(qzwoz)
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO COS-
MÉTICO DE MICELAS DE PROTEÍNA DE SORO DE LEITE".
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se ao uso de micelas de proteína desoro de leite coalhado como agentes abrasivos, em particular em composi-ções cosméticas e a um processo para obtenção das ditas composições.
Antecedentes
Composições heterogêneas contendo agentes abrasivos taiscomo pastas granulares ou líquidos areentos são comumente usadas nocampo de cuidados de saúde e cosméticos.
O pedido de patente WO 03000215 descreve por exemplo, com-posição de pasta de dentes contendo como um agente abrasivo, pós inorgâ-nicos, de modo a remover o filme de proteína que se forma sobre superfíciesde dentes.
US 6036966 é relacionada com composições tópicas contendoum componente pó levemente abrasivo selecionado em pós inorgânicos,sabões de metais ou pulverizados orgânicos como celulose microcristalinapara re-texturização de pele.
Ainda existem muitas áreas inexploradas no campo de produtosgranulares e seus usos.
Por isso é um objeto da presente invenção prover uma alternati-va para os meios abrasivos usados na técnica.Sumário da Invenção
Da mesma maneira, este objeto é obtido por meio das caracte-rísticas das reivindicações independentes. As reivindicações dependentesainda desenvolvem a idéia central da presente invenção.
Para obter este objeto, geralmente o uso de proteínas, por e-xemplo, o uso de micelas de proteína de soro de leite coalhado ou agrega-dos contendo micelas de proteína de soro de leite coalhado como meio a-brasivo é proposto. Em particular, a presente invenção refere-se ao uso tópi-co de micelas de proteína de soro de leite coalhado.
Ainda em um aspecto da invenção, uma composição cosméticacompreendendo micelas de proteína de soro de leite coalhado é provida.
Um terceiro aspecto da invenção refere-se a um processo para afabricação de uma composição cosmética.
Ainda um aspecto refere-se a um produto obtenível através deum tal processo.
Figuras
A presente invenção é ainda descrita a seguir com referência aalgumas modalidades preferidas mostradas nas figuras acompanhantes onde:
A Figura 1 mostra o resultado de um experimento demonstrandoo efeito de pH e tratamento térmico sobre a formação de micelas de beta -lactoglobulina.
A Figura 2 mostra um meio para determinar o pH da formaçãode micelas para uma preparação comercial (Bipro, Batch JE032-1-420) u-sando medições de turbidez em 500 nm.
A Figura 3 é uma micrografia de microscopia de transmissãoeletrônica de micelas de proteína de soro de leite coalhado (2% em peso,WPI 95, Lactalis) em pH 7,4. Barra de escala é de 200 nm.
A Figura 4 mostra o resultado de um experimento avaliando oimpacto da resistência iônica (Arginina HCI) sobre a formação de micelas deproteína em pH constante de 7,0.
A Figura 5 mostra a estabilidade de volume (FVS) de espumaestabilizada por micelas de beta - lactoglobulina 1% em peso (Davisco) empH 7,0 na presença de Arginina HCI 60 mM comparada a beta - Iactoglobu-Iina não-feita micelas.
A Figura 6 mostra o diâmetro hidrodinâmico equivalente basea-do em intensidade de proteína de soro de leite coalhado obtida por termotratamento de uma dispersão 1% em peso de beta - lactoglobulina por 15minutos a 85°C em pH variando de 2 a 8. Micelas de proteína de soro deleite coalhado são obtidas em pH 4,25 (carregadas positivamente com umpotencial zeta ao redor de +25 mV) e em pH 6,0 (carregadas negativamentecom um potencial zeta ao redor de -30 mV). Diâmetro hidrodinâmico feitomédia-Z das micelas foi de 229,3 nm em pH 4,25 e 227,2 nm em pH 6,0. Ascorrespondentes micrografias das micelas obtidas por TEM após mancha-mento negativo são mostradas. Barras de escala são de 1 μπι.
A Figura 7 mostra uma estrutura altamente esquemática de umamicela de proteína de soro de leite coalhado.
A Figura 8 mostra uma micrografia SEM (microscopia de explo-ração eletrônica) de um pó de micela de proteína de soro de leite coalhadoobtida após secagem por atomização de uma dispersão de teor de 20% deproteína após micro - filtração.
A Figura 9 é uma micrografia TEM de manchamento negativo deuma dispersão de micelas de proteína de soro de leite coalhado obtida emum teor de 4% de proteína.
A Figura 10 é uma micrografia TEM de manchamento negativo,de uma dispersão de micelas de proteína de soro de leite coalhado obtidaem um teor de proteína de 20% após micro - filtração.
A Figura 11 mostra a estabilidade térmica de uma dispersão demicelas de proteína de soro de leite coalhado obtida em um teor de proteínade 10% após microfiltração em pH 7,0 na presença de NaCI após aqueci-mento a 85°C por 15 minutos.
A Figura 12 mostra a estabilidade térmica de uma dispersão deproteína de soro de leite coalhado obtida em um teor de 4% de proteína empH 7,0 na presença de NaCI após aquecimento a 85°C por 15 minutos.
A Figura 13 é uma micrografia TEM de manchamento negativode uma dispersão 4% de micelas de proteína de soro de leite coalhado ba-seada em um pó secado por atomização de micelas de proteína após dis-persão a 50°C em água deionizada.
A Figura 14 é gráfico mostrando a distribuição de tamanho demicelas obtidas através do processo da invenção usando um isolado de pro-teína de soro de leite coalhado Prolacta 4t% (??) tratado em pH 5,9.
A Figura 15 é uma micrografia SEM mostrando a estrutura inter-na após corte de um grânulo em pó secado por atomização que é apresen-tado na figura 8.A Figura 16 é uma micrografia TEM de manchamento negativode uma dispersão de micelas de proteína de soro de leite coalhado 0,4%,com base em um pó Iiofilizado de micelas de proteína de soro de leite, apósem temperatura ambiente, em água deionizada. Barra de escala é de 0,5micrometro.
A Figura 17 é uma vista esquemática do revestimento WPM a-través de SBO (oleato de butila sulfatado) com aumento de razão de misturaem pH 3,0. Círculo cinza: WPM com cargas de superfície positivas. Cabeça+ cauda negros: cabeça carregada negativamente e cauda hidrofóbica deSBO.
A Figura 18 é uma fotografia de um concentrado de micelas deproteína de soro de leite coalhado em 20% obtida após evaporação na qual4% de NaCI é adicionado.
A Figura 19 é uma micrografia de microscopia de luz de campobrilhante de seção semi - fina em pó de micela de proteína de soro de leitecoalhado após manchamento com azul toluidina. Barra de escala é de 50micra.
A Figura 20 é uma micrografia SEM da partícula em pó de mice-las de proteína de soro de leite coalhado oca após corte. Esquerda: estruturainterna. Direita: Detalhe da micela de proteína de soro de leite coalhadocompondo a matriz de partícula em pó. Barras de escala são 10 e 1 micronrespectivamente.
Descrição Detalhada da Invenção
De acordo com a presente invenção, proteínas tais como mice-las de proteína de soro de leite coalhado ou seus agregados podem ser u-sadas como meio abrasivo.
Micelas de proteína de soro de leite coalhado que podem serusadas no contexto da presente invenção são representadas na Figura 7,onde as proteínas de soro de leite coalhado são arranjadas de modo que aspartes hidrofílicas das proteínas sejam orientadas na direção da parte exter-na do aglomerado e as partes hidrofóbicas das proteínas são orientadas nadireção do "núcleo" interno da micela. Esta configuração energeticamentefavorável oferece boa estabilidade para estas estruturas em um ambientehidrofílico.
A específica estrutura de micela pode ser vista a partir das figu-ras, em particular figuras 3, 9, 10 e 13, onde as micelas usadas na presenteinvenção consistem essencialmente em vários aglomerados esféricos deproteína de soro de leite coalhado desnaturada. As micelas da presente in-venção são particularmente caracterizadas por sua forma esférica, regular.
Micelas de proteína de soro de leite coalhado podem ser produ-zidas por um processo de primeiramente ajuste de pH e/ou resistência iônicade uma solução aquosa de proteína de soro de leite coalhado nativa, e entãosubmetendo a dita solução a calor. Tal processo é aqui descrito ainda emmais detalhes.
As micelas de proteínas de soro de leite coalhado assim produ-zidas têm um caráter dual (hidrofílico e hidrofóbico). Realmente, o arranjodas proteínas de soro de leite coalhado desnaturadas em uma estrutura demicela parece permitir interação com uma fase hidrofóbica, por exemplo,uma gotícula de gordura ou ar, e uma fase hidrofílica. As micelas de proteínade soro de leite coalhado por isso têm perfeitas propriedades de emulsifica-ção e formação de espuma.
