BRPI0709405A2

BRPI0709405A2 - composto lineares ou cìclicos

Info

Publication number: BRPI0709405A2
Application number: BRPI0709405-1A
Authority: BR
Inventors: Shubh D Sharma; Margarita Bastos; Wei Yang; Hui-Zhi Cai
Original assignee: Palatin Technologies Inc
Priority date: 2006-03-30
Filing date: 2007-03-30
Publication date: 2011-07-12
Also published as: KR20090008310A; CN101484171A; CA2647114C; MX2008012649A; EP2004352A2; IL194265A; EP2004352B1; KR101393715B1; AU2007233105A1; JP5424867B2; EA200802060A1; WO2007115164A3; HK1133393A1; CA2647114A1; ATE539762T1; EP2004352A4; CN101484171B; JP2009532382A; WO2007115164A9; WO2007115164A2

Abstract

COMPOSTOS LINEARES OU CICLICOS.Substitutos de aminoácido constritos no anel de fórmula 1: onde R^ 1^, R^ 2^, R^ 3^ R^ 4^ , R^ 5^, R^ 6a^ R^ 6b^, R^ 7^, e y são conforme definidos no relatório, métodos para sintetizar substitutos de aminoácido constritos no anel de fórmula 1, métodos para uso de substitutos de aminoácido constritos no anel, inclusive o uso em compostos lineares ou cíclicos que incluem uma pluralidade de resíduos aminoácido e um ou mais substitutos de aminoácido constritos no anel de fórmula 1 e compostoslineares ou cíclicos que incluem uma pluralidade de resíduos aminoácido e um ou mais substitutos de aminoácido constritos no anel de fórmula 1.

Description

"COMPOSTOS LINEARES OU CÍCLICOS".

Campo da Invenção (Campo Técnico)

A presente invenção refere-se a substitutos de aminoácido constritos no anel, a métodos para sintetizar substitutos de aminoácido constritos no anel e a métodos para utilizar os substitutos de aminoácido constritos no anel, incluindo o uso em construtos ou compostos lineares ou cíclicos que incluem uma pluralidade de resíduos aminoácido e um ou mais substitutos de aminoácido constritos no anel. Histórico da Invenção

Substitutos de aminoácido. Diversos miméticos peptídicos diferentes são conhecidos e empregados no preparo de miméticos de domínios de peptídeos com função crítica. Vide geralmente Biorganic Chemistry: Peptides and Proteins7 S.M.Hecht, ed., Oxford University Press, 1998, e especialmente capítulo 12 do mesmo, páginas 395-419 e as referências ali citadas. Os peptídeos e as proteínas são altamente flexíveis devido, em grande parte, aos altos graus rotacionais de liberdade de resíduos aminoácido individuais. Além disso, algumas ligações em cadeias laterais de resíduos aminoácido individuais também possuem graus rotacionais de liberdade. As interações estéricas não ligadas entre resíduos aminoácido forçam o peptídeo ou a proteína ao longo de seus graus de liberdade para alguma configuração de energia livre mínima estável. As estruturas locais, também conhecidas como "estrutura secundária" são comuns em peptídeos e proteínas. Essas estruturas incluem a-hélices, β-curvas, folhas, cadeias estendidas, laços e similares, muito freqüentemente contribuem para a ligação ou receptor-especificidade de peptídeos e proteínas. Existem diversos tipos de a-hélices conhecidos, que diferem quanto aos ângulos de torsão nos resíduos aminoácido do giro real e aos padrões de ligação de hidrogênio intra e intermolecular. Há também diversas β-curvas diferentesconhecidas, que diferem quanto aos ângulos de torsão diédricos Ψ (para a ligação Ca-C) ou Φ (para a ligação Ca-N), ou ambas. Miméticos peptídicos são empregados para prover um componente conformacionalmente restrito numa molécula, em parte com o objetivo de fixar domínios de função crítica numa configuração restrita que é ótima para uma resposta biológica desejada. Miméticos tipicamente peptídicos são criados e destinados a fixar e imitar a função de um dipeptídeo ou tripeptídeo. Por exemplo, vide os miméticos de giro invertido descritos nas patentes americanas 7.008.941, 6.943.157, 6.413.963, 6.184.223, 6.013.458 e 5.929.237 e o pedido publicado de patente americana 2 006/0084655, todos descrevendo várias estruturas de anel bicíclico para imitar uma seqüência de dipeptídica ou tripeptídica. Outros pedidos descrevem diversos compostos de pequena molécula diferentes, novamente com a finalidade de imitar uma seqüência dipeptídica ou tripeptídica. Vide, por exemplo, os pedidos publicados de patente americana 2006/0234923 e 2003/0191049.

Sistema de Peptídeo Natriurético. Uma aplicação potencial para substitutos de aminoácido emprega o sistema de peptídeo natriurético, que vem sendo intensivamente explorado desde a identificação da seqüência de peptídeo natriurético atrial (ANP) humano e da estrutura gênica em 1984. O ANP faz parte do sistema de peptídeo natriurético, que em humanos envolve um gene ANP, que, através de diferenças no processamento pós-translacional, resulta tanto em ANP como em urodi latina, um gene que produz BNP, ou peptídeo natriurético cerebral, e um gene que produz CNP, um peptídeo natriurético do tipo C. ANP, urodilatina, BNP e CNP são estruturas de anel, com um laço de 17 aminoácidos formado por uma ligação dissulfeto cisteína-cisteína. A seqüência e estrutura de aminoácido do ANP humano (hANP) é mostrado na Figura 1. ANP, urodilatina, BNP e CNP estão3

estreitamente relacionados, diferenciando-se por cinco ou seis aminoácidos no anel, embora as caudas N- e C-terminais sejam substancialmente diferentes. O ANP, BNP e CNP são específicos para receptores distintos, receptores de peptídeo natriurético A, B e C (NPRA, NPRB e NPRC). O NPRA e o NPRB estão ligados a guanilil ciclases, ao passo que o NPRC é um receptor de depuração ("clearance") ligado à proteína G. O ANP, BNP e CNP são os peptídeos natriuréticos endógenos primários de mamíferos identificados até o momento. Porém, existem diversos peptídeos natriuréticos não de mamífero que foram identificados e que podem ter aplicação farmacêutica em mamíferos. Estes incluem peptídeo natriurético ou cardíaco de salmão (sCP), peptídeo natriurético ventricular (VNP), um peptídeo natriurético cardíaco identificado em enguias e uma variedade de peptídeo natriurético de peixe e peptídeo natriurético de dendroaspis (DNP), um peptídeo natriurético identificado em veneno de cobra mamba, e 2três peptídeos do tipo natriurético (TNP-a, TNP-b e TNP-c) isolado de veneno de cobra Taipan. Vide, geralmente Tervonen V, Ruskoaho H, Lecklin T, ilves M, Vuolteenaho O. O peptídeo natriurético cardíaco de salmão é um hormônio regulador de volume. Am. J. Physiol.Endocrinol.Metab.283:E353-61 (2002) ; TakeyY., Fukuzawa A, Itahara Y, Watanabe TX, Yoshizawa Kumagaye K, Nakajima K, Yasuda A, Smith MP, Duff DW, Olson KR. Um novo peptídeo natriurético isolado do átrio cardíaco de trutas, Oncorhynchus mykiss. FEBS Ltt.414:377-80 (1997) ; Schweitz H, Vigne P, Moinier D, Frelin C, Lazdunski M. Um novo membro da família de peptídeo natriurético está presente no veneno da cobra verde mamba (Dendroaspis angusticeps). J.Biol.Chem.267:13928-32 91992); Lisy O, Jougasaki M, Heublein DM, Schirger JA, Chen HH, Wennberg PW, Burnett JC.Atividades renais do peptídeo natriurético sintético de dendroaspis. Kidney Int. 56:502-8 (1999); e Fry BG,Wickramaratana JC, Lemme S, Beuve Α, Garbers D, Hodgson WC, Alewood Ρ. Peptídeos natriuréticos novos de veneno de Oxyuranus microlepidotus: isolamento, caracterização química e biológica. Biochem. Biophys. Res. Comm. 327:1011-1015 (2005).

O ANP é endogenamente predominantemente secretado em resposta à pressão atrial aumentada, embora outros fatores, incluindo a estimulação do receptor de citocina, possam contribuir para a secreção endógena. Após liberado, o ANP é um regulador hormonal da pressão arterial, da homeostase de sódio e líquidos, provendo efeitos vasorrelaxantes, afetando a remodelagem cardiovascular, e similares. Assim, o ANP, inclusive o ANP endógeno, é eficaz na insuficiência cardíaca congestiva e em outra doença cardiovascular, provendo, em parte, defesa contra um sistema de renina-angiotensina-aldosterona cronicamente ativado. O ANP circulante é rapidamente removido da circulação através de dois mecanismos, ligação a um receptor de peptídeo natriurético e degradação enzimática.

O ANP humano é também designado ANP, hANP, ANP(1-28) e ANP(99-126) humano do tipo selvagem (este último refere-se à seqüência relevante no proANP(1-126), que é normalmente clivado em Arg98-Ser99 na região C-terminal durante a secreção). Na presente invenção, o ANP humano é às vezes designado "hANP".

Em geral, acredita-se que os peptídeos natriuréticos e suas variantes encontram utilidade no tratamento de insuficiência cardíaca congestiva, hipertensão renal, insuficiência renal aguda e condições relacionadas, bemcomo qualquer condição, doença ou síndrome na qual uma resposta diurética, natriurética e/ou vasodilatadora poderia ter um efeito terapêutico ou preventivo. Um artigo de revisão descrevendo peptídeos natriuréticos, inclusive ANP, e o uso do sistema de peptídeo natriurético na insuficiência cardíaca é Schmitt Μ. , Cockcroft J.R., e Frenneaux M.P. Modulation of thenatriuretic peptide system in heart failure: from bench to bedside? (Modulação do sistema de peptídeo natriurético na insuficiência cardíaca: da bancada para a cabeceira do doente? Clinicai Science 105:141-160 (2003) .

Um grande número de miméticos e variações de ANP foi preparado, sendo alguns deles de tamanho substancialmente reduzido de ANP. Uma versão de ANP de tamanho reduzido, porém biologicamente ativo, é opeptídeo cíclico de dissulfeto de 15-mer H-Met-ciclo (Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys) -Tyr-Arg-NH2 (SEQ ID NO:l) conforme descrito em Li B, Tom JY, Oare D, Yen R, Fairbrother WJ, Wells JA, Cunningham BC. Minimization of a polypeptide hormone.

Science 270:1657-60 (1995). Esse peptídeo de 15-mer é comumente designado como "mini-ANP". BREVE SUMARIO DA INVENÇÃOEm um aspecto, a invenção provê um substituto de aminoácido constrito no anel de fórmula geral I:

R1 é H, alquila, arila, alquilarila, alquila-N(R8) 2, alquila-OR8, alquila-C (=0) OR8, C(=0)0R8, alquila-NH2, alquila-S-R8, alquila-C (=0) N (R8) 2, ou um grupo da fórmula:<formula>formula see original document page 7</formula>

R3 é H ou um primeiro grupo hidrogênio-protetor; R4 é H, alquila, (CH2) mC (=0) OH, (CH2) mC (=0) NR11, (CH2) mC(=0) OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qOalila, (CH2) mC(=0) N (R8)2, ou (CH2)mC (=0)N(R8) (CH2)pN(R8)2; R5 é H ou alquila;

R6a é H, alquila, (CH2) mC (=0) OH, (CH2) mC (=0) NR11, (CH2)mC (=OJOR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qOalila, (CH2) mC (=0) N (R8) 2, ou (CH2) mC (=0) N (R8) (CH2)pN(R8)2; R5b é H ou alquila;

contanto que tanto R4 como R6a não sejam (CH2)mC (=0) OH, (CH2) mC (=0) NR11, (CH2)mC (=OJOR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qOalila, (CH2) mC (=0) N (R8) 2, ou(CH2)mCi=O) N (R8) (CH2)pN(R8)2;

R7 é H, C (=0) alquila, C (=0) (CH2) m (NR8) 2, alquila, aralquila, ou arila;

cada ocorrência de R8 é independemente H, arila, ou alquila;

R11 é um suporte sólido de peptídeo;

R12 é H ou um segundo grupo nitrogênio-protetor;

cada ocorrência de m é um número inteiro independentetendo um valor entre 0 e 6;

cada ocorrência de q é um número inteiro independentetendo um valor entre 1 e 6;

ρ é um número inteiro tendo um valor entre 1 e 10; e y é 0 ou 1.

Em um aspecto do substituto de fórmula geral I, y é 1. Em outro aspecto, y é 0.

Em um aspecto do substituto de fórmula geral I, R4 é(CH2)mC (=0) 0H, (CH2) mC (=0) N (R8) 2, ou (CH2) mC (=0) NR11, (CH2)mC (=0) OR11, e R6a ser H ou alquila.7Em um aspecto do substituto de fórmula geral I, R6a é

(CH2) mC(=0) N (R8)2, ou (CH2) mC(=0) NR e R4 é H ou alquila.

(CH2)mC (=0) OH, (CH2)mC (=0) OR111 Em um aspecto do substituto de fórmula geral I, R3 grupo de fórmula:

<formula>formula see original document page 8</formula>

e R9 é ter-butila, alila ou um grupo de fórmula:

<formula>formula see original document page 8</formula>

Em um aspecto do substituto de fórmula geral I, R1 é(CH2) n-C(=0) OR8, C (=0) OR8, alquila-C (=0) N (R8) 2, ou oalquila-N (R8) 2, alquila-OR8 alquila-NH2, alquila-S-R8, grupo da fórmula: >12

<formula>formula see original document page 8</formula>

e R12 é H ou trifenilmetileno, ter-butiloxicarbonila, toluenossulfonila, formila, nitro ou benziloxicarbonila e η ser um número inteiro tendo um valor entre 2 e 6. Em um aspecto do substituto de fórmula geral I, é provido um composto com a fórmula:<formula>formula see original document page 9</formula>

ou um enantiômero, estereoisômero ou diaestereoisômedro do mesmo, ou um sal sinteticamente aceitável do mesmo, onde :

<formula>formula see original document page 9</formula>

R6a é H ou alquila; e

R9 é ter-butila, alila, ou um grupo de uma fórmula:

<formula>formula see original document page 9</formula>

No anteriormente citado, R1 pode ser alquila-N (R8) 2,alquila-OR8, alquila-S-R8, fórmula:

(CH2) n-C(=0) OR8, C (=0) OR8, alquila-C (=0) N (R8) 2, oualquila-NH2, um grupo da trifenilmetileno,ter-butiloxicarbonila, toluenossulfonila, formila, nitro ou benziloxicarbonila e η ser um número inteiro tendo um

6. R7 pode ser H. R pode (CH2) mC (=0) NR11,ser ou valor entre 2(CH2) raC(=0)0H, (CH2)mC (=0)N(R8; 2, (CH2) mC (=0) OR11.

Em um aspecto do substituto de fórmula I, é provido um composto de fórmula:<formula>formula see original document page 10</formula>

ou um enantiômero, estereoisômero ou diaestereoisômero do mesmo, ou um sal sinteticamente aceitável do mesmo, onde:

R1 é alquila-N (R8)2, alquila-OR8, (CH2) n-C (=0) OR8, C (=0) OR8, alquila-NH2, alquila-S-R8,alquila-C (=0) N (R8) 2, ou o grupo da fórmula:

<formula>formula see original document page 10</formula>

R4 é (CH2) mC(=0) OH, (CH2)mC (=OJNR11, (CH2) mC (=0) OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qOalila, (CH2) mC (=0) N (R8) 2, ou (CH2)mC (=0) N (R8) (CH2)pN(R8)2; R6a é H ou alquila; e η é um número inteiro tendo um valor entre 2 e 6. No anteriormente citado, R1 pode ser alquila-N(R8) 2, alquila-OR8, (CH2) n-C (=0) OR8, C(=0)0R8, alquila-NH2, alquila-S-R8, alquila-C (=0) N (R8) 2, ou o grupo da fórmula:

<formula>formula see original document page 10</formula>

onde R12 é H ou trifenilmetileno, ter-butiloxicarbonila, toluenossulfonila, formila, nitro ou benziloxicarbonila e η é um número inteiro tendo um valor entre 2 e 6. R7 pode ser H. R4 pode ser (CH2)mC (=0) OH, (CH2)mC (=0)N(R8) 2, ou (CH2) mC (=0) NR11, ou<formula>formula see original document page 11</formula>

Em um aspecto do substituto de fórmula I, é provido um composto de fórmula:

<formula>formula see original document page 11</formula>

ou an enantiômero, estereoisômero ou diaestereoisômero do mesmo, ou um sal sinteticamente aceitável do mesmo, onde:

R1 é alquila-N (R8)2, (CH2)nOR8, (CH2) nC (=0) OR8, C(=0)0R8, alquila-NH2, alquila-S-R8, alquila-C (=0) N (R8) 2, ou o grupo da fórmula:

<formula>formula see original document page 11</formula>

R4 é H ou alquila;

R6a é H ou alquila; e η é um número inteiro tendo um valor entre 2 e 6.

No anteriormente citado,R3 pode ser um grupo de fórmula:

<formula>formula see original document page 11</formula>

e R9 é ter-butila, alila, ou um grupo da fórmula:

<formula>formula see original document page 11</formula><formula>formula see original document page 12</formula>

R1 pode ser alquila-N (R8) 2, alquila-OR8, (CH2) n-C (=O) OR8i C (=O) OR8, alquila-NH2/ alquila-S-R8,alquila-C (=O) N (R8) 2, ou um grupo da fórmula:

<formula>formula see original document page 12</formula>

onde R12 é H ou toluenossulf onila, formila, nitro ou benziloxicarbonila e η é um número inteiro tendo um valor entre 2 e 6. R7 pode ser H.

Em um aspecto do substituto de fórmula geral I, é provido um composto de fórmula:

<formula>formula see original document page 12</formula>

ou um enantiômero, estereoisômero ou diaestereoisômero do mesmo, ou um sal sinteticamente aceitável do mesmo, onde :

R1 é alquila-N (R8)2, alquila-OR8, (CH2) n-C (=0) OR8, C (=0) OR8, alquila-NH2/ alquila-S-R8,alquila-C (=0) N (R8) 2, ou um grupo da fórmula: >12

<formula>formula see original document page 12</formula>

R4 é H ou alquila; e

R6a é (CH2) mC(=0) OH, (CH2) mC (=0) NR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn,(CH2)qOalila7 (CH2) mC (=0) N (R8) 2, ou(CH2) mC (=0) N (R8) (CH2)pN(R8)2.

No anteriormente citado, R3 pode ser um grupo de fórmula:

<formula>formula see original document page 13</formula>

e R9 pode ser ter-butila, alila ou um grupo de fórmula:

<formula>formula see original document page 13</formula>

No anteriormente citado, R1 pode ser alquila-N (R8) 2, alquila-0R8, alquila-S-R8, fórmula:(CH2) n-C (=0) OR8, C (=0) OR8, alquila-NH2,onde R é H ou trifenilmetileno, ter-butiloxicarbonila, toluenossulfonila, formila, nitro oubenziloxicarbonila.

(CH2) mC(=0) N (R8)2, (CH2)mC (=OJNR1 pode ser H.

Em um aspecto do substituto de provido um composto da fórmula:ser (CH2) mC(=0) OH, (CH2) mC (=OOR11. R7fórmula geral I, é<formula>formula see original document page 14</formula>

R4 é H ou alquila; e

R9 é ter-butila, alila, ou um grupo da fórmula:

<formula>formula see original document page 14</formula>

No anteriormente citado, R pode ser alquila-N(R ) 2,

alquila-OR , alquila-S-R8, fórmula:

(CH2) n-C (=0) OR8, C (=0) OR8, alquila-NH2,

ou o grupo da

<formula>formula see original document page 14</formula>

alquila-C (=0)N(R8) 2,

ser

R1 trifenilmetiIeno, ter-H ou

butiloxicarbonila, toluenossulfonila, formila, nitro ou benziloxicarbonila e η é um número inteiro tendo um valor entre 2 e 6. R7 pode ser H.

R4 pode ser (CH2) mC (=0) OH, (CH2) mC (=0) N (R8) 2,

(CH2) mC (=0) NR11 ou (CH2)mC (=OiOR11.

Em um aspecto do substituto de fórmula geral I, éprovido um composto de fórmula:

<formula>formula see original document page 15</formula>

R1 e R2 são grupos alquila independentes.

No anteriormente citado, fórmula:

<formula>formula see original document page 15</formula>

pode ser um grupo de

onde R9 é ter-butila, alila, ou um grupo da fórmula:

(CH2) mC(=0) OH,

R pode ser (CH2)mC (=O) OR11, (CH2)mC (=0)N(R8) 2,

H ou alquila. R6a pode (CH2) mC (=0) NR11, (CH2) mC (=0) OR11,

(CH2) mC(=0) NR

(CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qOalila,

ou (CH2) mC(=0) N (Rb) (CH2)pN(Rb)2 e R6a é

ser (CH2)mC(=0) OH, (CH2)qOH, (CH2)qOBn,

(CH2)qOalila,

(CH2) mC (=0) N (R8) 2 ,

ou

(CH2)mC (=0)N(R8) (CH2)pN(R8)2 e R4 é H ou alquila. R7 pode ser H.

Em outra concretização, é provido um método para sintetizar um peptídeo, compreendendo um grupo da fórmula:<formula>formula see original document page 16</formula>

dito método compreendendo a etapa de reagir um composto tendo uma fórmula de estrutura I:

<formula>formula see original document page 16</formula>

ou um enantiômero, estereoisômero ou diaestereoisômero do mesmo, ou um sal sinteticamente aceitável do mesmo, com um aminoácido N-protegido, onde:

R1 é H, alquila, arila, alquilarila, alquila-N(R8) 2, alquila-OR8, alquila-C (=0) OR8, C(=0)0R8, alquila-NH2,alquila-S-R , fórmula:

<formula>formula see original document page 16</formula>

R2 é H ou alquila, contanto que R1 e R2 não sejam ambos H;

R3 é H ou um primeiro grupo nitrogênio-protetor;

R4 é H, alquila, (CH2) mC (=0) OH, (CH2) mC (=0) NR11, (CH2)mC(=0) OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qOalila, (CH2)mC (=0)N(R8) 2, ou (CH2) mC (=0) N (R8) (CH2)pN(R8)2;

R5 é H ou alquila;

R6a e H, alquila, (CH2) mC (=0) OH, (CH2) mC (=0) NR11,(CH2)mC (=0) OR117 (CH2)qOH, (CH2)qOBni (CH2)qOalila, (CH2) mC (=0) N (R8) 2, ou (CH2)mC(=0)N(R8) (CH2)pN(R8)2; R6b é H ou alquila;

contanto que ambos de R4 e R6a não sejam (CH2) mC (=0) OH,(CH2)mC (=OJNR11, (CH2)mC (=OXDR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qOalila, (CH2) mC (=0) N (R8) 2, ou

(CH2) mC (=0) N (R8) (CH2)pN(R8)2;

R7 é H, C (=0) alquila, C (=0) (CH2) m (NR8) 2, alquila, aralquila ou arila;

cada ocorrência de R8 é independentemente H, arila, ou alquila;

R11 é um suporte sólido de peptídeo; R12 é H ou um segundo grupo nitrogênio-protetor; cada ocorrência de m é um número inteiro independente

tendo um valor entre 0 e 6;

cada ocorrência de q é um número inteiro independente tendo um valor entre 1 e 6;

ρ é um número inteiro tendo um valor entre 1 e 10; e y é 0 ou 1.

Em outra concretização, é provido um composto compreendendo uma pluralidade de resíduos aminoácido e pelo menos um grupo da fórmula:

<formula>formula see original document page 17</formula>

ou um enantiômero, estereoisômero ou diaestereoisômero do mesmo, onde:

R1 é H, alquila, arila, alquilarila, alquila-N(Rs) 2, alquila-OR8, alquila-C (=0) OR8, C(=0)0R8, alquila-NH2, alquila-S-R8, alquila-C (=0) N (R8) 2, ou um grupo da fórmula:

<formula>formula see original document page 17</formula><formula>formula see original document page 18</formula>

R2 é H ou alquila, contanto que R1 e R2 não sejam ambos H;

R3 é H ou um primeiro grupo nitrogênio- protetor; R4 é H, alquila, (CH2) mC (=0) OH, (CH2) mC (=0) NR11, (CH2) mC (=OOR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qOalila, (CH2) mC (=0) N (R8) 2 / ou (CH2)mC(=0)N(R8) (CH2)pN(R8)2; R5 é H ou alquila;

R6a é H, alquila, (CH2) mC (=0) OH, (CH2) mC (=0) NR11, (CH2)mC (=0) OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qOalila, (CH2) mC (=0) N (R8) 2 ι ou (CH2) mC (=0) N (R8) (CH2)pN(R8)2; R6b é H ou alquila;

contanto que ambos R4 e R6a não sejam (CH2) mC (=0) OH, (CH2) mC (=OJNR11i (CH2)mC (=0) OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qOalila, (CH2) mC (=0) N (R8) 2, ou

(CH2)mC (=0)N(R8) (CH2)pN(R8)2;

R7 é H, C (=0) alquila ou C(=0) (CH2)m(NR8)2, alquila, aralquila ou arila;

cada ocorrência de R8 é independentemente H, arila, ou alquila;

R11 é um suporte sólido de peptídeo;

R12 é H ou um segundo grupo nitrogênio- protetor;

ρ é um número inteiro tendo um valor entre 1 e 10; y é 0 ou 1.

Em um aspecto da invenção, um substituto de aminoácido pode ser empregado num composto da invenção, doissubstitutos de aminoácido podem ser empregados num

composto da invenção, ou mais que dois substitutos deaminoácido podem ser empregados num composto da invenção.

Em outro aspecto da invenção, é provido um composto que inclui um substituto de aminoácido onde uma ou mais ligações peptídicas entre os resíduos aminoácido são substituídas com uma ligação não-peptídica. Em outro aspecto da invenção é provido um composto que inclui pelo menos um substituto de aminoácido e uma pluralidade de resíduos aminoácido onde o composto é um composto cíclico, ciclizado por uma ligação entre cadeias laterais de dois resíduos aminoácido, entre uma cadeia lateral de resíduo aminoácido e um grupo de um substituto de aminoácido, entre grupos de dois substitutos de aminoácido, entre um grupo terminal do composto e uma cadeia lateral de resíduo aminoácido, ou entre um grupo terminal do composto e um grupo de um substituto de aminoácido.

Substitutos de aminoácido constritos no anel de fórmula I podem ser usados para sintetizar compostos onde os compostos exibem, mediante administração a um mamífero, uma ou mais vantagens relacionadas com a seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo o substituto de aminoácido da invenção, as vantagens sendo selecionadas do grupo consistindo de aumento da resistência à degradação enzimática, aumento da meia-vida de circulação, aumento da biodisponibilidade, aumento da eficácia, duração de efeito prolongada e combinações dos anteriormente citados.

Um objeto da presente invenção consiste em prover substitutos de aminoácido constritos no anel de fórmula I que podem ser empregados através da substituição de um resíduo aminoácido de um polipeptídeo parental. Outro objeto da presente invenção consiste em prover um substituto de aminoácido constritos no anel de fórmula I útil para sintetizar um composto, onde o composto possui uma afinidade de ligação a receptor em equilíbrio, determinada pelo valor Ki(nM), menor que ovalor Ki(πΜ) da seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido. Outro objeto da presente invenção consiste em prover um substituto de aminoácido constrito no anel de fórmula I útil para sintetizar um composto onde o composto possui uma afinidade de ligação a receptor com respeito a um receptor peptídico natriurético maior que a afinidade de ligação a receptor da seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover um substituto de aminoácido constrito no anel de fórmula I, útil para sintetizar um composto onde o composto possui eficácia biológica pelo menos tão eficaz ou mais eficaz do que a mesma dose da seqüência de aminoácido não compreendendo um substituto de aminoácido. Outro objeto da presente invenção consiste em prover um substituto de aminoácido constrito no anel de fórmula I útil para sintetizar um composto onde o composto possui eficácia biológica mais eficaz que a mesma dose da seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido. Outro objeto da presente invenção consiste em prover um substituto de aminoácido constrito no anel de fórmula I útil para sintetizar um composto onde a seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido possui cerca de pelo menos 60% de homologia com a seqüência de um polipeptídeo parental.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover um substituto de aminoácido constrito no anel de fórmula I útil para sintetizar um composto onde a seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido possui cerca de pelo menos 80% de homologia com a seqüência de um polipeptídeo parental.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover umsubstituto de aminoácido constrito no anel de fórmula I para sintetizar um composto onde a seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido possui cerca de pelo menos 60% de homologia com a seqüência de um peptídeo que se liga a um receptor para ANP, BNP, CNP, sCP, DNP, TNP - a, TNP-b ou TNP-c.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover um substituto de aminoácido constrito no anel de fórmula I útil para sintetizar um composto que inclui um substituto conforme definido na presente invenção, onde a seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido é um polipeptídeo parental que se liga a um receptor conhecido.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover substitutos de aminoácido constritos no anel de fórmula I útil para sintetizar compostos com biodisponibilidade e meia-vida maior do que as formas naturais ou recombinantes de polipeptídeos parentais. Outro objeto da presente invenção consiste em prover substitutos de aminoácido constritos no anel de fórmula I úteis para sintetizar compostos com resistência aumentada à degradação, mas que possuem uma afinidade de ligação significativamente alta a seu receptor. Outro objeto da presente invenção consiste em prover substitutos de aminoácido constritos no anel de fórmula I úteis para sintetizar compostos numa formulação de liberação contínua.

