BRPI0708950A2

BRPI0708950A2 - composiÇço repelente, e, mÉtodo para repelir uma peste alvo de uma Área alvo

Info

Publication number: BRPI0708950A2
Application number: BRPI0708950-3A
Authority: BR
Inventors: Joel R Coats; Gretchen Elizabeth Paluch; Junwei Zhu
Original assignee: Univ Iowa State Res Found Inc
Priority date: 2006-03-21
Filing date: 2007-03-21
Publication date: 2011-06-14
Also published as: US20070154504A1; JP2009530421A; WO2007109736A2; AU2007226850A1; WO2007109736A3; CA2646649A1; US7939091B2; EP2009994A2

Abstract

COMPOSIÇçO REPELENTE, E, MÉTODO PARA REPELIR UMA PESTE ALVO DE UMA AREA ALVO As composições compreendem uma quantidade de repelente eficaz de um ou mais monoterpenóides, um ou mais sesquiterpenóides contendo oxigênio ou uma mistura de um ou mais monoterpenóides e um ou mais sesquiterpenóides contendo oxigênio em combinação com um carreador, em que as composições são formuladas para repelir uma peste alvo a partir de uma área alvo. Em uma forma de realização, o um ou mais monoterpenóides, e/ou um ou mais sesquiterpenóides são de uma fonte biorracional, tal como um volátil de planta. Tais composições possuem repelência, incluindo repelência a longo prazo, contra artrópodes.

Description

"COMPOSIÇÃO REPELENTE, Ε, MÉTODO PARA REPELIR UMAPESTE ALVO DE UMA ÁREA ALVO"

Este pedido é uma continuação em parte do Pedido U.S. No.de Série 10/323.100 depositado em 18 de dezembro de 2002, que é umdivisional do Pedido U.S. No. de Série 09/635.030 depositado em 04 deagosto de 2000, agora publicado como Patente U.S. ns 6.524.605. A PatenteU.S. n- 6.524.605 reivindica o benefício sob 35 U.S.C. 119 (e) do PedidoProvisório U.S. No. 60/147.679 depositado em 06 de agosto de 1999, agoraabandonado, e o Pedido Provisório U.S. no. de série 60/150.051 depositadoem 20 de agosto de 1999, agora abandonado, todos dos quais são por meiodesta incorporados por referência em sua totalidade.

Declaração dos Direitos de GovernoEsta invenção foi constituída com suporte do Governo dosEstados Unidos sob USDA/SCREES 2001-31100-06019; 2002-31100-06019;2003-31100-06019; 2004-31100-06019 e 2005-31100-06019. O Governopossui certos direitos nesta invenção.

Campo

A presente invenção pertence aos repelentes.

Fundamentos

O uso de repelentes de inseto é amplamente aceito em todo omundo. Além dos repelentes destinados para uso ao ar livre, os repelentes sãotambém disponíveis para uso em casas para repelir pestes tais como baratas,cupins, formigas, pulgas, e assim por diante. O padrão comercial para arepelência de inseto é N,N-dietil-3-metilbenzamida (DEET). AEnvironmental Protection Agency (EPA) estima que mais do que 38 % dapopulação dos U.S. utiliza um repelente de inseto com base em DEET a cadaano e que pelo mundo inteiro o uso excede a 200.000.000 de pessoasanualmente (U.S. Environmental Protection Agency, PBS1-207722, 1980).No entanto, a DEET é conhecida de causar efeitos adversos para a saúdeseveros em algumas pessoas, particularmente em concentrações mais elevadas(ver, por exemplo, Qui et. al.,1998, J. Am. Mosq. Control Assoc. 14 (1): 12-27; Miller, J.D., 1982, New Eng. J. Med. 307:1341-1342; Roland, et. al.,1985, Can J. Med. Assn. J. 132:155-156).

Durante os últimos anos esforços têm sido direcionados comrespeito ao desenvolvimento de repelentes naturais. Muito desta iniciativa édevido não apenas aos efeitos tóxicos dos repelentes tradicionais, mas aoregulamento aumentado do governo de certos produtos químicos no controlede peste de inseto (por exemplo, DEET, naftaleno, ftalato de dimetila, etc.) eo desejo de usar produtos que são mais ambientalmente amigáveis do que osprodutos químicos tradicionais.

Os biorrepelentes naturalmente derivados foram investigadoscomo um grupo de produtos químicos que possuem atividade biológica epodem causar efeitos repelentes ou inseticidas sem o impacto negativo sobre asegurança humana ou o ambiente. Muitos óleos e extratos de planta foramidentificados como inibitórios, repelentes ou tóxicos de inseto. Estesincluem os repelentes de inseto botânicos que incluem componentesextraídos da citronela, canela, cedro, eucalipto, hortelã, capim-limão,gerânio e feijão de soja. O óleo de Neem, um extrato da árvoreNeem, Azadirachta indica, é um outro produto natural que tem mostradorepelência de mosquitos Anopheles. No entanto, estes produtos não oferecemcontrole residual equivalente aos padrões, tais como DEET. A citronela, porexemplo, é conhecida de ser amplamente repelente e altamente volátil. Velasde citronela foram apresentadas de serem marginalmente eficazes, se nãotodas.

Assim, o que é necessário é um biorrepelente sempreocupações tóxicas ou ambientais, mas que possa fornecer repelência eficazcontra as pestes alvos.

SumárioAs composições repelentes contendo monoterpenóides e/ousesquiterpenóides são divulgadas. As composições repelentes quecompreendem uma quantidade eficaz de um ou mais monoterpenóides e/ouum ou mais sesquiterpenóides eficazes para repelir uma peste alvo de umaárea alvo, o um ou mais monoterpenóides e/ou um ou mais sesquiterpenóidesem combinação com um carreador são divulgados. Em uma forma derealização, uma composição repelente que compreende uma quantidaderepelente eficaz de um sesquiterpenóide contendo oxigênio e uma mistura demonoterpenóide em combinação com um carreador, em que a composição éformulada para repelir uma peste alvo de uma área alvo, são divulgadas. Emuma forma de realização, uma composição repelente compreendendo umaquantidade repelente eficaz de um sesquiterpenóide selecionado do grupoconsistindo de óleo essencial Amyris, óleo essencial de madeira Siam, (E)-nerolidol e focienol para repelir uma peste alvo de uma área alvo, osesquiterpenóide em combinação com um carreador é apresentado.

Em uma forma de realização, o um ou mais monoterpenóidese/ou o um ou mais sesquiterpenóides são de uma fonte biorracional, tal comoum volátil de planta. Em uma forma de realização particular, o volátil deplanta é um monoterpenóide, tal como "nepetalactona" (ou os isômeros denepetalactona individuais, a saber, Ζ,Ε-napetalactona e E,Z-nepatalactona),derivado da erva dos gatos (.Naptera cataria). Em uma forma de realização, ovolátil de planta é qualquer um ou uma combinação de sesquiterpenóidesderivados da fruta da laranjeira Osage {Maclura pomifera), madeira Siam(Fokeinia) ou a árvore de sândalo West Indian (Amyris balsamifera, tambémconhecida como a "planta Amyris").

Mais outras formas de realização incluem as combinações deum ou mais voláteis de planta monoterpenóides e um ou mais voláteis deplanta sesquiterpenóides. Em mais outras formas de realização, oscomponentes tais como p-mentano diol, álcool cinâmico, gautéria e/oucitronela, e outros mais, são usados em combinação com um ou maissesquiterpenóides.

As novas composições aqui descritas possuem repelênciacontra artrópodes, tais como baratas, mosquitos, ácaros, carrapatos, aranhas, eassim por diante.

As formas de realização da invenção ainda incluem métodosde repelir pestes alvos de uma área alvo que compreendem a aplicação deuma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o compostojuntamente com um carreador adequado em ou perto de uma área alvo,incluindo a aplicação da composição diretamente em seres humanos, animais(por exemplo, animais de estimação, criação), e assim por diante. Osrepelentes também podem ser aplicados a outras áreas alvos, incluindo, masnão limitadas a elas, plantas, artigos de vestuário, barracas, sacos de dormir,travesseiros, redes camas, cobertores, prédios, etc. Em uma forma derealização, um método para repelir uma peste alvo de uma área alvo,compreendendo a aplicação de uma quantidade repelente eficaz de umacomposição na ou ao redor da área alvo, a composição compreendendo umamistura de monoterpenóide/sesquiterpenóide ou um sesquiterpenóide e umcarreador, é divulgada. Em uma forma de realização, as composiçõesapresentam repelência a longo prazo, isto é, mais que duas (2) horas. Em umaforma de realização, um método para fornecer repelência a longo prazo deuma área alvo compreendendo a aplicação de uma quantidade repelente eficazde uma composição na ou ao redor da área alvo, a composiçãocompreendendo um monoterpenóide ou um sesquiterpenóide e um carreador,em que as pestes alvos são repelidas mais do que duas horas, é divulgado.

Também foi determinado que os quimiorreceptoresresponsáveis pela resposta repelente estão presentes nas antenas da barataAlemã. Tais quimiorreceptores estão provavelmente presentes nas antenas deoutros artrópodes igualmente. Também foi determinado que as baratasmachos são geralmente mais sensíveis aos odores do que as baratas fêmeas.

Breve Descrição dos Desenhos

A Fig. 1 mostra um perfil de cromatografia líquida de altodesempenho ("HPLC") para o óleo essencial contido em um destilado devapor de erva dos gatos na "absorbância" em unidades de mili-absorbância(mAu) versus o "tempo" em minutos (min), em um comprimento de onda deaproximadamente 254 nanômetros (nm) em uma forma de realização.

A Fig. 2 mostra um perfil de HPLC para E,Z-napetalactonaisolada do destilado de vapor descrito na Fig. 1 na absorbância (mAu) versuso tempo (min), em um comprimento de onda de aproximadamente 254nanômetros (nm) em uma forma de realização.

A Fig. 3 mostra um perfil de HPLC para Z,E-napetalactonaisolada do destilado de vapor descrito na Fig. 1 na absorbância (mAu) versuso tempo (min), em um comprimento de onda de aproximadamente 254nanômetros (nm) em uma forma de realização.

A Fig. 4 mostra um perfil de cromatografia gasosa capilar("GC") de voláteis coletados de um destilado de vapor de uma laranja Osagemadura em abundância (de partículas) versus o tempo de retenção em minutos(min) nas formas de realização da presente invenção. Uma GC máximarotulada indica que o constituinte volátil foi identificado usando aespectrometria de massa acoplada com um índice de tempo da retenção porGC.

A Fig. 5 mostra um perfil de GC de voláteis coletados de umdestilado de vapor de uma laranja Osage não madura em abundância versus otempo de retenção (min) nas várias formas de realização. Uma GC máximarotulada indica que o constituinte volátil foi identificado usando aespectrometria de massa acoplada com um índice de tempo da retenção porGC.

A Fig. 6 mostra um perfil de GC de voláteis coletados de umamicro-extração de fase sólida (SPME) de uma laranja Osage madura emabundância versus o tempo de retenção (min) nas várias formas de realização.Uma GC máxima rotulada indica que o constituinte volátil foi identificadousando a espectrometria de massa acoplada com um índice de tempo daretenção por GC.

A Fig. 7 mostra um perfil de GC de voláteis coletados de umaSPME de uma laranja Osage não madura em abundância versus o tempo deretenção (min) nas várias formas de realização. Uma GC máxima rotuladaindica que o constituinte volátil foi identificado usando a espectrometria demassa acoplada com um índice de tempo da retenção por GC.

A Fig. 8 mostra a porcentagem de repelência (15 minutos) domosquito doméstico do norte, Culex pipiens, em uma câmara de repelência dear estático para uma aplicação de 157 μg/cm2 (concentração de 1 %) de óleoessencial de erva dos gatos, elemol, DEET, óleo essencial de laranja Osage eum controle de solvente, em várias formas de realização.

A Fig. 9 mostra a porcentagem de repelência (15 minutos) domosquito doméstico do norte, Culex pipiens, em uma câmara de repelência dear estático para aplicação de 78,6 μg/cm (concentração de 0,5 %) de óleoessencial de erva dos gatos, elemol, DEET, óleo essencial de laranja Osage eum controle de solvente, em várias formas de realização.

A Fig. 10 mostra a porcentagem de repelência (15 minutos) domosquito doméstico do norte, Culex pipiens, em uma câmara de repelência dear estático para aplicação de 15,7 μg/cm (concentração de 0,1 %) de óleoessencial de erva dos gatos, elemol, DEET, óleo essencial de laranja Osage eum controle de solvente, em várias formas de realização.

A Fig. 11 mostra a porcentagem de repelência (15 minutos) domosquito da febre amarela fêmea adulta, Aedes aegypti, medida em seisreplicações em uma câmara de repelência de ar estático em óleo essencial deerva dos gatos, óleo essencial Amyris, mistura de óleo essencial de erva dosgatos/óleo essencial Amyris, e mistura de óleo essencial de erva dosgatos/elemol em 157 μ§/αη2 (solução a 1 %), em várias formas de realização.

A Fig. 12 mostra a porcentagem de repelência (15 minutos) domosquito da febre amarela fêmea adulta, Aedes aegyptí, medida em trêsreplicações em uma câmara de repelência de ar estático em óleo essencial deelemi, óleo essencial Amyris (Phoenix Natural Products Ltd.), óleo essencialAmyris (Essential Oil University), elemol (grau prático), e uma superfície nãotratada (controle), em várias formas de realização.

A Fig. 13 mostra a porcentagem de repelência (15 minutos) domosquito da febre amarela fêmea adulta, Aedes aegypti, medida em trêsreplicações em uma câmara de repelência de ar estático em óleo essencial demadeira Siam, mistura de óleo essencial de madeira Siam/óleo essencial deerva dos gatos e solvente apenas para controle, em várias formas derealização.

Descrição Detalhada

Na seguinte descrição detalhada das formas de realização deexemplo da invenção, referência é feita aos desenhos acompanhantes, queformam uma parte desta, e em que é mostrado por meio de ilustração apenas,as formas de realização específicas em que a invenção pode ser praticada.Deve ficar entendido que outras formas de realização podem ser utilizadas emudanças estruturais podem ser feitas sem divergir do escopo da presenteinvenção. A seguinte descrição detalhada, portanto, não deve ser tomada emum sentido limitativo, e o escopo da presente invenção é definido apenaspelas reivindicações anexas, junto do escopo completo dos equivalentes aosquais tais reivindicações são intituladas.

As composições úteis na repelência contra artrópodes sãoapresentadas. Vários termos são definidos primeiro, seguido por umadescrição das fontes preferidas dos monoterpenóides (por exemplo, erva dosgatos) e sesquiterpenóides (por exemplo, laranja Osage, planta Amyris emadeira Siam). A repelência das várias composições produzidas a partirdestes compostos é descrita logo depois, seguida pelos exemplos específicos.Definições

O termo "aplicação" como aqui usado inclui qualquer métodoadequado de emitir uma quantidade repelente eficaz dè um composto volátilde planta em uma área alvo. Isto inclui dispersão ou pulverização localizadarestrita de um volátil, em ou ao redor de uma área, com ou sem o primeiromicro-encapsulamento do volátil, que emite o volátil de um ou maisdispensadores da fonte do ponto de liberação controlada e ou ao redor de umaárea, e que integra a liberação do volátil com uma técnica de irrigação(propagação química). "Aplicação" pode também se referir à emissão derepelentes líquidos ou sólidos através do uso de cremes, produtos com baselíquida, pós, e assim por diante.

O termo "biorracional" como aqui usado se refere a um agentede controle de peste que é natural ou de outra maneira com base em métodosbiológicos, tais como produtos de planta, hormônios de inseto, feromônios, eassim por diante, quando oposto aos produtos químicos sintéticos nãobaseados em quaisquer compostos biologicamente conhecidos, por exemplo,DEET. Inclui não apenas agentes "botânicos", isto é, agentes derivadosdiretamente de uma fonte vegetal, mas ainda inclui análogos ou derivadosdestes agentes.

O termo "carreador" como aqui usado se refere a umcomponente que, quando combinado com um composto repelente, produzuma composição que pode ser liberada a uma peste alvo como um repelente.

Um carreador pode incluir, mas não é limitado a estes, vários líquidos, sólidose gases. Isto inclui, mas não é limitado a eles, óleos, incluindo qualquer tipode óleos vegetais, tais como óleo de canola, óleo de soja, e assim por diante,polímeros, tais como os polímeros de liberação lenta, plásticos, ceras,madeira, géis, colóides (por exemplo, cremes e loções), materiais granulares,tais como argilas e minerais (por exemplo, vermiculita, bentonita), polvilhos,pós, pulverizações, meios de embebimento, concentrados emulsificáveis, eassim por diante. Isto pode incluir produtos tais como substância para polirpavimentos, calafetagem de silicona, assim como névoas ou pulverizações deaerossol, e assim por diante. A escolha do carreador depende de váriosfatores, incluindo, mas não limitados a estes, a necessidade específica, otamanho da área alvo, e assim por diante.

