BRPI0709502A2 - promotor de gene de planta e seu uso - Google Patents
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Abstract
PROMOTOR DE GENE DE PLANTA E SEU USO. Compreendendo um método para proteger uma planta do stress de alta temperatura (HTS) , compreendendo a transformação da planta com uma sequência de polinucleotídeo; a sequência de polinucleotídeo compreende urna sequência de nucleotídeo codificando urna quinase de açúcar sob o controle do promotor específico de antera e/ou pólen, assim produzindo uma planta transformada rendo tolerância aprimorada ao HTS; também é revelada a sequência de polinucleotídeo do promotor LeFRK4.
Description
"PROMOTOR DE GENE DE PLANTA E SEU USO"
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-sea um promotor de gene de planta e seu uso.
REFERÊNCIAS
As seguintes referências sãomencionadas na especificação e são identificadas no textopor seus respectivos números. A menção da referência nãonecessariamente indica que é relevante para apatenteabilidade da invenção.
1. Imin N, Kerim T, Rolfe BG, Weinman JJ (2004) Efeito dostress prematuro de frio sobre a maturação de anteras dearroz. Proteômica 4: 1873-1882;
2. Aloni B, Peet M, Pharr M, Kami L (2001) 0 efeito de altatemperatura e alto C02 atmosférico sobre as alterações decarboidrato no pólen de pimentão (Capsicum annuum) comrelação a sua germinação. Planta Fisiol. 112: 505-512;
3. Pressman E, Peet MM, Pharr DM (2002) 0 efeito do stressde calor sobre as características de pólen de tomate éassociado às alterações na concentração de carboidrato nasanteras em desenvolvimento. Bot. An. (Lond) 90: 631-636;
4. German MA, Asher I, Petreikov M, Dai N, Schaffer AA,Granot D (2004) Clonagem, expressão e caracterização deLeFRK3, o quarto gene de tomate (Lycopersicon esculentumMill.) codificando a frutoquinase. Ciência de Planta 166:285-291
5. Kandel-Kfir M, Damari-Weissler H, German MA, Gidoni D,Mett Α, Belausov Ε, Petreikov Μ, Adir Ν, e Granot D (2006).Dois HXKs de tomate plastidico e associado à membranarecém-identificados: características, estrutura prevista elocalização intracelular. Planta 224, 1341-1352.
6. German MA, Dai N, Chmelnitsky I, Sobolev I, Salts Y,Barg R, Schaffer AA, Granot D (2002) LeFRK4, uma novafrutoquinase de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.)especificamente expressa em estames. Ciência de Planta 163:607-613;
7. Kami, L e Aloni, B (2002) Frutoquinase e hexoquinase dosgrãos de pólen do >pimentão (Capsicum annuum L.): possívelpapel na germinação do pólen sob condições de altatemperatura e enriquecimento de C02; Anais de Botânica, v.90 (5):607-612;
8. Dai N, Schaffer A, Petreikov M, Shahak Y, Giller Y,Ratner K, Levine A, Granot D (1999) Expressão em excesso dehexoquinase de Arabidopsis em plantas de tomate inibe ocrescimento, reduz a fotossíntese e induz rápidoenvelhecimento. Célula de Planta 11: 1253-1266.
HISTÓRICO DA INVENÇÃO
O fator principal responsávelpela redução dos rendimentos da safra de tomate sobtemperaturas elevadas é o prejuízo do desenvolvimento egerminação do pólen. Esse fator é conhecido como stress dealta temperatura (HTS). As etapas de floração mais sensívelàs altas temperaturas são a meiose (8-9 dias antes daantese) e fertilização (1-3 dias após a antese) . EmBrassica, o pólen das plantas expostas a quatro dias de HTS(35°C) tinha taxas inferiores de germinação in vitro(17,5%) do que o pólen das plantas de crescimento decontrole (59,2%). A taxa inferior de germinação foiindependente de se a germinação in vitro tinha sidorealizada em 23°C ou 35°C. As averiguações semelhantesindicando que os órgãos reprodutores masculinos são maissensíveis ao stress de calor também foram relatadas paraoutras espécies de planta.
Embora a esterilidademasculina devido ao HTS tenha sido observada em numerosasplantas, as vias bioquímicas e de desenvolvimento afetadaspermanecem desconhecidas. De forma semelhante, enquanto ésabido muito sobre a resposta dos tecidos vegetativos aostress ambiental, muito pouca informação está disponívelcom relação à capacidade do pólen de preparar uma respostadefensiva. Uma análise comparativa do perfil global deexpressão de proteína do pólen na presença de stress é umaabordagem que pode auxiliar no tratamento dessasdeficiências. Até agora, ainda existem poucas análisesabrangentes específicas ao proteoma do pólen e somente umaanálise lida com o stress de temperatura 1. Nesse estudo, operfil global de expressão da proteína das anteras de arrozfoi analisado sob stress de frio e 70 manchas de proteínaforam averiguadas como sendo diferencialmente exibidas. Apouca evidência até agora parece indicar que os grãos depólen não somente induzem as proteínas normalmenteencontradas nos tecidos vegetativos estressados, porém queos efeitos prejudiciais ocorrem principalmente no níveltranslacional e pós-translacional.
Os carboidratos têm um papelcritico no desenvolvimento, germinação e fertilização dopólen, atuando como nutrientes para as funções metabólicas,estruturais, de armazenamento e talvez de sinalização. Emmuitas plantas, incluindo o tomate e Brassica, o açúcartransportado é principalmente a sacarose. Uma via dedescarregamento da sacarose através do espaço apoplástico éobrigada para células simplasticamente isoladas, tais como,pólen em desenvolvimento, que recebe seu suprimento decarboidrato da camada de tapetum e o fluido locularadjacente. A sacarose transportada é liberada a partir doselementos de peneira do floema nas camadas de parede daantera e o apoplasto de tapetum, provavelmente através deum transportador de sacarose. As moléculas de sacaroseliberadas podem seguir uma ou ambas das seguintes rotas: 1.Entrar no citosol das células penetrantes de pólen e serclivada por sintase de sacarose (SuSy) para frutose e UDP-glicose (UDPG); 2. Irreversivelmente hidrolisada paraglicose e frutose por uma invertase extracelular(apoplástica) - ionicamente ligada à parede celular. Osmonômeros resultantes de hexose, glicose e frutose, sãoentão absorvidos nas células penetrantes portransportadores de hexose.
