BRPI0709147A2

BRPI0709147A2 - composições de dsrna e métodos para tratamento de infecção por hpv

Info

Publication number: BRPI0709147A2
Application number: BRPI0709147-8A
Authority: BR
Inventors: John Benson; Birgit Bramlage; Kevin Fitzgerald; Pamela Tan; Hans-Peter Vornlocher
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2006-03-24
Filing date: 2007-03-23
Publication date: 2011-06-28
Also published as: US20110230546A1; EP1999260A2; CA2644621A1; MX2008012173A; WO2007111998A3; JP2009531433A; WO2007111998A2; RU2008141977A; AU2007230995B2; AU2007230995A1; US7956177B2; US20090247607A1; KR20080106554A

Abstract

COMPOSIçõES DE DSRNA E MéTODOS PARA TRATAMENTO DE INFECçãO POR HPV. A presente invenção refere-se ao filamento do ácido nuclélco duplo (dsRNA) para tratar infecção em decorrência do vírus papiloma humano (HPV). O dsRNA compreende um filamento de sentido negativo possuindo uma seqúência de nucleotídeo que é inferior a 30 nucleotídeos de comprimento, geralmente 19-25 nucleotídeos de comprimento, e que é substancialmente complementar a pelo menos uma parte de um gene Alvo de HPV selecionado entre HPV E1, HPV E6 e o gene E6AP humano. A invenção também refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo o dsR-NA em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável; métodos para tratar doenças causadas por infecção decorrente do HPV e uma expressão gênica E6AP empregando a composição farmacêutica; e métodos para inibir a expressão dos genes Alvo de HPV em uma célula.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÕES DE DSRNA E MÉTODOS PARA TRATAMENTO DE INFECÇÃOPOR HPV".

Campo da invenção

A presente invenção refere-se ao filamento do ácido nucléicoduplo (dsRNA) e ao seu emprego mediando a interferência do RNA no tra-tamento de processos patológicos mediados na infecção por papilomavírushumano (HPV), tais como, câncer cervical, câncer anal, lesões pré-cancerígenas associadas e verrugas genitais.

Antecedentes da Invenção

Papilomavírus (PV) são vírus de DNA não-encapsulados queinduzem lesões hiperproliferativas dos epitélios. Os papilomavírus são difun-didos na natureza e foram reconhecidos em vertebrados superiores. Os ví-rus foram caracterizados, entre outros, dos seres humanos, gado, coelhos,cavalos e cães. O primeiro papilomavírus foi descrito em 1933 como papilo-mavírus de cauda de algodão de coelho (CRPV). Desde então, o coelho ra-bo de algodão, bem como o papilomavírus bovino do tipo I (BPV-1) vêm ser-vindo como protótipos experimentais para estudos nos papilomavírus. Amaior parte dos papilomavírus de animais está associada às lesões pura-mente epiteliais proliferativas e a maior parte das lesões em animais sãocutâneas. No ser humano, mais de 100 tipos de papilomavírus (HPV) foram-identificados e eles foram catalogados por sítio de infecção: epitélio cutâneoe epitélio mucosal (mucosa oral e genital). As doenças correlatas cutâneasincluem verrugas planas, verrugas planas, etc. As doenças relacionadas àmucosa incluem papilomas Iaringianos e doenças ano genitais compreen-dendo carcinomas cervicais (Fields, 1996, Virology, 35 edição, Lippincott-Raven Pub., Filadélfia, N.Y.; Bernard, H-U., 2005. J. Clin. Virol. 328: S1-S6).

O Papilomavírus humano (HPV) é uma das infecções sexual-mente transmitidas mais comuns no mundo. A maior parte das infecçõesdecorrentes do HPV são prejudiciais. Alguns tipos de HPV causam verrugasgenitais, que aparecem como saliências simples e múltiplos nas áreas geni-tais dos homens e mulheres incluindo a vagina, colo do útero, vulva (áreaexterna da vagina), pênis e reto. Muitas pessoas infectadas com HPV nãoapresentam sintomas.

Embora a maior parte dos subtipos resulte em lesões benignas,determinados subtipos são considerados de alto risco e podem levar à Ie-sões mais sérias, tais como, displasia cervical e anal. Quinze tipos de HPVforam recentemente classificados como tipos de alto risco (Menos, N. e ou-tros 2003. N. Inal. J. Med. 348(6):518-27). Esses subtipos de alto risco sãogeneticamente diversos demonstrando mais de 10% de divergência de se-qüência no gene L1, uma proteína de capsídeo de vírus principal. (Bernard,H-U., 2005. J. Clin. Virol. 328: S1-S6).

As mulheres com infecção decorrente do HPV são freqüente-mente assintomáticas e podem apenas descrever sua lesão após classifica-ção cervical. A classificação cervical é amplamente realizada empregando oteste Pap. Um teste Pap é uma avaliação histológica do tecido cervical que éusado para identificar células cervicais anormais. Como parte de um testePap, a presença de infecção decorrente do HPV e subtipo específico podeser determinada com o emprego de ensaios à base de ácido nucléico, taiscomo, PCR ou a técnica comercial (Digene, Gaithersburg, Maryland, U.S.A).

As células cervicais anormais, quando identificadas, são classifi-cadas como LSIL (lesões intra-epiteliais escamosas de baixa classificação)possuindo baixo risco de progressão para o câncer (incluindo as células de-signadas CIN-1 ("neoplasia-1 intra-epitelial cervical")); ou HSIL (lesões intra-epiteliais escamosas de baixa classificação), incluindo células designadascomo CIN-2 e CIN-3 possuindo uma probabilidade maior de progredir para ocâncer.

Cerca de 85% das lesões de classificação baixa regridem es-pontaneamente e o restante tanto permanece inalterada quanto progridepara lesões de classificação alta. Espera-se que cerca de 10% das lesõesde classificação alta, se deixadas sem tratamento se transformem em teci-dos cancerígenos. O HPV-16 e HPV-18 são mais freqüentemente associa-dos às displasias, embora vários outros subtipos de HPV estejam tambémassociados às displasias.Estudos indicam que, até 89% dos homens homossexuais HIVpositivos podem ser infectados com esses subtipos de HPV de alto risco. Ospacientes HIV positivos são também mais prováveis de ser infectados comsubtipos múltiplos de HPV ao mesmo tempo, o que está associado a um ris-co mais alto de progressão da displasia.

Evidência nas últimas duas décadas levou a uma ampla aceita-ção de que a infecção decorrente do HPV é necessária, embora não sufici-ente, para o desenvolvimento do câncer cervical. A presença de HPV nocâncer cervical é estimada em 99,7%. Acredita-se que o câncer anal tenhauma associação similar entre infecção decorrente do HPV e o desenvolvi-mento da displasia anal e câncer anal como é o caso com o câncer cervical.

Em um estudo dos pacientes HIV negativos com câncer anal, a infecção de-corrente do HPV foi encontrada em 88% dos cânceres anais. Nos EstadosUnidos da América, no ano de 2003, 12.200 novos casos de câncer cervicale 4.100 mortes por câncer cervical foram previstos, juntamente com 4.000novos casos de câncer anal e 500 mortes por câncer anal. Embora a inci-dência de câncer cervical tenha diminuído nas últimas quatro décadas devi-do à classificação preventiva difundida, a incidência de câncer anal vem au-mentando. O aumento na incidência de câncer anal pode ser atribuído, emparte, à infecção por HIV, uma vez que os pacientes HIV positivos possuemuma incidência maior de câncer anal que a população em geral. Embora» ocâncer anal tenha uma incidência de 0,9 casos por 100.000 na populaçãoem geral, o câncer anal possui uma incidência de 35 casos por 100.000 napopulação masculina homossexual e 70-100 casos por 100.000 na popula-ção de homens homossexuais portadores de HIV. De fato, devido à alta pre-valência de displasia anal entre os pacientes infectados com HIV e uma ten-dência ao crescimento de cânceres anais, a 2003 USPHA/IDSA Guidelinesfor the Treatment of Opportunistic Infections in HIV Positive Patients incluirádiretrizes de tratamento para pacientes diagnosticados com displasia anal.

Não existe cura conhecida para infecção decorrente do HPV. E-xistem tratamentos para verrugas genitais, embora elas freqüentemente de-sapareçam mesmo sem tratamento. O método de tratamento depende defatores, tais como, tamanho e localização das verrugas genitais. Entre ostratamentos empregados estão creme Imiquimod, solução antimicótica depodofilina a 20%, solução de podofilox a 0,5%, creme 5-fluoruracila a 5% eácido tricloroacético. O emprego de podofilina ou podofilox não é recomen-dado para mulheres grávidas uma vez que o mesmo é absorvido pela pele epode causar defeitos neonatais. O uso do creme 5-fluoruracila também nãoé recomendado para mulheres grávidas. Pequenas verrugas genitais podemser fisicamente removidas por congelamento (criocirurgia), queima (eletro-cauterização) ou tratamento a laser. Verrugas maiores que não responderama outro tratamento podem precisar de remoção por cirurgia. Sabe-se que asverrugas genitais retornam após remoção física; nesses casos, a-interferoné injetado diretamente nessas verrugas. Contudo α-interferon é oneroso e oseu emprego não reduz a taxa de retorno das verrugas genitais.

Como tal, existe uma necessidade não satisfeita de tratamentoeficaz contra HPV. Surpreendentemente, foram descobertos compostos quesatisfazem essa necessidade e fornecem também outros benefícios.

Recentemente, as moléculas de RNA de filamento duplo (dsR-NA) demonstraram bloquear a expressão gênica em um mecanismo regula-dor altamente conservado conhecido como interferência de RNA (RNAi). OWO 99/32619 (Fire e outros) descreve o emprego de um dsRNA de pelomenos 25 nucleotídeos de comprimento para inibir a expressão gênica emC. elegans. dsRNA também mostrou degradar o RNA alvo em outros orga-nismos, incluindo plantas (vide, por exemplo, WO 99/53050, Waterhouse eoutros; e WO 99/61631, Heifetz e outros), Drosophila (vide, por exemplo,Yang, D., e outros, Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200) e mamíferos (vide WO00/44895, Limmer; e DE 101 00 586.5, Kreutzer e outros). Esse mecanismonatural agora se tornou o foco do desenvolvimento de uma nova classe deagentes farmacêuticos para tratamento de transtornos que são causados porregulação aberrante ou indesejada de um gene.

A publicação PCT WO 03/008573 descreve um esforço anteriorpara desenvolver um medicamento à base de ácido nucléico para o trata-mento de doenças causadas com infecção decorrente do HPV. Essa publi-cação reporta o emprego de dois sisRNA direcionados ao mRNA do HPVpara inibir a replicação do HPV em um sistema com base em célula; umapublicação relacionada é encontrada em Jiang1 M. e outros 2005. N. A. R.33(18): e151.

A despeito nos avanços significantes no campo do RNAi e avan-ços no tratamento de processos patológicos mediados por infecção decor-rente do HPV, permanece uma necessidade de agentes que possam inibir aprogressão da infecção decorrente do HPV e que podem tratar doenças as-sociadas à infecção decorrente do HPV. O desafio é exacerbado uma vezque tais agentes podem ser projetados para inibir todos os subtipos de HPVde alto risco, que em conjunto descrevem um amplo grau de diversidadegenotípica.

Sumário da invenção

A invenção provê uma solução para o problema de tratar doen-ças associadas à infecção decorrente do HPV, por emprego de filamento doácido nucléico duplo (dsRNA) para silenciar a expressão gênica essencialpara propagação de HPV. E6AP é um gene conservado da espécie de hos-pedeiro humano necessária para HPV de modo a efetuar a proliferação.

A invenção provê filamento do ácido nucléico duplo (dsRNA),bem como composições e métodos para inibir a expressão gênica E6AP emuma célula ou mamífero empregando tais dsRNA. A invenção também provêcomposições e métodos para tratar condições patológicas e doenças causa-das pela expressão gênica E6AP em conexão com a infecção decorrente doHPV, tal como no câncer cervical e verrugas genitais. O dsRNA da invençãocompreende um filamento de RNA (o filamento de sentido negativo) possu-indo uma região que possui menos de 30 nucleotídeos de comprimento, ge-ralmente 19-24 nucleotídeos de comprimento, e é substancialmente com-plementar a pelo menos parte de uma transcrição de mRNA do gene E6AP.

Em uma concretização, a invenção provê moléculas filamento doácido nucléico duplo (dsRNA) para inibir a expressão gênica E6AP. O dsR-NA compreende pelo menos duas seqüências que são complementares umaa outra. O dsRNA compreende um filamento de sentido compreendendouma primeira seqüência e um filamento de sentido negativo compreendendouma segunda seqüência. O filamento de sentido negativo compreende umaseqüência de nucleotídeo que é substancialmente complementar a pelo me-nos parte de um mRNA codificando E6AP, e a região de complementaridadepossui menos de 30 nucleotídeos de comprimento, geralmente 19-24 nu-cleotídeos de comprimento. O dsRNA, quando do contato com uma célulaexpressando o E6AP, inibe a expressão gênica E6AP em pelo menos 40%.

Por exemplo, as moléculas de dsRNA da invenção podem sercompreendidas de uma primeira seqüência de dsRNA que é selecionada dogrupo consistindo nas seqüências de sentido da Tabela 1 e a segunda se-qüência é selecionada do grupo consistindo nas seqüências de sentido ne-gativo da Tabela 1. As moléculas de dsRNA da invenção podem ser com-preendidas de nucleotídeos ocorrendo naturalmente ou podem ser compre-endidas de pelo menos um nucleotídeo modificado, tal como o nucleotídeomodificado 2'-0-metila, um nucleotídeo compreendendo um grupo 5'-fosforotioato e um nucleotídeo terminal ligado a um derivado de colesterila.Alternativamente, o nucleotídeo modificado pode ser escolhido do grupo de:um nucleotídeo modificado com 2'-desóxi-2'-flúor, um nucleotídeo modificadocom 2'-desóxi-, um nucleotídeo travado, um nucleotídeo abásico, nucleotí-deo modificado 2'-amino, nucleotídeo modificado 2'-alquila, nucleotídeo mor-folino, um fosforamidato e um nucleotídeo compreendendo uma base não-natural. De modo geral, tal seqüência modificada será baseada em uma pri-meira seqüência de dsRNA selecionada do grupo consistindo nas seqüên-cias de sentido da Tabela 1 e uma segunda seqüência selecionada do grupoconsistindo nas seqüências de sentido negativo da Tabela 1.

Em outra concretização, a invenção provê uma célula compre-endendo um dos dsRNA da invenção. A célula é geralmente uma célula demamífero, tal como uma célula humana.

Em outra concretização, a invenção provê uma composição far-macêutica para inibir a expressão gênica E6AP em um organismo, geral-mente um indivíduo humano, compreendendo um ou mais dos dsRNA dainvenção e um veículo farmaceuticamente aceitável ou veículo de distribui-ção.

Em outra concretização, a invenção provê um método para inibira expressão gênica E6AP em uma célula, compreendendo as seguintes etapas:

(a) introdução à célula de um filamento do ácido nucléico du-plo (dsRNA), onde o dsRNA compreende pelo menos duasseqüências que são complementares uma a outra. O dsR-NA compreende um filamento de sentido compreendendouma primeira seqüência e um filamento de sentido negativocompreendendo uma segunda seqüência. O filamento desentido negativo compreende uma região de complementa-riedade que é substancialmente complementar a pelo me-nos uma parte de um mRNA codificando E6AP, e onde aregião de complementariedade possui menos de 30 nucle-otídeos de comprimento, geralmente 19-24 nucleotídeos decomprimento, e onde o dsRNA, mediante contato com umacélula expressando o E6AP, inibe a expressão gênicaE6AP em pelo menos 40%; e

(b) manutenção da célula produzida na etapa (a) por um tem-po suficiente para obter degradação da transcrição demRNA do gene E6AP, pelo que inibindo a expressão gêni-ca E6AP na célula.

Em outra concretização, a invenção provê métodos para tratar,prevenir ou gerenciar processos patológicos mediados por infecção decor-rente do HPV, por exemplo, câncer ou verrugas genitais, compreendendoadministração a um paciente que precise de tal tratamento de prevenção ougerenciamento de uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz deum ou mais dos dsRNA da invenção.

Em outra concretização, a invenção provê vetores para inibir aexpressão gênica E6AP em uma célula, compreendendo uma seqüênciareguladora ligada operavelmente a uma seqüência de nucleotídeo que codi-fica pelo menos um filamento de um dos dsRNA da invenção.Em outra concretização, a invenção provê uma célula compre-endendo um vetor para inibir a expressão gênica E6AP em uma célula. Ovetor compreende uma seqüência reguladora ligada operavelmente a umaseqüência de nucleotídeo que codifica pelo menos um filamento de um dosdsRNA da invenção.

Breve Descrição das Figuras

Nenhuma figura foi apresentada.Descrição Detalhada da invenção

A invenção provê uma solução para o problema de tratamentodas doenças associadas à infecção decorrente do HPV1 por emprego do fi-lamento do ácido nucléico duplo (dsRNA) para silenciar a expressão gênicaessencial à proliferação do HPV. Especificamente, o dsRNA da invençãosilencia os genes HPV E1 ou E6 ou E6AP humano, um gene conservadodas espécies hospedeiras humanas necessário à proliferação do HPV. Aqui,esses genes são algumas vezes referidos coletivamente como genes Alvode HPV.

A invenção provê filamento do ácido nucléico duplo (dsRNA),bem como composições e métodos para inibir a expressão gênica de Ε1, E6ou E6AP gene em uma célula ou mamífero empregando o dsRNA. A inven-ção também provê composições e métodos para tratar condições patológi-cas e doenças em um mamífero causadas pela expressão do gene E1, E6ou E6AP em associação com a infecção decorrente do HPV empregandodsRNA. dsRNA direciona a degradação específica da seqüência de mRNAatravés de um processo conhecido como interferência de RNA (RNAi).

O dsRNA da invenção compreende um filamento de RNA (o fi-lamento de sentido negativo) possuindo uma região que possui menos de 30nucleotídeos de comprimento, geralmente 19-24 nucleotídeos de compri-mento e é substancialmente complementar a pelo menos parte do transcri-ção de mRNA Alvo de HPV. O emprego desses dsRNA permite a degrada-ção alvejada dos mRNAs dos genes que estão implicados na replicação e/oumanutenção de um HPV nos mamíferos. Com o emprego dos ensaios combase em células e com base nos animais, os presentes inventores demons-traram que dosagens muito baixas desses dsRNA podem mediar específicae eficazmente o RNAi1 resultando em inibição significativa da expressão gê-nica E1, E6 ou E6AP gene. Assim, os métodos e composições da invençãocompreendendo esses dsRNA são úteis para tratar processos patológicosmediados por infecção decorrente do HPV pelo alvejamento a gene fatorialde hospedeiro envolvido no ciclo de vida do HPV.

Descrição dos Alvos de HPV: HPV E1 e E6 e E6AP humano

A ubiquitina Iigase celular E6AP do hospedeiro humano está im-plicada na replicação de HPV, especificamente as formas integradas (não-epissômicas) de HPV, através de seu complexo com a proteína E6 do vírus.

