BRPI0709033A2 - composição farmacêutica, métodos de tratamento ou prevenção de doença neurodegenerativa numa pessoa, de inibição ou redução da fosforilação de uma proteìna tau num neurÈnio, célula glial ou corpo de lewy, de intensificação da atividade de pp2a e de inibição da atividade de gsk3 num neurÈnio ou célula glial e uso de selenato ou sal farmaceuticamamente aceitável do mesmo - Google Patents

Abstract

Composição Farmacêutica, Métodos de Tratamento ou Prevenção e Doença Neurodegenerativa numa Pessoa, e Inibição ou Redução da Fosforilação de uma Proteína Tau um Neurónio, Célula Glial ou Corpo de Lewy, e Intensificação da Atividade de PP2A de Inibição da Atividade de GSK3 num Neurónio ou Célula Glial Uso de Selenato ou Sal Farmaceuticamente Aceitável do Mesmo A presente invenção relaciona-se com o uso de selenado ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo em métodos e composições para intensificar a atividade da fosfatase de proteína PP2A. São ambém descritos os métodos de redução da fosforilação da proteína tau, e inibição da atividade de GSK3 e de tratamento ou prevenção de oenças neurodegenerativas.

Description

"Composição Farmacêutica, Métodos de Tratamento ou Prevençãode Doença Neurodegenerativa numa Pessoa,

de Inibição ou Redução da Fosforilação de uma Proteína Taunum Neurônio, Célula Glial ou Corpo de Lewy,

de Intensificação da Atividade de PP2Ae de Inibição da Atividade de GSK3 num Neurônio ou Célula Gliale Uso de Selenato ou Sal Farmaceuticamente Aceitável do Mesmo"

Relatório Descritivo

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se ao uso do selenato ou um sal farmaceuti-

camente aceitável do mesmo em métodos e composições para aumentara atividade da PP2A. A presente invenção também se refere ao uso doselenato ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo em métodosde inibição ou redução da fosforilação da proteína tau, em métodos paraa inibição da atividade do GSK3p e particularmente em métodos para otratamento ou prevenção de doenças neurodegenerativas. Em algumasmodalidades, a invenção se refere ao uso do selenato ou um sal farma-ceuticamente aceitável do mesmo em combinação com outras terapiaspara uso em métodos de tratamento ou prevenção de doenças neurode-generativas.

Antecedentes da Invenção

Doença degenerativa é um termo geral para um certo número dedesordens que atuam pelo comprometimento da capacidade do cérebrode autocontrole ou do corpo de danificar neurônios que facilitam afunção normal do cérebro. As doenças neurodegenerativas são primari-amente doenças de pessoas idosas. Com um aumento na expectativade vida, a população do mundo está vivendo mais e o número deportadores de doenças neurodegenerativas tem aumentado.

Num certo número de doenças neurodegenerativas, existe a depo-sição anormal de proteína tau nos neurônios e células gliais no cérebro.Por exemplo, a proteína tau anormal tem sido achada em emaranhadosneurofibrilares característicos da doença de Alzheimer (AD). Os emara-nhados neurofibrilares (NTs) são uma das duas marcas registradasneuropatológicas da AD [Lee e colaboradores, 2001]. Filamentoshelicoidais emparelhados (PHFs) são os componentes estruturaisprincipais dos NTs e são principalmente compostos de proteína tauassociada com microtúbulos [Lee e colaboradores, 1991, Grundke-Iqbale colaboradores, 1986a, Grundke-Iqbal e colaboradores, 1986b]. PHF-tau (proteína tau isolada dos PHFs) é altamente insolúvel, mostramobilidade retardada em gel SDS e é incapaz de se ligar ao microtúbu-lo porque é anormalmente fosforilada (fosforilada em mais locais do quea proteína tau normal) [Lee e colaboradores, 1991, Grundke-Iqbal ecolaboradores, 1986a, Grundke-Iqbal e colaboradores, 1986b], Sobdesfoforilação, a PHF-tau se torna solúvel e tão capaz quanto a proteínatau normal de se ligar e promover a montagem de microtúbulos [Wang ecolaboradores, 1995, Wang e colaboradores, 1996, Bramblett e colabo-radores, 1993]. Acredita-se que a fosforilação tau anormal causedisfunção da tau, instabilidade dos microtúbulos, perda de transporteno axônio, neurodegeneração e demência associada com AD [Alonso ecolaboradores, 1996].

Um tipo de proteína tau anormal é a proteína tau hiper-fosforilada. A proteína tau é conhecida ser fosforilada em um númerode locais de fosforilação pela quinase sintase glicogênio 3β (GSK3p) invivo, incluindo o resíduo Ser396 específico da doença de Alzheimer [Li ePaudel, 2006]. De fato, a GSK3p é conhecida por ser fosforilada pelaproteína quinase Akt e a atividade da Akt é conhecida de ser atenuadapela proteína fosfatase PP2A.

A PP2A é uma holoenzima heterotrimérica que existe em múlti-plas formas compostas de uma estrutura núcleo comum ligada asubunidades regulatórias diferentes [Mumby e Walter, 1993]. A enzimanúcleo é um complexo entre as subunidades catalíticas (C) e estruturais(A). Uma terceira classe de subunidade, denominada B, compreendediversos polipeptídios que regulam a atividade e especificidade da PP2A[Mumby e Walter, 1993, Kamibayashi e colaboradores, 1994]. Umaporção significativa da isoforma ABC do PP2A está associada commicrotúbulos neuronais [Somntag e colaboradores, 1995], implicando oPP2A na regulação do estado de fosforização das proteínas associadasaos microtúbulos (MAPs), tal como a tau. A PP2A contém as subunida-des regulatórias B, mas nenhuma outra forma de PP2A (isto é, B' e B")tem sido mostrada se ligar e potencialmente desfosforilar a tau in vitro.Além disso, a inibição da isoforma ABC da PP2A induz a hiperfosforila-ção da tau, dissociação da tau dos microtúbulos e perda da estabiliza-ção dos microtúbulos induzida pela tau [Sontag e colaboradores, 1996],Tem sido recentemente mostrado que a PP2A corresponde a aproxima-damente 71% da atividade de fosfatase da tau total do cérebro humano[Liu e colaboradores, 2005]. A atividade de fosfatase total e as ativida-des da PP2A com relação a tau são significativamente diminuídas noscérebros de pacientes AD enquanto aquelas de outras fosfatases taiscomo PP2B são de fato aumentadas no cérebro AD [Liu e colaboradores,2005]. A atividade da PP2A negativamente se correlaciona ao nível dafosforilação da tau na maioria dos locais de fosforilação em cérebroshumanos. Isto indica que a PP2A é a principal fosfatase da tau queregula sua fosforilação em locais múltiplos no cérebro humano. Istoimplica que a hiperfosforilação anormal da tau é parcialmente devida àregulação para menor da atividade da PP2A no cérebro AD e que agen-tes que podem atuar para impulsionar a atividade da PP2A e em parti-cular da isoforma ABC da PP2A teria utilidade clínica no tratamento eou prevenção do desenvolvimento das doenças neurodegenerativas.

Existe também evidência crescente de que a fosforilação anormalda proteína tau pode ser associada com desordens neurodegenerativasem que a proteína α-sinucleína está presente. Ambas as patologias taue α-sinucleína ocorrem na doença de Alzheimer, doença de Parkinson,complexo de demência Guam-Parkinson-ALS e doença de Parkinsoncausada por mutações na α-sinucleína (Duda e colaboradores, 2002,Forman e colaboradores, 2002, Ishizawa e colaboradores, 2003).

A proteína α-sinucleína parece ter um papel importante na patofi-siologia da doença de Parkinson (PD). Os corpos de Lewy são umamarca registrada patológica da PD que são compostos primariamente deα-sinucleína (Spillantini e colaboradores, 1997; Spillantini e colabora-dores, 1998b).

Pensa-se que a α-sinucleína exerce um papel crítico na patofisio-logia da PD, porque se acumula nos corpos de Lewy e porque estudosgenéticos identificaram mutações na α-sinucleína que são associadascom a PD familial (Kruger e colaboradores, 1998; Polymeropoulos ecolaboradores, 1997; Singleton e colaboradores, 2003; Spillantini ecolaboradores, 1998b; Zarranz e colaboradores, 2004).

As mutações A53T e A30P na α-sinucleína parecem ser causado-ras na PD pelo aumento da tendência da α-sinucleína de se agregar.Ambas as mutações aumentam a tendência da α-sinucleína de seagrega espontaneamente ou em resposta a fatores exógenos, tais comoestresse de metais e oxidativos (Conway e colaboradores, 2000; Hashi-moto e colaboradores, 1999; Kruger e colaboradores, 1998; Ostrerova-Golts e colaboradores, 2000; Paik e colaboradores, 1999, 2000; Polyme-ropoulos e colaboradores, 1997).

As mutações A53T e A30P na α-sinucleína também causam agre-gação da α-sinucleína dependente da idade e dano neuronal em ratostransgênicos e Drosophila (Feany e Bender, 2000; Giasson e colabora-dores, 2002; Kahle e colaboradores, 2001; Masliah e colaboradores,2000). Estes resultados enfatizam a relevância da α-sinucleína para oestudo da neurodegeneração.

A tau fosforilada anormal está presente nos corpos de Lewy en-contrados em pacientes PD esporádicos e ocorre nos neurônios próxi-mos de áreas contendo a patologia α-sinucleína (Ishoizawa e colabora-dores, 2003). Evidência in vitro também liga a α-sinucleína a tau assimcomo α-sinucleína se liga a tau in vitro e estimula a fosforilação da taupela proteína quinase A in vitro (Giasson e colaboradores, 2003; Jensene colaboradores, 1999). Resultados recentes indicam que a a-sinucleína aumenta a íibrilização da tau in vitro e que fibrilas de tauestão presentes nos cérebros de ratos transgênicos sintomáticos superexpressando a α-sinucleína A53T mutante (Giasson e colaboradores,2003). Frasier e colaboradores 2005 mostraram que a agregação a-sinucleína A30P ocorre em paralelo da patologia tau e que a agregaçãoα-sinucleína ocorre em paralelo com a patologia tau em ratos transgêni-cos superexpressando a α-sinucleína A30P e mostraram que o ratotransgênico α-sinucleína A30P sintomático exibe fosforilação tauanormal e que a fosforilação se correlaciona com a ativação de umaquinase c-jun.

Dissociado da agregação da α-sinucleína (α-Syn), o estresse oxi-dativo e a exposição a certas neurotoxinas tal como a l-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) são ligados à patogênese da PD. AMPTP induz uma degeneração seletiva do caminho dopaminérgiconigrostriatal em ratos e primatas, como visto na PD, associado com oaumento nos níveis de expressão α-Syn e agregação, mas sem induzircorpos de Lewy reais (Dauer e Przedborski, 2003), mas engatilhando aformação de inclusões nigrais imunorreativas para a ubiquitina e a-sinucleína na administração contínua da MPTP (Fornai e colaboradores,2005). Outro componente de certos corpos de Lewy é a tau fosforiladaanormalmente (Ishizawa e colaboradores, 2003). A co-localizaçãoneuronal de tau e α-Sin como agregados ou inclusões ou dentro decertos corpos de Lewy ou inclusões do tipo corpo de Lewy, tem sidorelatadas em cérebros de pacientes com doença de Alzheimer da família(AD), síndrome de Down e doença do corpo de Lewy (Kotzbauer ecolaboradores, 2001; Lippa e colaboradores, 1999; Arima e colaborado-res, 1999; Iseki e colaboradores, 1999).

As similaridades entre a tau e a α-Sin incluem a expressão nosneurônios pré-sinápticos, meias vidas longas in vivo, suas naturezas"nativamente reveladas" permitindo suas estabilidades ao calor e suapropensão a formar fibrilas ao esticar resíduos hidrofóbicos que formamo núcleo das fibrilas montadas (Friedhoff e colaboradores, 2000; Serpelle colaboradores, 2000)

Outros dados in vitro com o tau mutante duplo 3E [396/404JS(um construto de pseudo-fosforilação imitando os locais de fosforilaçãoPHF-I nos quais os dois resíduos de serina na posição 396 e 404 naisoforma humana mais comprida de tau, ht40, foram substituídos porresíduos de glutamato) também indicam que a hiperfosforilação naSer396/404 pode levar à terminação C de tau a assumir uma confor-mação mais estendida, alterando seu efeito inibidor na oligomerizaçãode tau e potencializando a taxa de formação do filamento (Abraha ecolaboradores, 2000).

Duka e colaboradores, 2006, tem agora mostrado que os aumen-tos MPTP induzidos nos níveis de expressão α-Sin nos neurôniosdopaminérgicos mesencefálicos promovem mudanças nos padrões defosforilação de tau no local de ligação PHF-I (Ser396/404), resultandona localização errada de ambas as proteínas e com co-imunoprecipita-ção aumentada, junto com níveis aumentados de tau hiper-fosforiladoinsolúvel em sarcosil, sugerindo que uma etapa inicial no parkinsonis-mo e na neurotoxicidade induzidos pela MPTP é uma hiperfosforilaçãoα-Sin direcionada de Tau no Ser396/404.

As descobertas de que a MPTP causa uma dissociação aumentadade α-Sin a partir de microtúbulos, junto com diminuições nos níveis detau fosforilado associados com a fração de ligação citoesqueletal, podetambém ser de relevância para o(s) mecanismo(s) subjacente ao proces-so neurodegenerativo. A hiperfosforilação de tau grandemente reduz aafinidade de tau por microtúbulos, causando sua desestabilização(Drechsel e colaboradores, 1992; Biernat e colaboradores, 1993; Micha-elis e colaboradores, 2002). Além disso, o tau fosforilado é tambémconhecido de se ligar e esgotar outras proteínas que se ligam ao micro-túbulo, tal como a MAPl e MAP2, a partir dos microtúbulos (Wersingere Sidhu, 2005) com um possível papel no transporte de axônio (Sidhu ecolaboradores, 2004), é provável que a dissociação desta proteína dosmicrotúbulos ainda agrave a instabilidade dos microtúbulos, rompendoa rede citoesqueletal e homeostase celular. Assim, a dissociação da a-Sin dos microtúbulos e anormalidades nas propriedades de tau ligadaao microtúbulos pode compreender outra ligação na cadeia de eventoslevando ao processo neurodegenerativo associado com a formação deinclusão.

As anormalidades induzidas pela MPTP nos níveis de α-Sin modu-lam a formação de tau fosforilado e a forma de tau PHF-1, em particu-lar, fornece indicativos no desenvolvimento das fases iniciais de ambosa formação de PHF e perda associada de função neuronal vital e sugereque as síndromes ou neurotoxicidades parkinsonianas induzidas pelaMPTP podem ser uma tauopatia com alterações concomitantes na α-Sinde um modo remanescente de sinucleopatias.

Isto sugere que anormalidades de uma proteína (tau) conhecidapara ser mobilizada durante a patogénese da AD, podem também sermobilizadas no parkinsonismo, mas em uma região do cérebro nãoassociada com AD, sugerindo, desta forma, considerável interação nagênese de certas doenças neurodegenerativas. Isto sugere que doençasneurodegenerativas que parecem não relacionadas podem de fato tereventos de disparo comum e patologias subseqüentes, as quais põemem movimento a degeneração neuronal.

Existe a necessidade pro agentes que afetem a fosforilação da pro-teína tau e sejam clinicamente úteis no tratamento e prevenção dedesordens neurodegenerativas.

Sumário da Invenção

A presente invenção é atribuída em parte à constatação de que aatividade da proteína fosfatase PP2A pode ser aumentada pela exposi-ção ao selenato ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Oaumento da atividade da PP2A pode reduzir ou inibir a fosforilação daproteína tau, especialmente a hiperfosforilação, com uma abordagem bi-direcional: i) desfoforilação e inativação da Akt, reduzindo, desta forma,a fosforilação do GSK3p e reduzindo, consequentemente, a fosforilaçãoda proteína tau, e ii) desfoforilação direta da proteína tau. Uma redu-ção na fosforilação, especialmente a hiperfosforilação da proteína taureduz ou previne o acúmulo ou depósito de proteína tau anormal nosneurônios ou células gliais e desta forma é útil no tratamento e preven-ção de desordens neurodegenerativas.

De acordo, num aspecto, a presente invenção proporciona ummétodo para o tratamento e prevenção de doença neurodegenerativanum sujeito compreendendo administrar ao sujeito uma quantidadeefetiva de selenato ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.Em algumas modalidades, a doença neurodegenerativa é uma tauopati-a. Em algumas modalidades, a doença neurodegenerativa é uma a-sinucleopatia. Em modalidades específicas, uma doença neurodegene-rativa é selecionada da doença demência pré-senil, demência senil,doença de Alzheimer e doença de Parkinson.

Noutro aspecto da invenção é fornecido um método para inibir oureduzir a fosforilação de uma proteína tau em um neurônio, célula glialou corpo de Lewy, compreendendo expor o neurônio ou célula glial auma quantidade efetiva de selenato ou um sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo. Em algumas modalidades, a proteína tau é umaproteína tau associada ao microtúbulo. Em algumas modalidades, aproteína tau está em um emaranhado neuroílbrilar. Em algumasmodalidades, a hiperfosforilação da proteína tau é inibida ou evitada.

Ainda noutro aspecto, a presente invenção proporciona ummétodo de aumentar a atividade da PP2A compreendendo expor a PP2Aa uma quantidade efetiva de selenato ou um sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo. Em algumas modalidades, a PP2A é uma isoformaque desfosforila Akt. Em algumas modalidades, a PP2A é uma isoformaque desfosforila proteínas tau, especialmente proteínas tau associadascom microtúbulo encontradas nos neurônios e células gliais e corpos deLewy.

Em um aspecto adicional da invenção, é provido o uso do selenatoou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo na fabricação de ummedicamento para tratar ou prevenir uma doença neurodegenerativa.

Em algumas modalidades dos métodos e usos amplamentedescritos acima, o selenato ou um sal farmaceuticamente aceitável domesmo é administrado em combinação com outras terapias apropriadaspara o tratamento de doenças neurodegenerativas ou terapias apropria-das para aliviar os sintomas de doenças neurodegenerativas.