Como aqui usado, o termo "dispensador da fonte do ponto deliberação controlada" é um tipo de meio de liberação para uma composiçãoque compreende o composto repelente e um carreador. Um tal dispensadorinclui qualquer método adequado para o controle da taxa de emissão docomposto volátil de um reservatório de fonte concentrada dos compostos.Tais métodos incluem, mas não são limitados a eles, blocos, glóbulos,bastões, espirais ou bolas compreendidas de borracha, couro, algodão,madeira ou produtos de madeira, polietileno, polipropileno ou cloreto depolivinila que são impregnadas com o composto volátil; tubos micro-capilaresabertos em uma extremidade; tubos de polietileno ou polipropileno lacradosem ambas extremidades; laminados compreendidos de camadas do compostovolátil alternadas com plástico e cortados em vários flocos feitos sob medidaou conservados como grandes fitas ou lâminas; membranas permeáveis ousemi-permeáveis que cobrem um recipiente não permeável servindo como umreservatório para os compostos voláteis; grandes glóbulos porosos ouesponjas; micro-cápsulas; envolopes ou sacos lacrados produzidos depolietileno, polipropileno, papel, papelão, ou outras substâncias permeáveis,sistemas de aerossol medidos utilizando bomba ou tecnologias de pressãopara emitir gotículas aerossolizadas dos voláteis na atmosfera, nas superfíciesdas plantas ou solo, ou em qualquer um dos dispensadores de fonte de pontode liberação controlada; e tecnologias de micro-bomba não aerossol quefazem com que quantidades medidas dos compostos sejam dispensadas evolatilizadas por qualquer um dos métodos acima.

O termo "essencial" como aqui usado na frase "óleo essencial"se refere à "essência" ou "cheiro" do óleo que é distinto em uma plantaparticular, tal como erva dos gatos ou laranja Osage. O "óleo essencial" deuma planta contém os componentes voláteis.

O termo "fumigação" como aqui usado se refere ao uso de umrepelente gasoso, ou um sólido volátil ou repelente líquido para controlar aspestes em depósitos de armazenagem, construções, aeronaves, vagõesferroviários, produtos armazenados, materiais orgânicos tais como solo,alimentos, ração animal, adubo composto, e assim por diante, organismosvivos tais como plantas, ou em quaisquer áreas fechadas, isto é, áreas alvos,que são propensas a ter pestes, isto é, infestação de pestes.

O termo "maduro" ou "amadurecido" como aqui usadotipicamente se refere a uma fruta que foi separada de um galho e caiu no solo,embora uma fruta "madura" em alguns exemplos pode ainda estar ligada aogalho e dentro de alguns dias de separação. Uma fruta "não madura" ou"imatura" é necessariamente uma fruta que ainda está ligada a um galho, masnão está dentro de alguns dias de separação do galho. Em alguns exemplos,"maturidade" pode ser definida pelo calendário, tal que a fruta coletada apósuma certa data é considerada "madura", enquanto a fruta coletada antes destadata é tipicamente "não madura". Por exemplo, a fruta da laranja Osage que écoletada após aproximadamente 30 de setembro no Hemisfério Norte égeralmente considerada estar "madura", enquanto a fruta coletada antes destadata neste hemisfério está tipicamente em um estado "não maduro".

Obviamente, a estação de crescimento pode variar de ano para ano e emdiferentes latitudes. Por exemplo, em alguns anos a fruta de laranja Osage"madura" pode estar presente tão mais cedo quanto no meio de setembro,enquanto, a fruta de laranja Osage "não madura" pode ainda estar presente nomeio de outubro. Com respeito às muitas frutas, tais como a laranja de Osage,parece que a preparação química é diferente em uma fruta "madura" quandocomparada com uma fruta "não madura". Por exemplo, testes preliminaresindicam que as laranjas Osage "maduras" possuem uma quantidadesignificativa de hexanoato de hexila, isto é, mais que cerca de 30 % da fraçãovolátil enquanto a fruta "não madura" não parece ter mais do que quantidadesde tração deste composto.

O termo "monoterpeno" como aqui usado se refere a umcomposto tendo uma cadeia principal de 10 carbonos com ramificações nãolineares. Um monoterpeno tecnicamente se refere a um composto com duasunidades de isopreno conectadas em uma maneira do início ao fim. O termo"monoterpenóide" se refere a uma substância semelhante ao monoterpeno epode ser usado livremente aqui para se referir coletivamente aos derivados demonoterpenóide assim como aos análogos de monoterpenóide. Osmonoterpenóides podem, portanto, incluir monoterpenos, álcoois, cetonas,aldeídos, ésteres, éteres, ácidos, hidrocarbonetos sem um grupo funcional deoxigênio, e assim por diante. É prática comum se referir a certos compostosfenólicos, tais como eugenol, timol e carvacrol, como monoterpenóidesporque sua função é essencialmente a mesma como um monoterpenóide. Noentanto, estes compostos não são tecnicamente "monoterpenóides" (ou"monoterpenos") porque eles não são sintetizados pela mesma via debiossíntese de isopreno, mas de preferência pela produção de fenóis detirosina. Entretanto, a prática comum será aqui seguida.

Como aqui usado, o termo "repelir" significa que menostempo é gasto em uma dada área, isto é, uma área alvo, do que em uma áreanão direcionada ou não tratada disponível. "Repelir" pode também significarque nenhum tempo é gasto na área alvo. Como tal "repelir" uma peste incluiimpedir uma peste de permanecer em uma área alvo, assim como manter umapeste longe de uma área alvo. Em alguns exemplos, uma peste pode ser"retardada" no comportamento e sensibilidade após entrar em contato com umrepelente, tal que a presença da peste alvo é menos um incômodo para um serhumano ou animal na área alvo. Retardar uma peste alvo também podepermitir ser abatida por outros meios. O número total de pestes em uma áreapode ser considerado "suprimido" ou ainda "eliminado" devido ao uso de um"agente repelente" ou um "repelente".

O termo "sesquiterpeno" como aqui usado se refere a umcomposto tendo uma cadeia principal de 15 carbonos com ramificações nãolineares. O termo "sesquiterpenóide" se refere a uma substância semelhanteao sesquiterpeno e pode ser usada livremente aqui para se referircoletivamente aos derivados de sesquiterpenóide assim como aos análogos desesquiterpenóide. Os sesquiterpenóides podem incluir sesquiterpenos, álcoois,cetonas, aldeídos, éteres, ácidos, hidrocarbonetos sem um grupo funcional deoxigênio, e assim por diante.

O termo "suprimir" como aqui usado significa reduzir oulimitar a incidência ou gravidade de uma infestação de peste ou atividade dapeste, mesmo se durante um período de tempo limitado.

O termo "área alvo" como aqui usado inclui qualquer lugaronde a presença de pestes alvos não é desejável, incluindo qualquer tipo deprédio, que pode estar ao ar livre, tal como jardins, gramados, barracas, redesde dormir de camping, áreas de camping, e assim por diante, ou internos, taiscomo em estábulos, garagens, construções comerciais, casas, e assim pordiante, ou qualquer área onde as pestes são um problema, tais como emembarcações ou contêineres de armazenagem (por exemplo, sacos, caixas,engradados, etc.), materiais de embalagem, roupas de cama, e assim pordiante. A área alvo também pode incluir a cobertura externa de um ser vivo,tal como couro, pele, cabelo ou vestuário.

O termo "volatilidade" como aqui usado é definido como apropriedade de uma substância tendo um ponto de ebulição baixo e umapressão de vapor elevada em temperaturas e pressões usuais. Similarmente, otermo volátil é considerado para se referir a um composto que é facilmentevaporizável em uma temperatura relativamente baixa. Um composto"levemente volátil" pode se considerado de ter uma pressão de vapor entrecerca de 0,05 Pascal (Pa) e dois (2) Pa. Os repelentes levemente voláteispodem ser considerados incluir DEET (pressão de vapor de 0,22 Pa), assimcomo muitos dos repelentes preferidos nas formas de realização da presenteinvenção que contêm nepetalactona, isômeros de nepetalactona ou certossesquiterpenóides. Volatilidade "leve" é uma propriedade desejável para umrepelente porque fornece uma via adicional de exposição contra uma pestealvo, isto é, fumigação. Além disso, a mesma quantidade de um tal repelente éeficaz sobre uma área alvo maior quando comparada com um repelente nãovolátil, que é limitado apenas por uma via de contato de exposição. "Alta"volatilidade é geralmente considerada uma propriedade indesejável para umrepelente, porque tais repelentes tipicamente se dissipam muito rapidamentepara serem eficazes, por exemplo, citronela. O óleo essencial de uma planta éconsiderado incluir apenas componentes "voláteis". Similarmente, o termo"volátil de vegetais" como aqui usado se refere a um composto de volatizaçãode qualquer parte de uma planta, incluindo, mas não limitado a elas, umafolha, raiz, flor, ou botão de flor, fruta, legume, caule, e assim por diante.

O termo "repelência a longo prazo" como aqui usado se refereaos agentes que demonstram repelência mais que duas (2) horas. Isto está emcontraste com os repelentes botânicos conhecidos, muitos dos quais oferecemproteção de menos do que 20 minutos. Ver, Fradin, et al, ComparativeEfficacy of Insect Repellents Against Mosquito Bites, N. Engl. J. Méd., Vol.347, No. 1 (July 4, 2002).

O termo "repelência espacial" ou "repelência percentual"como aqui usado é uma medida de repelência causada pelos vapores domaterial repelente. Em teste experimental, é expressa como a porcentagem depestes alvos que estão posicionadas em uma metade não tratada de umacâmara de tratamento, isto é, a metade mais distante longe do papel de filtrotratado, comparado com o número que escolhe para posar na metade tratadada câmara, isto é, a metade mais próxima do papel de filtro tratado. Umrepelente tendo uma repelência espacial de 80 % ou mais é consideradoaltamente eficaz. Um repelente tendo uma repelência espacial entre pelomenos cerca de 70 % ou mais é considerado um repelente espacial muitobom. E um repelente tendo uma repelência espacial de pelo menos 50 % atécerca de 70 % é um repelente espacial bom. A repelência espacial abaixo de50 % pode não fornecer proteção adequada em uso e geralmente não éconsiderado um bom repelente espacial, embora tais níveis sejamconsiderados estatisticamente significativos.

O termo "repelência de contato" ou "irritação de contato"como aqui usado é uma medida de repelência causada pelo contato direto domaterial repelente por uma peste alvo. A repelência de contato é expressacomo freqüência de evitação. A importância é indicada como um valor "P"que se refere ao grau de diferença significativa entre o número de pestes alvosque descansam sobre o papel de filtro tratado versus um controle. Portanto,um material que é altamente eficaz como um repelente/irritante de contatoproduz um valor P que é muito pequeno (por exemplo, < 0,001 ou < 0,0001).Um material que não é eficaz como um repelente/irritante de contanto deveter um valor P que é maior do que 0,05.

O termo "repelência residual" como aqui usado se refere àquantidade de vezes que uma peste alvo é repelida para longe de umasuperfície tratada como um repelente espacial ou de contato.

Descrição das Formas de Realização

Os compostos úteis nas formas de realização da presenteinvenção incluem terpenóides voláteis e combinações de terpenóides voláteis.Em uma forma de realização, os compostos podem incluir compostosaltamente voláteis e/ou levemente voláteis derivados de voláteis vegetais. Taiscompostos incluem monoterpenóides (altamente voláteis) e sesquiterpenóides(levemente voláteis). Em uma forma de realização, os compostos sãomonoterpenóides conhecidos como nepetalactona, incluindo dois dosisômeros individuais de nepetalactona, a saber, Z,E- e Ε,Ζ-isômeros emcombinação com um ou mais sesquiterpenóides. Em uma forma de realização,os compostos são sesquiterpenóides, tais como os sesquiterpenóides listadosnas Tabelas de 5 a 7, assim como óleo essencial Amyris (da madeira daárvore de sândalo West Indian), óleo essencial de madeira Siam (isto é,Fokienia, óleo Vietnamese pemou), incluindo qualquer um dos compostosindividuais encontrados no óleo Vietnamese pemou como listado na Tabela 1de Weyerstahl, et al., Constituents of Vietnamese pemou oil - areinvestigation, Flavour Fragr. J., 14, 409-410 (1999), incluindo, mas nãolimitado a eles, os dois constituintes primários, (E)-nerolidol e focienol). Emuma forma de realização, o sesquiterpenóide é qualquer sesquiterpenóidecontendo oxigênio. Em uma forma de realização, o sesquiterpenóide équalquer sesquiterpenóide cíclico, embora a invenção não assim limitada,como certos sesquiterpenóides acíclicos, tais como (E)-nerolidol, forammostrados de apresentar propriedades repelentes. Outros compostospreferidos específicos incluem hedicariol, elemeno, elemol, alfa-cubebeno,cadineno, e assim por diante.

Estes compostos, quando combinados com um carreador ouveículo adequado, podem ser usados com um repelente de inseto em áreasalvos que incluem pessoas, animais de estimação, criação, armários,recipientes, casas, quintais, jardins e assim por diante. Os repelentes podemser usados contra uma variedade de pestes alvos incluindo baratas, mosquitos,moscas pretas, moscas domésticas, mosquitos, pestes de grãos armazenados(por exemplo, broca do milho, besouro vermelho da farinha, besouro de grãosdente-de-serra, traça de farinha Indian), traças de vestuário, carrapatos,ácaros, aranhas, e outras pestes artrópodes. Muitos dos testes descritos nosExemplos foram executados em mosquitos da febre amarela fêmeas (Aedesaegypti) ou o mosquito doméstico do norte (Culex pipiens). Ambos sãoimportantes com vetores de doença e espécies incômodas. O mosquitodoméstico do norte carrega o West Nile Virus, e o Aedes aegypti carrega afebre amarela. Outros mosquitos testados incluem o Western EncephalitisMosquito (iCulex tarsalis) que é também conhecido por carregar o vírus WestNile no oeste dos Estados Unidos, entre outras doenças. Mais outro teste foiexecutado sobre a barata Alemã. Mais uma vez, é esperado que as novascomposições nas formas de realização da presente invenção serão eficazescontra uma variedade de artrópodes.

Em uma forma de realização, as novas composições aquidescritas apresentam repelência com excesso de 20 minutos até duas horas.Em uma forma de realização, as composições apresentam repelência a longoprazo, isto é, mais que duas (2) horas. Em uma forma de realização, ascomposições apresentam repelência entre cerca de 3 e 6 horas. Em uma formade realização, a repelência é de pelo menos seis horas. Isto está em contrastecom os repelentes botânicos conhecidos, muitos dos quais oferecem proteçãode menos do que 20 minutos. Ver, Fradin, et al., Comparative Efficacy ofInsect Repellents Against Mosquito Bites, M Engl. J. Med., Vol. 347, No. 1(July 4, 2002).

Em uma forma de realização, o óleo essencial Amyris ou oscompostos individuais isolados da planta Amyris, isto é, eudesmol, incluindoquaisquer isômeros presentes, ou elemol, são usados nas composiçõesrepelentes. Mais uma vez, elemol é um sesquiterpenóide, e o óleo essencialAmyris consiste na maior parte de dois sesquiterpenóides, isto é, elemol eeudesmol. O elemol e o eudesmol são os componentes principais da laranjaOsage.

O elemol possui a seguinte estrutura:<formula>formula see original document page 18</formula>

Elemol

<formula>formula see original document page 18</formula>

O eudesmol possui a seguinte estrutura:

Eudesmol

Os sesquiterpenóides são muito menos voláteis e não são tãoeficazes quanto um repelente espacial quando comparado com o óleo de ervados gatos, por exemplo. No entanto, estes compostos são repelentes decontato eficazes.

Em uma forma de realização, as misturas de monoterpenóidese sesquiterpenóides são usadas. As misturas contendo tanto óleo de erva dosgatos quanto vários sesquiterpenóides foram apresentadas por demonstrarrepelência tanto espacial quanto de contato. Ver os Exemplos de 7 a 10. Noentanto, é provável que os isômeros individuais de erva dos gatos, isto é, E,Z-nepetalactona e Ζ,Ε-nepetalactona, também possam ser combinados comqualquer número de sesquiterpenóides para produzir um repelente a longoprazo eficaz. Em uma forma de realização, o elemol é misturado com ummonoterpenóide, tal como o óleo essencial de erva dos gatos e/ou um ouambos dos isômeros individuais e um carreador para uso como um repelente.

Em uma forma de realização, o óleo essencial de madeira Siamou qualquer um dos componentes no óleo essencial de madeira Siam sãousados como repelentes. Em uma forma de realização, o (E)-nerolidol, umsesquiterpeno acíclico encontrado no óleo essencial de madeira Siam, é usado.Em uma outra forma de realização, focienol, um sesquiterpenóide cíclicoencontrado no óleo essencial de madeira Siam, é usado.Em mais outras formas de realização, os componentes taiscomo p-mentano diol, álcool cinâmico, gautéria e/ou citronela são usados emcombinação com um ou mais sesquiterpenóides.