O crescimento de tubo e agerminação do pólen também são altamente dependentes dadisponibilidade dos açúcares, já que a atividade metabólicaprincipal durante esse processo é a biossintese dospolímeros que formarão a parede celular de prolongamento.Enquanto o volume do protoplasto não se alterarsignificativamente durante o prolongamento do tubo depólen, já que se movimenta para frente, a parede celularforma um tubo imóvel que continuamente se expande no ápice.Considerando que um único tubo de pólen tem que atingir umcomprimento total de cerca de um centímetro nos pistilos detomate e Brassica dentro de um curto tempo, o suprimentodos precursores de parede celular precisa ser ininterruptoe extremamente rápido. Para sustentar esse alto nível desíntese do carboidrato, os tubos de pólen utilizam tanto asreservas armazenadas, que podem incluir a sacarose, amido,ácido fítico e lipídeos, dependendo das espécies e fontesexternas de açúcar. Nos tubos de pólen de crescimento invitro, a necessidade para as fontes externas de carbono foidemonstrada para aumentar com o tempo conforme osarmazenamentos internos foram se esgotando. O metabolismoeficiente do açúcar é, portanto, crucial para o sucesso doprocesso de fertilização.
Em um número de espécies deplanta, o prejuízo induzido por stress do desenvolvimentodo gametófito masculino é precedido por desordens nometabolismo de carboidrato na antera e no pólen emdesenvolvimento 2. No tomate, o HTS provoca uma redução emambos os níveis de amido do pólen em desenvolvimento dotomate imaturo e concentração solúvel de açúcar dos grãosmaduros de pólen. Isso foi acompanhado por uma diminuiçãono' número dos grãos de pólen produzidos, um número elevadode pólen não viável e uma diminuição na capacidade do pólenviável para germinar 3.
Tanto a sintase de sacarose(SuSy) quanto a invertase clivam a sacarose para produziros açúcares, glicose e frutose de hexose, que devem serfosforilados por enzimas de fosforilação de hexose(quinases de hexose) antes de ser ainda metabolizadas. Asenzimas de fosforilação de hexose são caracterizadas porsua afinidade especifica aos diversos açúcares. Ahexoquinase (HXK) fosforila a glicose e a frutose,considerando que a frutoquinase (FRK) fosforila somente afrutose. A afinidade de FRKs com a frutose é uma de duasordens de magnitude mais alta do que de HXKs com a frutose.Os açúcares fosforilados (fosfatos de hexose) podem entrarna via de fosfato de pentose ou glicólise, ou seremconvertidos e armazenados como amido. A glicose dedifosfato de uridina (UDPG), produzida por clivagem dasacarose por SuSy, também pode ser usada para a paredecelular, celulose ou síntese de amido.
Quatro genes de HXK e quatrogenes de FRK (LeFRKl-4) foram identificados nas plantas detomate 4, 5. Todos os quatro genes de HXK e três de FRK(LeFRKl-3) são expressos em diferentes níveis em todos ostecidos de planta 4, 5. Entretanto, a quarta frutoquinaserecentemente clonada, LeFRK4, é expressa nas anteras e nopólen 6 (principalmente no pólen maduro e em germinação,porém também no pólen em desenvolvimento) nos níveis 100vezes mais altos do que quaisquer dos outros genes de HXK eFRK.
Kami, L e Aloni, Β. [7]investigaram as alterações nas atividades de frutoquinase(FRK) e hexoquinase nas flores de pimenta durante seudesenvolvimento, e estudaram os possíveis papéis dessasenzimas na determinação da capacidade de pólen sob altatemperatura e sob enriquecimento de C02, previamentedemonstrado por modificar as concentrações de açúcar nopólen de pimenta. Seus resultados sugeriram que o FRK de pólen e antera pode ter um papel na regulamentação dagerminação do pólen, possivelmente ao fornecer a frutose-6-fosfato para glicólise, ou por meio da conversão para UDPGde modo a sustentar a biossíntese do material de paredecelular para o crescimento de tubo do pólen.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em um aspecto da invenção, éfornecida uma seqüência isolada de polinucleotídeocompreendendo um dos seguintes: (a) o promotor LeFRK4; e(b) uma parte funcional do mesmo, sendo um promotormodificado LeFRK4 em que uma ou mais das bases denucleotídeo foram substituídas ou excluídas, ou uma ou maisbases de nucleotídeo foram adicionadas ao mesmo,caracterizado pelo fato de que a atividade específica depromotor do promotor modificado é substancialmente a mesmaque a do promotor LeFRK4. 0 termo "promotor LeFRK4" incluia seqüência consistindo nos nucleotídeos 1 a 2488 (SEQ. ID.N0 :1) da seqüência demonstrada na figura 6. Em umaconfiguração preferida, a termo refere-se aos nucleotídeos1175 a 2488 (SEQ. ID. N°: 2) da seqüência demonstrada naFig. 6. Deve ser observado que a seqüência 14bp no iniciodo gene LeFRK 4 (bp 2489-2502 na Figura 6) não éaparentemente expressa, e pode ser uma seqüência 5' UTR. Aseqüência de nucleotideo do promotor 1175 a 2488 (SEQ. ID.N°: 2) foi depositada no GenBank em 19 de março de 2006, efoi concedida com o número de adesão DQ453118.
O termo "atividade especificade promotor" dentro do contexto do promotor LeFRK4 inclui pelo menos as seguintes características:
1. a capacidade do promotor de acionar a expressão de umgene, preferivelmente um gene que pode codificar umaquinase de açúcar, e especificamente, a hexoquinase e/oufrutoquinase;
2. o promotor é principalmente ativo, e preferivelmentede forma exclusiva, nas porções de antera e pólen daplanta.
O termo "substancialmente omesmo" dentro do contexto de um promotor modificado LeFRK4significa que o promotor modificado possui uma atividadeespecífica de promotor tendo pelo menos um, epreferivelmente ambas de suas características, acimadefinidas, em um nível de pelo menos 80%, maispreferivelmente pelo menos 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, até mais preferivelmente pelo menos 95%, namaior parte preferivelmente pelo menos 98% da atividade dopromotor nativo não modificado.
Também está incluído nainvenção um vetor, preferivelmente um vetor de expressão,compreendendo o promotor da invenção. Os diversos vetoresde expressão ativos nas células de planta são bem-conhecidos para aquele com habilidade na técnica, ρ.ex.,PVX, pJLX, pBI121, pART7/27, pRT104, etc. Diversos genes ouseqüências de ácido nucléico heterólogo podem ser inseridosno vetor de modo a serem ligados de forma operável e sob ocontrole do promotor. Em uma configuração preferida, o geneheterólogo codifica uma proteína envolvida no metabolismodo açúcar, tal como, invertase, uma sintase de sacarose ouum transportador de glicose. Em uma configuração preferidana maior parte, o gene heterólogo codifica uma quinase deaçúcar, por exemplo, hexoquinase, frutoquinase, fucoquinaseou galactoquinase (GalK).
O gene heterólogo também podeser um gene variável tendo uma finalidade especial, talcomo, um gene repórter confirmando a expressão do promotor.No caso da produção de uma planta estéril masculina, o geneestrangeiro pode ser um gene degradando o desenvolvimentoou germinação do pólen.
