacienteespecífico. Conseqüentemente, se a comparação indicar uma diferença (isto é, um aumentoou diminuição) entre o(s) valor(es) medido(s) e o(s) valor(es) de referência quesugira/indique a doença, então o diagnóstico adequado é auxiliado ou estabelecido. Poroutro lado, se a comparação do(s) nível(eis) medido(s) com o(s) nível(eis) de referência nãoindicar diferenças que sugiram ou indiquem um diagnóstico de doença, então o diagnósticoadequado não é auxiliado ou estabelecido.

Quando é medido mais de um parâmetro de DPP relacionado com doença, masquando as diversas medições não sugerem ou indiquem unanimemente um diagnóstico dedoença, é usada a sugestão/indicação da "maioria" (quando o método utiliza quatroparâmetros de DPP relacionados com doença, por exemplo, três dos quais sugerem/indicama doença), Tal resultado seria considerado como sugerindo ou indicando um diagnóstico dedoença para o indivíduo.

O processo de se comparar um valor medido com um valor de referência pode serconduzido de qualquer modo conveniente adequado ao tipo de valor medido e valor dereferência para o parâmetro de DPP relacionado com diabetes em questão. "Medição" podeser conduzida usando-se técnicas de medição quantitativas ou qualitativas e o modo decomparação de um valor medido com um valor de referência pode variar dependendo datecnologia de medição empregada, quando é usado um ensaio qualitativo, por exemplo,para medir os níveis de atividade de DPP, os níveis podem ser comparados, comparando-sevisualmente a intensidade do produto de reação fluorescente, ou por comparação de dadosprovenientes de um espectrofotômetro (comprando-se os dados numéricos ou dadosgráficos, por exemplo, tais como gráficos de barras, derivados do dispositivo de medição,por exemplo). No entanto, espera-se que os valores medidos usados nos métodos dainvenção sejam mais habitualmente valores quantitativos (medições quantitativas deconcentração, por exemplo, tais como nanogramas de isoforma de DPP por mililitro deamostra, por exemplo, ou quantidade absoluta). Em outros exemplos, os valores medidossão qualitativos. Tal como ocorre com medições quantitativas, a comparação pode ser feitaexaminando-se os dados numéricos e examinando-se representações dos dados(examinando-se representações gráficas tais como gráficos de barras ou de linhas, porexemplo).

O processo de comparação pode ser manual (tal como o exame visual pelo usuáriodo método) ou ele pode ser automatizado, um dispositivo de ensaio (tal como umluminômetro para a medição de sinais quimioluminescentes), por exemplo, pode incluircircuitos e software que permita que ele compare um valor medido com um valor dereferência para o(s) parâmetro(s) de DPP. Alternativamente, um dispositivo separado (umcomputador digital, por exemplo) pode ser usado para comparar o(s) valor(es) medido(s) eo(s) valor(es) de referência. Os dispositivos automatizados para comparação podem incluirvalores de referência armazenados para o(s) parâmetro(s) de DPP relacionados comdoença que estiverem sendo medidos, ou ele podem comparar o(s) valor(es) medido(s) comvalores de referência que são derivados de amostras de referência medidas ao mesmotempo.

Em algumas modalidades, os métodos da invenção utilizam comparação "simples"ou "binária" entre o(s) nível (eis) medido(s) e o (s) nível(eis) de referência, a comparaçãoentre um nível medido e um nível de referência determina, por exemplo, se o nível medido ésuperior ou inferior ao nível de referência. Em algumas modalidades, qualquer diferença emvalor pode indicar doença.

Conforme empregado no presente, os parâmetros podem ser medidosquantitativamente (valores absolutos) ou qualitativamente (valores relativos). Os níveis do(s)parâmetro(s) de DPP relacionados com a doença respectivos para uma avaliação dadapodem se sobrepor ou não. Conforme descrito no presente documento, para algumasmodalidades, os dados qualitativos indicam um nível dado de estado mórbido (leve,moderado ou grave) e em outras modalidades, os dados quantitativos indicam um níveldado de estado mórbido.

Em determinados aspectos da invenção, a comparação é conduzida para sedeterminar a magnitude da diferença entre os valores medidos e de referência, comparando-se a diferença de "fator", por exemplo, ou a diferença de porcentagem entre o valor medidoe o valor de referência. Uma diferença de fator que é de aproximadamente 2 vezes abaixoou acima de alguma diferença de fator mínima sugere ou indica, por exemplo, a presença deuma doença. Uma diferença de fator pode ser determinada medindo-se a quantidadeabsoluta, concentração, atividade ou expressão de uma DPP e comparando-se com o valorabsoluto de uma referência, ou uma diferença de fator pode ser medida pela diferençarelativa entre um valor de referência e um valor de amostra em que nenhum valor é umamedida de quantidade, concentração, atividade ou expressão absoluta, e/ou nos casos emque os dois valores são medidos simultaneamente. Alternativamente, as diferenças de fatorpodem ser medidas no interior dos dados de teste propriamente ditos, comparando-se, porexemplo, a diferença de fator de "a" com "c". em comparação com a diferença de "b" com "c"ou qualquer outra tal relação de parâmetros mensuráveis no interior do sistema de ensaio.conseqüentemente, a magnitude da diferença entre o valor medido e o valòr de referênciaque sugere ou indica um diagnóstico específico dependerá do parâmetro específico queestiver sendo medido para produzir o valor medido e o valor de referência usado.Conforme descrito no presente documento, há uma correlação entre o perfil deatividade de DPP-IV obtido de uma faixa contínua de isoformas de DPP-IV separadas por ple a presença, ausência ou gravidade de diabetes do tipo II. Esta correlação é usada em ummétodo para o diagnóstico o prognóstico de diabetes do tipo Il que compreende a mediçãode um ou mais parâmetros de DPP-IV das porções de DPP-IV discriminadas provenientesde uma amostra de paciente, e a correlação do parâmetro de DPP-IV medido com apresença, ausência ou gravidade de diabetes do tipo Il no paciente, em determinadasmodalidades, o parâmetro de DPP-IV é atividade de DPP-IV. em determinadasmodalidades, as porções de DPP-IV são discriminadas com base em pl.

