BRPI0709540A2 - método para produzir terpenos e, portanto, microorganismos transformados por mep - Google Patents

Abstract

<B>MéTODO PARA PRODUZIR TERPENOS E, PORTANTO, MICROORGANISMOS TRANSFORMADOS POR MEP<D>. A presente invenção se relaciona com um microorganismo capaz de produzir um terreno de escolha. O microorganismo expressa uma via heteróloga para a formação de unidades de isoprene e, preferivelmente, uma terpeno sintase heteróloga. Desta forma, altas quantidades de terpeno podem ser isoladas a partir do meio do microorganismo.

Description

MÉTODO PARA PRODUZIR TERPENOS E, PORTANTO, MICROORGANISMOS

TRANSFORMADOS POR MEP

Campo técnico

O presente invento relaciona-se com os microorganismos que têm uma via heteróloga para produzir isopentenil-difosfato e/ou dimetilalil-difosfato, e com ummétodo para acumular um terpenóide em uma célula e/ou em um meio.Arte de fundamento

Os isoprenóides (também conhecidos como terpenóides ou terpenos) são umgrupo grande, diverso, de produtos naturais complexos com considerável interessecomercial. Os isoprenóides são, hoje na maior parte, extraídos de plantas ouquimicamente sintetizados para serem usados como produtos farmacêuticos (porexemplo, taxol, bisabolol, licopeno, artemisinina), suplementos alimentares paraanimais e corantes (vários carotenóides) ou sabores e fragrâncias alimentícios (porexemplo; mentol, patchoulol, nootkatona). Os isoprenóides são construídos a partir de unidades de isopreno (2-metil-1,3-butadieno), e o precursor biológico para todosos isoprenóides naturais é o isopentenil difosfato (IPP). Os isoprenóidesdesempenham importantes papéis nas células vivas, tais como regulação hormonal(esteróis), fotossíntese (carotenóides e outros), somente para mencionar alguns.Nas células vivas, o IPP pode ser gerado através da via dependente de mevalonato(doravante MEV) ou independente de mevalonato ou via de MEP, as quais são duasvias distintas. A maioria dos organismos conta exclusivamente com uma das viaspara geração de compostos isoprenóides, mas as plantas e alguns microorganismostêm ambas as vias. O precursor para síntese de IPP através da via do MEV é aacetil-CoA, a qual é sintetizada no metabolismo central de carbono. Os percursores para a síntese de IPP através da via do MEP são os intermediários glicolíticosgliceraldeído-3-fostato (GAP) e piruvato (PYR), os quais são sintetizados nometabolismo central de carbono. Tanto a via do mevalonato quanto a via do MEPproduzem dimetilalil difosfato (DMAPP) e IPP1 e as etapas da reação após o IPPproduzir geranil difosfato (GPP)1 farnesil difosfato (FPP) e geranilgeranil difosfato(GGPP) são as mesmas nas células que usam a via do mevalonato, a via do MEPou ambos. É a partir desses intermediários que os vários compostos isoprenóides nanatureza são produzidos.

A indústria química, que produz moléculas orgânicas através dos processosquímicos tradicionais, está progressivamente se voltando para os processos deprodução que utilizam fábricas de células microbianas. Os determinantes para essedesenvolvimento em direção à química verde são aqueles chamados "processosbiotecnológicos" são mais ambientalmente amigáveis, que muitos compostosproduzidos por microorganismos são tão complexos para serem obtidos por sínteseorgânica e que a fábrica de células microbianas representa um fornecimentoilimitado do composto em particular. Atualmente, os isoprenóides são produzidos emlarga escala através da extração de plantas ou por síntese química. A principaldesvantagem de ambos os métodos são os baixos rendimentos e os altos custos.Uma terceira opção é produzir os isoprenóides desejados através da conversãoenzimática in vitro, mas esta abordagem está limitada pela disponibilidade deprecursores e, portanto, na maioria dos casos, não é economicamente viável.

A engenharia metabólica de microorganismos para produção de isoprenóidespode levar à produção de grandes quantidades de isoprenóides a partir de fontesbaratas de carbono em processos de fermentação e, a partir disso, resolver muitosdos atuais problemas na produção industrial de isoprenóides (Maury et al., 2005,Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 100:19), no momento em que se leva em conta aexploração biotecnológica da grande diversidade encontrada no grupo isoprenóidedos compostos naturais.

Inúmeros produtos isoprenóides têm sido produzidos por microorganismosgeneticamente engenheirados, incluindo Iimoneno (Carter et al., 2003, Phytochem.

64:425), carotenóides (Kajiwara et al, 1997, Biochem. J. 324: 421), epicedrol(Jackson et al, 2003, Org. Iett 5: 1629), taxadieno (Huang et al, 2001, Biorg. Med.Chem 9: 2237) e outros. Com o objetivo de ampliar a produção de isoprenóides emE. coli, os genes dxs (codificando DXP sintase), dxr (DXP redutoisomerase) e idi(IPP isomerase) têm sido superexpressa com bons resultados para vários dosprodutos isoprenóides acima mencionados (revisado em Maury et al., 2005). Umaumento maior na produção de amorfadieno por E. coli tem sido obtido expressandoa via do mevalonato a partir de S. cerevisiae em uma cepa de E. coli produtora deamorfadieno (Martin et al., 2003, Nat. Biotechnol. 21:796). Alguns compostosisoprenóides têm sido produzidos em leveduras, incluindo epicedrol em S. cerevisiae(Jackson et al., 2003, Org. Lett. 5:1629), Iicopeno e beta-caroteno em S. cerevisiae(Yamano et al., 1994, Biosci. Biotechnol. Biochem. 58:1112) e em Candida utilis(Miura et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64:1226). Em vários casos, demonstrou-se que a produção de isoprenóides em levedura foi ampliada pela superexpressãode HMG1 (codificando HMG-CoA redutase) (revisto em Maury et al., 2005).

Apesar do fundamento descrito acima, ainda há necessidade de processosadicionais para produzir terpenos e terpenóides e, em particular, de modos paraacumular terpenos em microorganismos com rendimentos mais altos e de maneiramenos custosa e levando menos tempo que nos métodos anteriormente conhecidos.Portanto, é um objetivo da presente invenção fornecer um método para produzirterpenos ou terpenóides que atendam a esta necessidade.É um objetivo adicional da presente invenção, resolver o problema dofornecimento de quantidades suficientes de precursores do terpeno em umorganismo, de forma que se amplie o acúmulo de terpenos no organismo.

É um objetivo particular da presente invenção, produzir um microorganismoque acumule e/ou secrete altas quantidades de terpenos para o meio circundante. Aprodução de terpenos por um tal microorganismo é preferivelmente estável ao longodo tempo.

Ainda um objetivo adicional subjacente à presente invenção é fornecer umaplataforma biológica para a produção de terpenos que seja capaz de produzirqualquer terpeno de escolha do fabricante. Tal sistema único permitiria, aprincípio, a produção de um terpeno específico a cada vez, mas poderia serfacilmente modificado para produzir um outro terpeno ou uma mistura de terpenos. Omesmo sistema poderia ser usado, claro, para produzir diferentes terpenosindependentemente. Além disso, tal plataforma também poderia permitir a produçãode compostos derivados de terpeno que sejam úteis para a indústria de flavorizantese fragrâncias. Um exemplo particular que não é Iimitante da invenção é a produçãode nootkatona a partir do valenceno.

Além do mais, a plataforma de produção biológica para terpenos da invençãopreferivelmente tem alta capacidade de produção e está livre de endotoxinas e detodos os problemas associados a elas.

Um objetivo adicional da presente invenção é fornecer uma plataforma deprodução biológica altamente capaz de acumular altos níveis de compostoslipofílicos, mesmo em um meio geralmente aquoso onde tais compostos, ou seusprecursores, não são normalmente solúveis.Divulgação da invenção

Notadamente, os presentes inventores transformaram, com sucesso eestavelmente, um microorganismo com uma via do MEP heteróloga. Omicroorganismo não possui uma via do MEP para a produção de terpenos em seuestado natural e é engenheirado para adquirir tal via. O microorganismo exibe altaprodução de um composto terpeno de escolha durante o cultivo do microorganismoem um meio adequado. Surpreendentemente, o microorganismo transformado écapaz de produzir quantidades aumentadas de qualquer terpeno selecionadoquando comparado com sua capacidade, antes de tal transformação, de produzir odito terpeno.

Conseqüentemente, em um primeiro aspecto, a presente invenção forneceum microorganismo eucariótico que tem uma via do MEP heteróloga para converter1-deoxi-D-xilulose 5-fosfato (DXP) em isopentenil difosfato (IPP) e/ou dimetilalildifosfato (DMAPP).

O termo "via metabólica heteróloga" é definido neste documento como umavia metabólica que é introduzida no microorganismo do tipo selvagem para produziro microorganismo recombinante, um metabolismo que não estava presente nogenoma natural do microorganismo do tipo selvagem, isto é, que não era "nativo"àquele microorganismo naturalmente.

O microorganism preferido da invenção é um fungo, mais particularmente umalevedura do gênero Saccharomyces.

A arte anterior é omissa quanto à transformação de um microorganismoconforme presentemente declarado. Os fungos e leveduras presentes na naturezasão desprovidos da via do MEP para a produção de terpenos. Eles produzemterpenos através de uma via dependente do mevalonato, a qual não usa 1-deoxi-D-xilulose 5 fosfato (DXP) como precursor de IPP e/ou DMAPP.

A introdução de uma via dependente do mevalonato em uma bactéria, a qualpode ou não possuir uma naturalmente, tem sido descrita por K. Reiling et al. no WO2005/033287 A1. Estes autores também sugerem geralmente a possibilidade demodificar as células de levedura para integrar nestas as enzimas da via do DXP.

Este documento é, entretanto, inteiramente omisso quanto à maneira pela qual taltransformação pode ser alcançada e, portanto, não fornece nenhum ensinamento útilpara chegar à presente invenção. De fato, sem ensinamento específico da maneirapela qual tal transformação é alcançada, é impossível prever o resultado de taltentativa. A via do MEP envolve um grande número de enzimas, cada umaespecífica para apenas um substrato em particular, e a introdução de todas asenzimas juntas, de uma maneira estável, de modo a fornecer um microorganismorecombinante capaz de produzir quantidades aumentadas de IPP e/ou DMAPP e,assim, quantidades aumentadas dos terpenos desejados, é muito difícil de alcançar.Os presentes inventores fornecem neste documento uma solução surpreendentepara esse problema.

No WO 00/01649 A1, J. Millis et al. sugerem que é possível introduzir, emcepas de Saccharomyces cerevisiae, duas enzimas da via do MEP de E. coli, osgenes dxs e dxr. Novamente, não há nenhuma descrição específica da maneira pelaqual isto pode ser alcançado, e há até uma afirmação desconcertante para o efeitode que o precursor de MEP possivelmente obtido de tal transformação pode, então,ser mais metabolizado pelo microorganismo engenheirado via enzimas endógenas.Sabe-se, ainda, que Saccharomyees cerevisiae não possui tais enzimas endógenase, sem uma orientação específica para esse efeito, é aparente o que os autorestinham em mente. É claro, entretanto, que nenhuma transformação assim foirealizada e não é aparente como seria possível realizar da maneira sugerida.

Outra arte anterior representada, por exemplo, pelos documentos WO02/18617 A2 e WO 02/083720 A2, ensinou como transformar microorganismos quecompreendem uma via do MEP nativa para a produção de terpenos, masconcentrando-se na ampliação ou transformação da via nativa do MEP através dasuperexpressão de algumas das enzimas envolvidas ou outros métodos, tornandopossível ampliar a via nativa com o objetivo de aumentar a produção de terpenos oucarotenóides.

