BRPI0708959A2 - genes e proteìnas de brachyspira hyodysenteriae e uso dos mesmos para diagnóstico e terapia - Google Patents

Abstract

GENES E PROTEìNAS DE BRACHYSPIRA HYODYSENTERIAE E USO DOS MESMOS PARA DIAGNóSTICO E TERAPIA. A presente invenção refere-se a novos polinucleotídeos e aminoácidos de Brachyspíra hyodysenteriae. Essas seqúências são úteis para o diagnóstico da doença causada por B. hyodysenteriae em animais e como um tratamento terapêutico ou tratamento profilático de doença causada por B. hyodysenteriae em animais. Essas seqúências também podem ser úteis para o diagnóstico e tratamento terapêutico e/ou profilático de doenças em animais causadas por outras espécies de Brachyspira, inclusive B. intermedia, B. alvinipulli, B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii and B. pilosicoli.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "GENES EPROTEÍNAS DE BRACHYSPIRA HYODYSENTERIAE E USO DOS MES-MOS PARA DIAGNÓSTICO E TERAPIA".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a novos genes em Brachyspirahyodysenteriae e às proteínas codificadas nesses. Essa invenção se refereadicionalmente ao uso desses novos genes e proteínas para o diagnósticoda doença causada pela B. hyodysenteriae, vacinas contra B. hyodysenteri-ae e para triagem de compostos que matam B. hyodysenteriae ou bloqueiamos efeitos patogênicos de B. hyodysenteriae. Essas seqüências também po-dem ser úteis para o diagnóstico e tratamento terapêutico e/ou profilático dedoenças em animais causadas por outras espécies de Brachyspira, inclusive

B. intermedia, B. alvinipulli, B. aaiborgi, B. innocens, B. murdochii, e B. pilosicoii.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A disenteria suína é uma doença endêmica significativa de por-cos na Austrália e por todo o mundo. A disenteria suína é uma doença diar-réica muco-hemorrágica contagiosa, caracterizada por inflamação extensa enecrose da superfície epitelial do intestino grosso. Perdas econômicas devi-do à disenteria suína resultam principalmente de retardo de crescimento,custos de tratamento médico e mortalidade. O agente causador de disente-ria suína foi primeiramente identificado como um espiroqueta anaeróbico(Treponema hyodysenteriae) in 1971, e foi recentemente reatribuído ao gê-nero Brachyspira como B. hyodysenteriae. Quando a disenteria suína for estabelecida em um local de criação de porcos, o espectro da doença podevariar de leve, temporário ou inaparente, a grave e até fatal. As estratégiasde medicação em suinoculturas individuais podem mascarar sinais clínicos eem algumas suinoculturas a doença pode passar despercebida, ou pode serapenas uma suspeita. Se a doença evidente ocorrer ou não, B. hyodysente-riae pode persistir em porcos infectados, ou em outros reservatórios, taiscomo, roedores, ou no meio ambiente. Todas essas fontes afirmam potenci-al para transmissão da doença a rebanhos não infectados. As aves comerci-ais também podem ser colonizadas por B. hyodysenteriae, embora não sejaclaro como isso comumente ocorre sob condições de campo.

A colonização por B. hyodysenteriae produz uma resposta imu-nológica forte contra a espiroqueta, então a prova indireta de exposição àespiroqueta pode ser obtida ao medir os títulos de anticorpo circulante nosangue de animais infectados. Esses títulos de anticorpo foram relatadospara serem mantidos em níveis baixos, mesmo em animais que se recupera-ram de disenteria suína. Testes sorológicos para detecção de anticorpo pos-suem, portanto, potencial considerável para detectar infecções subclínicas eporcos portadores recuperados que possuem inúmeros espiroquetas inde-tectáveis em seu intestino grosso. Esses testes poderiam ser particularmen-te valiosos em uma forma de kit de fácil utilização, tal como, um ensaio imu-nossorvente ligado à enzima. Uma variedade de técnicas foi desenvolvidapara demonstrar a presença de anticorpos circulantes contra B. hyodysente-riae, inclusive testes de anticorpo fluorescente indiretos, testes de hemaglu-tinação, testes de aglutinação por microtitulação, testes de fixação comple-mentar, e ELISA que utiliza tanto lipopolissacarídeo quanto espiroquetassonicadas totais como antígeno. Todos esses testes sofreram problemas deespecificidade, visto que espiroquetas intestinais não-patogênicas relaciona-das podem induzir anticorpos de reatividade cruzada. Esses testes são úteispara detectar rebanhos onde há doença visível e altos títulos de anticorpocirculante, porém esses são problemáticos para identificar rebanhos subcli-nicamente infectados e porcos infectados individuais. Conseqüentemente,até esta data, nenhum ensaio completamente sensível e específico está dis-ponível para a detecção de anticorpos contra B. hyodysenteriae. A falta detestes diagnósticos adequados atrasou o controle da disenteria suína.

Inúmeros métodos são empregados para controlar a disenteriasuína, esses variam do uso profilático de agentes antimicrobianos, até o ex-termínio completo de rebanhos infectados e prevenção de reentrada de por-cos portadores infectados. Todas essas opções são dispendiosas e, paraessas serem completamente eficazes, requer-se o uso de testes diagnósti-cos sofisticados para monitorar o progresso. Atualmente, a detecção de di-senteria suína em rebanhos com infecções subclínicas, e animais portadoressaudáveis individuais, permanece um grande problema e atrasa a implemen-tação de medidas de controle eficazes. Um diagnóstico definitivo de disente-ria suína requer tradicionalmente o isolamento e identificação de B. hyody- senteriae das fezes ou mucosa de porcos doentes. Os principais problemasenvolvidos incluem o crescimento lento e exigências nutritivas meticulosasdessas bactérias anaeróbicas e confusão devido à presença de espiroque-tas morfologicamente similares na flora normal do intestino do porco. Umaprimoramento significativo no diagnóstico de porcos afetados individuais foi obtido com o desenvolvimento de ensaios de reação em cadeia da polime-rase (PCR) para a detecção de espiroquetas de fezes. Infelizmente, em apli-cações práticas o limite de detecção de PCRs se tornou incapaz de detectaranimais portadores com infecções subclínicas. Como uma conseqüênciadesses problemas de diagnóstico, há a necessidade visível de desenvolver uma ferramenta de diagnóstico simples e eficaz capaz de detectar infecçãopor B. hyodysenteriae no nível de rebanho e porco individual.

Uma resposta imunológica forte é induzida contra a espiroquetaapós a colonização com B. hyodysenteriae, e os porcos recuperados de di-senteria suína são protegidos de reinfecção. Apesar disso, tentativas de de- senvolver vacinas para controlar disenteria suína foram feitas com sucessomuito limitado, tanto devido ao fato de essas proporcionarem proteção ina-dequada sobre a base de rebanho, como devido ao fato de serem muito dis-pendiosas e difíceis de se produzir de modo a torná-las comercialmente viá-veis. As vacinas bacterina proporcionam algum nível de proteção, porém essas tendem a ser lipopolissacarídeo sorogrupo-específico, que então re-quer o uso de bacterinas multivalentes. Ademais, essas são difíceis e dis-pendiosas de se produzir sobre uma larga escala das exigências de cresci-mento anaeróbico meticulosas do espiroqueta.

Diversas tentativas foram feitas para desenvolver vacinas vivasatenuadas para disenteria suína. Essa abordagem possui a desvantagemque as cepas atenuadas mostram colonização reduzida, e conseqüentemen-te, causam estímulo imune reduzido. Há também a objeção sobre a parte deprodutores e veterinários ao uso de vacinas vivas para disenteria suína de-vido à possibilidade de reversão à virulência, especialmente visto que seconhece muito pouco sobre a regulação e organização genética em B.hyodysenteriae.

O uso de vacinas de subunidade recombinante é uma alternativaatraente, visto que os produtos seriam bem definidos (essencial para propó-sitos de registro), e relativamente fáceis de se produzir sobre uma larga es-cala. Até o momento o primeiro uso divulgado de uma proteína recombinan-te de B. hyodysenteriae como um candidato a vacina (uma proteína flagelarde 38 quilodáltons) não conseguiu impedir a colonização em porcos. É pro-vável que essa falha se refira especificamente à proteína recombinante par-ticular usada, bem como a outras questões de sistemas e rotas de distribui-ção, taxas de radiação absorvida, seleção de adjuvantes etc. (Gabe, JD,Chang, RJ, Slomiany, R, Andrews, WH and McCaman, MT (1995) Isolationof extracytoplasmic proteins from Serpulina hyodysenteriae B204 and mole-cular cloning of the flaB1 gene encoding a 38-kilodalton flagellar protein. In-fection and Immunity 63:142-148). A primeira proteína da B. hyodysenteriaerecombinante protetora parcialmente divulgada usada para vacinação foiuma lipoproteína de membrana externa de 29,7 kDa (Bhlp29.7, também re-ferida como BmpB e BIpA) essa possui homologia com as lipoproteínas deligação á metionina de várias bactérias patogênicas. O uso da proteína B-hlp29.7 recombinante marcada na his para vacinação de porcos, seguidopor infecção experimental com B. hyodysenteriae, resultou em 17 a 40% deporcos vacinados que desenvolveram a doença comparado com 50 a 70%dos porcos de controle não-vacinados que desenvolveram a doença. Vistoque a incidência de doença nos porcos vacinados com Bhlp29.7 foi significa-tivamente (/=0,047) menor do que nos porcos de controle, Bhlp29.7 mostrouter potencial como um componente de vacina contra disenteria suína (La, T,Phillips, ND, Reichel, MP and Hampson, DJ (2004). Protection of pigs fromswine dysentery by vaccination with recombinant BmpB, a 29.7 kDa outer-membrane Iipoprotein of Brachyspira hyodysenteriae. Veterinary Microbio-Iogy 102:97-109). Inúmeras outras tentativas foram feitas para identificar asproteínas envelope externas de B. hyodysenteriae que poderiam ser usadascomo componentes de vacina recombinante, porém ainda novamente ne-nhuma vacina foi feita. Uma abordagem muito mais global é necessária paraa identificação de proteínas recombinantes imunogênicos potencialmenteúteis de B. hyodysenteriae.

Até o momento, apenas um estudo utilizando DNA para vacina-ção foi divulgado. Nesse estudo, o gene ftnA da B. hyodysenteriae, que codi-fica uma suposta ferritina, foi clonado em um plasmídeo de E. coli e o DNAdo plasmídeo usado para cobrir as microesferas de ouro para vacinação ba-lística. Um modelo murino de disenteria suína foi usado para determinar anatureza protetora de vacinação com DNA e/ou proteína recombinante. Avacinação com proteína recombinante induziu uma boa resposta sistêmicacontra ferritina, entretanto, a vacinação com DNA induziu apenas uma res-posta sistêmica detectável. A vacinação com DNA seguida por reforço comproteína recombinante induziu uma resposta imune sistêmica à ferritina ape-nas após o reforço com a proteína. Entretanto, nenhum regime de vacinaçãotestado foi capaz de proporcionar proteção aos camundongos contra coloni-zação de B. hyodysenteriae e as lesões associadas. De forma interessante,a vacinação dos camundongos com DNA separadamente resultou em exa-cerbação significativa da doença (Davis, A. J., Smith, S.C. and Moore, RJ.(2005). Gene ftnA da Brachyspira hyodysenteriae: vacinação com vacinaçãode DNA e quantificação por PCR em tempo real de bactérias em um modelode camundongo da doença. Current Microbiology 50: 285-291).

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objetivo dessa invenção é possuir novos genes de B. hyody-senteriae e as proteínas codificadas por aqueles genes. Um objetivo adicio-nal dessa invenção é que os novos genes e as proteínas codificadas poraqueles genes possam ser usados para propósitos terapêuticos e diagnósti-cos. Uma pessoa pode usar os genes e/ou as proteínas em uma vacina con-tra B. hyodysenteriae e para diagnosticar infecções causadas por B. hyody-senteriae.

Um objetivo dessa invenção é possuir novos genes de B. hyody-senteríae que tenham a seqüência de nucleotídeo contida em SEQ ID NOs:I, 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 15. Um objetivo dessa invenção também é possuir asseqüências de nucleotídeo que são homólogas à SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9,II, 13, e 15 onde a homologia pode ser 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70%.

Essa invenção também inclui uma vacina de DNA ou composição imunogê-nica de que contém a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7,9, 11, 13 e 15 e as seqüências que são 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70%homólogas a essas seqüências. Essa invenção inclui ainda um ensaio diag-nóstico que contém DNA possuindo a seqüência de nucleotídeo de SEQ IDNOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, e 15 e as seqüências que são 95%, 90%, 85%,80%, 75% e 70% homólogas a essas seqüências.

Também, um objetivo dessa invenção é possuir plasmídeos quecontêm DNA possuindo a seqüência de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, e15; vetores de expressão procariótica e/ou eucariótica que contêm DNApossuindo a seqüência de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, e 15; e umacélula contendo os plasmídeos que contêm DNA possuindo a seqüência deSEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, e 15.

Um objetivo dessa invenção é possuir novas proteínas da B.hyodysenteriae possuindo a seqüência de aminoácido contida na SEQ IDNOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16. Outro objetivo dessa invenção é possuir asproteínas que são 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas às seqüên-cias contidas na SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, e 16. Também, um obje-tivo dessa invenção é uma vacina ou composição imunogênica para conteras proteínas que possuem a seqüência de aminoácido contida na SEQ IDNOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16, ou seqüências de aminoácido que são 95%,90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas às seqüências contidas na SEQ IDNOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16. Um aspecto adicional dessa invenção épossuir um kit de diagnóstico que contém uma ou mais proteínas possuindouma seqüência contida na SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16 ou quesão 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas às seqüências contidasna SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16.

Outro aspecto dessa invenção é possuir seqüências de nucleotí-deo que codificam as proteínas que possuem a seqüência de aminoácidocontida na SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16. A invenção também incluiplasmídeos, vetores de expressão eucariótica e procariótica, e vacinas deDNA que contêm DNA possuindo uma seqüência que codifica uma proteínapossuindo a seqüência de aminoácido contida na SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8,10, 12, 14 e 16. As células que contêm esses plasmídeos e vetores de ex-pressão estão incluídas nessa invenção.

Essa invenção inclui anticorpos monoclonais que se ligam àsproteínas que possuem uma seqüência de aminoácido contida na SEQ IDNOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16 ou se ligam às proteins que são 95%, 90%,85%, 80%, 75% e 70% homólogas às seqüências contidas na SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16. Os kits de diagnóstico que contêm os anticorposmonoclonais que se ligam às proteínas possuindo uma seqüência de amino-ácido contida na SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,e 16 ou se ligam às pro-teínas que são 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas às seqüênciascontidas na SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16 estão incluídos nessainvenção. Esses kits de diagnóstico podem detectar a presença de B.hyodysenteriae em um animal. O animal é, de preferência, qualquer mamífe-ro e ave; com mais preferência, galinha, ganso, pato, peru, periquito, cão,gato, hamster, gerbil, coelho, furão, cavalo, vaca, carneiro, porco, macaco eser humano.

A invenção também contempla o método para prevenir ou trataruma infecção de B. hyodysenteriae em um animal ao administrar em um a-nimal uma vacina de DNA que contém uma ou mais seqüências de nucleotí-deo listadas na SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 16 ou seqüências quesão 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas a essas seqüências. Es-sa invenção também abrange um método para prevenir ou tratar uma infec-ção de B. hyodysenteriae em um animal ao administrar em um animal umavacina que contém uma ou mais proteínas possuindo a seqüência de ami-noácido contida na SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16 ou seqüênciasque são 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas a essas seqüências.O animal é, de preferência, qualquer mamífero e ave; com mais preferência,galinha, ganso, pato, peru, periquito, cão, gato, hamster, gerbil, coelho, fu-rão, cavalo, vaca, carneiro, porco, macaco e ser humano.

A invenção também contempla o método para gerar uma respos-ta imune em um animal ao administrar em um animal uma composição imu-nogênica que contém uma ou mais seqüências de nucleotídeo listadas naSEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 14 e 16 ou seqüências que são 95%, 90%,85%, 80%, 75% e 70% homólogas a essas seqüências. Essa invenção tam-bém abrange um método para gerar uma resposta imune em um animal aoadministrar em um animal uma composição imunogênica que contém umaou mais proteínas que possuem a seqüência de aminoácido contida na SEQID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16 ou seqüências que são 95%, 90%, 85%,80%, 75% e 70% homólogas a essas seqüências. O animal é, de preferên-cia, qualquer mamífero e ave; com mais preferência, galinha, ganso, pato,peru, periquito, cão, gato, hamster, gerbil, coelho, furão, cavalo, vaca, car-neiro, porco, macaco e ser humano.

SUMÁRIO DETALHADO DA INVENÇÃO

Os artigos indefinidos "um" e "uma" são usados aqui para sereferir a um ou mais de um (ou seja, ao menos um) objeto gramatical do ar-tigo. A título de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais deum elemento.

O termo "aminoácido" pretende abranger todas as moléculas,seja naturais ou sintéticas, que incluem tanto funcionalidade de amino comofuncionalidade de ácido capaz de serem incluídas em um polímero de ami-noácidos naturalmente ocorrentes. Os aminoácidos exemplificativos incluemaminoácidos naturalmente ocorrentes; análogos, derivados e congêneresdesses; os análogos de aminoácido que possuem cadeias laterais variantes;e todos os estereoisômeros de qualquer um dos anteriores.

Um animal pode ser qualquer mamífero ou ave. Exemplos demamíferos incluem cão, gato, hamster, gerbil, coelho, furão, cavalo, vaca,carneiro, porco, macaco, e ser humano. Exemplos de aves incluem galinha,ganso, pato, peru e periquito.

O termo "resíduo conservado" se refere a um aminoácido que éum elemento de um grupo de aminoácidos que possuem algumas proprie-dades comuns. O termo "substituição de aminoácido conservativa" se refereà substituição (de forma conceituai ou de outro modo) de um aminoácido detal grupo com um aminoácido diferente do mesmo grupo. Uma maneira fun-cional para definir propriedades comuns entre aminoácidos individuais éanalisar as freqüências normalizadas de alterações de aminoácido entre pro-teínas correspondentes de organismos homólogos (Schulz, G. E. and R. H.Schinner., Principies of Protein Structure, Springer-Verlag). De acordo comtais análises, os grupos de aminoácidos podem ser definidos onde os ami-noácidos dentro de um grupo são trocados de forma preferencial um pelooutro, e portanto se parecem um com o outro principalmente em seu impactosobre a estrutura de proteína total (Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Princi-pies of Protein Structure, Springer-Verlag). Exemplos de grupos de aminoá-cido definidos dessa maneira incluem: (i) um grupo positivamente carregadoque contém Lys, Arg e His, (ii) um grupo negativamente carregado que con-tém Glu e Asp, (iii) um grupo aromático que contém Phe, Tyr e Trp, (iv) umgrupo de anel de nitrogênio que contém His e Tip, (v) um grupo não-polaralifático grande que contém Vai, Leu e De, (vi) um grupo levemente polarque contém Met e Cys, (vii) um grupo de resíduo pequeno que contém Ser,Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gln e Pro, (viii) um grupo alifático que contémVai, Leu, De, Met e Cys, e (ix) um pequeno grupo hidroxila que contém Ser e Thr.

Uma "proteína de fusão" ou "polipeptídeo de fusão" se refere auma proteína quimérica como aquele termo é conhecido na técnica e podeser construído utilizando métodos conhecidos na técnica. Em muitos exem-plos de proteínas de fusão, há duas seqüências de polipeptídeo diferentes, eem alguns casos, pode haver mais. As seqüências de polipeptídeo que codi-ficam a proteína de fusão podem ser operavelmente ligadas em estrutura demodo que a proteína de fusão possa ser corretamente traduzida. Uma prote-ína de fusão pode incluir seqüências de polipeptídeo da mesma espécie oude espécies diferentes. Em várias modalidades, o polipeptídeo de fusão po-de conter uma ou mais seqüências de aminoácido ligadas a um primeiro po-lipeptídeo. No caso onde mais de uma seqüência de aminoácido é fundidacom um primeiro polipeptídeo, as seqüências de fusão podem ser múltiplascópias da mesma seqüência, ou alternativamente, podem ser seqüências deaminoácido diferentes. Os polipeptídeos de fusão podem ser fundidos com oN-terminal, o C-terminal, ou o N- e C-terminal do primeiro polipeptídeo. Asproteínas de fusão exemplificativas incluem polipeptídeos que contêm ummarcador de glutationa S-transferase (marcador-GST), marcador de histidina(marcador-His), um domínio de imunoglobulina ou um domínio de ligação deimunoglobulina.

