BRPI0708907A2

BRPI0708907A2 - toxina clostridium botulinum mutada por pegilação

Info

Publication number: BRPI0708907A2
Application number: BRPI0708907-4A
Authority: BR
Inventors: Juergen Frevert; Volker Specht
Original assignee: Biotecon Therapeutics Gmbh
Priority date: 2006-03-15
Filing date: 2007-03-15
Publication date: 2011-06-21
Also published as: KR20080106451A; US9186396B2; JP2009531026A; EP1994048A2; US20150166977A1; US8912140B2; CN101432296A; IL193777A0; RU2426739C2; ES2334283T3; US8003601B2; AU2007224669A1; US8298550B2; HK1128929A1; CN101432296B; ATE443078T1; DE502007001546D1; EP1994048B1; RU2008140368A; WO2007104567A2

Abstract

TOXINA CLOSTRIDIUM BOTULINUM MUTADA POR PEGILAçãO A presente invenção refere-se a uma toxina de botulinum modificada que apresenta uma cadeia pesada natural e uma cadeia leve modificada, caracterizada pelo fato de que a modificação da cadeia leve consiste no fato de que ela (i) no seu N-terminal possui um prolongamento da cadeia que na direção da extremidade de N-terminal para a extremidade C-terminal possui a estrutura -(C)~ n~-(tag)~ m~-(X)-,onde C é um resíduo de cisteina, tag é qualquer tag, e X é um resíduo de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, n é um número inteiro de 1 a 50, m é O ou 1 e 1 é O ou um número inteiro de 1 a 50, e que (ii) pelo menos um dos resíduos de cisteina no prolongamento da cadeia é acoplado a pelo menos uma cadeia PEG.

Description

"TOXINA CLOSTRIDIUM BOTULINUM MUTADA POR PEGILAÇÃO".

A presente invenção refere-se a toxinas botulínicas modificadas (BoNT) que emcomparação com as respectivas toxinas de botulinum nativas possuem uma estabilidademaior e, por conseguinte, um tempo de ação terapêutica mais longo. A presente invençãorefere-se também a composições farmacêuticas que contêm estas toxinas botulínicas modi-ficadas. Por fim, a presente invenção refere-se a ácidos nucléicos que codificam estas toxi-nas botulínicas modificadas.

Histórico da presente invenção.

Clostridium botulinum é uma bactéria de crescimento anaeróbica, formadora de es-poros que desenvolve uma proteína altamente tóxica. Esta chamada toxina botulínica é acausadora do botulismo, uma intoxicação alimentar que sem a aplicação de tratamentos damedicina intensiva pode levar o paciente de botulismo à morte. Há sete diferentes sorotipos(tipo A a G, brevemente denominados de BoNT/A, BoNT/B, etc.) que possuem uma se-qüência de aminoácido semelhante, mas que induzem respostas de anticorpos diferentes.

As toxinas (a seguir também denominadas de neurotoxinas e de toxinas botulínicas) consis-tem de duas cadeias funcionais, a cadeia leve (~ 50 kD) e a cadeia pesada (~ 100 kD) queem algumas cepas de clostrídeos surgem através da divisão proteolítica da proteína precur-sora de cadeia única. Outras cepas não possuem a respectiva protease, portanto, a divisãopara formar as cadeias somente acontece no trato gastrintestinal do paciente (por exemplo,através da tripsina). Na forma de duas cadeias, as subunidades (isto é, a cadeia leve e acadeia pesada) são unidas uma à outra através de uma ponte de dissulfeto (além disso, porexemplo, em BoNT/A, existe uma ponte de dissulfeto intramolecular, isto é, entre dois resí-duos de cisteína da cadeia pesada).

As neurotoxinas puras não existem livremente in vivo em condições ácidas, masjunto com outras proteínas produzidas por Clostridium formam complexos, os chamadoscomplexos de toxina (Clostridium botulinum). Nestes complexos participam diversas proteí-nas, entre outros, com propriedades hemoaglutinantes. A composição dos complexos distin-gue-se de sorotipo para sorotipo. A integração em um complexo protege a neurotoxina napassagem através de estomago e intestino. Possivelmente, estas outras proteínas produzi-das por Clostridium (as formadoras de complexos ou proteínas de complexo) também parti-cipam na reabsorção da neurotoxina. A inclusão no complexo, portanto, faz com que a neu-rotoxina seja oralmente biodisponível e, portanto, uma toxina alimentar. O local da ação daneurotoxina encontra-se na placa final motora, onde o músculo é ativado pelo nervo. O neu-rônio motor emite acetilcolina para a ativação do músculo. Esta emissão é impedida pelatoxina botulínica. A ação inibidora ocorre em três passos seqüenciais: ligação, translocação,proteólise. A cadeia pesada da toxina botulínica liga-se especificamente ao neurônio motor,e em seguida, é absorvida pela célula nervosa em endossomos. Antes do domínio de liga-ção, localizado no C-terminal da cadeia pesada, encontra-se no segmento N-terminal dacadeia pesada o domínio de translocação que, através de um mecanismo até agora nãoexatamente conhecido, transporta a cadeia leve para o citosol da célula nervosa, ou quepossibilita a translocação. No citosol a cadeia leve torna-se ativa como protease, ela divideespecificamente as chamadas proteínas SNARE. A especificidade proteolítica dos diversostipos de botulinum é mostrada na Tabela 1. Estas proteínas SNARE são responsáveis pelafusão das vesículas de secreção carregadas de acetilcolina com a membrana celular domotoneurônio. A divisão proteolítica de uma dessas proteínas SNARE impede a formaçãode um complexo de fusão e, por conseguinte, a emissão continuada de acetilcolina. O mús-culo afetado não é mais ativado. Músculos anteriormente hiperativos são paralisados.

Tabela 1

<table>table see original document page 3</column></row><table>

Este mecanismo de ação é aproveitado na terapia de um grande número de disto-nias ou espasmos que são caracterizados por uma emissão descontrolada de acetilcolina(por exemplo, blefaroespasmo, torcicolo, espasticidade). Para a terapia da distonia, quanti-dades extremamente pequenas da neurotoxina (na faixa de pg até ng) são injetadas nomúsculo hiperativo. A neurotoxina se difunde até a placa motora final e entra no citosol doneurônio, a fim de lá impedir a emissão de acetilcolina. Depois de 1 a 2 dias, o músculo éparalisado.

Diversas rugas na face surgem em virtude de espasmos de músculos que se en-contram abaixo da pele, isto é, também através de uma emissão descontrolada de acetilco-lina. Nesse caso, as toxinas botulínicas são aplicadas cosmeticamente: por meio de injeçãode quantidades extremamente pequenas de toxina botulínica as rugas podem ser elimina-das por cerca de três meses.

Atualmente, quatro medicamentos contendo as toxinas botulínicas, são aprovadospelas autoridades de fármacos: Botox® (Allergan), Xeomin® (Merz), Dysport® (Ipsen) eNeuroBloc® (Solstice Neurosciences). O Botox®, Xeomin®, e Dysport® são Iiofilizados detoxina botulínica tipo A (como complexo, neurotoxina ou complexo), o Botox® e o Xeomin®com respectivamente 10 unidades por frasquinho de injeção, o Dysport® com 500 unidades.O NeuroBloc® contém toxina botulínica tipo B (como complexo) com 5 000 ou 10 000 uni-dades em formulação líquida.

Os preparados são disponíveis como liofilizados, exceto NeuroBloc, que são re-constituídos em solução de sal de cozinha e, dependendo do preparado e da indicação, sãoinjetados nos respectivos músculos em doses ajustadas. Dentro de 48 horas, o músculotratado é paralisado. A ação dura cerca de três meses, depois precisa ser feita uma outrainjeção, se o músculo deve continuar paralisado, isto é, a distonia ser tratada. Até agora nãofoi claramente esclarecido quais os processos que controlam a diminuição da ação. Enquan-to a cadeia leve estiver ativa como protease, a respectiva proteína SNARE é dividida (porexemplo, SNAP 25, da cadeia leve da neurotoxina tipo A). Por conseguinte, sob estas con-dições, é impedida a fusão das vesículas de secreção com a membrana de plasma, e comisso, a emissão de acetilcolina. Se fosse possível manter a atividade de protease da cadeialeve na célula por um tempo mais longo, então também o tempo de ação de um medicamen-to correspondente seria prolongado.