Além disso, as micelas de proteína de soro de leite coalhadousadas na presente invenção são produzidas de modo que elas tenham umadistribuição de tamanho extremamente aguda (ver Figura 14), de modo quemais que 80% das micelas produzidas têm um tamanho menor que 1 mi-cron. Preferivelmente as micelas de proteína de soro de leite coalhado usa-das na presente invenção terão um tamanho entre 100 nm e 900 nm, maispreferivelmente entre 100-770 nm, mais preferivelmente entre 200 e 400 nm.
O diâmetro médio das micelas pode ser determinado usandomicroscopia de transmissão eletrônica (TEM). De modo a assim fazer, asamostras de micela líquidas são encapsuladas em tubos de gel ágar. Fixa-ção é obtida através de imersão em uma solução de glutaraldeído 2,5% emtampão cacodilato 0,1 M1 pH 7,4 e pós-fixação com tetróxido de ósmio 2%no mesmo tampão. Ambas soluções contendo vermelho rutênio 0,04%. Apósdesidratação em uma série de etanol graduada (etanol 70, 80, 90, 96,100%), as amostras são embutidas em resina Spurr (Spurr/ etanol 1:1, 2:1,100%). Após polimerização da resina (70°C, 48 horas), seções semi - finase ultra - finas são cortadas com um ultra-microtomo Leica ultracut UCT. Se-ções ultra - finas, manchadas com acetato de uranila aquoso e citrato dechumbo, são então examinadas por microscopia de transmissão eletrônica(Philips CM12, 80 kV).
Sem desejar estar preso por teoria, é pensado que durante for-mação de micela, as micelas atingem um tamanho "máximo", devido à cargaeletrostática total da micela repelindo qualquer adicional molecular de prote-ína, de modo que a micela não pode crescer mais em tamanho. Isto respon-de pela aguda distribuição de tamanho observada (cf. Figura 14).
As micelas de proteína de soro de leite coalhado usadas na pre-sente invenção podem ser produzidas a partir de quaisquer isolados ou con-centrados de proteína de soro de leite coalhado comercialmente disponíveis,isto é, proteína de soro de leite coalhado obtida através de qualquer proces-so para a preparação de proteína de soro de leite coalhado conhecido natécnica, assim como frações de proteína de soro de leite coalhado prepara-das do mesmo ou proteínas tais como beta - Iactoglobulina (BLG), alfa -Iactalbumina e albumina de soro. Em particular, soro de leite coalhado doceobtido como um subproduto em fabricação de queijo, soro de leite coalhadoácido obtido como um subproduto em fabricação de caseína ácida, soro deleite coalhado nativo obtido através de microfiltração de leite ou soro de leitecoalhado de coalheira obtido como um subproduto em fabricação de caseínade coalheira podem todos ser usados como a fonte de proteína de soro deleite coalhado. A proteína de soro de leite coalhado pode ser uma única fon-te ou de misturas de quaisquer fontes. É preferível que a proteína de soro deleite coalhado não sofra qualquer etapa de hidrólise antes de formação demicelas. Assim, a proteína de soro de leite coalhado não é submetida aqualquer tratamento enzimático antes de formação de micelas. De acordocom a invenção, é importante que a proteína de soro de leite coalhado sejausada no processo de formação de micelas e não seus hidrolisados.Isolados de soro de leite coalhado usados para produção de mi-celas de proteína de soro de leite coalhado usadas na presente invençãonão são restritos àqueles de origem bovina, mas incluem isolados de soro deleite coalhado de todas as espécies de animal mamífero, como ovelha, ca-bras, cavalos, e camelos. Também, as preparações de soro de leite coalha-do podem ser mineralizadas, desmineralizadas, ou levemente mineralizadas.Por "levemente mineralizada" é pretendida qualquer preparação de soro deleite coalhado após eliminação de minerais livres que são dialisáveis ou dia-filtráveis, mas que mantém minerais associados à mesma através de mine-ralização natural após preparação do concentrado ou isolado de proteína desoro de leite coalhado, por exemplo. Estas preparações de soro de leite coa-lhado "levemente mineralizadas" não tiveram específico enriquecimento mi-neral.
Para a fabricação de micelas de proteína de soro de leite coa-lhado, proteínas de soro de leite coalhado podem estar presentes em umasolução aquosa em uma quantidade de 0,1% em peso a 12% em peso, pre-ferivelmente em uma quantidade de 0,1% em peso a 8% em peso, mais pre-ferivelmente em uma quantidade de 0,2% em peso a 7% em peso, mesmomais preferivelmente em uma quantidade de 0,5% em peso a 6% em peso,20 mais preferivelmente em uma quantidade de 1% em peso a 4% em peso nasbases do peso total da solução.
A solução aquosa da preparação de proteína de soro de leitecoalhado como presente antes de etapa de formação de micelas tambémpode compreender adicionais compostos, tais como subprodutos dos res-pectivos processos de produção de soro de leite coalhado, outras proteínas,gomas, carrageenans, ou carboidratos. A solução também pode conter ou-tros ingredientes alimentícios (gordura, carboidratos, extratos de plantas,etc.). A quantidade de tais compostos adicionais genericamente não excede50% em peso, preferivelmente 20%, mais preferivelmente não excede 10%em peso do peso total da solução.
A proteína de soro de leite coalhado, assim como as suas fra-ções e/ou as principais proteínas podem ser usadas em forma purificada ouda mesma maneira em forma de um produto bruto. 0 teor de cátions diva-Ientes na proteína de soro de leite coalhado para a preparação das micelasde proteína de soro de leite coalhado pode ser menos que 2,5%, preferivel-mente menos que 0,2%. Mais preferivelmente as proteínas de soro de leitecoalhado são completamente desmineralizadas.
Valores de pH e resistência tônica são importantes fatores nafabricação de micelas de proteína de soro de leite coalhado. Assim, paraamostras extensivamente dialisadas que são virtualmente destituídas ou es-gotadas de cátions livres como Ca, K, Na, Mg, quando realizando o trata-mento térmico durante um período de tempo de 10 s a 2 horas em um pHabaixo de 5,4, coalho é obtido, enquanto em um pH excedendo 6,8, resultaproteína de soro de leite coalhado solúvel (ver Figura 1). Assim, somentenesta antes estreita janela de pH micelas de proteínas de soro de leite coa-lhado tendo um diâmetro de menos que 1 μηπ serão obtidas. Estas micelasterão uma carga negativa total. A mesma forma de micela também pode serobtida simetricamente abaixo de pH isoelétrico, isto é, de 3,5 a 5,0, mais pre-ferivelmente 3,8 a 4,5 resultando em micelas sendo carregadas positivamen-te (ver Figura 6).
Assim, de modo a obter micelas carregadas positivamente, for-mação de micelas de proteínas de soro de leite coalhado pode ser feita emuma solução livre de sal em um valor de pH ajustado entre 3,8 e 4,5 depen-dendo do teor mineral da fonte de proteína.
Alternativamente, de modo a obter micelas carregadas negati-vamente, o pH pode ser ajustado para uma faixa de 6,3 a 9,0, para um teorde cátions divalentes compreendido entre 0,2% e 2,5% em pó de proteína desoro de leite coalhado.
Mais especificamente, para obter micelas carregadas negativa-mente, o pH é ajustado para uma faixa de 5,6 a 6,4, ou mesmo de 5,8 a 6,0para um baixo teor de cátion divalente (por exemplo, menos que 0,2% do póde proteína de soro de leite coalhado inicial). O pH pode ser aumentado até8,4 dependendo do teor mineral da fonte de proteína de soro de leite coa-lhado (concentrado ou isolado). Em particular, o pH pode estar entre 7,5 a8,4, preferivelmente 7,6 a 8,0 para obtenção de micelas carregadas negati-vamente na presença de grandes quantidades de minerais livres e o pH po-de estar entre 6,4 a 7,4, preferivelmente 6,6 a 7,2 para obtenção de micelascarregadas negativamente na presença de quantidades moderadas de mine-rais livres. Como uma regra geral, quanto maior o teor de cálcio e/ou mag-nésio do pó inicial de proteína de soro de leite coalhado, maior o pH de for-mação de micelas.
As condições de formação das micelas de proteína de soro deleite coalhado, podem ser padronizadas através de desmineralização - atra-vés de qualquer uma das técnicas de desmineralização conhecidas (diálise,ultrafiltração, osmose reversa, cromatografia de troca de íons) - de qualquerfonte de proteínas de soro de leite coalhado nativas líquidas com uma con-centração de proteínas variando a partir daquela de soro de leite coalhadodoce, permeado de microfiltração de leite ou soro de leite coalhado ácido(0,9% de teor de proteína) àquela de um concentrado com 30% de teor deproteína. A diálise pode ser feita contra água (destilada, deionizada, ou mo-le), mas como esta somente permitirá remoção dos íons fracamente ligadosàs proteínas de soro de leite coalhado, é usual dializar contra um ácido empH abaixo de 4,0 (orgânico ou inorgânico) para controlar melhor a composi-ção iônica das proteínas de soro de leite coalhado. Assim fazendo, o pH daformação de micelas de proteína de soro de leite coalhado estará abaixo depH 7,0, usualmente compreendido entre 5,8 e 6,6.
