BRPI0709328A2 - produção e uso de endófitos como novos inoculantes para promover acentuado crescimento saudável vigor de uma planta, reduzindo a produção do stress ambiental e para a redução da dependência em pesticidas quìmicos para o controle de pestes - Google Patents
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Abstract
<B>PRODUçãO E USO DE ENDõFITOS COMO NOVOS INOCULANTES PARA PROMOVER ACENTUADO CRESCIMENTO SAUDáVEL VIGOR DE UMA PLANTA, REDUZINDO A PRODUçãO DO STRESS AMBIENTAL E PARA A REDUçãO DA DEPENDêNCIA EM PESTICIDAS QUIMICOS PARA O CONTROLE DE PESTES<D> Processo e método para a produção de endófitos como produtos inoculantes de plantas, especificamente o estirpe da rósea Clonostachys 88- 71 O, para a promoção do vigor, crescimento e saúde de uma planta e sua produção são revelados. O endófito, estirpe da rósea Clonostachys 88-71 O produz uma preparação conidial fúngica pela utilização de um discreto sistema de fermentação de substrato sólido , chamano Agar de Dextrose de Batata ou Agar de Extrato de Malte. Adicionalmente, o endófito, estirpe de rósea Clonostachys 88-71 O, poderá agir como um inoculante para estimular e ter um efeito aditivo com a bactéria rizóbio na produção de nódulos de fixação de nitrogênio nos legumes e no acentuado crescimento de por exemplo, feijão, soja, ervilha e alfafa. Assim o estirpe da rósea Clonostachys 88-71 O poderá combinar com hormónios raízes, como por exemplo, ácido butírico-3-índole (IBA), para prover inoculante e benefícios às raízes no corte/transplante de plantas.
Description
"PRODUÇÃO E USO DE ENDÓFITOS COMO NOVOS INOCULANTES PARA PROMOVER ACENTUADO CRESCIMENTO SAUDÁVEL VIGOR DE UMA PLANTA, REDUZINDO A PRODUÇÃO DO STRESS AMBIENTAL E PARA A REDUÇÃO DA DEPENDÊNCIA EM PESTICIDAS QUÍMICOS PARA O CONTROLE DE PESTES"
A presente invenção refere-se à produção e uso de um processo pelo qual os endófitos são identificados como produtos inoculantes, especialmente os fungos rósea Clonostachys de estirpe 88-170 para prover:
- Único recurso inoculante para beneficiar o crescimento, saúde, vigor e produção de uma planta;
- Um processo de produção que provenha vários níveis de germes de alta viabilidade/estabilidade e material micélio nas formulações estáveis que venham prevenir a degradação de um endófito rósea C vivo;
-A formulação do produto permitindo e possibilitando o uso prático e aplicação do produto(s) para sementes, raízes, talos, troncos, folhas, flores, bulbos, etc. de plantas ccmo formulações puIverizadoras baseadas em égua ou um pó para outros usos, como por exemplo no tratamento de sementes e vetor de insetos;
- Permitindo o produto (como um endófito) ser formulado em produtos com valor agregado que provem como única característica e recurso prover benefícios
induzidos de resistência da planta à doenças fúngicas, como míldio pulverizado, botrites, putrefação de raízes, enfraquecimento da semente, doenças agrestes, e ou insetos/óbolos;
- Permitindo o produto ( endófito) quando aplicado em raízes, talos, troncos, folhas, flores, ou na poda ou corte das superfícies da planta de agir como
inoculante ocupador acentuado de locais" no interior dos tecidos das plantas;
- O produto endófito prover cultivadas e aperfeiçoadas raízes, folhas, talos, troncos e embrião vegetativo (flores) crescimento das plantas bem como germinação da semente; e
- Redução do stress do meio ambiente ou cultural provendo induzida resistência natural à planta como, o stress da raiz, devido à poda, aparagem, corte ou outra violência como o resultado em rede final de:
- Aperfeiçoada qualidade de colheita e rápida comercialização da safra colhida;- Uma rósea Clonostachys de estipe 88-710 com um único código genético que diferencia o endófito reprodutivo de outro tipo fúngico da rósea Clonostachys ou rósea Gliocadium;
- Uma rósea Clonostachys de estipe 88-710 agindo como um inoculante para estimular e ter um efeito aditivo com a bactéria rizóbio de solo para a produção de nódulos de fixação de nitrogênio em legumes para otimização no crescimento, como por exemplo, na soja.
O termo endófito como descrito nesta invenção é definido como (1) um "ocupador de espaço", ou seja endófitos ou "fungos ou bactérias que formam infecções sem sintoma, por porte ou todo o ciclo de vida no interior das folhas saudáveis e talos das plantas" (Definição de Hawksworth e outros, 1995), (2) micróbio vivendo simbioticamente ou no organismo hospedeiro de uma planta. O termo inoculante como descrito nesta invenção é definido em vários Regulamentos Federais ou Estaduais como (1) "substâncias outras que fertilizantes fabricados, vendidos ou representados para uso no aperfeiçoamento da condição física do solo ou para auxiliar no crescimento da planta ou na produção de safra" (Canada Fertilizer Act) ou (2) "uma formulação contendo puras ou predeterminadas misturas de bactéria viva, fungos ou partículas de vírus para o tratamento de sementes, mudas outro material de propagação de planta com a finalidade de acentuar as capacidades de crescimento ou resistência à doenças, ou ainda alterar as propriedades eventuais da planta ou da safra e da colheita" (Ad hoc European Working Group, 1997) ou (3) inolucantes de solo ou planta que deverão incluir condutores de cultura de um específico micro-organismo ou a mistura de micro-organismos representados para aperfeiçoar o solo, ou o crescimento, qualidade e produção de plantas, e ainda incluam a fertilização de qualquer semente representada para ser inoculada com a referida cultura (New York State 10-A Consolidated Law) ou (4) "significando qualquer produto químico ou substância biológica ou a mistura de substâncias ou dispositivos distribuídos neste estado para serem aplicados ao solo, plantas ou sementes para finalidades corretivas do solo, ou aqueles aplicados para o aperfeiçoamento da germinação, crescimento, qualidade, produção, qualidade do produto, reprodução, aroma, sabor ou outras desejadas características das plantas ou que sejam intencionados para produziremqualquer produto químico, bioquímico, biológico ou alteração física do solo (Section 14513 of the Califórnia Food and Agricultural Code). O termo micro-parasita nesta invenção é definido como (1) "um fungo que paralisa outro fungo (2) um parasítico fúngico ou fungo (3) um organismo que ataca e se alimenta do fungo. O termo hiper-parasita como descrito nesta invenção é definido como um organismo que é parasítico em outros parasitas. A rósea Clonostachys de estirpe 88-710 definida como específico fungo endófito e separado de amostras simples em Ontario e produzido sob nova produção técnica descrita nesta invenção. O termo EndoFine® é definido com o nome marca de fantasia da formulação para as formulações do produto rósea Clonostachys estirpe 88-710 e sendo uma marca registrada de Adjuvants Plus Inc.. ADJ 720 é definido como o código do produto para uma formulação específica da rósea Clonostachys estirpe 88-710 contendo componentes naturais na forma de cálcio, carbonato, sais potássios, e emulsificadores naturais ( lactose, proteínas de nível alimentício) que provêm rápida cura à feridas e benefícios na ocupação de espaços como um inoculante que por sua vez, também provê adicional inoculante à planta protetor contra uma ampla variedade de doenças de plantas, insetos, e óbolos, como por exemplo, míldio pulverizado, óbolos maculados duplamente, afídios. O termo ocroleuca Bionectria é referido como a referência Micologia: Vol 91, No. 2, pp. 365-385.1999. A classificação do micro-parasita roseum Gliocladium em Clonostachys como rósea C, é de seu relacionamento com o ocroleuca Bionectria, e se mostrando em outro fungo como Gliocadium. Hans Josef Schroers, Gary J. Samuels, Keith A . Seifert, e Walter Gams. Os endófitos como os fungos reseum Clocostachys anteriormente chamados de rósea Gliocadium, tem sido mais comumente descritos na literatura como "ocupadores de espaços", ou seja, endófitos ou "fungo ou bactéria que formam infecções sem sintomas para parte ou por toda o ciclo de vida saudável das folhas e caules e talos das plantas" (Definition by Hawksworth et al, 1995). Dados de amostras de endófitos como os fungos rósea Clonostachys ou roseum Gliocadium (como anteriormente conhecido) indicam que o fungo ocorre mundialmente em uma variedade de solos, como por exemplo, na Europa, América do Norte, América Latina, etc.. Entretanto, todos os deslocamentos da rósea Clonostachys são da mesma morfologia, reprodutivamente, ou tem o mesmo material genético. Oestirpe 88-710 descrito nesta invenção é único reprodutivamente às espécies de fungos Clonostachys. A experiência para a classificação da rósea Clonostachys é descrita na referência, isto é, (Micologia: Vol. 91, No. 2, pp. 365-385.1999. Hans-Josef Schroerss1 Gary J. Samuels, Keith A. Seiferth, e Walter Gams. Face ao comum fungo do solo e o micro-parasita roseum Gliocadium diferem do tipo da espécie de Gliocladium. G, penicilióides, na morfologia, ecologia, teleomorfo, e dados de seqüência de DNA, sendo classificado em um gênero diferente, rósea Penicilina Clonostachys, sendo o mais antigo nome viável para a roseum C e sendo combinado com a rósea C. A roseum Penicilina, descrita na batata na Alemanha, é neo-tipificada por um isolador conidial, originário de um sunstrato fúngico no solo Europeu. Pela escolha dessa extenuação como neo-tipo para roseum Ρ. o epíteto é anteriormente ligado ao fungo do solo comum usado no bio-controle da patogênese fúngica das plantas, O anamorfo do ocroleuca Bionectria (HypocreaIes) é morfologicamente diferente da rósea C; ambos morfos são reescritos. A Bionectria pe genericamente distinta da Nectria s.s. e é um gênero apropriado para espécies do ocroleuca Nectria. O gênero anamorfo Gliocadium s.s. é associado ao teleomorfos Sfaerostibela e Hipocrea série Palidae. Com a separação do Clonostachys do Gliocadium e Bionectria da Nectria o gênero de classificação reflete o natural relacionamento. Uma genérica circunscrição é proposta para o Clonostachys e comparada com o Gliocadium. O esporangicola Nectropsis e rufula Raumegueriella são relacionados à Bionectria mas tem distinta anamorfo como Gliocadium. Baseado nas características morfológicas, o gênero mixofilum Ropalocladium e sp. Nov. é proposto para o anmorfo N. esporangicola. O anamorfo de rufula Roumegueriela geralmente encontrado na associação como o teleomorfo é referido como do tipo Gliocadium. Nem todos os endófitos respondem às plantas da mesma forma. Os endófitos são conhecidos para plantas saudáveis infectadas, através de feridas, por exemplo, danos mecânicos causados por insetos ou doenças e na mesma instância de pesquisas tem se documentado certos endófitos para prover alguma proposta para a doença da planta ou controle de peste de insetos. Entretanto, pouca ou nenhuma documentação tem sido fornecida mostrando que os endófitos agem como inoculantes para promover a saúde da planta ou vigor e capazes de prover "resistência à planta induzida por inoculante natural(IIR) à agressão do meio ambiente. Além disso, pouca ou nenhuma informação tem sido fornecida para mostrar que específicos endófitos como a rósea Clonostachys de estirpe 88-710 quando atuando como inoculante também coexistem com outros benéficos fungos, bactérias, ou vírus para prover aditivo ou estimulados benefícios