Descrição da Invenção

1 - DefiniçõesA menos que de outra forma definido, todos os termos técnicos ecientíficos usados aqui neste documento têm o mesmo significado comocomumente compreendido por aqueles versados na técnica aos quais ainvenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ouequivalentes àqueles descritos possam ser usados na prática ou testeda presente invenção, métodos e materiais preferidos são descritos.Para os propósitos da presente invenção, os seguintes termos sãodefinidos abaixo.

Os artigos "um" e "uma" são aqui usados neste documento para se referir a um mais do que um (isto é, pelo menos um) do objetogramatical do artigo. Como exemplo, "um elemento" significa umelemento ou mais do que um elemento.

Como aqui usado neste documento, o termo "cerca" se refere aquantidade, nível, valor, dimensão, tamanho ou quantidade que varia tanto quanto 30%, 20% ou 10% com relação a quantidade, nível, valor,dimensão, tamanho ou quantidade de referência.

Em todo Relatório Descritivo e nas Reivindicações que se seguem,a menos que o contexto requeira de outra forma, a palavra "compreen-der" e variações tais como "compreende" e "compreendendo" serãocompreendidas como implicando na inclusão de um inteiro declaradoou uma etapa ou grupo de inteiros ou etapas, mas não a exclusão dequalquer outro inteiro ou etapa ou grupo de inteiros ou etapas.

O termo "desfosforilação" como aqui usado neste documento serefere à remoção química de um grupo fosfato (PO42") de uma entidade bioquímica tal como uma proteína. Sob condições celulares, a desfosfo-rilação é alcançada enzimaticamente por uma enzima tal como umafosfatase.

Como aqui usado neste documento, os termos "célula glial" e "cé-lulas gliais" se referem a células não neuronais que fornecem suporteestrutural e metabólico para neurônios no sistema nervoso central.Células gliais podem também ser referidas como neuroglia ou glia.

O termo "hiperfosforilação" refere-se à circunstância onde todosos locais de fosforilação disponíveis em uma entidade bioquímica talcomo uma proteína, são fosforilados. Nenhuma fosforilação adicionalda entidade bioquímica pode ocorrer. A frase "inibindo ou reduzindo ahiperfosforilação" inclui a prevenção de todos os locais em uma entida-de bioquímica de serem fosforilados e diminuir o número de entidadesbioquímicas que tem todos os seus locais de fosforilação fosforilados.

Como aqui usado neste documento, o termo "em combinaçãocom" refere-se ao tratamento de um sujeito com pelo menos doisagentes de forma que seus efeitos na doença neurodegenerativa ocor-ram, pelo menos em parte, durante o mesmo período de tempo. Aadministração de pelo menos dois agentes pode ocorrer simultaneamen-te em uma composição única ou cada agente pode ser simultaneamenteou seqüencialmente administrado em composições separadas.

Os termos "corpo de Lewy" e "corpos de Lewy" referem-se aos a-gregados anormais de proteína que se desenvolvem nas células nervo-sas. O agregado de proteína primário num corpo de Lewy é compostode a-sinucleína.

O termo "doença neurodegenerativa" como aqui usado neste do-cumento, se refere a uma doença neurológica caracterizada pela perdaou degeneração dos neurônios. As doenças neurodegenerativas inclu-em desordens de movimento neurodegenerativas e condições neurode-generativas relacionadas à perda de memória e/ou demência. Asdoenças neurodegenerativas incluem tauopatias e a-sinucleopatias.Exemplos de doenças neurodegenerativas incluem, mas sem limitação,demência pré-senil, demência senil, doença de Alzheimer, Parkinsonis-mo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), paralisia supra-nuclear pro-gressiva (PSP), doença de Pick, afasia progressiva primária, demênciafronto temporal, demência corticobasal, doença de Parkinson, doençade Parkinson com demência, demência com corpos de Lewy, síndromede Down, atrofia do sistema múltipla, esclerose lateral amiotrófica (ALS)e síndrome de Hallervorden-Spatz.

O termo "emaranhado neurofibrilar" como aqui usado neste do-cumento, se refere a estruturas anormais localizadas no cérebro ecompostas de alinhamentos densos de filamentos helicoidais empare-lhados (neurofilamentos e microtúbulos). Acredita-se que o número deemaranhados neurofibrilares presente no cérebro se correlaciona com ograu de demência em um sujeito. Os emaranhados neurofibrilares sãouma característica distinguível da doença de Alzheimer.

Como aqui usado neste documento, o termo "neurônio" refere-sea células encontradas no sistema nervoso central que são especializa-das em receber, processar e transmitir informação. Os neurôniospodem também ser referidos como células nervosas.

Como aqui usado neste documento, o termo "quantidade nutri-cional" inclui uma quantidade de selênio que proporciona uma ingestãodiária média. Nos Estados Unidos, a ingestão diária média é de 80-120Mg/dia.

Por um "sal farmaceuticamente" como aqui usado em relação aoselenato, significa sais de íons metálicos que são toxicologicamenteseguros para administração humana e animal. Por exemplo, saisfarmaceuticamente aceitáveis incluem, mas sem limitação, sais deácidos inorgânicos aceitáveis farmaceuticamente tais como ácidohidroclórico, sulfúrico, fosfórico, nítrico, carbônico, bórico, sulfâmico ehidrobrômicos ou sais de ácidos orgânicos aceitáveis farmaceuticamen-te tais como ácidos acético, propiônico, butírico, tartárico, maléico,hidroximaleico, fumárico, maléico, cítrico, láctico, múcico, glucônico,benzóico, succínico, oxálico, fenilacético, metanosulfônico, toluenosul-fônico, benzeno sulfônico, salicíclico, sulfanílico, aspártico, glutâmico,edético, esteárico, palmítico, oléico, láurico, pantotênico, tânico, ascór-bico e valérico.

Os sais de base incluem, mas sem limitação, aqueles formadoscom os cátions aceitáveis farmaceuticamente, tais como sódio, potássio,lítio, cálcio, magnésio, ferro, níquel, zinco, amônio e alquilamônio.

Grupos contendo nitrogênio básico podem ser quaternizados comagentes tais como haletos de alquila inferiores, tais como cloretos,brometos e iodetos de metil, etil, propil e butil; dialquil sulfatos comodimetil e dietil sulfatos e outros.

Os sais de íons metálicos apropriados de selenato incluem, massem limitação, sais de sódio, potássio, lítio, magnésio, cálcio, ferro,níquel, zinco, amônio e alquilamônio. Em algumas modalidades, o salnão é selenato de sódio. Um sal preferido do selenato é o sal de sódio,Na2SeO4.

O termo "fosforilação" como aqui usado neste documento refere-se à adição química do grupo fosfato (PO4"2) a uma entidade bioquímicatal como uma proteína. Sob condições celulares, a fosforilação éalcançada enzimaticamente por uma enzima tal com a quinase. A frase"inibindo ou reduzindo a fosforilação" inclui a prevenção da fosforilaçãoem um ou mais locais de fosforilação como na hiperfosforilação. Estafrase também inclui diminuição da extensão da fosforilação de umaentidade bioquímica pela prevenção da fosforilação de ocorrer em umou mais locais de fosforilação como um resultado da desfosforilaçãoocorrendo em um ou mais locais fosforilados na entidade bioquímica.

Os termos "sujeito" ou "indivíduo" ou "paciente" usados de formaintercambiável aqui neste documento, referem-se a qualquer sujeito,particularmente um sujeito vertebrado e, mais particularmente, a umsujeito mamífero, para quem a profilaxia ou tratamento é desejado.Animais vertebrados apropriados que caem dentro do escopo da inven-ção incluem, mas sem limitação, primatas, aves, animais de fazenda(por exemplo, porcos, ovelhas, vacas, cavalos, burros), animais de testede laboratório (por exemplo, coelhos, ratos, camundongos, porquinhosda índia, hamsters), animais de companhia (por exemplo, gatos ecachorros) e animais selvagens cativos (por exemplo, raposas, veados,dingos). Um sujeito preferido é um humano em necessidade de trata-mento ou profilaxia de uma doença neurodegenerativa, especialmentedoença de Alzheimer ou demência. Todavia, será compreendido que ostermos anteriormente mencionados não implicam que os sintomasestejam presentes.

O termo "supra-nutricional" como aqui usado neste documento,se refere a uma quantidade que é maior do que a quantidade conside-rada como uma exigência nutricional. Nos Estados Unidos, a ingestãodiária média de selênio é 80-120 μg/dia. Uma quantidade supra-nutricional de selênio prove selênio a um sujeito acima da permissãodiária recomendada. Por exemplo, uma quantidade supra-nutricionalde selênio pode ser de 3 Mg/kg a 20 mg/kg por dia, 0,015 mg/kg a 20mg/kg, 0,1 mg/kg a 20,0 mg/kg, 0,1 mg/kg a 14 mg/kg, 0,1 mg/kg a13 mg/kg, 0,1 mg/kg a 12 mg/kg, 0,1 mg/kg a 10 mg/kg, 0,1 mg/kg a9 mg/kg, 0,1 mg/kg a 8 mg/kg, 0,1 mg/kg a 7 mg/kg, 0,1 mg/kg a 6mg/kg, 0,15 mg/kg a 5 mg/kg, 0,15 mg/kg a 4 mg/kg, 0,15 mg/kg a 3mg/kg, 0,15 mg/kg a 2 mg/kg, 0,15 mg/kg a 1 mg/kg por dia, especi-almente 0,1 mg/kg a 14 mg/kg, 0,07 mg/kg a 6,5 mg/kg ou 0,15mg/kg a 5 mg/kg por dia, mais especialmente 0,07 mg/kg a 2 mg/kgpor dia.

Como aqui usado neste documento, o termo "α-sinucleopatia" re-fere-se a uma desordem neurodegenerativa ou doença envolvendo aagregação de α-sinucleína ou α-sinucleína anormal em células nervosasno cérebro. As α-sinucleopatias incluem, mas sem limitação, a doençade Parkinson, a doença de Parkinson com demência, a demência comcorpos de Lewy, a doença de Pick, a síndrome de Down, a atrofia dosistema múltiplo, a esclerose lateral amilotrófica (ALS) e a síndrome deHallervorden-Spatz.

Como aqui usado neste documento, o termo "quantidade efetiva"no contexto do tratamento ou prevenção de uma doença neurodegene-rativa ou inibição ou redução da fosforilação da proteína tau ou inibiçãoda atividade de GSK3P significa a administração ou adição de umaquantidade de selenato ou um sal farmaceuticamente aceitável domesmo, seja como uma dose única ou como parte de uma série dedoses, que é efetiva no aumento da atividade da PP2A e especialmenteque é efetiva para a prevenção de incorrer em um sintoma, manter sobcontrole tais sintomas e/ou tratar os sintomas existentes, associadoscom a doença neurodegenerativa. A quantidade efetiva variará depen-dendo da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, o grupotaxonômico do indivíduo a ser tratado, a formulação da composição, oacesso das situações médicas e outros fatores relevantes. É esperadoque a quantidade caia dentro de uma faixa relativamente ampla quepode ser determinada através de testes de rotina. Em modalidadesespecíficas, uma quantidade efetiva é uma quantidade nutricional ousupra-nutricional.

O termo "tauopatia" como aqui usado neste documento se refere auma desordem ou doença neurodegenerativa envolvendo a deposiçãoanormal de isoformas da proteína tau em neurônios e células gliais nocérebro. As tauopatias incluem doenças e desordens nas quais asproteínas tau são anormalmente fosforiladas, incluindo a proteína tauque é hiper-fosforilada. As tauopatias incluem, mas sem limitação, ademência pré-senil, a demência senil, a doença de Alzheimer, o Parkin-sonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), a paralisia supra-nuclearprogressiva (PSP), a doença de Pick, a afasia progressiva primária, ademência fronto temporal e a demência corticobasal.2 - Métodos de Tratamento ou Prevençãode Doenças Neurodegenerativas

A presente invenção é atribuída em parte à determinação de que oselenato ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é efetivo noaumento da atividade da PP2A que, por sua vez, resulta numa reduçãona fosforilação da proteína tau pela GSK3p e/ou um aumento na taxade desfosforilação da proteína tau. Os métodos da invenção compreen-dem geralmente expor a PP2A presente em neurônios ou células gliais auma quantidade de selenato ou um sal farmaceuticamente aceitável domesmo que aumenta a atividade da PP2A. De modo apropriado, aquantidade de selenato que aumenta a atividade da PP2A é uma quan-tidade nutricional ou supra-nutricional de selenato ou um sal farma-ceuticamente aceitável do mesmo. Em algumas modalidades, a quanti-dade de selenato ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, especialmente selenato ou um sal do mesmo, é de cerca de 0,015mg/kg a cerca de 20 mg/kg, usualmente de cerca de 0,1 mg/kg a 14mg/kg, 0,07 mg/kg a 6,5 mg/kg ou 0,15 mg/kg a 5 mg/kg por dia, porexemplo, 0,07 mg/kg a 2 mg/kg por dia.

A presente invenção pode ser usada efetivamente para tratar ouprevenir doenças neurodegenerativas. Doenças neurodegenerativasincluem desordens de movimento neurodegenerativo e doenças neuro-degenerativas associadas com a perda de memória e inclui tauopatias eα-sinucleopatias. Exemplos ilustrativos de doenças neurodegenerativasincluem a demência pré-senil, a demência senil, a doença de Alzheimer,o Parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), a paralisia supra-nuclear progressiva (PSP), a doença de Pick, a afasia progressiva primá-ria, a demência fronto temporal, a demência corticobasal, a doença deParkinson, a doença de Parkinson com demência, a demência comcorpos de Lewy, a síndrome de Down, a atrofia do sistema múltipla, aesclerose lateral amiotrófica (ALS) e a síndrome de Hallervorden-Spatz.Em modalidades preferidas, a invenção é apropriada para tratamentoou prevenção de tauopatias, especialmente doença de Alzheimer edemência. Em outras modalidades, a invenção é apropriada paratratamento ou prevenção de uma α-sinucleopatia, especialmente doençade Parkinson. Apropriadamente, a quantidade efetiva de selenato ouum sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é uma quantidadenutricional ou supra-nutricional de selenato. Em algumas modalida-des, a quantidade de selenato ou um sal farmaceuticamente aceitáveldo mesmo é de cerca de 0,015 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, usualmentede cerca de 0,1 mg/kg a 14 mg/kg ou 0,07 mg/kg a 6,5 mg/kg ou 0,15mg/kg a 5 mg/kg por dia, por exemplo, 0,07 mg/kg a 2 mg/kg por dia.Em modalidades preferidas, o selenato ou um sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo é selenato de sódio (Na2SeC>4).

Em algumas modalidades, o selenato ou um sal farmaceutica-mente aceitável do mesmo é administrado a um sujeito em combinaçãocom outra terapia para tratamento ou prevenção de uma doençaneurodegenerativa. Exemplos ilustrativos de terapias para tratamentoou prevenção de doença neurodegenerativa que podem ser usadas emcombinação com o selenato ou um sal farmaceuticamente aceitável domesmo incluem, mas sem limitação, inibidores de colinesterase taiscomo Tacrina (Cognex®), Donepezil, Galantamina e Rivastigmina;receptor antagonista de N-metil-D-aspartato (NMDA) tal como Meman-tina; terapias de estrogênio tais como Premarin, drogas anti-inflama-tórias não esteroidais (NSAIDs) tais como aspirina e ibuprofeno, levodo-pa (L-Dopa), inibidores de dopa decarboxilase tais como Carbidopa ebenserazida ou combinações de L-Dopa e um inibidor de dopa decarbo-xilase, tais como sinemet® e Stalevo®, agonistas de dopamina tais comobromocriptina (Parlodel®), pergolide (Permax®), pramipexol (Mirapex®),ropinirol (Requip®), cabergolina, apomorflna (APOKYN®) e lisurida,inibidores de B oxidase mono-amina tais como selegilina (Eldepryl® eCarbex®) e rasagilina (Azilect®), anticolinérgicos tais como benzotropinamesilato (Cogentin®) e trihexilfenidil cloreto (Artane®) e inibidores COMTtais como Entacapona (Commtan®) e Tolcapona (Tasmar®) ou outrosmedicamentos tais como rivastigmina tartrato (Exelon®) e Amantadina(Symmetrel®); ou misturas de dois ou mais de levodopa, inibidores dedopa decarboxilase, agonistas de dopamina, inibidores de B oxidasemono-amina, anticolinérgicos ou inibidores COMT.

As terapias combinadas poderiam incluir quantidades efetivas deselenato ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo junto comum agente usado para o tratamento ou prevenção de uma doençaneurodegenerativa em uma quantidade normalmente usada na ausên-cia de selenato. Por exemplo, o cloreto de tacrina pode ser administra-do como parte de uma combinação com selenato ou um sal farmaceuti-camente aceitável do mesmo a pacientes com uma doença neurodege-nerativa tal como AD em uma quantidade de 40 mg/dia até 160 mg/diaou donepezil pode ser administrado em uma quantidade de 5-10mg/dia. Premarin pode ser administrada em uma dosagem paraalcançar 1,25 mg/dia de estrogênios de eqüino conjugados (CEEs) empacientes com demência. Alternativamente a quantidade de agenteusado no tratamento de desordens neurodegenerativas pode ser dimi-nuída com a co-administração de selenato ou um sal farmaceuticamen-te aceitável do mesmo. Em algumas modalidades, a combinação podemostrar um efeito sinérgico.

Certas modalidades da presente invenção são direcionadas a mé-todos para o tratamento ou prevenção de doenças neurodegenerativasem um sujeito, ditos métodos geralmente compreendem a administra-ção ao sujeito de uma quantidade efetiva de selenato ou um sal farma-ceuticamente aceitável do mesmo. Para praticar estes métodos, umapessoa gerenciando o sujeito pode determinar a forma de dosagemefetiva de selenato ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmopara a condição particular e circunstâncias do sujeito. Uma quantida-de efetiva de selenato é uma que é efetiva para o tratamento ou preven-ção de uma doença neurodegenerativa, incluindo prevenção de incorrerem um sintoma, manter a condição de um sintoma e tratar um sinto-ma. Em algumas modalidades, a quantidade efetiva e uma quantidadenutricional. Em outras modalidades, a quantidade efetiva é umaquantidade supra-nutricional. Em modalidades específicas, o selenatoou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é sódio selenato.