O termo "polipeptídeo isolado" se refere a um polipeptídeo, emalgumas modalidades, preparado a partir de DNA ou RNA recombinante, oude origem sintética ou origem natural, ou alguma combinação dessas, que(1) não está associado com proteínas que são normalmente encontradas nanatureza, (2) é separado da célula onde esse normalmente ocorre, (3) é i-sento de outras proteínas da mesma fonte celular, (4) é expresso por umacélula de uma espécie diferente, ou (5) não ocorre na natureza. É possívelque haja um polipeptídeo isolado, porém não é qualificado como um polipep-tídeo purificado.

O termo "ácido nucléico isolado" e "polinucleotídeo isolado" serefere a um polinucleotídeo seja DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, iRNA ge-nômico, ou um polinucleotídeo obtido de uma organela celular (tal como,mitocôndria e cloroplasto), ou seja de origem sintética, esse (1) não está as-sociado com a célula onde o "ácido nucléico isolado" é encontrado na natu-reza, ou (2) é ligado de maneira operável a um polinucleotídeo ao qual essenão está ligado na natureza. É possível que haja um polinucleotídeo isolado,porém esse não é qualificado como um polinucleotídeo purificado.

O termo "ácido nucléico" e "polinucleotídeo" se refere a umaforma polimérica de nucleotídeos, tanto ribonucleotídeos como desoxirribo-nucleotídeos ou uma forma modificada de cada tipo de nucleotídeo. Os ter-mos devem ser entendidos incluindo, como equivalentes, análogos tanto deRNA como DNA feitos de análogos de nucleotídeo, e, como aplicável à mo-dalidade descrita, polinucleotídeos de cadeia simples (tal como, senso ouanti-senso) e de cadeia dupla.

O termo "ácido nucléico da invenção" e "polinucleotídeo da in-venção" se refere a um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da in-venção. Um polinucleotídeo da invenção pode compreender toda, ou umaparte, uma seqüência de ácido nucléico em questão; uma seqüência de nu-cleotídeo ao menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%idêntica a uma seqüência de ácido nucléico em questão; uma seqüência denucleotídeo que se hibridiza sob condições severas em uma seqüência deácido nucléico em questão; seqüências de nucleotídeo que codificam poli-peptídeos que são funcionalmente equivalentes aos polipeptídeos da inven-ção; seqüências de nucleotídeo que codificam polipeptídeos ao menos cercade 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% homólogas ou idênticas auma seqüência de aminoácido em questão; seqüências de nucleotídeo quecodificam polipeptídeos possuindo uma atividade de um polipeptídeo da in-venção e possuindo ao menos cerca de 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%,98%, 99% ou mais homologia ou identidade com uma seqüência de aminoá-cido em questão; seqüências de nucleotídeo que se diferem por 1 a cerca de2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 50, 75 ou mais substituições, adições ou deleçõesde nucleotídeo, tais como, variantes alélicas, de uma seqüência de ácidonucléico em questão; ácidos nucléicos derivados e evolucionariamente rela-cionados a uma seqüência de ácido nucléico em questão; e complementos,e seqüências de nucleotídeo que resultam da degeneração do código gené-tico, para todos os ácidos nucléicos anteriores e outros da invenção. Os áci-dos nucléicos da invenção também incluem homólogos, por exemplo, ortólo-gos e parálogos, de uma seqüência de ácido nucléico em questão e tambémvariantes de uma seqüência de ácido nucléico em questão que foi otimizadapor códon para expressão em um organismo particular (por exemplo, célulahospedeira).

O termo "ligado de maneira operável", quando descreve-se rela-ção entre as duas regiões de ácido nucléico, se refere a uma justaposiçãoonde as regiões estão em uma relação que as permite funcionar em suamaneira pretendida. Por exemplo, uma seqüência de controle "ligada demaneira operável" a uma seqüência de codificação está ligada de tal manei-ra que a expressão da seqüência de codificação seja obtida sob condiçõescompatíveis com as seqüências de controle, tal como, quando as moléculasapropriadas (por exemplo, indutores e polimerases) estiverem ligadas à(s)seqüência(s) de controle ou reguladora(s).

O termo "polipeptídeo", e os termos "proteína" e "peptídeo" quesão usados de maneira intercambiável aqui, se referem a um polímero deaminoácidos. Os polipeptídeos exemplificativos incluem produtos genéticos,proteínas naturalmente ocorrentes, homólogos, ortólogos, parálogos, frag-mentos, e outros equivalentes, variantes e análogos dos anteriores.

Os termos "fragmento de polipeptídeo" ou "fragmento", quandousados em referência a um polipeptídeo de referência, se referem a um poli-peptídeo em que os resíduos de aminoácido são deletados como compara-do com o próprio polipeptídeo de referência, porém onde a seqüência deaminoácido restante é geralmente idêntica às posições correspondentes nopolipeptídeo de referência. Tais deleções podem ocorrer no amino-terminalou carbóxi-terminal do polipeptídeo de referência, ou alternativamente am-bos. Os fragmentos possuem tipicamente ao menos 5, 6, 8 ou 10 aminoáci-dos de comprimento, ao menos 14 aminoácidos de comprimento, ao menos20, 30, 40 ou 50 aminoácidos de comprimento, ai menos 75 aminoácidos decomprimento, ou ao menos 100, 150, 200, 300, 500 ou mais aminoácidos decomprimento. Um fragmento pode manter uma ou mais atividades biológicasdo polipeptídeo de referência. Em algumas modalidades, um fragmento po-de compreende um domínio que possui a atividade biológica desejada, eopcionalmente aminoácidos adicionais em um ou ambos os lados do domí-nio, esses aminoácidos adicionais podem ser computados de 5, 10, 15, 20,30, 40, 50, ou até 100 ou mais resíduos. Ademais, os fragmentos podemincluem um subfragmento de uma região específica, esse subfragmentomantém uma função da região da qual esse é derivado. Em outra modalida-de, um fragmento pode possuir propriedades imunogênicas.

O termo "polipeptídeo da invenção" se refere a um polipeptídeoque contém uma seqüência de aminoácido em questão, ou um equivalenteou fragmento dessa. Os polipeptídeos da invenção incluem polipeptídeosque contêm toda ou uma parte da seqüência de aminoácido em questão;uma seqüência de aminoácido em questão com 1 a cerca de 2, 3, 5, 7, 10,15, 20, 30, 50, 75 ou mais substituições de aminoácido conservativas; umaseqüência de aminoácido que é ao menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%,97%, 98%, ou 99% idêntica a uma seqüência de aminoácido em questão; efragmentos funcionais dessa. Os polipeptídeos da invenção também incluemhomólogos, por exemplo, ortólogos e parálogos, de uma seqüência de ami-noácido em questão.

Também é possível modificar a estrutura dos polipeptídeos dainvenção para tais propósitos como aumentar a eficácia terapêutica ou profi-lática, ou estabilidade (por exemplo, vida em prateleira ex vivo, resistência àdegradação proteolítica in vivo, etc.). Tais polipeptídeos modificados, quan-do projetados para manter ao menos uma atividade da forma naturalmenteocorrente da proteína, são considerados "equivalentes funcionais" dos poli-peptídeos descritos em mais detalhes aqui. Tais polipeptídeos modificadospodem ser produzidos, por exemplo, por substituição, deleção, ou adição deaminoácido, tais substituições podem consistir como um todo ou em partepor substituições de aminoácido conservativas.

Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição conserva-tiva de aminoácido isolado, tal como, substituição de uma Ieucina por umaisoleucina ou valina, um aspartato por um glutamato, uma treonina por umaserina, não terá um grande efeito sobre a atividade biológica da molécularesultante. Se uma alteração na seqüência de aminoácido de um polipeptí-deo resultar em um homólogo funcional essa pode ser facilmente determi-nada ao avaliar a capacidade de o polipeptídeo variante produzir uma res-posta similar àquela da proteína tipo selvagem. Os polipeptídeos em queocorreu mais de uma substituição podem ser facilmente testados da mesmamaneira.

O termo "purificado" se refere a uma espécie que é a espéciepredominante presente (ou seja, sobre uma base molar é mais abundantedo que qualquer outra espécie individual na composição). Uma "fração puri-ficada" é uma composição onde a espécie em questão é ao menos cerca de50 porcento (sobre uma base molar) de todas as espécies presentes. Aofazer a determinação da pureza ou uma espécie em solução ou dispersão, osolvente ou matriz onde a espécie é dissolvida ou dispersa não está geral-mente incluída em tal determinação; de preferência, apenas as espécies(que inclui aquela de interesse) dissolvidas ou dispersas são levadas emconsideração. Geralmente, uma composição purificada terá uma espécieque é mais de cerca de 80% de todas as espécies presentes na composi-ção, mais de cerca de 85%, 90%, 95%, 99% ou mais de todas as espéciespresentes. A espécie em questão pode ser purificada para homogeneidadeessencial (as espécies contaminantes não podem ser detectadas na compo-sição por métodos de detecção convencionais) onde a composição é essen-cialmente uma única espécie. Um elemento versado na técnica pode purifi-car um polipeptídeo da invenção utilizando técnicas padrão para purificaçãode proteína e, consideração com as instruções neste documento. A purezade um polipeptídeo pode ser determinada por inúmeros métodos conhecidosna técnica, inclusive, por exemplo, análise de seqüência de aminoácido ami-noterminal, eletroforese em gel, análise de espectrometria de massa e osmétodos descritos aqui.

Os termos "proteína recombinante" ou "polipeptídeo recombi-nante" se referem a um polipeptídeo que é produzido por técnicas de DNArecombinante. Um exemplo de tais técnicas inclui o caso quando o DNA quecodifica a proteína expressa é inserido em um vetor de expressão adequadoque é, sucessivamente, usado para transformar uma célula hospedeira paraproduzir a proteína ou polipeptídeo codificado pelo DNA.

O termo "seqüência reguladora" é um termo genérico usado aolongo do relatório descritivo para se referir a seqüências de polinucleotídeo,tais como, sinais de iniciação, intensificadores, reguladores e promotores,que são necessários ou desejáveis para afetar a expressão de seqüênciasde codificação e não-codificação às quais esses estão ligados de maneiraoperável. As seqüências reguladoras exemplificativas estão descritas emGoeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, AcademicPress, San Diego, CA (1990), e incluem, por exemplo, os promotores iniciaise recentes de S V40, promotor imediato de adenovírus ou citomegalovírus, osistema lac, o sistema trp, o sistema TAC ou TRC, promotor 17 cuja expres-são é dirigida por RNA polimerase 17, o principal operador e regiões depromotor de fago lambda, as regiões de controle para proteína capsidial fd, opromotor de 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, os pro-motores de fosfatase ácida (por exemplo, Pho5), os promotores dos fatoresde alfa de acasalamento de leveduras, o promotor de poliedro do sistemabaculovírus e outras seqüências conhecidas para controlar a expressão degenes de células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus, e várias com-binações desses. A natureza e uso de tais seqüências de controle podem sediferir dependendo do organismo hospedeiro. Em procariotos, tais seqüên-cias reguladoras geralmente incluem promotor, sítio de ligação ribossomal, eseqüências de terminação de transcrição. O termo "seqüência reguladora"pretende incluir, no mínimo, componentes cuja presença pode influenciar aexpressão, e também pode incluir componentes adicionais cuja presença évantajosa, por exemplo, seqüências líder e seqüências de parceiro de fusão.Em algumas modalidades, a transcrição de uma seqüência de polinucleotí-deo está sob o controle de uma seqüência promotora (ou outra seqüênciareguladora) que controla a expressão do polinucleotídeo em um tipo de célu-la no qual a expressão está destinada. Também será entendido que o poli-nucleotídeo pode estar sob o controle de seqüências reguladoras que sãoiguais ou diferentes daquelas seqüências que controlam a expressão daforma naturalmente ocorrente do polinucleotídeo.

O termo "homologia de seqüência" se refere à proporção decompatibilidade de base entre duas seqüências de ácido nucléico ou à pro-porção de compatibilidades de aminoácido entre duas seqüências de ami-noácido. Quando a homologia de seqüência for expressa como porcenta-gem, por exemplo, 50%, a porcentagem indica a proporção de compatibili-dades ao longo do comprimento de seqüência de uma seqüência desejadaque é comparada com alguma outra seqüência. Lacunas (em cada uma dasduas seqüências) são permitidas para aumentar a compatibilidade; compri-mentos de lacuna de 15 bases ou menos são geralmente usados, 6 basesou menos são usados mais freqüentemente, com 2 bases ou menos, usadosainda mais freqüentemente. O termo "identidade de seqüência" significa queas seqüências são idênticas (ou seja, sobre uma base de nucleotídeo pornucleotídeo para ácidos nucléicos ou base aminoácido por aminoácido parapolipeptídeos) ao longo de uma janela de comparação. O termo "porcenta-gem de identidade de seqüência" é calculado ao comparar duas seqüênciasotimamente alinhadas ao longo da janela de comparação, determinar o nú-mero de posições nas quais ocorrem os aminoácidos ou nucleotídeos idênti-cos, em ambas as seqüências para produzir inúmeras posições combinadas,dividir o número de posições combinadas pelo número total de posições najanela de comparação, e multiplicar o resultado por 10O para obter a porcen-tagem de identidade de seqüência. Os métodos para calcular a identidadede seqüência são conhecidos pelos elementos versados na técnica e descri-tos em mais detalhes abaixo.

O termo "solúvel" como usado aqui com referência a um polipep-tídeo da invenção ou outra proteína, significa que mediante a expressão emcultura celular, ao menos alguma parte do polipeptídeo ou proteína expressapermanece na fração citoplásmica da célula e não é fracionada com os resí-duos celulares mediante Iise e centrifugação do lisado. A solubilidade de umpolipeptídeo pode ser aumentada por uma variedade de métodos reconheci-dos na técnica, inclusive fusão com uma seqüência de aminoácido heterólo-ga, deleção de resíduos de aminoácido, substituição de aminoácido (por e-xemplo, enriquecendo a seqüência com os resíduos de aminoácido quepossuem cadeias laterais hidrofílicas), e modificação química (por exemplo,adição de grupos hidrofílicos).

A solubilidade de polipeptídeos pode ser medida utilizando umavariedade de técnicas reconhecidas, inclusive, espalhamento dinâmico deluz para determinar o estado de agregação, absorção de UV, centrifugaçãopara separar o material agregado do não-agregado, e eletroforese em gelSDS (por exemplo, a quantidade de proteína na fração solúvel é comparadacom a quantidade de proteína nas frações solúveis e insolúveis combina-das). Quando expressos em uma célula hospedeira, os polipeptídeos da in-venção podem ser ao menos cerca de 1 %, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%,50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais solúveis, por exemplo, ao menos cercade 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou maisda quantidade total de proteína expressa na célula são encontrados na fra-ção citoplásmica. Em algumas modalidades, uma cultura de um litro de célu-las que expressam um polipeptídeo da invenção irá produzir ao menos cercade 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 30,40, 50 miligramas ou mais da proteínasolúvel. Em uma modalidade exemplificativa, um polipeptídeo da invenção éao menos cerca de 10% solúvel e irá produzir ao menos cerca de 1 miligra-ma de proteína de uma cultura celular de um litro.

O termo "se hibridiza especificamente" se refere à ligação deácido nucléico detectável e específica. Os polinucleotídeos, oligonucleotí-deos e ácido nucléicos da invenção se hibridizam seletivamente às cadeiasde ácido nucléico mediante hibridização e condições de lavagem que redu-zem as quantidades apreciáveis de ligação detectável a ácidos nucléicosnão-específicos. Condições severas podem ser usadas para atingir condi-ções de hibridização seletiva como conhecido na técnica e discutido aqui.Geralmente, a homologia de seqüência de ácido nucléico entre os polinucle-otídeos, oligonucleotídeos, e ácidos nucléicos da invenção e uma seqüênciade ácido nucléico de interesse será ao menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%,80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou mais. Em alguns casos, as condiçõesde hibridização e lavagem são realizadas sob condições severas de acordocom procedimentos de hibridização convencionais e como adicionalmentedescrito aqui.

Os termos "condições severas" ou "condições de hibridizaçãoseveras" se referem a condições que promovem hibridização específica en-tre duas cadeias de polinucleotídeos complementares para formar um du-plex. As condições severas podem ser selecionadas para serem cerca de5°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm) de um determinado duplex depolinucleotídeo em uma resistência iônica e pH definidos. O comprimentodas cadeias de polinucleotídeos complementares e seu teor de GC irão de-terminar o Tm do duplex, e assim as condições de hibridização necessáriaspara obter a especificidade desejada de hibridização. O Tm é a temperatura(sob resistência iônica e pH definidos) em que 50% de uma seqüência depolinucleotídeo se hibridizam a uma cadeia completar perfeitamente combi-nada. Em alguns casos pode ser desejado aumentar a severidade das con-dições de hibridização para ficar igual ao Tm de um duplex particular.

Uma variedade de técnicas para estimar o Tm está disponível.Tipicamente, os pares de bases G-C em um duplex são estimados para con-tribuir cerca de 3°C com o Tm, enquanto que os pares de bases A-T são es-timados para contribuir cerca de 2°C, até uma máxima teórica de cerca de80 a 100°C.

Entretanto, modelos mais sofisticados de Tm estão disponíveisem que interações de empilhamento G-C, efeitos de solvente, a temperaturade análise desejada e similares são levados em consideração. Por exemplo,as sondas podem ser designadas para possuir uma temperatura de dissoci-ação (Td) de aproximadamente 60°C, utilizando a fórmula: Td = (((3 χ #GC)+ (2 χ #AT)) χ 37) - 562)/#bp) - 5; onde #GC, #AT, e #bp são o número depares de bases guanina-citosina, o número de pares de bases adenina-timina, e o número de pares de bases totais, respectivamente, envolvidos naformação do duplex.

A hibridização pode ser realizada em 5x SSC, 4x SSC, 3x SSC,2x SSC, 1x SSC ou 0,2x SSC durante ao menos cerca de 1 hora, 2 horas, 5horas, 12 horas, ou 24 horas. A temperatura da hibridização pode ser au-mentada para ajustar a severidade da reação, por exemplo, de cerca de25°C (temperatura ambiente), a cerca de 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, ou 65°C.

A reação de hibridização também pode incluir outro agente que afeta a seve-ridade, por exemplo, a hibridização conduzida na presença de 50% de for-mamida aumenta a severidade de hibridização em uma temperatura definida.

A reação de hibridização pode ser seguida por uma única etapade lavagem, ou duas ou mais etapas de lavagem, que podem estar em umasalinidade e temperatura iguais ou diferentes. Por exemplo, a temperaturada lavagem pode ser aumentada para ajustar a severidade de cerca de 25°C(temperatura ambiente), a cerca de 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, ou mais.A etapa de lavagem pode ser conduzida na presença de um detergente, porexemplo, 0,1 ou 0,2% de SDS. Por exemplo, a hibridização pode ser segui-da por duas etapas de lavagem a 65°C cada durante cerca de 20 minutosem 2x de SSC, 0,1% de SDS, e opcionalmente duas etapas de lavagem adi-cionais a 65°C cada durante cerca de 20 minutos em 0,2x de SSC10,1%SDS.

As condições de hibridização severas exemplificativas incluemhibridização noturna a 65°C em uma solução que contém 50% de formami-da, 10x de Denhardt (0,2% de Ficoll, 0,2% de polivinilpirrolidona, 0,2% dealbumina do soro bovino) e 200 Mg/ml de DNA portador desnaturado, porexemplo, DNA de esperma de salmão, seguida por duas etapas de lavagema 65°C cada durante cerca de 20 minutos em 2x de SSC, 0,1% de SDS, eduas etapas de lavagem a 65°C cada durante cerca de 20 minutos em 0,2xde SSC, 0,1% de SDS.

A hibridização pode consistir na hibridização de dois ácidos nu-cléicos em solução, ou um ácido nucléico em solução a um ácido nucléicoligado a um suporte sólido, por exemplo, um filtro. Quando um ácido nucléi-co estiver sobre um suporte sólido, uma etapa de pré-hibridização pode serconduzida antes da hibridização. A pré-hibridização pode ser realizada du-rante ao menos cerca de 1 hora, 3 horas ou 10 horas na mesma solução ena mesma temperatura da solução de hibridização (sem a cadeia de polinu-cleotídeo complementar).

