BRPI0708943A2 - agonista do receptor de neuromidina u, mÉtodos para produÇço de um agonista do receptor de neuromidina u e para o tratamento de um distérbio metabàlico em um indivÍduo, uso do agonista do receptor de neuromedina u, e, composiÇço farmacÊutica - Google Patents

agonista do receptor de neuromidina u, mÉtodos para produÇço de um agonista do receptor de neuromidina u e para o tratamento de um distérbio metabàlico em um indivÍduo, uso do agonista do receptor de neuromedina u, e, composiÇço farmacÊutica Download PDF

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Abstract

AGONISTA DO RECEPTOR DE NEUROMIDINA U, METODOS PARA A PRODUÇçO DE UM AGONISTA DO RECEPTOR DE NEUROMIDINA U E PARA O TRATAMENTO DE UM DISTURBIO METABàLICO EM UM INDIVÍDU, USO DO AGONISTA DO RECEPTOR DE NEUROMEDINA U, E, COMPOSIÇçO FARMACÊUTICA Agonistas do receptor de neuromedina U para o uso no tratamento de distúrbios metabólicos, tais como obesidade e diabete são divulgados.

Description

"AGONISTA DO RECEPTOR DE NEUROMEDINA U, MÉTODOS PARAA PRODUÇÃO DE UM AGONISTA DO RECEPTOR DE NEUROMIDINAU E PARA O TRATAMENTO DE UM DISTÚRBIO METABÓLICO EMUM INDIVÍDUO, USO DO AGONISTA DO RECEPTOR DENEUROMEDINA U, E, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA"PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica o benefício do Pedido Condicional U.S. N0 60/783.933 depositado em 20 de março de 2006.FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
(1) Campo de Invenção
A presente invenção diz respeito a agonistas do receptor deneuromedina U para o uso no tratamento de distúrbios metabólicos tais comoobesidade.
(2) Descrição da técnica Relacionada
A Neuromedina U (NMU) foi originalmente isolada da medulaespinal porcina com base em sua capacidade de contrair músculo liso uterinode rato e visto que foi implicado em uma variedade de outros processosfisiológicos, incluindo tensão, nocicepção, inflamação, função cardiovasculare homeostase de energia. A caracterização de NMU identificou três peptídeoscom bioatividade similar, NMU de comprimento total, (um (NMU-25) de 25-mer) em humanos, porcos e cães, um (NMU-23) de 23-mer em ratos ecamundongos e um (NMU-8) de 8-mer. O NMU-8 é derivado da clivagem deNMU de comprimento total e divide um terminal C idêntico com o precursorde comprimento total. NMU-8 é altamente conservado entre os vertebrados,contendo sete resíduos de terminal C que são idênticos em todas as espéciesque foram examinadas; estes resíduos são críticos para a bioatividade(Brighton et al., Pharmacol. Rev. 56: 231-248 (2004)).
O papel de NMU na regulação da homeostase de energia ésuportado tanto por dados farmacológicos quanto genéticos. As propriedadesde NMU incluem a inibição da entrada de alimento e aumento no gasto deenergia visto quando a substância é administrada (Howard et al., Nature 406:70-74 (2000); Nakazato et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 277: 191-194(2000); Ivanov et al, Endocrinol. 143: 3813-3821 (2002); and Wren et al,Endocrinol., 143: 4227-4234 (2002)). Os camundongos deficientes emcamundongos deficientes em NMU desenvolvem obesidade caracterizadapela hiperfagia e gasto de energia reduzido (Hanada et al., Nat. Med., 10:1067-1073 (2004)) e camundongos transgênicos que super-expressam NMUsão magros e hipofágicos (Kowalski et al, J. Endocrinol. 185: 151-164(2005)). A condição de energia interna de um animal também afeta aexpressão e liberação de NMU (Wren et al, ibid.).
Dois receptores de NMU de alta afinidade, NMURl (Pedidode Patente Intl. N0 PCT/US99/15941) e NMUR2 (Patente U. S. N0 7163799),foram identificados. O NMURl é predominantemente expressado naperiferia, onde o NMUR2 é primariamente expressado no cérebro.
Os experimentos farmacológicos serviram para definir melhoros efeitos de curto e de longo período de NMU na homeostase de energia epara identificar quais receptores de NMU estão envolvidos na mediaçãodestas ações. Foi mostrado que as administrações agudas de NMU, central ouperifericamente reduzem a entrada de alimento em camundongos de umamaneira dependente da dose. As ações anoréticas de NMU centralmenteadministrado estão ausentes em camundongos deficientes em NMUR2(Nmur2'J') mas estão presentes em camundongos deficientes em NMURl(Nmurl'1'). Em contraste, as ações anoréticas de NMU perifericamenteadministrado estão ausentes em camundongos Nmurl'1' e presentes emcamundongos Nmur2'1'. Adicionalmente, a administração periférica aguda deNMU dependente de dose aumenta a temperatura do corpo do núcleo emcamundongos, sugerindo que o NMURl também pode modular o gasto deenergia. A administração crônica de NMU reduz central ou perifericamente aentrada de alimento, peso do corpo e adiposidade em camundongos,novamente em uma maneira dependente de dose. Em camundongostransgênicos NmurT1', peso corporal, composição corporal, temperaturacorporal e entrada de alimento são amplamente não afetados pelaadministração central crônica de NMU-23 de rato. Em camundongotransgênico Nmurl'1', peso corporal, composição corporal e entrada dealimento são amplamente não afetados pela administração periférica crônicade NMU-23 de rato.
Por causa disso, os locais de ação de eficácia mediada porNMURl vs. NMUR2 diferem e parecem ser independentes um do outro, mastem um papel na obesidade, é sugerido que tanto os agonistas seletivos deNMURl quanto de NMUR2 e agonistas não seletivos de NMUR1/2 podemser úteis para o tratamento de obesidade. Portanto, existe uma necessidade deagonistas do receptor de neuromedina U úteis no tratamento de distúrbiosmetabólicos.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece agonistas do receptor deneuromedina U. Em um aspecto, os agonistas do receptor de neuromedina Usão específicos para um subtipo de receptor, em um outro aspecto, osagonistas do receptor de neuromedina U são capazes de ligar e estimular tantoo receptor de NMURl quanto de NMUR2. Em outros aspectos, os agonistasdo receptor de neuromedina U foram derivados para permitir que os agonistasdo receptor de neuromedina U cruzem a barreira sangue-cérebro e interagecom os receptores de NMU no cérebro. Os agonistas do receptor deneuromedina U podem ser suados terapeuticamente e como ferramentas depesquisa.
As aplicações terapêuticas dos agonistas do receptor deneuromedina U incluem a administração dos agonistas do receptor deneuromedina U a um indivíduo para o tratamento de um distúrbio metabólicoque aflige o indivíduo. Tais distúrbios incluem, mas não são limitados a,obesidade, síndrome metabólica ou síndrome Xeo diabete tipo II. Ascomplicações de diabete, tais como retinopatia também podem serpositivamente afetadas deste modo. Obesidade é uma co-morbidez e tambémpode contribuir para tais estados de doença como diabete, hipertensão,dislipidemias, doença, cálculos biliares, osteoartrite e certas formas decânceres. A administração de um ou mais dos agonistas do receptor deneuromedina U divulgados neste afetam a perda de peso em um indivíduotambém pode ser útil na prevenção de tais doenças e como parte da terapiapara qualquer uma das condições citadas acima bem como outras. Em outrasformas de realização, é fornecido um método pata tratar uma doençametabólica em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo um oumais dos agonistas do receptor de neuromedina U descritos acima. A doençametabólica pode ser selecionada do grupo que consiste de diabete, síndromemetabólica, hiperglicemia e obesidade e pode ser administrado por intermédiode uma via periférica ao cérebro, tal como uma via oral, mucosal, bucal,sublingual, nasal, retal, subcutânea, transdérmica, intravenosa, intramuscularou intraperitoneal. Finalmente, os agonistas do receptor de neuromedina Upodem ser administrados a um indivíduo para realizar uma redução na entradade alimento pelo indivíduo, para realizar uma redução no ganho de peso noindivíduo, para evitar o ganho de peso no indivíduo, para afetar a perda depeso no indivíduo e/ou para evitar o reganho de peso no indivíduo.
Conseqüentemente, a presente invenção fornece um agonistado receptor de neuromedina U isolado, que tem a fórmula (I)Z1-Peptideo-Z2
em que o peptídeo tem a seqüência de aminoácido X1-X2-X3-
χ4„χ^χ6_χ7_χ8_χ9_χ10_χ11_χ12_χ13_χ14_χ15_χ16_χ17_χ18_χ19_χ20_χ21_χ22_X23-X24-X25 (SEQ ID N°: 27), em que os aminoácidos de 1 a 17 podem serqualquer aminoácido ou ausentes; em que o aminoácido X18 está ausente, Y,W, F, um des-aminoácido ou um grupo acila; aminoácido X19 é A, W, Y, F ouum aminoácido alifático; aminoácido X está ausente, L, G, sarcosina (Sar),D-Leu, NMe-Leu, D-Ala ou A; aminoácido X21 é F, NMe-Phe, umaminoácido alifático, um aminoácido aromático, A ou W; X22 é R, Κ, A ou L;aminoácido X23 é P, Sar, A ou L; aminoácido X24 é R, Harg ou K e oaminoácido X é N, qualquer D- ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle ou A.; e Zé um grupo de proteção opcionalmente presente que, se presente, é unido aogrupo amino de terminal N e Z é NH2 ou um grupo de proteçãoopcionalmente presente que, se presente, é unido ao grupo carbóxi de terminalC e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
Em aspectos particulares do agonista do receptor deneuromedina U, o peptídeo tem a seqüência de aminoácido X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X1 ^Xi2-X13-X14-X15-X16-X17-X18-F-L-F-R-P-R-N (SEQ IDN°: 1), em que os aminoácidos de 1 a 17 podem ser qualquer aminoácido ouausentes, que em aspectos particulares tem uma seqüência de aminoácidoselecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ IDN°: 4, SEQ ID N°: 5 e SEQ ID N°: 6. Em aspectos correntemente preferidos,o peptídeo tem uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID N°: 2.
Em um outro aspecto do agonista do receptor de neuromedinaU, o peptídeo compreende a seqüência de aminoácido F-R-V-D-E-E-F-Q-S-P-F-A-S-Q-S-R-G-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25 (SEQ ID N°: 7) em que oaminoácido X está ausente, Y, W, F, um des-aminoácido ou um grupo acila;aminoácido X19 é A, W, Y, F ou um aminoácido alifático; aminoácido X20está ausente, G, sarcosina (Sar), D-Leu, NMe-Leu, D-Ala ou A; aminoácidoXil é NMe-Phe,um aminoácido alifático, um aminoácido aromático, A ou W;aminoácido X é Κ, A ou L; o aminoácido X é Sar, A ou L; aminoácido Xé Harg ou K e o aminoácido X é qualquer D- ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle ou A, que em aspectos particulares tem a seqüência de aminoácidoselecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 15, SEQID Ν°: 22, SEQ ID Ν°: 23, SEQ ID Ν°: 24 e SEQ ID Ν°: 25.
Ainda, em um outro aspecto do agonista do receptor deneuromedina U, o peptídeo compreende a seqüência de aminoácido X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID N°: 8) em que o aminoácido X1 está ausente, Y,W, F, um des-aminoácido ou um grupo acila; aminoácido X2 é A, W, Y, F ouum aminoácido alifático; aminoácido X está ausente, G, sarcosina (Sar), D-Leu, NMe-Leu, D-Ala ou A; aminoácido X4 é NMe-Phe, um aminoácidoalifático, um aminoácido aromático, A ou W; aminoácido X5 é Κ, A ou L;aminoácido X é Sar, A ou L; aminoácido X é Harg ou K e o aminoácido Xé qualquer D- ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle, ou A, que em aspectosparticulares tem a seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consistede SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, SEQ IDN°: 13, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19,SEQ ID N°: 20 e SEQ ID N°: 21.
Em outros aspectos dos agonistas do receptor de neuromedinaU acima, o aminoácido de terminal N é covalentemente unido a uma ou maismoléculas selecionadas do grupo que consiste de PEG, colesterol, N-etilmaleimidila e palmitoíla. Ainda em outros aspectos do agonista doreceptor de neuromedina U, o peptídeo ainda inclui um resíduo de cisteína noterminal N do peptídeo em que um grupo de proteção está opcionalmentepresente que, se presente, é unido ao grupo amino de terminal N do resíduo decisteína. Em aspectos particulares do agonista do receptor de neuromedina U,o grupo tiol do resíduo de cisteína no terminal N é covalentemente unido auma ou mais moléculas selecionadas do grupo que consiste de PEG,colesterol, N-etilmaleimidila e palmitoíla. Em uma forma de realizaçãocorrentemente preferida, os agonistas do receptor de neuromedina U tem oaminoácido da SEQ ID N°: 2, que ainda inclui um resíduo de cisteína noterminal N do peptídeo em que está presente um grupo de proteção unido aogrupo amino de terminal N do resíduo de cisteína e uma molécula PEG unidaao grupo tiol.
O agonista do receptor de neuromedina U ainda pode incluirum grupo ligador tendo uma extremidade distai e uma extremidade proximal.
O grupo ligador é covalentemente unido a sua extremidade distai ao terminalN do peptídeo e é covalentemente ligado na extremidade proximal ao terminalcarboxila de um resíduo de cisteína, em que um grupo de proteção estáopcionalmente presente que, se presente, é unido ao grupo amino de terminalN do resíduo de cisteína. Em aspectos particulares, em que o grupo tiol doresíduo de cisteína é covalentemente unido a uma ou mais moléculasselecionadas do grupo que consiste de PEG, colesterol, N-etilmaleimidila epalmitoíla.
A presente invenção ainda fornece o uso de qualquer uma oumais das formas de realização e aspectos do agonista do receptor deneuromedina U na fabricação de um medicamento para o tratamento de umdistúrbio metabólico. Os distúrbios incluem, mas não são limitados a,obesidade, síndrome metabólica ou síndrome X e diabete do tipo II. Ascomplicações de diabete, tais como retinopatia também podem serpositivamente afetadas deste modo. A obesidade é uma co-morbididez de, etambém pode contribuir para tais estados de doença como o diabete,hipertensão, dislipidemias, doenças cardiovasculares, cálculos biliares,osteoartrite e certas formas de câncer. Desta maneira, a presente invençãofornece uma composição farmacêutica que compreende um ou mais dequalquer um dos agonistas do receptor de neuromedina U acima e umcarreador farmaceuticamente aceitável.
A presente invenção ainda fornece um método para produzirum agonista do receptor de neuromidina U que pode cruzar a barreira sangue-cérebro que compreende unir covalentemente ao peptídeo uma ou maismoléculas de PEG em que a uma ou mais moléculas de PEG tornam opeptídeo capaz de cruzar a barreira sangue-cérebro. Portanto, em aspectosparticulares, o agonista do receptor de neuromidina U tem a fórmula (I)Z1-Peptideo-Z2
em que o peptídeo tem a seqüência de aminoácido X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xi0-Xii-Xi2-Xi3-Xi4-Xi5-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25 (SEQ ID N°: 27), em que os aminoácidos de 1 a 17 podem serqualquer aminoácido ou ausentes; em que o aminoácido X18 está ausente, Y,W, F, um des-aminoácido ou um grupo acila; aminoácido X19 é A, W, Y, F ouum aminoácido alifático; aminoácido X está ausente, L, G, sarcosina (Sar),D-Leu, NMe-Leu, D-Ala ou A; aminoácido X21 é F, NMe-Phe, umaminoácido alifático, um aminoácido aromático, A ou W; X22 é R, Κ, A ou L;aminoácido X23 é P, Sar, A ou L; aminoácido X24 é R, Harg ou K e oaminoácido X25 éN, qualquer D- ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle, A e Z1 é umgrupo de proteção opcionalmente presente que, se presente, é unido ao grupoamino de terminal N e Z é NH2 ou um grupo de proteção opcionalmentepresente que, se presente, é unido ao grupo carbóxi de terminal C e seus saisfarmaceuticamente aceitáveis.
Ainda é fornecido um método para a produção de um agonistado receptor de neuromidina U que compreende todo ou uma porção dopeptídeo NMU-25 que é específico para um subtipo do receptor deneuromedina U que compreende modificar um ou mais dos sete aminoácidosno terminal C do polipeptídeo a um aminoácido ou análogo de aminoácidoque não é natural ao peptídeo NMU-25 humano.
Portanto, em um aspecto, o peptídeo compreende a seqüênciade aminoácido F-R-VD-E-E-F-Q-S-P-F-A-S-Q-S-R-G-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25 (SEQ ID N°: 7) em que o aminoácido X18 está ausente, Y, W, F,um des-aminoácido ou um grupo acila; aminoácido X19 é A, W, Y, F ou umaminoácido alifático; aminoácido X está ausente, G, sarcosina (Sar), D-Leu,NMe-Leu, D-Ala ou A; aminoácido X é NMe-Phe, um aminoácido alifático,um aminoácido aromático, A ou W; aminoácido X22 e K, A ou L; aminoácidoX23 é Sar, A ou L; aminoácido X24 é Harg ou K e o aminoácido X25 é qualquerD- ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle, ou A, que em aspectos particulares tem aseqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°:14, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24 e SEQID N°: 25.
Em um outro aspecto do agonista do receptor de neuromedinaU, o peptídeo compreende a seqüência de aminoácido X1 X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID N°: 8) em que o aminoácido X está ausente, Y, W, F, um des-aminoácido ou um grupo acila; aminoácido X2 é A, W, Y, F ou umaminoácido alifático; aminoácido X está ausente, G, sarcosina (Sar), D-Leu,NMe-Leu, D-Ala ou A; aminoácido X4 é NMe-Phe, um aminoácido alifático,um aminoácido aromático, A ou W; aminoácido X5 é Κ, A ou L; aminoácidoX6 é Sar, A ou L; aminoácido X7 é Harg ou K e o aminoácido X8 é qualquerD- ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle, ou A, que em aspectos particulares tem aseqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 9,SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, SEQ ID N0: 13, SEQ ID N°:16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20 e SEQID N°: 21.
Ainda é fornecido um método para o tratamento de umdistúrbio metabólico em um indivíduo que compreende administrar aoindivíduo a quantidade terapeuticamente eficaz de um agonista do receptor deneuromidina U que tem a fórmula (I)
Z1-Peptideo-Z2
em que o peptídeo tem a seqüência de aminoácido X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xi0-Xii-Xi2-Xi3-Xi4-Xi5-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X-X-Xi" (SEQ ID N°: 27),
em que os aminoácidos de 1 a 17 podem serqualquer aminoácido ou ausente; em que o aminoácido X18 está ausente, Y,W, F, um des-aminoácido ou um grupo acila; aminoácido X19 é A, W, Y, F ouum aminoácido alifático; aminoácido X está ausente, L, G, sarcosina (Sar),D-Leu, NMe-Leu, D-Ala ou A; aminoácido X21 é F, NMe-Phe, umaminoácido alifático, um aminoácido aromático, A ou W; X22 é R, Κ, A ou L;aminoácido X23 é P, Sar, A ou L; aminoácido X24 é R, Harg ou K e oaminoácido X é N, qualquer D- ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle5 AeZ éum grupo de proteção opcionalmente presente que, se presente, é unido aogrupo amino de terminal N e Z2 é NH2 ou um grupo de proteçãoopcionalmente presente que, se presente, é unido ao grupo carbóxi de terminalC, para tratar o distúrbio metabólico.
O método é particularmente útil para o tratamento de umdistúrbio metabólico selecionado do grupo que consiste de obesidade,síndrome metabólica ou síndrome X, diabete do tipo II, complicações dadiabete, hipertensão, dislipidemias, doenças cardiovasculares, cálculosbiliares, osteoartrite e certas formas de câncer.
Em aspectos particulares do método, o peptídeo tem aseqüência de aminoácido Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Xii-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-F-L-F-R-P-R-N (SEQ ID N°: 1), em que os aminoácidos de1 a 17 podem ser qualquer aminoácido ou ausentes, que em aspectosparticulares tem uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo queconsiste de SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5 e SEQID N°: 6. Em aspectos correntemente preferidos, o peptídeo tem umaseqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID N°: 2.
Em um outro aspecto do método, o peptídeo compreende aseqüência de aminoácido F-R-V-D-E-E-F-Q-S-P-F-A-S-Q-S-R-G-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25 (SEQ ID N°: 7) em que o aminoácido X18 estáausente, Y, W, F, um des-aminoácido ou um grupo acila; aminoácido X19 é A,W, Y, F ou um aminoácido alifático; aminoácido X20 está ausente, G,sarcosina (Sar), D-Leu, NMe-Leu, D-Ala ou A; aminoácido X21 é NMe-Phe,um aminoácido alifático, um aminoácido aromático, A ou W; aminoácido X22é Κ, A ou L; aminoácido X23 é Sar, A ou L; aminoácido X24 é Harg ou K e oaminoácido X é qualquer D- ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle, ou A, que emaspectos particulares tem a seqüência de aminoácido selecionada do grupoque consiste de SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N0: 22, SEQ ID N°:23, SEQ ID N°: 24 e SEQ ID N0: 25.
Ainda, em um outro aspecto do método, o peptídeocompreende a seqüência de aminoácido X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ IDN°: 8) em que o aminoácido X1 está ausente, Y, W, F, um des-aminoácido ouum grupo acila; aminoácido X é A, W, Y, F ou um aminoácido alifático;
aminoácido X está ausente, G, sarcosina (Sar), D-Leu, NMe-Leu, D-Ala ouA; aminoácido X4 é NMe-Phe, um aminoácido alifático, um aminoácidoaromático, A ou W; aminoácido X5 é Κ, A ou L; aminoácido X6 é Sar, A ouL; aminoácido X é Harg ou K e o aminoácido X é qualquer D- ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle, ou A, que em aspectos particulares tem aseqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°:16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N0: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20 e SEQIDN°: 21.
Em outros aspectos do método acima, o aminoácido determinal N é covalentemente unido a uma ou mais moléculas selecionadas dogrupo que consiste de PEG, colesterol, N-etilmaleimidila e palmitoíla. Aindaem outros aspectos do agonista do receptor de neuromedina U, o peptídeoainda inclui um resíduo de cisteína no terminal N do peptídeo em que umgrupo de proteção está opcionalmente presente que, se presente, é unido aogrupo amino de terminal N do resíduo de cisteína. Em aspectos particularesdo método, o grupo tiol do resíduo de cisteína no terminal N é covalentementeunido a uma ou mais moléculas selecionadas do grupo que consiste de PEG,colesterol, N-etilmaleimidila e palmitoíla. Em uma forma de realizaçãocorrentemente preferida, os agonistas do receptor de neuromedina U tem oaminoácido da SEQ ID N°: 2, que ainda inclui um resíduo de cisteína noterminal N do peptídeo em que está presente um grupo de proteção unido aogrupo amino de terminal N do resíduo de cisteína e uma molécula PEG unidaao grupo tiol.
O agonista do receptor de neuromedina U ainda pode incluirum grupo ligador tendo uma extremidade distai e uma extremidade proximalé covalentemente unido a sua extremidade distai ao terminal N do peptídeo ea extremidade proximal do grupo ligador é covalentemente ligado ao terminalcarboxila de um resíduo de cisteína em que um grupo de proteção estáopcionalmente presente que, se presente, é unido ao grupo amino de terminalN do resíduo de cisteína. Em aspectos particulares, em que o grupo tiol doresíduo de cisteína é covalentemente unido a uma ou mais moléculasselecionadas do grupo que consiste de PEG, colesterol, N-etilmaleimidila epalmitoíla. Em uma forma de realização correntemente preferida do método,agonista do receptor de neuromidina U tem a fórmula Ac-C2-peptídeo-CONH2 em que Ac é um grupo acetila, C2 é Cys(PEG)240 kDa e o peptídeotem a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID N°: 2.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura IA demonstra que a administração periférica deagonista H reduz a entrada de alimento e estas ações anoréticas são mediadaspor NMURl. Camundongos Nmurl+/+ e Nmurl-/- obesos induzidos à dietaforam dosados ip com veículo (água), composto H em 3,25 mmoles/kg, ouhNMU-25 em 3,25 mmoles/kg -30 minutos antes do início da fase de escuroe a entrada de alimento foi medida em torno de 2 e 18 horas (Durante a noite)mais tarde, respectivamente. *, P < 0,05 vs. Veículo, η = 11 a 12 por grupo detratamento.
A Figura IB mostra a mudança durante a noite no pesocorporal dos camundongos na Figura IA.
A Figura 2A mostra que a administração aguda periférica doagonista H seletivo de NMURl reduziu significantemente a entrada dealimento em camundongos do tipo selvagem, mas não em camundongos denocaute Nmurl, demonstrando que o NMURl é requerido para as açõesanoréticas de agonista H. Adicionalmente, estes dados demonstram que oagonismo seletivo de NMURl é suficiente para recapitular as ações anoréticasdo NMU do agonista de NMUR1/2 total.
A Figura 2B mostra que a administração aguda periférica doNMUl3 do agonista seletivo de NMURl também reduziu significantemente aentrada de alimento em camundongos do tipo selvagem, mas não emcamundongos de nocaute Nmur 1, demonstrando que o NMURl também érequerido para as ações anoréticas deste agonista. Adicionalmente, estesdados demonstram que o agonismo seletivo de NMURl é suficiente pararecapitular as ações anoréticas do NMU do agonista de NMUR1/2 total.
A Figura 3A mostra que a administração subcutânea de NMUPEGuilado reduz a entrada de alimento por três dias pós-dose. Consistentecom o perfil metabólico in vitro e in vivo dos análogos PEGuilados, o NMUlapresenta eficácia maior na redução, durante a noite, da entrada de alimentoem comparação com hNMU-25 e reduções na entrada de alimento sãoobservadas por três dias após a dose. Reduções significantes no peso corporaltambém foram observadas (Figura 3B).