O parâmetro de DPP-IV pode ser comparado com um controle padrão populacionalou com um controle interno. Qualquer diferença de um controle populacional negativopadrão ou de um controle interno negativo pode ser correlacionado com a presença ou agravidade de diabetes. Quanto mais elevado o grau de diferença entre o parâmetro de DPP-IV medido e a referência negativa, tanto mais grave é o prognóstico, de modo análogo,qualquer diferença de um controle positivo populacional padrão ou de um controle internopositivo pode ser correlacionado com a ausência de diabetes. Conforme discutido acima, osparâmetros incluem atividade, quantidade, expressão ou concentração.

As porções de DPP-IV podem ser discriminadas por qualquer característica oumétodo descrito no presente documento, em modalidades exemplares, as porções de DPP-IV são discriminadas com base no pl. em determinadas modalidades, as porções de DPP-IVsão separadas por eletroforese de fluxo livre.

A Figura 10 mostra a comparação do perfil de atividade de DPP-IV entre porçõesde DPP-IV discriminadas por pl em plasma proveniente de um paciente sadio e de umdiabético. Os inventores da presente invenção mostraram que, em pacientes diabéticos, operfil de atividade de DPP-IV se desvia para um pH mais elevado. Qualquer diferença emperfil de atividade de DPP-IV em qualquer ponto ou pontos do valor proveniente de qualquerpaciente sadio mostrada aqui, ou qualquer diferença em perfil de atividade de DPP-IV emqualquer ponto ou pontos do valor obtido de um controle negativo interno ou de um padrãopopulacional, pode ser correlacionado com diabetes.

Portanto, um desvio no perfil de atividade de DPP-IV de qualquer padrão negativomostrado no presente documento ou de um padrão negativo populacional para um pH maiselevado é indicador de diabetes de modo análogo, um desvio em perfil de atividade de DPP-IV de um controle negativo interno para um pH mais elevado é indicador da presença dediabetes do tipo II. Quanto mais pronunciado o desvio em perfil de atividade, mais grave é adoença.

Um padrão positivo associado com uma medição extrema "oposta" de uma amostrasadia ou populacional, pode ser representado pela medição da isoforma mais extremadentro dos limites de pl em questão. Tal padrão positivo deve ser estabelecido, por exemplo,por tratamento da amostra de paciente com métodos químicos ou enzimáticos para removercompletamente toda glicosilação, no caso em que a ausência de todos os glicanosrepresente a condição mensurável de isoforma mais afastada das isoformas contidas emamostras típicas sadias. Deve se observar que uma isoforma extrema que resulta destetratamento pode nunca ser realmente possível dentro das amostras propriamente ditas, maspode ainda ser usada para se estabelecer os limites mais distantes possíveis de pH, com afinalidade de fornecer um controle mensurável para o ensaio. Como uma alternativa, estaisoforma positiva "extrema" poderia ser um controle externo que poderia ser medidoseparadamente ou ser medido depois de ser adicionado à amostra que estivesse sendoanalisada. Em determinadas modalidades, tal controle positivo poderia também ser usadopara auxiliar na normalização das medições da amostra resultantes.

Por "desvio" em atividade pretende-se dizer qualquer diferença em atividade deDPP-IV em uma ou mais porções de DPP-IV. O valor medido para a atividade de DPP-IV,por exemplo, pode diferir do da referência em somente uma porção discriminada, ou elepode diferir em algumas ou em todas as porções. As tendências no nível de atividade deDPP-IV, um nível mais elevado de atividade a pH mais elevado, por exemplo, sãoespecialmente úteis para a detecção de diabetes do tipo II.

Os pacientes diabéticos e pacientes sadios também apresentam dois picosprincipais em perfil de atividade de DPP-IV, quando a DPP-IV é discriminada com base empl. Os pacientes diabéticos tendem a apresentar picos a um pH de aproximadamente 4,4 e aaproximadamente 4,8. Cada um destes picos é associado com aproximadamente 10% dototal de atividade medida das isoformas discriminadas por pl. Os pacientes sadios tendem aapresentar picos a um pH de aproximadamente 3,9 e de aproximadamente 4,1.

