BRPI0709552A2 - composição, e, método para aumentar a contagem dos glóbulos brancos em um paciente - Google Patents

Abstract

COMPOSIçãO, E, MéTODO PARA AUMENTAR A CONTAGEM DOS GLóBULOS BRANCOS EM UM PACIENTE. Colónia de granulócito estimulando fator obtido ovos postos por aves transgênieas tendo padrões de glicosilação G-CSF recentemente descritos.

Description

"COMPOSIÇÃO, E, MÉTODO PARA AUMENTAR A CONTAGEM DOSGLÓBULOS BRANCOS EM UM PACIENTE"Informação A Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica o benefício dos pedidos de patenteprovisórios n~ 60/783.648, depositado em 17 de março de 2006, e60/840.291, depositado em 25 de agosto de 2006.

Campo Da Invenção

A presente invenção diz respeito à introdução de materialgenético exógeno nas células aviárias e à expressão do material genéticoexógeno nas células aviárias. A invenção, particularmente, diz respeito aespécies aviárias transgênicas, incluindo galinha, codorna e peru, e a aves quedepositam ovos contendo proteínas exógenas, por exemplo proteínasfarmacêuticas.Fundamentos

Numerosas proteínas naturais e sintéticas são usadas emaplicações diagnosticas e terapêuticas; muitas outras se acham emdesenvolvimento ou em provas clínicas. Os métodos correntes de produção deproteínas incluem o isolamento das fontes naturais e a produção recombinantenas células bacterianas e de mamíferos. Por causa da complexidade e do altocusto destes métodos de produção de proteínas, entretanto, esforços acham-sea caminho para o desenvolvimento de alternativas. Por exemplo, métodospara produzir proteínas exógenas no leite de porcos, ovelhas, cabras e vacastêm sido relatados. Estas abordagens têm certas limitações, incluindo ostempos longos de geração entre o criador e os rebanhos transgênicos deprodução, custos extensivos de administração e de veterinários, e níveisvariáveis de expressão por causa dos efeitos de posição no sítio da introduçãode transgenes no genoma. As proteínas estão também sendo produzidas com ouso de processos de moagem e de maltagem da cevada e do centeio.Entretanto, as modificações pós-translacionais das plantas diferem dasmodificações pós-translacionais dos vertebrados, o que freqüentemente temum efeito crítico sobre a função das proteínas exógenas tais como as proteínasfarmacêuticas.

Como a cultura de tecidos e os biorreatores de glândulasmamárias, o oviduto aviário também pode potencialmente servir como umbiorreator. Métodos bem sucedidos de modificar o material genético aviário,de tal modo que altos níveis de proteínas exógenas sejam secretadas nooviduto e acondicionadas nos ovos, devem possibilitar a produção nãodispendiosa de grandes quantidades de proteína. Várias vantagens de uma talabordagem devem ser: a) curtos tempos de geração (24 semanas) e rápidoestabelecimento de rebanhos transgênicos através de inseminação artificial; b)produção facilmente graduada por tamanhos crescentes dos rebanhos paraatender às necessidades de produção; c) modificação pós-translacional dasproteínas expressas; 4) alimentação e coleta dos ovos automáticas; d) clarados ovos naturalmente estéreis; e e) custos reduzidos de processamento porcausa da alta concentração de proteínas na clara dos ovos.

O sistema reprodutivo das aves, incluindo o das galinhas, ébem descrito. O ovo da galinha consiste de várias camadas que são secretadassobre a gema durante sua passagem através do oviduto. A produção de umovo começa com a formação da grande gema no ovário da galinha. O oócitonão fertilizado é então posicionado no topo do saco vitelino. Após a ovulaçãoou liberação da gema do ovário, o oócito passa para o infiindíbulo do oviduto,onde ele é fertilizado se o esperma estiver presente. Ele então se movimentapara o magno do oviduto que se acha em linha com as células das glândulastubulares. Estas células secretam as proteínas da clara, incluindo aovalbumina, a lisozima, ovomucóide, conalbumina e ovomucina, dentro dolúmen do magno, onde elas são depositadas sobre o embrião e a gema dasaves..

O gene da ovalbumina codifica uma proteína de 45 dD, que éespecificamente expressa nas células da glândula tubular do magno dooviduto [Beato Cell 56: 335-344 (1989)]. A ovalbumina é a proteína da claramais abundante, compreendendo mais do que 50 por cento da proteína totalproduzida pelas células da glândula tubular, ou cerca de 4 gramas de proteínapor ovo grande de Graduação A (Gilbert, iiEgg albumen and its formatiori"em Physiology and Biochemistry of the Domestic Fowl, Bell e Freeman, eds.,Academic Press, London, N.Y., pp. 1291-1329). O gene da ovalbumina emais do que 20 kb de cada região de flanqueio foram clonados e analisados[Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75: 2205-2209 (1978); Gannon et al.,Nature 278: 428-424 (1979); Roop et al., Cell 19: 63-68 (1980); e Royal etal., Nature 279: 125-132 (1975)].

Muita atenção tem sido dispensada à regulação do gene daovalbumina. O gene responde a hormônios esteróides tais como o estrogênio,os glicocorticóides e a progesterona, os quais induzem o acúmulo de cerca de70.000 transcritos de mRNA da ovalbumina por célula de glândula tubular emfilhotes imaturos e 100.000 transcritos de mRNA da ovalbumina por célula deglândula tubular na galinha poedeira madura [Palmiter, J. Biol. Chem. 248:8260-8270 (1973); Palmiter, Cell 4: 189-197 (1975)]. A análise dahiperssensibilidade da DNAse e os ensaios do genes do promotor-repórter emcélulas de glândulas tubulares transfectadas definiram uma região de 7,4 kbcomo contendo seqüências necessárias para a expressão do gene daovalbumina. Esta região de flanqueio 5' contém quatro sítios 1-hipersensíveisda DNAse centrados em -0,25, -0,8, -3,2 e -6,0 kb do sítio de início datranscrição. Estes sítios são denominados HS-I, -II, -III e -IV respectivamente.Estas regiões refletem alterações na estrutura da cromatina e sãoespecificamente correlacionadas com a expressão do gene da ovalbumina nascélulas do oviduto [Kaye et al., EMBO 3: 1137-1144 (1984)]. Ashipersensibilidades de HS-II e -III are induzidas pelo estrogênio que suportaum papel para estes regiões na indução hormonal da expressão do gene daovalbumina.

HS-I e HS-II são ambos necessários para a indução esteróideda transcrição do gene da ovalbumina, e uma porção de 1,4 kb da região 5'que inclui estes elementos é suficiente para conduzir a expressão daovalbumina dependente de esteróides, nas células da glândula tubularexplantada [Sanders e McKnight, Biochemistry 27: 6550-6557 (1988)]. HS-Ié denominado o elemento de resposta negativa ("NRE") porque ele contémvários elementos reguladores negativos que reprimem a expressão daovalbumina na ausência de hormônios [Haekers et al., Mol. Endo. 9: 1113-1126 (1995)]. Fatores protéicos ligam estes elementos, incluindo algunsfatores apenas encontrados nos núcleos do oviduto, sugerindo um papel naexpressão específica do tecido. O HS-II é denominado elemento de respostadependente de esteróide ("SDRE") porque ele é necessário para promover aindução de esteróides da transcrição. Ele liga uma proteína ou complexoprotéico conhecido como Chirp-I. O Chirp-I é induzido pelo estrogênio e semodifica rapidamente na presença de cicloexamida [Dean et al., Mol. CellBiol. 16: 2015-2024 (1996)]. As experiências com o uso de um sistema decultura de células da glândula tubular explantada definiram um conjuntoadicional de fatores que ligam SDRE de uma maneira dependente deesteróides, incluindo um fator semelhante a NFkB [Nordstrom et al., J. Biol.Chem. 268: 13193-13202 (1993); Schweers e Sanders, J. Biol. Chem. 266:10490-10497(1991)].

Menos é conhecido acerca da função de HS-III e -IV. O HS-IIIcontém um elemento de resposta a estrogênio funcional, e confereindutibilidade ao estrogênio ou ao promotor proximal da ovalbumina ou a umpromotor heterólogo quando cotransfectado nas células HeLa com um cDNAdo receptor de estrogênio. Estes dados significam que HS-III podedesempenhar um papel funcional na regulação global do gene da ovalbumina.Pouco é conhecido acerca da função do HS-IV, exceto que ele não contém umelemento de resposta a estrogênio funcional [Kato et al., Cell 68: 731-742(1992)].

Tem havido muito interesse em modificar os genomaseucarióticos pela introdução de material genético estranho e/ou pelorompimento de genes específicos. Certas células eucarióticas podemcomprovar serem hospedeiros superiores para a produção de proteínaseucarióticas exógenas. A introdução de genes codificando certas proteínastambém leva em conta a criação de novos fenótipos que possam ter valoreconômico aumentado. Além disso, alguns estados de doença geneticamentecausados podem ser curados pela introdução de um gene estranho que permitaque as células geneticamente defeituosas expressem a proteína que elas nãopoderiam de outra forma produzir. Finalmente, a modificação de genomas deanimais pela inserção ou remoção do material genético permite estudosbásicos da função dos genes, e finalmente podem permitir a introdução degenes que podem ser usados para curar estados de doença, ou resultem emfenótipos melhorados de animais.

A transgênese tem sido realizada em mamíferos por váriosmétodos diferentes. Primeiro, em mamíferos incluindo camundongo, porco,cabra, carneiro e vaca, um transgene é microinjetado no pró-núcleo de um ovofertilizado, o qual é então colocado no útero de uma mãe adotiva, onde ele dáorigem a um animal criador carregando o transgene em sua linha germinativa.O transgene é engendrado para carregar um promotor com seqüênciasreguladoras específicas dirigindo a expressão da proteína estranha para umtipo particular de células. Uma vez o transgene se introduza aleatoriamente nogenoma, os efeitos da posição no sítio da introdução do transgene no genomapodem variavelmente causar níveis reduzidos de expressão transgene. Estaabordagem também requer caracterização do promotor, de tal modo que asseqüências necessárias para dirigir a expressão do transgene no tipo celulardesejado sejam definidas e incluídas no vetor transgene [Hogan et al.Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory, NY(1988)].

Um segundo método para efetuar a transgênese animal é orompimento do gene alvejado, em que um vetor alvo contendo seqüência dogene alvo franqueando um gene marcador selecionável é introduzido nascélulas tronco embriônicas ("ES"). Por recombinação homóloga, o vetor alvosubstitui as seqüências de genes alvo no lócus cromossômico ou introduz nasas seqüências interiores prevenindo a expressão do produto de genes alvo. Osclones das células ES, tendo o gene apropriadamente rompido, sãoselecionados e depois injetados nos blastócitos de estágio prematuro gerandoanimais criadores quiméricos, alguns dos quais tendo o transgene na linhagerminativa. No caso em que o transgene delete o lócus alvo, ele substitui olócus alvo com atributo de DNA estranho no vetor transgene, o qual consistede DNA codificando um marcador selecionável útil para detectar as célulasES transfectadas em cultura e podendo adicionalmente conter seqüências deDNA codificando uma proteína estranha que é então introduzida no lugar dogene deletado, de tal modo que o promotor do gene alvo conduza a expressãodo gene estranho [Patentes U.S. n~ 5.464.764 e 5.487.992 (Μ. P. Capecchi eK. R. Thomas)]. Esta abordagem padece da limitação de que as células ES sãoindisponíveis em muitos mamíferos, incluindo cabras, vacas, carneiro eporcos. Além disso, este método não é útil quando o gene deletado érequerido para a sobrevivência ou desenvolvimento apropriado do organismoou tipo celular.

Desenvolvimentos recentes na transgênese aviária têmpermitido a modificação dos genomas aviários. Galinhas transgênicas da linhagerminativa podem ser produzidas pela injeção de retrovírus defeituosos dereplicação dentro da cavidade subgerminal dos blastodermas de filhotes emovos recém-postos [Patente U.S. n° 5.162.215; Bosselman et ai., Science 243:533-534 (1989); Thoraval et ai., Transgenic Research 4: 369-336 (1995)]. Oácido nucléico retroviral carregando um gene estranho introduz-se em umcromossoma das células embriônicas, gerando animais transgênicos, algunsdos quais tendo o transgene em sua linha germinativa. O uso de elementosisoladores introduzidos nas regiões 5' ou 3' da construção de genes fundidospara superar os efeitos da posição no sítio de introdução, foi descrito [Chim etal., Celll4: 504-514(1993)].

Em outra abordagem, um transgene foi microinjetado no discogerminal de um ovo fertilizado para produzir uma ave criadora transgênicaestável que pudesse passar o gene para a geração Fl [Love et al.,Bio/Technology 12: 60-63 (1994)]. Entretanto, este método tem desvantagensvárias. As galinhas devem ser sacrificadas de modo a coletar-se o ovofertilizado, a fração das criadoras transgênicas é baixa, e os ovos injetadosnecessitam de cultura in vitro de trabalho intensivo nas cascas substitutas.

Em outra abordagem, as células blastodérmicas contendo ascélulas germinativas primordiais prováveis ("PGCs") são excisadas dos ovosdoadores, transfectadas com um transgene e introduzidas na cavidadesubgerminal dos embriões receptores. As células doadoras transfectadas sãoincorporadas nos embriões receptores, gerando embriões transgênicos, algunsdos quais sendo esperados possuírem o transgene na linha germinativa. Otransgene se introduz nos sítios cromossômicos aleatórios por recombinaçãonão homóloga. Entretanto, nenhuma ave criadora transgênicas foi aindagerada por este método.

Lui, Poult. Sei. 68: 999-1010 (1995), usou um vetor alvocontendo seqüências de DNA de flanqueio do gene de vitelogenina paradeletar parte do gene residente nas células blastodérmicas de galinhas emcultura. Entretanto, não foi demonstrado se estas células podem contribuirpara a linha germinativa e assim produzir um embrião transgênico. Alémdisso, este método não é útil quando o gene deletado é requerido para asobrevivência ou desenvolvimento apropriado do tipo de organismo ou célula.Assim, pode-se observar que existe uma necessidade de ummétodo de introduzir DNA estranho, operavelmente ligado a um promotoradequado, dentro do genoma aviário, de tal modo que a expressão eficiente deum gene exógeno possa ser alcançada. Além disso, existe uma necessidade decriar aves transgênicas modificadas na linha germinativa, que expressemgenes exógenos em seus ovidutos e secretem as proteínas exógenas expressasdentro de seus ovos.

Quando o interferon foi descoberto em 1957, ele foi aclamadocomo um agente antiviral significativo. Nos idos de 1970, o interferon tornou-se associado com a tecnologia do gene recombinante. Hoje, o interferon é umsímbolo da complexidade dos processos biológicos do câncer, e do valor daduração e persistência em manejar esta complexidade.

Os genes anormais que causam câncer compreendem pelomenos três tipos: primeiramente, existem os oncogenes, os quais, quandoalterados, favorecem o crescimento e divisão anormais que caracterizam ocâncer. Em segundo lugar, existem oso genes supressores de tumores, osquais, quando alterados, falham no controle deste crescimento e divisãoanormais. Em terceiro lugar, existem genes de reparo do DNA, os quais,quando alterados, falham no reparo das mutações que podem levar ao câncer.Os pesquisadores especulam que existem cerca de 30 a 40 genes supressoresde tumores no corpo, cada um dos quais produzindo uma proteína. Estasproteínas podem ser controladas pelas proteínas supressoras de tumores"mestre" tais como Rb (para retinoblastoma, com o qual ele foi primeiroassociado) e p53 (associado com muitos tumores diferentes). A evidência dolaboratório sugere que o retorno apenas de um destes genes supressores detumores à sua função normal pode apreciavelmente reduzir a agressividade damalignidade.

Os cientistas ficaram intrigados pelo interferon, quando ele foidescoberto, pelo fato do interferon poder inibir o crescimento celular. Alémdisso, o interferon foi observado possuir certos efeitos positivos sobre osistema imune. Ele é agora considerado análogo a uma proteína supressora detumores: ele inibe o crescimento das células, particularmente as célulasmalignas; ele bloqueia os efeitos de muitos oncogenes e de fatores docrescimento; e, diferente de outros agentes biológicos, ele inibe a motilidadecelular que é crítica para o processo da metástase.