Uma configuração adicional dainvenção inclui uma célula hospedeira transformada pelovetor da invenção. Em uma configuração preferida, a célulahospedeira é uma célula de planta, preferivelmente umacélula de antera ou pólen. Uma configuração ainda adicionalda invenção é uma planta transgênica compreendendo a célulahospedeira da invenção.
O promotor da invenção podeser usado em diversas aplicações na genética de planta. Umadas aplicações é descrita em detalhes abaixo.
Outras aplicações possíveissão: 1) provocar a esterilidade masculina por expressãoespecífica de diversos genes (tais como, RNAses, proteases,toxinas ou outros genes) que podem romper o desenvolvimentode pólen ou antera. A esterilidade masculina é um traçodesejável para a produção das sementes híbridas e podeeconomizar os métodos laboriosos de esterilizaçãoatualmente usados nas sementes de empresa; e 2) eliminaçãodo desenvolvimento de pólen para impedir ou reduzir oscomponentes alergênicos de pólen ou efeitos alérgicosprovocados pelo pólen.
Em um segundo aspecto da invenção, é fornecido um método para proteger uma planta dostress de alta temperatura (HTS), compreendendo atransformação da planta com uma seqüência depolinucleotídeo, caracterizada pelo fato de que a referidaseqüência de polinucleotídeo compreende uma seqüência de nucleotídeo codificando uma quinase de açúcar sob ocontrole de um promotor específico de antera e/ou pólen,assim produzindo uma planta transformada tendo tolerânciaaprimorada ao HTS.
Em uma configuração preferida, o promotor específico compreende o promotor LeFRK4. Emoutra configuração preferida, a quinase de açúcar é umahexoquinase ou uma frutoquinase. Em outra configuraçãoainda preferida, a planta é tomate, pepino, pimentas,abobrinha, milho, algodão, linho, trigo, arroz, berinjela,melão ou Brassica, ou qualquer outra planta suscetível aoHTS.
Em um terceiro aspecto dainvenção, é fornecido um método para provocar aesterilidade masculina compreendendo a transformação daplanta com uma seqüência de polinucleotideo, caracterizadapelo fato de que a referida seqüência de polinucleotideocompreende uma seqüência de nucleotídeo capaz de romper odesenvolvimento de pólen ou antera sob o controle de umpromotor específico de antera e/ou pólen, assim provocandoa esterilidade masculina. Em uma configuração preferida, opromotor específico compreende o promotor LeFRK4.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Com a finalidade de entender ainvenção e visualizar como ela pode ser realizada naprática, uma configuração preferida será agora descrita,somente como exemplo não limitante, com referência aosdesenhos anexos, em que:
a figura 1 é um gráfico em barra demonstrando o efeito deHTS sobre o desenvolvimento e germinação depólen. O pólen das plantas de tomate cultivadaspor diversas semanas em temperaturas normais(28°C/22°C - dia/noite) ou altas (32/26°C) foicoletado e germinado em temp. baixa (23 °C) ealta (32°C). A viabilidade do pólen foiclassificada sob o microscópio seguindo adescoloração com reagente Alexander conformedescrito em Pressman Ε, Moshkovitch Η, RosenfeldΚ, Shaked R, Gamliel B e Aloni B (1998),Influência de baixas temperaturas noturnas sobrea qualidade da flor de pimentão e o efeito depolinizações repetidas, com pólen viável, sobrecolocação de fruta. Jornal de Ciência eBiotecnologia de Horticultura 73: 131-136. Opólen viável inclui os grãos de germinação edescoloração;
a figura 2 é um gráfico em barra demonstrando a expressãode 35S::AtHXKl em antera e pólen. A expressão deAtHXKl de hexoquinase de Arabidopsis nas plantasde tomate sob o promotor 35S foi determinada nopólen maduro, antera (sem pólen) e pólen degerminação. A expressão foi determinada por PCRem tempo real com primers específicos de AtHXKl,e normalizada à expressão de uma ciclofilina degene de organização (resultados semelhantesforam obtidos mediante a normalização com rRNA); a figura 3 inclui fotografias e gráficos em barra edemonstra o efeito de HTS sobre a germinação depólen. As plantas de tomate de controle (MP,w.t.) e linhas de tomate transgênico isogênicoindependente expressando em excesso AtHXKl(HK37, HK4 e HK38) foram cultivadas por diversassemanas em temperaturas normais (A) (28°C/22°C -dia/noite) ou altas (B) (32/26°C). As plantasHK4 e HK38 tinham alta expressão de AtHXKl,considerando que as plantas HK37 tinham um nívelmoderado de expressão 8. O pólen foi coletado egerminado em temp. baixa (23°C) e alta (32°C). Aviabilidade do pólen foi classificada conformedescrito na figura 1;
a figura 4 demonstra os gráficos em barra ilustrando aexpressão relativa de diversos genes demetabolização do açúcar em antera e pólen detomate. LeFRK são frutoquinases, LeHXK sãohexokinases, TWl, Lin5-8 são invertases, SuSysão sintases de sacarose e LeGLT é umtransportador de glicose plastídica. A expressãode gene foi determinada por PCR em tempo realcom primers específicos de gene e foinormalizada para ciclofilina como o gene deorganização. As amostras com a letra H foramobtidas das plantas cultivadas em HTS(32°/26°C);