A Figura 3B mostra a mudança no peso corporal doscamundongos em Figura 3A.
Figura 4A mostra que o NMU12 também é um peptídeoanorético eficaz. Similar ao NMU1, uma redução significante na entrada dealimento e peso corporal (Figura 4B) foi observada por três dias a'[os umaadministração subcutânea simples dos agonistas.
A Figura 4B mostra uma mudança no peso corporal noscamundongos da Figura 4A.
A Figura 5A mostra que os efeitos anoréxicos de NMU12 sãomediados pelos receptores de NMURl e NMUR2. A administração aguda deNMU12 foi altamente eficaz em animais do tipo selvagem mas nenhum efeitofoi observado em animais de nocaute duplo NMUR1/NMUR2.
A Figura 5B mostra uma mudança diária no peso corporal doscamundongos em Figura 5A.
A Figura 6A mostra um efeito anorético de NMUl2PEGuilado são mediados tanto pelos receptores NMURl quanto NMUR2. Asreduções na entrada de alimento e de peso corporal (Figura 6B) foramobservadas por dois dias pós-dose nos animais de nocaute NMURl.Entretanto, apenas durante a noite os efeitos foram observados nos animais denocaute NMUR2. Isto está em contraste com os efeitos anoréticos de hNMU-25, que é mediado unicamente por NMURl, demonstrando que o hNMU-25 eNMUl2 tem mecanismo distintos de ação.
A Figura 6B mostra uma mudança no peso corporal doscamundongos na Figura 6A por quatro dias.
A Figura 7A mostra que a administração crônica de NMU12pode reduzir a entrada de alimento e o peso corporal. O NMUl 2 foi dosadotodo dia (QD), dia sim dia não (Q2D) ou a cada três dias (Q3D). A Figuramostra uma mudança cumulativa no peso corporal por nove dias após ocomeço do tratamento. A última dose foi administrada no dia quatro doestudo e as medições foram feitas no dia nove.
A Figura 7B mostra que a entrada cumulativa de alimento doscamundongos na Figura 7A foi significantemente reduzida em todos osparadigmas de dosagem para NMUl2. A entrada de alimento foi reduzida de12 a 27 % nestas doses com relação ao grupo tratado com veículo.
A Figura 7C mostra que a faixa cumulativa no peso corporaldos camundongos em Figura 7A variou de uma perda de 3,3 % a tanto quanto7,3 % com relação ao grupo de controle de veículo.
A Figura 8 mostra uma comparação da estabilidade in vitro dehNMU-25 e NMUl e NMU12 de agonista PEGuilado em plasma comexperimentos de perfuração. A PEGuilação forneceu estabilidade maior emplasma humano. A vida média de hNMU-25 em plasma humano foi menor doque 16 horas, visto que os agonistas PEGuilados apresentaram uma vidamédia maior do que 3 dias em plasma humano incubado a 37° C.
A Figura 9 mostra uma comparação das propriedadesfarmacocinéticas de hNMU-25 e NMU12 de agonista PEGuilado emcamundongos. A PEGuilação forneceu estabilidade metabólica maior in vivo.Os animais foram dosados subcutaneamente com 10 mg/kg de hNMU-25 ouNMUl2. O plasma foi coletado em vários pontos de tempo pós dose e medidono Bioensaio. A linha pontilhada indica os limites de detecção para o ensaio(LOD).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece o agonista do receptor deneuromidina U. O agonista do receptor de neuromedina U descrito neste atuaem receptores de NMU, liga os receptores de NMU e estimula a atividade dereceptor de NMU. Em um aspecto, os agonistas do receptor de neuromedinaU são específicos para um subtipo de receptor, em que tal especificidade édefinida como tendo um valor de IC50 que é menor do que cerca de 200 nMno ensaio de ligação de receptor de NMURl ou NMUR2. A seletividade écom base na atividade funcional ou as razões de EC50 em NMUR2humano/NMURl humano para peptídeos seletivos de NMURle em NMURlhumano/NMUR2 humano para peptídeos seletivos de NMUR2. Além disso,os agonistas seletivos do receptor de neuromedina U descritos neste variam decerca de 21 a 909 vezes o para NMURl e de cerca de 2 a 200 vezes seletivaspara NMUR2. Em um outro aspecto, os agonistas do receptor de neuromedinaU são capazes de ligar e estimular tanto os receptores de NMURl e NMUR2e foram derivados para permitir os agonistas do receptor de neuromedina Ucruzem a barreira sangue-cérebro e interajam com os receptores de NMU nocérebro. Os agonistas do receptor de neuromedina U podem ser usadosterapeuticamente e como ferramentas de pesquisa.
Um ou mais dos agonistas do receptor de neuromedina Upodem ser administrados a um indivíduo para tratar um distúrbio metabólicoque aflige o indivíduo. Tais distúrbios incluem, mas não são limitados a,obesidade, síndrome metabólica ou síndrome X e diabete do tipo II. Ascomplicações de diabete, tais como retinopatia também podem serpositivamente afetadas deste modo. A obesidade é uma comorbidez de, etambém pode contribuir para tais estados de doença como o diabete,hipertensão, dislipidemias, doenças cardiovasculares, cálculos biliares,osteoartrite e certas formas de câncer. A administração de um ou mais dosagonistas do receptor de neuromedina U divulgados neste causa a perda depeso em um indivíduo também pode ser útil na prevenção de tais doenças ecomo parte da terapia para qualquer uma das condições citadas acima, bemcomo outros. Em outras formas de realização, é fornecido um método paratratar uma doença metabólica em um indivíduo que compreende administrarao indivíduo um ou mais dos agonistas do receptor de neuromedina U descritoacima. A doença metabólica pode ser selecionada do grupo que consiste dediabete, síndrome metabólica, hiperglicemia e obesidade e pode seradministrado por intermédio de uma via periférica ao cérebro, tal como umavia oral, mucosal, bucal, sublingual, nasal, retal, subcutânea, transdérmica,intravenosa, intramuscular ou intraperitoneal. Em formas de realizaçãoparticular, os agonistas do receptor de neuromedina U podem ser usados parao tratamento de distúrbios múltiplos em um indivíduo. Como estará evidentepara uma pessoa de habilidade comum na técnica em vista da divulgaçãoneste, os agonistas do receptor de neuromedina U podem ser administrados aum indivíduo para realizar uma redução na entrada de alimento peloindivíduo, para realizar uma redução no ganho de peso no indivíduo, paraevitar o ganho de peso no indivíduo, para afetar a perda de peso no indivíduoe/ou para evitar o reganho de peso no indivíduo.O uso de ferramentas de pesquisa pode envolver o uso de umagonista do receptor de neuromidina Uea presença de um receptor de NMUou fragmento deste. Os exemplos de usos de ferramentas de pesquisa incluema avaliação de compostos ativos em receptores de NMU, determinando apresença de receptores de NMU em uma amostra ou preparação eexaminando o papel e o efeito de NMU. Adicionalmente, os agonistas doreceptor de neuromedina U podem ser usados para a avaliação de Compostosde ligação de NMU (agonistas ou antagonistas) usando-se uma agonista doreceptor de neuromidina U em um experimento de competição comcompostos de teste.
Os agonistas do receptor de neuromedina U da presenteinvenção compreendem a fórmula geral (I)
<formula>formula see original document page 18</formula>
em que o peptídeo tem a seqüência de aminoácido X-X-X-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xi0-Xii-Xi2-Xi3-Xi4-Xi5-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25 (SEQ ID N°: 27) em que os aminoácidos de 1 a 17 podem ser
qualquer aminoácido ou ausentes, em que o aminoácido X está ausente, Y,W, F, um des-aminoácido ou um grupo acila; aminoácido X19 é A, W, Y, F ou
um aminoácido alifático; aminoácido X está ausente, L, G, sarcosina (Sar),D-Leu, NMe-Leu, D-Ala ou A; aminoácido X21 é F, NMe-Phe, umaminoácido alifático, um aminoácido aromático, A ou W; X é R, Κ, A ou L;aminoácido X23 é P, Sar, A ou L; aminoácido X24 é R, Harg ou K e o
Λ{ ι
aminoácido X é N, qualquer D- ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle, AeZ éum grupo de proteção opcionalmente presente que, se presente, é unido aogrupo amino de terminal N; e Z é NH2 ou um grupo de proteçãoopcionalmente presente que, se presente, é unido ao grupo carbóxi de terminalC e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
Em formas de realização particular, o peptídeo compreende aseqüência de aminoácido X1-X2-X3 -X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-Xi3 -X14-X15-X16-X17-Xi8-F-L-F-R-P-R-N (SEQ ID N0: 1) em que os aminoácidosde 1 a 17 podem ser qualquer aminoácido ou ausentes. As seqüências deaminoácido de agonistas do receptor de neuromedina U particulares tendo aseqüência de aminoácido acima são mostrados na Tabela 1.
Em outras formas de realização, o peptídeo compreende aseqüência de aminoácido F-R-V-DE-E-F-Q-S-P-F-A-S-Q-S-R-G-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25 (SEQ ID N°: 7) em que o aminoácido X18 estáausente, Y, W, F, um des-aminoácido ou um grupo acila; aminoácido X19 é A,W, Y, F ou um aminoácido alifático; aminoácido X20 está ausente, G,sarcosina (Sar), D-Leu, NMe-Leu, D-Ala ou A; aminoácido X21 é NMe-Phe,um aminoácido alifático, um aminoácido aromático, A ou W; aminoácido X22é Κ, A ou L; aminoácido X23 é Sar, A ou L; aminoácido X24 é Harg ou K e oaminoácido X25 é qualquer D- ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle, ou A. Osexemplos de peptídeos tendo a seqüência de aminoácido acima são mostradosna Tabela 2.
Ainda, em uma outra forma de realização, o peptídeocompreende a seqüência de aminoácido X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ IDN°: 8) em que o aminoácido X1 está ausente, Y, W, F, um des-aminoácido ouum grupo acila; aminoácido X2 é A, W, Y, F ou um aminoácido alifático;aminoácido X3 está ausente, G, sarcosina (Sar), D-Leu, NMe-Leu, D-Ala ouA; aminoácido X4 é NMe-Phe, um aminoácido alifático, um aminoácidoaromático, A ou W; aminoácido X5 é Κ, A ou L; aminoácido X6 é Sar, A ouL; aminoácido X7 é Harg ou K e o aminoácido X8 é qualquer D- ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle, ou A. Os exemplos de peptídeos tendo aseqüência de aminoácido acima são mostrados na Tabela 2.
Em aspectos particulares, o agonista do receptor deneuromidina U opcionalmente inclui um grupo de proteção covalentementeunido ao grupo amino de terminal N. Um grupo de proteção covalentementeunido ao grupo amino de terminal N dos agonistas do receptor deneuromedina U eduz a reatividade do terminal amino sob condições in vivo.Os grupos de proteção amino incluem alquila Cl-10, alquila Cl-ClOsubstituída, alquenila -C2-10, alquenila -C2-10 substituída, arila, alquil arilaC1-6, -C(O)-(CH2) 1 -6-COON, -C(0)-alquila Cl-6, -C(0)-arila, -C(O)-O-alquila alquila Cl-6 ou -C(0)-0-arila. Em formas de realização particular, ogrupo de proteção de terminal amino é selecionado do grupo que consiste deacetila, propila, succinila, benzila, benziloxicarbonila e t-butiloxicarbonila. Adesaminação do aminoácido de terminal N é uma outra modificação que éconsiderada para a redução da reatividade do terminal amino sob condições invivo.
As composições quimicamente modificadas dos agonistas doreceptor de neuromedina U em que os derivados de agonista do receptor deneuromidina U são ligados a um polímero também estão incluídos dentro doescopo da presente invenção. O polímero selecionado usualmente modificadopara ter um grupo reativo simples, tal como um éster ativo para a acilação ouum aldeído para a alquilação, de modo que o grau de polimerização possa sercontrolado como fornecido nos presente métodos. Incluído dentro do escopode polímeros está uma mistura de polímeros. Preferivelmente, para o usoterapêutico da preparação de produto final, o polímero seráfarmaceuticamente aceitável.
O polímero ou mistura deste podem ser selecionados do grupoque consiste de; por exemplo, polietileno glicol (PEG), monometóxi-polietileno glicol, dextrano, celulose ou outros polímeros com base emcarboidrato, poli-(N-vinil pirrolidona) polietileno glicol, homopolímeros depropileno glicol, um co-polímero de óxido de polipropileno oxideletileno,polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol) e álcool polivinílico.
Ainda, em outras formas de realização, os agonistas doreceptor de neuromedina U são modificados por PEGuilação, colesteroilaçãoou palmitoilação. A modificação pode ser a qualquer resíduo de aminoácidono agonista do receptor de neuromidina U, entretanto, nas formas derealização correntemente preferidas, a modificação é ao aminoácido determinal N do agonista do receptor de neuromedina U, diretamente aoaminoácido de terminal N ou por meio de ligação ao grupo tiol de um resíduode cisteína adicionado ao terminal N ou A ligador adicional ao terminal N talcomo Ttds. Em outras formas de realização, o terminal N do agonista doreceptor de neuromedina U compreende um resíduo de cisteína ao qual umgrupo de proteção é ligado ao grupo amino de terminal N do resíduo decisteína e o grupo de tiolato de cisteína é derivado com N-etilmaleimida,grupo PEG, grupo colesterol ou grupo palmitoíla. Ainda, em outras formas derealização, um resíduo de cisteína acetilado é adicionado ao terminal N dosagonistas do receptor de neuromedina Ueo grupo tiol da cisteína é derivadocom N-etilmaleimida, grupo PEG, grupo colesterol ou grupo palmitoíla.
E conhecido que as propriedades de certas proteínas podem sermoduladas pela ligação de polímeros de polietileno glicol (PEG), queaumenta o volume hidrodinâmico da proteína e, desse modo, diminui suapureza pela filtração pelo rim. (Ver, por exemplo, Clark et al., J. Biol. Chem.271: 21969-21977 (1996)). Portanto, é previsto que os resíduos de peptídeode núcleo podem ser PEGuilados para fornecer os benefícios terapêuticosintensificados, tais como, por exemplo, eficácia aumentada estendendo-se avida média in vivo. Os inventores verificaram que o incluindo um grupo PEGno terminal N do agonista do receptor de neuromedina U, não estende apenasa vida média do soro do agonista PEGuilado do receptor de neuromidina Uem comparação com o peptídeo NMU-25 natural mas também permiteagonistas do receptor de neuromedina U particulares tais como NMU12cruzem a barreira sangue-cérebro e interajam com os receptores de NMUR2no cérebro. No geral, após a administração intravenosa, o NMU-25 natural érapidamente purificado a partir da circulação sistêmica. Como mostrado naFigura 7, a 37 ° C, a vida média de NMU-25 (NMUl) humano intacto ésignificantemente aumentado pela ligação covalente de uma molécula depolietileno glicol ao grupo amino no resíduo de fenilalanina de terminal N damolécula ou ao grupo tiol de um resíduo de cisteína covalentemente unido poruma ligação de amida ao resíduo de fenilalanina de terminal N de NMU-25(NMU12). Desta maneira, a PEGuilação dos agonistas do receptor deneuromedina U melhorarão a farmacocinética e a farmacodinâmica dosagonistas do receptor de neuromedina U.
Os métodos de PEGuilação de peptídeo são bem conhecidosna literatura e descritos na seguinte referência, cada um dos quais éincorporado neste por referência: Lu et al., Int. J. Pept. Protein Res.43: 127-38(1994); Lu et al., Pept. Res. 6: 140-6 (1993); Felix et al., Int. J. Pept. ProteinRes. 46: 253-64 (1995); Gaertner et al., Bioconjug. Chem. 7: 38-44 (1996);Tsutsumi et al., Thromb. Haemost. 77: 168-73 (1997); Francis et al., Int. J.Hematol. 68: 1-18 (1998); Roberts et al., J. Pharm. Sei. 87: 1440-45 (1998); eTan et al., Protein Expr. Purif. 12: 45-52 (1998). Polietileno glicol ou PEG éentendido abranger qualquer uma das formas de PEG que foram usadas paraderivar outras proteínas, que incluem, mas não limitam-se a, mono-alcóxi(Cl-IO) ou arilóxi-polietileno glicol. As porções de PEG adequadas incluem,por exemplo, 40 kDa de metóxi poli(etileno glicol) propionaldeído (Dow,Midland, Michigan); 60 kDa de metóxi poli(etileno glicol) propionaldeído(Dow, Midland, Michigan); 40 kDa de metóxi poli(etileno glicol) maleimido-propionamida (Dow, Midland, Michigan); 31 kDa de alfa-metil-w-(3-oxopropóxi), polioxietileno (NOF Corporation, Tokyo); mPEG2-NHS-40k(Nektar); mPEG2-MAL-40k (Nektar), SUNBRIGHT GL2-400MA((PEG)240 kDa) (NOF Corporation, Tokyo), SUNBRIGHT ME-200MA(PEG20 kDa) (NOF Corporation, Tokyo). Os grupos PEG são, no geral,ligados aos agonistas do receptor de neuromedina U via acilação oualquilação redutiva através de um grupo reativo na porção PEG (por exemplo,um aldeído, amino, tiol ou grupo éster) a um grupo reativo no agonista doreceptor de neuromidina U (por exemplo, um aldeído, amino, tiol ou grupoéster).
As moléculas de PEG podem ser covalentemente ligadas aquaisquer resíduos Lys, Cys ou K(CO(CH2)2SH) em qualquer posição noagonista do receptor de neuromidina U. Os agonistas do receptor deneuromedina U descritos neste podem ser PEGuilados diretamente a qualqueraminoácido no terminal N por meio do grupo amino de terminal N. Um"braço ligador" pode ser ligado ao agonista do receptor de neuromidina Upara facilitar a PEGuilação. A PEGuilação na cadeia secundária de tiol decisteína foi amplamente relatada (Ver, por exemplo, Caliceti & Veronese,Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 1261-77 (2003)). Se não existir resíduo de cisteínano peptídeo, um resíduo de cisteína pode ser introduzido através dasubstituição ou pela adição de uma cisteína ao aminoácido de terminal N.Aqueles agonistas do receptor de neuromedina U, que foram PEGuilados,foram PEGuilados através das cadeias secundárias de um resíduo de cisteínaadicionado ao aminoácido de terminal N.
Alternativamente, as moléculas de PEG podem sercovalentemente ligadas a um grupo amida no terminal C do agonista doreceptor de neuromedina U. No geral, existe pelo menos uma molécula dePEG covalentemente ligado ao agonista do receptor de neuromidina U. Emaspectos particulares, a molécula de PEG é ramificada, enquanto, em outrosaspectos, a molécula de PEG pode ser linear. Em aspectos particulares, amolécula de PEG está entre 1 kDa e 100 kDa em peso molecular. Em outrosaspectos, a molécula de PEG é selecionada de 10, 20, 30, 40, 50 e 60 kDa.Ainda em outros aspectos, é selecionado de 20, 40 ou 60 kDa. Quandoexistem duas moléculas PEG covalentemente ligadas ao agonista do receptorde neuromidina U da presente invenção, cada um é de 1 a 40 kDa e emaspectos particulares, estes tem pesos moleculares de 20 e 20 kDa, 10 e 30kDa, 30 e 30 kDa, 20 e 40 kDa ou 40 e 40 kDa. Em aspectos particulares, osagonistas do receptor de neuromedina U contém mPEG-cisteína. O mPEG emmPEG-cisteína pode ter vários pesos moleculares. A faixa do peso molecularé preferivelmente de 5 kDa a 200 kDa, mais preferivelmente de 5 kDa a 100kDa e ainda preferivelmente de 20 kDa a 60 kDa. O mPEG pode ser linear ouramificado.
Correntemente, é preferível que os agonistas do receptor deneuromedina U são PEGuilados através das cadeias secundárias de umacisteína adicionada ao aminoácido de terminal N. Correntemente, os agonistaspreferivelmente contém mPEG-cisteína. A mPEG em mPEG-cisteína pode tervários pesos moleculares. A faixa do peso molecular é preferivelmente 5 kDaa 200 kDa, mais preferivelmente 5 kDa a 100 kDa e ainda preferivelmente 20kDa a 60 kDa. O mPEG pode ser linear ou ramificado.
Uma estratégia útil para a PEGuilação de agonistas sintéticosdo receptor de neuromedina U consiste da combinação, através da formaçãode uma ligação conjugada na solução, um peptídeo e uma porção PEG, cadaum carregando uma funcionalidade especial que é mutuamente reativo comreação ao outro. Os agonistas do receptor de neuromedina U podem serfacilmente preparados com a síntese de fase sólida convencional. O agonistado receptor de neuromedina U é "pré-ativado" com um grupo funcionalapropriado em um local específico. Os precursores são purificados etotalmente caracterizados antes da reação com a porção de PEG. Aconjugação do polipeptídeo com PEG usualmente acontece e pode serfacilmente monitorada pela HPLC analítica de fase reversa. O agonistaPEGuilado do receptor de neuromidina U pode ser facilmente purificado pelacromatografia trocadora de cátion ou HPLC preparativa caracterizados pelaHPLC analítica, análise de aminoácidos e espectrometria de massa pordessorção a laser.
O agonista do receptor de neuromedina U pode compreenderoutras modificações que não de seqüência, por exemplo, glicosilação,lipidação, acetilação, fosforilação, carboxilação, metilação ou qualquer outramanipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente derotulação. Enquanto isso, em aspectos particulares, o agonista do receptor deneuromidina U aqui, utiliza aminoácidos de ocorrência natural ou isoformasD de aminoácidos de ocorrência natural, substituições com aminoácidos deocorrência não natural (por exemplo, sulfóxido de metionina, metioninametilsulfônio, norleucina, ácido épsilon-aminocapróico, ácido 4-aminobutanóico, ácido tetraidroisoquinolino-3-carboxílico, ácido 8-aminocaprílico, ácido 4-aminobutírico, Lys(N(épsilon)-trifluoroacetila) ouanálogos sintéticos, por exemplo, ácido o-aminoisobutírico, ρ ou y-aminoácidos e análogos cíclicos. Ainda em outros aspectos, os agonistas doreceptor de neuromedina U compreendem uma proteína de fusão que tem umaprimeira porção, que é um agonista do receptor de neuromidina U e umasegunda porção, que é um peptídeo heterólogo.
O agonista do receptor de neuromedina U pode ser modificadopor uma variedade de técnicas químicas para a produção de derivados tendoessencialmente a mesma atividade como o agonista do receptor deneuromidina U não modificado e/ou tendo outras propriedades desejáveis.
Um grupo de proteção covalentemente unido ao grupo carbóxi de terminal Creduz a reatividade do terminal carbóxi sob condições in vivo. Por exemplo,grupos de ácido carboxílico do polipeptídeo, terminal carboxila ou cadeiasecundária, podem ser fornecidos na forma de um sal de um cátionfarmacologicamente aceitável ou esterificado para formar um éster C1-6 ouconvertido a uma amida da fórmula NRR2 em que R e R2 são, cada um, H oualquila C1-6 ou combinados para formar um anel heterocíclico, tal como umanel de 5 ou 6 membros. O grupo de proteção de terminal carbóxi épreferivelmente ligado ao grupo α-carbonila do último aminoácido. Osgrupos de proteção de terminal carbóxi incluem, mas não são limitados a,amida, metilamida e etilamida. Os grupos amino do polipeptídeo, terminalamino ou a cadeia secundária, podem estar na forma de um sal de adiçãoácida farmacologicamente aceitável, tal como HCl5 HBr, acético, benzóico,tolueno sulfônico, maleico, tartárico e outros sais orgânicos ou podem sermodificados a alquila C1-6 ou dialquil amino ou ainda convertido a umaamida.
Os grupos hidroxila do agonista da cadeia secundária dereceptor de neuromedina U podem ser convertidos a alcóxi C1-6 ou a uméster C1-6 usando-se técnicas bem reconhecidas. Fenila e anéis fenólicos dacadeia secundária de polipeptídeo podem ser substituídos por um ou maisátomos halogênios, tais como flúor, cloro, bromo ou iodo ou com alquila Cl-6, alcóxi C1-6, ácidos carboxílicos e ésteres destes; ou amidas de tais ácidoscarboxílicos. Os grupos metileno dos agonistas de cadeia secundária dereceptor de neuromedina U podem ser estendidos a alquilenos C2-4homólogos. Os tióis podem ser protegidos com qualquer um de diversosgrupos de proteção bem reconhecidos, tais como grupos acetamida. Aqueleshabilitados na técnica também reconhecerão métodos para a introdução deestruturas cíclicas nos peptídeos desta invenção para selecionar e fornecerrestrição conformacional para a estrutura que resulta em estabilidadeintensificada. Por exemplo, um resíduo de cisteína de terminal carbóxi ou determinal amino pode ser adicionado ao peptídeo, de modo que quandooxidado o peptídeo conterá uma ligação de bissulfeto, desse modo gerandoum peptídeo cíclico. Outros métodos de ciclização de peptídeo inclui aformação de tioéteres e de amidas de terminal carboxila e amino e ésteres.
Os polímeros de polissacarídeo são um outro tipo de polímeroque pode ser usado para a modificação de proteína. Os dextranos sãopolímeros de polissacarídeo compreendidos de subunidades individuais deglicose predominantemente ligado por ligações α 1-6. O dextrano, por si sóestá disponível em muitas faixas de peso molecular e está facilmentedisponível em pesos moleculares de cerca de 1 kDa a cerca de 70 kDa. Odextrano é um polímero solúvel em água adequado para o uso como umveículo por si só ou em combinação com um outro veículo (Ver, por exemplo,WO 96/11953 e WO 96/05309). O uso de dextrano conjugado comimunoglobulinas terapêuticas ou diagnosticas foi relatado; ver, por exemplo,Publicação de Patente Européia N0 0 315 456. Dextrano de cerca de 1 kDa acerca de 20 kDa é preferido quando o dextrano é usado como um veículo deacordo com a presente invenção.