Diferente de muitas substâncias ativas de baixo peso molecular, substâncias ativasde proteínas são caracterizadas por uma estabilidade consideravelmente menor. O períodode semidesintegração (HWZ) na circulação do sangue, em algumas substâncias ativas deproteína, por exemplo, é de apenas alguns minutos, de modo que o tempo de ação (tera-pêutica) é fortemente restringido, e dentro de um curto prazo precisa ser feita uma nova in-jeção. O período de semidesintegração pode ser prorrogado se for possível proteger a pro-teína contra processos de decomposição e de eliminação. Um caminho teoricamente possí-vel consiste em especial em proteínas eucarióticas em uma glicosidação maior (mais resí-duos de carboidrato) ou na adaptação das estruturas de carboidrato a glicoproteínas humanas.Um outro caminho que foi tomado em uma série de substâncias ativas aprovadas, é o entrela-çamento da proteína com polietilenglicol (PEG). O PEG pode ser ligado de maneira polivalenteaos resíduos de diversos aminoácidos, por exemplo, a Iisina (função de amino) ou resíduos decisteína (função SH). PEG aumenta o peso molecular da proteína, sem que surjam estruturasimunogênicas que induzam a formação de anticorpos contra a substância ativa. Pelo contrário,a pegilação diminui a imunogenicidade da substância ativa. Devido ao aumento do peso mole-cular, a proteína é eliminada mais lentamente e um aumento considerável do período de semi-desintegração no soro é obtido. Para se manter um determinado espelho do soro necessário,o medicamento precisa ser injetado com menor freqüência.

As substâncias ativas de proteína que sofreram pegilação já estão sendo processadasem alguns medicamentos aprovados (veja a Tabela 2). O uso de proteínas, parcialmente pe-quenas (por exemplo, Interferon a 2a: Mr = 19,3 kD) na forma originária, isto é, não modificada,mostrou que as proteínas são muito rapidamente eliminadas do soro. A pegilação produziu umpeso molecular claramente maior e assim, um período de semidesintegração no soro essenci-almente mais longo. Dessa forma, por exemplo, no caso de Interferon a 2a, o período de semi-desintegração do soro é de nove horas, a pegilação com uma cadeia PEG de 40 kD aumenta opeso molecular drasticamente e prolonga o período de semidesintegração de nove para 72horas.

Tabela 2:

<table>table see original document page 5</column></row><table>

A ligação com uma ou várias cadeias PEG1 entretanto, é sujeito a restrições:

1. A cadeia PEG preferencialmente não diminui ou modifica pouco a atividade biológi-ca da proteína modificada (em comparação com a proteína nativa, não modificada) (atividadebiológica pouco diminuída da proteína modificada, de acordo com a presente invenção, é umaatividade biológica da proteína modificada que corresponde a pelo menos 20 %, de preferên-cia, 30 a 40 % ou 50 a 70 % ou até a 75 a 95 % da atividade biológica da proteína nativa, nãomodificada). Mas em muitos casos, uma atividade diminuída é muito tolerável: a atividade anti-viral de interferon submetido a pegilação é de, por exemplo, 25 a 35 % do Interferon a 2b nãopegilado. Interferon a 2a pegilado possui até apenas 1 a 7 % da atividade da forma não pegi-lada.

2. Uma vez que um grande número de proteínas terapeuticamente usadas desdobra aação através da ligação a um receptor específico, a pegilação não influencia ou influencia pou-co a ação recíproca com o receptor (a ação recíproca pode ser prejudicada por exemplo, atra-vés de impedimento estéreo diretamente no domínio de ligação ou através de alterações daestrutura espacial da proteína que exercem uma influência sobre o domínio de ligação e, por-tanto, sobre a ligação).

3. Se a ação farmacológica da proteína terapêutica (também) for fornecida através deuma atividade enzimática (tal como, por exemplo, no caso da asparaginase), a pegilação prefe-rencialmente não restringe ou restringe pouco a atividade enzimática.A pegilação de toxina botulínica, de preferência, cumpre estes três critérios. Nisso, amodificação da toxina botulínica com PEG influência preferencialmente nem (a) o domínio deligação da cadeia pesada, nem (b) a atividade enzimática de cadeia leve, isto significa, a ca-deia PEG preferencialmente não inibe a ação recíproca do domínio catalítico na cadeia levecom o substrato (proteína SNARE). Diferente de outras proteases que dividem peptídeos cur-tos, as toxinas botulínicas exigem peptídeos mais longos como substratos. Dessa forma, umpeptídeo que serve como substrato para a toxina botulínica tipo B, preferencialmente possuiuma seqüência de cerca de 40 resíduos de aminoácidos da proteína SNARE VAMP 2. Peptí-deos com seqüências de SNARE mais curtas, na verdade também são divididas, porém comuma eficiência consideravelmente menor. O domínio de divisão na cadeia leve da toxina botulí-nica que possui um comprimento comparável à seqüência de reconhecimento de cerca de 40resíduos de aminoácidos, preferencialmente não é influenciada pela cadeia PEG. Tambémprecisa ser levado em consideração que além do domínio de divisão que é responsável pelocontato direto do substrato (proteína SNARE ou peptídeo com a seqüência SNARE de cercade 40 resíduos de aminoácidos) com a cadeia leve, ainda são necessários para a atividadeotimizada de toxina botulínica outros pontos de contato com seqüências afastadas do domíniocatalítico na cadeia leve. Assim sendo, foi comprovado que na cadeia leve de toxina botulínicatipo A há cinco outros pontos de contato para seu substrato SNAP 15: 4 "σ exosites" (AS 102-113, 310-321, 335-348, 351-358) e um "β exosite" (AS 242-259). O contato preferencialmentenão é impedido ou é pouco impedido através de uma conjugação da cadeia leve com PEG.Além disso, a parte C-terminal da cadeia pesada, o domínio de translocação, precisa ser apto afuncionar, isto é, precisa cuidar para que a cadeia leve seja transportada dos endossomos parao citosol. Este processo de transporte, indispensável para a ação, também pode ser inibidoatravés de impedimentos estéreos de uma cadeia leve pegilada, uma vez que o domínio detranslocação possivelmente é um poro na membrana de endossomos, através da qual nãopoderia ser passada uma cadeia leve pegilada "volumosa".

Em um pedido de patente US (2002/0197278) é descrito um acoplamento de PEG atoxina botulínica. O acoplamento serve para a diminuição da antigenicidade ou da imunogeni-cidade e para o aumento do peso molecular para reduzir a difusão. Para a seleção dos pontosapropriados (determinantes antígenos) ou dos resíduos de aminoácidos para a pegilação, aatenção é chamada para o trabalho de Bavari et al. (Vaccine 16: 1850-1856,1998). No trabalhosão mostradas seqüências da cadeia pesada de toxina botulínica que induzem anticorpos neu-tralizantes. No pedido de patente citado somente é indicado que (1) a pegilação deve ocorrerem ou perto de um ponto ou em ou perto dos pontos que agem como epítopo ou epítopos im-portantes, porém são distantes do domínio catalítico (isto é, distantes da cadeia leve), e que (2)PEG pode ser conjugado aos carboxigrupos ou aminogrupos livres terminais ou aos aminogru-pos de cadeias laterais de lisina. (3). Como outra possibilidade de introduzir PEG na toxina, ésugerido usar grupos SH de resíduos de cisteína que ocorrem naturalmente ou que são intro-duzidos especialmente, sendo que, porém, alerta-se contra essa variação (3), uma vez quepontes de dissulfeto entre a cadeia pesada e a cadeia leve da toxina botulínica tem um papelimportante na configuração espacial da molécula. Não é mencionado nenhum exemplo de on-de pode ser obtida a estrutura da neurotoxina pegilada ou em qual resíduo de aminoácido foicolocado uma molécula PEG e qual o tamanho dela.

Em um outro pedido de patente (WO 02/40506) que se refere à alteração da persis-tência, é sugerida a introdução, a alteração ou a retirada de pontos para a glicosidação in vivo,a fosforização in vivo e, principalmente, a miristilação in vivo, a fim de aumentar ou diminuir aestabilidade da toxina botulínica seletivamente. Indica-se uma série de tais pontos de modifica-ção potenciais que se encontram com uma distância clara das extremidades N-terminal e C-terminal na cadeia leve da neurotoxina. Adicionalmente devem ser embutidas seqüências nacadeia de polipeptídeo, onde enzimas celulares acoplam cadeias de carboidratos ou resíduosde fosfato ou miristilato à cadeia leve. Porém, faltam informações referentes a uma neurotoxi-na respectivamente modificada ou para sua produção.