A comunicação intercelular é dependente do funcionamentoapropriado de todos os componentes estruturais do tecido, através dos quais asmensagens são conduzidas: a matriz, a membrana celular, o citosqueleto, e aprópria célula. No câncer, a rede de comunicação entre as células é rompida.Se o citosqueleto for rompido, as mensagens não atravessam o núcleo e onúcleo começa a funcionar anormalmente. Tendo em vista que o núcleo é osítio em que os oncogenes ou genes supressores tumorais se tornam ligadosou desligados, este funcionamento anormal pode levar à malignidade. Quandoisto acontece, as células começam a crescer irregularmente e não sediferenciam. Elas podem também começar a mover e romper outras células.Acredita-se que o interferon, provavelmente de comum acordo com outrassubstâncias extracelulares e celulares, restaure o equilíbrio da homeostasia,tornando seguras as mensagens que passam apropriadamente. O interferoninterrompe o crescimento, interrompe a motilidade, e intensifica a capacidadeda célula, através das moléculas de adesão, para responder ao seu ambiente.Ele também corrige defeitos e lesões no citosqueleto. O interferon tem sidoobservado bloquear a angiogênese, a etapa inicial na formação de novos vasossangüíneos que é essencial para o crescimento das malignidades. Além disso,ele bloqueia a fibrose, uma resposta à lesão que estimula muitas espéciesdiferentes de células e promove o crescimento celular (Kathryn L. Hale,Oncolog, Interferon: The Evolution of a Biological Therapy, Taking a NewLook at Cytokine Biology)..

O interferon é produzido pelas células animais quando elas sãoinvadidas por vírus, e é liberado na corrente sangüínea ou no fluidointercelular para induzir células saudáveis a fabricar uma enzima que seoponha à infecção. Por muitos anos, o fornecimento do interferon humanopara pesquisa foi limitado pelas técnicas de extração dispendiosas. Em 1980,entretanto, a proteína tornou-se disponível em maiores quantidades através daengenharia genética (isto é, formas recombinantes da proteína). Os cientistastambém determinaram que o corpo produz três tipos distintos de interferon,referidos como interferon-a(alfa), -p(beta) e -y(gama). Pensou-se primeiroque os interferons fossem altamente específicos da espécie, mas sabe-se agoraque os interferons individuais podem ter diferentes faixas de atividade emoutras espécies. O interferon alfa (α-IFN) foi aprovado para uso terapêuticocontra a leucemia de células pilosas e a hepatite C. O α-IFN também foiobservado ser eficaz contra a hepatite B crônica, uma causa principal docâncer do fígado e da cirrose, bem como para o tratamento das verrugasgenitais e de alguns cânceres mais raros do sangue e da medula óssea. Aspulverizações nasais contendo o α-IFN proporciona alguma proteção contraos resinados causados pelos rinovírus. O α-IFN humano pertence a umafamília das proteínas de sinalização extracelular com atividades antivirais,antiproliferativas e imunomoduladoras. As proteínas de IFN-α sãocodificadas por uma família de multigenes que inclui 13 genes aglomeradossobre o cromossoma 9 humano. A maioria dos genes de IFN-α é expressa nonível de mRNA em leucócitos induzidos pelo vírus Sendai. Além disso, foiobservado que pelo menos nove subtipos diferentes são também produzidosno nível protéico. O significado biológico da expressão de várias proteínas deIFN-α similares não é conhecido, porém acredita-se que elas tenham padrõesquantitativamente distintos de atividades antivirais, inibidoras do crescimentoe estimuladoras das células exterminadoras. Correntemente, duas variantes diIFN-α, o IFN-α 2a e o IFN-α 2b, são produzidas em massa em Escherichiacoli mediante tecnologia recombinante e comercializadas comomedicamentos.

Diferentes do IFN-α natural, estes produtos de IFN-arecombinantes foram observados serem imunogênicos em alguns pacientes, oque pode ser devido a formas não naturais das proteínas de IFN-α. Assim,para o desenvolvimento dos medicamentos de IFN-α é necessário não apenasidentificar os subtipos de IFN-α e variantes expressas nos leucócitos humanosnormais, mas também caracterizar suas possíveis modificações pós-translacionais possíveis (Nyman et al. (1998) Eur. J. Biochem. 253: 485-493).

Nyman et al. (supra) estudaram a glicosilação do IFN-αhumano natural. Eles observaram que dois, fora dos nove, dos subtiposproduzidos pelos leucócitos após uma indução do vírus Sendai, eramglicosilados, a saber o IFN-α 14c e o IFN-α 2b, o que é consistente com osestudos anteriores. O IFN-α 14 é o único subtipo de IFN-α com sítiospotenciais de glicosilação-N, Asn2 e Asn72, mas apenas o Asn72 é realmenteglicosilado. O IFN-α 2 é O-glicosilado na Treonina 106 (ThrlOó). De formainteressante, nenhum outro subtipo de IFN-α contém Thr nesta posição. Nesteestudo, Nyman et al. liberaram e isolaram as cadeias de oligossacarídeos eanalisaram suas estruturas por espectrometria de massa e digestões específicasde glicosidase. Tanto o IFN-α 2b quanto o IFN-α 14c foram resolvidos emtrês picos na cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RP-HPLC). A análise de espectrometria de massa de ionização emeletropulverização (ESI-MS) das frações de IFN-α 2b da RP-HPLC reveloudiferenças em suas massas moleculares, sugerindo que estas representamdiferentes glicoformas. Isto foi confirmado pela análise espectrométrica demassa dos O-glicanos liberados de cada fração. O IFN-α 2b foi estimadoconter cerca de 20 % do pentassacarídeo do núcleo tipo 2, e cerca de 50 % deglicanos do núcleo tipo 1 dissialilados e 30 % de monossialilados. Os dadosde Nyman et al. condizem com a caracterização parcial anterior daglicosilação do IFN-α 2b [Adolfo al. (1991) Biochem. J. 276: 511-518]. Opapel da glicosilação no IFN-α 14c e IFN-a 2b não se acha claramenteestabelecido. De acordo com Nyman et al. (acima), as cadeias de carboidratonão são essenciais para a atividade biológica, mas a glicosilação pode ter umefeito sobre a farmacocinética e a estabilidade das proteínas.

Existem pelo menos 15 genes funcionais no genoma humanoque codificam para as proteínas da família de LFN-a. As similaridades dasseqüências de aminoácidos são geralmente na área de cerca de 90 %, de modoque estas moléculas se acham intimamente relacionadas na estrutura. Asproteínas de IFN-α contêm 166 aminoácidos (com exceção do IFN-a 2, quetem 165 aminoácidos) e caracteristicamente contêm quatro resíduosconservados de cisteína que formam duas pontes dissulfeto. As espécies deIFN-α são levemente acídicas por natureza e carecem de um sítio dereconhecimento para a glicosilação ligada à asparagina (com exceção do IFN-α 14 que contém um sítio de reconhecimento para a glicosilação ligada àasparagina). Três variantes de IFN-a 2, diferindo em seus aminoácidos nasposições 23 e 34, são conhecidas: IFN-α 2a (Lys-23, His-34); IFN-α 2b (Arg-23, His-34); e IFN-a 2c (Arg-23, Arg-34). Acredita-se que IFN-α 2a e IFN-a2c sejam variantes alélicas do IFN-α 2b. Ver Gewert et al. (1993) J.Interferon Res. vol. 13, pp. 227-231. Não se espera que as menores diferençasno conteúdo de aminoácidos das espécies de IFN-a 2 efetuem a glicosilaçãodos interferon. Isto é, espera-se que os padrões de glicosilação sejamessencialmente os mesmos para cada um dos IFN-α 2a, 2b e 2c. Duas outrasespécies de IFN humano, a saber, IFN-ω 1 e IFN-β, são N-glicosiladas e sãode forma mais distante relacionadas ao IFN-α. Os IFN-a, -β e -ω,coletivamente referidas como IFNs de classe I, se ligam ao mesmo receptorda membrana celular de alta afinidade [Adolf et al. (1991) Biochem. J. 276:511-518].

Adolf et al. (acima) usaram a especificidade de um anticorpomonoclonal para o isolamento do IFN-a 2 natural do IFN do leucócitohumano. Eles obtiveram uma proteína 95 % pura através de cromatografia deimunoafinidade, a qual confirmou a atividade antiviral esperada do IFN-a 2.A análise do IFN-oc 2 natural por HPLC de fase reversa, mostrou que aproteína natural pode ser resolvida em dois componentes, ambos maishidrofílicos do que o IFN-a 2 derivado de E. coli. SDS/PAGE revelou que aproteína também é heterogênea na massa molecular, resultando em trêsbandas, todas elas com mobilidade eletroforética menor do que a proteínaequivalente derivada de E. coli.

Adolf et ai. (acima) também consideraram que o IFN-a 2natural carrega resíduos de carboidratos O-ligados. Sua hipótese foiconfirmada por clivagem da ligação putativa de peptídeo-carboidrato comálcali; A proteína resultante ficou homogênea e apresentou a mesma massamolecular da proteína recombinante. Outra comparação das proteínas natuaise recombinantes após a clivagem proteolítica, seguida por separação e análisedos fragmentos resultantes, possibilitou que elas definissem um glicopeptídeocandidato. A análise de seqüência deste peptídeo identificou Thr-106 como osítio de O-glicosilação. Uma comparação das seqüências de aminoácidos detodas as espécies de IFN-a 2 publicadas revelou que este resíduo de treoninaé único para IFN-a 2. Glicina, isoleucina ou ácido glutâmico acham-sepresentes na posição correspondente (107) em todas as outras proteínas.

As preparações do IFN-a 2 produzidas em E. coli sãodestituídas de O-glicosilação e foram registradas como medicamentos emmuitos países. Entretanto a imunogenicidade do IFN-a 2 liberado de E. coliterapeuticamente aplicado pode ser afetada pela falta de glicosilação. Estudostêm mostrado que quatro, fora dos dezesseis pacientes que receberam o fatorestimulador de colônias de macrófagos granulocíticos humanosrecombinantes produzido em levedura, desenvolveram anticorpos a estaproteína. De forma interessante, estes anticorpos foram observados reagiremcom epítopos que no fator estimulador de colônias de macrófagosgranulocíticos endógenos são protegidos pela glicosilação O-ligada, mas queficam expostos no fator recombinante (Adolf et al., acima).

De forma semelhante, a indução dos anticorpos para IFN-a 2recombinante derivados de E. coli após prolongado tratamento de pacientes,foi descrita e foi considerado que o IFN-a 2 natural pode ser menosimunogênico do que as proteínas de IFN-a 2 recombinante [Galton et al.(1989) Lancet 2: 572-573).

O que é necessário são métodos melhorados de produzirproteínas terapêuticas ou farmacêuticas, tais como anticorpos e citocinas queincluam o interferon, G-CSF e eritropoietina.Sumário Da Invenção

Esta invenção fornece vetores e métodos para a introduçãoestável de seqüências exógenas de ácido nucléico no genoma de aves, demodo a expressar as seqüências exógenas para alterar o fenótipo das aves oupara produzir seqüências desejadas em seus ovidutos e que depositemproteínas exógenas, tais como proteínas farmacêuticas, em seus ovos. Os ovosde aves que contêm tais proteínas exógenas são abrangidos por esta invenção.A presente invenção ainda fornece novas formas de proteínas terapêuticas(por exemplo, citocinas humanas) que incluem interferons, G-CSF, G-MCSFe eritropoietina que sejam eficientemente expressas no oviduto das avestransgênicas e depositadas nos ovos das aves.

Um aspecto da presente invenção fornece métodos paraproduzir proteínas exógenas em tecidos específicos das aves. As proteínasexógenas podem ser expressas no oviduto, no sangue e/ou em outras células etecidos das aves. Em uma forma de realização, os transgenes são introduzidosnas células blastodérmicas embriônicas, por exemplo próximo ao estágio X,para produzir uma ave transgênica, de tal modo que a proteína de interesseseja expressa nas células da glândula tubular do magno do oviduto, secretadano lúmen, e depositada na clara de ovo de um ovo de casca dura. Uma avetransgênica assim produzida pode carregar o transgene em sua linha germinal.Os genes exógenos podem, portanto, ser transmitido às aves tanto pelaintrodução artificial do gene exógeno nas células embriônicas aviárias quantopela transmissão do gene exógeno à prole de aves estavelmente em um padrãomendeliano.

A presente invenção abrange métodos de produzir proteínaexógena em um oviduto aviário. Os métodos podem incluir tanto umaprimeira etapa de prover um vetor que contenha uma seqüência codificadoraquanto um promotor operavelmente ligado à seqüência codificadora, de modoque o promotor possa efetuar a expressão do ácido nucléico no ovidutoaviário. Em seguida, as células e/ou tecidos transgênicos podem serproduzidos, nos quais o vetor seja introduzido nas células blastodérmicasembriônicas das aves, ou recém-isoladas, em cultura, ou em um embrião, demodo que a seqüência de vetores seja introduzida, por exemploaleatoriamente introduzida, no genoma aviário. Finalmente, uma avetransgênica madura que expresse a proteína exógena em seu oviduto, pode serderivada das células e/ou tecidos transgênicos. Este método pode também serusado para produzir um ovo de ave que contenha proteína exógena, tal comouma proteína farmacêutica (por exemplo, uma citocina) quando a proteínaexógena que é expressa no oviduto seja também secretada no lúmen dooviduto e depositada no ovo, por exemplo na clara do ovo de um ovo de cascadura.

Em um aspecto, a produção de uma ave transgênica medianteintrodução cromossômica de um vetor em seu genoma aviário, podeopcionalmente envolver a transfecção de DNA de células blastodérmicasembriônicas que são então injetadas na cavidade subgerminal abaixo de umblastoderma receptor. O vetor usado em um tal método pode ter um promotorque seja fundido a uma seqüência codificadora exógena e dirija a a expressãoda seqüência codificadora nas células da glândula tubular do oviduto.Em outro aspecto da invenção, uma introdução cromossômicaaleatória e a produção de uma ave transgênica são realizadas por transduçãodas células blastodérmica embriônica com defeito de replicação ou partículasretrovirais competentes de replicação carregando o código genético detransgenes entre os LTR 5' e 3' do vetor retroviral. Por exemplo, um vetorretroviral do vírus da leucose aviária (ALV) ou um vetor viral do vírus daleucemia murina (MLV) podem ser usados, os quais compreendam umplasmídeo pNLB modificado contendo um gene exógeno que é introduzido ajusante de um segmento de uma região promotora. Uma cópia de RNA dovetor retroviral modificado, acondicionado dentro de partículas virais, podeser usada para infectar blastodermas embriônicos que se desenvolvem nasaves transgênicas. Alternativamente, células auxiliares que produzem aspartículas de transdução retroviral são liberadas ao blastoderma embriônico.

Outro aspecto da invenção fornece um vetor que inclui umaseqüência codificadora e um promotor em relacionamento operacional e deposição, de tal modo que a seqüência codificadora seja expressa em umoviduto aviário. Tais vetorres incluem, porém sem limitar, um vetor retroviraldo vírus da leucose aviária (ALV), um vetor retroviral do vírus da leucemiamurina (MLV), e um vetor de lentivírus. Além disso, o vetor pode ser umaseqüência de ácido nucléico que inclua um LTR de um vetor retroviral dovírus da leucose aviária (ALV) um vetor retroviral do vírus da leucemiamurina, ou um vetor de lentivírus. O promotor é suficiente para efetuar aexpressão da seqüência codificadora no oviduto aviário. A seqüênciacodificadora codifica para uma proteína exógena que é depositada na clara deovo de um ovo de casca dura. Como tal, a seqüência codificadora codificapara proteínas exógenas tais como as proteínas derivadas de aves domésticastransgênicas como o interferon-α 2b (IFN-a 2b TPD) e a eritropoietinaderivada de aves domésticas transgênicas (EPO TPD) e o fator estimulador decolônias de granulócitos derivadas de aves domésticas transgênicas (G-C SFTPD). Em uma forma de realização, os vetores usados nos métodos dainvenção contêm um promotor que é particularmente adequado paraexpressão das proteínas exógenas em aves e seus ovos. Como tal, a expressãoda seqüência codificadora exógena pode ocorrer no oviduto e no sangue dasaves transgênicas e na clara de seu ovo aviário. Os promotores inclue, porémsem limitar, um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor deMDOT, um promotor do vírus de sarcoma de Rous (RSV), um promotor daβ-actina (por exemplo, um promotor da β-actina de galinha), um promotor dovírus da leucemia murina (MLV), um promotor do vírus de tumores mamáriosde camundongos (MMTV), um promotor da ovalbumina, um promotor dalisozima, um promotor da conalbumina, um promotor de ovomucóide, umpromotor da ovomucina, e um promotor da ovotransferrina. Opcionalmente, opromotor pode ser um segmento de pelo menos uma região promotora, talcomo um segmento da região promotora da ovalbumina, lisozima,conalbumina, ovomucóide, ovomucina e ovotransferrina. Em uma forma derealização o promotor é uma combinação de uma fusão de um ou maispromotores ou uma fusão de uma porção de um ou mais promotores tais comoos promotores da ovalbumina, lisozima, conalbumina, ovomucóide,ovomucina e ovotransferrina.