Antes de aquecimento de solução aquosa de proteína de sorode leite coalhado, o pH é genericamente ajustado pela adição de ácido talcomo, por exemplo, ácido clorídrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido cí-trico, ácido glucônico, ou ácido lático. Quando o teor mineral é alto, o pH égenericamente ajustado pela adição de solução alcalina tal como hidróxidode sódio, hidróxido de potássio, ou hidróxido de amônio.
Alternativamente, se nenhuma etapa de ajuste de pH é deseja-da, é possível ajustar a resistência iônica da preparação de proteína de sorode leite coalhado enquanto mantendo o pH constante. Então, resistênciaiônica pode ser ajustada através de íons orgânicos ou inorgânicos de modoa permitir formação de micelas em um valor de pH constante de 7. A Figura4 ilustra micelas sendo formadas em um valor de pH constante de 7,0 en-quanto a resistência iônica é variada através de adição de 70-80 mM de ar-ginina HCI.
Um tampão ainda pode ser adicionado à solução aquosa de pro-teína de soro de leite coalhado de modo a evitar uma substancial mudançado valor de pH durante tratamento térmico da proteína de soro de leite coa-lhado. Em princípio, o tampão pode ser selecionado de qualquer sistematampão, isto é, ácido acético e seus sais, tais como, por exemplo, acetato desódio ou acetato de potássio, ácido fosfórico e seus sais, por exemplo,NaH2PO4, Na2HPO4, KH2PO4, K2HPO4, ou ácido cítrico e seus sais, etc.
Ajuste de pH e/ou a resistência iônica das solução aquosa antesde aquecimento resulta em um processo controlado rendendo micelas tendoum tamanho entre 100 nm - 900 nm, preferivelmente 100-700 nm, mais pre-ferivelmente 200-400 nm. Preferivelmente, a distribuição de micelas tendodimensões entre 100-700 nm é mais que 80% quando realizando o processoaqui descrito (ver Figura 14).
De modo a obter micelas de forma regular, também é importan-te, de acordo com a invenção, que a proteína de soro de leite coalhado nãosofra qualquer etapa de hidrólise antes de formação de micelas.
Após ajuste de pH e/ou resistência iônica, a solução aquosa departida de proteína de soro de leite coalhado é submetida a tratamento tér-mico. Neste sentido, de modo a obter micelas de proteína de soro de leitecoalhado, é importante se ter a temperatura na faixa de cerca de 70 a abaixode 95°C, preferivelmente de cerca de 82 a cerca de 89°C, mais preferivel-mente de cerca de 84 a cerca de 87°C, mais preferido em cerca de 85°C.
Também foi verificado que, em uma escala industrial, é importante que atemperatura seja preferivelmente menos que 95°C, mais preferivelmente en-tre 80°C e 90°C, mais preferivelmente cerca de 85°C.
Uma vez a desejada temperatura tenha sido atingida, a soluçãoé mantida nesta temperatura por um mínimo de 10 segundos e um máximode 2 horas. Preferivelmente, o período de tempo durante o qual a soluçãoaquosa de proteína de soro de leite coalhado é mantida na desejada tempe-ratura varia de 12 a 25 minutos, mais preferivelmente de 12 a 20 minutos, oumais preferivelmente cerca de 15 minutos.
O tratamento térmico também pode ser obtido em um forno demicroondas ou qualquer equipamento similar permitindo aquecimento atra-vés de microondas com uma razão de tempo / quantidade de 10 s / 10 mLpara uma solução 4% em peso de proteína aquecida em uma aparelhagemde 1500 W até a temperatura de ebulição (98°C em uma altitude de 833 m).Um processo contínuo também pode ser usado através de adição de 8 oumais magnétrons ao redor de um tubo de vidro potencialmente prolongadopor um tubo de retenção para aumentar o tempo de incubação.
Como mostrado na Figura 2, medições de turbidez são uma in-dicação de formação de micelas. A turbidez medida através de absorbânciaem 500 nm é genericamente pelo menos 3 unidades de absorbância parasolução 1% de proteína mas pode atingir 16 unidades de absorbância quan-do o rendimento de formação de micelas está acima de 80% (ver Figura 2).
Para ainda ilustrar o efeito de formação de micela a partir de umponto de vista físico - químico, uma dispersão 1% em peso de Bipro foi a -quecida por 15 minutos a 85°C em pH 6,0 e 6,8 em água MilliQ. O diâmetrohidrodinâmico dos agregados obtidos após tratamento térmico foi medidoatravés de dispersão dinâmica de luz. O peso molecular aparente dos agre-gados foi determinado por dispersão estática de luz usando o assim chama-do gráfico Debye. A hidrofobicidade de superfície foi sondada com a sondaANS hidrofóbica e os grupos tióis acessíveis livres pelo processo DTNB u-sando cisteína como o aminoácido padrão. Finalmente, a morfologia dosagregados foi estudada através de TEM de manchamento negativo. Os re-sultados são apresentados na tabela 1.
A partir da tabela 1, é claro que as micelas de proteína de sorode leite coalhado que foram formadas em pH 6,0 permitem proteína diminuirsua hidrofobicidade de superfície ANS específica por um fator de 2 compa-rado a proteína de soro de leite coalhado não-feita micela aquecida namesma condição, mas em pH 6.8. A formação de micelas também pode servista no o peso molecular muito alto de 27x106 g.mol'1 comparado a0,64x106 g.mol"1 para proteína não-feita micela, indicando um estado muitocondensado da matéria dentro de micela (baixa quantidade de água). Inte-ressantemente, o potencial-ζ das micelas é mesmo mais negativo que asproteínas não-feitas micelas mesmo se as últimas tenham sido formadas emum pH mais básico que as micelas. Isto é o resultado de uma superfíciemais hidrofílica das micelas sendo expostas ao solvente. Finalmente, deve-se notar que a reatividade tiol das micelas é muito menor que aquela da pro-teína não-feita micelas devido ao diferente pH de tratamento térmico.
Tabela 1: Propriedades físico - químicas de agregados solúveis de proteínade soro de leite coalhado obtidos através de tratamento térmico (85°C. 15minutos) de uma dispersão 1% em peso de proteína em presença ou ausên-cia de NaCl
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O rendimento de conversão de proteína de soro de leite coalha-do nativa a micelas diminui quando a concentração inicial de proteína é au-mentada antes de ajuste de pH e tratamento térmico. Por exemplo, quandopartindo com um isolado de proteína de soro de leite coalhado Prolacta 90(lote 673 de Lactalis), o rendimento de formação de micelas de proteína desoro de leite coalhado cai de 85% (quando partindo com 4% de proteínas)para 50% (quando partindo com 12% de proteínas). De modo a maximizar aformação de micelas de proteína de soro de leite coalhado (>85% do teor deproteína inicial), é melhor partir com uma solução aquosa de proteína de so-ro de leite coalhado tendo uma concentração de proteína abaixo de 12%,preferivelmente abaixo de 4%. Dependendo da aplicação final pretendida, aconcentração de proteína pode ser ajustada antes de tratamento térmicopara gerenciar o ótimo rendimento de micelas de proteínas de soro de leitecoalhado.
Dependendo da aplicação desejada, o rendimento de micelasantes de concentração é de pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos80% e os agregados solúveis residuais ou teor de proteína solúvel está pre-ferivelmente abaixo de 20%. O tamanho de micela médio é caracterizado porum índice de polidispersividade abaixo de 0,200. Foi observado que micelasde proteína de soro de leite coalhado podem formar agregados ao redor depH 4,5, entretanto sem sinal de separação de fase macroscópica após pelomenos 12 horas a 4°C.
A pureza de micelas de proteína de soro de leite coalhado podeser obtida através de determinação de quantidade de proteínas solúveis re-siduais após produção. Micelas são eliminadas através de centrifugação a20°C e 26900 g por 15 minutos. O sobrenadante é usado para determinar aquantidade de proteína em cubetas de quartzo em 280 nm (comprimento decaminho de luz de 1 cm). Valores são expressos como uma porcentagem dovalor inicial antes de tratamento térmico.
Proporção de micelas = (quantidade de proteínas inicial - quan-tidade de proteínas solúveis) / quantidade inicial de proteínas
Através do uso do processo aqui descrito, as micelas de proteí-na de soro de leite coalhado não são submetidas a qualquer tensão mecâni-ca conduzindo a redução do tamanho de partícula durante formação, ao con-trário de processos convencionais. O processo induz espontânea formaçãode micelas de proteínas de soro de leite coalhado durante tratamento térmi-co na ausência de cisalhamento.
As micelas podem ser obtidas como uma suspensão ou umadispersão em um líquido e podem ter um tamanho variando de 100 a 900nm, preferivelmente de 100-770 nm, mais preferivelmente 200-400 nm.