Os modos de administração, as quantidades de selenato adminis-tradas e as formulações de selenato, para uso em métodos da presenteinvenção, são discutidos abaixo. A doença neurodegenerativa a sertratada pode ser determinada pela medida de um ou mais parâmetrosdiagnósticos indicativos do curso da doença, comparado com o controleapropriado. No caso do sujeito humano, um "controle apropriado" podeser o indivíduo antes do tratamento ou pode ser um humano (porexemplo, uma idade similar ou controle similar) tratado com um place-bo. De acordo com a presente invenção, o tratamento das doençasneurodegenerativas inclui e engloba sem limitação: (i) prevenção deuma doença neurodegenerativa em um sujeito que pode estar pré-disposto a uma doença, mas não foi ainda diagnosticado com a doençae, de acordo, o tratamento se constitui num tratamento profilático paraa doença neurodegenerativa; (ii) inibir uma doença neurodegenerativa,isto é, para o desenvolvimento de uma doença neurodegenerativa; ou(iü) alívio de sintomas resultando da doença neurodegenerativa.

Os métodos da presente invenção são apropriados para tratamen-to de um indivíduo que tenha sido diagnosticado com uma doençaneurodegenerativa ou que é conhecido de ser suscetível e que é conside-rado provável de desenvolver uma doença neurodegenerativa.

Em algumas modalidades dos métodos acima, uma doença neu-rodegenerativa é uma tauopatia, especialmente doença de Alzheimer oudemência e o tratamento opcionalmente ainda compreende a adminis-tração de outro agente apropriado para tratamento de uma tauopatiacomo descrito acima.

Em outras modalidades dos métodos acima, uma doença neuro-degenerativa é uma α-sinucleopatia, especialmente a doença de Parkin-son e o tratamento opcionalmente compreende a administração deoutro agente apropriado para tratar uma α-sinucleopatia como descritoacima.

Em modalidades preferidas, o selenato é um selenato de sódio.

Sujeitos exempliflcativos para o tratamento com os métodos dainvenção são vertebrados, especialmente mamíferos. Em certas moda-lidades, o sujeito é selecionado a partir de um grupo consistindo dehumanos, ovelhas, gado, cavalos, bovinos, porcos, cachorros e gatos.Um sujeito preferido é um humano.

O selenato ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo po-de ser formulado ao seguir qualquer número de técnicas conhecidas natécnica para a entrega da droga. O selenato ou um sal farmaceutica-mente aceitável do mesmo pode ser claramente administrado por umnúmero de meios mantendo-se em mente que todas as formulações nãosão apropriadas para cada rota de administração. O selenato ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo pode ser administrado na formasólida ou líquida. A aplicação pode ser oral, retal, nasal, tópica (inclu-indo bucal e sublingual) ou por inalação. O selenato ou um sal farma-ceuticamente aceitável do mesmo pode ser administrado junto com umadjuvante, veículos e/ou diluentes aceitáveis farmaceuticamenteconvencionais.

As formas sólidas de aplicação compreendem tabletes, cápsulas,pós, pílulas, pastilhas, supositórios e formas granulares de administra-ção. Elas podem também incluir veículos ou aditivos, tais como aroma-tizantes, corantes, diluentes, amaciantes, ligantes, preservantes,agentes conservantes e/ou materiais de revestimento. As formaslíquidas de administração incluem soluções, suspensões e emulsões.Podem também ser oferecidas juntas com os aditivos acima menciona-dos.

As soluções e suspensões de selenato ou um sal farmaceutica-mente aceitável do mesmo, supondo uma viscosidade apropriada paracada uso, podem ser injetadas. As suspensões muito viscosas parainjeção podem ser implantadas usando dispositivos projetados para taispropósitos, se necessário. As formas de liberação sustentadas sãogeralmente administradas vai parenteral ou meio entérico. A adminis-tração parenteral é outra rota de administração do selenato ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo usado para praticar a invenção."Parenteral" inclui formulações apropriadas para injeção e para admi-nistração nasal, vaginal, retal e bucal.

A administração do selenato ou um sal farmaceuticamente acei-tável do mesmo pode envolver uma formulação de dose prolongada oral.As formulações de dose oral são preferivelmente administradas uma vezao dia a três vezes ao dia na forma de uma cápsula ou tablete deliberação sustentada ou alternativamente como uma solução base água.O selenato ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo pode seradministrado de forma intravenosa seja diariamente, continuamente,uma vez na semana ou três vezes na semana.

A administração de selenato ou um sal farmaceuticamente acei-tável do mesmo pode incluir a administração diária, preferivelmenteuma vez ao dia na forma de uma cápsula ou tablete de liberação sus-tentada ou uma vez ao dia como uma solução aquosa.

As combinações de selenato ou um sal farmaceuticamente aceitá-vel do mesmo e pelo menos um agente que é apropriado para tratamen-to de uma doença neurodegenerativa podem ser administradas naforma sólida ou líquida em uma formulação ou composição única ou emformulações ou composições separadas. Em algumas modalidades, oselenato ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um agentede tratamento de uma doença neurodegenerativa são administradosoralmente como um tablete ou cápsula única ou tabletes ou cápsulasseparadas. Em outras modalidades, o selenato ou um sal farmaceuti-camente aceitável do mesmo e o agente de tratamento de uma doençaneurodegenerativa são administrados de forma intravenosa em umacomposição única ou composições separadas.

A presente invenção também proporciona composições farmacêu-ticas para tratamento ou prevenção de uma doença neurodegenerativa,compreendendo uma quantidade nutricional ou supra-nutricional deselenato ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em algu-mas modalidades, as composições contêm de cerca de 0,5 mg a cerca de1,0 g, por exemplo, 5 mg a 450 mg, de selenato ou um sal farmaceuti-camente aceitável do mesmo e um veículo aceitável farmaceuticamente.

Em algumas modalidades, o selenato ou um sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo está em uma quantidade de cerca de 5,0 mg a cercade 700 mg ou 5 mg a cerca de 450 mg. Em exemplos ilustrativos, oselenato ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo está em umaquantidade de cerca de 1,6 mg a 450 mg, 5 mg a 450 mg, 7,5 mg a 250mg, especialmente 50 mg a 200 mg, por exemplo, 50 mg a 100 mg ou100 mg a 150 mg para uma dose diária única ou dividida. Em algumasmodalidades, as composições farmacêuticas são úteis para tratar ouprevenir uma tauopatia, especialmente doença de Alzheimer ou demên-cia. Em outras modalidades, as composições farmacêuticas são úteispara tratar ou prevenir uma α-sinucleopatia, especialmente doença deParkinson.

As composições farmacêuticas que compreendem selenato ou umsal farmaceuticamente aceitável do mesmo podem ainda compreenderoutro agente para tratar ou prevenir uma doença neurodegenerativa.

Por exemplo, uma composição pode conter selenato ou um sal farma-ceuticamente aceitável do mesmo e um inibidor de colinesterase talcomo Tacrina, Donepezil, Galantamina ou Rivastigmina; um receptorantagonista de N-metil-D-aspartato (NMDA) tal como Memantina; umagente estrogênico tal como Premarin ou uma droga anti-inflamatórianão esteroidal (NSAID) tal como aspirina ou ibuprofeno, levodopa, uminibidor de dopa decarboxilase, combinações de levodopa e um inibidorde dopa decarboxilase e/ou um inibidor COMT, uma agonista dedopamina, um inibidor B oxidase mono-amina, um anticolinérgico, uminibidor COMT ou outros medicamentos tais como rivastigmina tartratoou Amantadina.

A composição farmacêutica da presente invenção pode incluirquaisquer componentes adicionais que são não imunogênicos e bio-compatíveis com o selenato, bem como capaz de bioabsorção, biodegra-dação, eliminação como uma molécula intacta. A formulação pode sersuprida em uma forma pronta para uso ou pode ser suprida como umpó estéril ou um líquido que exige uma adição de um veículo antes daadministração. Se for desejada a esterilidade, a formulação pode serfeita sob condições estéreis, os componentes individuais da misturapodem ser estéreis ou a formulação pode ser estéril filtrada antes douso. Essa solução pode também conter veículos aceitáveis farmacêuti-cos apropriados, tais como, mas não limitados a tampões, sais, excipi-entes, preservantes etc.

Em algumas modalidades, formulações orais de liberação susten-tada são usadas para administrar selenato ou um sal farmaceuticamen-te aceitável do mesmo em métodos da invenção. Estas formulaçõesgeralmente compreendem o selenato ou um sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo tendo uma solubilidade decrescendo de forma aatrasar a absorção na corrente sangüínea. Além disso, estas formula-ções podem incluir outros componentes, agentes, veículos, etc., quepodem também servir para atrasar a absorção do selenato ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo. O microencapsulamento,sistemas de captura polimérica e bombas osmóticas, que podem ser ounão bioerodíveis, podem também ser usados para permitir a difusãoretardada ou controlada do selenato ou um sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo de uma cápsula ou matriz.

O selenato ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo po-de ser usado sozinho ou como uma parte de outro agente. De acordo, apresente invenção também contempla um agente que compreendeselenato ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para otratamento de uma doença neurodegenerativa.

De forma que a natureza da presente invenção pode ser clara-mente compreendida e posta em efeito prático, modalidades preferidasparticulares da mesma serão descritas com referência aos seguintesexemplos não limitantes.

Breve Descrição das Figuras

A Figura IA é uma representação comparativa dos níveis da Aktfosforilada permitindo tratamento de ambas em células intactas e emum ambiente livre de célula para células PC3.

A Figura IB é uma representação gráfica que compara o efeito dosódio selenato e estaurosporina, um potente, mas não específico inibi-dor de quinase de proteína, na atividade enzimática do recombinantehumano Aktl usando o kit de atividade Calbiochem K-LISA® Akt.

A Figura 2A é uma representação comparativa da fosforilação Aktna Ser473 na presença de selenato de sódio ou ácido ocadáico, umatoxina poliéter da alga da maré vermelha que inibe as fosfo-proteínasfosfatases PPl e PP2A.

A Figura 2B é uma representação comparativa da fosforilação Aktna Ser473 na presença de selenato de sódio ou um número de inibidoresfosfo-proteína fosfatase, tautamicina, ácido ocadáico, endotal A, calicu-Iina A e ciclosporina A.

A Figura 2C fornece representações da imunoprecipitação de Aktde células PC3 mostrando a quantidade de Akt complexada com PP2A na ausência (controle) e presença de selenato (ATE) ou soro de bezerrofetal (FCS).

A Figura 2D é uma representação gráfica da atividade da fosfata-se PP2A em células PC3 na presença ou ausência de selenato de sódio.

A Figura 3 é uma representação esquemática da regulação pós-translacional da atividade da fosfatase PP2A e especificidade de subs-trato (LCMT - leucina carboximetiltransferase, PME-I - fosfatasemetilesterase 1, PTPA - ativador fosfolirosil fosfatase).

A Figura 4A(i) é uma representação gráfica da atividade dafosfatase PP2A relativa na ausência (controle) ou na presença de selena-to de sódio ou ácido ocadáico (ΟΚΑ).

A Figura 4A(ii) é uma representação gráfica que mostra os efeitosdo selenato de sódio na concentração do fosfato inorgânico liberado deum fosfopeptídeo serina pela ação de fosfatase da PP2A.

A Figura 4B é uma representação gráfica que mostra os efeitos doselenato de sódio na atividade de fosfatase da PPl.

A Figura 5A é uma representação esquemática da inativação daPP2A em um ambiente oxidante.

A Figura 5B é uma representação que mostra os efeitos doselenato de sódio e peróxido de hidrogênio em um nível de fosforilaçãoAkt.

A Figura 5C é uma representação gráfica dos grupos sulfidrillivres presentes na fosfatase PP2A na presença de N-etilmeleimida(NEM), peróxido de hidrogênio, selenato de sódio e selenato de sódiojunto com peróxido de hidrogênio.

A Figura 5D é uma representação gráfica do histograma dedistribuição da fluorescência para células tratadas com selenato desódio ou N-acetil cisteína (NAC) com ou sem peróxido de hidrogênio.

A Figura 5E representa graficamente a percentagem média decélulas fluorescentes sob tratamento com peróxido d hidrogênio, selena-to de sódio, peróxido de hidrogênio e selenato de sódio, NAC e peróxidode hidrogênio e NAC.

A Figura 6A representa graficamente a atividade da fosfataserelativa de imunoprecipitado PP2A com selenato de sódio (ATE 500 μΜ)ou endotal A (ETA 100 μΜ) ou sem um aditivo (controle).

A Figura 6B é uma representação comparativa de níveis dep70S6K fosforilada seguindo o tratamento com LY294003 (LY 50 μΜ)ou selenato de sódio (ATE 500 μΜ), com ou sem o pré-tratamento comácido ocadáico (ΟΚΑ 500 nM).

A Figura 6C é uma representação comparativa da investigação desubunidades da família B (B e B1) da PP2A com anticorpos que reconhe-cem Akt. Akt co-precipitado apenas com a subunidade da família B daPP2A.

A Figura 7 é uma representação que mostra os efeitos do selenatode sódio na ativação GSK3p.

A Figura 8 é uma representação comparativa que mostra que aselenometionina não afeta o nível da fosforilação Akt enquanto o selena-to inibiu a fosforilação Akt.

A Figura 9 é uma representação gráfica que mostra os efeitos dediferentes compostos de selênio na ativação da Akt. Tratamentos:controle (con); selenato de sódio (ATE); ácido selenoso (ácido Sei);seleneto de sódio (ITE); dióxido de selênio (SeCb); sulfeto de selênio(SeS2); metil selenocisteína (MSC); e selenocisteína (SeC). A Intensidadede sinal Akt ativo relativa correlacionada aos níveis de proteína Akt totalé mostrada no eixo y. O gráfico indica que apenas o selenato de sódio(ATE) inibe a ativação de Akt, reduzindo os níveis de Akt fosforiladoabaixo dos níveis de controle (con). Em contraste, o ácido selenoso(ácido Sei), o seleneto de sódio (ITE); o dióxido de selênio (SeÜ2); osulfeto de selênio (SeS2); a metil selenocisteína (MSC); a selenocisteína(SeC) todos induzem a ativação da Akt acima dos níveis de controle.

As Figuras IOA e IOB representam graficamente o efeito doselenato de sódio (ATE), seleneto de sódio (ITE) e selenometionina(SeMet) na atividade de fosfatase das PP2A no teste de hidrólise pNPPusando o pNPP (Figura 10A) ou uma fosfopeptídeo serina (Figura 10B)com um substrato.

A Figura 11 é uma representação comparativa de "imunoblotting"de linhagem de célula BE2M17 de neuroblastoma humano com anti-corpos PHF-tau anti-humanos na presença (+) ou ausência (-) deselenato de sódio sob várias condições de revestimento.

Figura 12 é uma representação comparativa de "immunoblotting"de linhagens de células SY5Y de neuroblastoma humano com anticor-pos PHF-tau anti-humano, AT270 (Figura 12A) e HT-7 (Figura 12B), napresença (+) ou ausência (-) de selenato de sódio sob várias condiçõesde revestimento.

A Figura 13 é uma representação comparativa de "imunoblotting"de lisatos de cérebro totais com 14 semanas de idade de camundongosmachos Balb/c Nu Nu com anticorpos PHF-tau anti-humano, AT 100(Figura 13A), AT180 (Figura 13B), AT270 (Figura 13C) e HT-7 (Figura13D), na presença (+) ou ausência (-) de selenato de sódio.

A Figura 14 representa graficamente os efeitos do tratamentocom selenato de sódio no comportamento testado em Campo Aberto(tigmotaxia) na vez 1 (Figura 14A) e vez 2 (Figura 14B).

A Figura 15 representa graficamente os efeitos do tratamentocom selenato de sódio no aprendizado e memória testados no teste doLabirinto Aquático de Morris como acessado pela latência de escape(tempo em segundos, Figura 15A) e caminho de nado (comprimento emmetros, Figura 15B).

A Figura 16 representa graflcamente o efeito do selenato de sódiona carga de Tau no hipocampo (Figura 16A) e na amídala (Figura 16B)como determinado pela imunohistoquímica HT7 em camundongosTMHT transgênicos hTAU441.

A Figura 17 representa graflcamente o efeito do selenato de sódiona carga de Tau no hipocampo (Figura 17A) e na amídala (Figura 17B)como determinado pela imunohistoquímica AT180 em camundongosTMHT transgênicos hTAU441.

ExemplosExemplo 1

Akt Desfosforilados de Selenato de Sódiopor um Mecanismo Indireto

O selenato de sódio consistentemente induz a desfosforilação daAkt em células de carcinoma de próstata intacta. Essa desfosforilaçãopode ser o resultado de um efeito inibidor direto na própria proteínakt, ou alternativamente, pode ser similarmente alcançada indireta-mente pelo efeito ampliado de um regulador negativo ou inibição de umregulador positivo de fosforilação Akt. Para distinguir entre um meca-nismo direto e indireto, o efeito do selenato de sódio na fosforilação Akte atividade em um ambiente livre de célula foi determinado. Células decarcinoma de próstata PC3 foram colocadas em pratos de 100 mm eentão 70-80% privadas do soro confluente durante a noite. Paradeterminar o efeito na fosforilação Akt em células intactas, células PC3foram tratadas com selenato de sódio 500 μΜ em um meio livre de sorofresco por 1 hora. As células foram lisadas e o nível de fosforilaçãoSer473 Akt determinado pela análise "imunoblot" com o anticorpoespecífico de ativação, e a comparação feita para níveis de proteína Aktexpressada. Para determinar o efeito no Akt purificado, células coloca-das em prato de modo similar, mas não tratadas foram lisadas em RIPA(inibidores de fosfatase menos), um tampão de Iise de célula rigorosoque minimiza a manutenção de complexos de proteína-proteína. O Aktfoi purificado a partir de quantidades iguais (40-500 μg) de lisato decélula completa (WCL) pela imunoprecipitação com um anticorpomonoclonal pan-Akt, e então incubado com 500 μΜ de selenato de sódiopor 1 hora em um bloco de aquecimento a 37°C. A proteína imunopre-cipitada foi então determinada e o nível de Akt ativado determinado pelaanálise "imunoblof como descrito acima. A Figura IA compara osníveis de Akt fosforilado seguindo o tratamento em ambas as célulasintactas e um ambiente livre de célula para células PC3. O tratamentode células PC3 intactas com 500 μΜ de selenato de sódio por 1 horaresulta em uma redução profunda na fosforilação Akt.