de crescimento. Por exemplo, não há conhecimento ou informação que demonstrem que u m fungo esp., como um endófito, por exemplo rósea Clonostachys de estirpe 88-710 possam agir como inoculante para estimular a produção de nódulos de fixação de nitrogênio nos legumes, como na soja. Até esta invenção, somente se acreditava que somente naturais bactérias existissem, por exemplo rizóbio eram capazes de produzirem e estimulares a produção de nódulos de fixação de nitrogênio em plantas Ieguminosas e reduzindo a dependência de fertilizantes químicos. Esta invenção ensina que a rósea Clonostacys estirpe 88-710 pode agir como um inoculante para estimular e aditivar (beneficamente interagindo com bactéria fixadora de nitrogênio) na produção de nódulos fixadores de nitrogênio em legumes, como na soja. Esta invenção descreve novos exemplos/peculiaridades sobre os endófitos como os de estirpe 88-710 da rósea Clonostachys que são novos, inventivos, adequados para novos ensinamentos. Os fungos chamados de rósea Clonostachys (résea C) ocorrem em todas as partes do mundo em várias fomas/variações e em variadas zonas de climas, tendo sido mais freqüentemente caracterizado como próximo (morfologicamente) correlato à Penicilina com conidia delgada/adesiva. O exemplo a ser seguido e a função da Penicilina ssp. Como inoculantes, é bem documentada, m as a função inoculante e o modo de ação está diretamente ligada ao endófito rósea C, não sendo bem documentada, quantificada ou demonstrada, até o surgimento desta invenção. Até recentemente, o exemplo a ser seguido e o modo de ação dos endófitos como a rósea C não eram completamente compreendidos; sendo a maioria dos estudos sendo conduzidos na presença de doenças na planta e não na ausência ou próximo à ausência de doenças na planta. Os dados apareceram não somente para medir ou indicar que a rósea C ou roseum Gliocadium ( como anteriormente conhecido) pode controlar várias infecções fúngicas de plantas como uma agente bio-controlador, por exemplo de micro-parasitas ou hiper-parasitas pela exsudação de antibióticos, metabólitos ou enzimas micro-parasíticas. Entretanto, como esta invenção mostra, os endófitos como a rósea C, estirpe 8 8-710 não diretamente controlam as doenças bacteriais ou fúngicas nem tem direta mitigação do controle de pestes de plantas, ou seja de doenças, insetos, óbolos, etc, pela exsudação de antibióticos metabólitos tóxicos ou enzimas. Mais apropriado ainda como novidade desta invenção será demonstrado que a rósea C atua como um verdadeiro inoculante no tecido da planta promovendo a saúde da planta, tamanho, crescimento da raiz, ou aumento da produção podendo ainda auxiliar na redução ou eliminação do uso de fungicidas químicos, que concedem resistência natural induzida à planta com adequadas formulações para stress do meio ambiente como doenças de plantas, redução da umidade, insetos e óbolos. Isto ocorre principalmente por ter rapidamente a habilidade de colonizar o tecido da planta (revivendo ou envelhecendo o tecido), concedendo resistência à planta pela ocupação do tecido e assim protegendo este tecido de ser infectado por organismos doentes , e outras agressões assistindo à planta com ricos nutrientes. A presente invenção também descreve a rósea C de estirpe 88-710 como benefícios para a saúde da planta independente se uma patogênese está presente, com conseqüente características de bio-controle não verdadeiras. O modo de ação da rósea C de estirpe 88-710 então aparece entre as habilidades de prover uma rápida presença como um "inoculante ocupador de especo" para folhas, talos, e raízes, pela promoção do vigor da planta, saúde e crescimento da mesma, redução da agressão como prevenção da perda da biomassa da raiz durante a poda do talo ou tronco. Esta habilidade ajuda a planta reter boa massa/crescimento das plantas recuperando-as do choque da poda (efeito bonsai) resultando em rápida regeneração do crescimento do talo e melhor utilização dos nutrientes. Ele também age da mesma forma sobre o stress da planta se esse stress for causado pelo meio ambiente ou cultural. Além disso, os endófitos como a rósea C, estirpe 88-710 são apropriadas para o aperfeiçoamento da solubilidade/viabilidade dos nutrientes das plantas, como por exemplo, do fósforo (Referência: Tilak. K.V. B.R et al "Diversity of Plant Growth and Soil Health Supporting Bactéria", July 2005, Current Science Vol 89 No. 1). Esta nova invenção mostrará que o estirpe 88-710 da rósea Clonostachys age como um intensificador do nitrogênio, fósforo e potássio, como micro-nutrientesnas plantas podendo agir como aditivo/complementar à bactéria rizóbio fixadora de nitrogênio. Além disso, essa invenção demonstra que os endófitos como a rósea C podem ser combinados com outras bactérias benéficas, ou fungos, devido ao fato que o estirpe 99-710 da rósea não é tóxico para os referidos organismos, ou seja não emite metabólitos tóxicos, antibióticos ou enzimas para outro fungo bio-controlado ou micro-parasita. Uma característica chave dos benefícios dos inoculantes é que os verdadeiros inoculantes podem sem adicionados/misturados juntamente para mútuo benefício, ao contrário dos agentes bio-controlados. A invenção ainda mostrará que alguns endófitos como a rósea C estirpe 88-710, são mais especializados por possuírem a habilidade de penetrar no interior dos tecidos das raízes, folhas, talos, etc. das plantas tendo direto acesso aos compostos orgânicos presentes na apoplast. Uma vez que no interior da apoplast dos tecidos das plantas, os endófitos como a rósea C poderão sobreviver e emitir voláteis compostos que promovem a saúde da planta, bem como induzem a planta a se auto-proteção dos vários fatores de stress via IRR (resistência induzida inoculante) como por exemplo, infecções por doenças (biotrites, fusarium, pitium, etc.) e ou ataque de inseto/óbolo. A rósea C tem a única característica o benefício inoculante de revitalizar ou envelhecer o tecido da planta e ainda permanecer dormente ou usar o tecido como alimento para prover as plantas com nutrição, apesar de o tecido da planta puder ter sido ferido por uma doença, inseto ou óbolo. Todos esses efeitos ora descritos são novos, inventivos de com adequadas características para os endófitos agirem como inoculantes. Como indicado, os endófitos poderão ainda promoverem o crescimento diretamente pela fixação do nitrogênio isoladamente ou em combinação com uma bactéria fixadora de nitrogênio e ou pela solubilização de minerais, como fósforo, e prover a produção de sideróforos não tóxicos para solubilizar ou isolar ferro e outros micro-nutrientes chaves (manganês, zinco, etc.). A aplicação acima nova e inventiva, e os novos ensinamentos desta invenção mostram os benefícios inoculantes do endófito, na promoção do vigor, saúde e crescimento da planta. Para que os endófitos, como a rósea C, estirpe 88-710 exibam referidos benefícios, o endófito, ou seja a rósea C, necessita estar presente em suficiente qualidade/quantidade e em uma adequada bio-viabiliadade de forma emulsificadora com um efetivo e rápido "ocupador deespaço", ou seja germes robustos, estáveis em uma formulação pronta. As reivindicações desta invenção provêm essas características do rápido "ocupador de espaço". Esta invenção também descreve uma aplicação de uso novo e inventivo, aperfeiçoada esporulação e estabilidade) para a produção de um endófito, por exemplo, a rósea C que otimiza a fabricação, concentração bem como a performance de um produto endófito, para vários usos como um inoculante(s). Além disso, os endófitos naturalmente ocorridos como a rósea C, estirpe 88-710 (que foi originalmente identificada à partir de algumas 1400 diferentes campos isolados (amostras) dos campos de morango de Ontário, teriam permanecido como um relativo ineficaz endófito obscuro/inoculante foi restituído efetivamente para esta invenção para prover os acima mencionados benefícios para a saúde da planta e os benefícios do recurso da redução de doenças induzidas em plantas , no combate a insetos e óbolos, tendo efetivo e prático uso (como um ocupador de espaços) nas formulações do produto contra as maiores patogêneses de plantas, insetos e pestes, como a cinérea Botritis (modelo ciriza). Sem produção chave e tratamentos físicos, os endófitos como a rósea C poderão manter-se relativamente ineficaz como inoculante. Esta invenção é também particularmente aplicável onde houver qualquer dano durante a poda, corte, aparagem das raízes, transplantes e outras ocorrências do gênero. O uso dos endófitos como inoculantes, como a rósea C, tem o potencial de oferecer um número de benefícios/recursos para auxiliar a calcular as impropriedades, falhas periódicas relativas e associados com o presente controle de peste e custo com as práticas da cultura da agricultura. Isto inclui medidas culturais e sanitárias, regulagem do micro-clima (meteorologia), além de reduzir a pesada dependência dos fungicidas sintéticos/inseticidas com conseqüências como à resistência à fungicidas/inseticidas, meio ambiente e exposição humana, sobrecarga e geral redução de custos de produção, redução de custo/necessidade de energia (até mesmo redução de gases/contaminantes para estufas de plantas, tempo para o comércio e aperfeiçoamento na qualidade da safra/colheita. Uma patente concedida, ou seja a Patente Norte-Americana No. 6.495.113 de 17 de dezembro de 2002, usando um determinado estirpe codificado ATCC # 7 4 4447 de roseum Gliocadium como um agente bio-controlador para controlar doenças causadas por patogêneses fúngicas, comoFusarium, Acochita1 Pitium, Rizoctonia em plantas para o tratamento de sementes, solo ou plantas (ervilha, feijão, canola, trigo, cevada, plantas hortoculturais e ornamentais). Patentes tem sido concedidas, como a Patente Norte-Americana No. 6.475.556 de 5 de novembro de 2002 ou a Patente Norte-Americana No. 5.334.252 de 09 de julho de 1996 para a proteção de trastes contra máculas sap ou fungos. Entretanto, nenhuma dessas patentes identificou a novidade da adequação desta invenção para o rósea Clonostachys, estirpe 88-710 ou endófitos como inoculantes benéficos para promover o vigor, saúde e crescimento nas plantas, com a ausência de doenças ou pressões dos insetos ou a combinação desses fatores com a resistência induzida às plantas aos danos do meio ambiente e outros. Em particular, como ressaltado nesta invenção, a necessidade para identificar e prover as corretas propriedades físicas para um endófito para um alto nível de inoculante "rápido ocupador de espaço" para assegurar um bom desempenho nas plantas e também para prover aperfeiçoamento nas folhas, talo, caule, crescimento das raízes e assim reduzindo os fatores de stress (meio ambiente e cultural) das plantas. Existem outros exemplos de outras patentes concedidas para endófitos, como por exemplo as Patentes Norte-Americanas No. 6.815.591 de 09 de novembro de 2004, ou a No. 5.723.720 de 03 de março de 1998, que provêm plantas através de sementes com importada resistência inseticida e tratamento de tolerâncias à estiagem para as plantas. Entretanto, novamente essas patentes não apresentam novidade e inventividade, ou qualquer adequação com relação ao aperfeiçoamento no crescimento de plantas, intensificação durante todo o crescimento da planta ou a combinação desses tratamentos com resistência inoculante para a planta aos danos e stress, como doenças, ou a habilidade para acentuar as formulações do produto endófito para prover benefício/recurso de valor agregado para permitir que as próprias plantas resistam ao ataque das pestes. Outras patentes, como por exemplo a Patente Norte-Americana No. 4.550.727 de 05 de novembro de 1985 descreve métodos usando especial misturas de solos e recipientes de como melhor combater infecção de raízes de plantas com benéfico fungo micorrizal com a finalidade de aperfeiçoar a saúde da planta, mas esses métodos não são relacionados aos endófitos para especificar endófitos como a rósea C, estirpe 88-710 ou para específicosbenefícios/recursos para a inoculação de espaços e aperfeiçoamento no crescimento. A presente invenção supera as desvantagens ocorridas no existente perante o estado da técnica, dando novos ensinamentos e informações ao domínio publico. As desvantagens são superadas por uma combinação das características/recursos das reivindicações rincipais. As sub-reivindicações revelam ainda vantajosas incorporações da invenção podendo ainda superar desvantagens e outros problemas não solucionados pelo conhecido no estado da técnica. A presente invenção provê para muitos a chave dos benefícios/recursos para o mercado comercial, procurando por exemplo:
(1) Natural produtos endófitos como a rósea C, estirpe 88-710 que poderá atuar como inoculantes para plantas provendo único recurso/benefício para a promoção da saúde, vigor e crescimento da planta e sua produção incluindo estimulação das plantas Ieguminosas para produzirem nódulos para a fixação de nitrogênio (até esta invenção era desconhecido um modo de ação dos endófitos fúngicos);
(2) Natural intensificação na safra/colheita de produtos que aumentam a produção, qualidade, reduzindo os períodos de crescimento entre o stress do meio ambiente e culturas, como estiagem, melhor utilização dos nutrientes, e assim reduzindo os custos com energia e conseqüências do ineficiente uso da energia;
(3) Pequeno ou nenhum risco do aumento ambiental ou risco de contaminação devido ao uso de convencionais pesticidas/agro-químicos ou fertilizantes;
(4) Efetiva produção de um natural bio agente em uma adequada formulação estável que conceda/acentue a "ocupação inoculante do espaço" no interior dos tecidos das plantas que poderão ser organicamente certificadas para a necessidade do mercado de crescimento, ou seja, certificação OMRI, que por sua vez;
(5) Concede e libera o crescimento e propriedades protetoras do efeito da resistência inoculante da planta contra doenças, feridas ou uma ação combinada para uma aperfeiçoada produção de safra que sejam impróprias para desenvolver face à "falta de desempenho de resistência" como aquelas dos pesticidas químicos;(6) Prover natural benefícios na cura de feridas como um inoculante que pode ser usado adequadamente em formulações (que contenham sais ou emulsificadores ) naturais podendo prover benefícios protetores à planta contra uma ampla variedade de doenças nas plantas, insetos e óbolos, etc., míldio pulverizado, óbolos duplamente maculados, afídios. Há um grande mercado interessado em ter como ferramentas agronômicas agentes que sejam ocorridos naturalmente para uso na melhoria da produção na colheita e da safra e qualidade de vida, como, produção e tempo para a comercialização qualificada com a certificação orgânica OMRI. O impacto econômico para o uso desta invenção é documentado em termos de recursos/benefícios. Soluções aos problemas recorrentes das patogêneses de plantas tem sido exploradas por décadas. Para que as safras se tornem mais abundantes e a área alocada para a expansão da agricultura, ou para a expansão de estufas de plantas, há uma inerente necessidade de empregar mais eficientes práticas agronômicas, preferivelmente aquelas benéficas providas pela própria Mãe Natureza e que ocorram naturalmente em nosso global meio ambiente. Como um resultando no aumento da demanda para produção da safra, fazendeiros devem habitualmente se comprometerem com suas práticas culturais pela plantação da safra em terra sub-otimizada, ou pelo aumento da freqüência em que as safras são plantadas em uma específica localidade. Em assim se procedendo, os nutrientes da safra são exauridos, uma substituição microbial ocorre e específicas patogêneses de safras, especialmente patogêneses dirigidas ao solo ou dirigidas às sementes se tornam mais aparentes. De acordo com isso, é muito difícil sustentar a saúde e a produtividade da safra. Tem sido muito bem documentado que espécies fúngicas da rósea C ocorrem com mais freqüência em solos virgens, em qualquer parte do mundo onde esses solos possam ser ainda encontrados; em solos exauridos ou supertrabalhados a rósea C e outros endófitos tem sido gradualmente desgastados estando próximos de ausência ou ausentes nos solos, e assim reduzindo a produtividade do solo e impedindo os fazendeiros de produzirem produtivas safras, como por exemplo, em alguns solos Africanos. A necessidade de aperfeiçoamento do solo condiciona e beneficia os efeitos de cadeia nas economias globais que poderão ser massivas. Somente a Califórnia aufere US$ 1.2 bilhões por ano com a indústria frutífera; a safra de morango éestimada em um valor aproximado de US$ 400 milhões, mas cada vez mais se esforça para minimizar as entradas de água/energia e produzir mais safras "orgânicas" para minimizar o uso de pesticidas. Há também um aumento na pressão na Europa para o uso de somente colheita organicamente aprovada entre essas ferramentas e a falta dessas ferramentas. Na instância do campo das ervilhas, como um exemplo ou no campo da safra "pulso" no Canadá, há aproximadamente 1.000.000 de hectares/ano de crescimento no campo da ervilha no Oeste do Canadá entre 1999-2005, estimado em um total valor de produção de US$ 600 milhões e outras safra de sementes de óleo como a Canola quando medida em aproximadamente 15 milhões de acres plantado anualmente entre o início dos problemas com a safra. Nos anos recentes, lentilha e outras especialidades de safas do Oeste do Canadá tem sido mais afetada por doenças dirigidas ao solo e doenças direcionadas às sementes, bem como os complexos de Ascochyta de raízes e folhagem. Conhecidas como PRRC (complexa putrefação de raízes de ervilhas), as doenças direcionadas ao solo ou direcionadas às sementes são mais comumente causadas pela patogênese Fusarium solani f.sp, pisi, oxisporum Fusarium f.sp pisi, pinodos Micosfaerella, solani Rizoctonia, esclerótio Esclerotina, euteices Aphanomices, a alternata Alternaria e o spp. Pitium. A incidência das várias doenças PRRC durante o ano e localidade, bem como sua severidade está fortemente ligada ao clima, prática culturais e rotação das safras. As perdas da produção da safra de ervilha, somente, como um resultado da patogênese PRRC incluindo infecção foliar pelo complexo Ascochyta, são freqüentemente devastadas com uma estimada perda de 15% - 20% na redução da produção traduzindo em uma perda anual de US$ 80 milhões em áreas do Oeste do Canadá A rosa e a indústria da floricultura tem estimado como produção do valor de superior à US$ 5 à US$ 6 bilhões de dólares na América do Norte ao nível de crescimento. A indústria normalmente requer 11-14 semanas de tempo usado do corte ao envio ao mercado. A habilidade para produzir um produto com mais qualidade sem uma redução em torno de 10-20 dias para o mercado (como a tecnologia desta invenção provê) é um custo muito benéfico para a indústria da flor/horticultural. A safra de vegetais de estufa, ou seja, tomate, pepino, pimenta, etc., somente no Canada tem um valor estimado de US$ 1 bilhão empregando cerca de 19.000pessoas. A indústria norte-americana é avaliada em 10 vezes mais que isso.
Perdas para estufas individuais como por exemplo o pepino plantados em uma área de produção de 44.500 m2, a produtividade da safra é freqüentemente 10-15% menos em áreas com plantas doentes onde as plantas são geralmente saudáveis. Esta perda transporta à mais de US$ 375.000 por ano. A presente invenção provê como novidade, um processo inventivo e aplicável e um método para a produção de endófitos, especificamente um fungo rósea Clonostachys como efetivos inoculantes de plantas que provêm a promoção do vigor, saúde e crescimento da planta e sua produção. Especificamente a invenção é provida para:
(1) um efetivo inoculante de planta de um produto(s) endófito compreendendo a rósea Clonostachys estirpe 88-710 com único benecífio/recurso inoculante para a promoção de aperfeiçoado vigor, saúde, qualidade, crescimento e produção da planta;
(2) um processo para fabricar o produto(s) que provenha vários níveis de germes altamente viáveis e estáveis e material de micélio em uma formulação estável com natural emulsificadores que previnam a degradação de um endófito rósea C estirpe 88-710 vivo, permitindo a rápida ocupação de espaços na planta;
(3) formulações do produtos que permitam/capacitem o uso e aplicação prática do produto(s) para sementes, raízes, folhas, flores, bulbos, etc. de plantas, como formulações pulverizadoras baseadas em água, como pós ou concentrados de germes para outros usos incluindo a aplicação de equipamentos/dispositivos do uso prático para cultivadores, como tratamento da semente, ou vetor do inseto, equipamento de irrigação;
(4) permitir ao(s) produto(s) endófito(s) quando aplicado à sementes, raízes, caules, talos, folhas, flores, podas, ou cortes da superfície das plantas agir como um inoculante de "acentuado ocupador de espaços e rápido colonizador" nointerior dos tecidos das plantas;
(5) produto(s) endófito(s) que provenham aperfeiçoado crescimento de raízes, folhas, talos, caules e ou germe vegetativo (flores) para plantas enquanto reduzem o envelhecimento das plantas, bem como;(6) a redução do stress causado pelo meio ambiente ou cultura das plantas, como a perda de raízes, devido à poda, aparagem, corte e semeadura, transplante ou outros esforços danosos com o resultado final de;
(7) aperfeiçoada qualidade de safra/colheita, aperfeiçoado enraizamento, aperfeiçoada emergência/germinação e rápido desenvolvimento para acomercialização da safra/colheita e ainda permitir que;
(8 os produtos (como endófitos) poderão ser formulados em produtos com valores agregados que provenham como único recurso/benefício a natural resistência induzida à planta à doenças fúngicas como míldio pulverizado, biotritis, putrefação de raízes, deterioração de sementes, doenças agrestes, e ou insetos/óbolos;
(9) produto(s) endófito(s) que provenham aperfeiçoado crescimento de raízes, folhas, caules, talos, troncos e ou germes vegetativos (flores) para plantas, bem como
(10) uma rósea Clonostachys estirpe 88-710 com um único código genético que diferencia o endófito de outro tipo de estirpe de fungo rósea Clonostachys ou roseum Gliocadium, como um estirpe que não produza o estado sexual (teleomorfo) e sim o anamorfo referido como ocroleuca Bionectria que é morfologicamente distinto da rósea C.;
(11) uma rose Clonostachys estirpe 88-710 agindo como um inoculante para estimular e ter um efeito aditivo com rizóbio na produção de nódulos de fixação de nitrogênio nos legumes e aperfeiçoamento no crescimento de como por exemplo, feijão, soja, ervilha, e alfafa.