"Pico" significa um de um pequeno número dos valores extremos locais para todosos valores medidos, cada valor é associado com uma porção discriminada. Um valor de picopode ser associado com uma porção discriminada ou um grupo de porções discriminadas.Esse valor pode, portanto, ser um valor descontínuo para uma porção única discriminada ouuma integração dos valores descontínuos para uma faixa de porções discriminadas, umperfil de valores como função de porções discriminadas, por exemplo, pode conter somenteum pico, ou ele pode conter mais de um pico. Em geral somente os 1, 2, 3, 4, ou 5 valoresde topo serão considerados picos. Opcionalmente, por exemplo, o pico pode ser valorcorrelato, de preferência no perfil ou na proximidade do perfil de uma multiplicidade devalores adjacentes, em que os valores se alteram de uma magnitude em ascensão parauma em queda.Portanto, um pico máximo em atividade de DPP-IV de isoformas de DPP-IVdiscriminadas por pl a um pH de 3,9 ou aproximadamente 3,9 e/ou a um pH deaproximadamente 4,1 pode ser correlacionado com a ausência de diabetes.

De modo análogo, um pico me atividade de DPP-IV de isoformas de DPP-IVdiscriminadas por pl a um pH de 4,4 ou de aproximadamente 4,4 e/ou a um pH deaproximadamente 4,8 pode ser correlacionado com a presença de diabetes. Picos queconstituem pelo menos aproximadamente 10% do total de atividade medida da faixacontínua de DPP-IV são especialmente úteis para a presença de diabetes. Quanto maiselevado for o pico ao pH de 4,4 ou de aproximadamente 4,4 e/ou a um pH de 4,8, tanto maisgrave é o diagnóstico.

A Figura 11 é um gráfico mostrando o perfil de atividade de DPP-IV cumulativa deisoformas discriminadas por pl provenientes de pacientes sadios e diabéticos, cada ponto nográfico representa a porcentagem cumulativa da atividade total como uma função do pHcrescente da faixa contínua das isoformas discriminadas. Conforme já foi explicado acima,as isoformas de DPP são discriminadas separando-se em porções discriminadasdescontínuas, sendo cada uma delas associada com uma faixa estreita específica de pH.

A Figura 12 mostra o pH ao qual a atividade cumulativa proveniente de porções deDPP-IV discriminadas por pl provenientes de pacientes individuais atingiu 90% da atividadetotal para a faixa medida, somando toda a atividade das porções de isoformas discriminadascomeçando na extremidade ácida da faixa de pH medida. Os pacientes sadios atingiram90% de atividade de DPP-IV para isoformas discriminadas a um pH de aproximadamente4,2 ou abaixo dele. Por outro lado, os pacientes diabéticos não atingiram 90% de atividadede DPP-IV para isoformas discriminadas a um pH de aproximadamente 4,4 ou abaixo. Aatividade cumulativa de DPP-IV proveniente de pacientes mais doentes não atingiu 90% dototal de atividade cumulativa de DPP-IV até serem levadas em conta as isoformas que sãodiscriminadas a pHs ainda mais elevados.

Portanto o pH ao qual a atividade cumulativa de porções de DPP-IV discriminadaspor pl provenientes de uma amostra atinge 90% do total da atividade da amostra pode serusado para correlacionar a medição da atividade de DPP-IV com doença. Portanto, se aporcentagem da atividade total de DPP-IV de todas as porções medidas da faixa contínuapresente nas isoformas discriminadas a um ponto isoelétrico associado com uma faixa depH a um pH de aproximadamente 4,4 ou abaixo dele não exceder aproximadamente 90%,então é detectada a presença de diabetes. Se pelo menos aproximadamente 10% daatividade total de DPP-IV de todas as porções medidas da faixa contínua estiverempresentes nas isoformas discriminadas a um ponto isoelétrico associado com uma faixa depH a um pH de aproximadamente 4,4 ou abaixo dele, então é detectada a presença dediabetes. Quanto mais elevado for o pH acima de pH 4,4 ao qual é atingida uma atividadede 90%, tanto mais grave é o prognóstico.

Se pelo menos aproximadamente 90% da atividade total de DPP-IV de todas asporções medidas da faixa contínua estiverem presentes nas isoformas discriminadas noponto isoelétrico associado com uma faixa de Ph a um Ph de aproximadamente 4,2 ouabaixo dele, então é detectada a ausência de diabetes. Se a porcentagem da atividade totalde DPP-IV de todas as porções medidas da faixa contínua presente nas isoformasdiscriminadas em um ponto isoelétrico associado com uma faixa de pH a um pH deaproximadamente 4,2 ou abaixo dele não exceder aproximadamente 10%, então édetectada a ausência de diabetes.

A Figura 13 mostra o pH ao qual a atividade cumulativa proveniente de porções deDPP-IV discriminadas por pl provenientes de pacientes individuais atingiu 60% da atividadetotal, somando a atividade de isoformas, a partir da extremidade ácida da faixa de pHmedida. Os pacientes sadios atingiram uma atividade de 60% de DPP-IV a um pH deaproximadamente 3,9. Por outro lado, os pacientes diabéticos não atingiram uma atividadede 60% de DPP-IV até um pH de aproximadamente 4,15 ou acima dele. A atividadecumulativa de DPP-IV proveniente de pacientes mais doentes não atingiu 60% da atividadetotal cumulativa de DPP-IV até se ter levado em conta as isoformas discriminadas a pHsainda mais elevados.