Para confirmar estes achados, o efeito do selenato de sódio naatividade enzimática do recombinante humano Aktl foi medida usandoo kit de atividade Akt Calbiochem K-LISA® e comparada ao efeito daestaurosporina, um potente, mas não específico inibidor de quinaseproteína. O teste baseado em ELISA usa um substrato de peptídeobiotinilado (GRPRTSSFAEG) que é fosforilado na segunda serina peloAkt. 250 ng de recombinante humano Aktl com ou sem selenato desódio 500 μΜ ou estaurosporina 1 μΜ foi incubada com substrato Aktbiotinilado em poços revestidos com estreptavidina por 30 min a30°C.

O substrato fosforilado ligado foi então detectado com um anticorpo dedetecção fosfo-serina, seguido pelo conjugado anticorpo HRP e desen-volvimento de cor com o substrato TMB. Absorbância medida a 450 nmcom referência a 590 nm. Os resultados de três experimentso indepen-dentes, resumidos como absorbância calculada média (A45o-As9o-branco)± SEM, são mostrados na Figura 1B. Consistente com as observaçõesdescritas acima, o selenato de sódio não teve efeito direto mensurávelna atividade de quinase de recombinante humano Akt. Em contraste, oinibidor não específico estaurosporina inibiu potencialmente a atividadede quinase da Akt.

Em resumo, estes dados indicam que o selenato de sódio não temum efeito inibitório direto na atividade da Akt, indicando que a desfosfo-rilação observada deve ser via um mecanismo indireto.

Exemplo 2

Akt Desfosforilados de Selenato de Sódiopela Estimulação da Atividade Fosfatase da PP2A

A redução na atividade Akt líquida poderia ser alcançada indire-tamente seja por prevenir a fosforilação de Akt inicial ou alternativa-mente, aumentando a desfosforilação da Akt [Kohn e colaboradores,1996]. Todavia, dada a resposta bifásica da fosforilação da Akt (umimpulso transiente inicial seguida por uma profunda e sustentáveldiminuição) induzido pelo selenato de sódio, pareceu improvável que oselenato de sódio estivesse agindo pela simples diminuição da habilida-de de uma quinase a montante para o Akt fosforilado. O efeito dainibição da fosfatase da proteína na habilidade do selenato de sódio deinduzir a desfosforilação de Akt foi desta maneira determinada. Inici-almente o ácido ocadáico, uma toxina poliéter da alga de maré vermelha(e agente causador do envenenamento de marisco causador de diarréia)que inibe as fosfatases fosfo-proteína PPl e PP2A, duas fosfatasesimplicadas na regulação da desfosforilação Akt foi usada [Fernandez ecolaboradores, 2002]. 5 χ IO5 células de carcinoma de próstata PC3foram postas em placas por poço de placas de 6 poços, permitidas seligarem por 8 horas e então privadas do soro durante a noite. Ascélulas foram pré-tratadas com ou sem ácido ocadáico 5 nM ou 1.000nM por 30 min em meio livre de soro fresco e então selenato de sódioadicionado para uma concentração final de 500 μΜ por 1 hora. Célulaslisadas foram reduzidas às suas partes elementares por SDS-PAGE,então testadas para fosforilação em resíduo de Ser473 pela análise de"imunoblof com um anticorpo que especificamente reconhece o Aktquando fosforilado neste local e comparação feita entre os níveis totaisda proteína Akt expressada (Figura 2A). O tratamento de células PC3deficientes de PTEN com selenato de sódio, como esperado, marcada-mente reduz os altos níveis crônicos de fosforilação de Akt observadosnesta linhagem de célula, e esta redução não é afetada pela incubaçãoprévia com ácido ocadáico 5 nM. Em contraste, o pré-tratamento com1.000 nM de ácido ocadáico não apenas aumenta a fosforilação da Aktem controles sem selenato, mas completamente acaba o efeito inibitóriodo selenato de sódio.

Para adicionalmente refinar a fosfatase envolvida, uma painelamplo de inibidores de fosfatase fosfo-proteína (PPP), que diferem emsuas especificidades para a inibição PPP, foram classificados por suashabilidades de abrogar o efeito inibitório do selenato de sódio na fosfori-lação da Akt. Este painel incluiu a tautamicina 500 nM (PP1), o ácidoocadáico 500 nM (baixa dose de PP2A > PP1), o endotal A (PP2A) 100μΜ, caliculina A 2 nM (baixa dose de PPl > PP2A), a caliculina AlO nM(alta dose inibe PPl e PP2A) e a ciclosporina A 400 ng/ml (PP2B).Células de carcinoma de próstata PC3 foram colocadas em pratoessencialmente como descrito acima e similarmente tratadas comselenato de sódio 500 μΜ por 1 h com ou sem pré-tratamento com uminibidor PPP por 30 min prévios. Novamente, as células lisadas foramreduzidas às suas partes elementares por SDS-PAGE, então as mem-branas foram testadas para a fosforilação de Akt no resíduo Ser473 pelaanálise de "imunoblof com um anticorpo que especificamente reconheceo Akt quando fosforilado neste local e comparação feita com os níveistotais da proteína Akt expressa. Como indicado na Figura 2B, emcélulas que recebem no pré-tratamento um inibidor PPP ou em célulasque foram tratadas com inibidores PPP que foram específicas para oPPl ou PP2B, a exposição ao selenato de sódio resultou em uma dimi-nuição marcada na fosforilação da Akt. Em contraste, células queforam tratadas seja com baixa dose de ácido ocadáico seja com endotalA, inibidores de PP2A específicos ou relativamente específicos, comple-tamente bloqueadas com selenato de sódio induziram a desfosforilaçãoda Akt.

O selenato de sódio poderia aumentar o PP2A mediado peladesfosforilação da Akt seja pelo aumento da taxa de formação decomplexo entre o PP2A e Akt, pelo aumento da atividade de fosfataseintrínseca do PP2A já ligado ao PP2A, ou ambos. Para ajudar a distin-guir entre estes mecanismos foi primeiro determinado se o tratamentocom selenato de sódio aumenta o nível de formação de complexo entre oPP2A e Akt. 1 χ IO6 células de carcinoma de próstata PC3 foramcolocadas em placas de 6 cm, permitidas se ligarem por 8 h e entãoprivadas do soro durante a noite. As células foram então tratadas sejacom 500 μΜ de selenato de sódio em meio livre de soro fresco ou 10%FCS, por 1,5 h e, então, lisadas em tampão ELB. A Akt total foi imuno-precipitada de 400 μg de cada lisato de célula completo usando umanticorpo anti-Akt monoclonal e capturado com contas de proteína A-sefarose. Os lisatos de controle negativo (branco) tinham o anticorpoimunoprecipitante omitido. Seguindo com a lavagem para reduzirligante não específico, as contas foram fervidas por 5 min em 3X emtampão de carga de proteína SDS, centrifugadas era alta velocidade e osobrenadante reduzido às suas partes elementares por SDS-PAGE. Onível de PP2A ligante foi determinado por análise de "imunoblot" comum anticorpo que especificamente reconhece a subunidade catalítica dafosfatase e a comparação feita com a quantidade de Akt tirada fora e aconcentração do anticorpo precipitando (IgG). Como indicado na Figura2C, a imunoprecipitação da Akt de células PC3 não tratadas aumenta aquantidade da subunidade catalítica de PP2A detectável acima do que aligação não específica às contas (branco), indicando que mesmo noestado basal com níveis altos de fosforilação Akt, pelo menos algum Akté complexado com PP2A. O tratamento com selenato de sódio aumentaa associação da subunidade catalítica PP2A com Akt, enquanto aestimulação com soro diminui a formação do complexo para abaixo dosníveis basais. Para quantificar este aumento na formação do complexo,"imunoblots" representativos de três experimentos independentes foramdigitalizados, sujeitos à análise densitométrica e normalizados para ocontrole de cada experimento. A razão média de subunidade catalíticaPP2A para a proteína Akt imunoprecipitada ± SEM foi então determina-da. Como indicado na Figura 2C, um aumento aproximado de 50% naligação da subunidade catalítica PP2A à proteína Akt seguido de trata-mento com selenato de sódio foi observado.

Para determinar se os efeitos do selenato de sódio na desfosforila-ção da Akt poderiam ser completamente explicados pelo simples au-mento na associação entre as duas proteínas, o efeito do selenato desódio na atividade de fosfatase associada à Akt foi medida. 2 χ IO6células PC3 foram postas em placas de 10 cm, permitidas se ligarempor 8 horas e então privadas do soro durante a noite. As células foramentão tratadas com ou sem selenato de sódio 500 μΜ por 1 h em meiolivre de soro fresco e, então, lisadas em tampão com pouco fosfato.500-600 μg de proteína total foi imunoprecipitada com anticorpo anti-Akt monoclonal (1:100) e 30 μΐ de pasta de Proteína A e após lavagem,verificada a contaminação por fosfato livre pela incubação de 25 μΐ dotempão de lavagem final com Verde Malaquita. Os imunoprecipitadosforam testados para a atividade de fosfatase pela incubação de 500 μΜdo peptídeo fosfotreonina sintético por 10 min a 30°C com agitação.

Fosfato livre foi detectado pela adição de solução de verde malaquita e aabsorbância foi lida a 590 nm para cada amostra em duplicata. Aatividade de fosfatase média de três experimentos independentes ± SEMé mostrada na Figura 2D. O tratamento de células PC3 com selenato desódio mais do que dobrou a atividade da fosfatase associada com aproteína Akt imunoprecipitada, significativamente maior do que osimples aumento na ligação PP2A previamente observado.

Em resumo, estes dados demonstram que o selenato de sódioinduz a desfosforilação Akt indiretamente através da fosfatase fosfo-proteína, especificamente PP2A. Embora o selenato de sódio aumente aquantidade de PP2A se ligando à Akt, o aumento relativo na atividadeda fosfatase associada é aproximadamente duas vezes aquela, indican-do que o selenato de sódio pode primariamente afetar a atividade daenzima.

Exemplo 3

Selenato de Sódio Diretamente

Impulsiona a Atividade da Fosfatasedo Dímero do Núcleo da PP2A

A estrutura do núcleo da PP2A consiste de subunidade catalítica(PP2Ac) de 36 kDa e uma subunidade regulatória de 65 kDa (PR65 ouSubunidade A). A ligação com uma terceira subunidade B regulatóriaregula a especificidade do substrato [Wera e Hemmings, 1995]. Aatividade da fosfatase PP2A pode ser regulada pela modificação pós-translacional, representada esquematicamente na Figura 3. A PP2Actem sido mostrada ser fosforilada in vitro por ambos o receptor e nãoreceptor de quinase de tirosina tal como um EGFR, o receptor deinsulina, p60v-src e p561ck [Chen e colaboradores, 1992], Esta fosfori-lação ocorre especificamente na Tir307 e é associada com uma perda naatividade de fosfatase maior do que 90% [Chen e colaboradores, 1992],Esta fosforilação é também identificada in vivo e é aumentada emfibroblastos estimulados com soro ou EGF ou transformado com p60v-src, enquanto ela é diminuída pela privação do soro [Chen e colabora-dores, 1994]. A fosforilação da Thr304 adjacente tem também sidoassociada com uma perda significativa na atividade de fosfatase [Guo eDamuni, 1993]. Em contraste ao Tir307, parece que o Thr304 é fosfori-Iado por uma quinase de proteína ativada por autofosforilação, destemodo amplificando o sinal inibitório inicial. Em ambos os casos, oPP2A atua como sua própria fosfatase, enquanto a inibição farmacológi-ca com ácido ocadáico ou microcistina LR aumenta a fosforilação [Chene colaboradores, 1994, Guo e Damuni, 1993]. Então, após a remoçãodo estímulo inibitório, a PP2A hidrolisa ambos os grupos fosfatos pararapidamente regenerar a fosfatase ativa. A PP2Ac está também sujeitaà regulação pela metilação reversível de um resíduo de lisina de termi-nal carbóxi, L309. A reação de metilação é catalisada por uma leucinacarboxil metil transferase [Xie e Clarke, 1994] e parece necessária paraa correta associação de subunidades para forma um trímero ativo [Wu ecolaboradores, 2000, Tulstylch e colaboradores, 2000, Bryant e colabo-radores, 1999]. A PP2Ac é desmetilada pela fosfatase metilesterase 1(PME-I) [Lee e colaboradores, 1996]. De modo interessante, a PME-Item também sido reportada de se ligar e estabilizar potencialmente osdímeros e trímeros de PP2A em uma conformação inativa, uma situaçãoinvertida pelo ativador de fosfatase fosfotirosil (PTPA), uma proteínaoriginalmente identificada estimulando a atividade fosfatase tirosil daPP2A [Cayla e colaboradores, 1994, Langin e colaboradores, 2004, VanHoofe colaboradores, 2005].Para determinar se o impulso na atividade de fosfatase PP2Aobservada com o selenato de sódio era independente de um efeito doscomponentes a montante envolvidos na pós-regulação translacional, foideterminada a atividade enzimática do heterodímero PP2A A-C humanopurificado a partir de células vermelhas do sangue encubadas napresença ou ausência de selenato de sódio. Em testes iniciais umsubstrato químico de ação enzimática de fosfatase, para-nitrofenilfos-fato (pNPP) foi usado, o qual após hidrólise dos segmentos fosfato gerapara-nitrofenol, um cromógeno amarelo intenso que é solúvel sobcondições alcalinas. 0,05U de dímero de PP2A humano purificado foiencubado na presença de 5 nM de selenato de sódio ou 500 nM deácido ocadáico por um total de 30 min a 37°C e medida a quantidade depara-nitrofenol gerada, como uma leitura de saída da atividade fosfata-se, comparada a amostras de controle não tratadas. A absorbância decada amostra foi medida em duplicata a 405 nm com 590 nm comouma referência. A atividade da PP2A foi calculada usando a seguinteequação:

atividade = (vol da amostra em litros) χ A40s/1,78 χ IO4M-1Cm"1 (coefici-ente de extinção) χ 0,25 cm χ 15 minutos χ 0,05 U enzima

O dado é apresentado como uma atividade de fosfatase relativamédia ± SEM de pelo menos três experimentos independentes. Comoindicado na Figura 4A(i), mesmo com tal concentração baixa de enzimapurificada, a atividade de fosfatase foi prontamente aparente e esta foicompletamente abolida pela incubação com ácido ocadáico. Em con-traste, a incubação de PP2A com selenato de sódio aproximadamentetriplicou a atividade da fosfatase observada.

A seguir foi determinado se o aumento na atividade de fosfataseera específico do substrato pela medida do efeito do selenato de sódiona liberação pelo dímero da PP2A A-C de fosfato inorgânico de umpeptídeo aminoácido 6 sintético, fosforilado no resíduo de treoninanterno. 0,01-0,05 U de PP2A foi incubada com 500 nM de fosfopeptí-deo por 15 min a 37°C, com ou sem 50 μΜ de selenato de sódio. Aquantidade de fosfato inorgânico liberado pela atividade enzimática foideterminada pela adição de verde de malaquita e a absorbância lida a590 nm. O verde de malaquita forma um complexo verde estável napresença de molibdato e ortofosfato, permitindo a concentração defosfato inorgânico presente a ser medido. O dado é apresentado comoabsorbância média a 590 nm de pelo menos três experimentos inde-pendentes, ± SEM. Como indicado na Figura 4A(ii), o selenato de sódionovamente mais do que dobrou a concentração de fosfato inorgânicoliberado do fosfopeptídeo serina pela ação de fosfatase da PP2A.

A subunidade catalítica da PPl divide aproximadamente 50% dehomologia de seqüência com a subunidade catalítica da PP2A, a maiorde qualquer das fosfatases relacionadas [Barton e colaboradores, 1994].Para determinar se o aumento na atividade da fosfatase estimulada peloselenato de sódio era específico da PP2A, seu efeito na atividade da PPlfoi determinado. 0,05U de PPl purificado de coelho do músculo doesqueleto foi incubada com 500 μΜ de peptídeo sintético de fosfo-treonina por 15 min a 37°C, com ou sem 50 μΜ de selenato de sódio e aconcentração de fosfato livre determinada usando verde de malaquitacomo descrito acima. O dado é apresentado como uma absorbânciamédia a 590 nm de três experimentos independentes, ± SEM. Comoindicado na Figura 4B, o selenato de sódio não afetou a atividadefosfatase da PPl.

Exemplo 4

O Selenato de Sódio Não Afetaa Regulação Redox da PP2A

Uma quantidade de trabalhos cada vez maior sugere que aoxidação reversível é um mecanismo comum pelo qual as fosfatases deproteínas são reguladas negativamente [Wang e colaboradores, 1996,Barrete t al., 1999, Sohn e Rudolph, 2003]. Um resíduo de cisteínaconvertido no domínio catalítico é crítico para a atividade enzimáticadelas, mas em um micro ambiente isto pode ser modificado pela forma-ção seja de ligações de disulfeto intramolecular ou sulfenil-amida(Figura 5A), com a perda da atividade de fosfatase [Salmeen e colabora-dores, 2003, Kwon e colaboradores, 2004]. Dado que os compostos deselênio podem afetar o estado redox celular, a possibilidade de que aPP2A estimulada pelo selenato de sódio pelo alívio dos efeitos inibidoresda oxidação foi investigada.

Inicialmente, foi determinado se a desfosforilação da Akt induzidapelo selenato de sódio era sensível ao estado redox celular. 5 χ IO3células de carcinoma de próstata PC3 foram colocadas por poço emuma placa de 6 poços, permitidas se ligarem por 8 h, e então privadasdo soro durante a noite. As células foram tratadas com ou sem selena-to de sódio 500 μΜ em meio fresco e então expostas a peróxido dehidrogênio 0,25 mM ou 1 mM por 10 min. Quantidades iguais delisatos de células foram reduzidas às suas partes elementares e entãosujeitas à análise de "imunoblof para determinar o nível de Akt Ser473fosforilado. A comparação foi então feita com o nível total da proteínaAkt expressada. Como indicado na Figura 5B, o tratamento de célulascom selenato de sódio marcadamente reduziu o nível de fosforilação deAkt, e esta não foi afetada pela adição aguda de 0,25 mM de peróxido dehidrogênio. Em contraste, a exposição aguda a uma dose maior de 1mM de peróxido de hidrogênio completamente aboliu o efeito de desfos-forilação do selenato de sódio, indicando que este bloqueio é sensível àredox.