Como descrito acima, a presença de um grupo "ligador" éopcional. Quando presente, sua estrutura química não é crítica, visto que estaserve primariamente como um espaçador. Entretanto, em certas formas derealização, o ligador pode, por si só fornece propriedades melhoradas àscomposições da presente invenção. O ligador é preferivelmente feito deaminoácidos ligados juntos pelas ligações de peptídeo. Desta maneira, emformas de realização particulares, o ligador é feito de 1 a 20 aminoácidosligados por ligações de peptídeo, em que os aminoácidos são selecionados dos20 aminoácidos de ocorrência natural. Alguns destes aminoácidos podem serglicosilados, como é bem entendido por aqueles na técnica. Em uma forma derealização mais preferida, os 1 a 20 aminoácidos são selecionados de glicina,alanina, prolina, asparagina, glutamina e lisina. Ainda mais preferivelmente,um ligador é feito de uma maioria de aminoácidos que são estericamente nãoimpedidos, tais como glicina e alanina. Desta maneira, os ligadores preferidossão poliglicinas (particularmente (Gly)4, (Gly)5), poli(Gly-Ala), epolialaninas. Outros exemplos específicos de ligadores são (Gly)3Lys(Gly)4;(Gly)3AsnGlySer(Gly)2; (Gly)3Cys(Gly)4 e GlyProAsnGlyGly.
Os ligadores que não de peptídeo também podem ser usados.
Por exemplo, ligadores de alquila, tais como -NH-(CH2)s-C(O)-, em que s = 2a 20 podem ser usados. Estes ligadores de alquila ainda podem sersubstituídos por qualquer grupo não estericamente impedido, tal como, alquilainferior (por exemplo, C1-6) acila inferior, halogênio (por exemplo, Cl, Br),CN, NH2, fenila e outros. Um ligador não peptídico exemplar é um ligadorPEG, em que η é, tal que o ligador tem um peso molecular de 100 a 5000 kD,preferivelmente de 100 a 500 kD. Os ligadores de peptídeo podem seralterados para a formação de derivados da mesma maneira como descrito.Outros ligadores incluem Ttds (ácido l-amino-4,7,10-trioxa-13-tridecanaminosuccinímico).
A presente invenção inclui diastereômeros, bem como suasformas enanciomericamente puras racêmicas e resolvidas. Os agonistas doreceptor de neuromedina U podem conter D-aminoácidos, L-aminoácidos ouuma combinação destes. No geral, os aminoácidos estão na forma de L comaminoácidos particulares na forma D. Como é conhecido na técnica, osaminoácidos individuais podem ser representados como segue:A=Ala=Alanina; C=Cys=Cisteina; D=Asp=Acido aspártico; E=Glu=Acidoglutâmico; F=Phe=Fenilalanina; G=Gly=Glicina; H=His=Histidina;I=Ile=Isoleucina; K=Lys=Lisina; L=Leu=Leucina; M=Met=Metionina;N=Asn=Asparagina; P=Pro=Prolina; Q=Gln=Glutamina; R=Arg=Arginina;S=Ser=Serina; T=Thr=Treonina; V=Val=Valina; W=Trp=Triptofano eY=Tyr=Tirosina.
Os exemplos de agonistas do receptor de neuromedina U dapresente invenção compreendem a seqüência de aminoácido X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xi4-Xii-Xi2-X13-X14-X15-X16-X17-X18-F-L-F-R-P-R-N (SEQ IDN°: 1) em que os aminoácidos de 1 a 17 podem ser qualquer aminoácido ouausentes são mostrados na Tabela 1. Os agonistas do receptor de neuromedinaU são protegidos no terminal C com um grupo amino e nenhum terminal Ncom um grupo acetila (exceto para o agonista do receptor de neuromidina UNMU1). Com a exceção do agonista do receptor de neuromidina U NMU2, osagonistas do receptor de neuromedina U ainda incluem um resíduo de cisteínano terminal N ao qual o grupo acetila está covalentemente ligado ao grupoamino do resíduo de cisteína. Como mostrado na tabela, para muitos dosagonistas do receptor de neuromedina U, o grupo tiol do resíduo de cisteína éreagido com um segundo grupo. Por exemplo, para agonistas do receptor deneuromedina U na tabela mostrada com um Ci no terminal Ν, o agonista doreceptor de neuromidina U tem um resíduo de cisteína N-acetilado noterminal N do agonista do receptor de neuromedina U ligado por meio de seugrupo tiol à N-etilmaleimidila; para agonistas do receptor de neuromedina Una tabela mostrada com um C2 no terminal Ν, o agonista do receptor deneuromedina U tem um resíduo de cisteína N-acetilado no terminal N doagonista do receptor de neuromedina U ligado por meio de seu grupo tiol aum (PEG)240 kDa; para agonistas do receptor de neuromedina U mostradocom um C4 no terminal N do agonista do receptor de neuromidina U, oagonista do receptor de neuromidina U tem um resíduo de cisteína N-acetilado no terminal N do agonista do receptor de neuromedina U ligado pormeio de seu grupo tiol a um (PEG)20 kDa; para os agonistas do receptor deneuromedina U mostrados com um C5 no terminal N do agonista do receptorde neuromidina U, o agonista do receptor de neuromidina U tem um resíduode cisteína N-acetilado no terminal N do agonista do receptor de neuromedinaU ligado por meio de seu grupo tiol a um (PEG)220 kDa; para agonistas doreceptor de neuromedina U mostrados com um C6 no terminal N do agonistado receptor de neuromidina U, o agonista do receptor de neuromidina U temum resíduo de cisteína N-acetilado no terminal N do agonista do receptor deneuromedina U ligado por meio de seu grupo tiol a um (PEG)40 kDa; paraagonistas do receptor de neuromedina U mostrados com um C3 no terminal Ndo agonista do receptor de neuromidina U, o agonista do receptor deneuromidina U tem um resíduo de cisteína N-acetilado no terminal N doagonista do receptor de neuromedina U ligado por meio de seu grupo tiol aocolesterol.Tabela 1 <table>table see original document page 30</column></row><table>C = cisteína; Pl = (PEG)240 kDa; Cj = Cys(N-etilmaleimidila), C2 = Cys(PEG)240kDa,C4 = Cys(PEG)20 kDa, C5 = Cys(PEG)220 kDa, C6 = Cys(PEG)40 kDa cada umcorrespondendo a um resíduo de cisteína PEGuilado por intermédio do tiol de cadeialateral com um PEG ramificado [(PEG)2] ou um PEG linear do MW indicado; C3 =Cys(Colesteroila), correspondente a um resíduo de cisteína ligado ao colesterol porintermédio do tiol de cadeia secundária; Ttds, ácido l-amino-4,7,10-trioxa-13-tridecanamino succinímico; a, D-Alanina; Ac = acetila; Pam = palmitoíla._
Os agonistas do receptor de neuromedina U mostrados naTabela 1, com a exceção daqueles agonistas do receptor de neuromedina Uque compreendem a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 25, sãobiespecíficos em que estes podem ligar e ativar receptores de NMURl ouNMUR2. Os agonistas do receptor de neuromedina U que compreendem SEQID N°: 25 foram observados ser específicos de NMURl. A PEGuilação dosagonistas do receptor de neuromedina U mostrada na tabela 1 parece estendera vida média do soro dos agonistas do receptor de neuromedina U esignificantemente, tornar os agonistas do receptor de neuromedina Uparticulares tais como NMUl2 capazes de cruzar a barreira sangue-cérebro.Por exemplo, como mostrado no Exemplo 4 e Figuras 6A e 6B, NMUl2 foimostrado ser capaz de reduzir a entrada de alimento e reduzir o ganho de pesoem camundongos de nocaute Nmurl. Os resultados indicam que os NMUl2 depeptídeo PEGuilados administrados perifericamente foram capazes de cruzara barreira sangue-cérebro. A PEGuilação pareceu estender a vida média dosoro de NMU1, NMU9 e NMU20 por três dias e NMUl 1 e NMU18 por doisdias. O NMU9 e o NMUl2 diferem pela fonte de (PEG)240 kDacovalentemente unida ao grupo tiol do resíduo de cisteína de terminal N.
Os exemplos de agonistas do receptor de neuromedina U dapresente invenção que compreende a seqüência de aminoácido F-R-V-D-E-E-F-Q-S-P-F-A-S-Q-S-R-G-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25 (SEQ ID N°: 7)ou X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID N°: 8) em que o aminoácido X18 ouX1 está ausente, Y, W, F, um des-aminoácido ou um grupo acila; aminoácidoX ou X" é A, W, Y, F ou um aminoácido alifático; aminoácido X ou Xestá ausente, G, sarcosina (Sar), D-Leu, NMe-Leu, D-Ala ou A; aminoácidoX ou X4 é NMe-Phe, um aminoácido alifático, um aminoácido aromático, Aou W; aminoácido X ou
X é Κ, A ou L; aminoácido X ou X0 é Sar, A ouL: aminoácido X ou X7 é Harg ou K e o aminoácido X25 ou X8 é qualquer D-ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle5 ou A. Os exemplos de peptídeos tendo aseqüência de aminoácido acima são mostrados na Tabela 2. No geral, opeptídeos que compreende SEQ ID N°: 7 ou SEQ ID N°: 8 são específicospara o receptor de NMURl; entretanto, como mostrado nos Exemplos, osagonistas do receptor de neuromedina U N, O e P são biespecíficos.
Tabela 2
<table>table see original document page 32</column></row><table>
Ainda são fornecidas composições farmacêuticas quecompreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais dosagonistas do receptor de neuromedina U divulgados neste para o tratamentode um distúrbio metabólico em um indivíduo. Tais distúrbios incluem, masnão são limitados a, obesidade, síndrome metabólica ou síndrome X, diabetedo tipo II, complicações de diabete, tais como retinopatia, hipertensão,dislipidemias, doenças cardiovasculares, cálculos biliares, osteoartrite e certasformas de câncer. Os distúrbios relacionados com obesidade aqui, sãoassociados com, causados por ou resultado de obesidade.
"Obesidade" é uma condição em que existe um excesso degordura corporal. A definição operacional de obesidade é fundamentada noíndice de Massa Corporal (BMI), calculado como peso corporal ou altura emmetros quadrados (kg/m ). "Obesidade" refere-se a uma condição pela qual,um paciente de outra maneira saudável tem um índice de Massa Corporal(BMI) maior do que ou igual a 30 kg/m2 ou uma condição pela qual umpaciente com pelo menos uma co-morbidez tem um BMI maior do que ouigual a 27 kg/m2. Um "paciente obeso" é um paciente de outra maneirasaudável com um índice de Massa Corporal (BMI) maior do que ou igual a 30kg/m ou um paciente com pelo menos uma co-morbidez com um BMI maiordo que ou igual a 27 kg/m2. Um "paciente em risco de obesidade" é umpaciente de outra maneira saudável com um BMI de 25 kg/m2 a menos do que30 kg/m ou um paciente com pelo menos uma co-morbidez com um BMI dekg/m2 a menos do que 27 kg/m2.
Os riscos aumentados associados com obesidade ocorrem emum índice de Massa Corporal (BMI) menor em asiáticos. Em países da Ásia,incluindo o Japão, "obesidade" refere-se a uma condição em que um pacientecom pelo menos uma co-morbidez induzida por obesidade ou relacionadacom a obesidade que requer redução de peso que deve ser melhorada pelaredução de peso, tem um BMI maior do que ou igual a 25 kg/m2. Em paísesasiáticos, incluindo o Japão, um "paciente obeso" refere-se a um paciente compelo menos uma co-morbidez induzida por obesidade ou relacionada com aobesidade que requer a redução de peso ou que deve ser melhorado pelaredução de peso, com um BMI maior do que ou igual a 25 kg/m2. Em paísesasiáticos, um "paciente em risco de obesidade" é um paciente com a BMImaior do que 23 kg/m a menos do que 25 kg/m2.
Como usado neste, o termo "obesidade" é entendido abrangertodas as definições acima de obesidade.
Co-morbidez induzida por obesidade ou relacionada comobesidade incluem, mas não são limitados a, diabete, diabete melito nãodependente de insulina - tipo 2, tolerância à glicose prejudicada, glicose emjejum prejudicada, síndrome de resistência à insulina, dislipidemia,hipertensão, hiperuricacidemia, gota, doença da artéria coronária, infarto domiocárdio, angina do peito, síndrome da apnéia do sono, síndrome dePickwickian, fígado gorduroso; infarto cerebral, trombose cerebral, ataqueisquêmico transitório, distúrbios ortopédicos, artrite deformante, lumbodinia,emeniopatia e infertilidade. em particular, co-morbidades incluem:hipertensão, hiperlipidemia, dislipidemia, intolerância à glicose, doençascardiovasculares, apnéia do sono, diabete melito e outras condiçõesrelacionadas com a obesidade.
"Tratamento" (de obesidade e distúrbios relacionados com aobesidade) refere-se à administração dos compostos da presente invençãopara reduzir ou manter peso corporal de um paciente obeso. Uma resposta dotratamento pode ser a redução do peso corporal de paciente obeso com relaçãoàquele peso corporal do paciente imediatamente antes da administração doscompostos da presente invenção. Uma outra resposta de tratamento pode ser aprevenção do reganho do peso corporal peso corporal previamente perdidocomo o resultado de uma dieta, exercício ou farmacoterapia. Uma outraresposta de tratamento pode ser a diminuição da ocorrência de e/ou dagravidade das doenças relacionadas com a obesidade. O tratamento poderesultar adequadamente em uma redução na entrada de alimento ou caloriapelo paciente, incluindo uma redução na entrada de alimento total ou umaredução de entrada de componentes específicos a dieta, tais comocarboidratos ou gorduras e/ou a inibição de absorção de nutriente e/ou ainibição da redução da taxa metabólica e na redução de peso em pacientes emnecessidade deste. O tratamento também pode resultar em uma alteração dataxa metabólica, tal como um aumento na taxa metabólica, em vez disso oualém de uma inibição na redução da taxa metabólica e/ou na minimização daresistência metabólica que normalmente resulta da perda de peso.
"Prevenção" (de obesidade e distúrbios relacionados com aobesidade) refere-se à administração dos compostos da presente invençãopara reduzir ou manter o peso corporal de um paciente em risco de obesidade.Uma resposta de prevenção pode ser a redução do peso corporal de umpaciente em risco de obesidade com relação àquele peso corporal do pacienteimediatamente antes da administração dos compostos da presente invenção.Uma outra resposta de prevenção pode ser a prevenção do peso corporalreganho de peso corporal previamente perdido como um resultado de umadieta, exercício ou farmacoterapia. Uma outra resposta de prevenção pode serprevenir que a obesidade ocorra se o tratamento foi administrado antes doinício da obesidade em um paciente em risco de obesidade. Uma outraresposta de prevenção pode ser a diminuição da ocorrência e/ou gravidade dedistúrbios relacionados com a obesidade se o tratamento for administradoantes do início da obesidade em um paciente em risco de obesidade. Alémdisso, se o tratamento ou começado em pacientes já obesos, tal tratamentopode evitar a ocorrência, progressão ou gravidade de distúrbios relacionadoscom a obesidade, tais como, mas não limitados a, arteriosclerose, Diabete dotipo II, doença ovariana policística, doenças cardiovasculares, osteoartrite,distúrbios dermatológicos, hipertensão, resistência à insulina,hipercolesterolemia, hipertrogliceridemia e colelitiase.
Os distúrbios relacionados com obesidade aqui, são associadoscom, causados por ou resulta de obesidade. Os exemplos de distúrbiosrelacionados com a obesidade incluem superalimentação e bulimia,hipertensão, diabete, concentrações de insulina no plasma elevadas eresistência à insulina, dislipidemias, hiperlipidemia, câncer endometrial,mama, próstata e de cólon, osteoartrite, apnéia do sono obstrutiva, colelitiase,cálculos biliares, doença cardíaca, ritmos e arritmias cardíacas anormais,infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva, doença cardíacacoronária, morte súbita, acidente vascular cerebral, doença ovarianapolicística, craniofaringioma, síndrome de Prader-Willi, síndrome deFrohlich, pacientes deficientes de GH, estatura curta variante normal,síndrome de Turner e outras condições patológicas que apresentam atividademetabólica reduzida ou uma diminuição no gasto de energia em repousocomo uma porcentagem de massa livre gordurosa total, por exemplo, criançascom leucemia linfoblástica aguda. Outros exemplos de distúrbiosrelacionados com a obesidade são síndrome metabólica, também conhecidocomo síndrome X, síndrome de resistência à insulina, disfunção sexual ereprodutiva, tal como infertilidade, hipogonadismo em machos e hirsutismoem fêmeas, distúrbios de motilidade gastrointestinal, tais como refluxo gastro-esofágico relacionado com a obesidade, distúrbios respiratórios, tais comosíndrome de obesidade-hipoventilação (síndrome de Pickwickian), distúrbioscardiovasculares, inflamação, tais como inflamação sistêmica da vasculatura,arteriosclerose, hipercolesterolemia, hiperuricemia, dor lombar, doença davesícula biliar, gota e câncer renal. Os compostos da presente invençãotambém são úteis para a redução do risco de respostas secundárias àobesidade, tais como a redução do risco de hipertrofia ventricular esquerda.
O termo "diabete," como usado neste, inclui tanto diabetemelito dependente de insulina (IDDM, também conhecido como diabete dotipo I) e diabete melito não dependente de insulina (NIDDM, tambémconhecido como diabete do tipo II). Diabete do tipo I ou diabete dependentede insulina, é o resultado de uma deficiência absoluta de insulina, o hormônioque regula a utilização da glicose. O diabete do tipo II ou diabeteindependente de insulina (isto é, diabete melito não dependente de insulina),também ocorre na face de níveis normais ou ainda elevados de insulina eparece ser o resultado da incapacidade dos tecidos responderemapropriadamente à insulina. A maioria dos diabéticos do tipo II também sãoobesos. Os compostos da presente invenção são úteis para tratar diabete tantodo tipo I quanto do tipo II. Os compostos são especialmente eficazes para otratamento de diabete do tipo II. Os compostos da presente invenção tambémsão úteis para tratar e/ou evitar diabete melito gestacional.
Os agonistas do receptor de neuromedina U divulgados nestepodem ser usados em uma composição farmacêutica quando combinados comum carreador farmaceuticamente aceitável. Tais composições compreendemuma quantidade terapeuticamente eficaz do agonista do receptor deneuromedina U e um carreador farmaceuticamente aceitável. Uma talcomposição também pode ser compreendida de (além do agonista do receptorde neuromidina U e um carreador) diluentes, enchedores, sais, tampões,estabilizadores, solubilizadores e outros materiais bem conhecidos na técnica.As composições que compreendem os agonistas do receptor de neuromedinaU podem ser administrados, se desejado, na forma de sais contanto que os saissejam farmaceuticamente aceitáveis. Os sais podem ser preparados usando-seos procedimentos padrão conhecidos por aqueles habilitados na técnica dequímica orgânica sintética.
O termo "indivíduo" é entendido incluir seres humanos eanimais de companhia e domesticados, tais como cães, gatos, cavalos eoutros. Portanto, as composições que compreendem a fórmula I também sãoúteis para tratar ou prevenir obesidade e distúrbios relacionados com aobesidade em cães e gatos. Como tal, o termo "mamífero" inclui animais decompanhia, tais como cães e gatos.
O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a saispreparados a partir de bases e ácidos não tóxicos farmaceuticamenteaceitáveis incluindo as bases orgânicas ou inorgânicas e ácidos inorgânicos ouorgânicos. Os ais derivados de bases inorgânicos incluem sais de alumínio,amônio, cálcio, cobre, férrico, ferroso, lítio, magnésio, mangânicos,manganosos, potássio, sódio, zinco e outros. Particularmente preferidos são ossais de amônio, cálcio, magnésio, potássio e sódio. Os sais derivados de basesnão tóxicas orgânicas farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de aminasprimárias secundárias e terciárias, aminas substituídas incluindo aminassubstituídas de ocorrência natural, aminas cíclicas e resinas trocadorasbásicas, tais como arginina, betaína, cafeína, colina, N,N'-dibenziletilenodiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilenodiamina, N-etilmorfolina, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina,isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina,resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina,trimetilamina, tripropilamina, trometamina e outros. O termo "salfarmaceuticamente aceitável" ainda inclui todos os sais farmaceuticamenteaceitáveis, tais como acetato, lactobionato, benzenossulfonato, laurato,benzoato, malato, bicarbonato, maleato, bissulfato, mandelato, bitartarato,mesilato, borato, brometo de metila, brometo, nitrato de metila, edetato decálcio, sulfato de metila, camsilato, mucato, carbonato, napsilato, cloreto,nitrato, clavulanato, N-metilglucamina, citrato, sal de amônio, dicloridreto,oleato, edetato, oxalato, edisilato, pamoato (embonato), estolato, palmitato,esilato, pantotenato, fiimarato, fosfato/difosfato, gluceptato,poligalacturonato, gluconato, salicilato, glutamato, estearato,glicolilarsanilato, sulfato, hexilresorcinato, subacetato, hidrabamina,succinato, bromidreto, tanato, cloridreto, tartarato, hidroxinaftoato, teoclato,iodeto, tosilato, isotionato, trietiodeto, lactato, panoato, valerato e outros quepodem ser usados como uma forma de dosagem para modificar ascaracterísticas de solubilidade ou hidrólise ou podem ser usados nasformulações de liberação ou de pró-medicamento. Será entendido que, comousado neste, as referências aos agonistas do receptor de neuromedina U dafórmula geral (I) também são entendidos incluir os sais farmaceuticamenteaceitáveis.
Como utilizados neste, o termo "farmaceuticamente aceitável"significa um material não tóxico que não interfere com a eficácia da atividadebiológica dos ingredientes ativos, aprovados pela agência reguladora dogoverno federal ou de um estado ou listado na U.S. Pharmacopoeia ou, nogeral, outra farmacopéia utilizada para o uso em animais e, maisparticularmente em seres humanos. O termo "carreador" refere-se a umdiluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o terapêutico éadministrado e inclui, mas não é limitado a tais líquidos estéreis como água eóleos. As características do carreador dependerão da via de administração. Oagonista do receptor de neuromedina U pode estar em multímeros (porexemplo, heterodímeros ou homodímeros) ou complexos por si próprios oucom outros peptídeos. Como um resultado, as composições farmacêuticas dainvenção podem compreender um ou mais agonistas do receptor deneuromedina U em tal forma multimérica ou complexada.
Como usado neste, o termo "quantidade terapeuticamenteeficaz" significa a quantidade total de cada componente ativo da composiçãofarmacêutica ou método que é suficiente para mostrar um benefíciosignificativo do paciente, isto é, tratamento, cura, prevenção ou melhora dacondição médica relativa ou um aumento na taxa de tratamento, cura,prevenção ou melhora de tais condições. Quando aplicado a um ingredienteativo individual, administrado sozinho, o termo refere-se apenas àqueleingrediente. Quando aplicado a uma combinação, o termo refere-se aquantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeitoterapêutico, administrados em combinação, serial ou simultaneamente.
A composição farmacológica pode compreender um ou maisagonistas do receptor de neuromedina U; um ou mais agonistas do receptor deneuromedina U e um ou mais outros agentes para o tratamento de umdistúrbio metabólico ou a composição farmacológica que compreende os umou mais agonistas do receptor de neuromedina U podem ser usadosconcorrentemente com a composição farmacológica que compreende umagente para o tratamento de um distúrbio metabólico. Tais distúrbios incluem,mas não são limitados a, obesidade, síndrome metabólica ou síndrome X,diabete do tipo II, complicações da diabete, hipertensão, dislipidemias,doenças cardiovasculares, cálculos biliares, osteoartrite e certas formas decâncer.
Quando a composição farmacológica compreende um outroagente para o tratamento de um distúrbio metabólico ou o tratamento incluiuma segunda composição farmacológica que compreende um agente para otratamento de um distúrbio metabólico, o agente inclui, mas não são limitadosa, antagonistas receptores de canabinóide (CB1), agonistas do receptor de(GU-I) peptídeo 1 semelhante ao glucagon, inibidores de lipase, leptina,tetraidrolipstatina, 2-4-dinitrofenol, acarbose, sibutramina, fentamina,bloqueadores de absorção graxos, simvastatina, mevastatina, ezetimiba,atorvastatin, sitagliptin, metformin, orlistat, Qnexa, topiramato, naltrexona,bupriopiona, fentermina, losartan, losartan com hidroclorotiazida e outros.