E6 se liga a muitas proteínas que regulam as vias de prolifera-ção celular e freqüentemente provoca a degradação das mesmas (Chakra-barti, O. and Krishna, S. 2003. J. Biosci. 28:337-348). O E6 complexa comE6AP para alvejar o supressor de tumor p53 para degradação (Scheffner, M.e outros, 1990. Cell. 63:1129-1136; e Scheffner, M. e outros, 1993. Cell75:495-505). Quando da inativação de p53, o vírus não apenas impede aapoptose mediada por p53 das células infectadas (Chakrabarti and Krishna,2003) e facilita a replicação de seu DNA que de outra forma seria bloqueadapor p53 (Lepik, D. e outros 1998. J. Virol. 72:6822-6831), porém tambémfavorece a oncogênese por aumento do controle mediado por p53 sobre aintegridade genômica (Thomas, M. e outros 1999. Oncogene. 18:7690-7700).

E1 e E6 são ambos descritos em detalhes consideráveis em"Papillomaviridae: The Viruses and Their Replication" por Peter M. Howley,pp. 947-978, em: Fundamental Virology, 3- edição. Bernard N. Fields, DavidM. Knipe, and Peter M. Howley, eds. Lippincott-Raven Publishers, Philadel-phia, 1996. A E1 ORF codifica uma proteína 68-76 kD essencial à replicaçãode DNA do plasmídeo. O produto E1 de comprimento pleno é uma proteínanuclear fosforilada que se liga à origem de replicação na LCR de BPV1. E1também mostrou se ligar a ATP e in vitro à proteína E2 de comprimento ple-no denominada a transativadora de transcrição de E2 (E2TA), pelo que, me-lhorando a transcrição virótica. A ligação à E2 também reforça a afinidade deE1 quanto a origem da replicação do DNA. No HPV-16, E1 possui efeitosindiretos na imortalização.

E6 é uma proteína de transformação celular básica, pequena(por exemplo, o HPV16 E6 compreende 151 aminoácidos), cerca de 16-19kD, que está localizada na matriz nuclear e fração de membrana não nucle-ar. O produto gênico de E6 contém quatro motivos Cys-X-X-Cys1 indicandoum potencial para ligação de zinco; podendo também atuar como uma prote-ína de ligação de ácido nucléico. Nos HPVs de alto risco, tais como, HPV-16,as proteínas E6 e E7 são necessárias e suficientes para imortalizar suascélulas epiteliais escamosas dos hospedeiros. Os produtos gênicos de E6 deHPVs de alto risco mostraram complexar com p53 e promover sua degrada-ção.

A descrição detalhada que se segue descreve como obter e usaro dsRNA e composições contendo dsRNA para inibir a expressão dos genesAlvo de HPV, bem como composições e métodos para tratar doenças etranstornos causados por infecção decorrente do HPV, por exemplo câncercervical e verrugas genitais. As composições farmacêuticas da invençãocompreendem um dsRNA possuindo um filamento de sentido negativo com-preendendo uma região de complementariedade que possui menos de 30nucleotídeos de comprimento, geralmente 19-24 nucleotídeos de compri-mento, e é substancialmente complementar a pelo menos parte de umatranscrição de RNA de um gene Alvo de HPV, em conjunto com um veículofarmaceuticamente aceitável. Uma concretização da invenção é o empregode mais de um dsRNA, opcionalmente alvejando genes Alvo de HPV diferen-tes, em combinação em uma formulação farmacêutica.

Conseqüentemente, determinados aspectos da invenção forne-cem composições farmacêuticas compreendendo o dsRNA da invenção, emconjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável, métodos de empregodas composições para inibir expressão de um ou mais genes Alvo de HPV, emétodos de emprego das composições farmacêuticas para tratar doençascausadas por infecção decorrente do HPV.I. DefiniçõesPara conveniência, forneceremos a seguir o significado de de-terminados termos e frases utilizados no relatório descritivo, exemplos e rei-vindicações apensas. Se existir uma discrepância clara entre o emprego deum termo em outras partes desse relatório descritivo e sua definição tiversido fornecida nessa sessão, a definição nessa sessão prevalecerá.

"G," "C," "A" e "U" representam, cada um, um nucleotídeo quecontém guanina, citosina, adenina e uracila como uma base, respectivamen-te. Contudo, será entendido que o termo "ribonucleotídeo" ou "nucleotídeo"pode também se referir a um nucleotídeo modificado, conforme abaixo ouuma fração de substituição. O versado na técnica tem conhecimento de quea guanina, citosina, adenina e uracila podem ser substituídas por outras fra-ções sem alterar substancialmente as propriedades de emparelhamento debase de um oligonucleotídeo compreendendo um nucleotídeo portando talfração de substituição. Por exemplo, sem limitação, um nucleotídeo compre-endendo inosina como sua base pode ser um par de base com nucleotídeoscontendo adenina, citosina ou uracila. Conseqüentemente, nucleotídeos con-tendo uracila, guanina, ou adenina podem ser substituídos nas seqüênciasde nucleotídeo da invenção por um nucleotídeo contendo, por exemplo, ino-sina. As seqüências compreendendo tais frações de substituição são concre-tizações da invenção.

- Conforme empregado aqui, "E6AP" refere-se à proteína ubiquiti-na Iigase E3A (ube3A, também referida como proteína associada a E6 ouE6AP) gene ou proteína. Seqüências mRNA humanas para E6AP represen-tando isoformas diferentes são providas como números de Acesso ao Gen-Bank NM-130838.1, NM_130839.1 e NM_000462.2.

Conforme empregado aqui, "E1" refere-se ao gene E1 do tipo 16do papilomavírus humano (HPV16) (número de acesso ao GenBankNC_001526, nucleotídeos 865 a 2813). Conforme empregado aqui, "E6" re-fere-se ao gene E6 do tipo 16 do papilomavírus humano (HPV16) (númerode acesso ao GenBank NC_001526, nucleotídeos 65 a 559). Muitas varian-tes dos genes E1 e E6 foram também reveladas publicamente. Essas e futu-ras variantes dos genes E1 e E6 publicadas são englobadas aqui pelo em-prego de "E1" e Έ6", a menos que especificamente excluído pelo contexto.

Conforme empregado aqui, "seqüência alvo" refere-se à porçãocontígua da seqüência de nucleotídeo de uma molécula de mRNA formadadurante a transcrição de um dos genes Alvo de HPV, incluindo mRNA que éo produto do processamento de RNA de um produto primário da transcrição.

Conforme empregado aqui, o termo "filamento compreendendouma seqüência" refere-se a um oligonucleotídeo compreendendo uma ca-deia de nucleotídeos que é descrita pela seqüência referida empregando anomenclatura de nucleotídeo padrão.

Conforme empregado aqui e a menos que de outra forma indi-cado, o termo "complementar", quando usado para descrever uma primeiraseqüência de nucleotídeo em relação a uma segunda seqüência de nucleo-tídeo, refere-se à capacidade de um oligonucleotídeo ou do polinucleotídeocompreendendo a primeira seqüência de nucleotídeo de hibridizar e formaruma estrutura de duplexo sob determinadas condições com um oligonucleo-tídeo ou polinucleotídeo compreendendo a segunda seqüência de nucleotí-deo, conforme será entendido por um versado na técnica. Tais condiçõespodem ser, por exemplo, condições estringentes, onde as condições estrin-gentes podem incluir: 400 mM NaCI, 40 mM PIPES, pH 6,4, 1 mM EDTA,50°C ou 70°C por 12-16 horas seguindo a lavagem. Outras condições, taiscomo, condições fisiologicamente relevantes como podem ser encontradasdentro de um organismo se aplicam. O versado na técnica será capaz dedeterminar o conjunto de condições mais apropriado para um teste de com-plementariedade de duas seqüências, de acordo com a aplicação final dosnucleotídeos hibridizados.

Isso inclui emparelhamento da base do oligonucleotídeo ou poli-nucleotídeo compreendendo a primeira seqüência de nucleotídeo em rela-ção ao oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo a segunda se-qüência de nucleotídeo por todo o comprimento da primeira e segunda se-qüências de nucleotídeo. Tais seqüências podem ser referidas como "inte-gralmente complementares" uma com relação à outra. Contudo, onde umaprimeira seqüência é referida como "substancialmente complementar" comrelação a uma segunda seqüência aqui, as duas seqüências podem ser in-tegralmente complementares ou elas podem formar um ou mais, porém ge-ralmente não mais de 4, 3 ou 2 pares de base incorretos quando da hibridi-zação, embora mantendo a capacidade de hibridizar sob as condições maisrelevantes à sua aplicação final. Contudo, onde dois oligonucleotídeos seformarem, quando da hibridização, um ou mais ressaltos filamentados sim-ples, tais ressaltos não devem ser considerados como incorretos com rela-ção à determinação de complementariedade. Por exemplo, um dsRNA com-preendendo um oligonucleotídeo com 21 nucleotídeos de comprimento eoutro oligonucleotídeo com 23 nucleotídeos de comprimento, onde o oligo-nucleotídeo mais longo compreende uma seqüência de 21 nucleotídeos queé integralmente complementar em relação ao oligonucleotídeo mais curto,podendo ainda ser referido como "integralmente complementar" para fins dainvenção.

Seqüências "complementares", conforme empregado aqui, tam-bém podem incluir ou ser formadas totalmente de pares de base não-Watson-Crick e/ou pares de base formados de nucleotídeos modificados enão-naturais, à medida que, os requisitos acima, com relação à sua capaci-dade de hibridizar, sejam preenchidos.

Os termos "complementar", "completamente complementar" e"substancialmente complementar" aqui podem ser empregados com relaçãoà combinação de base entre o filamento de sentido e o filamento de sentidonegativo de um dsRNA, ou entre o filamento de sentido negativo de um ds-RNA e a seqüência alvo, conforme será entendido, a partir do contexto deseu emprego.

Conforme empregado aqui, um polinucleotídeo que é "substan-cialmente complementar a pelo menos parte de um" RNA mensageiro(mRNA) refere-se a um polinucleotídeo que é substancialmente complemen-tar a uma porção contígua do mRNA de interesse (por exemplo, codificandoE6AP). Por exemplo, um polinucleotídeo é complementar a pelo menos umaparte de um mRNA de E6AP se a seqüência for substancialmente comple-mentar à porção não interrompida de um mRNA codificando E6AP.O termo "filamento do RNA duplo" ou "DsRNA", conforme em-pregado aqui, refere-se a um complexo de moléculas de ácido ribonucléico,possuindo uma estrutura de duplexo compreendendo dois filamentos de áci-do nucléico antiparalelos e substancialmente complementares, conformedefinido acima. Os dois filamentos formando a estrutura de duplexo podemser porções diferentes de uma molécula de RNA maior ou eles podem sermoléculas de RNA separadas. Os dois filamentos formando a estrutura deduplexo podem ser porções diferentes de uma molécula de RNA maior, oueles podem ser moléculas de RNA separadas. Quando separadas, as molé-cuias de RNA, tais como, dsRNA, são freqüentemente referidas na literaturacomo sirRNA ("RNA de interferência curta"). Quando os dois filamentos sãoparte de uma molécula maior e portanto, são conectados por uma cadeiaininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3' de um filamento e a ex-tremidade 5' do respectivo outro filamento formando a estrutura duplexa, acadeia de RNA de conexão é referida como uma "alça de grampo", "RNA dealça de grampo curto" ou "shRNA". Quando os dois filamentos são conecta-dos covalentemente por meio de outro que não uma cadeia não interrompidade nucleotídeos entre a extremidade 3' de um filamento e a extremidade 5'do outro respectivo filamento que faz parte da estrutura do duplexo, a estru-tura de conexão é referida como um "ligante". Os filamentos de RNA podemter um mesmo ou um número diferente de nucleotídeos. O número máximode pares de base é o número de nucleotídeos no filamento mais curto dodsRNA menos quaisquer ressaltos que estejam presentes no duplexo. Alémda estrutura em duplexo, um dsRNA pode compreender um ou mais ressal-tos de nucleotídeo. Além disso, conforme usado nesse relatório descritivo,"DsRNA" podem incluir modificações químicas aos ribonucleotídeos, liga-ções de internucleotídeo, grupos finais, tampas e frações conjugadas, inclu-indo modificações substanciais em nucleotídeos múltiplos e incluindo todostipos de modificações reveladas aqui ou conhecidas na técnica. Quaisquertais modificações, conforme usadas em uma molécula do tipo sirRNA, sãoenglobadas por "DsRNA" para as finalidades desse relatório descritivo e rei-vindicações.Conforme empregado aqui, um "ressalto de nucleotídeo" refere-se ao nucleotídeo não emparelhado ou nucleotídeos que se salientam daestrutura do duplexo de um dsRNA quando uma extremidade 3' de um fila-mento do dsRNA se estende além da extremidade 5' do outro filamento, ouvice-versa. "Cego" ou "extremidade cega" significa que não existem nucleo-tídeos não emparelhados naquela extremidade do dsRNA, isto é, no ressaltode nucleotídeo. Um dsRNA de "extremidade cega" é duplo filamentado emtodo seu comprimento, isto é, no ressalto do nucleotídeo em cada extremi-dade da molécula. Para clareza, as tampas químicas ou frações químicasnão nucleotídeo conjugadas à extremidade 3' ou extremidade 5' do sirRNAnão são consideradas na determinação se um sirRNA possui um ressalto oué de extremidade cega.

O termo "filamento de sentido negativo" refere-se ao filamentode um dsRNA que inclui uma região que é substancialmente complementara uma seqüência alvo. Conforme empregado aqui, o termo "região de com-plementariedade" refere-se à região no filamento de sentido negativo que ésubstancialmente complementar a uma seqüência, por exemplo a seqüênciaalvo, conforme definido aqui. Quando a região de complementariedade nãofor integralmente complementar à seqüência alvo, as incorreções são maistoleradas nas regiões terminais ou regiões, por exemplo, dentro de 6, 5, 4, 3,ou 2 nucleotídeos do término 5' e/ou 3'.

O termo "filamento de sentido", conforme empregado aqui, refe-re-se ao filamento de um dsRNA que inclui uma região que é substancial-mente complementar a uma região do filamento de sentido negativo.

"Introdução em uma célula", quando se referindo a um dsRNA,significa a facilitação da absorção na célula, como é entendido pelos versa-dos na técnica. A absorção de dsRNA pode ocorrer através de processosnão auxiliados ou celulares ativos ou por agentes auxiliares ou dispositivos.O significado desse termo não está limitado às células in vitro; um dsRNAtambém pode ser "introduzido na célula", quando a célula fizer parte de umorganismo vivo. Em tal exemplo, a introdução na célula incluirá a distribuiçãoa um organismo vivo. Por exemplo, para distribuição in vivo, dsRNA podemser injetados em um sítio de tecido ou ser administrados sistemicamente. Aintrodução in vitro em uma célula inclui métodos conhecidos na técnica, taiscomo, eletroporação e lipofecção.

Os termos "silenciar" e "inibir a expressão de" à medida que re-fere-sem à supressão pelo menos parcial de uma expressão gênica Alvo deHPV, conforme manifestada por uma redução na quantidade de mRNAtranscrito do gene Alvo de HPV que pode ser isolada de uma primeira célulaou grupo de células no qual o gene Alvo de HPV é transcrito sendo ou tendosido tratado, tal que, a expressão gênica Alvo HPV é inibida, quando compa-rada à segunda célula ou grupo de células substancialmente idênticas à pri-meira célula ou grupo de células, porém que foi ou não foi assim tratada (cé-lulas de controle). O grau de inibição é geralmente expresso em termos de

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Alternativamente, o grau de inibição pode ser fornecido em ter-mos de redução de um parâmetro que é funcionalmente ligado à transcriçãodo gene Alvo de HPV, por exemplo, a quantidade de proteína codificada pelogene Alvo de HPV que é secretada por ma célula ou o número de célulamostrando um determinado fenótipo, por exemplo, apoptose. Em princípio, osilenciamento do gene alvo de HPV pode ser determinado em qualquer célu-la expressando o alvo, tanto constitutivamente ou por engenharia genômicae por qualquer ensaio apropriado. Contudo, quando se precisa de uma refe-rência de modo a determinar se um dado dsRNA inibe a expressão do geneAlvo de HPV a um determinado grau e portanto é englobado pela presenteinvenção, o ensaio provido nos Exemplos abaixo servirá como tal referência.

Por exemplo, em determinados exemplos, a expressão gênicaE6AP é suprimida em pelo menos cerca de 20%, 25%, 35% ou 50% por ad-ministração do filamento do oligonucleotídeo duplo da invenção. Em algu-mas concretizações, o gene E6AP é suprimido em pelo menos cerca de60%, 70% ou 80% por administração do filamento do oligonucleotídeo duploda invenção. Em algumas concretizações, o gene E6AP é suprimido em pelomenos cerca de 85%, 90% ou 95% por administração do filamento do oligo-nucleotídeo duplo da invenção. A tabela 2 provê uma ampla faixa de valorespara inibição da transcrição obtida em um ensaio in vitro empregando váriasmoléculas E6AP dsRNA em várias concentrações. Da mesma forma, a tabe-Ia 6 provê uma ampla faixa de valores para a inibição da transcrição de E1 ea Tabela 8 provê uma ampla faixa de valores para a inibição da transcriçãode E6.

Conforme empregado aqui no contexto da infecção decorrentedo HPV, os termos "tratar", "tratamento" e similares refere-sem ao alívio dosprocessos patológicos mediados por infecção decorrente do HPV. Tal des-crição inclui o uso de agentes terapêuticos da invenção para profilaxia ouprevenção de infecção decorrente do HPV, e alívio dos sintomas ou patolo-gias causados por infecção decorrente do HPV. No contexto da presenteinvenção, à medida que ela refere-se a qualquer uma das outras condiçõescitadas aqui a seguir (que não os processos patológicos mediados por infec-ção decorrente do HPV), os termos "tratar", "tratamento" e similares signifi-cam alívio de pelo menos um sintoma associado a tal condição ou de modoa tornar lenta ou reverter a progressão de tal condição.

Conforme empregado aqui, as frases "quantidade terapeutica-mente eficaz" e "quantidade profilaticamente eficaz" refere-sem a uma quan-tidade que provê um benefício terapêutico no tratamento, prevenção ou ge-renciamento dos processos patológicos mediados por infecção decorrentedo HPV ou um sintoma claro dos processos patológicos mediados por infec-ção decorrente do HPV. A quantidade específica que é terapeuticamenteeficaz pode ser prontamente determinada por um médico e pode variar de-pendendo de fatores conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, o tipode processos patológicos mediados por infecção decorrente do HPV, o histó-rico do paciente e idade, o estágio dos processos patológicos mediados porinfecção decorrente do HPV, e a administração de outros agentes antipato-lógicos.

Conforme empregado aqui, uma "composição farmacêutica"compreende uma quantidade farmacologicamente eficaz de um dsRNA e umveículo farmaceuticamente aceitável. Conforme empregado aqui, "quantida-de farmacologicamente eficaz," "quantidade terapeuticamente eficaz" ousimplesmente "quantidade eficaz" refere-se àquela quantidade de um dsR-NA eficaz para produzir o resultado farmacológico, terapêutico ou preventivopretendido. Por exemplo, se um dado tratamento clínico é considerado efi-caz quando existe pelo menos uma redução de 25% em um parâmetro men-surável associado a uma doença ou transtorno, uma quantidade terapeuti-camente eficaz de um medicamento para o tratamento daquela doença outranstorno é a quantidade necessária para efetuar uma redução de pelo me-nos 25% naquele parâmetro.

O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se ao veí-culo para administração de um agente terapêutico. Tais veículos incluem,porém não estão limitados à salmoura, salmoura tamponada, dextrose, á-gua, glicerol, etanol e combinações dos mesmos. O termo exclui especifica-mente o meio de cultura de célula. Para medicamentos administrados oral-mente, os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém não estãolimitados aos excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como, diluentesinertes, agentes desintegrantes, agentes ligantes, agentes lubrificantes, a-gentes adoçantes, agentes aromatizantes, agentes corantes e preservantes.