Outros objetos, vantagens e características novas e ainda o escopo de aplicabilidade da presente invenção serão descritos em parte na descrição detalhada a seguir, em conjunto com os desenhos anexos e em parte serão evidentes para os habilitados na técnica ao examinar o relatório, ou podem ser aprendidos pela prática da invenção. Os objetos e vantagens da invenção poderão ser realizados e obtidos através dos meios ecombinações descritos nas reivindicações em anexo.

Descrição detalhada da invenção

1. DEFINIÇÕES "Grupo alquila"

Conforme aqui utilizado, o termo "grupo alquila" significa uma cadeia hidrocarbônica saturada, monovalente, não ramificada ou ramificada. Exemplos de grupos alquila incluem, porém não se restringem a grupos alquila (C1-C6) , tais como metila, etila, propila, isopropila, 2-metil-l-propila, 2-metil-2-propila, 2-metil-l-butila, 3-metil-l-butila, 2-metil-3-butila, 2 , 2-dimetil-1-propila, 2-metil-1-pentila, 3-metil-l-pentila, 4-metil-l-pentila, 2-metil-2-pentila, 3-metil-2-pentila, 4-metil-2-pentila, 2,2-dimetil-1-butila, 3,3-dimetil-1-butila, 2-etil-1-butila, butila, isobutila, t-butila, pentila, isopentila, neopentila, e hexila, e grupos alquila mais longos, tais como heptila, and octila. Um grupo alquila pode ser substituído ou opcionalmente substituído com um ou dois substituintes apropriados. "Alifático"

Conforme aqui utilizado, o termo "alifático" inclui compostos com cadeias hidrocarbônicas, tais como por exemplo alcanos, alquenos, alquinos, e seus derivados. Um "ômega amino alifático" inclui uma porção alifática com um grupo amino terminal. Exemplos de ômega amino alifáticos incluem 7"-amino-heptanoíIa e as porções de cadeia lateral de aminoácido de ornitina e lisina. "Grupo alquenila" Conforme aqui utilizado, o termo "grupo alquenila" significa uma cadeia hidrocarbônica monovalente, não ramificada ou ramificada tendo uma ou mais ligações duplas na mesma. A ligação dupla de um grupo alquenila pode ser não conjugada ou conjugada a outro grupo insaturado. Grupos alquenila apropriados incluem, porém não se restringem a grupos alquenila (C2-C6) , tais como vinila, alila, butenila, pentenila, hexenila,butadienila, pentadienila, hexadienila, 2-etilhexenila, 2-propil-2-butenila, 4- (2-metil-3-buteno)-pentenila. Um grupo alquenila pode ser não substituído ou opcionalmente substituído com um ou dois substituintes apropriados.

"Grupo alquinila"

Conforme aqui utilizado, o termo "grupo alquinila" significa cadeia hidrocarbônica monovalente, não ramificada ou ramificada tendo uma ou mais ligações triplas na mesma. A ligação tripla de um grupo alquinila pode ser não conjugada ou conjugada a outro grupo insaturado. Grupos alquinila apropriados incluem, porém não se restringem a grupos alquinila (C2-C6), tais como etinila, propinila, butinila, pentinila,hexinila, metilpropinila, 4-metil-l-butinila, 4-propil-2-pentinila, e 4-butil-2-hexinila. Um grupo alquinila pode ser não substituído ou opcionalmente substituído com um ou dois substituintes apropriados.

"Aralquila"

0 termo "aralquila" inclui um radical -RaRb onde Ra é umgrupo alquileno (um alquila bivalente) e Rb é um grupo arila conforme acima definido. Exemplos de grupos aralquila incluem benzila, feniletila, 3-(3-clorofenil)-2-metilpentila e similares.

"Grupo arila"

Conforme aqui utilizado, o termo "grupo arila" significa um radical aromático monocíclico ou policíclico compreendendo átomos de carbono e hidrogênio. Exemplos de grupos arila adequados incluem, porém não se restringem a fenila, tolila, antracenila, fluorenila, indenila, azulenila, naftila, 1-naftila, 2-naftila, e bifenila bem como porções carbocíclicas benzo-fundidas tais como 5, 6, 7, 8-tetrahidronaftila. Um grupo arila pode ser não substituído ou opcionalmentesubstituído com um ou dois substituintes apropriadosconforme abaixo definido. Um grupo arila opcionalmente pode ser fundido a um grupo cicloalquila, fundido aoutro grupo arila, fundido a um grupo heteroarila, ou fundido a um grupo heterocicloalquila. Grupos arila preferidos incluem, porém não se restringem a radicais hidrocarboneto aromáticos monocíclicos ou bicíclicos de 6 a 12 átomos de anel, e opcionalmente substituídos independentemente com um ou mais substituintes selecionados de alquila, haloalquila, cicloalquila, alcoxi alquiltio, halo, nitro, acila, ciano, amino, amino monosubstituído, amino disubstituído, hidroxi, carboxi ou alcoxi-carbonila.

Em uma concretização, fenila é um grupo arila preferido, que quando 11 substituído" independentemente compreende grupos hidroxila, halogênio, alquila ou arila ligados diretamente ou através de uma ligação éter. Quando o anel de fenila for substituído desta forma, o resíduo aminoácido pode ser designado como substituído, como em Phe substituído, HPhe substituído, ou Pgl substituído. "Grupo heteroarila" Conforme aqui utilizado, o termo "grupo heteroarila" significa um anel aromático monocíclico ou policíclico compreendendo átomos de carbono, átomos de hidrogênio e um ou mais heteroátomos, pref erivelmente de 1 a 4 heteroátomos, independentemente selecionado de nitrogênio, oxigênio e enxofre. Exemplos ilustrativos de grupos heteroarila incluem, porém não se restringem a piridila, piridazinila, pirazila, indolila, triazinila, pirrolila, pirazolila, imidazolila, (1, 2 , 3)-triazolila, (1,2,4)-triazolila, pirazinila, pirimidinila, tetrazolila, furila, tienila,isoxazolila, tiazolila, tiadiazolila, furila, fenila, isoxazolila, oxazolila, pirazolila, tetrazolila, triazolila, oxadiazolila, tiadiazolila, isoxazolila, triazinila, e pirazinila. Anéis heteroaromáticos bicíclicos incluem, porém não se restringem a benzotiadiazolila, indolila, benzotiofenila,benzofurila, benzimidazolila, benzisoxazolila,benzotiazolila, quinolinila, benzotriazolila,benzoxazolila, isoquinolinila, purinila, furopiridinila e tienopiridinila. Um heteroarila pode ser não substituído ou opcionalmente substituído com um ou dois substituintes apropriados conforme abaixo definido. Um grupo heteroarila opcionalmente pode ser fundido a outro grupo heteroarila, fundido a um grupo arila, fundido a um grupo cicloalquila, ou fundido a um grupo heterocicloalquila.

"Grupo cicloalquila"

Conforme aqui utilizado, o termo "grupo cicloalquila" significa um anel saturado monocíclico ou policíclico compreendendo átomos de carbono e hidrogênio e sem ligações múltiplas carbono-carbono. Exemplos de grupos cicloalquila incluem, porém não se restringem a grupos cicloalquila (C3-C7), tais como ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, e cicloheptila, bem como terpenos saturados cíclicos e bicíclicos. Um grupo cicloalquila pode ser não substituído ouopcionalmente substituído com um ou dois substituintesapropriados, conforme abaixo definido. Um grupo cicloalquila opcionalmente pode ser fundido a outro grupo cicloalquila, fundido a um grupo arila, fundido a um grupo heteroarila, ou fundido a um grupo heterocicloalquila.

"Grupo heterocicloalquila"

Conforme aqui utilizado, o termo "grupo heterocicloalquila" significa um anel monocíclico ou policíclico compreendendo átomos de carbono ehidrogênio e pelo menos um heteroátomo, preferivelmentede 1 a 3 heteroátomos selecionados de nitrogênio, oxigênio e enxofre. Um grupo heterocicloalquila pode ser fundido a um grupo arila ou heteroarila. Exemplos de grupos heterocicloalquila incluem, porém não se restringem a pirrolidinila, pirrolidino, piperidinila, piperidino, piperazinila, piperazino, morfolinila, morfolino, tiomorfolinila, tiomorfolino e piranila. Umgrupo heterocicloalquila pode ser não substituído ou opcionalmente substituído com um ou dois substituintes apropriados conforme abaixo definido. Um grupo heterocicloalquila opcionalmente pode ser fundido a um grupo cicloalquila, fundido a um grupo arila, fundido a um grupo heteroarila, ou fundido a outro grupo heterocicloalquila.

Por exemplo, um grupo heterocicloalquila pode ser fundido a ou substituído com um grupo arila ou grupo heteroarila, por exemplo, porém não restrito a 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolinila e 1,2,3,4-tetrahidroquinolinila, tetrahidronaftiridinila,fenilpiperidinila e piperidinilpiridinila. Numa concretização preferida, um grupoheterocicloalquila é um anel monocíclico ou bicíclico, mais preferivelmente, um anel monocíclico, onde o anel compreende de 3 a 6 átomos de carbono e formam de 1 a 3 heteroátomos, aqui designado como heterocicloalquila (C3-C6) . Em outra concretização preferida, um grupo heterocicloalquila é fundido a ou substituído com um grupo arila ou um grupo heteroarila. "Radical heterocíclico" ou "anel heterocíclico" Conforme aqui utilizado, os termos "radical heterocíclico" ou "anel heterocíclico" significam um grupo heterocicloalquil ou um grupo heteroarila. "Radical cíclico"Conforme aqui utilizado, o termo "radical cíclico" significa um grupo arila, um grupo cicloalquila, um grupo heterocicloalquila ou um grupo heteroarila.

"Grupo alcoxi"

Conforme aqui utilizado, o termo "grupo alcoxi" significa um grupo -O-alquila, onde alquila é conforme abaixo definido. Um grupo alcoxi pode ser não substituído ou opcionalmente substituído com um ou dois substituintes apropriados. Preferivelmente, a cadeia alquila de um grupo alquiloxi tem uma extensão de 1 a 6 átomos de carbono, aqui designada como "alcoxi(C1-C6)"."Grupo ariloxi"

Conforme aqui utilizado, o termo "grupo ariloxi" significa um grupo -O-arila, onde arila é conforme acima definido. Um grupo ariloxi pode ser não substituído ou opcionalmente substituído com um ou dois substituintes apropriados. Preferivelmente, o anel de arila de um grupo ariloxi é um anel monocíclico, onde o anel compreende 6 átomos de carbono, aqui designado como "ariloxi (C6) " .

"Alcoxicarbonila"

Conforme aqui utilizado, o termo grupo"alcoxicarbonila" significa um grupo monovalente da fórmula -C(=0)-alcoxi. Preferivelmente, a cadeia hidrocarbônica de um grupo alcoxicarbonila tem extensão de 1 a 8 átomos de carbono, aqui designado grupo "alcoxicarbonila inferior".

"Carbamoíla"

Conforme aqui utilizado, o termo grupo "carbamoíla" significa o radical -C (=0) N (R') 2, onde R' é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio, alquila e arila.

"Carbonila"

Conforme aqui utilizado, um grupo "carbonila" é um grupo divalente da fórmula C(=0).

"Oxo"

Conforme aqui utilizado, um grupo "oxo" é um grupo da fórmula (=0) .

"Acila"

O termo "acila" inclui um grupo R-C(=0)-, onde R é um grupo orgânico. Um exemplo é o grupo acetila CH3-C(=0)-, aqui designado "Ac".

Uma porção de peptídeo ou alifática é "acilada" quando um grupo arila, alquila ou alquila substituído, conforme acima definido, é ligado através de um ou mais grupos carbonila{-(C=O)-}. Um peptídeo é o mais geralmente acilado na posição C-terminal. "Amida"Uma "amida" inclui compostos que possuem um nitrogênio trivalente ligado a um grupo carbonila (-C(=0)-NH2) , tal como por exemplo metilamida, etilamida, propilamida e similares.

"Imida"

Uma "imida" inclui compostos contendo um grupo imido (-C(=0)-NH-C(=0)-).

"Amina"

Uma "amina" inclui compostos que contém um grupo amino (-NH2).

"Nitrila"

"Nitrila" inclui compostos que são derivados de ácido carboxílico e que contém um grupo (-CN) ligado a um grupo orgânico.

"Halogênio"

Conforme aqui utilizado, o termo "halogênio" significa flúor, cloro, bromo, ou iodo. Analogamente, o significado dos termos "halo" e "Hal" abrangem fluoro, cloro, bromo e iodo.

"Suporte sólido de peptídeo"

Conforme aqui utilizado, o termo "suporte sólido de peptídeo" significa um polímero sintético para uso em síntese de peptídeo que suporta grupos reativos (grupos hidroxila ou amino livres), geralmente através de um ligante, que podem reagir com o grupo carboxila com funcionalidade de um aminoácido N-protegido ou um substituto de fórmula I, e com isso covalentemente ligando o aminoácido ou substituto da fórmula I ao polímero. Ao término da síntese de peptídeo, a ligação entre o aminoácido C-terminal ou substituto e o suporte polimérico pode ser quimicamente clivada. 0 peptídeo ou composto incluindo um ou substitutos de fórmula I então penetra na solução e pode ser isolado da solução. Exemplos de suportes sólidos de peptídeo incluem, porém não se restringem a resinas de poliamida e resinas de poliestireno com um ligante apropriado para síntese em fase sólida. Exemplos de resinas incluem resinasMerrifield, resinas BHA, resinas MBHA, resinas Wang, resinas de oxima e similares. Ligantes que podem ser empregados incluem Fmoc-Rink, ligante Sieber, ligante Weinreb e similares.

"Grupo nitrogênio-protetor"

Conforme aqui utilizado, o termo "grupo nitrogênio-protetor" significa um grupo que substitui um hidrogênio de amino com a finalidade de proteger contra reações colaterais e degradação durante uma seqüência de reação, por exemplo, durante a síntese de peptídeo. A síntese de peptídeo em fase sólida envolve uma série de ciclos de reação compreendendo acoplar o grupo carboxi de um aminoácido ou substituto N-protegido com o grupo amino do substrato peptídico, em seguida clivar quimicamente o grupo nitrogênio-protetor para que o próximo sinton amino-protegido possa ser acoplado. Grupos nitrogênio-protetores úteis na invenção incluem grupos nitrogênio-protetores conhecidos na síntese de peptídeo em fase sólida, inclusive porém não restritos a t-Boc (ter-butiloxicarbonila), Fmoc(9-fluorenilmetiloxicarbonila), 2-clorobenziloxicarbonila, aliloxicarbonila (aloc), benziloxicarbonila, 2- (4-bifenil)propil-2-oxicarbonila (Bpoc), 1- adamantiloxicarbonila, tritila (trifenilmetila) e tolueno sulfonila.

"Substituinte apropriado"

Conforme aqui utilizado, o termo "substituinte apropriado" significa um grupo que não anula a utilidade sintética, terapêutica ou farmacêutica dos compostos da invenção ou os intermediários úteis no seu preparo. Exemplos de substituintes apropriados incluem, porém não se restringem a alquila; alquenila; alquinila; arila; heteroarila; heterocicloalquila ; cicloalquila; 0-alquila; 0-alquenila; 0-alquinila; 0-arila; CN; 0H; oxo; halo; C(=0)0H; C(=0)halo; OC (=0) halo; CF3; N3; NO2; NH2; NH(alquila); N(alquila)2; NH (arila) ; N(arila)2; C(=0)NH2; C (=0) NH (alquila) ;OC(=0)N(arila)2 C(=0) 0(alquila) OC(=0)(arila) S-alquila; S-

C(=0) N(alquila)2 ; C(=0)NH(arila); C(=0)N(arila)2

OC(=0)NH2; C(=0)NH(heteroarila) ; C(=0)N(heteroarila)2 NHOH; NOH(alquila); NOH(arila); OC(=0)NH(alquila) OC(=0)N(alquila)2; OC(=0)NH(arila) CHO; C(=0)(alquila); C(=0)(arila); C(=O)O(arila) ; OC(=0) (alquila);

OC(=0)0(alquila) ; OC(=0)O(arila) ; alquenila; S-alquinila; SC (=0) 2-arila, SC (=0) 2-alquila; SC(=O)2-alquenila; SC(=0)2-alquinila; e SC(=0)2-arila.

Um habilitado na técnica pode selecionar um substituinte apropriado com base na síntese, estabilidade e atividade farmacológica do composto da invenção.

The "<formula>formula see original document page 30</formula>"Conforme aqui utilizado nos desenhos de estrutura química a "linha ondulada" acima indica uma ligação no ponto em que um grupo químico é ligado a outro grupo químico. Assim, de acordo com essa definição, a fórmula química "A" abaixo:

<formula>formula see original document page 30</formula>

onde R' é um grupo da fórmula "Β",

<formula>formula see original document page 30</formula>

representa o composto abaixo

<formula>formula see original document page 30</formula>"Composição"

O termo "composição", como na composição química, destina-se a abranger um produto compreendendo o(s) ingrediente(s) ativo(s), e o(s) ingrediente(s) inerte(s) que compõe o portador, bem como qualquer produto que resulte, direta ou indiretamente, da combinação, complexação ou agregação de quaisquer dois ou mais dos ingredientes, ou da dissociação de um ou mais dos ingredientes, ou de outros tipos de reações ou interações de um ou mais dos ingredientes. Conseqüentemente, as composições farmacêuticas da presente invenção abrangem qualquer composição preparada misturando-se um composto da presente invenção e um portador farmaceuticamente aceitável.

"EC50"

O termo "EC50" pretende incluir a concentração molar de um agonista que produziu 50% da resposta máxima possível para aquele agonista. Para fins de exemplo, um composto que, a uma concentração de 72 nM, produza 50% da resposta máxima possível para aquele composto, conforme determinado num ensaio cGMP, possui um EC50 de 72 nM. Salvo se especificado de outra forma, a concentração molar associada com uma determinação EC50 é em nanomoles (nM). "Ki (nM)"

O termo "Ki(nM)" pretende incluir a afinidade de ligação a receptor em equilíbrio, representando a concentração molar de um composto competidor que se liga à metade dos sítios de ligação de um receptor em equilíbrio na ausência de um competidor. Em geral, o Ki está inversamente correlacionado com a afinidade do composto para o receptor, de forma tal que se o Ki for baixo, a afinidade será alta. 0 Ki pode ser determinado utilizando-se a equação de Cheng e Prusoff (Cheng Υ. , Prusoff W.H., Biochem. Pharmacol. 22:3099-3108, 1973).<formula>formula see original document page 32</formula>

onde "ligante" é a concentração de ligante, que pode ser um radioligante, e Kd é uma medição inversa de afinidade de receptor que produz 50% de ocupação do receptor. Salvo se especificado de outra forma, a concentração molar associada com uma determinação Ki é nM.

"Peptídeo"

O termo "peptídeo" conforme utilizado em todo o relatório e nas reivindicações, pretende incluir 10 qualquer estrutura compreendendo dois ou mais aminoácidos, incluindo as modificações químicas e derivados de aminoácidos. Os aminoácidos que foram todo ou parte de um peptídeo podem ser aminoácidos de ocorrência natural, estereisômeros e modificações de 15 tais aminoácidos, aminoácidos não de proteína, aminoácidos pós-translacionalmente modificados,

aminoácidos enzimaticamente modificados, e similares. O termo "peptídeo" também inclui dímeros e multímeros de peptídeos. Um peptídeo "manufaturado" inclui um 20 peptídeo produzido através de síntese química, tecnologia de DNA recombinante, fragmentação bioquímica ou enzimática de moléculas maiores, combinações dos anteriormente citados, ou, em geral, preparados através de qualquer outro método.

"Porção de cadeia lateral de aminoácido"

O termo "porção de cadeia lateral de aminoácido" utilizado na presente invenção, inclusive o utilizado no relatório e nas reivindicações, inclui qualquer cadeia lateral de qualquer aminoácido, conforme o termo

"aminoácido" aqui definido. Desta forma inclui a porçãode cadeia lateral presente em aminoácidos de ocorrência natural. Também inclui porções de cadeia lateral em aminoácidos de ocorrência natural, tais como aminoácidos glicosilados. Inclui ainda porções de 35 cadeia lateral em esteroisômeros e modificações deaminoácidos protéicos de ocorrência natural, aminoácidos não protéicos, aminoácidos pós-t rans1ac ionamente modificados, aminoácidosenzimaticamente sintetizados, aminoácidosderivatizados, construtos ou estruturas criadas para imitar aminoácidos e similares. Por exemplo, a porção de cadeia lateral de qualquer aminoácido aqui descrito está incluída na definição. Um "derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido" conforme adiante definido, está incluso na definição de uma porção de cadeia lateral de aminoácido.

"Derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido"

Um "derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido" é uma modificação ou variação em qualquer porção de cadeia lateral de aminoácido, inclusive uma modificação ou variação numa porção de cadeia lateral de aminoácido de ocorrência natural ou não natural, onde a modificação ou variação inclui:

(a) adicionar umou mais átomos de carbono saturados ou insaturados auma cadeia alquila, arila ou aralquila; (b) substituir um carbono na cadeia lateral com outro átomo, preferivelmente oxigênio ou nitrogênio; (c) adicionar um grupo terminal a um átomo de carbono da cadeia lateral, inclusive metila (-CH3) , metoxi (-OCH3), nitro(-NO2) , hidroxila (-0H), ou ciano (-C=N); (-C=N); (d) para porções de cadeia lateral incluindo um grupo hidroxi, tio ou amino, adicionar um grupo protetor hidroxi, tio ou amino apropriado; ou (e) para porções de cadeia lateral incluindo uma estrutura de anel,adicionar um ou mais substituintes de anel, inclusive grupos hidroxila, halogênio, alquila, ou arila ligados diretamente ou através de uma ligação éter. Para grupos amino, os grupos amino-protetores apropriados incluem, porém não se restrignem a, Z, Fmoc, Boc, Pbf, Pmc e similares. "Aminoácidos"Os "aminoácidos" utilizados nas concretizações da presente invenção, e o termo conforme utilizado no relatório e nas reivindicações incluem os aminoácidos protéicos de ocorrência natural conhecidos, que são designados tanto por sua abreviação comum de três letras como pela abreviação de letra única. Vide geralmente Synthetic Peptides: A User's Guide, G. A. Grant, editor, W.H. Freeman & Co., New York (1992), cujos ensinamentos foram aqui incorporados por referência, inclusive o texto e a tabela citada nas páginas de 11 a 24. Um "aminoácido" inclui a-aminoácidos convencionais e ainda β-aminoácidos e aminoácidos a,a-di-substitu£dos, onde pelo menos uma cadeia lateral é uma porção de cadeia lateral de 15 aminoácido, conforme aqui definida. Um "aminoácido" inclui ainda α-aminoácidos de N-alquila, onde o grupo amino N-terminal possui um substituinte alquila C1 a C6 linear ou ramificado. Pode-se assim observar que o termo "aminoácido" inclui estereoisômeros e modificações de aminoácidos protéicos de ocorrência natural, aminoácidos não-protéicos, aminoácidos pós-traslacionalmente modificados, aminoácidosenzimaticamente sintetizados, aminoácidosderivatizados, construtos ou estruturas criados para imitar aminoácidos, e similares. Aminoácidos modificados e incomuns são geralmente descritos em Synthetic Peptides: A User's Guide, citado acima; Hruby V. J., Al-obeidi F., Kazmierski W., Biochem. J. 268:249-262 (1990); e Toniolo C., Int. J. Peptide 30 Protein Res. 35:287-300 (1990); cujos ensinamentos foram aqui incorporados por referência. Além disso, as abreviações a seguir, incluindo os aminoácidos e os grupos modificadores e protetores dos mesmos, têm os seguintes significados: 35 Abu - ácido gama amino butírico

12-Ado - ácido 12-amino dodecanóico Aib - ácido alfa-aminoisobutírico6-Ahx - ácido 6-amino hexanóico

Amc - ácido 4-(aminometil)-ciclohexano carboxílico 8-Aoc - ácido 8-amino octanóico Bip - bifenilalanina

Boc - t-butoxicarbonila Bzl - benzila Bz - benzoíla

Dab - ácido diaminobutírico Dap - ácido diaminopropiônico Dip - 3,3-difenilalanina

Disc - ácido 1,3-dihidro-2H-isoindolcarboxílico Et - etila

Fmoc - fluorenilmetoxicarbonila Hept - heptanoíIa (CH3-(CH2) 5-C (=0) -) Hex - hexanoila (CH3-(CH2)4-Ci=O)-) HArg - homoarginina HCys - homocisteína HLys - homolisina HPhe - homofenilalanina HSer - homoserina Me - metila

Met(O) -sulfóxido de metionina Met(O2) - metionina sulfona Nva - norvalina Pgl - fenilglicina Pr - propila Pr-i - isopropila Sar - sarcosina Tle - ter-butilalanina Z- benziloxicarbonila

Na listagem de compostos de acordo com a invenção, resíduos aminoácido convencionais têm seu significado convencional conforme atribuído no capítulo 2400 de Manual of Patent Examining Procedure, 8a edição. Assim, "Nle" é norleucina; "Asp" é ácido aspártico; "His" é histidina; "Arg" é arginina; "Trp" é triptofano; "Lys" é lisina; "Gly" é glicina; "Pro" éprolina; nTyr" é tirosina, "Ser" é serina e assim por diante. Todos os resíduos estão na configuração de L-isômero, salvo se o D-isômero estiver especificado, como em "D-Ala" para D-alanina.

Um aminoácido simples, incluindo estereoisômeros e modificações de aminoácidos protéicos de ocorrência natural, aminoácidos não-protéicos, aminoácidos pós-translacionalmente modificados, aminoácidossinteticamente sintetizados, aminoácidos derivatizados, um aminoácido a,a-di-substituído derivado de qualquer um dos anteriormente citados(ou seja, um aminoácido a,α-di-substituído onde pelo menos uma cadeia lateral é igual à do resíduo do qual deriva) , um β-aminoácido derivado de qualquer um dos anteriormente citados (ou seja, um β-aminoácido que, exceto pela presença de um β-carbono é igual ao resíduo do qual deriva) e similares, inclusive todos os anteriormente citados, é âs vezes designado como "resíduo". "Aminoácido a,a-di-substituído" Um "aminoácido a,α-di-substituído" inclui qualquer a-aminoácido que possua um outro substituinte na posição-a, substituinte este que pode ser igual ou diferente da porção de cadeia lateral do α-aminoácido. Substituintes apropriados, além da porção de cadeia lateral do a-25 aminoácido, inclui alquila C1 a C6 linear ou ramificado. Aib é um exemplo de um aminoácido a,a-di-substituído. Embora os aminoácidos a,a-di-substituídos possam ser designados pelo uso de referências L- e D-isoméricas convencionais, fica entendido que tais referências servem como referência e que, quando os substituintes na posição α forem diferentes, tal aminoácido pode ser reciprocamente designado como aminoácido a,α-di-substituído derivado de L- ou D-isômero, conforme apropriado, de um resíduo com a porção de cadeia lateral de aminoácido designada. Assim ácido (S)-2-amino-2-metil-hexanóico pode ser designado ou como aminoácido a,α-di-substituído derivado de L-Nleou como aminoácido α,α-di-substituído derivado de D-Ala. Similarmente, Aib pode ser designado como um aminoácido a,a-disubstituído derivado de Ala. Sempre que for provido um aminoácido a,a-di-substituído, entende-se como incluindo todas as configurações (R) e (S) dos mesmos. "Aminoácido N-substituído"

Um "aminoácido N-substituído" inclui qualquer aminoácido onde uma porção de cadeia lateral de aminoácido é covalentemente ligada ao grupo amino da cadeia principal, opcionalmente quando não existir nenhum substituinte que não H na posição a-carbono. Sarcosina é um exemplo de um aminoácido N-substituído. Para fins de exemplo, sarcosina pode ser designada como um derivado de aminoácido N-substituído de Ala, no qual a porção de cadeia lateral de aminoácido de sarcosina e Ala é a mesma, metila. "Grupo capeador C-terminal"

0 termo "grupo capeador C-terminal" inclui qualquer grupo terminal ligado através do átomo de carbono de anel terminal ou, se provido, grupo carboxila terminal, do C-terminal de um composto. 0 átomo de carbono de anel terminal ou, se provido, o grupo carboxila terminal, pode fazer parte de um resíduo, ou pode fazer parte de um substituto de aminoácido. Num aspecto preferido, o grupo capeador C-terminal forma uma parte de um substituto de aminoácido que está na posição C-terminal do composto. 0 grupo capeador C-terminal inclui, porém não se restringe a-(CH2)n-OH, - (CH2)n-Ci=O)-0H, -(CH2)ra-OH, - (CH2) n-C (=0) -

- (CH2) n-C(=0) -NH- (CH2)m-N(V1) (v2),

- (CH2) n-C(=0) -N- ( (CH2)m-N(V1) (V2) ) 2,

- (CH2) n-C(=0) -NH-CH (-C (=0) -0H) - (CH2)ra-N(V1) (v2), -C (=0) -NH- (CH2) m-NH-C(=0) -CH (N(V1) (v2) ) ( (CH2)m-N(V1)(V2)), ou N(V1) (V2),

- (CH2)n-O- (CH2)m-CH3,

- (CH2)n-C(=0)

- (CH2)ra-N(V1) (V2), - (CH2)n-C (=0) -NH- (CH2)m-CH3,- (CH2)n-Ci=O) -NH-CH (-C (=0) -NH2) - (CH2)m-N(Vi) (ν2) , inclusive todas as configurações (R) ou (S) dos anteriormente citados, onde Vi e v2 são, cada qual,independentemente H, uma cadeia alquila linear ou ramificada Ci a Ci7, m é 0 a 17 e η é de 0 a 2; ou qualquer ômega amino alifático, arila ou aralquila terminal, incluindo grupos tais como metila, dimetila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, pentila, hexila, alila, metil ciclopropano, hexanoíla, heptanoíla, acetila, propionoíla, butanoíla,

fenilacetila, ciclohexilacetila, naftilacetilacinamoíla, fenila, benzila, benzoíla, 12-Ado, 7'-amino heptanoíla, 6-Ahx, Ame, ou 8-Aoc, ou qualquer a-aminoácido natural ou não natural simples, β-aminoácido ou aminoácido a,a-di-substitu£do, incluindo todas as configurações (R) ou (S) dos anteriormente citados, opcionalmente em combinação com qualquer um dos grupos capeadores não de aminoácido anteriormente citados. No texto anteriormente citado, fica entendido que, por exemplo,

-C (=0) -NH- (CH2)m-NHC (=0) -CH(N(vi) (v2) ) ( (CH2m-N(Vi) (v2) ) é :

"Grupo capeador N-terminal"

O termo "grupo capeador N-terminal" inclui qualquer grupo terminal ligado através da amina terminal do N-terminal de um composto. A amina terminal pode formar parte de um resíduo, ou pode formar uma parte de um substituto de aminoácido. Num aspecto preferido, o grupo capeador N-terminal forma uma parte de um substituto de aminoácido que se encontra na posição N-terminal do composto. 0 grupo capeador N-terminal inclui,porém não se restringe a qualquer ômega aminoalifático, grupo acila ou arila ou aralquila terminal, incluindo grupos tais como metila, dimetila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, pentila,hexila, alila, metil ciclopropano, hexanoíla, heptanoíla, acetila, propionoíla, butanoíla,fenilacetila, ciclohexilacetila, naftilacetila,cinamoíla, fenila, benzila, benzoíla, 12-Ado, 7'-amino heptanoíla, 6-Ahx, Amcf ou 8-Aoc, ou alternativamente um grupo capeador N-terminal é -(CH2)m-NH(V3), -(CH2)m-CH3, -C (=0) - (CH2)n-CH3,-C (=0) - (CH2)m-NH(V3) , -C (=0) - (CH2) m-C(=0) -0H,-C (=0) - (CH2)m-C (=0) - (V4) , - (CH2)m-C(=0) -0H, (CH2)m-C(=0) - (V4) , C (=0) - (CH2)m-O(V3) ,C (=0) - (CH2)m-S (v3) , or -(CH2)m-S(V3), onde v3 é H ou uma cadeia alquila Ci a Ci7 linear ou ramificada e V4 é uma cadeia alquila C1 a Ci7 linear ou ramificada e m é 0 a 17.