Portanto, o pH ao qual a atividade cumulativa proveniente de porções de DPP-IVdiscriminadas por pl provenientes de uma amostra atinge 60% da atividade total da amostrapode ser usado para correlacionar a medição da atividade de DPP-IV com doença. Assim,se a porcentagem da atividade total de DPP-IV de todas as porções medidas da faixacontínua presente nas isoformas discriminadas em um ponto isoelétrico associado com umafaixa de pH a um pH de aproximadamente 4,15 e abaixo dele não excederaproximadamente 60%, então é detectada a presença de diabetes. Se pelo menosaproximadamente 40% do total da atividade de DPP-IV de todas as porções medidas dafaixa contínua estiverem presentes nas isoformas discriminadas a um ponto isoelétricoassociado com uma faixa de pH a um pH de aproximadamente 4,15 ou acima, então édetectada a presença de diabetes. Quanto mais elevado for o pH acima do pH 4,15 ao qualé atingida uma atividade de 60%, mais grave é o prognóstico.

Se pelo menos aproximadamente 60% da atividade total de DPP-IV de todas asporções medidas da faixa contínua estiverem presentes nas isoformas discriminadas a umponto isoelétrico associado com uma faixa de pH a um pH de aproximadamente 3,9 ouabaixo dele, então é detectada a ausência de diabetes, se a porcentagem da atividade totalde DPP-IV de todas as porções medidas da faixa contínua presentes nas isoformasdiscriminadas a um ponto isoelétrico associado com uma faixa de pH a um pH deaproximadamente 3,9 ou acima dele não exceder aproximadamente 40%, então é detectadaa ausência de diabetes.

EXEMPLO 1

Usando-se a eletroforese de fluxo livre (FFE) (BD™ Free Flow ElectrophoresisSystem), separando-se as proteínas com base em carga foram separadas as isoformas deDPP-IV em porções e foram caracterizadas. O isolamento das isoformas da proteína épreferido para se examinar o papel das modificações específicas em atividade. A análise daatividade indica que um aumento em atividade específica se correlaciona com um aumentono pl da isoforma. Isto sugere que as modificações pós-traducionais podem representar umpapel na regulação da atividade de DPP-IV. FFE pode facilitar mais estudos que podemcorrelacionar a(s) modificação(ões) enzimáticas com estado mórbido.

FFE foi conduzida usando-se o BD™ Free Flow Electrophoresis System doseguinte modo: DPP-IV porcina foi obtida de Sigma™ (1-100 mg) forma diluídos (em geral a1:5) em um meio de separação de pH adequado, as proteínas diluídas foram entãocarregadas na entrada mais catódica de amostra da câmara de FFE Becton™ e separadaspor aplicação de 1200-1500V e 20-25 mA, com uma taxa de fluxo de meio de separação deaproximadamente 60 mL/h usando-se um gradiente de pH de 3-10.

Os tampões e meios de Focalização Isoelétrica (IEF-FFE) foram preparadOS deacordo com o protocolo dos fabricantes (Manual de aplicação Becton™ FFE ApplicationManual) usando-se condições nativas com um gradiente de pH de 3-10. A eletroforesesobre gel de poliacrilamida de focalização isoelétrica (PAGE) (IEF) foi conduzida com géisfeitos sob medida com T:4% ou utilizando-se Precoats™ (Serva) em branco equilibrados nafaixa adequada de pHs. Conduziu-se o tingimento com prata para se detectar as bandas deproteína e o resultado é mostrado na Figura 3.

Os ensaios de atividade foram conduzidos do seguinte modo: 45 //L do tampão deensaio (100 mM de Tris-Cl [pH 8,0]; 0,05% v/v DMSO) foram acrescentados a 5 μΐ deamostra de proteína, e o aumento em fluorescência foi medido como Tinitial. A atividade foiexpressa como o aumento em Unidades de Fluorescência Relativa (RFU)/min resultando dahidrólise do substrato GIy-Por-AMC (250 μΜ) a 30 0C. Os resultados são mostrados nasFiguras 2A e 2B.

A digestão das proteínas por tripsina foi conduzida pela excisão de bandas tingidascomo

Sypro Ruby que foram visualizadas em seguida a PAGE (IEF) ou SDS-PAGE e da digestãosubseqüente de acordo com as recomendações do kit (Pierce/Sigma).

A EM de Desorção/lonização por Laser Assistida por Matriz (MALDI) foi conduzidado seguinte modo: Os peptídeos foram digeridos "em gel", foram extraídos (conformeinstruídos) e limpos usando-se ZipTip® Pipette Tips (Millipore). Os peptídeos digeridos forammisturados a 1:1 com matriz (solução saturada de ácido a-ciano-4-hidróxi-cinâmico em 60%de acetonitrila) e pingados sobre um alvo de aço inoxidável (Bruker Daltonics).

Foram usadas Impressões Digitais de Massa de peptídeo de Tempo de Vôo (TOF)de MALDI inicial para a identificação das proteínas digeridas seguidas por identificação porTOF/TOF de peptídeos específicos (ambos usando Mascot). Os resultados sãoapresentados nas Figuras 4A e 4B.