Um aspecto da invenção envolve truncar o promotor daovalbumina e/ou condensar os elementos reguladores críticos do promotor daovalbumina de modo que ele retenha seqüências necessárias para expressãonas células da glândula tubular do magno do oviduto, ao mesmo tempo emque seja pequena o bastante para que possa ser facilmente incorporada nosvetores. Por exemplo, um segmento da região promotora da ovalbumina podeser usado. Este segmento compreende a região de flanqueio 5' do gene daovalbumina. O comprimento total do segmento do promotor da ovalbuminapode ser de cerca de 0,88 kb a cerca de 7,4 kb, e preferivelmente é de cerca de0,88 kb a cerca de 1,4 kb de comprimento. O segmento preferivelmente incluitanto o elemento regulador dependente de esteróide quanto o elementoregulador negativo do gene da ovalbumina. O segmento opcionalmente incluitambém resíduos da região não transladada 5' (5'UTR) do gene daovalbumina. Alternativamente, o promotor pode ser um segmento da regiãopromotora da lisozima, conalbumina, ovomucina, ovomucóide eovotransferrina. Um exemplo de um tal promotor é o promotor de MDOTsintético que é compreendido de elementos do promotor do ovomucóide(MD) e da ovotransferrina (OT).

Em outro aspecto da invenção, os vetores integrados nogenoma aviário contêm promotores constitutivos que são operavelmenteligados à seqüência codificadora exógena (por exemplo, o promotor decitomegalovírus (CMV), o promotor do vírus de sarcoma de Rous (RSV), eum promotor do vírus da leucemia murina (MLV). Alternativamente, umpromotor não constitutivo, tal como um promotor do vírus de tumoresmamários de camundongos (MMTV), pode ser usado.

Outros aspectos da invenção levam em conta aves transgênicasque carregam um transgene no material genético de seu tecido da linhagerminativa. Mais especificamente, o transgene inclui um gene exógeno e umpromotor em relacionamento operacional e de posição para expressar o geneexógeno. O gene exógeno pode ser expresso no oviduto aviário e no sanguedas aves transgênicas. O gene exógeno codifica para as proteínas exógenastais como as proteínas farmacêuticas incluindo as citocinas tais como IFN-aTPD (por exemplo, IFN-a 2) e EPO TPD e G-CSF TPD. A proteína exógenaé depositada na clara de um ovo de casca dura.

Outro aspecto da invenção leva em conta um ovo de ave quecontém proteína exógena para a espécia aviária. O uso da invenção leva emconta a expressão das proteínas exógenas nas células de ovidutos comsecreção das proteínas no lúmen do magno do oviduto e deposição na clara doovo de ave. As proteínas acondicionadas nos ovos podem estar presentes nasquantidades de até uma grama ou mais por ovo. A proteína exógena inclui,porém sem limitar, IFN-ot 2 TPD e EPO TPD e G-CSF TPD.

Ainda outro aspecto da invenção fornece uma seqüência depolinucleotídeos isolada compreendendo a seqüência codificadora otimizadado interferon-α 2b humano (IFN-α 2b), isto é, seqüência codificadora dointerferon-α 2b derivada de ave doméstica transgênica recombinante quecodifica para o interferon-α 2b derivado de ave doméstica transgênica (IFN-a2b TPD). A invenção também inclui uma proteína isolada compreendendo aseqüência de polipeptídeos de IFN-α 2b TPD, em que a proteína é O-glicosilada em Thr-106 com N-Acetil-Galactosamina, Galactose, N-Acetil-glicosamina, Acido Siálico, e combinações destes.

A invenção ainda considera uma composição farmacêuticacompreendendo a seqüência de polipeptídeos de IFN-α 2b TPD, em que aproteína é O-glicosilada em Thr-106 com N-Acetil-Galactosamina, Galactose,N-Acetil-glicosamina, Ácido Siálico, e combinações destes.

Um aspecto da invenção considera seqüências codificadoraspara proteínas exógenas produzidas como descrito neste relatório, em que aseqüência codificadora é otimizada pelo códon para expressão em uma ave,por exemplo, em uma galinha. A otimização do códon pode ser determinadada utilização do códon de pelo menos uma, e preferivelmente mais do queuma, proteína expressa em uma célula aviária (por exemplo, uma célula degalinha). Por exemplo, a utilização do códon pode ser determinada dasseqüências de ácidos nucléicos codificando as proteínas ovalbumina,lisozima, ovomucina e ovotransferrina de galinha. Por exemplo, a seqüênciacodificadora do DNA para a proteína exógena pode ser otimizada pelo códoncom o uso do programa BACKTRANSLATE® da Wisconsin Package, versão9.1 (Genetics Computer Group, Inc., Madison, WI) com uma tabela deaplicação do códon compilada das proteínas ovalbumina, lisozima,ovomucóide e ovotransferrina de galinha (Gallus gallus).Um aspecto da invenção fornece uma seqüência depolinucleotídeos isolada compreendendo a seqüência codificadora otimizadada erítropoietina (EPO) humana, isto é, a seqüência codificadora daeritropoietina derivada de aves domésticas transgênicas recombinantes quecodifica para a eritropoietina derivada de aves domésticas transgênicas (EPOTPD).

Outro aspecto da invenção leva em conta um vetorcompreendendo uma primeira e segunda seqüência codificadora e umpromotor em relacionamento operacional e de posição à primeira e segundaseqüência codificadora para expressar a primeira e segunda seqüênciacodificadora em um oviduto aviário. Neste aspecto, o vetor pode incluir umelemento do sítio de entrada de ribossoma interno (IRES) posicionado entre aprimeira e a segunda seqüência codificadora, em que a primeira seqüênciacodificadora codifica para a proteína Xea segunda seqüência codificadoracodifica para a proteína Y, e em que uma ou ambas proteína X e proteína Ysão depositadas no ovo (por exemplo, na clara) de um ovo de casca dura.

Por exemplo, a proteína X pode ser uma cadeia leve (LC) deum anticorpo monoclonal e a proteína Y pode ser uma cadeia pesada (HC) deum anticorpo monoclonal. Alternativamente, a proteína codificada pelasegunda seqüência codificadora (por exemplo, enzima) pode ser capaz deprover modificação pós-translacional da proteína codificada pela primeiraseqüência codificadora. O vetor opcionalmente inclui seqüênciascodificadoras adicionais e elementos do IRES adicionais, de tal modo quecada seqüência codificadora no vetor seja separada uma da outra seqüênciacodificadora por um elemento do IRES. Outros exemplos de empregar umIRES que são considerados para uso na presente invenção são apresentados,por exemplo, no Pedido de Patente U.S. nfi 11/047.184, depositado em 31 dejaneiro de 2005, cujo teor fica aqui incorporado em sua totalidade, comoreferência.A invenção também considera métodos de produzir um ovoaviário que contenha proteínas tais como as proteínas farmacêuticas queincluem anticorpos monoclonais, enzimas e outras proteínas. Tais métodospodem incluir o fornecimento de um vetor com um promotor, seqüênciascodificadoras, e pelo menos um elemento do IRES; a criação de células outecido transgênicos pela introdução do vetor nas células blastodérmicasembriônicas de aves, em que a seqüência de vetores seja aleatoriamenteintroduzida no genoma aviário; e derivar uma ave transgênica madura dascélulas ou tecido transgênicos. A ave transgênica assim derivada podeexpressar as seqüências codificadoras em seu oviduto, e a proteína resultantesecretada no lúmen do oviduto, de modo que a proteína seja depositada naclara de um ovo de casca dura. Além disso, a invenção inclui a progênie deaves transgênicas que produzem ovos contendo a proteína recombinante.Tipicamente, a progênie ou conterá o transgene essencialmente em todas ascélulas da ave, ou nenhuma das células da ave da progênie conterá otransgene.

Um aspecto importante da presente invenção diz respeito aovos de casca dura de aves (por exemplo, ovos de casca dura de galinhas) quecontêm um peptídeo ou proteína exógenos incluindo, porém sem limitar, umaproteína farmacêutica. O peptídeo ou proteína exógenos podem sercodificados por um transgene de uma ave transgênica. Em uma forma derealização, o peptídeo ou proteína exógenos (por exemplo, proteínafarmacêutica) são glicosilados. A proteína pode estarpresente em qualquerquantidade útil. Em uma forma de realização, a proteína está presente em umaquantidade em uma faixa entre cerca de 0,01 μg por ovo de casca dura, ecerca de 1 grama por ovo de casca dura. Em outra forma de realização, aproteína se acha presente em uma quantidade em uma faixa entre cerca de 1μg por ovo de casca dura e cerca de 1 grama por ovo de casca dura. Porexemplo, a proteína pode estar presente em uma quantidade em uma faixaentre cerca de 10 por ovo de casca dura e cerca de 1 grama por ovo decasca dura (por exemplo, uma faixa entre cerca de 10 μg por ovo de cascadura e cerca de 400 miligramas por ovo de casca dura).

Em uma forma de realização, a proteína exógena, por exemploa proteína farmacêutica exógena, se acha presente na clara do ovo. Em umaforma de realização, a proteína se acha presente em uma quantidade em umafaixa entre cerca de 1 ng por mililitro de clara de ovo e cerca de 0,2 grama pormililitro de clara de ovo. Por exemplo, a proteína pode estar presente em umaquantidade em uma faixa entre cerca de 0,1 μg por mililitro de clara de ovo ecerca de 0,2 grama por mililitro de clara de ovo (por exemplo, a proteína podeestar presente em uma quantidade em uma faixa entre cerca de 1 μg pormililitro de clara de ovo e cerca de 100 miligramas por mililitro de clara deovo. Em uma forma de realização, a proteína está presente em umaquantidade em uma faixa entre cerca de 1 μg por mililitro de clara de ovo ecerca de 50 miligramas por mililitro de clara de ovo. Por exemplo, a proteínapode estar presente em uma quantidade em uma faixa de cerca de 1 μg pormililitro de clara de ovo e cerca de 10 miligramas por mililitro de clara de ovo(por exemplo, a proteína pode estar presente em uma quantidade em umafaixa entre cerca de 1 μg por mililitro de clara de ovo e cerca de 1 miligramapor mililitro de clara de ovo).

A invenção considera a produção de ovos de casca duracontendo qualquer proteína útil, incluindo uma ou mais proteínasfarmacêuticas. Tais proteínas incluem, porém sem limitar, hormônios,imunoglobulinas ou porções de imunoglobulinas, citocinas (por exemplo GM-CSF, G-CSF, eritropoietina e interferon) e CTLA4. A invenção também incluia produção de ovos de casca dura contendo proteínas de fusão incluindo,porém sem limitar, as imunoglobulinas ou porções de imunoglobulinasfundidas a certas seqüências de peptídeos úteis. Em uma forma de realização,a invenção leva em conta a produção de ovos de casca dura contendo umfragmento Fc de anticorpo. Por exemplo, os ovos podem conter uma proteínade fusão Fc-CTLA4 de acordo com a invenção.

As aves desenvolvidas das células blastodérmicas dentro dasquais o vetor tenha sido introduzido, são a geração GO e são referidas como"criadoras". As aves criadoras são tipicamente quiméricas para cada transgeneintroduzido. Isto é, apenas algumas das células da ave transgênica GO contémo(s) transgene(s). A geração de GO tipicamente é também de hemizigotos parao(s) transgene(s). A geração de GO pode ser reproduzida para animais nãotransgênicos para dar origem à prole transgênica Gl que é também dehemizigotos para o transgene e contém o(s) transgene(s) em essencialmentetodas as células de aves. A prole de hemizigotos Gl pode ser reproduzida emanimais não transgênicos dando origem aos homozigotos da prole G2 para otransgene. Substancialmente todas as células de aves que são positivas para otransgene, que são derivadas da prole Gl, conterão o(s) transgene(s). Em umaforma de realização, a prole G2 hemizigótica da mesma linhagem pode serreproduzida para produzir os homozigotos da prole G3 para o transgene. Emuma forma de realização, os animais GO hemizigotos são reproduzidos juntospara dar origem à prole Gl de homozigotos contendo duas cópias do(s)transgene(s) em cada célula do animal. Estes são meramente exemplos decertos esquemas de reprodução úteis, e a presente invenção considera oemprego de qualquer esquema de reprodução útil, tal como aquelesconhecidos das pessoas de experiência normal na técnica.

Um aspecto da invenção é direcionado a composições quecontêm proteínas produzidas de acordo com a invenção, que têm um padrãode glicosilação derivado de aves domésticas, tal como um padrão deglicosilação derivado de galinha. Por exemplo, a invenção inclui proteínasfarmacêuticas tendo um padrão de glicosilação derivado de aves domésticas,tal como um ou mais dos padrões de glicosilação aqui apresentados. Ainvenção também inclui proteínas humanas tendo um padrão de glicosilaçãoderivado de aves domésticas tal como um ou mais dos padrões de glicosilaçãoapresentados neste relatório.

Em um aspecto, a invenção inclui G-CSF em que o G-CSFtem um padrão de glicosilação derivado de aves domésticas, isto é, G-CSF ouG-CSF TPD TPD derivado de aves domésticas transgênicas. Em uma formade realização, o padrão de glicosilação é outro que não aquele do G-CSFproduzido em uma célula humana e/ou em uma célula de CHO. Isto é, ascomposições têm uma molécula de G-CSF com uma cadeia de carboidratosderivada de aves domésticas (isto é, estrutura de glicosilação) e essa cadeia decarboidratos ou estrutura de glicosilação não é encontrada no G-CSF obtidode células humanas e/ou células de CHO. Entretanto, a composição podetambém incluir moléculas de G-CSF que possuam as estruturas deglicosilação que sejam as mesmas como aquelas encontradas no G-CSFobtido das células de CHO e/ou das células humanas. A glicosilação do G-CSF humano produzido em células de CHO é apresentada em Holloway, C.J., European J. of Câncer (1994) vol. 30A, pp. S2-S6, cujo conteúdo é aquiincorporado em sua totalidade como referência; em Oheda et ai. (1988) J.Biochem., vol. 103, pp. 544-546, cujo teor é aqui incorporado em suatotalidade como referência; e em Andersen et ai. (1994) Glycobiology, vol. 4,pp. 459-467, cujo teor é aqui incorporado em sua totalidade como referência.Parece que as estruturas tais como AeG mostradas no Exemplo 20, podemser as mesmas ou semelhantes às estruturas de glicosilação relatadas para o G-CSF produzido nas células de CHO. Em uma forma de realização, o padrãode glicosilação do G-CSF TPD é outro que não aquele do G-CSF produzidoem células de mamíferos.

Em uma forma de realização, a invenção leva em conta o G-CSF a ser isolado. Isto é, o G-CSF contido na composição pode ser um G-CSF isolado. Por exemplo, o G-CSF pode ser isolado da clara do ovo. O G-CSF isolado pode ser moléculas de G-CSF tendo diferentes estruturas deglicosilação entre as moléculas de G-CSF, ou o G-CSF isolado pode ser umaespécie individual isolada de moléculas de G-CSF tendo apenas uma estruturaparticular de glicosilação entre as espécies de moléculas de G-CSF.