0 protocolo de nomenclatura química e os diagramas estruturais aqui utilizados empregam e baseiam-se nas características de nomenclatura química conforme utilizadas pelo programa ChemDraw(disponível da Cambridgesoft Corp., Cambridge, Mass.). Em especial, certos nomes de compostos são derivados das estruturas utilizando o programa Autonom utilizado por Chemdraw Ultra ou ISIS base (MDL Corp.). Em geral, os diagramas estruturais não ilustram os átomos de hidrogênio associados com os átomos de carbono que não em grupos terminais e outras circunstâncias especiais. Certos compostos são aqui ilustrados com os substitutos identificados por diagramas estruturais e os resíduos aminoácido identificados por uma abreviação de três letras. Salvo se especificado de outra forma, fica entendido que a ligação entre o substituto e o resíduo, ou entre o resíduo e o substituto, ou entre um substituto e resíduos tanto na lateral N-terminal como na lateral C-terminal do mesmo, é uma ligação peptídica convencional, -C (=0)-NH- ou, no caso em que a ligaçãopeptídica é ao nitrogênio de anel no N-terminal do substituto, -C(=0)-N-. Em geral, na representação de tais ligações, os átomos do substituto de aminoácido são representados (ex: -C(=0)- ou -Ν), embora os átomos do resíduo aminoácido não sejam representados.

2. PUREZA ISOMÉRICA E ISOLAMENTO

Os substitutos da invenção podem conter um ou mais centros quirais e/ou ligações duplas e, portanto, existem como estereoisômeros, tais como isômeros de dupla ligação (ou seja, isômeros geométricos), enantiômeros, ou diastereômeros. De acordo com invenção, as estruturas químicas aqui descritas, e, portanto os compostos da invenção abrangem a forma racêmica de compostos da invenção bem cmotodos os enantiômeros e estereoisômeros, ou seja, tanto a forma estereomericamente pura (ex: geometricamente pura, enantiomericamente pura, ou diaestereomericamente pura) como as misturas enantioméricas e estereoisoméricas. Um substituto da invenção é considerado opticamente ativo ou enantiomericamente puro (ou seja,substancialmente a forma Rou a forma S) com respeito a um centro quiral quando o composto tem cerca de 90% de ee (excesso enantiomérico) ou mais, preferivelmente um ee igual ou maior que 95% com respeito a um centroquiral específico. Um composto da invenção éconsiderado enantiomericamente enriquecido quando o composto possui um excesso enantiomérico maior que cerca de 80% de ee, preferivelmente maior que cerca de 85% ee. Conforme aqui utilizada, uma mistura racêmicasignifica cerca de 50% de um enantiômero e cerca de 505de seu enantiômero correspondente em relação a todos os centros quirais na molécula. Assim, a invenção abrange todas as misturas enantiomericamente puras, enantiomericamente enriquecidas, e racêmicas de compostos da invenção.

Assim, em um aspecto, o substituto possui a estrutura geral:onde o asterisco indica qualquer conformação estereoquímica possível. Isso inclui as seguintes formas enantioméricas:

<formula>formula see original document page 41</formula>

Misturas enantioméricas ou estereoisoméricas podem ser resolvidas em seus enantiômeros ou estereoisômeros componentes através de métodos bem conhecidos, tais como cromatografia gasosa de fase quiral, cromatografia líquida de alto desempenho de fase quiral, cristalizar o composto como um complexo salino quiral, ou cristalizar o compostos num solvente quiral. Enantiômeros ou esteroisômeros podem também ser obtidos de intermediários estereomericamente ouenantiomericamente puros, reagentes, e catalisadores através de métodos sintéticos assimétricos conhecidos.

COMPOSTOS DA INVENÇÃO

A invenção provê substitutos de aminoácido constritos no anel da fórmula I e compostos lineares ou cíclicos compreendendo substitutos de aminoácido constritos no anel da fórmula I:

<formula>formula see original document page 41</formula>

ou um enantiômero, estereoisômero ou diastereoisômero dos mesmos, ou um sal sinteticamente aceitável dosmesmos, onde:

R1 é H, alquila, arila, alquilarila, alquila-N(R8) 2, alquila-OR8, alquila-C (=0) OR8, C (=0) OR8i alquila-NH2, alquila-S-R8, alquila-C (=0) N (R8) 2, ou um grupo da fórmula:

<formula>formula see original document page 42</formula>

R2 é H ou alquila, contanto que R1 e R2 não sejam ambos H;

R3 é H ou um primeiro grupo nitrogênio-protetor; R4 é H, alquila, (CH2) mC (=0) OH, (CH2) mC (=0) NR11, (CH2) mC (=0) OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qOallyl, (CH2)mC (=0)N(R8) 2, ou (CH2)mC (=0) N (R8) (CH2)pN(R8)2; R5 é H ou alquila;

R6a é H, alquila, (CH2) mC (=0) 0H, (CH2) mC (=0) NR11, (CH2)raC (=OJOR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qOallyl, (CH2) mC (=0) N (R8) 2, or (CH2) mC (=0) N (R8) (CH2)pN(R8)2; R6b é H ou alquila;

contanto que tanto R4 como R6a não sejam (CH2) mC (=0) 0H, (CH2)mC (=ONR11, (CH2)mC (=OjOR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qOallyl, (CH2) mC (=0) N (R8) 2, ou

(CH2) mC (=0) N (R8) (CH2)pN(R8)2;

R7 é H, C (=0) alquila, C (=0) (CH2) m (NR8) 2, alquila, aralquila, ou arila;

cada ocorrência de R8 é independentemente H, arila, ou alquila;

R11 é um suporte sólido de peptídeo

R12 é H ou um segundo grupo nitrogênio-protetor;

cada ocorrência de m é um número inteiro independentecom um valor entre 0 e 6;

cada ocorrência de q é um número inteiro independente com um valor entre 1 e 6;

ρ é um número inteiro com um valor entre 1 e 10; ey é O ou 1.

Os substitutos de aminoácido constritos no anel da fórmula I podem ser empregados para substituição de um ou mais resíduos aminoácido de compostos polipeptídicos preparados de uma pluralidade de resíduos aminoácido. Os substitutos de aminoácido constritos no anel de fórmula I são preferivelmente tais que possam ser preparados com um N-terminal amino-protegido convencional, utilizando um grupo protetor tal como Fmoc, e um C-terminal carboxila reativo, podendo assim ser empregado em metodologias convencionais de síntese de peptídeo. Fica entendido que se o substituto de aminoácido de fórmula I precisar ser acoplado à posição C-terminal do compostos, outro que não um terminal carboxila pode ser empregado em tal substituto.

Assim, numa concretização preferida, a invenção prove substitutos de aminoácido constritos no anel para incorporação, através de metodologias de síntese de peptídeos, modificadas se apropriado, em compostos polipeptídicos, compostos estes que compreendem uma pluralidade de resíduos aminoácido.

Exceto quando tanto R1 como R2 forem H, deve-se considerar que cada substituto da invenção pode ter uma das quatro formas enantioméricas diferentes. Assim, para fins de exemplo, quando o grupo R1 ou R2 for uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Arg, o composto pode ser genericamente mostrado como:

<formula>formula see original document page 43</formula>

onde cada asterisco representa um centro quiral que pode ter qualquer configuração estereoquímica. Assim, fica entendido que cada uma das seguintes fórmulas épossível, prevista e pretendida:

<formula>formula see original document page 44</formula>

De forma similar, com respeito a cada substituto, para uso na síntese de compostos que utilizam metodologias sintéticas convencionais de peptídeo, fica entendido que se um substituto estiver em outra posição que não a posição N-terminal, a posição de R3 incluirá um grupo nitrogênio-protetor ao invés de H, e assim terá a seguinte estrutura geral:

<formula>formula see original document page 44</formula>

onde PRG é um grupo nitrogênio-protetor, tal como, para fins de exemplo e não limitação, um grupo da fórmula:

<formula>formula see original document page 44</formula>

onde R é ter-butila, alila ou um grupo de uma fórmula:

<formula>formula see original document page 44</formula>

Assim, pode-se observar no exemplo que, quando o grupo R1 ou R2 for uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Arg e R3 for o grupo nitrogênio-protetor Fmoc, cadauma das seguintes estruturas é possível, prevista e pretendida:

<formula>formula see original document page 45</formula>

No exemplo específico acima, é também possível e previsto que um grupo nitrogênio-protetor, tal como por exemplo Pbf, poderia ser empregado no grupo guanidino. Pode-se também observar que substitutos análogos são possíveis e previstos empregando-se outro grupo como ogrupo nitrogênio-protetor ou outra porção de cadeia lateral de aminoácido ou derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido como o grupo R1 ou R2, ou alternativamente, onde pelo menos um dos mesmos for alquila, arila, alquilarila, alquila-N(R8) 2, alquila-OR8, alquila-C (=0) OR8, C(=0)0R8, alquila-NH2, alquila-S-R8, alquila-C (=0) N (R8) 2, ou um grupo de uma fórmula:

<formula>formula see original document page 46</formula>

onde R8 é H, arila, ou alquila e R12 é H ou um segundo grupo nitrogênio-protetor. Se um substituto for empregado na síntese de compostos utilizando as metodologias de síntese de peptídeo convencionais e estiver na posição C-terminal, então o substituto poderá ser um composto que é ligado a um suporte sólido de peptídeo, tal como uma resina. Neste caso, o substituto pode ter a seguinte estrutura geral:

<formula>formula see original document page 46</formula>

onde o oval representa a resina e um ligante ou outro suporte sólido de peptídeo. Aqui também o grupo R1 ou R2 pode ser qualquer porção de cadeia lateral de aminoácido ou derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido, ou alternativamente, pelo menos um dos mesmos pode ser alquila, arila, alquilarila, alquila-N(R8)2, alquila-OR8, alquila-C (=0) OR8, C(=0)0R8, alquila-NH2, alquila-S-R8, alquila-C (=0) N (R8) 2, ou um grupo da fórmula:

<formula>formula see original document page 46</formula><formula>formula see original document page 47</formula>

onde R8 é Η, arila, ou alquila e R12 é H ou um segundo grupo nitrogênio-protetor.

Em um aspecto, a invenção provê assim substitutos da seguinte estrutura geral:

<formula>formula see original document page 47</formula>

onde R1 é um dos seguintes:

<formula>formula see original document page 47</formula><formula>formula see original document page 48</formula>

onde R3 é H ou um primeiro grupo nitrogênio-protetor; R4 é H, alquila, (CH2) mC (=0) 0H, (CH2) mC (=0) NR11,(CH2)mC (=0) OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qOalila, (CH2)mC (=0)N(R8) 2, ou (CH2)mC(=0) N (R8) (CH2)pN(R8)2; R5 é H ou alquila; R8 é H, arila, ou alquila; R11 é um suporte sólido de peptídeo; cada ocorrência de m é um número inteiro independente com um valor entre 0 e 6; cada ocorrência de q é um número inteiro independente com um valor entre 1 e 6; pé um número inteiro com um valor entre 1 e 10; e qualquer grupo arila pode ser substituído independentemente com um ou mais substituintes selecionados de alquila, haloalquila, cicloalquila, alcoxi, alquitio, halo, nitro, acila, ciano, amino, amino monosubstituído, amino disubstituído, hidroxi, carboxi, ou alcoxi-carbonila. Assim, em um aspecto, são providos substitutos com um grupo R1 que é uma porção de cadeia lateral deaminoácido de um dos seguintes dezenove resíduos aminoácido de ocorrência natural (omitindo-se Pro), inclusive os seguintes:

<table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table><table>table see original document page 51</column></row><table><table>table see original document page 52</column></row><table>

Ácido 5-Mercaptometil-6-oxo-piperazino-2-carboxílico

<formula>formula see original document page 52</formula>

Em cada um dos anteriormente citados, em vez de H na posição R3 pode haver qualquer grupo nitrogênio-protetor; em vez de -C(=0)0H a posição R4 pode ser alquila, (CH2) qC (=0) OHi (CH2) mC (=0) NR11, (CH2) mC (=0) OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qOalila7 (CH2) mC (=0) N (R8) 2, ou (CH2)mC (=0) N (R8) (CH2)pN(R8)2 onde R8 é H, arila, ou alquila, R11 é suporte sólido de peptídeo, m é um número inteiro independente tendo um valor entre 0 e 6, q é um número inteiro independente tendo um valor entre 1 e 6, epé um número inteiro tendo um valor entre 1 e 6 e ρ é um número inteiro tendo um valor entre 1 e 10; em vez de H na posição R5 pode ser

alquila; e em vez de H a posição R7 pode ser C (=0) alquila ou C (=0) (CH2) m (NR8) 2. De forma similar, em de vez de uma das porções de cadeia lateral de aminoácido anteriormente citadas, R1 pode ser alquila, arila, alquilarila, alquila-N(R8) 2, alquila-0R8, alquila-C (=0) OR8, C(=0)0R8, alquila-NH2, alquila-S-R8, alquila-C (=0) N (R8) 2, ou um grupo de uma fórmula:

<formula>formula see original document page 52</formula>

onde R8 é H, arila, ou alquila e R12 é H ou um segundo grupo nitrogênio-protetor.

USO DE COMPOSTOS DA INVENÇÃO

De acordo com um aspecto da presente invenção, é provido um método para preparar um composto que inclui um substituto, cujo composto é baseado num polipeptídeo parental conhecido que se liga a um alvo de interesse.O polipeptídeo parental pode ser um peptídeo, um polipeptídeo ou uma proteína.

Em outro aspecto da presente invenção, é provido um método para identificar uma estrutura secundária de um polipeptídeo parental, estrutura secundária que está envolvida em ou é responsável pela ligação a um alvo de interesse. Tal método inclui (a) prover um polipeptídeo parental conhecido que se liga a um alvo de interesse com uma estrutura primária conhecida, tal estrutura primária consistindo de η resíduos aminoácido; (b) construir uma pluralidade de compostos em que um substituto é substituído por um resíduo aminoácido no polipeptídeo parental, o substituto substituído tendo preferivelmente um grupo R1 ou R2 que é igual à porção de cadeia lateral de aminoácido pelo qual é substituído, ou que é derivado da porção de cadeia lateral de aminoácido do resíduo aminoácido pelo qual é substituído; (c) identificar a pluralidade de compostos incluindo um substituto; e (d) selecionar o composto que exibe ligação ao alvo de interesse, por meio do que tal composto compreende a estrutura secundária que se liga ao alvo de interesse.

Num aspecto relativo da presente invenção, é provido um método para identificar uma estrutura secundária de um polipeptídeo parental que está envolvida em ou que é responsável pela ligação a um alvo de interesse, o método incluindo a etapa de construir uma pluralidade de compostos em que um substituto é substituído por um resíduo aminoácido no polipeptídeo parental, o substituto substituído tendo preferivelmente um grupo R1 e R2 limitado a H em ambas as posições ou metila numa posição e H na posição restante. Desta forma, o efeito da porção de cadeia lateral de aminoácido sobre a eficácia ou sobre qualquer outro parâmetro apurável pode ser prontamente determinado.

Em uma concretização, o método da invenção provê a análise sistemática de um polipeptídeo parental paradeterminar pelo menos uma seqüência ativa ou domínio no polipeptídeo parental que está envolvido na interação, tal como ligação, do polipeptídeo parental com uma substância alvo. Conforme aqui utilizado, "polipeptídeo parental" refere-se a qualquer seqüência de resíduos aminoácido que exibe interação, tal como ligação, a uma substância alvo, e que pode assim constituir um peptídeo, um polipeptídeo ou uma proteína. 0 polipeptídeo parental é geralmente um polipeptídeo conforme definido na presente invenção, com de cerca de 3 a cerca de 100 resíduos aminoácido, embora o termo polipeptídeo parental possa também incluir construtos maiores, geralmente considerados no estado da técnica como polipeptídeos ou proteínas grandes. Para empregar o método da invenção, a estrutura primária, ou seja a seqüência, de pelo menos parte, e preferivelmente de todo o polipeptídeo parental deve estar disponível. Porém, é necessário ter qualquer informação relacionada com a estrutura secundária ou terciária do polipeptídeoparental para praticar o método da invenção.

O polipeptídeo parental pode ser qualquer seqüência que exiba a ligação a um receptor encontrado, por exemplo, em células, tecidos, órgãos ou outros materais biológicos. Exemplos de polipeptídeos parentais incluem, sem limitação, peptídeos biologicamente ativos, hormônios, neurotransmissores, enzimas, anticorpos e similares. Tais polipeptídeos parentais podem transmitir sinais, direta ou indiretamente, como resultado da ligação a um receptor, e assim umpolipeptídeo parental pode ser um agonista, umantagonista, ou um agonista-antagonista misto. Exemplos de polipeptídeos parentais apropriados da invenção incluem peptídeos melanocortina-receptor específicos, proteína de ativador tecidual de plasminogênio tipo uroquinase, peptídeos relacionados com proteína beta-amilóide, peptídeos relacionados com doenças causadas por prions, peptídeos de vasopressina, peptídeosoxitocina, peptídeos natriuréticos, peptídeos de angiotensina, calcitonina, peptídeo relacionado com gene de calcitonina, peptídeos opióides, hormônio de crescimento humano, ligantes a receptor de prolactina humana, diversos interferons, tais como alfa-interferon, fator de crescimento epidérmico, fator de necrose tumoral, e diversos peptídeos hipotensivos, peptídeos fibrinolíticos, peptídeos guimiotáticos, peptídeos promotores de crescimento, peptídeos e polipeptídeos de adesão celular, mitógenos, imunomoduladores, e similares.

Em geral, para empregar a invenção é realizado pelo menos um ensaio ou teste para determinar um parâmetro de um construto da invenção com respeito a um receptor de interesse. Em um aspecto, emprega-se a ligação dos construtos da invenção a um receptor de interesse, e preferivelmente com determinação paralela de ligação do polipeptídeo parental ao receptor de interesse. Porém, outros parâmetros que não a ligação podem serempregados, inclusive diversos sistemas de ensaiofuncionais, sistemas de ensaio de eficácia, e similares. Tais parâmetros podem ser determinados com respeito a qualquer unidade de medição relevante, inclusive a expressão de um ou mais compostos num sistema de ensaio funcional, valores ki, valores EC50, e similares. Assim, em uma concretização preferida da invenção, um ensaio de inibição competitiva ou ensaio similar é empregado, por meio do qual a ligação ou atividade funcional de um construto da invenção podeser diretamente comparada com o polipeptídeo funcional,e a ligação ou atividade funcional relativa diretamente determinada. Em outras concretizações, podem ser empregados outros ensaios ou testes. Esses ensaios podem, porém não necessitam, ser ensaios funcionais.

Exemplos de ensaios incluem qualquer um de uma variedade de ensaios de inibição competitivos, ensaios de ligação direta, ensaios funcionais, e similares. Étambém possível e previsto empregar ensaios que determinem, por exemplo, se um construto da invenção é um agonista, antagonista ou agonista-antagonista misto, e ainda quando a ligação e função pode ser determinada separadamente, para independentemente determinar tanto a afinidade a receptor como a especificidade, bem como a atividade funcional. Exemplos de tais ensaios e testes são bastante conhecidos e bem documentados no estado da técnica e, em geral, um ou mais ensaios ou testes são conhecidos para qualquer polipeptídeo parental.

Em um método da invenção, o polipeptídeo parental é empregado como padrão para a geração de um ou mais, e preferivelmente de uma série de compostos, cada qual incluindo pelo menos um substituto substituído com pelo menos um resíduo aminoácido do polipeptídeo parental. Em um aspecto, os compostos com pelo menos um substituto podem omitir um ou mais resíduos aminoácido encontrados no polipeptídeo parental. Em outro aspecto, os compostos com pelo menos um substituto contém os mesmos resíduos aminoácido, ou homólogos dos mesmos, encontrados no polipeptídeo parental, com um ou mais resíduos aminoácido substituídos com um substituto. Em um aspecto, o substituto substituído preferivelmentepossui um grupo R1 e R2 que é igual a porção de cadeialateral de aminoácido do resíduo aminoácido pelo qual é substituído, ou que é um derivado da porção da cadeia lateral de aminoácido do resíduo aminoácido pelo qual é substituído. Em outro aspecto, o substituto substituídopreferivelmente possui um grupo R1 e R2 limitado a H emambas posições ou metila numa posição e H na posição restante.

Suponha, por exemplo, um polipeptídeo parental de seis resíduos aminoácido que se liga a um receptor especificado e conhecido. 0 polipeptídeo parental pode ser descrito como segue: X1-X2-X3-X4-X5-X6Um substituto da invenção designado como "S" é empregado para sintetizar um composto descrito como: X1-X2-X3-S-X5-X6

Em um aspecto do composto X1-X2-X3-S-X5-X6, onde o resíduo aminoácido X4 é substituído com S, S possui um grupo R1 e R2 que é igual à porção de cadeia lateral de aminoácido de X4. Em outro aspecto, onde X4 é outro que não Gly ou Ala, S possui um grupo R1 e R2 limitado a H em ambas as posições ou metila numa posição e H na posição restante. A ligação do composto X1-X2-X3-S-X5-X6, ou alguma outra medida de eficácia, é determinada e comparada ao polipeptídeo parental X1-X2-X3-X4-X5-X6. É possível e previsto que uma avaliação sistemática possa ser realizada. Suponha um peptídeo com quinze resíduos aminoácido que se liga a um receptor especificado conhecido. 0 peptídeo pode ser descrito como:

NH2-Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-Xii-Xi2-X13-X14-X15-COOH

Neste polipeptídeo parental, X pode ser qualquer resíduo, resíduo este que pode se repetir múltiplas vezes em qualquer ordem ou seqüência. Assim, o resíduo na posição X1 pode ser diferente de ou igual ao resíduo na posição X2, que pode ser diferente de ou igual aos resíduos na posição X1 ou X3 e assim por diante. Umasérie de compostos são preparados, onde um substituto"S" é substituído com um resíduo aminoácido de forma seqüencial ou em etapas. Assim, por exemplo, o resultado pode ser o seguinte:

S-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-Xii-Xi2-X13-X14-X15-COOHNH2-Xi-S-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-Xii-Xi2-X13-X14-X15-COOHNH2-Xi-X2-S-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-Xii-Xi2-X13-X14-X15-COOH NH2-Xi-X2-X3-S-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-Xii-Xi2-X13-X14-X15-COOH NH2-Xi-X2-X3-X4-S-X6-X7-X8-X9-Xio-Xii-Xi2-X13-X14-X15-COOH NH2-Xi-X2-X3-X4-X5-S-X7-X8-X9-Xio-Xii-Xi2-X13-X14-X15-COOH NH2-Xi-X2-X3-X4-X5-X6-S-X8-X9-Xio-Xii-Xi2-X13-X14-X15-COOH NH2-Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-S-X9-Xio-Xii-Xi2-X13-X14-X15-COOH NH2-Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-S-Xio-Xii-Xi2-X13-X14-X15-COOHNH2-Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-S-Xii-Xi2-X13-X14-X15-COOH NH2-Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-S-Xi2-X13-X14-X15-COOH NH2-Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-Xii-S-X13-X14-X15-COOH NH2-Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-Xii-X12-S-X14-X15-COOH NH2-Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-Xii-X12-X13-S-X15-COOH NH2-Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-X11-X12-X13-X14-S No anteriormente citado, o substituto S possui, para cada composto, um grupo R1 e R2 que é igual à porção de cadeia lateral de aminoácido do resíduo aminoácido peloqual é substituído ou que é derivado da porção de cadeia lateral de aminoácido do resíduo aminoácido pelo qual é substituído. De forma similar, para cada posição todas as formas enantioméricas podem ser empregadas e avaliadas. Adicionalmente, para cada posição, um método de "knock-out" pode ser avaliado, no qual onde X é outro que não Gly ou Ala, S possui um grupo R1 e R2 H em ambas as posições ou metila numa posição e H na posição restante.

É também possível e previsto substituir um ou mais resíduos aminoácido num polipeptídeo parental com outro resíduo aminoácido enquanto também se substitui um ou mais resíduos aminoácido num polipeptídeo parental com um substituto da invenção. Em um aspecto, um D-isômero é substituído com um L-isômero num polipeptídeoparental de ocorrência natural.

A seqüência de aminoácido correspondente compreendendo pelo menos um substituto de fórmula I pode ser idêntica a de um polipeptídeo parental conhecido, ou pode ser homólogo ao mesmo, tal como uma seqüência de aminoácidocorrespondente que é pelo menos 60% homóloga ou maispreferivelmente pelo menos cerca de 80% homóloga. Para essa finalidade, a homologia é determinada por referência à identidade da seqüência de aminoácido conhecida em relação ao composto exceto pela substituição com ou adição a um ou mais substitutos da fórmula I.