Vários compostos de terpenóide são isolados e purificados dequalquer fonte por qualquer método adequado. Em uma forma de realização,as fontes biorracionais, tais como plantas, frutas, e assim por diante, sãousadas. Em uma forma de realização particular, erva dos gatos (.Nepetacataria) é usada como a fonte de napetalactona, embora a invenção não sejaassim limitada. A napetalactona é quimicamente relacionada com certosmonoterpenos de ciclopentanóide isolados de insetos, muitos dos quais sãocomponentes de secreções defensivas (Eisner, T., 1964, Science, 146:1318).Em uma forma de realização particular, dois dos isômeros de napetalactona,isto é, cis-trans nepetalactona ("Ζ,Ε-isômero" ou "Ζ,Ε-nepetalactona") etrans-cis nepatalactona ("Ε,Ζ-isômero" ou "Ε,Ζ-nepetalactona"), podem cadaum ser usado individualmente como o composto ativo em uma composiçãorepelente. Em uma forma de realização, estes isômeros também são isolados epurificados do óleo essencial de erva dos gatos que é conhecido conter ocomposto iridodial derivado de monoterpeno, nepetalactona (5,6,7,7a-tetraidro-4,7-dimetilciclopenta[e]piran-l-(4aH)-ona) (McElvain et al., 1941,J. Am. Chem. Soe. 63:1558-1563). Pode ser que estes e outros isômeros, taiscomo o Ζ,Ζ-isômero ou Ε,Ε-isômero podem ser derivados de outras fontesvegetais, tais como Nepeta mussini, Nepeta grandiflora e Nepeta nuda. Taisfontes vegetais também podem ser usadas como uma fonte alternativa para anepetalactona (ver Eisenbraun, et al., 1980, J. Am. Chem. Soe. 45, 3811-3814).

Os sesquiterpenóides também são úteis como repelentes epodem ser encontrados em qualquer número de fontes biorracionais. Em umaforma de realização, a fruta da árvore de laranja Osage (às vezes referidacomo "maçã sebe") é usada como a fonte dos sesquiterpenóides. Outras fontesincluem, por exemplo, Ocimum micranthum (Peruvian basil), que é conhecidade conter isômeros de γ-elemeno, isômeros de β-elemeno, γ-copaeno e β-selineno (Charles et al., 1990, J. Agric. Food Chem. 38(1): 120:122). O capimaromático Bothriochloa pertusa é conhecido de conter α-selineno, τ-cadineno, δ-cubebeno, β-elemeno, δ-selineno e γ-cadineno seguinte amaceração enzimática (Sakho et al., 1998, J. Food Sei. 63(6): 975-978).Vários compostos foram isolados de laranjas-de-umbigo, incluindo β-copaeno, δ-candineno e hexanoato de hexila. Cubebeno foi identificado comoum componente secundário dos extratos do arbusto Cleome monophylla. Ossesquiterpenóides que possuem a cadeias principais de cubebeno/copaeno,elemeno, selineno e cadineno foram identificados a partir dos extratosantimicrobianos de Leptospermum seoparium e Kunzea ericoides (Porter andWilkins, 1998, Photochemistry 50: 407-415). Mais outras fontes desesquiterpenóides incluem madeira Siam e a planta Amyris.

O terpenóide isolado pode ser de qualquer pureza adequada,tal como 55 % ou mais. Em uma forma de realização, a pureza é pelo menoscerca de 90 %. Em outra forma de realização, a pureza é maior do que 90 %.Em mais uma outra forma de realização, a pureza é mais do que 90 %.

Diferentes formulações ou vias de exposição podem fornecerainda outras utilizações. Por exemplo, além da exposição da peste alvo aorepelente mediante o contato, e possivelmente exposição aquática, qualquerum destes novos repelentes também podem ser usados como substânciaspróprias para fumigação. Quantidades úteis para evocar a repelência(quantidades de "repelente") dependerão da técnica de aplicação particularusada e das condições específicas na área no momento da aplicação. Taisquantidades podem facilmente ser determinadas por aqueles versados natécnica. A determinação pelos Requerentes do meio de gasto sensorial para abarata Alemã, e provavelmente outras pestes alvos igualmente, isto é, atravésdas antenas, também ajudará na determinação das próprias quantidades paravárias aplicações.

Nos exemplos aqui descritos, a nepetalactona foi isolada daerva dos gatos por submeter as folhas e caules à destilação de vapor. A purezade nepetalactona de mais do que 99 % foi obtida com este método. O extratoresultante foi testado com relação a repelência contra as baratas Alemãesmachos {Blattella germânica) em uma arena de teste selecionada, isto é,através do contato. Os dois isômeros de nepetalactona também foramisolados, purificados por cromatografia de camada fina preparativa (TLC), etestados quanto a repelência da mesma maneira. A pureza de mais do que 97% foi obtida para o Ζ,Ε-isômero e de mais do que 91 % para o E,Z-isômero.(Teste de ressonância magnética nuclear (NMR) também pode ser usado paraverificação adicional com os isômeros tendo pureza ainda mais elevada, istoé, cerca de 99 % ou mais). Os isômeros de nepetalactona possuem asseguintes estruturas:

<formula>formula see original document page 21</formula>

Ζ,Ε-nepetalactona E,Z-nepetalactona.

Diferenças significativas devido à concentração foramdetectadas usando Analysis of Variance (ANOVA), um método estatísticoconhecido na técnica para encontrar diferenças significativas entre os tipos detratamento mediante a análise de variância entre as observações. As respostasforam comparadas usando o método de análise dos quadrados mínimos. Oisômero secundário, Ε,Ζ-nepetalactona, parece ser significativamente maisrepelente do que o isômero predominante, Ζ,Ε-nepetalactona. Além disso, nasconcentrações mais baixas testadas, o Ε,Ζ-isômero parece ser muito maisrepelente à baratas do que o DEET, o principal repelente de inseto padrãocomercial conhecido. Deve ser observado que os "inseticidas" de barataconhecidos incluem vários organofosfatos, carbamatos e piretróides.Entretanto, o DEET e naftaleno foram aqui usados com o padrão paracomparação contra barata porque não existe nenhum "repelente" de barataconhecido comercialmente disponível (ver o Exemplo 1).

As frutas maduras e imaturas da laranja Osage {Maclurapomifera, família Moraceae) foram extraídas usando diversos métodos,incluindo a destilação de vapor, micro-extração de fase sólida (SPME),extração de solvente com hexano e extração de Soxhlet com hexano oucloreto de metileno. Cada uma destas técnicas resultou em um óleo essencialcontendo vários sesquiterpenóides e outros componentes. Os extratos foramsubmetidos à cromatografia gasosa e espectrometria de massa (GC-MS) paraidentificar os componentes do extrato. As frutas maduras e não madurastambém foram comparadas usando a micro-extração de fase sólida (SPME).Além do teste do óleo essencial da laranja Osage contra a barata em umaarena de teste "selecionada", três dos componentes identificados no óleoessencial também foram similarmente testados com relação a repelência, asaber, elemol, alfa-cubebeno e hexanoato de hexila (um nãosesquiterpenóide).

A madeira Siam pode ser extraída por qualquer métodoconhecido na técnica, incluindo os métodos descritos em Weyerstahl, et al.,supra.

O óleo essencial Amyris também pode ser extraído da plantaAmyris por qualquer método conhecido, incluindo a destilação de vapor ouextração de hexano. Em uma forma de realização, dois isoflavonóides (quesão não sesquiterpenóides) são observados na laranja Osage, mas não no óleoessencial, osajin e pomiferin são usados em combinação com ummonoterpenóide ou em combinação com uma mistura demonoterpenóide/sesquiterpenóide.Os resultados até esta data indicam que os componentes desesquiterpenóide na laranja Osage assim como na planta Amyris e madeiraSiam possuem excelente repelência contra pestes quando comparados com osnão sesquiterpenóides. Osajin, um não sesquiterpenóide, demonstrourepelência, mas visto que não tinha nenhuma volatilidade, pode apenas serusado como um repelente de contato. Os sesquiterpenóides também parecemter melhor eficácia do que os naftalenos, um outro repelente de inseto padrãocomercial (comumente usado nas bolas de traça). Acredita-se que alguns dosoutros sesquiterpenóides presentes no óleo essencial de laranja Osage assimcomo a madeira Siam e planta Amyris (ou combinação destas) tambémdemonstrarão similaridade ou talvez propriedades de repelência aindamelhores (ver o Exemplo 2).

Testes preliminares com duas espécies de mosquito, a saber,Aedes aegypti e Culex tarsalis, determinaram os níveis letais das composiçõestanto de monoterpenóide quanto de sesquiterpenóide (Exemplo 5).

A série de experiências mostrada no Exemplo 6 dá suporte aevidência para os óleos essencial de erva dos gatos e laranja Osage, elemol enepetalactona como repelentes de inseto eficazes para pestes domésticascomuns e pestes da saúde humana. Investigações com respostascomportamentais do mosquito em um mecanismo de ar estático mostraramque o óleo essencial de erva dos gatos e elemol podem atuar como repelentesde mosquito eficazes de superfícies tratadas, mas diferem na eficácia residual.Outros estudos estão correntemente em andamento para avaliar os efeitos derepelência residual de outros produtos naturais no óleo essencial de laranjaOsage e examinar as diferenças no mecanismo de repelência.

Especificamente, as comparações de irritação de contato com abarata Alemã (Blattella germânica), e a mosca doméstica (Musca domestica)com o óleo essencial de erva dos gatos, e seus componentes principais, Z5E-nepetalactona e Ε,Ζ-nepetalactona com o padrão comercial, N,N-dietil-m-toluamida (DEET), são mostradas no Exemplo 6. Ambas as espéciesmostraram valores de repelência percentual elevados quando expostas aopapel de filtro tratado com óleo essencial de erva dos gatos ou com osisômeros de nepetalactona individuais. Dos dois isômeros de nepetalactonaavaliados, as baratas Alemãs foram as mais responsivas ao Ε,Ζ-isômero. Asmoscas domésticas apresentaram tendências similares na irritação de contato,respondendo às superfícies tratadas com o isômero de erva dos gatospredominante, Ζ,Ε-nepetalactona, mais intensamente do que ao óleo essencialde erva dos gatos. Estes resultados também são apresentados no Exemplo 6.

Dois bioensaios de mosquito foram usados para medir aporcentagem e repelência de contato. Os mosquitos responderam inicialmentecom repelência percentual elevada às superfícies tratadas com óleo essencialde erva dos gatos. A partir do estudo de repelência residual, esta tendência narepelência pelo óleo de erva dos gatos significativamente diminuiu durante operíodo de teste de 180 minutos. O elemol e o DEET inicialmente tiveramvalores de repelência percentual mais baixos do que o óleo essencial de ervados gatos, mas não apresentaram a conexão negativa entre o percentual derepelência e o tempo, retendo excelente repelência em todo o bioensaio de 3horas. As soluções com elemol e DEET apresentaram maior significância narepelência de contato comparada com o óleo essencial de erva dos gatos.

Estes resultados mostram que o óleo essencial de erva dos gatos é um potenterepelente de mosquito, mas não fornece os mesmos efeitos residuais como opadrão comercial, DEET. Elemol, um sesquiterpeno extraído da fruta dalaranja Osage, apresenta excelente promessa como um repelente de mosquitocom atividade comparável ao DEET na repelência de contato e residual. Estesresultados também são mostrados no Exemplo 6.

Vários outros sesquiterpenóides e misturas desesquiterpenóide/monoterpenóide também foram testados como debatidoacima (Exemplos de 7 a 10). Como observado acima, o óleo essencial de ervados gatos é principalmente preparado dos isômeros geométricos demonoterpenóide nepetalactona, ambos dos quais se volatilizam facilmente.Como um resultado, o óleo essencial de erva dos gatos não é um repelente decontato eficaz, embora seja um repelente espacial muito potente.

Os resultados de teste com sesquiterpenóides derivados damadeira Siam e da planta Amyris, mostraram que estes compostos aquitambém são úteis como repelentes, isoladamente ou em combinação com omonoterpenóide, óleo essencial de erva dos gatos. Ver os Exemplos de 7 a 10.

Uma experiência também foi conduzida para determinar comoos artrópodes detectam os repelentes. É sabido que o DEET é eficaz como umrepelente contra mosquitos porque pode mascarar o odor do ácido láctico,provavelmente mediante a interação com um receptor de ácido láctico nasantenas do mosquito (E. Davis et al., 1976, J. Comp. Physiol. 150, 43-54). Noentanto, não é conhecido como outros repelentes são detectados pelosmosquitos, nem se é conhecido como as pestes diferentes dos mosquitosdetectam qualquer tipo de repelente. De modo a determinar se a antenadesempenha um papel na detecção de repelente, para artrópodes diferentes demosquitos, a experiência envolveu a remoção das antenas de várias baratasAlemãs. As baratas submetidas a remoção de antenas foram expostas emconcentrações de repelentes que foram mostradas de serem ativas naexperiência anterior. Em todos os casos, as baratas foram indiferentes aorepelentes, gastando um tempo quase igual em cada peça de papel de filtro,isto é, tratado e não tratado. Visto que estas baratas nunca tinhamanteriormente encontrado estes repelentes, a resposta não foi considerada serinstrutiva ou de comportamento condicionado. Esta experiênciaconclusivamente demonstra que as baratas, e provavelmente a maioria deoutros artrópodes tendo antenas, detectam os repelentes com suas antenas (vero Exemplo 3). As diferenças entre as baratas machos e fêmeas também foramavaliadas. Foi confirmado que as baratas machos são mais sensíveis aosodores do que as fêmeas. As baratas fêmeas foram indiferentes ao DEET emconcentrações que produziram uma resposta definitiva nos machos. Asfêmeas também foram menos fortemente repelidas pelo extrato de laranjaOsage do que os machos. (Ver o Exemplo 4).

A invenção será ainda descrita com referência aos exemplosque seguem, que são oferecidos para ainda ilustrar várias formas de realizaçãoda presente invenção. Deve ficar entendido, no entanto, que muitas variaçõese modificações podem ser feitas enquanto se permanece dentro do escopo dapresente invenção.

EXEMPLO 1

Insetos: As baratas Alemãs (.Blattella germânico) foramobtidas de uma colônia no Entomology Department of Iowa State University.Ames, Iowa. Esta colônia foi estabelecida há vários anos mediante a capturade baratas silvestres. As baratas foram mantidas em um aquário de peixe degal tendo aproximadamente os (5) cm da parte de cima alinhados com o"Insect Trap Coating" produzido pela Tanglefoot Company tendo escritóriosem Grand Rapids, Michigan. Os cinco (5) cm em seguida são alinhados comvaselina para ajudar a impedir as baratas de entrarem no revestimento, ondeelas morrerão. O aquário é coberto com um pedaço de plexiglass tendo cercade um orifício de 7,5 cm (três (3) polegadas) em que uma tela foi colocada.Pequenas proteções de papelão também são mantidas no aquário para fornecerum lugar para as baratas se esconderem. Uma garrafa de água vedada commecha dentária é mantida no aquário junto com qualquer tipo convencional dealimento de gato seco no fundo da gaiola. Tipicamente cerca de V2 copo dealimento de gato seco é mantido na gaiola. As baratas presentes no aquáriosão tipicamente uma combinação de baratas recentemente capturadas e acolônia existente de baratas. Alimento de gato adicional, tal como cerca de iAcopo uma vez por semana, é adicionado no aquário. O alimento de gato antigoé removido e substituído periodicamente, particularmente se desenvolve omofo. Água fresca também é adicionada na garrafa de água periodicamente.A garrafa de água é substituída se o mofo se desenvolve sobre a mecha.Aproximadamente a cada quatro (4) a seis (6) meses, a colônia é transferidapara um aquário limpo.

Compostos Padrão e de Comparação. DEET foi adquirido daAldrich Chemicals tendo escritórios em Milwaukee, Wisconsin. Acetona ehexano, cada um tendo uma pureza de mais do que 99 % foram adquiridos daFisher Scientific Inc. tendo escritórios em Pittsburgh, Pennsylvania.

Materiais de Partida. Erva dos gatos fresca em vários estágiosde florescência foi coletada das áreas silvestres não pulverizadas do campusda Iowa State University em Ames, Iowa quando necessário durante a estaçãode crescimento. As plantas não destiladas imediatamente foram congeladasem -80 0C até necessárias para a destilação de vapor. Em alguns exemplos, asplantas congeladas foram usadas em conjunto com a erva dos gatos fresca. Asfolhas e caules foram moídas enquanto ainda congeladas ou de outra maneirapicadas em pequenos pedaços enquanto ainda frescas, na preparação para adestilação de vapor. As folhas e caules moídas ou picadas foram depoiscolocadas em um frasco de ebulição de três gargalos de cinco (5) litros edestiladas por vapor de acordo com o método de Pavia, et al., 1988,Introduction to Organic Laboratory Techniques, 3rd edition, Harcourt BraceCollege Publishers, Fort Worth, Texas. O destilado coletado foi lavado duasvezes com um (1) volume cada de hexano em um funil separador pararemover a camada de óleo da camada de água. O hexano foi removido usandoa destilação a vácuo por evaporação rotativa em 500 mmHg de vácuo e 25 0C.