Os agentes adequados de uso em combinação com umcomposto da composto da presente invenção, incluem, mas não são limitadosa:
(a) agentes anti-diabéticos tais como (1) agonistas PPAR-γ taiscomo glitazonas (por exemplo, ciglitazona; darglitazona; englitazona;isaglitazona (MCC-555); pioglitazona (ACTOS); rosiglitazona (AVANDIA);troglitazona; rivoglitazona, BRL49653; CLX-0921; 5-BTZD, GW-0207, LG-100641, R483 e LY-300512 e outros e compostos divulgados em WO97/10813, 97/27857, 97/28115, 97/28137, 97/27847, 03/000685, e 03/027112e SPPARMS (moduladores de PPAR gama seletivos) tais como Tl31(Amgen), FK614 (Fujisawa), netoglitazona e metaglidasen; (2) biguanidastais como buformin; metformin e fenformin e outros; (3) inibidores deproteína tirosina fosfatase-ΙΒ (PTP-1B), tais como ISIS 113715, A-401674,A-364504, IDD-3, IDD 2846, KP-40046, KR61639, MC52445, MC52453,C7, OC-060062, OC-86839, 0C29796, TTP-277BC1 e aqueles agentesdivulgados em WO 04/041799, 04/050646, 02/26707, 02/26743, 04/092146,03/048140, 04/089918, 03/002569, 04/065387, 04/127570 e US2004/167183; (4) sulfoniluréias, tais como acetoexamida; clorpropamida;diabinese; glibenclamida; glipizida; gliburida; glimepirida; gliclazida;glipentida; gliquidona; glisolamida; tolazamida e tolbutamida e outros; (5)meglitinida, tais como repaglinida, metiglinida (GLUFAST) e nateglinida eoutros; (6) inibidores da alfa glucosida hidrolase, tais como acarbose;adiposina; camiglibose; emiglitato; miglitol; voglibose; pradimicin-Q;salbostatina; CKD-711; MDL-25,637; MDL-73,945 e MOR 14 e outros; (7)inibidores de alfa-amilase, tais como tendamistat, trestatin, e A1-3 688 eoutros; (8) secreatagogos de insulina, tais como linoglirida, nateglinida,mitiglinida (GLUFAST), DllOl A-4166 e outros; (9) inibidores da oxidaçãode ácido graxo, tais como clornoxir e etomoxir e outros; (10) antagonistas deA2, tais como midaglizol; isaglidol; deriglidol; idazoxan; earoxan efluparoxan e outros; (11) insulina ou miméticos de insulina, tais como biota,LP-100, novarapid, insulina detemir, insulina lispro, insulina glargina,suspensão de zinco de insulina (lente e ultralente); Lys-Pro insulina, GLP-I(17-36), GLP-I (73-7) (insulintropina); GLP-I (7-36)-NH2)exenatida/Exendin-4, Exenatida LAR, Linaglutida, AVE0010, CJC 1131,BIM51077, CS 872, TH0318, BAY-694326, GPOIO, ALBUGON (GLP-1fundido à albumina), HGX-007 (agonista Epac), S-23521, e compostosdivulgados em WO 04/022004, WO 04/37859 e outros; (12) não-tiazolidinodionas, tais como JT-501 e farglitazar (GW-2570/GI-262579) eoutros; (13) agonistas duplos PPARa/γ tais como AVE 0847, CLX-0940,GW-1536, GW1929, GW-2433, KRP-297, L-796449, LBM 642, LR-90,LY510919, MK-0767, ONO 5129, SB 219994, TAK-559, TAK-654, 677954(GlaxoSmithkline), E-3030 (Eisai), LY510929 (Lilly), AK109 (Asahi),DRF2655 (Dr. Reddy), DRF8351 (Dr. Reddy), MC3002 (Maxocore),TY51501 (ToaEiyo), naveglitazar, muraglitizar, peliglitazar, tesaglitazar(GALIDA), reglitazar (JTT-501), chiglitazar e aqueles divulgados em WO99/16758, WO 99/19313, WO 99/20614, WO 99/38850, WO 00/23415, WO00/23417, WO 00/23445, WO 00/50414, WO 01/00579, WO 01/79150, WO02/062799, WO 03/033481, WO 03/033450, WO 03/033453 e (14) outrosmedicamentos sensibilizadores de insulina; (15) agonistas do receptor deVPAC2; (16) moduladores de GLK, tais como PSN105, RO 281675, RO274375 e aqueles divulgados no WO 03/015774, WO 03/000262, WO03/055482, WO 04/046139, WO 04/045614, WO 04/063179, WO 04/063194,WO 04/050645 e outros; (17) moduladores de retinóide tais como aquelesdivulgados no WO 03/000249; (18) inibidores de GSK 3beta/GSK 3 taiscomo 4-[2-(2-bromofenil)-4-(4-fluorofenil-lH-imidazol-5-il]piridina,CT21022, CT20026, CT-98023, SB-216763, SB410111, SB-675236, CP-70949, XD4241 e aqueles compostos divulgados em WO 03/037869,03/03877, 03/037891, 03/024447, 05/000192, 05/019218 e outros; (19)inibidores de glicogeno fosforilase (HGLPa), tais como AVE 5688, PSN 357,GPi-879, aqueles divulgados em WO 03/037864, WO 03/091213, WO04/092158, WO 05/013975, WO 05/013981, US 2004/0220229 e JP 2004-196702 e outros; (20) promotores do consumo de ATP, tais como aquelesdivulgados em WO 03/007990; (21) combinações fixadas de antagonistas dePPARy e metformina, tais como AVANDAMET; (22) agonistas de PPAR pantais como GSK 677954; (23) GPR40 (receptor ligado à proteína G 40)também denominado SNORF 55, tal como BG 700 e aqueles divulgados emWO 04/041266, 04/022551, 03/099793; (24) GPRl 19 (também denominadoRUP3; SNORF 25) tal como RUP3, HGPRBMY26, PFI 007, SNORF 25;(25) antagonistas do receptor de adenosina 2B, tais como ATL-618, AT1-802,E3080 e outros; (26) inibidores de carnitina palmitoil transferase, tais comoST 1327 e ST 1326 e outros; (27) inibidores de frutose 1,6-bisfosfatase, taiscomo CS-917, MB7803 e outros; (28) antagonistas de glucagon, tais comoAT77077, BAY 694326, GW 4123X, NN2501 e aqueles divulgados em WO03/064404, WO 05/00781, US 2004/0209928, US 2004/029943 e outros; (30)inibidores de glicose-6-fosfase; (31) inibidores de fosfoenolpiruvatocarboxiquinase (PEPCK); (32) ativadores da piruvato desidrogenase quinase(PDK); (33) agonistas de RXR, tais como MC1036, CS00018, JNJ 10166806,e aqueles divulgados em WO 04/089916, US 6759546 e outros; (34)inibidores de SGLT tais como AVE 2268, KGT 1251, T1095/RWJ 394718;(35) BLX-1002;
(b) agentes redutores de lipídeo, tais como (1) sequestrantesde ácido bílico, tais como colestiramina, colesevelem, colestipol,dialquilaminoalquila de um dextrano reticulado; Colestid®; LoCholest® eQuestran® e outros; (2) inibidores de HMG-CoA redutase, tais comoatorvastatin, itavastatin, pitavastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin,rivastatin, rosuvastatin, simvastatin, rosuvastatin (ZD-4522) e outros,particularmente simvastatin; (3) inibidores da HMG-CoA sintase; (4)inibidores da absorção de colesterol, tais como FMVP4 (Forbes Medi-Tech),KT6-971 (Kotobuki Pharmaceutical), FM-VA12 (Forbes Medi-Tech), FM-VP-24 (Forbes Medi-Tech), estanol ésteres, beta-sitosterol, esterol glicosidas,tais como tiquesida e azetidinonas tais como ezetimibe e aqueles divulgadosem WO 04/005247 e outros; (5) inibidores de acil coenzima A -colesterol aciltransferase (ACAT) tais como avasimibe, eflucimibe, pactimibe (KY505),SMP 797 (Sumitomo), SM32504 (Sumitomo) e aqueles divulgados em WO03/091216 e outros; (6) inibidores de CETP tais como JTT 705 (JapanTobacco), torcetrapib, CP 532,632, BAY63-2149 (Bayer), SC 591, SC 795 eoutros; (7) inibidores de esqualeno sintase; (8) anti-oxidantes, tais comoprobucol e outros; (9) agonistas de PPARa, tais como beclofibrato,benzafibrato, ciprofibrato, clofibrato, etofibrato, fenofibrato, gemcabeno egemfibrozil, GW 7647, BM 170744 (Kowa), LY518674 (Lilly), GW590735(GlaxoSmithkline), KRP-101 (Kyorin), DRF10945 (Dr. Reddy), NS-220/R1593 (Nippon Shinyaku/Roche, ST1929 (Sigma Tau)MC3001/MC3004 (MaxoCore Pharmaceuticals, gemcabeno cálcio outrosderivados de ácido fíbrico, tais como Atromid®, Lopid® e Tricor® e aquelesdivulgados em US 6.548.538 e outros; (10) moduladores de receptor de FXR,tais como GW 4064 (GlaxoSmithkline), SR 103912, QRX4Ol, LN-6691 (LionBioscience) e aqueles divulgados em WO 02/064125, WO 04/045511 eoutros; (11) moduladores do receptor de LXR, tais como GW 3965(GlaxoSrnithkline), T9013137 e XTCO179628 (X-CeptorTherapeutics/Sanyo) e aqueles divulgados em WO 03/031408, WO03/063796, WO 04/072041 e outros; (12) inibidores da síntese delipoproteína, tais como niacina; (13) inibidores do sistema reninaangiotensina; (14) agonistas parciais de PPAR 8, tais como aquelesdivulgados em WO 03/024395; (15) inibidores da reabsorção de ácido bílico,tais como BARI 1453, SC435, PHA3 84640, S8921, AZD7706 e outros esequestrantes de ácido bílico, tais como colesevelam (WELCHOL/CHOLESTAGEL), (16) os agonistas PPARy tais como GW 501516 (Ligand,GSK), GW 590735, GW-0742 (GlaxoSmithkline), T659 (Arngen/Tularik),LY934 (Lilly), NNC610050 (Novo Nordisk) e aqueles divulgados em WO97/28149, WO 01/79197, WO 02/14291, WO 02/46154, WO 02/46176, WO02/076957, WO 03/016291, WO 03/033493, WO 03/035603, WO 03/072100,WO 03/097607, WO 04/005253, WO 04/007439 e JP10237049 e outros; (17)inibidores da síntese de triglicerídeo; (18) inibidores do transportemicrossômico (MTTP), tais como implitapide, LAB687, JTTl30 (JapanTobacco), CP346086 e aqueles divulgados em WO 03/072532 e outros; (19)moduladores de transcrição; (20) inibidores da esqualeno epoxidase; (21)indutores do receptor de lipoproteína de densidade baixa (LDL); (22)inibidores da agregação de plaquetas; (23) inibidores de 5-LO ou FLAP e (24)agonistas do receptor de niacina incluindo agonistas do receptor de HM74A;(25) moduladores de PPAR tais como aqueles divulgados em WO 01/25181,WO 01/79150, WO 02/79162, WO 02/081428, WO 03/016265, WO03/033453; (26) cromo ligado à niacina, como divulgado no WO 03/039535;
(27) derivados de ácido substituídos divulgados no WO 03/040114; (28) HDLinfuso, tal como LUV/ETC-588 (Pfizer), APO-Al Milano/ETC216 (Pfizer),ETC-642 (Pfizer), ISIS301012, D4F (Bruin Pharma), ApoAl triméricosintético, Bioral Apo Al alvejado a células de espuma e outros; (29)inibidores de IBAT, tais como BARI143/HMR145A/HMR1453 (Sanofi-Aventis, PHA384640E (Pfizer), S8921 (Shionogi) AZD7806 (AstrZeneca),AKl05 (Asah Kasei) e outros; (30) inibidores de Lp-PLA2, tais comoSB480848 (GlaxoSmithkline), 659032 (GlaxoSmithkline), 677116(GlaxoSmithkline) e outros; (31) outros agentes que afetam a composiçãolípica incluindo ETC1001/ESP31015 (Pfizer), ESP-55016 (Pfizer), AGI1067(AtheroGenics), AC3056 (Amylin), AZD4619 (AstrZeneca) e
(c) agentes anti-hipertensivos, tais como (1) diuréticos, taiscomo tiazidas, incluindo clortalidona, clortiazida, diclorofenamida,hidroflumetiazida, indapamida e hidroclorotiazida; diuréticos de arco, taiscomo bumetanida, ácido etacrínico, furosemida e torsemida; agentes esparsosde potássio, tais como amilorida e triamtereno e antagonistas de aldosterona,tais como espironolactona, epirenona e outros; (2) bloqueadores beta-adrenérgicos, tais como acebutolol, atenolol, betaxolol, bevantolol, bisoprolol,bopindolol, carteolol, carvedilol, celiprolol, esmolol, indenolol, metaprolol,nadolol, nebivolol, penbutolol, pindolol, propanolol, sotalol, tertatolol,tilisolol e timolol e outros; (3) bloqueadores do canal de cálcio, tais comoamlodipina, aranidipina, azelnidipina, barnidipina, benidipina, bepridil,cinaldipina, clevidipina, diltiazem, efonidipina, felodipina, gallopamil,isradipina, lacidipina, lemildipina, lercanidipina, nicardipina, nifedipina,nilvadipina, nimodepina, nisoldipina, nitrendipina, manidipina, pranidipina everapamila e outros; (4) inibidores de enzimas convertedoras de angiotensina(ACE), tais como benazeprila; captoprila; cilazaprila; delaprila; enalaprila;fosinoprila; imidaprila; losinoprila; moexiprila; quinaprila; quinaprilat;ramiprila; perindoprila; perindroprila; quaniprila; spiraprila; tenocaprila;trandolaprila e zofenoprila e outros; (5) inibidores da endopeptidase neutra,tais como omapatrilat, cadoxatril e ecadotril, fosidotril, sampatrilat,AVE7688, ER4030 e outros; (6) antagonistas de endotelina, tais comotezosentan, A308165 e YM62899 e outros; (7) vasodilatadores, tais comohidralazina, clonidina, minoxidila e álcool nicotinílico e outros; (8)antagonistas do receptor de angiotensina II, tais como candesartan, eprosartan,irbesartan, losartan, pratosartan, tasosartan, telmisartan, valsartan e EXP-3137, FI6828K e RNH6270 e outros; (9) bloqueadores α/β adrenérgicoscomo nipradilol, arotinolol e amosulalol e outros; (10) bloqueadores alfa 1,tais como terazosin, urapidil, prazosin, bunazosin, trimazosin, doxazosin,naftopidil, indoramin, WHIP 164 e XEN010 e outros; (11) agonistas alfa 2,tais como lofexidina, tiamenidina, moxonidina, rilmenidine e guanobenz eoutros; (12) inibidores de aldosterona e outros; (13) agentes de ligação deangiopoietina-2 tais como aqueles divulgados em WO 03/030833 e
(d) agentes anti-obesidade, tais como (1) inibidores dotransportador de 5HT (serotonina), tais como paroxetina, fluoxetina,fenfluramina, fluvoxamina, sertralina e imipramina e aqueles divulgados emWO 03/00663, bem como inibidores da reentrada deserotonina/noradrenalina, tais como sibutramina (MERIDIA/REDUCTIL) einibidor da entrada de dopamina/inibidores da entrada de norepenefrina, taiscomo cloridreto de radafaxina, 353162 (GlaxoSmithkline) e outros; (2)inibidores do transportador de NE (norepinefrina), tais como GW 320659,despiramina, talsupram e nomifensina; (3) antagonistas de CB 1 (receptor decanabinóide-l)/agonistas inversos, tais como rimonabant (ACCOMPLIASanofi Synthelabo), SR-147778 (Sanofi Synthelabo), AVE 1625 (Sanofi-Aventis), BAY 65-2520 (Bayer), SLV 319 (Solvay), SLV326 (Solvay),CP945598 (Pfizer), E-6776 (Esteve), 01691 (Organix), ORG1448I (Organon),VER24343 (Vernalis), NESS0327 (Univ of SassarilUniv of Cagliari) eaqueles divulgados em Patentes U.S. N0 4,973,587, 5,013,837, 5,081,122,5,112,820, 5,292,736, 5,532,237, 5,624,941, 6,028,084 e 6,509367; e WO96/33159, WO 97/29079, WO 98/31227, WO 98/33765, WO 98/37061, WO98/41519, WO 98/43635, WO 98/43636, WO 99/02499, WO 00/10967, WO00/10968, WO 01/09120, WO 01/58869, WO 01/64632, WO 01/64633, WO01/64634, WO 01/70700, WO 01/96330, WO 02/076949, WO 03/006007,WO 03/007887, WO 03/020217, WO 03/026647, WO 03/026648, WO03/027069, WO 03/027076, WO 03/027114, WO 03/037332, WO 03/040107,WO 04/096763, WO 04/111039,WO 04/111033, WO 04/111034, WO04/111038, WO 04/013120, WO 05/000301, WO 05/016286, WO 05/066126and EP-658546 e outros; (4) agonistas/antagonistas de grelina, tais comoBVT81-97 (BioVitrurn), RC1291 (Rejuvenon), SRD-04677 (Sumitomo),grelina não acilada (TheraTechnologies) e aqueles divulgados em WO01/87335, WO 02/08250, WO 05/012331 e outros; (5) antagonistas/agonistasinversos de H3 (histamina H3), tais como tioperamida, 3-(lH-imidazoi-4-il)propil N-(4-pentenil)carbamato), clobenpropit, iodofenpropit, imoproxifan,GT2394 (Gliatech) e A331440 e aqueles divulgados em WO 02/15905; e O-[3-(lH-imidazol-4-il)propanol]carbamatos (Kiec-Kononowicz, K. et al.,Pharmazie, 55: 349-55 (2000)), antagonistas de receptor de histamina H3contendo piperidina (Lazewska, D. et al., Pharmazie, 56: 927-32 (2001),derivados de benzofenona e compostos relacionados (Sasse, A. et al., Arch.Pharm.(Weinheim) 334: 45-52 (2001)), N-fenilcarbamatos substituídos(Reidemeister, S. et al., Pharmazie, 55: 83-6 (2000)) e derivados de proxifano(Sasse, A. et al., J. Med. Chem.. 43: 3335-43 (2000)) e moduladores doreceptor de histamina H3 receptor tais como aqueles divulgados em WO03/024928 e WO 03/024929; (6) antagonistas do receptor de hormônio 1concentrador de melanina (MCH1R), tais como T-226296 (Takeda), T71(Takeda/Amgen), AMGN-608450, AMGN-503796 (Amgen), 856464(GlaxoSmithkline), A224940 (Abbott), A798 (Abbott),ATCO175/AR224349 (Arena Pharmaceuticals), GW803430(GlaxoSmithkine), NBI-IA (Neurocrine Biosciences), NGX-I (Neurogen),SNP-7941 (Synaptic), SNAP9847 (Synaptic), T-226293 (Schering Plough),TPI-1361-17 (Saitama Medicai School/University of Califórnia Irvine) eaqueles divulgados WO 01/21169, WO 01/82925, WO 01/87834, WO02/051809, WO 02/06245, WO 02/076929, WO 02/076947, WO 02/04433,WO 02/51809, WO 02/083134, WO 02/094799, WO 03/004027, WO03/13574, WO 03/15769, WO 03/028641, WO 03/035624, WO 03/033476,WO 03/033480, WO 04/004611, WO 04/004726, WO 04/011438, WO04/028459, WO 04/034702, WO 04/039764, WO 04/052848, WO 04/087680e Pedido de Patente Japonês N0 JP 13226269, JP 1437059, JP2004315511 eoutros; (7) agonistas/antagonistas de MCH2R (hormônio concentrador demelanina 2R); (8) antagonistas de NPYl (neuropeptídeo Y Yl), tais comoBMS205749, B1BP3226, J-115814, BIBO 3304, LY-357897, CP-671906 eGI-264879A e aqueles divulgados na Patente U.S. N0 6.001.836 e WO96/14307, WO 01/23387, WO 99/51600, WO 01/85690, WO 01/85098, WO01/85173, e WO 01/89528; (9) antagonistas de NPY5 (neuropeptídeo Y Y5),tais como 152,804, S2367 (Shionogi), E-6999 (Esteve), GW-569180A, GW-594884A (GlaxoSmithkline), GW-587081X, GW-548118X; FR 235,208;FR226928, FR 240662, FR252384; 1229U91, GI-264879A, CGP71683A, C-75 (Fasgen) LY-377897, LY366377, PD-160170, SR-120562A, SR-120819A,S2367 (Shionogi), JCF-104 e H409/22; e aqueles compostosdivulgados em Patentes U.S. N0 6,140,354, 6,191,160, 6,258,837, 6,313,298,6,326,375, 6,329,395, 6,335,345, 6,337,332, 6,329,395 e 6,340,683 e EP-01010691, EP-01044970 e FR252384 e Publicações PCT N°. WO 97/19682,WO 97/20820, WO 97/20821, WO 97/20822, WO 97/20823, WO 98/27063,WO 00/107409, WO 00/185714, WO 00/185730, WO 00/64880, WO00/68197, WO 00/69849, WO 01/09120, WO 01/14376, WO 01/85714, WO01/85730, WO 01/07409, WO 01/02379, WO 01/02379, WO 01/23388, WO01/23389, WO 01/44201, WO 01/62737, WO 01/62738, WO 01/09120, WO02/20488, WO 02/22592, WO 02/48152, WO 02/49648, WO 02/051806, WO02/094789, WO 03/009845, WO 03/014083, WO 03/022849, WO 03/028726,WO 05/014592, WO 05/01493 e Norman et al., J. Med. Chem. 43: 4288-4312(2000); (10) leptina, tal como leptina humana recombinante (PEG-OB,Hoffinan La Roche) e leptina humana de metionila recombinante (Amgen);(11) derivados de leptina, tais como aqueles divulgados nas Patentes N05,552,524; 5,552,523; 5,552,522; 5,521,283; e WO 96/23513; WO 96/23514;WO 96/23515; WO 96/23516; WO 96/23517; WO 96/23518; WO 96/23519;e WO 96/23520; (12) antagonistas de opióides, tais como nalmefeno (Revex®), 3-metoxinaltrexona, naloxona e naltrexona e aqueles divulgados em WO00/21509; (13) antagonistas de orexina, tal como SB-334867-A(GlaxoSmithkline) e aqueles divulgados em WO 01/96302, 01/68609,02/44172, 02/51232, 02/51838, 02/089800, 02/090355, 03/023561,03/032991, 03/037847, 04/004733, 04/026866, 04/041791, 04/085403 eoutros; (14) agonistas de BRS3 (receptor de bombesina subtipo 3); (15)agonistas de CCK-A (colecistocinina-A), tais como AR-R 15849, GI 181771,JMV-180, A-71378, A-71623, PD170292, PD 149164, SR146131,SR125180, butabindida e aqueles divulgados em US 5,739,106; (16) CNTF(fatores neurotróficos ciliares), tais como GI-181771 (Glaxo-SmithKline);SR146131 (Sanofi Synthelabo); butabindida e PD170,292, PD 149164(Pfizer); (17) derivados de CNTF, tais como axokine (Regeneron) e aquelesdivulgados em WO 94/09134, WO 98/22128, e WO 99/43813; (18) agonistasde GHS (receptor do secretagogo do hormônio de crescimento), tais comoNN703, hexarelina, MX-0677, SM-130686, CP-424,391, L-692,429 e L-163,255 e aqueles divulgados em Patente U. S. N°. 6358951, Pedido depatente U. S. N0 2002/049196 e 2002/022637 e WO 01/56592 e WO02/32888; (19) agonistas de 5HT2c (receptor de serotonina 2c), tais comoAPD3 546/ARIOA (Arena Pharmaceuticals), ATH88651 (Athersys),ATH88740 (Athersys), BVT933 (Biovitrum/GSK), DPCA37215 (BMS),IK264; LY448100 (Lilly), PNU 22394; WAY 470 (Wyeth), WAY629(Wyeth), WAYl61503 (Biovitrum), R-1065, VRl065 (Vernalis/Roche) YM348 e aqueles divulgados em Patente U.S. N0 3,914,250 e publicações PCT01/66548, 02/36596, 02/48124, 02/10169, 02/44152; 02/51844, 02/40456,02/40457, 03/057698, 05/000849 e outros; (20) agonistas Mc3r (receptor demelanocortina 3); (21) agonistas de Mc4r (eceptor de melanocortina 4), taiscomo CH1R86036 (Chiron), CHIR915 (Chiron); ME-10142 (Melacure), ME-10145 (Melacure), HS-131 (Melacure), NBI72432 (Neurocrine Biosciences),NNC 70-619 (Novo Nordisk), TTP2435 (Transtech) e aqueles divulgados emPCT Publications WO 99/64002, 00/74679, 01/991752, 01/0125192,01/52880, 01/74844, 01/70708, 01/70337, 01/91752, 01/010842, 02/059095,02/059107, 02/059108, 02/059117, 02/062766, 02/069095, 02/12166,02/11715, 02/12178, 02/15909, 02/38544, 02/068387, 02/068388, 02/067869,02/081430, 03/06604, 03/007949, 03/009847, 03/009850, 03/013509,03/031410, 03/094918, 04/028453, 04/048345, 04/050610, 04/075823,04/083208, 04/089951, 05/000339 e EP 1460069 e US 2005049269 eJP2005042839 e outros; (22) inibidores da reentrada de monoamina, taiscomo sibutratmina (Meridia ®/Reductil®) e seus sais e aqueles compostosdivulgados em Patentes U.S. N0 4,746,680, 4,806,570 e 5,436,272 ePublicação de Patente U.S. N0 2002/0006964, e WO 01/27068, e WO01/62341; (23) inibidores da reentrada de serotonina, tais comodexfenfluramina, fluoxetina e aqueles em Patentes U.S. N0 6,365,633, e WO01/27060, e WO 01/162341; (24) agonistas de GLP-I (peptídeo semelhanteao glucagon 1); (25) Topiramato (Topimax®); (26) composto fitofarma 57(CP 644,673); (27) inibidores de ACC2 (acetil-CoA carboxilase-2); (28)agonistas de β3 (receptor beta adrenérgico 3), tal comorafebergron/AD9677/TAK677 (Dainippon/ Takeda), CL-316,243, SB418790, BRL-37344, L-796568, BMS-196085, BRL-35135A, CGP12177A,BTA-243, GRC1087 (Glenmark Pharmaceuticals) GW 427353 (cloridreto desolabegron), Trecadrina, Zeneca D7114, N-5984 (Nisshin Kyorin), LY-377604 (Lilly), KT07924 (Kissei), SR 59119A e aqueles divulgados emPatentes U.S. N°. 5,705,515, US 5,451,677; e W094/18161, W095/29159,W097/46556, W098/04526 W098/32753, WO 01/74782, WO 02/32897,WO 03/014113, WO 03/016276, WO 03/016307, WO 03/024948, WO03/024953, WO 03/037881, WO 04/108674 e outros; (29) inibidores deDGATl (diacilglicerol aciltransferase 1); (30) inibidores de DGAT2(diacilglicerol aciltransferase 2); (31) inibidores de FAS (sintase de ácidograxo), tais como Cerulenina e C75; (32) inibidores de PDE (fosfodiesterase),tais como teofilina, pentoxifilina, zaprinast, sildenafil, amrinona, milrinona,cilostamida, rolipram e cilomilast, bem como aqueles descritos em WO03/037432, WO 03/037899; (33) agonistas β de hormônio de tireóide, taiscomo KB-2611 (KaroBioBMS) e aqueles divulgados em WO 02/15845 ePedido de Patente Japonês No. JP 2000256190; (34) ativadores de UCP-I(proteína não ligadora 1), 2 ou 3, tais como ácido fitânico, ácido 4-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naptalenil)-1 -propenil]benzóico
(TTNPB) e ácido retinóico e aqueles divulgados em WO 99/00123; (35) acil-estrogênios, tais como oleoil-estrona, divulgado em dei Mar-Grasa, M. et al.,Obesity Research, 9: 202-9 (2001); (36) antagonistas do receptor deglicocorticóide, tais como CP472555 (Pfizer), KB 3305 e aqueles divulgadosem WO 04/000869, WO 04/075864 e outros; (37) inibidores de 11β HSD-I(11-beta hidróxi esteróide desidrogenase tipo 1) tais como BVT 3498 (AMG331), BVT 2733, 3-(l-adamantil)-4-etil-5-(etiltio)-4H-l,2,4-triazol, 3-(l-adamantil)-5-(3,4,5-trimetoxifenil)-4-metil-4H-1,2,4-triazol, 3-adamantanil-4,5,6,7,8,9,10,11,12,3a-decaidro-l,2,4-triazolo[4,3-a][ll]anuleno e aquelescompostos divulgados em WO 01/90091, 01/90090, 01/90092, 02/072084,04/011410, 04/033427, 04/041264, 04/027047, 04/056744, 04/065351,04/089415, 04/037251 e outros; (38) inibidores de SCD-I (estearoil-CoAdesaturase-1); (39) inibidores de dipeptidil peptidase IV (DPP-4), tais comoisoleucina tiazolidida, valino pirrolidida, sitagliptin, saxagliptin, NVP-DPP728, LAF237 (vildagliptin), P93/01, TSL 225, TMC-2A/2B/2C, FE999011, P9310/K364, VIP 0177, SDZ 274-444, GSK 823093, E 3024, SYR322, TS021, SSR 162369, GRC 8200, K579, NN7201, CR 14023, PHX1004,ΡΗΧΠ49, PT-630, SK-0403 e os compostos divulgados no WO 02/083128,WO 02/062764, WO 02/14271, WO 03/000180, WO 03/000181, WO03/000250, WO 03/002530, WO 03/002531, WO 03/002553, WO 03/002593,WO 03/004498, WO 03/004496, WO 03/005766, WO 03/017936, WO03/024942, WO 03/024965, WO 03/033524, WO 03/055881, WO 03/057144,WO 03/037327, WO 04/041795, WO 04/071454, WO 04/0214870, WO04/041273, WO 04/041820, WO 04/050658, WO 04/046106, WO 04/067509,WO 04/048532, WO 04/099185, WO 04/108730, WO 05/009956, WO04/09806, WO 05/023762, US 2005/043292 e EP 1 258 476; (40) inibidoresde lipase, tais como tetraidrolipstatina (orlistat/XENICAL), ATL962(Alizyme/Takeda), GT389255 (GenzymeZPeptimmune)Triton WRl 339,RHC80267, lipstatin, teasaponin e dietilumbeliferil fosfato, FL-386, WAY-121898, Bay-N-3176, valilactona, esteracina, ebelactona A, ebelactona B eRHC 80267 e aqueles divulgados em WO 01/77094, WO 04/111004 ePatentes U.S. N0 4,598,089, 4,452,813, 5,512,565, 5,391,571, 5,602,151,4,405,644, 4,189,438 e 4,242,453 e outros; (41) inibidores do transportador deácido graxo; (42) inibidores do transportador de dicarboxilato; (43) inibidoresdo transportador de glicose e (44) inibidores do transportador de glicose; (45)compostos bicíclicos anoréticos tais como 1426 (Aventis) e 1954 (Aventis) eos compostos divulgados em WO 00/18749, WO 01/32638, WO 01/62746,WO 01/62747 e WO 03/015769; (46) agonistas de peptídeo YY e PYY taiscomo PYY336 (Nastech/Merck), AC162352 (IC Innovations/Curis/Amylin),TM30335/TM30338 (7TM Pharma), PYY336 (Emisphere Tehcnologies),peptídeos PEGuilados YY3-36, aqueles divulgados em WO 03/026591,04/089279 e outros; (47) moduladores do metabolismo de lipídeo, tais comoácido maslínico, eritrodiol, uvaol de ácido ursólico, ácido betulínico, betulinae outros e compostos divulgados em WO 03/011267; (48) moduladores dofator de transcrição tais como aqueles divulgados em WO 03/026576; (49)moduladores de McSr (receptor de melanocortina 5), tais como aquelesdivulgados em WO 97/19952, WO 00/15826, WO 00/15790, US20030092041 e outros; (50) fator neurotrópico derivado docérebro (BDNF),(51) Mclr (moduladores do receptor 1 de melanocortina, tais como LK-184(Proctor & Gamble) e outros; (52) antagonistas de 5HT6 tais comoBVT74316 (BioVitrum), BVT5182c (BioVitrum), E-6795 (Esteve), E-6814(Esteve), SB399885 (GlaxoSmithkline), SB271046 (GlaxoSmithkline), RO-046790 (Roche) e outros; (53) proteína do transporte de ácido graxo 4(FATP4); (54) inibidores de acetil-CoA carboxilase (ACC), tais comoCP640186, CP610431, CP640188 (Pfizer); (55) fragmentos do hormônio decrescimento de terminal C, tais como AOD9604 (Monash Univ/MetabolicPharmaceuticals) e outros; (56) oxintomodulina; (57) antagonistas do receptorde neuropeptídeo FF tais como aqueles divulgados em WO 04/083218 eoutros; (58) agonistas de amilina, tais como Symlin/pramlintida/AC137(Amylin); (59) extratos de Hoodia e tricocaulon; (60) BVT74713 e outrossupressores de apetite de lipídeo de intestino; (61) agonistas de dopamina taiscomo bupropion (WELLBUTRIN/GlaxoSmithkline); (62) zonisamida(ZONEGRAN/Dainippon/Elan) e outros.