A oxidação reversível de inativação de fosfatases de proteínasenvolve a modificação de um resíduo de cisteína crítico dentro dodomínio catalítico, em última análise levando à formação seja de liga-ções de disulfeto intramolecular ou sulfenil-amida. Para determinar seo selenato de sódio tinha qualquer efeito de modificação nos resíduos decisteína na PP2A, o número de grupos sulfidril livre em dímero PP2A A-C humano purificado foi quantificado seguindo vários tratamentosusando o teste de Ellman [Ellmann, 1958]. O reagente de Ellman (5,5-ditio-bis(2-ácido nitrobenzóico), DTNB) rapidamente forma uma ligaçãodisulfeto com grupos sulfidril livres com a liberação de íons tiolatocromogènicos. 0,01 U de PP2A foi incubado com N-etilmaleimida (NEM)10 mM ou peróxido de hidrogênio 10 mM ou selenato de sódio 10 mM,ou selenato de sódio 10 mM e peróxido de hidrogênio 10 mM por 15 mina37°C. A quantidade de grupos sulfidril presentes dentro da fosfatasefoi então determinada pela adição do reagente de Ellman e subseqüentemedida a absorbância a 412 nm (Figura 5C). A incubação com ambosNEM, um agente de alquilação sulfidril e peróxido de hidrogênio signifi-cativamente reduziu o número de grupos sulfidril livres presentes. Emcontraste, a incubação com selenato de sódio não teve efeito, e emparticular, não protegeu a PP2A da modificação mediada pelo peróxidode hidrogênio nos grupos sulfidril. Na verdade, a modificação dosgrupos sulfidril pelo peróxido de hidrogênio foi significativamente maiseficiente na presença de selenato de sódio.

A seguir foi determinado se o selenato de sódio afetava o potencialredox de células intactas usando diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluo-resceína (DCFDA). O DCFDA é não fluorescente e livremente permeávelà célula, mas na presença de espécies oxigênio reativas (ROS) é rapida-mente convertido a 2',7'-diclorofluoresceína (DCF) que é impermeável àcélula mas altamente fluorescente [Bass e colaboradores, 1983]. 1 χIO6 células de carcinoma de próstata PC3 foram postas em pratos de 60mm, permitidas se ligarem por 8 horas e então privadas do soro duran-te a noite. As células foram incubadas com DCFDA 5 μΜ por 15 minantes do tratamento.

As células foram tratadas seja com 500 μΜ de selenato de sódioou 1 mM de N-acetilcisteína (NAC) por lhe então expostas a 500 μΜ deperóxido de hidrogênio por 10 min. A proporção de células fluorescen-tes foi então determinada por citometria de fluxo. A Figura 5D mostraum histograma de distribuição de fluorescência representativo paracada grupo de tratamento e a porcentagem média de células fluorescen-tes de três experimentos independentes + SEM é resumido na Figura5E. A exposição de células PC3 ao peróxido de hidrogênio leva previsi-velmente a um aumento marcado na geração de radicais livres deoxigênio intracelular, indicado por um deslocamento para a direita nohistograma de distribuição. O pré-tratamento de células com selenatode sódio não teve efeito na proporção basal d células fluorescentes enão protegeram as células da geração de ROS após a exposição aoperóxido de hidrogênio. Em contraste, o pré-tratamento com o doadorde hidrogênio NAC leva a uma pequena redução na proporção basal decélulas fluorescentes e, em particular, significativamente atenuadaprodução de ROS pelo peróxido de hidrogênio.

Em resumo, estes dados indicam que embora a desfosforilação daAkt induzida pelo selenato de sódio seja sensível ao estado redoxcelular, o selenato de sódio não aumenta a atividade fosfatase da PP2Apelo alívio intrínseco, mas reversível da oxidação inibitória.

Exemplo 5

A Atividade de Fosfatase da PP2A Estimuladapelo Selenato de Sódio

Demonstra Especificidade para o Substrato

A PP2A é uma proteína ubíqua e altamente expressada que éestimada compor de 0,1-1% da proteína celular total [Gallego M eVirshup 2005; Cohen, 1997] e tem sido implicada na regulação de umnúmero cada vez mais crescente de substratos de proteína [Zhu ecolaboradores, 2004; Woetmann e colaboradores, 2003; Silverstein ecolaboradores, 2002]. O mecanismo que controla a especificidade dosubstrato da PP2A não é completamente compreendido, mas a ligaçãodiferencial a subunidades B regulatórias específicas parece ser impor-tante [Van Kanegan e colaboradores, 2005]. Foi determinado se aatividade fosfatase da PP2A aumentada estimulada pelo selenato desódio era indiscriminada ou específica a um particular heterotrímero.

Tem sido demonstrado acima que o selenato de sódio aumenta aatividade de fosfatase associada com a Akt imunoprecipitada de célulasde carcinoma de próstata PC3 e que o selenato de sódio diretamenteestimula a atividade de fosfatase do dímero PP2A A-C purificado. Paradeterminar se este aumento na atividade de fosfatase é generalizada, aPP2A foi imunoprecipitada de células PC3 tratadas seja com selenato desódio 500 μΜ ou endotal A 100 μΜ por 1 hora usando um anticorpomonoclonal para a subunidade catalítica PP2A. Fosfato livre foi remo-vido ao se passar lisatos de células através de colunas de dessalinizaçãoe a atividade de fosfatase medida usando um peptídeo fosfo-serina everde de malaquita. A atividade de fosfatase relativa da PP2A imuno-precipitada sob diferentes condições é mostrada na Figura 6A como aabsorbância média de três experimentos independentes + SEM. Otratamento de células PC3 com selenato de sódio não teve efeito naatividade de fosfatase no grupo geral da PP2A intracelular. Em contras-te, o tratamento com o inibidor fosfatase específico da PP2A, endotal A,significativa reduziu a atividade de fosfatase.

O efeito do selenato de sódio em outro substrato conhecido daPP2A, p70S6K foi examinado [Peterson e colaboradores, 1999]. 5 χ IO5células de carcinoma de próstata PC3 foram postas em placas por poçode placas de 6 poços, permitidas se ligarem por 8 horas e então priva-das de soro durante a noite. As células foram então tratadas seja comLY294003 50 μΜ ou selenato de sódio 500 μΜ por 1 hora, com ou sempré-tratamento com ácido ocadáico 500 nM por 30 minutos prévios.Quantidades iguais de lisatos de células totais (75 foram reduzidasàs suas partes elementares por SDS-PAGE e o nível da fosforilação dap70S6K determinado pela análise de "imunoblof com um anticorpo queespecificamente reconhece a proteína p70S6K quando fosforilada emThr389. A comparação é feita com a proteína tubulina β de controle decarga. Como indicado na Figura 6B, mesmo sob condições basais, afosforilação da p70S6K é prontamente aparente e isto é abolido pelotratamento com o inibidor PI3K LY294002. Consistente com seu papelconhecido como um regulador negativo da fosforilação p70S6K, ainibição da PP2A com ácido ocadáico aumenta o nível da fosforilaçãoobservada. Todavia, em contraste à desfosforilação da Akt induzidapelo selenato de sódio, a fosforilação da p70S6K não é afetada emcondições similares.

O determinante primário da especificidade do substrato pareceresidir na subunidade B regulatória, a qual junto com a A e subunida-des catalíticas, compreende o complexo trimérico observado in vivo.

Foi feita uma tentativa para determinar quais famílias de subuni-dades B formaram um complexo com a Akt em células de carcinoma depróstata. 2 χ IO6 células de carcinoma de próstata foram colocadas emplacas de 100 mm, permitidas se ligarem por 8 horas e privadas de sorodurante a noite. As células foram, então, lisadas com ELB, um tampãodetergente médio e e a Akt total imunoprecipitada de 500 μg de lisatoscom um anticorpo monoclonal pan-Akt (1:100) e 30 μι de proteína A-sefarose. Os controles negativos (brancos) tiveram o anticorpo imuno-precipitante omitido. Depois de repetidas lavagens as contas foramfervidas em tampão de carga de proteína SDS 3X por 5 minutos, centri-fugadas em alta velocidade e o sobrenadante resultante foi reduzido àssuas partes elementares por eletroforese em gel. 100 μg de lisatos decélulas totais foi corrido no mesmo gel para comparação e as membra-nas resultantes testadas com anticorpos que especificamente reconhe-cem membros seja das famílias de subunidades B ou B'. O abaixamen-to com sucesso da Akt foi confirmado ao testar os mesmo "blots" comum anticorpo que reconhece a pan-Akt. Como mostrado na Figura 6Capenas uma subunidade regulatória da família B co-precipitou com aAkt neste sistema, sugerindo que um trímero da PP2Ac, A e membro dasubunidade da família B R2 media a desfosforilação da Akt nestascélulas.

Exemplo 6

Os efeitos metabólicos da insulina na síntese do glicogênio sãomediados pela quinase-3 sintase de glicogênio (GSK-3), um substrato ajusante direto da Akt. O GSK-3 é uma quinase serina/treonina expres-sada de forma ubíqua que fosforila e inativa a sintase de glicogênio. Emresposta à ativação do receptor de insulina, a Akt fosforila e inativa orepressor GSK-3, desta forma estimulando a síntese de glicogênio[Cross e colaboradores, 1995]. Além disso, GSK-3 tem sido implicadono controle da translação da proteína, progressão do ciclo da célula esinalização Wnt [Diehl e colaboradores, 1998, Welsh e colaboradores,1996, He e colaboradores, 1995]. Para determinar o efeito do tratamen-to do selenato de sódio na ativação do GSK-3p, as células de carcinomade próstata foram colocadas em placas, privadas do soro durante anoite, então tratadas com selenato de sódio 500 μΜ em meio fresco porvárias vezes como indicado (Figura 7). Os lisatos de células totaisreduzidas às suas partes elementares foram submetidos à análise de"imunoblof com um anticorpo que especificamente reconhece a GSK-3Papenas quando fosforilada na Ser9, um local crítico para a atividade dequinase, e comparação feita com a proteína citoesqueletal β-tubulinacomo um controle de carga. As células PC3 tem altos níveis basais deativação de GSK-3P, indicado pelo alto grau de fosforilação observadona raia de controle (0 h). O tratamento com selenato de sódio levou auma redução marcada na fosforilação, a qual foi máxima em lhe 3h, eretornou na direção dos níveis basais no tempo de 6h. Para quantificaro grau de inibição que o selenato de sódio induziu, "imunoblots" digitali-zados foram preparados comparando os efeitos do selenato de sódio 500μΜ por 3 h para a LY294002 50 500 μΜ pr 1 h e determinado o grau defosforilação da GSK-3P como uma proporção da proteína expressadapela densitometria. Em média, o selenato de sódio reduziu a GSK-3P demais de 20%, enquanto a LY294002 resultou em uma redução de quase60% nos níveis de fosforilação.

Exemplo 7

O Selenato de Sódio, mas Não a Selenometionina,

Potencialmente Inibe a Ativação Akt/Proteína Quinase B

Para determinar se o selenato de sódio pode interferir com aatividade da via PI3K, células PC3 livres de soro foram tratadas com500 μΜ de selenato de sódio por várias vezes. O status de fosforilaçãoda Akt nos lisatos de células totais foi determinado usando anticorposespecíficos de ativação. Por causa da perda de PTEN, mesmo naausência de soro adicional, existe uma ativação robusta da Akt emambos os locais Ser 473 e Thre308. A adição de selenato de sódioinduziu um aumento transiente na fosforilação da Akt em ambos oslocais dentro de 10 minutos de exposição. Este aumento foi, então,seguido de uma desativação marcada e prolongada, ao mesmo tempoem que os níveis de Akt celulares totais (pan Akt) permaneceramessencialmente não modificados.

O efeito do selenato de sódio na ativação da Akt em células PC3 foicomparado àquele da selenometionina, pelo tratamento com 500 μΜ decada composto por vários tempos estabelecidos e acessando a fosforila-ção da Akt na Ser473. Com indicado na Figura 8, a selenometioninanão afetou o nível de fosforilação da Akt em todos os períodos medidos,enquanto o selenato de sódio profundamente inibiu a fosforilação da Akt.

Exemplo 8A Capacidade de Induzir a Desfosforilação da Akté Única do Selenato de Sódio

Dado que o selenato de sódio consistentemente induz profundadesfosforilação na quinase Akt chave, enquanto a selenometionina nãoteve efeito, foi determinado se esta habilidade era única do selenato desódio ou era compartilhada por outras formas químicas do selênio.Outras espécies inorgânicas (seleneto de sódio, dióxido de selênio,sulfeto de selênio e ácido selenioso) e orgânicas (metilselenocisteína,selenocisteína) foram testadas em suas habilidades de afetar na ativa-ção da Akt. Todas as formas foram dissolvidas em água com exceção dosulfeto de selênio que foi solubilizado em DMSO e adicionado às célulasPC3 privas de soro em uma concentração de 500 μΜ por 1 hora.Lisatos de células totais foram então reduzidos às suas partes elemen-tares e o status de ativação da Akt foi determinado por "imunoblotting"com um anticorpo que especificamente reconhece a Akt quando fosfori-Iada no local Ser473, bem como o nível total da expressão da Akt (pan-Akt). Para quantificar o grau de ativação da Akt, "imunoblots" foramdigitalizados e a razão de Akt fosforilado para o Akt total determinadapor densitometria. A razão média de Akt fosforilado para os níveis deproteína Akt totais ± SEM de três experimentos independentes estãosumarizados na Figura 9. O tratamento de células PC3 com selenato desódio em 500 μΜ por 1 hora resultou em uma redução maior do que80% na fosforilação da Akt na Ser473 comparado a células não tratadas(p < 0,05, teste t de Students). Em contraste, o tratamento de células PC3 com outras formas inorgânicas e orgânicas de selênio administra-das sob condições idênticas não tiveram efeito significativo no grau deativação da Akt. Em resumo, estes dados indicam a habilidade deinduzir a desfosforilação da Akt é única do selenato de sódio.

Exemplo 9A Capacidade de Aumentar a Atividade da PP2A

é Única do Selenato de Sódio

No Exemplo 7, o dado demonstrando que de todas as formasquímicas de selênio testadas, o selenato de sódio sozinho significativa-5 mente induziu a desfosfororilação da Akt foi apresentado. Para deter-minar se um efeito diferencial na atividade da PP2A poderia explicaresta especificidade, o efeito do selenato de sódio (5 mM ou 50 μΜ),seleneto de sódio (5 mM ou 50 μΜ) e selenometionina (5 mM ou 50 μΜ)na atividade de fosfatase da PP2A foi comparada no teste de hidrólise10 pNPP usando pNPP e um fosfopeptídeo serina como um substratorespectivamente (Figuras IOA e 10B). Em contraste, ao aumento clarona atividade de fosfatase observado como selenato de sódio, nem oseleneto de ódio nem a selenometionina significativamente afetaram aatividade da fosfatase PP2A.

15 Materiais e Métodos dos Exemplos 1 a 9

Os detalhes da linhagem de célula de mamífero usada nos proce-dimentos experimentais são dados na Tabela 1.

Reagentes

Linhagens de Células

20

Tabela 1

Linhagem deCélula

Origem

Fonte Referência

Derivada da metástasedo osso de um adeno-

(Kaighn ME e

PC3

carcinoma prostático de ATCC colaboradores,

grau IV de um machoCaucasiano de 62 anosde idade

1979)

Todas as culturas de células foram mantidas num IncubadorCientífico Forma com 5% ou 10% de dióxido de carbono a 37°C emRPMI 1641 com L-Glutamina (Gibco Invitrogen n° 11875-119). Penici-Iina (100 U/ml), estreptomicina (100 ug/ml) e anfotericina B (25 ng/ml)(Gibco Invitrogen n° 15240-062) foram adicionadas ao meio comopadrão. Como uma rotina, as células foram mantidas na presença de5% ou 10% de soro bovina fetal (Gibco Invitrogen n° 10099-141) amenos que de outra forma dito. Células sub-confluentes foram passa-das com 0,5% tripsina-EDTA (Gibco Invitrogen n° 15400-054).

Anticorpos Disponíveis Comercialmente

Um número de anticorpos comercialmente disponíveis primários eperoxidase de rábano silvestre (HRP) conjugado ou de forma fluorescen-te rotulado ou biotinilado secundário foram usados em um trabalhoexperimental descrito, os detalhes dos quais são resumidos abaixo:

Anti-Akt antibody rabbit polyclonal, Cat N0 9272, Cell SignallingTechnology (CST);

Anti-Akt (5G3) mouse monoclonal, Cat N0 2966, CST;

Anti-phospho Akt (ser473) rabbit polyclonal, Cat N0 9271, CST;

Anti-phospho GSK3p (ser9) rabbit polyclonal, Cat N0 9336, CST;different anti-PP2A antibodies, Cat Nos 05-421, 06-2221, 07-334e 05-592, Upstate.

Quinases e Inibidores de Quinase, Inibidores de Fosfatasee Fosfatases PurificadasTabela 2

Inibidores de Quinase e Fosfatase

<table>table see original document page 49</column></row><table>

Tabela 3

Fosfatases Purificadas e Quinases Recombinantes

<table>table see original document page 49</column></row><table>

Tampões, Soluções e Meio

Todas as soluções foram armazenadas na temperatura ambiente(RT) a menos que de outra forma afirmado.<table>table see original document page 50</column></row><table>

Compostos de SelênioSelenato de sódio foi comprado da Sigma. Todas as soluçõesforam feitas de modo recentemente em dH20 e usadas nas concentra-ções estabelecidas.