Os diluentes apropriadamente inertes incluem sódio e carbonato de cálcio,sódio e fosfato de cálcio e lactose, embora amido e milho e ácido algínicosejam agentes desintegrantes apropriados. Agentes de ligação podem incluiramido e gelatina, embora o agente lubrificante, caso presente, geralmenteserá estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco. Caso desejado, oscomprimidos podem ser revestidos com um material, tal como, monoesteara-to de glicerila ou diestearato de glicerila para retardar a absorção no tratogastrointestinal.

Conforme empregado aqui, uma "célula transformada" é uma cé-lula dentro da qual um vetor foi introduzido a partir do qual uma molécula dedsRNA pode ser expressa.

II. Filamento do ácido nucléico duplo (dsRNA)

Em uma concretização, a invenção provê moléculas de filamentodo ácido nucléico duplo (dsRNA) para inibir a expressão do gene Alvo deHPV em uma célula ou mamífero, onde o dsRNA compreende um filamentode sentido negativo compreendendo uma região de complementariedadeque é complementar a pelo menos uma parte de um mRNA formado emuma expressão gênica Alvo de HPV, e onde a região de complementarieda-de possui menos de 30 nucleotídeos de comprimento, geralmente 19-24 nu-cleotídeos de comprimento, e onde o dsRNA, mediante contato com umacélula expressando o dito gene Alvo de HPV, inibe a expressão gênica deAlvo de HPV em pelo menos 10%, 25% ou 40%.

O dsRNA compreende dois filamentos de RNA que são suficien-temente complementares a hibridização para formar ma estrutura de duple-xo. Um filamento do dsRNA (o filamento de sentido negativo) compreendeuma região de complementariedade que é substancialmente complementare de modo geral integralmente complementar em relação a umaseqüência alvo, derivada da seqüência de um mRNA formadodurante a expressão gênica Alvo de HPV, o outro filamento (o filamento desentido) compreende uma região que é complementar ao filamento de senti-do negativo, tal que, os dois filamentos hibridizam e formam uma estruturade duplexo quando combinados sob condições apropriadas. Geralmente, aestrutura duplexo está entre 15 e 30, mais geralmente entre 18 e 25, ainda~ mais geralmente entre 19 e 24, e mais geralmente entre 19 e 21 pares debase de comprimento. De modo similar, a região de complementariedadepara a seqüência alvo está entre 15 e 30, mais geralmente entre 18 e 25,ainda mais geralmente entre 19 e 24, e mais geralmente entre 19 e 21 nu-cleotídeos de comprimento. O dsRNA da invenção pode compreender adi-cionalmente um ou mais ressaltos de nucleotídeo(s) de filamento simples. OdsRNA pode ser sintetizado por métodos padrão conhecidos na técnica con-forme discutido adicionalmente a seguir, por exemplo, por emprego de umsintetizador de DNA automatizado, tal como estão comercialmente disponí-veis, por exemplo, na Biosearch, Applied Biosystems, Inc. Em uma concreti-zação preferida, o gene Alvo de HPV é um gene E6AP humano. Nas concre-tizações específicas, o filamento de sentido negativo do dsRNA compreendeum filamento selecionado das seqüências de sentido da Tabela 1 e uma se-gunda seqüência selecionada do grupo consistindo nas seqüências de sen-tido negativo da Tabela 1. Agentes de sentido negativo alternativos que alve-jam qualquer lugar na seqüência alvo provida na Tabela 1 podem facilmenteser determinados empregando a seqüência alvo e a seqüência E6AP deflanqueamento.

Nas concretizações adicionais, o dsRNA compreende pelo me-nos uma seqüência de nucleotídeo selecionada dos grupos de seqüênciasprovidos na Tabela 1. Em outras concretizações, o dsRNA compreende pelomenos duas seqüências selecionadas desse grupo, onde uma de pelo me-nos duas seqüências é complementar a outra de pelo menos duas seqüên-cias, e uma de pelo menos duas seqüências é substancialmente comple-mentar em relação a uma seqüência de um mRNA gerado na expressão gê-nica E6AP. De modo geral, o dsRNA compreende dois oligonucleotídeos,onde um oligonucleotídeo é descrito como o filamento de sentido na Tabela1 e o segundo oligonucleotídeo é descrito como o filamento de sentido nega-tivo na Tabela 1. A tabela 1 provê um nome duplexo e número ID de se-qüência para CAD dsRNA preferido.

Nas concretizações adicionais, o dsRNA compreende pelo me-nos um dsRNA denominado duplexo selecionado dos grupos de seqüênciasprovidas na Tabela 5 (E1 dsRNA) ou Tabela 7 (E6 dsRNA). -

O versado na técnica está a par de que dsRNA compreendendouma estrutura de duplexo entre 20 e 23, porém especificamente 21 pares debase foram denominados como especificamente eficazes na indução da in-terferência de RNA (Elbashir e outros, EMBO 2001, 20:6877-6888). Contu-do, outros verificaram que dsRNA mais curtos ou mais longos podem sertambém eficazes. Nas concretizações descritas acima, em virtude da natu-reza da seqüências de oligonucleotídeo providas na Tabela 1, Tabela 5 ouTabela 7 os dsRNA da invenção podem compreender pelo menos um fila-mento de um comprimento minimamente de 21 nt. Pode ser razoavelmenteesperado que dsRNA mais curtos compreendendo uma das seqüências daTabela 1, Tabela 5 ou Tabela 7, menos apenas alguns nucleotídeos em umaou ambas as extremidades podem ser similarmente eficazes como compa-rado aos dsRNA descritos acima. Conseqüentemente, dsRNA compreen-dendo uma seqüência parcial de pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou nucle-otídeos mais contíguos de uma das seqüências da Tabela 1, Tabela 5 ouTabela 7, e diferindo em sua habilidade para inibir a expressão do gene Alvode HPV em um ensaio FACS ou outro ensaio conforme descrito aqui a se-guir em inibição não superior a 5, 10, 15, 20, 25, ou 30% de um dsRNAcompreendendo a seqüência integral são contemplados pela invenção. Adi-cionalmente dsRNA que clivam dentro da seqüência alvo provida na Tabela1, Tabela 5 ou Tabela 7 podem ser prontamente preparados empregando aseqüência de referencia e a seqüência alvo provida.

Além disso, os agentes RNAi providos na Tabela 1, Tabela 5 eTabela 7 identificam um sítio no mRNA Alvo de HPV que é suscetível à cli-vagem com base em RNAi. Como tal, a presente invenção inclui adicional-mente agentes RNAi que serão alvejados dentro da seqüência alvejada porum dos agentes da presente invenção. Conforme empregado aqui um se-gundo agente RNAi será alvejado dentro da seqüência de um primeiro agen-te RNAi, se o segundo agente RNAi clivar a mensagem em qualquer lugardentro do mRNA que seja complementar ao filamento de sentido negativo doprimeiro agente RNAi. Tal segundo agente geralmente consistirá em pelomenos 15 nucleotídeos contínuos a partir de uma das seqüências providas -na Tabela 1, Tabela 5 ou Tabela 7 acoplados às seqüências de nucleotídeoadicionais tomadas da região contínua à seqüência selecionada no geneAlvo de HPV. Por exemplo, os últimos 15 nucleotídeos da SEQ ID NO:1(menos as seqüências de AA adicionadas) combinados com os próximos 6nucleotídeos do gene E6AP alvo produzem um agente de filamento simplesde 21 nucleotídeos que se baseia em uma das seqüências provida na Tabe-la 1.

O dsRNA da invenção pode conter uma ou mais incorreções emrelação à seqüência alvo. Em uma concretização preferida, o dsRNA da in-venção não contém mais de 3 incorreções. Se o filamento de sentido negati-vo do dsRNA contiver incorreções com relação à seqüência alvo, é preferívelque a incorreção seja restrita aos 5 nucleotídeos de cada extremidade, porexemplo 5, 4, 3, 2, ou 1 nucleotídeo de cada extremidade de 5' ou 3' da re-gião de complementariedade. Por exemplo, para um filamento de dsRNA de23 nucleotídeos que é complementar a uma região do gene Alvo de HPV, odsRNA geralmente não contém qualquer incorreção dentro dos 13 nucleotí-deos centrais. Os métodos descritos dentro da invenção podem ser empre-gados para determinar se um dsRNA contendo uma incorreção em relação auma seqüência alvo é eficaz na inibição da expressão do gene Alvo de HPV.A consideração da eficácia de dsRNA com incorreções na inibição da ex-pressão do gene Alvo de HPV é importante, especialmente se a região es-pecífica de complementariedade no gene Alvo de HPV for conhecida por tervariação de seqüência polimórfica no vírus (se E1 ou E6) ou dentro da popu-lação humana (para E6AP).

Em uma concretização, pelo menos uma extremidade do dsRNA15 possui um ressalto de nucleotídeo de filamento simples de 1 a 4, geralmente1 ou 2 nucleotídeos. dsRNA possuindo pelo menos um ressalto de nucleotí-deo possuem propriedades inibidoras inesperadamente superiores em rela-ção às suas contrapartes de extremidade cega. Além disso, os presentesinventores descobriram que a presença de apenas um ressalto de nucleotí-deo reforça a atividade de interferência do dsRNA, sem afetar sua estabili-dade total. dsRNA possuindo apenas um ressalto provou ser especificamen-te estável e eficaz in vivo, bem como em uma variedade de células, meiosde cultura celular, sangue e soro. Geralmente, o ressalto de filamento sim-ples está localizado na extremidade de término 3' do filamento de sentidonegativo ou alternativamente, na extremidade de término 3 do filamento desentido. O dsRNA pode também possui uma extremidade cega, geralmentelocalizada na extremidade 5' do filamento de sentido negativo. Tais dsRNApossuem estabilidade aperfeiçoada e atividade inibidora, assim permitindoadministração em dosagens baixas, isto é, inferiores a 5 mg/kg do peso cor-póreo do receptor diariamente. Geralmente, o filamento de sentido negativodo dsRNA possui um ressalto de nucleotídeo na extremidade 3' e a extremi-dade 5' é cega. Em outra concretização, um ou mais dos nucleotídeos noressalto é substituído pelo tiofòsfato de nucleosídeo.

Ainda em outra modalidade, o dsRNA é quimicamente modifica-do para melhorar a estabilidade. Os ácidos nucléicos da invenção podem sersintetizados e/ou modificados pelos métodos bem-estabelecidos na técnica,tais como aqueles descritos no "Current protocols in nucleic acid chemistry",Beaucage, S.L. e outros (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY,USA, que é incorporado aqui como referência. Modificações químicas po-dem incluir, porém não estão limitadas às modificações 2', modificações emoutros sítios do açúcar ou base de um oligonucleotídeo, introdução de basesnão naturais na cadeia oligonucleotídeo, introdução de bases não naturaisna cadeia de oligonucleotídeo, anexação covalente a um Iigante ou fraçãoquímica e substituição das ligações de fosfato do internucleotídeo com liga-ções alternadas, tais como, tiofosfatos. Mais de uma tal modificação podeser empregada.

A ligação química dos dois filamentos de dsRNA separados po-de ser obtida por qualquer de uma variedade de técnicas bem-conhecidas,por exemplo, por introdução de ligações covalentes, iônicas e de hidrogênio;interações hidrófobas, interações de van der Waals ou interações de empi-Ihamento; por meio de coordenação de íon metálico ou através do uso deanálogos puros. Geralmente, os grupos químicos que podem ser usadospara modificar o dsRNA incluem, sem limitação, azul de metileno; gruposbifuncionais, geralmente bis-(2-cloroetil)amina; N-acetil-N'-(p-glioxilbenzoil)cistamina; 4-tiouracila; e psoraleno. Em uma concretização, o Iigante é umIigante hexaetileno glicol. Nesse caso, os dsRNA são produzidos por síntesede fase sólida e o Iigante hexa-etileno glicol é incorporado de acordo com osmétodos padrão (por exemplo, Williams, D.J., e K.B. Hall, Biochem. (1996)35:14665-14670). Em uma concretização específica, a extremidade 5' dofilamento de sentido negativo e a extremidade 3' do filamento de sentido sãoquimicamente ligadas através de um Iigante hexaetileno glicol. Em outraconcretização, pelo menos um nucleotídeo de dsRNA compreende gruposfosforotioato ou fosforoditioato. A ligação química nas extremidades do dsR-NA é geralmente formada por ligações em hélice tríplice. A tabela 1 provêexemplos de agentes RNAi modificados da invenção.

Ainda em outra modalidade, os nucleotídeos em um ou ambosos dois filamentos simples podem ser modificados para prevenir ou inibir asatividades de degradação das enzimas celulares, tal como, por exemplo,sem limitação, determinadas nucleases. As técnicas para inibir a atividadede degradação das enzimas celulares contra ácidos nucléicos são conheci-das na técnica, incluindo, porém não limitado às modificações de 2'-amino,modificações de açúcar 2-amino, modificações de açúcar 2'-F, modificaçõesde 2'-F, modificações de açúcar 2'-alquila, modificações de estrutura nãocarregada, modificações de morfolino, modificações de 2'-0-metil e fosforo-amidato (vide, por exemplo, Wagner, Nat. Med. (1995) 1:1116-8). Assim,pelo menos um grupo 2'-hidroxila dos nucleotídeos em um dsRNA é substi-tuído por um grupo químico, geralmente por um grupo 2'-amino ou 2'-metila.Também, pelo menos um nucleotídeo pode ser modificado para formar umnucleotídeo travado. Tal nucleotídeo travado contém uma ponte de metilenoque conecta o 2'-oxigênio da ribose ao 4'-carbono de ribose. Oligonucleotí-deos contendo o nucleotídeo travado são descritos em Koshkin, A.A., e ou-tros, Tetrahedron (1998), 54: 3607-3630) e Obika, S. e outros, TetrahedronLett. (1998), 39:5401-5404). A introdução de um nucleotídeo travado dentrode um oligonucleotídeo aperfeiçoa a afinidade pra seqüências complementa-res e aumenta a temperatura de fusão em vários graus (Braasch, D.A. andD.R. Corey, Chem. Biol. (2001), 8:1-7).

A conjugação de um Iigante em um dsRNA pode melhorar suaabsorção celular, bem como alvejando um tecido específico ou absorção portipos específicos de células, tais como, epitélio vaginal. Em determinadosmomentos, um Iigante hidrófobo é conjugado ao dsRNA de modo a facilitar apermeação direta da membrana celular. Alternativamente, o Iigante conjuga-do ao dsRNA é um substrato para endocitose mediada por receptor. Essasabordagens foram empregadas para facilitar a permeação celular dos oligo-nucleotídeos de sentido negativo, bem como agentes dsRNA. Por exemplo,o colesterol foi conjugado aos vários oligonucleotídeos de sentido negativoresultando nos compostos que são substancialmente mais ativos em compa-ração aos seus análogos não-conjugados. Vide M. Manoharan Antisense &Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103. Outros compostos lipófilosque foram conjugados aos oligonucleotídeos incluem ácido 1-pireno butírico,1,3-bis-0-(hexadecil)glicerol, e mentol. Um exemplo de um Iigante para en-docitose mediada por receptor é o ácido fólico. O ácido fólico entra na célulapor endocitose mediada por folato-receptor. Os compostos dsRNA portandoácido fólico seriam eficazmente transportados para dentro da célula atravésda endocitose mediada por folato-receptor. Li e colaboradores reportam quea anexação do ácido fólico ao término 3' de um oligonucleotídeo resultou emum aumento de 8 vezes na absorção celular do oligonucleotídeo. Li, S.; De-shmukh, H. M.; Huang, L. Pharm. Res. 1998, 15, 1540. Outros Iigantes queforam conjugados aos oligonucleotídeos incluem polietileno glicóis, cachosde carboidrato, agentes de reticulação, conjugados de porfirina e peptídeosde distribuição.

Em determinados momentos, a conjugação de um Iigante catiô-nico aos oligonucleotídeos resulta em resistência aperfeiçoada às nucleases.Exemplos representativos de Iigantes catiônicos são propilamônio e dimetil-propilamônio. De modo interessante, foi reportado que os oligonucleotídeosde sentido negativo mantêm sua afinidade de ligação alta ao mRNA quandoo Iigante catiônico foi disperso através do oligonucleotídeo. Vide M. Manoha-ran Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103 e referênciasaqui.

Os dsRNA conjugados ao Iigante da invenção podem ser sinteti-zados pelo emprego de um dsRNA que porta uma funcionalidade reativapendente, tal como aquele derivado da anexação de uma molécula de liga-ção ao dsRNA. Esse oligonucleotídeo reativo pode ser reagido diretamentecom os Iigantes comercialmente disponíveis, Iigantes que são sintetizadosportando qualquer de uma variedade de grupos de proteção ou Iigantes quepossuem uma fração de ligação anexada ao mesmo. Esse oligonucleotídeoreativo pode ser reagido diretamente com Iigantes disponíveis comercial-mente, Iigantes que são sintetizados portando qualquer de uma variedade degrupos de proteção ou Iigantes que possuem uma fração de ligação anexadaao mesmo. Os métodos da invenção facilitam a síntese dos dsRNA conjuga-dos ao Iigante pelo emprego, em algumas concretizações preferidas, de mo-nômeros de nucleosídeo que foram apropriadamente conjugados com Iigan-tes e que podem ser adicionalmente anexados a um material de suporte só-lido. Tais conjugados de nucleosídeo-ligante, opcionalmente anexados aomaterial de suporte sólido são preparados de acordo com algumas concreti-zações preferidas dos métodos da invenção, através da reação de um Iigan-te de ligação de soro selecionado com uma fração de ligação localizada naposição 5' de um nucleotídeo ou oligonucleotídeo. Em determinados mo-mentos, um dsRNA portando um Iigante aralquila anexado ao término 3' dodsRNA é preparado primeiro por anexação covalente de um bloco de forma-ção de monômero a um suporte de vidro de poro controlado através de umgrupo aminoalquila de cadeia longa. Então, os nucleotídeos são ligados a-través de técnicas de síntese de fase sólida padrão ao bloco de formação demonômero ligado ao suporte sólido. O bloco de formação de monômero po-de ser um nucleosídeo ou outro composto orgânico que é compatível comsíntese de fase sólida.

O dsRNA usado nos conjugados da invenção pode ser conveni-ente e rotineiramente fabricado através da técnica bem-conhecida de síntesede fase sólida. Equipamento para tal síntese é vendido por vários fornecedo-res, incluindo, por exemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). Quaisqueroutros dispositivos para tais sínteses conhecidos na técnica podem ser adi-cional ou alternativamente empregados. Também é conhecido o emprego detécnicas similares para preparar outros oligonucleotídeos, tais como, fosforo-tioatos e derivados alquilados.