As condições de severidade apropriadas são conhecidas peloselementos versados na técnica ou podem ser determinadas experimental-mente pelo elemento versado na técnica. Vide, por exemplo, Current Proto-cols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-12.3.6;Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Press, N.Y.; S. Agrawal (ed.) Methods in Molecular Biology, volume20; Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Bio-logy - Hybridization With Nucleic Acid Probes, e.g., part I chapter 2 "Overvi-ew of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe as-says", Elsevier, New York; and Tibanyenda, N. et al., Eur. J. Biochem.139:19 (1984) and Ebel, S. et al., Biochem. 31 :12083 (1992).

O termo "vetor" se refere a um ácido nucléico capaz de transpor-tar outro ácido nucléico ao qual esse foi ligado. Um tipo de vetor que podeser usado de acordo com a invenção é um epissomo, ou seja, um ácido nu-cléico capaz de replicação extracromossomal. Outros vetores incluem aque-les capazes de replicação autônoma e expressão de ácidos nucléicos aosquais esses estão ligados. Os vetores capazes de dirigir a expressão de ge-nes aos quais estão ligados de maneira operável são referidos como "veto-res de expressão". Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técni-cas de DNA recombinante estão geralmente na forma de "plasmídeos" sereferem a moléculas circulares de DNA de cadeia dupla que, em sua formade vetor, não estão ligadas ao cromossomo. No presente relatório descritivo,"plasmídeo" e "vetor" são usados de maneira intercambiável como o plasmí-deo é a forma mais comumente usada de vetor. Entretanto, a invenção sedestina a incluir tais outras formas de vetores de expressão que apresentamfunções equivalentes e que ficarão conhecidas na técnica subseqüentemen-te a essa.

Os ácidos nucléicos da invenção podem ser usados como rea-gentes diagnósticos para detectar a presença ou ausência das seqüênciasde DNA ou RNA alvo às quais essas se ligam especificamente, tal como,para determinar o nível de expressão de um ácido nucléico da invenção. Emum aspecto, a presente invenção contempla um método para detectar a pre-sença de um ácido nucléico da invenção ou uma parte desse em uma amos-tra, o método das etapas de: (a) proporcionar um oligonucleotídeo com aomenos oito nucleotídeos de comprimento, sendo que o oligonucleotídeo écomplementar a uma parte de um ácido nucléico da invenção; (b) colocar ooligonucleotídeo em contato com uma amostra que contém ao menos umácido nucléico sob condições que permitem a hibridização do oligonucleotí-deo com um ácido nucléico da invenção ou uma parte desse; e (c) detectar ahibridização do oligonucleotídeo a um ácido nucléico na amostra detectando,assim, a presença de um ácido nucléico da invenção ou uma parte desse naamostra. Em outro aspecto, a presente invenção contempla um método paradetectar a presença de um ácido nucléico da invenção ou uma parte desseem uma amostra, ao (a) proporcionar um par de oligonucleotídeos de cadeiasimples, sendo que cada um possui ao menos oito nucleotídeos de compri-mento, complementares às seqüências de um ácido nucléico da invenção, eem que as seqüências às quais os oligonucleotídeos são complementaressão ao menos dez nucleotídeos à parte; e (b) colocar os oligonucleotídeosem contato com uma amostra que contém ao menos um ácido nucléico sobcondições de hibridização; (c) amplificar a seqüência de nucleotídeo entre osdois "primers" de oligonucleotídeo; e (d) detectar a presença da seqüênciaamplificada detectando, assim, a presença de um ácido nucléico da inven-ção ou uma parte desse na amostra.

Em outro aspecto da invenção, o polinucleotídeo da invenção éproporcionado em um vetor de expressão que contém uma seqüência denucleotídeo que codifica um polipeptídeo da invenção e ligado de maneiraoperável a ao menos uma seqüência reguladora. Deve ser entendido que odesenho do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a sele-ção da célula hospedeira que será transformada e/ou o tipo de proteína de-sejado a ser expresso. O número de cópias do vetor, a capacidade de con-trolar o número de cópias e a expressão de qualquer outra proteína codifica-da pelo vetor, tais como, marcadores antibióticos, devem ser considerados.

Um vetor de expressão que contém o polinucleotídeo da inven-ção pode ser então usado como um agente farmacêutico para tratar um a -nimal infectado com B. hyodysenteríae ou como uma vacina (também umagente farmacêutico) para impedir que um animal seja infectado com B.hyodysenteríae, ou para reduzir os sintomas e curso da doença se o animalfor infectado. Uma maneira de utilizar um vetor de expressão como um a-gente farmacêutico é administrar uma vacina de ácido nucléico no animalem risco de ser infectado ou no animal após ser infectado. A tecnologia devacina de ácido nucléico é bem descrita na técnica. Algumas descrições po-dem ser encontradas na Patente U.S. 6.562.376 (Hooper et al.); PatenteU.S. 5.589.466 (Feigner1 et al.); Patente U.S. 6.673.776 (Feigner1 et ai.); ePatente U.S. 6.710.035 (Feigner, et al.). As vacinas de ácido nucléico podemser injetadas no músculo ou de forma intradérmica, podem ser eletroporadasno animal (vide WO 01/23537, King et al.; e WO 01/68889, Malone et al.),através de composições lipídicas (vide Patente U.S. 5.703.055, Feigner, etal), ou outros mecanismos conhecidos no campo da técnica.

Os vetores de expressão também podem ser transfectados embactérias que podem ser administradas no animal alvo para induzir uma res-posta imune à proteína codificada pelos nucleotídeos dessa invenção conti-dos no vetor de expressão. O vetor de expressão pode conter seqüências deexpressão eucariótica de modo que os nucleotídeos dessa invenção sejamtranscritos e traduzidos no animal hospedeiro. Alternativamente, o vetor deexpressão pode ser transcrito nas bactérias e então traduzido no animalhospedeiro. As bactérias usadas como um veículo do vetor de expressãodeveriam ser atenuadas, porém permanecem invasivas. Alguém pode usarShigella spp., Salmonella spp., Escherichia spp., e Aeromonas spp., apenaspara citar algumas, que foram atenuadas, porém permanecem invasivas.

Exemplos desses métodos podem ser encontrados na Patente U.S.5.824.538 (Branstrom et al); Patente U.S. 5.877.159 (Powell, et al.); PatenteU.S. 6.150.170 (Powell, et al.); Patente U.S. 6.500.419 (Hone, et al.); e Pa-tente U.S. 6.682.729 (Powell, et al.).

Alternativamente, os polinucleotídeos dessa invenção podem sercolocados em alguns vírus que atuam um vetor. Os vetores virais podemtanto expressar as proteínas dessa invenção sobre a superfície do vírus,como transmitir os polinucleotídeos dessa invenção à célula de um animalonde o polinucleotídeo é transcrito e traduzido em uma proteína. O animalinfectado com os vetores virais pode desenvolver uma resposta imune àsproteínas codificadas pelos polinucleotídeos dessa invenção. Com isso, umapessoa pode suavizar ou prevenir uma infecção por B. hyodysenteriae noanimal que recebeu os vetores virais. Exemplos de vetores virais podem serencontrados na Patente U.S. 5.283.191 (Morgan et al.); Patente U.S.5.554.525 (Sondermeijer et al) e Patente U.S. 5.712.118 (Murphy).O polinucleotídeo da invenção pode ser usado para induzir aexpressão e superexpressão de um polipeptídeo da invenção em célulaspropagadas em cultura, por exemplo, para produzir proteínas ou polipeptí-deos, inclusive proteínas de fusão ou polipeptídeos.

Essa invenção pertence a uma célula hospedeira transfectadacom um gene recombinante para expressar um polipeptídeo da invenção. Acélula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Porexemplo, um polipeptídeo da invenção pode ser expresso em células bacte-rianas, tais como, E. coli, células de inseto (baculovírus), levedura, célulasde plantas, ou mamíferos. Naqueles casos onde a célula hospedeira é hu-mana, essa pode estar ou não em um indivíduo vivo. Outras células hospe-deiras adequadas são conhecidas pelos elementos versados na técnica. A-dicionalmente, a célula hospedeira pode ser suplementada com moléculasde tRNA não tipicamente encontradas no hospedeiro para otimizar a expres-são do polipeptídeo. Alternativamente, a seqüência de nucleotídeo pode seralterada para otimizar a expressão na célula hospedeira, a proteína produzi-da ainda poderia possuir alta homologia à proteína originalmente codificada.Outros métodos adequados para maximizar a expressão do polipeptídeoserão conhecidos pelos elementos versados na técnica.

A presente invenção pertence adicionalmente a métodos paraproduzir os polipeptídeos da invenção. Por exemplo, uma célula hospedeiratransfectada com um vetor de expressão que codifica um polipeptídeo dainvenção pode ser cultivada sob condições apropriadas para permitir queocorra a expressão do polipeptídeo. O polipeptídeo pode ser secretado eisolado de uma mistura de células e do meio que contém o polipeptídeo. Al-ternativamente, o polipeptídeo pode ser mantido de maneira citoplásmica eas células colhidas, Iisadas e a proteína isolada.

Uma cultura celular inclui células hospedeiras, meios e outrossubprodutos. Os meios adequados para cultura celular são bem-conhecidosna técnica. O polipeptídeo pode ser isolado do meio de cultura celular, célu-las hospedeiras, ou ambos utilizando técnicas conhecidas para purificaçãode proteínas, inclusive cromatografia de troca iônica, cromatografia de filtra-ção em gel, ultrafiltração, eletroforese, e purificação por imunoafinidade comanticorpos específicos para epítopos particulares de um polipeptídeo da in-venção.

Assim, uma seqüência de nucleotídeo que codifica todo ou umaparte selecionada de polipeptídeo da invenção, pode ser usada para produ-zir uma forma recombinante da proteína através de processos celulares mi-crobianos ou eucarióticos. A ligação da seqüência em uma construção depolinucleotídeo, tal como, um vetor de expressão, e transformação ou trans-fecção em hospedeiros, tanto eucarióticos (levedura, ave, inseto ou mamífe-ro) ou procarióticos (células bacterianas), são procedimentos padrão. Proce-dimentos similares, ou modificações desses, podem ser empregados parapreparar os polipeptídeos recombinantes da invenção por meios microbianosou tecnologia de cultura de tecidos.

Os vetores adequados para a expressão de um polipeptídeo dainvenção incluem plasmídeos dos tipos: plasmídeos derivados de pTrcHis,plasmídeos derivados de pET, plasmídeos derivados de pBR322, plasmí-deos derivados de pEMBL, plasmídeos derivados de pEX, plasmídeos deri-vados de pBTac e plasmídeos derivados de pUC para expressão em célulasprocarióticas, tal como, E. coli. Os vários métodos empregados na prepara-ção dos plasmídeos e transformação de organismos hospedeiros são bem-conhecidos na técnica. Para outros sistemas de expressão adequados tantopara células procarióticas como eucarióticas, bem como procedimentos re-combinantes gerais, vide, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed.,ed. por Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989) Chapters 16 and 17.

As seqüências de codificação de um polipeptídeo de interessepodem ser incorporadas como uma parte de um gene de fusão que incluiuma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo diferente. Apresente invenção contempla um polinucleotídeo isolado que contém umácido nucléico da invenção e ao menos uma seqüência heteróloga que codi-fica um peptídeo heterólogo ligado em estrutura à seqüência de nucleotídeodo ácido nucléico da invenção para codificar uma proteína de fusão que con-tém o polipeptídeo heterólogo. O polipeptídeo heterólogo pode ser fundidocom (a) o C-terminal do polipeptídeo da invenção, (b) o N-terminal do poli-peptídeo da invenção, ou (c) o C-terminal e o N-terminal do polipeptídeo dainvenção. Em certos casos, a seqüência heteróloga codifica um polipeptídeoque permite a detecção, isolamento, solubilização e/ou estabilização do poli-peptídeo com o qual essa se funde. Ainda em outras modalidades, a se-qüência heteróloga codifica um polipeptídeo, tal como, um marcador polyHis, myc, HA, GST1 proteína A, proteína G, peptídeo de ligação à calmoduli-na, tioredoxina, proteína de ligação à maltose, poli arginina, poly His-Asp,FLAG, uma parte de uma proteína imunoglobulina, e um peptídeo de transcitose.

Os sistemas de expressão de fusão podem ser úteis quando sedeseja produzir um fragmento imunogênico de um polipeptídeo da invenção.

Por exemplo, a proteína capsidial VP6 de rotavírus pode ser usada comouma proteína portadora imunológica para partes de polipeptídeo, tanto naforma monomérica como na forma de uma partícula viral. As seqüências deácido nucléico correspondentes à parte de um polipeptídeo da invenção aoqual os anticorpos devem ser elevados podem ser incorporadas em umaconstrução de gene de fusão que inclui seqüências de codificação de umaproteína estrutural do vírus da varíola para produzir um conjunto de vírusrecombinantes que expressam as proteínas de fusão que compreendemuma parte da proteína como parte do vírion. O antígeno de superfície daHepatite B também pode ser utilizado nessa função também. Similarmente,as construções quiméricas que codificam as proteínas de fusão que contêmuma parte de um polipeptídeo da invenção e a proteína capsidial do polioví-rus pode ser criada para aumentar a imunogenicidade (vide, por exemplo,Publicação EP NO: 0259149; e Evans et al., (1989) Nature 339:385; Huanget al., (1988) J. Viroi 62:3855; e Schlienger et al., (1992) J. ViroL 66:2).

As proteínas de fusão podem facilitar a expressão e/ou purifica-ção de proteínas. Por exemplo, um polipeptídeo da invenção pode ser gera-do como uma proteína de fusão da glutationa-S-transferase (GST). Tais pro-teínas de fusão de GST podem ser usadas para simplificar a purificação deum polipeptídeo da invenção, tal como, através do uso de matrizes derivati-zadas de glutationa (vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Bio-logy, eds. Ausubel et al., (N. Y.: John Wiley & Sons, 1991)). Em outra moda-lidade, um gene de fusão que codifica uma seqüência líder de purificação,tal como, uma seqüência de sítio de clivagem com poly-(His)/enteroquinaseno N-terminal da parte desejada da proteína recombinante, pode permitir apurificação da proteína de fusão expressa por cromatografia de afinidadeutilizando uma resina de metal Ni2+. A seqüência líder de purificação podeser então subseqüentemente removida por tratamento com enteroquinase para proporcionar a proteína purificada (por exemplo, vide Hochuli et al.,(1987) J. Chromatography 411:177; and Janknecht et al., PNAS USA88:8972).

As técnicas para fabricar genes de fusão são bem-conhecidas.Essencialmente, a união de vários fragmentos de DNA que codificam as se-qüências de polipeptídeo diferentes é realizada de acordo com técnicas con-vencionais, que empregam terminações com extremidade cega ou com ex-tremidade irregular para ligação, digestão com enzima de restrição para pro-porcionar terminações apropriadas, preenchimento de extremidades coesi-vas, como apropriado, tratamentos com fosfatase alcalina para evitar uniãoindesejada, e ligação enzimática. Em outra modalidade, o gene de fusãopode ser sintetizado por técnicas convencionais que incluem sintetizadoresautomáticos de DNA. Alternativamente, a amplificação por PCR de fragmen-tos de gene pode ser realizada utilizando "primers" âncora que causam res-saltos complementares entre dois fragmentos de gene consecutivos que po-dem ser subseqüentemente anelados para gerar uma seqüência de genequimérica (vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds.Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).

Em outras modalidades, a invenção proporciona ácidos nucléi-cos da invenção imobilizados sobre uma superfície sólida, inclusive, placas,placas microtiter, lâminas, microesferas, partículas, esferas, películas, fila-mentos, precipitados, géis, folhas, tubos, recipientes, capilares, adesivos,porções, etc. Os ácidos nucléicos da invenção podem ser imobilizados sobreum chip como parte de uma matriz. A matriz pode conter um ou mais polinu-cleotídeos da invenção como descrito aqui. Em uma modalidade, o chip con-tém um ou mais polinucleotídeos da invenção como parte de uma matriz deseqüências de polinucleotídeo da mesma espécie patogênica como tal(is)polinucleotídeo(s).

Em uma forma preferida da invenção proporciona-se polipeptí-deos isolados da B. hyodysenteriae como descrito aqui, e também as se-qüências de polinucleotídeo que codificam esses polipeptídeos. De maneiramais desejada, os polipeptídeos da B. hyodysenteriae são proporcionadosem forma substancialmente purificada.

Os polipeptídeos preferidos da invenção terão uma ou mais pro-priedades biológicas (por exemplo, propriedades in vivo, in vitro ou imunoló-gicas) do polipeptídeo de comprimento total nativo. Os polipeptídeos não-funcionais também estão incluídos dentro do escopo da invenção, pois es-ses podem ser úteis, por exemplo, como antagonistas dos polipeptídeosfuncionais. As propriedades biológicas de análogos, fragmentos, ou deriva-dos com relação ao tipo selvagem podem ser determinadas, por exemplo,por meio de análises biológicas.

Os polipeptídeos, inclusive análogos, fragmentos e derivados,podem ser preparados de forma sintética (por exemplo, utilizando as técni-cas bem-conhecidas de síntese peptídica em fase sólida ou em fase de so-lução). De preferência, empregam-se técnicas sintéticas em fase sólida. Al-ternativamente, os polipeptídeos da invenção podem ser preparados utili-zando técnicas de engenharia genética bem-conhecidas, como descrito in-fra. Ainda em outra modalidade, os polipeptídeos podem ser purificados (porexemplo, por purificação por imunoafinidade) de um fluido biológico, tal co-mo, porém sem caráter limitativo, plasma, fezes, soro, ou urina de animais,inclusive, porém sem caráter limitativo, porco, galinha, ganso, pato, peru,periquito, ser humano, macaco, cão, gato, cavalo, hamster, gerbil, coelho,furão, gado e carneiro. Um animal pode ser qualquer mamífero ou ave.

Os análogos de polipeptídeo da B. hyodysenteriae incluem a-queles polipeptídeos que possuem a seqüência de aminoácido, em que umou mais aminoácidos são substituídos por outro aminoácido, tais substitui-ções não alteram substancialmente a atividade biológica da molécula.

De acordo com a invenção, os polipeptídeos da invenção produ-zidos de forma recombinante ou por síntese química e fragmentos ou outrosderivados ou análogos desses, inclusive proteínas de fusão, podem ser usa-dos como um antígeno para gerar anticorpos que reconhecem os polipeptídeos.

Uma molécula é "antigênica" quando é capaz de interagir espe-cificamente com uma molécula de reconhecimento do antígeno do sistemaimune, tal como, imunoglobulina (anticorpo) ou receptor de antígeno de célu-la T. Uma seqüência de aminoácido antigênica contém ao menos cerca de5, e de preferência, ao menos cerca de 10, aminoácidos. Uma parte antigê-nica de uma molécula pode ser a parte que é imunodominante para reco-nhecimento de anticorpo ou de receptor de célula T, ou pode ser uma parteusada para gerar um anticorpo à molécula ao conjugar a parte antigênicacom uma molécula portadora para imunização. A própria molécula que éantigênica não precisa ser imunogênica, ou seja, capaz de obter uma res-posta imune sem um veículo.

Um "anticorpo" é qualquer imunoglobulina, inclusive anticorpos efragmentos desses, que se liga a um epítopo específico. O termo abrangeanticorpos policlonais, monoclonais, e quiméricos, o último mencionado estádescrito em mais detalhe na Patente Nos. U.S. 4.816.397 e 4.816.567, bemcomo partes de ligação a antígeno de anticorpos, inclusive Fab, F(ab')2 eF(v) (inclusive anticorpos de cadeia única). Conseqüentemente, a expressão"molécula de anticorpo" em suas várias formas gramaticais como usado aquicontempla tanto a molécula de imunoglobulina intacta como parte imunologi-camente ativa de uma molécula de imunoglobulina que contém o sítio decombinação de anticorpo. Um "sítio de combinação de anticorpo" é aquelaparte estrutural de uma molécula de anticorpo compreendida de regiões va-riáveis e hipervariáveis de cadeia pesada e leve que ligam especificamenteum antígeno.

As moléculas de anticorpo exemplificativas são moléculas deimunoglobulina intactas, moléculas de imunoglobulina substancialmente in-tactas e aquelas partes de uma molécula de imunoglobulina que contêm oparátopo, inclusive aquelas partes conhecidas na técnica como Fab, Fab',F(ab')2 e F(v), tais partes são preferidas para uso nos métodos terapêuticosdescritos aqui.