Expressão da Proteína

Eletroforese em Gel SDS-Poliacrilamida (SDS-PAGE)

Seguindo os tratamentos especificados, as células em culturaforam lavadas uma vez em PBS e então lisadas por 15 min a 4°C sejaem Tampão de Lises de Ovo (ELB) ou tampão de lise de RIPA contendoum coquetel inibidor de protease (Coquetel Inibidor de Protease Calbio-chem Conjunto 1 n° 539131) e inibidores de fosfatase (10 mM deOrtovanadato de sódio e 10 mM de Fluoreto de sódio) com a ajuda deum raspador de célula. As amostras foram clarificadas por centrifuga-ção a 14.000 rpm por 15 min a 4°C e o sobrenadante usado paraanálise. A concentração da proteína na amostra foi determinada peloTeste de Solução Ácida Bicincrônico (BCA). 1 μL de lisato foi diluído1:25 com dH20 em uma placa de 96 poços. 200 μl de uma solução80:1 de uma solução de ácido bicincrônico e 4% (peso/peso) de sulfatode cobre foi adicionado a cada amostra e incubada a 37°C por 30 min.A absorbância foi medida a 590 nm (Perkin Elmer MBA2000) contrauma série de padrões de proteínas.

As amostras de proteínas foram analisadas por eletroforese em gelusando géis SDS-poliacrilamida desnaturantes, consistindo de um gelde empilhamento e um gel de redução. 50-100 μg de proteína foramcarregadas em géis SDS-PAGE de concentrações variadas. O tampão deamostra SDS foi adicionado em igual volume para as amostras e fervi-das a 100°C por 5 min antes da carga. A eletroforese em gel foi efetua-da em tampão de corrida a aproximadamente 100V. O peso moleculardas proteínas de interesse foi acessado pr marcadores de tamanho deproteínas (Biorad Kaleidoscope) carregado com cada gel.Análise de Western Blot

Após a resolução as proteínas foram transferidas para a membra-na PVDF (Immobilon P, Millipore). A membrana foi preparada pelaimersão em 100% de metanol por 10 s, lavada em água destilada eequilibrada em tampão de transferência de western. A transferênciaocorreu a 100 V a RT por 1,5 h ou durante a noite a 4°C. A membranafoi lavada por 5 min em TBS-T e permitida secar por 1 h. A membranafoi então bloqueada com 3% de leite desnatado em TBS com 0,1% deTween por lha RT. A membrana foi lavada três vezes por 5 min comTBS-T e então incubada com o anticorpo primário diluído em 3% deleite desnatado/0,1% de TBS-T ou 3% de BSA/0,1% de TBS-T por 1-2 ha RT ou durante a noite a 4°C com agitação suave. Após três lavagensde 5 min em 0,1% de TBS-T a membrana foi incubada com anticorpossecundários conjugados de peroxidase de rábano silvestre em tampão de bloqueio por 1 h. A membrana foi novamente lavada três vezes por 5min antes da ligação do anticorpo fosse detectada pelo aumento daquimioluminescência com Super Signal® West Dura Extended DurationSubstrate (Pierce n° 34075) ou ECL Western Blotting Detection Agents(Amerscham Biosciences n° RPN2106). A luminescência era registrada por autoradiograíla usando um filme de exposição CL (Kodak). Apósanálises "imunoblots" iniciais foram extraídos com Tampão de Extraçãode Membrana (62,5 mM de TRIS pH 7, 2% de SDS, 7% de β-mercaptoetanol) por 15 min a 60°C, lavado três vezes em TBS-T ebloqueado de novo antes de novo teste.

Análise Densitométrica

"Imunoblots" relevantes foram convertidos para arquivos.tif noCorel Photo-Paint Versão 8 (Corel Corporation) usando um scannerdigital Vista (Umax). A análise densitométrica foi efetuada no Image-Pro-Plus V4.5.1.22 para Windows (Media Cybernetics). Usando umacalibração linear na qual ao branco foi atribuído o valor 0 e ao preto ovalor 255, uma região de interesse correspondendo a uma faixa relevan-te foi selecionada e a intensidade de sinal determinada.

Imunoprecipitação

100-600 μg de lisato de célula total foi incubado com váriosanticorpos a uma diluição 1:100 em tubos microfuge em uma centrífugapor 1-2 h a RT ou 16 h a 4°C como indicado. Após breve centrifugação,30-40 μΐ^ de contas de Fluxo Rápido de Sefarose 50% de Proteina-A(Sigma n° 9424) foi adicionado a cada tubo e girado a 4°C por 1 h a RTou 4°C. Após breve centrifugação, o sobrenadante foi removido e apelota lavada com 500 μΐ^ de tampão de Iise de célula. Após três de taislavagens, as contas foram usadas para testes enzimáticos ou a proteínaeluída por ebulição das contas em 3X tampão de carga de proteína SDSpor 5 min e decomposta em géis SDS-PAGE.

Testes de Fosfatase

PP2Ac humano purificada e PPl de coelho foram diluídas para0,01 υ/μΐ^ com o tampão de diluição fornecido e armazenado emalíquotas de -20°C.

Testes de Fosfopeptídeoscom Fosfatases Purificadas

1 mg de fosfopeptídeos sintéticos K-R-pT-I-R-R (Upstate n° 12-219) e R-R-A-os-V-A (Upstate n° 12-220) foram dissolvidos em 1,ΙΟ-Ι,285 ml de dH2Ü para preparar uma solução 1 mM, então separadaem alíquotas e armazenadas a -20°C até o uso. 0,01-0,05 U de dímeropurificado PP2A A-C purificado de células vermelhas do sangue huma-no ou 0,05 U de PPl purificada de coelho do músculo do esqueleto foimisturado com 500 μΜ de fosfopeptídeo e incubado na presença devários tratamentos como indicado a 37°C num bloco de aquecimentopor 15 min. Cada reação foi preparada para um volume total de 25 \xLcom tampão pNPP (50 mM Tris-HCl, pH 7,0, 100 μΜ de CaCl2). Areação da enzima foi terminada pela adição de 100 μΐ^ de solução verdede malaquita (0,034% de verde de malaquita em 10 mM de mollibdatode amônio, IN HCl, 3,4% de etanol, 0,01% de Tween-20). O verde demalaquita forma uma complexo verde estável na presença de molibdatoe ortofosfato, permitindo a quantidade de fosfato inorgânico presente deser medido. A absorbância foi lida em duplicata para cada amostra a590 nm.

Imunoprecipitação de PP2Ae Teste de Fosfatase

1x106 células PC3 foram colocadas em placas de 60 mm e permi-tidas se ligarem por 8 h, então privadas de soro durante a noite.

Seguindo vários tratamentos como indicado, o meio foi aspirado e ascélulas lavadas uma vez com TBS. As células foram lisadas em 0,3 mlde tampão de Iise (20 mM de Tris-HCl, pH 7,0, 1% de Igepal-CA, 2mMde EDTA, 2mM de EGTA, Ix de Coquetel Inibidor de Protease Completo)e os fosfatos removidos pela passagem do lisato através de uma Colunade 2 ml Zeba Desalt Spin Column (Pierce n° 89890). A concentração deproteína do lisato dessalgado foi determinada pelo teste BCA comodescrito previamente. 100-150 μg da proteína total foi imunoprecipita-da com 4μg de anticorpo monoclonal anti-PP2A e 30 μίν de pasta deProteína A-sefarose a 4°C por 2 h. As amostras foram então empelota-das a 14.00 rpm por 1 min, lavadas três vezes em excesso de TBS euma vez com tampão de teste pNPP. Após o giro final todo o sobrena-dante foi cuidadosamente removido e 500 μΜ do peptídeo fosfo-treoninaem um volume final de 80 μΐ^ adicionado às contas. As amostras foramincubadas a 30°C por 10 min com agitação, e a reação terminada pelaadição de solução verde de malaquita. A absorbância foi lida a 590 nmpara cada amostra em duplicata.Teste de Hidrólise pNPP

Para-nitrofenilfosfato (pNPP) é um substrato químico de enzimasde fosfatase, o que seguindo a hidrólise do segmento fosfato gera para-nitrofenol, um cromógeno intensamente amarelo, solúvel sob condiçõesalcalinas. Em testes medindo a atividade de fosfatase relativa, 0,05 Ude PP2A purificada foi misturada com 5 μΐ^ de 40 mM de NiCb e 5 pL desolução BSA (5 mg/ml) em um tubo de micro centrífuga. Vários trata-mentos foram adicionados como indicado e o volume ajustado para 80\xb com tampão de teste pNPP. As amostras foram pré-incubadas a37°C por 15 min. O substrato pNPP foi recentemente preparado antesde cada teste pela dissolução de 1,5 mg/ml de pNPP em 50 mM de Tris-HCl, pH 7,0. Para iniciar a reação de fosfatase, 120 \\L de substratopNPP foi adicionado e amostras incubadas por 15 min adicionais com590 nm como uma referência. A atividade da PP2A foi calculadausando a seguinte equação: atividade = (vol da amostra em litros) χΑ40δ/1,78 χ IO4M-1Cm-1 (coeficiente de extinção) χ 0,25 cm χ 15 minutosχ 0,05 U enzima.

Medida dos Grupos Sulfidril Livres Totais

A mudança nos grupos sulfidril livres no PP2A purificado apósvários tratamentos foi determinada usando o Reagente de Elmann.Para 0,01 U de PP2A foi adicionada a 37,5 μΐ, de tampão de diluição (30mM de Tris-HCl, 3 mM EDTA, pH 8,2), 12,5 pL de reagente DTNB(reagente de Elmann) e 200 pL de metanol. As amostras foram incuba-das pr 5 min a RT e então a extinção medida em duplicata para cada a412 nm. Os resultados foram comparados a uma curva padrão geradacom N-acetilcisteína.

Teste de Atividade Quinase Akt

O efeito do selenato de sódio na atividade da quinase Aktl huma-na recombinante foi determinado usando o kit de atividade AKT K-LISA®(Calbiochem η° CBAO19). Este é um teste baseado no ELISA que utilizaum substrato de peptídeo biotinilado (GRPRTSSFAEG) que é fosforiladona segunda serina por Aktl, Akt2, Akt3, SGK (Soro de Quinase deGlucocorticóide) e MSKl. O substrato de Akt biotinilado e amostra Aktsão incubados na presença de ATP nos poços de placas de 96 poçosrevestidas com estreptavidina, o que permite a fosforilação e a capturado substrato em uma única etapa. O substrato fosforilado é detectadocom um anticorpo de detecção fosfo-serina, seguido pelo conjugadoHRP-anticorpo e desenvolvimento de cor com o substrato TMB.

No início de cada corrida de teste, uma nova alíquota da soluçãode trabalho de substrato de Akt biotinilado era preparada pela diluiçãoda solução estoque 1:100 com dH20. Em seguida era então adicionadaa cada poço nesta ordem: 10 μΐ^ de 5X Tampão de Teste de Quinase;10μl de solução de trabalho de substrato Akt biotinilado; 250 ng deAktl humano recombinante em 10 μΐ^ de dH2Ü; 500 μΜ de selenato desódio ou 1 μΜ de estaurosporina em 10 μΐ, de dH20, ou apenas dl-hOpara controles positivos; 10 μΐ^ de 5X de uma mistura ATP/MgCb paraum total de 50 μΐ^ por poço. A placa foi selada com selador de placas,misturado brevemente em um agitador de microplacas e incubada por30 m a 30°C. A reação de quinase foi então parada pela adição de 10μl de solução de parada de quinase para cada poço. O conteúdo decada poço foi descartado e então lavado 3 vezes com Ix solução delavagem ELILSA (preparada pela diluição da solução de ELISA emestoque 1:20 com dl-hO), invertido e batida de leve em papel "blotting"até a secagem. 100 μL de solução de trabalho de anticorpo de detecçãofosfo-serina (preparada recentemente para cada corrida do teste peladiluição da estoque de anticorpo fosfo-serina 1:1.000 com dH20) foientão adicionada a cada poço e incubada por lha RT. A placa foientão lavada como descrito acima. 100 μL de solução de trabalhoconjugado HRP-anticorpo (preparada recentemente para cada corridado teste pela diluição do estoque HRP-anticorpo 1:1.000 com dH2Ü) foientão adicionada a cada poço e incubada por lha RT. A placa foientão lavada novamente como descrito acima. 100 \xL de substratoTMB foi então adicionada a cada poço e a cor permitida se desenvolverpor 20 min a RT. A reação foi parada pela adição de 100 μΐ^ de soluçãode parada ELISA para cada poço e a absorbância lida a 450 nm comreferência a 590 nm usando um leitor de microplaca.

Teste de Estado Redox Intracelular

O estado redox intracelular foi determinado usando 2',7'-diclorodihidrofluoresceína diacetato (DCFDA). O DCFDA é não fluores-cente e livremente permeável à célula, mas na presença de espéciesoxigênio reativas (ROS) é rapidamente convertido ao impermeável àcélula, mas altamente fluorescente 2',7'-diclorofluoresceína (DCF). Ascélulas foram equilibradas com 5 μΜ de DCFDA por 15 min antes devários tratamentos. Células aderentes foram então postas em cultura,lavadas duas vezes com PBS e a proporção de células fluorescentesdeterminadas imediatamente por citometria de fluxo.

O revelado de cada Patente, Pedido de Patente e publicação citadaneste documento é aqui incorporado neste documento por referência emsua totalidade.

A citação de qualquer referência aqui neste documento não deveser entendido como uma admissão de que tais referências estão dispo-níveis como "Estado da Técnica" no momento do depósito.

Através de todo o Relatório Descritivo o objetivo tem sido o dedescrever as modalidades preferidas da invenção sem limitar a invençãoa qualquer uma realização ou coleção específica de aspectos. Aquelesversados na técnica apreciarão desta forma que, em luz da revelação domomento, várias modificações e mudanças podem ser feitas nas moda-lidades particulares exemplificadas sem fugir do escopo da presenteinvenção. Todas as tais modificações e mudanças são tencionadas paraserem incluídas dentro do escopo das reivindicações anexadas.

Exemplo 10

Efeitos do Selenato nas Atividades de Fosforilação da Tau Ambasnos Tecidos do Cérebro de Camundongos e Linhagens de Células deNeuroblastoma Humanos

Materiais e Métodos

Cultura das Células. Linhagens de células SY5Y e BE2M17 deneuroblastoma humanas foram obtidas de Janetta Culvenor (Depart-ment of Pathology, University of Melbourne, VIC). As células Sy5Yforam cultivadas rotineiramente em meio RPMI 1640 (Invitrogen Auc-kland, Nova Zelândia) suplementadas com 10% de soro bovine fetal(FBS, Invitrogen, GIBCO), 1% de aminoácidos não essenciais (Sigma, StLouis, MO, EUA), 10 mM HEPES (Invitrogen, GIBCO), ImM de piruvatode sódio (Invitrogen, GIBCO) e 1% da mistura antibiótico/antimicótico(Invitrogen, GIBCO). As células BE2M17 foram cultivadas em meio desoro reduzido OPTI-MEM (Invitrogen, GIBCO) suplementadas com 10%de FBS (Invitrogen, GIBCO), 1% de aminoácidos não essenciais (Sigma,St Louis, MO, EUA), ImM de piruvato de sódio (Invitrogen, GIBCO) e 1%da mistura antibiótico/antimicótico (Invitrogen, GIBCO). As célulasforam cultivadas a 37°C em 5% de CO2. O selenato de sódio foi obtidoda Sigma (St. Louis, MO, EUA).

Anticorpos: Os seguintes anticorpos foram obtidos da PieerceEndogen (Rockford, EUA) a menos que de outra forma indicado: anti-humano PHF-Tau monoclonal (clone AT100; Atl80; AT270) e anti-humano Tau monoclonal (clone HT-7). Imunoglobulinas?HRP anti-camundongos de bode policlonal (Dako, Dinamarca) e anti-tubulina(G712A, Promega).

In Vitro. 2 χ IO5 células SY5Y ou BE2M17 foram colocadas emcada poço em uma placa de 6 poços Falcon, seja com superfíciesrevestidas ou não revestidas e foram permitidas se ligarem durante anoite a 5% de C02/37°C em meio de crescimento completo (comodescrito acima). O meio foi substituído com meio de crescimentocompleto recente contendo 100 μΜ de concentração de selenato desódio e foram cultivadas por 3 horas. As células foram cultivadas sobreplacas de 6 poços Falcon com superfícies revestidas seja com 0,1% degelatina (Sigma, St Louis, MO, EUA), matrigel (cat n° 354234, BD, NSW,Austrália) ou 0,5 Mg/ml de fíbronectina (Sigma, St Louis, MO, EUA).

In Vivo: camundongos machos de 14 semanas de idade Balb/CNu Nu foram obtidos da ARC. Os camundongos receberam uma injeçãosubcutânea única de 300 μg de selenato de sódio por 200 μΐ^ em PBS.Os camundongos foram sacrificados em vários períodos de tempo apósa injeção e amostras do sangue e tecidos do cérebro das espécies foramcoletadas.

Preparação de Lisatos e uImunoblottingn: As células foramlavadas duas vezes em PBS frio e foram lisadas em 150 μΐ, de tampãoRIPA frio (contendo 10% de glicerol, 20 mM de Tris, 137 mM de NaCl,0,1% de SDS, 0,05% de IGEPAL, 1% de Triton X-100, 2 mM de EDTA,10% de NaV, 2% de NaF e 4X inibidor de protease), similarmente, ostecidos do cérebro foram homogeneizados em gelo seco usando gral epilão e Usados em 150 μΐ, de tampão RIPA. As amostras foram incuba-das em gelo por 30 minutos, seguido por centrifugação a 13.000rpm/10 minutos/4°C. O sobrenadante foi coletado e a estimativa deproteína foi calculada para cada amostra usando o reagente BCA(Sigma). Quantidades iguais de proteína foram carregadas em cada raiade 10% de gel SDS-poliacrilamida. As proteínas foram transferidaspara membranas PVDF (Millipore) e foram bloqueadas com 5% de leitedesnatado "blotto" por duas horas. Após bloquear a membrana, anti-corpos primários: sejam anti-humano PHF-Tau (AT100 a 1:200, AT180a 1:1.000 e AT270 a 1:2500) ou anti-humano Tau (HT-7 a 1:1.000)foram incubados durante a noite a 4°C em 5% de leite desnatado"blotto". Antes da incubação de anticorpo secundário, as membranasforam lavadas 3x seguido por 3x5 lavagens em Tampão salino Tris com0,01% de Tween na temperatura ambiente. Seguido por 1 hora deincubação de anti-camundongo bode policlonal anticorpo secundário(Dako, Dinamarca) acoplado com a peroxidase de rábano silvestre (HRP)a diluições de 1:10.000 em 5% de leite desnatado "blotto"/temperaturaambiente. As membranas foram lavadas como descrito acima e foramdetectadas usando o reagente de detecção "western blotting" ECLAmersham (Amersham Bioscience, Buckinghamshire, Reino Unido). Asmembranas foram extraídas usando 2% de tampão de extração SDS/β-mecaptoetanol e testado novamente para atubulina (Promega) paraconfirmar a carga de proteína.