Em outro aspecto, a invenção provê substitutos deaminoácido constritos no anel de fórmula II úteis para sintetizar um composto que é modelado num peptídeo conhecido que se liga a um receptor para um peptídeo natriurético, mas que inclui um ou mais substitutos de aminoácido, tais substitutos sendo ou substituídos com um ou mais resíduos aminoácido contidos no peptídeo conhecido, ou adicionalmente à seqüência compreendendo o peptídeo conhecido. O peptídeo conhecido pode ser qualquer peptídeo natriurético conhecido no estado da técnica, inclusive, porém não restrito aos descritos em qualquer publicação, patente, pedido ou referência ali citados, inclusive, porém não restritos aos peptídeos natriuréticos descritos nas patentes americanas 4,496,544; 4, 609,725; 4,656,158; 4,673,732; 4,716, 147; 4,757,048; 4, 764,504 ; 4,804,650; 4,816,443 ; 4,824, 937; 4,861,755; 4, 904,763; 4,935,492; 4,952,561; 5,047, 3 97; 5,057,495; 5, 057,603 ; 5,091,366; 5,095,004; 5,106, 834; 5,114,923 ; 5, 159,061; 5,204,328; 5,212,286; 5,352, 587; 5,376,635; 5, 418,219; 5,665,704; 5,846,932 ; 5,583, 108; 5,965,533; 6, 028,055; 6,083,982; 6,124,430; 6,150, 4 02; 6,407,211; 6 ,525,022; 6,586,396 or 6,818 ,619; nas

Publicações de Pedido de Patente Americana 2004/0002458; 2004/0063630; 2004/0077537; 2005/01132 86; 2005/0176641; ou 2006/0030004; ou em diversas patentes 2e pedidos de patente não americanos inclusive WO 85/04870; WO 85/04872; WO 88/03537; WO 88/06596; WO 89/10935; WO 89/05654; WO 90/01940; WO 90/14362; WO 92/06998; WO 95/13296; WO 99/08510; WO 99/12576; WO 01/016295; WO 2004/047871; WO 2005/072055; EPO 0291 999; EPO 0 323 740; EPO 0 341 603; EPO 0 350 318; EPO 0 356 124; EPO 0 385 476; EPO 0 497 368; ou EPO 0 542 863. Em um aspecto, o peptídeo conhecido é um peptídeo ou homólogo do mesmo descrito nas patentes americanas 4,656,158, 4,824,937, 4,935,492, 5,159,061, 5,204,328, 5,376,635, 5,665,704, 5,846,932, 6,028,055, 6,407,211, 6,525,022, 6,586,396, or 6,818,619, Publicações de pedido de patente americana 2 004/0002458, 2004/0063630,or 2005/0176641, ou Publicações de pedido de patente americana WO 2004/047871 ou WO 2005/072055. Os ensinamentos de cada uma das patentes e pedidos de patente são incorporados por referência como se providos em sua totalidade. Em um aspecto, a seqüência de aminoácido que se liga a um receptor de peptídeo natriurético é, antes da substituição, H-Met-ciclo(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2 (SEQ ID NO: 1). Em outro aspecto, a invenção provê substitutos de aminoácido constritos no anel de fórmula I úteis para sintetizar um composto que se liga a um receptor para um peptídeo natriurético, incluindo um receptor para ANP e BNP.

Os compostos preparados utilizando um ou mais substitutos de fórmula I pode ser usado tanto em aplicações médicas, como em aplicações veterinárias e de criação de animais. Tipicamente, o composto ou uma composição farmacêutica incluindo o composto, é usado em humanos, podendo porém ser também usado em outros mamíferos. 0 termo "paciente" pretende estipular um indivíduo mamífero, sendo assim utilizado em todo o relatório e nas reivindicações. As principais aplicações da presente invenção envolvem pacientes humanos, porém, a presente invenção pode ser aplicada aanimais de laboratório, gado, animais de zoológico, deestimação, esportivo ou outros animais.

Os compostos aqui descritos ou preparados através dos métodos aqui descritos, podem ser usados no tratamento de qualquer condição, síndrome ou doença, e em especialde qualquer condição, síndrome ou doença para os quaisum polipeptídeo parental possui alguma eficácia. Os compostos aqui descritos ou preparados através dos métodos aqui descritos, podem ter uma oumais vantagens relacionadas com o polipeptídeo parental,inclusive, porém não restrito a vantagens tais como resistência aumentada à degradação enzimática, meia-vida de circulação aumentada, biodisponibilidade aumentada,eficácia aumentada, duração prolongada de efeito e combinações dos anteriormente citados. Tais vantagens são devido, no todo ou em parte, ao uso dos substitutos da fórmula I da invenção.

Em um aspecto, os compostos descritos na presente invenção são usados no tratamento do estágio inicial, tal como classe 1, da insuficiência cardíaca congestiva. Em outro aspecto, os compostos aqui descritos são usados no tratamento de insuficiência cardíaca congestiva crônica ou descompensda. Em outro aspecto, os compostos aqui descritos são usados no tratamento de insuficiência cardíaca congestiva aguda, inclusive insuficiência cardíaca congestiva aguda descompensada de pacientegs com dispnéia em repouso ou com atividade mínima.

Forma Salina dos Compostos. Os compostos da presente invenção podem ser apresentados na forma de qualquer sal farmacêuticamente aceitável. 0 termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais preparados com bases ou ácidos atóxicos farmaceuticamente aceitáveis, inclusive as bases e os ácidos orgânicos ou inorgânicos. Sais derivados de bases inorgânicas incluem sais de alumínio, amônio, cálcio, cobre, férrico, ferroso, lítio, magnésio, mangânico, manganoso, potássio, sódio, zinco e similares. Especialmente preferidos são os sais de amônio, cálcio, lítio, magnésio, potássio e sódio. Sais derivados de bases atóxicas orgânicas farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de aminas primárias, secundárias e terciárias, aminas substituídas incluindo as aminas substituídas de ocorrência natural, aminas cíclicas e resinas básicas de troca iônica, tais como arginina, betaína, cafeína, colina, N,N'-dibenziletilenodiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilenodiamina, n-etil-morfolina, N-etilpiridina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina,isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina,procaína, purinas, teobromina, trietilamina,trimetilamina, tripropilamina, trometamina e similares. Quando o composto da presente invenção for básico, sais de adição de ácido podem ser preparados com os ácidos atóxicos farmaceuticamente aceitáveis, incluindo os ácidos inorgânicos e orgânicos. Tais ácidos incluem ácido acético, benzenossulfônico, benzóico,canforssulfônico, carboxílico, cítrico,etanossulfônico, fórmico, fumárico, glucônico, glutâmico, bromídrico, clorídrico, isotiônico, láctico, maleico, málico, mandélico, metanossulfônico, malônico, múcico, nítrico, pamóico, pantotênico, fosfórico, propiônico, succínico, sulfúrico, tartárico, ácido p-toluenossulfônico, ácido trifluoroacético, e similares. Sais de adição de ácido dos compostos da presente invenção são preparados num solvente apropriado do composto e um excesso de um ácido, tal como ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, fosfórico, acético, trifluoroacético, cítrico, tartárico, maleico, succínico ou metanossulfônico. A forma salina de acetato é especialmente útil. Quando os compostos da presente invenção incluem uma porção ácida, sais farmaceuticamente aceitáveis adequados podem incluir sais alcalino-metálicos, tais como sais de sódio ou de potássio, ou sais metálicos alcalinoterrosos, tais como sais de cálcio ou magnésio. Composições Farmacêuticas. Outra concretização da presente invenção provê uma composição farmacêutica que inclui um composto da presente invenção e um portador farmaceuticamente aceitável. O portador pode ser uma formulação líquida, sendo preferivelmente uma solução tamponada, isotônica, aquosa. Portadoresfarmaceuticamente aceitáveis também incluemexcipientes, tais como diluentes, portadores e similares, e aditivos, tais como agentesestabilizantes, preservativos, agentes solubilizantes, tampões e similares, conforme adiante descrito. Os compostos de diversas concretizações da presente invenção podem ser formulados ou combinados em composições farmacêuticas que incluem pelo menos um composto da presente invenção juntamente com um ou mais portadores farmaceuticamente aceitáveis, incluindo os excipientes, tais como diluentes, portadores e similares, e aditivos, tais como agentes estabilizantes, preservativos, agentes solubilizantes, tampões e similares, conforme desejado. Os excipientes da formulação podem incluir polivinilpirrolidonaf gelatina, hidroxicelulose, acácia, polietileno glicol, manitol, cloreto de sódio e citrato de sõdio. Para injeção ou outras formulações de administraçãolíquida, água contendo pelo menos um ou mais constituintes tamponantes é preferida, bem como agentes estabilizantes, preservativos e agentes solubilizantes podem também ser empregados. Para formulações de administração sólida, qualquer um de uma variedade de aditivos espessantes, de carga, de volume e portadores podem ser empregados, tais como amidos, açúcares, ácidos graxos e similares. Para formulações de administração tópica qualquer um de uma variedade decremes, pomadas, géis, loções e similares pode serempregado. Para a maioria das formulações farmacêuticas, ingredientes não ativos constituirão a maior parte, em peso ou volume, da preparação. Para formulações farmacêuticas, também se prevê que qualquerum de uma variedade de formulações e aditivos deliberação dosimetrada, lenta ou gradual podem ser empregados, de forma que a dosagem possa ser formulada para efetuar a liberação de um composto da presente invenção durante um período de tempo.

Em geral, a quantidade real de compostos administrados a um paciente variará entre faixas bastante amplas, dependendo do modo de administração, da formulaçãoutilizada e da resposta desejada.

No uso prático, os compostos podem ser combinados como o ingrediente ativo numa mistura com um portador farmacêutico de acordo com técnicas de combinação farmacêutica convencionais. O portador pode assumir uma variedade de formas, dependendo da forma de preparação desejada para administração, por exemplo, oral, parenteral (inclusive intravenosa), uretral, vaginal, nasal, dérmica, transdérmica, pulmonar, pulmonar profunda, inalação, bucal, sublingual ou similares. Na preparação das composições para a forma de dosagem oral, qualquer um dos meios farmacêuticos normais podem ser empregados, tais como, por exemplo, água, glicóis, óleos, álcoóis, agentes aromatizantes, preservativos, agentes corantes, e similares no caso de preparações orais líquidas, tais como, por exemplo, suspensões, elixires e soluções;ou portadores tais como amidos, açúcares, celulose microcristalina, diluentes, agentes granulantes, lubrificantes, ligantes, agentesdesintegrantes e similares no caso de preparações orais sólidas tais como, por exemplo, pós, cápsulas e comprimidos duros e moles e comprimidos.

Devido à facilidade de administração, os comprimidos e as cápsulas representam uma forma unitária de dosagemoral vantajosa. Se desejado, uma composição que incluaum composto da presente invenção pode ser revestida através de técnicas padrão aquosas ou não-aquosas. A quantidade de composto ativo em tais composições terapeuticamente úteis é tal que uma dosagem eficazserá obtida. Em outra forma unitária de dosagemvantajosa, composições farmacêuticas sublinguais podem ser empregadas, tais como folhas, wafers(hóstias), comprimidos ou similares. 0 composto ativo pode também ser administrado intranasalmente tal como, por exemplo, através de gotas líquidas ou pulverização.

Os comprimidos, pílulas, cápsulas e similares podem também conter um ligante tal como goma tragacanto,acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes tais como fosfato dicálcico; um agente desintegrante tal como amido de milho, amido de batata ou ácido algínico; um lubrificante tal como estearato de magnésio; e um agente adoçante tal como sacarose, lactose ousacarina. Quando uma forma unitária de dosagem for uma cápsula, ela pode conter, além dos materiais do tipo acima, uum portador líquido tal como óleo graxo. Diversos outros materiais podem ser utilizados como revestimentos ou para modificar a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, comprimidos podem ser revestidos com goma-laca, açúcar ou ambos. Um xarope ou elixir pode conter, além do ingrediente ativo, sacarose como agente adoçante, metil e propilparabenos como preservativos, um corante e um aromatizante tal como cereja ou laranja.

Os compostos podem também ser administrados parenteralmente. Soluções ou suspensões desses peptídeos ativos podem ser preparados em águaadequadamente misturada com um surfactante, tal comohidroxipropilcelulose. As dispersões podem também ser preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos, e suas misturas em óleos. Essas preparações podem opcionalmente conter um preservativo para prevenir o crescimento de microorganismos. Formulações liofilizadas unitárias únicas podem também ser utilizadas, sendo reconstituídas, tais como com solução salina, imediatamente antes da administração, e assim, não requerem um preservativo.

As formas farmacêuticas apropriadas para uso injetávelincluem, por exemplo, soluções ou dispersões aquosas estéreis bem como pós estéreis, tais como formulações liofilizadas, para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os 35 casos, a forma deve ser estéril e fluida a ponto de poder ser administrada através de seringa. A forma deve ser estável sob as condições de fabricação earmazenamento e preservadas contra a ação contaminante de microorganismos, tais como bactérias e fungos. 0 portador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, um poliol, como por exemplo glicerol, propileno glicol ou polietileno glicol líquido, misturas apropriadas dos mesmos, e óleos vegetais.

Compostos, conforme aqui descritos, podem ser terapeuticamente aplicados por meio de administração nasal. Por "administração nasal" entende-se qualquer forma de administração intranasal de qualquer um dos compostos da presente invenção. Os compostos podem ser apresentados como uma solução aquosa, tal como uma solução que inclui solução salina, citrato ou outros excipientes ou preservativos comuns. Os compostos podem também ser apresentados como uma formulação seca ou em pó.

Numa concretização alternativa, os compostos podem ser administrados diretamente no pulmão. A administração intrapulmonar pode ser realizada por meio de um inalador dosimetrado, um dispositivo que permite a auto-administração de um bolus metrado de um composto da presente invenção quando acionado por um paciente durante a inspiração. Tanto a inalação de pó seco como os aerossóis nebulizados podem ser empregados.

De acordo com outra concretização da presente invenção, os compostos da presente invenção podem ser formulados com qualquer um de uma variedade de agentes que aumentem a absorção nasal eficaz de fármacos, inclusive de fármacos peptídicos. Esses agentes devem aumentar a absorção nasal sem danos inaceitáveis à membrana mucosa. As patentes americanas 5.693.608 e 5.977.070 e 5.908.825, entre outras, ensinam a respeito de diversas composições farmacêuticas que podem ser empregadas, inclusive intensificadores de absorção, e os ensinamentos de cada um dos anteriormente citados, e todas as referências e patentes aqui citadas, sãoincorporadas por referência.

Se numa solução aquosa, certos compostos da presente invenção podem ser apropriadamente tamponados por meio de solução salina, acetato, fosfato, citrato, acetato, ou outros agentes tamponantes, que podem ter qualquer pH fisiologicamente aceitável, geralmente de cerca de pH 4 a cerca de pH 7. Uma combinação de agentes tamponantes pode também ser empregada, tais como solução salina tamponada com fosfato, um tampão de solução salina e acetato, e similares. No caso de uma solução salina, uma solução salina a 0,9%, pode ser empregada. No caso de acetato, fosfato, citrato, acetato e similar, uma solução 50mM pode ser empregada. Além dos agentes tamponantes, um preservativo apropriado pode ser empregado, para impedir ou limitar a proliferação de bactérias e de outros micróbios. Tal preservativo que pode ser empregado ê o cloreto de benzalcônio a 0,05%.

É também possível e previsto que o composto possa estarnuma forma seca e particulada. Numa concretizaçãopreferida, as partículas estão entre cerca de 0,5 e 6,0 μm, de forma que as partículas tenham massa suficiente para se depositarem na superfície pulmonar, e não serem exaladas, sendo porém pequenas o bastante para serem depositadas nas superfícies das vias aéreas antes de atingir o pulmão. Qualquer uma de uma variedade de técnicas diferentes pode ser empregada para preparar micropartículas de pó seco, inclusive, porém não restrito a micro-trituração, secagem por pulverização eum aerossol de congelamento rápido através de

Iiofilização. Com micropartículas, os compostos podem ser depositados profundamente no pulmão, provendo assim absorção rápida e eficiente pela corrente sangüínea. Além disso, mediante o uso de tal técnica, intensificadores de penetração não são necessários, como às vezes é o caso das vias de administração transdérmica, nasal ou de mucosa oral. Qualquer um deuma variedade de inaladores pode ser empregado, inclusive os aerossóis à base de propelente, nebulizadores, inaladores de pó seco de dose única, e inaladores de pó seco de doses múltiplas. Dispositivos comuns utilizados atualmente incluem os inaladores dosimetrados, que são usados para liberar medicações para o tratamento da asma, doença pulmonar obstrutiva crônica e similares. Dispositivos preferidos incluem inaladores de pó seco, criados para formar uma nuvem ou aerossol de pó fino com um tamanho de partícula que é sempre inferior a cerca de 6,0 μm.

O tamanho da micropartícula, incluindo distribuição média de tamanho, pode ser controlada através do método de fabricação. Para micro-trituração, o tamanho do cabeçote do triturador, velocidade do rotor, tempo de processamento e similares controlam o tamanho da micropartícula. Para secagem por pulverização, o tamanho do bico, taxa de escoamento, calor do secador e similares controlam o tamanho da micropartícula. Para fabricação através de aerossol de congelamento rápido seguido de Iiofilização, o tamanho do bico, taxa de escoamento, concentração da solução aerosolizada, e similares, controlam o tamanho da micropartícula. Esses parâmetros e outros podem ser empregados para controlar o tamanho da partícula.

Os compostos da presente invenção podem ser terapeuticamente administrados por meio de injeção, tipicamente uma injeção intramuscular profunda, tal como na região glútea ou músculo deltóide, de uma formulação injetável de liberação gradual. Em uma concretização, um composto da presente invenção é formulado com um PEG, tal como poli(etileno glicol) 33 50, e opcionalmente um ou mais excipientes e preservativos adicionais, inclusive, porém não restritos a excipientes tais como sais, polisorbato 80, hidróxido de sódio ou ácido clorídrico para ajustar o pH e similares. Em outra concretização, um composto dapresente invenção é formulado com um poli(orto éster), que pode ser um poli(orto éster) auto-catalisado com qualquer um de uma porcentagem variável de ácido láctico na cadeia polimérica principal, e opcionalmente um ou mais excipientes adicionais. Em uma concretização, polímero de poli(D,L-lactídeo-co-glicolídeo) (polímero PLGA) é empregado,preferivelmente um polímero PLGA com um grupo hidrofílico terminal, tal como PLGA RG502H da Boehringer Ingelheim, Inc. (Ingelheim, Alemanha). Tais formulações podem ser preparadas, por exemplo, combinando-se um composto da presente invenção num solvente adequado, tal como metanol, com uma solução de PLGA em cloreto de metileno, e adicionando-se ao mesmo uma solução de álcool polivinílico em fase contínua, sob condições apropriadas de misturação num reator. Em geral, qualquer um de diversos polímeros injetáveis e biodegradáveis, que também são preferivelmente polímeros adesivos, pode ser empregado numa formulação injetável de liberação gradual. Os ensinamentos das patentes americanas 4.938.763, 6.432.438 e 6.673.767, e os polímeros biodegradáveis e métodos de formulação ali descritos, são aqui incorporados por referência. A formulação pode ser tal que uma injeção seja necessáriaem base periódica semanal, mensal ou outra, dependendoda concentração e quantidade de composto, da taxa de biodegradação do polímero e de outros fatores conhecidos no estado da técnica.

Vias de Administração. Se a administração for porinjeção, a injeção pode ser intravenosa, subcutânea,intramuscular, intraperitoneal ou outros meios conhecidos no estado da técnica. Os compostos da presente invenção podem ser formulados através de quaisquer meios conhecidos no estado da técnica, inclusive, porém não restritos à formulação na forma de comprimidos, cápsulas, comprimidos revestidos, suspensões, pós, preparações Iiofilizadas,supositórios, gotas oculares, adesivos transdérmicos, formulações orais solúveis, sprays, aerossóis, e similares, e podem ser misturados e formulados com tampões, ligantes, excipientes, estabilizantes, antioxidantes, e outros agentes conhecidos no estado da técnica. Em geral, qualquer via de administração por meio da qual os compostos da presente invenção são introduzidos por uma camada epidérmica de células pode ser empregada. Os meios de administração podem então incluir administração através de membranas mucosas, administração bucal, administração oral, administração dérmica, administração por inalação, administração pulmonar, .administração nasal, administração uretral, administração vaginal, e similares. Em um aspecto, o composto da presente invenção é administrado por meio de uma formulação injetável de liberação gradual, tal como um composto da presente invenção numa formulação com um PEG, poli(orto éster) ou polímero PLGA.Em outro aspecto, um composto da presente invenção é administrado através de um dispositivo de liberação automatizado provendo liberação subcutânea, de forma contínua ou intermitente. Qualquer um dos métodos e formulações anteriormente citados, são especialmente aplicáveis no tratamento de condições ou síndromes crônicas,inclusive insuficiência cardíaca congestiva crônica, e especialmente insuficiência cardíaca congestiva descompensada crônica.

Em um aspecto, qualquer composto da presente invençãopode ser administrado através de administraçãosubcutânea, inclusive todos os métodos descritos na patente americana 6.586.396. Em outro aspecto, um paciente, especialmente um paciente relativamente compensado ou um paciente com insuficiência cardíaca congestiva na condição ambulatorial, pode receber um composto da presente invenção através dos métodos e em doses conforme descrito na publicação de pedido depatente americana 2004/0077537 e publicação de pedido de patente internacional WO 2003/079979. Em outro aspecto, um paciente pode receber um composto da presente invenção através dos métodos descritos na publicação de pedido de patente americana 2 005/0113286. Em outro aspecto ainda, um paciente que tenha sofrido lesão no miocárdio pode ser tratado para remodelagem cardíaca através dos métodos descritos na publicação de pedido de patente americana 2 006/0019890.

Um composto da presente invenção pode também ser administrado através de administração transdérmica, inclusive por meio do sistema de administração, inclusive o aparelho e os métodos descritos na publicação de pedido de patente americana 2006/0034903.

De forma similar, as formulações em hidrogel e as formulações em estado sólido descritos em tal patente podem ser adaptadas para uso com os compostos da presente invenção.

Quantidade Terapeuticamente Eficaz. Em geral, aquantidade real de um composto da presente invenção administrada a um paciente variará entre faixas bastante amplas, dependendo do modo de administração, da formulação utilizada, e da resposta desejada. A dosagem para o tratamento é a administração através dequalquer um dos meios anteriormente citados ouquaisquer outros meios conhecidos no estado da técnica, de uma quantidade suficiente para produzir o efeito terapêutico desejado. Assim, uma quantidade terapeuticamente eficaz inclui uma quantidade de umcomposto ou de uma composição farmacêutica da presenteinvenção que seja suficiente para induzir um efeito desejado. Em um aspecto quando um peptídeonatriurético é empregado como o polipeptídeo parental na preparação de um composto que inclui um ou maissubstitutos de fórmula I uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade que resulte em natriurese, diurese e/ou vasodilatação desejadas. Emgeral, os compostos da presente invenção são altamente ativos. Por exemplo, o composto pode ser administrado a cerca de 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 ou 100 μg/ peso corporal, dependendo do composto específico selecionado, da resposta terapêutica desejada, da via de administração, da formulação e de outros fatores conhecidos no estado da técnica.

5. MÉTODOS SINTÉTICOS PARA SUBSTITUTOS DE FÓRMULA I

Os substitutos de fórmula I da invenção podem ser obtidos através da metodologia sintética padrão.Alguns métodos convenientes são ilustrados nos Esquemas abaixo. Os materiais de partida úteis para preparar os compostos da invenção e intermediários para os mesmos, estão disponíveis no comércio ou podem ser preparados 15 com materiais disponíveis no comércio utilizando métodos e reagentes sintéticos conhecidos. Os grupos protetores aqui utilizados denotam grupos que não são geralmente encontrados nos compostos terapêuticos finais, mas que são intencionalmente introduzidos em algum estágio da síntese para proteger grupos que poderiam ser de outra forma alterados no curso de manipulações químicas. Tais grupos protetores são removidos ou convertidos no grupo desejado num estágio posterior da síntese e os compostos que portam tais grupos protetores são importantes principalmentecomo intermediários químicos (embora alguns derivados também apresentem atividade biológica) .

Conseqüentemente, a estrutura precisa do grupo protetor não é crítica.

Numerosas reações para a formação e remoção de taisgrupos protetores são descritas em diversos trabalhos padrão inclusive, por exemplo, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, London and New York, 1973; Greene, Th. W. Protective Groups in Organic 35 Synthesis, Wiley, New York, 1981; The Peptides, Vol. I, Schroder and Lubke, Academic Press, London and New York, 1965; e Methoden der organischen Chemie, Houben-Weyl, 4th Edition, Vol.15/1, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, cujas descrições foram aqui incorporadas por referência.

Os exemplos seguintes de métodos de síntese de substitutos de aminoácido de fórmula I da invenção pretendem ser exemplificativos, ficando entendido que variações nos mesmos podem ser efetuadas por um habilitado na técnica, e que a intenção é que tais variações sejam incluídas na presente invenção.

Síntese de Estruturas de Cetopiperazina Simulando Aminoácidos sem Cadeia Lateral R Funcionalizada (Métodos AeB)

Os construtos foram preparados através de uma variedade de métodos conforme descritos nos Métodos AeB.

Método A : Os dipeptídeos (3) foram formados através do método de anidrido misto, utilizando Boc-serina (OBn)-OH (1) e um α-amino éster (2). Os dipeptídeos foram obtidos com altos rendimentos, e geralmente nenhuma purificação foi necessária. A redução tanto de metil éster como de grupo amida foi executada utilizando-se diborano-tetrahidrofurano, com as aminas secundárias protegidas para dar os intermediários de aminoálcool protegido com di-Boc (4). A oxidação dos álcoóis com dicromato de piridínio (PDC) com ciclização concomitante deu as piperazin-2-onas (5) em etapa única. A remoção de benzil éter através de hidrogenação, seguido de troca de grupo protetor deu piperazin-2-onas protegidas com Fmoc. Finalmente, o álcool primário foi oxidado ao ácido através de qualquer um dos diferentes métodos (PDC, oxidação de Jones, cloreto de rutênio-periodato de sódio, 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi, oxidação de radical livre (TEMPO) para dar os produtos finais (7).Método A

<formula>formula see original document page 74</formula>

Síntese de metil éster de ácido 2- (3-benziloxi-2-ter-butoxicarbonilamino-propionilamino) -2-substituído (3) : A uma solução de 10 mmol de Boc serina benzil éter (1)em 30 ml de tetrahidrof urano, mantida a -20°C sob nitrogênio, adicionou-se 22 mmol de trietilamina, seguido de lenta adição de 11,4 mmol de cloroformiato de isobutila. Houve precipitação de um sólido branco. A pasta foi agitada por 15 minutos e então 11,1 mmol de α-amino éster (2) foi adicionado em uma única porção. A pasta foi agitada a -20°C por 30 minutos e então deixada aquecer até temperatura ambiente, agitada por 2 horas, e então concentrada até secagem. A mistura foi então repartida em 50 ml de acetato de etila/30ml de solução de ácido clorídrico IN. As camadas foram separadas, e a camada orgânica lavada com 1x20 ml de ácido clorídrico IN e 1 χ 20 ml de solução saturada de bicarbonato de sódio, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada.Os compostos (3) foram geralmente obtidos em rendimentos acima de 90%, não sendo necessária purificação.<table>table see original document page 75</column></row><table>

Síntese de Di-Boc-2-substituído-(2-amino-3-benziloxi-propilamino)-etanol(4): A uma solução de 35 mmol de (3) em 50 ml de tetrahidrofurano seco, mantida à temperatura ambiente sob nitrogênio, adicionou-se 200 ml de solução IN de diborano em tetrahidrofurano. A solução foi agitada à temperatura ambiente da noite para o dia, e então lentamente despejada sobre uma solução gelada de 200 ml de solução IN de ácido clorídrico. A solução bifásica foi então neutralizada com hidróxido de sódio sólido. 140 ml de solução saturada de bicarbonato de sódio foram adicionados, seguido de 70 mmol de dicarbonato de di-ter-butila e a mistura agitada por 2 dias à temperatura ambiente, diluída com 200 ml de acetato de etila e as camadas separadas. A camada orgânica foi secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. Os produtos (4) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre síIica gel.<table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table>

Síntese de 4-Fmoc-6-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-ona (6): Uma suspensão de 19 mmol de (5) e 2 g de paládio a 10% sobre carbono em 2 00 ml de etanol foi hidrogenada à temperatura ambiente e sob pressão atmosférica da noite para o dia. A suspensão foi filtrada em placa de celite e concentrada. 0 resíduo foi redissolvido em 40 ml de ácido trifluoroacético a 50% em diclorometano. A solução foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, então concentrado. O resíduo foi redissolvido em 60 ml de tetrahidrof urano/40 ml de água e neutralizado com bicarbonato de sódio sólido, seguido de adição de 40 mmol de bicarbonato de sódio sólido e mmol de cloreto de Fmoc. A mistura foi então agitada à temperatura ambiente por 2 horas, diluída com 300 ml de acetato de etila, e as camadas separadas. A camada orgânica foi secada sobre sulfato de magnésio, concentrada e purificada através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

<table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table>

Síntese de ácido 4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazino-2-carboxílico (7) :

Os compostos (7) foram preparados através de diversos métodos:

(a) A uma solução bifásica de 10 mmol de (6) em 180 ml de acetonitrila, 180 ml de tetracloreto de carbono, e 240 ml de água, resfriados a 0°C, adicionou-se 112 mmol de periodato de sódio sólido, seguido de 340 mg de cloreto de rutênio. A reação foi deixada aquecer até temperatura ambiente, agitada por 12 horas e então filtrada em celite. As camadas foram separadas e a camada aquosa reextraída com 2 χ 75 ml de acetato de etila. As camadas orgânicas foram combinadas, secadas sobre sulfato de magnésio, e concentradas.

(b) Uma solução de 12 mmol de (6) e 59 mmol de PDC em 6 0 ml de dimetilformamida secada foi agitada a 4 8°C sob nitrogênio durante ~5 horas, resfriada até temperatura ambiente e despejada sobre 600 ml de água, e extraída com 3 χ 200 ml de diclorometano. As camadas orgânicas foram combinadas, secadas sobre sulfato de magnésio e concentradas.