Os compostos específicos que podem ser usados emcombinação com os agonistas de receptor de neuromedina U incluemantagonistas/agonistas inversos de CBI específicos incluem aqueles descritosem W003/077847, N-[3-(4-clorofenil)-2(S)-fenil-l(S)-metilpropil]-2-(4-trifluorometil-2-pirimidilóxi)-2-metilpropanamida, N-[3-(4-clorofenil)-2-(3-cianofenil)-1 -metilpropil]-2-(5-trifluorometil-2-piridilóxi)-2-metilpropanamida, N-[3-(4-clorofenil)-2-(5-cloro-3-piridil)-l-metilpropil]-2-(5-trifluorometil-2-piridilóxi)-2-metil-propanamida e seus saisfarmaceuticamente aceitáveis; bem como aqueles em WO 05/000809, queinclui o seguinte: 3-{l-[bis(4-clorofenil)metil]azetidin-3-ilideno}-3-(3,5-difluorofenil)-2,2-dimetilpropanenitrila, 1 - {1 - [ 1 -(4-clorofenil)pentil] azetidin-3-il}-1 -(3,5-difluorofenil)-2-metilpropan-2-ol, 3-((S)-(4-clorofenil){3-[(l S)-l-(3,5-difluorofenil)-2-hidróxi-2-metilpropil]azetidin-l-il}metil)benzonitrila,3 -((S)-(4-clorofenil) {3 -[(IS)-I -(3,5 -difluorofenil)-2-fluoro-2-metilpropil] -azetidin-1 -il}metil)benzonitrila, 3-((4-clorofenil) {3-[ 1 -(3,5-difluorofenil)-2,2-dimetilpropil] azetidin-1 -il} metil)benzonitrila, 3-((lS)-l-{l - [(S)-(3 -cianofenil)(4-cianofenil)metil] azetidin-3 -il} -2-fluoro-2-metilpropil)-5 -fluorobenzonitrila, 3-[(S)-(4-clorofenil)(3-{(lS)-2-fluoro-l-[3-fluoro-5-(4H-l,2,4-triazol-4-il)fenil]-2-metilpropil}azetidin-l-il)metil]benzonitrila e 5-((4-clorofenil) {3-[( 1S)-1 -(3,5-difluorofenil)-2-fluoro-2-metilpropil]azetidin-1 -il}metil)tiofeno-3-carbonitrila e seus sais farmaceuticamente aceitáveis; bemcomo: 3-[(S)-(4-clorofenil)(3-{(1 S)-2-fluoro-1 -[3-fluoro-5-(5-oxo-4,5-diidro-l,3,4-oxadiazol-2-il)fenil]-2-metilpropil}azetidin-l-il)metil]benzonitrila, 3-[(,5 ')-(4-clorofenil)(3 - { (1 S)-2-fluoro-1 - [3 -fluoro-5 -(1,3,4-oxadiazol-2-il)fenil]-2-metilpropil} azetidin-1 -il)metil]benzonitrila, 3-[(S)-(3- {(1S)-1-[3-(5-amino-l,3,4-oxadiazol-2-il)-5-fluorofenil]-2-fluoro-2-metilpropil}azetidin-1 -il)(4-clorofenil)metil]benzonitrila, 3-[(S)-(4-cianofenil)(3-{(1 S)-2-fluoro-1 -[3-fluoro-5-(5-oxo-4,5-diidro-l,3,4-oxadiazol-2-il)fenil]-2-metilpropil} azetidin-1 -il)metil] benzonitrila, 3-[(S)-(3-{(lS)-l-[3 -(5 -amino-l,3,4-oxadiazol-2-il)-5-fluorofenil]-2-fluoro-2-metilpropil)azetidin-l-il)(4-cianofenil)metil]benzonitrila, 3-{(S)-(4-cianofenil)(3-{(lS)-2-fluoro-l-[3-fluoro-5-(1,3,4-oxadiazol-2-il)fenil]-2-metilpropil} azetidin-1 -il)metil]benzonitrila, 3 - [(S)-(4-clorofenil)(3 - { (1 S)-2-fluoro-1 - [3-fluoro-5 -(l,2,4-oxadiazol-3-il)fenil]-2-metilpropil}azetidin-l-il)metil]benzonitri 3-(1S)-1·-(1·- {(S)-(4-cianofenil)[3-( 1,2,4-oxadiazol-3-il)fenil]-metil} azetidin-3-il)-2-fluoro-2-metilpropil]-5-fluorobenzonitrila, 5-(3-{1-[1-(difenilmetil)azetidin-3-il]-2-fluoro-2-metilpropil}-5-fluorofenil)-lH-tetrazol,5-(3-{l-[l -(difenilmetil)azetidin-3 -il] -2-fluoro-2-metilpropil} -5 -fluorofenil)-1 -metil-1 H-tetrazol, 5 -(3 - {1 - [ 1 -(difenilmetil)azetidin-3 -il] -2-fluoro-2-metilpropil}-5-fluorofenil)-2-metil-2H-tetrazol, 3-[(4-clorofenil)(3-{2-fluoro-l-[3-fluoro-5-(2-metil-2H-tetrazol-5-il)fenil]-2-metilpropil}azetidin-l-il)metil]benzonitrila, 3-[(4-clorofenil)(3 -{2-fluoro-1 -[3-fluoro-5-( 1 -metil- IH-tetrazol-5-il)fenil]-2-metilpropil}azetidin-l-il)metil]benzonitrila, 3-[(4-cianofenil)(3- {2-fluoro-1 -[3-fluoro-5-( 1 -metil- lH-tetrazol-5-il)fenil]-2-metilpropil} azetidin-1 -il)metil]benzonitrila, 3- [(4-cianofenil)(3 - {2-fluoro-1 -[3-fluoro-5-(2-metil-2H-tetrazol-5-il)fenil]-2-metilpropil} azetidin-1-il)metil]benzonitrila, 5- { 3 -[(S)- {3 - [(1S)-1 -(3 -bromo-5-fluorofenil)-2-fluoro-2-metilpropil] azetidin-1 -il} (4-clorofenil)metilfenil} -1,3,4-oxadiazol-2(3H)-ona, 3-[(lS)-l-(l -{(S)-(4-clorofenil)[3-(5-oxo-4,5-dihidro-1,3,4-oxadiazol-2-il)fenil] metil} azetidin-3 -il)-2-fluoro-2-metilpropil] -5 -fluorobenzonitrila, 3 -[(1S)-1 -(1 - {(S)-(4-cianofenil)[3-(5-oxo-4,5-diidro-1,3,4-oxadiazol-2-il)fenil]metil} azetidin-3-il)-2-fluoro-2-metilpropil]-5-fluorobenzonitrila, 3-[(lS)-l-(l - { (S)-(4-cianofenil) [3 -(1,3,4-oxadiazol-2-il)fenil]metil} azetidin-3 -il)-2-fluoro-2-metilpropil]-5-fluorobenzonitrila, 3-[( 1S)-1 -(1 - {(S)-(4-clorofenil)[3-(l,3,4-oxadiazol-2-il)fenil]metil}azetidin-3-il)-2-fluoro-2-metilpropil] -5 -fluorobenzonitrila, 3 -((15)-1 - {1 - [(S)- [3 -(5 -amino-1,3,4-oxadiazol-2-il)fenil] (4-clorofenil)metil] azetidin-3 -il} -2-fluoro-2-metilpropil)~5-fluorobenzonitrila, 3-((lS)-l-{ l-[(S)-[3-(5-amino-l,3,4-oxadiazol-2-il)fenil](4-cianofenil)metil]azetidin-3-il)-2-fluoro-2-metilpropil)-5-fluorobenzonitrila, 3 - [(1S)-1 -(1 - { (S)-(4-cianofenil) [3 -(1, 2,4-oxadiazol-3 -il)fenil]metil}azetidin-3-il)-2-fluoro-2-metilpropil]-5-fluorobenzonitrila, 3-[(1S)-l-(l-{ (S)-(4-clorofenil) [3 -(1,2,4-oxadiazol-3 -il)fenil] metil} azetidin-3 -il)-2-fluoro-2-metilpropil]-5-fluorobenzonitrila, 5-[3-((S)-(4-clorofenil){3-[(IS)-I -(3,5-difluorofenil)-2-fluoro-2-metilpropil]azetidin-1 -il}metil)fenil]-1,3,4-oxadiazol-2(3H)-ona, 5-[3-((S)-(4-clorofenil){3-[(lS)-l-(3,5-difluorofenil)-2-fluoro-2-metilpropil] azetidin-1 -il} metil)fenil] -1,3,4-oxadiazol-2(3H)-ona, 4-{(S)-{3-[(lS)-l-(3,5-difluorofenil)-2-fluoro-2-metilpropil] azetidin-1 -il} [3 -(5 -oxo-4,5 -diidro-1,3,4-oxadiazol-2-il)fenil]metil}-benzonitrila, ACOMPLIA (rimonabant, N-(l-piperidinil)-5-(4-clorofenil)-1 -(2,4-diclorofenil)-4-metilpirazol-3 -carboxamida, SRl 41716A),3-(4-clorofenil-N'-(4clorofenil)sulfonil-N-metil-4-fenil-4,5-diidro-lH-pirazol-1-carboxamida (SLV-319), taranabant, N-[(1S, 2S)-3-(4-Clorofenil)-2-(3-cianofenil)-1-metilpropil]-2-metil-2-[[5-(trifluorometil)-2-piridinil]óxi]propanamida e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
Os antagonistas de NPY5 específicos que podem ser usadosem combinação com os agonistas do receptor de neuromedina U incluem: 3-oxo-N-(5-fenil-2-pirazinil)-espiro[isobenzofuran-1 (3H),4'-piperidino]- Γ-carboxamida, 3-oxo-N-(7-trifluorometilpirido[3,2-b]piridin-2-il)espiro-[isobenzofuran-1 (3H),4'-piperidino]-1 -carboxamida, N-[5-(3-fluorofenil)-2-pirimidinil]-3-oxoespiro-[isobenzofuran-l(3N),4'-piperidina]-r-carboxamida,trans-3'-oxo-N-(5-fenil-2-pirimidinil)espiro [ciclohexano-1,1' (3Ή)-isobenzofuran]-4-carboxamida, trans-3'-oxo-N-[ l-(3-quinolil)-4-imidazolil]espiro[ciclohexano-1,1 '(3'H)-isobenzofuran]-4-carboxamida, trans-3-oxo-N-(5-fenil-2-pirazinil)espiro[4-azaiso-benzofuran-1 (3H), 1 '-cicloexano]-4'-carboxamida, trans-N-{5-(3-fluorofenil)-2-pirimidinil}-3-oxospiro[5-azaisobenzofuran-1 (3H), 1 -cicloexano]-4'-carboxamida, trans-N-[5-(2-fluorofenil)-2-pirimidinil]-3-oxospiro[5-azaisobenzofuran-1 (3H), 1 '-cicloexano]-4-carboxamida, trans-N-[l-(3,5-difluorofenil)-4-imidazolil]-3-oxospiro[7-azaisobenzofuran-1 (3H), 1 '-cicloexano]-4'-carboxamida, trans-3-oxo-N-(l -fenil-4-pirazolil)espiro[4-azaisobenzofuran-l(3H),r-cicloexano]-4'-carboxamida, trans-N-[l-(2-fluorofenil)-3-pirazolil]-3-oxospiro[6-azaisobenzofuran-1 (311), 1 '-cicloexano]-4'-carboxamida, trans-3-oxo-N-( 1 -fenil-3-pirazolil)espiro[6-azaisobenzofuran-1 (3H), 1 '-cicloexano]-4'-carboxamida, trans-3-oxo-N-(2-fenil-l,2,3-triazol-4-il)espiro[6-azaisobenzofuran-l(3H),r-cicloexano]-4'-carboxamida e saisfarmaceuticamente aceitáveis e éteres destes.
Os inibidores ACC-1/2 específicos que podem ser usados emcombinação com os agonistas do receptor de neuromedina U incluem: Γ-[(4,8-dimetoxiquinolin-2-il)carbonil]-6-(lH-tetrazol-5-il)espiro[croman-2,4'-piperidin]-4-ona; (5-{r-[(4,8-dimetoxiquinolin-2-il)carbonil]-4-
10 oxospiro[croman-2,4'-piperidin]-6-il}-2H-tetrazol-2-il)metil pivalato; ácido 5-{r-[(8-ciclopropil-4-metoxiquinolin-2-il)carbonil]-4-oxospiro[croman-2,4'-piperidin]-6-il}nicotínico; r-(8-metóxi-4-morfolin-4-il-2-naftoil)-6-(lH-tetrazol-5-il)espiro[croman-2,4'-piperidin]-4-ona e 1 '-[(4-etóxi-8-etilquinolin-2-il)carbonil]-6-(lH-tetrazol-5-il)espiro[croman-2,4-piperidin]-4-ona e sais15 farmaceuticamente aceitáveis e éteres destes. MK-3887, L-001738791.
Os compostos antagonistas de MCHlR específicos que podemser usados em combinação com os agonistas do receptor de neuromedina Uincluem: 1 - {4- [(1 -etilazetidin-3 -il)óxi] fenil} -4- [(4-fiuorobenzil)óxi]piridin-2(1 l)-ona, 4-[(4-fiuorobenzil)óxi]-l-{4-[(l-isopropilazetidin-3-
20 il)óxi] fenil }piridin-2( 1 H)-ona, 1 - [4-(azetidin-3 -ilóxi)fenil] -4-[(5-cloropiridin-2-il)metóxi]piridin-2( 1 H)-ona, 4- [(5 -cloropiridin-2-il)metóxi] -1 - {4- [(1 -etilazetidin-3-il)óxi] fenil }piridin-2(IH)-ona, 4-[(5-cloropiridin-2-il)metóxi]-1 -{ 4- [(1 -propilazetidin-3 -il)óxi] fenil} piridin-2( 1 H)-ona e 4- [(5 -cloropiridin-2-il)metóxi]-1 -(4- {[(2S)-1 -etilazetidin-2-il]metóxi} fenil)piridin-2(lR)-ona ou25 um sal farmaceuticamente aceitável deste.
Um inibidor de DP-IV específico que pode ser usado emcombinação com os agonistas do receptor de neuromedina U é 7-[(3R)-3-amino-4-(2,4,5-trifluorofenil)butanoil]-3-(trifluorometil)-5,6,7,8-tetrahidro-l,2,4-triazolo[4,3-a]pirazina ou um sal farmaceuticamente aceitável destes.Os antagonistas/agonistas inversos de H3 específicos(histamina H3) que podem ser usados em combinação com os agonistas doreceptor de neuromedina U incluem: aqueles descritos no W005/077905,incluindo: 3 - { 4- [(1 -ciclobutil-4-piperidinil)óxi] fenil} -2-etilpirido [2,3 -d] -pirimidin-4(3H)-ona, 3-{4-[(l-ciclobutil-4-piperidinil)óxi]fenil}-2-metilpirido[4,3-d]pirimidin-4(3H)-ona, 2-etil-3-(4-{3-[(3 S)-3-metilpiperidin-1-il]propóxi}fenil)pirido[2,3-d]pirimidin-4(3H)-ona, 2-metil-3-(4-{3-[(3S)-3-metilpiperidin-l-il]propóxi}-fenil)pirido[4,3-d]pirimidin-4(3H)-ona, 3-{4-[(l-ciclobutil-4-piperidinil)óxi]fenil}-2,5-dirnetil-4(3H)-quinazolinona, 3-{4-[(l-ciclobutil-4-piperidinil)óxi]fenil}-2-metil-5-trifluorometil-4(3H)-quinazolinona, 3 - { 4- [(1 -ciclobutil-4-piperidinil)óxi] fenil} -5 -metóxi-2-metil-4(3H)-quinazolinona, 3-{4-[(l-ciclobutilpiperidin-4-il)óxi]fenil}-5-fluoro-2-metil-4(3 H)-quinazolinona, 3 - { 4- [(1 -ciclobutilpiperidin-4-il)óxi] fenil} -7-fluoro-2-metil-4(3H)-quinazolinona, 3-{4-[( 1 -ciclobutil-piperidin-4-il)óxi]fenil}-6 -metóxi-2-metil-4(3 H)-quinazolinona, 3 - { 4- [(1 -ciclobutilpiperidin-4-il)óxi] fenil }-6-fluoro-2-metil-4(3H)-quinazolinona, 3-{4-[(l-ciclobutilpiperidin-4-il)óxi]fenil}-8-fluoro-2-metil-4(3H)-quinazolinona, 3- {4-[(1 -ciclopentil-4-piperidinil)óxi]fenil} -2-metilpirido[4,3 -d]pirimidin-4(3H)-ona, 3 - {4-[( 1 -ciclobutilpiperidin-4-il)óxi]fenil} -6-fluoro-2-metilpirido[3,4-d]pirimidin-4(3H)-ona, 3-{4-[(l-ciclobutil-4-piperidinil)óxi] fenil} -2-etilpirido [4,3 -d]pirimidin-4(3 H)-ona, 6-metóxi-2-metil-3 - { 4- [3 -(1 -piperidinil)propóxi] fenil }pirido [3,4-d]pirimidin-4(3H)-ona,6-metóxi-2-metil-3 - {4-[3-(l -pirrolidinil)propoxi] fenil} pirido [3,4-d]pirimidin-4(3H)-ona, 2,5-dirnetil-3-{4-[3-(l-pirrolidinil)propóxi]fenil}-4(3H)-quinazolinona, 2-metil-3 - {4- [3 -(1 -pirrolidinil)propóxi] fenil} -5 -trifluorometil-4(3 H)-quinazolinona, 5 -fluoro-2-metil-3 - { 4- [3 -(1 -piperidinil)propóxi] fenil} -4(3H)-quinazolinona, 6-metóxi-2-metil-3- {4-[3-(1 -piperidinil)propóxi]fenil} -4(3H)-quinazolinona, 5-metóxi-2-metil-3-(4- {3-[(3 S)-3-metilpiperidin-1 -il]propóxi} fenil)-4(3H)-quinazolinona, 7-metóxi-2-metil-3 -(4- { 3 - [(3 S)-3 -metilpiperidin-1 -il]propóxi} fenil)-4(3H)-quinazolinona, 2-metil-3-(4- {3-[(3S)-3-metilpiperidin-l-il]propóxi)fenil)pirido[2,3-d]pirimidin-4(3H)-on^ 5-fluoro-2-metil-3 -(4- { 3 - [(2R)-2-metilpirrolidin-1 -il]propóxi} fenil)-4(3H)-quinazolinona, 2-metil-3-(4- {3-[(2R)-2-metilpirrolidin-1 -il]propóxi} fenil)pirido [4,3 -d]pirimidin-4(3H)-ona, 6-metóxi-2-metil-3 -(4- { 3 -[(2R)-2-metilpirrolidin-1 -iljpropóxi} fenil)-4(3H)-quinazolinona, 6-metóxi-2-metil-3 -(4- { 3 - [(2 S)-2-metilpirrolidin-1 -iljpropóxi} fenil)-4(3 H)-quinazolinonae seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
Os agonistas de CCKlR específicos para o uso emcombinação dos agonistas do receptor de neuromedina U incluem: ácido 3-(4-{[ 1 -(3 -etoxifenil)-2-(4-metilfenil)-1 H-imidazol-4-il] carbonil} -1 -piperazinil)-1 -naftóico; ácido 3 -(4- {[ 1 -(3 -etoxifenil)-2-(2-fluoro-4-metilfenil)-1H-imidazol-4-il] carbonil} -1 -piperazinil)-1 -naftóico; ácido 3 -(4- {[ 1 -(3 -etoxifenil)-2-(4-fluorofenil)-1 H-imidazol-4-il]carbonil} -1 -piperazinil)-1 -naftóico; ácido 3-(4-{[l-(3-etoxifenil)-2-(2,4-difluorofenil)-lH-imidazol-4-il]carbonil}-l-piperazinil)-1-naftóico e ácido 3-(4-{[l-(2,3-dihidro-l,4-benzodioxin-6-il)-2-(4-fluorofenil)-1 H-imidazol-4-il] carbonil} -1 -piperazinil)-1-naftóico e sais farmaceuticamente aceitáveis destes. MK-8406
Os agonistas de MC4R específicos de uso em combinação comos agonistas do receptor de neuromedina U incluem: 1) (5S)-1'-{[(3R,4R)-1-terc-butil-3 -(2,3,4-trifluorofenil)piperidin-4-il] carbonil} -3 -cloro-2-metil-5 - [ 1 -metil-1 -(1 -metil- IH-1,2,4-triazol-5-il)etil]-5H-espiro[faro[3,4-b]piridina-7,4'-piperidina]; 2) (5R)-1{[(3R,4R)-1 -terc-butil-3-(2,3,4-trifluorofenil)-piperidin-4-il] carbonil} -3 -cloro-2-metil-5 - [ 1 -metil-1 -(1 -metil-1H-1,2,4-triazol-S-i^etilJ-SH-espiroffurofS^-bJpiridina-y^^piperidina]; 3) 2-(l'-{[(3S,4R)-l-terc-butil-4-(2,4-difluorofenil)pirrolidin-3-il]carbonil}-3-cloro-2-metil-5H-espiro[furo[3,4-b]pirídina-7,4'-piperidin]-5-il)-2-metilpropanenitrila; 4) l'-{[(3S,4R)-l-terc-butil-4-(2,4-difluorofenil)pirrolidin-3 -il]carbonil} -3-cloro-2-metil-5- [ 1 -metil-1 -(1 -metil-lH-l,2,4-triazol-5-il)etil]-5H-espiro[furo[3,4-b]piridina-7,4'-piperidina]; 5)N-[(3R,4R)-3-({3-cloro-2-metil-5-[l-metil-l-(l-metil-lH-l,2,4-triazol-5-ί1)είί1]-1Ή,5Η-68ρίΓθ[ίυΓο-[3,4-ό]ρΐπάίη3-7,4ι-ρίρ6πάϊη]-Γ-ί1}θ3Γ0οηΐ1)-4-(2,4-difluorofenil)-ciclopentil]-N-metiltetraidro-2H-piran-4-amina; 6) 2-[3-cloro-1'-({(1 R,2R)-2-(2,4-difluorofenil)-4-[metil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino]-ciclopentil}-carbonil)-2-metil-5H-espiro[furo[3,4-b]piridina-7,4'-piperidin]-5-il}-2-metil-propano-nitrila e os sais farmaceuticamente aceitáveisdestes.