Até onde conhecemos, portanto, nunca foi ensinado na arte anterior que ummicroorganismo eucariótico tenha sido transformado como está presentementereivindicado.

A presente invenção também fornece um método para acumular umterpenóide na célula e/ou meio de um microorganismo, o método que compreende aetapa de engenheirar o microorganismo para englobar uma via heteróloga paraproduzir IPP e/ou DMAPP.

Ainda em um aspecto, a presente invenção fornece um método para produzirum terpenóide, o método que abrange a etapa de cultivar o microorganismo dainvenção em um meio que leva à produção do dito terpenóide, e isolar o terpenóidea partir do meio e/ou do microorganismo.

A presente invenção ainda fornece um método para preparar ummicroorganismo capaz de acumular e/ou produzir um terpeno, o método queabrange uma etapa de transformar um microorganismo naturalmente desprovido deuma via do MEP para a produção de terpenos, com genes de uma via do MEPheteróloga e pelo menos um gene codificando uma terpeno sintase.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de aumentar aquantidade de precursores de terpenóide em um microorganismo, o método queabrange uma etapa de transformar um microorganismo naturalmente desprovido deuma via do MEP para a produção de terpenos com genes de uma via do MEPheteróloga.

A presente invenção ainda se relaciona com um plasmídeo.

Conseqüentemente, a presente invenção fornece um plasmídeo que abrange pelomenos três genes da via do MEP. A invenção fornece, além disso, um plasmídeoque engloba pelo menos três genes da via do MEP e uma terpeno sintase.Seguindo as materializações preferidas, a invenção fornece um plasmídeo composto de quatro enzimas da via do MEP. Ainda em aspectos específicos da invenção, sãofornecidos dois plasmídeos, um plasmídeo composto de quatro genes da via doMEP, a saber, a partir de E. coli, e o outro plasmídeo composto de três genes da viado MEP e uma terpeno sintase.

A invenção ainda se relaciona com os métodos de uso de tais plasmídios paratransformar um microorganismo eucariótico desprovido de uma via do MEP nativa. Otermo "nativa" é usado aqui para se referir à via do MEP que está presente nomicroorganismo conforme encontrado na natureza.

Breve descrição dos desenhos

A Figura 1 apresenta a via do MEP de E. coli para a síntese de IPP e DMPP. 1: D-gliceraldeído 3-fosfato, 2: piruvato, 3: 1-deoxi-D-xilulose 5-fosfato (DXP), 4: 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato (MEP), 5: 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol (CDP-ME)1 6: 2fosfo-4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol (CDP-ME2P), 7: 2-C-metil-D-eritritol 2,4ciclodifosfato (MECDP), 8: 1 hidroxi-2-metil-2-(E)-butenil 4-difosfato (HMBPP), 9:isopentenil difosfato (IPP), 10: dimetilalil difosfato (DMAPP).

As enzimas codificadas pelos diferentes genes são: dxs: DXP sintase, dxr.DXP redutoisomerase, ispD: MEP citidililtransferase, ispE: CDP-ME quinase, ispF:MECDP sintase, gcpE: MECDP redutase, IytB: HMBPP redutase, idi: IPP isomerase.

A Figura 2 mostra dois plasmídios plP001 e plP002, cada plasmídiocomposto por quatro seqüências de heterólogas de vias de terpeno. Em particular,plP001 compreende quatro genes da via do MEP de E. coli (dxs, dxr, ispD, ispE) eplP002 compreende três genes da via do MEP (ispF, gcpE, IytB) e uma terpenosintase.

A Figura 3 mostra a integração almejada de genes da via do MEP através darecombinação homóloga em S. cerevisiae.

Os diferentes fragmentos, isto é, os fragmentos de A a L1 são ampliadosatravés de PCR. Subseqüentemente, fragmentos específicos são fundidos juntosdurante 2 PCR de fusão seqüenciais para finalmente obter fragmentos A/B/C, D/E/F,G/H/l e J/K/L. Os fragmentos AeF fornecem as regiões homólogas necessáriaspara integração genômica do cluster lytB/gcpE/ispF, enquanto os fragmentos GeLfornecem as regiões homólogas necessárias para integração genômica do clusterdxs/dxr/ispD/ispE. Os fragmentos A/B/C e D/E/F são transformados juntos em S.cerevisiae para obter inserção intencionada do cluster lytB/gcpE/ispF. Os fragmentosG/H/l e J/K/L são transformados juntos em S. Cerevisiae para obter a integraçãoalmejada do cluster dxs/dxr/ispD/ispE graças à recombinação homóloga in vivo.

A Figura 4 mostra a avaliação da expressão dos genes da via do MEP.A: amostra da cepa YIP-DV-02, B: amostra da cepa YIP-0V-02. O gene deactina é usado aqui como padrão interno.

A Figura 5 mostra o efeito da Iovastatina no crescimento de uma cepa delevedura abrigando a via do MEP e gene da valenceno sintase (YIP-DV-02) e a cepade levedura somente com o gene da valenceno sintase como controle (YIP-0V-01).A Figura 6 mostra a estratégia para a deleção de ERG13 usando o marcadorseletivo Kl URA3. O Kl URA3 flanqueado através de repetições diretas é ampliado apartir de pWJ1077 em dois fragmentos separados, mas sobrepostos, usando primersque têm adaptamers em suas extremidades. Fragmentos de aproximadamente 500bp anteriores e posteriores ao local de inserção são ampliados separadamentetambém através de PCR usando genoma de S. cerevisiae como modelo. A PCR defusão permite a combinação dos quatro fragmentos de PCR em dois. Estes últimossão transformados em S. Cerevisiae e a construção do Kl URA3 é integrada no lócusERG13 graças à recombinação homóloga in vivo.

A Figura 7 mostra três plasmídeos usados na construção de uma cepa de S.cerevisiae produtora de licopeno, plP033, plP034 e plP035, cada plasmídioabrigando um dos três genes crt otimizados por códon a partir de E. hebicola nopCR4TOPO.

A Figura 8 mostra quatro plasmídeos usados na construção de uma cepa deS. cerevisiae produtora de licopeno, plP036 (pESC-URA com crtE), plP037 (pESC-HIS com crtl), plP038 (pESC-HIS com crtl e crtB) e plP039 (pESC-URA com crtE,crtB, e crtl), cada plasmídio abrigando um ou mais dos três genes crt otimizados porcódon a partir de E. herbicola nos vetores pESC-URA ou pESC-HIS.

Modo(s) para realizar a invenção

A presente invenção refere-se e faz uso de um microorganismo eucarióticoque tem uma via heteróloga.

De acordo com as materializações preferidas da invenção, o microorganismoé um microorganismo fúngico, mais particularmente uma levedura.

Uma lista não exaustiva de microorganismos adequados incluirá o seguinte:uma espécie pertencendo ao gênero Saccharomyces, por exemplo, S. cerevisiae, S.bayanus, S. pastoríanus, S. paradoxus, S. exiguous, S. servazzi, S. uvarum, S.kluyveri, S. castellii, uma espécie pertencendo ao gênero Kluyveromyces, porexemplo, K. Iactis, K marxianus var. marxianus, K. thermotolorens, K. waltii, K.delphensis, K. nonfermentas, K. wickerhamii, uma espécie pertencendo ao gêneroCandida, por exemplo, C. utilis, C. tropicalis, C. castellii, C. humilis, uma espéciepertencente ao gênero Zygosaccharomyces, por exemplo, Z rouxii, Z. bailii, Z.fermentati, Z. bisporus, Z. florentinus, uma espécie pertencente ao gênero Pichia,por exemplo, P. stipidis, P. pastoris, P. sorbithophila, P. anômala, ou outrasespécies, por exemplo, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica, Debaromyceshansenii, Schizosaccharomyces pombe, Torulaspora delbueckii', Ashbya gossipie,Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans,Peneeillium ehrysogenum, Rhizopus oryzae, Mueor eireenelloides.

Mais preferivelmente, o microorganismo é uma levedura e, até maispreferencialmente, o microorganismo é Saccharomyees eerevisiae. Por exemplo, eleé a cepa de S. eerevisiae depositado no at DSMZ-Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Mascheroder Weg 1b, D-38124Braunschweig, Alemanha, número de acesso: DSMZ 17900, em 27.01.2006.

Uma via heteróloga, para o propósito da presente invenção, é uma via que,em sua atividade para formar um composto através de etapas intermediáriasdefinidas e a partir de materiais de partida definidos, não está presente no tiposelvagem do microorganismo. Mais preferivelmente, a via heterólogoa é uma viaderivada do DNA de uma espécie diferente.

A via heteróloga é a via do MEP (via do 2-C-Metil-D-Eritritol 4-Fosfato). Estavia, em uma materialização preferida da presente invenção, é capaz de converter 1-deoxi-D-xilulose 5-fostato (DXP) em isopentenil difosfato (IPP) e/ou dimetilalil fosfato(DMAPP). Claro, esta capacidade se refere a condições in vivo, onde qualquer co-fator, mineral etc., necessário para a via operar esteja presente.

De acordo com uma materialização preferida da presente invenção, a via doMEP heteróloga é capaz de converter gliceraldeído-3-fosfato (GAP) e piruvato emIPP e/ou dimetilalil difosfato (DMAPP).

De acordo com uma materialização preferida, o microorganismo da invençãocompreende genes heterólogos codificando pelo menos uma enzima funcionalselecionada do grupo de 1-deoxi-D-xilulose 5-fosfato (DXP) sintase, 1-deoxi-D-xilulose 5-fosphato (DXP) redutoisomerase, 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato (MEP)citidililtransferase, 4-difosfocitidil-2-C-methil-D-erithritol (CDP-ME) quinase, 2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato (MECDP) sintase, 2-C-methil-D-erithritol 2,4-ciclodifosfato(MECDP) redutase e 1-hidroxi-2-methil-2-(E)-butenil- 4-difosfato (HMBPP) redutase.

Em consideração à conveniência e simplicidade, o termo "gene", por exemplo,conforme usado na expressão "genes heterólogos", é usado para designar qualquerseqüência de nucleotídeos contendo informações que codifiquem uma proteínaconforme especificado. Conseqüentemente, o termo "gene" também é usado para sereferir ao DNA de organismos que não sejam bactérias, tais como plantas ouanimais, por exemplo, os quais geralmente contêm partes não codificantes, taiscomo introns ou, ainda, onde as partes não codificantes tenham sido removidas.

Este termo também é usado, por exemplo, para se referir ao cDNA.

Preferivelmente, o microorganismo exibe atividade enzimática de uma,algumas ou todas as enzimas citadas no parágrafo acima. Mais preferivelmente, eleexibe atividade de todas as enzimas da via do MEP.

Para o propósito da presente invenção, essas enzimas têm a capacidade decatalisar as reações descritas na Figura 1. Por exemplo, a DXP sintase é umaenzima que tem a capacidade de catalisar a formação de DXP a partir de D-gliceraldeído-3-fosfatase e piruvato.

O termo "funcional" para o propósito da presente invenção, refere-se ao fatode que a atividade da enzima pode ser observada e/ou deduzida de alguma forma.

Por exemplo, a funcionalidade da via do MEP heteróloga pode ser deduzida a partirda presença de IPP em um microorganismo desprovido de qualquer outra via paraproduzir IPP que não seja outra heteróloga.

O termo funcional também se refere ao fato de que os genes heterólogos aquimencionados são realmente expressos pelo microorganismo.