Os ensinamentos relacionados à síntese de oligonucleotídeosmodificados específicos podem ser encontrados nas Patentes US que seseguem: Patentes US números 5.138.045 e 5.218.105, direcionadas aosoligonucleotídeos conjugados de poliamina; Patente US número 5.212.295direcionada aos monômeros para a preparação de oligonucleotídeos possu-indo ligações fósforo quirais; Patentes US números 5.378.825 e 5.541.307direcionadas aos oligonucleotídeos possuindo estruturas modificadas; Pa-tente US número 5.386.023 direcionada aos oligonucleotídeos modificadosna estrutura e a preparação dos mesmos através do acoplamento redutivo;Patente US número 5.457.191 direcionada às nucleobases modificadas combase no sistema de anel de 3-deazaurina e métodos de síntese da mesmas;

Patente US número 5.459.255 direcionada às nucleobases modificadas combase nas purinas substituídas N-2; Patente US número 5.521.302 direciona-da aos processos para preparação de oligonucleotídeos possuindo ligaçõesfósforo quirais; Patente US número 5.539.082 direcionada aos ácidos nucléi-cos peptídicos; Patente US número 5.554.746 direcionada aos oligonucleotí-deos possuindo estruturas β-lactama; Patente US número 5.571.902 direcio-nada aos métodos e materiais para a síntese de oligonucleotídeos; PatenteUS número 5.578.718 direcionada aos nucleotídeos possuindo grupos alquil-tio, onde tais grupos podem ser usados como Iigantes para outras fraçõesanexadas a qualquer de uma variedade de posições do nucleosídeo; Paten-tes US números 5.587.361 e 5.599.797 direcionadas aos oligonucleotídeospossuindo ligações fosforotioato de pureza quiral alta; Patente US número5.506.351, direcionada aos processos para preparação de 2'-0-alquil gua-nosina e compostos correlatos, incluindo compostos incluindo 2,6-diami-nopurina; Patente US número 5.587.469, direcionada aos oligonucleotídeospossuindo purinas substituídas N-2; Patente US número 5.587.470, direcio-nada aos oligonucleotídeos possuindo 3-deazapurinas; Patente US número5.223.168, e Patente US número 5.608.046, ambas direcionadas para aná-logos de 4'-desmetil nucleosídeo; Patentes US números 5.602.240, e5.610.289, direcionadas aos análogos de oligonucleotídeo modificados naestrutura; Patentes US números 6.262.241 e 5.459.255 direcionadas, entreoutras coisas, aos métodos de sintetização de 2'-flúor-oligonucleotídeos.

Nos dsRNA conjugados ao Iigante e molécula de Iigante portan-do nucleosídeos ligados específicos em seqüência da invenção, os oligonu-cleotídeos e oligonucleosídeos podem ser montados em um sintetizador deDNA apropriado utilizando precursores de nucleotídeo ou nucleosídeo pa-drão ou precursores conjugados de nucleotídeo ou nucleosídeo que já por-tam a fração de ligação, precursores de nucleotídeo Iigante ou de conjugadode nucleosídeo que já portam a molécula Iigante ou blocos de formação por-tando Iigante de não-nucleosídeo.

Quando se emprega os precursores de conjugado nucleotídeoque já portam uma fração de ligação, a síntese dos nucleosídeos ligadosespecíficos da seqüência é tipicamente completada e a molécula Iigante éentão reagida com a fração de ligação para formar o oligonucleotídeo conju-gado ao ligante. Os conjugados de oligonucleotídeo portando uma variedadede moléculas, tais como, esteróides, vitaminas, lipídeos e moléculas repórterforam descritos anteriormente (vide Manoharan e outros, Pedido PCT WO93/07883). Em uma concretização preferida, os oligonucleotídeos ou nucleo-sídeos ligados da invenção são sintetizados por um sintetizador automatiza-do empregando fosforamiditas derivadas de conjugados de nucleotídeo li-gante além das fosforamiditas padrão e fosforamiditas não padrão que estãocomercialmente disponíveis e são usadas rotineiramente na síntese de oli-gonucleotídeo.

A incorporação de um grupo 2'-0-metila, 2'-0-etila, 2'-0-propila,2'-0-alila, 2'-0-aminoalquila ou 2'-desóxi-2'-flúor nos nucleosídeos de umoligonucleotídeo confere propriedades de hibridização melhoradas ao oligo-nucleotídeo. Adicionalmente, os oligonucleotídeos contendo estruturas fosfo-rotioato possuem estabilidade nuclease melhorada. Assim, nucleosídeosligados e funcionalizados da invenção podem ser aumentados para incluircada ou ambos uma estrutura de fosforotioato ou um grupo 2'-0-metila, 2'-0-etila, 2'-0-propila, 2'-0-aminoalquila, 2'-0-alila ou 2'-desóxi-2'-flúor. Uma lis-tagem resumida de algumas das modificações do oligonucleotídeo conheci-das na técnicas é encontrada, por exemplo, na Publicação PCT WO200370918.

Em algumas concretizações, as seqüências de nucleosídeo fun-cionalizadas da invenção possuindo um grupo amino no término 5' são pre-paradas empregando um sintetizador de DNA e então reagidas com um de-rivado de éster ativo de um ligante selecionado. Derivados de éster ativo sãobem-conhecidos pelos versados na técnica. Esteres de ativos representati-vos incluem ésteres N-hidrosuccinimida, ésteres tetrafluorfenólicos, ésterespentafluorfenólicos e ésteres pentaclorofenólico. A reação do grupo amino edo éster ativo produz um oligonucleotídeo no qual o Iigante selecionado éanexado na posição 5' através de um grupo de ligação. O grupo amino notérmino 5' pode ser preparado utilizando um reagente C6 modificador de 5-amino. Em uma concretização, as moléculas de Iigante podem ser conjuga-das nos oligonucleotídeos na posição 5' pelo emprego de uma fosforamiditanucleosídeo de Iigante onde o Iigante é unido ao grupo 5'-hidróxi direta ouindiretamente através de um ligante. Tais fosforamiditas de nucleosídeo Ii-gante são tipicamente usadas ao final de um procedimento de síntese auto-matizado para fornecer um oligonucleotídeo conjugado ao ligante portando oligante no término 5'.

Exemplos de ligações internucleosídeo modificadas ou estrutu-ras incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirais, fosforoditioa-tos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metila e outros fosfonatos al-quila incluindo fosfonatos de 3'-alquileno e fosfonatos quirais, fosfinatos, fos-foramidatos incluindo 3'-amino fosforamidato e aminoalquilfosforamidatos,tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres e bora-nofosfatos possuindo ligações 3'-5', análogos ligados em 2'-5' desses e a-queles possuindo polaridade invertida onde os pares adjacentes das unida-des de nucleosídeo são ligados 3'-5' a 5'-3' ou 2'-5' a 5'-2'. Vários sais, saismistos e formas ácidas livres são também incluídos.

Patentes representativas dos Estados Unidos relacionadas àpreparação das ligações contendo átomo fósforo incluem, porém não estãolimitadas às Patentes US números 3.687.808; 4.469.863; 4.476.3015.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.3025.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.2335.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.1115.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.625.050; e 5.697.248, cada uma dasquais sendo incorporada aqui como referência.

Exemplos de ligações internucleotídeo modificadas ou estruturasque não incluem um átomo de fósforo (isto é, oligonucleosídeos) possuemestruturas que são formadas por ligações alquila de cadeia curta ou intera-çúcar cicloalquila, heteroátomo misto e ligações interaçúcar cicloalquila oualquila, ou uma ou mais ligações interaçúcar heteroatômicas de cadeia curtaou heterocíclicas. Essas incluem aquelas possuindo ligações morfolino (for-madas em parte da porção de açúcar de um nucleosídeo); estruturas siloxa-no; estruturas sulfeto, sulfóxido e sulfona; estruturas formacetila e tioforma-cetila; estruturas formacetil metileno e tioformacetila; estruturas contendoalceno; estruturas sulfamato; estruturas metilenoimino e metilenohidrazino;estruturas sulfonato e sulfonamida; estruturas amida e outras possuindo N1O, S mistos e partes do componente CH2.

Patentes dos Estados Unidos representativas relacionadas àpreparação dos oligonucleosídeos acima incluem, porém não limitadas àsPatentes US números 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134;5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257;5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086;5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704;5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; e 5.677.439 cada uma sendoincorporada aqui como referência.

Em determinados momentos, o oligonucleotídeo pode ser modi-ficado por um grupo não-ligante. Várias moléculas de não-ligante foram con-jugadas aos oligonucleotídeos, a fim de melhorar a atividade, distribuiçãocelular ou absorção celular do oligonucleotídeo e procedimentos para reali-zar tais conjugações estão disponíveis na literatura cientifica. Tais fraçõesnão-ligantes incluíram frações de lipídeo, tais como, colesterol (Letsinger eoutros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1989, 86:6553), ácido cólico (Manoharane outros, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), um tioéter, por exemplo,hexil-S-tritiltiol (Manoharan e outros, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306;Manoharan e outros, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), a tiocolesterol(Oberhauser e outros, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533) uma cadeia alifática,por exemplo, dodecandiol ou resíduos undecila (Saison-Behmoaras e outros,EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov e outros, FEBS Lett., 1990, 259:327; Svi-narchuk e outros, Biochimie, 1993, 75:49), um fosfolipídeo, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou trietilamônio 1,2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-H-fos-fato (Manoharan e outros, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea e outros,Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), uma poliamina ou uma cadeia de polietile-no glicol (Manoharan e outros, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), ouácido acético adamantano (Manoharan e outros, Tetrahedron Lett., 1995,36:3651), uma fração palmitila (Mishra e outros, Biochem. Biophys. Acta,1995, 1264:229), ou uma octadecilamina ou fração hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke e outros, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). AsPatentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação detais conjugados de oligonucleotídeo foram listadas acima. Protocolos de con-jugação típicos envolvem uma síntese de oligonucleotídeos portando umIigante amino em uma ou mais posições da seqüência. O grupo amino é en-tão reagido com a molécula sendo conjugada empregando acoplamento a-propriado ou reagentes de ativação. A reação de conjugação pode ser reali-zada tanto com o oligonucleotídeo ainda ligado ao suporte sólido ou seguin-do clivagem do oligonucleotídeo na fase da solução. A purificação do conju-gado de oligonucleotídeo por HPLC fornece, tipicamente, o conjugado puro.O emprego de um conjugado de colesterol é especificamente preferido, umavez que tal fração pode aumentar as células epiteliais vaginais alvo, um sítiode infecção decorrente do HPV.

A presente descrição descreve uma ampla variedade de concre-tizações de dsRNA que são úteis para silenciar gene Alvo de HPV e assimtratar transtorno associado ao HPVs. Embora o projeto do agente terapêuti-co específico possa tomar uma variedade de formas, determinadas caracte-rísticas funcionais distinguirão o dsRNA preferido de outro dsRNA. Especifi-camente, aspectos, tais como, boa estabilidade do soro, alta potência, faltade resposta imune induzida e bom comportamento similar ao medicamento,todos mensuráveis pelos versados na técnica, serão testados para identificadsRNA preferidos da invenção. Em algumas situações, nem todos essesaspectos funcionais estarão presentes no dsRNA preferido. Porém os versa-dos na técnica são capazes de otimizar essas variáveis e outras para sele-cionar os compostos preferidos da invenção.

Embora muitas modificações de nucleotídeo sejam possíveis, osinventores identificaram padrões de modificações químicas que fornecembenefício farmacológico, imunológico e de forma final terapêutico. A tabela 9estabelece o padrão de modificações químicas preferidas para uso nos ds-RNA duplexos estabelecidos na Tabela 1, Tabela 5 e Tabela 7 da invenção.Algumas dessas modificações são também ilustradas na Tabela 3.<table>table see original document page 34</column></row><table>Agentes RNAi codificados por vetor

O dsRNA da invenção pode também ser expresso de vetoresviróticos recombinantes intracelularmente in vivo. Os vetores viróticos re-combinantes da invenção compreendem seqüências codificando o dsRNAda invenção e qualquer promotor apropriado para expressão das seqüênciasde dsRNA. Promotores apropriados incluem, por exemplo, as seqüênciaspromotoras U6 ou H1 RNA pol Ill e o promotor citomegalovírus. A seleção deoutros promotores apropriados está dentro do conhecimento dos versadosna técnica. Os vetores viróticos recombinantes da invenção também podemcompreender promotores induzíveis ou reguláveis para expressão do dsRNAem um tecido específico ou em um ambiente intracelular específico. O em-prego de vetores viróticos recombinantes para liberar o dsRNA da invençãopara as células in vivo será discutido em maiores detalhes a seguir.

O dsRNA da invenção pode ser expresso de um vetor viróticorecombinante tanto como duas moléculas de RNA complementares, separa-das, ou como uma molécula de RNA simples com duas regiões complemen-tares.

Qualquer vetor virótico capaz de aceitar as seqüências de codifi-cação para a(s) molécula(s) de dsRNA a ser(em) expressa(s) pode ser usa-do, por exemplo, vetores derivados de adenovírus (AV); vírus adenoassocia-do (AAV); retrovírus (por exemplo, lentivírus (LV), vírus da raiva, vírus daleucemia em murino); vírus da herpes, e similares. O tropismo dos vetoresviróticos pode se modificado por pseudotipagem dos vetores com proteínasencapsuladas ou outros antígenos de superfície de outros vírus ou por subs-tituição das diferentes proteínas de capsídeo virótico, conforme apropriado.

Por exemplo, vetores lentiviróticos da invenção podem ser pseu-dotipados com proteínas superficiais a partir do vírus da estomatite vesicular(VSV), raia, Ebola, Mokola e similares. Os vetores AAV da invenção podemser fabricados para alvejar células diferentes por engenharia dos vetorespara expressar diferentes sorotipos de proteína capsídeo. Por exemplo, umvetor AAV expressando um capsídeo de sorotipo 2 em um genoma de soro-tipo 2 é denominado AAV 2/2. Esse gene de capsídeo de sorotipo 2 no vetorAAV 2/2 pode ser substituído por um gene de capsídeo de sorotipo 5 paraproduzir um vetor AAV 2/5. Técnicas para construção dos vetores AAV queexpressam diferentes sorotipos de proteína capsídeo estão dentro dos co-nhecimentos de um versado na técnica; vide, por exemplo, Rabinowitz JEeoutros (2002), J Virol 76:791-801, a descrição total sendo incorporada aquicomo referência.

A seleção de vetores viróticos recombinantes apropriados parauso na invenção, métodos para inserção de seqüências de ácido nucléicopara expressão dos dsRNA no vetor e métodos para distribuição do vetorvirótico para as células de interesse está dentro da prática da técnica. Vide,por exemplo, Dornburg R (1995), Gene Therap. 2:301-310; Eglitis M A(1988), Biotechniques 6:608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1:5-14; eerson W F (1998), Nature 392: 25-30; e Rubinson DAe outros, Nat.Genet. 33: 401 -406, a descrição total incorporada aqui como referência.Vetores viróticos preferidos são aqueles derivados de AV e AAV.

Em uma concretização especificamente preferida, o dsRNA da invenção éexpresso como duas moléculas de filamento de RNA simples a partir de umvetor AAV recombinante compreendendo, por exemplo, cada um dos promo-tores de U6 ou H1 RNA ou o promotor do citomegalovírus (CMV).

Um vetor AV apropriado para expressão do dsRNA da invenção,método para construção do vetor AV recombinante e um método para distri-buição do vetor dentro das células alvo são descritos em Xia H e outros(2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010.

Vetores AAV apropriados para expressão do dsRNA da inven-ção, métodos para construção do vetor AV recombinante e métodos paradistribuição dos vetores nas células alvo são descritos em Samulski R e ou-tros (1987), J. Virol. 61:3096-3101; Fisher KJe outros (1996), J. Virol,70:520-532; Samulski R e outros (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; Patente USnúmero 5.252.479; Patente US número 5.139.941; Pedido de Patente Inter-nacional número WO 94/13788; e Pedido de Patente Internacional númeroWO 93/24641 as descrições completas dos mesmos sendo incorporadasaqui como referência.III. Composições Farmacêuticas Compreendendo dsRNA

Em uma concretização, a invenção provê composições farma-cêuticas compreendendo um dsRNA, conforme descrito aqui e um veículofarmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica compreendendo odsRNA é útil para tratar uma doença ou transtorno associado à expressãoou atividade do gene Alvo de HPV1 tal como processos patológicos media-dos por infecção decorrente do HPV. Tais composições farmacêuticas sãoformuladas com base no modo de distribuição. Um exemplo são as compo-sições que são formuladas tanto para administração tópica no colo do úteroou administração sistêmica através da distribuição parenteral.

As composições farmacêuticas da invenção são administradasem dosagens suficientes para inibir a expressão do gene Alvo de HPV. Ospresentes inventores determinaram que, em razão de sua eficiência aperfei-çoada, as composições compreendendo o dsRNA da invenção podem seradministradas em dosagens surpreendentemente baixas. A dosagem de 5mg de dsRNA por kg de peso corpóreo do receptor por dia é suficiente parainibir ou suprimir a expressão do gene Alvo de HPV1 e no caso das verrugasou tratamento cervical ou anal, pode ser aplicado diretamente ao tecido in-fectado.

Em geral, uma dose apropriada de dsRNA estará na faixa de0,01 a 5,0 mg por kg de peso corpóreo do receptor diariamente, geralmentena faixa de 1 mg para 1 mg por kg de peso corpóreo por dia. A composiçãofarmacêutica pode ser administrada uma vez ao dia ou o dsRNA pode seradministrado duas, três ou mais subdoses em intervalos apropriados atravésde todo o dia ou mesmo empregando infusão contínua ou distribuição atra-vés de uma formulação de liberação controlada do gel vaginal. Naquele ca-so, o dsRNA contido em cada subdose deve ser correspondentemente me-nor a fim de obter a dosagem diária total. A unidade de dosagem pode tam-bém ser composta para distribuição por vários dias, por exemplo, emprega-do uma formulação de distribuição prolongada convencional que provê dis-tribuição prolongada dos dsRNA por um período de vários dias. Formulaçõesde distribuição prolongada são bem-conhecidas na técnica e são especifi-camente úteis para distribuição vaginal dos agentes, tal como seriam usadascom os agentes da presente invenção. Nessa concretização, a unidade dedosagem contém um múltiplo correspondente da dose diária.

Um versado na técnica apreciará que determinados fatores po-dem influenciar a dosagem e temporização necessárias para tratar eficaz-mente um indivíduo, incluindo porém não limitado à gravidade da doença outranstorno, tratamentos anteriores, a saúde em geral e/ou idade do indivíduoe outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo comuma quantidade" terapeuticamente de uma composição pode incluir um tra-tamento simples ou uma série de tratamentos. Estimativas de dosagens efi-cazes e meias vidas in vivo para os dsRNA individuais englobadas pela in-venção podem ser feitas empregando metodologias convencionais ou combase no teste in vivo empregando um modelo animal apropriado, conformedescrito aqui em algum lugar.

Os inventores reconhecem que por várias razões, incluindo a va-riabilidade dos genótipos de HPV, pode ser desejável tratar a infecção de-corrente do HPV com mais de um dsRNA da invenção ao mesmo tempo. Emuma concretização, uma combinação de dsRNA é selecionada para alvejaruma faixa mais ampla de genótipos HPV, com a última mistura de complexode dsRNA. Espera-se que uma composição farmacêutica da invenção com--preendendo mais de um tipo de dsRNA contenha dosagens de dsRNA indi-viduais conforme descrito aqui.

Combinações de dsRNA podem ser providas em conjunto emuma composição farmacêutica de forma de dosagem simples. Alternativa-mente, a combinação de dsRNA pode ser provida em formas de dosagemseparadas, onde elas podem ser administradas ao mesmo tempo ou emtempos diferentes e possivelmente por meios diferentes. A invenção, portan-to, contempla composições farmacêuticas compreendendo as combinaçõesdesejadas de dsRNA da invenção e também contempla composições farma-cêuticas de dsRNA simples que se destinam a ser providas como parte deum regime de combinação. Nesse último caso, a terapia de combinação dainvenção é um método de administração ao invés de uma composição dematéria.