Uma parte do líquido obtido da evaporação rotativa foi diluídaem cera de um (1) μΐ/ml com hexano e submetida à análise cromatográfica. Aidentificação dos componentes foi obtida usando um Varian GasChromatograph, series 3700, produzido pela Varian Inc., tendo escritórios emPalo Alto, Califórnia, com um coluna OV 101 a 3 % acondicionada de doismetros, carreador de nitrogênio, detector de FID, temperatura de injetor de250°C, um volume de injeção de 1,5 μl, com uma temperatura de colunainicial de 70°C, elevada em 5 °C/min até 150°C e mantida durante 8 minutos.O Ζ,Ε-isômero teve um tempo de retenção de cerca de 10,75 min, e o E,Z-isômero teve um tempo de retenção de cerca de 11,25 min. A relação de Ζ,Ε-isômero para Ε,Ζ-isômero foi de cerca de 6:1, como determinado pelo cálculodas áreas sob os picos. Estes isômeros juntos compreendiam mais de 98 % dodestilado de vapor. Os componentes secundários não foram identificados.

A HPLC foi conduzida usando um Hewlett Packard series1100 HPLC produzido pela Hewlett Packard Inc. tendo escritórios em xx city,xx state, com uma coluna preparativa de alta cromatografia de FenilglicinaCovalente (25 cm χ 10 mm I.D., 5 mícrons S5NH Modified Spherosorb),tendo um volume de injeção de 25 μΐ, uma fase móvel de 9:1 hexano:acetatode etila na taxa de fluxo de cerca de 2,5 ml/min, e detecção usando umSpectroflow 757 UV-Detector em 254 nm.

Os dois isômeros de nepetalactona foram separados usandoplacas de TLC preparativa de sílica gel (Whatman 20 χ 20 cm, espessura:1000 μm) com um sistema solvente de aproximadamente 19:1 hexano:éteretílico. As placas foram operadas sete (7) vezes, deixando-as secarcompletamente entre cada operação. As faixas resultantes, que incluíram umafaixa "larga" e uma faixa "fina", foram cada uma iluminada sob luz UV de254 nm. A sílica gel foi depois raspada das placas e lavada com três lavagensde éter. A solução resultante foi filtrada e o solvente de éter foi removido pelaevaporação rotativa. A pureza foi avaliada usando HPLC.

Os tempos de retenção e a porcentagem de área para odestilado de vapor e os dois isômeros são mostrados na Tabela 1 e Figs. de 1até 3.Tabela 1. Resultados de HPLC para o Destilado de Vapor de Erva dos gatos,E.Z-Isômero e Ζ,Ε-Isômero.

<table>table see original document page 29</column></row><table>

Como a Tabela 1 mostra, a faixa larga sobre a placa de TLCconsistia predominantemente do Ζ,Ε-isômero, e a faixa fina foi determinadapara consistir principalmente do Ε,Ζ-isômero. Na HPLC, como mostrada naFig. 1, o segundo pico representa o Ζ,Ε-isômero, e o primeiro pico é o Ε,Ζ-isômero. Comparando as áreas para cada faixa, os gráficos de HPLC mostramque o procedimento de TLC foi acurado e eficiente na separação dos doisisômeros. A Fig. 1 indica uma pureza do destilado de vapor de mais do quecerca de 99 %, com cerca de 25,2 % de Ε,Ζ-isômero presente e cerca de 74,8% do Ζ,Ε-isômero presente. A Fig. 2 indica uma pureza do Ε,Ζ-isômero depelo menos cerca de 91,3 %. Os componentes remanescentes sãodesconhecidos neste momento. Similarmente, a Fig. 3, mostra que o Ζ,Ε-isômero pode ser isolado em uma pureza de pelo menos cerca de 97,5 %, comos componentes remanescentes sendo de cerca de 0,8 % do Ε,Ζ-isômero e decerca de 1,7 % de desconhecidos.

A cromatografia gasosa/espectroscopia de massa dos isômerosde nepetalactona também foi conduzida em um cromatógrafo de gás Varian3400, com uma coluna DB-5ms nanopolar 30-m (0,25 mm ID, 0,25 mm deespessura de película). A cromatografia gasosa foi acoplada a umaespectrômetro de massa Finnigan TSQ 700 triple quadrupole (San Jose, CA),impacto de elétron de 70 eV. A análise de espectro de massa dos isômerosrevelou que os dois compostos são quase indistinguíveis pela espectrometriade massa, como é esperado com os isômeros. O Ζ,Ε-isômero eluiu fora dacoluna em 2,26 minutos, mostrando os íons em m/z 166 [M+] (100 %), m/z123 (78,5 %), m/z 109 (46,3 %), m/z 95 (58,8 %), m/z 81 (62,2 %) e m/z 69(46,7 %). O Ε,Ζ-isômero eluiu fora da coluna em 2,67 com o seguinteespectro de massa: m/z 166 [M+] (100 %), m/z 166 (9,9 %), m/z 109 (51,8%), m/z 95 (66,6 %), m/z 81 (67,0 %) e m/z 69 (50,2 %). Visto que ambos ospicos possuem essencialmente espectros de massa idênticos, estes resultadossão uma outra indicação de que o composto é nepetalactona, mesmo emboracontenha dois isômeros diferentes.

Procedimento de Teste. Os bioensaios de repelência foramconduzidos para avaliar as propriedades repelentes das composições contendodestilados de vapor de erva dos gatos (nepetalactona), Z,E-nepetalactona,Ε,Ζ-nepetalactona e DEET contra baratas. Acetona certificada e hexanocertificado também foram testadas de modo a avaliar os efeitos de solvente.(DEET foi dissolvido em acetona, porque o DEET é insolúvel em hexano. Oscompostos testados foram dissolvidos em hexano porque o hexano foi osolvente usado para extrair estes compostos do destilado).

Um papel de filtro redondo de 125 mm Whatman foi cortado nametade. Um lado foi tratado com um (1) ml do composto de teste e o outro ladofoi tratado com um (1) ml de solvente. Os papéis foram deixados secar em umacoifa de fumaça durante aproximadamente dois (2) minutos antes de seremcolocados em uma arena de placa de Petri de 150 mm. A posição relativa do ladotratado (isto é, no direito ou esquerdo) da placa foi escolhida a esmo usando umatabela numérica aleatória. A parte de cima da placa de Petri tinha um orifíciodividido no centro para introdução de uma barata em um momento diretamente nocentro da arena. O orifício foi vedado usando um pedaço pequeno de fita paraimpedir o inseto de escapar. Uma barata Alemã macho (Blattella germânico) foiselecionado da colônia e deixada cair dentro do orifício pré-formado na tampa daplaca de Petri. Imediatamente após a introdução da barata, o número de segundosque a barata gastou sobre o lado tratado ou não tratado durante um período de 300segundos (cinco (5) minutos) foi registrado com dois (2) cronômetros diferentes.Dez (10) replicações foram executadas para cada composto de teste.

Resultados. Usando os valores médios e seu Erro Padrãorelacionado dos valores médios (SEM), a repelência das amostras selecionadas foideterminada como mostrado na Tabela 2. A significância devido à concentraçãofoi determinada usando ANO VA. As médias para cada dose foram comparadasusando a análise média dos quadrados mínimos em SAS (SAS Institute 1991)como mostrado na Tabela 3. A Tabela 3 também mostra uma repelênciapercentual usando o teste t binário de duas caudas ("teste t binário") que indica as"diferenças" como é conhecido na técnica e mostrado na Tabela 4 (quandocomparado com um teste de "duas caldas", que indica "maior ou menor do que").

Tabela 2. Repelência de Nepetalactona e Isômero de Nepetalactona contra aBarata Alemã quando Comparada com DEET, Acetona e Hexano

<table>table see original document page 31</column></row><table>

Como a Tabela 2 mostra, os bioensaios de controleenvolvendo acetona e hexano não apresentaram nenhuma repelênciasignificativa. O DEET em um nível de dez (10) % em volume, na solução deteste foi altamente repelente. No entanto, quando se compara cinco (5) % deDEET com cinco (5) % de destilado de vapor de erva dos gatos (em volume),pode ser observado que o óleo essencial de erva dos gatos foi um repelentemais eficaz (como determinado pela diferença entre os dois valores médios).

Adicionalmente, o um (1) % de destilado de vapor de erva dos gatos repeliuas baratas melhor do que o um (1) % de DEET. Nos níveis de concentração de0,5 % e 0,1 %, o Ε,Ζ-isômero repeliu significativamente melhor do que oextrato, DEET e o Ζ,Ε-isômero (em ordem descendente de repelênciacomparativa).

O número médio de segundos gasto pelas baratas no ladotratado da arena, mais ou menos o erro padrão da média (SEM) é relatado naTabela 3. A quantidade de composto de teste per área unitária de papel defiltro é observada em '^g/cm " na Tabela 3. A porcentagem em peso de cadacomponente listado na Tabela 2 pode ser convertida em '^g/cm " pelaseguinte fórmula: ^g de composto/um (1) ml de solução)/área de papel defiltro em cm. Por exemplo, uma solução contendo "cinco (5) %" em volumede um composto, é equivalente a uma concentração de aproximadamente"800 μg/cm " do composto (por exemplo, cinco (5) % de DEET é equivalentea uma concentração de cerca de 800 μ§/αη de DEET). Similarmente, um (1)% de DEET é equivalente a uma concentração de aproximadamente 160μg/cm.

Tabela 3. Número médio de segundos (± SEM) gastos sobre o lado tratado daarena de teste por B. germanica macho em 300 segundos

<table>table see original document page 32</column></row><table><table>table see original document page 33</column></row><table>

Para cada solução de teste, as médias ± SEM seguidas pela mesma letra não sãosignificativamente diferentes pela análise média dos quadrados mínimos (a = 0,05).*A porcentagem de repelência foi calculada pela seguinte fórmula: (não tratado -tratado)/300 χ 100

A significância devido à concentração foi observada pelaANOVA de duas caudas para DEET (F = 4,83, df = 4,54; P = 0,001), Ζ,Ε-nepetalactona (F = 20,00, df = 4,45; ρ = 0,0001) e E,Z=nepetalactona (F =41,08, df = 2,27; P = 0,0001). A significância devido à concentração não foiobservada para o óleo essencial de erva dos gatos no nível de significância deduas caudas em 0,05, mas foi observada no nível de significância em 0,1 (F =3,44, df = 3,36; P = 0,0267). Como mostrado na Tabela 3, todas asconcentrações de DEET testadas abaixo de 1600 μg não foramsignificativamente diferentes do controle pela análise da média dos quadradosmínimos (a = 0,05). Entretanto, o óleo essencial de erva dos gatos foisignificativamente diferente do controle em uma dose de 800 μg/cm . Alémdisso, a Ζ,Ε-nepetalactona foi significativamente diferente do controle emdoses de 160 μg/cm2 e mais elevadas. A Ε,Ζ-nepetalactona foi da mesmaforma significativamente diferente do controle em todas as doses testadas,incluindo a dose testada mais baixa de aproximadamente 16 μg/cm .

As comparações do teste t binárias (a = 0,05, df = 9) entre oscompostos diferentes em doses equivalentes foram feitas e mostradas abaixona Tabela 4.

Tabela 4. Comparações do teste t binárias de doses equivalentes doscompostos de teste<table>table see original document page 34</column></row><table>

*A diferença é significativa pelo teste t binário de duas caudas em α = 0,05, df = 9.CNEO = óleo essencial de erva dos gatos; Z5E = Ζ,Ε-nepetalactona; E5Z = E5Z-nepetalactona

Como a Tabela 4 mostra, o óleo essencial de erva dos gatosapenas diferiu do DEET em 800 μ^ατι, e não em doses mais baixas. A Z,E-nepetalactona diferiu das doses equivalentes de DEET acima de 80 μ§/αη .No entanto, a Ε,Ζ-nepetalactona diferiu do DEET em todas as concentraçõestestadas. A Ζ,Ε-nepetalactona, que compreende cerca de 85 % do óleoessencial, não diferiu do óleo essencial de erva dos gatos em qualquer umadas concentrações testadas. A Ε,Ζ-nepetalactona foi mais ativa do que o óleoessencial de erva dos gatos em 80 μg/cm . Ambas as Z,E- e Ε,Ζ-nepetalactonaforam comparadas em 80 e 16 μg/cm . Foi observado que a Ε,Ζ-nepetalactonafoi significativamente mais ativa do que o Ζ,Ε-isômero em ambasconcentrações.

Conclusões. O destilado de vapor não refinado (nepetalactona)apresentou repelência "muito boa" em cada concentração testada, como éevidenciado pela quantidade mínima de tempo que a barata permaneceu sobreo lado tratado, quando comparado com lado não tratado, isto é,aproximadamente de duas (2) a três (3) vezes menos. Os isômeros individuaistambém demonstraram resultados de "muito bom" a "excelente". Porexemplo, o Ζ,Ε-isômero em cinco (5) % demonstrou "excelente" repelência,quando a barata gastou cerca de cinco (5) vezes menos o tempo sobre o ladotratado quando comparado com o lado não tratado. O Ε,Ζ-isômero em 0,5 %demonstrou repelência "altamente superior", quando a barata gastou cerca deoito (8) vezes menos o tempo sobre o lado tratado quando comparado com olado não tratado. É muito provável que a repelência seria elevada também emoutros valores. Estes compostos, em combinação com um carreador adequadoou meio de liberação, foram demonstrados de serem melhores do que opadrão comercial (DEET) com relação a repelência contra a barata Alemã.Provavelmente estes compostos também sejam repelentes contra outrosartrópodes igualmente.

EXEMPLO 2

Insetos. Baratas da mesma fonte com descrito no Exemplo 1foram usadas.

Padrões e Controles. Naflaleno tendo uma pureza de mais doque 99 % foi obtido da Fischer Scientific Inc. O naftaleno, que foi dissolvidoem acetona antes do teste, foi usado como um padrão quando este for um doscomponentes nas bolas de traça, um produto usado para repelir as traças devestuário. (Mais uma vez, não existe nenhum padrão comercial para"repelentes" de barata per se, apenas para "inseticidas" de barata). O hexanotendo uma pureza de mais do que 99 % também foi obtido da FischerScientific Inc.

Materiais de Partida. Uma série de testes de GC-MS foiempreendida para determinar os vários componentes da laranja Osage quepodem potencialmente ser usados como materiais de partida para o teste derepelência. Os componentes foram isolados usando os métodos descritosabaixo, incluindo a destilação de vapor, extrações Soxhlet e embebimento dehexano (ver as Tabelas 5-6), assim como as micro-extrações de fase sólida(SPME) (ver a Tabela 7).

Alguns dos componentes identificados foram purificados empelo menos cerca de 95 % e usados nos estudos de repelência. Outroscomponentes identificados foram adquiridos para uso nestes estudos. Todosestes componentes foram depois dissolvidos em solventes antes do reste derepelência. Especificamente, osajin e pomiferin foram purificados emaproximadamente 95 % e 98 %, respectivamente, e dissolvidos em acetona.Hexanoato de hexila e alfa-cubebeno, tendo purezas de 97 % e 98 %,respectivamente, foram adquiridos da Fischer Scientific, Inc., e dissolvidosem hexano. Elemol, que foi identificado como um componente principal dalaranja Osage, também foi adquirido e dissolvido em hexano.Especificamente, o elemol de grau técnico (experimentado em 55 %), daAugustus Oils LTD, Borden, Hampshire, UK, foi usado porque o elemol emníveis de pureza mais elevados não estava disponível no momento do teste.

Métodos de Isolamento

Destilação de vapor. O método de destilação de vapor seguiuPavia et al., 1988, Introduction to Organic Laboratory Techniques, 3d, ed.Sete frutas maduras foram moídas mediante o uso de um moedor de carneprovido de energia manual e colocadas em um frasco de ebulição de fundoredondo de três gargalos de 5000 ml. Água foi adicionada para cobrir ospedaços de fruta e fervida durante aproximadamente três (3) horas, isto é, atéque aproximadamente 500 ml de condensado fosse coletado. A água coletadafoi lavada duas vezes com 250 ml de hexano, e a água foi descartada. Aslavagens de hexano foram passadas através de sulfato de sódio anídrico pararemover a água. A lavagem de hexano foi testada sem mais purificação ouconcentração. O extrato de hexano coletado foi analisado pela cromatografiagasosa e cromatografia/espectrometria de massa para identificar oscomponentes da mistura.