As partes Fab e F(ab')2 de moléculas de anticorpo são prepara-das pela reação proteolítica de papaína e pepsina, respectivamente, sobremoléculas de anticorpo substancialmente intactas por métodos que sãobem-conhecidos. Vide, por exemplo, Patente N9 U.S. 4.342.566 de Theofilo-polous et al. As partes de molécula de anticorpo Fab' também são bem-conhecidas e são produzidas a partir das partes F(ab')2 seguida pela redu-ção com mercaptoetanol das ligações de bissulfeto que ligam as duas partesde cadeia pesada, e seguida pela alquilação da proteína resultante mercap-tano com um reagente, tal como, iodoacetamida. Um anticorpo que contémmoléculas de anticorpo intactas é preferido aqui.

A expressão "anticorpo monoclonal" em suas várias formas gra-maticais se refere a um anticorpo que possui apenas uma espécie de sítiode combinação de anticorpo capaz de imunoreagir com um antígeno particu-lar. Um anticorpo monoclonal apresenta, assim, tipicamente uma única afini-dade de ligação para qualquer antígeno com o qual esse imunoreage. Umanticorpo monoclonal pode conter, portanto, uma molécula de anticorpo quepossui uma pluralidade de sítios de combinação de anticorpo, cada um imu-noespecífico a um antígeno diferente; por exemplo, um anticorpo monoclo-nal biespecífico (quimérico).

O termo "adjuvante" se refere a um composto ou mistura queaumenta a resposta imune a um antígeno. Um adjuvante pode servir comoum depósito de tecido que libera lentamente o antígeno e também como umativador de sistema linfático que aumenta de maneira não-específica a res-posta imune [Hood et al., em Immunology, p. 384, Second Ed., Benja-min/Cummings, Menlo Park, Califórnia (1984)]. Geralmente, um desafio pri-mário com um antígeno sozinho, na ausência de um adjuvante, não conse-guirá obter uma resposta imune humoral ou celular. Os adjuvantes incluem,porém sem caráter limitativo, adjuvante completo de Freund, adjuvante in-completo de Freund, saponina, géis minerais, tal como, hidróxido de alumí-nio, substâncias ativas de superfície, tais como, lisolecitina, polióis plurôni-cos, poliânions, peptídeos, óleo ou emulsões de hidrocarboneto, hemociani-nas de molusco, dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencialmente úteistais como, BCG (bacilo Calmette-Gueriri) e Corynebacterium parvum. Depreferência, o adjuvante é farmaceuticamente aceitável.

Vários procedimentos conhecidos na técnica podem ser usadospara a produção de anticorpos policlonais aos polipeptídeos da invenção.

Para a produção de anticorpo, vários animais hospedeiros podem ser imuni-zados por injeção com o polipeptídeo da invenção, inclusive, porém sem ca-ráter limitativo, coelhos, camundongos, ratos, carneiro, cabras, etc. Em umamodalidade, um polipeptídeo da invenção pode ser conjugado a um veículoimunogênico, por exemplo, albumina do soro bovino (BSA) ou hemocianinade molusco (KLH). Vários adjuvantes podem ser usados para aumentar aresposta imunológica, dependendo da espécie de hospedeiro, inclusive, po-rém sem caráter limitativo, adjuvante de Freund (completo e incompleto),géis minerais, tais como, hidróxido de alumínio, substâncias ativas de super-fície, tais como, lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emul-sões de óleo, hemocianinas de molusco, dinitrofenol, e adjuvantes humanospotencialmente úteis, tais como, BCG (bacilo Calmette-Guerin) e Corynebac-terium parvum.

Para a preparação de anticorpos monoclonais frente a um poli-peptídeo da invenção, qualquer técnica que proporciona a produção de mo-léculas de anticorpo por linhagens celulares contínuas em cultura pode serusada. Essas incluem, porém sem caráter limitativo, técnica de hibridomaoriginalmente desenvolvida por Kohler et al, (1975) Nature, 256:495-497, atécnica de trioma, a técnica de hibridoma de célula B humano [Kozbor et al,(1983) Immunology Today, 4:72], e a técnica de hibridoma EBV para produ-zir anticorpos monoclonais humanos [Cole et al., (1985) em Monoclonal An-tibodies and Câncer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc.]. Linhagens celu-lares produtoras de anticorpo imortais podem ser criadas por técnicas, exce-to fusão, tal como, transformação direta de linfócitos B com DNA oncogêni-co, ou transfecção com vírus Epstein-Barr. Vide, por exemplo, Patente Nos.U.S. 4.341.761 ; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887; 4.451.570; 4.466.917;4.472.500; 4.491.632; e 4.493.890.

Em uma modalidade adicional da invenção, os anticorpos mono-clonais podem ser produzidos em animais isentos de germes utilizando umatecnologia recente. De acordo com a invenção, anticorpos de galinha ou su-ínos podem ser usados e obtidos ao utilizar hibridomas de galinha ou suínosou ao transformar as células B com vírus EBV in vitro. Na verdade, de acor-do com a invenção, as técnicas desenvolvidas para a produção de "anticor-pos quiméricos" [Morrison et al., (1984) J. Bacteriol., 159-870; Neuberger etal, (1984) Nature, 312:604-608; Takeda et al., (1985) Nature, 314:452-454]ao juntar os genes de uma molécula de anticorpo de camundongo específicade um polipeptídeo da invenção com os genes de uma molécula de anticor-po de atividade biológica apropriada podem ser usadas; tais anticorpos es-tão dentro do escopo dessa invenção. Tais anticorpos quiméricos são prefe-ridos para uso na terapia de doenças ou distúrbios intestinais (descritos in-fra), visto que é muito menos provável que os anticorpos, que não, anticor-pos xenogênicos induzam uma resposta imune, em particular uma respostaalérgica, por si só.

De acordo com a invenção, as técnicas descritas para a produ-ção de anticorpos de cadeia simples (Patente U.S. 4.946.778) podem seradaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples específicos para umpolipeptídeo da invenção. Uma modalidade adicional da invenção utiliza astécnicas descritas para a construção de bibliotecas de expressão Fab [Huseet al., (1989) Science, 246:1275-1281] para permitir uma identificação rápidae fácil de fragmentos Fab monoclonais com a especificidade desejada de umpolipeptídeo da invenção.

Os fragmentos de anticorpo, que contêm o idiótipo da moléculade anticorpo, podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, taisfragmentos incluem, porém sem caráter limitativo: o fragmento F(ab')2 quepode ser produzido por digestão de pepsina da molécula de anticorpo; osfragmentos Fab' que podem ser gerados ao reduzir as pontes de bissulfetodo fragmento F(ab')2, e os fragmentos Fab que podem ser gerados ao tratara molécula de anticorpo com papaína e um agente de redução.

Na produção de anticorpos, a classificação do anticorpo deseja-do pode ser realizada por técnicas conhecidas, por exemplo, radioimunoen-saio, ELISA, imunoensaios em "sanduíche", ensaios imunorradiométricos,reações de precipitina de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, imuno-ensaios in situ (utilizando ouro coloidal, enzima ou marcadores de radioisó-topo, por exemplo), Western blots, reações de precipitação, ensaios de aglu-tinação (por exemplo, ensaios de aglutinação em gel, ensaios de hemagluti-nação), ensaios de fixação complementares, ensaios de imunofluorescência,ensaios de proteína A, ensaios de imunoeletroforese, etc. Em uma modali-dade, a ligação de anticorpo é detectada ao detectar um marcador sobre oanticorpo primário. Em outra modalidade, o anticorpo primário é detectadoao detectar a ligação de um anticorpo secundário ou reagente ao anticorpoprimário. Em uma modalidade adicional, o anticorpo secundário é marcado.

Muitos meios são conhecidos na técnica para detectar a ligação em um imu-noensaio e estão dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, paraselecionar os anticorpos que reconhecem um epítopo específico de um poli-peptídeo da invenção, alguém pode avaliar os hibridomas gerados de umproduto que se liga a um fragmento de um polipeptídeo da invenção quecontém tal epítopo.

A invenção também abrange métodos diagnósticos e prognósti-cos para detectar a presença de B. hyodysenteríae utilizando um polipeptí-deo da invenção e/ou anticorpos que se ligam ao polipeptídeo da invenção ekits úteis para a diagnose e prognose de infecções causadas pela B. hyody-senteríae.

Os métodos diagnósticos e prognósticos serão geralmente con-duzidos utilizando uma amostra biológica obtida de um animal, tal como, ga-linha ou suíno. Uma "amostra" se refere ao tecido ou fluido de um animalsuspeito de conter uma espécie de Brachyspira, tal como, B. hyodysenteria-e, ou seus polinucleotídeos ou seus polipeptídeos. Exemplos de tais tecidosou fluidos incluem, porém sem caráter limitativo, plasma, soro, material fecal,urina, pulmão, coração, músculo esquelético, estômago, intestinos, e consti-tuintes de culta celular in vitro.

A invenção proporciona métodos para detectar a presença deum polipeptídeo da invenção em uma amostra, com as seguintes etapas: (a)colocar uma amostra suspeita de conter um polipeptídeo da invenção emcontato com um anticorpo (de preferência, ligado a um suporte sólido) quese liga especificamente ao polipeptídeo da invenção sob condições quepermitem a formação de complexos de reação que compreendem o anticor-po e o polipeptídeo da invenção; e (b) detectar a formação de complexos dereação que compreende o anticorpo e polipeptídeo da invenção na amostra,onde a detecção da formação de complexos de reação indica a presença dopolipeptídeo da invenção na amostra.

De preferência, o anticorpo usado nesse método é derivado deum anticorpo policlonal purificado por afinidade, e com mais preferência, umanticorpo monoclonal. Ademais, prefere-se que as moléculas de anticorpousadas aqui estejam na forma de partes de Fab, Fab', F(ab')2 ou F(v) ou mo-léculas de anticorpo totais.

Os métodos particularmente preferidos para detectar B. hyody-senteriae com base no método acima incluem ensaios imunossorventes li-gados à enzima, radioimunoensaios, ensaios imunorradiométricos e ensaiosimunoenzimáticos, inclusive ensaios em sanduíche utilizando anticorposmonoclonais e/ou policlonais.

Três tais procedimentos que são especialmente úteis utilizamcada polipeptídeo da invenção (ou um fragmento desse) marcado com ummarcador detectável, anticorpo Abi marcado com um marcador detectável,ou anticorpo Ab2 marcado com um marcador detectável. Os procedimentospodem ser resumidos pelas seguintes equações onde o asterisco indica quea partícula é marcada e "AA" sustenta o polipeptídeo da invenção:

A. AA* + Abi=AA*Abi

B. AA + Ab*i= AA Abi*

C. AA + Ab1 + Ab2* = Abi AA Ab2*Os procedimentos e sua aplicação são familiares ao elementoversado na técnica e conseqüentemente podem ser utilizados dentro do es-copo da presente invenção. O procedimento "competitivo", Procedimento A,está descrito na Patente Nos. U.S. 3.654.090 e 3.850.752. O ProcedimentoB é representativo de técnicas de ensaio competitivo bem-conhecidas. OProcedimento C, o procedimento em "sanduíche", está descrito na PatenteNos. U.S. RE 31.006 e 4.016.043. Ainda outros procedimentos são conheci-dos, tal como, o "anticorpo duplo" ou "procedimento DASP", e podem serusados.

Em cada caso, o polipeptídeo da invenção forma complexos comum ou mais anticorpo(s) ou parceiros de ligação e um elemento do complexoé marcado com um marcador detectável. O fato de um complexo ser forma-do, se desejado, a quantidade desse, pode ser determinado por métodosconhecidos aplicáveis para a detecção de marcadores.

Será observado a partir da descrição acima que uma proprieda-de característica de Ab2 é irá reagir com Abi. Essa reação se deve ao fatode Abi, elevado em uma espécie de mamífero, ser usado em outras espé-cies como um antígeno para elevar o anticorpo, Ab2. Por exemplo, Ab2 podeser elevado em cabras utilizando anticorpos de coelho como antígenos. Ab2,portanto, seria anticorpo anticoelho em cabras. Para propósitos dessa des-crição e reivindicações, Abi será referido como um anticorpo primário, e Ab2será referido como um anticorpo secundário ou anti-Abi.

Os marcadores mais comumente empregados nesses estudossão elementos radioativos, enzimas, produtos químicos que exibir fluores-cência quando expostos à luz ultravioleta, e outras. Exemplos de materiaisfluorescentes capazes de serem utilizados como marcadores incluem fluo-resceína, rodamina e auramina. Um material de detecção particular é umanticorpo anticoelho em cabras e conjugado com fluoresceína através de umisotiocianato. Exemplos de isótopo preferido incluem 3H, 14C, 32P, 35S1 36CI,51Cr, 57Co, 58Co1 59Fe, 90Y, 125I, 131I1 e 186Re. O marcador radioativo pode serdetectado por qualquer um dos procedimentos de contagem atualmente dis-poníveis. Embora muitas enzimas possam ser usadas, exemplos de enzimaspreferidas são peroxidase, β-glucuronidase, β-D-glucosidase, β-D-galactosidase, urease, glicose oxidase mais peroxidase e fosfatase alcalina.As enzimas são conjugadas com a partícula selecionada por reação commoléculas de ligação, tais como, carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldeídoe similares. Os marcadores de enzima podem ser detectados por quaisquertécnicas colorimétricas, espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas,amperométricas ou gasométricas atualmente utilizadas. A Patente Nos. U.S.3.654.090; 3.850.752; e 4.016.043 é referida a título de exemplo para des-crição de material e métodos de marcação alternados.

A invenção também proporciona um método para detectar anti-corpos a um polipeptídeo da invenção em amostras biológicas, utilizando asseguintes etapas: (a) proporcionar um polipeptídeo da invenção ou um frag-mento desse; (b) incubar uma amostra biológica com o dito polipeptídeo dainvenção sob condições que permitem a formação de um complexo antíge-no-anticorpo; e (c) determinar se um complexo antígeno-anticorpo com opolipeptídeo da invenção foi formado.

Em outra modalidade da invenção proporcionam-se métodos invitro para avaliar o nível de anticorpos em um polipeptídeo da invenção emuma amostra biológica utilizando as seguintes etapas: (a) detectar a forma-ção de complexos de reação em uma amostra biológica de acordo com ométodo observado acima; e (b) avaliar a quantidade de complexos de rea-ção formados, tal quantidade de complexos de reação corresponde ao nívelde polipeptídeo da invenção na amostra biológica.

Ademais, proporcionam-se métodos in vitro para monitorar otratamento terapêutico de uma doença associada com B. hyodysenteriae emum hospedeiro animal ao avaliar, como descrito acima, os níveis de anticor-pos em um polipeptídeo da invenção em uma série de amostras biológicasobtidas em pontos de tempo diferentes de um hospedeiro animal que ésubmetido a tal tratamento terapêutico.

A presente invenção proporciona adicionalmente métodos paradetectar a presença ou ausência de B. hyodysenteriae em uma amostra bio-lógica ao: (a) colocar a amostra biológica em contato com uma sonda depolinucleotídeo ou primer de polinucleotídeo da invenção sob condições dehibridização adequadas; e (b) detectar qualquer duplex formado entre asonda ou primer e ácido nucléico na amostra.

De acordo com uma modalidade da invenção, a detecção de B.hyodysenteriae pode ser realizada ao amplificar diretamente as seqüências depolinucleotídeo da amostra biológica, utilizando técnicas conhecidas e entãoao detectar a presença de polinucleotídeo das seqüências da invenção.

Em uma forma da invenção, a seqüência de ácido nucléico alvoé amplificada por PCR e então detectada utilizando quaisquer métodos es-pecíficos mencionados acima. Outras técnicas de diagnóstico úteis para de-tectar a presença de seqüências de polinucleotídeo incluem, porém sem ca-ráter limitativo: 1) PCR alelo-específica; 2) análise de conformação de ca-deia simples; 3) eletroforese em gel de gradiente desnaturante; 4) ensaiosde proteção RNase; 5) o uso de proteínas que reconhecem erros de parea-mento de nucleotídeo, tais como, a proteína de mutS de E. colr, 6) oligonu-cleotídeos alelo-específicos; e 7) hibridização fluorescente in situ.

Além dos métodos acima as seqüências de polinucleotídeo po-dem ser detectadas utilizando tecnologia de sonda convencional. Quando assondas forem usadas para detectar a presença das seqüências de polinu-cleotídeo desejadas, a amostra biológica que será analisada, tal como, san-gue ou soro, podem ser tratadas, se desejado, para extrair os ácidos nucléi-cos. A amostra de seqüências de polinucleotídeo pode ser preparada de di-versas maneiras para facilitar a detecção da seqüência alvo; por exemplo,desnaturação, digestão de restrição, eletroforese ou dot blotting. A regiãoalmejada da amostra de seqüência de polinucleotídeo geralmente deve serao menos parcialmente de cadeia simples para formar híbridos com a se-qüência alvo da sonda. Se a seqüência for naturalmente de cadeia simples,a desnaturação não será requerida. Entretanto, se a seqüência for de cadeiadupla, a seqüência provávelmente precisará ser desnaturada. A desnatura-ção pode ser realizada por várias técnicas conhecidas.

A amostra de seqüências de polinucleotídeo e sondas são incu-badas sob condições que promovem formação híbrida estável da seqüênciaalvo na sonda com a suposta seqüência de polinucleotídeo desejada na a -mostra. De preferência, condições de alta severidade são usadas para im-pedir falsos positivos.

A detecção, se alguma, do híbrido resultante é geralmente reali-zada pelo uso de sondas marcadas. Alternativamente, a sonda pode sernão-marcada, porém pode ser detectável por ligação específica com um Ii-gante que é marcado, tanto direta como indiretamente. Os marcadores emétodos adequados para marcar sondas e Iigantes são conhecidos na téc-nica, e incluem, por exemplo, marcadores radioativos que podem ser incor-porados por métodos conhecidos (por exemplo, tradução por cortes, métodode iniciador aleatório ou método de quinase), biotina, grupos fluorescentes,grupos quimiluminescentes (por exemplo, dioxetanos, particularmente dioxe-tanos ativados), enzimas, anticorpos e similares. Variações desse esquemabásico são conhecidas na técnica, e incluem aquelas variações que facilitama separação dos híbridos que serão detectados a partir de materiais estra-nhos e/ou que amplificam o sinal da porção marcada.

Também contempla-se dentro do escopo dessa invenção que osensaios de sonda de ácido nucléico dessa invenção podem empregar um co-quetel de sonda de ácido nucléico capaz de detectar as seqüências de polinu-cleotídeo desejadas dessa invenção. Assim, em um exemplo para detectar apresença de seqüências de polinucleotídeo dessa invenção em uma amostracelular, mais de uma sonda complementar a uma seqüência de polinucleotí-deo é empregada e em particular o número de sondas diferentes é alternati-vamente 2, 3, ou 5 seqüências de sonda de ácido nucléico diferentes.

As seqüências de polinucleotídeo descritas aqui (de preferência,na forma de sondas) também podem ser imobilizadas em um suporte emfase sólida para a detecção de espécies de Brachyspira, inclusive, porémsem caráter limitativo, B. hyodysenteriae, B. intermedia, B. alvinipulli, B. aal-borgi, B. innocens, B. murdochii e B. pilosicoli. Alternativamente, as seqüên-cias de polinucleotídeo descritas aqui formarão parte de uma biblioteca demoléculas de DNA que pode ser usada para detectar simultaneamente inú-meros genes diferentes de espécie Brachyspira, tal como, B. hyodysenteria-e. Em uma forma alternativa adicional as seqüências de polinucleotídeo dainvenção descritas aqui juntamente com outras seqüências de polinucleotí-deo (tais como, de outras bactérias ou vírus) podem ser imobilizadas sobreum suporte sólido de tal maneira que permita a identificação da presença deuma espécie de Brachyspira, tal como, B. hyodysenteriae e/ou qualquer ou-tra seqüência de polinucleotídeo ligada sobre o suporte sólido.

As técnicas para produzir bibliotecas imobilizadas de moléculasde DNA foram descritas. Geralmente, a maioria dos métodos da técnica an-terior descreve a síntese de bibliotecas de molécula de ácido nucléico decadeia simples, utilizando, por exemplo, técnicas de mascaramento paraconstituir diversas permutações de seqüências nas várias posições distintassobre o substrato sólido. A Patente N9 U.S. 5.837.832 descreve um métodoaprimorado para produzir matrizes de DNA imobilizado em substratos desilício com base em tecnologia de integração em larga escala. Em particular,a Patente Ne U.S. 5.837.832 descreve uma estratégia chamada "tiling" parasintetizar conjuntos específicos de sondas em locais espacialmente defini-dos sobre um substrato que pode ser usado para produzir as bibliotecas deDNA imobilizado da presente invenção. A Patente Nq U.S. 5.837.832 tam-bém proporciona referências de técnicas anteriores que também pode serusadas. Assim, as sondas de seqüência de polinucleotídeo podem ser sinte-tizadas in situ sobre a superfície do substrato.