As micelas obteníveis através do processo aqui descrito são es-truturas insolúveis, extremamente estáveis que podem ser usadas comomeio abrasivo de acordo com a presente invenção.
As ditas micelas podem ser usadas como tais na presente in-venção ou podem ainda sofrer processamento, tal como concentração, se-cagem por atomização, etc. enquanto retendo suas propriedades abrasivas.
Realmente, ainda concentração da dispersão de micelas obtení-vel após tratamento térmico pode ser realizada através de evaporação, cen-trifugação, sedimentação, microfiltração e/ou ultrafiltração, por exemplo.
O enriquecimento das micelas de proteína de soro de leite coa-lhado para produção de seus concentrados oferece a vantagem de que pro-dutos enriquecidos em proteína podem ser obtidos em concentração anteri-ormente não-obtenível. Assim, a suspensão de micelas pode ser concentra-da para um teor de proteína maior que 4%, preferivelmente maior que 10%,mais preferivelmente maior que 20%.
Evaporação pode ser realizada através de alimentação de dis-persão de micelas para um evaporador SBO vácuo, tendo uma temperaturaentre 50°C è 85°C. O produto resultante genericamente terá o aspecto deum gel ou um creme como mostrado na Figura 18. Tal produto de micelaspode ser usado como tal como um meio abrasivo ou como um agente cos-mético, ou em composições cosméticas da presente invenção. Além disso, oconcentrado 20% de proteína de micelas de proteína de soro de leite coa-lhado obtenível por evaporação pode ser texturizado em uma textura quepode ser espalhada através de acidulação usando ácido lático.
Centrifugação pode ser realizada com alta taxa de aceleração(mais de 2000g) ou baixa taxa de aceleração (menos que 500 g) após acidu-lação da dispersão de micelas de proteína de soro de leite coalhado em umpH menor que 5, preferivelmente 4,5.
Sedimentação espontânea também pode ser realizada sobre adispersão de micelas de proteína de soro de leite coalhado através de acidu-lação. Preferivelmente, o pH será 4,5 e o tempo de sedimentação é maisque 12 horas.
Alternativamente, concentração das micelas de proteína de sorode leite coalhado usadas na presente invenção pode ser obtida através demicrofiltração da dispersão de micelas. Esta técnica de enriquecimento nãosomente permite concentrar micelas de proteína de soro de leite coalhadoatravés de remoção de solvente mas também permite a remoção de proteínanão-feita micelas (como proteínas nativas ou agregados solúveis). Assim, oproduto final consiste essencialmente somente em micelas (como verificadopor Microscopia de Transmissão Eletrônica - cf. figura 9 e 10). Neste caso, ofator concentração que é possível obter é obtido após a taxa de fluxo inicialde permeado através de membrana ter caído para 20% de seu valor inicial.Isto permite obtenção de micelas em uma concentração maior que 80%.
Ainda processamento de micelas de proteína de soro de leitecoalhado pode ser realizado sobre a dispersão de micelas obtenível usandoo processo aqui descrito.
Por exemplo, as micelas de proteína de soro de leite coalhadopodem ser revestidas com um emulsificante tal como fosfolipídeos, por e-xemplo, ou outros agentes de revestimento como uma proteína, um peptí-deo, um hidrolisado de proteína ou uma goma como goma acácia de modo amodular a funcionalidade das micelas de proteína de soro de leite coalhado.
Quando uma proteína é usada como um agente de revestimento, ela podeser selecionada de quaisquer proteínas tendo um ponto isoelétrico signifi-cantemente maior ou menor que proteína de soro de leite coalhado. Estassão, por exemplo, protamina, Iactoferrina e algumas proteínas de arroz.
Quando um hidrolisado de proteína é usado como agente de revestimento,ele é preferivelmente um hidrolisado de proteínas tais como protamina, Iacto-ferrinar proteína de arroz, caseína, soro de leite coalhado, trigo, soja ou suasmisturas. Preferivelmente, o revestimento é um emulsificante selecionado deoleato de butila sulfatado, ésteres de ácido diacetil tartárico de mono- e di-glicerídeos, ésteres de ácido cítrico de monoglicerídeos, Iactilatos de estea-roíla e suas misturas. A Figura 17 é uma representação esquemática de talrevestimento com oleato de butila sulfatado. Além disso, secagem de co-espargimento, como ainda descrito aqui, pode resultar também em um re-vestimento das micelas de proteína de soro de leite coalhado.
Ainda processamento tal como secagem, por exemplo, secagempor atomização, secagem de congelamento, secagem com rolo, etc. tambémpode ser realizado sobre as micelas de proteína de soro de leite coalhado.
Assim, o concentrado de proteína de soro de leite coalhado pode ser secadopor atomização com ou sem adição de ainda ingredientes e pode ser usadocomo um sistema de liberação ou um bloco de construção para ser usadoem uma ampla faixa de processos, por exemplo, produção de consumíveis,aplicações cosméticas, etc.
A Figura 8 mostra um pó obtido através de uma secagem poratomização sem adição de ainda quaisquer ingredientes, tendo um tamanhode diâmetro de partícula médio maior que 1 micron devido à agregação demicela ocorrendo durante secagem por atomização. Um diâmetro medianode volume médio típico (D43) dos pulverizados de micelas de proteína desoro de leite coalhado está entre 45 e 55 micra, preferivelmente 51 micra. Odiâmetro mediano de superfície (D32) destes pulverizados está preferivel-mente entre 3 e 4 micra, mais preferivelmente ele é 3,8 micra.
O teor de umidade dos pulverizados obtidos após secagem poratomização é preferivelmente menos que 10%, mais preferivelmente menosque 4%.
Um tal pó de micelas de proteína de soro de leite coalhado éconsiderado como "puro" quando ele compreende pelo menos 90% de prote-ína de soro de leite coalhado da qual pelo menos 80% estão na forma mice-lar.
Além disso, o pó de micelas de proteína de soro de leite coalha-do "puro" tem uma alta capacidade de ligação para solventes tais como á-gua, glicerol, etanol, óleo, solventes orgânicos, etc. A capacidade Iigante dospulverizados para água é pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos90%, mais preferivelmente pelo menos 100%.
Para solventes tais como glicerol e etanol, a capacidade de liga-ção é de pelo menos 50%. Esta propriedade dos pulverizados de micelas deproteína de soro de leite coalhado permite que estes sejam aspargidos ouenchidos com ainda agentes ativos selecionados do grupo de peptídeos,extratos de plantas, hidrolisados de proteína, bioativos, vitaminas, minerais,farmacêuticos, componentes cosméticos, etc., e suas misturas.
Os agentes ativos podem ser incluídos no pó em uma quantida-de de 0,1-50%. Assim, o pó pode atuar como um veículo para aqueles in-gredientes funcionais.
Ingredientes adicionais que podem ser misturados às micelas deproteína de soro de leite coalhado ou um concentrado do mesmo antes desecagem por atomização compreendem sais solúveis ou não-solúveis, pep-tídeos, hidrolisados de proteína, pigmentos, gorduras, emulsificantes, aroma,extratos de plantas, Iigantes ou bioativos (minerais, vitaminas, drogas), leite,proteínas de leite, leite em pó desnatado, caseína micelar, caseinato, proteí-na vegetal, aminoácidos, polifenóis, e quaisquer suas misturas. Os resultan-tes pulverizados de micelas de proteína de soro de leite coalhado mistoscompreendem micelas de proteína de soro de.leite coalhado e adicionaisingredientes em uma razão em peso variando de 1:1 a 1:1000. Isto resultaem aglomerados ainda compreendendo estes ingredientes adicionais, demodo que eles podem ser usados de acordo com a presente invenção comomeios abrasivos que ainda exibem propriedades funcionais e benefícios desaúde, dependendo do ingrediente adicional usado. O pó misto por isso po-de atuar como um veículo para agentes bioativos, por exemplo.
Os pulverizados de micelas de proteína de soro de leite coalha-do obtidos pela presente invenção são caracterizados por uma estrutura in-terna composta principalmente por esferas ocas mas também por esferascolapsadas (cf. Figura 19). A estrutura de esferas ocas pode ser facilmenteexplicada pela formação da gotícula de vapor dentro de gotícula de concen-trado WPM durante a secagem por atomização. Quando a gotícula de vapordeixa a gotícula de WPM devido a uma temperatura acima de 100°C, umaesfera oca permaneceu. A "forma de osso" é devida a uma combinação daevaporação de água de gotícula e a pressão externa dentro da gotícula.
A estrutura interna das esferas ocas esféricas foi investigada porSEM após secionamento de partícula perto de seu diâmetro (Figura 20, es-querda). A espessura de parede da partícula foi ao redor de 5 μιη e pareceumuito uniforme, enquanto a estrutura interna teve uma aparência mais are-enta. Maior aumento mostrou que esta aparência areenta foi de fato devido àpresença do WPM inicial que foi fundido para formar a matriz interna da par-tícula em pó. Interessantemente, a forma esférica das micelas foi mantidadurante secagem por atomização assim como a distribuição de tamanho departículas homogênea (Figura 20, direita).