Avanços na genética dos camundongos geraram vários geraramvários modelos de camundongos para o estudo de várias doenças humanas,tais como processos patológicos mediados por infecção decorrente do HPV.Tais modelos são empregados para teste in vivo de dsRNA, bem como paradeterminar uma dose terapeuticamente eficaz.

Qualquer método pode ser empregado para administrar um ds-RNA da presente invenção a um mamífero contendo células infectadas comHPV. Por exemplo, a administração pode ser tópica (por exemplo, vaginal,transdérmica, etc.); oral; ou parenteral (por exemplo, por injeção subcutânea,intraventricular, intramuscular ou intraperitoneal ou por via intravenosa). Aadministração pode ser rápida (por exemplo, por injeção) ou pode ocorrerem um período de tempo (por exemplo, por infusão lenta ou administraçãode formulações de liberação lenta).

Tipicamente, quando se trata um mamífero possuindo célulasinfectadas com HPV, as moléculas de dsRNA são administradas topicamen-te em um gel vaginal ou creme. Por exemplo, dsRNA formulados com ousem Iipossomas podem ser topicamente aplicados diretamente ao colo doútero, trato anal ou lesões decorrentes de HPV, tais como, verrugas genitais.Para administração tópica, uma molécula de dsRNA pode ser formulada nascomposições, tal como soluções aquosas estéreis e não estéreis, soluçõesnão-aquosas em solventes comuns, tais como, alcoóis ou soluções em ba-ses de óleo sólidas ou líquidas. Tais soluções também podem conter tam-pões, diluentes e outros aditivos apropriados. As composições para adminis-tração tópica podem ser formuladas na forma de emplastros transdérmicos,ungüentos, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, aspersões, líquidos epós. Géis e cremes podem ser formulados empregando polímeros e perme-abilizadores conhecidos na técnica. Os géis ou cremes contendo o dsRNA eexcipientes associados podem ser aplicados ao colo do útero empregandouma cápsula cervical, diafragma vaginal, códon revestido, luva e similares.Veículos farmacêuticos convencionais, bases aquosas, em pó ou oleosas,espessantes e similares podem ser adicionados.Para administração parenteral, intratecal ou intraventricular, umamolécula de dsRNA pode ser formulada nas composições, tal como solu-ções aquosas estéreis, que também podem conter tampões, diluentes e ou-tros aditivos apropriados (por exemplo, melhoradores de penetração, com-postos veículo e outros veículos farmaceuticamente aceitáveis).

Além disso, moléculas de dsRNA podem ser administradas a ummamífero contendo células infectadas por HPV empregando métodos nãoviróticos, tais como, meios biológicos ou abiológicos, conforme descrito, porexemplo, na Patente US número 6.271.359. A distribuição abiológica podeser realizada por uma variedade de métodos incluindo, sem limitação, (1)carregamento de Iipossomas com uma molécula de ácido dsRNA providaaqui e (2) complexação da molécula de dsRNA com lipídeos ou Iipossomaspara formar complexos de ácido nucléico-lipídeo ou ácido nucléico-lipossoma. O Iipossoma pode ser composto de lipídeos catiônicos e neutrosgeralmente usados para transfectar células in vitro. Os lipídeos catiônicospodem complexar (por exemplo, associado à carga) com ácidos nucléicoscarregados negativamente para formar lipossomas. Exemplos de Iipossomascatiônicos incluem, sem limitação, lipofectina, lipofectamina, lipofectace,DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamônio propano), DOTMA (cloreto de N-[1,2(2,3-dioleoilóxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio), DOSPA (2,3-dioleoilóxi-N-[2-(esperminacarboxamido)etil]-N,N-deimetil-1-propanamina), DOGS (dioctade-cil amido glicil espermina), e DC-col (3,[N-N1,N-dimetiletilenodiamina)-carba-moil]colesterol).

Procedimentos para formação de lipossomas são bem-conhe-cidos na técnica. As composições lipossômicas podem ser formadas, porexemplo, de fosfatidilcolina, fosfatidilcolina dimiristoila, fosfatidilcolina dipal-mitoila, fosfatidilglicerol dimiristoila ou fosfatidiletanolamina dioleoila. Váriosagentes lipófilos são comercialmente disponíveis incluindo Lipofectina®. (In-vitrogen/Life Technologies, Carlsbad, Calif.) e Effectene®. (Qiagen, Valenci-a, Calif.). Além disso, os métodos de distribuição sistêmica podem ser otimi-zados empregando lipídeos catiônicos comercialmente disponíveis, tais co-mo, DDAB ou DOTAP, cada um dos quais pode se misturado com um lipí-deo neutro, tal como, DOPE ou colesterol. Em alguns casos, os lipossomas,tais como aqueles descritos por Templeton e outros (Nature Biotechnology,15: 647-652 (1997)) podem ser empregados. Em outras modalidades, ospolicátions, tais como, polietilenoimina podem ser empregados para obterdistribuição in vivo e ex vivo (Boletta e outros, J. Am Soe. Nephrol. 7: 1728(1996)). Informação adicional com relação ao emprego de lipossomas paradistribuição de ácidos nucléicos pode ser encontrado na Patente US número6.271.359, Publicação PCT WO 96/40964 e Morrissey, D. e outros 2005. NatBiotechnol. 23(8):1002-7.

Outros métodos não-viróticos para administração das moléculasde dsRNA a um mamífero contendo células infectadas por HPV incluem sis-temas de distribuição à base de lipídeo catiônico (além dos lipossomas) taiscomo, Iipoplexos e nanoemulsões. Adicionalmente, a condensação dos sis-temas de distribuição poliméricos (isto é, complexos poliméricos de DNA ou"poliplexos") podem ser empregados, incluindo, porém não limitado à quito-sanas, poli(L-lisina)(PLL), polietilenimina (PEI), dendrímeros (por exemplo,poliamidoamina (PANAM) dendrímeros), e poloxaminas. Adicionalmente, ossistemas de distribuição polimérica de não-condensação podem ser usados,incluindo, porém não limitado as poloxâmeros, gelatina, PLGA (ácido polilác-tico-co-glicólico), PVP (polivinilpyrrolidona) e PVA (álcool polivinila).

Procedimentos para as técnicas de distribuição ou administraçãomencionadas acima são bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, conden-sação do trabalho dos sistemas de distribuição polimérica por complexaçãofácil com moléculas de DNA aniônicas; por exemplo, a poli(L-lisina) (PLL)trabalha por formação de um complexo carregado positivamente que intera-ge com a superfície celular carregada negativamente e após isso, sofre umarápida internalização.

A distribuição biológica pode se realizada por vários métodos in-cluindo, sem limitação, o emprego de vetores viróticos. Por exemplo, os ve-tores viróticos (por exemplo, adenovírus e vírus da herpes) podem ser usa-dos para distribuir moléculas de dsRNA para as células da pele e célulascervicais. Técnicas de biologia molecular padrão podem ser empregadaspara introduzir um ou mais dos dsRNA providos aqui em um dos muitos ve-tores viróticos diferentes desenvolvidos anteriormente para liberar ácido nu-cléico para as células. Esses vetores viróticos resultantes podem ser empre-gados para distribuir um ou mais RNAs às células, por exemplo, por infec-ção.

Os dsRNA da presente invenção podem ser formulados em umveículo farmaceuticamente aceitável ou diluente. Um "veículo farmaceutica-mente aceitável" (também referido aqui como um "excipiente") é um solventefarmaceuticamente aceitável, agente de suspensão ou qualquer outro veícu-Io farmacologicamente inerte. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis po-dem ser líquidos ou sólidos e podem ser selecionados tendo-se a maneirade administração já planejada, de modo a fornecerem o volume desejado,consistência e outras propriedades de transporte e químicas pertinentes.Veículos típicos farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo e semlimitação; água, solução de salmoura, agentes de ligação (por exemplo, poli-vinilpirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose); cargas (por exemplo, Iactose eoutros açúcares, gelatina ou sulfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo,amido, polietileno glicol ou acetato de sódio); desintegrantes (por exemplo,amido ou glicolato amido de sódio) e agentes umectantes (por exemplo, Iau-ril sulfato de sódio).

Além disso, dsRNA que alvejam o gene Alvo de HPV podem serformulados em composições contendo os dsRNA misturados, encapsulados,conjugados ou de outra forma associados à outras moléculas, estruturasmoleculares ou misturas de ácidos nucléicos. Por exemplo, uma composiçãocontendo um ou mais agentes dsRNA que alvejam o gene E6AP pode conteroutros agentes terapêuticos, tais como, medicamentos antiinflamatórios (porexemplo, medicamentos antiinflamatórios não-esteróides e corticosteróides)e medicamentos antiviróticos (por exemplo, ribivirina, vidarabina, aciclovir eganciclovir). Em algumas concretizações, a composição pode conter um oumais dsRNA possuindo uma seqüência complementar ao gene Alvo de HPVem combinação com um agente ceratolítico. Agentes ceratolíticos são agen-tes que separam ou perdem a camada calejada da epiderme. Um exemplode um agente ceratolítico inclui, sem limitação, ácido salicílico. Outros e-xemplos são providos na Patente US número 5.543.417. Agentes ceratolíti-cos podem ser usados em uma quantidade eficaz para melhorar a penetra-ção de dsRNA, por exemplo, nos tecidos tais como pele. Por exemplo, umagente ceratolítico pode ser usado em uma quantidade que permita que umdsRNA aplicado a uma verruga genital penetre através da verruga.

A toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos pode serdeterminada por procedimentos farmacêuticos padrão nas culturas celularesou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letala 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% dapopulação). A taxa de dosagem entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é oíndice terapêutico e ele pode ser expresso como taxa LD50/ED50. Os com-postos que exibem índices terapêuticos altos são os preferidos.

Os dados obtidos dos ensaios de cultura de célula e estudos emanimais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem parauso nos seres humanos. A dosagem das composições da invenção repousageralmente dentro de uma faixa de concentrações de circulação que incluemED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentrodessa faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da via de ad-ministração utilizada. Para qualquer composto usado nesse método da in-venção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente dosensaios de cultura de célula. A dose pode ser formulada em modelos de a-nimais para obter uma faixa de concentração de plasma circulante ou, quan-do apropriado, do produto peptídico de uma seqüência alvo (por exemplo,obtenção de uma concentração diminuída do polipeptídeo) que inclui o IC50(isto é, a concentração do composto de teste que obtém uma meia inibiçãomáxima dos sintomas), conforme determinado na cultura celular. Tal infor-mação pode ser usada para determinar mais acuradamente as doses úteisnos seres humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo,por cromatografia líquida de alto desempenho.

Além de sua administração individualmente ou como uma plura-lidade, conforme discutido acima, os dsRNA da invenção podem ser admi-nistrados em combinação com outros agentes conhecidos eficazes no trata-mento dos processos patológicos mediados por infecção decorrente do HPV.Em qualquer evento, o médico pode ajustar a quantidade e temporizar aadministração do dsRNA com base nos resultados observados empregandomedidas padrão de eficácia conhecidas na técnica ou descritas aqui.

As combinações de dsRNA podem ser testadas in vitro e in vivoempregando os mesmos métodos usados para identificação de dsRNA sim-ples preferidos. Tais combinações podem ser selecionadas em uma basepuramente de bioinformática, onde é selecionado o número mínimo de sirR-NA que fornece cobertura de uma ampla faixa de genótipos. Alternativamen-te, tais combinações podem ser selecionadas com base nas avaliações invitro ou in vivo, ao longo das linhas descritas aqui para agentes dsRNA sim-ples. Um ensaio preferido para combinações de teste de dsRNA é avaliar asconseqüências fenotípicas do alvo derrubado de HPV mediado por sirRNAem linhagens celulares positivas para câncer (por exemplo SiHa ou Caski1conforme descrito, por exemplo em Hengstermann e outros (2005) JournalVir. 79(14): 9296; e Butz e outros (2003) Oncogene 22: 5938), ou nos siste-mas de cultura organotípicos, conforme descrito, por exemplo em Jeon eoutros (1995) Journal Vir. 69(5):2989.

Os inventores identificaram determinadas combinações preferi-das de. dsRNA que podem ser usadas para tratar infecção decorrente deHPV. Nos termos mais gerais, a combinação de dsRNA compreende maisde um dsRNA selecionado entre a Tabela 1, Tabela 3, Tabela 5 e Tabela 7.Assim, a invenção contempla o emprego de 2, 3, 4, 5 ou mais duplexos ds-RNA selecionados dentre a Tabela 1, Tabela 3, Tabela 5 e Tabela 7 na tera-pia de combinação. Em princípio, o número menor de dsRNA é preferidopara simplificação do produto terapêutico. Isso força a seleção de dsRNAque cobrirão o maior número de genótipos de HPV prejudiciais ou potenci-almente prejudiciais e na realidade, pode justificar a seleção de uma combi-nação que não necessariamente cobre todos tais genótipos de HPV.

Os dsRNA que se seguem são especificamente tratáveis pelacombinação:De Ε1: ND-9072; ND-9142; ND-9092; ND-9162; ND-9097; ND-9167; ND-9066; ND-9123; AL-DP-8082; AL-DP-8095;

De E6: ND-8903; ND-8991; ND-8914; ND-9002; ND-8906; ND-8994; ND-8943; ND-9031; ND-9032; ND-8920; ND-8952; ND-8951; ND-9008; ND-9040; ND-9039; AL-DP-7783; AL-DP-7784;

De E6AP: AL-DP-7365; AL-DP-7371; AL-DP-7499; AL-DP-7545;AL-DP-7492; AL-DP-7473; AL-DP-7478; AL-DP-7554; AL-DP-7514; AL-DP-7397, ND-9300.

Métodos para tratar doenças causadas por infeccão decorrente do HPV

Os métodos e composições descritos aqui podem ser usados

para tratar doenças e condições causadas por papilomavírus humano, quepode ser o resultado de infecções clínicas ou subclínicas em decorrência dopapilomavírus. Tais doenças e condições, aqui denominadas "transtorno as-sociado ao HPVs" ou "processos patológicos mediados por infecção decor-rente do HPV", incluem, por exemplo, malignidades epiteliais, câncer de pele(não-melanoma ou melanoma), malignidades ano genitais, tais como, câncercervical, lesões pré-cancerígenas associadas ao HPV (incluindo LSIL ou te-cido cervical HSIL), carcinoma anal, lesões malignas, lesões benignas, papi-Ioma carcinomas, papilomaadenocistomas, papiloma neuropático, papiloma-tose, papilomas cutâneos e das mucosas, condilomas, tumores fibroblásticose outras condições patológicas associadas ao papilomavírus.

Por exemplo, as composições descritas aqui podem ser empre-gadas para tratar verrugas causadas em decorrência do HPV. Tais verrugasincluem, por exemplo, verrugas comuns (verruca vulgaris), por exemplo,palmar, plantar e verrugas periunguinais, verrugas planas e filiformes, papi-lomas anal, oral faríngeo, laríngeo e da língua; e verrugas venéreas (condi-Ioma acuminada), também conhecido como verrugas genitais (por exemplo,do pênis, vulva, verrugas vaginais e cervicais) que são uma das manifesta-ções mais sérias da infecção decorrente do HPV. O DNA do HPV pode serencontrado em todas classificações de neoplasia intra-epitelial cervical (CINl-lll), e um subconjunto específico de tipos de HPV pode ser encontrado nocarcinoma in situ do colo do útero. Conseqüentemente, mulheres com verru-gas genitais contendo tipos específicos de HPV1 são consideradas comocorrendo um alto risco de desenvolverem câncer cervical.

A doença mais comum associada à infecção por papilomavírusse constitui em verrugas benignas na pele ou verrugas comuns. As verrugascomuns geralmente contêm HPV dos tipos 1, 2, 3, 4 ou 10. Outras condiçõescausadas por papilomavírus incluem, por exemplo, papilomas laríngeos, quesão tumores epiteliais benignos da laringe. Dois tipos de papilomavírus,HPV-6 e HPV-11, são mais geralmente associados aos papilomas laríngeos.As composições descritas aqui podem ser empregadas para tratar essasdoenças e condições.

As composições descritas aqui podem também ser usadas notratamento da epidermodisplasia verruciformis (EV)1 uma doença transmitidageneticamente e rara, caracterizada por verrugas planas disseminadas quetem aparência de pequenas máculas avermelhadas.

Além disso, as composições descritas aqui podem ser emprega-das para tratar lesões resultantes de transformação celular para que HPVseja um agente etiológico, por exemplo, no tratamento do câncer cervical.

As composições descritas aqui podem ser usadas também notratamento das displasias induzidas PR HPV, por exemplo, pênis, vulva, cer-vical, vaginal, oral, anal e displasias faríngeas e no tratamento de cânceresinduzidos por HPVp por exemplo, pênis, vulva, cervical, vaginal, anal, oral,faríngea e cânceres de cabeça e pescoço.

A invenção pode também ser pratica por inclusão de dsRNA es-pecífico em combinação com outro agente quimioterapêutico anticâncer, talcomo, qualquer agente quimioterapêutico convencional. A combinação deum agente de ligação específico com tais outros agentes pode potencializaro protocolo quimioterapêutico. A combinação de um agente de ligação espe-cífico com tais outros agentes pode potencializar o protocolo quimioterapêu-tico. Vários protocolos quimioterapêuticos estão presentes no conhecimentodo praticante como sendo capazes de incorporar o método da invenção.

Qualquer agente quimioterapêutico pode ser usado incluindo agentes alqui-lantes, antimetabólitos, hormônios e antagonistas, radioisótopos, bem comoprodutos naturais. Por exemplo, o composto da invenção pode ser adminis-trado com antibióticos, tais como, doxorubicina e outros análogos de antraci-clina, mostardas nitrogenadas, tais como, ciclofosfamida, análogos de piri-midina, tais como, 5-fluoruracila, cisplatina, hidroxiuréia, taxol e seus deriva-dos naturais e sintéticos e similares. Como outro exemplo, no caso de tumo-res mistos, tais como, adenocarcinoma da mama, onde os tumores incluemcélulas independentes e dependentes de gonadotropina, o composto podeser administrado em conjunto com Ieuprolido ou goserelina (análogos depeptídeo sintético de LH-HR). Outros protocolos antineoplásticos incluem oemprego de um composto de tetraciclina com outra modalidade de tratamen-to, por exemplo, cirurgia, radiação, etc., também referidos aqui como "moda-lidades antineoplásticas adjuvantes". Assim, o método da invenção pode serempregado com tais regimes convencionais com o benefício de reduzir osefeitos e melhorar a eficácia.