Por exemplo, o microorganismo pode ter um deleção em sua via do tiposelvagem tornando a via nativa incapaz de produzir IPP. Sob estas circunstâncias, afuncionalidade da via heteróloga pode ser deduzida da capacidade domicroorganismo produzir IPP e, assim, sobreviver. Por exemplo, se omicroorganismo é uma cepa de S. cerevisiae, uma deleção pode ser construída emum gene essencial da via do MEV, por exemplo, o gene ERG 13. Um cassete dedeleção pode ser gerado conforme revelado na arte anterior, com primerscompreendendo saliências para recombinação homóloga para deletar o gene deMEV essencial. Geralmente, comprova-se que uma cepa viável compreendendo taldeleção depende da via heteróloga.

Em uma materialização preferida, entretanto, o microorganismo tem uma viado MEV funcional, basicamente do tipo selvagem, e uma via do MEP funcional,basicamente heteróloga. Define-se a via do MEV como sendo uma via capaz deconverter AcetiI-CoA e AcetoacetiI-CoA em IPP e/ou DMAPP.

Exemplos e materializações preferidas de enzimas da via do MEP sãoaqueles com os seguintes números EC: DXP sintase: EC 2.2.1.7; DXPredutoisomerase: EC 1.1.1.267; MEP citidililtransferase: EC 2.7.7.60; CDP-MEquinase: EC 2.7.1.148; MECDP sintase: EC 4.6.1.12; MECDP redutase: EC 1.17.4.3;e HMBPP redutase: EC 1.17.1.2.

Genes heterólogos codificando estas enzimas estão revelados em bancos dedados públicos e estão assim disponíveis para a pessoa habilitada. Exemplos de taisgenes da via do MEP são os de E. coli. Essas amostras têm os seguintes númerosde acesso: dxs: (AAC73523, GM786622, U00096.2); dxr. (AAC73284, Gl:1786369,U00096.2); ispD: (AAC75789, Gl: 1789104, U00096.2); ispE: (AAC74292,Gl: 1787459, U00096.2); ispF: (AAC75788, Gl: 1789103, U00096.2); gcpE:(AAC75568, Gl:1788863, U00096.2); IytB: (AAC73140, Gl:1786212, U00096.2), porexemplo.

Em uma materialização preferida, o microorganismo compreende genesheterólogos codificando um DXP-redutoisomerase funcional (dxr), MEPcitidililtransferase (ispD), CDP-ME quinase (ispE), MECDP sintase (ispF), MECDPredutase (gcpE) e HMBPP redutase (IytB). Preferivelmente1 o microorganismocompreende um gene heterólogo codificando uma DXP sintase (dxs).

Preferivelmente, o microorganismo compreende um gene heterólogocodificando uma IPP isomerase (idi na Figura 1).

Preferivelmente, o microorganismo compreende um gene heterólogocodificando uma FPP sintase. Genes codificando IPP isomerases e FPP sintase têmsido descritos e estão disponíveis para a pessoa habilitada. Cópias heterólogasdestes genes podem ser úteis para aumentar ainda mais a produtividade de terpenodo microorganismo da presente invenção.

Em uma materialização preferida o microorganismo compreende pelo menosum gene heterólogo codificando uma terpeno sintase funcional. Uma vantagemimportante do microorganismo da presente invenção é sua adequação para produzirqualquer terpeno à escolha da pessoa habilitada. Conseqüentemente qualquerseqüência de codificação da sintase de terpeno conhecida pode ser usada para serheterologamente expressa no microorganismo. A particularidade da presenteinvenção reside no fato de que a funcionalidade da enzima da via do MEP resulta naprodução heteróloga de IPP1 enquanto a terpeno sintase pode ser uma enzimacapaz de converter os precursores indicados abaixo em qualquer terpeno.

O termo terpeno sintase abrange enzimas, complexos e/ou grupos deenzimas capazes de sintetizar um terpeno a partir de um ou de vários precursores. Em particular, os precursores para terpenos, para o propósito da presente invençãosão farnesil difosfato (FPP), geranil difosfato (GPP)1 geranilgeranil difosfato (GGPP),e qualquer combinação de dois ou mais destes.

Preferivelmente, uma terpeno sintase é uma única enzima, complexo e/ougrupo de enzimas capazes de sintetizar um terpeno a partir dos precursores GPP,FPP, GGPP ou uma combinação de pelo menos dois destes.

Um terpeno é um hidrocarboneto saturado ou insaturado, opcionalmentesubstituído, baseado ou composto essencialmente de unidades de isopreno (C5). Osterpenos podem ser acíclicos ou cíclicos. Os terpenos, conforme usado aqui,incluem terpenos, derivados de terpenos e compostos referidos como terpenóides,os quais podem ou não cair em uma das duas classes precedentes de compostos.Os derivados de terpeno incluem compostos que se submeteram a uma ou maisetapas de funcionalização, tais como hidroxilações, isomerizações, óxido-reduçõesou acilações, por exemplo. Preferivelmente, para o propósito da presente invenção,um terpeno é um composto que preenche a condição acima e/ou cujo esqueleto decarbono se origina, pelo menos em parte, mas preferivelmente de modo total, da viado MEP e/ou do MEV. Conseqüentemente, os terpenos incluem álcoois de terpeno,por exemplo, compostos de C15H26O and C10H18O, tais como patchoulol, epicedrol,cubebol, linalol, nerolidol, por exemplo, e diálcoois, por exemplo, esclareol. Osterpenos também incluem compostos de difosfato, tais como bornil-difosfato(monoterpeno) e copalil-difosfato (diterpeno), apenas para mencionar uma pequenaamostra da vasta categoria dos terpenos.

Como usado aqui, um "derivado" é qualquer composto obtido de umcomposto conhecido ou suposto e que contenha elementos essenciais dasubstância de origem.

Por exemplo, terpenos são compostos que têm esqueletos de carbono de Cio,C15, C20, C30, C40, C45 e assim sucessivamente.

Conseqüentemente, o termo terpeno abrange mono, sesqui, di, tri, tetra e/oupoliterpenos. Em uma materialização preferida da invenção, a terpeno sintase é umamono, sesqui e/ou diterpeno sintase. Preferivelmente, ela é uma sesquiterpenosintase.

De acordo com uma materialização preferida, o terpeno da presente invençãoé um sesquiterpeno. Por exemplo, o sesquiterpeno é cubebol, patchoulol, farneseno,amorfadieno e/ou valenceno. Os genes que codificam sintases para estes terpenosestão disponíveis nos bancos de dados públicos, por exemplo, sob os números deacesso AY508730, CQ813505, AY566286, AY523409, DQ309034, AF024615,AF374462, AF138959, AY006482, CQ813508.

As terpeno sintases e os genes que as codificam estão amplamentedisponíveis para a pessoa habilitada e podem ser selecionados de acordo com aspreferências. Uns poucos exemplos não Iimitantes são as monoterpeno sintases, porexemplo, as Iimoneno sintases (L13459, D49368, AAM53944), pineno sintases(AF543530, AF543528), sabineno sintase (AF051901), bornil-difostato sintase(AF051900), 1,8-cineol sintase (AF051899) e Iinalool sintase (AF154124, U58314).

Os exemplos para as diterpeno sintases com seqüências disponíveis são casbenosintase (P59287), taxadieno sintase (U48796) e abietadieno sintase (U50708). Estesexemplos servem somente para ilustração da ampla aplicabilidade da presenteinvenção. As seqüências ainda a serem isoladas que codificam as terpeno sintasespodem igualmente ser empregadas para trabalhar o princípio da presente invenção.

Preferivelmente, a terpeno sintase é heteróloga. Conseqüentemente, oterpeno não é produzido pelo microorganismo nativo e/ou do tipo selvagem.

Entretanto, a presente invenção também compreende ocorrências onde omicroorganismo já engloba um gene nativo e/ ou tipo selvagem codificando umasintase para produzir um terpeno. Neste caso, o microorganismo da invençãoabrange cópias adicionais do mesmo gene, ou genes heterólogos codificando umaterpeno sintase capaz de produzir o mesmo terpeno ou um diferente. Desta forma,quantidades maiores desse mesmo terpeno ou de uma mistura desse terpeno comoutros diferentes podem ser produzidas.

De acordo com uma materialização preferida, o microorganismo da invençãofornece um rendimento de pelo menos 30 pg, mais preferivelmente ao menos100 ug, de terpeno por grama de peso seco do microorganismo. O rendimento doterpeno de um microorganismo é preferivelmente estabelecido pelo protocolo noExemplo 10.

Preferivelmente, os genes heterólogos estão sob controle dos promotores.Preferivelmente, estes promotores estão na vizinhança próxima dos genesheterólogos. Até mais preferivelmente, cada um dos genes heterólogos, isto é,aqueles da via do MEP e o gene da terpeno sintase estão individualmente sobcontrole de um promotor localizado anteriormente à respectiva seqüência decodificação. Qualquer promotor pode ser usado, por exemplo, promotoresconstitutivos fortes e/ou fracos ou promotores indutivos. Exemplos de promotorespreferidos são os promotores de S. cerevisiae indutíveis por galactose, tais comoGAL1 e GAL10 ou promotores de S.cerevisiae constitutivos fortes, tais como TPI1 eTEF1.

Preferivelmente, cada um dos genes heterólogos mencionados acima estáassociado com uma seqüência de terminador. Preferivelmente, a seqüência determinador está localizada posteriormente ao gene heterólogo. Assim como para asseqüências de promotor, as seqüências de terminador podem ser selecionadas apartir de um vasto "pool" de seqüências de terminador conhecidas ou ainda a seremdescritas. Exemplos são os terminadores de S.cerevisiae de CYC1, ADH1, TPH ouFBP1.

O microorganismo pode ou não compreender genes heterólogos adicionais.Tipicamente, os genes heterólogos adicionais incluem seqüências de marcadores,tais como marcadores de resistência ou auxotroficos, indicando que um geneheterólogo de escolha está presente em um microorganismo selecionado.

Um problema subjacente à presente invenção é a estabilização de umagrande quantidade de material genético heterólogo durante gerações sucessivas do microorganismo. Grandes plasmídeos são difíceis de construir e não são facilmenteabsorvidos e mantidos pelo microorganismo. Além do mais, manter plasmídios podeconstituir um custo energético para a célula, e isto pode abaixar as capacidades deprodução. Se muitos plasmídeos pequenos forem usados, entretanto, alguns delespodem ser perdidos com cada ciclo de replicação. Além do mais, regiões homólogasem diferentes plasmídeos, ou dentro do mesmo plasmídeo, podem recombinar,resultando na perda do material genético heterólogo.

Notadamente, os presentes inventores poderiam transformar ummicroorganismo introduzindo estavelmente uma via heteróloga. Os genes da viaheteróloga podem estar presentes em plasmídeos do microorganismo.

Conseqüentemente, a presente invenção fornece um plasmídeo e/ou um parde plasmídeos conforme aqui definido com respeito ao microorganismo. Essesplasmídos são surpreendentemente adequados para transformar ummicroorganismo com uma via do MEP heteróloga. Preferivelmente, omicroorganismo abrange pelo menos dois plasmídeos com genes da via heterólogae, opcionalmente, um gene codificando uma terpeno sintase. Mais preferivelmente,ele compreende dois (2) plasmídeos.

Em uma materialização preferida, o microorganismo compreende pelo menosdois plasmídeos, um plasmídeo compreendendo pelo menos três (3) e o outroplasmídeo compreendendo outros três (3) genes da via heteróloga. Preferivelmente,todos os genes são diferentes genes que têm diferentes atividades enzimáticas.