Em um outro pedido de patente US (2003/0027752), um resíduo de peptídeo com umchamado motivo de Ieucina (por exemplo, XEXXXLL) é inserido na neurotoxina ou na cadeialeve a fim de aumentar a persistência da cadeia leve na célula nervosa. Através da equipaçãoda cadeia leve com este motivo pretende-se conseguir que seja localizada na membrana naproximidade do seu substrato. Além disso, é indicado um chamado "Tyrosine-based Motive"(YXXHy, Y = Tyrosin, HY = aminoácido hidrófobo) que depois da inserção da cadeia leve deveaumentar a persistência da mesma. Finalmente, o pedido de patente citado sugere uma toxinabotulínica tipo A modificada, onde a cadeia leve sofreu mutação (respectivamente de alaninapara Ieucina nas posições 427 e 428).

Diante do estado da técnica acima descrito, a presente invenção tem a tarefa de for-necer uma outra forma, ou uma forma concretamente descrita, da estabilização de toxina botu-línica de qualquer sorotipo, preferencialmente, porém, do tipo A, B e C1. Junto com isso, a tare-fa da presente invenção era então, fornecer variações / analogias estáveis das toxinas botulíni-cas naturais que em comparação com as toxinas botulínicas correspondentes não modificadasapresentam uma estabilidade in vivo maior. Isto significa primeiro que a atividade biológica (deacordo com a presente invenção, a atividade biológica é definida como atividade total, compre-endendo a atividade enzimática / catalítica da cadeia leve e a ligação necessária para tal daneurotoxina à célula alvo e a translocação da cadeia leve para dentro da célula alvo) da varia-ção / analogia da toxina botulínica, quando muito, deve ser diminuído pouco (veja a definiçãoacima) e preferencialmente não deve ser diminuída, e segundo, que a cadeia leve, apesar dasua modificação no seu local de ação, seja translocada para dentro do citosol dos motoneurô-nios.Diferente do pedido de patente US 2002/0197278, já mencionado acima, a tarefa queé a base do presente pedido de patente não pretende bloquear determinantes antigênicos,diminuir a antigenicidade das toxinas ou restringir sua difusão quando se afastam do local dainjeção.

Surpreendentemente, os inventores do presente pedido descobriram que a cadeia le-ve das toxinas botulínicas no seu N-terminal pode ser especificamente pegilada através daintrodução de pelo menos um resíduo de cisteína, sem que ao mesmo tempo a atividade bioló-gica (de acordo com a definição acima) das toxinas botulínicas seja prejudicada ou até mesmoinibida. Uma toxina botulínica assim pegilada destaca-se por uma estabilidade in vivo surpre-endentemente maior (aumento considerável do período de semidesintegração) e, por conse-guinte, um tempo de ação (farmacológica) prolongado.

O tempo de ação (terapêutica) das toxinas botulínicas naturais no paciente dependedo sorotipo. A toxina botulínica Tipo A destaca-se por ter o tempo de ação mais longo de cercade três meses. A toxina botulínica Tipo C tem mais ou menos a mesma duração como o tipo A,ao passo que a toxina botulínica Tipo B apresenta um tempo de ação um pouco menor. A açãoda toxina botulínica Tipo E e Tipo F é de respectivamente apenas duas semanas. O curto tem-po de ação destes dois tipos não permite a administração clínica para o tratamento de distoni-as. A presente invenção possibilita (1) o uso clínico de todas as toxinas botulínicas, tambémdaquelas que até agora somente tinham um efeito de somente curto tempo, e (2) uma terapiamais vantajosa com as toxinas já usadas em terapias dos tipos A e B, uma vez que estas nãoprecisam mais ser aplicadas a cada três meses, e sim, por exemplo, apenas a cada seis meses.

Descrição das figuras e seqüências.

A figura 1: Mostra uma lista dos oligonucleotídeos (SEQ ID NR: 1 a 14), que são usa-dos nas clonagens das toxinas recombinantes e fragmentos de toxinas. Seqüências de reco-nhecimento para endonucleases de restrição estão sublinhadas. As seqüências longas com osSEQ ID NR: 16 e 15 são exemplos para uma neurotoxina de botulinum Tipo A recombinante(modificada) com um resíduo de cisteína N-terminal de um histidina-tag acoplado (consistindode dez resíduos de histidina) ou um DNA que codifica para este. O resíduo de prolina no N-terminal da toxina nativa exprimida de modo monocistrônico e transladada (posição 1) foi subs-tituída por um resíduo de alanina, a fim de criar uma interface na Multi Cloning Site (MCS) dovetor. O vetor compreende a seqüência que codifica para o his-tag, isto é, exatamente na vizi-nhança de 5' desse MCS. Além disso, no lugar do Ioop nativo entre a cadeia leve e a cadeiapesada já foi introduzida uma seqüência que é reconhecida por células E. coli devido a que opré-peptídeo nativo (N-cadeia leve - loop - cadeia pesada-C) já antes da produção recombinan-te da neurotoxina e sem acréscimo de proteases exógenas é dividido na neurotoxina de duascadeias, e mantido como tal.A figura 2 mostra a análise da preparação de pegilação e de controle de C-H10-BoBT/A (exemplo 5) no gel de SDS-poliacrilamida sob condições não reduzidas. Trilha 1: Mar-cador de peso molecular; Trilha 2: Preparação de controle; Trilha 3: Preparação de pegilação.

Descrição da presente invenção.

A fim de cumprir a tarefa colocada (veja acima), os inventores desenvolveram toxinasbotulínicas modificadas. Portanto, um aspecto e objeto da presente invenção é uma toxina bo-tulínica modificada que possui uma cadeia pesada natural e uma cadeia leve modificada, sen-do que a modificação da cadeia leve significa: (1) que ela no seu N-terminal possui um prolon-gamento da cadeia que em direção da extremidade N-terminal para a extremidade C-terminalpossui a seguinte estrutura:

-(C)n-(tag)m-(X)r,

onde

C é um resíduo de cisteína,

Tag é qualquer tag, por exemplo, um strep-tag ou um his-tag,

X é um resíduo de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente,

η é um número inteiro de 1 a 50,m é 0 ou 1

I é 0 ou um número inteiro de 1 a 50,

e (2) que pelo menos um dos resíduos de cisteína no prolongamento da cadeia é aco-piado a pelo menos uma cadeia PEG. Uma toxina botulínica modificada desse modo a seguirtambém é denominada de toxina botulínica ou neurotoxina pegilado que sofreu mutação.

De acordo com uma forma de execução preferida, as seguintes condições estão va-lendo:

η = 1, 2 ou 3, m = 0 ou 1, 1 = 0 ou 1 * 0,η = 1, m = 1, 1 = 0; η = 2, m = 1, 1 = 0; η = 3, m = 1, 1 = 0;η = 1, m = 0, 1 = 0; η = 2, m = 0, 1 = 0; η = 3, m = 0, 1 = 0;η = 1, m = 1,1* 0; η = 2, m = 1, 1 * 0; η = 3, m = 1, 1 * 0;η = 1, m = 0, 1 φ 0; η = 2, m = 0, 1 * 0; η = 3, m = 0, 1 * 0;

onde as toxinas por molécula são acopladas a uma, a duas ou a três moléculasPEG, dependendo se η = 1, 2 ou 3.

Portanto, às toxinas botulínicas modificadas acima mencionadas da presente in-venção pertencem preferencialmente àquelas toxinas botulínicas modificadas (em especialdos tipos A, B e C1), cuja cadeia leve é de tal modo modificada que esta, no seu N-terminal,possui um prolongamento da cadeia, onde a cadeia prolongada possui uma das seguintesseqüências:

-(CMtag)1-(X)0-, -(CHtag)1-(X)0-, -(C J3-(Iag)1-(X)0-, -(C)4-(Iag)1-(X)0-, -(C)5-(Iag)1-(X)o-,-(CMtag)1-(X)1-, -(CHtag)1-(X)1-, -(C )3-(tag)1-(X)1-, -(C)4-(Iag)1-(X)1-, -(CMtag)1-(Χ)1-.

-(C)1-(Iag)1-(X)2-, -(C)2-(Iag)1-(X)2-, -(C MtagJ1-(X)r, -(C)4-(Iag)1-(X)2-, -(CMtag)1-(X)2-,

-(CMtag)1-(X)3-, -(C)2-(Iag)1-(X)3-, -(C MtagJ1-(X)3-, -(CMtag)1-(X)3-, -(CMtag)1-(X)3-,

-(C)1-(Iag)1-(X)4-, -(CMtag)1-(X)4-, -(C Mtagy(X)4-, -(CMtag)1-(X)4-, -(CMtag)1-(X)4-, etc.

onde para cada uma das 25 formas de execução preferidas listadas, m no lugar de1 também pode ser 0, e/ou respectivamente todos os resíduos de cisteína que ocorrem noprolongamento da cadeia leve, também são pegilados.