Extrações em Soxhlet de Cloreto de Metileno e Hexano. Umafruta madura foi cortada em vários pedaços de cerca de dois (2) cm3 detamanho, e colocada em dois Soxhlets separados. Um mecanismo foicarregado com 500 ml de cloreto de metileno e o outro com 500 ml dehexano. Os Soxhlets foram aquecidos até o ponto de ebulição dos respectivossolventes e deixados circular durante aproximadamente 24 horas. Osparticulados foram removidos da solução por filtração a vácuo e a água foiremovida por filtração com sulfato de sódio anídrico. O extrato coletado foitestado sem mais purificação ou concentração.

Extrações de Embebimento de Hexano Cortado e Triturado.

Uma fruta madura foi cortada em pedaços de cerca de dois (2) cm detamanho e embebida durante 24 h com 500 ml de hexano. Uma outra fruta foitriturada mediante o uso de um moedor de carne provido de energia manual eembebida durante aproximadamente 24 h com 500 ml de hexano. Osparticulados foram removidos dos extratos por filtração a vácuo e a água foiremovida por filtração com sulfato de sódio anídrico.

A Tabela 5 mostra os constituintes identificados mediante ouso dos métodos de isolamento descritos acima juntamente com GC-MS parauma laranja Osage madura. As Figs.4 e 5 apresentam um perfil dosconstituintes identificados (usando GC-MS) no extrato a partir do método deisolamento de destilação de vapor com relação ao laranja Osage madura e nãomadura, respectivamente, com alguns dos picos rotulados conseqüentemente.

"Área Relativa Percentual Aproximada" se refere à área sob o "pico" de umcomponente particular, isto é, uma porcentagem da resposta total pelodetector durante a análise. Tal porcentagem não é diretamente equivalente auma porcentagem de volume ou peso específica de um componente particularna solução de teste. As concentrações efetivas dos vários componentes podemser determinadas pela correlação destes resultados com as porcentagens deárea de padrões conhecidos mediante a construção de uma "curva padrão",como é conhecido na técnica. Em alguns exemplos, a área relativa percentualaproximada não é relatada, e a provável presença ou não presença de umcomponente em um extrato particular é observada com um "+" óu "-".Os tempos de retenção e, em alguns exemplos, a porcentagemde área relativa, para os componentes nos extratos destilados de vapormaduros, embebidos em hexano cortados, embebidos em hexano triturados,em Soxhlet de cloreto de metileno e em Soxhlet de hexano, podem serobservados na Tabela 5. Os tempos de retenção e abundância doscomponentes no destilado de vapor maduro da laranja Osage podem ser vistosna Fig. 4. Geralmente, um componente é listado abaixo sem qualificação se aqualidade de adaptação foi maior do que 80 %. Aqueles componentesmarcados com um asterisco tiveram uma qualidade de adaptação de menos doque 80 %. "Qualidade de adaptação" é um termo conhecido na técnica que serefere ao nível de superposição com referência a vários critérios (porexemplo, peso molecular, similaridade de fragmento maior, etc.) entre ocomposto sendo testado e uma biblioteca dos espectros dos compostosconhecidos armazenados em uma base de dados. As qualidades de adaptaçãodurante a espectroscopia de massa dos vários componentes listados na Tabela5 variaram consideravelmente. Portanto, embora seja possível que oscomponentes listados com qualidades de adaptação baixas sejam corretamenteidentificados, outro teste necessita ser executado para verificar estesresultados com mais certeza.

Tabela 5. Constituintes da laranja Osage madura identificados usandométodos de extração de vapor e solvente (Área Relativa PercentualAproximada)

<table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table>

* A qualidade de adaptação é menor do que 80 %.Micro-extração de fase sólida. Para identificar os voláteisliberados da laranja Osage por outros meios, as frutas tanto maduras quantonão maduras foram colocadas separadas em recipientes de vidro de um (1)litro. Nesta forma de realização, os voláteis do espaço superior foramcoletados em temperatura ambiente mediante o uso de um dispositivo demicro-extração de fase sólida (SPME), que contém uma fibra poliméricarevestida com aproximadamente 100 m de polidimetilsiloxano (Supelco Co.,Bellefonte, Pennsylvania). A fibra de SPME foi pré-condicionada durantecerca de duas (2) h ao redor de 250 0C antes da coleta de voláteis através daexposição dos voláteis através de um septo no recipiente de vidro. Durante oprocesso de coleta, a fibra foi exposta e colocada sobre as frutas em umrecipiente de vidro fornecido com ar filtrado com carvão vegetal e uma taxade fluxo de cerca de 50 ml/minuto. As coletas continuaram durante cerca de30 a 120 min, em cujo tempo a fibra de SPME foi imediatamente inserida noinjetor de um sistema de GC-MC para a termo-dessorção. O sistema de GC-MS era composto de uma cromatografia gasosa Hewlett Packard 5890 SeriesII equipada com uma coluna DB-5 (30 m χ 0,25 mm de diâmetro interno, J &W Scientific Co., Folsom, Califórnia), e um Hewlett Packard 5972 MassSelective Detector (MSD). A temperatura do injetor foi fixada emaproximadamente 250 0C. A válvula de divisão foi aberta aproximadamenteum (1) min após a injeção. A temperatura de coluna foi inicialmente ao redorde 40 0C durante cerca de um (1) min seguinte a injeção, depois elevada para250 0C em uma taxa de cerca de 15 °C/min. Os espectros de massa foramregistrados de 30 a 550 amu após a ionização de impacto de elétrons em 70volts de elétron (eV).

A Tabela 7 e as Figs. 6 e 7 mostram os constituintesidentificados na laranja madura e não madura no extrato de SPME (usandoGC-MS) com alguns dos picos rotulados nos perfis.

Tabela 7. Identificação dos constituintes voláteis na laranja Osage usandoSPME e GCMS.<table>table see original document page 41</column></row><table>

* A qualidade de adaptação é menor do que 80 %"+" Indica que um componente provavelmente está presente em um extrato."-" Indica que um componente provavelmente não está presente em um extrato.

Os resultados acima mostram que diferentes tipos equantidades de vários componentes estão presentes em uma laranja Osagemadura ou amadurecida quando comparada com uma laranja não madura. Noentanto, existem vários outros componentes na laranja Osage tanto maduraquanto não madura que ainda não foram identificados. Outros trabalhos paraidentificar estes componentes e verificar a identificação dos componentescorrentemente tendo uma qualidade de adaptação baixa, usando umacombinação destas e outras técnicas conhecidas no ofício, eventualmente renderãoa preparação completa da laranja Osage tanto madura quanto não madura.

Procedimento de Teste. O mesmo procedimento descrito no

Exemplo 1 foi usado.

Resultados. Os resultados deste teste são mostrados abaixo naTabela 8.

Tabela 8. Repelência do óleo essencial de laranja Osage e componenteindividual da laranja Osage contra a barata Alemã quando comparada comnaftaleno

<table>table see original document page 42</column></row><table>

*A porcentagem de repelência foi calculada pela seguinte fórmula: ((não tratada -tratada)/300) χ 100.Deve ser observado que a concentração de óleo essencial paraa solução de teste de destilado de vapor de laranja Osage não madura foideterminada ser ao redor de 65 μ{*Λιπι (1) ml. Especificamente, através deGC-MS, foi observado que a concentração de elemol no destilado de vapornão maduro da laranja Osage foi de cerca de 34 μg/ml. A porcentagem deelemol no destilado de vapor não maduro foi determinada ser deaproximadamente 52 %. Pela razão deste 34 μ§/ηι1 ter sido ao redor de 52 %do destilado de vapor não maduro total, a concentração do óleo essencial nodestilado de vapor não maduro foi estimada ser de cerca de 65 μg/ml. Pelarazão de um (1) ml do destilado de vapor não maduro ter sido aplicado aopapel de filtro no ensaio, é estimado que cerca de 65 μ§ de óleo essencialtenha sido usado no mecanismo. Isto indica que a concentração do óleoessencial sobre o papel de filtro foi de aproximadamente 1,06 μg/cm .

Como a Tabela 8 mostra, os sesquiterpenóides demonstraramrepelência contra a barata Alemã. Especificamente, o alfa-cubebenodemonstrou excelente repelência. O elemol também demonstrou muito boarepelência. Entretanto, é sabido que o grau técnico do elemol contém umaquantidade significativa de delta-cadineno. Outro teste de repelência usandouma pureza mais elevada de elemol provavelmente produzirá resultadosdiferentes.

O pomiferin e o hexanoato de hexila são componentes nãosesquiterpenóides que desempenharam relativamente mal, quando as barataspareceram ser indiferentes a estes compostos nas concentrações testadas. Oosajin demonstrou repelência contra a barata Alemã e pode ter algumasutilidades, talvez em combinação com um ou mais sesquiterpenóides voláteisna laranja Osage. No entanto, visto que o osajin não é um componente volátil,a repelência é menos efetiva, isto é, apenas através do contato.

Conclusão. O teste até esta data mostra que os destilados devapor de vários componentes de laranja Osage madura desempenharammelhor do que os componentes extraídos por outros meios. Isto inclui, masnão é limitado a eles, alfa-cubeno, elemol, assim como osajin. Além disso, oscomponentes da laranja Osage ainda não testados, particularmente ossesquiterpenóides voláteis, também podem ser repelentes eficazes. Tambémpode ser que uma combinação ou mistura dos vários constituintes da laranjaOsage, juntamente com um carreador adequado, ainda forneça melhorrepelência do que qualquer um dos componentes individuais possa alcançarisoladamente. Teste futuro usando várias concentrações de DEET e outrasconcentrações de naftaleno como comparações, também é esperado de serexecutado.

EXEMPLO 3

O propósito deste teste foi determinar os meios pelos quais osrepelentes, tais como os vários compostos testados no Exemplo 1, sãodetectados por um inseto.

Insetos. Baratas da mesma fonte como nos Exemplos 1 e 2foram usadas.

Compostos Padrão e de Comparação. DEET foi adquirido daAldrich Chemicals.

Materiais de Partida. O destilado de vapor e os isômerospurificados de erva dos gatos (nepetalactona) como descritos no Exemplo 1foram usados.

Procedimento de Teste. Baratas machos foram submetidos aremoção de antena mediante o uso de uma lâmina de barbear para remover asantenas tão próximas da cabeça quanto possível. As baratas foram deixadas serecuperar do procedimento durante 24 horas antes de serem expostas aoscompostos de teste no bioensaio descrito no Exemplo 1.

Resultados. As comparações entre os compostos de teste pelolado tratado foram produzidas usando um teste t binário como mostrado naTabela 9.Tabela 9. Resultados do ensaio comportamental de baratas machossubmetidos a remoção de antena, e comparação do teste t binário com asbaratas machos não submetidos a remoção de antena testados na mesmaconcentração.

<table>table see original document page 45</column></row><table>

*A diferença é significativa mediante o teste t binário de duas caudas ema = 0,05, df = 9.

As baratas sem antenas eram indiferentes aos repelentestestados, quando elas gastaram quantidades quase iguais de tempo em ambosos lados do papel de filtro.

Conclusão. Os resultados destes testes demonstram que osquimiorreceptores responsáveis pela ação do repelente dos compostos estãolocalizados nas antenas da barata Alemã. É provável que taisquimiorreceptores estejam localizados nas antenas de outros artrópodes tendoantenas igualmente.

EXEMPLO 4

O propósito deste teste foi determinar se as baratas machosseriam mais sensíveis do que as baratas fêmeas aos compostos de teste damesma maneira como o DEET.

Métodos e Materiais de Teste. Nesta experiência, baratasfêmeas Alemãs foram testadas da mesma maneira descrita no Exemplo 1contra os destilados de vapor de erva dos gatos e da laranja Osage. O testeusando o repelente comercial, DEET, também foi efetuado para comparação.É sabido que as baratas machos são geralmente mais sensíveis aos repelentes,tais como DEET, do que as baratas fêmeas.Resultados. A Tabela 10 mostra o padrão comercial, DEET,quando comparado com acetona contra a barata Alemã fêmea. "L" e "R" sereferem aos lados esquerdo e direito do papel de filtro.

Tabela 10. Teste de barata Alemã fêmea - 10 % *(1600 ug/cm2) de DEET vs.acetona

<table>table see original document page 46</column></row><table>

*em volume

Como pode ser visto, na taxa de dez (10) %, o DEET apresentarepelência reduzida contra as baratas fêmeas quando comparada com asbaratas machos testadas acima visto que não existiu diferença significativaentre os lados tratados e não tratados. Em comparação, o mesmo tratamentode dez (10) % de DEET resultou em 63 segundos sobre o lado tratado e 238segundos sobre o lado não tratado como descrito no Exemplo 1 (ver a Tabela 2).

A Tabela 11 é uma comparação do óleo essencial de erva dosgatos, quando comparado com o hexano contra a barata Alemã fêmea.Tabela 11. Teste da barata Alemã fêmea - Cinco (5) %* (800 ug/cm2) dedestilado de vapor de erva dos gatos vs. hexano

<table>table see original document page 46</column></row><table><table>table see original document page 47</column></row><table>

*em volume

Os resultados apresentados na Tabela 11 demonstram umarepelência muito elevada do óleo essencial de erva dos gatos, isto é,nepetalactona, contra a barata Alemã fêmea em muitas das provas. Aocontrário do DEET, entretanto, que não apresentou nenhuma repelênciasignificativa contra as baratas Alemãs fêmeas, o óleo essencial de erva dosgatos demonstrou repelência muito boa na taxa mais baixa de cerca de cinco(5) %.

A Tabela 12 é uma comparação do óleo essencial da laranjaOsage madura com hexano contra a barata Alemã fêmea.

Tabela 12. Teste da barata Alemã fêmea - Dois (2) ml de destilado de vaporde laranja Osage vs. hexano

<table>table see original document page 47</column></row><table> Mais uma vez, em muitas das provas, o óleo essencial dalaranja Osage desempenhou surpreendentemente bem, apresentandorepelência muito boa contra a barata fêmea.

Conclusões. Vários dos compostos e extratos testadosdesempenharam melhor do que o padrão comercial, DEET, com referência arepelência contra as baratas fêmeas. Estes testes mostram que as baratasfêmeas podem ser repelidas pelos óleos essenciais de erva dos gatos e dalaranja Osage (embora não na mesma extensão como os machos). Isto está deacordo com Scheffler and Dombrowski, 1992, Insecticides: Mechanism ofReaction and Resistance, Andover, U.K. Estes resultados indicam que ascomposições contendo nepetalactona ou, provavelmente, um de seusisômeros, também muitos dos componentes da laranja Osage, tais comoelemol, provavelmente serão eficazes para uso como um repelente deartrópodes, tais como a barata Alemã.

EXEMPLO 5

O propósito deste teste foi determinar uma dose não letal denepetalactona para duas espécies de mosquito. Para uso na câmara deatividade descrita no Exemplo 7.

Insetos. Sexos misturados de Aedes aegypti silvestre coletadosinicialmente na Costa Rica em 1999 foram usados neste teste. Sexosmisturados de mosquitos Culex tarsalis obtidos da University of Califórnia atBerkeley, em Berkeley, Califórnia, também foram testados. Ambos os tiposde mosquitos são agora mantidos no Entomology Department átomos decarbono Iowa State University, Ames, Iowa de acordo com os seguintesmétodos de criação:

Aeds aegypti. Ovos dos mosquitos são secados e armazenadosem sacos plásticos em um refrigerador durante vários meses. A data dearmazenagem é anotada no recipiente. Uma seção de toalha de papel contendoos ovos mais velhos é depois colocada em água desoxigenada. As larvastipicamente emergem em minutos. Assim que as larvas apareceram, elas sãocolocadas em uma panela tendo cerca de 2,5 a 3,7 cm (cerca uma (1) a 1,5pol) de água. Duas (2) a três (3) gotas de mistura de Tetramin™ sãoadicionadas e as panelas são rotuladas com da data apropriada. Tetramin™ éproduzido pela TetraWerke em Melle, Germany, e distribuído nos EstadosUnidos pela Tetra Co. em Blacksburg, Virgínia. Uma gota de mistura deTetramin™ é adicionada todos os dias até que as larvas alcancem a terceirainstar. As larvas são alimentadas com cerca de uma (1) a três (3) gotas demistura de Tetramin™ diariamente, dependendo de sua progressão decrescimento. Se o crescimento for fraco, mas gotas são fornecidas. Cinqüentapupas são depois colocadas em copos que são enchidos até a metade comágua destilada. O copo é apropriadamente rotulado e lacrado com umquadrado de malha e tampa. Uma bola de algodão saturada com sacarose édepois colocada na malha e achatada. Após o surgimento de todos osmosquitos no copo, os mosquitos são liberados em uma gaiola rotulada. Umcoelho vivo sedado é colocado na parte de cima da gaiola aproximadamenteseis (6) a sete (7) dias após a liberação para os mosquitos se alimentaremdurante 15 a 20 minutos. Três dias após a alimentação, um copo que estáaproximadamente pela metade com água destilada e alinhado com uma tolhade papel (isto é, placa de oviposição) é colocado na gaiola. Após dois dias, ocopo é removido e o papel é secado para começar o ciclo novamente.