Em uma forma de realização, o G-CSF de uma composição dainvenção está presente em um ovo de casca dura. Por exemplo, o G-CSF podeestar presente na clara de um ovo de casca dura posto por uma ave transgênicada invenção. Isto é, em uma forma de realização, a invenção é dirigida à clarade ovo de uma ave (por exemplo, galinha) contendo G-CSF da invenção. Emuma forma de realização, o G-CSF está presente na clara de ovo em umaquantidade excedente de cerca de 1 micrograma por mililitro de clara de ovo.Por exemplo, o G-CSF pode estar presente em uma quantidade maior do quecerca de 2 microgramas por mililitro de clara de ovo (por exemplo, presenteem uma quantidade de cerca de 2 microgramas a cerca de 200 microgramaspor mililitro de clara de ovo).

Em um aspecto particular da invenção, o G-CSF é glicosiladoem uma célula de oviduto da ave, por exemplo glicosilado em uma célula deoviduto de uma galinha. Por exemplo, o G-CSF pode ser produzido eglicosilado em uma célula de oviduto. Em uma forma de realização, o G-CSFé glicosilado em uma célula de glândula tubular (por exemplo, o G-CSF éproduzido e glicosilado em uma célula de glândula tubular).

Acredita-se que o G-CSF seja glicosilado na treonina 133. Noentanto, a invenção não se limita à glicosilação em qualquer sítio particularem uma molécula de G-CSF.

Tipicamente, o G-CSF da invenção é G-CSF humano. Em umaforma de realização, o G-CSF maduro tem a seqüência de aminoácidos daFigura 18 C.

Em uma forma de realização, as composições da invençãoincluem moléculas de G-CSF glicosiladas com:<formula>formula see original document page 27</formula>

A invenção é também especificamente dirigida a composiçõescontendo moléculas de G-CSF que possuem uma destas estruturasparticulares de glicosilação. Tais composições podem também incluir uma oumais moléculas de G-CSF tendo uma ou mais outras estruturas deglicosilação.

Isto é, em uma forma de realização a invenção éespecificamente dirigida a composições contendo moléculas de G-CSF quetêm:

Gal-NAcGlu-NAcGal-Gal

e a composições contendo moléculas de G-CSF que têm:SA-Gal-NAcGlu-NAcGal-,

Gal

e a composições contendo moléculas de G-CSF que têm:SA-Gal-NAcGlu-NAcGal-,

Gal

SA

e a composições contendo moléculas de G-CSF que têm:SA-Gal-NAcGal-,

e a composições contendo moléculas de G-CSF que têm:Gal-NAcGlu-NAcGal-GalSA

e a composições contendo moléculas de G-CSF que têm:SA-Gal-NAcGal-,

Gal

e a composições contendo moléculas de G-CSF que têm:

Gal-NAcGal-,

em que Gal = Galactose,

NAcGal = N-Acetil-Galactosamina

NAcGlu = N-Acetil-Glicosamina, e

SA = Acido Siálico.

A invenção é também direcionada a métodos de aumentar acontagem de glóbulos brancos em um paciente, na quantidade desejada.

Qualquer combinação útil dos aspectos descritos nesterelatório descritivo sse acha incluída dentro do escopo da presente invenção,contanto que os aspectos incluídos em qualquer uma de tais combinações nãosejam mutuamente inconsistentes, como será evidente do contexto desterelatório descritivo, e do conhecimento de uma pessoa de experiência normalna técnica.

Objetos e aspectos adicionais da presente invenção se tornarãomais evidentes após revisão da descrição detalhada apresentada abaixo,quando tomada em combinação com as figuras anexas, as quais sãoresumidamente descritas como segue.Breve Descrição Dos Desenhos

As Figuras IA e IB ilustram vetorres de expressão dopromotor da ovalbumina compreendendo segmentos do promotor daovalbumina e uma seqüência codificadora, gene X, que codifica uma proteínaX exógena. X representa qualquer gene exógeno ou proteína exógena deinteresse.

As Figuras 2 A, 2B, 2C e 2D ilustram vetores retro virais dainvenção compreendendo um promotor da ovalbumina e uma seqüênciacodificadora, gene X, codificando uma proteína X exógena. X representaqualquer gene ou proteína exógena de interesse.

A Figura 2E ilustra um método de amplificar um geneexógeno para introdução nos vetores de 2A e 2B.

A Figura 2F ilustra um vetor retroviral compreendendo umpromotor da ovalbumina que controla a expressão de uma seqüênciacodificadora, gene X, e um elemento do sítio de entrada de ribossoma interno(IRES) permitindo a expressão de uma segunda seqüência codificadora, geneΥ. X e Y representam qualquer gene de interesse.

As Figuras 3A e 3B mostram representações esquemáticas dosvetores pNLB e pNLB-CMV-BL derivados de ALV5 respectivamente. Tendoem vista que NLB não foi seqüenciado em sua totalidade, as medições em pb(pares de base) são estimadas dos dados publicados (Cosset et al., 1991;Thoraval et al., 1995) e dos dados aqui examinados. Os vetores são ambosapresentados como eles devam aparecer quando integrados no genoma dagalinha.

As Figuras 4A e 4B mostram a quantidade de β-lactamase(Iactamase) no soro do sangue de galinhas quiméricas e transgênicas. NaFigura 4A, a concentração de lactamase bioativa no soro de galinhas GOtransduzidas com o transgene NLB-CMV-BL foi medida em 8 meses após onascimento. A geração, o sexo e os números de bandas das asas são indicados.As concentrações do soro da lactamase foram medidas para galinhastransgênicas Gl em 6 a 7 meses após o nascimento. As flechas indicamfilhotes Gl produzidas do galo 2395. Na Figura 4B a concentração de soro dalactamase foi medida quanto a filhotes transgênicos Gl e G2. As flechasindicam G2s produzidos da galinha 5657 ou do galo 4133. As amostras dosfilhotes 4133, 5308 e 5657 são as mesmas daquelas da Figura 4A. Asamostras de aves G2 nascidas de 5657 foram coletadas em 3 a 60 dias após onascimento. As amostras das aves G2 nascidas de 4133 foram coletadas em 3meses após o nascimento.

A Figura 5 mostra uma linhagem de filhotes contendo asposições transgênicas abrigadas pela galinha 5657 (Figura 5A) ou pelo galo4133 (Figura 5B). O 2395 foi um galo que carregava múltiplas posiçõestransgênicas. O 2395 foi fecundado em uma galinha não transgênica, queproduziu 3 filhotes, cada um carregando o transgene em uma posição única dogenoma dos frangos. Por simplicidade, a progênie transgênica para a qual osdados da expressão não foram mostrados, assim como a progênie nãotransgênica foram omitidas da linhagem. Números do grupos são indicadospelos seguintes símbolos: o galinha; □ galo; · galinha carregando o transgeneNLB-CMV-BL; galo carregando o transgene NLB-CMV-BL.

A Figura 6 apresenta a β-lactamase (Iactamase) na clara doovo da galinha 5657 e na prole da galinha. Na Figura 6A, a clara do ovo dagalinha 5637 e sua prole transgênica foram ensaiadas quanto à lactamaseativa. O controle é de galinhas não tratadas e o acasalamento da ninhada éuma reprodução G2 não transgênica da galinha 5657. Os ovos foramcoletados em Março de 2000. As flechas indicam a reprodução de G2s dagalinha 5657. Na Figura 6B, as amostras de clara de ovo das galinhastransgênicas G2 carregando uma cópia do transgene (hemizigoto) foramcomparadas com aquelas da galinha G3 6978, que abrigava duas cópias(homozigoto). Os ovos foram coletados em fevereiro de 2001. A geração e osnúmeros de bandas das asas são indicados à esquerda.

A Figura 7 apresenta a β-lactamase (lactamase) nos ovos dasgalinhas G2 e G3 produzidas do galo 4133. Na Figura 7A, as claras de ovo dequatro galinhas transgênicas hemizigotas representativas procriadas do galo4133, foram ensaiadas quanto à lactamase ativa. Os ovos foram coletados emoutubro de 1999, março de 2000 e fevereiro de 2001, e um mínimo de 4 ovospor galinha foi ensaiado um mês após cada conjunto ter sido coletado. Ocontrole representa clara de ovo de galinhas não tratadas. Os números dasbandas são indicados à esquerda. A média de 4 galinhas para cada período écalculada. Na Figura 7B, a clara de ovo de galinhas transgênicas G2hemizigotas foi comparada com aquela das galinhas G3 transgênicashemizigotas e homozigotas. Os ovos foram colhidos em fevereiro de 2001. Ageração e o número de cópias de transgenes são apresentados na barra dedados para cada galinha. A concentração média para as galinhas carregandouma ou duas cópias acha-se no fundo do gráfico.

As Figuras 8A e 8B mostram o vetor pNLB-CMV-IFN paraexpressar IFN-α 2b em galinhas; e o vetor pNLB-MDOT-EPO usado paraexpressar a eritropoietina (EPO) nas galinhas, respectivamente.

A Figura 9 apresenta o novo padrão de glicosilação dointerferon-α 2b derivado de aves domésticas transgênicas (IFN-α 2b TPD),incluindo todas as 6 bandas.

A Figura 10 mostra a comparação do interferon-α 2b derivadodo leucócito de sangue periférico humano (IFN-α do PBL 2b ou hlFNnatural) e interferon-α 2b derivado de aves domésticas transgênicas (IFN-α2b TPD ou hlFN de clara de ovo).

A Figura IlA apresenta a seqüência de ácido nucléicosintético (cDNA, resíduos 1 a 498) do interferon-α 2b humano otimizado, istoé, IFN-α 2b TPD recombinante (SEQ ID NO: 1). A Figura IlB apresenta aseqüência de aminoácidos sintéticos (resíduos 1 a 165) do interferon-α 2bderivado de aves domésticas transgênicas (IFN-α 2b TPD) (SEQ ED NO: 2).

A Figura 12A apresenta a seqüência de ácido nucléico sintética(cDNA, resíduos 1 a 579) da eritropoietina (EPO) humana otimizada, isto é,EPO TPD recombinante (SEQ ID NO: 3). A Figura 12B apresenta aseqüência de aminoácidos sintéticos (resíduos 1 a 193) da eritropoietinaderivada de aves domésticas transgênicas (EPO TPD) (SEQ ID NO: 4).(Quanto à EPO humana natural, ver também o Número de Acesso da NCBINP 000790).

A Figura 13 mostra o promotor de MDOT sintético ligado aoIFN-MM CDS. O promotor de MDOT contém elementos do geneovomucóide de galinha (promotor ovomucóide) variando de -435 a -166 paresde base (ver o Número de Acesso da NCBI J00894) e o gene da conalbuminade galinha (promotor da ovotransferrina) variando de -251 a +29 pares debase (ver os Números de Acesso da NCBIY00497, Ml 1862 e XO1205).

A Figura 14 provê um sumário das principais proteínas daclara de ovo.

As Figuras 15A e 15D mostra o vetor pCMV-LC-emcvIRES-HC, em que a cadeia leve (LC) e a cadeia pesada (HC) de um anticorpomonoclonal humano foram expressas para este vetor único pela colocação deum IRES do vírus da encefalomiocardite (EMCV) de modo a testar quanto àexpressão dos anticorpos monoclonais. Em comparação, as Figuras 15B e15C mostram os vetores pCMV-HC e pCMV-LC separados, respectivamente,em que estes vetores foram também usados para testar quanto à expressão dosanticorpos monoclonais.

A Figura 16 mostra uma SDS PAGE manchada de prata deNeupogen® (faixa A) e G-CSF TPD (faixa B).

A Figura 17 apresenta o aumento na Contagem de NeutrofilosAbsolutos (ANC) de G-CSF TPD em comparação com o G-CSF humano dederivação bacteriana durante um período de 14 dias.

A Figura 18 (SEQ ID NO: 39) mostra a seqüência denucleotídeos codificando a seqüência de aminoácidos da Figura 18B. AFigura 18B (SEQ ID NO: 40), que corresponde ao Acesso da NCBI NP7577373, mostra a seqüência de aminoácidos de G-CSF incluindo a seqüênciade sinal natural que é separada por clivagem para formar o G-CSF madurodurante a secreção celular. A Figura 18C (SEQ ID NO: 41) mostra aseqüência de aminoácidos da proteína de G-CSF madura produzida de acordocom a presente invenção.Descrição Detalhada

Certas definições são aqui apresentadas para ilustrar e definir osignificado e o escopo dos vários termos usados para descrever a invençãoneste relatório.

Uma "seqüência de ácido nucléico ou de polinucleotídeos"inclui, porém sem limitar, mRNA eucariótico, cDNA, DNA genômico e DNAsintético, e seqüências de RNA, compreendendo as bases de nucleotídeosnaturais adenina, guanina, citosina, timidina e uracila. A expressão tambéminclui seqüências tendo uma ou mais bases modificadas.

"Proteínas terapêuticas" ou "proteínas farmacêuticas" incluemuma seqüência de aminoácidos que no todo ou em parte compõe ummedicamento.

Uma "seqüência codificadora" ou "matriz de leitura aberta"referem-se a um polinucleotídeo ou seqüência de ácido nucléico que podemser transcritas e transladadas (no caso de DNA) ou transladadas (no caso domRNA) em um polipeptídeo in vitro ou in vivo quando colocada sob ocontrole de seqüências reguladoras apropriadas. Os limites da seqüênciacodificadora são determinados por um códon de partida da translação notérmino 5' (amino) e um códon de parada da translação no término 3'(carbóxi). Uma seqüência de terminação da transcrição usualmente serálocalizada em 3' da seqüência codificadora. Uma seqüência codificadora podeser flanqueada nas extremidades 5' e/ou 3' por regiões não transladadas.

"Exon" refere-se àquela parte de um gene que, quandotranscrita em um transcrito nuclear, é "expressa" no mRNA citoplasmáticoapós remoção dos íntrons ou das seqüências intervenientes medianterecomposição nuclear."Seqüências de controle" ou "seqüências reguladoras" deácido nucléico referem-se a seqüências promotoras, códons de partida e deparada translacionais, sítios de ligação de ribossoma, sinais de poliadenilação,seqüências de terminação da transcrição, domínios reguladores de montante,intensificadores, e outros, quando necessário e suficiente para a transcrição etranslação de uma dada seqüência codificadora em uma célula hospedeiradefinida. Exemplos de seqüências de controle adequadas para as célulaseucarióticas, são promotores, sinais de poliadenilação, e intensificadores.Todas estas seqüências de controle não necessitam estar presente em um vetorrecombinante, contanto que aqueles necessários e suficientes para atranscrição e translação do gene desejado estejam presentes.

"Operavelmente ou operativamente ligado" refere-se àconfiguração das seqüências codificadoras e de controle, de modo a realizar afunção desejada. Assim, as seqüências de controle operavelmente ligadas auma seqüência codificadora são capazes de efetuar a expressão da seqüênciacodificadora. Uma seqüência codificadora é operavelmente ligada, ou se achasob o controle de regiões reguladoras transcricionais em uma célula, quando aDNA polimerase se ligue à seqüência promotora e transcreva a seqüênciacodificadora no mRNA que possa ser transladado na proteína codificada. Asseqüências de controle não necessitam ser contíguas com a seqüênciacodificadora, contanto que elas funcionem para dirigir a sua expressão.Assim, por exemplo, as seqüências intervenientes não transladadas oratranscritas podem estar presentes entre uma seqüência promotora e aseqüência codificadora, e a seqüência promotora pode ainda ser considerada"operavelmente ligada" à seqüência codificadora.

Os termos "heterólogo" e "exógeno", quando eles dizemrespeito a seqüências de ácido nucléico tais como as seqüências codificadorase as seqüências de controle, denotam seqüências que não são normalmenteassociadas com uma região de uma construção recombinante ou com umlócus cromossômico particular, e/ou não são normalmente associadas comuma célula específica. Assim, uma região "exógena" de uma construção deácido nucléico é um segmento identificável de ácido nucléico dentro ouligado a outro molécula de ácido nucléico que não seja observada emassociação com a outra molécula por natureza. Por exemplo, uma regiãoexógena de uma construção pode incluir uma seqüência codificadoraflanqueada por seqüências não constatadas em associação com a seqüênciacodificadora por natureza. Outro exemplo de uma seqüência codificadoraexógena é uma construção em que a própria seqüência codificadora não éobservada na natureza (por exemplo, seqüências sintéticas tendo códonsdiferentes do gene nativo). De forma semelhante, uma célula hospedeiratransformada com uma construção ou ácido nucléico que não estejanormalmente presente na célula hospedeira, deve ser considerada exógenapara os fins desta invenção.