Assim, em uma base microscópica, pulverizados de micelas deproteína de soro de leite coalhado são caracterizados por uma morfologia degrânulo única de esferas ocas ou colapsadas contendo micelas de proteínade soro de leite coalhado intactas e individualizadas.
Pulverizados de micelas de proteína de soro de leite coalhadosão caracterizados por uma capacidade de escoamento muito alta, que ofe-rece as vantagens de fácil capacidade de uso e de transferência. O ângulode repouso destes pulverizados é preferivelmente abaixo de 35°C, mais pre-ferivelmente abaixo de 30°C. Um tal baixo ângulo de repouso permite que ospulverizados sejam usados como agentes de escoamento em aplicaçõescosméticas, por exemplo.
Estes pulverizados também podem ser usados de acordo com apresente invenção, por exemplo, como meio abrasivo, como agente cosmé-tico ou na fabricação de uma composição cosmética.
O tamanho das partículas em pó, isto é, dos agregados de mice-las de proteína de soro de leite coalhado e o tamanho das próprias micelasde proteína de soro de leite coalhado apresentam a vantagem de que asmicelas de proteína de soro de leite coalhado ou seus agregados são po-bremente perceptíveis e atuarão como um agente abrasivo sem irritação depele, quando usados em aplicações tópicas.
Uma característica importante de micelas de proteína de soro deleite coalhado, independente de sua forma (concentrado, suspensão, pó se-co, etc.) é que a estrutura de micela básica das proteínas de soro de leitecoalhado é conservada. A Figura 15 mostra um grão em pó de proteína desoro de leite coalhado que foi seccionado, e pelo que as micelas de proteínade soro de leite coalhado individuais são observáveis. Além disso, a estrutu-ra de micela pode ser facilmente reconstituída em solventes. Por exemplo,foi mostrado que os pulverizados obtidos a partir de concentrado de micelasde proteína de soro de leite coalhado podem ser facilmente redispersos emágua em temperatura ambiente ou a 50°C. O tamanho e estrutura das mice-Ias de proteína de soro de leite coalhado são inteiramente conservadoscomparados ao concentrado inicial. Por exemplo, na Figura 13, o concentra-do de proteína de soro de leite coalhado que foi secado por atomização emconcentração de 20% de proteína foi redisperso em água deionizada a 50°Cem uma concentração de proteína de 50%. A estrutura das micelas foi son-dada por TEM e pode ser comparada à Figura 10. Uma forma similar de mi-celas foi obtida. O diâmetro das micelas foi verificado ser 315 nm por disper-são dinâmica de luz com um índice de polidispersividade de 0,2. A Figura 16também mostra dispersão de um pó de micelas de proteína de soro de leitecoalhado secado por congelamento, onde as micelas são reconstituídas.
O fato de que as micelas de proteína de soro de leite coalhado esomente uma menor fração de agregados foram observados em soluçãoapós reconstituição do pó secado por atomização ou secado por congela-mento confirma que micelas de proteína de soro de leite coalhado são fisi-camente estáveis com relação a secagem por atomização, secagem de con-gelamento, etc.
Também é interessante notar que o concentrado, se ajustadopara um teor de proteína de 10% tem a habilidade para suportar um subse-qüente tratamento térmico a 85°C por 15 minutos em pH 7,0 na presença,por exemplo, de até 0,15 M de cloreto de sódio, como mostrado na Figura11. Como uma questão de comparação, uma dispersão de proteína de sorode leite coalhado nativa (Prolacta90, lote 500658 de Lactalis) forma um gelna presença de 0,1 M de cloreto de sódio em uma concentração de proteínade 4% (cf. Figura 12).
A alta estabilidade da estrutura de micelas é também preservadadurante a etapa de concentração. Isto oferece a vantagem de que as propri-edades abrasivas proporcionadas pela estrutura de micela não serão perdi-das durante a produção, estocagem, etc. de uma composição cosmética deacordo com a presente invenção.
De acordo com a presente invenção, micelas de proteína de so-ro de leite coalhado ou seus agregados podem ser usados como meio abra-sivo. Agregados de micelas de proteína de soro de leite coalhado podemestar na forma em pós secados por espargimento ou secados por congela-mento. Eles podem compreender adicionais ingredientes selecionados dogrupo de sais solúveis ou insolúveis, pigmentos, gorduras, emulsificantes,aroma, extratos de plantas, Iigantes ou bioativos (minerais, vitaminas, fárma-cos) e quaisquer suas misturas.
De acordo com a presente invenção, micelas de proteína de so-ro de leite coalhado ou os ditos seus agregados podem ser usados comoagentes cosméticos ou para a fabricação de uma composição cosmética.
Eles podem ser combinados com ainda ingredientes ativos sele-cionados do grupo de peptídeos, extratos de plantas, hidrolisados de proteí-nas, bioativos, vitaminas, minerais, compostos farmacêuticos, componentescosméticos e suas misturas.
Preferivelmente as micelas de proteína de soro de leite coalhadoou seus agregados estão contidos na composição em uma quantidade depelo menos 1%, preferivelmente mais que 5%, mais preferivelmente maisque 10%, mesmo mais preferivelmente mais que 20%, mais preferivelmenteaté 50%.
As micelas de proteína de soro de leite coalhado podem estarpresentes em forma de uma dispersão líquida, uma suspensão, um gel, umcreme ou um pó. Preferivelmente, a concentração de proteína de soro de- leite coalhado na dita dispersão líquida, suspensão, gel, creme, ou pó é maisque 4%, preferivelmente mais que 10%.
As micelas de proteína de soro de leite coalhado usadas na pre-sente invenção podem ter um tamanho médio na faixa de 100 nm a 900 nm,preferivelmente na faixa de 100 - 770 nm, mais preferivelmente na faixa de200-400 nm.
Por outro lado, os agregados de micelas de proteína de soro deleite coalhado usados na presente invenção podem ter um tamanho médiode mais que 1 μm.
As ditas micelas de proteína de soro de leite coalhado ou seusagregados podem ser usadas na fabricação de xampu, géis de banho, etc.
Elas também podem ser usadas em aplicações tópicas pelo queas micelas de proteína de soro de leite coalhado estão na forma de uma dis-persão líquida, uma suspensão, um creme, um gel ou um pó.
As ditas micelas de proteína de soro de leite coalhado podemser incorporadas em uma composição cosmética para aplicação tópica.
De acordo com uma realização, a invenção provê um processopara a abrasão de partículas de pele, compreendendo a aplicação de mice-las de proteína de soro de leite coalhado a uma pele. As micelas de proteínade soro de leite coalhado podem estar na forma de uma dispersão líquida,uma suspensão, um creme, um gel ou um pó ou podem ser incorporadas emuma composição antes de aplicação.
As composições da presente invenção podem compreender mi-celas em uma quantidade de pelo menos 1%, preferivelmente mais que 5%,mais preferivelmente mais que 10%, mesmo mais preferivelmente mais que20%, mais preferivelmente até 50%.
Preferivelmente, a concentração de proteína de soro de leite co-alhado na composição é mais que 1%, preferivelmente maior que 10%, maispreferivelmente maior que 20%, mais preferivelmente maior que 50%.
A composição pode estar na forma de uma solução, um creme,um gel, uma pasta, uma espuma, uma aspersão, etc.
De acordo com uma realização, a composição é um produto decuidados de cabelos, tal como um xampu. Ela também pode ser um gel debanho ou xampu de corpo e/ou cabelos.
A presente invenção também provê um processo para a fabrica-ção de uma composição cosmética compreendendo as etapas de:
a. produção de micelas de proteína de soro de leite coalhado ouseus agregados e
b. incorporação das ditas micelas ou seus agregados em umacomposição.
As micelas de proteína de soro de leite coalhado ou seus agre-gados e composições obtidas através do processo da presente invenção sãotais como aquelas descritas acima.
A natureza abrasiva das micelas de proteína de soro de leite co-alhado permitem que estas sejam usadas em um processo para a abrasãode partículas de pele de acordo com a presente invenção. Isto pode ser rea-lizado através de aplicação tópica das micelas de proteína de soro de leitecoalhado na forma de uma suspensão, uma dispersão, um creme, um gel,ou um pó, que pode ser usado como tal ou em combinação com ainda agen-tes ativos. Tais agentes ativos são selecionados de peptídeos, extratos deplantas, hidrolisados de proteína, bioativos, vitaminas, minerais, farmacêuti-cos, componentes cosméticos, etc. Além disso, as micelas de proteína desoro de leite coalhado ou seus agregados também podem ser incorporadosem uma composição antes de aplicação. A composição na qual as micelasde proteína de soro de leite coalhado são incorporadas podem variar decomposição de creme básica, a soluções de limpeza elaboradas, sabões,géis, espumas, pastas de dentes, espargimentos, xampus, etc.