(c) A uma solução de 17 mmol de (6) em 350 ml de acetona mantida à temperatura ambiente adicionou-se 25 ml de reagente de Jones (preparado com 8, Og de ácido crômico, 17,4 ml de água e 6,9 ml de ácido sulfúrico concentrado). A mistura foi agitada durante 1 hora, 150ml de isopropanol foi adicionado, e a mistura filtrada em placa de celite. A placa de celite foi lavada com acetato de etila. As camadas orgânicas foram combinadas e concentradas. 0 resíduo foi dissolvido em 250 ml de acetato de etila e lavado com 2 χ 50 ml de água, secado sobre sulfato de magnésio e concentrado, (d) A uma solução de 81 mmol de álcool (6) em 810 ml de acetonitrila mantida à temperatura ambiente, adicionou-se solução tampão de fosfato (preparada com 7,2g de fosfato de sódio monobásico, e 14,3 g de fosfato de sódio dibásico em 295 ml de água), seguido da adição de 3, 3g (20,7 mmol) de TEMPO, e 18,6g (164,4 mmol) de clorito de sódio, e a solução bifásica colocada em banho de óleo a 43°C e então uma solução de 43,3 ml (25,9 mmol) de solução de hipoclorito de sódio (preparada misturando-se 19,3 ml de solução de hipoclorito de sódio a 10-13% e 24 ml de água) foi adicionada lentamente. A reação foi agitada a 43°C por 4 horas. A solução foi resfriada até temperatura ambiente e uma solução de 200 ml de solução de hidrogeno sulfito de sódio a 10% foi adicionada, agitada por 10 minutos, diluída com 500 ml de acetato de etila, e as camadas separadas. A camada orgânica foi lavada com 1 χ IOOml de salmoura, 1 χ 160 ml de solução de ácido clorídrico IN, secada sobre sulfato de sódio e concentrada.

Os produtos (7) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

<table>table see original document page 79</column></row><table><formula>formula see original document page 80</formula>

Método B: Intermediários de Di-Boc-2-substituído-(2-amino-3-benziloxi-propil-amino)etanóis (4), preparados conforme descrito no método A, foram oxidados a ácido utilizando TEMPO/reagente de ácido isocianúrico, e então esterifiçados com iodometano para dar análogos dipeptídicos reduzidos totalmente protegidos (8). A desproteção dos grupos Boc e de benzil éter deu 5-hidroximetil-piperazin-2-onas 3-substituídas que foram protegidas como os derivados de Fmoc para dar (6), que foram oxidados ao produto final conforme descrito no método A.

Método B

<formula>formula see original document page 80</formula>

Síntese de metil éster de ácido acético Di-Boc-(2-amino-3-benziloxi-propilamino) -2-substituído (8): A uma suspensão de 7 6 mmol de (4) em 68 0 ml de acetona, e 210ml de uma solução saturada de bicarbonato de sódio, mantida a 0°C, adicionou-se 21 mmol de brometo de sódio sólido, e 2,9 mmol de TEMPO, seguido de lenta adição de 156 mmol de ácido tricloroisocianúrico. A reação foi agitada por 30 minutos a 0°C e então à temperatura ambiente da noite para o dia, acidificada com uma solução de ácido clorídrico IN, e extraída com 2 χ 300 ml de acetato de etila. A camada orgânica foi lavada com 3 χ 50 ml de ácido clorídrico IN, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. O resíduo foi redissolvido em 40ml de dimetilformamida seca e 95 mmol de bicarbonato de sódio sólido e 112 mmol de iodometano foi adicionado e a mistura agitada à temperatura ambiente sob nitrogênio até que HPLC mostrasse que a 15 reação estava concluída; a solução foi então diluída com 200 ml de etil éter, e lavada com 2 χ 100 ml de água, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. 0(s) produto (s) (8) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

Dados analíticos para compostos (8)

<table>table see original document page 81</column></row><table>

Síntese de 4-Fmoc-6-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-ona (6) : Uma solução de 36 mmol de (8) em 40 ml de ácido trifluoroacético a 50% em diclorometano foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, e então despejada em 200 ml de solução saturada de bicarbonatode sódio. As camadas foram separadas, e a camada orgânica concentrada. O resíduo foi redissolvido em 100 ml de acetato de etila, e lavado com 2 χ 50 ml de água, secado sobre sulfato de magnésio e concentrado. O resíduo foi dissolvido em 100 ml de etanol, e 5g de paládio a 10% sobre carbono e 35 ml de solução de ácido clorídrico IN foi adicionada, e a mistura hidrogenada à temperatura ambiente e pressão atmosférica até que HPLC mostrasse que a reação estava concluída; a solução foi 10 então filtrada em placa de celite e concentrada. O resíduo foi redissolvido em 80 ml de acetato de etila, 70 mmol de bicarbonato de sódio em 30 ml de água foram adicionados e a mistura agitada à temperatura ambiente da noite para o dia. O acetato de etila foi removido e 100 ml de tetrahidrofurano foram adicionados, seguido de 178 mmol de bicarbonato de sódio sólido e 43 mmol de cloreto de Fmoc, e a mistura foi agitada até que HPLC mostrasse que estava concluída, diluída com 300 ml de acetato de etila e as camadas separadas. A camada orgânica foi lavada com 2 χ 50 ml de água, secada sobre sulfato de magnésio, e concentrada. 0 produto(s) (6) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

Síntese de ácido 4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazino-2 5 2-carboxíIico (7) : Os compostos (7) foram preparados conforme descrito no método A.

Esquema Sintético Geral Comum para o Preparo de Estruturas de Cetopiperazina Aplicáveis a Compostos com ou sem cadeias laterais R funcionalizadas (Métodos C, 30 E, F)

Método C : Metil ésteres de ácido acético (2-Fmoc-amino-3-R'-O-propilamino)-2-substituído (10) foram preparados através de aminação redutiva de Fmoc serinal 0-protegido (9) com α-amino ésteres (2), utilizando cianoborohidreto de sódio outriacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor. 0 Fmoc serinal 0-protegido (9) necessário para aminaçãoredutiva foi preparado de acordo com o método D, através de redução de éster (12) com hidreto de diisobutilalumínio, através de oxidação de Fmoc serinol O-protegido (13) com periodinano Dess-Martin, ou através da redução de Fmoc serina amida Weinreb O-protegido (14) com hidreto de lítio alumínio. O método preferido para a preparação de Fmoc serinais O-protegidos (9) foi a redução do análogo de amida Weinreb. Metil ésteres de ácido acético (2-Fmoc-amino-3-R'-O-propilamino)-2-substituído (10) foram então N- e O-desprotegidos, ciclizados e protegidos com Fmoc para dar 6-hidroximetil-piperazin-2-onas 3-substituído (6) que foram então oxidados até o produto final conforme descrito no Método A. 0 grupo protetor (R') no grupo hidroxila de Fmoc-serinal-O-protegido (9) utilizado na síntese depende da natureza da cadeia lateral R do amino éster. Quando R não continha grupos funcionais, a cadeia lateral de Fmoc serina era protegida como o tBu éter. Quando R continha grupos funcionais, a cadeia lateral de Fmoc serina era protegida como o tritil éter.

Método C

<formula>formula see original document page 83</formula><formula>formula see original document page 84</formula>

Método D: Síntese de diversos Fmoc-serinais 0-protegidos (9) . Síntese de Fmoc-O-R'serina metil éster (12) : Uma solução leve de 80 mmol de Fmoc 0-R'serina (11), 10,0g (120 mmol) de bicarbonato de sódio sólido, e 10,0 ml (160 mmol) de iodometano em 80 ml de dimetilformamida seca, mantidos sob nitrogênio, foi agitada à temperatura ambiente da noite para o dia. A mistura de reação foi então despejada sobre 500 ml de água, e o sólido filtrado. O sólido foi redissolvido em 800 ml de acetato de etila, e lavado com 1 χ 200 ml de água, secado sobre sulfato de magnésio e concentrado. Não foi necessária purificação.

<table>table see original document page 84</column></row><table>Síntese de Fmoc-O-R' serinol (13) : A uma solução de 10,0 mmol de Fmoc 0-R'serina (11) em 50 ml de tetrahidrofurano seco, mantida a -20°C sob nitrogênio, adicionou-se 1,77 ml (12,7 mmol) de trietilamina, seguido de lenta adição de 1,57 ml(12,0 mmol) de cloroformiato de isobutila. A mistura foi agitada durante 30 minutos, e então despejada lentamente sobre uma solução gelada de 3,77g (99,6 mmol) de borohidreto de sódio em 10 ml de água, mantendo-se a temperatura abaixo de 5°C. A reação foi agitada a O0C por 15 minutos e então resfriada rapidamente com solução IN de ácido clorídrico. A mistura de reação foi diluída com 100 ml de acetato de etila, e as camadas separadas. A camada orgânica foi lavada com 2 χ 25 ml solução IN de ácido clorídrico, 2 χ 25 ml de água, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. Os compostos foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

<table>table see original document page 85</column></row><table>

Síntese de Fmoc-O-R' serina amida Weinreb (14): Umasuspensão de 20,2 mmol de Fmoe 0-R'serina (11), 6,98 g (21,6 mmol) de tetrafluoroborato de 2-(lH-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametilurônio (TBTU) e 2,5 ml (22,7 mmol) de N-metil-morfolina em 8 0 ml de diclorometano seco foi agitada à temperatura ambiente sob nitrogênio durante 20 minutos, e então 3,02g (31 mmol) de cloridrato de N,0-di-metil-hidroxilamina e 3,3ml (30mmol) de N-metilmorfolina foram adicionados, e a suspensão agitada à temperatura ambiente da noite para o dia. A solução formada foi então concentrada até secagem, repartida entre 200 ml de acetato de etila e 5 100 ml de água, lavado com 2 χ 40 ml de solução de ácido clorídrico IN, e então 2 χ 40 ml de solução saturada de bicarbonato de sódio, secada sobre sulfato de magnésio, e concentrada. Não foi necessária purificação.

<table>table see original document page 86</column></row><table>

Síntese de Fmoc-0-R'serinal (9) de éster (12) : A uma solução de 3.5 mmol de (12) em 5 mL de tetrahidrofurano, mantida a -780C sob nitrogênio, adicionou-se lentamente IOml de solução de hidreto de diisobutil alumínio IN (DIBAL), agitou-se por 15 minutos e resfriou-se rapidamente mediante lenta adição de uma solução saturada de tartarato de sódio e potássio. A reação foi deixada aquecer até temperatura ambiente, diluída com 50ml de acetato de etila, e 50 ml de solução saturada de sódio e tartarato de sódio e potássio foram adicionados. As camadas foram separadas, e a camada aquosa reextraída com 1 χ 50 ml de acetato de etila. As camadas orgânicas foram combinadas, secadas sobre sulfato de magnésio, e concentradas. Os compostos (9) foram usados sem purificação adicional na etapa seguinte.<table>table see original document page 87</column></row><table>

Síntese de Fmoc-O-R' serinal (9) de álcool (13) : A uma solução de 80 mmol de Fmoc-O-R' serinol (13) em 2 00 mL de diclorometano seco, mantido à temperatura ambiente sob nitrogênio, adicionou-se 88 mmol de periodinano Dess-Martin e a reação foi agitada por 2,5 horas e rapidamente resfriada mediante adição de 400 ml de solução aquosa a 10% de tiossulfato de sódio. As camadas foram separadas, e a camada orgânica concentrada, diluída com 300 ml de etil éter, e lavada três vezes com uma solução aquosa saturada de bicarbonato contendo tiossulfato de sódio a 10%, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. Síntese de Fmoc-0-R'serinal (9) de amida Weinreb (14): A uma solução de 8,8 g (20,2 mmol) de intermediário Fmoc-0-R'serina amida Weinreb (14) em 60 ml de tetrahidrofurano seco, resfriado até -78°C sob nitrogênio, adicionou-se 30 ml de solução IN de hidreto de lítio alumínio em tetrahidrofurano. A solução foi agitada por 15 minutos e então rapidamente resfriada mediante lenta adição de 3 0 ml de uma solução de hidrogeno sulfato de potássio 1,4N. Após aquecimento até temperatura ambiente, o sólido foi filtrado e o filtrado concentrado até secagem. 0 resíduo foi repartido em 50 ml de acetato de etila e 25 ml de solução de ácido clorídrico IN. As camadas foramseparadas, e a camada orgânica secada sobre sulfato de magnésio, filtradas e concentradas.

Síntese de metil éster de ácido acético (2-Fmoc-amino-3-R'-O-propilamino)-2-substituído (10): Compostos (10) foram preparados através de aminação redutiva utilizando cianoborohidreto de sódio outriacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor. Método utilizando cianoborohidreto de sódio: A uma solução de 8,5 mmol de (2) sal de cloridrato em 20 ml de metanol, mantido à temperatura ambiente sob nitrogênio, adicionou-se 2,3 mmol de hidróxido de potássio sólido, e a mistura agitada por 25 minutos. Uma solução de Fmoc-0-R'serinal (9)em 10 ml de metanol foi adicionada à suspensão acima, e a mistura de reação 1 agitada durante 1 hora. Uma solução de 8,5 ml de cianoborohidreto de sódio IN em tetrahidrofurano foi lentamente adicionada, e a reação agitada por mais 1 hora, filtrada e concentrada. O resíduo foi repartido em acetato de etila e água, e a camada orgânica lavadacom 1 χ 2Oml de bicarbonato de sódio saturado, secadasobre sulfato de sódio e concentrada.

Método utilizando triacetoxiborohidreto de sódio: Uma suspensão de 21 mmol de sal de cloridrato (2) e 2, 9ml (2lmmol) de trietilamina em 50 ml de tetrahidrofurano seco, foi agitada à temperatura ambiente por 45 min, e então uma solução de ~ 20mmol de Fmoc-(O-R')-serinal bruto (9) em 3 0 ml de tetrahidrofurano foi adicionada, seguido de 1, 7g de crivos moleculares em pó 4A, e a suspensão agitada por mais 2 horas. 6,4g (3 0 mmol) detriacetoxiborohidreto de sódio sólido foi adicionado ea suspensão agitada à temperatura ambiente da noite para o dia. A suspensão foi diluída com metanol, e os crivos moleculares filtrados, e o filtrado concentrado. 0 resíduo foi repartido em 100 ml de acetato de etila e 50 ml de água. A camada orgânica foi secada sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada. Os compostos (10) foram purificados através decromatografia de coluna sobre sílica gel.<table>table see original document page 90</column></row><table><table>table see original document page 91</column></row><table>

Síntese de 4-Fmoc-6-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-ona (6) : Para a preparação de compostos (6) três etapas foram necessárias: (a) desproteção com Fmoc com ciclização concomitante; (b) proteção com Fmoc e (c) desproteção de grupo hidroxila.

Remoção e ciclização de grupo Fmoc: Uma solução de 10 mmol de composto cíclico em 30 ml de dietilamina a 30% èm solução de acetato de etila foi agitada à temperatura ambiente da noite para o dia, e então concentrada até secagem.

(a) Proteção com Fmoc: A uma solução bifásica de 10 mmol de composto em 2Oml de tetrahidrofurano e 10 ml de água, adicionou-se 2,52g (3 0 mmol) de bicarbonato de sódio sólido, seguido de 3,3 6g (13 mmol) de Fmoc-Cl. A mistura foi agitada por 3 horas, diluída com acetato de etila, as camadas separadas, e a camada orgânica lavada com água, secada sobre sulfato de magnésio econcentrada.

(b) Desproteção de grupo hidroxila: para compostos contendo grupo protetor tBu éter: os compostos foram desprotegidos com uma solução de ácido trifluoroacético a 90% em diclorometano por 1-2 horas, e então concentrados até secagem. O resíduo foi dissolvido em acetato de etila e lavado com uma solução saturada de bicarbonato de sódio, secado sobre sulfato de magnésio e então concentrado. Para compostos contendo um grupo protetor Trt éter: os compostos foram desprotegidos adicionando-se uma solução de ácido trifluoroacético a1-10% em diclorometano contendo tri-isopropil silano a2-10%. A reação foi instantânea. A solução foi então neutralizada despejando-se numa solução saturada de bicarbonato de sódio. As camadas foram separadas, secadas sobre sulfato de sódio e concentradas.

Os compostos (6) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel._

<table>table see original document page 92</column></row><table><table>table see original document page 93</column></row><table><table>table see original document page 94</column></row><table>

Síntese de ácido 4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazino-2-carboxíIico (7) : Os compostos (7) foram preparados conforme descrito no Método A. Os compostos (7) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

<table>table see original document page 94</column></row><table><table>table see original document page 95</column></row><table><table>table see original document page 96</column></row><table>

Método E: Metil éster de ácido acético (2-Fmoc-amino-3-hidroxi-propil-Cbz-amino)-2-substituído (15) foi preparado através de aminação redutiva de Fmoc serinal (OR') (9) com um α-amino éster (2) , utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor. A amina secundária foi protegida com cloroformiato de benzila e então o grupo hidroxila desprotegido com solução de ácido trifluoroacético. Os compostos (15) foram então desprotegidos com Fmoc. Os intermediários de amino éster foram imediatamente ciclizados para formar 6-hidroximetil-piperazin-2-onas-4-Cbz-3-substituídas (16) .

6-hidroximetil-piperazin-2-onas Fmoc-3-substituídas (6) foram preparadas através de troca de grupo protetor e então oxidadads aos produtos desejados (7) conforme descrito no método A.

Método E

<formula>formula see original document page 96</formula>Síntese de metil éster de ácido acético (2-Fmoc-amino-3-hidroxi-propil-Cbz-amino)-2-substituído (15): Uma suspensão de 67 mmol de cloridrato de amino éster (2) e 20,9 mmol de hidróxido de potássio sólido em 80 ml de metanol foi agitada à temperatura ambiente por 25 minutos e então adicionada a uma suspensão de (9) em 250 ml de metanol. A mistura de reação foi agitada por 1,5 horas, seguida de lenta adição de 70 ml de solução IN de cianoborohidreto de sódio em tetrahidrofurano. A solução foi agitada da noite para o dia e então concentrada. 0 resíduo foi repartido em 300 ml de tetrahidrofurano e 50 ml de solução IN de ácido clorídrico. As camadas foram separadas e a camada orgânica neutralizada com uma solução de 239 mmol de bicarbonato de sódio em 50ml de água, e então 66 mmol de cloroformiato de benzila foi adicionado lentamente e a reação agitada por 3 horas, diluída com 200 ml de acetato de etila e as camadas separadas. A camada orgânica foi secada sobre sulfato de magnésio, e concentrada. 0 resíduo foi dissolvido numa solução de ácido trifluoroacético em diclorometano, e agitada à temperatura ambiente por 2 horas. A solução foi despejada sobre 2 0Oml de solução de bicarbonato de sódio saturado. As camadas foram separadas e a camada orgânica secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. Os compostos (15) foram purificadosatravés de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

<table>table see original document page 97</column></row><table>

Síntese de 4-Cbz-6-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-onas (16) : Uma solução de 24 mmol de (15) em 100 mL de dietilamina a 30% em acetato de etila foiagitada à temperatura ambiente da noite para o dia, e então concentrada até secagem. Os compostos foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

<table>table see original document page 98</column></row><table>

Síntese de 4-Fmoc-6-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-onas (6) : Uma suspensão de 15 mmol de (16) , e 1.8 g de paládio a 10% sobre carbono em 50 mL de etanol foi hidrogenada à temperatura ambiente e pressão atmosférica até que HPLC mostrasse que a reação estava completa. A mistura foi então filtrada em placa de celite, concentrada, e o resíduo dissolvido em 35 ml de tetrahidrofurano e 10 ml de água, e então 62 mmol de bicarbonato de sódio sólido foram adicionados, seguido de 16 mmol de Fmoc-Cl, e a mistura foi agitada por 3 horas, diluída com 100 ml de acetato de etila e 10 ml de água. As camadas foram separadas e a camada orgânica secada sobre sulfato de magnésio e concentradas. Os compostos (6) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

Dados analíticos para compostos (6)

<table>table see original document page 98</column></row><table>

Síntese de ácido 4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazino-2-carboxílico (7) : Os compostos (7) foram preparados conforme descrito no método A, e purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.<table>table see original document page 99</column></row><table>

Método F: Metil ésteres de ácido acético(2-Cbz-amino-3-benziloxi-propylamino)-2-substituídos (20) foram preparados através de aminação redutiva de Cbz serinal (OBn) (19) com α-amino éster(2), utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor. 0 Cbz 0-benzil serinal (19) necessário para a aminação redutiva foi obtido mediante oxidação de Cbz serinol (OBn) (18) com periodinano Dess-Martin. A hidrogenação de (20) seguida de ciclização deu 6-hidroximetil-piperazin-2-onas 3-substituídas que foram então protegidas com Fmoc em S-hidroximetil-piperazin-2-onas 4-Fmoc-3-substituídas(6). Os produtos finais (7) foram obtidos conforme descrito no método A.

Método F

<formula>formula see original document page 99</formula>Síntese de Cbz-serinol (OBn) (18): 0 composto (18) foi preparado conforme descrito para o composto (13). 0 composto (18) foi obtido com 79% rendimento após purificação através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

1H NMR δ (CDCl3) 3.57 -3.74 (dois m, 3H, CHN, e CH2O), 3.76-3.96 (dois m, 2H, CH2O), 4.50 (s, 2H, CH2O), 5.10 (s, 2H, CH2O), 5.40-5.50 (br. d, 1H, NH), 7.22-7.38 (m, 1OH, Ph); HPLC tR = 5.33 min, (M+ + Na+) = 337.64. Síntese de Cbz serinal (OBn) (19): 0 composto (19) foi preparado conforme descrito para composto (9). A uma solução de 0 mmol de Cbz-O-Bn serinol (18) em 200 ml de diclorometano seco, mantida à temperatura ambiente sob nitrogênio, adicionou-se 88 mmol de periodinano Dess-Martin e a reação agitada por 2,5 horas, e então rapidamente resfriada mediante adição de 400 ml de solução aquosa a 10% de tiossulfato de sódio. As camadas foram separadas e a camada orgânica concentrada, diluídas com 300 ml de etil éter, e lavadas três vezes com uma solução saturada de bicarbonato de sódio contendo tiossulfato de sódio a 10%, secadas sobre sulfato de magnésio e concentradas. 0 composto (19) foi obtido com rendimento bruto de 99% e utilizado sem purificação adicional. 1H NMR δ (CDCl3) 3.69-3.78 (dd, 1H, CH2O), 3.99-4.06 (dd, 1H, CH2O), 4.37-4.46 (m, 1H, CHN) , 4.47-4.52 (d, 2H, CH2O), 5.14 (s, 2H, CH2O), 5.65-5.75 (br. d, 1H, NH), 7.14-7.48 (uma série de m, 9H, Ph), 7.98-8.08 (dd, 1H, Ph), 9.63 (s, 1H, CHO).

Síntese de metil ésteres de ácido acético (2-Cbz-amino-3-benziloxi-propylamino)-2-substituídos (20): Oscompostos (20) foram preparados conforme descrito para o composto (10), porém utilizando Cbz serinal (19) como o aldeído. Os compostos (20) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.<table>table see original document page 101</column></row><table>

Síntese de 4-Fmoc-6-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-onas (6): Uma suspensão de 38 mmol de (20) em 160 ml de etanol, 38 ml de ácido clorídrico IN, e 20g de paládio a 10% sobre carbono, foi hidrogenada à temperatura ambiente e pressão atmosférica até que HPLC mostrasse que a reação estava completa. A mistura foi então filtrada em placa de celite e concentrada até secagem. O resíduo foi diluído com 75 ml de tetrahidrofurano e neutralizado com uma solução saturada de bicarbonato de sódio. 106 mmol de bicarbonato de sódio sólido e 53 mmol de cloreto de Fmoc foram adicionados e a reação agitada à temperatura ambiente até que HPLC mostrasse que a reação estava completa, diluídos com 300 ml de acetato de etila e 300 ml de salmoura. As camadas foram separadas e a camada orgânica lavada duas vezes com salmoura, secadas sobre sulfato de magnésio e concentradas. Os produtos(6) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

Síntese de ácido 4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazino-2-carboxíIico (7) :

Os compostos (7) foram preparados conforme descrito no método A

Síntese de Estruturas de cetopiperazina 2,2-di-substituídas Simulando Aminoãcidos sem Cadeias Laterais Funcionalizadas (Método G)

As sínteses de estruturas de ácido 4-Fmoc-5-subst ituído - 6 - oxo-piperazino-2 - metil - 2 - carboxí Iico simulando aminoácidos sem cadeias lateraisfuncionalizadas foram realizadas utilizando o método G. Ter-butil ésteres de ácido 2-Boc-amino-3-metoxicarbonil-l-substituído-metilamino-2-metil-propiônico (23) foram preparados através de aminação redutiva de metil éster de ácido 2-Boc-amino-2-metil-3-oxo-propiônico (22) com a-amino-éster (2), utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor. O composto (22) necessário para a aminação redutiva foi obtido através da oxidação de ter-butil éster de α-metil-Boc serina (21) com periodinano Dess-Martin. O grupo Boc de (23) foi removido com cloreto de hidrogênio 2N em dioxano, e os amino-ésteres ciclizados a ter-butil ésteres de ácido 5 - substituído-6-oxo-piperazino-2-metil-2-carboxílico desprotegidos (24), que foram protegidos com cloreto de Fmoc para dar ter-butil ésteres de ácido 4-Fmoc-5-subst ituído-6-oxo-piperazino-2 -metil-2 - carboxílico, que foram desprotegidos com ácido trifluoroacético para dar os produtos finais (25).

<formula>formula see original document page 102</formula>Síntese de ter-butil éster de ácido 2-Boc-amino-2-metil-3-oxo-propiônico (22) : A oxidação de ter-butil éster de Boc α-metil serina (21) foi realizada utilizando periodinano Dess-Martin conforme anteriormente descrito, dando o produto desejado (22) com 96% de rendimento bruto. 0 composto foi utilizado sem purificação adicional na etapa seguinte.

1HNMR δ (CDCl3): 1.44 (s, 18H, tBu), 1.46 (s, 3H, CH3), 5.63-5.70 (br. s, IH, NH), 9.5 (s, IH, CHO) Síntese de ter-butil éster de ácido 2-Boc-amino-3-metoxicarbonil-1-substituído-metilamino-2-metil-propiônico (23) : Os compostos (23) foram preparados utilizando um procedimento similar ao descrito para o composto (10), porém utilizando o composto (22) como aldeído. Os compostos (23) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

<table>table see original document page 103</column></row><table>

Síntese de ácido 2-metil-6-oxo-5-substituído-piperazino-2-carboxílico (25): uma solução de 4mmol de (23) em 8 ml de cloreto de hidrogênio 2N em dioxano foiagitada à temperatura ambiente por 5 horas, e então concentrada até secagem. 0 resíduo foi suspenso em 20 ml de t et rahidrof urano, neutralizado com 10 mmol de trietilamina, e agitado a 60°C por 2 dias. Foi então concentrado até secagem, resuspenso em 2 0 ml de tetrahidrofurano e 10 ml de água, bicarbonato de sódio sólido foi adicionado para ajustar o pH em básico, seguido de 5,6 mmol de cloreto Fmoc sólido e a mistura de reação agitada da noite para o dia à temperatura ambiente, o pH ajustado em 1 com solução de ácido clorídrico IN, diluído com 100 ml de acetato de etila, e as camadas separadas. A camada orgânica foi lavadacom 2 χ 100 ml de salmoura, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. O resíduo foi dissolvido em 10 ml de ácido trifluoroacético a 50% em diclorometano, e a solução agitada à temperatura ambiente por 3 horas. 0 5 solvente foi concentrado e os produtos (25) purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

<table>table see original document page 104</column></row><table>

Síntese de estruturas de cetopiperazina 2,2-di-substituídas simulando aminoácidos com cadeias laterais funcionalizadas (Método H)

As sínteses de estruturas de ácido 4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazino-2-metil-2-carboxílico simulando aminoácidos com cadeias laterais funcionalizadas são realizadas utilizando o método H. Metil éster de ácido 2-Aloc-amino-3-metoxicarbonil-1-15 substituído-metilamino-2-metil-propiônico (30) épreparado através de aminação redutiva de metil éster de ácido 2-Aloc-amino-2-metil-3-oxo-propiônico (28) com α-amino alil éster (29), utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor seguido de proteção da amina secundária com cloroformiato de benzila. 0 composto (28) necessário para a aminação redutiva é obtido através de oxidação de (27) com periodinano Dess-Martin. Os grupos alil éster e aloc dos análogos (30) são removidos utilizando tetracistrifenil fosfino paládio (O) e o aminoácido ciclizado através da reação com um reagente acoplador de peptídeo para dar metil ésteres de ácido 5-substituído-6- oxo-piperazino-2-metil-2- carboxílico (31) . Ácidos 4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazino-2-metil-2-30 carboxílicos (25) são obtidos através de saponificação do metil éster, seguido de troca de grupo protetor.<formula>formula see original document page 105</formula>

Síntese de metil éster de aloc-a-metil serina (27) : Uma solução de 8 mmol de Boc α-metil serina (26), 1,0 g (12 mmol) de bicarbonato de sódio sólido e 1,0 ml (16 mmol) de iodometano em 8 ml de dimetilformamida seca, mantida sob nitrogênio é agitada da noite para o dia. A mistura de reação é então despejada sobre 50 ml de água e extraída com 50 ml de dietil éter, e lavada com 1 χ 20 ml de água, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. 0 resíduo foi dissolvido em 20 ml de ácido trifluoroacético a 90% em diclorometano, e a solução agitada à temperatura ambiente por 3 horas, e então concentrada até secagem. 0 resíduo é dissolvido em 35 ml de tetrahidrof urano, e 10 ml de água, seguido de adição de 30 mmol de bicarbonato de sódio sólido, e lenta adição de 12mmol de cloroformiato de alila. A mistura é agitada à temperatura ambiente por 2 horas, . diluída com 50 ml de acetato de etila, e as camadas separadas. A camada orgânica é então lavada com 1 χ 10 ml de bicarbonato de sódio saturado e 1 χ 10 ml de ácido clorídrico IN e 1 χ 10 ml de água, secada sobresulfato de magnésio e concentrada. 0 composto (27) é purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

Síntese de metil éster de ácido 2-Aloc-amino-2-metil-3-oxo-propiônico (28): A oxidação de metil éster de aloc α-metil serina (27) é realizada utilizando periodinano Dess Martin conforme acima descrito para dar o produto desejado (28).