A invenção se relata à um processo e método para a produção e uso de endófitos como inoculantes para plantas que provenham únicos recursos/benefícios para a promoção do vigor, saúde, crescimento e produção de plantas compreendendo o grupo fúngico da rósea Clonostachys. Ela também relata um processo e método para produzir economicamente quantidades aceitáveis de uma preparação conidial fúngica de rósea Clonostachys utilizando um discreto sistema de fermentação sólida. A invenção ainda relata um produto(s) endófito(s) produzido pelo referido método e processo. O referido produto poderá compreender rósea Clonostachys, estirpe 88-710 e o processo para a fabricação de produtos prover vários níveis de germes de altaviabilidade/estabilidade e material de micélio em uma formulação estável que previna a degradação de um endófito rósea C de estirpe vivo. O(s) produto(s) endófito( s) compreendendo a rósea Clonostachys, estirpe 88-710 é único em termos de perfil genético e como o estirpe do endófito não produz o estado sexual (teleomorfo) e sim o anamorfo referenciado como ocroleuca Bionectria que é morfologicamente distinto da rósea C. 0(s) produto(s) endófito(s) poderão compreender um substrato sólido de, por exemplo, certos cereais, como, centeio, que contém suficientes emulsificadores naturais nas formas de várias proteínas, lígneos, para prover a produção de germes/micélios da rósea C com excelentes naturais agentes de dispersão/umedecimento/adesão que permitam a rápida ocupação do espaço em plantas para uso em formulações EndoFine®, como, tratamento de sementes, sem ter de adicionar outros emulsificadores para a dispersão e uso. A formulação do produto permite/capacita o uso e aplicação prática do(s) produto (s) para raízes, caules, talos, folhas, flores, bulbos, etc. de plantas como formulações pulverizadoras baseadas em água ou como pó ou outros usos, como no tratamento de sementes, pós vetores para insetos/óbolos. O produto quando aplicado em sementes, raízes, talos, folhas, flores, poda ou corte da superfície das plantas possibilita o endófito a agir como um inoculante "acentuado ocupador de espaço" dentro dos tecidos das plantas. O produto provê aperfeiçoadas raízes, folhas, caules, talos, ou germes vegatativos (flores) e crescimento para plantas aperfeiçoando a germinação e emergência das sementes. O produto provê a redução do stress do meio ambiente ou cultural, como perda das raízes, devido à poda, aparagem, corte ou outras agressões. O produto provê aperfeiçoada qualidade de safra e colheita e rápido desenvolvimento em sua comercialização da safra/colheita. O produto provê a redução da dependência de pesticidas químicos para o controle de pestes, como o controle de Botritis, Fusarium. Pitium, spp. e outros. O produto poderá ser usado para a produção de uma variedade de estufas de plantas domésticas, e para a safra de colheita no campo da horticultura e da agronomia. A composição da invenção poderá ser uma composição incoulante de planta compreendendo germes rósea Clonostachys, conidia, ou micélio ou na mistura com um diluente ou condutor agro-quimicamente aceitável. A invenção ainda refere-se a um método de melhora do crescimento, saúde, vigor e produção de uma planta cujométodo compreende a aplicação da composição inoculante da planta da invenção para uma planta ou no local da planta. A invenção ainda relata um método de combate do fungo de uma planta que compreende a aplicação de uma quantidade efetiva de anti-fúngicos da composição da invenção para um fungo danoso pela ocupação do local alvo da infecção ou habitat do referido fungo ou interditando a fonte de alimentação do referido fungo. O endófito da invenção poderá compreender a rósea Clonostachys estirpe 88-170 que age como um inoculante para estimular tendo um efeito aditivo com o rizóbio na produção de nódulos de fixação de nitrogênio em legumes (como no feijão, soja, ervilha, e alfafa) levando à intensificação do crescimento. O endófito da invenção quando compreendendo a rósea Clonostachys estirpe 88-710 provê benefícios de cura de feridas como um inoculante, que por sua vez quando formulado em apropriadas formulações poderá prover benefícios protetores adicionais à planta contra uma ampla variedade de doenças de plantas, insetos e óbolos, como míldio pulverizado, óbolos duplamente maculados e afídios (pulgões). O endófito da invenção quando compreendendo a rósea Clonostachys estirpe 88-710 poderá ser combinado com hormônios de raízes, como ácido butírico-3-índole (IBA) para prover mais benefícios inoculantes às raízes no corte/transplante de plantas. O endófito rósea Clonostachys estirpe 88-710 poderá ser combinado com hormônio de raízes como ácido butírico-3-índole (IBA) para prover benefícios mais inoculantes às raízes nos cortes/transplantes de plantas para uso com equipamento robótico em formulações que não interrompam o equipamento sensor robótico por absorver partículas de pó no sensor sensitivo no material da planta durante o transplante. A invenção relata ainda a produção e uso de um processo pelo qual os endófitos como produtos inoculantes especificamente do exemplo do estirpe 88-710 que provê a acentuada promoção do vigor, saúde, crescimento e produção da planta. O método de produção do endófito, rósea C. estirpe 88- 710 provê a produção economicamente aceitável de uma preparação conidial fúngica utilizando uma discreta sistema de fermentação de substrato sólido; o método resultando em efetivos níveis de inoculação em germes e micélios em formulações de produtos de aplicabilidade prática e estável. Especificamente, o endófito, como a rósea Clonostachys, anteriormente denominada róseum Gliocadium, com um específico estirpe 88-710, que é geneticamente e reprodutivamente diferenciado de outros estirpes de Clonostachys ou Gliocadium, sendo usado como um exemplo para prover um alto nível de inoculante de "ocupação de espaço" com grande desempenho para plantas, que por sua vez provem aperfeiçoadas sementes, folhas; talos, raízes, crescimento e produção pela redução dos fatores de stress (meio ambiente e cultural) no crescimento das plantas. A invenção ainda provê a novidade de um endófito rósea Clonostachys estirpe 88-170 atuando como um inoculante para estimular e ter um efeito aditivo com a bactéria rizóbio na produção de nódulos de fixação de nitrogênio em legumes, e acentuação no crescimento, como em feijão, soja, ervilha e alfafa. A invenção também provê único uso e novidade no que os endófitos, como a rósea Clonostachys estirpe 8 8-170 poderá ser formulado/usado para prover benefícios de cura de feridas, quando formuladas com sais adequados e emulsificadores naturais (proteínas, ácido láctico) podendo prover benefícios protetores adicionais às plantas contra uma ampla variedade de doenças de plantas, insetos e óbolos, como por exemplo, míldio pulverizado, óbolos duplamente maculados, afídios. A rápida colonização e uso da formulada rósea Clonostachys estirpe 88-710, como o da marca EndoFine®, provê benefícios/recursos de produção para plantas em termos de, mais rápida emergência/germinação, menor tempo de produção, mais rápida colheita e safra e comercialização e qualidade. A invenção é aplicada à várias espécies de plantas e safras agronômicas, como rosas,pepinos, tomates, pimentas, cereais, legumes, etc, cultivados em estufas ou em condições de campo sob uma variedade de métodos culturais, como, hidropônicos, sementes, cortes, transplantes, cultivação de campo, etc.. Específicas formulações de rósea Clonostachys provem único inoculante benéfico para plantas que reduzem o stress da planta para acentuar no todo, o crescimento, saúde, produção e qualidade incluindo prevenindo infecções via indução da resistência da planta contra doenças e pestes e assim reduzindo os pesticidas químicos para o controle da peste. A invenção será melhor compreendida na descrição detalhada dos desenhos em anexo, apresentados em caráter exemplificativo, e não limitativo, nos quais:
- A Figura 1 mostra a germinação do Clonostachys (EndoFine®) nos tecidos das plantas de morango que foram tratadas pela imersão na suspensão EndoFine;- A Figura 1A mostra a germinação do Botritis nos tecidos das plantas de morango que forma tratadas por imersão em suspensão EndoFIne por 2 minutos plantada em potes e amostradas 15 dias depois por Botritis nos tecidos das Plantas de Morango. As plantas foram tratadas com 10g de EndoFine®/L;
- A Figura 2 mostra os efeitos da rósea Clonostachys e clorografis Pseudomonas na área da folha do pepino;
- A Figura 3 mostra os efeitos da rósea Clonostachys e clorografis Pseudomonas em massas secas de raízes, feridas em todas as plantas de pepinos hidropônicos;
- A Figura 4-8 mostram os resultados dos testes com inoculante em estufa de soja;
- A Figura 9 mostra a colonização de feridas na planta da rosa e usando somente EndoFine nas raízes em combinação com o composto de raízes I BA;
- A Figura 10 mostra os ganhos de peso das raízes da planta da rosa usando somente EndoFine e em combinação com o composto de raízes IBA.