Conseqüentemente, a presente invenção fornece um plasmídeocompreendendo 3 genes da via heteróloga, opcionalmente compreendendo aindapelo menos um gene heterólogo que codifica uma DXP sintase funcional. Maispreferivelmente, o plasmídeo compreende 4 genes da via MEP.

A presente invenção ainda fornece um plasmídeo que compreende 3 genesda via heteróloga e ainda compreendendo pelo menos um gene heterólogo quecodifica uma terpeno sintase funcional.

Conseqüentemente, o microorganismo preferivelmente compreende doisplasmídeos, um abrangendo (4) diferentes genes da via heteróloga, incluindo umgene que codifica uma DXP sintase, e o outro plasmídeo compreende três (3) genesda via do MEP e um gene que codifica uma terpeno sintase.

Em uma materialização preferida da invenção, o microorganismo compreendepelo menos (2) plasmídeos que, absorvidos juntos, compreendem os genes dxs, dxr,ispD, ispE, ispF, gcpE, IytB e um gene que codifica uma terpeno sintase. Em outraspalavras, pelo menos dois plasmídeos, por exemplo, 3 ou 4 plasmídeos,compreendem esses genes de modo que cada gene esteja presente em pelo menosum dos dois plasmídeos.

Qualquer vetor e/ou plasmídeo adequado pode ser usado para abrigar osgenes heterólogos. Exemplos de plasmídeos adequados para transformar o microorganismo são vetores pESC (por exemplo, pESC-URA, Stratagene), vetorespYES (por exemplo, pYES2/CT, Invitrogen), e vetores pRS (por exemplo, pRS426,Sikorski e Hieter, 1989, Genetics 122:19).

De acordo com uma materialização preferida, alternativa, os genes quecodificam a via heteróloga são integrados no genoma do microorganismo.

Esta materialização tem várias vantagens quando comparada com amaterialização onde os genes da via heteróloga estão localizados nos plasmídeos.Primeiramente, a integração no genoma aumenta a estabilidade da integração dosgenes heterólogos durante as gerações sucessivas. Além disso, os procedimentossubseqüentes de otimização, tais como engenharia evolucionária, são muito maisfáceis de realizar. Então, este sistema é mais flexível com respeito à localização dogene que codifica a terpeno sintase. Este último pode, então, estar presente em umplasmídeo comparativamente pequeno e/ou também integrado no genoma.Vantagens básicas da integração no genoma são, desta forma, a estabilidade e, emmenor extensão, a flexibilidade.

Conseqüentemente, em uma materialização preferida, os genes da viaheteróloga e/ou o gene da DXS sintase estão integrados no genoma domicroorganismo, e um gene que codifica terpeno sintase está presente em umplasmídeo e/ou integrado no genome. Preferivelmente, o gene que codifica umaterpeno sintase está presente em um plasmídeo, uma vez que isto facilita atransformação adicional do microorganismo com uma variedade de sintases.

Alternativamente, o gene heterólogo da terpeno sintase pode ser inserido nogenoma do microorganismo, e os genes da via do MEP heteróloga e/ou o gene daDXP sintase estar presente em plasmídeos conforme revelado acima, por exemplo.

Variações adicionais possíveis em relação à repartição dos genes heterólogosno genoma e/ou nos plasmídeos serão apreciadas pela pessoa habilitada e não sãodiscutidos em todos os detalhes.

O genoma do microorganismo, para o propósito da presente invenção, éequivalente à totalidade do DNA cromossômico, mas exclui o DNA dos plasmídeos eo DNA mitocondrial.

Todos os DNA heterólogos podem ser otimizados pelo códon.

Conseqüentemente, os códons de DNA heterólogo são preferivelmente modificadospara corresponder aos códons preferidos do microorganismo. Os códons tambémpodem ser modificados para minimizar o teor de GC no DNA heterólogo e alterar aformação da estrutura secundária do mRNA. Isto permite obter níveis mais altos deenzimas da via do MEP e/ou terpeno sintase, heterologamente expressas nomicroorganismo.

O Ergosterol é um composto essencial para o crescimento de determinadosmicroorganismos, tais como fungos, e, em particular, levedura. Entretanto, de modoa atrair o fluxo de carbono em direção à produção do terpeno de escolha de acordocom a invenção, a produção de ergosterol no microorganismo da invenção épreferivelmente reduzida. Isto é preferivelmente conseguido substituindo ospromotores da biossíntesse do ergosterol com somente promotores fracamenteconstitutivos e/ou repressíveis. Preferivelmente, o promotor nativo do genecodificador da esqualeno sintase ERG9 em levedura é substituído por um promotorfracamente constitutivo ou repressível. Por exemplo, na levedura, o promotor nativopode ser substituído pelo promotor de MET3 de S. cerevisiae. Os promotores podemser substituídos pela PCR de fusão e pelo método que almeja o gene bipartido(Ederniz et aí., 1997, Genome Research 7: 1174).

Se o microorganismo é um fungo e, preferivelmente uma cepa deSaccharomyces, fosfatases que hidrolisam intermediários importantes paraacumulação de terpenos como FPP e/ou GGPP, são preferivelmente de maneiratotal ou parcialmente inativados. Em S. cerevisiae, demonstrou-se que os produtosdos genes LPP1 (YDR284C) e DPP1 (YDR284C) têm tal atividade (Faulkner et al,1999, J. Biol. Chem. 274: 14831). Estes ou genes similares são, assim,preferivelmente deletados se presentes no microorganismo da presente invenção.

A presente invenção fornece métodos para acumular um terpeno na célulae/ou meio de um microorganismo, para produzir um terpeno e para aumentar aquantidade de precursores de terpeno em um microorganismo.

Os terpenos podem acumular-se nas células. Por exemplo, eles podemacumular-se no citoplasma, nas mitocôndrias, membranas celulares ou outrasorganelas celulares. Muitos terpenos são compostos lipofílicos, os quais seacumulam na membrana plasmática da célula.

Para o propósito da presente invenção, o termo "acumulando no meio"também engloba a acumulação em um solvente durante um processo defermentação de duas fases.O terpeno e o microorganismo usados em tais métodos são conforme definidoacima. O meio do microorganismo pode ser líquido ou sólido a 25°C (temperaturaambiente), mais é preferivelmente líquido.

O meio é selecionado em função das necessidades do microorganismoselecionado. O meio, assim, contém todos os ingredientes e fatores necessáriospara crescimento e/ou produção do terpeno. Freqüentemente, um meio éselecionado para o crescimento do microorganismo diferente daquele para produçãodo terpeno. O último é normalmente obtido trazendo o microorganismo para umestágio em seu ciclo de vida onde a replicação é minimizada e a transcrição e/ousíntese de proteína maximizada. O meio geralmente precisa conter todos os fatoresnecessários para a sobrevivência ao menos de curto prazo da cepa.

De acordo com uma materialização preferida, a etapa de cultivar omicroorganismo e/ou a etapa de isolar o terpeno a partir do meio é realizada via umafermentação de duas fases.

Conseqüentemente, solventes orgânicos imiscíveis e biocompatíveis sãoadicionados a um meio de cultura.

Esses solventes formam uma segunda fase, preferivelmente hidrófoba, capazde acumular o terpeno e/ou evitar sua perda por evaporação ou outros fenômenos.Desta forma, os solventes orgânicos podem ser usados para separação in-situ demetabólitos na fermentação (Frenz et al., 1989, Enzyme Microb. Technol. 11:717;Sim et al., 2001, Biotechnol. Lett. 23:201). Uma fermentação de duas fases, para opropósito da presente invenção, é um método de cultivar um microorganismocaracterizado pela presença de pelo menos um solvente orgânico no, ou além domeio do microorganismo, para formar pelo menos um sistema de duas fases.

Preferivelmente, o solvente orgânico, não afeta significativamente ocrescimento e/ou sobrevivência do microorganismo. Solventes adequados parafermentações de duas fases são diisononil ftalato, dibutil ftalato, álcool oleílico, di-hexil-éter e dodecano, por exemplo.

A fermentação de duas fases também inclui uma separação ao menos parciale/ou isolamento do terpeno do meio.

O método para acumular um terpeno compreende a etapa de engenheirar omicroorganismo para abranger a via do MEP heteróloga para produzir IPP e/ouDMAPP. A engenharia pode ser realizda com base no material descrito acima.Conseqüentemente, a engenharia pode ser através da transformação complasmídeos e/ou através da integração genômica do material genético heterólogo.Os procedimentos para engenharia genética são conhecidos para a pessoahabilitada e nenhuma limitação com respeito a qualquer metodologia particular énecessária.

De acordo com uma materialização preferida, o método compreende umaetapa de engenheirar o microorganismo para compreender uma terpeno sintaseheteróloga. Preferivelmente, uma etapa de engenharia é realizada transformando omicroorganismo para compreender plasmídeos contendo genes que codificamenzimas da via heteróloga.

Em uma materialização adicional, o método compreende a etapa de cultivar omicroorganismo sob condições que levam à produção do dito terpeno. Essascondições são conhecidas para a pessoa habilitada. Geralmente, elas podem serajustadas através da seleção de um meio adequado, vaso de fermentação,temperatura e pH.

O método para produzir um terpeno pode compreender a etapa de isolar oterpene a partir do meio, a partir das células e/ou de um solvente orgânico, no casode uma fermentação de duas fases ser realizada. O terpeno pode ser isoladoatravés de qualquer método usado na arte, incluindo, mas não limitado acromatografia, extração e destilação, por exemplo.

Os microorganismos e métodos de acordo com a invenção fornecem, assim,uma plataforma melhorada e flexível para a produção de uma variedade de terpenosindividuais, ou misturas destes; e essa plataforma ainda pode ser complementadavia uma possível transformação adicional dos microganismos via integração ouampliação de outras enzimas capazes de converterem os terpenos em outroscompostos úteis na indústria de flavorizantes e fragrâncias em particular. Um usoóbvio é para a conversão dos terpenos apropriados em carotenóides, via integraçãodas enzimas apropriadas, nos microorganismos da invenção, via plasmídeo ouincorporação do genoma. Outro é a conversão de valenceno em nootkatona, porexemplo, através da inserção adicional, no metabolismo do microorganismo, decitocromo P450 monooxigenase capaz de efetuar essa conversão. A invenção,assim, fornece uma ferramenta útil e vantajosa para a produção de terpenos e seusderivados, bem como dos precursores.

Exemplos

Pretende-se que os seguintes exemplos ilustrem a invenção sem limitar oescopo como resultado. As porcentagens são dadas com base no peso a menosque indicado de outra forma.

Exemplos 1-4

Os genes dxs, dxr, ispD, ispE, ispF, gcpE e os genes IytB foram ampliados apartir do DNA genômico de E. coli atv de PCR usando os primers listados na Tabela 1.

Genes que codificam terpene sintases, em particular, genes que codificampatchoulol sintase (PatTps177, acesso GeneBank No. AY508730), cubebol sintase(GFTpsC, acesso GenBank No. CQ813505) e valenceno sintase (GFTpsD, acessoGenBank No. CQ813508) foram ampliados a partir de plasmídeo pET11a ou pET101contendo esses genes e usando os primers listados na Tabela 4. As seqüênciasdessas terpeno sintases, bem como o isolamento dos respectivos genes, e aconstrução dos plasmídeos citados estão divulgados nos W005/052163,W005/056803 (patchoulol sintase) e W004/031376 (valenceno e cubebol sintase).

As condições de PCR estavam de acordo com as condições padrão de"Expand High Fidelity" (Roche Applied Science). Os fragmentos de DNA foramseparados por eletroforese com gel e os fragmentos do tamanho esperado, depoispurificados usando o Kit de Purificação de Produto de PCR Altamente Puro (RocheApplied Science).