A vantagem apresentada pelo uso de micelas de proteína desoro de leite coalhado como um agente cosmético é que não somente o as-pecto abrasivo é de interesse para remoção de células de pele mortas porexemplo, mas a própria natureza das micelas permite que as mesmas de-sempenhem outras funções. Em adição a comportamento abrasivo mecâni-co as micelas de proteína de soro de leite coalhado altamente carregadasnegativamente ou carregadas positivamente podem formar complexos ele-trostáticos com impurezas carregadas oposíamente a partir da pele para fa- *vorecer sua específica eliminação. Da mesma maneira, a hidrofobicidadenatural de micelas pode ajudar a eliminar impurezas lipofílicas da pele semnunca ser agressiva e irritante para a pele.
Além disso, micelas de proteína de soro de leite coalhado mos-traram ser idealmente apropriadas para uso como um emulsificante, agentebranqueador, substituto de gordura, substituto para caseína micelarou agen-te de formação de espuma, uma vez que elas são capazes de estabilizargordura e/ou ar em um sistema aquoso por prolongado período. A estabili-dade de espuma é mostrada na Figura 5 que compara uso de proteína desoro de leite coalhado não-feita micelas versus as micelas de proteína desoro de leite coalhado usadas na presente invenção.Assim, micelas de proteína de soro de leite coalhado podem serusadas como um agente emulsificante, para o qual o material é idealmenteapropriado, uma vez que elas têm um sabor neutro e nenhum aroma - fora écriado através do uso de tal material.
Em adição, as presentes micelas de proteína de soro de leitecoalhado ainda estão em uma condição para servirem como agente bran-queador, de modo que com um composto várias tarefas podem ser satisfei-tas. Uma vez que soro de leite coalhado é um material abundantemente dis-ponível, o seu uso reduz o custo de um produto requerendo um agente e-mulsificante, de enchimento, branqueador ou de formação de espuma.
Também, em seu papel como emulsificantes, micelas de proteí-na de soro de leite coalhado podem não somente serem úteis como estabili-zadores de emulsões ou espumas, por exemplo, mas elas também podemauxiliar na remoção de resíduos oleosos, provendo um efeito de total Iimpe-za. Além disso, as micelas de proteína de soro de leite coalhado podem serusadas em combinação com outros ingredientes ativos como lactoferrina,hidratante, emoliente, analgésico, adstringente, antioxidante, antimicrobial,antiviral, antiinflamatório, fármaco, antibiótico, substâncias, ácidos, água-de-rosas, glicerina, etc. Elas podem ser usadas em xarhpu como um agente delimpeza, um agente branqueador, ou mesmo como um agente de pigmenta-ção. Elas também podem ser usadas em géis de banho.
Aplicações para as micelas de proteína de soro de leite coalhadoem qualquer forma assim incluem cuidados de pele, cuidados bucais comopasta de dente, lavagem bucal, agentes de limpeza de gengiva, etc. e cuida-dos de cabelos. As micelas de proteína de soro de leite coalhado ou seuconcentrado podem ser usadas como tal ou diluídas dependendo da aplica-ção.
Da mesma maneira, um processo para a fabricação de umacomposição cosmética é também provido pela presente invenção, pelo queas micelas de proteína de soro de leite coalhado são produzidas de acordocom um processo tal como descrito acima, e onde as ditas micelas são ain-da incorporadas em uma composição.A composição na qual as micelas de proteína de soro de leitecoalhado são incorporadas pode variar de composição de creme básica, asoluções de limpeza elaboradas, sabões, géis, espumas, pastas de dentes,aspersões, xampus, etc. Estes também podem conter ainda ingredientesativos como lactoferrina, hidratante, emoliente, analgésico, adstringente, an-tioxidante, antimicrobial, antiviral, antiinflamatório, droga, antibiótico, subs-tâncias, ácidos, água destilada rose, glicerina, sulfo succinato, sulfonato dealquila, coco betaína, goma xantano, EDTA, sorbato de potássio, óleo desoja, óleo de amêndoa, propil trimonium, ceteareth 20, álcool cetílico, óleoessencial, óleo vegetal, óleo de mamona hidrogenado, emulsificante, estabi-lizador, Parabeno-DU, Fragrância, Iauril glicosídeo, Iaureth sulfato de amô-nio, Iaureth sulfato de sódio, butileno glicol, Iauroil sarcosinato de sódio, es-tearato de peg-2, álcool estearílico, cleth-12, álcool estearílico, mieticona,alantoína, EDTA dissódio, EDTA tetrassódio, metoxi cinamato de etil hexila,ácido glicirretínico, metil cocil de sódio, taurato, bht, cloreto de sódio, imida-zolidinil uréia, alfa isometil ionona, salicilato de benzila, butil fenila, metil pro-pional, hidroxi isoexil 3-ciclohexeno carboxaldeído, ácido salicílico, polietile-no, trietanolamina, goma xantano, peg-60 óleo de mamona hidrogenado,benzofenona-4, imidazolidinil uréia, decil glicosídeo, dimetil meã, cocamido-propil betaína, ácido glicólico, ppg-2 hidroxi etil cocamida, glicereth-7, diolea-to de peg-120 metil glicose, cocoil sarcosinato de sódio, fenoxi etanol, metilparabeno, propil parabeno, butil parabeno, etil parabeno, isobutil parabeno,perfume mentol, citronelol, geraniol, hexil cinamal, limoneno, etc.
Tipicamente, a composição compreenderá micelas de proteínade soro de leite coalhado ou seus agregados em uma quantidade de pelomenos 1%, 5%, 10%, 20%, até 50% em pó.
Os exemplos que se seguem ilustram a presente invenção semlimitar a mesma.
Exemplos
A invenção é ainda definida por referência aos seguintes exem-plos descrevendo em detalhes a preparação das micelas da presente inven-ção. A invenção aqui descrita e reivindicada não é para ser limitada em es-copo pelas modalidades específicas aqui mostradas, uma vez que estasmodalidades são pretendidas como ilustrações de vários aspectos da inven-ção. Quaisquer modalidades equivalentes são pretendidas estarem dentrodo escopo desta invenção. Realmente, várias modificações da invenção emadição àquelas aqui mostradas e descritas tornar-se-ão aparentes para a-queles versados na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificaçõestambém são pretendidas caírem dentro do escopo das reivindicações apos-tas.
Exemplo 1: Formação de micelas de β-Lactoqlobulina
β-lactoglobulina (lote JE002-8-922, 13-12-2000) foi obtida deDavisco (Le Sueur, MN1 USA). A proteína foi purificada a partir de soro deleite coalhado doce através de ultrafiltração e cromatografia de troca de íons.A composição do pó é 89,7% de proteína, 8,85% de umidade, 1,36% de cin-zas (0,079% Ca2+, 0,013% Mg2+, 0,097% K+ 0,576% Na+, 0,050% Cl"). Todosos outros reagentes usados foram de grau analítico (Merck Darmstadt, Ger-many).
A solução de proteína foi preparada em concentração de 0,2%através de solvatação de β-lactoglobulina em água MiIIiQ (Millipore), e agita-ção a 20°C por 2 horas. Então pH de alíquotas foi ajustado para 5,0, 5,2, 5,4,5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0 através de adição de HCI. As soluçõesforam enchidas em frascos de vidro de 20 mL (Agilent Technologies) e sela-dos com cápsulas de alumínio contendo uma selagem de silício / PTFE. Assoluções foram aquecidas a 85°C por 15 minutos (tempo para atingir a tem-peratura 2,30 - 3,00 minutos). Após o tratamento térmico, as amostras foramresfriadas em água gelada para 20°C.
O aspecto visual de produtos (Figura 1) indica que o pH ótimo deformação de micelas é 5,8.
Exemplo 2: Formação de Micelas de Isolado de Proteína de Soro de LeiteCoalhado
Isolado de proteína de soro de leite coalhado (WPI) (Bipro, bate-Iada JE032-1-420) foi obtido de Davisco (Le Sueur, MN, USA). A composi-ção do pó é reportada na tabela 1.A solução de proteína foi preparada em 3,4% de proteína atra-vés de solvatação em pó de proteína de soro de leite coalhado em água Mil-liQ (MiIIipore)1 e agitação a 20°C por 2 horas. O pH inicial foi 7,2. Então o pHde alíquotas foi ajustado em 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4 e 6,6 através de adição deHCI 0,1 N.
As soluções foram enchidas em frascos de vidro de 20 mL (Agi-lent Technologies) e selados com cápsulas de alumínio contendo uma sela-gem de silício (silicon) / PTFE. As soluções foram aquecidas a 85°C por 15minutos (tempo para atingir a temperatura 2,30 - 2,50 minutos). Após o tra-tamento térmico, amostras foram resfriadas em água gelada para 20°C.
A turbidez de proteínas de soro de leite coalhado aquecidas foideterminada em 500 nm e 25°C, amostras foram diluídas para permitir amedição na faixa de 0,1-3 unidades Abs (espectrofotômetro Uvikon 810,Kontron Instrument). Valores foram calculados para a concentração inicial deproteína de 3,4%.