Como empregado acima e em toda a revelação, os seguintes itens a menos que contrariamente indicados serão entendidos para ter o seguinte significado: Endófito é definido como "fungo ou bactéria que forma infecções sem sintomas, para parte ou todo o ciclo de vida na saúde das folhas e nos talos das plantas" (Definição por Hawksworth et al, 1995). Esta invenção também indica que a definição de endófitos como a rósea C poderão incluir vida dentro das raízes das plantas e crescimento para ser parte da interia rizosfera da planta e ter a habilidade de reduzir ou converter minerais em formas mais fáceis de serem absorvidas pelas plantas. A rósea Clonostachys anteriormente roseum Gliocadium é um fungo endófito como definido em "Compendium of Soil Fungi" vol 1 Domsch, K.H., Gams, W adn Anderson, Traute-Heidi Academic Press 1980 pgs. 369-374. Um "endófito ocupador de espaço" é definido com um significado de um endófito (fungo/ bactéria) que ocupa a apoplasta no interior dos tecidos/membranas das células. Inoculante é definido como um micróbio benéfico que promove a saúde, tamanho, raiz e crescimento da planta ou aumenta a produção e auxilia na redução ou eliminação do uso de fungicida químico. Um nódulo leguminoso, como feijão,soja, ervilha, e alfafa, que ocorrem nas raízes das plantas que se associam com bactéria simbiótica sob condiçõeslimitadoras de nitrogênio. Um relacionamento simbiótico é defini do como uma próxima, prolongada associação entre dois ou mais diferentes organismos de diferentes espécies que poderão ser, mas não necessariamente, benéficos à cada membro ou tendo um relacionamento de mútuo benefício ou dependência. A detalhada descrição da invenção será detalhada no resumo e nas reivindicações. A presente invenção provê um método e processo para a produção e uso de:
(1) um efetivo inoculante de planta de um produto(s) endófito compreendendo a rósea Clonostachys estirpe 88-710 com únicos recursos/~benefícios inoculantes para a promoção de aperfeiçoado vigor, saúde, qualidade, crescimento e produção da planta;
(2) um processo para fabricar o(s) produto(s) que provenha para vários níveis de germes de alta estabilidade/viabilidade e material de micélio em estável mas em formulações emulsificadas naturalmente que venham prevenir a degradação de um endófito rósea C estirpe 88-710 vivo enquanto provê excelentes características de dispersão;
(3) formulações do produto que permitam/possibilitem o uso e aplicação prática do produto(s) para sementes, raízes, caules, talos, troncos, folhas, flores, bulbos, etc. de plantas como formulações pulverizadoras baseadas em agu a, como um pó ou concentrados de germes para outros usos incluindo a aplicação em equipamentos/dispositivos de uso prático para cultivadores, como tratamento de sementes, ou vetores de inseto s, spray ou equipamento de irrigação;
(4) que permita o produto(s) (endófito) quando aplicado à sementes, raízes, caules, talos, folhas, flores, poda, ou corte das superfícies das plantas agirem como um inoculante "acentuado ocupador de espaços e rápido colonizador" no interior do tecido das plantas;
(5) e produto(s) endófito que provenham aperfeiçoadas raízes, folhas, talos, ou germes vegetativos (flores) e crescimento reduzindo o envelhecimento da planta;
(6) bem como reduzido o stress do meio ambiente ou cultural para as plantas, como à perda de raízes devido à poda, aparagem, cortes e semeadura, transplante ou outras agressões com o resultado final de:(7) aperfeiçoada qualidade de safra;colheita, aperfeiçoadas raízes, aperfeiçoada emergência/germinação e rápido desenvolvimento para comercialização da safra e ainda permitindo que;
(8) o produto(s) (como endófitos) possam ser formulados em produtos com valores agregados que provenham únicos benefícios/recursos para prover natural resistência induzida à planta contra doenças fúngicas como míldio pulverizado, botritis, putrefação de raízes, decadência das sementes, doenças agrestes e insetos/óbolos;
(9) o produto(s) endófito que provê aperfeiçoadas raízes, folhas, talos ou germes vegetativos (flores) e crescimento para plantas, bem como
(10) uma rósea Clonostachys estirpe 88-710 com um único código genético que diferencia o endófito de outros estirpes fúngicos da rósea Clonostachys ou roseum Gliocadium, como os estirpes que não produzem estado sexual (teleomorfo) mas sim o anamorfo referido como ocroleuca Bionectria que é morfologicamente distinto da rósea C;
(11) uma rósea Clonostachys estirpe 88-710 agindo como um inoculante para estimular e ter um efeito aditivo com rizóbio na produção de nódulos de fixação de nitrogênio em legumes, acentuando o crescimento de por exemplo, feijão, soja, ervilha e alfafa.
Exemplos 1 à 3 (abaixo) resumirão o método para a produção e preparação de um efetivo e estável (colonizador) produto endófito incoulante contendo rósea Clonostacys estirpe 88-710. O Exemplo 4 detalha os meios pelos quais o endófito rósea C quando aplicado em um inoculante permite o inoculante agir como um "avançado ocupador de espaço" no interior dos tecidos das plantas. Esta ação por sua vez, provê o aperfeiçoado crescimento de raízes, folhas, talos e/ou germes vegetativos (flores ou frutas ) e crescimento das plantas como ilustrado nos Exemplos 5 e 6. Nas Tabelas 1 e 4, e 5 testes (operações com estufas comerciais envolvendo cerca de 150.000 miniaturas de vasos com plantas de rosas) demonstraram a atividade de consistência da rósea C para aperfeiçoar a qualidade de produção em termos de mais germes florais, menor envelhecimento das folhas, e menor período de crescimento para a comercialização das plantas. Os Exemplos 7 a 11 ilustram a redução do stress do meio ambiente e cultural para planta, como a perda de raízes devido à poda,aparagem, corte, semeadura, transplante ou outra agressão com o resultado final de (7) aperfeiçoar a qualidade da safra/colheita e mais rápido desenvolvimento da comercialização da safra. A poda das plantas da rosa para estimular o desenvolvimento do germe usualmente resulta em um perda de 40%-50% da massa bruta da raiz; o stress resultante às plantas ocasiona a produção de açúcar pelas plantas para compensar o stress da poda (notar que similar efeitos ocorrem à vários problemas ambientais e stress cultural). Isto torna a raiz suscetível à doenças de raízes, como fusarium, pitium. A rósea C age como um inoculante "ocupador de espaço" para prevenir que o açúcar seja consumido pela patogênese da planta danosa e desta forma permite que as reservas de açúcar da planta se mantenham existentes na massa da raiz promovendo mais rápido ciclo vegetativo e crescimento das folhas, bem como melhor produção, comercialização e maior qualidade das plantas.
PREPARAÇÃO DE UM EFETIVO PRODUTO ENDÓFITO INOCULANTE ESTÁVEL CONTENDO RÓSEA CLONOSTACHYS
EXEMPLO 1
O único método de preparação e know-how ligado à performance das reivindicações desta invenção envolve a identificação dos padrões do desempenho que produzem: **
(1) um percentual aceitável de recuperação de um mínimo de 60% de germes viáveis/estáveis à partir de uma matriz sólida;
(2) um alcance analítico: de 0.1 a 5 χ 10 até a 9a ou (maior) CFU para puro poder
inoculo (concentrado). Preferidas concentrações alcançam de 104 a 1012 CFU/gramas, especialmente de 106 à1010 CFU/gramas, particularmente de IO7 à 10to CFU/grama, e mais especialmente de 107 à 109 CFU/gramas;
(3) um método para medir um mínimo limite de quantificação de 2 χ 3.7 χ 10 à 8a CFU/grama (ou maior) para formulação de uso final acabada. Essas formulações usualmente são diluídas pela mistura com diluente agro-quimicamente aceitável. A diluição poderá ser de qualquer espécie a partir de 2 à dez mil vezes mais (usualmente), ainda que diluições de entre 10 à dez mil vezes mais são mais preferidas e diluições de 15 à 100 vezes maiôs são especialmente preferidas na maioria das situações;(4) uma limitação de detecção para germes viáveis de 0.1 χ 5 χ 10 à 9a e mais;
(5) % CV de repetição: 85% (dentro do laboratório) ou mais;
(6) % CV de reprodutibilidade (entre laboratório) 85% ou mais.
** (também notar as referências: Schroeder's, H.J. Samuels, G.J., Siefert1 K.A. & Gams, W. (1999) Classificação da mio-parasita roseum Gliocadium em rósea Clonostachys, seu relacionamento com a ocroleuca Bionectria e ainda notar o outro Gliocadium como fungo. Mycologia 91, 365-383. Domsch, K.H., Gams, W., Anderson, Traute-Heide (1980) Compendium of Soil Fungi Volume 1, Academic Press, A Subsidiary of Harcourt Brace Jovanovich, Pusblisers) Produção da Conidia Viável pela Fermentação de Substrato Sólido A preparação de um endófito estável e efetivo inoculante contendo a rósea Clonostachys envolve o cultivo das células da rósea Clonostachys em um substrato sólido. A preparação de novos vegetativos ou culturas conidiais de rósea C (inoculo) é realizada pela incubação de uma pura cultura em um adequado nutriente médio como Agar Dextrose de Batata ou Agar de Extrato de Malte (fonte PDA de Adjuvants Plus, Inc., o Extrato de Malte poderá ser obtido de um ou mais fornecedores comerciais), permitindo as culturas à incubarem/germinarem por aproximadamente 7-20 dias dependendo da temperatura e umidade. Alternativamente, as culturas poderão ser transferidas para um ou mais líquidos ou meio de substrato sólido como grão cereal, nutriente enriquecido com vermiculita ou outra matriz sólida , e permitindo a colonização do referido substrato no sentido de facilitar a melhor dispersão durante a inoculação. Um particular material (ou uma mistura do mesmo) capaz de reter suficiente umidade e nutrientes requeridos para sustentar o crescimento e promover a germinação das culturas da rósea C é introduzido em um liqüidificador rotativo capaz de alcançar e manter temperaturas e pressões solicitadas para a esterilização do material. Uma típica mistura contém um grão cereal ou outro substrato sólido, como centeio, painço, ou vermiculita, giz ou gesso e suficiente água para produzir um produto acabado contendo aproximadamente 45-55% de umidade e um pH entre 6.6 e 7.7. Uma única característica desta invenção do substrato sólido, é que certos cereais, como centeio, contém suficientes naturais emulsificadores na forma de várias proteínas, Iignans para prover o germe rósea C com excelente naturais agentesdispersantes/úmidos/adesivos para uso em formulações de EndoFine® como por exemplo no tratamento de sementes. A mistura do nutriente é combinada e esterilizada pelo aquecimento à aproximadamente 125° C e mantida nesta temperatura por 20-45 minutos como necessário para alcançar adequada esterilização. A mistura esterilizada é resfriada à uma temperatura inferior à 50° negativos e a inoculação da rósea C, como acima descrito, é introduzida assepticamente no vaso misturador. Uma vez introduzida, a inoculação é totalmente misturada e dispersada inteiramente em um material substrato estéril, conectado à um sistema de preenchimento de uma bolsa por meio de um conector estéril e preenchida em bolsas de polietileno estéril contendo tiras de aspiração micro-porosas. As bolsas preenchidas são imediatamente vedadas em um ambiente claro e limpo e transferidas para um adequado ambiente de crescimento para incubação e crescimento para atingir a maturidade. Alternativamente, a o material particular poderá ser pré-misturado, introduzido em bolsas, bandejas ou outros adequados recipientes e esterilizado no local. O substrato particular estéril poderá então ser misturado com uma adequada inoculação da rósea C e permitido para o crescimento para maturidade. O substrato preparado e inoculado, em bolsas, é incubado em temperatura ambiente 18-24° C até o substrato ser densamente colonizado com o micélio da rósea C (aproximadamente 6 dias); cuidado é tomado para permitir a troca de ar, para eliminar o excesso de água nas bolsas e permitir para sempre o crescimento do micélio por um período de 7-28 dias dependendo das condições.
A continuada incubação produz germes dos fungos com 6-10 semanas de inoculação dependendo das condições do crescimento. O substrato colonizado poderá ser periodicamente agitado para assegurar a uniformidade do crescimento, promover a germinação e maximizar a produtividade. Após a germinação, o grão colonizado é moído e o produto é sortido através de uma peneira vibratória em 100, 4 0 ou vários tamanhos de malha; vários tamanhos de malha são usados para preparar finais formulações dependendo dos usos. O concentrado final 100, 40 ou vários tamanhos de malha deverão conter um mínimo de 10 até a 10a CFU viável (unidades de formação de colônias) germe/gramas.Novo Método para a Medição do Número de Germes Viáveis por Grama do Produto
EXEMPLO 2
A invenção também envolve o desenvolvimento de um consistente método para determinar o número viável de germes por grama do pó (germes/g CFU). Isto foi realizado pela colocação de 0.1 g do pó em 9.9 de água destilada estéril em um tubo de teste estéril. (= 10 minutos 2 diluições). Agitar intensamente, e continuar a diluição em série com 1.0 ml em 9.0 ml cada vez. Um ponto zero ml (0.1 ml) de cada diluição é então colocada em PDTSA (em fonte de estufa de Adjuvants Plus Inc.) em patros Petri ao menos 3 replicações. Os patros Petri são então incubados por 4-5 dias até as colônias serem desenvolvidas, e contadas as colônias. Múltiplos de colônias contadas pelo fator de diluição darão o número viável de germes (colônia - produção) por grama de pó. Por exemplo, a primeira diluição de 10 menos 2 se torna 10 à 3 uma vez que somente 0.1 foi usado para o plantio, de modo que nesta instância o múltiplo da colônia será por 1000. Para determinar o número de germes viáveis de substrato do grão por grama, 1 g do grão seco é amostrado aleatoriamente à partir da inoculação armazenada. Os grãos são agitados em água destilada esterilizada mais surfactante (em fonte de Adjuvants Plus, Inc.) à 110 rpm por 10 minutos, filtrada a suspensão do germe através de 3 camadas de tecido de algodão, estimando a concentração do germe com auxílio de um hemacitômetro e continuando a diluição em série com 1.0 ml em 90 ml cada vez, se necessário.