"Imunoblotting" de linhagem de célula BE2M17 de neuroblastomahumano com anti-humano PHF-Tau na presença (+) ou ausência (-) deselenato de sódio, sob várias superfícies de revestimento é mostrado naFigura 11. O selenato de sódio a 100 μΜ foi preparado em meio decrescimento completo BE2M17. As células foram cultivadas comselenato de sódio por 3 horas em fibronectina, não revestida (plástica)ou matrigel (cpmp descrito na seção métodos).

Resultados:

O Clone AT100 anti-humano PHF-Tau foi detectado a 68 kDa.

Na presença de selenato de sódio, o sinal PHF-Tau pareceu estarreduzido de células cultivadas em fibronectina e matrigel, em compara-ção às células não tratadas com selenato.

O Clone AT180 anti-humano PHF-Tau foi detectado em ambos71 e 67 kDa. Células tratadas com selenato cultivadas em fibronecti-na, plástica (não revestida) e matrigel pareceram ter um sinal PHF-Taumais fraco comparado às células não tratadas com selenato. As célulascultivadas com matrigel deram um sinal mais forte de PHF-Tau a 67kDa comparado com as células cultivadas em fibronectina e plástico.

O Clone AT270 anti-humano PHF-Tau foi detectado em ambos66 e 63 kDa. As células tratadas com selenato cultivadas em fibronec-tina, plástico (não revestidas) e matrigel pareceram ter um sinal PHF-Tau mais fraco comparado às células não tratadas com selenato. Nota,existe apenas uma leve diferença entre as células tratadas com selenatoe as células não tratadas cultivadas em matrigel.

O Clone HT-7 anti-humano Tau foi detectado a 68, 64 e 57 kDa.

As células cultivadas em fibronectina com selenato pareceram reduzir aexpressão da Tau.

Anti-tubulina foi detectada mostrando igual carga de proteína.

"Imunoblotting" de linhagens de células SY5Yde neuroblastomahumano com PHF-Tau anti-humano na presença (+) ou ausência (-) deselenato de sódio, sob várias superfícies de cultura é mostrado naFigura 12. O selenato de sódio a 100 μΜ fio preparado em meio decrescimento completo SY5Y. As células foram cultivadas com selenatode sódio por 3 horas em gelatina, fibronectina, não revestida (plástico)ou matrigel (como descrito na seção métodos).

Resultados:

O Clone AT270 anti-humano PHF-Tau especificamente detec-tado a 70 kDa. As células tratadas com selenato cultivadas em gelati-na e fibronectina pareceram ter um sinal PHF-Tau mais fraco compara-do às células não tratadas com selenato.

O Clone HT-7 anti-humano Tau foi detectado a 60kDa. Ambos omatrigel e a fibronectina pareceram reduzir o sinal anti-Tau. Emparticular, as células cultivadas em fibronectina com selenato parece-ram ter um sinal mais fraco para anti-Tau do que aquelas cultivadassem selenato.

Anti-tubulina foi detectada mostrando relativa igual carga deproteína.

"Imunoblotting" de lisatos de cérebro totais de camundongosmachos de 14 semanas de idade Balb/C Nu Nu com PHF-Tau anti-humano (como indicado) seja com (+) ou sem (-) selenato de sódio émostrado na Figura 13. Aos camundongos tratados com selenato desódio foram dadas injeções subcutâneas de 1,5 μg/μL. Na ausência deselenato de sódio (-) os camundongos foram injetados de forma subcu-tânea com PBS. O tecido do cérebro foi coletado em vários períodos detempo: 0, 2 e 6 horas (como descrito na seção métodos).

Resultados:

O PBS pareceu ter um efeito no sinal PHF anti-humano paratodos os clones estudados (AT100, AT180 e AT270). Para confirmarcarga de proteína igual todas as membranas foram extraídas e testadasde novo para tubulina como descrito na seção métodos.

A Figura 13A mostra a imunoreatividade do clone ATlOO anti-humano PHF-Tau a 60 kDa. Na presença de selenato de sódio, o sinalPHF-Tau pareceu estar reduzido no período de tempo de 2 e 6 horascomparado às células não tratadas com selenato.

A Figura 13B mostra a imunoreatividade do clone ATl80 anti-humano PHF-Tau em 60 kDa. Na presença de selenato de sódio, o sinalda PF-Tau claramente reduziu em 2 e 6 horas comparado a células nãotratadas com selenato.

A Figura 13C mostra sinais de imunoreatividade similares doAT270 comparado aos clones AT180. Parece que os clones AT270detectaram três isoformas de PHF Tau a 73, 70 e 60 kDa.

A Figura 13D mostra a expressão da proteína Tau em lisatostotais de cérebros de camundongos seja com (+) ou sem (-) selenato desódio. Tau anti-humano, especificamente o clone HT-7 em tecidos decérebros de camundongos pareceram ser não específicos.

Exemplo 11

Efeitos do Selenato de Sódio no Comportamento e Patologia doCérebro Tau de Camundongos Transgênicos Superexpressando a

Tau Humana 441 (TMHT)

Métodos

Introdução

O estudo foi projetado para avaliar os efeitos de um tratamentocom selenato de sódio no comportamento e morfologia do cérebro decamundongos TMHT (Tg) transgênicos TAU441 (antecedente C57BL6)superexpressando o gene TAU441 humano com duas mutações, V337Me R406W, sob o controle de um promotor Thy-1 de murino específico decérebro. O comportamento de todos os camundongos Tg foi avaliadoapós 1,5 e 3 meses após tratamento no teste do Campo Aberto (OF), oteste do "Rota Rod" (RR) e teste de curiosidade "nose poke" e atividade,o primeiro para avaliar o comportamento de curiosidade. Ao final dotratamento adicionalmente a memória e aprendizado foram avaliados noteste do Labirinto Aquático de Morris (MWM). Camundongos nãotratados do grupo da linha base foram também testados no teste OF,teste RR, teste do "Nose poke" e na tarefa MWM. A patologia TAU docérebro foi determinada inicialmente em 3 animais por grupo de tratamento.

AnimaisCamundongos TMHT machos e fêmeas expressando TAU441humano tendo as mutações missense V37M e R406W sob o controleregulatório do promotor Thy-I de murino específico do cérebro foiusado. Os camundongos foram gerados e criados em JSW-Research,Graz, Áustria. Os antecedentes C57BL/6 para estes camundongosresultam nos camundongos como sendo bons aprendizes. Este modelode camundongo lembra a patologia tau da doença de Alzheimer. Noinício do tratamento os camundongos tinham uma idade de 5 meses ± 2semanas e esta era também a idade do grupo da linha base.

Identificação do Animal e Moradia

Os camundongos foram identificados com marcações nas orelhas.Eles foram mantidos em gaiolas ventiladas individuais (IVCs) emmaterial que serve de leito para roedores padronizado suprido pelaABEDD®. Cada gaiola continha um máximo de cinco camundongos.

Os camundongos foram mantidos de acordo com os procedimentos deoperação padrão baseado em padrões internacionais.

Cada gaiola foi identificada por um cartão colorido indicando onúmero do estudo, sexo, os números de registro do individual (IRN) dosanimais, data de nascimento, bem como a data de triagem e alocaçãodo grupo de tratamento.

A temperatura durante o estudo foi mantida a aproximadamente24°C e a umidade relativa foi mantida a aproximadamente 40-70%. Osanimais foram mantidos sob um ciclo de luz constante (12 horasluz/escuro).

Comida de roedor padrão seca, em pelotas (Altromin®) e água detorneira normal estavam disponíveis para os animais à vontade.

TratamentoOs camundongos foram aleatoriamente alocados nos grupos A(selenato de sódio), B (veículo) e C (linha base). O grupo de tratamentoA recebeu selenato de sódio através da água de beber por 12 semanasenquanto os camundongos de controle (B) tiveram acesso á água detorneira normal. Para aplicação, 1,2 mg de selenato de sódio foi dissol-vido em 100 mL de água esterilizada, o peso foi registrado e a garrafa foicolocada na gaiola. Isto foi feito cada segunda, quarta e sexta a água foipesada na troca para medir o consumo.

Teste Comportamental

Teste do Campo Aberto

A medida da função locomotora geral mais padronizada é aatividade espontânea no Campo Aberto (OF). Para as presentes investi-gações, um foi usado Plexiglas Open Field (48x48 cm; TSE-System®).Os feixes de foto de infravermelho foram colocados a uma distância de1,4 cm ao redor da caixa. Para detectar a posição de ficar nas patastraseiras (permanecer nas patas traseiras) outra linha de feixe de fotosfoi montada 4 cm acima da primeira. A sessão de teste durou r5minutos para verificar o comportamento do camundongo no novoambiente bem como a habituação. Desta forma o número d bolo fecalfoi contado, como uma medida da emotividade. O OF foi limpo cometanol 70% após cada camundongo para remover traços de odor. Oteste foi efetuado sob condições de iluminação da sala padrão durante afase de luz do ciclo circadiano.

Teste do "Rota Rod"

Este teste foi usado para detectar possíveis déílcits motores noscamundongos Tg TAU. As investigações foram conduzidas em um testeRota Rod de cinco raias com aceleração (TSE-Systems®). Os camun-dongos tinham que completar um programa em no máximo 300 sec.Eles iniciavam com uma velocidade de 5 rpm e após 120 sec a rodaalcançava a velocidade de 60 rpm. Após esta corrida, a latência paracair e a velocidade da roda naquele momento eram calculadas.

Curiosidade "Nose Poke" e Teste de Atividade

O equipamento do orifício-prancha oferece um método simples demedir as respostas de um camundongo a um ambiente novo e tiravantagem da natureza curiosa dos camundongos e a tendência deles decolocar os narizes em buracos. A investigação do comportamento decuriosidade foi feito em caixas OF equipadas com orifícios/pranchas (16buracos/prancha). A cabeça sendo enfiada no orifício interrompe osfeixes de infravermelho justo abaixo da borda de cada buraco. Onúmero e duração de colocação das cabeças foram calculados paracada animal durante um período de 5 minutos.

Teste do Labirinto Aquático de Morris (MWM)

O teste do Labirinto Aquático de Morris foi conduzido em umreservatório circular preto com um diâmetro de 100 cm. O reservatóriofoi preenchido com água de torneira a uma temperatura de 22 ± 1°C e oreservatório foi virtualmente dividido em quatro setores. Uma platafor-ma transparente (8 cm de diâmetro) foi colocada cerca de 0,5 cm abaixoda superfície da água. Durante a sessão de teste inteira, exceto o pré-teste, a plataforma foi localizada no quadrante sudoeste do reservatório.

Um dia antes da sessão de treinamento com duração de 4 dias osanimais tiveram que efetuar um chamado "pré-teste" (duas tentativasde 60 segundos) para garantir que a habilidade visual de cada animalfosse normal. Apenas animais que completaram esta tarefa continua-ram no teste MWM.

Na tarefa MWM cada camundongo tinha que efetuar três tentati-vas em quatro dias consecutivos. Um teste único durou pr um máximode um minuto. Durante este tempo, o camundongo tinha a chance deachar o alvo escondido, diáfano. Se o animal não pudesse achar uma"saída" para fora da água, o investigador guiava ou colocava o camun-dongo na plataforma. Após cada tentativa o camundongo era permitidodescansar na plataforma por 10-15 segundos. Durante este tempo, ocamundongo tinha a possibilidade de se orientar pelas vizinhanças. Asinvestigações tiveram lugar sob condições de luz reguladas, paraprevenir o sistema de rastreamento de influências negativas (Kaminski;PCS, Biomedical Research Systems). Nas paredes envolvendo o reserva-tório, pôsteres com símbolos geométricos pretos, em negrito (por exem-pio, um círculo e um quadrado) foram fixados aonde os camundongospoderiam usar os símbolos como paisagens para orientação.

Um grupo de natação por tentativa consistiu de cinco ou seiscamundongos, de forma que um tempo entre tentativas de cerca decinco a dez minutos foi garantido.

Para a quantificação da latência de escape (o tempo em segundosque o camundongo necessitou para achar a plataforma escondida edesta forma escapar da água), do caminho (o comprimento da trajetóriaem metros para alcançar o alvo) e a permanência no quadrante alo umsistema de rastreamento computadorizado foi usado. O computador foiconectado a uma câmera colocada no centro do reservatório. A câmeradetectou o sinal do diodo de emissão de luz (LED), o qual foi fixado comum pequeno grampo de cabelo no rabo do camundongo.

Teste de Sondagem

Uma hora após a última tentativa no dia 4, os camundongostinham que completar um chamado teste de sondagem. Neste tempo, aplataforma foi removida do reservatório e durante um teste de sonda-gem de um minuto, o experimentador contou o número de passagenssobre a posição do alvo anterior. Adicionalmente, a permanência nestequadrante foi medida.Preparação do Tecido e Amostragem

Ao final do período de tratamento, e seguindo todo teste compor-tamental, no sacrifício de cada animal, sangue (plasma e soro), CSF ecérebro foram obtidos, imediatamente processados ou armazenadospara experimentos adicionais.

Para aquele propósito todos os camundongos foram sedados comanestesia por inalação padrão (Isofluran, Baxter). O fluido cerebrospi-nal foi obtido por dissecação abrupta e exposição do forâmen magno.Som exposição, uma pipeta Pasteur foi inserida a uma profundidadeaproximada de 0,3 - 1 mm no forâmen magno. O CSF foi coletado pelasucção e ação capilar até que o fluxo completamente cessasse. Cadaamostra foi imediatamente resfriada e mantida a -80°C até estar prontapara análise adicional pela técnica ELISA.

Após a amostragem CSF, cada camundongo foi colocado emdecúbito dorsal e uma agulha de tamanho 26 ligada a uma seringa de 1ml foi inserida no tórax através do diafragma a uma profundidadeaproximada de 2 cm. Sucção leve foi aplicada à agulha e a colocação nacâmara cardíaca (ventricular) do camundongo foi confirmada pelo fluxode sangue para a câmara da seringa. O sangue foi aspirado até o fluxocessar, coletado em frascos com EDTA e armazenados a -20°C para usoposterior.

Após a amostragem de sangue, os camundongos transgênicosforam injetados intracardiacamente com 0,9% de cloreto de sódio. Oscérebros foram rapidamente removidos e a metade direita foi fixada porimersão por 24 horas em paraformaldeído 4% recentemente preparado eenvolvido em parafina para investigações histológicas. O hemisférioesquerdo foi congelado em gelo seco e armazenado a -80°C para possí-veis análises bioquímicas posteriores.

Em inicialmente nove (9) hemisférios de cérebro (> 3 por grupoanimal Tg) avaliações histológicas foram efetuadas para quantitativa-mente e qualitativamente avaliar a patologia TAU.

Quinze (15) seções consecutivas coronais (Leica SM 2000R) foramcortadas (5 μιη de espessura) em cada um de 5 diferentes camadas decérebro entre Bregma -1,82 e -l,34mm, as quais foram escolhidas deacordo com o Atlas de morfologia "The Mouse Brain" de PAxinos eFranklin (2a edição), para mancha de Gallyas e para determinação dapatologia TAU com anticorpos específicos (AT 180 e HT7). Os tecidos detodos os animais transgênicos investigados foram manuseados exata-mente da mesma maneira para evitar desvios devido à variação nesteprocedimento. Os hemisférios de cérebro ou tecido remanescentes nãousados foram salvos e guardados até que o responsável tenha decididocom proceder ou até o final do estudo.

Determinação Imunohistoquímica da Patologia TAU

As deposições de TAU foram determinadas usando os anticorpos

TAU monoclonais AT180 e HT7 (Pierce Endogen®). O AT180 reconhecea PHF-TAU e formações como emaranhados [a epítope deste anticorpo éo resíduo Thr231 fosforilado] e HT7 normal humano e PHF-TAU [oepítope deste anticorpo tem sido mapeado na TAU humana entre oresíduo 159 e 163].

Seções de parafina coronais de cinco (5) pm de espessura de cadaum das cinco diferentes camadas foram manchadas como os anticorposacima descritos TAU anti-humanos de camundongo monoclonal (ATI80- 1:100; HT7 - 1:1.000) e visualizadas usando um anti-camundongosecundário Cy3 (1:500, Jackson Laboratories®). Os protocolos demancha detalhados são fixados abaixo:

Protocolo de Incubação AT180Para Determinação de Deposições PHF-TAU Humano1) Desparafinar e hidratar as seções do tecido através do clarea-dor de tecidos ("Tissue Clear")(Sakura®) e série álcool gradua-do (Merck®).

2) Lavar por 2 minutos em água "bidest" (água filtrada com mil-lipore)(Fresenius-Kabi®).

3) Colocar as seções do tecido para desmascaramento do antíge-no em 10% de tampão citrato (Labvision®) por 15 minutos a95°C em um vaporizador e resfriar por 15 minutos à tempera-tura ambiente.

4) Lavar as seções por 2x5 minutos em PBS.

5) Bloquear a peroxidase endógena com 1% de peróxido de hi-drogênio (Linaris®) em metanol (Merck®) por 10 minutos àtemperatura ambiente.

6) Lavar as seções por 2x5 minutos em PBS.

7) Bloquear ligações não específicas com Reagente de Bloqueio

MOM (Vector®) por 60 minutos à temperatura ambiente emuma câmara de umidade.

8) Lavar as seções por 2x5 minutos em PBS.

9) Bloquear ligações não específicas com Diluente MOM (Vector®)por 5 minutos à temperatura ambiente.

10) Incubar com AT180 (Pierce Endogen®; 1:100 em DiluenteMOM) por 60 minutos à temperatura ambiente em uma câma-ra de umidade.