a figura 5 é um gráfico em barra demonstrando o efeito dePi_,eFRK4 · :AtHXKl sobre a germinação de pólen. Asplantas de tomate de controle (MP) e linhasnormais de tomate transgênico isogênicoindependente (To) expressando em excessoPLeFRK4::AtHXKl (linhas designadas de PFH 1-8)foram cultivadas em temperaturas normais(28°C/22°C - dia/noite). O pólen foi coletado egerminado em temp. baixa (23°C) e alta (32°C). Aviabilidade de pólen foi classificada conformedescrito na figura 1; ea figura 6 demonstra a seqüência de nucleotideo do promotorLeFRK4 compreendendo 2488 bp, seguido pelaseqüência de cDNA do gene LeFRK4 (bp 2489-3821).O promotor foi seqüenciado a partir das colôniasde BAG usando primers apropriados, conformeabaixo indicado.DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONFIGURAÇÕES EXEMPLARESLista de Abreviações
CaMV - Virus de mosaico da couve-flor
FrutoquinaseFrutose 6-fosfatoGlicose 6-fosfatoHexoquinase
L. esculentum hexoquinase 1,2,3 e 4L. esculentum frutoquinase 1, 2, 3 e 4Reação em Cadeia de PolimeraseSintase de SacaroseGlicose de difosfato de uridilLista de meio de crescimento
1/2 χ MSO: 2,3g/l de sais Murashige e Skoog (MS)3% de sacarose0,8% de ágarpH5, 8
Do: 4,3g/l MS de sais3% de glicoselmg/1 de zeatina0,8% de ágar
CaMV
FRK
Fru6p
Glc6P
HXK
LeHXKl,2,3,4-LeFRKl,2,3,4-PCRSuSy
UDP-glicoseρΗ5, 8
Dl: 4,3g/l de sais MS3% de glicoselmg/1 de zeatina0,8% de ágar
100mg/l de canamicina300mg/l de carbenicilinapH 5, 8
MSR: 4,3g/l de sais MS3% de sacaroselmg/1 de IBA0,8% de ágarpH5, 8
LB: IOg/1 triptona5 g/l de extrato de levedura5g/l NaCl15g/l de ágar
Primers
1 . LeHXKl fw: GGACTTGCTGGGAGAGGAGT (SEQ. ID. N°: 3) ;2 . LeHXKl rev: : AAG G TACAT T GAAT GAGAG GCA (SEQ . ID N ° : 4 ) ;3 . LeHXK2 fw: GTCCTCCCATCTTCCCTTG (SEQ. ID N0 : 5) f4 . LeHXK2 rev: : C C CAAG TACATAC CAGAACAT (SEQ. ID N0 :6) ;5. LeHXK3 fw: GCGATATTATCACCTCTCGTG (SEQ. ID N0 : 7) ;6. LeHXK3 rev: : CTGCTTCTCTCCGTCTTTAAA (SEQ. ID N0 : 8) ;7 . LeHXK4 fw: GCT GAG GACAC C T GATATAT G (SEQ. ID N0 : 9) ;8 . LeHXK4 rev: : GATCGGATTTTACCCCAGCTA (SEQ. ID N0 : 10);9. LeFRKl fw: CTCCGTTACATATCTGATCCT (SEQ. ID N0 : 11) ;10. LeFRKl rev: : GACAGCAT T GAAG T CAC CTT (SEQ. ID N0 : 12) ;11. LeFRK2 fw: TTGTTGGTGCCCTTCTAACCA (SEQ. ID N°: 13);
12. LeFRK2 rev: ACGATGTTTCTATGCTCCTCCCT (SEQ. ID N°: 14);
13. LeFRK3 fw: TTACGGAGCCATGCAAATCAG (SEQ. ID N°:15);
14. LeFRK3 rev: GCCACAATGGAAGCCCTCAATT (SEQ. IDN°: 16);
15. LeFRK4 fw: GGTGATGCATTTGTTGGTGGAC (SEQ. IDN0: 17);
16. LeFRK4 rev: GCTGTGGCACCATCCAATATTT (SEQ. IDN0: 18);
17. TTVl fw: GAAGTGGACAAAGTCGCGCTT (SEQ. IDNO:19);
18. TIVl rev: CTGGCGTTAGCTCAGATAGCGT (SEQ. IDNO:20)
19. Lin5 fw: GAACTGAGTTTCGCGATCCAACT (SEQ. ID N021)
20. Lin5 rev: TGAAGTGGATGTTGGGCTTTG (SEQ. ID N0:22)
21. Lin6 fw: ACCCAAAAGGAGCAACATGG (SEQ. ID N°:23);
22. Lin6 rev: CCTGGTAAGATTGTGGCTGACC (SEQ. ID N°: 24);
23. Lin7 fw: TTGTTTGGGCTCATTCCGTT (SEQ. ID N°: 25);
24. Lin7 rev: CCGGTGTACAAGATGACTGGCT (SEQ. IDN°:26);
25. Lin8 fw: AACCCGCAATCTATCCATCCA (SEQ. ID N°:27);
26. Lin8 rev: TCCGCTGGGATTGCATAGTTT (SEQ. IDN°:28);
27. SuSyl fw: TTCACCATGGCAAGATTGGAC (SEQ. ID N°:29);
28. SuSyl rev: TCTCTGCCTGCTCTTCCAAGTC (SEQ. IDN°:30);
29. SuSy2 fw: CATCACCAGCACATTCCAGGA (SEQ. ID N°:31);
30. SuSy2 rev: AGCTCCAGGTGAGACGATGTTG (SEQ. IDN°:32);
31. LeGT fw: GGGTTGCTGAGGTTATGAGTGATT (SEQ. ID N°:33);
32. LeGT rev: AGCTGCACCAACGCTAACAA (SEQ. ID N°:34);
33. Ciclo fw: CGTCGTGTTTGGACAAGTTG (SEQ. IDN°:35);
34. Ciclo rev: CCGCAGTCAGCAATAACCA (SEQ. IDN°:36);
35. Fk4102: ATCGAGTTTACTAGAAGAGGA (SEQ. IDNO:37);
36. Fk4128: GGTGAACATATAGAGCTCTTGCTT (SEQ. IDN°:38);
37. Fkpro656: GCATATCAAC T CTAAATCACGAAG (SEQ. IDN°:39);
38. Fkpro659: GATGCATATCAACTCTAAATCACG (SEQ. IDN°:40);39. Fkpro7 7 6: TGAAGAAGAC TAGAGGAAT TCCCT (SEQ. IDN°:41);
40. LeFRK4pro fw: AGGTTCTAGAGCTCTCCGGAAA (SEQ. ID N°:42);
41. LeFRK4pro rev: GATCGGTCAAGAATAACAGGG (SEQ. IDN°:43);
42. LeFRK4pro fw: ACCACTAGATATCCTAAGTAGTA (SEQ. ID N°:44);
43. AtHXKl fw: GCGGGAAGCAAGAGCGTGTT (SEQ. ID N°:45);
44. AtHXKl rev: CTCCTCGGGTTGCTATGATG (SEQ. IDN°:46);Exemplos
1. O efeito de HTS sobre o desenvolvimento e germinaçãode pólen
O efeito de HTS tanto nodesenvolvimento quanto na germinação de pólen é demonstradona figura 1. O pólen das plantas de tomate cultivadas emtemperaturas normais (28/22°C dia/noite) possui boaviabilidade na germinação em 23°C e viabilidademarcadamente reduzida na germinação em 320C, indicando umefeito negativo de HTS sobre a germinação do pólen. O pólendas plantas cultivadas em altas temperaturas (32/26°C)também exibiu viabilidade inferior quando germinado em23°C, indicando um efeito negativo persistente de HTS sobreo desenvolvimento de pólen.