Preparação de Formulações do Produto Adequado Estável da Rósea C
EXEMPLO 3
Todos endófitos bacterial/fúngico vivo são altamente suscetíveis à degradação devido ao número de fatores, como altas temperatu rãs (4o C ou mais), halogênios no a, como água clorada, contaminação bacterial, etc. Esta invenção também envolve a preparação de uma nova formulação que provê estabilidade para germes viáveis e para a formulação de produtos para aplicação e uso prático para raízes, caules, talos, folhas, flores, bulbos, etc. de plantas como formulações puIverizadoras baseadas em água ou um pó para outros usos, como tratamento de sementes. O objetivo com formulações finais é ter germes viáveis estáveis no produto acabado em vários níveis desejados, ou seja, à partirde 0.1 para mínimos de 2 X 107 germes/g. ou mais. O pó ou polvilho fino do concentrado rósea C (100 malhas) é misturado com um condutor inerte (carbonato de cálcio 15-30%w/w ; talco 13-15%w/w e sulfonato de dibutilanaftalina sódio (75-78%w/w, e sulfato de sódio 13-20%w/w) por um produto exemplo EnfoFine® de 14.5%w/w de pó concentrado de rósea C: 85% w/w de talco/carbonato: 0.5% de sulfonato dibutilanaftalina sódio misto w/w. Diferentes produtos EndoFine® poderão ser feitos com o concentrado rósea C, como por exemplo, 2.5 X 10 à 8a CFU/g ou mais para a adequar a saída para as sementes e outras formulações para uma variedade de usos. Basicamente, a proporção de mistura é determinada pela densidade dos germes da rósea C contidos no produto em pó. Os produtos acabados poderão ser armazenados em recipientes à prova de água à 4o C por um período de 1 ano ou mais antes do uso (ver exemplo 14). O produto poderá ainda ser movido dentro ou fora de um recipiente refrigerado e mantido em temperatura ambiente por mínimos períodos sem afetar a degradação ou viabilidade da rósea C na formulação acabada.
O ENDÓFITO RÓSEA C COMO UM INOCULANTE PARA AGIR E ACENTUADO OCU PADOR DE ESPAÇO NO INTERIOR DO TECIDO DE PLANTAS E CONCEDENDO RESISTÊNCIA INOCULANTE À PLANTA CONTRA DOENÇAS, INSETOS E ÓBOLOS
EXEMPLO 4
A amostragem do tecido da folha, talo, e da raiz de plantas tratadas de várias colheitas, como rosas (ambas no campo ou em estufas ver Tabelas 1 à 10, tendo indicado que as aplicações do produto rósea C (preparado como sublinhado acima)), são hábeis para penetrar e colonizar talos, folhas e raízes. A amostragem também indicou que a rósea C foi hábil para o crescimento rápido em tecidos naturalmente envelhecidos ou estressados das plantas e contínua germinação após o tratamento. Nas Tabelas 1 e 2 (abaixo). O desenvolvimento do endófito da rósea Clonostachys, estirpe 88-71 Om foi estabelecido em plantas de rosa tratadas de todos os tratamentos em todas as vezes de amostragens, ou seja, a rósea C estava presente dentro das folhas, talos e raízes. A rósea C estava ainda presente nas folhas envelhecidas. Nenhum outro organismo patogênico foi recuperado de folhas e talos incubados no laboratório, como cinérea Botritis - alternate Alternaria, ou seja testes foram completados naausência ou próximo da ausência da doença para demonstrar os benefícios/recursos inoculantes. As Tabelas 8-10 (abaixo) ilustram a colonização da rósea C estirpe 88-710 em muitas variedades de morangos como um tratamento de imersão para transplantes que foram subseqüentemente cultivados em estufa para maturidade.
As diferenças no crescimento como medido na massa seca (todas as variedades de morango) tratados com EndoFine® foi de 122% acima das plantas não tratadas.
A Tabela 9 ilustra a habilidade da rósea Clonostachys, estirpe 88-710 para dar natural resistência às plantas contra doenças à plantas tratadas contra plantas não tratadas, como botritis em morangos após um tratamento profundo de transplante (ver também exemplo 18, Tabela 18 re-proteção contra míldios pulverizados, insetos e óbolos).
O PRODUTO ENDÓFITO DE RÓSEA C PROVENDO APERFEIÇOADO CRESCIMENTO DE SEMENTE. GERMINAÇÃO, RAIZ, TALO, E OU GERME VEGETATIVO (FLOR) PARA PLANTAS E APERFEIÇOADA QUALIDADE
Os seguintes exemplos (Tabelas 1 à 13, e 19) demonstram o uso de rósea C, estirpe 88-710 para prover aperfeiçoada germinação da semente, da raiz, do talo e benefícios no crescimento vegetativo para plantas e aperfeiçoada qualidade de safra/colheita e produção.
EXEMPLO 5
Tabela 1. Testes em variedades de rosas **; número de flores, botões de flores, percentual de morte ou envelhecimento de folhas e índice de qualidade nas rosas miniaturas tratadas com rósea Clonostachys em 80 dias após o plantio (tratamentos com taxas de 15g/Litro do produto acabado (2 X 10"7 germes/g de cortes novos, cortes plantados, primeira poda, segunda poda ou as combinação dos mesmos).
O tratamento na Tabela abaixo tem sido replicado 8 vezes para várias variedades de rosas em testes com estufas comerciais envolvendo mais de 50.000 potes plantados (4 polegadas de diâmetro, cada contendo 4 plantas). ** rosas (Série Parade, Padio Hit, Town e Country, Courtyard, Vigorosa, Flower Circus, Climbing Max, vários cultivares da Dinamarca e Alemanha)<table>table see original document page 28</column></row><table>
Valores seguidos da mesma letra não são significativamente diferentes (PLSD, p>0.05)
EXEMPLO 6
Nas Tabelas 2 e 3 (abaixo), experimentos foram iniciados quando raízes de plantas de pimenta hidropônica cresceram 5-8 acima ou abaixo à partir das tampas das camadas de lã nas cestas, e antes das raízes das adjacentes plantas fazerem contatos. Para tratamentos, cada micróbio benéfico foi adicionado ã solução nutriente no reservatório de cada uma das quatro réplicas das unidades hidropônicas. A densidade final da bactéria foi de 107 células mL"1 da solução do nutriente total na unidade. A densidade da rósea C foi de 106 germes mL"1 do total da solução nutriente.
Tabela 2. Os efeitos benéficos dos micróbios no crescimento de plantas de pimenta em sistemas de gamelas hidropônicas de baixa escala com tratamentos da rósea C
<table>table see original document page 28</column></row><table>Médias em uma coluna seguida pela mesma letra não são significantemente diferentes dos sistemas de gamelas hidropônicas em pequena-escala (LSD, P < 0.05).
<table>table see original document page 29</column></row><table>
Médias em uma coluna seguida pela mesma letra não são significantemente 5 diferentes dos sistemas de gamelas hidropônicas em pequena-escala (LSD, P < 0.05).
O PRODUTO ENDÓFITO DE RÓSEA C PROVENDO APERFEIÇOADA QUALIDADE DE SAFRA E RÁPIDO DESENVOLVIMENTO PARA COMERCIALIAÇÃO
EXEMPLO 7
Tabela 4. Testes com estufas comerciais com várias variedades de rosas;
Efeitos Dos tratamentos com rósea Clonostachys em numerosos botões de flores e flores abertas, percentual de envelhecimento/morte de folhagem e qualidade de aparência em rosas miniaturas em 80 dias após os cortes serem realizados. Os tratamentos tiveram taxas de 10g/Litro do produto acabado (2 X 10"7 germes/f) de cortes novos, cortes plantados, primeira poda, segunda poda em 50.000 (4 polegadas) potes de rosas cada contendo 4 plantas.<table>table see original document page 30</column></row><table>
a Considera a aparência da folhagem e flores: 1 = muito pobre; 10 = excelente.
Todas plantas em um tratamento avaliadas coletivamente.
EXEMPLO 8
Tabela 5. Testes com variedades de rosas; Número médio de flores; botões de flores, percentual de envelhecimento da folha e índice de qualidade nas rosas miniaturas tratadas com rósea Clonostachys em 80 dias após o plantio. Os tratamentos com 2 X 107 germes/g em taxas de 5g/Litro na primeira poda, segunda poda. Um total de 50.000 (4 polegadas de Tamanho) os potes de rosas foram tratados cada contendo 4 plantas de rosas.
<table>table see original document page 30</column></row><table>Essas avaliações na Tabelas 1, 4 e 5 coincidem com o tempo geral no qual o crescimento deverá ser embarcado para compradores. Os dados no número de botões de flores e flores abertas dão ênfase ao imenso impacto benéfico da rósea Clonostachys na promoção antecipada e melhoria na floração, saúde das plantas e aperfeiçoado crescimento vegetativo.
AS PLANTAS TRATADAS FORAM PROTAMENTE EMBARCADAS 10-15 DIAS ANTES DAS PLANTAS NÃO TRATADAS
EXEMPLO 9
Tabela 6. Nos tratamentos replicados em pepinos hidropônicos os seguintes tratamentos foram conduzidos por vários inoculantes
<table>table see original document page 31</column></row><table> * Experimentos 1, 2 e 3, respectivamente foram conduzidos na primavera/verão, outono e inverno durante os períodos de colheitas
* EndoFine é uma marca registrada de Adjuvants Plus, Inc. Tabela 7. Efeitos de quatro agentes/produtos microbiais aplicados uma vez (1), duas vezes (2), ou três vezes (3) na zona de raízes de plantas de pepinos na produção frutífera com experimentos na primavera/verão.<table>table see original document page 32</column></row><table>
1 F-teste de contraste entre tratamento e controle
2 Alteração na produção relativa ao controle
3 Valores seguidos pela mesma letra não são significantemente diferentes (agrupamento-T LSD1 p<0.05)
*EndoFine® uma marca registrada de Adjuvants Plus, Inc.
A Figura 1 mostra a germinação do Clonostachys (EndoFine®) nos tecidos de plantas de morango que foram tratados por imersão em suspensão de EndoFine por 2 minutos, plantada em potes e amostrada 15 dias depois. As plantas foram tratadas com 10g de EndoFine®/L.
* Germinação do Clonostachys no envelhecimento;morte dos tecidos (0-100 escalas)
Clonostachys foi bem estabelecido em pecíolos de folhas e raízes de plantas tratadas de todos os euItivares testados (valores de índice 60 -100). As lâminas das folhas foram somente colonizadas (10 -20) mas essas eram a maioria novos tecidos que tinham crescido após o tratamento de imersão.