Alternativamente, as moléculas de cadeia simples podem sersintetizadas fora do substrato sólido e cada seqüência pré-formada aplicadaa uma posição distinta sobre o substrato sólido. Por exemplo, as seqüênciasde polinucleotídeo podem ser impressas diretamente sobre o substrato utili-zando dispositivos robóticos equipados tanto com pinos como dispositivospiezoelétricos.

As seqüências de biblioteca são tipicamente imobilizadas sobreou em regiões distintas de um substrato sólido. O substrato pode ser porosopara permitir a imobilização dentro do substrato ou substancialmente não-poroso, em tal caso as seqüências da biblioteca são tipicamente imobiliza-das sobre a superfície do substrato. O substrato sólido pode ser feito dequalquer material ao qual os polipeptídeos podem se ligar, tanto direta comoindiretamente. Exemplos de substratos sólidos adequados incluem vidroplano, tablete de silício, mica, cerâmicas e polímeros orgânicos, tais como,plásticos, inclusive poliestireno e polimetacrilato. Também pode ser possívelusar membranas semipermeáveis, tais como, nitrocelulose ou membranasde náilon, que estão amplamente disponíveis. As membranas semipermeá-veis podem ser montadas sobre uma superfície sólida mais forte, tal como,vidro. As superfícies podem ser opcionalmente cobertas com uma camadade metal, tal como, ouro, platina ou outro metal de transição.

De preferência, o substrato sólido é geralmente um material quepossui uma superfície rígida ou semi-rígida. Em modalidades preferidas, aomenos uma superfície do substrato será substancialmente plana, emboraem algumas modalidades possa ser desejado separar fisicamente as regi-ões de síntese de polímeros diferentes com, por exemplo, regiões elevadasou sulcos gravados. Também prefere-se que o substrato sólido seja ade-quado para a aplicação de alta densidade de seqüências de DNA em áreasdistintas de tipicamente 50 a 100 pm, obtendo uma densidade de 10000 a40000 pontos/cm"2.

O substrato sólido é convenientemente dividido em seções. Issopode ser obtido por técnicas, tais como, fotogravura, ou pela aplicação detintas hidrofóbicas, por exemplo, tintas à base de teflon (Cel-line, USA).

As posições distintas, onde cada elemento diferente da bibliote-ca fica localizado podem possuir qualquer formato conveniente, por exem-plo, circular, retangular, elíptico, cuneiforme, etc.

A fixação das seqüências de polinucleotídeo ao substrato podeser por meios covalentes ou não-covalentes. As seqüências de polinucleotí-deo podem ser fixadas ao substrato através de uma camada de moléculas àqual as seqüências de biblioteca se ligam. Por exemplo, as seqüências depolinucleotídeo podem ser marcadas com biotina e o substrato coberto comavidina e/ou estreptavidina. Uma característica conveniente de utilizar se-qüências de polinucleotídeo biotiniladas é que a eficiência de acoplamentoao substrato sólido pode ser facilmente determinada. Uma vez que as se-qüências de polinucleotídeo podem se ligar apenas de maneira insatisfatóriaa alguns substratos sólidos, é geralmente necessário proporcionar uma in-terface química entre o substrato sólido (tal como no caso de vidro) e as se-qüências de ácido nucléico. Exemplos de interfaces químicas adequadasincluem hexaetileno glicol. Outro exemplo é o uso de vidro coberto com poli-lisina, a polilisina é então quimicamente modificada utilizando procedimentospadrão para introduzir um Iigante de afinidade. Outros métodos para fixarmoléculas às superfícies de substrato sólido pelo uso de agentes de aco-plamento são conhecidos na técnica, vide, por exemplo, W098/49557.

A ligação de seqüências de polinucleotídeo complementares àbiblioteca de ácido nucléico imobilizado pode ser determinada por uma vari-edade de meios, tais como, alterações nas características ópticas da se-qüência de polinucleotídeo ligada (ou seja, pelo uso de brometo de etídio) oupelo uso de ácidos nucléicos marcados, tais como, polipeptídeos marcadoscom fluoróforos. Outras técnicas de detecção que não requerem o uso demarcadores incluem técnicas ópticas, tais como, otoacústica, refletometria,elipsometria e ressonância de plásmon de superfície (vide W097/49989).

Assim, a presente invenção proporciona um substrato sólido quepossui ao menos um polinucleotídeo da presente invenção imobilizado sobreesse, de preferência, duas ou mais seqüências de polinucleotídeo diferentesda presente invenção.

A presente invenção também pode ser usada como um profiláti-co ou terapêutico, que pode ser utilizado para o propósito de estimular res-postas humorais e mediadas por células em animais, tais como, galinhas esuíno proporcionando, assim, proteção contra colonização com espécie deBrachyspira, inclusive, porém sem caráter limitativo, B. hyodysenteriae, B.intermedia, B. aivinipuili, B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii e B. piiosicoli.A infecção natural com uma espécie de Brachyspira, tal como, B. hyodysen-teriae induz titragens de anticorpo circulante contra as proteínas descritasaqui. Portanto, as seqüências de aminoácido descritas aqui ou partes des-sas, possuem o potencial para formar a base de um profilático ou terapêuti-co administrado de maneira sistêmica ou oral para proporcionar proteçãocontra espiroquetose intestinal.

Conseqüentemente, em uma modalidade a presente invençãoproporciona as seqüências de aminoácido descritas aqui ou fragmentosdessas ou anticorpos que ligam as seqüências de aminoácido ou as se-qüências de polinucleotídeo descritas aqui em uma quantidade terapeutica-mente eficaz misturada com um veículo, diluente, ou excipiente farmaceuti-camente aceitável.

A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" é usada aquipara se referir a uma quantidade suficiente para reduzir em ao menos 15%,de preferência, ao menos 50%, com mais preferência, em ao menos 90%, ecom mais preferência, prevenir, um déficit clinicamente significativo na ativi-dade, função e resposta de hospedeiro animal. Alternativamente, uma quan-tidade terapeuticamente eficaz é suficiente para causar um aprimoramentoem uma condição clinicamente significativa no hospedeiro animal.

A expressão "farmaceuticamente aceitável" se refere a entida-des moleculares e composições que são fisiologicamente toleráveis e nãoproduzem tipicamente uma reação alérgica ou similarmente desconfortável,tal como, distúrbio gástrico e similares, quando administradas em um animal.

O termo "veículo" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente, ou transpor-tador com o qual o composto é administrado. Tais veículos farmacêuticospodem ser líquidos estéreis, tais como, água e óleos, inclusive aqueles deorigem petrolífera, animal, vegetal ou sintética, tal como, óleo de amendoim,óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. A água e soluçõessalinas e dextrose aquosa e soluções de glicerol são, de preferência, em-pregadas como veículos, particularmente para soluções injetáveis. Os veícu-los farmacêuticos adequados são descritos em Martin, Remington1S Phar-maceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, (1990).

Em uma forma mais específica da invenção proporcionam-secomposições farmacêuticas que compreendem quantidades terapeuticamen-te eficazes das seqüências de aminoácido descritas aqui ou um análogo,fragmento ou produto derivado dessas ou anticorpos juntamente com diluen-tes, conservantes, solubilizantes, emulsificantes, adjuvantes e/ou veículosfarmaceuticamente aceitáveis. Tais composições incluem diluentes de teorde tampão variado (por exemplo, Tris-HCI, acetato, fosfato), pH e resistênciaiônica e aditivos, tais como, detergentes e agentes solubilizantes (por exem-plo, Tween 80, Polisorbato 80), antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico,metabissulfito de sódio), conservantes (por exemplo, Thimersol, álcool ben-zílico) e substâncias avolumadoras (por exemplo, lactose, manitol). O mate-rial pode ser incorporado em preparações de particulado de compostos po-liméricos, tais como, ácido polilático, ácido poliglicólico, etc. ou em Iiposso-ma. Ácido hilaurônico também pode ser usado. Tais composições podeminfluenciar o estado físico, estabilidade, taxa de liberação in vivo, e taxa dedepuração in vivo das presentes proteínas e derivados. Vide, por exemplo,Martin, Remington1S Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publi-shing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435 a 1712 que está incorporadaaqui a título de referência. As composições podem ser preparadas em formalíquida, ou podem estar em forma de pó seco, tal como, forma liofilizada.

Alternativamente, os polinucleotídeos da invenção podem serotimizados para expressão em plantas (por exemplo, milho). A planta podeser transformada por plasmídeos que contêm os polinucleotídeos otimiza-dos. Então, a planta se desenvolve, e as proteínas da invenção são expres-sas na planta, ou a versão otimizada por planta é expressa. A planta é entãocolhida, e a seção da planta que contém as proteínas da invenção é proces-sada em alimento para o animal. Esse alimento irá conferir imunidade contraB. hyodysenteriae quando mastigado pelo animal. Exemplos da técnica an-terior que detalham esses métodos podem ser encontrados na Patente U.S.5.914.123 (Arntzen, et al.); Patente U.S. 6.034.298 (Lam, et al.); e PatenteU.S. 6.136.320 (Arntzen, et al.)

Será avaliado que as composições farmacêuticas proporciona-das de acordo com a invenção podem ser administradas por qualquer meioconhecido na técnica. De preferência, as composições farmacêuticas paraadministração são administradas por injeção, oralmente, ou pela rota pulmo-nar, ou nasal. As seqüências de aminoácido descritas aqui ou anticorposderivados dessas são mais preferivelmente distribuídos por rotas intraveno-43sas, intra-arteriais, intraperitoniais, intramusculares, ou subcutâneas de ad-ministração. Alternativamente, a seqüência de aminoácido descrita aqui ouanticorpos derivados dessa, devidamente formulada, pode ser administradapor administração nasal ou oral.

O uso de seqüências de polinucleotídeo da invenção também éabrangido pela presente invenção, bem como as seqüências de polinucleo-tídeo anti-senso e ribozima a uma seqüência de polinucleotídeo que codificauma seqüência de aminoácido de acordo com a invenção, para a fabricaçãode um medicamento para a modulação de uma doença associada com B.hyodysenteriae.

As seqüências de polinucleotídeo que codificam as construçõesanti-senso ou ribozimas para uso em métodos terapêuticos são diretamenteadministradas de maneira desejada como uma construção de ácido nucléiconua. A absorção de construções de ácido nucléico nuas por células bacteri-anas é aumentada por diversas técnicas de transfecção conhecidas, por e-xemplo, aquelas que incluem o uso de agentes de transfecção. Exemplodesses agentes incluem agentes catiônicos (por exemplo, fosfato de cálcio eDEAE-dextrano) e lipofectantes. Tipicamente, as construções de ácido nu-cléico são misturadas com o agente de transfecção para produzir uma composição.

Alternativamente, a construção anti-senso ou ribozimas pode sercombinada com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável ou paraproduzir uma composição farmacêutica. Os veículos e diluentes adequadosincluem soluções salinas isotônicas, por exemplo, salina tamponada comfosfato. A composição pode ser formulada para administração parenteral,intramuscular, intravenosa, subcutânea, intra-ocular, oral ou transdérmica.As rotas de administração descritas são destinadas apenas como um guiavisto que um médico experiente será capaz de determinar facilmente a rotaotimizada de administração e qualquer dosagem para qualquer animal econdição particular.

A invenção também inclui kits para classificar animais suspeitosde estarem infectados com uma espécie de Brachyspira, tal como, B. hyody-senteriae ou para confirmar que um animal está infectado com uma espéciede Brachyspira, tal como, B. hyodysenteríae. Em uma modalidade adicionaldessa invenção, os kits adequados para uso por um especialista podem serpreparados para determinar a presença ou ausência de espécie Brachyspi-ra, inclusive, porém sem caráter limitativo, B. hyodysenteríae, B. intermedia,B. alvinipulli, B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii, e B. pilosicoli em ani-mais suspeitos de estarem infectados ou para medir de maneira quantitativauma espécie Brachyspira, inclusive, porém sem caráter limitativo, infecçãocausada por B. hyodysenteríae, B. intermedia, B. alvinipulli, B. aalborgi e B.pilosicoli. De acordo com as técnicas de teste discutidas acima, tais kits po-dem conter ao menos uma versão marcada de um das seqüências de ami-noácido descritas aqui ou seu parceiro de ligação, por exemplo, um anticor-po específico a esse, e direções dependendo do método selecionado, porexemplo, "competitivo", "sanduíche", "DASP" e similares. Alternativamente,tais kits podem conter ao menos uma seqüência de polinucleotídeo comple-mentar a uma parte das seqüências de polinucleotídeo descritas aqui junta-mente com instruções para seu uso. Os kits também podem conter reagen-tes periféricos, tais como, tampões, estabilizantes, etc.

Conseqüentemente, um kit de teste para a demonstração dapresença de uma espécie Brachyspira, inclusive, porém sem caráter limitati-vo, B. hyodysenteríae, B. intermedia, B. alvinipulli, B. aalborgi, B. innocens,B. murdochii e B. pilosicoli, pode conter os seguintes:

(a) uma quantidade predeterminada de ao menos um compo-nente reativo imunoquimicamente marcado obtido pela fixação direta ou indi-reta de uma das seqüências de aminoácido descritas aqui ou um parceiro deligação a essas, a um marcador detectável;

(b) outros reagentes; e

(c) instruções para uso do dito kit.

Mais especificamente, o kit de teste diagnóstico pode conter:

(a) uma quantidade conhecida de uma das seqüências de ami-noácido descritas aqui, como relatado acima, (ou um parceiro de ligação)geralmente ligada a uma fase sólida para formar um imunossorvente, ou al-ternativamente, ligada a um marcador adequado, ou há múltiplos tais produ-tos finais, etc;

(b) se necessário, outros reagentes; e

(c) instruções para uso do dito kit de teste.Em uma variação adicional, o kit de teste pode conter:

(a) um componente marcado que foi obtido ao acoplar uma dasseqüências de aminoácido descritas aqui a um marcador detectável;

(b) um ou mais reagentes imunoquímicos adicionais cujo ao me-nos um reagente é um Iigante ou um Iigante imobilizado, tal Iigante é sele-cionado do grupo que consiste em:

(i) um Iigante capaz de se ligar ao componente marcado (a);

(ii) um Iigante capaz de se ligar a um parceiro de ligação docomponente marcado (a);

(iii) um Iigante capaz de se ligar a ao menos um do(s) compo- nente(s) que será/serão determinados; ou

(iv) um Iigante capaz de se ligar a ao menos um dos parceirosde ligação de ao menos um do(s) componente(s) que será/serão determina-do(s); e

(c) instruções para a performance de um protocolo para a detec-ção e/ou determinação de um ou mais componentes de uma reação imuno-química entre uma das seqüências de aminoácido descritas aqui e um par-ceiro de ligação específico a essas.

Preparação de biblioteca genômica

Uma biblioteca genômica é preparada utilizando um isolado decampo de porcos australianos de B. hyodysenteriae (cepa WA1). Essa cepafoi bem caracterizada e mostrou ser perigosa após infecção experimental deporcos. O método de brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) é usado parapreparar DNA cromossomal de alta qualidade adequado para preparação debibliotecas de DNA genômico. B. hyodysenteriae se desenvolve em 100 mlde cultura de caldo tripticase de soja anaeróbica a uma densidade celular de109 células/ml. As células são colhidas em 4.000 xg durante 10 minutos, e opelete celular ressuspenso em 9,5 ml de tampão TE. SDS é adicionado auma concentração final de 0,5 % (p/v), e as células Iisadas a 37°C durante 1hora com 100 pg de Proteinase K. NaCI é adicionado a uma concentraçãofinal de 0,7 M e 1,5 ml de solução CTAB/NaCI (10% p/v de CTAB, 0,7 M deNaCI) é adicionado antes de incubar a solução a 65°C durante 20 minutos. OIisado é extraído com um volume igual de clorofórmio/álcool isoamílico, e otubo é centrifugado em 6.000 χ g durante 10 minutos para separar as fases.A fase aquosa é transferida para um tubo novo e 0,6 volume de isopropanolé adicionado para precipitar o DNA de alto peso molecular. O DNA precipi-tado é coletado utilizando um bastão de vidro em forma de gancho e transfe-rido para um tubo que contém 1 ml de 70 % (v/v) de etanol. O tubo é centri-fugado em 10.000 χ g e o DNA peletizado redissolvido em 4 ml de tampãoTE durante a noite. Um gradiente de cloreto de césio que contém 1,05 g/mlde CsCI e 0,5 mg/ml de brometo de etídio é preparado utilizando a soluçãode DNA redissolvido. O gradiente é transferido para tubos centrífugos selá-veis de 4 ml e centrifugado em 70.000 χ g durante a noite a 15°C. O DNAseparado é visualizado sob uma luz ultravioleta, e o DNA de alto peso mole-cular é retirado do gradiente utilizando uma agulha de 15 g. O brometo deetídio é removido do DNA por extração seqüencial com isopropanol saturadopor CsCI. O DNA cromossomal purificado é dialisado contra 2 litros de tam-pão TE e precipitado com isopropanol. O DNA genômico ressuspenso é cor-tado utilizando um GeneMachines Hydroshear (Genomic Solutions, Ann Ar-bor, Ml), e o DNA cortado é preenchido utilizando polimerase de DNA Kle-now para gerar fragmentos com extremidade cega. Cem ng dos fragmentosde DNA com extremidade cega são ligados a 25 ng de vetor VC pSMART(Lucigen, Meddleton, Wl) utilizando Iigase de DNA CIoneSmart. O DNA liga-do é então eletroporado em células eIetrocompetentes de E. coli. Uma biblio-teca de inserto pequeno (2 a 3 kb) e uma biblioteca inserto médio (3 a 10 kb)são construídas na versão de cópia baixa do vetor VC pSMART.Seaüenciamento genômico

Após a biblioteca genômica ser obtida, os clones individuais deE. coli que contêm o vetor VC pSMART são selecionados. O DNA de plas-mídeo é purificado e seqüenciado. Os plasmídeos purificados são submeti-dos ao seqüenciamento direto automático do vetor VC pSMART utilizado os"primers" direto e reverso específicos para o vetor VC pSMART. Cada rea-ção de seqüenciamento é realizada em um volume de 10 μΙ que consiste em200 ng de DNA de plasmídeo, 2 pmol de primer, e 4 μΙ de ABI PRISM™BigDye Terminator Cycle Seqüencing Ready Reaction Mix (PE Applied Bi-osystems, Foster City, CA). As condições de ciclo envolvem uma etapa dedesnaturação de 2 minutos a 96°C, seguida por 25 ciclos de desnaturação a96°C durante 10 segundos, e uma etapa de extensão e anelamento do pri-mer combinado a 60°C durante 4 minutos. Os terminadores de corante resi-dual são removidos dos produtos de seqüenciamento por precipitação com95% (v/v) de etanol contendo 85 mM de acetato de sódio (pH 5,2), 3mM deEDTA (pH 8), e seco a vácuo. Os plasmídeos são seqüenciados em duplica-ta utilizando cada primer. Os produtos de seqüenciamento são analisadosutilizando um Seqüenciador de DNA ABI 373A (PE Applied Biosystems).

Observação

As seqüências de genoma parciais de B. hyodysenteríae sãomontadas e observadas utilizando uma variedade de ferramentas de bioin-formática de domínio público para analisar e reanalisar as seqüências comoparte de um procedimento de garantia de qualidade em análises de dados.

Os quadros abertos de leitura (ORFs) são previstos utilizando uma varieda-de de programas inclusive GeneMark, GLIMMER, ORPHEUS, SELFID eGetORF. Os supostos ORFs são examinados para homologia (DNA e prote-ína) com bancos de dados internacionais existentes que utilizam pesquisasinclusive BLAST e FASTA. Todos os ORFs previstos são analisados paradeterminar sua localização celular utilizando programas inclusive PSI-BLAST, FASTA, MOTIFS, FINDPATTERNS, PHD3 SIGNALP e PSORT. Osbancos de dados que incluem lnterpro, Prosite1 ProDom, Pfam e Blocks sãousados para prever proteínas associadas com superfície, tais como, domí-nios de transmembrana, peptídeos líder, homologias a proteínas de superfí-cie conhecidas, marca de lipoproteína, motivos de ancoragem de membranaexterna e domínios de ligação de célula hospedeira. A análise filogenética eoutras análises de evolução molecular são conduzidas com os genes identi-ficados e com outras espécies para ajudar na transferência de função. A a-nálise in silico de cada genoma parcialmente seqüenciado produz uma listaabrangente de todos os ORFs previstos presentes nos dados de seqüênciadisponíveis. Cada ORF é examinado para informações descritivas, tais co- mo, peso molecular previsto, ponto isoelétrico, hidrofobicidade, e localizaçãosubcelular para permitir a correlação com as propriedades in vitro do produtode gene nativo. Os genes previstos que codificam proteínas similares aoscomponentes localizados em superfície e/ou fatores de virulência em outrasbactérias patogênicas são selecionados como alvos de vacina potenciais.