Exemplos 1-4. parte (a)

Os produtos de PCR purificados do dxr, ispD, ispF, IytB, gene de valencenosintase e gene de cubebol sintase e um plasmídeo (pESC-TRP ou pESC-URA)foram digeridos com as enzimas de restrição indicadas na Tabela 1 ou 4 epurificados com o kit de extração por Gel QIAEX® Il (Qiagen). Para os genes deterpeno sintase, pESC-TRP foi usado, caso contrário ver Tabela 1. A ligação in vitrodo plasmídeo digerido com o produto de PCR digerido foi realizada como oprocedimento padrão dado para a T4 DNA Iigase (Roche Applied Science) com umarazão inserto/vetor de pelo menos 3:1 e incubada a 4°C por 16 horas. A mescla deligação resultante foi usada para transformar quimicamente as células competentesde E. coli (DH5a) (Inoue et al, 1990, Gene 96:23) e os transformadores foramselecionados no meio LB suplementado com ampicilina (1% Triptona, 0,5% extratode levedura, 1% NaCI, 2% agar, pH 7, 75 mg/L ampicilina).Os transformadores foram depois verificados purificando os plasmídeos erealizando a digestão com enzimas de restrição adequadas. Se um transformadorcontivesse um plasmídeo do tamanho correto, 1 pg do plasmídeo DNA era purificadoe enviado para seqüenciamento.

Os plasmídeos obtidos são conforme segue:

dxr em pESC-TRP: plP020; ispD em pESC-URA: plP018; ispF em pESC-TRP:plP016; IytB em pESC-URA: plP009; Valenceno sintase em pESC-TRP: plP027;Cubebol sintase em pESC-TRP: plP013.

Tabela 1 Primers de PCR usados para clonar genes da via de E. coli

<table>table see original document page 28</column></row><table><table>table see original document page 29</column></row><table>A "técnica de clonagem" envolve digestão dos modelos pelas enzimas derestrição citadas seguidas pela ligação e transformação dos produtos resultantesem E. coli, ou construção in vivo graças ao reparo de GAP em S. cerevisiae.

Exemplos 1-4, parte fb)

Os genes remanescentes, dxs, ispE, gcpE e uma terpeno sintase selecionadaonde inserido cada um em um dos plasmídeos previamente mencionados (plP020,018, 009) através da clonagem clássica ou do método de reparo de gap conformesegue.

Os gcpE, produtos de PCR de valenceno sintase e cubebol sintase foramclonados seguindo o esquema abaixo:

Tabela 2

<table>table see original document page 30</column></row><table>

Os produtos de PCR e plasmídeos foram digeridos com as enzimas derestrição indicadas na Tabela 1 ou Tabela 4, respectivamente, purificados, ligados invitro, seguidos por transformação de E. coli, seleção de transformadores everificação de transformadores através do seqüenciamento dos plasmídeosesperados exatamente como indicado para os Exemplos 1-4(a) acima.

O método de reparo de gap foi usado para clonar dxs em plP020, ispE emplP018 e uma patchoulol sintase em plP016 para obter plasmídeos cada umcompreendendo dois genes adicionais.

Este método de clonagem utiliza recombinação homóloga em levedura parajuntar seqüências de DNA homólogas (DeMarini et aí, 2001, BioTechniques 30:520-52). Esta técnica consiste em gerar produtos de PCR com as extremidadeshomólogas para o local de inserção no plasmídeo a construir. Os primers utilizadospara clonar dxs e ispE são dados na Tabela 1, aquels para clonar uma terpenosintase na Tabela 4.

Os produtos de PCR {dxs, ispE, terpeno sintase) e plasmídeos alvo foramdigeridos de acordo com o esquema a seguir:

Tabela 3

<table>table see original document page 31</column></row><table>

O produto de PCR e o plasmídeo digeridos foram ambos transformados em S.cerevisiae YIP-00-02 (MATa trpl ura3) usando procedimento padrão de transformação (Gietz e Woods1 2002, Methods in Enzymology 350: 87). Ostransformadores foram selecionados em meio SC-trp (6,7 g/L base de nitrogêniopara levedura sem aminoácidos, 2 g/L menos mescla de retirada de trp, 2% glicose,2% agar) ou meio SC-ura (6,7 g/L base de nitrogênio para levedura semaminoácidos, 2 g/L menos mescla de retirada de ura, 2% glicose, 2% agar). Após 2-3 dias de incubação a 30°C, todos os transformadores foram inoculados em umúnico tubo de ensaio contendo 5 mL of SC-trp (6,7 g/L base de nitrogênio paralevedura sem aminoácidos, 2 g/L menos mescla de retirada de trp, 2% glicose) ouSC-ura (6,7 g/L base de nitrogênio para levedura sem aminoácidos, 2 g/L menosmescla de retirada de ura, 2% glicose) e incubados 12 h a 30°C. A partir deste cultivo, o DNA total foi isolado (Sambrook e Russell, 2000, Molecular cloning alaboratory manual 3rd ed. 6.31-6.32) e utilizado depois para transformarquimicamente as células competentes de E. coli (DH5a) (Inoue et al, 1990). Ostransformadores foram selecionados em placas contendo meio LB suplementadocom ampicilina.

Tabela 4

<table>table see original document page 32</column></row><table>

A "técnica de clonagem" envolve digestão dos modelos através das enzimas derestrição citadas, seguidas pela ligação e transformação dos produtosresultantes em E. coli, ou construção in vivo graças ao reparo de GAP em S.cercvisiae.Exemplo 5: combinação de plasmídeo através de recombinação homóloga invivo em Saccharomyces cerevisiae (Reparo de gap)

Para reduzir a instabilidade do plasmídeo e facilitar a integração posterior dosgenes no genoma de Saccharomyces cerevisiae, os 4 plasmídeos foramcombinados entre si, dois a dois, para terminar com 2 plasmídeos principais: umsuportando dxs, dxr, ispD, ispE (pIP001) e o outro suportando gepE, IytB, ispF e umgene de sesquiterpeno sintase (no caso da valenceno sintase, esse plasmídeo édenominado plP002). A combinação dos diferentes plasmídeos foi realizada atravésde reparo de gap em S. cerevisiae (DeMarini et. al, 2001, BioTechniques 30:520-52).

Para construir o plasmídeo plP002, o pedaço de DNA contendo ispF, geneque codifica valenceno sintase, promotores de GAL1 e GAL10, terminadores CYC1e ADH1 (plP015) foi ampliada através de PCR usando os primers pfus_grf e pfus_grr(Tabela 1). Os produtos de PCR resultantes foram purificados usando o Kit dePurificação de Produto de PCR Altamente Puro (Roche Applied Science). Oplasmídeo plP008 (pESC-URA contendo gcpE e IytB) foi digerido por Mfel, esubseqüentemente purificado após eletroforese com gel usando Kit de Extração porGel QIAEX® Il (Qiagen). O plasmídeo purificado e digerido junto com os produtos dePCR foram usados na transformação de S. cerevisiae YIP-00-03 (MATa ura3) (Gietze Woods, 2002). Os transformadores foram selecionados em placas contendo meioSC-ura. Após 2-3 dias de incubação a 30°C, todos os transformadores foraminoculados em um único tubo de ensaio contendo 5 mL de SC-ura e incubados 12 ha 30°C. A partir deste cultivo, o DNA total foi isolado (Sambrook e Russell, 2000) eutilizado depois para transformar quimicamente as células competentes de E. coli(DH5a) (Inoue et al, 1990). Os transformadores foram selecionados em placascontendo meio LB suplementado com ampicilina. Os transformadores foram, então,verificados purificando os plasmídeos e realizando digestão enzimática com enzimasde restrição adequadas. No caso de transformadores contendo o plasmídeoesperado, 1 pg de DNA de plasmídeo era purificado e enviado paraseqüenciamento. O plasmídeo resultante pESC-URA contendo gcpE, IytB, ispF evalenceno sintase foi denominado plP002 (Fig. 2).

O mesmo protocolo foi seguido para construir o plasmídeo pIPOOl, i.é, opedaço de DNA contendo promotores de ispD, ispE, GAL1 e GAL10, terminadoresde CYC1 e ADH1 foi ampliado através de PCR usando os primers pfus_grf epfus_grr (Tabela 1). The produtos de PCR resultantes foram purificados usando o Kitde Purificação de Produto de PCR Altamente Puro (Roche Applied Science). Oplasmídeo pESC-TRP contendo dxs e dxr foi digerido por Xcml1 esubseqüentemente purificados após eletroforese com gel usando QIAEX® Il GelExtração Kit (Qiagen). O plasmídeo purificado e digerido junto com os produtos dePCR foram usados na transformação de S. cerevisiae YIP-00-02 (MATa trpl ura3)(Gietze Woods, 2002). Os transformadores foram selecionados em placas contendomeio SC-trp. Após 2-3 dias de incubação a 30°C, todos os transformadores foraminoculados em um único tubo de ensaio contendo 5 mL de SC-trp e incubados 12 ha 30°C. A partir deste cultivo, o DNA total foi isolado (Sambrook e Russell, 2000) eutilizado depois para transformar quimicamente as células competentes de E. coli(DH5a) (Inoue et al, 1990). Os transformadores foram selecionados em placascontendo meio LB suplementado com ampicilina. Os transformadores foram, então,verificados purificando os plasmídeos e realizando digestão enzimática com enzimasde restrição adequadas. No caso de transformadores contendo o plasmídeoesperado, 1 pg de DNA de plasmídeo era purificado e enviado paraseqüenciamento. O plasmídeo resultante pESC-TRP contendo dxs, dxr, ispD e ispEfoi denominado plP001 (Fig. 2).

O protocolo acima para produzir plasmídeo plP002 foi repetido substituindoplP015 por plP014 e plP012, para obter os plasmídeos plP003 e plP005compreendendo os genes de cubebol e patchoulol sintase, respectivamente.

Exemplo 6: Construção de uma cepa de S. cerevisiae expressando a via doMEP a partir de plasmídeos para a produção de isoprenóides

Os plasmídeos purificados pIPOOl e plP002 (Fig. 2) foram sucessivamentetransformados (Gietz e Woods, 2002) na cepa S. cerevisiae YIP-00-02 (MATa trplura3). Após a transformação com pIPOOl, os transformadores foram selecionadosem placas contendo meio SC-trp. Um transformador foi colônia-purificado etransformado com plP002. Os transformadores foram selecionados em placascontendo meio SC-trp-ura (6,7 g/L base de nitrogênio para levedura semamincácidos, 2 g/L menos trp menos mescla de retirada de ura, 2% glicose, 2%agar). Inúmeros transformadores foram inoculados em uma série de tubos de ensaioindependentes contendo 5 mL de SC-trp-ura e incubados 12 h a 30°C. A partirdestes cultivos, o DNA total era isolado de cada transformador (Sambrook e Russell,2000). A presença de genes da via do MEP foi verificada através de PCR. Trêsclones caracterizados pela presença dos genes da via do MEP e do gene devalenceno sintase foram selecionados para caracterização posterior e denominadosYlP-DV-01, YIP-DV-02 e YIP-DV-03. O YIP-DV-02 foi depositado no DSMZ sob onúmero de depósito DSM 17900. Cada gene codificando cada uma das 7 enzimasda via do MEP era ampliado através de PCR a partir da cepa YIP-DV-02 e enviadopara seqüenciamento (MWG-Biotech AG DNA Sequencing Service). As seqüênciasresultantes foram comparadas com as seqüências originais dos genes da via do MEP de E. coli depositados na Genbank® para verificar a ausência de mutações.A construção de cepas de S. cerevisiae expressando a via do MEP junto comos genes que codificam cubebol sintase ou patchoulol sintase foi realizada conformedescrito para a construção das cepas de S. cerevisiae YIP-DV-01, YIP-DV-02 e YIP-DV-03. Para construir plasmídeos contendo gcpE, IytB, ispF e uma sesquiterpenosintas.3, o mesmo procedimento do Exemplo 5 foi seguido, mas substituindo avalenceno sintase por uma sesquiterpeno sintase apropriada citada acima. Essascepas, todas expressando a via do MEP e expressando cubebol sintase oupatchoulol sintase, são denominadas, respectivamente, YIP-DC-01 e YIP-DP-01.