Naturalmente 1 também pode ser qualquer número inteiro de 11 a 50, ou também su-perior a 50, em especial superior a 100 ou superior a 250. Por maior que seja 1, mais compridaserá a cadeia leve, sem que através de um determinado limite superior do comprimento dacadeia leve, sua atividade enzimática / catalítica ou a atividade (global) biológica (de acordocom definição acima) da neurotoxina seria colocada em risco. Mas, por motivos da praticidade,é indicado um limite superior para 1 entre 10 a 20, de modo que valores preferidos para 1 ficamna faixa de 1 a 10, quando 1 não é 0, especialmente preferido.

Cogitações correspondentes também se aplicam para n, sendo que seu limite superi-or, de acordo com a presente invenção, único e exclusivamente por motivos práticos e econô-micos, foi fixado em 50. Preferencialmente, η deve ser introduzido na faixa de 1 a 10, melhor,de 1 a 5, para não introduzir ou não ter de introduzir moléculas PEG demais (já que preferenci-almente todos os resíduos de cisteína introduzidos também são pegilados) e não tirar da toxinabotulínica / neurotoxina modificada pegilada resultante sua atividade biológica de acordo com adefinição acima. Isto pode acontecer facilmente quando são introduzidos resíduos de cisteína ede PEG demais ou quando resíduos de cisteína e de PEG são introduzidos em lugares erra-dos, uma vez que a cadeia leve eventualmente apesar da ligação da toxina à célula alvo, nãoseja translocada para a célula alvo.

A estrutura da toxina botulínica Tipo A foi publicada por Lacy & Stevens 1998 (Nat. S-truct. Biol 5, 898 a 902), a estrutura da toxina botulínica Tipo B foi publicada por Swaninathan &Eswaramoorthy (Nat. Struct. Biol 7, 693 a 699 (2000)). Assim sendo, também a estrutura dacadeia leve é conhecida e é possível verificar que áreas da cadeia pesada ou da cadeia leveencontram-se na superfície da proteína, e portanto podem ser apropriadas para uma ligaçãocom PEG. O modo de proceder freqüentemente escolhido, a ligação de um PEG apropriada-mente ativado (por exemplo, PEG- succinimidil propionato) ao ε-aminogrupo de resíduos delisina não pareceu interessante para os inventores. Um PEG ativado pode atacar em numero-sos resíduos de Iisina - também na área de ligação da cadeia pesada, o que, por experimento,produziu uma inativação drástica.

Em vez disso, os inventores identificaram resíduos de aminoácido da cadeia leve quesão apropriados para, primeiro, serem substituídos por pelo menos um resíduo de cisteína, eem seguida, ser pegilados no pelo menos um resíduo de cisteína introduzido. Também estastoxinas botulínicas modificadas, que serão caracterizadas mais adiante, são uma realizaçãopreferida da presente invenção, possuem como conjugados com PEG uma atividade biológicasuficiente (inclusive enzimática / catalítica) (que, de acordo com a definição, corresponde a pelomenos 20 %, preferencialmente a pelo menos 30 a 40 %, 50 a 70 % ou até mesmo 75 a 95 %da atividade biológica da proteína modificada), mostrando ao mesmo tempo uma estabilidadeaumentada (em comparação com as neurotoxinas nativas correspondentes), e em seguidatambém serão denominadas toxinas botulínicas ou neurotoxinas modificadas pegiladas da pre-sente invenção.

Estas toxinas botulínicas modificadas, mencionadas por último, da presente invençãotambém são conjugados de toxinas botulínicas modificados com PEG. Também estas toxinasbotulínicas modificadas são acopladas a PEG através de resíduos de cisteína introduzidos se-paradamente. Para tal, pelo menos um, mas eventualmente também 2, 3, 4, 5, 10 ou até mes-mo todos os 20 dos primeiros vinte resíduos de aminoácido da extremidade N-terminal da ca-deia leve da toxina botulínica correspondente são respectivamente substituídos por um resíduode cisteína. Estas toxinas botulínicas modificadas também apresentam uma cadeia pesadanatural e uma cadeia leve modificada, sendo que a modificação da cadeia leve justamenteconsiste em que pelo menos um até no máximo 20 dos resíduos de aminoácido que se encon-tram no seu N-terminal se modificam em um resíduo de cisteína. Eventualmente eles possuemadicionalmente um prolongamento N-terminal, de modo que a seqüência da cadeia leve nadireção da extremidade N-terminal para a extremidade C-terminal possui a seguinte estrutura:

-(tag)m-(X),-BoNT(XI-20C)

onde

C é um resíduo de cisteína,

tag é qualquer tag, por exemplo, um strep-tag ou um his-tagX é um resíduo de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente,

m é 0 ou 1

I é 0 ou um número inteiro de 1 a 50.

Pelo menos um dos no máximo 20 resíduos de cisteína no N-terminal está acoplado apelo menos uma cadeia PEG.

Para a BoNT/A resultam então mutantes que são caracterizados por pelo menos uma- e no máximo vinte - das substituições de resíduos de aminoácido seguintes, de modo quenos resíduos de cisteína introduzidos pode ocorrer uma pegilação:

P1C, F2C, V3C, N4C, K5C, Q6C, F7C, N8C, Y9C, K10C, D11C, P12C, V13C, N14C,G15C, V16C, D17C, 118 C, A19C, Y20C.

De acordo com uma forma de execução preferida valem as seguintes condições:

m = 1 = O1 apenas um dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal é substituído porum resíduo de cisteína, em especial apenas o resíduo na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;

m = 0, 1 = 0, apenas um dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal é substituído porum resíduo de cisteína, em especial apenas o resíduo na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;

m = 1, 1 φ 0, apenas um dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal é substituído porum resíduo de cisteína, em especial apenas o resíduo na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;

m = 0, 1 φ 0, apenas um dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal é substituído porum resíduo de cisteína, em especial apenas o resíduo na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;

m = 1 _ 1 = O1 apenas dois dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal são substituídospor um resíduo de cisteína, em especial apenas os resíduos nas posições 1 e 3, 1 e 4, 2 e 4, 1e 5, 2 e 5, 3 e 5,1 e 6, 2 e 6, 3 e 6 ou 4 e 6;

m = 0, 1 = 0, apenas dois dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal são substituídospor um resíduo de cisteína, em especial apenas os resíduos nas posições 1 e 3, 1 e 4, 2 e 4, 1e 5, 2 e 5, 3 e 5, 1 e 6, 2 e 6, 3 e 6 ou 4 e 6;

m = 1, 1 φ 0, apenas dois dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal são substituídospor um resíduo de cisteína, em especial apenas os resíduos nas posições 1 e 3, 1 e 4, 2 e 4, 1e 5, 2 e 5, 3 e 5, 1 e 6, 2 e 6, 3 e 6 ou 4 e 6;

m = 0, 1 φ 0, apenas dois dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal são substituídospor um resíduo de cisteína, em especial apenas os resíduos nas posições 1 e 3, 1 e 4, 2 e 4, 1e 5, 2 e 5, 3 e 5, 1 e 6, 2 e 6, 3 e 6 ou 4 e 6;

m = 1, 1 = O1 apenas dois dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal são substituídospor um resíduo de cisteína, em especial apenas os resíduos nas posições 1 e 2, 2 e 3, 3 e 4, 4e 5, ou 5 e 6;

m = 0, 1 = 0, apenas dois dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal são substituídospor um resíduo de cisteína, em especial apenas os resíduos nas posições 1 e 2, 2 e 3, 3 e 4, 4e 5, ou 5 e 6;

m = 1, 1 φ 0, apenas dois dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal são substituídospor um resíduo de cisteína, em especial apenas os resíduos nas posições 1 e 2, 2 e 3, 3 e 4, 4e 5, ou 5 e 6;

m = 0, 1 φ 0, apenas dois dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal são substituídospor um resíduo de cisteína, em especial apenas os resíduos nas posições 1 e 2, 2 e 3, 3 e 4, 4e 5, ou 5 e 6;

sendo que as toxinas por molécula são acopladas a uma ou a duas moléculas PEG,dependendo de se apenas um ou dois resíduos de aminoácido foram substituídos por (um)resíduo(s) de cisteína N-terminal.Portanto, entre as toxinas botulínicas modificadas acima mencionadas da presente in-venção encontram-se preferencialmente aquelas toxinas botulínicas (em especial os tipos A, Be C1) cuja cadeia leve é de tal modo modificada que esta no seu N-terminal possui um prolon-gamento da cadeia, sendo que o N-terminal da cadeia leve prolongada possui uma das seguin-tes seqüências:

-(tag)r(X)o-BoNT(P1C), -(tag)r(X)o-BoNT(F2C), -(tag)r(X)0-BoNT(V3C), -(tag)r(X)0-BoNT(N4C), -(tag)r(X)o-BoNT(K5C),

-(Iag)r(X)1-BoNT(PIC), -(tag)r(X)rBoNT(F2C), -(Iag)1-(X)rBoNT(VSC), -(tag)r(X)rBoNT(N4C), -(tag)r(X)rBoNT(K5C),

-(tag)r(X)2-BoNT(P1C), -(tag)r(X)2-BoNT(F2C), -(tag)r (X)2-Bo NT(V3C), -(tag)r(X)2-BoNT(N4C), -(tag)r(X)2-BoNT(K5C),

-(tag)r(X)3-BoNT(P1C), -(tag)r(X)3-BoNT(F2C), -(tag)r(X)3-BoNT(V3C), -(tag)r(X)3-BoNT(N4C), -(tag)r(X)3-BoNT(K5C),

-(tag)r(X)4-BoNT(P1C), -(tag)r(X)4-BoNT(F2C), -(tag)r(X)4-BoNT(V3C), -(tag)r(X)4-BoNT(N4C), -(tag)r(X)4-BoNT(K5C),

sendo que para cada uma das 25 formas de execução preferidas acima listadas m emvez de 1 também pode ser 0, e/ou respectivamente todos resíduos de cisteína introduzidos porN-terminal também são pegilados.

É lógico que 1 também pode ser qualquer número inteiro de 11 a 50, ou também su-perior a 50, em especial superior a 100 ou superior a 250. Mas, por maior que seja 1, maiscomprida se torna a cadeia leve, sem que por meio de um determinado limite superior do com-primento da cadeia leve sua atividade enzimática / catalítica ou a atividade (global) biológica daneurotoxina no sentido da definição acima seria colocada em risco. Mas por motivos de pratici-dade convém um limite superior para 1 de 10 a 20, de modo que valores preferidos para 1 seencontram na faixa de 1 a 10, contanto que 1 não é, especialmente preferido, 0.

As seguintes explicações, salve outras explicações explicitas, valem para a toxinasbotulínicas modificadas da presente invenção, independentemente de se se trata da variaçãocom resíduos de cisteína introduzidos no prolongamento N-terminal da cadeia leve ou da varia-ção com resíduos de cisteína introduzidos na extremidade N-terminal da cadeia leve.

De preferência, a toxina botulínica modificada é uma toxina botulínica modificada de-duzida de BoNT/A, BoNT/B ou BoNT/C1, mas também pode ser uma toxina botulínica dos ti-pos D1 E, F ou G. Também é preferido que, por um lado, todos os resíduos de cisteína artifici-almente introduzidos (preferencialmente são introduzidos 1 a 10 resíduos de cisteína) apresen-tem pelo menos uma cadeia PEG, mas por outro lado, nenhum dos resíduos de cisteína queocorrem naturalmente na cadeia pesada e na cadeia leve da toxina botulínica seja pegilado.

O técnico entenderá sem dificuldade que o significado de tag (m - 1) se encontra napurificação mais fácil da toxina botulínica modificada produzida de modo recombinante (porexemplo, Ε. coli) da presente invenção. O tag então não será necessitado para aumentar aestabilidade da neurotoxina ou sua atividade biológica, e sim, possibilita o isolamento simplifi-cado e quase que quantitativa da toxina botulínica modificada da cultura das bactérias.

Na questão de uma seleção apropriada de η (no caso da variação com o / os resí-duo(s) de cisteína introduzidos no prolongamento N-terminal da cadeia leve) ou do número eposição dos resíduos de aminoácido a serem substituídos por resíduos de cisteína (no caso davariação com o / os resíduo(s) de cisteína introduzidos na extremidade N-terminal da cadeialeve) deve ser levado em consideração que preferencialmente apenas são introduzidos tantosresíduos de cisteína como devem ser feitas pegilações (o mesmo vale também para o caso,que 1 φ 0 e pelo menos um resíduo de aminoácido X é um resíduo de cisteína). Estes resíduosde cisteína introduzidos, preferencialmente todos eles podem ser pegilados, e pegilados com-pletamente, sem que, e isso é a descoberta surpreendente dos inventores, nenhum dos resí-duos de cisteína que ocorrem naturalmente na toxina botulínica, nem na cadeia pesada nem nacadeia leve, foi pegilado (além de cada vez uma ponte de dissulfeto intramolecular e intermole-cular, por exemplo, a toxina botulínica tipo A possui ainda três outros resíduos de cisteína nacadeia pesada (C79i, C967, C106o)> e dois outros resíduos de cisteína na cadeia leve (Ci34 eCies)). Dessa forma pode ser obtido um produto uniforme (homogêneo) na forma de uma toxinabotulínica modificada pegilada. Além disso, por uma outra razão, deve ser evitado que sejamintroduzidos demais resíduos de cisteína e resíduos de PEG ou que sejam introduzidos demaisresíduos de cisteína e resíduos de PEG em posição erradas. Isto, porque (i) a toxina possivel-mente se torna volumosa demais a fim de ligar a célula alvo e/ou (ii) a cadeia leve, eventual-mente apesar da ligação da toxina à célula alvo, não é translocada ou não é translocada namedida suficiente para dentro da célula alvo. Em outras palavras, a introdução de apenas umresíduo de cisteína, nessa ou naquela variação, e sua pegilação cumpre o objetivo de acordocom a presente invenção regularmente e, portanto, é especialmente preferido.

As toxinas de botulinum / neurotoxinas modificadas pegiladas de acordo com a pre-sente invenção, conseqüentemente, são biologicamente e enzimaticamente (isto é, catalitica-mente) ativas como as respectivas toxinas de botulinum / neurotoxinas naturais (nativas) ouapresentam no sentido da definição dada acima uma atividade biológica e enzimática / catalíti-ca no máximo pouquíssima reduzida, mas são mais estáveis, em parte até mesmo considera-velmente mais estáveis do que suas toxinas precursoras naturais, a partir das quais foram obti-das. Assim sendo, também é preferida uma toxina de botulinum modificada pegilada, cuja ca-deia leve mutada (modificada) pegilada apresenta no citosol dos motoneurônios uma estabili-dade maior do que a cadeia leve não modificada da respectiva toxina de botulinum nativa.

A pegilação da cadeia leve, conforme acima descrito, produz uma estabilidade eleva-da em comparação com a cadeia leve não modificada. A cadeia PEG, de acordo com a pre-sente invenção, é de tal modo acoplada na cadeia leve que (1) sua atividade enzimática é inal-terada ou no máximo pouquíssimo reduzida (de acordo com a definição dada), e (2) a cadeialeve modificada, como também a cadeia não modificada, é translocada para o citosol dos mo-toneurônios.

O his-tag assim como também outros tags, por exemplo, o strep-tag, possibilita um i-solamento simples da neurotoxina modificada do Iisato de bactérias transformadas (por exem-plo, E. coli). Ele é acoplado de modo mais simples no plano DNA em direção 5' da área codifi-cada do gene de neurotoxina. No caso do his-tag, o isolamento é feito por meio de cromatogra-fia de afinidade através de sefarose de Ni-NTA. A neurotoxina modificada assim isolada, nopróximo passo, é acoplada ao PEG ativado. A firma Nektar Therapeutics fornece uma série dederivados de PEG ativados, por exemplo, maleimida de PEG, vinilsulfona de PEG, iodoaceta-mida de PEG e dissulfeto ortopiridil de PEG, e fornece instruções para a pegilação. Estes deri-vados de PEG, de acordo com a presente invenção, podem possuir diferentes comprimentosde cadeias: por exemplo, derivados de PEG com pesos moleculares de 5 OOO Dalton, 10 000Dalton, 20 000 Dalton e 30 000 Dalton são comercialmente disponíveis e podem ser usados deacordo com a presente invenção.