2. Expressão em excesso de AtHXKl aprimora odesenvolvimento e germinação do pólen de tomate sob HTS
Para investigar a importânciada fosforilação de hexose na determinação da competência dopólen para germinar, a germinação de pólen foi analisadapara plantas de tomate expressando em excesso o gene dehexoquinase de Arabidopsis (AtHXKl) sob o controle dopromotor 35S de CaMV (35S::AtHXKl) 8. Embora os relatóriosanteriores reivindicassem que esse promotor somente tinhaexpressão insignificante no pólen de tomate, foi averiguadoque a montagem de 35S:: AtHXKl é expressa no pólen, emconformidade com os resultados publicados para tomate eoutras espécies de planta [Duck NB, Folk WR (1994) 0cognato de choque de calor de Hsp70 é expresso e armazenadono pólen de tomate em desenvolvimento. Biol. Mol. de Planta26: 1031-1039], bem como em anteras vazias de tomate e nagerminação de pólen em 23°C ou 32°C (Figura 2) .Considerando que o promotor 35S de CaMV é expresso em todosos órgãos de planta, a expressão de AtHXKl de Arabidopsissob esse promotor acelerou o envelhecimento de folha ecrescimento inibido 8. Não obstante, o pólen das plantas detomate expressando em excesso o AtHXKl tinha umaviabilidade significativamente mais alta quando cultivadoou germinado em altas temperaturas (320C) em correlaçãodireta com a ocorrência da expressão de AtHXKl (Figura 3).Embora as plantas HK37, HK4 e HK38 possuam menos capacidadede fotossintese, elas ainda eram capazes de criar frutosmediante o crescimento em HTS (32/28°C), diferente dasplantas de controle. Esses resultados fortemente sugeremque a fosforilação de hexose em antera e pólen pode afetaro potencial de germinação do pólen e realçar a necessidadede utilizar promotores específicos de antera e pólen para acionar a expressão de AtHXKl.
3. LeFRK4 é altamente expresso em pólen de tomate maduroou em germinação
Recentemente, um gene defrutoquinase, LeFRK4, foi clonado que é exclusivamenteexpresso em estames 6. A expressão de LeFRK4 foi analisadano desenvolvimento e germinação de pólen com relação aosoutros três genes de FRK (LeFRKl, 2 e· 3), os quatro genesconhecidos de HXK (LeHXKl-4), os 5 genes de invertase(TIV1, LIN5-8) e os dois genes de SuSy (SuSyl-2) . Foiaveriguado que o LeFRK4 é decididamente o gene maisabundantemente expresso tanto no pólen de tomate emgerminação quanto no maduro (Figura 4) . O LeFRK4 também éexpresso nos grãos de pólen em desenvolvimento e em outraspartes da antera, embora em um nível inferior (nãomostrado). O promotor LeFRK4 deve, portanto, ser um bomcandidato para acionar a expressão especifica de antera epólen.
4. Isolamento do promotor LeFRK4 e seu uso para acionar aexpressão de AtHXKl e LeFRKl
A região preferida de promotordo LeFRK4 (SEQ. ID. N°: 2) foi isolada e unida ao AtHXKl eao LeFRKl para obter montagens de PLeFRM:: AtHXKl ePLeFRK4:: LeFRKl. Para tratar a questão de quais das duasatividades de AtHXKl, fosforilação de glicose ou frutose,contribui para a resistência ao HTS, a resistência ao HTSdas plantas expressando AtHXKl ou LeFRKl sob o controle dopromotor LeFRK4 deve ser comparada. Para reduzir apossibilidade de co-supressão, o LeFRKl deve ser usado,cuja expressão normal em antera e pólen é relativamentebaixa. O LeFRKl deve ser preferido sobre o LeFRK2 e LeFRK3já que o LeFRKl, diferente das últimas enzimas (porémsemelhante ao LeFRK4), não é reprimido por frutose e talvezpudesse aperfeiçoar a fosforilação de frutose.
As montagens de PLeFRKi:: AtHXKle PLeFRKi:: LeFRKl foram usadas para gerar cerca de trintaplantas transgênicas de tomate por montagem. A análiseinicial de plantas de To expressando PLeFRK4:: AtHXKldemonstrou que as plantas transgênicas independentes exibemalta viabilidade de pólen mediante a germinação em altatemperatura (Figura 5) . Além disso, diferente da inibiçãode crescimento observada com as plantas de HK (plantasexpressando AtHXKl sob o promotor 35S de CaMV) , as plantasexpressando PLeFRK4:: AtHXKl exibiram crescimento edesenvolvimento totalmente normais (não mostrado).LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Estado de Israel, Ministério da Agricultura e Desenvolvimento
Rural, Organização de Pesquisa Agrícola (A.R.O.), Centro Volcani
<120> PROMOTOR DE GENE DE PLANTA E SEU USO
<130> 173795-6
<140> PCT/IL2 007/0004 07
<141> 2007-03-28
<150> US60/790.777
<151> 11-04-2006
<160> 47
<170> PatentIn versão 3.1<210> 1<211> 2488<212> DNA
<213> Lycopersicon esculentum<22 0>
<221> misc_feature<222> (101)..(101)
<223> "n" pode ser A, ou C, ou G, ou T<400> 1
tatatcttaa tttatgaagt taattatttt aaattgttta aactcgagaa gctcgctaat 60
taattactat cgaggaaggg cacaaattgg atgttaacac nctccaaaag tcatctaatt 120aatagataca tagttatatt ggaagttctt atcactttgg aagcacctaa acatgaatcc 180atttaatagt ggataaatct aatggataat ctacatatac tatacaattg attcactaac 240actttcgaca taaaatgtaa agtttatctt aagagaggaa tagcatattc ctctagtttc 300ttatttattt aattatagct aataatattt tcttgacatt ttctgtaaga tttatcttaa 360ctgtatcttc ctctagtttc ttatttaatt agttatagct aataatattc tctcagcata 420aaatgtaaga tttatcttaa caaagtcttc ctttaatttc ttatttgatt aattataact 480aataaaattc tctccatata aaatataaga tttatcttcc tttagtttct tacttaatta 540
caattatagc taatattatt ctctcggcat aaaatgtaag atttacctta acaacatctt 600
ctcctaattt cttatttagt taattatata gctaataata ttctctcggc ataaaattac 660
tagattttaa aatgtaaata gaatttgctt taaaagttta aatcattaac actcctattt 720
tttggtgatg aaatttcaaa acagctaagt gtcacggacc tagagaatct attaagactc 780
cgtgtgacac ttgacaactt actcacgatt ctttcacgat cttgtaagct caagtaaacc 840
tttatgactc ggaacactaa gagaatgcaa agaaagactt agaaagggca aagagaactt 900
tagaagaagg aaccttgtat tactacttta cttggttgga tttggttgga ttcttggatt 960
ggatgagtta caaatgaatg tccctcctat ttatactaca tcctaagggc cttagtgtaa 1020
ataaaattta ctatacaagt tcttctactt actacgcttt agtccatatt ctagagaatt 1080