Resultados da bioinformática

O seqüenciamento "shotgun" do genoma de B. hyodysenteriaeresulta em 73% (2347,8 kb fora 2300 kb previstos) do genoma que é se-qüenciado. A seqüência de B. hyodysenteriae é compreendida de 171 con-tigs com um tamanho médio de contig de 13,7 kb. Para B. hyodysenteriae,1860 quadros abertos de leitura (ORFs) são previstos a partir dos 171 con-tigs. A comparação dos ORFs previstos com os genes presentes nos bancosde dados de ácido nucléico e proteína indica que aproximadamente 70% dosORFs possuem homologia com os genes contidos nos bancos de dados pú-blicos. Os 30% restantes dos ORFs previstos não possuem identidade co-nhecida.

Candidatos à vacina

Para ajudar a reduzir o número de ORFs que poderiam ser tes-tados como um candidato a vacina, um teste de duas partes é estabelecido.Requer-se que os candidatos a vacina potenciais possuam algumas, apesarde menor, homologia com as proteínas de superfície externa e fatores devirulência presentes nos bancos de dados públicos. Os ORFs de candidato avacina potencial também devem estar presentes em muitas cepas de B.hyodysenteriae. Dos 1860 ORFs obtidos no seqüenciamento "shotgun" ge-nômico, muitos permitiram um ou ambos prongs desse teste, porém os re-sultados de apenas sete são apresentados aqui. A Tabela 1 mostra seteclones selecionados como alvos de vacina potenciais e sua similaridade comoutras seqüências de aminoácido obtidas a partir do banco de dadosSWISS-PROT. Observa-se que a porcentagem de identidade de aminoáci-dos não aumenta acima de 46% enquanto a porcentagem de similaridade deaminoácidos permanece menor que 65% indicando, assim que esses ORFssão exclusivos.

Tabela 1

<table>table see original document page 50</column></row><table>O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H7 são encontra-dos na SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente. O DNA e seqüências de ami-noácido de NAV-H8 são encontrados na SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamen-te. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H10 são encontrados naSEQ ID NOs: 5 e 6, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácidode NA V-H 12 são encontrados na SEQ ID NOs: 7 e 8, respectivamente. ODNA e seqüências de aminoácidos de NA V-H 17 são encontrados na SEQID NOs: 9 e 10, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido deNAV-H21 são encontrados na SEQ ID NOs: 11 e 12, respectivamente. ODNA e seqüência de aminoácidos of NAV-H34 são encontrados na SEQ IDNOs: 13 e 14, respectivamente. The DNA and seqüências de aminoácido deNAV- H42 são encontrados na SEQ ID NOs: 15 e 16, respectivamente.

Análise de distribuição de gene utilizando reação em cadeia dapolimerase (PCR) Um ou dois pares de "primers" que se anelam em regiõesdiferentes da região de codificação de gene alvo são desenhados e otimiza-dos para detecção por PCR. Os "primers" individuais são desenhados utili-zando Oligo Explorer 1.2 e conjuntos de "primers" com temperaturas de fusãocalculadas de aproximadamente 55 a 60°C são selecionados. Esses conjun-tos de "primers" também são selecionados para gerar produtos de PCR maio-res de 200bp. Uma temperatura de anelamento de primer de severidade mé-dia de 50°C é selecionada para PCR de análise de distribuição. As condiçõesde severidade média poderiam permitir seqüências com menos erros de pa-reamento potenciais (devido à diferença de cepa) que ocorrem nos sítios deligação de primer para não afetar a ligação de primer. A análise de distribui-ção dos sete genes alvo de B. hyodysenteriae é realizada em 23 cepas de B.hyodysenteriae, inclusive duas cepas que foram mostradas como avirulentas.Os conjuntos de "primers" usados na análise de distribuição são mostrados naTabela 2. A análise de PCR é realizada em um volume total de 25 μΙ utilizan-do Taq DNA polimerase (Biotech International, Thurmont, MD). A mistura poramplificação consiste em 1x tampão PCR (que contém 1,5 mM de MgCk), 1 Ude Taq DNA polimerase, 0,2 mM de cada dNTP (Amersham Pharmacia Biote-ch, Piscataway, NJ), 0,5 μΜ do par de "primers", e 1 μΙ de DNA modelo cro-mossomal purificado. As condições de ciclo envolvem uma etapa de desnatu-ração padrão inicial de 5 minutos a 94°C, seguida por 35 ciclos de desnatura-ção a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 50°C durante 15 segundos, eextensão de primer a 68°C durante 4 minutos. Os produtos PCR são submeti-dos à eletroforese em 1% (p/v) de géis agarose em 1x tampão TAE (40 mMde Tris-acetato, 1 mM de EDTA), coloração com 1 pg/ml de solução de bro-meto de etídio e visualização através de luz UV.

Todos os ORFs de B. hyodysenteriae, exceto NAV-H 17, NAV-H21 e NAV-H42, estavam presentes em cada cepa testada. NAV-H 17 esta-va presente em 95,7% (22 de 23) das cepas de B. hyodysenteriae analisa-das, e NAV-H21 e NAV-H42 estavam presentes em 91,3% (21 de 23) dascepas de B. hyodysenteriae. As cepas desprovidas desses ORFs não eramcepas avirulentas (SA3 e VS1).

Tabela 2

<table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table>

Os oito ORFs selecionados para teste adicional como candida-tos a vacina potenciais são clonados em vetores de expressão, expressos,purificados, e avaliados em termos de imunogenicidade.

Extração de plasmídeo pTrcHis

Os clones de Escherichia coli JM109 que hospedam o plasmí-deo pTrcHis (Invitrogen, Carlsbad, CA) são marcados a partir de armazena-mento de estoque de glicerol sobre placas de agar Luria-Bertani (LB) suple-mentadas com 100 mg/l de ampicilina e incubadas a 37°C durante 16 horas.

Uma única colônia é usada para inocular 10 ml de caldo LB suplementadocom 100 mg/l de ampicilina, e a cultura de caldo é incubada a 37°C durante12 horas com agitação. Toda a cultura é centrifugada durante a noite a5.000 χ g durante 10 minutos, e o plasmídeo contido nas células é extraídoutilizando o Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Doncaster VIC). As célulaspeletizadas são ressuspensas com 250 μΙ de tampão de ressuspensão celu-lar Pl e então Iisadas com a adição de 250 μΙ de tampão de Iise celular P2.As células Iisadas são neutralizadas com 350 μΙ de tampão de neutralizaçãoN3, e os fragmentos celulares precipitados são peletizados por centrifugaçãoem 20.000 χ g durante 10 minutos. O sobrenadante é transferido para umacoluna de centrifugação e centrifugado em 10.000 χ g durante 1 minuto. A-pós descartar o fluxo 500 μ de tampão de lavagem PE são aplicados à colu-na e centrifugados como antes. O fluxo é descartado, e a coluna é seca porcentrifugação em 20.000 χ g durante 3 minutos. O DNA de plasmídeo é eluí-do da coluna com 100 μΙ de tampão de eluição EB. O plasmídeo purificado équantificado utilizando um fluorômetro de DNA Dynaquant (Hoefer, San Francisco, CA), e a concentração de DNA é ajustada para 100 μg/ml pordiluição com tampão TE. O plasmídeo purificado pTrcHis é armazenado a 20°C.

Preparação de vetor

Dois μg do plasmídeo purificado pTrcHis são digeridos a 37°Cdurante 1 a 4 horas em um volume total de 50 μΙ que contém 5 U de duasenzimas de restrição em 100 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 50 mM de NaCI, 10mM de MgCI2, 1 mM de DTT e 100 μg/ml de BSA. O par particular de enzi-mas de restrição usado depende da seqüência dos "primers" encontrada naTabela 3; porém em particular os pares de enzimas de restrição usados sãoXhol e EcoRI; Xhol e Pstl; Xhol e Bglll que podem ser obtidos junto a NewEngland Biolabs, Beverly, MA. O vetor restrito é verificado por eletroforese 1μL da reação de digestão através de 1% (p/v) de gel agarose em 1X de tam-pão TAE em 90V durante 1 hora. O DNA submetido à eletroforese é coloridocom 1 μg/ml de brometo de etídio e é visualizado através de luz ultravioleta(UV).

O vetor pTrcHis Iinearizado é purificado utilizando o Kit de Lim-peza UItraCIean PCR (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA). Resumidamente,a reação de restrição (50 μΙ) é misturada com 250 μΙ de tampão SpinBindB1, e o volume total é adicionado a uma coluna de centrifugação. Após acentrifugação em 8.000 χ g durante 1 minuto, o fluxo é descartado e 300 μΙde tampão SpinCIean B2 são adicionados à coluna. A coluna é centrifugadacomo antes, e o fluxo é descartado antes de secar a coluna em 20.000 χ gdurante 3 minutos. O vetor purificado é eluído a partir da coluna com 50 μΙde tampão TE. O vetor purificado é quantificado utilizando um fluorômetro, ea concentração de DNA é ajustada para 50 pg/ml por diluição com tampãoTE. O vetor restrito purificado é armazenado a -20°C.

Desenho de primer para preparação de inserto

Os pares de primer são desenhados para amplificar tanto quantopossível a região de codificação do gene alvo utilizando DNA genômico co-mo o ponto de partida. Todas as seqüências de "primers" incluem sítios deenzima de restrição terminais para permitir a ligação de extremidade coesivado amplicon resultante no vetor pTrcHis linearizado. As seqüências de pri-mer usadas para clonagem são mostradas na Tabela 3. Os "primers" sãotestados utilizando Amplify 1.2 (University of Wisconsin, Madison, Wl) e aseqüência de amplicon teórica é inserida na posição apropriada na seqüên-cia de vetor pTrcHis. A tradução deduzida do cassete de expressão de pTr-cHis quimérico é realizada utilizando Vetor NTI versão 6 (InforMax) paraconfirmar que os insertos de gene poderiam estar no quadro de leitura corre-to. A Tabela 3 também proporciona o peso molecular previsto da proteínanativa em daltons e o peso molecular aparente da proteína expresso em kDacomo determinado a partir de SDS-PAGE. A fusão de histidina da proteínarecombinante adiciona aproximadamente 4 kDa à proteína nativa.

Tabela 3

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Amplificação dos insertos de gene

Mediante a utilização de DNA genômico, todos os insertos degene alvo são amplificados por PCR em um volume total de 100 μΙ utilizandoTaq DNA polimerase (Biotech International) e Pfu DNA polimerase (Prome-ga, Madison, Wl). A mistura de amplificação consiste em 1x de tampão PCR(que contém 1,5 mM de MgCI2), 1 U de Taq DNA polimerase, 0,01 U de PfuDNA polimerase, 0,2 mM de cada dNTP (Amersham Pharmacia Biotech),0,5 μΜ do par de primer apropriado e 1 μΙ de DNA cromossomal purificado.O DNA cromossomal é preparado a partir da mesma cepa de B. hyodysente-riae usada para seqüenciamento de genoma. As condições de ciclo envol-vem uma etapa de desnaturação padrão inicial de 5 minutos a 94°C, seguidapor 35 ciclos de desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a50°C durante 15 segundos, e extensão de primer a 68°C durante 4 minutos.Os produtos de PCR são submetidos à eletroforese em 1% (p/v) de géis a-garose em 1x de tampão TAE, e coloridos com a 1 μg/ml de solução debrometo de etídio e são visualizados através de luz UV. Após verificar a pre-sença do produto de PCR de tamanho correto, a reação de PCR é purificadautilizando o Kit de Limpeza UltraCIean PCR (Mo Bio Laboratories, Carlsbad,CA). A reação de PCR (100 μΙ) é misturada com 500 μΙ de tampão SpinBindB1, e o volume total é adicionado a uma coluna de centrifugação. Após acentrifugação em 8.000 χ g durante 1 minuto, o fluxo é descartado, e 300 μΙde tampão SpinCIean B2 são adicionados à coluna. A coluna é centrifugadacomo antes e o fluxo é descartado antes de secar a coluna em 20.000 χ gdurante 3 minutos. O vetor purificado é eluído a partir da coluna com 100 μΙde tampão TE.

Digestão de enzima de restrição dos insertos de gene

Trinta μΙ do produto de PCR purificado foram digeridos em umvolume total de 50 μΙ com 1 U de cada enzima de restrição compatível com osítio de reconhecimento de endonuclease de restrição terminal determinadopela clonagem de primer de oligonucleotídeo (vide Tabela 3). A reação derestrição consiste em 100 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 50 mM de NaCI, 10 mMde MgCI2, 1 mM de DTT e 100 pg/ml de BSA com 1 U de cada enzima derestrição a 37°C durante 1 a 4 horas. Os insertos NAV-H7 e NAV-H42 foramdigeridos com Xho\ e PstI. Os insertos NAV-H8, NAV-H10, NAV-H12, NAV-H21 e NAV-H34 foram digeridos com Xho\ e EcoRI. O inserto NAV-H 17 foidigerido com Xho\ e BgH\. O DNA de inserto digerido foi purificado utilizandoo Kit de Limpeza UItraCIean PCR (vide acima). O DNA de inserto digeridopurificado foi quantificado utilizando o fluorômetro, e a concentração de DNAajustada para 20 μg/ml por diluição com tampão TE. O DNA de inserto restri-to purificado foi usado imediatamente para ligação de vetor.Ligação dos insertos de gene no vetor pTrcHis

Todas as reações de ligação são realizadas em um volume totalde 20 μl. Cem ng de pTrcHis Iinearizado são incubados com 20 ng de insertorestrito a 16°C durante 16 horas em 30 mM de Tris-HCI (pH 7,8), 10 mM deMgCI2, 10 mM de DTT e 1 mM de ATP contendo 1 U de T4 DNA Iigase(Promega). Uma reação de ligação idêntica que não contém inserto de DNAtambém é incluída como um controle negativo de recirculação de vetor. Aenzima de restrição apropriada foi usada para cada reação.Transformação de ligações pTrcHis em células de E. coliAs células de Ε. coli JM109 (Promega) competentes são derreti-das a partir de um armazenamento de -80°C em gelo e então 50 μΙ das célu-las são transferidos em tubos microfuge de 1,5 ml gelados que contêm 5 μΙdas reações de ligação noturnas (equivalentes a 25 ng de vetor pTrcHis). Ostubos são misturados ao dar pequenos tapas no fundo de cada tubo sobre abancada e deixá-los em gelo durante 30 minutos. As células são então so-frem um choque térmico ao colocar os tubos em um banho de água a 42°Cdurante 45 segundos antes de o tubo retornar para o gelo durante 2 minutos.

As células transformadas são recobertas em 1 ml de caldo LB durante 1 ho-ra a 37°C com mistura suave. As células recobertas são colhidas em 2.500 χg durante 5 minutos, e as células são ressuspensas em 50 μΙ de caldo frescoLB. O total de 50 μΙ de células ressuspensas é espalhado uniformementesobre uma placa de agar LB que contém 100 mg/1 de ampicilina utilizandoum bastão de vidro estéril. As placas são incubadas a 37°C durante 16 horas.

Detecção de construções de pTrcHis recombinantes em E. coli por PCR

Doze colônias de único transformante de cada construção sãomarcadas sobre placas de agar de LB fresco que contêm 100 mg/1 de ampi-cilina e incubadas a 37°C durante 16 horas. Uma única colônia de cada e-vento de transformação é ressuspensa em 50 μΙ de tampão TE e é fervidadurante 1 minuto. Dois μΙ de células fervidas são usados como modelo paraPCR. A mistura de amplificação consiste em 1x de tampão PCR (que con-tém 1,5 mM de MgCI2), 1 U de Taq DNA polimerase, 0,2 mM de cada dNTP,0,5 μΜ do primer pTrcHis-F (5'-CAATTTATCAGACAATCTGTGTG-3' SEQID NO: 57) e 0,5 μΜ do primer pTrcHis-R (51-TGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCG-3' SEQ ID NO: 58). As condições deciclo envolvem uma etapa de desnaturação padrão inicial de 5 minutos a94°C, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 94°C durante 30 segundos,anelamento de 60°C durante 15 segundos, e uma extensão de primer a72°C durante 1 minuto. Os produtos de PCR são submetidos à eletroforeseem 1% (p/v) de géis agarose em 1x de tampão TAE, são coloridos com 1μg/ml de solução de brometo de etídio e são visualizados através de luz UV.A clonagem dos vários insertos no vetor de expressão de pTrcHis produzconstruções recombinantes de vários tamanhos.

Expressão experimental de proteínas recombinantes marcadas com His

Cinco a dez colônias isoladas de construção de pTrcHis recom-binante em E. coli JM 109 são inoculadas em 3 ml de caldo LB em um tubode 5 ml que contém 100 mg/1 de ampicilina e 1 mM de IPTG e incubadas a37°C durante 16 horas com agitação. As células são colhidas por centrifuga-ção em 5.000 χ g durante 10 minutos a 4°C. O sobrenadante é descartado, ecada pelete é ressuspenso com 10 μΙ de tampão de Iise desnaturante Ni-NTA (100 mM de NaH2PO4, 10 mM de Tris-HCI1 8 M de uréia, pH 8,0). Apóso vórtice do tubo durante 1 minuto, os fragmentos celulares são peletizadospor centrifugação em 10.000 χ g durante 10 minutos a 4°C. O sobrenadanteé transferido para um novo tubo e armazenado a -20°C até a análise.

Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio(SDS-PAGE)

A análise SDS-PAGE da proteína é realizada utilizando um sis-tema de tampão Tris-glicina descontínuo. Trinta μΙ de amostra de proteínasão misturados com 10 μΙ de 4x tampão de tratamento de amostra (250 mMde Tris-HCI (pH 6,0), 8% (p/v) SDS, 200 mM de DTT, 40% (v/v) de glicerol e0,04 % (p/v) de azul de bromofenol). As amostras são fervidas durante 5 mi-nutos imediatamente antes do carregamento de 10 μΙ da amostra em poçosno gel. O gel compreende um gel concentrador (125 mM de Tris-HCI ph 6,8,4% p/v de acilamida, 0,15% p/v de bis-acrilamida e 0,1% p/v de SDS) e i, gelseparador (375 mM de Tris- HCI ph 8,8, 12% p/v de acilamida, 0,31% p/v debis-acrilamida e 0,1% p/v de SDS). Esses géis são polimerizados pela adi-ção de 0,1% (v/v) de TEMED e 0,05% (p/v) de solução de sulfato de amôniorecentemente preparada e fundidos em mini-Protean dual slab cell (Bio-Rad,Hercules, Califórnia). As amostras são administradas em 150 V em tempera-tura ambiente (TA) até o corante azul de bromofenol atingir a parte inferiordo gel. Os padrões de peso molecular pré-coloridos são submetidos à eletro-forese em paralelo com as amostras para permitir estimativas de peso mole-cular. Após a eletroforese, o gel é imediatamente colorido utilizando Azul deCoomassie Brilhante G250 (Bio-Rad) ou é submetido à eletrotransferênciasobre membrana de nitrocelulose para Western blotting.

Análise de Western blot

A transferência eletroforética de proteínas separadas do gelSDS-PAGE para a membrana de nitrocelulose é realizada utilizando o sis-tema de tampão de transferência Towbin. Após a eletroforese, o gel é equili-brado em tampão de transferência (25 mM de Tris, 192 mM de glicina, 20%v/v de metanol, pH 8,3) durante 15 minutos. As proteínas no gel são eletro-transferidas para a membrana de nitrocelulose (Protran, Schleicher and S-chuell BioScience1 Inc., Keene, NH) utilizando o aparelho mini-Proteantransblot (Bio-Rad) em 30 V durante a noite a 4°C. A membrana de nitrocelu-lose recentemente transferida que contém as proteínas separadas é bloque-ada com 10 ml de salina tamponada com tris (TBS) que contém 5% (p/v) deleite em pó desnaturado durante hora em TA. A membrana é lavada comTBS que contém 0,1 % (v/v) de Tween 20 (TBST) e então é incubada com 10mL de anticorpo anti-his de camundongo (diluído 5.000 vezes com TBST)durante 1 hora em TA. Após a lavagem três vezes durante 5 minutos comTBST, a membrana é incubada com 10 mL de IgG de cabra anti-camundongo (molécula total) diluído em AP 5.000 vezes em TBST durante 1hora em TA. A membrana é desenvolvida utilizando o Kit de Substrato Fos-fatase Alcalina (Bio-Rad). A reação de desenvolvimento é interrompida aolavar a membrana com água destilada. A membrana é então seca e varridapara apresentação.