O pH de formação de micelas foi considerado ser atingido comestabilidade (menos que 5% de variação do valor inicial) da absorbânciamedida em 500 nm dentro de um intervalo de 10 minutos para a mesma a-mostra como ilustrado pela figura 2. Para este produto o pH ótimo para for-mação de micelas foi 6,0 a 6,2. Para este pH ajustado antes de tratamentotérmico turbidez estável foi 21 e proteína solúvel residual avaliada por ab-sorbância em 280 nm após centrifugação foi 1,9%. Pode-se concluir que45% de proteínas iniciais foram transformadas em micelas em pH 6,0.
Tabela 2: Composição de WPI e características de amostra após formaçãode micelas
<table>table see original document page 27</column></row><table><table>table see original document page 28</column></row><table>
Exemplo 3: Observação microscópica de micelasProdução de Micelas:
Solução de proteína foi prpearada em 2% de proteína por solva-tação em pó de proteína de soro de leite coalhado (WPI 90 batelada 989/2,Lactalis, Retier, France) em água MiIIiQ (MiIIipore)1 e agitada a 20°C por 2horas. Então pHs de alíquotas foram ajustados usando HCI 0,1 N ou NaOH0,1 N.
As soluções foram enchidas em frascos de vidro de 20 ml_ (Agi-Ient Technologies) e selados com cápsulas de alumínio contendo uma sela-gem de silício / PTFE. As soluções foram aquecidas a 85°C por 15 minutos(tempo para atingir a temperatura 2,30-2,50 minutos). Após o tratamentotérmico, as amostras foram resfriadas em água gelada para 20°C. Para esteproduto o pH ótimo para formação de micelas foi 7,4.Observações Microscópicas:
Amostras de micelas líquidas foram encapsuladas em tubos degel de ágar. Fixação foi obtida através de imersão em uma solução de gluta-raldeído 2,5% em tampão cacodilato 0,1 M, pH 7,4 e pós-fixação com tétró-xido de ósmio 2% no mesmo tampão, ambas soluções contendo vermelhorutênio 0,04%. Após desidratação em uma série de etanóis graduados (eta-nol 70, 80, 90, 96, 100%), as amostras foram embutidas em resina Spurr(Spurr / etanol 1:1, 2:1, 100%). Após polimerização da resina (70°C, 48 ho-ras), seções semi9 - finas e ultra - finas foram cortadas com um ultra-microtomo Leica ultracut UCT. Seções ultra - finas, manchadas com acetatode uranila aquoso e citrato de chumbo, foram examinadas em microscopiade transmissão eletrônica (Philips CM12, 80 kV).
Micrografia TEM é apresentada na figura 3. Micelas obtidas es-tão apresentando uma forma esférica com um diâmetro de 200 nm.
Distribuição de Tamanho de Partículas
As distribuições de tamanhos de micelas baseadas em intensi-dade foram medidas para aquelas micelas obtidas através de tratamentotérmico de uma dispersão 1% em peso de β-lactoglobulina por 15 minutos a85°C em pH 4,25 (carregadas positivamente com um potencial zeta ao redorde +25 mV) e em pH 6,0 (carregadas negativamente com um potencial zetaao redor de -30 mV). Diâmetro hidrodinâmico de média-Z das micelas foi de229,3 mm em pH 4,25 e 227,2 em pH 6,0. β-LG e agregações de proteína desoro de leite coalhado foram seguidas usando dispersão dinâmica de luz.
Uma aparelhagem Nanosizer ZS (Malvern Instruments, UK) equipada comum laser emitindo em 633 nm e com energia de 4,0 mW foi usada. O instru-mento foi usado na configuração contra-dispersão, onde detecção é feita emum ângulo de dispersão de 173°. Isto permite considerável redução dos múl-tiplos sinais de dispersão encontrados em amostras túrbidas. Amostras fo-ram colocadas em uma célula de quartzo quadrada (Hellma, comprimento decaminho 1 cm). O comprimento de caminho do feixe de luz foi automatica-mente fixado pela aparelhagem, dependendo da turbidez da amostra (ate-nuação). A função auto-correlação foi calculada a partir da flutuação da in-tensidade dispersada). Os resultados são apresentados na figura 6. Elesmostram que a partícula média é caracterizada por um índice de polidisper-sividade muito estreito (<0,200).
Exemplo 4: Formação de micelas de uma β-lactoqlobulina em um pH constante
O processo descrito no exemplo 1 foi repetido com a condiçãode uso de uma solução aquosa de 2% de β-lactoglobulina. O pH desta solu-ção foi ajustado para 7,0 após adição de soluções de Arginina HCI para ob-ter uma concentração final de sal variando de 5 a 200 mM e uma concentra-ção final de β-lactoglobulina de 1%. Subseqüente tratamento térmico (80°C,10 minutos, cerca de 2 minutos para aquecer) foi realizado para produzirmicelas.
Os resultados são mostrados na Figura 4 e indicam claramenteque somente na faixa de resistência iônica de cerca de 50 a 70 mM, umasubstancial turbidez pode ser observada, indicando a presença de micelasde proteína de soro de leite coalhado.
Exemplo 5: Preparação de um agente branqueador
Proteínas de soro de leite coalhado nativas (WPI 95 batelada848, Lactalis; solução aquosa 8% em peso) foram tratadas de acordo comexemplo 2. A resultante clareza de produto (L) foi medida em modo trans-refletância usando uma aparelhagem MacBeth CE-XTH D65 10° SCE equi-pada com uma célula de medição de 2 mm. A resultante clareza foi L = 74,8,que pode ser comparada ao valor de L = 74,5 para leite de gordura total.
Exemplo 6: Preparação de uma espuma aquosa
β-lactoglobulina nativa (Biopure, Davisco, lote JE 002-8-922, so-lução aquosa 2% em peso) foi misturada com solução 120 mM de ArgininaHCI de modo que a concentração final de β-lactoglobulina foi 1% em peso eArginina HCI 60 mM. O pH foi então ajustado para 7,0 pela adição de HCI 1Ν. A mistura foi então tratada termicamente a 80°C por 10 minutos de modoque 90% de β-lactoglobulina inicial foram convertidos em micelas tendo umdiâmetro de média-Z de 130 nm. Neste caso, o diâmetro das micelas foi de-terminado usando uma aparelhagem Nanosizer ZS (Malvern Instruments,UK). A amostra foi vertida em uma cubeta de quartzo e variações da luz dis-persa foram anotadas automaticamente. A função de auto-correlação obtidafoi adaptada usando o processo acumulante de modo que o coeficiente dedifusão das partículas pode ser calculado e a seguir o diâmetro hidrodinâmi-co de média-z usando a lei de Stokes-Einstein. Para esta medição, o índicede refração do solvente foi tomado como 1,33 e aqueles das micelas 1,45.Um volume de 50 mL da resultante dispersão de micelas de β-lactoglobulinaé então feito espuma através de espargimento de nitrogênio através de umvidro sinterizado gerando bolhas de 12-16 μm para produzir um volume deespuma de 180 cm3 usando a aparelhagem Foamscan padronizada (ITCon-cept). A estabilidade de volume da espuma foi então seguida com tempo a26°C usando análise de imagem e comparada à estabilidade da espuma ob-tida com β-lactoglobulina tratada nas mesmas condições, mas sem ArgininaHCI, onde nenhuma micela foi formada. A Figura 5 mostra que a estabilidadede volume de espuma é grandemente aperfeiçoada pela presença de mice-Ias de β-lactoglobulina.
Exemplo 7: Micelas de proteína de soro de leite coalhado pulverizadas obti-das por secagem por atomização
Material
Isolado de proteína de soro de leite coalhado (WPI, Prolacta90de Lactalis, Rétiers, France) com um teor de proteína de 90%
Lactose comestívelMaltodextrinas DE39Água deionizadaÁcido clorídrico comestível 1 M
Processo
Usando um tanque de camisa dupla de 100 L, o pó de Prolac-ta90 foi disperso a 50°C em água deionizada em uma concentração de pro-teínas de 10% em peso SBO agitação suave de modo a evitar formação deespuma, isto é, 11 kg de Prolacta90 foram dispersos em 89 kg de água dei-onizada. Após 1 hora de dispersão, o pH da dispersão foi ajustado para o pHde formação de micelas (ao redor de 6,3 neste caso) através de adição deHCI. A temperatura da dispersão foi elevada para 85°C e mantida por 15 mi-nutos de modo a-gerar as micelas de proteína de soro de leite coalhado. A-pós 15 minutos, a temperatura foi diminuída para 50°C e a dispersão de 10%em peso de micelas de proteína de soro de leite coalhado foi dividida emduas bateladas de 50 kg. Em um primeiro experimento, 20 kg de Iactose fo-ram dispersos em 50 kg de dispersão de micelas a 50°C e agitados por 30minutos. Similarmente, 20 kg de maltodextrinas DE39 foram adicionados aos50 kg restantes de dispersão de micelas de proteína de soro de leite coalhado.