Tabela 8. A germinação do Clonostachys (EndoFine®) e Botritis nos tecidos de plantas de morango que foram tratados por imersão em suspensão de EndoFine por 2 dias, plantadas em potes e amostradas 15 dias depois.<table>table see original document page 33</column></row><table>
- Não tratado (Controle)
2 Germinação do Clonostachys nos tecidos envelhecidos/mortos (0-1OO escalas)
3 Germinação do Botritis nos tecidos envelhecidos/mortos (0-100 escalas). Tabela 9 **. Efeitos da EndoFine® (rósea C) no crescimento de componentes de morangos mergulhados em suspensão de EndoFine antes de serem transplantados e cultivados em estufa por 77 dias.
As variedades de morangos tratados com fertilizante 20-8-20 à cada 7 dias em 25-100g/100L
<table>table see original document page 33</column></row><table>
- não tratado (controle) + tratado com EndoFine® / não viável 1 10g/1 L EndoFine®** Diferenças na massa seca (todas as variedades de morangos) tratados com EndoFine® sobre as não tratadas: 122%
A Figura 1 mostra a germinação do Botritis nos tecidos das plantas de morango que foram tratadas pela imersão em suspensão de EndoFine® por 2 minutos e plantadas em potes e amostradas 15 dias depois com Botritis nos tecidos das Plantas de Morangos. As plantas foram tratadas com 10g de EndoFlne®/L. Todo Biotritis encontrado nos tecidos das plantas teriam sido originários de fontes naturais (encontradas no campo). Os índices dos valores indicaram que os pecíolos das plantas não tratadas foram moderadamente infectadas com Botritis (25-60), e as lâminas da folha infectadas (5-10) ou não infectadas (0). Muito menos Botritis foi encontrado nos pecíolos das plantas tratadas (O -20)do que nos pecíolos das plantas não tratadas (25 - 60). Nenhum Botritis foi encontrado nas raízes das plantas tratadas e não tratadas.
O PRODUTO ENDÓFITO DE RÓSEA C PROVENDO UMA REDUÇÃO DO STRESS DO MEIO AMBIENTE E CULTURAL ÀS PLANTAS
EXEMPLO 10
Em uma câmara de crescimento para estudar a habilidade do endófito rósea C para resistência ao stress ambiental e cultural, das plantas tratadas das rosas miniaturas levadas ao tratamento (ver Tabela 1) ficaram sujeitas à 2-3 dias de limitada umidade do solo, ou recebendo regular solução nutriente úmida à planta. O resultado foi que as plantas não tratadas se formaram muito mais severamente que as plantas tratadas com a rósea c sob condições de limitada umidade na zona de raiz. As plantas também demoraram para se recuperar no caso das plantas não tratadas.
EXEMPLO 11 STRESS DEVIDO À PODA
Tabela 10. O percentual de medições da massa da raiz para várias variedades de rosa (Andréa) 10 dias após a poda. Os tratamentos com 10g/Litro do produto acabado contendo 2 X 107 germes/g de rósea C. Os resultados abaixo replicados em aproximadamente 50.000 potes plantados (4 polegadas) em diâmetro cada contendo 4 plantas de rosas.<table>table see original document page 35</column></row><table>
EXEMPLO 12
Tabela 11. Os testes no campo do tratamento de semente de cevada para aumento da agricultura/culminação e produção
<table>table see original document page 35</column></row><table>
O PRODUTO ENDÓFITO DE RÓSEA C ESTIRPE 88-710 COMO UM AUXILIAR PARA ESTIMULAR A PRODUÇÃO DE NÓDULOS FIXADORES DE NITROGÊNIO EM LEGUMES PARA UM EFEITO ADITIVO DE CRESCIMENTO PARA A BACTÉRA RIZÓBIO
As Tabelas 14 e 16 demonstram a habilidade da rósea C estirpe 88-710 agindo como um inoculante no tratamento de sementes para estimular e ter um efeito aditivo com o rizóbio na produção de nódulos de fixação de nitrogênio em legumes e acentuação no crescimento, como para feijão, soja, ervilha e alfafa.
EXEMPLO 13
Tabela 12.
Título: Teste com feixes de amostras no tratamento de sementes no Campo de Ervilhas, tratamento de sementes com EndoFIne 2005 Alberta Lethbridge. Variedade: EclipseToda semente tratada com Fiom Bios Tag Team (Pencillium e Mesorizóbio)
1360kg/bolsa do produto
Tratamento com EndoFine: 5g/10kg de semente
A) Emergência da Planta **
<table>table see original document page 36</column></row><table>
** Plantas também coletadas aumentaram a nodulação em 35% sobre as não tratadas.
B) Produção
EndoFine VitaFIo Não tratada
Alqueire/Acre (27.2kg/alq.) 70 66 65
% Diferença sobre a não tratada 16.6% 1.7% na
FORMULAÇÕES DE RÓSEA CLONOSTACHYS, ESTIRPE 88-710 MOSTRAM EXCELENTE VIDA PRÓPRIA E ESTABILIDADE
A Tabela 13 ilustra a vida própria e estabilidade da rósea C, estirpe 88-710 eo produto formulado Endowing® sendo armazenado em um refrigerado à 4°C.
EXEMPLO 14
Tabela 13. A densidade da conidia viável da rósea Clonostachys (estirpe 88-710) em uma formulação de EndoFine ® armazenada em um refrigerador à 4°C ** Meses de Armazenamento Densidade da conidia (CFU/g)
<table>table see original document page 36</column></row><table>** Produto Endofine é totalmente formulado para compensar qualquer perda menor de germes e tendo uma indicação garantida de 2 χ 20 à 7a CFU/g germes.
EXEMPLO 15
Tabela 14
Título: Testes com cultivadores no campo da fixação de nitrogênio e benefícios no crescimento com EndoFine
Variedade: AC Kent
Data da semeadura: 03 de junho de 2006; plantada em restolho do milho sem fertilizante
Tratamento da semente: somente EndoFine. Nenhum rizóbio
Tratamento da semente com EndoFine: 0.5kg da semente
Datas da colheita:
a) EndoFine de outubro de 2006
b) Não tratadas: 01 de novembro de 2006
Múltiplas amostras aleatórias
<table>table see original document page 37</column></row><table>Endofine 44.58 alqueires/acres 15.4% de soja colhida tratada com EndoFine por 15 dias antes do que a soja não tratada Não tratadas 38.62 alqueires/acres
RÓSEA CLONOSTACHYS, ESTIRPE 89-710 COMO UM INOCULANTE PARA A PRODUÇÃO DEM NÍTROGÊNIO, FOSFATO E SOLUÇÕES NUTRIENTES DE POTÁSSIO
As Figuras 2 e 3 demonstram a ativa produção de soluções de nutrientes Ν, Ρ, K com rósea C, estirpe conforme medida pela assimilação completa da folha CO2, folha de clorofila fluorescente, e crescimento da planta em pepinos hidropônicos medidos na área de folhas e nas diferenças das massas secas
EXEMPLO 16
As plantas de pepino (Cucumis sativus L.) 'Loustik' foram cultivadas à partir de sementes em tampas de caixas com camadas de lã (2.5 com χ 2.5 cm χ 4.0 cm) e transferidas para unidades com única planta hidropônica com altura de 8-10 cm. Em cada unidade, uma planta foi posicionada com a tampa em um orifício no centro da tampa de um container plástico branco de 1.9 L que foi enchido com solução nutriente (Ν: Ρ: K, 20: 8: 20; pH 6.0, condutividade elétrica 2.5 mS · cm1). O recipiente foi inserido em um pote plástico preto, e a tampa foi coberta com uma folha plástica branco e preto, sendo a cor preta na parte debaixo. Ar comprimido com fluxo regulado por uma válvula de ar de aquário foi borbulhada continuamente na solução em cada recipiente para manter o nível de ar dissolvido próximo de 8.6mg/L. As plantas foram mantidas em uma estufa de pesquisa com temperatura do ar próxima à 25° C durante todo o dia (0800 -1600 horas) e à 22° C à noite. A temperatura da solução do nutriente atingiu de 22.0 - 23.6° C. O inoculo da rósea C e Os, clororafis foram aplicados separadamente e em combinação à solução nutriente para determinar os efeitos dos micróbios da assimilação da rede CO2, na folha de clorofila fluorescente e no crescimento da planta. A final concentração de cada micróbio foi de 1 χ 105 CFU mL"1 em solução de nutriente. O controle das plantas não tratadas não recebeu nenhum inóculo.
EXEMPL017
Título: Teste com inoculante para soja em estufa para mostrar a promoção de crescimento com e sem a bactéria rizobio de fixação de nitrogênio como tratamento de semente.Tabela 15
Variedade: PAC Kent (Pronto Recolhimento)
Proporção do tratamento da semente com EndoFine: 5g/kg
Tratamento com fertilizante: 20-8-20 aplicado à cada 2 dias em 25-100g/1 OOL para todos tratamentos
<table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 40</column></row><table>
O ENDÓFITO RÓSEA CLONOSTACHYS, ESTIRPE 88-710 EM FORMULAÇÕES QUE PROVENHAM ADICIONAIS/ADITIVOS BENEFÍCIOS PROTETORES DAS PLANTAS CONTRA DOENÇAS, INSETOS E ÓBOLOS
EXEMPL018
Os Exemplos A, B. C, D e F demonstram o desempenho da rósea C, estirpe 88-710 na proteção contra os míldios pulverizados, óbolos duplamente maculados e afídios vermelhos no uso em testes em estufas cultivadoras de pepino, rosas. Tabela 16. A rósea Clonostachys estirpe 88-710 beneficia a cura de feridas como formulações inoculantes para valores agregados aos benefícios protetores das plantas contra doenças, insetos e óbolos.
A) Testes no Cultivo do Pepino (em estufas) para cicoracearum Erisife míldio pulverizado; Erisife ssp., Esfaeroteca fuliginea.) 5 replicadas de ADJ 702 aplicadas em 16g/L uma vez na folhagem .
<table>table see original document page 40</column></row><table>
Programas (metila tiofanato, miclobutanila, piraclostrobina+boscalida)*
* míldio pulverizado complexo acreditado para ser resistentes à fungicidas spray.