Culex tarsalis. Cinco (5) punhados de ovos são colocados emuma panela tendo cerca de 2,5 a 3,7 cm (cerca de um (1) a 1,5 pol) de água.Cera de duas (2) a três (3) gotas de mistura Tretramin™ são adicionadasdiariamente. As panelas são verificadas diariamente com relação a eclosão.Tipicamente, os primeiros instares aparecem em cerca de dois (2) ou três (3)dias. Uma (1) gota de mistura Tetramin™ é adicionada cada dia até que aslarvas alcancem o terceiro instar. Uma (1) a três (3) gotas de mistura éalimentada nas larvas diariamente, dependendo do progresso de crescimento.Cinqüenta pupas são coletadas nos copos que são enchidos pela metade comágua destilada. O copo é apropriadamente rotulado com data, espécie, númerode pupas, etc. O copo é depois lacrado com um quadrado de malha e tampa.(Fita verde é usada para indicar não autógeno, com fita vermelha usada paraautógeno). Uma bola de algodão saturada com sacarose é depois colocada namalha e achatada. Após o surgimento de todos os mosquitos no copo, osmosquitos são liberados em uma gaiola rotulada. Uma codorna sedada écolocada na parte de cima da gaiola aproximadamente seis (6) a sete (7) diasapós a liberação para os mosquitos se alimentarem durante cerca de 15 a 20minutos. As almofadas de sacarose são removidas no dia anterior aalimentação. Três dias após a alimentação, a placa de oviposição (descritaacima) é colocada na gaiola. A placa é removida após dois dias, e ospunhados de ovos são separados em cinco (5) per panela para começar o ciclonovamente. Se necessário, os mosquitos podem ser alimentados na codornamais uma vez de três (3) a quatro (4) dias após a oviposição.

Padrões e Materiais de Partida. O óleo essencial de erva dosgatos isolado com descrito acima foi usado neste teste. Hexano, adquirido daFisher Scientific, Inc., foi usado como um controle.

Procedimento de Teste. Os testes de toxicidade foramconduzidos nas seções superiores de várias garrafas de vidro.Especificamente, cada garrafa de vidro foi cortada em duas seções, e a partedo fundo foi descartada. A parte superior remanescente tinha um volume deaproximadamente 175 ml. O topo da parte superior tinha uma boca de vidroestabelecida. O final do fundo aberto foi revestido com um pedaço de sete (7)cm de papel de filtro, que foi firmado com cola para todos os propósitos. Acola foi deixada secar e o excesso de papel de filtro foi podado mediante ouso de uma lâmina de barbear. Meio ml de solução de hexano foi aplicado aopapel de filtro. O hexano foi deixado secar durante aproximadamente um (1)minuto. Película de cobertura de estiramento com parafina da marcaParafilm® produzida pela American National Can Co. em Chigago, Illinois,foi colocada sobre o lado de fora da garrafa para lacrar o fundo da garrafasobre o filtro de papel. Aproximadamente cinco (5) mosquitos adultos (sexosmisturados) foram colocados na garrafa através da boca. A boca foi depoistampada com uma bola de algodão que foi embebida em uma solução desacarose de dez (10) %. As mortalidades foram registradas em 0,5, 24, 48 e120 horas.13.

Resultados. Os resultados deste teste são mostrados na Tabela

Tabela 13. Mortalidade de mosquito em concentrações variáveis denepetalactona derivada de erva dos gatos.

<table>table see original document page 51</column></row><table>

Os resultados acima demonstram que os isômeros individuaisde erva dos gatos assim como o óleo essencial de erva dos gatos, são cada umtóxico para os mosquitos adultos em um sistema fechado. Tais resultadospodem ser devido à toxicidade de fumigação ou de contato.

Conclusão. Os estudos empreendidos para determinar asconcentrações sub-letais de nepetalactona produziram surpreendentementealta toxicidade nos bioensaios de contato/fumigação.

EXEMPLO 6

O propósito deste teste foi estudar a repelência de mosquitos,moscas e baratas em um ambiente de ar estático, em concentrações que sãonão letais.Insetos

Blattella germanica. A barata Alemã foi obtida da mesmafonte como no Exemplo 1.

Musca domestica (moscas domésticas). As moscas eram desexos misturados (cepa Cornell) e foram criadas a partir de ovos coletados deuma colônia existente no Pesticide Toxicology Laboratory, Iowa StateUniversity, Ames, Iowa. As moscas adultas foram deixadas em um período deoviposição de 24 h para a deposição de ovos em um meio de cultivoumedecido. O meio de cultivo fornecido era uma mistura de Fly Diet(LabDiet, St. Louis, Missouri), levedura, açúcar e água destilada. Após operíodo de postura de ovos, os ovos foram transferidos para uma panela de12" χ 5" com meio de cultura e contida dentro uma panela maior, 20" χ 7",com areia (panela larval). Esta panela larval foi mantida em uma incubadora a750°F (24°C) por 1 semana durante o desenvolvimento larval e maturação. Nofinal de 1 semana, as larvas se moveram para foram da panela com meio decultura e ficaram em forma de pupa na areia circundante. O meio de culturafoi depois removido da panela larval e a água foi adicionada para flutuar aspupas e facilitar a coleta. Aproximadamente 250 pupas foram colocadas emuma gaiola controlada de 12" χ 12" χ 12" única com água destilada e umamistura de açúcar e leite em pó (1:1) para alimentação. Ver, por exemplo,Clegern, Robert W., Population Dynamics and Environmental Stress Studiesof House Flies in the Laboratory. PhD Thesis-University of Illinois at Urbana-Champaign. 1972. DNALDISS-73-9, 907, Ann Arbor, Michigan.

Culex pipiens (Mosquito Doméstico do Norte). Os mosquitosaqui testados foram obtidos de uma colônia de dez gerações removida demosquitos silvestres coletados em Ames, Iowa, foram usados para teste. Acolônia foi alimentada com sangue da codorniz norte-americana, Colinusvirginianus. Os ovos dos mosquitos foram secados e armazenados em umaincubadora até que necessários. Os ovos foram colocados em águadesoxigenada e duas a três gotas de uma solução de alimento de peixeTetraMin™ triturada foram adicionadas na água para alimentar as larvas. Aspupas foram removidas das panelas larvais quando elas surgiram e foramcolocadas em copos de papel cobertos com malha. Seguinte ao surgimento, asfêmeas adultas foram testadas durante um período de seis dias. Os mosquitosforam continuamente deixados se alimentar em uma bola de algodãoembebida com 0,3 M solução de sacarose. Em 1 a 2 horas antes do testecomeçar, as bolas de algodão foram removidas, e os mosquitos foram pré-condicionados na câmara ambiental do bioensaio, mantida em 26 0C, durante1 a 2 horas.

Métodos de Bioensaio de Repelência

Bioensaio da Barata Alemã e Mosca DomésticaUma arena de teste selecionada foi usada par avaliar a irritaçãodas soluções de teste em duas pestes de inseto doméstico comuns, a barataAlemã (.Blattella germânico) e a mosca doméstica (Musca domestica). O óleoessencial de erva dos gatos obtido pela destilação de vapor de erva dos gatosobtida da mesma fonte como descrito nos exemplos acima, e os doiscomponentes principais de seu óleo essencial, Ζ,Ε-nepetalactona e E,Z-nepetalactona (isolados do óleo essencial por TLC preparativa), foramavaliados com relação aos efeitos comportamentais de irritação de contatopara a barata Alemã. A TLC foi executada como descrito em McElvain, S.M.et ai., J. Am. Chem. Soc., 1941, 63, 1558-1563. O óleo essencial de erva dosgatos e seu constituinte principal Ζ,Ε-nepetalactona foram testados contra amosca doméstica. O N,N-dietil-m-toluamida (DEET) (Aldrich, St. Louis,MO) serviu com um controle positivo para o ensaio da arena de testeselecionada e como um ponto de comparação para medir os efeitoscomportamentais do inseto que resultam dos repelentes de inseto comerciaiscorrentes. As soluções de testes variando de 10 % a 0,1 % (vol/vol) deingrediente ativo (a.i) foram preparadas com acetona e depois liberadas emum papel de filtro para a evaporação do solvente. As taxas resultantes doingrediente ativo foram 1,63 mg/cm2, 815 μ§/αη2, 81,5 μΒ/οπι2, e 16,3μ^οηι2. As arenas de teste selecionadas para baratas Alemãs e moscasdomésticas foram construídas de placas de Petri de plástico. Metade de umpapel de filtro de 12,5 cm de dia. Foi tratada com 1 ml de solução de teste, e aoutra foi tratada com 1 ml de apenas solvente (controle). Ambas as partesdivididas do papel de filtro foram colocadas na arena de teste selecionada. Aposição do papel de filtro tratado foi escolhida a esmo usando uma tabelanumérica aleatória.

As baratas Alemãs ou moscas domésticas individuais foramcolocadas em cada arena de teste selecionada através de um orifíciolocalizado no centro na tampa da placa de Petri e avaliadas durante umperíodo de 300 segundos. A quantidade de tempo que o inseto gastou sobre ospapéis de filtro tratados e não tratados foi registrada e usada para calcular umvalor de repelência percentual:

Repelência Percentual = ((Tempo sobre o não tratado - Tempo sobre oTratado) / 300) χ 100.

Dez réplicas de cada solução de tratamento foram testadastanto para as baratas Alemãs quanto para as moscas domésticas. Os detalhesdeste plano de ensaio e alguns resultados foram anteriormente descritos (813).

Repelência de Mosquito

Uma colônia de Culex pipiens, obtida da mesma fonte comodescrito acima foi usada.

Porcentagem e Bioensaio de Repelência de Contato

Um mecanismo de teste selecionado de ar estático comdescrito acima foi usado para determinar os efeitos comportamentais sobre osinsetos neste estudo. O mecanismo consistia de uma seção de 9 χ 60 cm detubulação de vidro com um orifício de 2 cm furado no ponto central ao longodo comprimento para a introdução central dos insetos. Todo o teste foiconduzido em uma câmara ambiental a 26°C.

Os tratamentos incluíram óleo essencial de erva dos gatos,obtidos pela destilação de vapor como aqui descrito e em Peterson, et al., J.Econ. Entomol., 2002, 95, 377-380. O óleo essencial de laranja Osage, obtidopela destilação de vapor de frutas integrais anteriormente descrita emPeterson, et al., J. Essential Oil Res., 2002, 14, 233-236, soluções de teste deelemol (Augustus Oils, New Hampshire, England) e DEET (Aldrich, St.Louis, MO) em concentrações de 1 %, 0,5 % e 0,1 % (p/vol). O solvente dassoluções de teste, hexano, serviu com um tratamento de controle neste ensaio.

Um mililitro da solução foi aplicado na metade do papel de 2.

filtro redondo de 9 cm de diâmetro com uma área de 63,6 cm e depoisdeixado secar antes do teste. Isto resultou nas seguintes taxas de exposição:157, 78,6 e 15,7 μg/cm2. Os papéis de filtro tratados foram colocados dentrodas tampas de placas de Petri de vidro de 9 cm, e colocados sobre asextremidades do tubo de vidro. A posição do lado tratado, para a direita oupara a esquerda, foi selecionada mediante o uso de uma tabela numéricaaleatória. Aproximadamente quinze mosquitos fêmeas adultas não acasaladasforam anestesiadas com CO2 e depois introduzidas no cilindro de vidro de 9 χ60 cm através do orifício de 2 cm localizado no centro. A marcação do tempocomeçou dois minutos após a introdução do mosquito, e a distribuição demosquito dentro do mecanismo de teste selecionado de ar estático foiobservada durante um período de 180 minutos para cada tratamento. Adistribuição de mosquito (número de indivíduos sobre o lado tratado e nãotratado) foi registrada em pontos do tempo de 15, 30, 60, 90, 120 e 180minutos.

Os dados gerados por este estudo foram usados para examinarduas medidas de repelência de mosquito, repelência percentual e repelênciade contato. A repelência percentual foi calculada com a seguinte fórmula:Repelência Percentual = ((Número de Indivíduos sobre a metade não tratada -Número de Indivíduos sobre a metade tratada) / 15) χ 100.

A repelência de contato foi definida neste ensaio como o atode evitar 100 % do papel de filtro tratado (nenhum contato). Pontos do tempode 15, 30, 60, 90, 120 e 180 minutos foram usados para avaliar a repelênciade contato para observações individuais.

O plano experimental foi um plano completamente escolhido aesmo usando três replicações de cada tratamento. A análise de variância foiexecutada em SAS (PROC GLM; SAS Version 8) para identificar asdiferenças significativas de repelência percentual devido ao tratamento, econcentração. As comparações múltiplas foram completadas usando oprocedimento de Tukey. As comparações aos pares de tratamento derepelência de contato, que incluíram os dados dos seis pontos de tempoobservados para cada tratamento, foram concluídas usando Fishers Exact(PROC FREQ; SAS Version 8).Bioensaio de Repelência Residual de Mosquito

Aplicações envelhecidas de óleo essencial de erva dos gatos,elemol, DEET e hexano (controle) foram comparadas no mecanismo de testeselecionado de ar estático sob as mesmas condições descritas acima. Assoluções de 0,5 % e 0,1 % (p/vol) de cada solução de teste foram produzidaspara render a mesma taxa de ingrediente ativo usado no bioensaio derepelência de mosquito acima. Os papéis de filtro individualmente tratadosforam depois colocados em uma coifa de fumaça e envelhecidos durante 0,30, 60, 120 ou 180 minutos, deixando a volatilização ocorrer durante umperíodo de tempo fixo. Após o período de envelhecimento específico, ospapéis de filtro foram colocados dentro das tampas de placa de Petri de vidrode 9 cm, e depois colocados sobre as extremidades do tubo de vidro. Aposição do lado tratado foi escolhida a esmo. Aproximadamente 18 mosquitosfêmeas adultas não acasaladas foram anestesiadas com CO2 e depoisintroduzidas no cilindro de vidro de 9 χ 60 cm através do orifício de 2 cmlocalizado no centro. A marcação do tempo começou 2 minutos após aintrodução do mosquito, e a distribuição de mosquito (número de indivíduossobre os lados tratados e não tratados) dentro do mecanismo de testeselecionado de ar estático foi registrada após 15 minutos para a determinaçãoda Repelência Percentual (cálculos mostrados sob o Bioensaio de RepelênciaPercentual e de Contato). O plano experimental foi completamente escolhidoa esmo com três replicações de cada solução de teste envelhecida. A análisede variância foi usada para identificar as diferenças significativas relacionadascom o ingrediente ativo, concentração e período de envelhecimento.

Resultados

Repelência de Barata Alemã e Mosca Doméstica

A barata Alemã e a mosca doméstica ambas apresentaramrespostas de irritação de contato em pelo menos uma concentração de cadasolução de teste avaliada (Tabela 14). As baratas Alemãs forneceram aresposta de valor de repelência percentual mais elevado quando expostas àsolução 0,5 % de Ε,Ζ-nepetalactona. Esta resposta de repelência percentualfoi mais do que quatro vezes a resposta vista do teste na mesma concentraçãode Ζ,Ε-nepetalactona. Na experiência com barata, os isômeros tanto Z,Equanto Ε,Ζ-nepetalactona causaram uma resposta de repelência percentualmais elevada total em concentrações mais baixas do respectivo ingredienteativo, comparado com os tratamento com DET. A mosca domésticarespondeu às soluções de teste com uma tendência similar, embora o E,Z-isômero não foi testado. Os valores de repelência percentual mais elevadosresultaram da exposição ao óleo essencial de erva dos gatos e à Ζ,Ε-nepetalactona, variando de 70 a 96 %, comparado com DEET (39 %) (Tabela 15).

Tabela 14. Repelência percentual de óleo essencial de erva dos gatos, Ζ,Ε-nepetalactona, Ε,Ζ-nepetalactona, DEET e controle para a barata Alemã,<table>table see original document page 58</column></row><table>

Repelência de Mosquito

A repelência percentual de óleo essencial de erva dos gatos elaranja Osage, elemol e DEET em 15 minutos é representada nas Figs. 8, 9 e10. Os tratamentos com a mesma letra não são significativamente diferentespela análise de Tukey em α = 0,05. Adicionalmente, os resultados de testemostrando entre +15 % e -15 % de repelência (isto é, atração) são de formatípica não estatisticamente diferentes de zero tal que nenhum efeitoquantificável possa ser reivindicado. Ver, por exemplo, os resultados para ocontrole nas Figs. de8al0edellal3. Tais variações pequenas de zero sãoaqui interpretadas como o resultado do erro experimental ou aleatoriedade nocomportamento dos insetos. A Fig. 8 mostra a repelência percentual (15minutos) do mosquito doméstico do norte, Culex pipiens, em uma câmara derepelência de ar estático em uma aplicação de 157 μ§/αη2 (concentração de 1%) de óleo essencial de erva dos gatos, elemol, DEET, óleo essencial delaranja Osage e um controle de solvente.