As duas misturas foram então secadas por espargimento emuma torre NIRO SD6.3N em uma taxa de fluxo de 15 L/h. A temperatura deentrada de ar foi 140°C e a temperatura de saída de ar foi de 80°C. O teorde água dos pulverizados obtidos foi menor que 5%.O tamanho das micelas de proteína de soro de leite coalhado foideterminado na presença de Iactose e maltodextrina (DE39) em água usan-do dispersão dinâmica de luz antes e após secagem por atomização. A con-centração total de proteína foi fixada para 0,4% em peso através de diluiçãoda dispersão antes de secagem por atomização ou reconstituição do pó demodo a estar no regime diluído de viscosidade para micelas de proteína desoro de leite coalhado. Uma aparelhagem Nanosizer ZS (Malvern Instru-ments) foi usada e diâmetro de micela foi feito média a partir de 20 medições.
O diâmetro de partícula determinado para micelas de proteínade soro de leite coalhado em presença de Iactose e maltodextrinas (DE39)foi 310,4 nm e 306,6, respectivamente. Após reconstituição dos pulveriza-dos, os respectivos diâmetros foram verificados serem 265,3 nm e 268,5,respectivamente. Estas medições confirmam que micelas de proteína desoro de leite coalhado foram fisicamente estáveis com relação a secagempor atomização. Os resultados foram corroborados por observações de mi-croscopia TEM de dispersões 0,1% em peso de micelas de proteína de sorode leite coalhado em água usando manchamento negativo na presença deácido fosfotungstico em pH 7. Um microscópio de transmissão eletrônicaPhilips CM12 operando em 80 kV foi usado. Micelas de proteína de soro de„ leite coalhado foram observadas em solução antes de secagem por atomi-zação e após reconstituição do pó secado por atomização. Nenhuma dife-rença de morfologia e estrutura pode ser detectada.
Exemplo 8: Concentração por evaporação
Um isolado de proteína de soro de leite coalhado Prolacta 90 deLactalis (1°500648) foi reconstituído a 15°C em água mole em uma concen-tração de proteína de 4% para atingir um tamanho de batelada final de 2500kg. O pH foi ajustado pela adição de ácido clorídrico 1 M de modo que o va-lor de pH final foi 5,90. A dispersão de proteína de soro de leite coalhado foibombeada através de um trocador de calor APV-mix placa - placa em umataxa de fluxo de 500 l/h. Pré-aquecimento a 60°C foi seguido por tratamentotérmico a 85°C por 15 minutos. Formação de micelas de proteína de soro deleite coalhado foi verificada por medição de tamanho de partícula usandodispersão dinâmica de luz assim como uma medição de turbidez em 500 nm.
A dispersão de micelas de proteína de soro de leite coalhado 4% obtida foicaracterizada por um raio hidrodinâmico de partículas de 250 nm, um índicede polidispersividade de 0,13 e uma turbidez de 80. A dispersão de micelasde proteína de soro de leite coalhado foi então usada para alimentar um e-vaporador Scheffers em uma taxa de fluxo de 500 L/h. A temperatura e vá-cuo no evaporador foram adaptados de modo que ao redor de 500 kg deconcentrado de micelas de proteína de soro de leite coalhado tendo umaconcentração de proteína de 20% foram produzidos e resfriados para 4°C.
Exemplo 9: Enriquecimento por microfiltração
Um isolado de proteína de soro de leite coalhado Prolacta 90 deLactalis (1°500548) foi reconstituído a 15°C em água mole em uma concen-tração de proteína de 4% para atingir um tamanho de batelada final de 2500kg. O pH foi ajustado pela adição de ácido clorídrico 1 M de modo que o va-lor de pH final foi 5,90. A dispersão de proteína de soro de leite coalhado foibombeada através de um trocador de calor APV-mix placa - placa em umataxa de fluxo de 500 l/h. Um pré-aquecimento a 60°C foi seguido por trata-mento térmico de 85°C por 15 minutos. Formação de micelas de proteína desoro de leite coalhado foi verificada por medição de tamanho de partículausando dispersão dinâmica de luz assim como uma medição de turbidez em500 nm. A dispersão de micelas de proteína de soro de leite coalhado 4%obtida foi caracterizada por um raio hidrodinâmico de partículas de 260 nm,um índice de polidispersividade de 0,07 e uma turbidez de 80. A forma mice-Ia da proteína também foi verificada por TEM, e estruturas de micelas comum diâmetro médio de 150-200 nm foram claramente visíveis (Figura 9). Adispersão de micelas de proteína de soro de leite coalhado pode ser resfria-da a 4°C para estocagem ou usada diretamente para alimentar uma unidadede filtração equipada com uma membrana Carbosep M14 de 6,8 m2 em umataxa de fluxo de 180 l/h. Neste caso, a concentração das micelas de proteínade soro de leite coalhado foi realizada em 10 a 70°C até a taxa de fluxo depermeado ter atingido 70 LVh. Neste caso, o concentrado de proteína de sorode leite coalhado final conteve 20% de proteínas. A estrutura das micelas noconcentrado foi verificada por TEM, e claramente nenhuma mudança signifi-cante foi visível comparada à dispersão de proteína de soro de leite coalha-do 4% antes de micro - filtração (Figura 10).
Exemplo 10: Pó de micelas de proteína de soro de leite coalhado compreen-dendo pelo menos 90% de proteína de soro de leite coalhado
200 kg de um concentrado de micelas de proteína de soro deleite coalhado obtido através de micro - filtração em 20% de proteína (verexemplo acima) foram injetados em uma torre Niro SD6.3N usando um bocalde atomização (0 = 0,5 mm, ângulo de espargimento = 65°, pressão = 40bars) em uma taxa de escoamento de produto de 25 kg/h. A temperatura deentrada de produto foi de 150°C e a temperatura de saída foi 75°C. O fluxode ar na torre foi de 150 m3/h. O teor de umidade no pó foi de menos que4% e o pó foi caracterizado por uma capacidade de escoamento muito alta.Microscopia de varredura eletrônica do pó exibiu partículas muito esféricastendo um diâmetro aparente variando de 10 a 100 μιη (Figura 8).
Exemplo 11: Pó de micelas de proteínas de soro de leite coalhado misto
20 kg de um concentrado de micelas de proteína de soro de leitecoalhado foram misturados com 1,7 kg de maltodextrinas com uma DE de 39de modo que a razão final de micelas de proteína para maltodextrina em póé 70/30.-Esta mistura foi injetada em uma torre Niro SD6.3N usando um bo-cal de atomização (0 = 0,5 mm, ângulo de espargimento = 65°, pressão = 4mPa (40 bars)) em uma taxa de fluxo de produto de 25 kg/h. A temperaturade entrada de produto foi de 150°C e a temperatura de saída foi de 75°C. Ofluxo de ar na torre foi de 150 m3/h. O teor de umidade no pó foi de menosque 4% e o pó foi caracterizado por habilidade escoamento muito alta.
Os pulverizados de exemplos 10 e 11, quando reconstituídos emágua, compreendem essencialmente micelas tendo a mesma estrutura emorfologia como o concentrado de micelas de proteína de soro de leite coa-lhado.
Exemplo 12: Receita para uma composição cosmética compreendendo 3.8%de micelas de proteína de soro de leite coalhado. Gel esfoliante de banho.<table>table see original document page 35</column></row><table>
Processo:
WPM 20% concentrado e água destilada rosa foram aquecidos a40°C então glicerina e goma xantana foram adicionadas. Esta combinaçãofoi adicionada a sulfonato de alquila, coco betaína, sulfossuccinato e EDTA.Todos os ingredientes foram misturados por agitação, então sorbato de po-tássio e fragrância foram adicionados.
Exemplo 17: Receita para uma composição cosmética compreendendo11,8% de micelas de proteína de soro de leite coalhado. Loção de descas-camento WPM.
<table>table see original document page 35</column></row><table>
Processo:
Concentrado 20% WPM foi aquecido a 70°C então glicerina foiadicionada. Fase oleosa fundida (óleo de amêndoa, álcool cetílico, ácidoesteárico e polissorbato 60) foi adicionada e agitada até dispersão homogê-nea ser obtida. A mistura foi resfriada para temperatura ambiente então pa-rabeno DU e fragrância foram adicionados.
Exemplo 18: Receita para uma composição cosmética compreendendo 14%de micelas de proteína de soro de leite coalhado. Loção de descascamentoWPM.
<table>table see original document page 36</column></row><table>
Processo:
Concentrado 20% WPM foi aquecido a 70°C então glicerina epropiltrimonium foram adicionados. Fase oleosa fundida (70°C) (óleo de so-ja, cera CreamMaker, ceteareth-20, coco betaína, álcool cetílico) foi adicio-nada e agitada até dispersão homogênea ser obtida. A mistura foi resfriadaem temperatura ambiente então Parabeno-DU e fragrância foram adicionados.