Algum dano à folhagem ** ADJ 702 como segurança para a folhagem do pepino mostrou-se excelente B) Testes em Rosas (10 replicadas em estufas cultivadoras) míldio pulverizado Esfaeroteca panosa var. rósea ADJ 700 aplicado em 16g/L à folhagem<table>table see original document page 41</column></row><table>
Programas (metila tiofanato, sulfúrico, dodomorfo)*
* fungicidas para míldios pulverizados acreditados para serem resistentes aos míldios pulverizados em alguns danos à plantas de rosas, folhas de chás à partir de tratamentos químicos
** segurança à folhagem da rosa (todas as fases excelentes)
<table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table>
E) Teste no Cultivo de Rosas (estufa) para proteção contra óbolo (óbolo duplamente maculado, Tetranicos, urticae)ADJ 702 16g/L tratamento duplo (durante 2 dias) para folhagem Tratamento Média de Redução % de óbolos adultos, ovos/répteis)
Dias após tratamento
<table>table see original document page 42</column></row><table>
Programas *
* óbolos acreditados para serem resistentes em algum dano de folhagem para plantas de rosas de tratamentos químicos
** segurança para plantas com aplicações de ADJ 702 excelente
F) Teste em Cultivos de Pepinos (estufa) para proteção à óbolos (óbolos duplamente maculados, Tetranicos urticae)ADJ 702 16g/L tratamento duplo (durante 2 dias) spray para folhagem Tratamento Meda de Redução % de Óbolos Adultos, ovos/répteis)
Dias após tratamento
<table>table see original document page 42</column></row><table>
Programas*
* óbolos acreditados para serem resistentes à tratamentos
** segurança para plantas com aplicações de ADJ 702 excelenteO ENDÓFITO RÓSE CLONOSTACHYS, ESTIRPE 88-710 PODENDO SER COMBINADO COM HORMÔNIOS DE RAÍZES PARA PROVER VALOR AGREGADO AOS BENEFÍCIOS DAS RAÍZES PARA CORTES/TRANSPLANTES/ENXERTO DE TECIDOS DE PLANTAS
EXEMPL019
As Figuras 9 e 10 demonstram que a rósea C, estirpe 88-710 poderá ser usado em combinação com produtos de hormônios de raízes como IBA (ácido butírico-3-índole) para o benefício da raiz e benefícios inoculantes, ou seja a colonização do crescimento da planta. A Figura 9 mostra a colonização da planta da rosa e as raízes usando somente EndoFine e em combinação com compostos de raízes I BA.
EXEMPLO 20
Concentrado de ENDOFINE como tratamento de semente seca para otimizar a germinação da semente e cultivo da planta (testes de cultivo de raízes). Tabela 17.
Soja: Variedade AC Kent; 4 replicadas χ 7 tratamentos χ 4 amostragens = 112 plantas
Agente microbial e aplicação
E-D=pó seco EndoFine® 3.7 χ 108 CFU/q @ 5g/Kg de semente como um revestimento (4.7 X 10 germes/semente)
Tratamento Fertilizante: 20-8-20 aplicado à cada 2 dias em 25-1 OOg/ L em todos tratamentos
Tratamento de semente com EndoFine® em emergência e peso de raízes de soja.
<table>table see original document page 43</column></row><table>Parte da Planta
<table>table see original document page 44</column></row><table>
EXEMPLO 21
A INDENTIFICAÇÃO GENÉTICA DA RÓSEA CLONOSTACHYS ESTIRPE 88-710
Amostras de solos de 18 diferentes localidades de Ontário indicaram que o gene de seqüência 18S rRNA da estirpe 88-710 com "Banco de gene" foi encontrado que a seqüência 18S da estirpe 88-710 não tem seqüência intron da ocroleuca Bionectria (ver definições).Isto indica que o estirpe 88-710 é 100 homólogo à rósea C baseado na comparação do espaçador transcrito interno (ITS) e nas seqüências de gene 28S rRNA "Banco de Gene". Dessa forma o estirpe Clonostachys 88-710 não produz o estado sexual (teleomorfo) sendo único geneticamente.
REFFERÊNCIAS
<table>table see original document page 44</column></row><table>
O Pedido de Patente Norte-Americano No. 20050063955 de 24 de março de 2005, Elmer, Philip Albert George e outros
Claims (29)
1. PROCESSO E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO E USO DE ENDÓFITOS COMO PRODUTOS INOCULANTES PARA PLANTAS", que provem recursos inoculantes únicos para a promoção do crescimento saúde e produção da planta, caracterizado por compreende o grupo fúngico da rósea Clonostachys.
2. "PROCESSO E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO ECONÔMICA DE QUANTIDADES ACEITÁVEIS DE UMA PREPARAÇÃO CONIDIAL FÚNGICA DA RÓSEA CLONOSTACHYS", caracterizado por utilizar um discreto sistema de fermentação de um substrato sólido.
3. "PRODUTO(S) ENDÓFITO", de acordo com a reivindicações 1 e 2, compreendendo uma rósea Clonostachys, estirpe 88-710, caracterizado por o processo de produzir o produto(s) prover de vários níveis de germes altamente viáveis e estáveis e material micélio em uma formulação estável que previna a degradação de um endófito vivo com estirpe de rósea C.
4. "PRODUTO(S) ENDÓFITO", de acordo com a reivindicações 1, 2 e 3, compreendendo uma rose Clonostachys, estirpe 88-710, caracterizado por ser único em termos de perfil genético e por se um endófito de estirpe não produzindo um estado sexual (teleomorfo) e produzindo o anamorfo como ocroleuca Bionectria que é indistinto morfologicamente da rósea C.
5. "PRODUTO(S) ENDÓFITO", de acordo com a reivindicações 1, 2, 3 e 4, caracterizado por ter o substrato sólido ser determinados cereais, como por exemplo, centeio, contendo suficientes emulsificadores naturais na forma de várias proteínas, lígneos para prover a produção do germe/micélio rósea C com excelentes agentes naturais dispersantes/úmidos/adesivos permitindo a rápida ocupação do lugar em plantas de formulações EndoFine®, como por exemplo tratamento de sementes, sem a adição de emulsificadores para dispersão e uso.
6. "PRODUTO(S) ENDÓFITO", de acordo com a reivindicações 1, 2. 3 e 4, caracterizado por a formulação do produto permitir/capacitar o uso prático e aplicação do produto(s) para raízes, talos, troncos, folhas, flores, bulbos, etc. de plantas como formulações pulverizadoras baseadas em água ou como pó para outros usos, como para o tratamento de sementes, e pós vetores de insetos/óbolos.
7. "PRODUTO(S) ENDÓFITO", de acordo com a reivindicações 1, 2, 3, 4 e 5, caracterizado por o produto quando aplicado em sementes, raízes, talos, troncos, folhas, flores, feridas ou no corte de superfície de plantas, possibilitar o endófito agir como um inoculante de "acentuada ocupação de lugar" no interior dos tecidos das plantas.
8. "PRODUTO(S) ENDÓFITO", de acordo com a reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, caracterizado por o produto prover aperfeiçoado crescimento de raízes, folhas, talos, e embriões vegetativos (flores) para plantas ou acentuar/aperfeiçoar a germinação e emergência de sementes.
9. "PRODUTO(S) ENDÓFITO", de acordo com a reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, caracterizado por o produto prover para a redução do stress ou dano ambiental ou cultural às plantas, por exemplo a perda de raízes devido à poda, aparagem, corte ou outros danos.
10. "PRODUTO(S) ENDÓFITO", de acordo com a reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 , caracterizado por o produto prover uma aperfeiçoada qualidade de colheita e rápido desenvolvimento para negociação da colheita.
11. "PRODUTO(S) ENDÓFITO", de acordo com a reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9, caracterizado poro produto prover para u ma redução da dependência do uso de pesticidas químicos para o controle de pestes, por exemplo Botrytis, Fusarium1 Pythium, spp e similares.
12. "PRODUTO(S) ENDÓFITO", de acordo com a reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9 e 10, caracterizado por o produto poder ser usado para a produção de uma variedade de colheitas e safras no campo de horticultura, agronômico e para estufas de plantas.
13. "COMPOSIÇÃO INOCULANTE PARA PLANTA", caracterizada por compreender germes de rósea Clonostachys.,. conídio ou micélio na mistura com um diluente ou condutor agro-quimicamente aceitável.
14. "MÉTODO PARA ACENTUAR O CRESCIMENTO, SAÚDE, VIGOR E PRODUÇÃO DE UMA PLANTA", de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender a aplicação inoculante de planta para uma planta ou gene de planta.
15. "MÉTODO PARA O COMBATE EM FUNGO DE PLANTA", de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por aplicar uma quantidade efetiva deantifungicida ao referido fungo pela ocupação do local alvo da infecção ou do habitat do referido fungo ou repudiando a fonte de alimentação do referido fungo.
16. "ENDÓFITO", de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13, caracterizado por a rósea Clonostachys de estirpe 88-170 agir como um inoculante para estimular e ter um efeito aditivo com o rizóbio na produção dos nódulos fixadores de nitrogênio em legumes e acentuando o crescimento dce por exemplo, feijão, soja, lentilha e alfafa.
17 "ENDÓFITO", de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 e 14 , caracterizado por o endófito rósea Clonostachys de estirpe 88-710 prover benefícios de cura à feridas como um inoculante que poderá por sua vez, ser formulado em formulações apropriadas, podendo prover adicionais/aditivos benefícios de proteção às plantas contra uma ampla variedade de doenças de plantas, insetos e óbolos, como por exemplo míldio pulverizado, óbolos duplamente maculados.
18. "ENDÓFITO", de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 e 15, caracterizado por endófito de rósea Clonostachys de estirpe 88-710, poder ser combinado com hormônios de raízes como o ácido butírico-3-índole (IBA) para prover um inoculante com mais benefícios de raízes para o corte/transplante de plantas.
19. "ENDÓFITO", de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 e 16, caracterizado por o endófito de rósea Clonostachys de estirpe 88-710 poder ser combinado com hormônios de raízes para prover um inoculante com mais benefícios de raízes para o corte/transplante de plantas para uso com equipamento robótico em formulações que não interrompam o equipamento sensitivo robótico pelos resíduos de partículas no sensor ao material da planta durante o transplante.
20. "COMPOSIÇÃO INOCULANTE ENDÓFITO ESTABILIZADA",caracterizada por compreender uma fase conidial ou vegetativa da rósea Clonostachys na mistura com um condutor estabilizador aceitável agro-quimicamente.
21. "COMPOSIÇÃO INOCULANTE ENDÓFITO ESTABILIZADA", de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por o condutor estabilizador aceitável agro-quimicamente compreender um emulsificador.
22. "COMPOSIÇÃO INOCULANTE ENDÓFITO ESTABILIZADA", de acordo com a reivindicação 21, caracterizada por o emulsificador ser um derivado biológico.
23. "COMPOSIÇÃO INOCULANTE ENDÓFITO ESTABILIZADA", de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por o emulsificador ser um grão cereal ou um extrato ou uma farinha do mesmo.
24. "COMPOSIÇÃO INOCULANTE ENDÓFITO ESTABILIZADA", de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por se compor na forma pulverizada baseada em água.
25. "COMPOSIÇÃO INOCULANTE ENDÓFITO ESTABILIZADA", de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por se conter na forma de pó.
26. "COMPOSIÇÃO INOCULANTE ENDÓFITO ESTABILIZADA", de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por compreender a fase conidial ou vegetativa da rósea Clonostachys de estirpe 88-710.
27. "COMPOSIÇÃO INOCULANTE ENDÓFITO ESTABILIZADA", de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por ter um pH de 6 à 8.
28. "COMPOSIÇÃO INOCULANTE ENDÓFITO ESTABILIZADA", de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por compreender 106 à 1012 de gramas/germe da referida composição.
29. "COMPOSIÇÃO INOCULANTE ENDÓFITO ESTABILIZADA", de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por compreender 107 à 1010 de gramas/germe da referida composição.
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