Exemplo 7: Integração dos genes da via do MEP no genoma deSaccharomyces cerevisiae

A fim de estabilizar a expressão dos genes da via do MEP1 os cassetes dos 7genes foram integrados no genoma de Saccharomyces cerevisiae. Isto é feitousando recombinação homóloga in vivo em Saccharomyces cerevisiae (DeMarini etal, 2001) e o método almejando o gene bipartido (Ederniz et al, 1997, GenomeResearch 7: 1174). A integração dos 2 clusters de gene é feita em 2 lóci específicos.A estratégia para integração é conforme segue (Fig. 3). Para cada cluster de gene(dxs/dxr ispD/ispE ou gcpE/lytB ispF), 6 produtos de PCR são gerados primeiro (Fig.3) a partir do plasmídeo plP001 ou plP002. Esses produtos de PCR são depoisfundidos juntos durante 2 PCR de fusão subseqüentes. Por exemplo, os fragmentosA, B e C são ampliados primeiro separadamente. Depois, eles são fundidos durante2 PCR de fusão, resultando um fragmento A/B/C linear longo (Fig. 3) Os fragmentosde PCR fundidos resultantes são caracterizados por regiões de superposição nonível do marcador seletivo (Kluyveromyces Iactis URA3 ou KanMX) e pelasextremidades compartilhando homologia com os 2 locais de integração diferentes nogenoma (Fig. 3). Os locais de integração são o lócus ura3 para o primeiro cluster epDC6 (que codifica uma isozima de piruvato descarboxilase de atividade deimportância secundária) ou uma região não-codificadora de genoma para o segundogenorna. Essas características são essenciais para a inserção almejada dos 2clusters de gene no genoma de S. cerevisiae. A PCR é realizada de acordo com ascondições padrão Expand High Fidelity (Roche Applied Science). Os produtos dePCR são purificados usando o Kit de Purificação de Produto de PCR Altamente Puro(Roche Applied Science) após cada PCR e etapa de PCR de fusão. Os últimosfragmentos são usados para a transformação de S. cerevisiae YIP-00-03 (MATaura3) através de um protocolo padrão (Gietz e Woods, 2002). Os transformadoressão selecionados em placas contendo meio SC-ura para a inserção do clusterIytBIgcpE-KI URA3-ispF e em placas contendo meio SC-ura suplementado comgeneticina para a inserção de ambos os clusters. Após 2-3 dias de incubação a30°C, colônias simples são cultivadas durante a noite em 5 mL de meio SC-ura +geneticina (6,7 g/L base de nitrogênio para levedura sem aminoácidos, 2 g.L"1menos mescla de retirada de ura, 2% glicose, 200 mg.L"1 geneticina, 2% agar). Apartir deste cultivo, o DNA total é isolado (Sambrook e Russell, 2000). A integraçãodos clusters de gene em lóci específicos é verificada através de PCR. Uma dascepas resultantes selecionadas é a YIP-D0-01.

Exemplo 8 : Avaliação da expressão dos genes da via do MEP de E. co/ι em S.cerevisiae.

A fim de verificar a expressão de todos os 7 genes da via do MEP de E. coliem S. cerevisiae, seus perfis de expressão foram avaliados através de umafermentação usando RT-PCR (PCR de Transcrição Reversa). Para detectorespecificamente a expressão de cada gene da via do MEP1 um conjunto de primersespecíficos foi desenhado para cada um deles (Tabela 5), e as condições de PCRotimizadas.

Ao cultivar as cepas YIP-DV-02 e YIP-0V-02 em frascos com agitação,usando galactose como fonte de carbono (20 g.L"1), mantendo a temperatura decultivo em 30°C e agitando a 150 rpm, amostras foram tomadas em diferentes fasesde crescimento e o RNA total extraído de acordo com o kit FastRNA® Pro Red(Qbiogene). Para remover qualquer traço de DNA contaminante, um tratamentosubseqüente das amostras de RNA com Turbo DNase (Ambion) era aplicadoseguindo as condições padrão descritas para o kit sem Turbo DNase™ (Ambion,Foster City, CA). O RNA era, então, armazenado a -80°C. Após verificar aconcentração e integridade das amostras de RNA, a RT-PCR era realizada conformesegue. A transcrição reversa para síntese do primeiro DNA de fita simples foirealizada de acordo com as condições padrão de Expand Reverse Transcriptase(Roche) usando primers específicos para cada gene da via do MEP (Tabela 6). Areação era interrompida colocando os tubos em gelo. Depois, uma reação de PCRera realizada usando a Taq DNA polimerase e os primers específicos para cadagene. As temperaturas de têmpera eram 55°C para dxs, ispD, ispE, ispFe IytB, 57°Cpara dxr e gcpE e 53°C para actina (usada como padrão interno). O tempo dealongamento era de 90 segundos e a ampliação era realizada durante 35 ciclos.Para confirmar que o fragmento de DNA observado foi ampliado a partir do mRNA enão a partir do DNA de plasmídeo, uma PCR de controle era realizada nas mesmascondições da RT-PCR, mas sem a etapa de transcrição reversa. Essa PCR decontrole não revelou nenhuma ou revelou quantidades de importância secundária deampliação contaminante a partir do DNA que não afetavam o experimento de RT-PCR.

Tabela 5 - Primers usados para avaliar a expressão dos genes da via doMEP através de RT-PCR.

<table>table see original document page 39</column></row><table>

Para cada um dos genes da via do MEP1 mRNA foram especificamentedetectados na S. cerevisiae YIP-DV-02 em uma fase de cultivo tardia após exaustãoda galactose. Nenhuma banda foi observada na cepa controle YIP-0V-02 nãotransformada com genes da via do MEP (Fig 4). Este experimento mostraclaramente que os 7 genes da via do MEP são expressos na cepa YIP-DV-02.Exemplo 9: Efeito da Iovastatina no crescimento em frascos com agitação deS. cerevisiae expressando a via do MEP

A fim de testar a funcionalidade da via do MEP na cepa de S. cerevisiae queabriga a via do MEP a partir de E. coli, Iovastatina (mevinolina) foi usada comoinibidor da via do mevalonato. Entretanto, a Iovastatina é uma Iactona inativa, masna forma hidrolisada, ela age como um inibidor extremamente potente da HMG-CoAredutase. A Iovastatina foi hidrolisada em NaOH etanólico [15% (v/v) etanol, 0,25%(p/v) NaOH] a 60°C em banho-maria por 1 h. Após o resfriamento, a soluçãoestoque de Iovastatina 20 mg/ml foi esterilizada por filtro e armazenada a -20°C parao uso subseqüente.

Tubos de teste contendo o meio mínimo definido (Verduyn et al., 1992, Yeast8:501), diferentes níveis de Iovastatina e 20 g/L de galactose como fonte de carbonoforam inoculados a partir de uma pré-cultura para uma densidade ótica (OD) a600 nm de 0,01 e incubados a 30°C e 150 rpm, e o crescimento foi acompanhadomedindo-se a OD (Fig. 5). Observou-se que a cepa que abriga a via do MEP e avalenceno sintase (S. cerevisiae YIP-DV-02) demonstrou melhor crescimento napresença de lovastatina, comparada com as cepas controle somente com a via domevalonato nativa e a valenceno sintase (YIP-0V-01). A cepa controle paroucompletamente de crescer após 20 horas em uma OD de cerca de 12, enquanto quea cepa expressando a via do MEP continuou a crescer por mais de 60 horas eatingiu uma OD de cerca de 30 (Fig. 5). Isto mostra claramente que a via do MEP deE. coli é funcionalmente expressa na cepa S. cerevisiae YIP-DV-01.

Exemplo 10 Fermentação de duas fases para separação de isoprenóides in situ

Para acumular eficientemente os terpenos hidrofóbicos e altamente voláteis,uma fermentação de duas fases com solventes orgânicos imiscíveis ebiocompatíveis como a segunda fase pode ser usada. A fermentação de duas fasestem sido usada para separação de alguns metabólitos in situ em fermentações(Frenz et al., 1989, Enzyme Microb. Technol. 11:717; Sim et al., 2001, Biotechnol.Lett. 23:201). Neste exemplo, dodecane foi usado para separação in situ de valenceno. A produção de valenceno por S. cerevisiae expressando a via do MEP evalenceno sintase (YIP-DV-02) foi investigada. Como referência, a cepa queexpressava somente a valenceno sintase (YIP-0V-01) também foi cultivada. Naprimeira cepa, a valenceno sintase é expressa a partir de um promotor indutível porgalactose, enquanto que na última cepa, a valenceno sintase é expressa a partir do promotor constitutivo de TPI1. Isto significa que as diferenças observadas nos níveisde produção de valenceno entre as cepas são tanto um efeito da via do MEP quantopotencialmente também do promotor da valenceno sintase.

Com o fim de determinar a produção de terpeno por matéria seca demicroorganismo (biomassa), é aplicado o procedimento a seguir:

Frascos Erlenmeyer de 500 ml baffled [específicos para agitação], tampadoscom algodão, contendo 100 ml do meio mínimo definido (Verduyn et al., 1992, Yeast8:501) e 15 g/L de galactose foram inoculados, para uma densidade óptica (OD) a600 nm de 0,05 com culturas noturnas das cepas YIP-0V-01 ou YIP-DV-02 eincubados a 30°C e 150 rpm. Quando a OD a 600 nm atingia 1,0, 10 ml de dodecano (equivalentes a 10% do meio de cultura) foram adicionados a cada frascocom agitação. O dodecano não apresentou nenhum efeito significativo nocrescimento (dados não mostrados). Ao final da fase logarítmica, uma vez que agalactose tivesse sido esgotada, os meios eram centrifugados e a fase orgânicasuperior era analisada através de GC-MS [cromatografia gasosa com espectrometria de massa] quanto a valenceno (ver abaixo). A OD era verificada a cada hora após aadição de dodecano. O instante de esgotamento da galactose é quando a mediçãoda OD revela pela primeira vez que o crescimento exponencial terminou.

Os resultados são dados na Tabela 6. Este experimento comprovou apossibilidade de usar fermentação de duas fases para separação in situ devalenceno como isoprenóide volátil. A Tabela 5 mostra que a cepa que abriga a viado MEP acumulou aproximadamente 10 vezes mais valenceno comparada com acepa que expressava somente a via do mevalonato endógeno (MEV).