Em uma alternativa adicional, o dsRNA alvejando E6AP podeser empregado para tratar transtornos neurológicos e comportamentais.E6AP está implicado nos transtornos neurológicos e comportamentais, atra-vés da identificação das mutações de E6AP nos pacientes possuindo sín-drome Angelman. Síndrome de Angelman (AS) é um transtorno neurocom-portamental impresso, caracterizado por retardo mental, retardo, ausênciade fala, risada excessiva, apoplexia, ataxia e um padrão EEG característico.(Hitchins, M.P. e outros 2004. Am J Med Genet A. 125(2): 167-72). Não seria,prematuramente, a intenção do tratamento induzir tais condições; ao invésdisso, conforme observado em muitos defeitos hereditários, isso evidenciaque E6AP possui um papel crítico nas condições neurológicas e comporta-mentais indicando que esse alvo pode ter uma variedade de papéis nas pa-tologias humanas e é provavelmente um alvo apropriado para outras doen-ças nessa classe onde o silenciamento de E6AP compensará outros defeitosbioquímicos ou doenças. Conforme empregado aqui, "transtornos associa-dos ao E6AP" incluem o transtorno associado ao HPVs observado acima eoutros transtornos neurológicos e comportamentais.Métodos para inibir expressão qênica de E6APAinda em outro aspecto, a invenção provê um método para inibira expressão gênica de E6AP em um mamífero. O método compreende ad-ministração da composição da Tabela 1 da invenção a um mamífero, tal que,a expressão do gene alvo E6AP é silenciada. Em razão de sua alta especifi-cidade, tais dsRNA da invenção especificamente alvejam RNAs (primário ouprocessado) do gene E6AP. As composições e métodos para inibir a ex-pressão desses genes E6AP empregando tais dsRNA podem ser realizadasconforme descrito aqui em qualquer lugar.

Em uma concretização, o método compreende administração deuma composição compreendendo um dsRNA, onde o dsRNA compreendeuma seqüência de nucleotídeo que é complementar a pelo menos uma partede uma transcrição de RNA do gene E6AP do mamífero a ser tratado.Quando o organismo a ser tratado é um mamífero, tal como um ser humano,a composição pode ser administrada por qualquer meio conhecido na técni-ca incluindo, porém não limitado às vias oral ou parenteral, incluindo admi-nistração intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica, vias aéreas(aerossol), nasal, retal, vaginal e tópica (incluindo bucal e sublingual). Nasconcretizações preferidas, as composições são administradas por via tópi-ca/vaginal ou por infusão intravenosa ou injeção.

A menos que de outra forma definido, todos termos técnicos ecientíficos usados aqui possuem o mesmo significado conforme'entendidode modo geral por um versado na técnica a qual a essa invenção pertence.Embora os métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aquipodem ser usados na prática ou teste da invenção, métodos apropriados emateriais são descritos abaixo. Todas publicações, pedidos de patente, pa-tentes e outras referências mencionadas aqui são incorporadas como refe-rência em sua totalidade. No caso de conflito, o presente relatório descritivo,incluindo definições, regerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplossão apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes.

EXEMPLOS

Percurso do gene E6AP

O projeto de sirRNA foi realizado para identificar sirRNAs alve-jando proteína Iigase de ubiquitina humana E3A (ube3A, também referidacomo E6AP). Seqüências mRNA humanas para E6AP representando dife-rentes isoformas (NM_130838.1, NM_130839.1, NM_000462.2) foram usadas.

A função de alinhamento múltiplo do CachoW (Thompson J.D., eoutros, Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673) do software BioEdit foi usada comtodas isoformas de E6AP humanas para identificar a seqüência mRNANM_130838.1 como a seqüência mais curta, bem como para confirmar aconservação da seqüência a partir da posição 5 para a posição 4.491 (posi-ção de extremidade) da seqüência de referência, um requisito para alveja-mento eficiente de todas isoformas E6AP.

Todos 19mers de sobreposição possíveis (representandofilamento de sentido seqüências siRNUm) seqüência de referência do inter-valo E6AP NM_130838.1 foram identificados, resultando em 4.473 seqüên-cias candidatas de 19mer. Combinadas, esses seqüências alvo candidatascobrem a 5'UTR, codificando e domínios de 3'UTR do E6AP mRNA, e sítiosde junção desses domínios.

A fim de classificar e selecionar sirRNAs fora do grupo de candi-datos, o potencial previsto para interação com alvos irrelevantes (alvo empotencial) foi tomado como um parâmetro de classificação. sirRNAs compotencial alvo baixo foram definidos como preferíveis e presume-se que se-jam mais específicos in vivo.

Para prever o potencial alvo específico para RNsir, presume-se que:

1. a complementariedade para o gene alvo nas posições 2 a9 (contagem 5' a 3') de um filamento (região de semeadu-ra) pode ser suficiente para interação daquele filamentocom o mRNA transcrito do gene alvo e infra-regulaçãosubseqüente (Jackson AL, e outros Nat. Biotechnol. 2003Jun;21(6):635-7)

2. as posições 1 e 19 de cada filamento não são relevantespara interações fora do alvo.

3. a região de semeadura pode contribuir mais para potencialfora do alvo que o restante da seqüência.

4. posições de região de sítio de clivagem 10 e 11 (contagem-5' a 3') de um filamento podem contribuir mais para o po-tencial fora do alvo que as seqüências 3' para o sítio de cli-vagem (região de não-semeadura), porém não tanto comoa região de semeadura.

5. uma classificação fora do alvo pode ser calculada para ca-da gene e cada filamento, com base na complementarie-dade da seqüência do filamento sirRNA para a seqüênciagênica e posição das incorreções, embora se considerandoas presunções 1 a 4.

6. presumindo-se aborto em potencial da atividade do fila-mento de sentido por modificações internas introduzidas,apenas potencial fora alvo do filamento de sentido negativoserá relevante.

7. o potencial fora do alvo de um sirRNA pode ser inferido apartir da descrição do gene de homologia mais alta de a-cordo com nossos critérios (melhor gene alvo), podendoassim ser expresso por classificação alvo do respectivogene.

Para identificar os genes fora do alvo em potencial-, seqüênciasde sentido negativo 19mer foram submetidas a uma pesquisa de homologiacontra seqüências mRNA humanas publicamente disponíveis. Para esse fim,pesquisas fastA (versão 3.4) foram realizadas com todas seqüências de sen-tido negativo de 19mer candidatas contra a base de dados RefSeq humana.

Um script Perl foi empregado para gerar seqüências de sentido negativo apartir de seqüências 19mer candidatas (Perl script 2). Uma pesquisa fastAfoi executada com pares de parâmetro/valor -g 30 -f 30 -L -i -H a fim de levarem consideração a homologia em relação ao comprimento pleno de 19mer eformatar a saída apropriada para a análise de script na próxima etapa. Apesquisa resultou em uma lista de genes fora do alvo em potencial para sir-RNAs candidatos.Adicionalmente, os parâmetros da pesquisa fastA foram aplica-dos com valores -E 15.000 a fim de fornecer entradas da base de dados commais de 8 neobases contíguas idênticas às seqüências de filamento de sen-tido de 19mer que serão, muito provavelmente, transferidas para um arquivode saída fastA, embora revelando a homologia do comprimento completo de19mer (vide presunção 1).

A fim de identificar o melhor gene fora do alvo e sua classifica-ção fora do alvo, o arquivo de saída fastA foi analisado. As propriedades forado alvo que se seguem para a seqüência de entrada de entrada de 19 merforam extraídas para cada gene alvo em potencial:

Número de incorreções na região de semeadura

Número de incorreções na região de não-semeadura

Número de incorreções na região de sítio de clivagem

A classificação fora do alvo para cada gene fora do alvo foi cal-culada como se segue:

(número de incorreções de semeadura multiplicado por 10) +(número de incorreções de sítio de clivagem multiplicado por 1,2) + númerode incorreções de não-semeadura.

A menor classificação fora do alvo foi extraída para cada se-qüência de entrada de 19mer e sucessivamente escrita em um arquivo desaída resultando em uma lista de classificações fora do alvo pra todos sirR-NAs correspondendo às seqüências 19mer de entrada.

A fim de gerar uma classificação de sirRNAs, classificações forado alvo deram entrada em uma tabela de resultados. Todos sirRNAs foramfinalmente classificados de acordo com a descendência em relação à classi-ficação Dora do alvo e seqüências contendo estiramentos com mais de 3 Gsem uma fileira foram excluídas da seleção.

Os 156 sirRNAs com uma classificação fora do alvo de >=3 fo-ram selecionados e sintetizados (Tabela 1).<table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table>Síntese de dsRNA

Fonte de Reaqentes

Quando a fonte de um regente não é fornecida aqui especifica-mente, tal reagente pode ser obtido de qualquer fornecedor de reagentespara biologia molecular em um padrão de qualidade/pureza para aplicaçãona biologia molecular.

Síntese de sirRNA

RNAs filamentados simples foram produzidos por síntese de fa-se sólida em uma escala de 1 μιτιοΙ empregando um sintetizador Expedite8909 (Applied Biosystems1 Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Alema-nha) e vidro puro controlado (CPG, 500Â, Proligo Biochemie GmbH, Ham-burg, Alemanha) como suporte sólido. RNA e RNA contendo nucleotídeos 2'-O-metila foram gerados por síntese de fase sólida empregando as fosfora-miditas correspondentes e fosforamiditas 2'-0-metila, respectivamente (Pro-ligo Biochemie GmbH, Hamburg, Alemanha). Esses blocos de construçãoforam incorporados em sítios seletivos dentro da seqüência da cadeia deoligoribonucleotídeo empregando química de fosforamidita de nucleosídeopadrão, tal como descrito em Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,Beaucage, S.L. e outros (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY,USA. Ligações fosforotioato foram introduzidas por substituição da soluçãode oxidação de iodo com uma solução do reagente Beaucage (ChruachemLtd, Glasgow, Reino Unido) em acetonitrila (1%). Reagentes auxiliares adi-cionais foram obtidos da Mallinckrodt Baker (Griesheim, Alemanha).

Desproteção e purificação dos oligoribonucleotídeos brutos portroca de ânion HPLC foram realizadas de acordo com procedimentos esta-belecidos. Rendimentos e concentrações foram determinados por absorçãode UV de uma solução do respectivo RNA a um comprimento de onda de260 nm empregando um fotômetro espectral (DU 640B, Beckman CoulterGmbH, UnterschIeiBheim, Alemanha). Duplo filamento de RNA foi geradopor mistura de uma solução equimolar de filamentos complementares notampão de saturação (20 mM fosfato de sódio, pH 6,8; 100 mM cloreto desódio), aquecida em um banho de água a 85 - 90°C por 3 minutos e resfria-da a temperatura ambiente por um período de 3 - 4 horas. A solução de RNAsaturada foi armazenada a -20°C até ser empregada.

Para a síntese de sirRNAs conjugados com 3'-colesterol (referi-do aqui como -Col-31) foi empregado um suporte sólido apropriadamentemodificado para síntese de RNA. O suporte sólido modificado foi preparadocomo se segue:

Dietil-2-azabutano-1,4-dicarboxilato AA

<formula>formula see original document page 59</formula>

Uma solução aquosa de hidróxido de sódio a 4,7M foi adiciona-da em uma solução resfriada em gelo, agitada de cloridrato de glicinato deetila (32,19 g, 0,23 mol) em água (50 mL). Então, acrilato de etila (23,1 g,0,23 mol) foi adicionado e a mistura foi agitada à temperatura ambiente até otérmino da reação foi determinado por TLC. Após 19 horas a solução foi di-vidida com diclorometano (3 χ 100 mL). A camada orgânica foi seca comsulfato de sódio anidro, filtrada e evaporada. O resíduo foi destilado parafornecer AA (28,8 g, 61 %).

Éster etílico AB do ácido 3-{etoxicarbonilmetil-[6-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonil-amino)-hexanoil]-amino}-propiônico AB

<formula>formula see original document page 59</formula>

Ácido hexanóico fmoc-6-amino (9,12 g, 25,83 mmols) foi dissol-vido em diclorometano (50 mL) e resfriado com gelo. Diisopropilcarbodimida(3,25 g, 3,99 mL, 25,83 mmols) foi adicionada à solução a 0°C. Ela foi entãoseguida por adição de dietil-azabutano-1,4-dicarboxilato (5 g, 24,6 mmols) edimetilamino piridina (0,305 g, 2,5 mmols). A solução foi trazida para a tem-peratura ambiente e agitada adicionalmente por 6 horas. O término da rea-ção foi determinado por TLC. A mistura de reação foi concentrada sob vácuoe acetato de etila foi adicionado para precipitar diisopropil uréia. A suspen-são foi filtrada. O filtrado foi lavado com ácido clorídrico aquoso a 5%, bicar-bonato de sódio a 5% e água. A camada orgânica combinada foi seca sobresulfato de sódio e concentrada para fornecer o produto bruto que foi purifica-do por cromatografia de coluna (50% EtOAC/Hexanos) para render 11,87 g(88%) de AB.

Éster etílico do ácido 3-[(6-amino-hexanoil)-etoxicarbonilmetil-amino]-propiônico AC

<formula>formula see original document page 60</formula>

Éster etílico do ácido 3-{etoxicarbonilmetil-[6-(9H-fluoren-9-ilme-toxicarbonilamino)-hexanoil]-amino}-propiônico AB (11,5 g, 21,3 mmols) foidissolvido em piperidina a 20% em dimetilformamida a 0°C. A solução foiagitada continuamente por 1 hora. A mistura de reação foi concentrada sobvácuo, água foi adicionada ao resíduo e o produto foi extraído com acetatode etila. O produto bruto foi purificado por conversão em seu sal cloridrato.

Éster etílico do ácido 3-({6-[17-(1,5-Dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecaidro-1 H-ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}etoxicarbonilmetil-amino)-propiônico AD

<formula>formula see original document page 60</formula>

O sal cloridrato de éster etílico do ácido 3-[(6-amino-hexanoil)-etoxicarbonilmetil-amino]-propiônico AC (4,7 g, 14,8 mmols) foi absorvido emdiclorometano. A suspensão foi resfriada a 0°C em gelo. Diisopropiletilaminafoi adicionada à suspensão (3,87 g, 5,2 mL, 30 mmols). Cloroformato de co-Iesterila foi adicionado à solução resultante (6,675 g, 14,8 mmols). A misturade reação foi agitada por toda a noite. A mistura de reação foi diluída comdiclorometano e lavada com ácido clorídrico a 10%. O produto foi purificadopor cromatografia instantânea (10,3 g, 92%).

Éster etílico do ácido 1-{6-17.(1,5-Dimetil-hexiO-10.13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecaidro-1H-ciclopenta[a] fenantren-3-iloxi-carbonilamino]-hexanoil}-4-oxo-pirrolidina-3-carboxílico AE

<formula>formula see original document page 61</formula>

T-butóxido de potássio (1,1 g, 9,8 mmols) foi transformado empasta em 30 mL de toluene seco. A mistura foi resfriada a 0°C em gelo e 5 g(6,6 mmols) de diéster AD foi adicionado lentamente com agitação dentro de20 minutos. A temperatura foi mantida abaixo de 5°C durante a adição. Aagitação continuou por 30 minutos a 0°C e 1 mL de ácido acético glacial foiadicionado, seguido imediatamente por 4 g de NaH2PO4-H2O em 40 mL deágua. A mistura resultante foi extraída duas vezes com 100 mL de dicloro-metano cada vez e os extratos orgânicos combinados foram lavados duasvezes com 10 mL de tampão fosfato cada vez, secos e evaporados à secu-ra. O resíduo foi dissolvido em 60 mL de tolueno e evaporado à secura. Oresíduo foi dissolvido em 60 mL de tolueno, resfriado a 0°C e extraído comtrês porções de 50 mL de tampão carbonato frio, pH 9,5. Os extratos aquo-sos foram ajustados para pH 3 com ácido fosfórico e extraídos com cincoporções de 40 mL de clorofórmio que foram combinados, secos e evapora-dos à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna empre-gando acetato de etila a 25%/hexano para fornecer 1,9 g de b-cetoéster(39%).

Éster 17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecaidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-il do éster do ácido[6-(3-hidróxi-4-hidroximetil-pirrotidin-1 -il)-6-oxo-hexil]-carbâmico AF

<formula>formula see original document page 62</formula>

Metanol (2 mL) foi adicionado gota a gota por um período de 1hora a uma mistura de refluxo de b-cetoéster AE (1,5 g, 2,2 mmols) e boroi-dreto de sódio (0,226 g, 6 mmols) em tetraidrofurano (10 mL). A agitaçãocontinuou em temperatura de refluxo por 1 hora. Após o resfriamento a tem-peratura ambiente, 1 N HCI (12,5 mL) foi adicionado, a mistura foi extraídacom acetato de etila (3 χ 40 mL). A camada de acetato de etila foi seca so-bre sulfato de sódio anidro e concentrada sob vácuo para render o produtoque foi purificado por cromatografia de coluna (10% MeOH/CHCI3) (89%).

Éster 17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecaidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-il AG do ácido (6-{3-[Bis-(4-metóxi-fenil)-fenil-metoximetil]-4-hidróxi-pirrolidin-1-il}-6-oxo-hexil)-carbâmico

<formula>formula see original document page 62</formula>

Diol AF (1,25 gm 1,994 mmol) foi seco por evaporação com piri-dina (2x5 mL) in vácuo. Piridina anidra (10 mL) e cloreto de 4,4'-dime-toxitritila (0,724 g, 2,13 mmols) foram adicionados com agitação. A reação foirealizada à temperatura ambiente por toda a noite. A reação foi saturada poradição de metanol. A mistura de reação foi concentrada sob vácuo e o diclo-rometano residual (50 mL) foi adicionado. A camada orgânica foi lavada com1M de bicarbonato de sódio aquoso. A camada orgânica foi seca sobre sul-fato de sódio anidro, filtrada e concentrada. A piridina residual foi removidapor evaporação com tolueno. O produto bruto foi purificado por cromatogra-fia de coluna (2% MeOH/Clorofórmio, Rf = 0,5 em 5% MeOH/CHCI3) (1,75 g, 95%).

Éster do ácido mono-(4-[bis-(4-metóxi-fenil)-fenil-metoximetil]-1-{6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-te-tradecaidro-1 H ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}-pirroli-din-3-il) succínico AH

<formula>formula see original document page 63</formula>

O composto AG (1,0 g, 1,05 mmol) foi misturado com anidridosuccínico (0,150 g, 1,5 mmol) e DMAP (0,073 g, 0,6 mmol) e seco em vácuoa 40°C por toda noite. A mistura foi dissolvida em dicloroetano anidro (3 mL),trietilamina (0,318 g, 0,440 mL, 3,15 mmols) foi adicionado e uma solução foiagitada à temperatura ambiente sob atmosfera de argônio por 16 horas. Elafoi então diluída com diclorometano (40 mL) e lavada com ácido cítrico, a-quoso, gelado (5% em peso, 30 mL) e água (2 X 20 mL). A fase orgânica foiseca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada à secura. O resíduo foiusado como tal para a próxima etapa.

CPG Al derivatizado do cholesterol<formula>formula see original document page 64</formula>

Succinato AH (0,254 g, 0,242 mmol) foi dissolvido em uma mis-tura de diclorometano/acetonitrila (3:2, 3 mL). Aquela solução DMAP (0,0296g, 0,242 mmol) em acetonitrila (1,25 mL), 2,2'-Ditio-bis(5-nitropiridina) (0,075g, 0,242 mmol) em acetonitrila/dicloroetano (3:1, 1,25 mL) foram adicionadossucessivamente. À solução resultante foi adicionada trifenilfosfina em (0,064g, 0,242 mmol) em acetonitrila (0,6 mL). A mistura de reação se tornou decor laranja brilhante. A solução foi agitada mais rapidamenet empregandoum agitador de ação de pulso (5 minutos). Amina-CPG alquila de cadeialonga (LCAA-CPG) (1,5 g, 61 mM) foi adicionado. A suspensão foi agitadapor 2 horas. A CPG foi filtrada através de um funil sintetizado e lavada comacetonitrila, diclorometano e éter sucessivamente. Grupos amino não-reagi-dos foram mascarados empregando anidrido acético/piridina. A carga obtidade CPG foi medida por realização da medição de UV (37 mM/g).