"Proteína exógena", como aqui usado, refere-se a uma proteínanão naturalmente presente em um tecido ou célula particular, uma proteínaque seja o produto de expressão de uma construção de expressão exógena outransgene, ou uma proteína não naturalmente presente em uma dadaquantidade em um tecido ou célula particular. Uma proteína que seja exógenaa um ovo é uma proteína que não é normalmente encontrada no ovo. Porexemplo, uma proteína excógena a um ovo pode ser uma proteína que estejapresente no ovo como resultado da expressão de uma seqüência codificadorapresente em um transgene do animal que pôs o ovo.

"Gene endógeno" refere-se a um gene de ocorrência natural ouseu fragmento normalmente associado com uma célula particular.

Os produtos de expressão aqui descritos podem consistir dematerial proteináceo tendo uma estrutura química definida. Entretanto, aestrutura precisa depende de vários fatores, particularmente modificaçõesquímicas comuns às proteínas. Por exemplo, uma vez que todas as proteínascontêm grupos amino e carboxila ionizáveis, a proteína pode ser obtida naforma de sal acídico ou básico, ou na forma neutra. A seqüência primária deaminoácidos pode ser derivada com o uso de moléculas de açúcar(glixosilação) ou por outras derivações químicas envolvendo ligaçãocovalente ou iônica com, por exemplo, grupos lipídicos, de fosfato, acetílicos,e outros, freqüentemente ocorrendo através da associação com sacarídeos.Estas modificações podem ocorrer in vitro ou in vivo, a ocorrência in vivosendo realizada por uma célula hospedeira através de sistemas deprocessamento pós-translacional. Tais modificações podem aumentar oureduzir a atividade biológica da molécula, e essas moléculas quimicamentemodificadas pretende-se também que estejam dentro do escopo da invenção.

Métodos alternativos de clonagem, amplificação, expressão epurificação serão evidentes aos técnicos habilitados. Métodos representativossão apresentadoso em Sambrook, Fritsch e Maniatis, Molecular Cloning, aLaboratory Manual, 2~ Edição, Cold Spring Harbor Laboratory (1989).

"Vetor" significa um polinucleotídeo compreendido de DNAou RNA de filamento único, filamento duplo, circular ou superenrolado. Umvetor típico pode ser compreendido dos seguintes elementos operativamenteligados em distâncias apropriadas para permitir a expressão funcional dogene: origem de replicação, promotor, intensificador, seqüência condutora demRNA 5', sítio de ligação ribossômica, cassete de ácido nucléico, sítios determinação e de poliadenilação, e seqüências marcadoras selecionáveis. Umou mais destes elementos podem ser omitodos em aplicações específicas. Ocassete de ácido nucléico pode incluir um sítio de restrição para inserção daseqüência de ácido nucléico a ser expressa. Em um vetor funcional, o cassetede ácido nucléico contém a seqüência de ácido nucléico a ser expressaincluindo os sítios de início da translação e de terminação. Um íntron podeopcionalmente ser incluído na construção, por exemplo 5' para a seqüênciacodificadora. Um vetor é construído de modo que a seqüência codificadoraparticular seja localizada no vetor com as seqüências reguladoras apropriadas,o posicionamento e a orientação da seqüência codificadora em relação àsseqüências de controle sendo tal que a seqüência codificadora seja transcritasob o "controle" das seqüências de controle e reguladoras. A modificação dasseqüências codificando a proteína particular de interesse pode ser desejávelpara se alcançar este fim. Por exemplo, em alguns casos pode ser necessáriomodificar a seqüência de modo que ela possa ser articulada às seqüências decontrole com a orientação apropriada; ou manter a matriz de leitura. Asseqüências de controle e outras seqüências reguladoras podem ser ligadas àseqüência codificadora antes da inserção em um vetor. Alternativamente, aseqüência codificadora pode ser clonada diretamente em um vetor deexpressão que já contenha as seqüências de controle e um sítio de restriçãoapropriado que esteja em matriz de leitura com e sob o controle regulador dasseqüências de controle.

Um "promotor" é um sítio sobre o DNA ao qual a RNApolimerase se liga para iniciar a transcrição de um gene. Em algumas formasde realização, o promotor será modificado pela adição ou deleção dasseqüências, ou substituído por seqüências alternativas, incluindo seqüênciasnaturais e sintéticas, bem como seqüências que podem ser uma combinaçãode seqüências sintéticas e naturais. Muitos promotores eucarióticos contêmdois tipos de seqüências de reconhecimento: a TATA boxe e os elementospromotores de montante. A primeira, localizada a montante do sítio de inícioda transcrição, se acha envolvida em dirigir a RNA polimerase para iniciar atranscrição no sítio correto, enquanto os últimos parecem determinar o índicede transcrição e se acha a montante da TATA boxe. Elementosintensificadores podem também estimular a transcrição dos promotoresligados, mas muitos funcionam exclusivamente em um tipo específico decélulas. Muitos elementos intensificadores/promotores derivados de vírus, porexemplo o promotor de SV40, o promotor do citomegalovírus (CMV), opromotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV), e o promotor do vírus daleucemia murina (MLV), são todos ativos em uma ampla disposição de tiposcelulares, e são denominados "ubíquos". Alternativamente, promotores nãoconstitutivos tais como o promotor do vírus do tumor mamário decamundongo (MMTY) podem também ser usados na presente invenção. Aseqüência de ácido nucléico introduzida no sítio de clonagem pode terqualquer matriz de leitura aberta codificando um polipeptídeo de interesse,com a condição de que, quando a seqüência codificadora codificar umpolipeptídeo de interesse, ela deva carecer de sítios de encaixe críptico quepodem bloquear a produção das moléculas de mRNA apropriadas e/ouproduzir moléculas de mRNA aberrantemente encaixadas ou anormais.

A expressão "derivada de aves domésticas" refere-se a umacomposição ou substância produzidas pelas aves domésticas ou delas obtidas."Aves domésticas" refere-se a aves que podem ser mantidas como criação,incluindo, porém sem limitar, galinhas, perus, patos, perus, codornas e ratitas.Por exemplo, "derivado de aves domésticas" pode referir-se a derivado degalinha, derivado de peru e/ou derivado de codorna.

Um "gene marcador" é um gene que codifica uma proteína queleva em conta a identificação e o isolamento de células corretamentetransfectadas. Seqüências marcadoras adequadas incluem, porém sem limitar,os genes de proteínas fluorescentes verde, amarela e azul (GFP, YFP e BFP,respectively). Outros marcadores adequados incluem os genes da timidinacinase (tk), da diidrofolato redutase (DHFR) e da aminoglicosídeofosfotransferase (ΑΡΗ). Esta última comunica resistência aos antibióticos deaminoglicosídeos, tais como a canamicina, a neomicina e a geneticina. Estas,e outros genes marcadores tais como aqueles que codificam a cloranfenicolacetiltransferase (CAT), a β-lactamase, a β-galactosidade (β-gal), podem serincorporados no cassete de ácido nucléico primário junto com o gene queexpressa a proteína desejada, ou os marcadores de seleção podem estarcontidos em vetores separados e cotransfectados.

Um "gene repórter" é um gene marcador que "relata" suaatividade em uma célula pela presença da proteína que ele codifica.

Uma "partícula retroviral", "partícula transdutora" ou"partícula de transdução" referem-se a um vírus defeituoso de replicação oucompetente de replicação capaz de transduzir DNA ou RNA virais em umacélula.

Os termos "transformação", "transdução" e "transfecção"denotam, todos, a introdução de um polinucleotídeo em uma célulablastodérmica aviária. "Magno" é aquela parte do oviduto entre o infundíbuloe o istmo contendo células da glândula tubular que sintetizam e secretam asproteínas da clara de ovo do ovo.

Um "promotor de MDOT", como aqui usado, é um promotorsintético que é ativo nas células da glândula tubular do magno do ovidutoentre outros tecidos. MDOT é compreendido de elementos dos promotores deovomucóides (MD) e ovotransferrinas (TO) (Figura 13).

O termo "otimizado" é usado no contexto da "seqüênciacodificadora otimizada", em que os códons mais freqüentemente usados paracada aminoácido particular encontrado nas proteínas da clara de ovoovalbumina, lisozima, ovomucóide e ovotransferrina, são usados no esquemada seqüência de polinucleotídeos de interferon-α 2b (IFN-a 2b) humanootimizado que é introduzida nos vetores da presente invenção. Maisespecificamente, a seqüência de DNA para IFN-α 2b humano otimizadobaseia-se no uso do códon otimizado do oviduto de galinha e é criada com ouso do programa BACKTRANSLATE do Pacote Wisconsin, Versão 9.1(Genetics Computer Group Inc., Madison, Wis.) com uma tabela de uso docódon compilada das proteínas ovalbumina, lisozima, ovomucóide eovotransferrina de galinha (Gallus gallus). Por exemplo, o percentual de usopara os quatro códons do aminoácido alanina nas quatro proteínas da clara deovo é de 34 % para GCU, 31 % para GCC, 26 % para GCA e 8 % para GCG.Portanto, a GCU é usada como o códon para a maioria das alaninas naseqüência codificadora de IFN-α 2b humana otimizada. Os vetores contendoo gene para IFN-α 2b humano otimizado são usados para produzir avestransgênicas que expressem IFN-α 2b derivado de aves domésticastransgênicas (IFN-α 2b TPD) em seus tecidos e ovos. De forma semelhante, ométodo acima é empregado para o esquema de outras proteínas de seqüênciascodificadoras tais como a eritropoietina (EPO) humana ou outras proteínasque possam ser produzidas de acordo com a invenção.

Pelos métodos da presente invenção, os transgenes podem serintroduzidos nas células blastodérmicas embriônicas aviárias para produzirgalinha transgênica, peru transgênico, codorna transgênica e outras espéciesaviárias, que carregam o transgene no material genético de seu tecido da linhagerminativa. As células blastodérmicas são tipicamente células dos estágiosVII a XII, ou o seu equivalente, e em uma forma de realização acham-se pertodo estágio X. As células úteis na presente invenção incluem as célulasgerminativas embriônicas (EG), as células tronco embriônicas (ES) e célulasgerminais primordiais (PGCs). As células blastodérmicas embriônicas podemser isoladas de forma recente, mantidas em cultura, ou residem dentro de umembrião.

Os vetores úteis na realização dos métodos da presenteinvenção são descritos neste relatório. Estes vetores podem ser usados paraintrodução estável de uma seqüência codificadora exógena no genoma de umaave. Alternativamente, os vetores podem ser usados para produzir proteínasexógenas em tecidos específicos de uma ave, por exemplo no tecido dooviduto de uma ave. Os vetores podem também ser usados nos métodos paraproduzir ovos aviários que contenham proteína exógena. Em uma forma derealização, a seqüência codificadora e o promotor são ambos posicionadosentre os LTRs 5' e 3' antes da introdução nas células blastodérmicas. Em umaforma de realização, o vetor é retroviral e a seqüência codificadora e opromotor são ambos posicionados entre os LTRs 5' e 3' do vetor retroviral.Em uma forma de realização útil, os LTRs ou vetor retroviral são derivadosdo vírus da leucose aviária (ALV), vírus da leucemia murina (MLV), oulentivírus.

Em uma forma de realização, o vetor inclui uma seqüênciacodificadora de peptídeo de sinal, que é operavelmente ligada à seqüênciacodificadora, de modo que, após a translação em uma célula, o peptídeo desinal dirigirá a secreção da proteína exógena expressa pelo vetor na clara deum ovo de casca dura. O vetor pode incluir um gene marcador, em que esteseja operavelmente ligado a um promotor.

Em alguns casos, a introdução de um vetor da presenteinvenção nas células blastodérmicas embriônicas é realizada com célulasblastodérmicas embriônica que são ou recém-isoladas ou em cultura. Ascélulas transgênicas são então tipicamente injetadas na cavidade subgerminalabaixo de um blastoderma receptor em um ovo. Em alguns casos, entretanto,o vetor é liberado diretamente às células de um embrião blastodérmico.

Em uma forma de realização da invenção, os vetores usadospara transfectar células blastodérmicas e gerar a integração estável no genomaaviário contêm uma seqüência codificadora e um promotor emrelacionamento operacional e de posição para expressar a seqüênciacodificadora na célula da glândula tubular do magno do oviduto aviário, emque a seqüência codificadora codifica para uma proteína exógena que édepositada na clara de um ovo de casca dura. O promotor pode opcionalmenteser um segmento da região do promotor da ovalbumina que sejasuficientemente grande para dirigir a expressão da seqüência codificadora nascélulas da glândula tubular. A invenção envolve truncar o promotor daovalbumina e/ou condensar os elementos reguladores críticos do promotor daovalbumina, de modo que ele retenha as seqüências necessárias paraexpressão nas células da glândula tubular do magno do oviduto, enquanto sejasuficientemente pequeno de modo que possa ser facilmente incorporado nosvetores. Em uma forma de realização, um segmento da região do promotor daovalbumina pode ser usado. Este segmento compreende a região de flanqueio5' do gene da ovalbumina. O comprimento total do segmento do promotor daovalbumina pode ser de cerca de 0,88 kb a cerca de 7,4 kb de comprimento, eé de preferência de cerca de 0,88 kb a cerca de 1,4 kb de comprimento. Osegmento preferivelmente inclui tanto o elemento regulador dependente deesteróide quanto o elemento regulador negativo do gene da ovalbumina. Osegmento opcionalmente também inclui resíduos da região 5' não transladada(5' UTR) do gene da ovalbumina. Conseqüentemente, o promotor pode serderivado das regiões do promotor dos genes da ovalbumina, lisozima,conalbumina, ovomucóide, ovotransferrina ou ovomucina (Figura 14). Umexemplo de um tal promotor é o promotor de MDOT sintético que consiste deelementos do promotor de ovomucóide e de ovotransferrina (Figura 13). Opromotor pode também ser um promotor que seja grandemente, porém nãointeiramente, específico para o magno, tal como o promotor de lisozima. Opromotor pode também ser um promotor do vírus de tumor mamário decamundongo (MMTV). Alternativamente, o promotor pode ser um promotorconstitutivo [por exemplo, um promotor de citomegalovírus (CMV), umpromotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV), um promotor do vírus daleucemia murina (MLV), etc.]. Em uma forma de realização preferida dainvenção, o promotor é um promotor de citomegalovírus (CMV), umpromotor de MDOT, um promotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV), umpromotor do vírus da leucemia murina (MLV), um promotor do vírus dotumor mamário de camundongo (MMTV), um promotor da ovalbumina, umpromotor da lisozima, um promotor da conalbumina, um promotor doovomucóide, um promotor da ovomucina, e um promotor da ovotransferrina.Opcionalmente, o promotor pode ser pelo menos um segmento de uma regiãopromotora, tal como um segmento da região promotora da ovalbumina,lisozima, conalbumina, ovomucóide, ovomucina e ovotransferrina. Em umaforma de realização, o promotor é um promotor de CMV.

As Figuras IA e IB ilustram exemplos de vetores de expressãodo promotor da ovalbumina. O gene X é uma seqüência codificadora quecodifica uma proteína exógena. As flechas dobradas indicam os sítios deinício transcricionais. Em um exemplo, o vetor contém 1,4 kb da região deflanqueio 5' do gene da ovalbumina (Figura IA). A seqüência do "promotorde -1,4 kb" da Figura IA corresponde à seqüência partindo deaproximadamente 1,4 kb a montante (1,4 kb) do sítio de início da transcriçãoda ovalbumina e estendendo-se em aproximadamente 9 resíduos na região nãotransladada 5' do gene da ovalbumina. O segmento de aproximadamente 1,4kb de comprimento abriga dois elementos reguladores críticos, o elementoregulador dependente de esteróides (SDRE) e o elemento regulador negativo(NRE). O NRE é assim denominado porque ele contém vários elementosreguladores negativos que bloqueiam a expressão do gene na ausência dehormônios (por exemplo, estrogênio). Um segmento mais curto de 0,88 kbtambém contém ambos os elementos. Em outro exemplo, o vetor contémaproximadamente 7,4 kb da região de flanqueio 5' do gene da ovalbumina eabriga dois elementos adicionais (HS-III e HS-IV), um dos quais sendoconhecido por conter uma região funcional que permite a indução do genepelo estrogênio (Figura 1B). Um segmento mais curto de 6 kb tambémcontém todos os quatro elementos e pode opcionalmente ser usado napresente invenção..