Tabela 6: fermentação de duas fases para avaliar a produção de valenceno pelascepas YIP-0V-01 e YIP-DV-02 no crescimento do lote em frascos com agitação com15 g/L de galactose

<table>table see original document page 42</column></row><table>

Para a análise e quantificação do terpeno, uma combinação deespectrometria de massa e cromatografia gasosa era usada conforme detalhadoabaixo:

Um cromatógrafo a gás Finnigan Focus equipado com espectrômetro demassa Finnigan Focus DSQ e uma coluna capilar ZB-5ms (30 m χ 250 pm Dl χ0,25 pm espessura do filme, Phenomenex) foi usado para a análise das amostras. Aanálise de GC-MS foi realizada usando um programa de temperatura da estufa doGC [cromatógrafo a gás] de 80°C durante 1 min, uma rampa de 10°C/min até 130°Cseguida por uma rampa de 3°C/min até 160°C e, finalmente uma rampa de 10°C/minaté 270°C e mantendo a temperatura em 270°C durante 5 min. 1 ml/min de hélio eraaplicado como gás transportador. A GC-MS foi realizada no modo splitless durante0,8 min e depois a split valve [válvula bifucurda] era aberta com 50 ml/min de splitflow.

A biomassa era determinada como peso celular seco através do uso de filtrosde nitrocelulose com tamanho de poro 0,45 μιτι (Gelman Sciences, Ann Arbor, Ml).

Primeiramente, os filtros eram previamente secos em um forno de microondas a180 W durante 10 min, e pesados. Um volume conhecido de cultura de células erafiltrado e, depois, o resíduo era lavado com água destilada. Finalmente, o filtro erasecado no microondas a 180 Wdurante 15 min, e pesado.

A concentração de terpeno por biomassa era calculada conforme segue: Aconcentração correspondente nos 100 ml de meio de cultura dada na Tabela 3 eracalculada como C = 0,01* Cv/0,1 = Cv/10, com Cv sendo a concentração devalenceno na fase de dodecano estabelecida por GC-MS conforme indicado acima.

O rendimento de terpeno (valenceno) na biomassa era calculado como aconcentração acumulada de valenceno dividida pela concentração acumulada debiomassa (a partir do instante de adição do dodecano até o instante de esgotamentoda galactose). Rendimento = (Cv/10) / (Xt - Xo), onde Xt é a concentração debiomassa no instante de esgotamento da galactose (e quantificação do valenceno),e Xo é a concentração de biomassa no instante de adição do dodecano. Aprodutividade era calculada como a concentração acumulada de valenceno divididapelo tempo de acumulação. Produtividade = (Cv/10) / (Tt - T0), onde Tt é o instantede esgotamento da galactose (e quantificação do valenceno) e To é o instante deadição do dodecano.

O experimento mostrou que o valenceno foi produzido por YIP-DV-02 em umrendimento de 39,9 pg de valenceno por g de peso seco de biomassa produzida,durante a fase exponencial de crescimento aeróbico do lote na galactose. Istocorrespondeu a uma produtividade volumétrica de 8,3 μ9 por L de meio por hora(Tabela 6).

Exemplo 11: Construção de uma cepa de S. cerevisiae expressando a via doMEP a partir de E. coli e apresentando deleção de um gene essencial na via domevalonato

Saccharomyces cerevisiae YIP-00-02 (MATa ura3 trpl) é usado para construiruma cepa com deleção de um gene essencial da via do mevalonato, através datransformação com um cassete de deleção. Um cassete de deleção para o gene deS. cerevisiae ERG13 é gerado por ampliação de PCR do marcador Kl URA3 a partirdo plasmídeo pWJ1077 (Reid et al., 2002, Methods Enzymol. 350, 258-277), comprimers contendo saliências para um subseqüente PCR de fusão com as regiõesanteriores e posteriores do ERG13 no genoma de S. cerevisiae. Essas regiões sãoobtidas através de PCR usando genoma de S. cerevisiae como modelo (Figura 6 eTabela 7). Os 4 fragmentos obtidos são combinados por PCR de fusão para obter 2fragmentos superpostos para parte do marcador Kl URA3. A PCR é realizada deacordo com as condições padrão Expand High Fidelity (Roche Applied Science). Osprodutos de PCR são purificados usando o Kit de Purificação de Produto de PCRAltamento Puro (Roche Applied Science) após cada PCR e etapa de PCR de fusão.

Tabela 7: Primers usados para deleção do ERG13

<table>table see original document page 44</column></row><table>dKI3' gtcagcggccgcatccctgcCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTG

3'int GAGCAATGAACCCAATAACGAAATC

ERG13dw_dKI3' gcagggatgcggccgctgacCGATTGCATCTTGCTGAACCC

ERG13_dw_r CCAGAGGTCAAATTCCCTC

Os adaptamers são exibidos com letras minúsculas.

Os fragmentos de DNA resultantes são usados para transformar S. cerevisiaeYIP-00-02 usando métodos padrão (Gietz e Woods, 2002) e graças à recombinaçãohomóloga in vivo, o ERG13 é deletado. Os transformadores AERG13 sãoselecionados em meio SC-ura suplementado com mevalonato (50 mg/L), ergosterol(10 mg/L) e Tween80 (0,5%). A correta deleção do ERG13 é verificada através dePCR diagnostica após isolamento do DNA total a partir de cada transformador(Sambrook e Russell, 2000) e fenotipando o crescimento na presença/ausência demevalonato, ergosterol ou Tween80. A cepa de S. cerevisiae MATa trpl Aergl3 éobtida e denominada YIP-M0-06.

O requisito de metabólito de S. cerevisiae YIP-M0-06 (MATa trpl Aergl3) podeser superado pela introdução da via do MEP a partir de E. coli, após ter laçado omarcador K.I. URA3 por cultivo em meio sintético suplementado com ácido 5-fluoro-orótico (5-FOA) (6,7 g/L base de nitrogênio para levedura sem aminoácidos, 2 g/Lmenos a mescla de retirada de ura, 50 mg/L uracil, 1 g/L 5-FOA, 2% glicose, 2%agar). Através da transformação desta cepa com plasmídeos plP001 e plP002,plP001 e plP003, plP001 e plP004, plP001 e plP005, ou plP001 e plP006, as cepasYIP-DV-04 (Aerg13, via do MEP e valenceno sintase), YIP-DC-03 (Aerg13 , via doMEP e cubebol sintase), YIP-DC-04 (Aerg13 , via do MEP e cubebol sintaseotimizada por códon), YIP-DP-03 (Aerg13 , via do MEP e patchoulol sintase) e YIP-DP-04 (Aerg13 , via do MEP e patchoulol sintase otimizada por códon) são obtidos,respectivamente.

Exemplo 12: Construção de uma cepa de S. cerevisiae produtora de licopeno,expressando a via do MEP a partir de E. coli

Uma variante ura3 de S. cerevisiae YIP-D0-01 foi primeiramente selecionadaplaqueando esta cepa em meio sintético suplementado com ácido 5-fluoro-orótico (5-FOA) (6,7 g/L base de hidrogênio para levedura sem aminoácidos, 2 g/L menos a deretirada de ura, 50 mg/L uracil, 1 g/L 5-FOA, 2% glicose, 2% agar). A cepa YIP-DO-01 (MATa ura3 MEP) selecionada é usada para expressão dos genes para produçãode licopeno.

Os genes biossintéticos de licopeno foram derivados de genes críE (acessoGenebank no. AAA21260), críB (acesso Genebank no. AAA21264) e crtl (acessoGenebank no. AAA21263) de Erwinia herbicoia que codificam, respectivamente, umageranilgeranil difosfato sintase, um fitoeno sintase e uma fitoeno desaturase. Asseqüências nucleotídicas dos genes biossintéticos de licopeno foram modificadaspara otimizar sua expressão na levedura. Os códons foram modificados sem mudaras seqüências de aminoácidos. Os três genes crt otimizados por códon foramsintetizados com locais de restrição apropriados adicionados a suas extremidades eprincipalmente clonados no plasmídeo pCR4TOPO (Invitrogen) e os genes queproduzem os plasmídeos crtE, crtB e crtl foram denominados plP033, plP034 eplP035, respectivamente (Figura 7).

Os genes crt no plasmídeo pCR4TOPO foram digeridos usando enzimas derestrição e foram subclonados nos vetores de expressão de levedura pESC-URA epESC-HIS (Stratagene). Os DNA de plasmídeo plP033 e pESC-URA foram digeridoscom enzimas de restrição Sacl e Notl, e submetidos a eletroforese de agarose comgel. Os fragmentos resultantes foram purificados com gel usando o Kit de PurificaçãoGFX Gel Band (Amersham Biosciences), ligado in vitro, seguido pela transformaçãoem E. coli, seleção dos transformadores e verificação dos transformadores atravésde análise de perfil de restrição e seqüenciamento. A partir de transformadoresexibindo ligação correta do gene crtE com o vetor pESC-URA, o plasmídeo plP036era purificado e armazenado.

Os DNA de plasmídeo plP035 e pESC-HIS foram subseqüentementedigeridos com enzimas de restrição Sacl e Spel. Os fragmentos resultantes forampurificados com gel, ligados in vitro, seguidos pela transformação em E. coli, seleçãodos transformadores e verificação dos transformadores através de perfilagem derestrição e seqüenciamento. Os transformadores com a ligação correta do gene crtlcom o vetor pESC-HIS foram usados para purificar o plasmídeo (plP037).

Os DNA de plasmídeo plP034 e plP037 foram subseqüentemente digeridoscom enzimas de restrição Sall e Xhol e o plasmídeo plP038 (gene crtB com o vetorplP037) foi obtido da mesma maneira indicada anteriormente, purificado earmazenado.

Para reduzir a instabilidade do plasmídeo e facilitar a integração posterior dosgenes no genoma de S. cerevisiae, os 2 plasmídeos (plP036 e plP38) foramcombinados juntos de modo a obter o plasmídeo plP039. A combinação dos doisplasmídeos foi feita usando o método de reparo de gap em S. cerevisiae (DeMariniet ai, 2001, BioTechniques 30:520-52). Para construir o plasmídeo plP039, o pedaçode DNA contendo promotores de crtl, crtB, GAL1, GAL10 e terminadores de GAL10,CYC1 e ADH1 (plP038) foi ampliado através de PCR usando os primers pfus_grf epfus_grr (Tabela 1). O produto de PCR resultante foi purificado usando o Kit dePurificação de Produto de PCR Altamente Puro (Roche Applied Science). Oplasmídeo plP036 (pESC-URA contendo crtE) foi digerido por Mfel esubseqüentemente purificado após eletroforese com gel usando o Kit de Extraçãopor Gel QIAEX® Il (Qiagen). O plasmídeo purificado e digerido junto com os produtosde PCR foi usado na transformação de S. cerevisiae YIP-00-03 (MATa ura3). Ostransformadores foram selecionados em placas contendo meio SC-ura. Após 2-3dias de incubação a 30°C, todos os transformadores foram inoculados em um únicotubo de ensaio contendo 5 mL de SC-ura e incubados 12 h a 30°C. A partir destecultivo, o DNA total foi isolado e utilizado depois para transformar quimicamente ascélulas competentes de E. coli DH5a. Os transformadores foram selecionados emplacas contendo meio LB suplementado com ampicilina. Os transformadores foramdepois verificados para purificar os plasmídeos e realizar a digestão enzimática comenzimas de restrição adequadas. No caso de transformadores contendo o plasmídeoesperado, 1 pg de DNA de plasmídeo era purificado e enviado paraseqüenciamento. O plasmídeo resultante pESC-URA contendo genes crtE, crtB ecrtl foi obtido e denominado plP039. A Figura 8 mostra diferentes genes crt contendoo vetor pESC construído.

Uma cepa de S. cerevisiae produtora de licopeno, expressando a via do MEPa partir de E. coli, é construída transformando S. cerevisiae YIP-D0-01 (MATa ura3MEP) com o plasmídeo plP039 construído contendo crtE, crtl e crtB . A ceparesultante éYIP-DK-01.