ctacattgtc tagaatatgc taaagtcttc tacaaagctc taaagtattc tagagaattc 1140
tagggaattc tctagtcttc ttcacaaaac tagaaggttc tagagctctc cggaaacctc 1200
ttcaagactc tagctcctcc tcccccattc gaacgtaaaa tctggctgga attgtggcgg 1260
gacgtcacat aagactagaa atataatcag attctttagt tattgttttc ttaagtacga 1320
ttgatatcta tatgttagaa ggagcaaaga ggcaagcgag attgaacatg aaggaaagag 1380
gctagcgata tttggaaaga gaaacattaa catgttatgg ttaataaata ttaatacgtt 1440
atatagttaa aaacgtgtat taggtctaaa atattaacac attatggcta tacttccttt 1500
cagttgcttt atattatcct tttttctctc ttcaacgata gcaaacacta actcgctatc 1560
tctttttttc cttaccgttt cttttcgcga ttttcacttc gttcacttag atgcaaaaat 1620
atttatcctc tcaggatagt tttcgattaa aatacgatgg tggttaatat ttatttcgat 1680
tgttcatttc tcagatatga ttttgcatat attttcttgg aagaatttta cgagaagatg 1740
aaagatggtg aaagcaatga tcaccgttga atatgatatt ctgtttttag tacttctcca 1800
cttatacatt gtgtaattag tgtaatgatt gtataattac aacatataca ccatgtatac 1860
acttgggaat gaaagattat agaggatata attggtactg aaatattttt ttcaaaaaag 1920
ggatgatata atttctctac ttcgtgattt agagttgata tgcatcttta tatatatata 1980
tatatatata tataaaagat tgcatatacg agtatgcccc taatgttata cctttttcag 2040
ttgacgaata gagtaaaaaa aataacctta aatttacttt ttactaaaaa gtatgtttga 2100
tcctttaaaa gtttaggaat atattcacta gtaatctttt atagtttgac aaacttaact 2160agagatctat agttattgct tgattacgct tgattaggaa ttatagctat atgttttggg 2220
aggccaattt tgtccaactt ataacatcca aatatatatg gatataaaaa aaataataga 2280
aaaattagga cagtaatggc aagtgttagg ctcataaaaa tataatccgt ccaatcgaac 2340
cggtcatttt gctttgtaga ataaatattt gtggtaaaaa tttgaaaaac cactagatat 2400
cctaagtagt agggttaaat tttgattata tatagaatga ataacataaa aatcaaattt 2460
tcattgcttg cttttcttat atttttat 2488<210> 2<211> 1313<212> DNA<213> Lycopersicon esculentum<400> 2
ggttctagag ctctccggaa acctcttcaa gactctagct cctcctcccc cattcgaacg 60
taaaatctgg ctggaattgt ggcgggacgt cacataagac tagaaatata atcagattct 120
ttagttattg ttttcttaag tacgattgat atctatatgt tagaaggagc aaagaggcaa 180
gcgagattga acatgaagga aagaggctag cgatatttgg aaagagaaac attaacatgt 240
tatggttaat aaatattaat acgttatata gttaaaaacg tgtattaggt ctaaaatatt 300
aacacattat ggctatactt cctttcagtt gctttatatt atcctttttt ctctcttcaa 360
cgatagcaaa cactaactcg ctatctcttt ttttccttac cgtttctttt cgcgattttc 420
acttcgttca cttagatgca aaaatattta tcctctcagg atagttttcg attaaaatac 480
gatggtggtt aatatttatt tcgattgttc atttctcaga tatgattttg catatatttt 540
cttggaagaa ttttacgaga agatgaaaga tggtgaaagc aatgatcacc gttgaatatg 600
atattctgtt tttagtactt ctccacttat acattgtgta attagtgtaa tgattgtata 660
attacaacat atacaccatg tatacacttg ggaatgaaag attatagagg atataattgg 720
tactgaaata tttttttcaa aaaagggatg atataatttc tctacttcgt gatttagagt 780
tgatatgcat ctttatatat atatatatat atatatataa aagattgcat atacgagtat 840
gcccctaatg ttataccttt ttcagttgac gaatagagta aaaaaaataa ccttaaattt 900
actttttact aaaaagtatg tttgatcctt taaaagttta ggaatatatt cactagtaat 960
cttttatagt ttgacaaact taactagaga tctatagtta ttgcttgatt acgcttgatt 1020aggaattata gctatatgtt ttgggaggcc aattttgtcc aacttataac atccaaatat 1080atatggatat aaaaaaaata atagaaaaat taggacagta atggcaagtg ttaggctcat 1140aaaaatataa tccgtccaat cgaaccggtc attttgcttt gtagaataaa tatttgtggt 1200aaaaatttga aaaaccacta gatatcctaa gtagtagggt taaattttga ttatatatag 1260aatgaataac ataaaaatca aattttcatt gcttgctttt cttatatttt tat 1313
<210> 3<211> 20<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<22 0>
<223> Primer antecipado LeHXKl<4 00> 3
ggacttgctg ggagaggagt 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<22 0>
<223> Primer reverso LeHXKl
<400> 4
aaggtacatt gaatgagagg ca 22
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<22 0>
<223> Primer adiantado LeHXK2
<400> 5gtcctcccat cttcccttg<210> 6<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer reverso LeHXK2<400> 6
cccaagtaca taccagaaca t<210> 7<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer LeHXK3 antecipado<400> 7
gcgatattat cacctctcgt g<210> 8<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer reverso LeHXK3<400> 8
ctgcttctct ccgtctttaa a<210> 9<211> 21<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer antecipado LeHXK4<400> 9
gctgaggaca cctgatatat g
<210> 10<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer reverso LeHXK4<400> 10
gatcggattt taccccagct a<210> 11<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<22 0>
<223> Primer antecipado LeFRKl<400> 11
ctccgttaca tatctgatcc t<210> 12<211> 20<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer reverso LeFRKl<400> 12gacagcattg aagtcacctt<210> 13<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<22 0>
<223> Primer antecipado LeFRK2<400> 13
ttgttggtgc ccttctaacc a<210> 14<211> 23<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer reverso LeFRK2<400> 14
acgatgtttc tatgctcctc cct<210> 15<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer antecipado LeFRK3<400> 15
ttacggagcc atgcaaatca g<210> 16<211> 22<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer reverso LeFRK3<400> 16
gccacaatgg aagccctcaa tt<210> 17<211> 22<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer antecipado LeFRK4<400> 17
ggtgatgcat ttgttggtgg ac<210> 18<211> 22<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer reverso LeFRK4<400> 18
gctgtggcac catccaatat tt<210> 19<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer antecipado TIVl<400> 19gaagtggaca aagtcgcgct t 21
<210> 20<211> 22<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer reverso TIVl<400> 20
ctggcgttag ctcagatagc gt 22
<210> 21<211> 23<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer antecipado Lin5<400> 21
gaactgagtt tcgcgatcca act 23
<210> 22<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer reverso Lin5<400> 22
tgaagtggat gttgggcttt g 21
<210> 23<211> 20<212> DNA<213> Seqüência Artificial<22 0>