Cada vetor usado para a integração aleatória de acordo com apresente invenção preferivelmente compreende pelo menos um elemento de1,2 kb do lócus da β-globina de galinha, o qual isola o gene dentro tanto daativação quanto da inativação no sítio de introdução no genoma. Em umaforma de realização, dois elementos isoladores são adicionados a umaextremidade da construção de genes da ovalbumina. No lócus da β-globina,os elementos isoladores servem para prevenir a região de controle do lócus(LCR) distai dos genes de ativação de montante do domínio de genes daglobina, e foram observados superarem os efeitos da posição nas moscastransgênicas, indicando que elas podem proteger-se tanto contra os efeitospositivos quanto negativos no sítio de inserção. O(s) elemento(s) isoladoresé(são) apenas necessários ou na extremidade 5' ou na 3' do gene, porque ostransgenes são integrados em cópias múltiplas em série eficazmente criandouma série de genes flanqueados pelo isolador do transgene da vizinhança. Emoutra forma de realização, o elemento isolador não é ligado ao vetor, mas écotransfectado com o vetor. Neste caso, o vetor e o elemento são unidos emsérie na célula pelo processo de integração aleatória no genoma.

Cada vetor pode opcionalmente também compreender um genemarcador para permitir a identificação e o enriquecimento dos clonescelulares que tenham estavelmente integrado o vetor de expressão. Aexpressão do gene marcador é conduzida por um promotor ubíquo que conduzaltos níveis de expressão em uma variedade de tipos celulares. Em uma formade realização da invenção, o gene marcador é o interferon humanooconduzido por um promotor de lisozima. Em outra forma de realização, ogene repórter da proteína fluorescente verde (GFP) [Zolotukhin et ai, J.Virol. 70: 4646-4654 (1995)] é conduzido pelo promotor do fator 1-a dealongamento (ef-1-α) de Xenopus [Johnson e Krieg, Gene 147: 223-226(1994)]. O promotor do ef-1-α de Xenopus é um forte promotor expresso emuma variedade de tipos celulares. A GFP contém mutações que intensificamsua fluorescência e é humanizada, ou modificada, de tal modo que os códonsse igualam ao perfil de utilização dos códons dos genes humanos. Uma vezque o uso dos códons aviários é virtualmente o mesmo que o uso dos códonshumanos, a forma humanizada do gene é também altamente expressa nascélulas blastodérmicas aviárias. Em formas de realização alternativas, o genemarcador é operavelmente articulado a um dos promotores ubíquos da tk doHSV5 CMV, β-actina ou RSV.

Embora o uso de códons humanos e aviários sejam bemcombinados, quando um gene de invertebrados é usado como a seqüênciacodifícadora no transgene, a seqüência de genes de invertebrados pode sermodificada para mudar os códons apropriados de tal modo que o uso decódons seja semelhante àquele dos seres humanos e das aves.

A transfecção das células blastodérmicas pode ser mediada porqualquer número de métodos conhecidos daqueles de experiência normal natécnica. A introdução do vetor na célula pode ser auxiliada misturando-seprimeiro o ácido nucléico com a polilisina ou lipídeos catiônicos que ajudema facilitam a passagem através da membrana celular. Entretanto, a introduçãodo vetor em uma célula é preferivelmente obtida através do uso de um veículode liberação, tal como um lipossoma ou um vírus. Os vírus que podem serusados para introduzir os vetores da presente invenção em uma célulablastodérmica incluem, porém sem limitar, retrovírus, adenovírus, vírusadenoassociados, vírus do herpes simples, e vírus da vacínia.

Em um método de transfectar células blastodérmicas, um vetorcom base retroviral envolvido é usado para liberar o vetor nas célulasblastodérmicas embriônicas, de modo que o vetor seja integrado no genomaaviário.

Como uma alternativa para liberar partículas de transduçãoretroviral às células blastodérmicas embriônicas em um embrião, célulasauxiliares que produzem o retrovírus podem ser liberadas ao blastoderma.

Retrovírus úteis para introduzir aleatoriamente um transgeneno genoma aviário é o vírus da leucose aviária (ALV) deficiente dereplicação, o vírus da leucemia murina (MLV) deficiente de replicação, ou olentivírus. A fim de produzir um vetor retroviral apropriado, um vetor depNLB é modificado pela introdução de uma região do promotor daovalbumina e um ou mais genes exógenos entre as repetições terminais longas(LTRs) 5' e 3' do genoma do retrovírus. A invenção considera que qualquerseqüência codificadora colocada a jusante de um promotor que seja ativo nascélulas da glândula tubular será expressa nas células da glândula tubular. Porexemplo, o promotor da ovalbumina será expresso nas células da glândulatubular do magno do oviduto porque o promotor da ovalbumina conduz aexpressão da proteína da ovalbumina e é ativo nas células da glândula tubulardo oviduto. Embora um promotor da ovalbumina de 7,4 kb tenha sidoobservado produzir a maior parte da construção ativa quando ensaiado nascélulas cultivadas da glândula tubular do oviduto, o promotor da ovalbuminaé preferivelmente encurtado para uso no vetor retroviral. Em uma forma derealização, o vetor retroviral compreende um segmento de 1,4 kb do promotorda ovalbumina; um segmento de 0,88 kb deve também ser adequado.

Qualquer dos vetores da presente invenção pode tambémincluir opcionalmente uma seqüência codificadora codificando um peptídeode sinal que dirija a secreção da proteína expressa pela seqüência codificadorado vetor das células da glândula tubular do oviduto. Este aspecto da invençãoamplifica eficazmente o espectro das proteínas exógenas que possam serdepositadas nos ovos aviários com o uso dos métodos da invenção. Quandouma proteína exógena deva não ser de outra forma secretada, o vetorcontendo a seqüência codificadora é modificado para compreender umaseqüência de DNA contendo cerca de 60 pares de base codificando umpeptídeo de sinal do gene da lisozima. A seqüência de DNA codificando opeptídeo de sinal é inserida no vetor, de tal modo que seja localizada notérmino N da proteína codificada pelo DNA.

As Figuras 2A a 2D ilustram exemplos de construções de vetorretroviral adequadas. A construção do vetor é introduzida no genoma aviáriocom LTRs de flanqueio de 5' e 3'. Neo é o gene da neomicinafosfotransferase. As flechas dobradas indicam os sítios de início datranscrição. As Figuras 2A e 2B ilustram LTRs e transcritos do oviduto comuma seqüência codificando o peptídeo de sinal da lisozima (LSP), enquanto asFiguras 2C e 2D ilustram transcritos sem uma tal seqüência. Existem duaspartes para a estratégia do vetor retroviral. Qualquer proteína que contenhaum peptídeo de sinal eucariótico pode ser clonada nos vetores apresentadosnas Figuras 2B e 2D. Qualquer proteína que não seja comumente secretadapode ser clonada nos vetores ilustrados nas Figuras 2A e 2B para levar emconta sua secreção das células da glândula tubular.

A Figura 2E ilustra a estratégia para clonar um gene exógenoem um vetor de peptídeo de sinal da lisozima. A reação em cadeia dapolimerase é usada para amplificar uma cópia de uma seqüência codificadora,gene X, usando um par de iniciadores de olifonucleotídeos contendo sítios deenzimas de restrição que possibilitam a inserção do gene amplificado noplasmídeo após a digestão com as duas enzimas. Os oligonucleotídeos de 5' e3' contêm os sítios de restrição Bsu36I e Xbal, respectivamente.

Outro aspecto da invenção envolve o uso de elementos do sítiode entrada de ribossoma interno (IRES) em qualquer dos vetores da presenteinvenção, para permitir a translação de duas ou mais proteínas de um mRNAdicistrônico ou policistrônico (Exemplo 15). As unidades do IRES sãofundidas às extremidades 5' de uma ou mais seqüências codificadorasadicionais que são então introduzidas nos vetores na extremidade daseqüência codificadora original, de modo que as seqüências codificadorasfiquem separadas uma das outras por um IRES (Figuras 2F, 15A e 15D). Deacordo com este aspecto da invenção, a modificação pós-translacional doproduto é facilitada porque uma seqüência codificadora pode codificar umaenzima capaz de modificar o outro produto de seqüência codificadora. Porexemplo, a primeira seqüência codificadora pode codificar colágeno que devaser hidroxilado e tornado ativo pela enzima codificada pela segunda seqüênciacodificadora. No exemplo de vetor retroviral da Figura 2F, um elemento dosítio de entrada do ribossoma interno (IRES) é posicionado entre duasseqüências codificadoras exógenas (gene X e gene Υ). O IRES possibilita quetanto a proteína X quanto a proteína Y sejam transladadas do mesmotranscrito cuja transcrição seja dirigida por um promotor tal como o promotorda ovalbumina. As flechas dobradas indicam os sítios de início da transcrição.Espera-se que a expressão da proteína codificada pelo gene X seja maiselevada nas células da glândula tubular, onde ela é especificamente expressa,porém não secretada. A proteína codificada pelo gene Y é também expressaespecificamente nas células da glândula tubular, mas, tendo em vista ser elaeficientemente secretada, a proteína Y é acondicionada dentro dos ovos. Noexemplo de vetor retroviral das Figuras 15A e 15D, a cadeia leve (LC) e acadeia pesada (HC) de um anticorpo monoclonal humano são expressas apartir de um vetor único, o pCMV-LC-emcvIRES-HC, mediante a colocaçãode um IRES do vírus da encefalomiocardite (EMCV). A transcrição éconduzida por um promotor de CMV [Ver, também, Murakami et al. (1997)iiHigh-Ievel expression of exogenous genes by replication-competentretrovirus vectors with an internai ribosomal entry site" Gene 202: 23-29;Chen et al. (1999) iiProduction and design of more ejfective avianreplication-incompetent retroviral vectors" Dev. Biol. 214: 370-384; Noel etal. (2000) iiSustained systemic delivery of monoclonal antibodies bygenetically modifiedskin fibroblasts" J. Invest. Dermatol. 115: 740-745).

Em outro aspecto da invenção, as seqüências codificadoras dosvetores usados em qualquer dos métodos da presente invenção são dotados deuma região não transladada 3' (3' UTR) para conferir estabilidade ao RNAproduzido. Quando uma 3' UTR é adicionada a um vetor retroviral, aorientação do promotor, do gene X e da 3' UTR deve ser invertida naconstrução, de modo que a adição da 3' UTR não interfira com a transcriçãodo RNA genômico de comprimento completo. Em uma forma de realização, aUTR pode ser aquela dos genes da ovalbumina ou da lisozima, ou qualquer3' UTR que seja funcional em uma célula do magno, isto é, a região tardia deSV40.

Em uma forma de realização alternativa da invenção, umpromotor constitutivo (por exemplo, CMV) é usado para expressar aseqüência codificadora de um transgene no magno de uma ave. Neste caso, aexpressão não fica limitada ao magno; a expressão também ocorre nos outrostecidos dentro da ave (por exemplo, no sangue). O uso de um tal transgene,que inclui um promotor constitutivo e uma seqüência codificadora, éparticularmente adequado para efetuar ou conduzir a expressão de umaproteína no oviduto e a subseqüente secreção da proteína dentro da clara deovo (ver a Figura 8A, quanto a um exemplo de uma construção conduzidapelo CMV, tal como o vetor pNLB-CMV-IFN para expressar IFN-α 2b emgalinhas).

A Figura 3A apresenta um esquema do vetor pNLB com baseno vírus da leucose aviária (ALV) deficiente de replicação, um vetor que éadequado para uso na invenção. No vetor pNLB, a maior parte do genoma deALV é substituída pelo gene de resistência à neomicina (Neo) e pelo geneIacZ, que codifica a b-galactosidase. A Figura 3B apresenta o vetor pNLB-CMV-BL, em que o IacZ foi substituído pelo promotor de CMV e a seqüênciacodificadora da β-lactamase (β-LA ou BL). A construção do vetor é relatadanos exemplos específicos (Exemplo 1, vide abaixo). A β-lactamase é expressado promotor do CMV e utiliza um sinal de poliadenilação (pA) no terminallongo repetido 3' (LTR). A proteína da β-lactamase tem um peptídeo de sinalnatural; assim, ela é observada no sangue e na clara do ovo.

Os embriões aviários são transduzidos com o vetor pNLB-CMV-BL (Exemplo 2, vide abaixo). As claras de ovos das galinhasresultantes estavelmente transduzidas contêm até 60 microgramas ^g) de β-lactamase ativa secretada por ovo (Exemplos 2 e 3, vide abaixo).

As Figuras 8A e 8B ilustram o vetor pNLB-CMV-IFN usadopara expressar o interferon-α 2b (IFN-a 2b) e o vetor pNLB-MDOT-EPOusado para expressar a eritropoietina (EPO), respectivamente. Ambas asproteínas exógenas (EPO, IFN) são expressas nas aves, preferivelmente nasgalinhas e nos perus.

O vetor pNLB-MDOT-EPO é criado pela substituição de umaseqüência codificando EPO para a seqüência codificadora BL (Exemplo 10,vide abaixo). Em uma forma de realização, um promotor sintéticodenominado MDOT é empregado para conduzir a expressão da EPO. AMDOT contém elementos tanto do promotor do ovomucóide quanto daovotransferrina. A seqüência de DNA para a EPO humana baseia-se no usodo códon otimizado do oviduto de galinha criado com o uso do programaBACKTRANSLATE do Wisconsin Package, versão 9.1 (Genetics ComputerGroup, Inc., Madison, Wis.) com uma tabela de uso do códon compilada dasproteínas ovalbumina, lisozima, ovomucóide e ovotransferrina de galinha{Gallus gallus). A seqüência de DNA de EPO é sintetizada e clonada no vetore o plasmídeo resultante é pNLB-MDOT-EPO (a.k.a. pA VIJCR-A145.27.2.2). Em uma forma de realização, as partículas transdutoras (isto é,partículas de transdução) são produzidas para o vetor, e estas partículastransdutoras são tituladas para se determinar a concentração apropriada quepode ser usada para injetar embriões. Os ovos recebem então a injeção compartículas transduroras após o que eles são incubados por cerca de 21 dias.

Os níveis de proteína exógena, tais como os níveis de EPO,podem então ser medidos por um ensaio ELISA das amostras de sorocoletadas dos filhotes uma semana após o nascimento. As aves machos sãoselecionadas para reprodução, em que elas são escolhidas para gaios GO quecontenham o transgene EPO em seu esperma. Preferivelmente, os gaios comos níveis mais elevados do transgene nas amostras de seu esperma sãopreparados para produzir galinhas não transgênicas mediante inseminaçãoartificial. As amostras de DNA do sangue são escolhidas quanto à presença dotransgene. Vários filhotes são usualmente observados serem transgênicos(aves Gl). O soro dos filhotes é testado quanto à presença de EPO humana(por exemplo, ensaio ELISA). A clara nos ovos de galinhas Gl é igualmentetestada quanto à presença de EPO humana. A EPO (isto é, derivada daseqüência codificadora otimizada da EPO humana) presente nos ovos dapresente invenção é biologicamente ativa (Exemplo 11).