Os experimentos descritos no Exemplo 2 seguiram o mesmo protocolo que foiapresentado no Exemplo 1, exceto que a amostra de proteína foi derivada de plasmahumano proveniente de pacientes sadios.

As amostras de plasma humano (anticoagulante EDTA) foram obtidas de doisindivíduos, e as isoformas de DPP-IV foram separadas em porções conforme descrito noExemplo 1. A atividade foi medida conforme descrito no Exemplo 1. Os padrões da atividadede DPP-IV foram examinados para se observar se existia um perfil de atividade similar aodas isoformas de DPP-IV porcina. Os resultados são apresentados nas Figuras 6A e 6B.

A partir dos resultados relatados nas Figuras 6A e 6B foi observado que umadispersão de atividade similar à observada com atividade de DPP-IV porcina para aatividade de DPP-IV em plasma humano. Foi observado um aumento da atividade a valoresmais elevados de pH (pH máximo de aproximadamente 5,2). Uma quantificação precisa daproteína (DPP-IV) seria necessária para a determinação da atividade específica.

Pelos Exemplos 1 e 2 foi demonstrado que isoformas de proteína podem serseparadas usando-se FFE (IEF) e é permitida uma caracterização bioquímica de isoformasseparadas. O modelo porcino de DPP-IV apresenta uma multiplicidade de isoformas(identificadas usando-se Espectrografia de Massa) que apresentam atividades específicasdiferentes. A DPP-IV humana (separada no plasma) apresenta uma tendência análogaquando analisada após FFE. As modificações pós-traducionais (PTMs) podem representarum papel na regulação da atividade específica de DPP-IV. A FFE pode facilitar aidentificação e as implicações de PTMs potenciais para isoformas individuais de DPP-IVassim como para outras proteínas.

DPP-IV foi medida do modo já descrito. Os resultados, apresentados nas Figuras6A e 6B quando comparados com os resultados provenientes dos experimentos com DPP-IV porcina indicam que a DPP-IV humana apresenta uma tendência de atividade similarquando analisada depois de FFE assim como a DPP-IV porcina analisada de modo análogo.

Tomado em conjunto, os resultados provenientes dos exemplos 1 e 2 sugerem queas modificações pós-traducionais (PTMs) podem representar um papel na regulação daatividade específica de DPP-IV e que FFE pode facilitar a identificação e implicação dePTMs potenciais para as isoformas individuais de DPP-IV assim como para outrasproteínas.EXEMPLO 3

Os experimentos Os experimentos descritos no Exemplo 3 seguiram o mesmoprotocolo apresentado no Exemplo 1, exceto que a amostra de proteína foi derivada doplasma humano e IEF foi conduzida com um gradiente de pH de 3-7. Mais especificamente,2 amostras de plasma humano tratado heparinizado foram obtidas, uma de uma pessoacom diabetes do tipo 2 ( nível de glicose de 538 mg/dL) e uma de uma pessoa sadia.

Os resultados, apresentados nas Figuras 7 e 8, indicam que o perfil da isoforma deDPP-IV juntamente com uma faixa isoelétrica mais elevada é apresentada pela amostradiabética.

EXEMPLO 4

O plasma proveniente de quatro pacientes sadios e cinco diabéticos foramdiscriminados por pl. FFE foi conduzida usando-se uma câmara de FFE BectonTM conformesegue: 25 /vL de plasma (diluído a 1:8) foram misturados com 25 μί. de glicerol, 25 μΐ deHPMC a 0,08%, 125 μΐ de Tampão de Separação pH 3-7.As proteínas diluídas foram entãocarregadas na entrada mais catódica da amostra da câmara de FFE Becton™, e separadaspor Focalização de Intervalo Isoelétrico (IIEF)-FFE usando-se condições nativas e umafaixa de pH 3-7 com a aplicação de 1200-1500V e 20-25 mA. IIEF-FFE foi conduzida a 10 0Ccom um tempo de residência num total de 64 minutos. Foi usada uma taxa de fluxo detampão de 50 mL/hora a intervalos de 5 minutos (5 minutos à frente e então 5 minutos paratrás) num total de 60 minutos. A aplicação da amostra foi feita a 6000 //L/hora durante 2minutos com uma taxa de fluxo de meio de 180 mL/hora durante a aplicação da amostra.

Depois da aplicação da amostra, aplicou-se a voltagem e a taxa de fluxo do meio foiajustada para fluir a 50 mL/hora a intervalos de 5 minutos (5 minutos à frente e então 5minutos para trás) numa total de 60 minutos. A amostra foi coletada depois da Separaçãopor Intervalo aumentando-se o fluxo de tampão à frente para 300 mL/hora durante 2minutos, fazendo uma pausa e coletando-se então durante 2 minutos em 96 poços. Aatividade de DPP-IV foi testada conforme delineado no Exemplo 1. Os resultados sãoapresentados nas Figuras 10 e 11.

Na Figura 10, as barras claras representam o valor obtido a cada pl de um pacientesadio, e as barras escuras representam o valor médio obtido a cada pl proveniente de umpaciente diabético.