<223> Primer antecipado Lin6
<400> 23
acccaaaagg agcaacatgg
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer reverso Lin6
<400> 24
cctggtaaga ttgtggctga cc
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer antecipado Lin7
<400> 25
ttgtttgggc tcattccgtt
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer reverso Lin7
<400> 26ccggtgtaca agatgactgg ct 22
<210> 27<211> 21<212> DNA<213> Seqüência Artificial<22 0>
<223> Primer antecipado Lin8<400> 27
aacccgcaat ctatccatcc a 21
<210> 28<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer reverso Lin8<400> 28
tccgctggga ttgcatagtt t 21
<210> 29<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer antecipado SuSyl<400> 29
ttcaccatgg caagattgga c 21
<210> 30<211> 22<212> DNA<213> Seqüência Artificial<22 0>
<223> Primer reverso SuSyl<400> 30
tctctgcctg ctcttccaag tc 22
<210> 31<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Primer antecipado SuSy2<4 00> 31
catcaccagc acattccagg a 21
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<22 0>
<223> Primer reverso SuSy2
<400> 32
agctccaggt gagacgatgt tg 22
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer antecipado LeGT
<4 00> 33gggttgctga ggttatgagt gatt 24
<210> 34<211> 20<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer reverso LeGT<400> 34
agctgcacca acgctaacaa 20
<210> 35<211> 20<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer antecipado de ciclo<400> 35
cgtcgtgttt ggacaagttg 20
<210> 36<211> 19<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer reverso de ciclo<400> 36
ccgcagtcag caataacca 19
<210> 37<211> 21<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer Fk4102
<400> 37
atcgagttta ctagaagagg a 21
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer Fk4128
<400> 38
ggtgaacata tagagctctt gctt 24
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer Fkpro656
<400> 39
gcatatcaac tctaaatcac gaag 24
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer Fkpro659
<400> 40gatgcatatc aactctaaat cacg 24
<210> 41<211> 24<212> DNA<213> Seqüência Artificial<22 0>
<223> Primer Fkpro776<4 00> 41
tgaagaagac tagaggaatt ccct 24
<210> 42<211> 22<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<22 0>
<223> Primer antecipado LeFRK4pro<4 00> 42
aggttctaga gctctccgga aa 22
<210> 43<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer reverso LeFRK4pro<400> 43
gatcggtcaa gaataacagg g 21
<210> 44<211> 23<212> DNA<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer antecipado LeFRK4p
<400> 44
accactagat atcctaagta gta
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer antecipado AtHXKl
<400> 45
gcgggaagca agagcgtgtt
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer reverso AtHXKl
<400> 46
ctcctcgggt tgctatgatg
<210> 47
<211> 3821
<212> DNA
<213> Lycopersicon esculentum<220>
<221> misc_feature
<222> (101)..(101)<223> "η" pode ser Α, ou C, ou Τ, ou G<4 00> 47
tatatcttaa tttatgaagt taattatttt aaattgttta aactcgagaa gctcgctaat 60
taattactat cgaggaaggg cacaaattgg atgttaacac nctccaaaag tcatctaatt 120
aatagataca tagttatatt ggaagttctt atcactttgg aagcacctaa acatgaatcc 180
atttaatagt ggataaatct aatggataat ctacatatac tatacaattg attcactaac 240
actttcgaca taaaatgtaa agtttatctt aagagaggaa tagcatattc ctctagtttc 300
ttatttattt aattatagct aataatattt tcttgacatt ttctgtaaga tttatcttaa 360
ctgtatcttc ctctagtttc ttatttaatt agttatagct aataatattc tctcagcata 420
aaatgtaaga tttatcttaa caaagtcttc ctttaatttc ttatttgatt aattataact 480
ataaaattc tctccatata aaatataaga tttatcttcc tttagtttct tacttaatta 540
caattatagc taatattatt ctctcggcat aaaatgtaag atttacctta acaacatctt 600
ctcctaattt cttatttagt taattatata gctaataata ttctctcggc ataaaattac 660
tagattttaa aatgtaaata gaatttgctt taaaagttta aatcattaac actcctattt 720
tttggtgatg aaatttcaaa acagctaagt gtcacggacc tagagaatct attaagactc 780
cgtgtgacac ttgacaactt actcacgatt ctttcacgat cttgtaagct caagtaaacc 840
tttatgactc ggaacactaa gagaatgcaa agaaagactt agaaagggca aagagaactt 900
tagaagaagg aaccttgtat tactacttta cttggttgga tttggttgga ttcttggatt 960
ggatgagtta caaatgaatg tccctcctat ttatactaca tcctaagggc cttagtgtaa 1020
ataaaattta ctatacaagt tcttctactt actacgcttt agtccatatt ctagagaatt 1080
ctacattgtc tagaatatgc taaagtcttc tacaaagctc taaagtattc tagagaattc 1140
tagggaattc tctagtcttc ttcacaaaac tagaaggttc tagagctctc cggaaacctc 1200
ttcaagactc tagctcctcc tcccccattc gaacgtaaaa tctggctgga attgtggcgg 1260
gacgtcacat aagactagaa atataatcag attctttagt tattgttttc ttaagtacga 1320
ttgatatcta tatgttagaa ggagcaaaga ggcaagcgag attgaacatg aaggaaagag 1380
gctagcgata tttggaaaga gaaacattaa catgttatgg ttaataaata ttaatacgtt 1440
atatagttaa aaacgtgtat taggtctaaa atattaacac attatggcta tacttccttt 1500
cagttgcttt atattatcct tttttctctc ttcaacgata gcaaacacta actcgctatc 1560tctttttttc cttaccgttt cttttcgcga ttttcacttc gttcacttag atgcaaaaat 1620
atttatcctc tcaggatagt tttcgattaa aatacgatgg tggttaatat ttatttcgat 1680
tgttcatttc tcagatatga ttttgcatat attttcttgg aagaatttta cgagaagatg 1740
aaagatggtg aaagcaatga tcaccgttga atatgatatt ctgtttttag tacttctcca 1800
cttatacatt gtgtaattag tgtaatgatt gtataattac aacatataca ccatgtatac 1860
acttgggaat gaaagattat agaggatata attggtactg aaatattttt ttcaaaaaag 1920
ggatgatata atttctctac ttcgtgattt agagttgata tgcatcttta tatatatata 1980
tatatatata tataaaagat tgcatatacg agtatgcccc taatgttata cctttttcag 2040
ttgacgaata gagtaaaaaa aataacctta aatttacttt ttactaaaaa gtatgtttga 2100
tcctttaaaa gtttaggaat atattcacta gtaatctttt atagtttgac aaacttaact 2160
agagatctat agttattgct tgattacgct tgattaggaa ttatagctat atgttttggg 2220
aggccaattt tgtccaactt ataacatcca aatatatatg gatataaaaa aaataataga 2280
aaaattagga cagtaatggc aagtgttagg ctcataaaaa tataatccgt ccaatcgaac 2340
cggtcatttt gctttgtaga ataaatattt gtggtaaaaa tttgaaaaac cactagata 2400
cctaagtagt agggttaaat tttgattata tatagaatga ataacataaa aatcaaattt 2460