Para a determinação da atividade de protease da toxina de botulinum modificada edepois pegilada, a dissociação da proteína SNARE que corresponde ao sorotipo, é determina-da quantitativamente. A atividade é então eventualmente comparada à atividade (i) da neuroto-xina nativa (do respectivo sorotipo), (ii) da neurotoxina modificada com tag para fins de isola-mento simplificado, e/ou (ii) da neurotoxina modificada sem tag. A atividade da neurotoxinamodificada e da neurotoxina pegilada modificada de acordo com a presente invenção é seme-lhante à atividade da neurotoxina nativa (não modificada), (isto significa, a atividade biológica,de acordo com a definição acima, da neurotoxina mutada e da neurotoxina modificada de acor-do com a presente invenção, em comparação com a atividade biológica da neurotoxina nativa,se muito, é pouquíssimo diminuída no sentido da definição acima).

A atividade global da neurotoxina mutada pegilada, primeiro é determinada em ummodelo ex-vivo, o chamado teste de diafragma ou hemidiafragma. Para tal é determinada aatividade paralisante em um preparado de nervo e músculo. De acordo com a presente inven-ção, a atividade biológica da neurotoxina modificada, isto é da neurotoxina mutada e depoispegilada, é de no mínimo 20 %, de preferência, de 30 a 40 % ou de 50 a 70 % ou até mesmode 75 a 95 % da atividade biológica da proteína não modificada (nativa), (atividade biológica,também neste caso, deve ser entendida de acordo com a definição acima).

A toxicidade da neurotoxina mutada pegilada de acordo com a presente invenção po-de der verificada no teste LD50 no rato, sendo que é determinada a dose que depois de umaaplicação i.p. é letal na metade de um grupo de ratos.

O tempo de ação da neurotoxina mutada, pegilada de acordo com a presente inven-ção, é determinada in vivo, também no rato. Depois da injeção de uma dose subletal dê umatoxina de botulinum tipo A mutada, pegilada de acordo com a presente invenção, ou da respec-tiva toxina de botulinum nativa no músculo gastrocnêmico da pata traseira é determinado otempo durante o qual o músculo permanece paralisado. A intensidade da paralise é classifica-da por meio de uma escala. O tempo de ação, que no rato é mais curto do que no homem, foiprolongando-se em dependência da toxina de botulinum tipo A modificada usada em 30 a 150% (medido em comparação com a toxina de botulinum tipo A não mutada e não pegilada).

A toxina de botulinum mutada pegilada de acordo com a presente invenção pode serprocessada em uma formulação apropriada para se tornar um medicamento pronto para seradministrado que contém uma dose (ou um múltiplo do número inteiro da dose) na faixa dedose terapêutica (por exemplo, 100 unidades de LD50 por frasco de injeção). De acordo comuma forma de execução preferida, a composição farmacêutica é estabilizada sem a adição desoroalbumina humano (HSA). Mas ela também pode ser estabilizada com soroalbumina huma-na (HSA). Neste sentido é especialmente preferido o uso de uma composição livre de HSApara a estabilização de substâncias ativas de proteína, como é descrito no documento WO2005/007185. De acordo com uma outra forma de execução preferida, a composição farma-cêutica da presente invenção está presente em forma Iiofilizada ou líquida. Ambas as formassão apropriadas, eventualmente depois da absorção de um solvente apropriado, para a injeçãoi. m. no músculo a ser tratado.

A toxina de botulinum mutada pegilada com estabilidade maior e período de semide-sintegração maior ou o farmacêutico que a contém pode ser usado para a terapia de diversasdistonias, como a distonia espasmódica, distonia de laringe, distonia cervical, distonia manualfocai, blefaroespasmo, estrabismo, parese cerebral, espasmos hemifaciais, espasticidade, coli-te espasmódica, anismo, RICS, tremores, fissura anal, acalasia, disfagia, hiper-hidrose e para aeliminação de rugas na face.

Outros aspectos da presente invenção referem-se (1) a um ácido nucléico que codificapara a toxina de botulinum modificada, detalhadamente descrita acima, com estabilidade maior(o ácido nucléico é especialmente DNA); (2) um vetor, compreendendo o ácido nucléico deacordo com (1); e (3) uma célula hospedeira compreendendo o vetor de acordo com (2) (a cé-lula hospedeira é especialmente uma célula procariótica, especialmente uma célula hospedeirade E. coli).

Os exemplos seguintes explicam a presente invenção detalhadamente, porém, semrestringi-la aos parâmetros específicos lá mencionados.

Exemplos.

Exemplo 1: Clonagem e expressão de neurotoxina de botulinum tipo A (BoNT/A)

Para a clonagem das seqüências de DNA da cadeia leve bem como do domínio detranslocação, ADN cromosomal foi isolada de uma cepa de Clostridium botulinum Tipo A (cepaATCC 3502). Através de amplificação por PCR com os primer SEQ IC NR: 1 e SEQ ID NR: 2foi obtido um fragmento de gene que codifica com seqüência de Ioop modificada para a cadeialeve de BoNT/A. O amplificado por PCR foi clonado através das interfaces de restrição paraNco I e Bgl Il para o plasmídeo de expressão pQE-H10 que foi derivado de pQE-60 e codificadopara um his-tag (consistindo de 10 resíduos de histidina) no lado 5' do ponto de clonagem.

Com essa clonagem, foi gerado o plasmídeo pQE-H10-BoNT/A-L. Por meio da amplificação porPCR com os primer SEQ ID NR : 3 e SQE ID NR : 4 foi obtido o fragmento de gene que codifi-ca para a cadeia pesada de BoNT/A. Através das interfaces de restrição para Stu I e Bgl Il elefoi clonado na extremidade 3' da seqüência de Ioop da cadeia leve em pQE-H10-BoNT/A-L(plasmídeo pQE-H10-BoNT/A). A cepa de expressão E. coli M15[pREP4] (Qiagen) foi transfor-mada com o plasmídeo pQE-Hi0-BoNT/A. A expressão da toxina recombinante aconteceu pormeio de indução graduada com 500 μΜ (concentração final) de IPTG a 25 0C durante a noite.

As células foram desintegradas em um estabilizador de 50 mM fosfato a pH 8.0 com 300 mMNaCI através de tratamento de Iisozima e ultra-som. O Iisato centrifugado foi incubado durante5 horas em temperatura ambiente e depois de armazenamento intermediário a 20 0C negativosfoi cromatografado através de uma coluna de agarose de Ni-NTA. Finalmente foi feita uma diá-Iise das frações de elusão contra um estabilizador de acoplamento (100 mM de fosfato de hi-drogênio de sódio pH 7.5, 150 mM de NaCI1 10 mM EDTA) e uma determinação da concentra-ção de proteína. Uma análise no gel- poliacrilamida SDS mostrou que através de Coomassiesob condições redutoras foram coloridas duas bandas fortes a aproximadamente 50 kD e 100kD, e uma banda fraca a 150 kD, ao passo que sob condições não redutoras foi observadaapenas uma banda a aproximadamente 150 kD que corresponde ao padrão de banda de umaneurotoxina de botulinum tipo A na sua estrutura predominantemente de duas cadeiras componte de dissulfeto.

Exemplo 2: Clonagem e expressão de neurotoxina de botulinum tipo B (BoNT/B).

A clonagem e a expressão de uma neurotoxina de botulinum tipo B de um N-terminaldotado de um histidina-tag (consistindo de 10 resíduos de histidina) foi feita analogamente à datoxina de tipo A. Para a amplificação de cadeia leve e da cadeia pesada foram usados DNAcromosomais de Clostridium botulinum tipo B (cepa Okra) e os primer SEQ ID NR: 5 e SEQ IDNR: 6 ou SEQ ID NR:7 e SEQ ID NR:8.

Exemplo 3: Clonagem e expressão de neurotoxina de botulinum tipo C1 (BoNT/CD.

A clonagem e a expressão de uma neurotoxina de botulinum tipo C1 de um N-terminaldotado de um histidina-tag (consistindo de 10 resíduos de histidina) foi feita analogamente à datoxina de tipo A. Para a amplificação de cadeia leve e da cadeia pesada foram usados DNAcromosomais de Clostridium botulinum tipo C (cepa 205) e os primer SEQ ID NR: 9 e SEQ IDNR: 10 ou SEQ ID NR:11 e SEQ ID NR:12.

Exemplo 4: Clonagem e expressão de C-Hin-BoNT/A.

A fim de possibilitar uma pegilação N-terminal, N-terminal de histidina-tag (consistindode 10 resíduos de histidina) um resíduo de cisteína foi adicionado à seqüência de aminoácido.Isto foi conseguido através de mutagênese dirigida na faixa de seqüência de pQE-H10-BoNT/Aque codifica para o his-tag. Para tal, foi usado o kit QuickChange Site Directed Mugenesis dafirma Stratagene. A reação mutagênese ocorreu com os primer SEQ ID NR: 13 e SEQ ID NR:14. A troca de nucleotídeos na seqüência de DNA foi verificada pela seqüência dos clones iso-lados. A expressão e purificação da toxina mudada foram feitas analogamente ao exemplo 1.