Verificação de quadro de leitura das construções de PTrcHis recombinantespor análise de seqüência direta

Dois clones transformantes de cada construção que produzemos produtos de PCR de tamanho correto são inoculados em 10 ml de caldoLB contendo 100 mg/1 de ampicilina e incubados a 37°C durante 12 horascom agitação. Todas as culturas noturnas são centrifugadas em 5.000 χ gdurante 10 minutos, e o plasmídeo contido nas células é extraído utilizandoo Kit QIAprep Spin Miniprep, como anteriormente descrito. O plasmídeo puri-ficado é quantificado utilizando um fluorômetro. Ambos os plasmídeos purifi-cados são submetidos ao seqüenciamento direto automático do cassete deexpressão de pTrcHis utilizando os "primers" pTrcHis-F e pTrcHis-R. cadareação de seqüenciamento é realizada em um volume de 10 μΙ que consisteem 200 ng de DNA de plasmídeo, 2 pmol de primer, e 4 μΙ da ABI PRISM™BigDye Terminator Cycle Seqüencing Ready Reaction Mix (PE Applied Bi-osystems, Foster City, CA). As condições de ciclo envolvem uma etapa dedesnaturação de 2 minutos a 96°C, seguida por 25 ciclos de desnaturação a96°C durante 10 segundos, e uma etapa de anelamento e extensão de pri-mer combinado a 60°C durante 4 minutos. Os terminadores de corante resi-dual são removidos dos produtos de seqüenciamento por precipitação com95% (v/v) de etanol contendo 85 mM de acetato de sódio (pH 5,2), 3mM deEDTA (pH 8), e secos a vácuo. Os plasmídeos são seqüenciados em dupli-cata utilizando cada primer. Os produtos de seqüenciamento são analisadosutilizando um Seqüenciador de DNA ABI 373A (PE Applied Biosystems). Oseqüenciamento de nucleotídeos das construções de pTrcHis verifica se ocassete de expressão está no quadro de leitura correto em todas as cons-truções. A tradução prevista de cassete de expressão de pTrcHis indica quetodas as proteínas recombinantes marcadas com e a seqüência de aminoá-cido deduzida das proteínas nativas de B. hyodysenteriae são idênticas.

Expressão e purificação de proteínas recombinantes marcadas com HisUma única colônia da construção de pTrcHis recombinante emE. coli JM 109 é inoculada em 50 ml de caldo LB em um frasco cônico de250 ml que contém 100 mg/l de ampicilina e incubado a 37°C durante 16horas com agitação. Um frasco cônico de 2 I que contém 1 I de caldo LB su-plementado com 100 mg/l de ampicilina é inoculado com 10 ml da culturanoturna e incubado a 37°C até a densidade ótica das células em 600 nm ser0,5 (aproximadamente 3 a 4 horas). A cultura é então induzida ao adicionarIPTG a uma concentração final de 1 mM, e as células retornam para 37°Ccom agitação. Após 5 horas de indução, a cultura é transferida para garrafascentrífugas de 250 ml, e as garrafas são centrifugadas em 5.000 χ g durante20 minutos a 4°C. O sobrenadante é descartado, e cada pelete é ressus-penso com 8 ml de tampão de Iise desnaturante Ni-NTA (100 mM deNaH2PO4, 10 mM de Tris-HCI, 8 M de uréia, pH 8,0). As células ressuspen-sas são armazenadas a -20°C durante a noite. A suspensão celular é remo-vida do armazenamento a -20°C e degelada. O Iisado celular é então soni-cado em gelo 3 vezes durante 30 segundos com incubação de 1 minuto emgelo entre ciclos de sonicação. As células Iisadas são purificadas por centri-fugação em 20.000 χ g durante 10 minutos a 4°C, e o sobrenadante é trans-ferido para uma coluna de 15 ml que contém um volume de leito de 0,5 mlde resina agarose Ni-NTA (Qiagen). A proteína recombinante marcada comHis6 é permitida para se ligar à resina durante 1 hora a 4°C com mistura"end-over-end". A resina é então lavada com 30 ml de tampão de lavagemdesnaturante Ni-NTA (100 mM de NaH2PO4, 10 mM de Tris-HCI, 8 M de u-réia, pH 6,3) antes da eluição com 12 ml de tampão de eluição desnaturanteNi-NTA (100 mM de NaH2PO4, 10 mM de Tris-HCI, 8 M de uréia, pH 4,5).

Quatro frações de 3 ml do eluato são coletadas e armazenadas a 4°C. TrintaμΙ de cada eluato são tratados com 10 μΙ de 4x de tampão de tratamento deamostra e fervidos durante 5 minutos. As amostras são submetidas a SDS-PAGE e coloridas com Azul de Coomassie Brilhante G250 (Bio-Rad). O gelcolorido é equilibrado em água destilada durante 1 hora e seco entre duasfolhas de celulose durante a noite em TA.

A expressão dos clones recombinantes de E. coli selecionados érealizada em média escala para gerar proteína recombinante suficiente paravacinação de camundongos (vide abaixo). Todas as proteínas recombinan-tes que possuem aa fusão hexa-histidina (4 kDa) produzem uma proteínaimportante com um peso molecular aparente similar ao peso molecular pre-visto da proteína nativa (vide Tabela 3). Essas proteínas são altamente rea-tivas em análise de Western blotting utilizando o anticorpo anti-His. A purifi-cação das proteínas recombinantes marcadas com his por cromatografia deafinidade sob condições desnaturantes é bem sucedida. SDS-PAGE e colo-ração com azul de Coomassie de todas as proteínas recombinantes mos-tram que uma purificação de ao menos 85% é obtida. Os rendimentos deproteína recombinante de 2 mg/L são consistentemente obtidos utilizandoesse protocolo de expressão.Diálise e liofilizacão da proteína recombinante marcada com His purificada

As proteínas eluídas são agrupadas e transferidas em um tubode diálise hidratado (Spectrum Laboratories, Inc., Los Angeles, CA) com umpeso molecular de corte (MWCO) de 3.500 Da. Uma alíquota de 200 μl doeluato agrupado é obtida e quantificada utilizando uma Análise de Proteínacomercial (Bio-Rad). As proteínas são dialisadas contra 2 I de água destiladaa 4°C com agitação. O tampão de diálise é alterado 8 vezes em intervalos de12 horas. As proteínas dialisadas são transferidas do tubo de diálise em tu-bos centrífugos de 50 ml (40 ml de volume máximo), e os tubos são coloca-dos a -80°C durante a noite. Os tubos são colocados em um MAXI freeze-drier (Heto-Holten, Allerod, Denmark) e Iiofilizados até secarem. As proteí-nas Iiofilizadas são então reidratadas com PBS a uma concentração calcula-da de 2 mg/ml e armazenadas a -20°C. Após a diálise e liofilização, o antí-geno recombinante estável é produzido de forma bem sucedida.Sorologia utilizando proteína recombinante purificada

Vinte pg de proteína recombinante purificada são carregados emum poço IEF de 7 cm, submetidos à eletroforese através de 10% (p/v) de gelSDS-PAGE, e eletrotransferidos para a membrana de nitrocelulose. A mem-brana é bloqueada com leite desnatado TBS (5% p/v) e montada no apare-Iho multi-screen (Bio-Rad). Os poços são incubados com 100 μΙ de soro deporco diluído (100 vezes) durante 1 hora em TA. O soro de porco foi obtido apartir de porcos com alto status de saúde (n=3), porcos experimentalmenteinfectados que mostram SD (n=5) clínico, porcos seroconvertidos natural-mente infectados (n=5), e porcos recuperados de infecção natural (n=4). Amembrana é então removida do aparelho e lavada três vezes com TBST(0,1% v/v) antes da incubação com 10 ml de IgG de cabra anti-suíno (molé-cula total)-AP (5.000 vezes) durante 1 hora em TA. A membrana é lavadatrês vezes com TBST antes do desenvolvimento de cor utilizando um Kit deSubstrato de Fosfatase Alcalina (Bio-Rad). A membrana é lavada com águada torneira quando ocorrer um desenvolvimento suficiente, seca e varridapara apresentação.

Todas as proteínas clonadas são reconhecidas por 80 a 100%do painel de soro de porco, independente do status de saúde indicando, as-sim, que os genes foram expressos in vivo e que os porcos foram capazesinduzir uma resposta imune sistêmica após a exposição à espiroqueta.

Vacinação de camundonqos utilizando as proteínas recombinantes marca-das com his purificadas

Para cada proteína recombinante marcada com his purificada,dez camundongos são imunizados de maneira sistêmica e oral para deter-minar se a proteína recombinante poderia ser imunogênica. A proteína re-combinante é emulsificada com 30% (v/v) adjuvante de água em óleo e inje-tado de forma intramuscular nos músculos do quadríceps de dez camun-dongos (Balb/cJ: machos com 5 semanas de idade). Todos os camundon-gos recebem 100 pg de proteína em um volume total de 100 μΙ. Três sema-nas após a primeira vacinação, todos os camundongos recebem uma se-gunda vacinação intramuscular idêntica à primeira vacinação. Todos os ca-mundongos morreram duas semanas após a segunda vacinação. Os sorossão obtidos do coração após a morte e testados em análise de Western blotde anticorpos contra extratos celulares de B. hyodysenteriae.

Análise de Western blot

Vinte pg de proteína recombinante purificada são carregados emum poço de IEF de 7 cm, submetidos à eletroforese através de 10% (p/v) degel SDS-PAGE, e eIetrotransferidos para a membrana de nitrocelulose. Amembrana é bloqueada com leite desnatado TBS (5% p/v) e montada noaparelho multi-screen (Bio-Rad). Os poços são incubados com 100 μΙ desoro de camundongo diluído (100 vezes) durante 1 hora em TA. A membra-na é removida do aparelho e lavada três vezes com TBST (0,1% v/v) antesda incubação com 10 ml de IgG de cabra anti-camundongo (molécula total)-AP (5.000 vezes) durante 1 hora em TA. A membrana é lavada três vezescom TBST antes de desenvolvimento de cor utilizando um Kit de Substratode Fosfatase Alcalina (Bio-Rad). A membrana é lavada com água da torneiraquando ocorrer um desenvolvimento suficiente, seca e varrida para apresen-tação.

A análise de Western blot mostra um aumento significativo nareatividade de anticorpo nos camundongos frente aos antígenos de vacinarecombinantes após a vacinação. Todos os camundongos reconheceramque as proteínas recombinantes são similares em peso molecular àquelasdas proteínas recombinantes purificadas coloridas com azul de Coomassie.

Esses experimentos proporcionam provas que as proteínas recombinantessão imunogênicas quando usadas para vacinar camundongos, e que o pro-tocolo de vacinação empregado pode induzir titragens de anticorpo circulan-te específicas contra o antígeno.

Vacinação de porcos utilizando proteínas recombinantes marcadas com hispurificadas

Para cada proteína recombinante marcada com his purificada,dez porcos soronegativos são injetados de maneira intramuscular com 1 mgdo antígeno particular em 1 ml de volume de vacina. O antígeno é emulsifi-cado com um volume igual de um adjuvante de água em óleo. Os porcossão vacinados com três semanas de idade e novamente com seis semanasde idade. Um segundo grupo geralmente de porcos soronegativos é usadocomo controles negativos e são deixados não-vacinados. Todos os porcosforam infectados com 100 ml de uma cultura ativa de B. hyodysenteriae(~109 células/ml) com oito semanas de idade, e os porcos são observadospara manifestação clínica de disenteria suína durante o experimento (atéseis semanas após a infecção) e exame após a morte.

Kit de Diagnóstico

O soro é obtido de porcos em uma suinocultura com infecçãoconhecida de B. hyodysenteriae, de porcos conhecidos por não serem infec-tados com B. hyodysenteriae, e de porcos em uma suinocultura com infec-ção desconhecida com B. hyodysenteriae. Vinte pg de proteína recombinan-te purificada são carregados em um poço de IEF de 7 cm, submetidos à ele-troforese através de 10% (p/v) de um gel SDS-PAGE, e eletrotransferidospara a membrana de nitrocelulose. A membrana é bloqueada com leite des-natado TBS (5% p/v) e montada em um aparelho multi-screen (Bio-Rad). Ospoços são incubados com 100 μΙ de soro de porco diluído (100 vezes) du-rante 1 hora em TA. A membrana é então removida do aparelho e lavadatrês vezes com TBST (0,1% v/v) antes da incubação com 10 ml de IgG decabra anti-suíno (molécula total)-AP (5.000 vezes) durante 1 hora em TA. Amembrana é lavada três vezes com TBST antes do desenvolvimento de corutilizando um Kit de Substrato de Fosfatase Alcalina (Bio-Rad). A membranaé lavada com água da torneira quando ocorrer um desenvolvimento suficien-te, seca e varrida para apresentação. O soro dos porcos conhecidos queserá infectado com B. hyodysenteríae (controles positivos) reage com asproteínas recombinantes enquanto o soro dos porcos sem infecção (contro-les negativos) não reagem. Uma pessoa pode determinar se os porcos estãoinfectados com B. hyodysenteríae ao comparar os resultados com o controlepositivo e negativo.

Embora essa invenção seja descrita com referência a modalida-des específicas, ficará claro para os elementos versados na técnica que va-riações nesses métodos e composições podem ser usadas e que pretende-se que a invenção possa ser praticada de modo diferente daquele especifi-camente descrito aqui. Conseqüentemente, essa invenção inclui todas asmodificações abrangidas dentro do espírito e escopo da invenção como de-finido pelas reivindicações.Listagem de Seqüências

<110> Hampson, DavidLa, Tom

Bellgard, MatthewMurdoch University

Novartis AG

<120> GENES E PROTEÍNAS DE BRACHYSPIRA HYODYSENTERIAE E USO DOS MESMOS PARADIAGNÓSTICO E TERAPIA<130> 50106

<160> 56

<170> FastSEQ para Windows versão 4.0<210> 1<211> 1038<212> DNA

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 1

atgagaaaaa cagtgaaaat tattacttca ttagttttaa ttgcatgttt gtttttatta 60gcttcatgtg ctaataaggg atcatcatct tctggtgatg caacaacatt gaaagtggct 120gtaatgccat ttttaaactc tgtacctatt gagtatatga ttaataacaa attagatgaa 180aaatatggtt ttaaaattga aactgtatat ttcccatcag gcggtcctat gaatgaagca 240ttaggtgctg gtttatggga agttggtaca ttaagtgctg cttctgtata ttctttggct 300aattataatg ctcatgttgt agctgatata ggacactctg aaggcggtat agaagtatta 360gttaatcctg attctgatat attaacagtt aagggcgtta ataaagattt tccagaagtt 420tatggagatg ctgctacttt aaaaggaaaa actataagcg tacctactgg aacaatatct 480catttaaatg ttatacattg gcttagagct ataaatgttg atcctaatac agttaatata 540gttcatatgg aattccctca ggcatatcaa gctttaaaag ctaaaaaaat agatgctgct 600gctttgaatc ctccaacttc tttctctgct gaagctgatg gaatgaaaat agtttcaagt 660ttaactacat taaatatacc tcagtacgat tcaataatag tatctgatga agctttcaat 720aataaaaaag atactatagt gttatatatt aaagcattct tagaagcatg cgatgcatta 780caggctgatc ctaatatggc tgctcaagaa ttattaaatt ggtatacaaa aaatggatct 840acttctactt tagaagcttg tcagtctgaa gttcaaactc gtccttttgt tacaacagaa 900gaaatcaaaa atataaaaac aggtgattct gtaagaataa cagctgactt ctttgcaagc 960cagtctttaa taacagagga taaattaact gttgttgacc aaaatgtaga tactgaatta 1020ttaggtaaag cattaaat 1038

<210> 2<211> 346<212> PRT

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 2

Met Arg Lys Thr Val Lys Ile Ile Thr Ser Leu Val Leu Ile Ala Cys

1 5 10 15

Leu Phe Leu Leu Ala Ser Cys Ala Asn Lys Gly Ser Ser Ser Ser Gly

20 25 30

Asp Ala Thr Thr Leu Lys Val Ala Val Met Pro Phe Leu Asn Ser Val

35 40 45

Pro Ile Glu Tyr Met Ile Asn Asn Lys Leu Asp Glu Lys Tyr Gly Phe

50 55 60

Lys Ile Glu Thr Val Tyr Phe Pro Ser Gly Gly Pro Met Asn Glu Ala65 70 75 80

Leu Gly Ala Gly Leu Trp Glu Val Gly Thr Leu Ser Ala Ala Ser Val

85 90 95

Tyr Ser Leu Ala Asn Tyr Asn Ala His Val Val Ala Asp Ile Gly His

100 105 110

Ser Glu Gly Gly Ile Glu Val Leu Val Asn Pro Asp Ser Asp Ile Leu

115 120 125

Thr Val Lys Gly Val Asn Lys Asp Phe Pro Glu Val Tyr Gly Asp Ala

130 135 140

Ala Thr Leu Lys Gly Lys Thr Ile Ser Val Pro Thr Gly Thr Ile Ser145 150 155 160

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Asp Asn Pro Gln980

<210> 11<211> 954<212> DNA<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 11

atgagaaatg tttttatcac tattagtgcc attctatcat taatattaat gattggatgc 60caaaaaagca acaatctcaa ctacattttt gctacaggcg gaacaagcgg tacatactat 120tcattcggcg gaagtatagc tagtatatgg aatgctaata tagaaggaat gaatgttact 180gctcaatcaa caggagcttc tgctgaaaac ttaagacttc ttaacagaca tgaagctgat 240ttagcattcg tacaaaacga tgttatggac tatgcctata acggtactga tatatttgac 300ggtgaagtat tatcaaactt ctctgctatt cttacattat atccagaaat agtgcaaata 360gcagctacaa aagcaagcgg catcacaaca attgctgata tgaaaggaaa aagagtatca 420gttggagatg ctggaagcgg tacagaattc aatgctaaac aaatattaga agcttatgga 480ttgactttta atgatataaa caaatcaaat ctttcattta aagaatcaag cgacggactt 540caaaacggta ctttagatgc ttgtttcata gttgcaggaa tacctaatgc agctttacaa 600gaattatctt tatcaagcga tatcgtttta gtatctttag acaaagttca ggtagatgat 660atcttaaata aatataaata ttatacagaa gttacaatac ctgctaatac atataataat 720

870

Met Ala Thr Met Asn Val885 890

Arg Val Arg Ile Ile Pro905

Ala Phe Asp Gly Gly Val920

Gly Gly Asn Ala Gln Ala935

Asn Val Lys Met Ala Gln950

Gly Ser Gly Lys Lys Tyr965 970

875 880

Ile His Asn Glu Leu Val895

Asn Ser Phe Asp Thr Ile910

Glu Glu Lys Ser Ser Ala925

Ile Gln Ser Lys Val Lys940

Lys Ile Gly Arg Asn Asp955 960

Lys His Cys His Gly Lys975gttactacag atactacagc aatagcagta aaagcaacta tcgcagttaa taacaatata 780cctgaagatg ttgtttacaa tctaataaaa actttatttg ataaaaaaac tgatttagca 840actgctcatg ctaaaggtga agaattaaat attgatgatg cttataaagg catatcagta 900cctttccatc caggtgcttt aaaatattat aaagaattag gatataatat acaa 954

<210> 12<211> 318<212> PRT

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 12

Met Arg Asn Val Phe Ile Thr Ile Ser Ala Ile Leu Ser Leu Ile Leu

1 5 10 15

Met Ile Gly Cys Gln Lys Ser Asn Asn Leu Asn Tyr Ile Phe Ala Thr

20 25 30

Gly Gly Thr Ser Gly Thr Tyr Tyr Ser Phe Gly Gly Ser Ile Ala Ser

35 40 45

Ile Trp Asn Ala Asn Ile Glu Gly Met Asn Val Thr Ala Gln Ser Thr

50 55 60

Gly Ala Ser Ala Glu Asn Leu Arg Leu Leu Asn Arg His Glu Ala Asp65 70 75 80

Leu Ala Phe Val Gln Asn Asp Val Met Asp Tyr Ala Tyr Asn Gly Thr

85 90 95

Asp Ile Phe Asp Gly Glu Val Leu Ser Asn Phe Ser Ala Ile Leu Thr

100 105 110

Leu Tyr Pro Glu Ile Val Gln Ile Ala Ala Thr Lys Ala Ser Gly Ile

115 120 125

Thr Thr Ile Ala Asp Met Lys Gly Lys Arg Val Ser Val Gly Asp Ala

130 135 140

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Asn Ala Lys Gln Ile Leu Glu Ala Tyr Gly145 150 155 160