Dois picos principais são observados nos pacientes sadios, a um pH deaproximadamente 3,9 e a um pH de aproximadamente 4,1. De modo análogo, foramobservados dois picos principais nos pacientes diabéticos a um pH de aproximadamente 4,4e a um pH de aproximadamente 4,8. O perfil do plasma diabético é desviado para um pHmais elevado ou para a direita do perfil plasmático de pacientes sadios.Neste exemplo, o Grupo 1 é constituído por pacientes sadios (S04, S11, S07 e s02)e o Grupo 2 por diabéticos diagnosticados: L205 - Glicose Sangüínea = -139 mg/dL; S09 -Glicose Sangüínea desconhecida; S08 - Glicose Sangüínea = -90 mg/dL, doença dopaciente é controlada com medicação; S01 - Glicose Sangüínea = ~150 mg/dL; e S139 -Glicose sangüínea: -350 mg/dL.

Uma alíquota do plasma de um paciente sadio foi dividida e a metade foidessialilada com neuraminidase e a outra metade deixada como controle. Cada porção foiseparada em condições descritas acima neste Exemplo e o perfil da isoforma foi medido poranálise enzimática. A remoção do ácido siálico resultou em um desvio do perfil de um pH deaproximadamente 4,0 para um de aproximadamente 5,0. Os resultados estão representadosem um gráfico de barras na Figura 9.

A dessialilação também resultou em um aumento de um fator de dois a três naatividade específica, conforme mostrado na Tabela 1

Tabela 1. Atividade específica de DPP-IV (mU/mg) de

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Prece que um excesso de sialilação reduz a eficácia (também conhecida como aatividade específica) de DPP-IV. portanto, uma das razões por que os pacientes comdiferentes estados mórbidos podem apresentar perfis diferentes de isoformas é devido àmodificação pós-traducional, tal como sialilação.

Para se explicar os gradientes reais de pH das múltiplas amostras, a leitura de pHpela porcentagem de atividade local (àquele pH) foram semi-integradas. em seguidaacrescentou-se a porcentagem de atividade juntamente com a faixa de pH. Isto éapresentado na Figura 1. Essencialmente, isso permite a visualização do pH ao qual éatingido um determinado "limiar" de atividade.

Os dados de pacientes sadios e dos diabéticos são apresentados a 60% na Figura12 e a 90% na Figura 13. Os pacientes sadios todos incidem muito de modo estreito a umpH de 4,2 para 90% de atividade; ao passo que os pacientes diabéticos todos incidem demodo disperso acima de pH 4,4, e a um pH mais elevado com o aumento da gravidade dadoença. Os pacientes sadios todos incidem estreitamente a um pH de aproximadamente 3,9para 60% de atividade; ao passo que os pacientes todos incidem de modo mais dispersoacima de pH 4,15.

Embora a invenção tenha sido descrita no presente documento com referência amodalidades específicas, deve ficas subentendido que estas modalidades são de cunhoilustrativo somente dos princípios e aplicações da presente invenção. Portanto deve ficarsubentendido que numerosas modificações podem ser introduzidas nas modalidadesilustrativa e que outros arranjos podem ser feitos sem que haja desvio do espírito e âmbitoda presente invenção conforme definida pelas reivindicações apensas.

Claims (73)

1. Método para o diagnóstico ou prognóstico de um estado ou condição mórbidaCARACTERIZADA por um parâmetro específico de dipeptidil peptidase (DPP)1 compreen-dendo:a medição de pelo menos um parâmetro de uma ou mais porções discriminadas deuma DPP específica proveniente de uma amostra de paciente; ecorrelação do parâmetro de DPP medido com a presença, ausência ou gravidadedo estado ou condição mórbida.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quecada porção contém uma ou mais isoformas de DPP.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de quecada porção contém uma isoforma de DPP.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queuma ou mais porções não contêm nenhuma isoforma de DPP, e outras porções contêm umaou mais isoformas de DPP

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oestado mórbido é selecionado do grupo que consiste em um estado mórbido metabólico,câncer, uma infecção viral e uma doença autoimune.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que oestado mórbido é diabetes do tipo II.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oparâmetro é selecionado do grupo que consiste em quantidade, concentração, atividade,expressão, tipo de modificação pós-traducional e quantidade de modificação pós-traducional.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que oparâmetro é atividade de DPP, e a medição é conduzida por meio de um ensaio que detectaa presença ou a quantidade de um produto de hidrólise da atividade de DPP sobre um subs-trato direta ou indiretamente detectável.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que aDPP específica é DPP-IV e o parâmetro é atividade de DPP-IV.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de queo substrato é X-Y-R1 em que X é qualquer aminoácido, Y é prolina, alanina ou arginina e R équalquer rótulo detectável.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo parâmetro é medido usando-se um anticorpo ou Iectina específico para uma ou mais iso-formas de DPP.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queé medido mais de um parâmetro de DPP.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quea amostra de paciente é selecionada do grupo que consiste em tecido, sangue, plasma, so-ro, saliva, lágrimas, muco, urina, fluido amniótico, fluido de junta sinovial, fluido seminal, flui-do cérebro-espinhal e suas combinações.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende ainda a comunicação da presença, ausência ou gravidade do estado mórbido aum operador.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de quea comunicação compreende a exibição do estado mórbido em um mio selecionado do grupoque consiste em uma tela eletrônica, uma tela digital, um substrato que pode ser impresso eum sinal audível.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende ainda discriminação de porções de DPP de um DPP específico presente naamostra de paciente.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de quea discriminação é conduzida antes da medição.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de quea discriminação é conduzida simultaneamente com a medição.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quea amostra de paciente é processada antes da medição.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de queo processamento é selecionado do grupo que consiste em homogeneização, diluição, con-centração, congelamento e suas combinações.

21. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de quea discriminação é conduzida por separação ou isolamento físico.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de quea discriminação é conduzida usando-se um formato isento de gel.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de queo formato isento de gel é selecionado do grupo que consiste em eletroforese de fluxo livre eeletroforese isenta de matriz.

24. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de queas porções de DPP são discriminadas com base no ponto isoelétrico de isoformas de DPP.

25. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de quehá pelo menos duas porções da DPP.

26. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quea correlação compreende a comparação do parâmetro medido ao parâmetro correspondentede um padrão.

27. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quea correlação compreende a comparação do parâmetro medido ao parâmetro correspondentede um controle interno.

28. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de queo parâmetro é medido para as pelo menos duas porções.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de quea correlação compreende a comparação do parâmetro de pelo menos uma porção do parâ-metro correspondente medido total para pelo menos duas porções.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de quea correlação compreende a comparação do parâmetro de pelo menos uma porção ao parâ-metro correspondente medido total para todas as porções.

31. Método, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de quea correlação compreende a comparação do parâmetro medido de pelo menos uma porçãoao parâmetro medido correspondente de pelo menos uma outra porção.

32. Método, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de quea correlação compreende a comparação do parâmetro medido total para duras ou mais por-ções ao parâmetro total correspondente de um padrão.

33. Método, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de quea correlação compreende a comparação do parâmetro medido total para duas ou mais por-ções ao parâmetro correspondente total de um controle interno.

34. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quea DPP específica é DPP-IV.

35. Método para o diagnóstico ou prognóstico de um estado ou condição mórbidaCARACTERIZADA por um parâmetro de dipeptidil peptidase (DPP), CARACTERIZADOpelo fato de que compreende:a medição de pelo menos um parâmetro de uma ou mais isoformas discriminadasde DPP a partir de uma amostra de paciente; ea correlação do parâmetro de DPP medido com a presença, ausência ou gravidadedo estado ou condição mórbida.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de queo estado mórbido é selecionado do grupo que consiste em um estado mórbido metabólico,uma infecção viral e uma doença autoimune.

37. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de queo parâmetro é selecionado do grupo que consiste em quantidade, concentração, atividade,expressão, tipo de modificação pós-traducional e quantidade de modificação pós-traducional.

38. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de queé medido mais de um parâmetro de DPP.

39. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de quea amostra de paciente é selecionada do grupo que consiste em tecido, sangue, plasma, so-ro, saliva, lágrimas, muco, urina, fluido amniótico, fluido de junta sinovial, fluido seminal, flui-do cérebro-espinhal e suas combinações.

40. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende ainda a presença, ausência ou gravidade do estado mórbido a um operador.

41. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende ainda a discriminação das isoformas de DPP na amostra de paciente.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADO pelo fato de quea discriminação é conduzida antes da medição.

43. Método, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADO pelo fato de quea discriminação é conduzida simultaneamente com a medição.

44. Método, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADO pelo fato de quea amostra de paciente é processada antes da medição.

45. Método, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADO pelo fato de quea discriminação é conduzida por separação ou isolamento físico.

46. Método, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADO pelo fato de queas porções de DPP são discriminadas com base no ponto isoelétrico das isoformas de DPP.

47. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de quea correlação compreende a comparação do parâmetro medido ao parâmetro correspondentede um padrão.

48. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de quea correlação compreende a comparação do parâmetro medido ao parâmetro correspondentede um controle interno.

49. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de quea correlação compreende a comparação do parâmetro de pelo menos uma isoforma ao pa-râmetro correspondente medido total para duas ou mais outras isoformas.

50. Método, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADO pelo fato de quea correlação compreende a comparação do parâmetro de pelo menos uma isoforma ao pa-râmetro correspondente medido total para todas as isoformas.

51. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de quea correlação compreende a comparação do parâmetro medido de pelo menos uma isoformaao parâmetro medido correspondente de pelo menos uma outra isoforma.

52. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de quea correlação compreende a comparação do parâmetro medido total para duas ou mais iso-formas ao parâmetro total correspondente de um padrão.

53. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de quea correlação compreende a comparação do parâmetro medido total para duas ou mais iso-formas ao parâmetro total correspondente de um controle interno.

54. Método para o diagnóstico ou prognóstico de um diabetes do tipo II,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:a medição de pelo menos um parâmetro de uma ou mais porções discriminadas deisoformas de DPP-IV provenientes de uma amostra de paciente; ea correlação do parâmetro medido com a presença, ausência ou gravidade de dia-betes do tipo II.

55. Método, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de quecada porção medida contém uma ou mais isoformas de DPP-IV.

56. Método, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de quecada porção medida contém uma isoforma de DPP-IV.

57. Método, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de queuma ou mais porções não contêm nenhuma isoforma de DPP-IV, e outras porções contêmuma ou mais isoformas de DPP-IV.