Exemplo 5: Peqilação de C-H-m-BoNT/A.

1.2 mg de C-H10-BoNT/A foram incubados, para fins de redução de dímeros com pon-te de dissulfeto, durante 30 minutos com 1 nM DTT. Para a separação do meio de reação, foiestabilizado através de uma coluna PD 10 para estabilizador de acoplamento. A solução detoxina foi concentrada até 3,6 mg/ml através de ultra-filtração. Uma pequena parte foi incubadasem tratamento como amostra de controle, a solução restante foi misturada com um excessomolar de cinco vezes mPEG-Mal-5000 (Nektar Therapeutics) e rodado durante a noite a tem-peratura ambiente. Para evitar possíveis reações de derivação em outros resíduos de cisteínadurante a preparação da amostra para a SDS-PAGE, o agente de pegilação foi saturado comum excesso de 5 vezes de L-cisteína. No gel-SDS mostrou-se uma banda adicional forte commobilidade levemente diminuída, em comparação com a preparação de controle com aplicaçãonão redutora, ao passo que a intensidade da banda de toxina originária foi claramente reduzidaem 150 kD (figura 2).

Exemplo 6: teste de atividade in vitro.

A determinação da atividade de protease específica (isto significa, da atividade catalí-tica sem ligação ou translocação) dos derivados mutados pegilados foi feita em formato deELISA. Para tal foi clonado um polipeptídeo recombinante que na área N-terminal é compostopelo parceiro de fusão usual glutação-S-transferase (GST) e uma seqüência de peptídeos C-terminal, que compreende os 17 resíduos de aminoácido de SNAP-25 C-terminal. Estes 17resíduos de aminoácido representam a área da proteína de substrato SNAP-25 onde o BoNT/Adesintegra especificamente. Depois de revestir uma placa microtiter com a proteína de fusão,foi incubado com H10-BoNT/A como amostra de referência ou com os mutantes em forma pegi-lada e não pegilada. A detecção dos produtos de desintegração respectivamente gerados comum anticorpo que reconhece especificamente o C-terminal recém surgido. Os valores para C-H10-B0NT/A na sua forma não pegilada e pegilada, e para H10-BoNTVA (amostra de referência)são listados na Tabela 3. Levando em consideração a faixa de oscilação do teste, pode seconstatar que através da introdução da mutação e seguinte pegilação, a atividade catalítica datoxina de botulinum não é reduzida, e sim, antes pelo contrário, foi elevada.

Tabela 3

<table>table see original document page 18</column></row><table><table>table see original document page 19</column></row><table>

A atividade específica foi determinada em unidades de protease / ng de proteína.

Exemplo 7: Determinação da atividade in vivo no teste de hemidiafraqma.

Para determinar a atividade global dos derivados de toxina, isto é, da ligação das neu-rotoxinas modificadas para o receptor das células alvo e da translocação para a célula nervosae proteólise do substrato SNARE1 foi determinada o tempo de paralisia de um preparado denervo e músculo de rato após intoxicação. Como amostra de referência serviu, por sua vez Hi0-BoNT/A. Os valores das atividades relativas estão listados na Tabela 4. A diminuição da ativi-dade das toxinas de botulinum modificadas de acordo com a presente invenção em compara-ção com a amostra de referência para 20 a 30 %, obviamente é baseada em uma capacidadediminuída da ligação da toxina às células alvo e na capacidade diminuída de translocar a toxinapara as células alvo.

Tabela 4

<table>table see original document page 19</column></row><table>

Exemplo 8: Tempo de ação de toxina de botulinum tipo A peqilada.

O tempo de ação de toxina de botulinum mutada pegilada (mPEG-C-H10-BoNT/A) foitestado em ratos CD 1. Cada vez 10 ratos receberam injeções i.m. (2 χ 0,05 ml) de (i) toxinade botulinum mutada, (ii) toxina de botulinum mutada pegilada ou com (iii) toxina de botulinumnativa, em uma dosagem de cada vez 0,4 ou 0,6 unidades LD50/ rato (solução fisiológica de salde cozinha + 1 mg/mL de HSA) no músculo gastrocnêmico da pata traseira. Em seguida, aparalisia do músculo foi avaliada diariamente com a ajuda de uma escala (paralisia mínima,leve, grave). Depois de 25 dias, os animais tratados com a neurotoxina nativa não mostrarammais nenhuma paralisia do músculo. Nos animais tratados com toxina de botulinum mutada oumutada pegilada, o tempo de ação era mais longo 7 a 20 dias.

Claims

1. Toxina de botulinum modificada que apresenta uma cadeia pesada natural e umacadeia leve modificada, CARACTERIZADA pelo fato de que a modificação da cadeia leveconsiste no fato de que ela (i) no seu N-terminal possui um prolongamento da cadeia que nadireção da extremidade de N-terminal para a extremidade C-terminal possui a estrutura -(C)n-(tag)m-(X)r,ondeC é um resíduo de cisteína,Tag é qualquer tag,X é um resíduo de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente,η é um número inteiro de 1 a 50,m é 0 ou 1I é 0 ou um número inteiro de 1 a 50,e que (ii) pelo menos um dos resíduos de cisteína no prolongamento da cadeia é aco-piado a pelo menos uma cadeia PEG.

2. Toxina de botulinum modificada que apresenta uma cadeia pesada natural e umacadeia leve modificada, CARACTERIZADA pelo fato de que a modificação da cadeia leveconsiste no fato de que pelo menos um resíduo de aminoácido, e no máximo 20 resíduos deaminoácido, que naturalmente são mutados no resíduo no N-terminal para um resíduo de ciste-ína, que (ii) ela eventualmente possui adicionalmente um prolongamento N-terminal, de modoque a seqüência da cadeia leve na direção da extremidade N-terminal para a extremidade C-terminal possui a estrutura-(tag)m-(X)rBoNT(X1 -20C)ondeC é um resíduo de cisteína,tag é qualquer tag,X é um resíduo de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente,m é 0 ou 1 eI é 0 ou um número inteiro de 1 a 50.e que (iii) pelo menos um dos no máximo 20 resíduos de cisteína no N-terminal estáacoplado a pelo menos uma cadeia PEG.

3. A toxina de botulinum, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADApelo fato de que nenhum resíduo de cisteína que ocorre naturalmente na cadeia pesada e nacadeia leve da toxina de botulinum é pegilado.

4. A toxina de botulinum, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3,CARACTERIZADA pelo fato de que o tag é um his-tag ou um strep-tag.

5. A toxina de botulinum, de acordo com uma das reivindicações 1, 3 ou 4,CARACTERIZADA pelo fato de que a toxina de botulinum é uma toxina de botulinum dos tiposA, B, C1, D1 E, F ou G e que se aplicam as seguintes condições:(a) η = 1, 2 ou 3, m = O ou 1, 1 = O ou 1 φ O,(b) η = 1, m = 1, 1 = 0; η = 2, m = 1, 1 = 0; η = 3, m = 1, 1= 0;(c) η = 1, m = 0, 1 = 0; η = 2, m = 0, 1 = 0; η = 3, m = 0, 1= 0;(d) η = 1, m = 1, 1 * 0; η = 2, m = 1, 1 φ 0; η = 3, m = 1, 1 * 0;(e) η = 1, m = 0, 1 φ 0; η = 2, m = 0, 1 φ 0; η = 3, m = 0, 1 φ 0;sendo que as toxinas por molécula são acopladas a uma, a duas ou a três molécu-las PEG, dependendo se η = 1, 2 ou 3.