A Fig. 9 é uma repelência percentual de 15 minutos domosquito doméstico do norte, Culex pipiens, em uma câmara de repelência dear estático para aplicação de 78,6 μg/cm2 (concentração de 0,5 %) de óleoessencial de erva dos gatos, elemol, DEET, assim como óleo essencial delaranja Osage, e um controle de solvente.

A Fig. 10 é uma repelência percentual de 15 minutos domosquito doméstico do norte, Culex pipiens, em uma câmara de repelência dear estático para aplicação de 15,7 μg/cm2 (concentração 0,1 %) de óleoessencial de erva dos gatos, elemol, DEET, assim como óleo essencial delaranja Osage, e um controle de solvente.

Todos os compostos testados apresentaram vários níveis designificância na repelência percentual em repelência de contato. O efeito deconcentração total não foi significativo (P = 0,4569). O óleo essencial delaranja Osage representou os valores mais baixos na repelência percentual (<60 %) e não mostrou qualquer repelência de contato significativa (P = 0,1). Oóleo essencial de erva dos gatos apresentou repelência percentual elevada noponto de tempo de 15 minutos em todas as concentrações testadas, incluindoo valor mais elevado, 100 % da concentração de 0,1 % (Fig. 8). Este tambémfoi o nível mais significativo de repelência de contato (P < 0,0001) resultantedas três concentrações de óleo essencial de erva dos gatos (Tabela 16). Asoutras concentrações de óleo essencial de erva dos gatos variaram naconcentração de repelência de contato (0,5 %), P = 0,5, e concentração de 15 %, P = 0,02.

As soluções de elemol produziram a segunda série maiselevada de valores de repelência percentual das soluções de teste, variando de81 % a 63 %. Estes tratamentos também resultaram na repelência de contantoaltamente significativa (Tabela 16). O padrão comercialmente disponível com10 relação a repelência de mosquito, DEET, também apresentou valores derepelência percentual elevados, variando de 63 % a 44 %, além da altasignificância com relação a repelência de contato.

Tabela 16. Repelência de contato do mosquito doméstico do norte, Culexpipiens, medida em 15, 30. 60, 90, 120, 180 minutos em uma câmara de15 repelência de ar estático para o óleo essencial de erva dos gatos, óleoessencial de laranja Osage. elemol, DEET, e controle. Os valores P na tabelasão do teste Fisher Exact.

Tratamento Taxa de aplicação Tratamento vs. controle valor PÓleo essencial de erva dos gatos 157 μg/cm Λ 78.6 μg/cm 15.7 μg/cm2 0,02 0,5 <0,001óleo essencial de laranja Osage 157 μg/cm 78.6 μg/cm2 'y 15.7 μg/cm 0,1 0,5 0,5Elemol 157 μg/cm Λ 78.6 μg/cm Λ 15.7 μg/cm <0,001 <0,001 <0,001DEET Λ 157 μg/cm 'y 78.6 μg/cm 15.7 μg/cm <0,001 <0,001 <0,001Controle - -

Como uma comparação, a Tabela 17 mostra os dados sobre arepelência espacial de concentrações a 1 %, 0,5 % e 0,1 % (equivalentes a 15720 μg/cm2, 78,6 μg/cm2 e 15,7 μg/cm2, respectivamente). O óleo essencial deerva dos gatos é o mais potente espacialmente (em 15 minutos, o período detempo usual testado). O elemol é a seguir o mais potente, seguido por DEET edepois óleo essencial de laranja Osage. Todos são repelentes em um nívelestatisticamente significativo, embora a laranja Osage foi apenas repelente naconcentração de 1 %. O potencial para o óleo essencial de laranja Osage éainda bom, visto que todos os repelentes comerciais são agora vendidos emformulações (pulverizações, loções, cremes, soluções) com 5 % a 50 % oumais elevado de ingrediente ativo.

Tabela 17. Repelência percentual de Culex pipiens para o óleo essencial deerva dos gatos, óleo essencial de laranja Osage, elemol, DEET, e superfícienão tratada (controle).

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Um teste de comparação múltiplo usado para determinar qual a média em uma sériediferente do repouso. A média seguida pela mesma letra não é significativamente diferente.

Repelência Residual

Os valores de repelência percentual foram elevados parasoluções de óleo essencial de erva dos gatos, elemol, e DEET imediatamenteseguinte a aplicação na superfície de teste (Tabela 18). A análise de variânciamostrou que existiu uma diferença entre três soluções diferentes e o controle(P < 0,0001), e uma interação significativa com a solução de tratamento etempo (P = 0,0019). As únicas soluções de tratamento que mostram umadiminuição significativa na repelência percentual durante um tempo foramóleo essencial de erva dos gatos 0,5 % (P = 0,02) e óleo essencial de erva dosgatos 0,1 % (P = 0,003) em que 51 % da variabilidade nos dados foi explicadapor esta conexão linear negativa. Os tratamentos de controle Elemol, DEET econtrole não apresentaram tendências na análise de regressão, indicando amanutenção de repelência com elmol e DEET sobre um período de 3 horas.

Tabela 18. Repelência percentual residual do mosquito doméstico do norte,Culex pwiens, em tratamentos de envelhecimento de 0. 30, 60, 90. 120, 180minutos de soluções de 0,5 % e 0,1 % de óleo essencial de erva dos gatos,elemol, DEET, e controle em uma câmara de repelência de ar estático.

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Conclusões

Os bioensaios em uma arena de teste selecionada foram usadospara avaliar as respostas de irritação da barata e mosca doméstica. O uso deimpedientes é uma ferramenta valiosa para o controle de peste,particularmente quando usados com um programa de controle de pesteintegrado. Nos estudos relatamos, a irritação de contato serve como umamedida de impediente e ajuda a identificar os compostos que podem servircomo protetores eficazes para prédios. Deve ser observado que as limitaçõesdeste método são que os indivíduos são apenas expostos à superfícies tratadasdurante um período de 5 minutos e pode apenas caracterizar uma resposta acurto prazo.

As baratas Alemãs e as moscas domésticas responderamnegativamente a todas as soluções avaliadas. Estes resultados demonstram aeficiência do ensaio e adicionam suporte com relação ao óleo essencial deerva dos gatos como um repelente de insetos. Especificamente, as baratasapresentaram maior fuga dos papéis de filtro tratados com isômeros denepetalactona purificados, Z5E e E,Z, e as moscas domésticas apresentarammaior fuga de Ζ,Ε-nepetalactona. Ambos os isômeros de nepetalactona foramcomparados durante as provas na barata Alemã, e o resultado foi umarepelência percentual muito maior dos papéis tratados com E,Z-nepetalactona.Estes resultados aumentam a necessidade de estudos de conexão estrutura-atividade, visto que a Ζ,Ε-nepetalactona e a Ε,Ζ-nepetalactona são compostosmuito similares que apenas diferem na orientação de grupos através de umaligação sobre a molécula. Estudos adicionais no modo de ação dosimpedientes são requeridos antes das conclusões serem tiradas sobre como adiferença estrutural mínima na Z,E e Ε,Ζ-nepetalactona causam respostassignificativamente diferentes da B. germanica.

Investigações iniciais da repelência de mosquito com óleoessencial de erva dos gatos e laranja Osage permitiram-nos a diretamentecomparar com DEET, o padrão comercial corrente, e outra análise ajudou aidentificar as diferenças na atividade destes compostos como repelentes deinseto. No momento, não existe nenhuma característica que se adapta a todosos repelentes ou um mecanismo único que explica como os produtos químicosespecíficos e as misturas atuam sobre os insetos. Estudos têm mostrado queuma resposta de inseto aos produtos químicos no meio ambiente é dependentede seu estado fisiológico e desenvolvente (14). Os estudos apresentados nesterelato focaliza em mosquitos fêmeas adultas e na sua receptividade à váriastaxas de óleo essencial de erva dos gatos e laranja Osage, elemol e DEETdurante um tempo. Os resultados do ensaio de repelência de mosquitomostram que após 15 minutos, o mosquito doméstico do norte foi maissignificativamente repelido das superfícies do papel de filtro tratadas comóleo essencial de erva dos gatos (100 %). Os valores de repelência percentuaisdos tratamentos com DEET e elemol resultaram em uma faixa mais baixa (81% a 44 %) do que o óleo essencial de erva dos gatos, mas apresentaramrepelência de contato mais elevada. Observações durante o ensaio mostraramque os indivíduos expostos ao óleo essencial de erva dos gatos se moverampara mais longe da superfície tratada do que nos tratamentos de DEET eelemol. Durante um tempo, este efeito começou a diminuir com o óleoessencial de erva dos gatos quando os mosquitos se redistribuíram através dotubo, eventualmente alcançando uma distribuição similar ao controle.

Os mosquitos expostos ao DEET e elemol se acomodaramlonge o bastante da superfície tratada para obter um nível adequado derepelência de contato. Como o tempo aumentou, os indivíduos devemcontinuamente rejeitar a superfície tratada até o final do período de 180minutos, ao contrário do óleo essencial de erva dos gatos, que apresentou umaresposta de repelência inicialmente elevada que diminuiu durante um tempo.O DEET e o elemol mostraram uma duração mais longa de repelênciacomparada com o óleo essencial de erva dos gatos, como é evidenciado com asignificância mais elevada na repelência de contato. Estudos adicionais sãonecessários para melhor compreender como estas diferenças ocorrem,incluindo os estudos sobre a volatilização química, e interferência com osestágios comportamentais de encontro e aceitação do mosquito hospedeiro.

O segundo ensaio de mosquito focalizou na quantificação darepelência residual do mosquito doméstico do norte aos papéis de filtroenvelhecidos de óleo essencial de erva dos gatos, elemol e DEET. Todas assoluções de teste de 0,5 % e 0,1 % apresentaram repelência percentualsignificativa seguinte a aplicação (isto é, sem o período de envelhecimento).Este efeito de repelência lentamente diminuiu durante um tempo para ambasas concentrações de óleo essencial de erva dos gatos (0,5 %, P = 0,02, 0,1 %,P = 0,003). Não existiu nenhuma perda significativa na repelência percentualvista nas soluções de tratamento de DEET e elemol, sendo responsável pelarepelência de mosquito contínua durante 3 horas de uma superfície tratada. Arepelência olfativa difere da repelência de contato, e o método aqui usado levaem conta alguma diferenciação entre os dois tipos. A repelência espacialinicial elevada de óleo essencial de erva dos gatos não é sustentada duranteum período de 3 horas, mas o elemol e o DEET mostraram repelência residualneste ponto do tempo.

EXEMPLO 7

O propósito deste teste foi determinar a repelência espacial ede contato de vários agentes biorracionais ao mosquito Aedes aegypti.Insetos

Mosquito da Febre Amarela (Aedes aegypti). Os mosquitosobtidos da University of Wisconsin em 2005 (que se originou em Liverpool,England) foram testados.

Materiais de Partida

Erva dos Gatos. A erva dos gatos foi obtida da fonte comodescrito acima no Exemplo 1.

Elemol. O elemol foi obtido da Augusta Chemical Limitedtendo escritórios no United Kingdom.

Óleo essencial Amyris (Amyris balsamifera). Para o teste noExemplo 7, o óleo essencial Amyris foi obtido dos Phoenix Natural Products(NP), tendo escritórios em Middlesex, United Kingdom.

Controle. Hexano tendo uma pureza de mais do que 99 % foiadquirido da Fisher Scientific Inc. tendo escritórios em Pittsburgh,Pennsylvania. O hexano também foi usado como o carreador juntamente comvários compostos testados.

Equipamento de Teste. Neste teste, uma câmara de repelênciade ar estático foi usada. O mecanismo consistia de uma seção de 9 χ 60 cm detubulação de vidro com um orifício de 2 cm furado no ponto central ao longodo comprimento para a introdução central dos insetos. Todo o teste foiconduzido em uma câmara ambiental nas temperaturas ambientes.

Métodos de Teste. Os dados para a repelência espacial foramcoletados em 15 minutos após a introdução dos mosquitos da febre amarelafêmeas em uma câmara de repelência de ar estático. Os dados para arepelência de contato foram coletados após três horas. As concentraçõesusadas nos testes são de 1 % em solução (1) ml dela em um papel de filtro de9 cm de diâmetro). Um (1) ml de uma solução a 1 % (p/vol) de substânciarepelente contendo hexano como um carreador foi colocado em pipeta em umpapel de filtro de 9 cm de diâmetro resulta em uma concentração de 157μ^ηι2. A solução continha a massa desejada de composto a ser testadoadicionado ao volume desejado de hexano, por exemplo, para uma solução a 1% de óleo essencial de erva dos gatos, 1 g foi adicionado a 100 ml de hexano.

Um mililitro da solução foi aplicado na metade de um papel defiltro redondo de 9 cm de diâmetro com uma área de 63,6 cm2 e depoisdeixado secar antes do teste. Portanto, a taxa de exposição foi de 157 μg/cm .Os papéis de filtro tratados foram colocados dentro das tampas de placas dePetri de vidro de 9 cm, e colocados sobre as extremidades do tubo de vidro. Aposição do lado tratado, para a direita ou para a esquerda, foi selecionadamediante o uso de uma tabela numérica aleatória. Aproximadamente quinzemosquitos fêmeas adultas não acasaladas foram anestesiadas com CO2 edepois introduzidas no cilindro de vidro de 9 χ 60 cm através do orifício de 2cm localizado no centro. A marcação do tempo começou dois minutos após aintrodução do mosquito, e a distribuição de mosquito dentro do mecanismo deteste selecionado de ar estático foi observada durante um período de 15minutos para cada tratamento para determinar a repelência espacial.Basicamente o número de mosquitos na metade não tratada foi consideradoser repelido e foi contado. A repelência percentual foi considerada ser:((Número de Indivíduos na Metade não Tratada - Número de Indivíduos naMetade Tratada) / 15) χ 100. A repelência de contato foi definida neste ensaiocomo 100 % de fuga do papel de filtro tratado após três horas. O planoexperimental foi um plano completamente escolhido a esmo usando seisreplicações de cada tratamento.

Resultados. A Tabela 19 mostra a repelência de 15 minutos e arepelência de contato dos mosquitos da febre amarela fêmeas adultas, Aedesaegypti, medidas em seis replicações em uma câmara de repelência de arestático em óleo essencial de erva dos gatos, óleo essencial Amyris, misturade óleo essencial de erva dos gatos/óleo essencial Amyris, e mistura de óleoessencial de erva dos gatos/elemol em 157 μg/cm2 (solução a 1 %).

A FIG. 11 mostra a repelência percentual (15 minutos) dosmosquitos da febre amarela fêmeas adultas, Aedes aegypti, medida em seisreplicações em uma câmara de repelência de ar estático em óleo essencial deerva dos gatos, óleo essencial Amyris, mistura de óleo essencial de erva dosgatos/óleo essencial Amyris, e mistura de óleo essencial de erva dosgatos/elemol em 157 μg/cm (solução a 1 %).

Tabela 19. A repelência espacial de 15 minutos e a repelência de contato de 3horas de mosquitos da febre amarela fêmeas adultas, Aedes aesvpti, de váriosrepelentes biorracional.

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A repelência % foi determinada em 15 minutos.b Significativamente diferiu do controle (a = 0,05).

0 Freqüência de fuga = média de repelência de contato do mosquito durante o período detempo de 3 horas.

d Repelência de Contato = 100 % dos indivíduos fora da superfície tratada.

Como a Tabela 19 mostra, a erva dos gatos é um repelenteespacial muito bom no período de tempo de 15 minutos, mas não ésignificativamente ativo como um repelente de contato durante o período detempo de 3 horas total (valor P = 0,2186). O óleo essencial Amyris é umrepelente espacial moderadamente bom (55,2 %) no período de tempo de 15minutos, e mostrou eficácia extremamente significativa como um repelente decontato durante o período de tempo de 3 horas (valor P é < 0,0001). O elemoltem um perfil de repelência similar ao óleo essencial Amyris. Isto não ésurpreendente visto que o óleo essencial Amyris contém maiores quantidadesde elemol e um análogo estrutural próximo, eudesmol. Os dados são tambémmostrados para as duas misturas de repelentes: óleo essencial de erva dosgatos/elemol e óleo essencial de erva dos gatos/ óleo essencial Amyris, ambasem uma relação de 1:1 dos componentes. Estas misturas apresentam forterepelência espacial (93 % e 82,6 %), ainda mais forte do que o óleo essencialde erva dos gatos isoladamente (77 %); as duas misturas tambémapresentaram repelência de contato muito forte sobre o período de tempo de 3horas, com indicado pelos valores P < 0,0001 com relação a sua diferença dotratamento de controle. As duas misturas fornecem um perfil ideal deatividade repelente de insetos, isto é, excelente eficácia como um repelenteespacial e excelente eficácia como um repelente de contato, durante o períodode tempo de 3 horas. Outros dados de nosso Iab indicam que o elemol e o óleoessencial Amyris são repelentes espaciais bons e de contato muito bonsdurante um período de tempo de 6 horas. Testamos eudesmol, a mistura deerva dos gatos/elemol, a mistura de óleo essencial de erva dos gatos/Amyris, euma mistura de erva dos gatos/eudesmol sobre um período de teste de 6 horas,com a expectativa de que todos os quatro serão repelentes de contato muitobons durante o período de 6 horas e que as três misturas serão altamenteeficazes como repelentes tanto espaciais quanto de contato.