Adicionalmente, outros análogos de peptídeos e miméticos dopeptídeo semelhante ao glucagon do hormônio de incretina 1 (GLP-1),também podem ser de uso em combinação com os agonistas do receptor deneuromedina U.
Os métodos de administrar as composições farmacológicas quecompreendem os um ou mais agonistas do receptor de neuromedina U a umindivíduo inclui, mas não são limitados a, vias intradérmicas, intramusculares,intraperitoneais, intravenosas, subcutâneas, intranasais, epidurais e orais. Ascomposições podem ser administradas por uma via conveniente, por exemplo,pela infusão ou injeção de bolo, pela absorção através dos revestimentosepiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal eintestinal e outros), oculares e outros e podem ser administrados juntos comoutros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica oulocal. Além disso, pode ser vantajoso administrar a composição no sistemanervoso central por qualquer via adequada, incluindo injeção intraventriculare intratecal. A injeção intraventricular pode ser facilitada por um cateterintraventricular ligado a um reservatório (por exemplo, um reservatório deOmmaya). A administração pulmonar também pode ser utilizada pelo uso deum inalador ou nebulizador e formulação com um agente de aerossolização.
Também pode ser desejado administrar os um ou mais agonistas do receptorde neuromedina U localmente na área em necessidade de tratamento; istopode ser atingido, por exemplo, e não apenas por meio de limitação, infusãolocal durante cirurgia, aplicação tópica, por injeção, por meio de um catéter,por meio de um supositório ou por meio de um implante.
Vários sistemas de liberação são conhecidos e podem serusados para a administração dos agonistas do receptor de neuromedina U queincluem, mas não limitam-se a, encapsulação em lipossomas, micropartículas,microcápsulas; minicélulas; polímeros; cápsulas; tabletes e outros. Em umaforma de realização, o agonista do receptor de neuromidina U pode serliberado em uma vesícula, em particular uma lipossoma. Em uma lipossoma,o agonista do receptor de neuromidina U é combinada, além de outroscarreadores farmaceuticamente aceitáveis, com agentes antipáticos tais comolipídeos que existem na forma agregada como micelas, monocamadasinsolúveis, cristais líquidos ou camadas lamelares em solução aquosa. Oslipídeos adequados para a formulação lipossômica incluem, sem limitação,monoglicerídeos, diglicerídeos, sulfatidas, lisolecitina, fosfolipídeos,saponina, ácidos bílicos e outros. A preparação de sais formulaçõeslipossômicas está dentro do nível de habilidade na técnica como divulgado,por exemplo, na Patente U.S. N0 4,837,028 e Patente U.S. N0 4,737,323.Ainda, em uma outra forma de realização, o agonista do receptor deneuromidina U pode ser liberado em um sistema de liberação controlado queinclui, mas não limita-se à bomba de liberação (ver, por exemplo, Saudek, etal., New Engl. J. Med. 321: 574 (1989) um material polimérico semi-permeável (Ver, por exemplo, Howard, et al., J. Neurosurg. 71: 105 (1989)).Adicionalmente, o sistema de liberação controlada pode ser colocado emproximidade do alvo terapêutico (por exemplo, o cérebro), desta maneirarequerindo apenas uma fração da dose sistêmica. Ver, por exemplo, Goodson,em: Medicai Applications of Controlled Release, 1984. (CRC Press, BoccaRaton, Fla.).
As quantidade das composições que compreendem o agonistado receptor de neuromidina U que serão eficazes no tratamento de umdistúrbio ou condição particulares dependerão da natureza do distúrbio oucondição e podem ser determinadas pelas técnicas clínicas padrão por aquelesde habilidade dentro da técnica. Além disso, os ensaios in vitro podem seropcionalmente utilizados para ajudar a identificar as faixas de dose ótimas. Adose precisa a ser utilizada na formulação também dependerá da via deadministração e da seriedade total da doença ou distúrbio e deve ser decididode acordo com o julgamento do médico e com as circunstâncias do paciente.
Ultimamente, o médico atendente decidirá a quantidade da composição com aqual ratar cada paciente individual. Inicialmente, o médico atendenteadministrará doses baixas da composição e observará a resposta do paciente.
Doses maiores da composição podem ser administradas até o efeitoterapêutico ótimo ser obtido para o paciente e naquele ponto a dosagem aindanão é aumentada. No geral, a faixa de dose diária está dentro da faixa de cercade 0,001 mg a cerca de 100 mg por kg peso corporal de um mamífero,preferivelmente 0,01 mg a cerca de 50 mg por kg e mais preferivelmente 0,1 a10 mg por kg em doses simples ou divididas. Por outro lado, pode sernecessário usar dosagens fora destes limites em alguns casos. Entretanto, asfaixas de dosagens adequadas para a administração intravenosa dascomposições que compreende o agonista do receptor de neuromidina U são,no geral, de cerca de 5 a 500 microgramas ^g) do composto ativo porquilograma (Kg) de peso corporal. As faixas de dosagem adequadas para aadministração intranasal são, no geral, de cerca de 0,01 pg/kg de pesocorporal a 1 mg/kg de peso corporal. As doses eficazes podem serextrapoladas a partir das curvas de resposta de dose derivadas de sistemas deteste de modelo in vitro ou animal. Os supositórios, no geral, contémingrediente ativo na faixa de 0,5 % a 10 % em peso; as formulações oraispreferivelmente contém de 10 % a 95 % de ingrediente ativo. Ultimamente, omédico atendente decidirá a duração apropriada da terapia usando-secomposições que compreendem o agonista do receptor de neuromidina U dapresente invenção. A dosagem também variará de acordo com a idade, peso eresposta do paciente individual.
Ainda é fornecido um pacote ou conjunto farmacêuticos, quecompreende um ou mais recipientes enchidos com um ou mais dosingredientes das composições farmacêuticas e agonistas do receptor deneuromedina U. Opcionalmente associados com tais recipientes podem estaruma aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula afabricação, o uso ou a venda de produtos farmacêuticos e biológicos, cujoaviso reflete a aprovação pela agência de fabricação, uso ou venda para aadministração humana.
Os seguintes exemplos são pretendidos promover umentendimento adicional da presente invenção.
EXEMPLO 1
Geração de linhas celulares que expressam NMURl ouNMUR2 humano ou de roedor
CDNAs de humanos, camundongo ou rato que codificamNMURl ou NMUR2 (como descrito em Howard et al. Nature 406: 70 a 74(2000) foram sub-clonados em pcDNA5 (Invitrogen) e transfectados emcélulas FLP-In CHO e células HEK-293 FLP-In adquirido a partir deInvitrogen (Carlsbad, CA) usando lipofectamina (Invitrogen). O sistema Flp-In permite a integração e expressão de um gene particular de interesse emuma localização genômica específica que utiliza a Flp recombinase dalevedura. As células transfectadas foram selecionadas pelo desenvolvimentoem meio contendo 200 μg/mL de higromicina (Invitrogen). As populaçõesforam congeladas em números de passagem precoces, e estes estoques foramusados para estudos adicionais. Os clones estáveis que expressam os mRNAsforam identificados funcionalmente pelo FLIPR bem como pelo RT-PCR.
Com base no banco de dado genômico público, os receptores NMURl deroedores não parecem ter a metionina tradicional (ATG) como o códon departida para tradução mas contém um códon de partida substituto (TTG pararato e CTG para camundongo). Duas linhas celulares NMURl de roedoresdiferentes foram desta maneira gerados: um com o códon como predito apartir do banco de base genômico e uma outra linha celular com umametionina projetado (ATG) como o códon de partida. Adicionalmente, aslinhas celulares estáveis que expressam os receptores humanos foram geradosem células HEK-293/aeql7 que expressam estavelmente o gene aequorin sobo promotor CMV. O NMUR2 cDNA humano foi clonado em pCDNA3,l eNMURl humano foi subclonado em pIRES-puro (Clontech, Mountain View,CA), após as células transfectadas foram selecionadas em meio contendoG418 e higromicina (NMUR2) ou puromicina (NMUR1).
EXEMPLO 2
Ensaios funcionais in vitro
O sinal dos receptores de NMU primeiramente através deproteínas Gocq/ll; portanto ensaios de mobilização de cálcio podem serutilizados para atividade funcional.
Ensaio FLIPR
As linhas celulares estáveis que expressam receptores NMUR2humano ou NMURl de roedor ou humano foram colocados em umadensidade de 12,000 células por reservatórios durante a noite em placas deparede negra de 384 reservatórios revestidas por poli-lisina. O dia seguinte, omeio foi removido a partir de placas e as células foram subseqüentementecarregadas com Fluo-3 (Molecular Probes), uma matriz sensível ao cálcio,diluído em tampão FLIPR (IX de solução salina tamponada de Hankcontendo 20 mM de HEPES, 0,1 % de BSA, 2,5 mM de probenecid (Sigma) e1,6 mM de TR40). Todos os reagentes são de Invitrogen a não ser de umaoutra maneira notada. Os estoques de peptídeos foram recolocados emsuspensão no DMSO em uma concentração de estoque de 2 mM e diluído emtampão FLIPR no dia do experimento em uma solução de estoque de trabalhode 4 μ.Μ.
Após uma incubação de 90 minutos em temperatura ambiente,as placas celulares foram carregadas em um FLIPR (Molecular Devices) paramonitorar a fluorescência celular (excitação = 488 nM; emissão = 540 nM)antes e após a adição de composto/peptídeo. A resposta de dose de oito a dozepontos foram testados em linhas celulares NMUR que expressam o uso deFLIPR com ΙμΜ de peptídeo como a dose mais alta. A resposta após a adiçãode peptídeo foi tomada como as unidades de fluorescência máximas menos afluorescência imediata antes da estimulação para cada reservatório. Os valorEC50 foram calculados usando software GraphPad Prism (San Diego, CA).
As respostas in vitro de agonistas do receptor de neuromedinaU (NMU1 a NMU25) no ensaio FLIPR por NMURl humano (Tabela 3),camundongo (Tabela 4) e rato (Tabela 5) e NMUR2, os EC50S são relatadosnos valores nM. A atividade percentual refere-se à resposta máxima a ΙμΜcomparado à resposta hNMU-25 na mesma concentração. NT = não testado.As tabelas mostram que a maioria dos agonistas do receptor de neuromedinaU são biespecíficos e ligarão tanto o receptor NMURl quanto o NMU2.
Tabela 3
<table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table>
Tabela 4
<table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table>
Tabela 5
<table>table see original document page 67</column></row><table>
Aequorin
Além disso para FLIPR, a função do receptor NMU tambémpode ser avaliado usando um ensaio aequorin. As linhas celulares estáveis queexpressam o gene de água via aequorin pode ser usado para relatar a ativaçãode GPCRs pelo monitoramento de mobilização de cálcio intracelular. Oobjetivo é para identificar os compostos que especificamente estimula abioluminescência aequorin. A luminescência dependente do cálcio é geradopelo tratamento de células com a luciferina de celenterado, celenterazina.Resumidamente, as monocamadas aderentes de células HEK-293/aeq 17 queexpressam hNMURl ou hNMUR2 são "carregadas" com de celenterazina(Molecular Probes, Carlsbad, CA). Os frascos T75 aderentes são enxaguadoscom meio contendo 300 μΜ de glutationa e 0,1 % de FBS. As células sãoincubadas a 37° C por uma hora em meio de 8 mL, 0,1 % de FBS, 300 μΜ deglutationa, e 20 μΜ de celenterazina. Os frascos T75 são subseqüentementeenxaguados com 6 mL de tampão ECB (140 mM de NaCl, 20 mM de KCl, 20mM de HEPES, 5 mM de glicose, 1 mM de MgCl, 1 mM de CaCl2, 0,1mg/mL de BSA, PH 7,3 a 7,4). As células foram removidas a partir do frascoem tampão ECB, granulado, e recolocado em suspensão em uma densidade de2X105 células/mL. Os agonistas são adicionados às células e a atividade édeterminada usando um luminômetro.
Ensaio IPl
Além disso para medições diretas de cálcio, a atividadereceptora NMU pode ser determinada pelas medições de fosfato de mio-inositol 1 (IP1), um dos maiores produtos da cascata de fosfatidil inositol, quejustamente correlacionam a atividade ligada por Gq. Um equipamento deensaio (IPOne) de Cisbio (Bedford, MA) é disponível para o uso de HTRF(período homogêneo de fluorescência resolvida) para medir níveis de IPl. Osseguintes ensaios das direções dos fabricantes. Resumidamente, as células sãocolocadas durante a noite em uma densidade de 30.000 células porreservatórios em placas de parede branco de 384 reservatórios. O meio do diaseguinte é removido das células, e agonista de 10 uL é adicionado pelo qual édiluído em tampão de estimulação (IOmM de HEPES, 1 mM de CaCl2, 0,5mM de MgCl2, 4,2 mM de KCL, 146 mM de NaCl, 5,5 mM de glicose, 50mM de Ll Cl, pH 7,4). As células são incubadas por 1 hora a 37° C comagonista. As moléculas de detecção são adicionadas, O conjugado IPl-d2 ecriptato anti-IPl (preparado por protocolos do fabricante), e as células sãoincubadas em 1 hora em temperatura ambiente. A fluorescência é medida emuma máquina Envision e os resultados são calculados a partir das razões defluorescência a partir da leitura do instrumento.
Medições substitutas da Atividade receptora NMU
Dados adicionais sugerem que a sinalização receptora NMUpode ocorrer por intermédio da atividade ligada por Gai. A ativação dohNMURl ou hNMUR2 tem mostrado o resultado na inibição da acumulaçãocAMP estimulado por forskolina (10 uM). Para medir a sinalização ligada por Gi,a inibição de cAMP induzido por forskolina pode ser medido. Resumidamente, ascélulas são colocadas 24 antes da realização do experimento. O agonista doreceptor de neuromidina U é adicionado às células e incubado por 10 minutos,seguido pela adição de IOuM de forskolina. Após uma incubação de 10 minutos, ocAMP é extraído das células e medido pelo ensaio radioreceptor. Os níveis debase de cAMP e níveis estimulados por forskolina de cAMP são medidos com esem tratamento de agonista.
Um resumo do dado funcional ou de ligação por agonistas
receptores de neuromedina U seletivos do subtipo NMURl específicos paraespécies cruzadas de NMURl é mostrado nas Tabelas 6 e 7, Calculado aatividade percentual que é relativa as respostas hNMRU naturais.
Tabela 6
<table>table see original document page 69</column></row><table>( ) indica valores por NMU-25 humano com 100 % de atividade.
Tabela 7
Respostas In vitro em peptídeo NMU13 seletivo de NMURl
<table>table see original document page 70</column></row><table>
( ) indica valores por NMU-25 humano com 100 % de atividade.
EXEMPLO 3
Ensaios de ligação
Preparação da membrana:
As camadas celulares aderentes que expressam os receptoresde NMU (as células HEK descritas acima) foram coletadas com soluçãosalina tamponada por fosfato, coletado pela centrifiigação, e recolocado emsuspensão no tampão de membrana (50 mM de TrisCl pH 7,4, 5 mM deMgCl2, IX de coquetel inibidor de protease, 10 μΜ de fosforamidona). Apósas células granuladas serem homogeneizadas, a solução foi centrifugada a18,000 rpm por 20 minutos a 4°C. O grânulo foi recolocado em suspensão notampão de membrana para render uma concentração final de 0,5 a 5 μg/μL damembrana e armazenada a -80°C.
Ensaio de Ligação 125I-hNMU-25:
Os experimentos foram realizados em tampão de ensaio (25mM de TrisCl, pH 7,4, 10 mM de MgCl2, 2mM de EDTA, 1 X de coquetelinibidor de protease, 100 μg/mL de Bacitricina, 10 μΜ de fosforamidona) emvolumes de 200 μl, em um formato de 96 reservatórios usando 2 a 5 μg damembrana e 0,1 nM 125l-hNMU-25 (cerca de 12.000 cpm/reservatório). Paraligação não específica, 1 μΜ de hNMU-25 foi adicionado. Cerca de 5 μΐ. dospeptídeos foram adicionados para medir a atividade antagonista, e a reaçãototal foi incubada em temperatura ambiente com agitação por 80 minutos. Areação foi terminada pela filtração rápida através de placas de filtro de 96reservatórios Millipore pré-encharcadas com poli-etilenimina 0,3% e lavadascom tampão gelado (5 mM de TrisCl pH 7,4, 10 mM de MgCl2, 2,5 mM deEDTA, 0,04 % de Triton X-100). As placas foram secadas por ar durante anoite em temperatura ambiente e recuperadas pela radioatividade, e serádeterminada pela contagem de cintilação padrão. O valor de IC50 foramdeterminados usando software GraphPad Prism.
Análise de dados:
Curvas de concentração-resposta e radio ligando-dado deligação foram adequados usando Prism (GraphPad Software). Os resultadossão resumidos abaixo nas Tabelas 8 e 9.
Tabela 8 <table>table see original document page 71</column></row><table>
Tabela 9
<table>table see original document page 71</column></row><table><table>table see original document page 72</column></row><table>
EXEMPLO 4
Síntese de agonistas receptores de Neuromedina UAgonistas do receptor de neuromedina U podem serproduzidos usando técnicas bem conhecidas na técnica. Por exemplo, umaregião de polipeptídeo de um análogo NMU truncado pode ser químico oubioquimicamente sintetizado e, se desejado, modificado para produzir umterminal N bloqueado e/ou terminal C bloqueado. As técnicas para síntesequímica dos polipeptídeos são bem conhecidos na técnica, (ver por exemplo.,Vincent, in Peptide and Protein Drug Delivery, New York, N.Y., Dekker,1990) Exemplos de técnicas para a síntese bioquímica envolve a introduçãode um ácido nucléico na célula e expressão de ácidos nucléicos são fornecidosem Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-1998, and Sambrook, et al., in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2oEd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
1.1. Substituições de aminoácido e modificaçõesO agonista do receptor de neuromedina U NMUl é umpeptídeo PEGuilado em que um PEG ramificado de 40 kDa é ligado aoterminal N do peptídeo Neuromedina U humano natural. O grupo do terminalN do peptídeo foi acilado com um análogo de (PEG)240K N-hidroxisuccinimida ramificado (por exemplo, mPEG2-NHS-40k; Nektar, SanCarlos, CA; Cat# 2Z3Y0T01). Este foi projetado para criar um agonista doreceptor de neuromidina U com perfil farmacológico melhorado. O peptídeoprecursor, a seqüência de tipo selvagem de NMU, foi atuado com umderivado de N-hidroxisuccinimida de um PEG ramificado de 40 kDa. APEGuilação com este reagente ocorre especificamente no grupo amino determinal N do peptídeo, como este é apenas como um grupo amino disponívelno peptídeo.
O agonista do receptor de neuromedina U NMU2 é o peptídeoNMU natural que é acetilado no terminal N. Foi projetado para estudar oimpacto de acetilação, ou mais geralmente, acilação no terminal N ematividade. Com base na resíduos de rotação da seqüência ativa mínima 19 a25, as seqüências de peptídeos foram modificadas nestes resíduos 17 a 25 pelaadição de um resíduo de cisteína acetilada adicional no terminal Ν. O grupotiolado de cisteína ainda foi derivado com (a) N-etilmaleimida para obterNMU6, um peptídeo de controle para a conjugação; (b) (PEG)2 40 kDa paraobter NMU7, um análogo PEGuilado projetado para ter um perfilfarmacológico in vivo melhorado; ou (c) um grupo colesterol para obterNMUl 1, um análogo lipidado projetado para ter um perfil farmacológico invivo melhorado.
Outras seqüências de peptídeos foram projetados de partida daseqüência NMU natural de adição de um resíduo de cisteína acetilado noterminal N. Por exemplo, um grupo tiolado de cisteína foi derivado com (a)N-etilmaleimida para obter NMU8, um peptídeo de controle para aconjugação; (b) (PEG)2 40 kDa de Nektar (mPEG2-MAL-40k, Cat#2D3 YOTO1) para obter NMU9, ou (PEG)2 40 kDa de NOF Corporation, Japan(SUNBRIGHT GL2-400MA) para obter NMUl2; (c) a grupo colesterol paraobter NMU10; (d) (PEG)20 kDa para obter NMU21; (e) (PEG)2 40 kDa paraobter NMU26; ou (f) (PEG)40 kDa para obter NMU27, Todos estes agonistasreceptores de Neuromedina U foram projetados para ter um perfilfarmacológico in vivo melhorado.
Em outro exemplo de peptídeo, o resíduo de aminoácidoNMU-25 natural na posição 20 foi mudado por D-Alanina e o resíduo deaminoácido na posição 21 por triptofano. Estas mutações conferem adicionarseletivamente para o receptor NMURl e ter um resíduo de cisteína acetiladaadicional no terminal Ν. O grupo tiolado de cisteína foi derivado com (a)N-etilmaleimida para obter NMUl3, um peptídeo de controle; ou (b) (PEG)240 kDa para obter NMU14, um análogo PEGuilado projetado para ter umperfil farmacológico in vivo melhorado.
Os peptídeos NMU15 e 16 foram projetados para obter umpeptídeo PEGuilado com base na seqüência ativa mínima que compreenderesíduos de aminoácido 19 a 25. As seqüências foram modificadas pelaintrodução no terminal N de um grupo Ttds (ácido de l-amino-4,7,10-trioxa-13-tridecanamina succínico) como um espaçador e um resíduo de cisteínaacetilado. O espaçador foi introduzido para minimizar o impacto em atividadena seqüência de lista mínima devido à adição da porção de PEG. O grupotiolado de cisteína foi derivado com (a) N-etilmaleimida para obter NMUl5,um peptídeo de controle para conjugação; ou (b) (PEG)2 40 kDa para obterNMUl6, um análogo PEGuilado projetado para ter um perfil farmacológicoin vivo melhorado.
Os peptídeos NMU 17 e 18 foram projetados para obterpeptídeos PEGuilados com base na seqüência truncada do terminal N 12 a 25.Os peptídeos tendo um resíduo de cisteína acetilada adicional no terminal N.O grupo tiolado de cisteína foi derivado com (a) N-etilmaleimida para obterNMUl7, um peptídeo de controle para conjugação; ou (b) (PEG)2 40 kDapara obter NMUl 8, um análogo PEGuilado projetado para ter um perfilfarmacológico in vivo melhorado.