De forma semelhante, o vetor pNLB-CMV-IFN (Figura 8A) écriado pelai substituição de uma seqüência codificadora do IFN pelaseqüência codificadora BL (Exemplo 12, vide abaixo). Em uma forma derealização, um promotor do citomegalovírus (CMV) constitutivo é empregadopara conduzir a expressão do IFN. Mais especificamente, a seqüênciacodificadora do IFN é controlada pelo promotor/intensificador prematurosimediatos do citomegalovírus (CMV) e do sítio poliA de SV40. A Figura 8Ailustra o pNLB-CMV-IFN usado para expressar IFN nas aves, por exemplo nagalinha e no peru. Uma seqüência codificadora otimizada é criada quanto aoIFN-α 2b humano, em que os códons mais freqüentemente usados para cadaaminoácido particular encontrado nas proteínas da clara de ovo ovalbumina,lisozima, ovomucóide e ovotransferrina é usado no esquema da seqüência deIFN-α 2b humano que é introduzida nos vetores da presente invenção. Maisespecificamente, a seqüência de DNA para o IFN-α 2b humano otimizado(Figura 1 IA) baseia-se no uso do códon otimizado do oviduto da galinha e écriada usando-se o programa BACKTRANSLATE (acima) com a tabela deuso do códon compilada das proteínas ovalbumina, lisozima, ovomucóide eovotransferrina de galinha (Gallus gallus). Por exemplo, o percentual de usopara os quatro códons do aminoácido alanina nas quatro proteína da clara deovo é de 34 % para GCU, 31 % para GCC, 26 % para GCA e 8 % para GCG.Portanto, GCU é usado como o códon para a maioria das alaninas naseqüência de IFN-α 2b humano otimizado. Os vetores contendo o gene para aseqüência de IFN-α 2b humano otimizado são usados para criar avestransgênicas que expressem IFN-α 2b TPD em seus tecidos e ovos.

As partículas transdutoras (isto é, partículas de transdução) sãoproduzidas para o vetor e tituladas para se determinar a concentraçãoapropriada que pode ser usada para se injetar embriões (Exemplo 2, videabaixo). Assim, as aves quiméricas são produzidas (ver também o Exemplo13, vide abaixo). Os ovos de aves são dotados de aberturas de acordo com oprocedimento de Speksnijder (Patente U.S. n° 5.897.998), e os ovos recebema injeção com partículas transdutoras. Os ovos são chocados cerca de 21 diasapós a injeção. Os níveis de hlFN são medidos (por exemplo, ensaio ELISA)das amostras de soro coletadas dos filhotes uma semana após terem sidochocados. Como foi o caso com a EPO (acima), as aves machos sãoselecionadas para reprodução. A fim de proceder aos testes quanto aos gaiosGO que contenham o transgene de IFN em seu esperma, o DNA é extraído dasamostras do esperma dos gaios. Os gaios GO com os mais elevados níveis dotransgene nas amostras de seu esperma são reproduzidos em galinhas nãotransgênicas mediante inseminação artificial. As amostras de DNA do sanguesão testadas quanto à presença do transgene. O soro dos gaios transgênicos étestado quanto à presença de hlFN (por exemplo, mediante ensaio ELISA). Sea proteína exógena for confirmada, o esperma dos gaios transgênicos é usadopara inseminação artificial de galinhas não transgênicas. Um certo percentualda prole conterá então o transgene (por exemplo, mais do que 50 %). Quandoo IFN (isto é, derivado da seqüência codificadora otimizada do IFN humano)está presente nos ovos da presente invenção, o IFN pode ser testado quanto àatividade biológica. Como foi o caso com a EPO, esses ovos usualmentecontêm IFN biologicamente ativo, tal como IFN-α 2b TPD (FIG. 11B).

Os métodos da invenção que levam em conta a produção daproteína exógena no oviduto das aves e a produção de ovos que contêmproteína exógena, envolvem uma etapa adicional subseqüente para prover umvetor adequado e introduzir o vetor nas células blastodérmicas embriônicas demodo que o vetor seja integrado no genoma aviário. A etapa subseqüenteenvolve derivar uma ave transgênica madura das células blastodérmicastransgênicas produzidas nas etapas anteriores. A obtenção de uma avetransgênica madura das células blastodérmicas opcionalmente envolve atransferência das células blastodérmicas transgênicas para um embrião epossibilita que o embrião se desenvolva completamente, de modo que ascélulas se tornem incorporadas na ave quando o embrião é deixadodesenvolver-se. O filhote resultante é então desenvolvido até a maturidade.Em uma forma de realização, as células de um embrião blastodérmico sãotransfectadas com o vetor diretamente dentro do embrião (Exemplo 2). Oembrião resultante é deixado desenvolver-se e o filhote é deixado amadurecer.

Em qualquer caso, a ave transgênica assim produzida a partirdas células blastodérmicas transgênicas é conhecida como um criador. Algunscriadores carregarão o transgene nas células da glândula tubular no magno deseus ovidutos. Estas aves expressarão a proteína exógena codificada pelotransgene em seus ovidutos. A proteína exógena pode também ser expressaem outros tecidos (por exemplo, no sangue) além dos ovidutos. Se a proteínaexógena contiver a(s) seqüência(s) de sinal apropriada(s), ela será secretadano lúmen do oviduto e dentro da clara do ovo. Alguns criadores são criadoresde linha germinativa (Exemplos 8 e 9). Um criador da linha germinativa é umcriador que carrega o transgene no material genético do tecido de sua linhagerminativa, e pode também carregar o transgene nas células da glândulatubular do magno do oviduto que expressam a proteína exógena. Portanto, deacordo com a invenção, as aves transgênica terão células da glândula tubularexpressando a proteína exógena, e a prole das aves transgênicas terão tambémcélulas da glândula tubular do magno do oviduto que expressem a proteínaexógena. Alternativamente, a prole expressa um fenótipo determinado pelaexpressão do gene exógeno em tecido(s) específico(s) da ave (Exemplo 6,Tabela 2). Em uma forma de realização da invenção, a ave transgênica é umagalinha ou um peru.

A invenção pode ser usada para expressar com grandesproduções e baixos custos, as proteínas desejadas, incluindo aquelas usadascomo aditivos farmacêuticos, diagnósticos humanos e de animais e dealimentação de animais domésticos. Por exemplo, a invenção inclui avestransgênicas que produzem tais proteínas e ovos por elas postos, os quaiscontenham a proteína, por exemplo, na clara dos ovos. A presente invenção éconsiderada para uso na produção de qualquer proteína desejada, incluindo asproteínas farmacêuticas com o requisito de qúe a seqüência codificadora daproteína possa ser introduzida em uma célula de oviduto de acordo com apresente invenção. De fato, todas as proteínas testadas até agora quanto àprodução heteróloga de acordo com a presente invenção, incluindo ointerferon α 2b, GM-CSF, interferon β, eritropoietina, G-CSF, proteína defusão de CTLA-4-Fc e β-lactamase, foram produzidas com sucessoempregando-se os métodos aqui apresentados.

A produção das proteínas humanas como apresentado nesterelatório é de particular interesse. A forma humana de cada uma das proteínasaquiapresentadas, para as quais existe uma forma humana, é considerada paraa produção em conformidade com a invenção.

As proteínas consideradas para a produção como aqui seapresenta incluem, porém sem limitar, as proteínas de fusão, os hormônios decrescimento, citocinas, proteínas estruturais e enzimas incluindo o hormôniode crescimento humano, interferon, lisozima e caseína-β, albumina,antitripsina a-1, antitrombina III, colágeno, fatores VIU, IX, X (e outros),fibrinogênio, insulina, lactoferrina, proteína C, eritropoietina (EPO), fator deestimulação de colônias de granulócitos (G-CSF), fator estimulador decolônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), ativador tecidual doplasminogênio (tPA), somatotropina e quimiotripsina. Imunoglobulinasmodificadas e anticorpos, incluindo as imunotoxinas que se ligam a antígenosde superfície em células tumorais humanas e as destroem, podem também serproduzidas como aqui apresentado.

Outros exemplos específicos de proteínas terapêuticas quepodem ser produzidas como apresentado neste relatório, incluem, semlimitação, o fator VIII, o fator VIII deletado do domínio b, o fator Vila, ofator IX, anticoagulantes; hirudina, alteplase, tpa, reteplase, tpa, tpa-3 dos 5domínio deletados, insulina, insulina lispro, insulina aspart, insulina glargina,análogos de insulina de longa atuação, hgh, glucabons, tsh, folitropina-beta,fsh, gm-csf, pdgh, ifn alfa2, ifh alfa2a, ifii alfa2b, inf-alfa, inf-beta lb, ifn-beta la, ifn-gamalb, il-2, il-11, hbsag, ospa, mab murino direcionado contra oantígeno t-linfocítico, mab murino direcionado contra tag-72, glicoproteínaassociada ao tumor, fragmentos de fab derivado de mab quiméricodirecionado contra o receptor superficial de plaquetas gpII(b)/III(a),fragmento de mab murino direcionado contra o antígeno cal 25 associado aotumor, o fragmento de mab murino direcionado contra o antígenocarcinoembriônico humano, cea, o fragmento de mab murino direcionadocontra a miosina cardíaca humana, o fragmento de mab murino direcionadocontra psma antígeno de superfície tumoral, os fragmentos de mab murino(mistura de fab/fab2) direcionados contra hmw-maa, o fragmento de mabmurino (fab) direcionado contra o antígeno associado com o carcinoma,fragmentos de mab (fab) direcionados contra nca 90, um antígeno de reaçãocruzada não específico de granulócito de superfície, mab quiméricodirecionado contra o antígeno ed20 encontrado sobre a superfície de linfócitosb, mab humanizado direcionado contra a cadeia alfa do receptor il2, mabquimérico direcionado contra a cadeia alfa do receptor il2, mab quiméricodirecionado contra tnf-alfa, mab humanizado direcionado contra um epítoposobre a superfície do vírus sincicial respiratório, mab humanizado direcionadocontra her 2, receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano, mabhumano direcionado contra o antígeno anti-ctla4 associado com o tumor decitoceratina, mab quimérico direcionado contra o antígeno de superfície cd 20dos linfócitos b dornase-alfa dnase, glicocerebrosidase beta, tnf-alfa, proteínade fusão da toxina de il-2-difteria, fragmento tnfr-lgg da proteína de fusão dalaronidase, dnaases, alefacept, darbepoietina alfa (fator estimulador decolônias), tositumomab, mab de murino, alemtuzumab, rasburicase,agalsidase beta, teriparatida, derivados do hormônio paratireóideo,adalimumab (lggl), anakinra, modificador biológico, nesiritida, peptídeonatriurético tipo b humano (hbnp), fatores estimuladores de colônias,pegvisomant, antagonista do receptor de hormônio de crescimento humano,proteína c ativada recombinante, omalizumab, imunoglobulina e bloqueador(lge), Ibritumomab tiuxetan, ACTH, glucagon, somatostatina, somatotropina,timosina, hormônio paratireóideo, hormônios pigmentares, somatomedina,eritropoietina, hormônio luteinizante, gonadotropina coriônica, fatores deliberação hipotálmica, etanercept, hormônios antidiuréticos, prolactina ehormônio estimulador da tireóide.

A invenção inclui métodos para produzir proteínasmultiméricas que incluem as imunoglobulinas, tais como anticorpos, e seusfragmentos de ligação a antígenos. Assim, em uma forma de realização dapresente invenção, a proteína multimérica é uma imunoglobulina, em que oprimeiro e o segundo polipeptídeos heterólogos são cadeias pesadas e leves daimunoglobulina, respectivamente.

Em certas formas de realização, um polipeptídeo deimunoglobulina codificado pela unidade transcricional de pelo menos umvetor de expressão pode ser um polipeptídeo de cadeia pesada daimunoglobulina compreendendo uma região variável ou uma sua variante, epode ainda compreender uma região D, uma região J, uma região C, ou umacombinação destas. Um polipeptídeo de imunoglobulina codificado por umvetor de expressão pode também ser um polipeptídeo de cadeia leve deimunoglobulina compreendendo uma região variável ou uma sua variante, epode ainda compreender uma região J e uma região C. A presente invençãotambém leva em conta regiões múltiplas de imunoglobulina, que sãoderivadas da mesma espécie animal, ou uma mistura de espécies, incluindo,mas não apenas estas, seres humanos, camundongos, ratos, coelhos egalinhas. Em certas formas de realização, os anticorpos osão humanos ouhumanizados.

Em outras formas de realização o polipeptídeo deimunoglobulina codificado por pelo menos um vetor de expressão,compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglubulina, umaregião variável de cadeia leve de imunoglobulina, e um peptídeo ligador, poresse meio formando um anticorpo de cadeia única capaz de ligarseletivamente um antígeno.

Exemplos de anticorpos terapêuticos que podem ser produzidonos métodos da invenção incluem, porém sem limitar, HERCEPTIN(Trastuzumab) (Genentech, CA), que é um anticorpo monoclonal anti-HER2humanizado para o tratamento de pacientes com câncer metastático demamas; REOPRO® (abciximab) (Centocor), que é um receptorantiglicoproteína Ilb/IIIa sobre as plaquetas para a prevenção da formação decoágulos; ZENAPAX® (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals, Suíça), que é

um anticorpo monoclonal anti-CD25 imunossupressor humanizado para aprevenção da rejeição aguda de aloenxertos renais; PANOREX , que é umanticorpo do antígeno IgG2a superficial celular anti-17-ΙΑ de murino (GlaxoWellcome/Centocor); BEC2, que é um anticorpo de IgG antidiótipo demurino (epítopo GD3) (ImClone System); IMC-C225, que é um anticorpo deIgG anti-EGFR quimérico (ImClone System);

VITAXIN®, que e um

anticorpo da integrina anti-aVp3 humanizado (Applied MolecularEvolution/Medlmmune); Campath; Campath 1H/LDP-03, que é um anticorpode IgGl anti-CD52 humanizado (Leukosite); Smart M195, que é umanticorpo de IgG anti-CD33 humanizado (Protein Design Lab/Kanebo);RITUXAN®, que é um anticorpo de IgGl anti-CD20 quimérico (IDECPharm/Genentech, Roche/Zettyaku); LYMPHOCIDE®, que é um anticorpo deIgG anti-CD22 (Immunomedics); ICM3 é um anticorpo anti-ICAM3humanizado (ICOS Pharm); IDEC-114 é um anticorpo anti-CD80 de primatas(IDEC Pharm/Mitsubishi); ZEVALIN® é um anticorpo anti-CD20radiorrotulado de murinos (IDEC/Schering AG); IDEC-131 é um anticorpoanti-CD40L humanizado (IDEC/Eisai); LDEC-151 é um anticorpo anti-CD4transformado em primata (IDEC); IDEC-152 é um anticorpo anti-CD23transformado em primata (IDEC/Seikagaku); SMART anti-CD3 é um IgGanti-CD3 humanizado (Protein Design Lab); 5G1.1 é um anticorpo do fator 5anticomplemento humanizado (CS) (Alexion Pharm); D2E7 é um anticorpoanti-TNF-α humanizado (CATIBASF); CDP870 é um fragmento Fab anti-TNF-a humanizado (Celltech); IDEC-151 é um anticorpo IgGl anti-CD4transformado em primata (IDEC Pharm/SmithKline Beecham); MDX-CD4 éum anticorpo de IgG anti-CD4 humano (Medarex/Eisai/Genmab); CDP571 éum anticorpo de IgG4 anti-TNF-α humanizado (Celltech);. LDP-02 é umanticorpo anti-a4p7 humanizado (LeukoSite/Genentech); OrthoCloneOKT4A é um anticorpo de IgG anti-CD4 humanizado (Ortho Biotech);ANTOVA® é um anticorpo de IgG anti-CD40L humanizado (Biogen);ANTEGREN® é um anticorpo de IgG anti-VLA-4 humanizado (Elan); CAT-152, um anticorpo anti-TGF-p2 humano (Cambridge Ab Tech); Cetuximab(BMS) é um anticorpo do receptor anti-EGF (EGFr) monoclonal; Bevacizuma(Genentech) é um anticorpo monoclonal humano anti-VEGF; Infliximab(Centocore, JJ) é um anticorpo monoclonal quimérico (camundongo ehumano) usado para tratar de distúrbios autoimunes; Gemtuzumabozogamicina (Wyeth) é um anticorpo monoclonal usado para a quimioterapia;e Ranibizumab (Genentech) é um anticorpo monoclonal quimérico(camundongo e humano) usado para tratar da degeneração macular.