tcattgcttg cttttcttat atttttatat gtaaaaaata aaatggatcg gtcaagtaaa 2520
aaagagtgga aaatggcctg ttgtttccct gttattcttg accgatccat gagaagcagc 2580
ttcaagctat ctaagagctc ctcttctagt aaactcgata aaagcaagag ctctatatgt 2640
tcaccaacat ccttatcgac gaagaagaag tcgatccagg aaaatgataa cctggttgta 2700
tgttttgggg agctgttgat agattttgtg cctacagtat ctggagtttc acttgcagaa 2760
gcacctggtt ttaaaaaggc tcctggtggg gctccagcta atgttgcagt tggtattgca 2820
agattaggtg gatcttccgc ttttattggc aaggtgggtg cagatgaatt tggttacatg 2880
ttagctgata tattaaaaca gaacaatgtc gacaattctg gtatgcgttt tgatactcat 2940
gctagaacag cgttggcgtt tgttacattg aaatcagacg gtgagagaga attcatgttt 3000
ttccgcaatc caagtgctga tatgcttcta actgaggcag agctcgacaa gaatctcatt 3060
caaaaggcaa gaatctttca ctatggttca atctctttga ttgctgaacc atgtaggtca 3120
gctcatcttg ctgccatgga aactgctaaa aatgcaggct gcattctttc ttatgaccca 3180
aatctaaggt tgcctttatg gccatccgaa gaggctgctc gtgaaggaat tttaagcatt 3240tgggaccaag ctgacattat taaggtaagt gaagatgaaa tcacattttt gacaaatggt 3300
gaagatgctt atgatgacaa tgtcgtcatg actaagcttt tccactccaa ccttaaactt 3360
ttgctcgtaa ctgaaggcgg agacggttgc agatactata ctaataattt tcatggaaga 3420
gtgagtggcg ttaaagttgc agcagttgac accacaggag caggtgatgc atttgttggt 3480
ggacttctca acagtatggc ctcagatcca gacatttaca tggatgagaa gaaattaagg 3540
gatgcactcc tatttgctaa tggatgtgga gcaataactg taacagaaaa aggagcaata 3600
cctgcattgc ctacaaaaga agcagtactt aaaatattgg atggtgccac agctaattga 3660
tcaaattata catgccctca taaaaatatg atacattgca ccacttatgt aaaataaatt 3720
ttgtggaata ttttagtcta taatattatt gctatcccct gtacaaaatc atgtggatat 3780
aattcctttt taaacatttt attttatata atatataata t 3821
Claims (16)
1. "PROMOTOR DE GENE DE PLANTAE SEU USO", compreendendo uma seqüência isolada depolinucleotideo que prevê um dos seguintes: (a) o promotorLeFRK4; e (b) um promotor modificado LeFRK4 em que uma oumais bases de nucleotideo foram substituídas ou excluídas,ou uma ou mais bases de nucleotideo foram lá adicionadas,caracterizada pelo fato de que a atividade específica depromotor do promotor modificado é substancialmente a mesmaque a do promotor LeFRK4.
2. "PROMOTOR DE GENE DE PLANTAE SEU USO", compreendendo um vetor que é caracterizado porcontar com a seqüência de polinucleotideo da reivindicação 1.
3. "PROMOTOR DE GENE DE PLANTAE SEU USO", compreendendo um vetor, segundo o reivindicadoem 2, caracterizado pelo fato de que a seqüência depolinucleotideo da reivindicação 1 é ligada de formaoperável a um gene heterólogo.
4. "PROMOTOR DE GENE DE PLANTAE SEU USO", compreendendo o vetor da reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que o referido gene heterólogocodifica uma proteína envolvida no metabolismo do açúcar.
5. "PROMOTOR DE GENE DE PLANTAE SEU USO", compreendendo o vetor da reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que o referido gene heterólogocodifica um invertase, uma sintase de sacarose, umtransportador de glicose ou uma quinase de açúcar.
6. "PROMOTOR DE GENE DE PLANTAE SEU USO", compreendendo o vetor da reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que a referida quinase de açúcaré uma hexoquinase, uma frutoquinase, uma fucoquinase ou umagalactoquinase.
7. "PROMOTOR DE GENE DE PLANTAE SEU USO", compreendendo uma célula hospedeira,caracterizada por contar com o vetor de quaisquer dasreivindicações 2-6.
8. "PROMOTOR DE GENE DE PLANTAE SEU USO", compreendendo uma planta transgênica que écaracterizada por contar com a célula hospedeira dareivindicação 7.
9. "PROMOTOR DE GENE DE PLANTAE SEU USO", compreendendo um método para proteger umaplanta do stress de alta temperatura (HTS), prevendo atransformação da planta com uma seqüência depolinucleotideo, caracterizado pelo fato de que a referidaseqüência de polinucleotideo compreende uma seqüência denucleotideo codificando uma quinase de açúcar sob ocontrole de um promotor especifico de antera e/ou pólen,assim produzindo uma planta transformada tendo tolerânciaaprimorada ao HTS.
10. "PROMOTOR DE GENE DEPLANTA E SEU USO", compreendendo o método da reivindicação-9, caracterizado pelo fato de que a referida quinase deaçúcar é uma hexoquinase, uma fucoquinase, umagalactoquinase ou uma frutoquinase.
11. "PROMOTOR DE GENE DEPLANTA E SEU USO", compreendendo o método dasreivindicações 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que oreferido promotor especifico de antera e/ou pólen é opromotor LeFRK4.
12. "PROMOTOR DE GENE DEPLANTA E SEU USO", compreendendo o método dasreivindicações 9, 10 e 11, caracterizado pelo fato de que areferida planta é selecionada a partir das plantassuscetíveis ao HTS.
13. "PROMOTOR DE GENE DEPLANTA E SEU USO", compreendendo o método da reivindicação-12, caracterizado pelo fato de que as referidas plantas sãoselecionadas a partir de tomate, pepino, pimentas,abobrinha, milho, algodão, linho, trigo, arroz, berinjela,melão e Brassica.
14. "PROMOTOR DE GENE DEPLANTA E SEU USO", compreendendo um método para provocar aesterilidade masculina em uma planta, que prevê atransformação da planta com uma seqüência depolinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que a referidaseqüência de polinucleotídeo compreende uma seqüência denucleotídeo capaz de romper o desenvolvimento de pólen ouantera sob o controle de um promotor específico de anterae/ou pólen, assim provocando a esterilidade masculina.
15. "PROMOTOR DE GENE DEPLANTA E SEU USO", compreendendo o método da reivindicação-14, caracterizado pelo fato de que a referida seqüência depolinucleotídeo codifica um RNAse, protease ou toxina.
16. "PROMOTOR DE GENE DEPLANTA E SEU USO", compreendendo o método dasreivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que oreferido promotor especifico de antera e/ou pólen é opromotor LeFRK4.
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