Síntese de alil éster de ácido 2-aloc-amino-3-metoxicarbonil-l-substituído-metil-Cbz-amino-2-metil-propiônico (30): Os compostos (30) são preparados utilizando um procedimento similar ao descrito para os compostos (15) porém utilizando o composto ( 8) como aldeído.

Síntese de metil éster de ácido 4-Cbz-2-metil-6-oxo-5-substituído-piperazino-2-carboxíIico (31): À solução de 10 mmol de composto (30) em 30 ml de diclorometano, mantida à temperatura ambiente sob nitrogênio, adicionou-se 2 equivalentes de fenilsilano e 0,3 equivalentes de tetracisfenilfosfino paládio (0) e a solução foi agitada por 2 horas, e então 11 mmol de TBTU e 14 mmol de N-metil-morfolina foram adicionados e a solução agitada à temperatura ambiente por 2 horas e então concentrada até secagem.

Síntese de ácido 4-Fmoc-2-metil-6-oxo-5-substituído-piperazino-2-carboxílico (25): A uma solução de 10 mmol de composto (31) em 25 ml de metanol, mantida à temperatura ambiente sob nitrogênio, adicionou-se lentamente 11 mmol de solução de hidróxido de sódio IN, e a reação é agitada à temperatura ambiente da noite para o dia, neutralizada com 21 ml de solução de ácido clorídrico IN, Ig de paládio a 10% sobre carbono é adicionado, e a suspensão hidrogenada à temperatura ambiente e pressão atmosférica por 3 horas. A suspensão é filtrada em placa de celite e concentrada. 0 resíduo é redissolvido em 25 ml de tetrahidrofurano e 10 ml de água, seguido de adição de 3Ommol de bicarbonato desódio sólido, e 10 mmol de cloreto de Fmoc, e a reação agitada à temperatura ambiente sob nitrogênio por 2 horas. A reação é então diluída com 50 ml de acetato de etila, e acidificada com solução de ácido clorídrico IN. As camadas são então separadas e a camada orgânica lavada com 1 χ 20 ml de água, secadas sobre sulfato de magnésio e concentradas. Os compostos (25) são purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

Síntese de estruturas de ácido(5-substituído-6-oxo-piperazin-2-il)acético (Métodos I, J, K). As sínteses de estruturas de ácido(5-substituído-6-oxo-piperazin-2-il)acético foram realizadas através de diversos métodos.

Método I : (3-protegido-amino-4-(metoxicarbonil-substituído-metilamino)-butiratos de ter-butila (35) foram preparados através de aminação redutiva de 3-protegido -amino-4-oxo-butirato de ter-butila (34) com α-amino ésteres (2) utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto de sódio como agente

redutor. 0 3-protegido-amino-4-oxo-butirato de ter-butila (34) necessário para a aminação redutiva foi preparado através de redução com hidreto de lítio alumínio (LAH) dos derivados de amida Weinreb (33) .

Análogos de (3-protegido-amino-4-(metoxicarbonil-substituído-metilamino)butirato de ter-butila (35) foram então desprotegidos, ciclizados e protegidos com Fmoc para dar (5-substituído-6-oxo-piperazin-2-il)acetatos de ter-butila (36), que foram então desprotegidos para dar os produtos finais (37).<formula>formula see original document page 108</formula>

Síntese de amida Weinreb Asp-(OtBu) amino-protegida (33) : Os compostos (33) foram preparados utilizando um procedimento similar ao descrito para o composto (14) :

<table>table see original document page 108</column></row><table>

Síntese de 3-amino protegido-amino-4-oxo-butirato de ter-butila (34): Os compostos (34) foram preparados utilizando um procedimento similar ao descrito para o composto (9).<table>table see original document page 109</column></row><table>

Síntese de 3-Protegido-amino-4-(metoxicarbonil-substituido-metilamino)-butirato de ter-butila (35):

Os compostos (35) foram preparados utilizando um procedimento similar ao descrito para os compostos(10), porém utilizando os compostos (34) como aldeído.Síntese de (4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazin-2-il) -acetato de ter-butila (36) : Para compostos contendo grupo protetor Fmoc amino, uma solução de 10 mmol de composto (35) em 30 ml de dietilamina a 30% em solução de acetato de etila foi agitada à temperatura ambiente da noite para o dia e então concentrada até secagem. Para compostos contendo grupo protetor Cbz amino, uma solução de 10 mmol de composto (35) em 3 0 ml de etanol foi hidrogenada à temperatura ambiente e pressão atmosférica por 2 horas, filtrada em celite e concentrada até secagem. Para proteção com Fmoc, o resíduo foi dissolvido em 2 0 ml de tetrahidrofurano, e 10 ml de água, e 2,52g (30 mmol) de bicarbonato de sódio sólido foi adicionado, seguido de adição de 3,3g (13 mmol) de cloreto de Fmoc. A mistura foi agitada por 3 horas e diluída com acetato de etila. As camadas foram separadas, e a camada orgânica lavada com água, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. Os compostos (36) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

<table>table see original document page 110</column></row><table><table>table see original document page 111</column></row><table>

Síntese de (4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazin-2-il)-acetato (3 7): Os compostos (3 6) foram desprotegidos com solução de ácido trifluoroacético a 90% em diclorometano por 3 horas, e então concentrados até secagem. Os produtos finais (37) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

<table>table see original document page 111</column></row><table><table>table see original document page 112</column></row><table>

Método J: 3-Fmoc-amino-4-(metoxicarbonil-substituído-metilamino)-butiratos de difenilmetila (41) foram preparados através de aminação redutiva de 3-Fmoc-araino-4-oxo-butirato de difenilmetila (40) com a-amino ésteres (2) utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor. 0 3 -Fmoc-amino-4 -oxo-butirato de difenilmetila (40) necessário para a aminação redutiva foi preparado através de redução com hidreto de lítio alumínio do derivado de amida Weinreb(39), que se formou do derivado de α-alil éster de ácido Fmoc-aspártico (38) disponível no mercado através da proteção do β-éster sob condições Mitsunobu. O alil éster foi removido utilizando catalisador de paládio (O), seguido da formação de amida Weinreb utilizando TBTU como agenteacoplador. 3-Fmoc-amino-4-(metoxicarbonil-substituído-metilamino)-butirato de difenilmetila (41) foi então desprotegido com Fmoc, ciclizado, difenilmetil éster removido através de hidrogenação, seguido de proteção com Fmoc para dar o produto final ácido (4-Fmoc-5-substitu£do-6-oxo-piperazin-2-il)-acético (37) . Método J

<formula>formula see original document page 113</formula>

Síntese de amida Weinreb Fmoc-Asp- (OCHPh2) (39) : A uma solução de 5, Ig (13,0mmol) de α-alil éster de ácido Fmoc-aspártico (38) em 30ml de tetrahidrofurano seco, contendo 3, 4g (13 mmol) de trifenilfosfino e 2,41g (13,1 mmol) de difenilmetanol, mantida a O0C sob nitrogênio, adicionou-se lentamente 2,6ml (13,4mmol) de azodicarboxilato de diisopropila. 0 banho de gelo foi 15 removido, e a reação agitada da noite para o dia à temperatura ambiente, concentrada até secagem, e então purificada através de cromatografia de coluna sob sílica gel.

1H NMR δ (CDCl3) 2.96-3.06 (dd, 1H, CH2CO), 3.15-3.26 20 (dd, 1H, CH2CO), 4.18-4.76 (uma série de m, 3H, CH,CH2), 5.14-5.32 (τη, 1Η, CHN) , 5.76-5.86 (m, IH, CHO), 7.20-7.80 (uma série de m, 18H, fulveno, e Ph); HPLC tR = 7.68 min, (M+ + Na+) = 583.90.

O produto (9.8 mmol) foi então dissolvido em 40 ml de uma solução de diclorometano:ácido acético:N-metil morfolina a 3 7:2:1 contendo l,5g (l,3mmol) de tetracis trifenilfosfino paládio (0), e a solução foi agitada à temperatura ambiente da noite para o dia, concentrada até secagem, e repartida em 100 ml de acetato de etila e 30ml de água. As camadas foram separadas e a camada orgânica lavada com 1 χ 50 ml de água, secada sobre sulfato de sódio e concentrada. O resíduo foi suspenso em 20ml de diclorometano seco, e l,65ml (15 mmol) de N-metil morfolina, e 4,07g (12,7 mmol) de TBTU foram adicionados, e a suspensão agitada à temperatura ambiente por 2 0 minutos, seguido de adição de 1,65 ml (15 mmol) de N-metil morfolina e 1,52 g (15,6 mmol) de sal de cloridrato de Ν,Ο-dimetil hidroxilamina. A suspensão foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, concentrada, repartida em 100 ml de acetato de etila e 50ml de água. A camada orgânica foi lavada com 1x30 ml de água, 1x30ml de solução saturada de bicarbonato de sódio e 1x30ml de solução IN de ácido clorídrico, secada sobre sulfato de sódio, e concentrada. O produto foi purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel. 1H NMR δ (CDCl3) 2.76-2.88 (dd, 1H, CH2CO), 2.89-3.00 (dd, 1H, CH2CO), 3.16 (s, 3H, CH3N), 3.70 (s, 3H, CH3O), 4.14-4.22 (dd, 1H, CH), 4.28-4.40 (t, 2H, CH2), 5.07- 5.16 (dd, 1H, CHN) , 5.69-5.76 (d, 1H, CHO) , 7.24-7.8 (uma série de m, 18H, fulveno, e Ph); HPLC tR = 7.08, (M+ + Na+) = 587 . 03 .

Síntese de 3-Fmoc-amino-4-oxo-butirato de difenilmetila (40) : O composto (40) é preparado utilizando um procedimento similar ao descrito para o composto (9) .

Síntese de 3-Fmoc-amino-4-(metoxicarbonil-substituído-metilamino)-butirato de difenilmetila (41) : Oscompostos (41) foram preparados utilizando um procedimento similar ao descrito para os compostos (10), porém utilizando o composto (40) como aldeído.

<table>table see original document page 115</column></row><table>

Síntese de ácido (4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazin 2-il)-acético (37) : Uma solução de 10 mmol de composto (41) em 30 mL de dietilamina a 30% em acetato de etila foi agitada à temperatura ambiente por 3 horas. A solução foi então concentrada até secagem, redissolvida em 2 χ 3Oml de acetato de etila, e reconcentrada. 0 resíduo foi dissolvido em 50ml de etanol, e 20ml de solução IN de ácido clorídrico e hidrogenado à temperatura ambiente e pressão atmosférica da noite para o dia, filtrado em placa de celite e concentrado até secagem. O resíduo foi dissolvido em 20ml de tetrahidrofurano, e 10 ml de água e 2,52g(30 mmol) de bicarbonato de sódio sólido foi adicionado, seguido da adição de 3, 3g (13 mmol) de cloreto de Fmoc. A mistura foi agitada por 3 horas, diluída com 100 ml de acetato de etila, as camadas separadas, e a camada orgânica lavada com 2 χ 5Oml de água, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. 0 produto foi purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.<table>table see original document page 116</column></row><table>

Método K: As sínteses de estruturas deácido (5-substituído-6-oxo-piperazin-2-il)-acéticoforam executadas a partir do α-ter-butil éster de ácido 5 Fmoc-aspártico (42). 0 α-ter-butil éster de ácido Fmoc-aspártico é reduzido a α ter-butil éster de Fmoc-homoserina com borohidreto de sódio através de anidrido misto, seguido de proteção do álcool com brometo de benzila para dar α-ter-butil éster de Fmoc-homoserina benzil éter (43). O ter-butil éster é então removido com ácido trifluoroacético, e o ácido reduzido ao álcool com borohidreto de sódio via anidrido misto para dar 2-Fmoc-amino-4-benziloxi-l-butanol (44) . O álcool (44) é então convertido em 2-Fmoc-amino-4 -benziloxibutanal (45) utilizando periodinano Dess-Martin conforme anteriormente descrito. A aminação redutiva de 2-Fmoc-amino-4-benziloxibutanal (45) e examino éster (2) dá metil éster de ácido acético(2-Fmoc-amino-4 -benziloxi -butilamino) -2 -substituído (46). A desproteção de Fmoc com dietilamina dá a amina primária livre que cicliza em 6-benziloxietil-3-substituído-piperazin-2-ona espontaneamente. 0 benzil éter é removido por hidrogenação, e a amina secundária protegida como seu derivado de Fmoc para dar 4-Fmoc-6-25 hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-onas (47).

Finalmente, o álcool primário é oxidado ao ácido para dar os produtos finais (48)conforme descrito no método A.Método K

<formula>formula see original document page 117</formula>

Síntese de α-ter butil éster de Fmoc-Homoserina (OBn) (43) : A uma solução de 10.0 mmol de Fmoc Asp-OtBu (42) em 50 mL de tetrahidrofurano seco, mantida a -2O0C sob nitrogênio, adicionou-se l,77ml(12,7 mmol)detrietilamina, seguido de len.ta adição de l,57ml (12,0 mmol) de cloroformiato de isobutila. A mistura é agitada por 30 minutos, e então lentamente despejada sobre solução gelada de 3,77g (99,6 mmol) de borohidreto de sódio em 10 ml de água, mantendo-se a temperatura abaixo de 5°C. A reação é agitada a O0C por 15 minutos, e então rapidamente resfriada com solução de ácido clorídrico IN. A mistura de reação é diluída com IOOml de acetato de etila, e as camadas separadas. A camada orgânica é lavada com 2 χ 25 ml de solução de ácido clorídrico IN, 2x 25 ml de água, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada e purificada atravésde cromatografia de coluna sobre sílica gel. 0 composto purificado é então dissolvido em 3 0 ml de tetrahidrofurano e 12 mmol de dispersão de hidreto de sódio a 60% em óleo mineral é adicionado, seguido de 0,2mmol de iodeto de tetrabutilamônio e 12 mmol de brometo de benzila e a mistura é agitada da noite para o dia, rapidamente resfriada com 50ml de bicarbonato de sódio aquoso saturado e extraída com IOOml de acetato de etila. O composto é então purificado através de 1 cromatografia de coluna sobre sílica gel.

Síntese de 2-Fmoc-amino-4-benziloxi-1-butanol (44): A desproteção do ter-butil éster utilizando ácido trifluoroacético a 90% é realizada conforme descrito para o composto (37) no método I, seguido de redução do ácido ao álcool com borohidreto de sódio via intermediário de anidrido misto conforme descrito para o composto (13).

Síntese de 2-Fmoc-amino-4-benziloxi-butanal (45): 2-Fmoc-amino-4-benziloxi-l-butanol (44) é oxidado ao aldeído utilizando periodinano Dess-Martin periodinano conforme descrito para a síntese de (9).

Síntese de metil éster de ácido acético (2-Fmoc-amino-4-benziloxi-butilamino)-2-substituído (46): a aminação redutiva de 2-Fmoc-amino-4-benziloxi-butanal (45) com α-amino éster (2) utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor é realizada conforme descrito para a síntese de (10).

Síntese de 4-Fmoc-6-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-onas (47) : a desproteção com Fmoc de metil éster de ácido acético (2-Fmoc-amino-4-benziloxi-butilamino)-2-substituído (46) com ciclizaçãoconcomitante, seguida de desbenzilação e reproteção com Fmoc é realizada conforme descrito para o composto (37) no método J.

Síntese de ácido 4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazin-2-il-acético (37) : A oxidação de 4-Fmoc-6-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-onas (47) a ácido é realizadaconforme descrito no Método A. A escolha do agente oxidante utilizado baseia-se na natureza do grupo na posição 5.

Síntese de estruturas de ácido 3-Oxo-[1,4]-diazepano-5-carboxilico 2-substituído (Métodos L, Μ, N)

A síntese de estruturas de ácido 3-Oxo-[1,4]-diazepano-5-carboxílico 2-substituído é realizada utilizando diversos métodos.

Método L: 2-Cbz-amino-4-(benziloxicarbonil-substituído-metil-Boc amino)-butiratos de ter-butila (52) são preparados através de aminação redutiva de Cbz-2-amino-4-oxo-butirato de ter-butila (50) com amino éster (51) , utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor, seguido de proteção da amina secundária com Boc. O Cbz-2-amino-4-oxo-butirato de ter-butila (50) necessário para a aminação redutiva é preparado através de redução com hidreto de lítio alumínio do derivado de amida de Weinreb (49) . O anel de diazepano é formado através de remoção de grupo protetor, seguido de ciclização com um reagente formador de peptídeo para dar (53). Finalmente, ácidos 3-oxo-[1,4]-diazepano-5-carboxílico 4-Fmoc-2-substituídos (54) são formados através de troca de grupo protetor.

Método L

<formula>formula see original document page 119</formula><formula>formula see original document page 120</formula>

Síntese de Cbz-Asp-(amida Weinreb)-OtBu (49): O composto (4 9) é preparado utilizando um procedimento similar ao descrito para o composto (14). Síntese de 3-Cbz-amino-4-oxo-butirato de ter-butila (50) : 0 composto (50) é preparado utilizando-se um procedimento similar ao descrito para o composto (9) Síntese de 2-Cbz-amino-4-(benziloxicarbonil-substituído-metilamino)-butirato de ter-butila (52): A aminação redutiva é realizada através de um procedimento similar ao descrito para o composto (10). A amina secundária é protegida através de reação da mistura bruta com 2 equivalentes de dicarbonato de Boc em tetrahidrofurano.

Síntese de I-Boc 2-substituído-3-oxo-[1,4]-diazepano-5-carboxilato de ter-butila (53) : Uma solução de 10 mmol de composto (52) em 3 0 ml de etanol é hidrogenada à temperatura ambiente e pressão atmosférica por 2 horas, filtrada em placa de celite e concentrada até secagem. O resíduo é dissolvido em 100 ml de diclorometano e 1,2 equivalentes de TBTU, e 2,6 equivalentes de N-metil-morfolina são adicionados. A solução é agitada à temperatura ambiente da noite para o dia, e então concentrada. 0 resíduo é repartido em 50 ml de acetato de etila e 25 ml de solução IN de ácido clorídrico, lavado com 1 χ 2 Oml de uma solução saturada de bicarbonato de sódio, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada.

Síntese de ácido I-Fmoc 2-substituído-3-oxo-[1,4]-diazepano-5-carboxílico (54): Uma solução de IOmmol de composto (53) em IOml de ácido trifluoroacético a 90% em diclorometano é agitada à temperatura ambiente por 2 horas, e então a solução é concentrada até secagem. 0resíduo é dissolvido em 2 Oml de tetrahidrofurano e IOml de água, e 2,52g (3 0 mmol) de bicarbonato de sódio sólido é adicionado, seguido da adição de 3,36g (13 mmol) de Cloreto de Fmoc. A mistura é agitada por 3 horas, e então diluída com acetato de etila. As camadas são separadas, e a camada orgânica lavada com 2 χ 50ml de água, secadas sobre sulfato de magnésio e concentradas.

Método M : Os análogos dipeptídicos reduzidos (60)são preparados através de aminação redutiva de Aloc-2-amino-4-oxo-butirato de dif enilmetila (59) com amino éster (29) , utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor, seguido de proteção da amina secundária com Cbz. O aloc-2-amino-4-oxo-butirato de difenilmetila (59) necessário para a aminação redutiva é preparado através de redução do derivado de amina Weinreb com hidreto de lítio alumínio (58) , que é preparado através de troca de grupo protetor do derivado de amida Weinreb (57). 0 anel de diazepano é então formado através de remoção de grupo ali Ia e aloc, seguido de fechamento de anel na presença de reagente formador de peptídeo. Estruturas de ácido 2 - substituído 3-oxo-[1,4]-diazepano-5-carboxílico (54) são formadas através de troca de grupo protetor.Método M

<formula>formula see original document page 122</formula>

Síntese de Fmoc-Asp-(amida Weinreb)-OCHPh2 (57) : O Composto (57) é preparado utilizando-se um procedimento similar ao descrito para o composto (39). Síntese de Aloc-Asp- (amida Weinreb) -OCHPh2 (58) : uma solução de 10mmol de composto (56) em 20ml de dietilamina a 30% em acetato de etila é agitada por 2 horas, e concentrada até secagem. O resíduo é dissolvido em 20ml de tetrahidrofurano e 10ml de água e 2,52g (30 mmol) de bicarbonato de sódio sólido é adicionado, seguido da adição de 13 mmol de cloreto de Aloc. A mistura é agitada por 3 horas e então diluída com acetato de etila. As camadas são separadas, e a camada orgânica lavada com água, secada sobre sulfatode magnésio e concentrada. 0 composto (58) é purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel. Síntese de 3-Aloc-amino-4-oxo-butirato de difenilmetila (59): 0 composto (59) é preparado utilizando um procedimento similar ao descrito para o composto (9).

Síntese de 2-Aloc-amino-4-(aliloxicarbonil-substituído-metilamino)-butirato de difenilmetila (60): 0 composto 60 é preparado através de aminação redutiva utilizando um procedimento similar ao descrito para compostos (15), porém utilizando o composto (59) como aldeído. 0 produto é purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

Síntese de I-Cbz 2-substituído-3-oxo-[1,4]-diazepano-5-carboxilato de dif enilmetila (61) : A uma solução de 1 Ommol de composto (60) em 30 ml de diclorometano, mantida à temperatura ambiente sob nitrogênio, adicionou-se 2 equivalentes de fenilsilano e 0,3 equivalentes de tetracisfenilfosfino paládio (0) e a solução agitada por 2 horas e então 1,2 equivalentes de TBTU e 1,3 equivalentes de N-metil morfolina são adicionados. A solução é agitada à temperatura ambiente da noite para o dia e concentrada. 0 resíduo é repartido em 50ml de acetato de etila e 25 ml de solução IN de ácido clorídrico, lavado com 1 χ 2Oml deuma solução saturada de bicarbonato de sódio, secadosobre sulfato de magnésio e concentrado.

Síntese de ácido I-Fmoc 2-substituído-3-oxo-[1, 4] -diazepano-5-carboxílico (54): Uma solução de 10 mmol de composto (61) em 3 Oml de etanol é hidrogenada àtemperatura ambiente por 2 horas, filtrada em placa decelite e então a solução é concentrada até secagem. 0 resíduo é dissolvido em 20ml de tetrahidrofurano e IOml de água, e 2,52g (30 mmol) de bicarbonato de sódio sólido é adicionado, seguido de adição de 3,36g (13 mmol) de cloreto de Fmoc. A mistura é agitada por 3 horas, e então diluída com acetato de etila. As camadas são separadas, e a camada orgânica lavada com água,secadas sobre sulfato de magnésio e concentradas. Método N : β ter-butil éster de ácido Fmoc-aspártico é reduzido a β ter-butil éster de Fmoc-aspartanol (63) com borohidreto de sódio via anidrido misto, seguido de proteção do álcool com brometo de alila para dar Fmoc-aspartanol com β ter-butil éster de Fmoc-aspartanol alil éter (64). O ter-butil éster é então removido com ácido trifluoroacético e o ácido reduzido ao álcool com borohidreto de sódio via anidrido misto para dar 3-10 Fmoc-amino-4-aliloxi-l-butanol (65) . O álcool (65) é então convertido em 3-Fmoc-amino-4-aliloxibutanal (66) utilizando periodinano Dess-Martin conforme previamente descrito. A aminação redutiva de 3-Fmoc-amino-4-aliloxibutanal (66) e α-amino éster (51) seguido de 15 proteção com aloc na amina secundária, dá os benzil ésteres de ácido acético (3-Fmoc-amino-4-aliloxi-butil-aloc-amino)-2-substituídos (67) . Aloc 7-aliloximetil-3-substituído-[1,4]-diazepan-2-onas (68) são formados através da saponificação do benzil éster, seguido de desproteção de Fmoc com dietilamina para dar a amina primária livre que é ciclizado utilizando um reagente formador de peptídeo tal como TBTU. Os produtos finais (54)são formados através de troca de grupo protetor: o alil éter e o aloc são removidos através de paládio 2 5 (0) , e a amina secundária é protegida como seu derivado de Fmoc para dar 4-Fmoc-7-benziloximetil-3-substituído-[1,4] -diazepan-2-onas, seguido de oxidação com álcool primário ao ácido para dar os produtos finais (54) . A escolha do agente oxidante utilizado é baseado na 30 natureza do grupo na posição 2. Método N

<formula>formula see original document page 124</formula><formula>formula see original document page 125</formula>

Síntese de β ter-butil éster de Fmoc-Aspartanol (63): O composto (63) ê preparado conforme descrito para a síntese do composto (13), utilizando β ter-butil éster de Fmoc-aspártico (62) como material de partida.

Síntese de ter-butil éster de ácido 3- Fmoc-amino-4-aliloxi-butírico (64): A uma solução de 10 mmol de (63) em 3Oml de tetrahidrofurano, mantida à temperatura ambiente sob nitrogênio, é adicionado 12mmol de dispersão de hidreto de sódio em óleo mineral, 2mmol de iodeto de tetrabutilamônio e 13 mmol de brometo de alila, e a mistura é agitada da noite para o dia, rapidamente resfriada com IOml de bicarbonato de sódio aquoso saturado, eextraída com 50ml de acetato de etila.

Síntese de 3-Fmoc-amino-4-aliloxi-1-butanol (65) : 0 composto (65) é preparado conforme descrito para a síntese do composto (44).

Síntese de 3-Fmoc-amino-4-aliloxi-butanal (66) : 3-Fmoc-amino-4-aliloxi-l-butanol (65) é oxidado a aldeído utilizando periodinano Dess-Martin conforme descrito para a síntese de (9).

Síntese de metil éster de ácido acético (3-Fmoc-amino-4-aliloxi-butil-aloc-amino)-2-substituído (67): aaminação redutiva de3-Fmoc-amino-4-benziloxi-butanal 966) com α-amino éster (51)utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto como agente redutor conforme descrito para o composto (10) , seguido de proteção da amina secundária como derivado de aloc, é realizada conforme descrito para o composto (15) , porém utilizando cloroformiato de alila em vez de cloroformiato de benzila.

Síntese de 4-Aloc-7-aliloximetil-3-substituído-[1,4]-10 diazepan-2-onas (68) : Uma solução de mmol of metil éster de ácido acético (3-Fmoc-amino-4-aliloxi-butil-aloc-amino)-2-substituído(67), 20 mmol de carbonato de potássio em 2 0 ml de metanol, e 10 ml de água é agitada à temperatura ambiente por 3 horas, neutralizada com 21 ml de uma solução IN de ácido clorídrico e então concentrada até secagem. 0 resíduo é dissolvido em 20ml de dietilamina a 30% em acetato de etila e agitado por 3 horas e então concentrado até secagem. 0 resíduo é dissolvido em 100 ml de diclorometano, e 12 mmol de TBTU e 24 mmol de N-metilmorfolina são adicionados e a solução agitada à temperatura ambiente da noite para o dia, e então concentrada até secagem. 0 resíduo é repartido em 30 ml de acetato de etila e 30ml de solução IN de ácido clorídrico e então as camadas são separadas. A camada orgânica é lavada com 3 0 ml de umasolução saturada de bicarbonato de sódio, secada sobre sulfato de magnésio e purificada através de cromatografia de coluna sobre sílica gel. Síntese de ácido 4-Fmoc-2-substituído-3-oxo-[1,4] -diazepano-5-carboxílico (54) : À solução de 10 mmol de composto (68) em 30 ml de diclorometano, mantida à temperatura ambiente sob nitrogênio, adicionou-se 2 equivalentes de tetracistrifenilfosfino paládio (0) e a solução foi então agitada por 2 horas, e concentrada até secagem. A amina secundária é dissolvida em 2 0 mlde tetrahidrofurano e 10 ml de água, seguida de adição de 2,52g (30 mmol) de bicarbonato de sódio sólido e 1,2equivalentes de cloreto de Fmoc e a solução bifásica é agitada à temperatura ambiente por 2 horas, diluída com 30 ml de acetato de etila,e as camadas separadas. A oxidação de 4-Fmoc-7-hidroximetil-3-substituído-[1,4]-diazepan-2-onas ao produto final (54) é realizada conforme descrito no método A. A escolha do agente oxidante utilizado baseia-se na natureza do grupo na posição 2, como no Método A para a conversão de (6) em (7).