A síntese de sirRNAs portando grupo bisdecilamida do ácidododecanóico 5'-12 (referida aqui como "5'-C32-") ou um grupo derivado de5'-colesterila (referido aqui como "5'-Col-") foi realizada conforme descrito noWO 2004/065601, exceto que, para o derivado de colesterila, a etapa deoxidação foi realizada empregando um reagente Beaucage, a fim de introdu-zir uma ligação de fosforotioato em uma extremidade 5' do oligômero do áci-do nucléico.

Vetores de expressão de dsRNA

Em outro aspecto da invenção, as moléculas de dsRNA especí-ficas de E6AP que modulam a atividade de expressão gênica de E6AP sãoexpressas das unidades de transcrição inseridas no DNA ou vetores de RNA(vide, por exemplo, Couture, A, e outros, TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., eoutros, Publicação PCT Internacional número WO 00/22113, Conrad, Publi-cação PCT Internacional número WO 00/22114, e Conrad, Patente US nú-mero 6.054.299). Esses transgenes podem ser introduzidos como uma cons-trução linear, um plasmídeo ou um vetor virótico, que pode ser incorporado eherdado como um transgene integrado no genoma hospedeiro. O transgenepode também ser construído para permitir que o mesmo seja inibido comoum plasmídeo extracromssômico (Gassmann, e outros, Proc. Natl. Acad.Sei. USA (1995) 92:1292).

Os filamentos individuais de um dsRNA podem também sertranscritos por promotores nos dois vetores de expressão separada e co-transfectados em um célula alvo. Alternativamente, cada filamento individualdo dsRNA pode ser transcrito pelos promotores ambos os quais estão locali-zados no mesmo plasmídeo de expressão. Em uma concretização preferida,um dsRNA é expresso como uma repetição invertida ligada por uma se-qüência de polinucleotídeo de ligante, tal que dsRNA possui uma haste eestrutura em laço.

Os vetores de expressão de dsRNA recombinante são geral-mente plasmídeos de DNA ou vetores viróticos. Os vetors viróticos expres-sando dsRNA podem ser construídos com base, porém não limitado ao vírusadeno associado (para revisão, vide Muzyczka, e outros, Curr. Topics Micro.Immunol. (1992) 158:97-129)); adenovírus (vide, por exemplo, Berkner, eoutros, BioTechniques (1998) 6:616), Rosenfeld e outros (1991, Science252:431-434), e Rosenfeld e outros (1992), Cell 68:143-155)); ou alfavírusbem como outros conhecidos na técnica. Os retrovírus foram usados paraintroduzir uma variedade de genes em muitos tipos de célula diferentes, in-cluindo células epiteliais in vitro e/ou in vivo (vide, por exemplo, Eglitis, e ou-tros, Science (1985) 230:1395-1398; Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad.Sei. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson e outros, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 85:3014-3018; Armentano e outros, 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA87:61416145; Huber e outros, 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:8039-8043; Ferry e outros, 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:8377-8381; Chow-dhury e outros, 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. e outros,1992, Proc. Nad. Acad. Sei. USA 89:7640-19; Kay e outros, 1992, HumanGene Therapy 3:641-647; Dai e outros, 1992, Proc. Natl.Acad. Sei. USA89:10892-10895; Hwu e outros, 1993, J. Immunol. 150:4104-4115; PatenteUS número 4.868.116; Patente US número 4.980.286; Pedido PCT WO89/07136; Pedido PCT WO 89/02468; Pedido PCT WO 89/05345; e PedidoPCT WO 92/07573). Retrovetores viróticos recombinantes capazes detransdução e expressão dos genes inseridos no genoma de uma célula po-dem ser produzidos por transfecção do genoma retroviral recombinante naslinhagens de célula de embalamento apropriadas, tais como, PA317 e Psi-CRIP (Comette e outros, 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone e outros,1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6349). Adenovetores viróticos recombi-nantes podem ser empregados para infectar uma ampla variedade de célu-las e tecidos em hospedeiros sucessivos (por exemplo, rato, hamster, cão, echimpanzes) (Hsu e outros, 1992, J. Infectious Disease, 166:769), e tambémtem a vantagem de não requerem células mitoticamente ativas para infecção.

O promotor acionando a expressão de dsRNA em um plasmídeode DNA ou vetor virótico da invenção pode ser uma RNA polimerase I euca-riótica (por exemplo, promotor de RNA ribossômico), RNA polimerase Il (porexemplo, promotor de CMV anterior ou promotor actina ou promotor de U1snRNA) ou geralmente promotor RNA polimerase Ill (por exemplo, promotorU6 snRNA ou 7SK- RNA) ou um promotor procariótico, por exemplo, o pro-motor de T7, provido pelo plasmádio de expressão também codifica T7 RNApolimerase necessária para transcrição de um promotor de T7. O promotortambém pode direcionar a expressão transgênica para o pâncreas (Bucchinie outros, 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:2511-2515)).

Além disso, a expressão do transgene pode ser precisamenteregulada, por exemplo, por emprego de uma seqüência reguladora induzívele sistemas de expressão, tal com, uma seqüência reguladora que é sensívelà determinados reguladores fisiológicos, por exemplo, circulando níveis deglicose ou hormônios (Docherty e outros, 1994, FASEB J. 8:20-24). Tais sis-temas de expressão induzíveis, apropriados para o controle da expressãotransgênica nas células ou nos mamíferos incluem regulação por eedisona,por estrogênio, progesterona, tetraciclina, indutores químicos ou dimerizaçãoe isopropil-beta-D1-tiogalactopiranosídeo (EPTG). Uma pessoa versada natécnica seria capaz de escolher a seqüência reguladora/promotora com baseno uso pretendido do transgene de dsRNA.

154561

Geralmente, os vetores recombinantes capazes de expressarmoléculas de dsRNA são fornecidos como descrito abaixo e persistem nascélulas alvos. Alternativamente, podem ser utilizados vetores virais que for-necem expressão transitória de moléculas de dsRNA. Tais vetores podemser administrados repetidamente quando necessário. Uma vez expressos, osdsRNAs se ligam ao RNA alvo e modulam sua função ou sua expressão. Ofornecimento de vetores que expressam dsRNAs pode ser sistêmico, tal co-mo através de administração intravenosa ou intramuscular, através de admi-nistração às células aivos explantadas do paciente seguida pela reintrodu-ção no paciente ou através de quaisquer outros meios que permitam a intro-dução em uma célula alvo desejada.

Os plasmídeos de DNA de expressão de dsRNAs são tipicamen-te transfectados nas células alvos na forma de um complexo com carreado-res lipídicos catiônicos (por exemplo, Oligofectamina) ou carreadores à basede lipídeos não catiônicos (por exemplo, Transit-TKO™). Várias transfec-ções com lipídeos para nocautes mediados por dsRNA que se direcionam aregiões diferentes de um único gene E6AP ou de vários genes E6AP duranteum período de uma semana ou mais também são consideradas pela inven-ção. A introdução bem sucedida dos vetores da invenção nas células hospe-deiras pode ser monitorada utilizando vários métodos conhecidos. Por e-xemplo, a transfecção transitória pode ser sinalizada com um repórter, talcomo um marcador fluorescente, tal como a Proteína Fluorescente Verde(GFP). A transfecção estável de células ex vivo pode ser garantida utilizandomarcadores que fornecem à célula transfectada resistência a fatores ambi-entais específicos (por exemplo, antibióticos e fármacos), tal como a resis-tência à higromicina B.

As moléculas de dsRNA específicas a E6AP também podem serinseridas em vetores e utilizadas como vetores de terapia gênica para paci-entes humanos. Os vetores de terapia gênica podem ser fornecidos a umindivíduo, por exemplo, através de injeção intravenosa, administração local(vide a Patente U.S. N- 5.328.470) ou através de injeção estereotática (vide,por exemplo, Chen e outros (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:3054-3057). A composição farmacêutica do vetor de terapia gênica pode incluir ovetor de terapia gênica em um diluente aceitável ou pode compreender umamatriz de liberação lenta na qual o veículo de fornecimento gênico está em-bebido.

Alternativamente, quando o vetor de fornecimento gênico com-pleto puder ser produzido intacto partindo de células recombinantes, por e-xemplo, vetores retrovirais, a preparação farmacêutica pode incluir uma oumais células que produzem o sistema de fornecimento gênico,

Seleção de siRNA de E6AP em células HCT-116

As células HCT-116 foram obtidas na DSMZ (Deutsche Sam-mlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) (Braunschweig, Alemanha, N2de cat ACC 581) e cultivadas em McCoys (Biochrom AG, Berlim, Alemanha,N- de cat. F1015) suplementado para conter 10% de soro fetal de bezerro(FCS), Penicilina 100 U/mL, Estreptomicina 100 pg/mL e 2 mM de L-Glutamina a 37°C em uma atmosfera com 5% de CO2 em uma incubadoraumedecida.

Para a transfecção com siRNA, as células HCT-116 foram se-meadas a uma densidade de 2,0 χ 104 células/poço em placas de 96 poçose transfectadas diretamente. A transfecção do siRNA (30 nM e 3 nM para averificação de uma única dose) foi realizada com Iipofectamina 2000 (Invitro-gen) como descrito pelo fabricante.

24 horas após a transfecção as células HCT-116 foram Iisadas eos níveis de expressão do mRNA de E6AP foram quantificados com o Quan-tigene Explore Kit (Panomics, Inc. (Fremont, CA) (anteriormente Genospec-tra, Inc.)) de acordo com o protocolo padronizado. Os níveis de mRNA deE6AP foram normalizados ao do mRNA de GAP-DH. Para cada siRNA foramcoletados quatro pontos de dados individuais. Os duplexes de siRNA nãorelacionados ao gene E6AP foram utilizados como controle. A atividade deum certo duplex de siRNA específico ao E6AP foi expressa na forma daconcentração percentual de mRNA de E6AP nas células tratadas em relaçãoà concentração de mRNA de E6AP em células tratadas com o duplex desiRNA de controle.

A Tabela 2 abaixo fornece os resultados. Muitas moléculas desiRNA ativas que se direcionam ao gene E6AP foram identificadas.

Tabela 2 Atividade de dsRNA que se direciona ao E6AP

<table>table see original document page 69</column></row><table>AL-DP-7393 22,40 9,77 30,69 8,51AL-DP-7511 26,50 6,02 30,88 6,43AL-DP-7454 25,16 14,85 31,09 8,75AL-DP-7450 20,09 8,43 32,10 8,57AL-DP-7533 26,93 5,86 33,91 5,52AL-DP-7485 27,45 4,36 34,12 10,28AL-DP-7495 28,51 13,42 34,45 11,20AL-DP-7456 16,82 5,62 34,54 10,30AL-DP-7538 29,04 5,12 34,71 6,42AL-DP-7377 22,98 8,19 35,31 12,53AL-DP-7405 21,93 10,30 35,66 15,22AL-DP-7392 23,83 8,93 36,14 6,31AL-DP-7453 25,78 12,10 36,98 5,22AL-DP-7366 19,60 7,30 37,20 13,88AL-DP-7534 26,35 5,24 37,69 8,49AL-DP-7401 28,74 9,10 37,75 7,70AL-DP-7523 33,88 6,85 39,81 9,45AL-DP-7555 29,13 8,87 40,35 6,23AL-DP-7536 32,33 3,49 41,08 8,00AL-DP-7371 25,49 9,83 42,19 16,08AL-DP-7372 21,83 12,03 42,87 17,78AL-DP-7370 24,51 12,64 43,75 14,09AL-DP-7474 32,57 13,13 44,40 7,78AL-DP-7452 30,12 12,02 46,66 9,19AL-DP-7498 32,38 11,81 54,11 12,74AL-DP-7504 15,04 6,39 19,69 5,67AL-DP-7467 19,81 6,42 21,66 8,12AL-DP-7463 26,63 8,84 21,73 8,80AL-DP-7399 15,62 8,32 22,98 7,65AL-DP-7501 17,32 5,24 23,45 7,44AL-DP-7385 17,60 5,11 28,00 11,84AL-DP-7480 21,89 8,21 29,42 8,64AL-DP-7528 26,47 2,94 30,76 10,87AL-DP-7535 26,65 3,13 31,77 4,34AL-DP-7403 24,10 6,21 38,79 14,41AL-DP-7380 29,84 7,65 40,42 5,72AL-DP-7469 17,18 7,41 21,13 6,29AL-DP-7518 15,71 6,00 21,89 6,68AL-DP-7464 29,18 12,30 22,13 8,99AL-DP-7560 17,33 4,85 24,84 5,80AL-DP-7461 30,55 8,26 25,62 9,48AL-DP-7472 25,17 11,50 26,31 8,61AL-DP-7459 29,60 7,71 27,27 9,68AL-DP-7381 17,29 6,63 27,31 7,42AL-DP-7515 32,18 10,22 29,76 6,01AL-DP-7517 29,75 6,99 29,87 5,69AL-DP-7521 28,60 8,06 31,68 5,72AL-DP-7530 31,09 8,09 31,94 3,36AL-DP-7388 22,81 3,80 32,28 6,23AL-DP-7451 22,66 8,92 32,45 8,26AL-DP-7484 26,77 13 ,00

AL-DP-7376 34,18 14,11

AL-DP-7500 32,69 8,47

AL-DP-7776 17,91 4,95

AL-DP-7777 21,10 7,60

AL-DP-7510 34,70 5,83

AL-DP-7507 35,11 6,78

AL-DP-7479 35,29 13,76

AL-DP-7542 36,32 5,00

AL-DP-7494 38,34 12,68

AL-DP-7531 38,58 14,26

AL-DP-7373 39,04 16,08

AL-DP-7508 39,95 12,87

AL-DP-7487 40,48 15,20

AL-DP-7375 41,19 15,06

AL-DP-7462 41,61 17,23

AL-DP-7513 41,69 9,15

AL-DP-7455 43,35 12,72

AL-DP-7374 43,37 12,26

AL-DP-7475 43,68 11,45

AL-DP-7369 43,99 15,44

AL-DP-7466 44,27 15,53

AL-DP-7491 45,06 10,32

AL-DP-7482 45,06 12,37

AL-DP-7398 45,79 9,50

AL-DP-7471 46,11 13,53

AL-DP-7383 46,87 20,08

AL-DP-7367 46,96 16,88

AL-DP-7386 47,46 10,01

AL-DP-7525 49,60 14,11

AL-DP-7486 49,64 8,95

AL-DP-7539 49,97 12,73

AL-DP-7483 49,97 12,50

AL-DP-7503 51,28 7,08

AL-DP-7537 53,19 7,75

AL-DP-7396 54,11 13,02

AL-DP-7404 54,96 17,72

AL-DP-7543 55,48 9,23

AL-DP-7379 55,82 18,47

AL-DP-7502 56,15 16,52

AL-DP-7519 56,15 13,30

AL-DP-7506 57,24 21,04

AL-DP-7457 57,30 15,19

AL-DP-7468 57,83 15,40

AL-DP-7368 59,38 22,50

AL-DP-7402 59,57 13,42

AL-DP-7481 60,17 14,54

AL-DP-7465 61,44 28,49

AL-DP-7496 61,65 17,78

AL-DP-7549 61,90 12,36<table>table see original document page 72</column></row><table>

Teste de E6AP alvejando dsRNA Modificados QuimicamentedsRNA modificados quimicamente foram testados para identifi-car suas capacidades relativas de reduzir o nível de exprssão de E6AP codi-ficando mRNA em um célula. As condições de ensaio descritas acima paraas céiuias HCT-116 foram empregadas. A atividade de um dado duplexo desirRNA específico para E6AP foi expressa como concentração de porcent-gem de E6AP mRNA nas células tratadas com o duplexo sirRNA de controle.

1. dsRNA Quimicamente

A tabela 3 estabelece as composições dsRNA da invenção.Nessa tabela, a seqüência não-modificada é seguida pela mesma seqüênciacontendo uma ou mais modificações de nucleotídeo.

Tabela 3

Letras maiúsculas: ribonucleotídeo não-modificado (exceto paraT que é um desoxiribonucleotídeo não-modificado)

Letras minúsculas: ribonucleotídeo portando substituinte 2'-0-metila na fração ribose.

s: Indica posição da ligação do internucleotídeo fosforotioatocol: fração de colesterol conjugada ao 3' ribonucleotídeo.

"Nome duplex" significa o nome da composição formado por hi-bridização específia do filamento de sentido indicado e o filamento de senti-do negativo indicado.<table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table><table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table><table>table see original document page 79</column></row><table>A tabela 4 estabelece os resultados do teste dos dsRNA listadosna Tabela 3.

Tabela 4

<table>table see original document page 80</column></row><table><table>table see original document page 81</column></row><table><table>table see original document page 82</column></row><table><table>table see original document page 83</column></row><table>

Projeto da Expressão Gênica de HPV E1 Alvejando sirRNA

A tabela 5 etabelece composições dsRNA da invenção.<table>table see original document page 84</column></row><table><table>table see original document page 85</column></row><table><table>table see original document page 86</column></row><table><table>table see original document page 87</column></row><table><table>table see original document page 88</column></row><table><table>table see original document page 89</column></row><table><table>table see original document page 90</column></row><table>Teste da Expressão Gênica de sirRNA alvejando E1 HPV

dsRNA modificados e não-modificados quimicamente foram tes-tados para identificar suas capacidades relativas para reduzir o nível de ex-pressão gênica de E1 HPV codificando mRNA codificando HPV E1 em umacélula.

As condições de ensaio empregadas foram como se segue:C33A células foram obtidas de ATCC. As seqüências codificando E6 e E1 deHPV16 foram clonadas no vetor pNAS-055 vector (Husken e outros. NucleicAcids Research, 31:e102, 2003), para expressão como transcrições de fusãoYFP. Os plasmídeos resultantes foram transfectados nas células C33A cells,e linhagens estáveis expressando essas transcrições de fusão foram deriv-dos da seleção de Zeocina, de acordo com o protocolo do fabricante (Invi-trogen). Por transfecção com sirRNA contra E6 de HPV ou E1 de HPV16, asrespectivas células foram semeadas a uma densidade de 2,0 χ 104 célu-Ias/poço em placas de 96 poços e transfectadas diretamente. Transfecçãode sirRNA (30nM, 3nM ou 300pm conforme indicado) foi realizada em umadose simples com Iipofectamina 2000® (Invitrogen), conforme descrito pelofabricante.

24 horas após transfecção, as células foram Iisadas e os níveisde expressão de mRNA em fusão foram quantificados com o Kit da Quanti-gene Explore (Panomics, Inc. (Fremont, CA)(formerly Genospectra, Inc.))empregando uma sonda direcionada contra YFP, de acordo com o protocolopadrão. Níevis mRNA de YFP em fusão foram normalizados para mRNA deGAP-DH. Para cada sirRNA foram coletados quatro pontos de dados indivi-duais. Os duplexos de sirRNA não correlatos aos genes E1 ou E6 de HPV16foram usados como controle. A atividade de um dado duplexo de sirRNA foiexpressa como concentração da porcentagem de mRNA de YFP em fusãonas células tratadas em relação à concentração do mesmo transcrito nascélulas tratadas com o duplexo sirRNA de controle.Tabela 6 mostra os resultados do teste de E1 de dsRNA da invenção.