Os peptídeos NMU 19 e 20 foram projetados para obter umpeptídeo PEGuilado com base na seqüência truncada do terminal N 7 a 25. Os peptídeos tendo um resíduo de cisteína acetilada adicional no terminal Ν. ogrupo tiolado de cisteína foi derivado com (a) N-etilmaleimida para obterNMUl 9, um peptídeo de controle para conjugação; ou (b) (PEG)2 40 kDapara obter NMU20, um análogo PEGuilado projetado para ter um perfilfarmacológico in vivo melhorado.Os peptídeos NMU 22 e 23 foram projetados de partida daseqüência NMU natural de adição dois resíduos de cisteína no terminal N. Ospolipeptídeos do terminal N foram acetilados. Os grupos tiolados de cisteínaforam derivados com (a) N-etilmaleimida para obter NMU22, um peptídeo decontrole para conjugação; ou (b) (PEG)20 kDa para obter NMU23, umanálogo PEGuilado projetado para ter um perfil farmacológico in vivomelhorado.
Os peptídeos NMU 24 e NMU 25 são com base na seqüênciaNMU natural ao que um resíduo de cisteína palmitoilado no terminal N foiadicionado. Estes foram projetados para estudar o impacto em atividade de (1)palmitolação do terminal N, ou mais geralmente acilação com uma cadeia deácido graxo; e (2) o efeito combinado tanto da PEGuilação quanto dalipidação. O grupo tiolado de cisteína foi derivado com (a) N-etilmaleimidapara obter NMU24, um análogo lipidado projetado para ter um perfilfarmacológico in vivo melhorado e também para atuar como um peptídeo decontrole para conjugação; ou (b) (PEG)2 40 kDa para obter NMU25, estesanálogos lipidados e PEGuilados foram projetados para ter um perfilfarmacológico in vivo melhorado.
Os peptídeos NMU 28 e 29 span, resíduos 17 a 25 do NMUnatural. Um resíduo de cisteína acetilado foi adicionado ao terminal N bemcomo um grupo Ttds para atuar como um espaçador. O espaçador foiintroduzido para minimizar o impacto da atividade na seqüência devido àadição da porção de PEG. O grupo tiolado de cisteína foi derivado com (a) N-etilmaleimida para obter NMU28, um peptídeo de controle para a conjugação;ou (b) (PEG)2 40 kDa para obter NMU29, um análogo PEGuilado projetadopara ter um perfil farmacológico in vivo melhorado.
1.2. PEGuilação e/ou Colesteroilação
Os locais de PEGuilação nos agonistas do receptor deneuromedina U da presente invenção foram escolhidos levando em conta aestrutura de NMU e estas interações com os receptores de NMU.Conseqüentemente, a PEGuilação é preferivelmente de local específico. APEGuilação no grupo amino de terminal N do peptídeo NMU é possível vistoque este é apenas o grupo amino disponível na seqüência. Por exemplo ogrupo do terminal N do peptídeo foi acilado com um análogo ((PEG)2 40 kDaN-hidroxisuccinimida ramificado (por exemplo, mPEG2-NHS-40k, Nektar,Cat# 2Z3Y0T01).
1.3. Síntese de agonistas do receptor de Neuromedina U
O agonista receptor de Neuromedina U (ver Tabela 1) foramsintetizados pela fase sólida usando química Fmoc/tBu em um peptídeosintetizado por AB1433A (Applied Biosystems). Para cada peptídeo 0,75 g deum ligador Fmoc de resina AM-Champion, 1 % reticulado (BiosearchTechnologies, Inc., Novato, CA) e uma resina com base em PEG-PS derivadacom um ligador Rink modificado por ácido p-[(R,S)-a-[9H-Fluoren-9-il-metoxiformamido]-2,4-dimetoxibenzil]-fenoxiacético (Rink, TetrahedronLett. 28: 3787-3789 (1987); Bernatowicz, et al., Tetrahedron Lett. 30: 4645-4667 (1989)) foi usado. As reações de acilação foram realizados por 60minutos com excesso de quatro vezes do aminoácido ativado durante osgrupos mino livre de resina. Os aminoácidos foram ativados com quantidadesequimolares de HBTU (2-(lH-benzotriazol-l-il)-l,l,3,3-tetrametilurôniohexafluorofosfato) e um excesso molar de 2 vezes de DIEA (N,N-diisopropiletilamina) em DMF.
Alternativamente, os peptídeos foram sintetizados pela fasesólida usando química Fmoc/t-Bu em um sintetizador de peptídeo Pioneer(Applied Biosystems). Neste caso, todas as reações de acilação foramrealizadas por 60 minutos com um excesso de quatro vezes do aminoácidoativado durante os grupos amino livres de resina seguindo a extremidade dareunião de peptídeo no sintetizador. O grupo de cadeia secundária de proteçãofoi: terc-butila para Asp, Glu, Ser e Tyr; tritila para Asn, Cys e Gln; 2,2,4,6,7-pentametildiidrobenzofuran-5-sulfonila para Arg. A reação de acetilação doterminal N foi realizado na extremidade da reunião do polipeptídeo pelareação com um excesso de 10 vezes de anidrido acético em DMF. Apalmitolação da reação do terminal N (por NMU24 e NMU25) foi realizadona extremidade da reunião do polipeptídeo pela reação com um excesso dequatro vezes do palmítico ativado durante os grupos amino livres de resina. Oácido palmítico foi ativado com quantidades equimolares de DIPC (1,3Diisopropilcarbodiimida) e HOBt (Hidroxibenzotriazol) em DMF.
Na extremidade da síntese, os peptídeos-resinas secos foramindividualmente tratados com 20 mL da mistura de clivagem, 88 % de TFA, 5% de fenol, 2 % de triisopropilsilano e 5 % de água (Sole and Barany, J. Org.Chem. 57: 5399-5403 (1992)) por 2,5 horas em temperatura ambiente. Cadaresina foi filtrada e a solução foi adicionada ao éter metil-t-butílico frio a fimde precipitar o peptídeo. Após a centrifugação, os grânulos de peptídeo foramlavados com éter metil-t-butílico frio fresco para remover osdescontaminantes orgânicos. O processo foi repetido duas vezes. Os grânulosfinais foram secos, recolocados em suspensão em H2O, 20 % de acetonitrila, eliofilizado.
Os peptídeos brutos foram purificados por HPLC de fasereversa usando-se cartuchos semi-preparativos Waters RCM Delta-Pak™ C4ou Ci8 (40 χ 200 mm, 15 μπι) e usando como eluentes (A)0,1 % de TFA emágua e (B) 0,1 % de TFA em acetonitrila, taxa de fluxo 80 mL/minuto. OHPLC analítico foi realizado em uma coluna Phenomenex, Júpiter C4 (150 χ4.6 mm, 5 μπι) ou coluna ReproSil-Pur 300 C4 (150 χ 4,6 mm, 5 μηι) (Dr.Maisch GmbH) ou Beckman, coluna Ultrasphere Cl8 (250 χ 4,6 mm, 5 μπι),uma taxa de fluxo de mL/minuto. O peptídeo purificado foi caracterizado pelaespectrometria de massa por eletropulverização em uma plataformaMicromass LCZ.
A síntese de peptídeo NMU6 foi realizada por dissolver o tiolcontendo peptídeo precursor NMU em HEPES 0,1 M pH 7,3, EDTA 4mM.Um excesso molar de 1,5 de N-etilmaleimida foi adicionado. Após uma horade incubação, o peptídeo foi purificado por HPLC.
A síntese de peptídeo NMU8 foi realizada por dissolver o tiolcontendo peptídeo precursor NMU em HEPES 0,1 M pH 7,3, EDTA 4mM.Um excesso molar de 1,5 de N-etilmaleimida foi adicionado. Após uma horade incubação, o peptídeo foi purificado por HPLC.
A síntese de peptídeo NMUl 3 foi realizada por dissolver o tiolcontendo peptídeo precursor NMU em HEPES 0,1 M pH 7,3, uréia 8M,EDTA 4mM. Um excesso molar de 1,5 de N-etilmaleimida foi adicionado.Após uma hora de incubação, o peptídeo foi purificado por HPLC.
A síntese de peptídeo NMUl 5 foi realizada por dissolver o tiolcontendo peptídeo precursor NMU em HEPES 0,1 M pH 7,3, EDTA 4mM.Um excesso molar de 1,5 de N-etilmaleirnide foi adicionado. Após uma horade incubação, o peptídeo foi purificado por HPLC.
A síntese de peptídeo NMUl 7 foi realizada por dissolver o tiolcontendo peptídeo precursor NMU em HEPES 0,1 M pH 7,3, EDTA 4mM.Um excesso molar de 1,5 de N-etilmaleimida foi adicionado. Após uma horade incubação, o peptídeo foi purificado por HPLC.
A síntese de peptídeo NMU19 foi realizada por dissolver o tiolcontendo peptídeo precursor NMU em fosfato de sódio 0,1 M pH 6,5, uréia4M, EDTA 4mM. Um excesso molar de 1,5 de N-etilmaleimida foiadicionado. Após uma hora de incubação, o peptídeo foi purificado porHPLC.
A síntese de peptídeo NMU22 foi realizada por dissolver o tiolcontendo peptídeo precursor NMU em fosfato de sódio 0,2M pH 6,5, uréia8M, EDTA 4mM. Um excesso de três molares de N-etilmaleimida foiadicionado. Após uma hora de incubação, o peptídeo foi purificado porHPLC.A síntese de peptídeo NMU24 foi realizada por dissolver o tiolcontendo peptídeo precursor NMU em fosfato de sódio 0,2M pH 6,5, uréia8M, EDTA 4mM. Um excesso de três molares de N-etilmaleimida foiadicionado. Após uma hora de incubação, o peptídeo foi purificado porHPLC.
A síntese de peptídeo NMU28 foi realizado por dissolver o tiolcontendo peptídeo precursor NMU em HEPES 0,1 M pH 7,3, EDTA 4mM.
Um excesso molar de 1,5 de N-etilmaleimida foi adicionado. Após uma horade incubação, o peptídeo foi purificado por HPLC.
1.4. PEGuilação de análogos de Neuromedina U (NMU)
As reações de PEGuilação foram realizadas sob condiçõespermitindo a formação de ligação de amida (NMUl) ou ligação de tioéter. Ospeptídeos PEGuilados NMU foram então isolados usando cromatografiatrocadora de cátion (IXC) e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Acromatografia trocadora de cátion (WC) foi realizada em coluna TSK SP-5PW (Tosoh) (16 χ 100 nun) com um gradiente linear de NaCl (Oa 1M) emvolumes de coluna 3,5 em 0,2% de ácido fórmico, um carregamento de taxade fluxo mL/minuto, eluição de gradiente 2 mL/minuto. A cromatografia deexclusão de tamanho (SEC) foi realizada em coluna TSK-HW50 (Tosoh) (21χ 700 mm) em 0,1% de ácido acético (p/v), 30 % de acetonitrila, uma taxa defluxo mL/minuto. Os análogos NMU PEGuilados foram caracterizadosusando espectrometria de massa RP-HPLC, HPLC-SEC e MALDI-Tof.
O peptídeo NMUl foi sintetizado a partir do peptídeoprecursor NMU natural para produzir um derivado com PEG covalentementeligado por intermédio de uma ligação amida.
Síntese de NMUl
8,7 mg de peptídeo precursor (2,8 μmoles) foram dissolvidosem 1,5 mL de 0,2 M de HEPES, pH 7,3. Então 360 mg de mPEG2-NHS-40k(NEKTAR, 2Z3Y0t01) (8,6 μmoles) dissolvido em 3,5 mL de água (1: 3mol/razão molar de peptídeo ao PEG) foi adicionado por esta solução. Após18 horas de incubação, a solução de peptídeo PEGuilado foi acidificado por 1% de ácido fórmico e purificado pela cromatografia trocadora de cátion(IXC). O peptídeo PEGuilado purificado por DCC ainda foi purificado porSEC caracterizado pela RP-HPLC e MALDI-Tof.
Os peptídeos NMU7, NMU9, NMU12, NMU14, NMUl6,NMUl 8, NMU20, NMU21, NMU23, NMU25, NMU26, NMU27 e NMU29foram sintetizados a partir do peptídeo precursores NMU contendo tiol paraproduzir derivados com PEG covalentemente ligado por intermédio de umaligação de tioéter.
Síntese de NMU7
10 mg de peptídeo precursor (7,6 μηιο^) foram dissolvidosem 1 mL de 0,2 M de HEPES, pH 7,3, 4 mM de EDTA. Então 340 mg demPEG2-MAL-40k (NEKTAR, 2D3Y0T01) (8,4 μmoles) dissolvido em trêsmL de água (1: 1,1 mol/razão molar do peptídeo por PEG) foi adicionado poresta solução. Após uma hora de incubação, a solução de peptídeo PEGuiladofoi acidificado por 1 % de ácido fórmico e purificado pela cromatografiatrocadora de cátion (IXC). O peptídeo PEGuilado purificado por IXC aindafoi purificado pelo SEC caracterizado pela RP-HPLC e MALDI-Tof.
Síntese de NMU9
15 mg de peptídeo precursor (4,6 μηιο^) foram dissolvidosem 1 mL de 0,2 M de fosfato de sódio, pH 6,5, uréia 8M, 4 mM de EDTA.Então 204 mg de mPEG2-MAL-40k (NEKTAR, 2D3Y0T01) (5,1 μιηοΐεβ)dissolvido em dois mL de água (1: 1,1 mol/razão molar do peptídeo por PEG)foi adicionado por esta solução. Após uma hora de incubação, a solução depeptídeo PEGuilado foi acidificado por 1 % de ácido fórmico e purificadopela cromatografia trocadora de cátion (IXC). O peptídeo PEGuiladopurificado por IXC ainda foi purificado pelo SEC caracterizado pela RP-HPLC e MALDI-Tof.Síntese de NMU12
8 mg de peptídeo precursor (2,5 μηιοΐεε) foram dissolvidos em1 mL de 0,1 M de HEPES, pH 7,3, uréia 8M, 4 mM de EDTA. Então 115 mgde SUNBRIGHT GL2-400MA (NOF Corp.) (2,7 μπιοΐββ) dissolvido em doismL de água (1: 1,1 mol/razão molar do peptídeo por PEG) foi adicionado poresta solução. Após uma hora de incubação, a solução de peptídeo PEGuiladofoi acidificado por 1 % de ácido fórmico e purificado pela cromatografiatrocadora de cátion (IXC). O peptídeo PEGuilado purificado por IXC aindafoi purificado pelo SEC caracterizado pela RP-HPLC e MALDI-Tof.
Síntese de NMU14
10 mg de peptídeo precursor (3,1 μιηοίβε) foram dissolvidosem 1 mL de 0,1 M de HEPES, pH 7,3, uréia 8M, 4 mM de EDTA. Então 145mg de SUNBRIGHT GL2-400MA (NOF Corp.) (3,4 μπιοΐββ) dissolvido emdois mL de água (1: 1,1 mol/razão molar do peptídeo por PEG) foi adicionadopor esta solução. Após uma hora de incubação, a solução de peptídeoPEGuilado foi acidificado por 1 % de ácido fórmico e purificado pelacromatografia trocadora de cátion (LXC). O peptídeo PEGuilado purificadopor DCC ainda foi purificado pelo SEC caracterizado pela RP-HPLC eMALDITof.
Síntese de NMUl 6
8,3 mg de peptídeo precursor (6,0 μηιοΐεε) foram dissolvidosem 1 mL de 0,1 M de HEPES, pH 7,3, 4 mM de EDTA. Então 280 mg deSUNBRIGHT GL2-400MA (NOF Corp.) (6,6 μιηοΐεε) dissolvido em doismL de água (1: 1,1 mol/razão molar do peptídeo por PEG) foi adicionado poresta solução. Após uma hora de incubação, a solução de peptídeo PEGuiladofoi acidificado por 1 % de ácido fórmico e purificado pela cromatografiatrocadora de cátion (IXC). O peptídeo PEGuilado purificado por DCC aindafoi purificado pelo SEC caracterizado pela RP-HPLC e MALDI-Tof.
Síntese de NMUl810 mg de peptídeo precursor (5,4 μηιο^) foram dissolvidosem 1 mL de 0,1 M de HEPES, pH 7,3, 4 mM de EDTA. Então 250 mg deSUNBRIGHT GL2-400MA (NOF Corp.) (5,9 μιηοίβε) dissolvido em doismL de água (1: 1,1 mol/razão molar do peptídeo por PEG) foi adicionado poresta solução. Após uma hora de incubação, a solução de peptídeo PEGuiladofoi acidificado por 1 % de ácido fórmico e purificado pela cromatografiatrocadora de cátion (DCC). O peptídeo PEGuilado purificado por IXC aindafoi purificado pelo SEC caracterizado pela RP-HPLC e MALDI-Tof.
Síntese de NMU20
10 mg de peptídeo precursor (4,1 μπιο^) foram dissolvidosem 1 mL de 0,1 M de fosfato de sódio, pH 7,3, uréia 4M, 4 mM de EDTA.Então 174 mg de SUNBRIGHT GL2-400MA (NOF Corp.) (4,1 μηιο^)dissolvido em dois mL de água (1:1 mol/razão molar do peptídeo por PEG)foi adicionado por esta solução. Após uma hora de incubação, a solução depeptídeo PEGuilado foi acidificado por 1 % de ácido fórmico e purificadopela cromatografia trocadora de cátion (IXC). O peptídeo PEGuiladopurificado por DCC ainda foi purificado pelo SEC caracterizado pela RP-HPLC e MALDITof.
Síntese de NMU21
10 mg de peptídeo precursor (3,1 μιηο^) foram dissolvidosem 1 mL de 90 mM de fosfato de sódio, pH 6,6, uréia 4M, 4 mM de EDTA.Então 65 mg de SUNBRIGHT ME-200MA (NOF Corp.) (3,1 μηιοΐεε)dissolvido em um mL de água (1:1 mol/razão molar do peptídeo por PEG) foiadicionado por esta solução. Após uma hora de incubação, a solução depeptídeo PEGuilado foi acidificado por 1 % de ácido fórmico e purificadopela cromatografia trocadora de cátion (IXC). O peptídeo PEGuiladopurificado por DCC ainda foi purificado pelo SEC caracterizado pela RP-HPLC e MALDI-Tof.
Síntese de NMU2310 mg de peptídeo precursor (3,0 μmoles) foram dissolvidosem 1 mL de 90 mM de fosfato de sódio, pH 7,1, uréia 8M, 4 mM de EDTA.Então, 157 mg de SUNBRIGHT ME-200MA (NOF Corp.) (7,5 μπιοΐεε)dissolvido em dois mL de água (1: 2,5 moles/razão molar do peptídeo porPEG) foi adicionado por esta solução. Após uma hora de incubação, a soluçãode peptídeo PEGuilado foi acidificado por 1 % de ácido fórmico e purificadopela cromatografia trocadora de cátion (IXC). O peptídeo PEGuiladopurificado por IXC ainda foi purificado pelo SEC caracterizado pela RP-HPLC e MALDI-Tof.
Síntese de NMU25
10 mg de peptídeo precursor (2,9 μιηο^) foram dissolvidosem 1 mL de 90mM de fosfato de sódio, pH 7,1, uréia 8M, 4 mM de EDTA.Então, 125 mg de SUNBRIGHT GL2-400MA (NOF Corp.) (2,9 ^imoles)dissolvido em dois mL de uréia 8M (1: 1 mol/razão molar do peptídeo porPEG) foi adicionado por esta solução. Após uma hora de incubação, a soluçãode peptídeo PEGuilado foi acidificado por 1 % de ácido fórmico e purificadopela cromatografia trocadora de cátion (DCC). O peptídeo PEGuiladopurificado por DCC ainda foi purificado pelo SEC caracterizado pela RP-HPLC e MALDITof.
Síntese de NMU26
10 mg de peptídeo precursor (3,1 μmoles) foram dissolvidosem 1 mL de 90 mM de fosfato de sódio, pH 7,1, uréia 8M, 4 mM de EDTA.Então 70 mg de SUNBRIGHT GL2-200MA (NOF Corp.) (3,1 μπιοΐββ)dissolvido em dois mL de água (1:1 mol/razão molar do peptídeo por PEG)foi adicionado por esta solução. Após uma hora de incubação, a solução depeptídeo PEGuilado foi acidificado a 1 % de ácido fórmico e purificado pelacromatografia trocadora de cátion (IXC). O peptídeo PEGuilado purificadopor DCC ainda foi purificado pelo SEC caracterizado pela RP-HPLC eMALDI-TofSíntese de NMU27
10 mg de peptídeo precursor (3,1 μmoles) foram dissolvidosem 1 mL de 90 mM de fosfato de sódio, pH 7,1, uréia 8M, 4 mM de EDTA.Então 136 mg de mPEG-maleimida-40 kDa (DOWpharma, 008-016) (3,4μπιοίβε) dissolvido em dois mL de água (1: 1,1 mol/razão molar do peptídeopor PEG) foi adicionado por esta solução. Após uma hora de incubação, asolução de peptídeo PEGuilado foi acidificado por 1 % de ácido fórmico epurificado pela cromatografia trocadora de cátion (IXC). O peptídeoPEGuilado purificado por IXC ainda foi purificado pelo SEC caracterizadopela RPHPLC e MALDI-Tof.
Síntese de NMU29
8 mg de peptídeo precursor (5,1 μmoles) foram dissolvidos em1 mL de 0,1 M de HEPES, pH 7,3, 4 mM de EDTA. Então 217 mg deSUNBRIGHT GL2-400MA (NOF Corp.) (5,1 μπιο^) dissolvido em doismL de água (1:1 mol/razão molar do peptídeo por PEG) foi adicionado poresta solução. Após uma hora de incubação, a solução de peptídeo PEGuiladofoi acidificado por 1 % de ácido fórmico e purificado pela cromatografiatrocadora de cátion (IXC). O peptídeo PEGuilado purificado por IXC aindafoi purificado pelo SEC caracterizado pela RP-HPLC e MALDI-Tof
1.5. Colesteroilação de análogos de Neuromedina U (NMU)
Derivações com colesterol foram realizadas sob condições quepermite a formação de ligação de tioéter. Os agonistas colesteroilados doreceptor de neuromedina U foram então purificados pelo RPHPLCcaracterizado pela espectrometria de massa de eletropulverização.
Síntese de NMUlO
18 mg de peptídeo precursor (5,6 μmoles) foram dissolvidosem 1 mL de DMF. Então três mg de bromoacetato de colesterila (14 μιηο^),dissolvido em 70 μί de THF (1: 1,1 mol/razão molar do peptídeo porbromoacetato de colesterila), e 5 μΙ, de DIEA (N,N-diisopropiletilamina)(excesso molar de 2,5 vezes durante o peptídeo) foram adicionados para estasolução. Após uma hora de incubação, o peptídeo colesteroilado foipurificado por RP-HPLC caracterizado pela espectrometria de massa deeletropulverização.
Síntese de NMUl 1
17 mg de peptídeo precursor (12,9 μmoles) foram dissolvidosem 1 mL de DMF. Então 7,2 mg de bromoacetato de colesterila (14 μιηο^),dissolvido em 0,17 mL de THF (1: 1,1 mol/razão molar do peptídeo porbromoacetato de colesterila), e 11,7 μL de DIEA (excesso molar de 5 vezesdurante o peptídeo) foram adicionados por esta solução. Após uma hora deincubação, o peptídeo colesteroilado foi purificado por RP-HPLCcaracterizado pela espectrometria de massa de eletropulverização.
EXEMPLO 5
Estudo da alimentação com NMU e análogos destes
Camundongo de nocaute NMURl (Nmurl-/-) foi geradousando técnicas de recombinação homóloga padrão. Os camundongos Nmurltransferidos ao Taconic Farms onde estes foram mantidos em uma práticagenética mista de 75 % C57BL/6 χ 25 % 129S6/SvEv ou seis geraçõescruzadas novamente com C57BL/6, os camundongos nocautes NMUR2(Nmur2-/-) foram licenciados por Deltagen Inc., San Mateo, CA esubseqüentemente transferidos por Taconic Farms onde estes foram mantidosem uma prática genética mista de 75 % C57BL/6 χ 25 % 129/OlaHsd ou setegerações cruzadas novamente com C57BL/6, os camundongos nocautesNMURl e NMUR2 duplos (Nmurl&2-/-) foram gerados pelo cruzamento doscamundongos N6 Nmurl-/- pelos camundongos N7 Nmur2-/-. Oscamundongos foram individualmente alojados em gaiolas Tecniplast em umafacilidade SPF convencional. Os camundongos foram inicialmente mantidosem uma dieta de comida regular e então prematuramente na sua vida mudadospara uma dieta rico em gordura (D 12492: 60 % kcal de gordura; ResearchDiets, Inc., New Brunswick, NJ) com ad libitum à água em um ciclo de 12horas de luz /12 horas de escuro.
Os camundongos obesos induzidos por dieta machosalimentados ad libitum foram pesados e dosados i.p. ou s.c. cerca de 30minutos antes do começo da fase do escuro do ciclo de luz e fornecido comuma alíquota pré-pesada de dieta de gordura alta D12492 que foi então pesado2 horas e 18 horas (dia 1), 42 horas (dia 2), 66 horas (dia 3), e 90 horas (dia 4)após o começo da fase escura inicial. Os camundongos foram pesados nospontos de tempo 18, 42, 66 e 90 horas. Os dados mostrados do resultado doestudo da alimentação (todos os valores são relatados como significam ±SEM e os dados foram analisados usando um teste t de Student que não empar de duas caudas; valores ρ < 0,05 foram relatados como significante e sãodenotados com um asterisco).
Como mostrado nas Figuras 2A e 2B, administração periféricaaguda dos peptídeos seletivos NMURl, agonista do receptor H deneuromidina U e NMUl3, significantemente reduzido pela entrada dealimento em camundongos do tipo selvagem, mas não em camundongosnocaute Nmur 1, demonstrando que NMURl é requerido para as açõesanoréticas destes análogos. Adicionalmente, estes dados demonstram queagonismo seletivo NMURl é suficiente para recapitular as ações anoréticasdo agonista NMU NMURl/2 total.