Síntese de estruturas de ácido 6-substituído-5-oxo-piperazino-2-carboxílico (Método O)

As sínteses de estruturas de ácido 6-substituído-5-oxo-piperazino-2-carboxílico contendo cadeias laterais não funcionalizadas na posição 6 são realizadas conforme descrito no Método O, iniciando-se com a resina de 1-cloro-tritil 3-Fmoc-amino-1,2-propan-diol disponível no mercado (69) que é oxidada a cetona (70) utilizando periodinano Dess-Martin. A aminação redutiva a cetona (70) com α-amino éster (2) dá o metil éster de ácido acético (l-aminometil-2-cloro-tritiloxi-etilamino)-2-substituído ligado a resina (71), que é ciclizado a 5-clorotritiloximetil-3-substituído-piperazin-2-ona (72) após desproteção da amina. A reproteção da amina secundária, seguida de clivagem da resina, dá Fmoc-5-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-ona (73) que é oxidado a ácido 6-substituído-5-oxo-piperazino-2-carboxílico (74) utilizando qualquer um dos procedimentos descritos no Método A. Método 0<formula>formula see original document page 128</formula>

Síntese de l-amino-3-clortritiloxi-propan-2-ona (70) : a oxidação de álcool ligado a resina (69) é realizada através de oxidação com trióxido de enxofre, oxidação com NMO/TPAP (N-óxido de N-metilmorfolina/perrutenato de tetrapropil amônio ou oxidação com PDC. Para a oxidação com trióxido de enxofre, um procedimento similar ao descrito em Parikh, J.R. e Doering, W.V., J. Am. Chem. Soe. 89:5505-5507 (1967) é utilizado.Para a oxidação com NMP/TPAP, a 0,3mmol de álcool ligado a resina adiciona-se uma solução de 3mmol de N-óxido de N-metilmorfolina em 10 ml de dimet ilf ormamida seca e então 0,06 mmol de perrutenato de tetrapropilamônio (TPAP) é adicionado à suspensão de resina. A reação é sacudida por 80 minutos. 0 solvente é drenado, a resina 15 lavada com tetrahidrofurano e diclorometano e então secada sob vácuo. Para a oxidação com PDC, uma suspensão de álcool ligado a resina em 0,2M de dicromato de piridínio em dimetilformamida é sacudida a 3 7°C por 4 horas, o solvente é drenado e a resina lavada com dimetilformamida, tetrahidrofurano e diclorometano.

Síntese de metil éster de ácido acético(l-aminometil-2-cloro-tritiloxi-etilamino)-2 - substituído (71): Aaminação redutiva de cetona ligada a resina (70) com amino éster é realizada através de qualquer de dois métodos diferentes. Em um método, a uma solução de 2,6 mmol de α-amino éster (2) em 20ml de ácido acético 1% em dimet ilf ormamida adiciona-se 2,6 mmol de triacetoxiborohidreto de sódio, seguido de adição imediata de 0,5 mmol de resina derivatizada com cetona (70) e a mistura é sacudida por 60 minutos, lavada commetanol, diisopropil etil amina a 10%,dimetilformamida, e metanol. Num segundo método, uma suspensão de 0,05 mmol de resina derivatizada com cetona (70) e 2, OM de cloridrato de α-amino éster (2) 5 em metanol, contendo 0,05M cianoborohidreto de sódio é sacudida à temperatura ambiente por 5horas, drenada e lavada.

Síntese de 5-clorotritiloximetil-3-substituído-piperazin-2-ona (72): Uma suspensão de 0.05 mmol de resina em 10 ml de piperidina a 20% em dimetilformamida é sacudida à temperatura ambiente por 2 horas. Síntese de Fmoc-5-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-ona (73) : Uma suspensão de 0.05 mmol de (72) em 10 mL de diclorometano, contendo 0,25 mmol de cloreto de Fmoc e 0,25 mmol de trietilamina é agitada à temperatura ambiente por 6 horas, drenada e lavada com diclorometano. A resina é resuspensa em 10 ml de ácido trifluoroacético a 95% em diclorometano e a suspensão sacudida por 2 horas, e filtrada, e o filtrado concentrado.

Síntese de ácido Fmoc-6-substituído-5-oxo-piperazino-2-carboxílico (74) : A oxidação de (73) ao produto desejado é realizada através de qualquer um dos procedimentos descritos para o método A Síntese de Aminoácidos a,α-Di-substituídos (Métodos P e Q).

Em certos construtos da invenção, é possível e previsto empregar um resíduo aminoácido di-substituído, tal como aminoácido ot, α-disubstituído, onde os substituintes são iguais ou diferentes. Em um aspecto, um aminoácido a, α-di-substituído é empregado em qualquer posição Aaa1 ou Aaa8, onde pelo menos uma das cadeias laterais dos aminoácidos α, cv-di-substituídos é uma cadeia lateral de Nle, Ala, Leu, lie, Vai, Nva, Met(O) ou Met(O2). Os métodos sintéticos PeQ seguintes descrevem a preparação de (2-Amino-2-butil-ácido hexanóico) α,α-di-n-butilglicina, onde cada uma das cadeias laterais são- (CH2) 3 ~CH3, e assim, cada uma delas é igual à cadeia lateral de Nle. Porém, deve ficar entendido que métodos e esquemas similares podem ser empregados na preparação de outros aminoácidos a,α-di-substituídos, onde os substituintes são iguais ou diferentes. Adicionalmente, qualquer método para preparar um aminoácido oí,Q!-di-substituído pode ser empregado na prática da presente invenção e a prática da presente invenção não se restringe aos métodos dos esquemas sintéticos a seguir descritos. Assim, qualquer método conhecido no estado da técnica, para a síntese de aminoácidos a,o!-di-substituídos pode ser empregado na prática da presente invenção. A seguir são descritos métodos alternativos para a preparação de aminoácidos a, o;-di- substituí dos: Clark J.S. e Middleton M.D.: Síntese de aminoácidos alfa-substituídos e alfa,alfa-di-substituídos através do rearranjo de iletos de amônio gerados de carbenóides metálicos. Org. Lett. 4 (5): 765-8 (2002); Guino M., Hii K.K.: Resina Wang-aldeído como suporte reciclável para a síntese de derivados de aminoácidos alfa,alfa-disubstituídos. Org Biomol. Chem. 3 (17) : 3188-93 (2005); e Kotha S., Behera M.: Síntese e modificação de derivados de dibenzilglicina via reação de acoplamento cruzado Suzuki-Miyaura. J. Pept. Res. 64(2):72-85 (2004) .<formula>formula see original document page 131</formula>

Síntese de benzoil di-n-butilglicina (80): A uma solução de 10 mmol de benzoil glicina (75) em 20ml de diclorometano, mantida a 0°C sob nitrogênio, adicionou-se lentamente 12 mmol de Ν,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) , e a reação foi agitada por 2 horas para dar o composto (76). O sólido é filtrado, e o filtrado concentrado. O resíduo é dissolvido em 15 ml de tetrahidrofurano, resfriado até 0°C, e então 24 mmol de hidreto de sódio é adicionado, seguido de 3Ommol de brometo de n-butila. A suspensão é agitada a 0°C por 2 horas e então deixada aquecer até temperatura ambiente, e a solução concentrada até secagem para dar o composto (77) . Alternativamente, o composto (77) pode também ser preparado a partir de benzoil norleucina (78) de forma similar exceto que 12 mmol de hidreto de sódio e 15 mmol de brometo de n-butila são utilizados. O composto (77) é dissolvido em metanol, 50 ml de solução de ácido clorídrico IN são adicionados, e a solução agitada por 2 horas e concentrada. 0 composto (80) é purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.Síntese de Fmoc di-n-butilglicina (81) : 10 mmol do composto (80) são dissolvidos em 30ml de dioxano e 10 ml de solução de ácido clorídrico 6N são adicionados e a solução refluxada da noite para o dia. A reação é resfriada até temperatura ambiente, concentrada até secagem, redissolvida em 30 ml de tetrahidrofurano e 10 ml de água e 30 mmol de bicarbonato de sódio são adicionados, seguido de 15 mmol de cloreto de Fmoc. A solução bifásica é agitada por 1 hora, e o tetrahidrofurano removido sob vácuo. A solução aguosa é extraída com 1 χ 50 ml de dietil éter, acidificada com solução IN de ácido clorídrico e extraída com 2 χ 50ml de acetato de etila. As camadas de acetato de etila são combinadas, secadas sobre sulfato de sódio e concentradas. 0 composto (8) é purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel. Métodos similares podem ser empregados iniciando-se com qualquer derivado de aminoácido apropriado (similar ao composto 78), e utilizando um reagente de alquil butila, aril butila ou aralquil butila o esquema produzirá uma variedade de substitutos de aminoácido (R,R')di-substituídos onde ReR' são diferentes.

Método Q

<formula>formula see original document page 132</formula>suspensão de 2Ommol de cloridrato de metil éster de glicina (82) e 2g de crivos moleculares em pó em 40 ml de tetrahidrofurano seco, mantida à temperatura ambiente, adicionou-se 24 mmol de hidróxido de potássio, seguido de 22mmol de benzaldeído. A suspensão é agitada por 2 horas, filtrada, e o filtrado concentrado. O resíduo é redissolvido em 4 Oml de tolueno seco, e então adicionado a uma suspensão de 60 mmol de hidreto de sódio em tolueno, seguido da adição de 60mmol de brometo de n-butila. A suspensão é agitada por 12 horas, seguida de adição de 30 ml de uma solução de ácido clorídrico 6N, agitada à temperatura ambiente por 2 horas, e então as camadas separadas. O sal de cloridrato de (84) assim obtido é utilizado in situ 15 para a preparação de (87). Para isolar (84) para o sal de cloridrato, a camada aquosa é concentrada até secagem e o produto cristalizado de metanol-éter seco. Alternativamente, o composto (84) pode ser preparado a partir de cloridrato de metil éster de norleucina utilizando um procedimento sintético similar exceto que 30 mmol de hidreto de sódio e 3 0 mmol de brometo de n-butila são utilizados para a conversão de (86) em (84) . A mistura aquosa da forma de cloridrato do composto (9) conforme obtida acima é aquecida até refluxo por 1 hora e então resfriada até temperatura ambiente. É neutralizada com hidróxido de sódio sólido e então diluída com 3Oml de tetrahidrofurano. Bicarbonato de sódio (3 0 mmol) é adicionado seguido de 15 mmol de cloreto de Fmoc. A solução bifásica é agitada por 1 hora e o tetrahidrofurano removido sob vácuo. A solução aquosa é extraída com 1x50 ml de dietil éter, acidificada com solução de ácido clorídrico IN e extraída com 2 χ 50ml de acetato de etila. As camadas de acetato de etila são combinadas, secadas sobre sulfato de sódio e concentradas. 0 composto (87) é purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.Métodos similares podem ser empregados, iniciando-se com qualquer derivado de aminoácido apropriado (similar ao composto 85) e utilizando um reagente de alquil butila, aril butila ou aralquil butila o esquema produzirá uma variedade de substitutos de aminoácido (R, R') di-substituídos onde ReR' são diferentes. Síntese de Estruturas (RiR') Di-Substituidas (Método R) A presente invenção prove ainda construtos nos quais os substitutos de aminoácido são empregados com dois grupos R, ReR'. 0 método a seguir descreve a síntese de ácido ácido (R)-5,5-dibutil-6-oxo-piperazino-2-carboxílico protegido com Fmoc, onde ReR' são, cada qual, grupos que correspondem a uma porção de cadeia lateral de norleucina. Observa-se que o método abaixo pode ser modificado, em parte com base nos métodos anteriormente citados, para produzir substitutos de aminoácido (R,R')di-substituídos. Métodos similares podem ser empregados de forma tal que, iniciando-se com qualquer derivado de aminoácido apropriado (um composto similar ao composto (84)) o esquema possa produzir uma variedade de substitutos de aminoácido (R7R')di-substituídos onde ReR' são diferentes.

Método R

<formula>formula see original document page 134</formula>Síntese de metil éster de ácido(2-Fmoc-amino-3-ter-butoxi-propilamino)-2,2,di-n-butil acético (88): Uma suspensão de 21 mmol de (84, esquema Q) , e 2.9 mL (21mmol) of trietilamina em 50 mL de tetrahidrofurano seco é agitada à temperatura ambiente por 45 minutos, e então uma solução de ~20mmol de Fmoc-(0-t-butil)-serinal bruto (9, esquema D) em 30 mL de tetrahidrofurano é adicionada, seguida de 1, 7g de crivos moleculares em pó de 4Á e a suspensão é agitada por mais 2 horas. 6,4g (30 mmol) de triacetoborohidreto de sódio sólido é adicionado, e a suspensão agitada à temperatura ambiente da noite para o dia. A suspensão é diluída com metanol, os crivos moleculares filtrados, e o filtrado concentrado. O resíduo é repartido em 100 ml de acetato de etila e 50ml de água. A camada orgânica é secada sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada.O composto (88) é purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel. Síntese de 4-Fmoc-6-hidroximetil-3,3-di-n-butil-piperazin-2-ona (89) : Uma solução de 10 mmol do composto (88) em 30 mL of dietilamina a 30% em acetato de etila é agitada à temperatura ambiente da noite para o dia, e então concentrada até secagem. O resíduo é dissolvido em 20 ml de tetrahidrofurano e 10 ml de água, 2,52g (30 mmol) de bicarbonato de sódio sólido é adicionado, seguido de 3,36g (13 mmol) de cloreto de Fmoc. A mistura é agitada por 3 horas, diluída com 50ml de acetato de etila, as camadas separadas, e a camada orgânica lavada com 3Oml de água, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. A mistura bruta é dissolvidanuma solução de 10ml de ácido trifluoroacético a 90% em diclorometano, agitada por 2 horas, e então concentrada até secagem. O resíduo é dissolvido em acetato de etila e lavado com 50ml de uma solução saturada de bicarbonato de sódio, secado sobre sulfato de magnésio e concentrado. O composto (89) é purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel. Síntese de ácido 4-Fmoc-5,5-di-n-butil-6-oxo-piperazino-2-carboxílico (90): A uma solução de 8 mmol de álcool (89) em 81ml de acetonitrila mantida à temperatura ambiente, adicionou-se solução de tampão fosfato (preparada com 0,72g de fosfato de sódio monobásico e l,43g de fosfato de sódio dibásico em 29,5 ml de água), seguido de adição de 0,33g (2,lmmol) de TEMPO, e l,86g (16,5 mmol) de clorito de sódio, e a solução bifásica é colocada num banho de óleo mantido a 43°C. Uma solução de 4, 3ml (2,6mmol) de solução de hipoclorito de sódio (preparada misturando-se 1,9ml de solução de hipoclorito de sódio a 10-13%, e 2,4ml de água) é adicionada lentamente. A reação é agitada a 4 3°C por 4 horas, resfriada à temperatura ambiente, 2Oml de hidrogeno sulfito de sódio a 10% adicionados, agitada por 10 minutos, diluída com 50ml de acetato de etila e as camadas separadas. A camada orgânica é lavada com 1 χ 10ml de salmoura, 1 χ 10 ml de solução IN de ácido clorídrico, secada sobre sulfato de sódio e concentrada. O composto (90) é purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

6. MÉTODOS SINTÉTICOS PARA COMPOSTOS QUE INCLUEM SUBSTITUTOS DA FÓRMULA I

Os compostos que incluem um ou mais substitutos da fórmula I, conforme descritos nas diversas concretizações da presente invenção, podem ser prontamente sintetizados através de qualquer procedimento convencional conhecido para a formação de uma ligação peptídica entre aminoácidos. Tais procedimentos convencionais incluem, por exemplo,qualquer procedimento de fase em solução permitindo uma condensação entre o grupo alfa amino livre de um resíduo aminoácido tendo seu grupo carboxila ou outros grupos reativos protegidos e o grupo carboxila primário livre de outro resíduo aminoácido tendo seu grupo amino ou outros grupos reativos protegidos. Num procedimento convencional preferido, os compostos da presente invenção podem ser sintetizados através de síntese em fase sólida e purificados de acordo com os métodos conhecidos no estado da técnica. Os substitutos de aminoácido da presente invenção podem ser incorporados aos compostos da presente invenção através de métodos substancialmente similares ou idênticos aos empregados com os resíduos. Qualquer um de diversos procedimentos conhecidos utilizando uma variedade de resinas e reagentes podem ser utilizados para preparar os compostos da presente invenção.

0 processo de sintetização dos compostos pode ser conduzido através de um procedimento, através do qual cada aminoácido ou substituto de aminoácido, na seqüência desejada, é adicionado, um de cada vez, sucessivamente a outro resíduo aminoácido ou substituto de aminoácido ou através de um procedimento por meio do qual os fragmentos de peptídeo com a seqüência de aminoácido desejada, que podem incluir um ou mais substitutos de aminoácido, são primeiramente sintetizados de forma convencional e então condensados para prover o composto desejado. 0 composto resultante é ciclizado para dar um composto cíclico da invenção.

Os métodos de síntese de peptídeo em fase sólida são bastante conhecidos e praticados no estado da técnica. Em tais métodos, a síntese dos compostos da invenção pode ser conduzida incorporando-se seqüencialmente os resíduos aminoácido ou os substitutos de aminoácido desejados, um de cada vez, à cadeia peptídica crescente, de acordo com os princípios gerais dos métodos de fase sólida. Esses métodos são descritos emnumerosas referências, inclusive Merrifield R.B., Síntese em Fase Sólida (Nobel lecture). Angew. Chem. 24:799-810 (1985) e Barani et al., Os Peptídeos, Análise, Síntese e Biologia, Vol. 2, Gross E. e Meienhofer J., Eds. Academic Press, 1-284 (1980).

Nas sínteses químicas dos compostos, grupos de cadeia lateral reativos dos diversos resíduos aminoácido ou substitutos de aminoácido são protegidos com grupos protetores apropriados, que impedem a ocorrência de reação química naquele local até que o grupo protetor seja removido. É também comum a proteção do grupo alfa amino de um resíduo aminoácido ou substituto de aminoácido, enquanto aquela entidade reage no grupo carboxila, seguido de remoção seletiva do grupo protetor alfa amino para permitir a ocorrência de uma reação posterior naquele local. Grupos protetores específicos foram descritos e são conhecidos nos métodos de síntese em fase sólida e em métodos de síntese de fase em solução.

Grupos alfa amino podem ser protegidos através de umgrupo protetor adequado, inclusive um grupo protetor do tipo uretano, tal como benziloxicarbonila (Z) e benziloxicarbonila substituído, tal como p-clorobenziloxicarbonila, p-nitrobenziloxicarbonila, p- bromobenziloxicarbonila, p-bifenil-isopropoxicarbonila, 9-fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc) e p-metoxibenziloxicarbonila (Moz) ; grupos protetores alifáticos tipo uretano, tais como t-butiloxicarbonila (Boc), diisopropilmetoxicarbonila, isopropoxicarbonila,e aliloxicarbonila. Fmoc é preferido para a proteção dealfa amino.

Grupos guanidino podem ser protegidos através de um grupo protetor adequado, tal como nitro, p-toluenossulf onila (Tos), Z, pentametilcromanossulf onila (Pmc), adamantiloxicarbonila,pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonila (Pbf), Fmoc e Boc. Pbf é um grupo protetor preferido para Arg. Outrosgrupos protetores preferidos incluem Z, Fmoc, e Boc. Deve ficar entendido que particularmente os grupos protetores guanidino podem ser clivados e removidos durante o processo sintético ou podem alternativamente não ser clivados ou removidos, quando então a cadeia lateral com o grupo protetor forma um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido, conforme aqui definido. Particularmente, quando o grupo protetor for lábil e puder ser removido através de algum mecanismo in vivo mediante administração a um paciente, o construto se torna um "profármaco", ou seja, um composto que é um precursor de fármaco e que, mediante administração a um paciente, se converte na forma de fármaco desejado in vivo através de alguns processos químicos ou fisiológicos (ex: um profármaco que, ao ser trazido para pH fisiológico ou através de ação enzimática é convertido na forma de fármaco desejada). Os compostos da invenção aqui descritos podem ser preparados utilizando síntese em fase sólida, seja manualmente ou através de um sintetizador de peptídeo automatizado, utilizando módulos de programação conforme fornecidos pelo fabricante e seguindo os protocolos estabelecidos por ele, ou através de modificações dos protocolos do fabricante para melhorar o rendimento de acoplamentos difíceis.

A síntese em fase sólida é iniciada a partir da extremidade C-terminal do composto acoplando-se um a-aminoácido protegido, substituto de α-aminoácido ou mimético de α-amino álcool a uma resina apropriada. Tal material de partida é preparado ligando-se um aminoácido protegido com α-amino ou substituto de aminoácido protegido com α-amino através de uma ligação éster a uma resina de álcool p-benziloxibenzílico (Wang) ou a resina de cloreto de 2-clorotritila, através de uma ligação amida entre um ligante Fmoc, tal como ácido p-[(R, S)-a-[1-(9H-fluor-en-9-il)-metoxiformamido] -2 , 4-dimetiloxibenzil] -phenoxiacético(ligante de Rink) a uma resina de benzidrilamina (BHA), ou através de qualquer outro meio conhecido no estado da técnica, tal como ligando-se um mimético de álcool α-amino-protegido a um ligante de 3,4-dihidro-2H-piran-2-il-metanol ligado a resina de poliestireno de clorometila. Os suportes de Ligante-Fmoc-resina BHA estão disponíveis no mercado e são geralmente utilizados quando possível. As resinas são transportadas através de ciclos repetitivos conforme necessário para adicionar aminoãcidos seqüencialmente. Os grupos protetores alfa amino Fmoc são removidos sob condições básicas. Piperidina, piperazina, dietilamina, ou morfolina (2 0-40% em volume) em N,N-dimetilformamida (DMF) podem ser usados para essa finalidade.

Após remoção do grupo protetor alfa-amino, os aminoácidos protegidos ou substitutos de aminoácido posteriores são acoplados em etapas na ordem desejada para se obter uma resina de peptídeo intermediário protegido. Os reagentes ativadores utilizados paraacoplamento dos aminoácidos na síntese em fase sólidados peptídeos são bastante conhecidos no estado da técnica. Após o composto ser sintetizado, se desejado, os grupos protetores de cadeia lateral ortogonalmente protegidos podem ser removidos utilizando métodos bem conhecidos no estado da técnica para derivatização adicional do composto.

Os grupos reativos num composto podem ser seletivamente modificados, seja durante a síntese em fase sólida ou após remoção da resina. Por exemplo, os compostos podem ser modificados para se obter modificações N-terminais, tal como acetilação, enquanto em resina, ou podem ser removidos da resina mediante o uso de um reagente de clivagem e então modificados. Métodos para modificação N-terminal tal como acetilação, ou modificação C-terminal, tal como amidação ou introdução de um grupoN-acetila são bastante conhecidos no estado da técnica. De forma similar, os métodos para modificar cadeiaslaterais de aminoácidos são bem conhecidos no estado da técnica da síntese de peptídeos. A escolha de modificações feitas em grupos reativos presentes no composto será determinada, em parte, pelas características que são desejadas no composto.

Os compostos são, em uma concretização, ciclizados antes da clivagem da resina. Para a ciclização através de porções de cadeia lateral reativa, as cadeias laterais desejadas são desprotegidas, e o composto suspenso num solvente apropriado e um agente acoplador cíclico adicionado. Solventes apropriados incluem, por exemplo, DMF, diclorometano (DCM) ou l-metil-2-pirrolidona (NMP). Reagentes de acoplamento cíclicos apropriados incluem, por exemplo, tetrafluoroborato de 2-(lH-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio(TBTU) , hexafluorofosfato de 2-(lH-benzotriazol-l-il) -1, 1, 3 , 3-tetrametilurônio (HBTU), hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris (dimetilamino) fosfônio (BOP) , hexaf luorofosf ato de benzotriazol-l-il-oxi-tris (pirrolidino)fosfônio (PyBOP) , tetrafluoroborato de 2- (7-aza-lH-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (TATU), tetrafluoroborato de 2 -(2-oxo-1(2H)-piridil)-1,1,3, 3-tetrametilurônio (TPTU) ou Ν, N' -diciclohexi lcarbodiimida/l-hidroxibenzotriazol (DCCl/HOBt). O acoplamento é convencionalmente iniciadomediante o uso de uma base adequada, tal como N,N-diisopropiletilamina (DIPEA), sim-colidina or N-metilmorfolina (NMM).

Após clivagem de compostos da fase sólida pós-síntese, o composto pode ser purificado através de qualquer número de métodos, tais como cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RP-HPLC) utilizando uma coluna apropriada, tal como uma coluna C18. Outros métodos de separação ou purificação, tal como métodos baseados no tamanho ou carga do composto, podem também ser empregados. Após purificado, o composto pode ser caracterizado através de qualquer número de métodos, tal como cromatograf ialíquida de alto desempenho (HPLC), análise de aminoácido, espectrometria de massa e similares. Os compostos da presente invenção com um C-terminal derivado de amida substituído, tipicamente um grupo N- alquila, são preparados através de síntese em fase sólida iniciada a partir da extremidade C-terminal do composto mediante acoplamento de um aminoácido alfa-protegido ou substituto de aminoácido a uma resina apropriada. Tais métodos para preparar derivados de amida substituídos na fase sólida foram descritos no estado da técnica. Vide, por exemplo, Barn D.R., Morphi J.R., Rees D.C. Síntese de uma série de amidas através de clivagem assistida com cloreto de alumínio de ésteres ligados à resina. Tetrahedron Lett. 37, 3213-15 3216 (1996) ; DeGrado W. F. Kaiser E. T. Síntese em fase sólida de peptídeos protegidos numa oxima ligada a polímero: Preparação de segmentos compreendendo as seqüências de um análogo citotóxico de 26 peptídeos. J. Org. Chem. 47:3258-3261 (1982). Tal material de partida pode ser preparado ligando-se um aminoácido alfa-amino-protegido ou substituto de aminoácido através de uma ligação éster a uma resina de álcool p-benziloxibenzíIico (Wang) através de meios bem conhecidos. A cadeia peptídica é crescida com aseqüência desejada de aminoácidos ou substitutos de aminoácido, o produto ciclizado e tratada com resina com uma solução de amina e cloreto de alumínio apropriados (tal como metilamina, dimetilamina, etilamina, e assim por diante) em diclorometano. 0composto resultante derivado de amida é liberado emsolução da resina. A resina é filtrada e o composto derivado de amida recuperado através da concentração de solvente seguido de precipitação com éter. O composto bruto é secado e os grupos protetores de cadeia lateral 35 de aminoácido restantes clivados utilizando-se ácido trif luoroacét ico (TFA) na presença de água e 1,2-etanoditiol (EDT). 0 produto final é precipitadoadicionando-se éter frio e coletado por filtração. A purificação final é realizada através de RP-HPLC utilizando um coluna Ci8.

Em um método preferido, os compostos foram sintetizados através dos métodos a seguir descritos. Cada um dos compostos possuía um ou dois substitutos de aminoácido com base numa estrutura ceto-piperazínica. Os substitutos de aminoácido foram sintetizados conforme acima descrito. Os compostos foram sintetizados utilizando química Fmoc. Um método sintético manual foi utilizado para acoplamentos imediatamente antes e após a incorporação do substituto de aminoácido ceto-piperazínico.

0 protocolo seguinte foi empregado para ligar um substituto de aminoácido à resina, tal como quando o substituto de aminoácido estava numa posição terminal. A resina de amida Rink (carga a 0,3 mmol/g, Advanced Chem Tech) foi deixada intumescer em DMF por 30 minutos. A desproteção da resina com Fmoc foi realizada utilizando-se piperidina a 20%/DMF por 20 minutos. 0 acoplamento da resina com o substituto de aminoácido ceto-piperazínico protegido com Fmoc (2 eq) foi realizado através de uma incubação da noite para o dia em DMF com PyBop (2 eq) e DIEA (4 eq). Se após o teste de Kaiser o resultado fosse positivo, a reação de acoplamento era conduzida uma segunda vez. A acetilação foi conduzida utilizando-se Ac2O (10 eq) e piridina (20 eq) em DMF.

0 protocolo seguinte foi empregado para ligar um substituto de aminoácido ceto-piperazínico à resina peptídica. 0 acoplamento foi conduzido misturando-se substituto de aminoácido ceto-piperazínico protegido com Fmoc (2 eq), TBTU (2 eq) e DIEA (4 eq) em DMF e deixando-se incubar da noite para o dia, novamente com uma repetição da reação de acoplamento, se um teste de Kaiser positivo fosse obtido. A acetilação foi conduzida utilizando-se Ac2O (10 eq) e piridina (20eq)em DMF.

O protocolo seguinte foi empregado para acoplar um aminoácido protegido com Fmoc a um substituto de aminoácido ceto-piperazínico em fase sólida. Na maioria dos casos, pelo menos dois ciclos de acoplamento foram necessários, e freqüentemente três ciclos foram empregados. Um aminoácido de ciclo típico protegido com Fmoc (4 eq) foi misturado com HOAt (4 eq) e DIC (4 eq) em DMF por 30 minutos. A mistura resultante foi então misturada da noite para o dia num tubo SPE com um substituto de aminoácido ceto-piperazínico ligado diretamente ou através de intermediários à resina. Os acoplamentos entre aminoácidos que não estavam diretamente adjacentes a um substituto de aminoácido ceto-piperazínico na seqüência foram conduzidos utilizando-se protocolos padrão para a síntese de peptídeo em fase sólida. Foram empregados os seguintes grupos protetores: Boc para Lys e Orn, t-butila para Tyr e Ser, tritila para Cys e His, 0-t-butila para Asp Os compostos foram clivados da resina empregando uma mistura de TFA/tioanisol/f enol/H20/DTT/TIS(87,5/2,5/2,5/5/2,5) (5ml) por 3 horas. O material resultante foi filtrado e precipitado de éter gelado 2 5 sob condições de congelamento por uma hora. O peptídeo de cisteinila precipitado foi lavado com éter frio pelo menos três vezes antes de ser utilizado numa etapa de oxidação.