Aplicabilidade industrial

O microorganismo da presente invenção é útil para a produção de compostoscomplexos de terpeno, seus precursores e seus derivados.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

TITULAR: FIRMENICH SA

ENDEREÇO: 1 ROUTE DES JEUNES, 1211 GENEVA 8 SUÍÇAPRIORIDADE: PCT/IB2006/050476, datado de 14.02.2006TÍTULO DA INVENÇÃO: MÉTODO PARA PRODUZIR TERPENOS E, PORTANTO,MICROORGANISMOS TRANSFORMADORES POR MEP.FORMATO PARA LEITURA EM COMPUTADOR: PATENTIN VERSÃO 3.3NÚMERO DE SEQÜÊNCIA CONSTANTE NO PEDIDO: 46NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 1TAMANHO: 31TIPO: DNANOME: Artificial1

ggactagtcc taatgaagca actcaccatt c 31

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 2TAMANHO: 29TIPO: DNANOME: Artificial2

ccatcgatgg tcagcttgcg agacgcatc 29

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 3TAMANHO: 52TIPO: DNANOME: Artificial3actttaacgt caaggagaaa aaaccccgga tcccatgagt tttgatattg cc 52

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 4TAMANHO:55TIPO: DNANOME: Artificial

4

ttcttcggaa atcaacttct gttccatgtc gacgccttat gccagccagg ccttg 55NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 5TAMANHO: 31TIPO: DNA

NOME: Artificial

5

ggactagtcc taatggcaac cactcatttg g 31

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 6TAMANHO: 29TIPO: DNANOME: Artificial

6

ccatcgatgg ttatgtattc tcctgatgg 29

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 7TAMANHO: 54TIPO: DNANOME: Artificial7

actttaacgt caaggagaaa aaaccccgga tcccatgcgg acacagtggc cctc 54NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 8

TAMANHO: 57

TIPO: DNA

NOME: Artificial

8

ttcggaaatc aacttctgtt ccatgtcgac gccttaaagc atggctctgt gcaatgg 57NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 9TAMANHO: 29

TIPO: DNA

NOME: Artificial

9

ggactagtcc taatgcgaat tggacacgg 29

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 10

TAMANHO: 29

TIPO: DNA

NOME: Artificial

ccatcgatgg tcattttgtt gccttaatg 29NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 11

TAMANHO: 34TIPO: DNANOME: Artificial11

ggactagtcc taatgcataa ccaggctcca attc 34

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 12TAMANHO: 30TIPO: DNANOME: Artificial12

cgagctcgtt atttttcaac ctgctgaacg 30

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 13TAMANHO: 36TIPO: DNANOME: Artificial13

gcgtcgacgt cttgatgcag atcctgttgg ccaacc 36

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 14TAMANHO: 33TIPO: DNANOME: Artificial

14

ccctcgaggg tttaatcgac ttcacgaata tcg 33

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 15TAMANHO: 59TIPO: DNA

NOME: Artificial

15

cagcactacc ctttagctgt tctatatgct gccactccta cgcaaaccgc ctctccccg 59NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 16TAMANHO: 58TIPO: DNANOME: Artificial16

aggaaatgat agcattgaag gatgagacta atccaattat cggtgcgggc ctcttcgc 58NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 17TAMANHO: 38TIPO: DNANOME: Artificial17

cgggatcccg tgggccctat ggcacttcaa gattcaga 38

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 18TAMANHO: 34TIPO: DNANOME: Artificial18

aagacgtcga cgcttcaaaa gggaacaggc ttct 34

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 19TAMANHO: 38TIPO: DNANOME: Artificial19

cgggatcccg tgggccctat gtcgtctgga gaaacatt 38

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 20TAMANHO: 34TIPO: DNANOME: Artificial20

aagacgtcga cgcttcaaaa tggaacgtgg tctc 34

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 21TAMANHO: 59TIPO: DNANOME: Artificial21

actttaacgt caaggagaaa aaaccccgga tccaatggag ttgtatgccc aaagtgttg 59NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 22TAMANHO: 64TIPO: DNANOME: Artificial22

ttcttcggaa atcaacttct gttccatgtc gacgccttaa tatggaacag ggtgaaggta 60caac 64

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 23TAMANHO: 20TIPO: DNANOME: Artificial23

cagtgattca ctcaatggtg 20

- NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 24

TAMANHO: 22TIPO: DNANOME: Artificial

24

acgcatcacc tcttttctgg cg 22

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 25

TAMANHO: 22

TIPO: DNA

NOME: Artificial

25

ctggcagaac aggcggaagt tg 22

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 26

TAMANHO: 21

TIPO: DNA

NOME: Artificial

26

acgcagctct ttcggcactt c 21

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 27

TAMANHO: 20

TIPO: DNA

NOME: Artificial

27

gctccatgcg ttgaccgatg 20

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 28

TAMANHO: 22

TIPO: DNA

NOME: Artificialccggtaaatc ccagtttttc cg 22

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 29TAMANHO: 22TIPO: DNANOME: Artificial

29

taaagatcct gaactcccgc gc 22

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 30TAMANHO: 20TIPO: DNANOME: Artificial

30

catggctctg tgcaatgggg 20

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 31TAMANHO: 21TIPO: DNANOME: Artificial

31

cgcaccagtg cgcgatacta t 21

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 32TAMANHO: 22TIPO: DNANOME: Artificial32cctgatggat ggttcgggtg ag 22

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 33

TAMANHO: 20

TIPO: DNA

NOME: Artificial

33

aacttcatcg cctgcccgac 20

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 34

TAMANHO: 20

TIPO: DNA

NOME: Artificial

34

caattcgacg cgcttcgtcc 20

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 35

TAMANHO: 21

TIPO: DNA

NOME: Artificial

35

tgatgccaga agcggcgaaa g 21

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 36TAMANHO: 20TIPO: DNANOME: Artificial

36

ttggcttcca taccagcggc 20NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 37TAMANHO: 20TIPO: DNANOME: Artificial37

gccggtattg accaaactac 20

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 38TAMANHO: 20TIPO: DNANOME: Artificial

38

ggtgatttcc ttttgcattc 20

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 39TAMANHO: 19TIPO: DNA

NOME: Artificial

39

gacgaactgg atgagatgg 19

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 40TAMANHO: 39TIPO: DNANOME: Artificial

40

gatccccggg aattgccatg gagagtttca tgctgcacc 39

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 41TAMANHO: 41TIPO: DNANOME: Artificial41

catggcaatt cccggggatc gtgattctgg gtagaagatc g 41

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 42TAMANHO: 25TIPO: DNANOME: Artificial42

cttgacgttc gttcgactga tgagc 25

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 43TAMANHO: 44TIPO: DNANOME: Artificial

43

gtcagcggcc gcatccctgc cctcactaaa gggaacaaaa gctg 44

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 44TAMANHO: 25TIPO: DNA

NOME: Artificial

44

gagcaatgaa cccaataacg aaatc 25

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 45TAMANHO: 41TIPO: DNANOME: Artificial

45

gcagggatgc ggccgctgac cgattgcatc ttgctgaacc c 41

NÚMERO IDENTIFICADOR DA SEQÜÊNCIA: 46

TAMANHO: 19

TIPO: DNA

NOME: Artificial

46

ccagaggtca aattccctc 19

Claims (21)

1. MICROORGANISMO RECOMBINANTE, caracterizado por compreenderuma via heteróloga para converter 1-deoxi-D-xilulose 5-fosfato (DXP) em isopentenildifosfato (IPP) e/ou dimetilalil difosfato (DMAPP), o metabolismo nativo do ditomicroorganismo sendo desprovido da dita via.

2. MICROORGANISMO RECOMBINANTE da reivindicação 1, caracterizadopor ainda compreender um gene heterólogo para a produção de DXP.

3. MICROORGANISMO RECOMBINANTE da reivindicação 1 ou 2,caracterizado por compreender genes heterólogos da via do 2-metileritritol 4-fosfato (MEP).

4. MICROORGANISMO RECOMBINANTE da reivindicação 2 ou 3,caracterizado por ser um fungo, preferivelmente do gênero Sacharomyces.

5. MICROORGANISMO RECOMBINANTE de qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes caracterizado por compreender genes heterólogos que codificam umaDXP-redutoisomerase, MEP citidililtransferase, CDP-ME quinase, MECDP sintase,MECDP redutase e HMBPP redutase funcionais.

6. MICROORGANISMO RECOMBINANTE da reivindicação 2, caracterizadopor compreender genes heterólogos que codificam uma DXP-sintase, DXP-redutoisomerase, MEP citidililtransferase, CDP-ME quinase, MECDP sintase,MECDP redutase e HMBPP redutase funcionais.

7. MICROORGANISMO RECOMBINANTE de qualquer das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado por compreender ao menos um gene heterólogo quecodifica uma terpeno sintase funcional.

8. MICROORGANISMO RECOMBINANTE da reivindicação 7, caracterizadopor fornecer um rendimento de pelo menos 100 pg de terpeno por g de peso secodo microorganismo, na síntese do terpeno em um meio apropriado domicroorganismo.

9. MICROORGANISMO RECOMBINANTE de qualquer das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado por compreender ao menos um gene heterólogo quecodifica uma mono, sesqui e/ou diterpeno sintase funcional.

10. MICROORGANISMO RECOMBINANTE de qualquer das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelos genes da via heteróloga estarem presentes emplasmídeos no microorganismo.

11. MICROORGANISMO RECOMBINANTE da reivindicação 10, caracterizadopor compreender dois plasmídeos, cada um compreendendo ao menos 3 genes davia heteróloga.

12. MICROORGANISMO RECOMBINANTE da reivindicação 10, caracterizadopor compreender ao menos dois (2) plasmídeos que, tomados em conjunto,compreendem os genes dxs, dxr, ispD, ispE, ispF, gcpE, IytB e um gene que codificaa terpeno sintase.

13. MICROORGANISMO RECOMBINANTE da reivindicação 12, caracterizadopelos ditos genes serem transportados em dois plasmídeos.

14. MICROORGANISMO RECOMBINANTE de qualquer das reivindicações 1-9,caracterizado pelos genes que codificam a via heteróloga serem integrados aogenoma do microorganismo.

15. MICROORGANISMO RECOMBINANTE da reivindicação 4, caracterizadopor ser a cepa de Saccharomyces cerevisiae YIP-DV-02 tendo número de depósitoDSM 17900.

16. MÉTODO para acumular um terpeno na célula e/ou meio de ummicroorganismo, caracterizado pelo microorganismo ser um microorganismorecombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15.

17. MÉTODO da reivindicação 16, caracterizado por compreender a etapa decultivar o microorganismo em um meio apropriado.

18. MÉTODO para produzir um terpeno, caracterizado por compreender a etapade cultivar o microorganismo de qualquer das reivindicações 1 - 15 em um meioapropriado para a produção do dito terpeno e, opcionalmente, isolando o terpeno apartir do meio e/ou do microorganismo.

19. MÉTODO da reivindicação 17 ou 18, caracterizado pela etapa de cultivar omicroorganismo ser realizada, ao menos parcialmente, via uma fermentação de duasfases.

20. MÉTODO para preparar um microorganismo recombinante capaz de acumulare/ou produzir um terpeno, caracterizado por compreender a etapa detransformação de um microorganismo desprovido da via do MEP nativa com genesde uma via do MEP heteróloga e ao menos um gene que codifica a terpeno sintase.

21. MÉTODO para aumentar a quantidade de precursores de terpeno em ummicroorganismo, desprovido da via do MEP nativa, caracterizado por compreendera etapa de transformação do dito microorganismo com genes de uma via do MEPheteróloga e opcionalmente ao menos um gene que codifica a terpeno sintase.