As Figuras 3 A e 3 B ilustram a descoberta da administraçãosubcutânea aguda do NMU PEGuilado reduzindo a entrada de alimento portrês dias pós-dose. Consistente com o perfil metabólico in vitro e in vivo dosanálogos PEGuilados, NMUl exibe maior eficácia na redução durante a noiteda entrada de alimento quando comparado ao hNMU-25 e reduções naentrada de alimento são observados por três dias pós-dose. Reduçõessignificantes no peso corporal também foram observadas.
As Figuras 4A e 4B demonstram que NMU12 também é umpeptídeo anorético efetivo. Similar a NMUl, uma redução significante naentrada de alimento e peso corporal são observados por três dias seguindouma administração subcutânea simples de peptídeo.
Ainda, as Figuras 5A e 5B ilustram que os efeitos anoréticosdo NMU12 são mediados pelos receptores NMURl e NMUR2. Aadministração aguda de NMUl 2 foi altamente eficaz em animais do tiposelvagem mas nenhum efeito foi observado nos animais nocautes duplosNMUR1/NMUR2. Visto que o efeito no receptor NMUR2 ocorreprincipalmente no cérebro, o resultado indica que NMU12 é capaz de cruzar abarreira sangue-cérebro. Os efeitos de NMUR2 para reduzir a entrada dealimento e peso corporal requer exposição central, considerando aqueleNMUR1 que requer exposição periférica.
As Figuras 6A e 6B mostram que o termo mais longo dosefeitos anoréticos de NMU12 PEGuilado são mediados tanto pelos receptoresNMUR1 e quanto NMUR2. As reduções na entrada de alimento e pesocorporal são observados por dois dias pós-dose nos animais nocaute NMURl.Entretanto, apenas durante a noite os efeitos são observados nos animaisnocaute NMUR2. Este é em contraste com os efeitos anoréticos de hNMU-25que são mediados unicamente por NMURl, demonstrando que hNMU-25 eNMUl2 tendo mecanismos distintos de ação.
As Figuras 7A a 7C demonstram que administração crônica deNMU12 pode reduzir a entrada de alimento e peso corporal. O NMU12 foidosado todos os dias (QD), todos os outros dias (Q2D) ou a cada três dias(Q3D). O painel A mostra uma mudança cumulativa no peso corporal pornove dias após o começo do tratamento. A última dose foi administrada no diaquatro do estudo e as medições foram feitas no dia nove. A entrada dealimento crescente (B) e peso corporal (C) foi significantemente reduzido emtodos os paradigmas de dosagem para NMUl 2, a entrada de alimento foireduzido 12 a 27 % nestas doses com relação ao grupo tratado com veículo.Da mesma maneira, a mudança crescente no peso corporal variou de umaperda de 3,3 % a tanto quanto uma de 7,3 % com relação ao grupo de controlede veículo.
Um resumo das reduções percentuais na entrada de alimento emudança do peso corporal a partir dos experimentos in vivo com análogoshNMU-25 e NMU são mostrados na Tabela 10, os cálculos são baseados emresposta dos veículos.
Tabela 10 <table>table see original document page 88</column></row><table>
EXEMPLO 6
Experimentos de Estabilidade de Plasma
Para determinar a estabilidade de NMU12 e NMUl em plasmaa partir de espécies diferentes, os experimentos de perfuração in vitro foramrealizados. NMU12, NMUl, ou hNMU-25 foram adicionados ao plasma(adquirido a partir de Bioreclamation) em uma concentração final de ΙμΜ eincubados em várias temperaturas (temperatura ambiente, 4o C e 37° C). asalíquotas destas amostras de plasma foram retiradas em vários pontos detempo, congelados a -80° C, e subseqüentemente realizado no ensaio FLEPRcom a expressão da linha celular NMURl humano para determinar opercentual do peptídeo ativo que permanece após vários pontos de tempo deincubação. A atividade percentual de peptídeo remanescente na amostra foicalculado com base na resposta FLIPR para a amostra no período de tempo departida (T = 0) antes de qualquer mudança de temperatura ser calada com aamostra de peptídeo. Em T = Oa recuperação esperada é de 100 %.
A Figura 8 ilustra a estabilidade in vitro de hNMU-25 eagonistas NMUl e NMUl2 PEGuilados do receptor de neuromedina U emplasma humano com experimentos de perfuração, indicando que aPEGuilação de NMU fornece maior estabilidade em plasma humano. A vidamédia de hNMU-25 em plasma humano é menor do que 16 horas portanto osanálogos PEGuilados NMUI (hNMU-25 PEGuilado) e NMU12 exibiu umaumento na vida média do que três dias em plasma humano incubado a 37° C.
EXEMPLO 7
Análise Farmacocinética de peptídeos usando o bioensaio
O agonista do receptor NMU12 de neuromidina U expõeníveis em animais dosados que foram medidos usando o bioensaio ecomparados com hNMU-25 de níveis de exposição. Os animais foramdosados subcutaneamente com 10 mg/kg NMU12 ou hNMU-25 e o plasmafoi coletado em vários pontos de tempo pós-dose. O bioensaio foi um ensaiocom base em a FLIPR, que foi realizado essencialmente como descrito acimacom as seguintes modificações. A preparação das amostras antes do ensaio foirealizado em gelo para minimizar a degradação das amostras de plasma. Oensaio foi realizado com 4 % de plasma como na concentração final. Umatitulação de três pontos foi calada com o plasma dosado e testado em linhascelulares NMURl humanas que expressam o uso de FLIPR. Uma respostaapós adição da amostra foi tomada como as unidades de fluorescênciamáxima menos a fluorescência imediata antes da estimulação para cadareservatório. Além disso para uma titulação de três pontos de amostras deplasma dosado, uma titulação de 16 pontos do polipeptídeo (hNMU-25 ouNMU12) foi realizado em 4 % de plasma (plasma simples) para servir como opadrão. A concentração do polipeptídeo em plasma foi calculado com baseem extrapolações do padrão apropriado usando o software GraphPad Prism.
A Figura 9 mostra as propriedades farmacocinéticas dehNMU-25 e NMU12 PEGuilado em camundongos, indicando que aPEGuilação de NMU fornece maior estabilidade metabólica in vivo. A linhatracejada indica que os limites da detecção para o ensaio (LOD). Estesexperimentos demonstram que a PEGuilação de NMU intensifica aestabilidade metabólica tanto in vitro quanto in vivo.
Enquanto a presente invenção é descrita neste com referênciaas formas de realização ilustradas, será entendido que a invenção não élimitada a isto. Aquele tendo uma habilidade comum na técnica e acesso asexplicações destes reconhecerão as modificações adicionais e formas derealização dentro do escopo deste. Portanto, a presente invenção é limitadaapenas pelas reivindicações ligadas neste.SEQUENCE LISTING
<110> Merck & Co., Inc.Marsh, Donald J.Pessi, AntonelloBednarek, Maria A.Bianchi, ElisabettaIngallinella, PaoloPeier, Andera M.
<120> AGONISTAS DO RECEPTOR DE NEUROMEDINA U E SEUS USOS
<130> PCT-21984Y
<150> 60/783,933<151> 2006-03-20
<160> 28
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1<211> 25<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Agonista NMU
<223> Xaa Pode ser qualquer aminoácido ou está ausente
<400> 1
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn20 25
<210> 2<211> 25<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU-25<400> 2
Phe Arg Val Asp Glu Glu Phe Gln
1 5
Gly Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg20
Ser Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg10 15
Asn25
<210> 3<211> 14<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU (12-25)<400> 3
Ala Ser Gln Ser Arg Gly Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn1 5 10
<210> 4<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU (17-25)<400> 4
Gly Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn1 5
<210> 5<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU (19-25)<400> 5
Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn1 5
<210> 6<211> 19<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU (7-25)<400> 6
Phe Gln Ser Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg Gly Tyr Phe Leu Phe Arg
1 5 10 15
Pro Arg Asn
<210> 7<211> 25<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU
<221> VARIANT<222> 18
<223> Xaa é Y, W, F, uma des-aminoácido ou um grupo acila, ou estáausente
<221> VARIANT<222> 19
<223> Xaa é A, W, Y, F, ou um aminoácido alifático<221> VARIANT<222> 20
<223> Xaa é G, sarcosina (Sar), D-leu, NMe-Leu, D-Ala,Α, ou está ausente
<221> VARIANT<222> 21
<223> Xaa é NMe-Phe, um aminoácido alifático, um aminoácidoaromático, A, ou W
<221> VARIANT<222> 22
<223> Xaa é K, A, ou L
<221> VARIANT
<222> (23)...(23)
<223> Xaa é Sar, A, ou L
<221> VARIANT<222> (24) ... (24)<223> Xaa é Harg ou K
<221> VARIANT<222> (25)...(25)
<223> Xaa é qualquer D- ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle, ou A
<400> 7
Phe Arg Val Asp Glu Glu Phe Gln Ser Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg
15 10 15
Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25
<210> 8<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> NMU Agonist
<221> VARIANT<222> 1
<223> Xaa é A, W, Y, F, um aminoácido alifático, ou estáausente
<221> VARIANT<222> 2
<223> Xaa é A, W, Y, F, ou um aminoácido alifático
<221> VARIANT<222> 3
<223> Xaa é L, F, G, Sar, D-Leu, NMe-Leu, D-Ala, A, ou estáausente
<221> VARIANT<222> 4
<223> Xaa é NMe-Phe, um aminoácido alifático, umaminoácido aromático, A, ou W
<221> VARIANT<222> 5
<223> Xaa é R, F, K, A, ou L<221> VARIANT<222> (6)...(6)<223> Xaa é Ρ, Sar, Α, ou L
<221> VARIANT
<222> (7)...(7)
<223> Xaa é R, Harg, ou K
<221> VARIANT<222> (8) ... (8)
<223> Xaa é qualquer D- ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle, ou A<400> 8
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 9<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU<400> 9
Tyr Phe Trp Arg Phe Arg Asn1 5
<210> 10<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU
<221> VARIANT<222> 3
<223> Xaa is D-Leu<4 00> 10
Tyr Phe Xaa Trp Arg Pro Arg Asn1 5
<210> 11<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU<4 00> 11
Tyr Phe Gly Trp Arg Pro Arg Asn1 5
<210><211>
128<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU
<221> VARIANT<222> (0)...(0)<223> Xaa é D-Ala
<400> 12
Tyr Phe Xaa Trp Arg Pro Arg Asn1 5
<210> 13<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU<400> 13
Phe Phe Trp Arg Pro Arg Asn1 5
<210> 14<211> 24<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU
<400> 14
Phe Arg Val Asp Glu Glu Phe Gln
1 5
Gly Tyr Phe Trp Arg Pro Arg Asn20
Ser Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg10 15
<210> 15<211> 24<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU
<221> VARIANT<222> 20
<223> Xaa é D-Leu
<400> 15
Phe Arg Val Asp Glu Glu Phe Gln Ser Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg
1 5 10 15
Gly Tyr Phe Xaa Leu Trp Arg Pro20
<210> 16<211> 8
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU
<221> VARIANT<222> 7
<223> Xaa é Harg<400> 16
Phe Trp Leu Phe Arg Pro Xaa Asn1 5
<210> 17<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU
<221> VARIANT<222> 7
<223> Xaa é Harg<4 00> 17
Phe Trp Leu Phe Arg Ala Xaa Asn1 5
<210> 18<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU
<221> VARIANT<222> 8
<223> Xaa é D-Nle<4 00> 18
Trp Phe Leu Phe Arg Pro Arg Xaa1 5
<210> 19<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU<4 00> 19
Phe Trp Leu Phe Arg Ala Arg Asn1 5<210> 20<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU<400> 20
Tyr Ala Leu Phe Arg Ala Arg Asn1 5
<210> 21<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU<400> 21
Phe Ala Leu Phe Arg Pro Arg Asn1 5
<210> 22<211> 24<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU
<221> VARIANT<222> 24
<223> Xaa é Harg<400> 22
Phe Arg Val Asp Glu Glu Phe Gln Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg Gly
1 5 10 15
Phe Trp Leu Phe Arg Pro Xaa Asn20
<210> 23<211> 25<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU
<221> VARIANT<222> 24
<223> Xaa é Harg<400> 23
Phe Arg Val Asp Glu Glu Phe Gln
1 5
Gly Phe Trp Leu Phe Arg Ala Xaa20
Ser Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg10 15
Asn25<210> 24<211> 25<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU
<221> VARIANT<222> 25
<223> Xaa é D-Nle<400> 24
Phe Arg Val Asp Glu Glu Phe Gln
1 5
Gly Phe Trp Leu Phe Arg Pro Arg20
Ser Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg10 15
Xaa25
<210> 25<211> 25<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU
<221> VARIANT<222> 20
<223> Xaa é D-Ala<400> 25
Phe Arg Val Asp Glu Glu Phe Gln
1 5
Gly Tyr Phe Xaa Trp Arg Pro Arg20
Ser Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg10 15
Asn25
<210> 26<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU
<221> VARIANT<222> 2
<223> Xaa é D-Leu<400> 26
Phe Xaa Trp Arg Pro Arg Asn1 5
<210> 27<211> 25<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Agonista NMU<221> VARIANT<222> (1) ... (17)
<223> Xaa é qualquer aminoácido ou está ausente
<221> VARIANT<222> 18
<223> Xaa é Y, W, F, um des-aminoácido ou um acila
<221> VARIANT<222> 19
<223> Xaa é F, A, W, or um aminoácido alifático
<221> VARIANT<222> 20
<223> Xaa é L, G Sar, D-Leu, NMe-Leu, D-Ala, D, ou estáausente
<221> VARIANT<222> 21
<223> Xaa é F, NMe-Phe, um aminoácido alifático, umaminoácido aromático, A, ou W
<221> VARIANT
<222> (22)...(22)
<223> Xaa é R, K, A, ou L
<221> VARIANT
<222> (23)...(23)
<223> Xaa é P, Sar, A, ou L
<221> VARIANT
<222> (24) ... (24)
<223> Xaa é R, Harg, ou K
<221> VARIANT
<222> (25)...(25) D- or L-amino acid, Nle ou Dle, ou A<400> 27
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
15 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25
<210> 28<211> 25<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Agonista NMU<400> 28
Phe Arg Val Asp Glu Glu Phe Gln
1 5
Pro Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg20
Ser Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg10 15
Asn25

Claims (35)

1. Agonista do receptor de neuromidina U, caracterizado pelofato de que tem a fórmula<formula>formula see original document page 100</formula>em que o peptideo tem a seqüência de aminoácido X-X-X-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X1 °-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X-X-Xz3 (SEQ ID N°: 27), em que os aminoácidos de 1 a 17 podem serqualquer aminoácido ou ausentes; em que o aminoácido X18 está ausente, Y,W, F, um des-aminoácido ou um grupo acila; aminoácido X19 é A, W, Y, F ouum aminoácido alifático; aminoácido X está ausente, L, G, sarcosina (Sar),D-Leu, NMe-Leu, D-Ala ou A; aminoácido X21 é F, NMe-Phe, umaminoácido alifático, um aminoácido aromático, A ou W; X22 é R, Κ, A ou L;aminoácido X23 é P, Sar, A ou L; aminoácido X24 é R, Harg ou K e oaminoácido X25 é N, qualquer D- ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle, A; e Z éum grupo de proteção opcionalmente presente que, se presente, é unido aogrupo amino de terminal N e Z2 é NH2 ou um grupo de proteçãoopcionalmente presente que, se presente, é unido ao grupo carbóxi de terminalC e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
2. Agonista do receptor de neuromedina U de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o aminoácido de terminal N écovalentemente unido a uma ou mais moléculas selecionadas do grupo queconsiste de PEG, colesterol, N-etilmaleimidila e palmitoíla.
3. Agonista do receptor de neuromedina U de acordo com areivindicação 1 caracterizado pelo fato de que o peptideo ainda inclui umresíduo de cisteína no terminal N do peptideo em que um grupo de proteçãoestá opcionalmente presente que, se presente, é unido ao grupo amino determinal N do resíduo de cisteína.
4. Agonista do receptor de neuromedina U de acordo com areivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o grupo tiol do resíduo decisteína no terminal N é covalentemente unido a uma ou mais moléculasselecionadas do grupo que consiste de PEG, colesterol, N-etilmaleimidila epalmitoíla.
5. Agonista do receptor de neuromedina U de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grupo tiol do resíduo decisteína no terminal N é covalentemente ligado a uma molécula de PEG.
6. Agonista do receptor de neuromedina U de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um grupo ligador tendo umaextremidade distai e uma extremidade proximal é covalentemente unido a suaextremidade distai ao terminal N do peptídeo e a extremidade proximal dogrupo ligador é covalentemente ligada ao terminal carboxila de um resíduo decisteína em que um grupo de proteção está opcionalmente presente que, sepresente, é unido ao grupo amino de terminal N do resíduo de cisteína.
7. Agonista do receptor de neuromedina U de acordo com areivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o grupo tiol do resíduo decisteína é covalentemente unido a uma ou mais moléculas selecionadas dogrupo que consiste de PEG, colesterol, N-etilmaleimidila e palmitoíla.
8. Agonista do receptor de neuromedina U de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem a seqüência deaminoácido Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xi0-Xii-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-F-L-F-R-P-R-N (SEQ ID N°: 1), em que os aminoácidos de 1 a 17 podemser qualquer aminoácido ou ausentes.
9. Agonista do receptor de neuromedina U de acordo com areivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem uma seqüênciade aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 2, SEQ IDN°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5 e SEQ ID N°: 6.
10. Agonista do receptor de neuromedina U de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem uma seqüênciade aminoácido mostrada na SEQ ID N°: 2.
11. Agonista do receptor de neuromedina U de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agonista tem a fórmula Ac-C2-peptídeo-CONH2 em que Ac é um grupo acetila, C2 é Cys(PEG)240 kDa eo peptídeo tem a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID N°: 2.
12. Agonista do receptor de neuromedina U de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo compreende aseqüência de aminoácido F-R-V-D-E-E-F-Q-S-P-F-A-S-Q-S-R-G-X18-X19-X20-X2I-X22-X23-X24-X25 (SEQ ID N°: 7) em que o aminoácido X18 estáausente, Y, W, F, um des-aminoácido ou um grupo acila; aminoácido X19 é A,W, Y, F ou um aminoácido alifático; aminoácido X está ausente, G,sarcosina (Sar), D-Leu, NMe-Leu, D-Ala ou A; aminoácido X21 é NMe-Phe5um aminoácido alifático, um aminoácido aromático, A ou W; aminoácido X22é Κ, A ou L; aminoácido X23 é Sar, A ou L; aminoácido X24 é Harg ou K e oaminoácido X é qualquer D- ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle, ou A.
13. Agonista do receptor de neuromedina U de acordo com areivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o peptídeo compreende aseqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N0:-14, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24 e SEQID N°: 25.
14. Agonista do receptor de neuromedina U de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo compreende aseqüência de aminoácido X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID N°: 8) em queo aminoácido X1 está ausente, Y, W, F, um des-aminoácido ou um grupoacila; aminoácido X é A, W, Y, F ou um aminoácido alifático; aminoácidoX está ausente, G, sarcosina (Sar), D-Leu, NMe-Leu, D-Ala ou A;aminoácido X4 é NMe-Phe, um aminoácido alifático, um aminoácidoaromático, A ou W; aminoácido X5 é Κ, A ou L; aminoácido X6 é Sar, A ouL; aminoácido X' é Hargou K e o aminoácido X é qualquer D- ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle, ou A.
15. Agonista do receptor de neuromedina U de acordo com areivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o peptídeo compreende aseqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N0: 9,SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°:- 16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N0: 20 e SEQIDN°: 21.
16. Método para a produção de um agonista do receptor deneuromidina U que pode cruzar a barreira sangue-cérebro, caracterizado pelofato de que compreende:ligar covalentemente ao agonista uma ou mais moléculas dePEG em que as uma ou mais moléculas de PEG tornam o peptídeo capaz decruzar a barreira sangue-cérebro.
17. Método de acordo com a reivindicação 16 caracterizadopelo fato de que o agonista do receptor de neuromidina U tem a fórmulaZ1-Peptideo-Z2em que o peptídeo tem a seqüência de aminoácido X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Xn-X12-X13..X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24 -X25 (SEQ ID N°: 27), em que os aminoácidos de 1 a 17 podem serqualquer aminoácido ou ausentes; em que o aminoácido X18 está ausente, Y,W, F, um des-aminoácido ou um grupo acila; aminoácido X19 é A, W, Y, F ouum aminoácido alifático; aminoácido X está ausente, L, G, sarcosina (Sar),D-Leu, NMe-Leu, D-Ala ou A; aminoácido X21 é F, NMe-Phe, umaminoácido alifático, um aminoácido aromático, A ou W; X22 é R, Κ, A ou L;aminoácido X23 é P, Sar, A ou L; aminoácido X24 é R, Harg ou K e oaminoácido X25 é N, qualquer D- ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle, A e Z1 éum grupo de proteção opcionalmente presente que, se presente, é unido aogrupo amino de terminal N e Z é NH2 ou um grupo de proteçãoopcionalmente presente que, se presente, é unido ao grupo carbóxi de terminalC e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
18. Método para a produção de um agonista do receptor deneuromidina U compreendendo todo ou uma porção do peptídeo de NMU-25que é específico para um subtipo de receptor de neuromedina U, caracterizadopelo fato de que compreende modificar um ou mais dos sete aminoácidos noterminal C do polipeptídeo a um aminoácido ou análogo de aminoácido quenão é natural ao peptídeo NMU-25 humano.
19. Método para o tratamento de um distúrbio metabólico emum indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende:administrar ao indivíduo a quantidade terapeuticamente eficazde um agonista do receptor de neuromidina U que tem a fórmulaZ1-Peptideo-Z2em que o peptídeo tem a seqüência de aminoácido X1-X2-X3-X4-X5-X^-X^-X8-X9-X 1^-X11-X12-X13-X1 4-X 15-X1 ^-X1 ^-X 1^-X1 9-X2^-X21-X22-X23-X24-X25 (SEQ ID N°: 27), em que os aminoácidos de 1 a 17 podem serquaisquer aminoácidos ou ausentes; em que o aminoácido X18 está ausente, Y,W, F, um des-aminoácido ou um grupo acila; aminoácido X19 é A, W, Y, F ouum aminoácido alifático; aminoácido X está ausente, L, G, sarcosina (Sar),D-Leu, NMe-Leu, D-Ala ou A; aminoácido X21 é F, NMe-Phe, umaminoácido alifático, um aminoácido aromático, A ou W; X22 é R, Κ, A ou L;aminoácido X23 é P, Sar, A ou L; aminoácido X24 é R, Harg ou K e oaminoácido X é N, qualquer D- ou L-aminoácido, Nle ou D-Nle, A; e Z éum grupo de proteção opcionalmente presente que, se presente, é unido ao grupoamino de terminal N e Z é NH2 ou um grupo de proteção opcionalmentepresente que, se presente, é unido ao grupo carbóxi de terminal C, para otratamento do distúrbio no indivíduo e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o distúrbio metabólico é selecionado do grupo que consistede obesidade, síndrome metabólica ou síndrome X, diabete do tipo II,complicações da diabete, hipertensão, dislipidemias, doençascardiovasculares, cálculos biliares, osteoartrite e certas formas de câncer.
21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o distúrbio metabólico é obesidade.
22. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o peptídeo tem a seqüência de aminoácido X1-X2-X3-X4-X5- X6-X7-X8-X9-Xio-Xii-Xi2-X13-X14-X15-X16-X17-X18-F-L-F-R-P-R-N (SEQ ID N°: 1),em que os aminoácidos de 1 a 17 podem ser qualquer aminoácido ou ausentes.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que o peptídeo tem uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo que consiste de SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ IDN°: 5 e SEQ ID N°: 6.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de que o peptídeo tem uma seqüência de aminoácido mostrada naSEQ ID N°: 2.
25. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o aminoácido de terminal N é covalentemente unido a umaou mais moléculas selecionadas do grupo que consiste de PEG, colesterol, N-etilmaleimidila e palmitoíla.
26. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o peptídeo ainda inclui um resíduo de cisteína no terminal Ndo peptídeo em que um grupo de proteção está opcionalmente presente que,se presente, é unido ao grupo amino de terminal N do resíduo de cisteína.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que o grupo tiol do resíduo de cisteína no terminal N écovalentemente unido a uma ou mais moléculas selecionadas do grupo queconsiste de PEG, colesterol, N-etilmaleimidila e palmitoíla.
28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que o grupo tiol do resíduo de cisteína no terminal N écovalentemente ligado a uma molécula PEG.
29. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que um grupo ligador tendo uma extremidade distai e umaextremidade proximal é covalentemente unida a sua extremidade distai aoterminal N do peptídeo e a extremidade proximal do grupo ligador écovalentemente ligado ao terminal carboxila de um resíduo de cisteína em queum grupo de proteção está opcionalmente presente que, se presente, é unidoao grupo amino de terminal N do resíduo de cisteína.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que o grupo tiol do resíduo de cisteína é covalentemente unido auma ou mais moléculas selecionadas do grupo que consiste de PEG,colesterol, N-etilmaleimidila e palmitoíla.
31. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o agonista tem a fórmula Ac-C2-peptídeo-CONH2, em queAc é um grupo acetila, C2 é Cys(PEG)240 kDa e o peptídeo tem a seqüênciade aminoácido mostrada SEQ ID N°: 2.
32. Uso do agonista do receptor de neuromedina U comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelofato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de umdistúrbio metabólico.
33. Uso do agonista do receptor de neuromedina U comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelofato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de obesidade.
34. Uso do agonista do receptor de neuromedina U comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelo fato deser na fabricação de um medicamento para o tratamento de diabete do tipo Π.
35. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende o agonista do receptor de neuromidina U como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 15 e um carreador farmaceuticamenteaceitável.
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