<table>table see original document page 92</column></row><table>ND-9109 97,63 14,18ND-9110 47,58 7,48ND-9111 65,14 15,02ND-9112 30,24 7,33ND-9113 31,69 10,80ND-9114 108,54 7,17ND-9115 87,16 14,74ND-9116 56,35 14,69ND-9117 33,79 8,42ND-9118 65,12 19,60ND-9119 33,37 12,37ND-9120 70,98 18,74ND-9121 39,37 10,06ND-9122 33,24 14,79ND-9123 20,37 7,53ND-9124 30,47 5,18ND-9125 26,22 5,56ND-9126 29,86 5,15ND-9127 84,95 22,37ND-9128 35,14 6,10ND-9129 49,41 15,75ND-9130 51.54 12.31ND-9131 45,51 7,96ND-9132 81,48 16,52ND-9133 46,79 13,27ND-9134 63,22 32,12ND-9135 118,82 19,88ND-9136 47,83 12,16ND-9137 65,11 15,44ND-9138 92,31 36,27ND-9139 42,01 10,70ND-9140 40,54 7,24ND-9141 101,31 24,39ND-9142 33,83 7,06ND-9143 86,43 16,50ND-9144 33,94 11,74ND-9145 41,93 12,85ND-9146 118,24 29,81ND-9147 69,90 30,13ND-9148 40,74 6,28ND-9149 65,26 10,10ND-9150 36,62 4,85ND-9151 27,83 4,48ND-9152 88,99 9,86ND-9153 66,45 33,75ND-9154 45,42 8,86ND-9155 63,55 8,36ND-9156 53,00 7,71ND-9157 32,74 7,39ND-9158 102,06 26,87ND-9159 59,47 10,16ND-9160 31,23 7,52<table>table see original document page 94</column></row><table>AL-DP-8054 45,00 4,56AL-DP-8055 51,64 9,55AL-DP-8056 35,51 4,67AL-DP-8057 45,89 8,82AL-DP-8058 38,47 4,44AL-DP-8059 34,97 7,85AL-DP-8060 66,44 14,39AL-DP-8061 52,17 12,80AL-DP-8062 100,52 25,88AL-DP-8063 43,83 8,22AL-DP-8064 26,25 5,84AL-DP-8065 107,74 32,53AL-DP-8066 94,13 13,45AL-DP-8067 107,09 17,49AL-DP-8068 48,99 10,40AL-DP-8069 68,14 19,39AL-DP-8070 60,42 11,52AL-DP-8071 71,76 13,75AL-DP-8072 62,25 6,16AL-DP-8073 31,33 7,21AL-DP-8074 47,97 11,55AL-DP-8075 51,35 14,67AL-DP-8078 50,40 17,25AL-DP-8077 38,99 8,15AL-DP-8078 50,93 11,54AL-DP-8079 32,27 10,82AL-DP-8080 33,91 10,48AL-DP-8081 31,45 6,72AL-DP-8082 26,41 7,99AL-DP-8083 86,75 6,66AL-DP-8084 112,73 25,79AL-DP-8085 112,33 22,53AL-DP-8086 39,84 12,22AL-DP-8087 - 104,24 29,47AL-DP-8088 59,29 13,99AL-DP-8089 114,08 24,06AL-DP-8090 35,69 6,75AL-DP-8091 47,28 12,14AL-DP-8092 92,85 19,28AL-DP-8093 102,59 15,83AL-DP-8094 87,51 18,86AL-DP-8095 27,99 8,27AL-DP-8096 31,74 7,52AL-DP-8097 40,29 9,18

Projeto da Expressão Gênica E6 HPV de Alvejamentode dsRNAA tabela 7 estabelece as composições de dsRNA da invenção.<table>table see original document page 96</column></row><table><table>table see original document page 97</column></row><table><table>table see original document page 98</column></row><table><table>table see original document page 99</column></row><table><table>table see original document page 100</column></row><table><table>table see original document page 101</column></row><table><table>table see original document page 102</column></row><table>Teste da Expressão Gênica de sirRNA alvejando E6 HPV

DsRNA modificados e não-modificados quimicamente foram tes-tados para identificar suas capacidades relativas para reduzir o nível de ex-pressão gênica de E6 HPV codificando mRNA codificando HPV E1 em umacélula.

As condições de ensaio empregadas foram como se segue:C33A células foram obtidas de ATCC. As seqüências codifican-do E6 e E1 de HPV16 foram clonadas no vetor pNAS-055 vector (Husken eoutros. Nucleic Acids Research, 31:e102, 2003), para expressão comotranscrições de fusão YFP. Os.plasmídeos resultantes foram transfectadosnas células C33A cells, e linhagens estáveis exprssando essas transcriçõesde fusão foram derivdos da seleção de Zeocina, de acordo com o protocolodo fabricante (Invitrogen). Por transfecção com sirRNA contra E6 de HPV ouEl de HPVI6, as respectivas células foram semeadas a uma densidade de2,0 χ 104 células/poço em placas de 96 poços e transfectadas diretamente.Transfecção de sirRNA (30nM, 3nM ou 300pm conforme indicado) foi reali-zada em uma dose simples com Iipofectamina 2000® (Invitrogen), conformedescrito pelo fabricante.

24 horas após transfecção, as células foram Iisadas e os níveisde expressão de mRNA em fusão foram quantificados com o Kit da Quanti-gene Explore (Panomics, Inc. (Fremont, CA) (anteriormente Genospectra,Inc.)) empregando uma sonda direcionada contra YFP, de acordo com o pro-tocolo padrão. Níevis mRNA de YFP em fusão foram normalizados paramRNA de GAP-DH. Para cada sirRNA foram coletados quarto pontos dedados individuais. Os duplexos de sirRNA não correlatos aos genes E1 ouE6 de HPV16 foram usados como controle. A atividade de um dado duplexode sirRNA foi expressa como concentração da porcentagem de mRNA deY.FP em fusão nas células tratadas em relação à concentração do mesmotranscrito nas células tratadas com o duplexo sirRNA de controle.A tabela 8 mostra os resultados do teste de E6 dsRNA da invenção.

Tabela 8

<table>table see original document page 104</column></row><table>ND-8939 11,51 2,04 29,57 10,38ND-8940 12,80 2,94 29,67 6,73ND-8941 19,46 2,91 43,13 3,64ND-8942 96,02 29,93 85,34 4,57ND-8943 13,44 3,90 19,03 5,18ND-8944 14,35 2,09 20,03 4,68ND-8945 11,45 1,98 23,80 8,36ND-8946 15,43 2,27 43,12 13,34ND-8947 13,32 2,20 53,58 18,04ND-8948 12,85 3,18 23,22 6,79ND-8949 86,23 23,43 75,99 7,17ND-8950 29,49 7,99 47,19 14,70ND-8951 10,51 2,85 20,21 6,23ND-8952 12,10 2,74 28,82 9,06ND-8953 41,13 11,23 77,64 9,46ND-8954 46,52 8,41 81,61 14,93ND-8955 38,40 8,46 83,38 16,32ND-8956 12,13 2,23 21,94 9,54ND-8957 28,39 6,18 53,84 12,53ND-8958 36,41 9,92 55,67 8,77ND-8959 33,95 11,23 63,63 5,53ND-8960 13,63 2,39 26,49 9,24ND-8961 80,42 18,39 89,13 8,61ND-8962 33,00 4,18 82,57 9,01ND-8963 16,67 1,85 28,39 9,50ND-8964 14,17 2,58 43,74 14,37ND-8965 17,23 5,15 48,03 10,97ND-8966 23,01 5,10 53,86 10,10ND-8967 18,68 5,13 23,30 6,20ND-8968 10,99 1,83 28,22 9,33ND-8969 13,75 2,67 32,62 10,53ND-8970 11,02 2,68 29,14 10,73ND-8971 21,71 3,11 57,75 10,54ND-8972 17,10 3,20 52,10 10,84ND-8987 40,36 7,25 91,12 9,07ND-8988 20,54 5,27 30,76 12,23ND-8989 36,60 7,23 74,41 8,61ND-8990 17,55 8,33 61,02 11,13ND-8991 11,29 2,87 19,03 5,98ND-8992 14,49 3,37 44,53 14,74ND-8993 18,45 5,75 48,07 6,79ND-8994 13,16 1,80 25,92 7,94ND-8995 52,21 5,93 90,43 4,86ND-8996 32,77 6,96 57,54 7,12ND-8997 14,45 1,50 20,63 4,28ND-8998 137,83 33,37 90,09 14,65ND-8999 82,01 13,74 85,69 10,39ND-9000 69,77 21,32 83,16 14,34<table>table see original document page 106</column></row><table>ND-9049 82,93 21,46 87,79 7,07ND-9050 18,51 3,33 40,70 10,96ND-9051 22,80 3,37 42,44 14,86ND-9052 12,61 3,78 37,58 13,35ND-9053 19,88 4,32 53,11 3,23ND-9054 33,65 8,32 59,71 6,42ND-9055 22,61 7,41 27,44 7,04ND-9056 16,61 3,38 34,34 13,22ND-9057 25,51 6,29 51,45 10,10ND-9058 27,60 4,56 54,99 13,52ND-9059 23,83 4,36 84,76 13,88ND-9060 17,12 3,29 44,54 15,68AL-DP-7778 19,35 8,95 63,31 14,21AL-DP-7779 41,30 9,51 65,96 7,82AL-DP-7780 24,01 7,52 59,43 8,85AL-DP-7781 13,69 3,41 53,58 9,31AL-DP-7782 31,35 5,31 65,84 10,41AL-DP-7783 14,46 2,85 38,92 10,30AL-DP-7784 13,52 1,52 25,09 7,89AL-DP-7803 39,68 4,75 66,72 11,327804 12,56 3,96 26,81 6,28AL-DP-7805 13,92 2,22 35,87 8,95AL-DP-7807 35,54 4,95 70,94 11,01AL-DP-7808 81,47 9,77 96,18 10,87AL-DP-7810 15,14 2,12 37,66 16,19AL-DP-7812 12,89 1,99 25,18 12,05

Os versados na técnica estão familiarizados com os métodos ecomposições além daqueles especificamente estabelecidos na presente in-venão que permitirão praticar essa invenção no pleno escopo das reivindica-ções apensas aqui a seguir.

Claims

1. Filamento do ácido nucléico duplo (dsRNA) para inibir a ex-pressão gênica de E6AP humano em uma célula, em que o dsRNA compre-ende pelo menos duas seqüências que são complementares uma a outra eem que um filamento de sentido compreende uma primeira seqüência e umfilamento de sentido negativo compreende uma segunda seqüência compre-endendo uma região de complementariedade que é substancialmente com-plementar a pelo menos uma parte de um mRNA codificando E6AP, e emque a dita região de complementariedade possui menos de 30 nucleotídeosde comprimento e em que o dsRNA, mediante contato com uma célula ex-pressando a E6AP, inibe a expressão gênica de E6AP em pelo menos 40%.

2. DsRNA como definido na reivindicação 1, onde a primeira se-qüência é selecionada do grupo consistindo na Tabela 1 e a segunda se-qüência é selecionada do grupo consistindo em Tabela 1:

3. DsRNA como definido na reivindicação 1, em que o dsRNAcompreende pelo menos um nucleotídeo modificado.

4. DsRNA como definido na reivindicação 2, em que o dsRNAcompreende pelo menos um nucleotídeo modificado.

5. dsRNA de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que o nu-cleotídeo é escolhido do grupo de: um nucleotídeo 2'-0-metila modificado,um nucleotídeo compreendendo um grupo 5'-fosforotioato e um nucleotídeoterminal ligado a um derivado de colesterila ou grupo bisdecilamida ácidododecanóico.

6. dsRNA de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que o nu-cleotídeo modificado é escolhido do grupo de: um nucleotídeo modificadocom 2'-desóxi-2'-flúor, um nucleotídeo modificado com 2'-desóxi, um nucleo-tídeo travado, um nuclotídeo abásico, nucleotídeo modificado com 2'-amino,nucleotídeo modificado com 2'-alquila, nucleotídeo morfolino, um fosforoa-midato e uma base não-natural compreendendo nucleotídeo.

7. dsRNA de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que a pri-meira seqüência é selecionada do grupo consistindo em Tabela 1 e a se-gunda seqüência é selecionada do grupo consistindo em Tabela 1.

8. dsRNA de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que a pri-meira seqüência é selecionada do grupo consistindo em Tabela 1 e a se-gunda seqüência é selecionada do grupo consistindo em Tabela 1.

9. Célula compreendendo o dsRNA como definido na reivindicação 1.

10. Composição farmacêutica para inibir a expressão gênica deE6AP em um organismo, compreendendo um dsRNA e um veículo farma-ceuticamente aceitável, em que o dsRNA compreende pelo menos duas se-qüências que são complementares uma a outra e em que um filamento desentido compreende uma primeira seqüência e um filamento de sentido ne-gativo compreende uma segunda seqüência compreendendo uma região decomplementariedade que é substancialmente complementar a pelo menosuma parte de um mRNA codificando E6AP, e em que a dita região de com-plementariedade possui menos de 30 nucleotídeos de comprimento e emque o referido dsRNA, mediante contato com uma célula expressando o re-ferido E6AP, inibe a expressão gênica de E6AP gene em pelo menos 20%.

11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10,em que a primeira seqüência do dsRNA é selecionada do grupo consistindoem Tabela 1 e a segunda seqüência do dsRNA é selecionada do grupo con-sistindo em Tabela 1.

12. Composição farmacêutica de-acordo com a reivindicação 10,em que a primeira seqüência do dsRNA é selecionada do grupo consistindoem Tabela 1 e a segunda seqüência de dsRNA é selecionada do grupo con-sistindo em Tabela 1.

13. Método para inibir a expressão gênica E6AP em uma célula,o método compreendendo:(a) introdução à célula de um filamento do ácido nucléico du-plo (dsRNA), em que o dsRNA compreende pelo menosduas seqüências que são complementares uma a outra eem que um filamento de sentido compreende uma primeiraseqüência e um filamento de sentido negativo compreendeuma segunda seqüência compreendendo uma região decomplementariedade que é substancialmente complemen-tar a pelo menos uma parte de um mRNA codificandoE6AP, e onde a dita região de complementariedade possuimenos de 30 nucleotídeos de comprimento e em que odsRNA, mediante contato com uma célula expressando oreferido E6AP, inibe a expressão gênica de E6AP em pelomenos 40%; e(b) manutenção da célula produzida na etapa (a) por um tem-po suficiente para obter degradação da transcrição demRNA do gene E6AP, pelo que inibindo a expressão gêni-ca E6AP na célula.

14. Método para tratar, prevenir ou gerenciar processos patoló-gicos mediados por infecção decorrente do HPV compreendendo adminis-tração a um paciente que precise de tal tratamento de prevenção ou geren-ciamento de uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de umdsRNA, em que o dsRNA compreende pelo menos duas seqüências que sãocomplementares uma a outra e em que um filamento de sentido compreendeuma primeira seqüência e um filamento de sentido negativo compreendeuma segunda seqüência compreendendo uma região de complementarieda-de que é substancialmente complementar a pelo menos uma parte de ummRNA codificando E6AP,~e em que a dita região de complementariedadepossui menos de 30 nucleotídeos de comprimento e em que o dsRNA, me-diante contato com uma célula expressando o referido E6AP, inibe a ditaexpressão gênica de E6AP em pelo menos 40%.

15. Vetor para inibir a expressão gênica E6AP em uma célula, ovector compreendendo uma seqüência reguladora ligada operavelmente auma seqüência de nucleotídeo que codifica pelo menos um filamento de umdsRNA, em que um dos filamentos do dsRNA é substancialmente comple-mentar a pelo menos uma parte de um mRNA codificando E6AP e em que odsRNA possui menos de 30 pares de base de comprimento e em que o ds-RNA, mediante contato com uma célula expressando o E6AP, inibe a ditaexpressão gênica E6AP em pelo menos 40%.

16. Célula compreendendo o vetor como definido na reivindica-ção 5.

17. Filamento do ácido nucléico duplo (dsRNA) para reduzir onível de expressão de um gene E6AP humano em uma célula, em que o ds-RNA compreende pelo menos duas seqüências que são complementaresuma a outra e onde um filamento de sentido compreende uma primeira se-qüência e um filamento de sentido negativo compreende uma segunda se-qüência compreendendo uma região de complementariedade que é subs-tancialmente complementar a pelo menos uma parte de um mRNA codifi-cando E6AP, e em que o dsRNA, mediante contato.com uma célula expres-sando said E6AP, reduz o nível de expressão do gene E6AP.

18. dsRNA de acordo com a reivindicação 17, em que o contatoreduz o nível da dita expressão gênica de E6AP em pelo menos 40%.

19. dsRNA como definido na reivindicação 17, em que o contatoé realizado in vitro a 30 nM ou menos.

20. Composição farmacêutica para reduzir o nível de expressãogênica E6AP em um organismo, compreendendo o dsRNA como definido nareivindicação 17 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

21. Método para tratamento de um transtorno associado ao HPVcompreendendo administração a um paciente que precise de tal tratamento,de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um dsRNA como definido nareivindicação 17.

22. Método para tratamento de um transtorno associado aoE6AP, compreendendo administração a um paciente que precise de tal tra-tamento, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um dsRNA comodefinido na reivindicação 17.

23. dsRNA selecionado daqueles listados na Tabela 3.

24. Composição farmacêutica compreendendo o dsRNA comodefinido na reivindicação 23.

25. Método para tratamento de um transtorno associado ao HPVcompreendendo administração a um paciente que precise de tal tratamento,de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um dsRNA como definido nareivindicação 23.

26. DsRNA selecionado daqueles listados na Tabela 5.

27. Composição farmacêutica compreendendo o dsRNA comodefinido na reivindicação 26.

28. Método para tratamento de um transtorno associado ao HPVcompreendendo administração a um paciente que precise de tal tratamento,uma quantidade terapeuticamente eficaz de um dsRNA como definido nareivindicação 26.

29. dsRNA selecionado entre aqueles selecionados na Tabela 7.

30. Composição farmacêutica compreendendo o dsRNA comodefinido na reivindicação 29.

31. Método para tratamento de um transtorno associado ao HPVcompreendendo administração a um paciente que precise de tal tratamento,uma quantidade terapeuticamente eficaz de um dsRNA como definido nareivindicação 29.

32. Composição farmacêutica compreendendo pelo menos doisdsRNA selecionados dentre o dsRNA como definido na reivindicação 2, rei-vindicação 23, reivindicação 26 e reivindicação 29.

33. Método para tratamento de um transtorno associado ao HPVcompreendendo administração a um paciente que precise de tal tratamentode uma quantidade terapeuticamente- eficaz da composição farmacêuticacomo definido na reivindicação 32.

34. dsRNA de acordo com a reivindicação 26 ou reivindicação-29, em que o dsRNA compreende pelo menos um nucleotídeo modificado.

35. dsRNA de acordo com a reivindicação 34, em que o nucleo-tídeo modificado é escolhido do grupo de: um nucleotídeo modificado com-2'-0-metila, um nucleotídeo compreendendo um grupo 5'-fosforotioato e umnucleotídeo terminal ligado a um derivado de terminal nucleotídeo ligado aum derivado de colesterila ou grupo bisdecilamida do ácido dodecanóico.

36. dsRNA de acordo com a reivindicação 34, em que o nucleo-tídeo modificado é escolhido do grupo de: um nucleotídeo 2'-desóxi-2'-flúormodificado, um nucleotídeo 2'-desóxi modificado, um nucleotídeo travado,um nucleotídeo abásico, nucleotídeo modificado com 2'-amino, ncleotídeomodificado com 2'-alquila, nucleotídeo morfolino, um fosforoamidato e umnucleotídeo comprendendo base não-natural.