Leu Thr Phe Asn Asp Ile Asn Lys Ser Asn Leu Ser Phe Lys Glu Ser

165 170 175

Ser Asp Gly Leu Gln Asn Gly Thr Leu Asp Ala Cys Phe Ile Val Ala180 185 190

Gly Ile Pro Asn Ala Ala Leu Gln Glu Leu Ser Leu Ser Ser Asp Ile

195 200 205

Val Leu Val Ser Leu Asp Lys Val Gln Val Asp Asp Ile Leu Asn Lys

210 215 220

Tyr Lys Tyr Tyr Thr Glu Val Thr Ile Pro Ala Asn Thr Tyr Asn Asn225 230 235 240

Val Thr Thr Asp Thr Thr Ala Ile Ala Val Lys Ala Thr Ile Ala Val

245 250 255

Asn Asn Asn Ile Pro Glu Asp Val Val Tyr Asn Leu Ile Lys Thr Leu

260 265 270

Phe Asp Lys Lys Thr Asp Leu Ala Thr Ala His Ala Lys Gly Glu Glu

275 280 285

Leu Asn Ile Asp Asp Ala Tyr Lys Gly Ile Ser Val Pro Phe His Pro

290 295 300

Gly Ala Leu Lys Tyr Tyr Lys Glu Leu Gly Tyr Asn Ile Gln305 310 315

<210> 13<211> 1149<212> DNA

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 13

atgggagtca aaaagtattt ctttttattg ctagtcttat tagctatgaa tagtatatat 60gcatttgcaa atcaaaatat tataagagta caattaacag atgtaaaagc accatatact 120attaatatca aaggaccata taaagcatac aattataaat atgaaagtga aattatatct 180gctcttacca atgaaactgt aatggtagtt gaaaacagat taggattaaa agttaatgaa 240gtaggagttt ataaagaagg tatagtattt gaaactcagg atggatttac tttaaatggt 300attgaatatt atggttcttt aatgtttatt ccatataatg atacaatgat agttgttaat 360gaacttaata ttgaagatta tgttaaagga gtacttcctc atgaaatgtc tcctgattgg 420cctatggaag ctttaaaagc tcaggcagta gcagctagaa cttatgctat gtatcatata 480ttaaaaaatg ctaataaact tccttttgat gttgataata ctacaaaata tcaagtttat 540aatggtaaag aaaaaatgaa ttggtctgta gaacaggcag ttgatagaac tagatatgag 600attgctgttt ataaaggaaa agttatagct acatatttca gtgctttatg cggcggacat 660actgatagtg ctgaaaatgt atttggtgtt gctgttcctt atttgggcgg tgttgcttgt 720ccttactgca atgctcagat taagccttgg actaatgctt tgagttataa tgagcttaat 780aatgatttag ctaattattc tgtacatgct actgaaaaat cttctatagg tataagtact 840gatcctaaat ctggaaaagc tactaatata aaaatagata ataatgatat tacttcaaga 900gatttcagaa ctactctttc tcctagatta gtaccttcac ttaacttcac tattaaaaaa 960gttgataacg gtattataat cactggaaaa ggaagtggac atggagtagg tatgtgtcag 1020tggggtgctt acggtatggc acaagtaaaa aaagattata aagagatttt aaaattctat 1080tataacggag ttgatatcgt agattataat agagttaata aagagtttga acccgatgta 1140tggggaaat 1149

<210> 14<211> 383<212> PRT

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 14

Met Gly Val Lys Lys Tyr Phe Phe Leu Leu Leu Val Leu Leu Ala Met

15 10 15

Asn Ser Ile Tyr Ala Phe Ala Asn Gln Asn Ile Ile Arg Val Gln Leu

20 25 30

Thr Asp Val Lys Ala Pro Tyr Thr Ile Asn Ile Lys Gly Pro Tyr Lys

35 40 45

Ala Tyr Asn Tyr Lys Tyr Glu Ser Glu Ile Ile Ser Ala Leu Thr Asn

50 55 60

Glu Thr Val Met Val Val Glu Asn Arg Leu Gly Leu Lys Val Asn Glu65 70 75 80

Val Gly Val Tyr Lys Glu Gly Ile Val Phe Glu Thr Gln Asp Gly Phe

85 90 95

Thr Leu Asn Gly Ile Glu Tyr Tyr Gly Ser Leu Met Phe Ile Pro Tyr

100 105 110

Asn Asp Thr Met Ile Val Val Asn Glu Leu Asn Ile Glu Asp Tyr Val

115 120 125

Lys Gly Val Leu Pro His Glu Met Ser Pro Asp Trp Pro Met Glu Ala130 135 140

Leu Lys Ala Gln Ala Val Ala Ala Arg Thr Tyr Ala Met Tyr His Ile145 150 155 160

Leu Lys Asn Ala Asn Lys Leu Pro Phe Asp Val Asp Asn Thr Thr Lys

165 170 175

Tyr Gln Val Tyr Asn Gly Lys Glu Lys Met Asn Trp Ser Val Glu Gln

180 185 190

Ala Val Asp Arg Thr Arg Tyr Glu Ile Ala Val Tyr Lys Gly Lys Val

195 200 205

Ile Ala Thr Tyr Phe Ser Ala Leu Cys Gly Gly His Thr Asp Ser Ala

210 215 220

Glu Asn Val Phe Gly Val Ala Val Pro Tyr Leu Gly Gly Val Ala Cys225 230 235 240

Pro Tyr Cys Asn Ala Gln Ile Lys Pro Trp Thr Asn Ala Leu Ser Tyr

245 250 255

Asn Glu Leu Asn Asn Asp Leu Ala Asn Tyr Ser Val His Ala Thr Glu

260 265 270

Lys Ser Ser Ile Gly Ile Ser Thr Asp Pro Lys Ser Gly Lys Ala Thr

275 280 285

Asn Ile Lys Ile Asp Asn Asn Asp Ile Thr Ser Arg Asp Phe Arg Thr

290 295 300

Thr Leu Ser Pro Arg Leu Val Pro Ser Leu Asn Phe Thr Ile Lys Lys305 310 315 320

Val Asp Asn Gly Ile Ile Ile Thr Gly Lys Gly Ser Gly His Gly Val

325 330 335

Gly Met Cys Gln Trp Gly Ala Tyr Gly Met Ala Gln Val Lys Lys Asp

340 345 350

Tyr Lys Glu Ile Leu Lys Phe Tyr Tyr Asn Gly Val Asp Ile Val Asp

355 360 365

Tyr Asn Arg Val Asn Lys Glu Phe Glu Pro Asp Val Trp Gly Asn

370 375 380

<210> 15<211> 708<212> DNA

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 15

atgaatatga aaagattaag tatcttgata acaatgttaa ttctaactgt tgcattcttg 60ttgtttgccc aagatgcggc tcaaacaggt gagcaaacta ctcaaaatca gggtgaaaat 120ggtaataact tcgtaactga agctatcact aactacttaa tagatgattt tgaatttgct 180aatacttggc aagcttctat gcctagagat tacggtgtag ttagcatcat tcgtcgtgaa 240ggcggtccag ctgatgttgt agctgaaggt gctgaaaata ataaatatat tttaggtgct 300aaagtagagt acttcagaac aggttatcct tggttctctg ttactcctcc tagacctgtt 360aaaatacctg gttatactaa agaacttagt gtttgggtag ctggtcgtaa ccataataat 420agaatgagtt tctatgttta tgatgtaaac ggtaagcctc aagcagttgg taatgaagct 480cttaacttta tgggttggaa aaacattact gtacaaattc ctgctaatat aagacaagaa 540gaattcagag gacaagttga acaaggtatt agctttatgg gtatacatgt taaagttgat 600cctagagatt cttatggtaa atattatata tacttcgatc aattaatggc taagactgat 660atgtacttag aaacttatag agaagaagat gacccattag atacttgg 708

<210> 16<211> 236<212> PRT

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 16

Met Asn Met Lys Arg Leu Ser Ile Leu Ile Thr Met Leu Ile Leu Thr

1 5 10 15

Val Ala Phe Leu Leu Phe Ala Gln Asp Ala Ala Gln Thr Gly Glu Gln

20 25 30

Thr Thr Gln Asn Gln Gly Glu Asn Gly Asn Asn Phe Val Thr Glu Ala

35 40 45

Ile Thr Asn Tyr Leu Ile Asp Asp Phe Glu Phe Ala Asn Thr Trp Gln

50 55 60

Ala Ser Met Pro Arg Asp Tyr Gly Val Val Ser Ile Ile Arg Arg Glu65 70 75 80

Gly Gly Pro Ala Asp Val Val Ala Glu Gly Ala Glu Asn Asn Lys Tyr85 90 95

Ile Leu Gly Ala Lys Val Glu Tyr Phe Arg Thr Gly Tyr Pro Trp Phe

100 105 110

Ser Val Thr Pro Pro Arg Pro Val Lys Ile Pro Gly Tyr Thr Lys Glu

115 120 125

Leu Ser Val Trp Val Ala Gly Arg Asn His Asn Asn Arg Met Ser Phe

130 135 140

Tyr Val Tyr Asp Val Asn Gly Lys Pro Gln Ala Val Gly Asn Glu Ala145 150 155 160

Leu Asn Phe Met Gly Trp Lys Asn Ile Thr Val Gln Ile Pro Ala Asn

165 170 175

Ile Arg Gln Glu Glu Phe Arg Gly Gln Val Glu Gln Gly Ile Ser Phe

180 185 190

Met Gly Ile His Val Lys Val Asp Pro Arg Asp Ser Tyr Gly Lys Tyr

195 200 205

Tyr Ile Tyr Phe Asp Gln Leu Met Ala Lys Thr Asp Met Tyr Leu Glu

210 215 220

Thr Tyr Arg Glu Glu Asp Asp Pro Leu Asp Thr Trp225 230 235

<210> 17<211> 26<212> DNA

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 17

ggtgatgcaa caacattgaa agtggc<210> 18<211> 27<212> DNA

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 18

gtcagctgtt attcttacag aatcacc<210> 19<211> 26<212> DNA

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 19

tgatatagga cactctgaag gcggta<210> 20<211> 26<212> DNA

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 20

ttgagcagcc atattaggat cagcct<210> 21<211> 25<212> DNA

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 21

aggaatacag gctggaattg gacta<210> 22<211> 27<212> DNA

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 22

cataatctat ggcaagcaaa gctctgt<210> 23<211> 27<212> DNA

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 23

ggagcagtag gtaaatacgg aagttta<210> 24<211> 27<212> DNA<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 24

actatcagcg aaaggaactg cctccat<210> 25<211> 19<212> DNA

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 25

atttcatgcg gcggcggaa<210> 26<211> 31<212> DNA

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 26

ttgtattaaa ttaactgtaa ctatatctaa a<210> 27<211> 34<212> DNA

<213> Braehyspira hyodysenteriae<400> 27

aaetcgaggt ttttattagt geggatattg aagg<210> 28<211> 33<212> DNA

<213> Braehyspira hyodysenteriae<400> 28

atgaatteea aggetcttag tattteataa tag

<210> 29<211> 28<212> DNA

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 29caccatgtta atcaggcatt gaaagctc<210> 30<211> 29<212> DNA<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 30ctctcgccgc cgaataaacg cattaaatc<210> 31<211> 33<212> DNA<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 31agctcgaggt tacagtaaac gattacctcg Cta<210> 32<211> 33<212> DNA<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 32caagatctag gattatcctt cccatggcaa tgc<210> 33<211> 23<212> DNA<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 33agaaatgttt ttatcactat tag<210> 34<211> 26<212> DNA<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 34ttgtatatta tateetaatt etttat<210> 35<211> 29<212> DNA

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 35

gaaggtatag tatttgaaac tcaggatgg<210> 36<211> 27<212> DNA

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 36

ccagatttag gatcagtact tatacct<210> 37<211> 37<212> DNA

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 37

gactcgagag agtacaatta acagatgtaa aagcacc<210> 38<211> 33<212> DNA

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 38

tcgaattctc cccatacatc gggttcaaac tct<210> 39<211> 25<212> DNA

<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 39

ctgttgcatt cttgttgttt gccca<210> 40<211> 27<212> DNA<213> Brachyspira hyodysenteriae<400> 40

ccaagtatct aatgggtcat cttcttc<210> 41<211> 32<212> DNA

<213> Artificial Sequence<220>

<223> H7-F58-XhoI primer<400> 41

tactcgagtg tgctaataag ggatcatcat ct<210> 42<211> 32<212> DNA

<213> Artificial Sequence<220>

<223> H7-R1036-Pstl primer<400> 42

cactgcagtg ctttacctaa taattcagta tc<210> 43<211> 33<212> DNA

<213> Artificial Sequence<220>

<223> H8-F62-XhoI primer<400> 43

aactcgagac tttgacttat gctgcttata tgg<210> 44<211> 33<212> DNA

<213> Artificial Sequence<220><223> H8-R1454-EcoRI primer<400> 44

ttgaattcat aatctatggc aagcaaagct ctg<210> 45<211> 28<212> DNA

<213> Artificial Sequence<220>

<223> H10-F52-XhoI primer<400> 45

attctcgaga tttcatgcgg cggcggaa<210> 46<211> 40<212> DNA

<213> Artificial Sequence<220>

<223> H10-R1074-EcoRI primer<400> 46

gttgaattct tgtattaaat taactgtaac tatatctaaa<210> 47<211> 34<212> DNA

<213> Artificial Sequence<220>

<223> H12-F7-XhoI primer<400> 47

aactcgaggt ttttattagt gcggatattg aagg<210> 48<211> 33<212> DNA

<213> Artificial Sequence<220><223> H12-R792-EcoRI primer

<400> 48

atgaattcca aggctcttag tatttcataa tag<210> 49<211> 33<212> DNA

<213> Artificial Sequence<220>

<223> Hl7-F45I-XhoI primer<400> 49

agctcgaggt tacagtaaac gattacctcg cta<210> 50<211> 33<212> DNA

<213> Artificial Sequence<220>

<223> H17-R2937-BglII primer<400> 50

caagatctag gattatcctt cccatggcaa tgc<210> 51<211> 32<212> DNA

<213> Artificial Sequence<220>

<223> H21-F4-XhoI primer<400> 51

ctactcgaga gaaatgtttt tatcactatt ag<210> 52<211> 35<212> DNA

<213> Artificial Sequence<220><223> H21-R954-EcoRI primer<400> 52

ctagaattct tgtatattat atcctaattc tttat<210> 53<211> 37<212> DNA

<213> Artificial Sequence<220>

<223> H34-F84-XhoI primer<400> 53

gactcgagag agtacaatta acagatgtaa aagcacc<210> 54<211> 33<212> DNA

<213> Artificial Sequence<220>

<223> H34-Rl146-EcoRI primer<400> 54

tcgaattctc eceatacatc gggtteaaac tet<210> 55<211> 29<212> DNA

<213> Artificial Sequence<220>

<223> H42-F76-XhoI primer<400> 55

gactcgaggc ggctcaaaca ggtgagcaa<210> 56<211> 34<212> DNA

<213> Artificial Sequence<220><223> H42-R705-Pstl primer

<400> 56

gcctgcagag tatctaatgg gtcatcttct tctc

Claims (37)

1. Polinucleotídeo, que compreende a seqüência selecionada dogrupo que consiste em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, e 15.

2. Plasm ídeo, que compreende o polinucleotídeo, de acordo coma reivindicação 1.

3. Plasmídeo, de acordo com a reivindicação 2, em que o ditoplasmídeo é um vetor de expressão.

4. Célula contendo o plasmídeo, como definidido na reivindica-ção 2.

5. Célula contendo o plasmídeo, como definidido na reivindica-ção 3.

6. Composição imunogênica, que compreende o plasmídeo, co-mo definidido na reivindicação 3.

7. Composição de vacina para o tratamento ou prevenção deBrachyspira hyodysenteriae que compreende o vetor de expressão, comodefinidido na reivindicação 3.

8. Composição de vacina para o tratamento ou prevenção deBrachyspira hyodysenteriae que compreende a célula, como definidido nareivindicação 4.

9. Molécula de DNA, que compreende uma seqüência que é aomenos 70% homóloga ao polinucleotídeo, como definidido na reivindicação-1.

10. Plasmídeo, que compreende o polinucleotídeo, como defini-dido na reivindicação 9.

11. Molécula de DNA1 de acordo com a reivindicação 9 , em quea dita molécula de DNA é ao menos 80% homóloga ao polinucleotídeo, co-mo definidido na reivindicação 1.

12. Plasmídeo, que compreende os polinucleotídeo, como defi-nidido na reivindicação 11.

13. Molécula de DNA, de acordo com a reivindicação 9, em quea dita molécula de DNA é ao menos 90% homóloga aos polinucleotídeo,como definidido na reivindicação 1.

14. Plasmideo, que compreende o polinucleotídeo, como defini-dido na reivindicação 13.

15. Polipeptídeo, que compreende a seqüência selecionada dogrupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, e 16.

16. Polinucleotídeo, que compreende uma seqüência que codifi-ca o polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 15.

17. Plasm ídeo, que compreende o polinucleotídeo, de acordocom a reivindicação 16.

18. Plasmídeo, de acordo com a reivindicação 17, em que o ditoplasmídeo é um vetor de expressão.

19. Célula que contém o plasmídeo, como definidido na reivindi-cação 17.

20. Composição imunogênica, que compreende a célula, comodefinidido na reivindicação 19.

21. Proteína que compreende uma seqüência que é ao menos-70% homóloga ao polipeptídeo, como definidido na reivindicação 15.

22. Proteína, de acordo com a reivindicação 21, em que a ditaproteína é ao menos 80% homóloga ao polipeptídeo, como definidido na rei-vindicação 15.

23. Proteína, de acordo com a reivindicação 22, em que a ditaproteína é ao menos 90% homóloga ao polipeptídeo, como definidido na rei-vindicação 15.

24. Composição imunogênica, que compreende a proteína, co-mo definidido na reivindicação 23.

25. Composição imunogênica, que compreende o polipeptídeo,como definidido na reivindicação 15.

26. Composição de vacina para o tratamento ou prevenção deBrachyspira hyodysenteriae que compreende o polipeptídeo, como definidi-do na reivindicação 15.

27. Anticorpo monoclonal que se liga ao polipeptídeo, como de-finidido na reivindicação 15.

28. Kit para o diagnóstico da presença de Brachyspira hyodysen-teriae em um animal, sendo que o dito kit compreende o anticorpo monoclo-nal, como definidido na reivindicação 27.

29. Kit para o diagnóstico da presença de Brachyspira hyodysen-teriae em um animal, sendo que o dito kit compreende os polipeptídeos, co-mo definidido na reivindicação 15.

30. Kit para o diagnóstico da presença de Brachyspira hyodysen-teriae em um animal, sendo que o dito kit compreende os polinucleotídeos,como definidido na reivindicação 1.

31. Método para gerar uma resposta imune a Brachyspirahyodysenteriae em um animal que compreende administrar no dito animal acomposição imunogênica, como definidido na reivindicação 24.

32. Método para gerar uma resposta imune a Brachyspirahyodysenteriae em um animal que compreende administrar no dito animal acomposição imunogênica, como definidido na reivindicação 25.

33. Método para gerar uma resposta imune a Brachyspirahyodysenteriae em um animal que compreende administrar no dito animal acomposição imunogênica, como definidido na reivindicação 6.

34. Método para gerar uma resposta imune a Braehyspirahyodysenteriae em um animal que compreende administrar no dito animal acomposição imunogênica, como definidido na reivindicação 20.

35. Método para tratar ou prevenir uma doença causada porBraehyspira hyodysenteriae em um animal necessitado do dito tratamentoque compreende administrar no dito animal uma quantidade terapeuticamen-te eficaz da composição de vacina, como definidido na reivindicação 7.

36. Método para tratar ou prevenir uma doença causada porBraehyspira hyodysenteriae em um animal necessitado do dito tratamentoque compreende administrar no dito animal uma quantidade terapeuticamen-te eficaz da composição de vacina, de acordo com a reivindicação 8.

37. Método para tratar ou prevenir uma doença causada porBraehyspira hyodysenteriae em um animal necessitado do dito tratamentoque compreende administrar no dito animal uma quantidade terapeuticamen-te eficaz da composição de vacina, como definidido na reivindicação 26.