Embora as misturas testadas foram combinadas em umarelação de 1:1 é provável que outras proporções também produzirão efeito.

EXEMPLO 8Todos os métodos de teste foram os mesmos com descritos noExemplo 6, exceto a repelência espacial sobre um período mais longo.Tabela 20. Repelência Percentual durante um tempo de Aedes aezvpti emelemol (grau prático), citronela, DEET, óleo essencial Amyris ÍPhoenix5 Natural Products Ltd.), e uma superfície não tratada (controle) em umolfactômetro de ar estático.

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Estes resultados demonstram que o óleo essencial Amyris,

DEET e elemol todos apresentaram repelência a longo prazo.EXEMPLO 9

O propósito deste teste foi determinar a repelência espacial ede contato dos vários agentes biorracionais para o mosquito Aedes aegypti.

Materiais de Partida

Óleo essencial Amyris. O óleo essencial Amyris da Phoenix(NP) e o óleo essencial Amyris da Essential Oil University (EOU), umacorporação tendo escritórios em Southall, Middlesex, United Kingdom, foramtestados. O óleo essencial Amyris foi adquirido para o teste porque foirelatado de ter quantidades elevadas de elemol e eudesmol nele, que são osdois repelentes predominantes na laranja Osage. No entanto, os isômerosindividuais tanto de elemol quanto de eudesmol também estão presentes noóleo essencial Amyris. Tanto o elemol quanto o eudesmol são encontrados emporcentagens mais elevadas no óleo essencial Amyris do que no óleoessencial de laranja Osage. Usando métodos de cromatografia gasosaconvencional/espectrometria de massa conhecidos na técnica, temosconfirmado quantidades elevadas, isto é, mais de 50 % em peso de óleo, deambos os sesquiterpenóides no óleo essencial Amyris da Phoenix NP.Entretanto, parece que o óleo essencial Amyris da EOU possui umacomposição diferente.

Elemi. Elemi foi obtido da Phoenix NP.

Controle. Hexano tendo uma pureza de mais do que 99 % foiadquirido da Fisher Scientific Inc. O hexano também foi usado como ocarreador juntamente com vários compostos testados.

Métodos de Teste. Os métodos de teste como descritos noExemplo 1 foram usados exceto que as concentrações foram de 0,5 % solução(1 ml dele em um papel de filtro de 9 cm de diâmetro). Um (1) ml de umasolução a 0,5 % de um material repelente colocado em pipeta no tamanho depapel de filtro resulta em 78,6 μ^ατι2. Da mesma forma apenas trêsreplicações foram usadas em lugar de seis.

Resultados. A Tabela 21 mostra a Repelência Percentual e a15 repelência de Contato do Aedes aegypti em óleo essencial elemmi, óleoessencial Amyris (Phoenix Natural Products Ltd.), óleo essencial Amyris(Essential Oil University), elemol (grau prático), e uma superfície não tratada(controle) em um olfactômetro de ar estático.

A Fig. 12 mostra a repelência percentual (15 minutos) demosquitos da febre amarela fêmeas adultas, Aedes aegypti, medida em trêsreplicações em uma câmara de repelência de ar estático em óleo essencialelemi, óleo essencial Amyris (Phoenix Natural Products Ltd.), óleo essencialAmyris (Essential Oil University), elemol (grau prático), e uma superfície nãotratada (controle).

A Tabela 21 mostra que dois óleos são repelentes espaciaiseficazes na metade da concentração utilizada na Tabela 1, isto é, 78,6 μg/cm(obtido pelo tratamento do papel de filtro com 1 ml de solução a 0,5 % paracada material).Tabela 21. Repelência de 15 minutos e repelência de contato de 3 horas deAedes aesvvti.

<table>table see original document page 71</column></row><table>

* A repelência % foi determinada em 15 minutos.

** Significativamente diferente do controle em uma comparação da média LS (a = 0,05).

*** a repelência de contato foi determinada como > 12 in. de distância da superfícietratada em seis pontos do tempo durante um período de 3 horas.

**** As concentrações são equivalentes a uma solução a 0,5 % (vol./vol.).

O óleo essencial Amyris da Phoenix NP foi altamente eficazde modo espacial, e o elemol foi significativamente repelente, mas não tãofortemente quanto o óleo essencial Amyris da Phoenix NP. O óleo elemi foitestado porque tinha uma pequena quantidade de elemol nele, mas não foieficaz nesta concentração baixa. No entanto, pode ser ativo em umaconcentração mais elevada, por exemplo, cerca de 10 vezes a concentraçãoaqui usada. O óleo essencial Amyris da EOU não foi significativamenterepelente nesta concentração. Três dos materiais testados foramsignificativamente repelentes através do modo de repelência de contato: tantoos óleos essenciais Amyris quanto o elemol eram repelentes por contato,enquanto o óleo elemi não era.

Estes resultados mostraram que o óleo essencial Amyris daPhoenix NP e o elemol foram ainda eficazes em uma concentração maisbaixa. É possível ainda que os compostos serem eficazes em concentraçõesainda mais baixas. No uso real, no entanto, concentrações mais elevadasprovavelmente serão requeridas quando a área alvo tipicamente será maior doque a área alvo usada nestes testes.EXEMPLO 10

O propósito deste teste foi determinar a repelência espacial ede contato de vários agentes biorracionais para o mosquito Culex pipens.

Mosquitos

Culex pipiens. Os mosquitos foram obtidos da mesma fontecomo descrito acima.

Materiais de Partida.

A erva dos gatos foi preparada como descrito acima. Amadeira Siam foi obtida da Oshadhi Limited, tendo escritórios em PetalumaCalifórnia.

Métodos de Teste. Os métodos de teste como descritos noExemplo 1. Da mesma forma apenas três replicações foram usadas em lugarde seis.

Resultados. A Tabela 22 mostra a repelência de 15 minutos e arepelência de contato para o óleo essencial de madeira Siam, mistura de óleoessencial de madeira Siam/óleo essencial de erva dos gatos e controle apenasde solvente. Usando os valores médios e seu Erro Padrão relacionado dosvalores médios (SEM), a repelência das amostras selecionadas foideterminada como mostrado na Tabela 22.

A Fig. 13 mostra a repelência percentual (15 minutos) demosquitos da febre amarela fêmeas adultas, Aedes aegypti, medida em trêsreplicações em uma câmara de repelência de ar estático em óleo essencial demadeira Siam, mistura de óleo essencial de madeira Siam/óleo essencial deerva dos gatos e controle apenas de solvente.Tabela 22. Repelência de 15 minutos e repelência de contato

PercentualMédia

Concentração

<table>table see original document page 72</column></row><table>Como a Tabela 22 mostra que o óleo essencial de madeiraSiam é bastante eficaz em repelir os mosquitos, mas é ainda mais repelentequando for misturado com o óleo essencial de erva dos gatos. Teste adicionaldeterminará a repelência dos componentes individuais de óleo essencial demadeira Siam, incluindo os dois componentes principais, isto é, nerolidol efocienol. Mais outro teste adicional incluirá os componentes individuais deóleo de erva dos gatos, a saber, Ζ,Ε-nepetalactona e Z,E-nepetalactona.Outras misturas tendo proporções variáveis dos dois compostos também serãotestadas.

Conclusão

Todas as publicações, patentes e documentos de patente sãoincorporadas aqui por referência, como se individualmente incorporadas porreferência, cada uma em sua totalidade, como se individualmenteincorporadas por referência. No caso de qualquer inconsistência, a presentedivulgação, incluindo quaisquer definições, prevalecerá.

Embora as formas de realização específicas tenham sido aquiilustradas e descritas, será observado por aqueles de habilidade usual natécnica que qualquer ajuste que seja calculado para obter o mesmo propósitopode ser substituído pela forma de realização específica apresentada. Estepedido é planejado para cobrir quaisquer adaptações ou variações da presentematéria objeto. Por exemplo, embora as formas de realização focalizem sobreos repelentes, é possível que algumas formas de realização possam serformuladas para abater a peste alvo, tal que o repelente seja eficazmenteatuado como um pesticida. Portanto, é manifestamente planejado que asformas de realização desta invenção sejam limitadas apenas pelasreivindicações e os seus equivalentes.

Claims

1. Composição repelente, caracterizada pelo fato de quecompreende uma quantidade repelente eficaz de um ou maissesquiterpenóides contendo oxigênio e um ou mais monoterpenóides emcombinação com um carreador, em que a composição é formulação pararepelir uma peste alvo de uma área alvo.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o um ou mais sesquiterpenóides contendo oxigênio sãocíclicos ou acíclicos.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o um ou mais sesquiterpenóides contendo oxigênio sãoselecionados do grupo consistindo de óleo essencial de laranja Osage, um oumais componentes individuais de óleo essencial de laranja Osage, óleoessencial Amyris, um ou mais componentes individuais de óleo essencialAmyris, óleo essencial de madeira Siam, um ou mais componentesindividuais de óleo essencial de madeira Siam, e combinações destes.

4. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o um ou maissesquiterpenóides contendo oxigênio são selecionados do grupo consistindode elemol, β-elemol, β-eudesmol, (E)-nerolidol, focienol, γ-eudesmol, a-muurolol, a-cadinol, α-eudesmol, dauca-8(14),ll-dien-9-ol, 1-hexanol,hedicariol, β-eudesmol, farnesol, mirtenol, globulol, Ζ,Ε-farsenol, 1-dodecanol, 1-decanol, heptanal, 4-metilfenol, 2,6-nonadienal, E,Z-decanal,elemol/hedicariol, e combinações destes.

5. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o um ou maismonoterpenóides são selecionados do grupo consistindo de óleo essencial deerva dos gatos, nepetalactona, Z,E-nepetalactona, Ε,Ζ-nepetalactona, Z,Z-nepetalactona e Ε,Ε-nepetalactona e combinações destes.

6. Composição repelente, caracterizada pelo fato de quecompreende uma quantidade repelente eficaz de um ou maissesquiterpenóides contendo oxigênio em combinação com um carreador, o umou mais sesquiterpenóides contendo oxigênio selecionados do grupoconsistindo de óleo essencial Amyris, óleo essencial de madeira Siam, (E)-nerolidol, focienol, γ-eudesmol, α-muurolol, a-cadinol, α-eudesmol, dauca-8(14),ll-dien-9-ol, e combinações destes, em que a composição é formuladapara repelir uma peste alvo de uma área alvo.

7. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a quantidade repelenteeficaz é uma quantidade suficiente para abater algumas ou todas as pestesalvos.

8. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de que ainda compreende p-mentano diol, álcool cinâmico, gautéria, citronela, e combinações destes.

9. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o carreador é umsólido, líquido ou gás.

10. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o carreador éselecionado do grupo consistindo de óleos, polímeros, plásticos, ceras,madeira, géis, colóides, materiais granulares, polvilhos, pós, pulverizações,meios de embebimento, concentrados emulsificáveis, e combinações destes.

11. Composição de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de que o colóide é um creme ou loção, os óleos sãoóleos vegetais, os polímeros são polímeros de liberação lenta, os materiaisgranulares são argilas ou minerais, e os concentrados emulsificáveis sãopolidores de pavimentos, calafetagens de silicona, pulverizadores ounebulizadores de aerossol.

12. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 ali, caracterizada pelo fato de que a área alvo é um serhumano ou animal.

13. Composição de acordo com a reivindicação 12,caracterizada pelo fato de que o animal é um animal de estimação ou criação.

14. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a área alvo é ao arlivre ou interna.

15. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a área alvo évestuário.

16. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a área alvo éselecionada do grupo consistindo de um jardim, quintal, planta, área decamping, barraca, redes de dormir, saco de dormir, massa de água, parque,campo, estábulo, garagem, construções comerciais, construções particulares,casa, armário, contêiner de navio, material de embalagem e roupa de cama.

17. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 16, caracterizada pelo fato de que a peste alvo é umartrópode selecionado do grupo consistindo de formigas, baratas, mosquitos,moscas pretas, moscas domésticas, mosquitos, pestes de grãos armazenados,traças, carrapatos, ácaros e aranhas.

18. Composição de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de que a peste de grãos armazenados é uma broca domilho, besouro vermelho da farinha, besouro de grãos dente-de-serra, traça defarinha Indian e a traça é uma traça de vestuário.

19. Composição de acordo com a reivindicação 18,caracterizada pelo fato de que o mosquito é um mosquito da febre amarela,um mosquito doméstico do norte ou mosquito da Western Encephalitis, amosca é uma mosca doméstica e a barata é uma barata Alemã.

20. Método para repelir uma peste alvo de uma área alvo,caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação de uma quantidaderepelente eficaz de uma composição na ou ao redor da área alvo, acomposição compreendendo uma mistura de um ou mais monoterpenóides eum ou mais sesquiterpenóides contendo oxigênio e um carreador.

21. Método para fornecer repelência a longo prazo em umaárea alvo, caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação de umaquantidade repelente eficaz de uma composição na ou ao redor da área alvo, acomposição compreendendo um ou mais sesquiterpenóides ou um ou maismonoterpenóides, em que as pestes alvos são repelidas mais que duas horas.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-20 a 21, caracterizado pelo fato de que pelo menos um do um ou maissesquiterpenóides e pelo menos um do um ou mais monoterpenóides são deuma fonte biorracional.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que a fonte biorracional é selecionada do grupo consistindo deplanta de erva dos gatos, laranja Osage imatura, laranja Osage madura,manjericão peruano, Bothricohloa pertusa, mangas, laranjas de umbigo,Cleoma monophylla, Leptospermum scoparium, Kunzea erocoides, madeiraSiam, planta Amyris, hormônios de inseto, feromônios, e combinações destes.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-20 a 22, caracterizado pelo fato de que o um ou mais monoterpenóides sãoselecionados do grupo consistindo de óleo essencial de erva dos gatos,nepetalactona, Ζ,Ε-nepetalactona, E,Z-nepetalactona, Ζ,Ζ-nepetalactona eΕ,Ε-nepetalactona e combinações destes.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-20 a 22 ou reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o um ou maissesquiterpenóides contendo oxigênio são selecionados do grupo consistindode óleo essencial de laranja Osage, um ou mais componentes individuais deóleo essencial de laranja Osage, óleo essencial Amyris, um ou maiscomponentes individuais de óleo essencial Amyris, óleo essencial de madeiraSiam, um ou mais componentes individuais de óleo essencial de madeiraSiam, e combinações destes.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizadopelo fato de que o um ou mais componentes individuais de óleo de madeiraSiam incluem β-elemol, β-eudesmol, (E)-nerolidol, focienol, γ-eudesmol, a-muurolol, a-cadinol, α-eudesmol, dauca-8(14),ll-dien-9-ol.

27. Método de acordo com a reivindicação 25 ou 26,caracterizado pelo fato de que o um ou mais componentes individuais de óleoAmyris incluem valerianol e 10-epi-gama eudesmol.

28. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que o um ou mais sesquiterpenóides contendo oxigênio sãoselecionados do grupo consistindo de elemol, β-elemol, β-eudesmol, (E)-nerolidol, focienol, γ-eudesmol, α-muurolol, a-cadinol, α-eudesmol, dauca-8(14),ll-dien-9-ol, 1-hexanol, hedicariol, β-eudesmol, farnesol, mirtenol,globulol, Ζ,Ε-farsenol, 1-dodecanol, 1-decanol, heptanal, 4-metilfenol, 2,6-nonadienal, Ε,Ζ-decanal, elemol/hedicariol, e combinações destes.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-20 a 28, caracterizado pelo fato de que as pestes alvos são repelidas por pelomenos seis horas.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-20 a 29, caracterizado pelo fato de que a peste alvo é um artrópodeselecionado do grupo consistindo de formigas, baratas, mosquitos, moscaspretas, moscas domésticas, vários mosquitos, pestes de grãos armazenados,traças, carrapatos, ácaros e aranhas.

31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-20 a 30, caracterizado pelo fato de que a peste alvo é exposta à composiçãorepelente por contato, fumigação, exposição aquática ou combinações destes.

32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-20 a 31, caracterizado pelo fato de que a composição é liberada na área alvocom um dispensador da fonte do ponto de liberação controlada.