6. A toxina de botulinum, de acordo com uma das reivindicações 1, 3, 4 ou 5,CARACTERIZADA pelo fato de que o prolongamento da cadeia leve possui uma das se-guintes seqüências:-(O1-Ctag)1-(X)0-, -(CMtag)1-(X)0-, -(C )3-(tagJ1 -(X)0-, -(CMtag)1-(X)0-, -(C)5-(Iag)1-(X)o-,-(CMtag)1-(X)1-, -(CMtag)1-(X)1-, -(C MtagMX),-, -(CMtag)1-(X)1-, -(CMtag)1-(X)i-.-(CMtag)1-(X)2-, -(CMtag)1-(X)2-, -(C )3-(tag)r(X)2-, -(CMtag)1-(X)2-, -(CMtag)1-(X)2-,-(C)1-(Iag)1-(X)3-, -(C)2-(Iag)1-(X)3-, -(C )3-(tagJ1-(X)3-, -(CMtag)1-(X)3-, -(C)5-(Iag)1-(X)3-,-(CMtag)1-(X)4-, -(CMtag)1-(X)4-, -(C MtagJHX),-, -(C)4-(Iag)1-(X)4-, -(CMtag)1-(X)4-, etc.sendo que para cada uma dessas 25 seqüências m também pode ser 0, e/ou querespectivamente todos os resíduos de cisteína que ocorrem no prolongamento da cadeialeve, também são pegilados.

7. A toxina de botulinum, de acordo com uma das reivindicações 2 a 4,CARACTERIZADA pelo fato de que a toxina de botulinum é uma toxina de botulinum dostipos A, B, C1, D, E, F ou G e que valem as seguintes condições:(a) m = 1, 1 = 0, apenas um dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal é substituídopor um resíduo de cisteína, em especial apenas o resíduo na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;(b) m = 0, 1 = 0, apenas um dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal é substituídopor um resíduo de cisteína, em especial apenas o resíduo na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;(c) m = 1, 1 φ 0, apenas um dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal é substituídopor um resíduo de cisteína, em especial apenas o resíduo na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;(d) m = O1 1 φ 0, apenas um dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal é substituídopor um resíduo de cisteína, em especial apenas o resíduo na posição 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;(e) m = 1, 1 = 0, apenas dois dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal são substituí-dos por um resíduo de cisteína, em especial apenas os resíduos nas posições 1 e 3, 1 e 4, 2 e- 4,1 e 5, 2 e 5, 3 e 5,1 e 6, 2 e 6, 3 e 6 ou 4 e 6;(f) m = 0, 1 = 0, apenas dois dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal são substituí-dos por um resíduo de cisteína, em especial apenas os resíduos nas posições 1 e 3, 1 e 4, 2 e- 4, 1 e 5, 2 e 5, 3 e 5, 1 e 6, 2 e 6, 3 e 6 ou 4 e 6;(g) m = 1, 1 φ 0, apenas dois dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal são substituí-dos por um resíduo de cisteína, em especial apenas os resíduos nas posições 1 e 3, 1 e 4, 2 e- 4,1 e 5, 2 e 5, 3 e 5, 1 e 6, 2 e 6, 3 e 6 ou 4 e 6;(h) m = 0, 1 φ 0, apenas dois dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal são substituí-dos por um resíduo de cisteína, em especial apenas os resíduos nas posições 1 e 3, 1 e 4, 2 e- 4, 1 e 5, 2 e 5, 3 e 5, 1 e 6, 2 e 6, 3 e 6 ou 4 e 6;(i) m = 1, 1 = 0, apenas dois dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal são substituí-dos por um resíduo de cisteína, em especial apenas os resíduos nas posições 1 e 2, 2 e 3, 3 e- 4, 4 e 5, ou 5 e 6;(j) m = 0, 1 = 0, apenas dois dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal são substituí-dos por um resíduo de cisteína, em especial apenas os resíduos nas posições 1 e 2, 2 e 3, 3 e- 4, 4 e 5, ou 5 e 6;(k) m = 1, 1 φ 0, apenas dois dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal são substituí-dos por um resíduo de cisteína, em especial apenas os resíduos nas posições 1 e 2, 2 e 3, 3 e- 4, 4 e 5, ou 5 e 6;(l) m = 0, 1 φ 0, apenas dois dos 20 resíduos de aminoácido N-terminal são substituí-dos por um resíduo de cisteína, em especial apenas os resíduos nas posições 1 e 2, 2 e 3, 3 e- 4, 4 e 5, ou 5 e 6;onde as toxinas por molécula são acopladas a uma ou a duas moléculas PEG, de-pendendo de se apenas um ou dois resíduos de cisteína foram introduzidas pelo N-terminal.

8. A toxina de botulinum, de acordo com uma das reivindicações 2 a 4 e 7,CARACTERIZADA pelo fato de que a toxina de botulinum modificada é uma toxina de botuli-num cuja cadeia leve é de tal modo modificada que esta no seu N-terminal possui um prolon-gamento da cadeia, sendo que o N-terminal da cadeia prolongada possui uma das seguintesseqüências:(a)-(tag)1-(X)0-BoNT(P1C), -(tag)1-(X)0-BoNT(F2C), -(tag)r(X)o-BoNT(V3C), -(tag)r(X)0-Bo NT(N4C), -(tag J1 -(X)0-BoNT(K5C),(b)-(tag)i-(X)rBoNT(P1 C), -(tag)r(X)i-BoNT(F2C), -(Iag)1-(X)1-BoNT(VSC), -(tag)r(X)i-BoNT(N4C), -(tag)r(X)rBoNT(K5C),(c)-(Iag)1-(X)2-BoNT(PIC)l -(tag)r(X)2-BoNT(F2C), -(tag)r(X)2-BoNT(V3C), -(Iag)1-(X)2-BoNT(N4C), -(tagJ1 -(X)2-BoNT(K5C),(d)-(tag)r(X)3-BoNT(P1 C), -(tag)1-(X)3-BoNT(F2C), -(tag)r(X)3-BoNT(V3C), -(tag)r(X)3-BoNT(N4C), -(tag)r(X)3-BoNT(K5C),(e)-(tag)r(X)4-BoNT(P1C), -(tag)1-(X)4-BoNT(F2C), -(tag)r(X)4-BoNT(V3C), -(Iag)1-(X)4-BoNT(N4C), -(tag)r(X)4-BoNT(K5C),sendo que para cada uma das 25 formas de execução preferidas acima listadas m emvez de 1 também pode ser O, e/ou respectivamente todos os resíduos de cisteína introduzidospor N-terminal também são pegilados.

9. A toxina de botulinum, de acordo com uma das reivindicações anteriores,CARACTERIZADA pelo fato de que a toxina de botulinum é uma toxina de botulinum do tipo A,B ou C1.

10. A toxina de botulinum, de acordo com uma das reivindicações anteriores,CARACTERIZADA pelo fato de que a toxina de botulinum modificada possui pelo menos 20%, de preferência, 30 a 40 %, 50 a 70 % ou 75 a 95 % da atividade biológica da toxina de botu-linum correspondente natural (não modificada, nativa), e em comparação com esta, uma esta-bilidade maior.

11. A toxina de botulinum, de acordo com uma das reivindicações anteriores,CARACTERIZADA pelo fato de que a cadeia leve modificada é translocada in vivo para o cito-sol dos motoneurônios.

12. A toxina de botulinum, de acordo com uma das reivindicações anteriores,CARACTERIZADA pelo fato de que a cadeia leve modificada no citosol dos motoneurôniospossui uma estabilidade maior do que a toxina de botulinum nativa correspondente.

13. Composição farmacêutica para a medicina humana e veterinária,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição possui a toxina de botulinum modificadade acordo com uma das reivindicações anteriores.

14. A composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 13,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição é estabilizada sem a adição de soroalbu-mina (HSA) humana.

15. A composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 13 ou 14,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição está disponível na forma Iiofilizada ou lí-quida, e onde ambas as formas eventualmente, depois da absorção em um solvente apropria-do, são apropriadas para a injeção i. m..

16. Uso da toxina de botulinum modificada, de acordo com uma das reivindicações 1 a-12, CARACTERIZADO pelo fato de ser para a produção de um farmacêutico para a terapiade distonias e para a eliminação de rugas faciais.

17. Uso da toxina de botulinum modificada, de acordo com uma das reivindicações 1 a-12, CARACTERIZADO pelo fato de que a distonia é uma disfonia espasmódica, uma distoniade laringe, distonia cervical, distonia manual focai, blefaroespasmo, estrabismo, parese cere-bral, espasmos hemifaciais, espasticidade, colite espasmódica, anismo, TICS, tremores, fissuraanal, acalasia, disfagia, ou uma hiper-hidrose.

18. Ácido nucléico, CARACTERIZADO pelo fato de que codifica para a toxina de bo-tulinum modificada, de acordo com uma das reivindicações 1 a 12.

19. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fatode que é DNA.

20. Vetor, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o ácido nucléico, de a-cordo com a reivindicação 18 ou 19.

21. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de que compreendendo o vetorde acordo com a reivindicação 20.

22. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fa-to de que a célula hospedeira é uma célula procariótica, em especial, uma célula E. coli.