11) Lavar as seções por 3x5 minutos em PBS.

12) Bloquear ligações não específicas com 10% de Soro Normal de

Bode Não Imune (Dako®) por 10 minutos à temperatura ambi-ente em uma câmara de umidade.

13) Lavar as seções por 2x5 minutos em PBS.

14) Incubar com Anti-camundongo de Bode Cy 3 (Jacson®; 1:500cm Diluente MOM) por 60 minutos à temperatura ambienteem uma câmara de umidade.

15) Lavar as seções por 5 minutos em PBS.16) Lavar as seções por 5 minutos em água "bidest".

17) Cobrir as seções com Moviol e cobertas.

Produtos Químicos e Reagentes

1% de peróxido de hidrogênio em metanol:

60 ml de metanol + 2 ml de 30% de peróxido de hidrogênio + 0,6mL de Triton X-100 (Amresco®).

Reagente de Bloqueio MOM:

2 gotas de Reagente de Bloqueio IgG de Camundongo MOM (do kitMOM (Vector®)) + 2,5 mL de PBS.

Diluente MOM:

10 ml de PBS + 800 μL de Concentrado de Proteína (do kit MOM(Vecto r®)).

Anticorpo HT7:

1:100 em Diluente MOM.

Anticorpo de Anti-Camundongo de Bode Cy 3:1:500 em Diluente MOM

Protocolo de Incubação de HT7Para a Determinaçãode Deposições de TAU Humano Normale PHF-TAU

1) Desparafmar e hidratar as seções do tecido através do clarea-dor de tecidos ("Tissue Clear")(Sakura®) e série álcool gradua-do (Merck®).

2) Lavar por 2 minutos em água "bidest" (água filtrada com mil-lipore)(Fresenius-Kabi®).

3) Colocar as seções do tecido para desmascaramento do antíge-no em 10% de tampão citrato (Labvision®) por 15 minutos aem um vaporizador e resfriar por 15 minutos à tempera-tura ambiente.

4) Lavar as seções por 2x5 minutos em PBS.

5) Bloquear a peroxidase endógena com 1% de peróxido de hi-drogênio (Linaris®) em metanol (Merck®) por 10 minutos àtemperatura ambiente.

6) Lavar as seções por 2x5 minutos em PBS.

7) Bloquear ligações não específicas com Reagente de BloqueioMOM (Vector®) por 60 minutos à temperatura ambiente emuma câmara de umidade.

8) Lavar as seções por 2x5 minutos em PBS.

9) Bloquear ligações não específicas com Diluente MOM (Vector®)por 5 minutos à temperatura ambiente.

10) Incubar com HT7 (Pierce Endogen®; 1:1.000 em DiluenteMOM) por 60 minutos à temperatura ambiente em uma câma-ra de umidade.

11) Lavar as seções por 3x5 minutos em PBS.

12) Bloquear ligações não específicas com 10% de Soro Normal deBode Não Imune (Dako®) por 10 minutos à temperatura ambi-ente em uma câmara de umidade.

13) Lavar as seções por 2x5 minutos em PBS.

14) Incubar com Anti-camundongo de Bode Cy 3 (Jacson®; 1:500em Diluente MOM) por 60 minutos à temperatura ambienteem uma câmara de umidade.

15) Lavar as seções por 5 minutos em PBS.

16) Lavar as seções por 5 minutos em água "bidest".17) Cobrir as seções com Moviol e cobertas.

Produtos Químicos e Reagentes

1% de peróxido de hidrogênio em metanol:

60 ml de metanol + 2 ml de 30% de peróxido de hidrogênio + 0,6mL de Triton X-IOO (Amresco®).

Reagente de Bloqueio MOM:

2 gotas de Reagente de Bloqueio IgG de Camundongo MOM (do kitMOM (Vector®)) + 2,5 mL de PBS.

Diluente MOM:

10 ml de PBS + 800 μι de Concentrado de Proteína (do kit MOM(Vector®)).

Anticorpo HT7:

1:1.000 em Diluente MOM.

Anticorpo de Anti-Camundongo de Bode Cy 3:

1:500 em Diluente MOM

Avaliação

Comportamento

Na atividade horizontal e vertical de Campo Aberto (OF), o númerode bolos fecais, número e duração de em que se ficou apoiado nas patastraseiras, hiperatividade e tempo gasto no centro versus tempo gasto noperímetro do campo aberto foram medidos.

Na curiosidade "Nose poke" e teste de atividade o número e dura-ção em que se enfiou a cabeça foram calculados.

No teste de "Rota Rod" a latência para cair e a velocidade da rodanaquele tempo foram calculados.

Nas tentativas do teste do Labirinto Aquático de Morris o compri-mento do caminho do nado e latências de escape foram registrados. Avelocidade do nado foi calculada como o caminho do nado dividido pelalatência de escape. No teste de sondagem, uma tentativa com a plata-forma removida, o número de passagens sobre a posição da plataformainicial foi registrado para a folha de dados bem como o tempo gasto emcada quadrante do reservatório.

Neuropatologia

Para determinar a extensão da imunoreatividade da TAU no hipo-campo e amídala um software de análise de imagem especializado(Image Pro Plus, versão 4.5.1.29) foi usado. Os seguintes parâmetrosforam avaliados e calculados:

• região da área do hipocampo e amídala em cada fatia

• área absoluta de células positivas imunoreativas em regiõesespecíficas do cérebro do hipocampo e amídala

• número da área positiva imunoreativa em relação à área daregião do cérebro específica do hipocampo e amídala

Procedimento de Quantificação:

a) Contraste da imagem para melhor visualização da morfologiada fatia sem aplicar o contraste à imagem.

b) Desenho interativo do contorno do hipocampo e medidas daárea do hipocampo fregião da área).

c) Desenho interativo da área de interesse (AOI), na qual objetosmanchados são detectados sobre uma intensidade baseada nonível de início. Para determinar o valor de início um histogra-ma de linha foi interativamente desenhado próximo da AOI euma área sem imunoreação visível. O nível de intensidademédio de todos os pixels do histograma de linha mais uma

constante definiram o nível de início da intensidade. Objetosabaixo de um tamanho de 7 μπι2 foram excluídos.

d) Medida da área de cada objeto e a soma da área manchada noAOI.

e) Repetição de a-d) para a amídala.

f) Cálculo da área imunopositiva TAU relativa (= "soma da áreada imunoreatividade TAU/ área da região * 100").

g) Exportação de dados automática para uma planilha de dadosExcel, incluindo os parâmetros "título da imagem, área da re-gião, área de TAU total e área de TAU em percentagem". Umcampo para anotações foi usado para registrar a qualidade daimagem e critérios de exclusão, respectivamente. Os critériosde exclusão foram partes faltando da fatia, muitas dobras oufalhas dominantes.

h) Fechar a imagem sem salvar (para manter o dado bruto).

Estatísticas

Médias, desvios padrões ou SEMs foram calculados para todos osparâmetros medidos.

ResultadosObservações Gerais

Em geral pode ser afirmado que o tratamento com selenato de só-dio não leva a qualquer efeito colateral negativo ou causou qualquermorte prematura.

Resultados de ComportamentoCampo Aberto

Enquanto os parâmetros de atividade (atividade, hiperatividade,comportamento de ficar nas patas traseiras) não foram influenciadospelo tratamento com selenato de sódio, os camundongos tratados comselenato de sódio mostraram comportamento tigmotático perturbadodurante a primeira sessão do OF. Isto resultou numa permanênciasignificativa maior no centro da caixa do Campo Aberto, significandomenos tigmotaxia, entre os animais tratados com o veículo e selenato desódio na primeira vez (veja Figura 14 - "tigmotaxia", teste T para ani-mais tratados: ρ = 0,019). Ao final do tratamento na 2a vez o compor-tamento tigmotático normalizou-se a um nível dos controles comveículo.

Os animais da linha base apresentaram taxas de defecação maislatas no teste OF versus ambos os grupos investigados um mês e meiodepois (AOVA: ρ = 0,018, ρ < 0,05 para ambos os grupos tratados)indicando uma reação emocional maior ao procedimento do teste.

"Rota Rod"

O desempenho motor permaneceu inalterado com o tratamentocom selenato de sódio.

Curiosidade de "Nose Poke" e Teste de Atividade

O comportamento de curiosidade permaneceu inalterado com otratamento com selenato de sódio.

Teste do Labirinto Aquático de Morris

Os resultados do desempenho do teste do Labirinto Aquático deMorris (MWM) de dois grupos de tratamento diferentes mais a linhabase (tratamento de animais de 5 meses de idade) são mostrados naFigura 15 e Tabela 4 mostrando os resultados da análise estatística. Atarefa MWM revelou diferenças pronunciadas em alguns casos (vejaTabela 4) e mesmo significativas entre os animais tratados com selenatode sódio em comparação com o grupo veículo e mesmo em comparaçãoao grupo de linha base três meses mais jovem.

Tabela 4

Tabela de Resultados Para o Teste-U de Mann WhitneyPara os Resultados do Teste do Labirinto Aquático de Morris:

<table>table see original document page 77</column></row><table> Os resultados claramente mostram o potencial do selenato desódio para aumentar as funções cognitivas.

Resultados da Histologia do Cérebroe Imunohistoquímica

Resultados Gerais

Nas quantificações da AT180 e HT7 as áreas das regiões IHC dohipocampo e da amídala foram altamente constantes em todos oscérebros investigados, o que exclui efeitos negativos no tecido nasetapas de mancha imunohistoquímica (por exemplo, encolhimento,circunstâncias de corte diferentes) e é, além disso, um sinal de que nãohouve atrofia induzida pelo tratamento. Os dados de carga da TAUmedidos foram relacionados ao tamanho da região do indivíduo na fatiapara ser capaz de copiar com diferenças mínimas.

HT7 e AT180

A percentagem da área HT7-TAU relativa no hipocampo foi sig-nificativamente reduzida em animais tratados com selenato de sódio(1,2 mg) versus veículo (ANOVA: ρ < 0,05, teste T dos grupos tratados: ρ= 0,04) e grupos da linha base não tratados (ANOVA: ρ < 0,05; vejaFigura 16A). Este efeito foi mais pronunciado na amídala (veja Figura16B) na quais os camundongos tratados com selenato de sódio mostra-ram uma percentagem de redução significativa em relação à área HT7-TAU versus grupo de linha base não tratado (ANOVA: ρ < 0,01) e versusanimais tratados com veículo (ANOVA: ρ < 0,05; teste T para tratadosapenas: ρ = 0,0018).

Similar ao HT7-TAU também a percentagem da área relativaAT180-TAU no hipocampo foi reduzida em animais tratados comselenato de sódio (1,2 mg) versus veículo (teste T dos grupos tratados: ρ= 0,04, veja Figura 17A), todavia em um nível menor de significância.Novamente este efeito foi mais pronunciado na amídala (veja Figura17B) na qual os camundongos tratados com selenato de sódio mostra-ram significativa percentagem reduzida de área HT7-TAU relativa versuso grupo veículo (ANOVA: ρ < 0,05, teste T dos grupos tratados: ρ =0,0045) mas não versus grupo linha base não tratado.

Os neurônios positivos imunoreativos AT180 e HT7 no hipo-campo e amídala mostraram deposições massivas de TAU na somaneuronal, a qual estava densamente empacotada com PHF TAU. Otratamento com selenato de sódio visivelmente reduziu a carga de TAUbem como células positivas TAU na amídala e camada neuronal daregião CAl do hipocampo.

Resumo dos Efeitos e Conclusões

o Menos tigmotaxia um mês e meio depois do tratamentocomeçam as dicas de mudança no medo relacionadas àsestruturas amidaloidéicas nos camundongos transgênicostratados com selenato de sódio. Após tratamento prolon-gado com selenato de sódio os camundongos retornaramao comportamento tigmotático comparável e normal doscontroles tratados com veículo na segunda corrida do tes-te de Campo Aberto antes do sacrifício,o Todos os parâmetros motores com desempenho "RotaRod", atividade no Campo Aberto, hiperatividade e com-portamento de ficar nas patas traseiras não foram influ-enciados pelo tratamento com selenato de sódio.

O tratamento com selenato de sódio pôde aumentar ashabilidades cognitivas testadas no teste do Labirinto A-quático de Morris,

o Nos dias 1, 2 e 3 os animais tratados com selenato de só-dio puderam achar a plataforma mais rapidamente deforma altamente significativa (p < 0,01) do que animais doveículo e no dia 1 também mais rápido do que os animaistrês meses mais jovens do grupo de linha base.

o Efeitos pronunciados de um tratamento com selenato desódio podem ser visto quando avaliando a deposição TAUimunopositiva HT7 e carga TAU no hipocampo e amídalade camundongos TNHT Tg.

Devido ao tratamento uma redução significativa da áreaTAU positiva HT7 no hipocampo e amídala comparada aogrupo da linha base não tratado ou ao invés na amídalatambém para os controles tratados com veículo (H2O) po-dem ser vistos.

Os resultados da deposição HT7-TAU são suportados pelaincubação da AT180. Aqui uma redução significativa deTAU positiva AT180 após o tratamento com selenato desódio no hipocampo e amídala comparada aos controlestratados com veículo (H2O) pode ser vista.Referências

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Claims (18)

"Composição Farmacêutica, Métodos de Tratamento ou Prevençãode Doença Neurodegenerativa numa Pessoa,de Inibição ou Redução da Fosforilação de uma Proteína Taunum Neurônio, Célula Glial ou Corpo de Lewy,de Intensificação da Atividade de PP2Ae de Inibição da Atividade de GSK3 num Neurônio ou Célula Gliale Uso de Selenato ou Sal Farmaceuticamente Aceitável do Mesmo"Reivindicações

1. - Método de Tratamento ou Prevenção de Doença Neurodegenera-tiva numa Pessoa, caracterizado por que compreende administrar àpessoa uma quantidade efetiva de selenato ou sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo.

2. - Método de Tratamento ou Prevenção de Doença Neurodegenera-tiva numa Pessoa, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado porque a doença neurodegenerativa é uma tauopatia.

3. - Método de Tratamento ou Prevenção de Doença Neurodegenera-tiva numa Pessoa, de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado porque a tauopatia é selecionada a partir de demência pré-senil, demênciasenil, doença de Alzheimer, Parkinsonismo ligado ao cromossomo 17(FTDP-17), paralisia subnuclear progressiva, doença de Pick, afasiaprogressiva primária, demência frontotemporal e demência corticobasal.

4. - Método de Tratamento ou Prevenção de Doença Neurodegenera-tiva numa Pessoa, de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado porque a tauopatia é selecionada a partir de demência pré-senil, demênciasenil e doença de Alzheimer.

5. - Método de Tratamento ou Prevenção de Doença Neurodegenera-tiva numa Pessoa, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado porque compreende ainda a administração de outra terapia para tratamentoou prevenção de doenças neurodegenerativas ou uma terapia para aliviaros sintomas de doenças neurodegenerativas.

6. - Método de Inibição ou Redução da Fosforilação de uma ProteínaTau num Neurônio, Célula Glial ou Corpo de Lewy, caracterizado porque compreende expor o neurônio, a célula glial ou o corpo de Lewy auma quantidade efetiva de selenato ou sal farmaceuticamente aceitáveldo mesmo.

7. - Método de Inibição ou Redução da Fosforilação de uma ProteínaTau num Neurônio, Célula Glial ou Corpo de Lewy, de acordo com aReivindicação 6, caracterizado por que a proteína tau é proteína tauassociada a microtúbulo.

8. - Método de Inibição ou Redução da Fosforilação de uma ProteínaTau num Neurônio, Célula Glial ou Corpo de Lewy, de acordo com aReivindicação 6, caracterizado por que a proteína tau está num emara-nhado neurofibrillar.

9. - Método de Inibição ou Redução da Fosforilação de uma ProteínaTau num Neurônio, Célula Glial ou Corpo de Lewy, de acordo com aReivindicação 6, caracterizado por que é inibida ou prevenida a hiper-fosforilação da proteína tau.

10. - Método de Intensificação da Atividade de PP2A, caracterizadopor que compreende exporr a PP2A a uma quantidade efetiva de selenatoou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

11. - Método de Intensificação da Atividade de PP2A, de acordo com aReivindicação 10, caracterizado por que a PP2A é uma isoforma quedefosforila Akt.

12. - Método de Intensificar a Atividade de PP2A, de acordo com aReivindicação 10, caracterizado por que a PP2A é uma isoforma quedefosforila proteínas tau.

13. - Método de Intensificar a Atividade de PP2A, de acordo com aReivindicação 10, caracterizado por que a proteína tau é proteína tauassociada a microtúbulos encontrada em neurônios, células gliais oucorpos de Lewy.

14. - Método de Inibição da Atividade de GSK3 num Neurônio ouCélula Glial, caracterizado por que compreende expor o neurônio oucélula glial a uma quantidade efetiva de selenato ou sal farmaceutica-mente aceitável do mesmo.

15. - Uso de Selenato ou Sal Farmaceuticamente Aceitável do Mes-mo, caracterizado por que é no fabrico de um medicamento para trata-mento ou prevenção de doença neurodegenerativa.

16. - Composição Farmacêutica, caracterizada por que compreendeum selenato ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e outroagente para tratamento ou prevenção de doença neurodegenerativa.

17. - Composição Farmacêutica, de acordo com a Reivindicação 16,caracterizada por que o outro agente é selecionado a partir de um oumais de um inibidor de colinesterase, um antagonista de receptor de N-metil-D-aspartato, um agente estrogênico, uma droga antiinflamatórianão esteróide, levodopa, um inibidor de dopa decarboxilase, um agonistade dopamina, um inibidor de oxidase B de monoamina, um anticolinér-gico e um inibidor de COMT.

18. - Composição Farmacêutica, de acordo com a Reivindicação 16,caracterizada por que o outro agente é selecionado a partir de tacrina,donepezil, galantamina, rivastigmina, memantina, premarina, aspirina,ibuprofeno, levodopa, carbidopa, benserazida, bromocriptina, pergolida,pramipexola, ropinirola, cabergolina, apomorfina, lisurida, selegilina,rasasilina, mesilato de benzotropina, cloreto de trihexilfenidil, entacapo-na, tolacapona e amantadina.