58. Método, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de queo parâmetro é selecionado do grupo que consiste em quantidade, concentração, atividade,expressão, tipo de modificação pós-traducional e quantidade de modificação pós-traducional.

59. Método, de acordo com a reivindicação 58, CARACTERIZADO pelo fato de queo parâmetro é a atividade de DPP-IV.

60. Método, de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de quea atividade de DPP-IV é medida por meio de um ensaio que detecta a presença ou a quanti-dade de um produto de hidrólise da atividade de DPP-IV sobre um substrato rotulado.

61. Método, de acordo com a reivindicação 60, CARACTERIZADO pelo fato de queo substrato é X-Y-R, em que X é qualquer aminoácido, Y é prolina, alanina ou arginina e R équalquer rótulo detectável.

62. Método, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de queo parâmetro é medido usando-se um anticorpo ou Iectina específico para uma ou mais iso-formas de DPP.

63. Método, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de queé medido mais de um parâmetro de DPP-IV.

64. Método, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de quea amostra de paciente é selecionada do grupo que consiste em sangue plasma, soro e suascombinações.

65. Método, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende ainda a comunicação da presença, ausência ou gravidade do diabetes do tipoII a um operador.

66. Método, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende ainda discriminação de DPP-IV em porções.

67. Método, de acordo com a reivindicação 66, CARACTERIZADO pelo fato deque, a discriminação é conduzida antes da medição.

68. Método, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de queas isoformas de DPP-IV são discriminadas com base no ponto isoelétrico.

69. Método, de acordo com a reivindicação 68, CARACTERIZADO pelo fato de queo parâmetro medido é a atividade de DPP-IV.

70. Método, de acordo com a reivindicação 69, CARACTERIZADO pelo fato de queé medida a atividade de uma série contínua de porções.

71. Método, de acordo com a reivindicação 70, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende ainda a obtenção de um perfil de atividade que se estende sobre a série contí-nua de porções.

72. Método, de acordo com a reivindicação 71, CARACTERIZADO pelo fato de quea presença de diabetes é correlacionada com uma característica do perfil de atividade sele-cionada do grupo que consiste em:a. a porcentagem da atividade de DPP-IV total de todas as porções medidas da fai-xa contínua presentes nas isoformas discriminadas em um ponto isoelétrico associado comuma faixa de pH a e abaixo de aproximadamente 4,4 não excede aproximadamente 90%;b. a porcentagem da atividade de DPP-IV total de todas as porções medidas da sé-rie contínua presentes nas isoformas discriminadas em um ponto isoelétrico associado comuma faixa de pH a e abaixo de aproximadamente pH 4,15 não excede aproximadamente 60%;c. pelo menos aproximadamente 10% da atividade de DPP-IV total de todas as por-ções medidas da série contínua estão presentes nas isoformas discriminadas em um pontoisoelétrico associado com uma faixa de pH a e acima de aproximadamente pH 4,4;d. pelo menos aproximadamente 40% da atividade de DPP-IV total de todas as por-ções medidas da série contínua estão presentes nas isoformas discriminadas em um pontoisoelétrico associado com uma faixa de pH a e acima de aproximadamente pH 4,15;e. um pico do perfil de atividade de DPP-IV a aproximadamente pH 4,4, sendo o pi-co associado com pelo menos aproximadamente 10% da atividade medida total da sériecontínua;f. um pico do perfil de atividade de DPP-IV a aproximadamente pH 4,8, sendo o pi-co associado com pelo menos aproximadamente 10% da atividade medida total da sériecontínua;g. um deslocamento no perfil de atividade de DPP-IV para um pH mais alto emcomparação com um controle negativo interno;h. um deslocamento no perfil de atividade de DPP-IV para um pH mais alto emcomparação com um padrão negativo; ei. suas combinações.

73. Método, de acordo com a reivindicação 71, CARACTERIZADO pelo fato de quea ausência de diabetes é correlacionada com uma característica de perfil de atividade sele-cionada do grupo que consiste em:a. pelo menos aproximadamente 90% da atividade de DPP-IV total de todas as por-ções medidas da série contínua se encontram presentes nas isoformas discriminadas emum ponto isoelétrico associado com uma faixa de pH a e abaixo de aproximadamente pH 4,2;b. pelo menos aproximadamente 60% da atividade de DPP-IV total de todas as por-ções medidas da série contínua se encontram presentes nas isoformas discriminadas emum ponto isoelétrico associado com uma faixa de pH a e abaixo de aproximadamente pH 3,9;c. a porcentagem da atividade de DPP-IV total de todas as porções medidas da sé-rie contínua presentes nas isoformas discriminadas em um ponto isoelétrico associado comuma faixa de pH a e acima de aproximadamente pH 4,2 não excede aproximadamente 10%;d. a porcentagem da atividade de DPP-IV total de todas as porções medidas da sé-rie contínua presentes nas isoformas discriminadas em um ponto isoelétrico associado comuma faixa de pH a e acima de aproximadamente pH 3,9 não excede aproximadamente 40%;e. um deslocamento em perfil de atividade de DPP-IV para um pH mais baixo emcomparação com um controle positivo interno;f. um deslocamento em perfil de atividade de DPP-IV para um pH mais baixo emcomparação com um padrão positivo; eg. suas combinações.