Na ciclização para formar ligações dissulfeto via oxidação por ar, o composto de cisteinila bruto foi dissolvido numa mistura de acetonitrila e água. 0 pH da mistura de reação foi ajustado em 7-8 utilizando NH4OH a 5%. A solução resultante foi agitada lentamente com 150mg de carbonato granular ativado por 2 dias. A conclusão da ciclização foi confirmada através de análi se LC-MS antes de proceder à etapa de processo seguinte. Após ciclização, o carbono sólido foifiltrado da solução. O filtrado foi liofilizado ou secado num "speed-vac" para se obter um composto cíclico bruto.

Certos compostos da invenção, quando o substituto de fórmula i está ligado à resina ou a outro suporte sólido de peptídeo e se encontra na posição C-terminal, podem ser sintetizados por meio do esquema seguinte.

O substituto (7) é preparado através do esquema do método A acima, ou qualquer método alternativo. A resina de amida Sieber protegida com Fmoc foi tratada intumescendo-se a resina numa mistura 1:1 de dimetilformamida e diclorometano por 45 minutos, seguido de filtragem e lavagem com dimetilformamida. A resina lavada foi então desprotegida com piperidina a 20% em dimetilformamida por 15 minutos, filtrada, e lavada com dimetilformamida.

Uma solução de substituto protegido com Fmoc (7) em dimetilformamida foi adicionada à resina de amida Sieber desprotegida, de acordo com a preparação acima, seguido de PyBop sólido, e diisopropiletilamina, seguido de dimetilformamida. A mistura foi agitada da noite para o dia com borbulhamento de nitrogênio. A resina foi filtrada e lavada com dimetilformamida, capeada com solução capeadora consistindo de uma solução 3:2:1 de dimetilformamida:anidrido acético:piridina por minutos, filtrada, e lavada comdimetilformamida para prover o substituto (7)complexado em resina.

0 substituto protegido com Fmoc resultante (7) complexado em resina foi desprotegido com piperidina a 20% em dimetilformamida por 15 minutos, filtrado e lavado com dimetilformamida para dar o substituto (7) complexado em resina. Uma solução do Fmoc-AA-OH desejado (4 eq. onde AA é qualquer aminoácido desejado) em dimetilformamida foi adicionada ao substituto (7) complexado em resina, seguido de uma solução de HCTU (60 mmol, 4 eq) e diisopropiletilamina (120 mmol, 8 eq. )em DMF e acoplada da noite para o dia com borbulhamento de nitrogênio. 0 substituto de Fmoc-AA-(7)-resina foi isolado por filtração e lavado dimetilformamida. Para garantir o acoplamento completo, o produto foi novamente tratado com uma solução de Fmoc-AA-OH conforme acima da noite para o dia com borbulhamento de nitrogênio. A resina resultante foi filtrada e lavada com dimetilformamida.

0 substituto Fmoc-AA-(7)-resina foi então capeado com solução capeadora, conforme acima, por 30 minutos. A resina foi então filtrada, lavada com dimetilformamida, diclorometano, MeOH, e dietil éter, e secada sob vácuo. Em seguida, cada aminoácido seguinte pode ser acoplado utilizando os métodos de acoplamento de peptídeo convencionais.

0 tratamento opcional de compostos com PEG preparados empregando-se um substituto de fórmula I da invenção pode ser conduzido, inclusive através dos métodos descritos abaixo.

0 tratamento dos grupos amina reativos com PEG, tais como cadeias laterais de lisina ou ornitina, um ômega amino alifático na posição N-terminal ou um grupo amina de um substituto de fórmula I na posição C-terminal, foi conduzido dissolvendo-se 0,005 mmol de composto purificado em 2ml de dimetilsulf óxido, seguido da adição de 55,5mg (0,011 mmol, 2 eq) de PEG-5K-0Su(5.000 Da MW metoxi-PEG com um grupo reativo succinimidil propionato) com 17,7 μΐ (0,13 mmol, 20 eq) de trietilamina então adicionada e a solução levemente turva agitada à temperatura ambiente por 3 horas. 0 PEG-5K-OSu excedente foi rapidamente resfriado mediante a adição de 7^L (0,111 mmol, 10 eg) de etanolamina e a reação agitada da noite para o dia.

O tratamento de grupos carboxila reativos com PEG, tais como as cadeias laterais Asp ou Glu ou um carboxila terminal num composto quer num resíduo aminoácido terminal ou substituto terminal de fórmula I, é realizado acoplando-se PEG-NH2 (PEG-amina) ao construto contendo um grupo carboxilato na cadeia lateral de Asp ou Glu ou no C-terminal. O construto de peptídeo (0,005 mmol) é dissolvido em DMSO (2ml), seguido da adição de 55,5 mg (0,011 mmol, 2 eq.) de PEG-NH2 e HOBt (0,01 mmol). 0 acoplamento é iniciado mediante adição de 0,0055 mmol de reagente de acoplamento N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDAC). A soluçãolevemente turva foi agitada à temperatura ambiente danoite para o dia. O composto de peptídeo tratado com PEG é então purificado através de HPLC.

0 tratamento de grupos tiol reativos com PEG, tais como cadeias laterais Cys ou Hcys ou um grupo tiol em R1 do substituto de fórmula I, é realizado tratando-se o composto em DMSO com reagente de PEG-metila-maleimida (SubnBio, Orinda, Califórnia) da noite para o dia. 0 composto de peptídeo tratado com PEG é então purificado através de HPLC.

Após o tratamento com PEG, a mistura de composto brutoresultante é purificada através de HPLC, produzindo um composto derivatizado com PEG, inclusive um ou mais substitutos de aminoácidos.

7. ENSAIOS PARA DETERMINAR A EFICÁCIA DE COMPOSTOS QUE INCLUEM OS SUBSTITUTOS DE FÓRMULA I

Em geral, qualquer sistema de ensaio apropriado para um polipeptídeo parental pode ser empregado. A seguir sãoexemplificados sistemas de ensaio empregados quando o polipeptídeo parental é um peptídeo ANP, tal como mini-ANP. Compostos selecionados incluindo pelo menos um substituto de fórmula I foram testados em ensaios para determinar a situação funcional e de ligação. Foram empregados os ensaios a seguir descritos. Cultura de células. Um clone de cDNA que codifica o receptor A de peptídeo natriurético humano (NPRA) foi adquirido da Bio S & T Inc. (Montreal, Quebec). O clone de cDNA foi inserido no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.1 (Invitrogen) e transfectado em células HEK-293. Clones estáveis foram selecionados através de cultura de células na presença de sulfato G418 .

A expressão de NPRA foi examinada através da ligação de [125I]-peptídeo natriurético atrial ( [125I]-ANP) _a homogenados membrânicos preparados a partir de linhagens celulares clonais. As células HEK-hNPRA foram mantidas em cultura a 3 7°C em CO2 5% em meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEMO suplementado com FBS a10%, sulfato G418 (300 μg/ml) glutamato de sódio (0,29 mg/ml), penicilina (100 unidades/ml) e estreptomicina (100 Mg/ml).

Ensaio de Ligação Competitivo. Um ensaio de ligação de inibição competitivo foi conduzido utilizando-se homogenados membrânicos brutos preparados a partir de células hNPRA. Para preparar os homogenados membrânicos, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato e incubadas por 15 minutos a 4°C em tampão de lise hipotônico (10 mM Tris, pH 7,4 + 5mM EDTA). As células foram transferidas de placas para tubos de polipropileno e homogeneizadas. Os homogenados foram centrifugados a 25.000 χ g por 20 minutos. As pelotas foram resuspensas em tampão consistindo de 50 mM Tris (pH 7,4) e 1 mM EDTA, homogeneizadas e centrifugadas a 25.000 χ g por 20 minutos. As pelotas foram resuspensas em tampãoconsistindo de 100 mM Tris (pH 7,4) e 10 mM MgCl2 e armazenadas a -80°C até que fosse necessário. No dia de um ensaio, os homogenados foram degelados e homogeneizados. A ligação de [125I]-ANP foi realizada em 5 tampão contendo 25 mM Hepes (pH 7,4), IOOmM NaCl, 2 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 0,1% BSA e 1 mM 1,10-fenantrolina. Os homogenados (1-10 /xg proteína/cavidade) foram incubados com [125I] -ANP (25-30 pM) e concentrações crescentes de ligantes competitivos em placas de filtro Millipore por 120 minutos a 4°C. Os ensaios foram interrompidos mediante adição de tampão de lavagem frio (solução salina tamponada com fosfato) seguido de filtração utilizando um coletor de vácuo. A radioatividade de ligação foi determinada utilizando-se um contador gama. A ligação não-específica foi definida através da ligação de [I125] -hANP a membranas HEK293 nãotransfectadas. Os dados foram analisados utilizando-se®software de ajustamento de curvas GraphPad Prism . Método geral para determinação de EC5O · A avaliação funcional de compostos foi realizada medindo-se o acúmulo de cGMP intracelular em células HEK-293 que expressem hNPR-A recombinante. Células HEK-NPRA cells foram coletadas através de lavagem e centrifugação em Tampão de Dissociação de Células (Gibco, Life Technologies). As células peletizadas foram resuspensas em Solução Salina Balanceada Hanks (HBSS) contendo 10 mM Hepes (pH 7,4), 5 mM MgCl2, 200 mM L-glutamina, 1 mM 1,10-fenantrolina e BSA (0.5 mg/mL). Após a centrifugação, as células foram resuspensas no tampão acima suplementado com 0.5 mM de 3 -isobutil-1-metilxantina (IBMX) .Células (~2xl05/cavidade) foram adicionadas a cada cavidade de uma placa de 96 cavidades e incubadas por 15 minutos a 37°C. Após o período de pré-incubação, as células foram 35 incubadas por mais 15 minutos na presença de concentrações crescentes de compostos. A reação foi concluída através de Iise das células com choque detemperatura. A placa de reação foi incubada num banho de gelo seco/etanol por 15 minutos seguido de incubação a 90 0C por 10 minutos. O acúmulo de cGMP foi medido utilizando-se o cGMP Flashplate RIA (Perkin-Elmer). A análise de dados e os valores EC50 foram determinados utilizando-se análise de regressão não linear com software GraphPad Prism8.

Determinação de massa e análise de ressonância magnética nuclear

Os valores de massa foram determinados utilizando um dispositivo Waters MicroMass ZQ num modo positivo. As determinações de massa foram comparadas com valores calculados e expressadas na forma de peso de massa mais dois dividido por dois (M+2)/2), salvo se especificado de outra forma.

Dados de NMR protônica foram obtidos utilizando-se um espectrômetro Bruker 3 00 MHz. Os espectros foram obtidos após dissolver os compostos num solvente deuterado tal como clorofórmio, DMSO, ou metanol,conforme apropriado.

As medições por HPLC foram realizadas utilizando-se um HT da Waters Alliance com uma coluna YMC Pack Pro Ci8 (4,6 χ 50mm, 3μ) eluída a 1 ml/minuto num procedimento por etapas. O solvente A (água contendo ácido trifluoroacético a 0,1% em volume) e solvente B (acetonitrila contendo ácido trifluoroacético a 0,1% em volume) foram utilizados como fases móveis. Para análise de intermediários ceto piperazínicos, a coluna foi equilibrada com 10% B e então B foi aumentado até90% por um período de 8 minutos. Para análise depeptídeos, a coluna foi equilibrada com 2% B e então B foi aumentado até 90% por um período de 8 minutos.

8. COMPOSTOS INCLUINDO SUBSTITUTOS DA FÓRMULA I

A invenção é também ilustrada através dos seguintes exemplos não restritivos.

EXEMPLO 1

Os compostos seguintes baseados no polipeptídeoparental H-Met-ciclo(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2 (SEQ ID NO:l) foram sintetizados, cada qual empregando um substituto de aminoácido simples de fórmula I de um ou mais dos métodos anteriormente citados. Por questões sintéticas, Met na posição 1 foi substituído com Nle. Os compostos resultantes foram purificados e os pesos em massa determindos, com os resultados apresentados abaixo:<table>table see original document page 152</column></row><table><table>table see original document page 153</column></row><table><table>table see original document page 154</column></row><table><table>table see original document page 155</column></row><table><table>table see original document page 156</column></row><table><table>table see original document page 157</column></row><table>Nos compostos da Tabela 1, os compostos 1-1, 1-5, 1-7, 1-8, 1-12, 1-15, 1-18, 1-20 e 1-22 estavam inativos nossistemas de ensaio relevantes. Os compostos restantesestavam ativos. O composto 1-2 com a estrutura a seguir,foi testado conforme acima descrito, o

<formula>formula see original document page 158</formula>

Em estudos de ligação a receptor, esse composto possuía um Ki médio de 0,3 nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um Ki de 0,05 nM e mini-ANP tinha um Ki de 0,6 nM. 0 composto 1-2 tinha um EC50 de 2nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um EC50 de 0,6 nM e mini-ANP tinha um EC50 de 3,3 nM.

O composto 1-14, com a estrutura seguinte, foi testado conforme descrito:

<formula>formula see original document page 158</formula>

Em estudos de ligação a receptor, esse composto possuía 15 um Ki médio de 0,9 nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um Ki de 0,05 nM e mini-ANP tinha um Ki de 0,6 nM. 0 composto 1-14 tinha um EC50 de 3, 5nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um EC50 de 0,6 nM e mini-ANP tinha um EC50 de 3,3 nM. O composto 1-13, com a estrutura seguinte, foi testado conforme descrito.

<formula>formula see original document page 158</formula>

Em estudos de ligação a receptor, esse composto possuía um Ki médio de 0,2 nM num sistema de ensaio no qual hANPtinha um Ki de 0,05 nM e mini-ANP tinha um Ki de 0,6 nM. O composto 1-13 tinha um EC50 de 2 nM num sistema de ensaio no qual o construto da Fig. 1 tinha um EC50 de 0,6 nM e mini-ANP tinha um EC50 de 3,3 nM.

EXEMPLO 2

Os compostos seguintes baseados no polipeptídeo parental H-Met-ciclo(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-1Ie-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2 (SEQ ID N0:1) foram sintetizados, cada qual empregando dois substitutos de aminoácido de fórmula I de um ou mais dos métodos anteriormente citados. Por questões sintéticas, Met na posição 1 foi substituído com Nle. Os compostos resultantes foram purificados e os pesos em massa determinados, com os resultados apresentados abaixo:<table>table see original document page 160</column></row><table><table>table see original document page 161</column></row><table>Nos compostos da tabela 2, os compostos 2-2 e 2-4 estavam inativos em sistemas de ensaio relevantes. Os compostos restantes estavam ativos. 0 composto 2-6, com a estrutura seguinte, foi testado conforme descrito acima.

Em estudos de ligação a receptor, esse composto possuía um Ki médio de 0,027 nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um Ki de 0,05 nM e mini-ANP tinha um Ki de 0,6 nM. 0 composto 2-6 tinha um EC50 de 0,2 nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um EC50 de 0,6 nM e mini-ANP tinha um EC50 de 3,3 nM.

EXEMPLO 3

O composto seguinte baseado no polipeptídeo parental H-Met-ciclo (Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-IIe-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2 (SEQ ID N0:1) foi sintetizado, cada qual empregando três substitutos de aminoácido de fórmula I de um ou mais dos métodos anteriormente citados. Por questões sintéticas, Met na posição 1 foi substituído com Nle. O composto resultante foi purificado e os pesos em massa determinados.<table>table see original document page 163</column></row><table>EXEMPLO 4

Os compostos seguintes baseados no polipeptídeo parental H-Met-ciclo(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2 (SEQ ID N0:1) foram sintetizados, empregando dois substitutos de aminoácido de fórmula I de um ou mais dos métodos anteriormente citados e um grupo protético PEG. Por questões sintéticas, Met na posição 1 foi substituído com Nle. Os compostos resultantes foram purificados e os pesos em massa determinados.<table>table see original document page 165</column></row><table><table>table see original document page 166</column></row><table>Nos compostos da Tabela 4, o composto 4-6 estava inativo nos sistemas de ensaio relevantes. Os compostos restantes estavam ativos.

EXEMPLO 5

Os compostos seguintes baseados no polipeptídeo parental H-Met -ciclo(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-IIe-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2 (SEQ ID NO.-l) foram sintetizados, empregando um ou dois substitutos de aminoácido de fórmula I de um ou mais dos métodos anteriormente citados. Embora o polipeptídeo parental fosse cíclico, esses compostos eram lineares, cada qual com resíduo Cys substituído com um resíduo Ala. Por questões sintéticas, Met na posição 1 foi substituído com Nle.

0 Composto 5-1, com a estrutura seguinte, foi testado 15 conforme descrito acima.

<formula>formula see original document page 167</formula>

Em estudos de ligação a receptor, esse composto possuía um Ki médio de 88,5 nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um Ki de 0,05 nM e mini-ANP tinha um Ki de 0,6 nM. 0 composto 5-1 tinha um EC50 de 340 nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um EC50 de 0,6 nM e mini-ANP tinha um EC50 de 3,3 nM.

O Composto 5-2, com a estrutura seguinte, foi testado conforme acima descrito.

<formula>formula see original document page 167</formula>

Em estudos de ligação a receptor, esse composto possuía um Ki médio de 14,5 nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um Ki de 0,05 nM e mini-ANP tinha um Ki de 0,6 nM. 0 composto 5-2 tinha um EC50 de 550 nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um EC50 de 0,6 nM e mini-ANP tinha um EC50 de 3,3 nM.O Composto 5-3, com a estrutura seguinte, foi testado conforme descrito acima.

<formula>formula see original document page 168</formula>

Em estudos de ligação a receptor, esse composto possuía um Ki médio de 8,7 nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um Ki de 0,05 nM e mini-ANP tinha um Ki de 0,6 nM. O composto 5-3 tinha um EC50 de 80,5 nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um EC50 de 0,6 nM e mini-ANP tinha um EC50 de 3,3 nM.

EXEMPLO 6

Os compostos seguintes baseados no polipeptídeo parental H-ciclo (Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys)-Pro-Leu Gly-NH2 (SEQ ID NO: 3) foram sintetizados, empregando um substituto de aminoácido de fórmula I de um ou mais dos métodos anteriormente citados.

Tabela 6

<table>table see original document page 168</column></row><table><table>table see original document page 169</column></row><table>

EXEMPLO 7

Os compostos seguintes baseados no polipeptídeo parental de oxitocina H-ciclo(Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys)-Pro-Leu Gly-NH2 (SEQ ID NO:3) foram sintetizados, empregando um substituto de aminoãcido simples de fórmula I de um ou mais dos métodos anteriormente citados. Embora o polipeptídeo parental fosse cíclico, esses compostos eram lineares, com cada resíduo Cys substituído com um resíduo Ala.

Tabela 7

<table>table see original document page 169</column></row><table><table>table see original document page 170</column></row><table>Os exemplos anteriores podem ser repetidos com sucesso similar substituindo-se os reagentes e/ou condições operacionais da presente invenção genérica ou especificamente descritos por aqueles utilizados nos exemplos precedentes.

Embora a invenção tenha sido descrita em detalhes com especial referência às concretizações preferidas, outras concretizações podem obter os mesmos resultados. Variações e modificações da presente invenção serão evidentes para os habilitados na técnica e pretendem abranger todas essas modificações e equivalentes. Todas as descrições de todas as referências, pedidos, patentes e publicações citados acima e/ou nos anexos, e do(s) pedido(s) correspondentes, são aqui incorporados por referência.

Claims

1. Composto, caracterizado pelo fato de apresentar uma fórmula da estrutura I:<formula>formula see original document page 172</formula>ou um enantiômero, estereoisômero ou diaestereoisômero do mesmo, ou um sal sinteticamente aceitável do mesmo, onde:R1 é H, alquila, arila, alquilarila, alquila-N(R8) 2/ alquila-OR8, alquila-C (=0) OR8, C(=0)0R8, alquila-NH2, alquila-S-R8, alquila-C (=0) N (R8) 2, ou um grupo da fórmula:<formula>formula see original document page 172</formula>ouR2 é H ou alquila, contanto que R1 e R2 não sejam ambos H; R3 é H ou um primeiro grupo nitrogênio protetor; R4 é H, alquila, (CH2) mC (=0) OH, (CH2) mC (=0) NR11, (CH2) mC(=0) OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qOalila,(CH2) mC (=0) N (R ) 2 # OU (CH2) mC (=0) N (R ) (CH2)pN(Ra)2; R5 é H ou alquila;R6a é H, alquila, (CH2) mC (=0) OH, (CH2) mC (=0) NR11, (CH2) mC (=OOR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qOalila,(CH2) mC (=0) N (Ra) 2 , OU (CH2) mC(=0) N (R8) (CH2)pN (R8)2 ; R6b é H ou alquila;contanto que ambos R4 e R6a não sejam (CH2) mC (=0) OH, (CH2)mC (=OJNR11, (CH2)mC (=OiOR11, (CH2)qOH,(CH2)qOBn,(CH2) gOalila, (CH2)mC(=0) N (R8) (CH2) pN (R8)2 ;(CH2)mC (=0) N (R8)2,OUR' H, C (=0) alquila, C (=0) (CH2) m (NR8 alquila,aralquila, ou arila;cada ocorrência de R8 é independemente H, arila, ou alquila;R11 é um suporte peptídico sólido;R12 é H ou um segundo grupo nitrogênio protetor;cada ocorrência de m é um número inteiro independentetendo um valor entre 0 e 6;cada ocorrência de q é um número inteiro independente tendo um valor entre 1 e 6;ρ é um número inteiro tendo um valor entre 1 e 10; e y é 0 ou 1.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de R3 ser um grupo da fórmula:<formula>formula see original document page 173</formula>e R ser ter-butila, alila ou um grupo de uma fórmula:<formula>formula see original document page 173</formula>

3. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de R1 ser alquila-N(R8) 2, alquila-OR8, (CH2) n-C (=0) OR8, C (=0) OR8, alquila-NH2, alquila-S-R8, alquila-C (=O) N (R8) 2, ou o grupo da fórmula:<formula>formula see original document page 174</formula>e R12 ser H ou trifenilmetileno, ter-butiloxicarbonila, toluenossulfonila, formila, nitro ou benziloxicarbonila e η ser um número inteiro tendo um valor entre 2 e 6.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ter a fórmula:<formula>formula see original document page 174</formula>ou um enantiômero, estereoisômero ou diaestereoisômedro do mesmo, ou um sal sinteticamente aceitável do mesmo, onde:Rl6aé H ou alquila; eR9 é ter-butila, alila, ou um grupo de uma fórmula:<formula>formula see original document page 174</formula>

5. Composto, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de R1 ser alquila-N (R8) 2, alquila-OR8, (CH2) n-C(=0) OR8, C (=0) OR8, alquila-NH2, alquila-S-R8, alquila-C (=0) N (R8) 2, ou o grupo da fórmula:<formula>formula see original document page 175</formula>ouR4 ser (CH2) mC(=0) 0Η, (CH2) mC (=0) N (Ra) 2, ou (CH2) mC (=0) NR11; eR12 ser H ou trifenilmetileno, ter-butiloxicarbonila, toluenossulfonila, formila, nitro ou benziloxicarbonila e η ser um número inteiro tendo um valor entre 2 e 6.

6. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ter a fórmula:<formula>formula see original document page 175</formula>ou um enantiômero, estereoisômero ou diaestereoisômero do mesmo, ou um sal sinteticamente aceitável do mesmo, onde: R1 é alquila-N (R8) 2, alquila-0R8, (CH2) n-C (=0) OR8, C(=0)0R8, alquila-NH2 , alquila-S-R8, alquila-C (=0) N (R8) 2, ou o grupo da fórmula:<formula>formula see original document page 175</formula>ouR4 é (CH2)mC (=0) OH, (CH2)qOalila,(CH2)qOBn, ou(CH2)mC (=OJNR11,(CH2) mC (=0) N (R8) 2, (CH2)mC (=0) N (R8) (CH2)pN(R8)2; R6a é H ou alquila; eη é um número inteiro tendo um valor entre 2 e 6.

7. Composto, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de R1 ser alquila-N(R8) 2, alquila-OR8i (CH2) η-C (=0) OR8, C (=0) OR8, alquila-NH2, alquila-S-R8, alquila-C (=0) N (R8) 2, ou o grupo da fórmula:<formula>formula see original document page 176</formula>R7 ser H,R4 ser (CH2) mC(=0) OHi (CH2) mC (=0) N (R8) 2, ou (CH2) mC (=0) NR11, (CH2) mC( =OOR11;toluenossulfonila, formila, nitro ou benziloxicarbonila; eη ser um número inteiro tendo um valor entre 2 e 6.

8. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de ter a seguinte fórmula:<formula>formula see original document page 176</formula>ou um enantiômero, estereoisômero ou diaestereoisômero do mesmo, ou um sal sinteticamente aceitável do mesmo, onde:R1 é alquila-N (R8) 2, (CH2)nOR8, (CH2) nC (=0) OR8, C(=0)0R8, alquila-NH2, alquila-S-R8, alquila-C (=0) N (R8) 2, ou um grupo da fórmula:<formula>formula see original document page 176</formula>R12 ser H ou trifenilmetileno, ter-butiloxicarbonila,R4 é H ou alquila; R6a é H ou alquila; eη é um número inteiro tendo um valor entre 2 e 6.

9. Composto, de acordo com a reivindicação caracterizado pelo fato de R3 ser um grupo da fórmula:<formula>formula see original document page 177</formula>R ser ter-butila, alila, ou um grupo da fórmula:<formula>formula see original document page 177</formula>

10. Composto, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de R1 ser alquila-N(R8) 2, alquila-OR8, (CH2) n-C(=0) OR81 alquila-C (=0) N(Rs) 2,C(=0)OR8, alquila-NH2, alquila-S-R8, ou o grupo da fórmula:<formula>formula see original document page 177</formula>H ou trifenilmetileno, ter-butiloxicarbonila, toluenossulfonila, formila, nitro ou benziloxicarbonila; e η ser um número inteiro tendo um valor entre 2 e 6.

11. Composto, de acordo com a reivindicação caracterizado pelo fato de ter a seguinte fórmula:<formula>formula see original document page 177</formula>ou um enantiômero, estereoisômero ou diaestereoisômero do mesmo, ou um sal sinteticamente aceitável do mesmo, onde: R1 é alquila-N (R8)2, alquila-OR8, (CH2) n-C (=0) OR8, C (=0) OR8, alquila-NH2, alquila-S-R8, alquila-C (=0) N(R8) 2, ou um grupo da fórmula:<formula>formula see original document page 178</formula>R4 é H ou alquila;R6a é (CH2) mC(=0) OH, (CH2)qOalila,(CH2) mC( =0)NR1X, (CH2)qOHf (CH2)qOBn, (CH2) mC (=0) N (R8) 2, ou(CH2) mC(=0) N (Ra) (CH2)pN(R8)2; e η é um número inteiro tendo um valor entre 2 e 6.

12. Composto, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de R3 ser um grupo da fórmula:<formula>formula see original document page 178</formula>e R ser ter-butila, alila, ou um grupo da fórmula:<formula>formula see original document page 178</formula>

13. Composto, de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ter a fórmula:<formula>formula see original document page 179</formula>ou um enantiômero, estereoisômero ou diaestereoisômero do mesmo, ou um sal sinteticamente aceitável do mesmo, onde: R4 é H ou alquila; eR9 é ter-butila, alila, ou um grupo da fórmula:<formula>formula see original document page 179</formula>

14. Composto, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de R1 ser alquila-N (R8) 2, alquila-ORB (CH2)n-C (=0) OR8, C (=0) OR8, alquila-NH2, alquila-S-R8,alquila-C (=0) N (R8) 2, ou o grupo da fórmula: m<formula>formula see original document page 179</formula>R4 ser (CH2) mC(=0) OH, (CH2) „C(=0)0Ru;(CH2) mC (=0) N (Ru) 2, (CH2) mC (=0) NR11 ouR12 ser H ou trifenilmetileno, ter-butiloxicarbonila, toluenossulfonila, formila, nitro ou benziloxicarbonila e η ser um número inteiro tendo um valor entre 2 e 6.

15. Composto, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de:R ser um grupo de uma fórmula:<formula>formula see original document page 180</formula>R4 ser (CH2)mC(=0) OH, (CH2) mC (=0) NR(CH2) mC(=0) OR(CH2)qOHi (CH2)qOBn, (CH2)qOalilai (CH2) mC (=0) N (R8) 2, ou(CH2) mC (=0) N (R8) (CH2)pN(R8)2 e R6a ser HR6a é (CH2) mC(=0)0H, (CH2)qOH, (CH2)qOBn,ou alquila oualternativamente Rba é (CH2) mC (=0) OH, (CH2) mC (=0) NR117 (CH2) mC (=0) OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qOalilai(CH2) mC (=0) N (R8) 2, ou (CH2) mC(=0) N(R8) (CH2)pN(R8)2 e R4 é H ou alquila; eR9 é ter-butila, alila ou um grupo de uma fórmula:<formula>formula see original document page 180</formula>