Em um aspecto, a invenção é delineada para o G-CSFproduzido em aves domésticas. Em um aspecto, a invenção 'é delineada paraG-CSF com um padrão de glicosilação derivado de aves domésticas (G-CSFTPD), em que o G-CSF é obtido de células de aves, por exemplo célulasaviárias de uma galinha, codorna ou peru. São igualmente incluídas nainvenção as proteínas humanas incluindo citocinas tais como G-CSFproduzidas em aves domésticas na forma isolada ou purificada, e proteínashumanas incluindo citocinas tais como G-CSF produzidas em avesdomésticas presentes nas composições farmacêuticas. O isolamento dasproteínas que incluem G-CSF pode ser realizado por metodologias facilmenteevidentes a um médico especializado na técnica de purificação de proteínas. Acomposição de formulações úteis para produzir composições farmacêuticas étambém conhecida na técnica.

A presente invenção inclui proteínas terapêuticas oufarmacêuticas derivadas de aves domésticas transgênicas tendo um padrão deglicosilação derivado de aves domésticas de origem aviária. Por exemplo, ainvenção inclui o interferon-a 2 (IFN-a 2 TPD) derivado de aves. O IFN-a 2TPD (por exemplo, as espécies de tipo b) apresenta um novo padrão deglicosilação e contém novas formas glico (as faixas 4 e 5 são dissacarídeosestendidos α-Gal; ver a Figura 9) não normalmente observadas no interferon-α 2 derivado dos leucócitos do sangue periférico humano (IFN-α 2b do PBL).O IFN-a 2b TPD também contém estruturas de carboidrato O-Iigadas que sãosimilares ao IFN-α 2b do PBL humano e são mais eficientemente produzidasem galinhas do que na forma humana.

A presente invenção considera um polinucleotídeo isoladocompreendendo a seqüência de polinucleotídeos otimizados das proteínasproduzidas como apresentado neste relatório. Por exemplo, a invenção incluiseqüência codificadora otimizada aviária para IFN-α 2b humano, isto é,interferon-α 2b derivado de aves domésticas transgênicas recombinantes(IFN-α 2b TPD) (SEQ ID NO: 1). A seqüência codificadora para o IFN-α 2bhumano otimizado inclui 490 ácidos nucléicos e 165 aminoácidos (ver SEQID NO: Iea Figura 11A). De forma semelhante, a seqüência codificadorapara o IFN-α 2b humano natural inclui 498 nucleotídeos (Número de Acessoda NCBI AF405539 e GI: 15487989) e 165 aminoácidos (Número de Acessoda NCBI AALO1040 e GI: 15487990). Os códons mais freqüentemente usadospara cada aminoácido particular encontrado nas proteínas ovalbumina,lisozima, ovomucóide e ovotransferrina da clara de ovo são usados noesquema da seqüência codificadora de IFN-α 2b humano otimizado que éintroduzida nos vetores da presente invenção. Mais especificamente, aseqüência de DNA para o IFN-α 2b humano otimizado baseia-se no uso docódon otimizado do oviduto de galinha e é criada com o uso do programaBACKTRANSLATE® da Wisconsin Package, versão 9.1 (Genetics ComputerGroup, Inc., Madison, Wis.) com uma tabela de aplicação do códoncompilada das proteínas ovalbumina, lisozima, ovomucóide e ovotransferrinade galinha (Gallus gallus). Por exemplo, o percentual de uso para os quatrocódons do aminoácido alanina nas quatro proteínas da clara de ovo é de 34 %para GCU, 31 % para GCC, 26 % para GCA e 8 % para GCG. Portanto, aGCU é usada como o códon para a maioria das alaninas na seqüênciacodificadora de IFN-α 2b humana otimizada. Os vetores contendo o genepara IFN-α 2b humano otimizado são usados para produzir aves transgênicasque expressem IFN-α 2b TPD) em seus tecidos e ovos.

Como examinado no Exemplo 13 (vide abaixo), o IFN-α 2bTPD é produzido na galinha. Entretanto, o IFN-α 2b TPD pode também serproduzido no peru e em outras espécies aviárias tais como a codorna. Em umaforma de realização preferida da invenção, o IFN-α 2b TPD é expresso nagalinha e no peru e em seus ovos de casca dura. Uma análise de carboidratos(Exemplo 14, vide abaixo), incluindo uma análise de monossacarídeos eanálise de FACE, revela a composição de açúcar ou o novo padrão deglicosilação da proteína. Como tal, o IFN-α 2b TPD apresenta os seguintesresíduos de monossacarídeos: N-Acetil-Galactosamina (NAcGal), Galactose

(Gal), N-Acetil-Glicosamina (NAcGlu) e Aeido Siálico (SA). Entretanto, nãoexiste nenhuma glicosilação ligada em N no IFN-α 2b TPD. Ao invés, o IFN-a 2b TPD é O-glicosilado em Thr-106. Este tipo de glicosilação é semelhanteao IFN-a 2 humano, em que o resíduo de Thr na posição 106 é único paraIFN-a 2. Semelhante ao IFN-α natural, o IFN-α 2b TPD não tem resíduos demanose, em que as bandas 1, 2 e 3 são não sialiladas, mono-sialiladas e di-sialiladas, respectivamente (Figura 10). A articulação do ácido siálico (SA) éalfa 2-3 à Galactose (Gal) e alfa 2-6 à N-Acetil-Galactosamina (NAcGal). Abanda 6 representa um tetrassacarídeo não sialilado. As bandas 4 e 5 sãodissacarídeos prolongados até alfa-Galactose (alfa-Gal) que não sãoobservados no IFN-α 2b do PBL humano ou no IFN humano natural (hlFNnatural). A Figura 10 apresenta a comparação do IFN-α 2b TPD (hlFN daclara de ovo) com o IFN-α 2b do PBL humano (hlFN natural). As bandasmenores se acham presentes entre as bandas 3 e 4 e entre as bandas 4 e 5 noIFN-α 2b TPD (vide abaixo).

A presente invenção leva em conta uma seqüência depolipeptídeos isolados (SEQ ID NO: 2) do IFN-α 2b TPD (ver, também, aFigura 11B) e uma sua composição farmacêutica, em que a proteína é O-glicosilada. em Thr-106 com uma ou mais das estruturas de carboidrãto aquiapresentadas, como segue:

(i) Gal-NAcGal-

(ii) SA-Gal-NAcGal-

(iii) SA-Gal-NAcGal-.

(iv) Gal-NAcGlu-NAcGal-,

(v) Gal-Gal-NAcGal-(vi) Gal-Gal-NAcGal-

em que Gal = Galactose,

NAcGal = N-Acetil-Galaetosamina,

NAeGlu = N-Acetil-Glicosamina, e

SA = Ácido Siálico.

Em uma forma de realização da presente invenção, ospercentuais são como segue:

(i) Gal-NAcGal- é de cerca de 20 %

(ii) SA-Gal-NAcGal- é de cerca de 29 %

(iii) SA-Gal-NAcGal- é de cerca de 9 %

(iv) Gal-NAcGlu-NAcGal- é de cerca de 6 %

(v) Gal-Gal-NAcGal- é de cerca de 7 %

(vi) Gal-Gal-NAcGal- é de cerca de 12 %

As bandas menores se acham presentes entre as bandas 3 e 4 eentre as bandas 4 e 5 que respondem por cerca de 17 % no IFN-α 2b TPD.

Em uma forma de realização, a invenção é direcionada aproteínas humanas tendo um padrão de glicosilação derivado de avesdomésticas. Em uma forma de realização, o padrão de glicosilação derivadode aves domésticas é obtido de células de oviduto de aves, por exemplocélulas da glândula tubular. Por exemplo, são aqui apresentados os padrões deglicosilação que foram demonstrados estarem presentes nas proteínashumanas produzidas nas células do oviduto de uma galinha, de acordo com apresente invenção.

Em uma forma de realização, a invenção é dirigida a G-CSFhumano produzido em aves (por exemplo, células do oviduto de aves) taiscomo galinhas, peru e codorna tendo um padrão de glicosilação derivado deaves domésticas. A seqüência de aminoácidos de hG-CSF maduro éapresentada na Figura 18 C. A seqüência de nucleotídeos aqui usada paraproduzir G-CSF é apresentada na Figura 18 A e no Acesso da NCBI NM172219. As seqüências de nucleotídeos otimizadas para uso no códon de aves(por exemplo, galinha) são também consideradas para uso para produzir G-CSF e outras proteínas tais como as proteínas humanas produzidas de acordocom a invenção.

A invenção inclui os ovos e as aves (por exemplo, galinha,peru e codorna) que põem os ovos contendo moléculas de G-CSF da invençãocontendo uma ou mais das estruturas de glicosilação apresentadas abaixo:

<formula>formula see original document page 63</formula>

Em uma forma de realização, a invenção inclui uma mistura demoléculas de G-CSF, em que a mistura contém moléculas de G-CSF tendouma estrutura de glicosilação selecionada de uma ou mais dentre a EstruturaA, Estrutura B, Estrutura C, Estrutura D, Estrutura E, Estrutura F e EstruturaG. A invenção também inclui uma mistura de moléculas de G-CSF em que amistura contém moléculas de G-CSF tendo uma estrutura de glicosilaçãoselecionada de uma ou mais dentre Estrutura A, Estrutura B, Estrutura C,Estrutura D, Estrutura E, Estrutura F e Estrutura G em que a mistura é isoladaou purificada, por exemplo purificada de um ovo ou da clara de ovoproduzida de acordo com a invenção. Acha-se também incluída uma misturade moléculas de G-CSF, que contém moléculas de G-CSF tendo duas, três,quadro, cinco ou seis das estruturas: Estrutura A, Estrutura B, Estrutura C,Estrutura D, Estrutura E, Estrutura F e/ou Estrutura G. Também acha-seincluída uma mistura de moléculas de G-CSF que contém moléculas de G-CSF tendo duas, três, quatro, cinco ou seis das estruturas: Estrutura A,Estrutura B, Estrutura C, Estrutura D, Estrutura E, Estrutura F e/ou EstruturaG, que tenham sido isoladas ou purificadas, por exemplo purificadas de umovo ou de clara de ovo produzida de acordo com a invenção.

A invenção também inclui uma molécula de G-CSF individualcompreendendo uma Estrutura A. A invenção também inclui uma moléculade G-CSF individual compreendendo uma Estrutura Β. A invenção tambéminclui uma molécula de G-CSF individual compreendendo uma Estrutura C.A invenção também inclui uma molécula de G-CSF individualcompreendendo uma Estrutura D. A invenção também inclui uma moléculade G-CSF individual compreendendo uma Estrutura Ε. A invenção tambéminclui uma molécula de G-CSF individual compreendendo uma Estrutura F. Ainvenção também inclui uma molécula de G-CSF individual compreendendouma Estrutura G. Em uma forma de realização, a molécula de G-CSFindividual está presente em uma mistura de moléculas de G-CSF que pode seruma mistura isolada ou purificada de moléculas de G-CSF, por exemplo amistura sendo purificada de um ovo ou de clara de ovo produzida de acordocom a invenção. Em uma forma de realização, a molécula de G-CSFindividual está presente é isolada ou purificada, por exemplo purificada comoaqui apresentado (por exemplo por HPLC como apresentado no Exemplo 20)..

As formas de realização da invenção, como aqui especificadascom respeito a G-CSF, por exemplo misturas de moléculas de G-CSF emoléculas de G-CSF individuais (nos dois parágrafos precedentes), sãotambém aplicáveis em geral para cada uma das outras proteínas produzidas deacordo com a invenção e suas estruturas de glicosilação correspondentesderivadas de aves domésticas.

E também considerado que as estruturas de glicosilaçãodemonstradas como estando presentes em uma proteína da invenção, podemestar presentes em outra proteína da invenção. Por exemplo, as estruturas deglicosilação mostradas como estando presentes em G-CSF TPD podemtambém estar presentes em GM-CSF TPD, EPO, IFN TPD e/ou outrasproteínas de TPD. Em outro exemplo, é considerado que as estruturas deglicosilação determinadas como estando presentes em IFN oc2 TPDpodemestar presentes em G-CSF TPD, GM-CSF TPD, EPO TPD e/ou outrasproteínas derivadas de aves domésticas transgênicas (TPD). A invençãotambém especificamente inclui proteínas humanas em geral tendo uma oumais das estruturas de glicosilação de TPD aqui apresentadas.

Embora seja possível que, para uso em terapia, as proteínasterapêuticas produzidas em conformidade com esta invenção possam seradministradas na forma bruta, é preferível administrá-las como parte de umaformulação farmacêutica.

A invenção, assim, ainda fornece formulações farmacêuticascompreendendo proteínas terapêuticas glicosiladas derivadas de avesdomésticas, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, junto com umou mais dos seus portadores farmaceuticamente aceitáveis e, opcionalmente,outros ingredientes terapêuticos e/ou profiláticos, e métodos de administrartais formulações farmacêuticas. O(s) portador(es) devem ser "aceitáveis" nosentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação, enão deletérios ao seu receptor. Os métodos de tratar de um paciente (porexemplo, a quantidade da proteína farmacêutica administrada, a freqüência deadministração e a duração do período de tratamento) com o uso dascomposições farmacêuticas da invenção, podem ser determinados com o usode metodologias padrão conhecidas dos médicos de experiência na técnica.

As formulações farmacêuticas incluem aquelas adequadas parauso oral, retal, nasal, tópico (incluindo bucal e sublingual), vaginal ouparenteral. As formulações farmacêuticas incluem aquelas adequadas paraadministração por injeção, incluindo a administração intramuscular,subcutânea e intravenosa. As formulações farmacêuticas também incluemaquelas para administração por inalação ou insuflação. As formulaçõespodem, quando apropriado, ser convenientemente apresentadas em unidadesde dosagem discretas e podem ser preparadas por qualquer um dos métodosbem conhecidos na técnica de farmácia. Os métodos de produzir asformulações farmacêuticas tipicamente incluem a etapa de colocar asproteínas terapêuticas em associação com portadores líquidos ou portadoressólidos finamente divididos, ou ambos, e depois, se necessário, moldar oproduto na formulação desejada.

As formulações farmacêuticas adequadas para administraçãooral podem convenientemente ser apresentadas como unidades discretas taiscomo cápsulas, lâminas ou tabletes, cada uma contendo uma quantidadepredeterminada do ingrediente ativo; como um pó ou grânulos; como umasolução; como uma suspensão; ou como uma emulsão. O ingrediente ativopode também ser apresentado como um bolo, electuário ou pasta. Os tabletese cápsulas para administração oral podem conter excipientes convencionaistais como agentes de ligação, enchedores, lubrificantes, desintegrantes ouagentes umectantes. Os tabletes podem ser revestidos de acordo com métodosbem conhecidos na técnica. As preparações líquidas orais podem estar, porexemplo, na forma de suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões,xaropes ou elixires, ou podem ser apresentadas como um produto seco paraconstituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Taispreparações líquidas podem conter aditivos convencionais tais como agentesde suspensão, agentes emulsificantes, veículos não aquosos (que podemincluir óleos comestíveis) ou preservativos.

As proteínas terapêuticas da invenção podem também serformuladas para administração parenteral (por exemplo, por injeção, porexemplo injeção de bolo ou infusão contínua) e podem ser apresentadas naforma de dose unitária em ampolas, seringas pré-enchidas, infusão depequeno volume ou em recipientes de múltiplas doses com um preservativoadicionado. As proteínas terapêuticas podem ser injetadas, por exemplo,mediante injeções subcutâneas, injeções intramusculares e infusões ouinjeções intravenosas.

As proteínas terapêuticas podem tomar formas tais comosuspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podemconter agentes formuladores tais como os agentes de suspensão, estabilizaçãoe/ou dispersão. Considera-se também que as proteínas terapêuticas possamestar na forma de pó, obtidas por isolamento asséptico do sólido estéril ou porliofilização da solução, para constituição com um veículo adequado, porexemplo água estéril isenta de pirogênio, antes do uso.

Quanto à administração tópica à epiderme, as proteínasterapêuticas produzidas de acordo com a invenção podem ser formuladascomo ungüentos, cremes ou loções, ou como um emplastro transdérmico. Osungüentos ou cremes podem, por exemplo, ser formulados com uma baseaquosa ou oleosa com a adição de agentes espessantes e/ou de gelaçãoadequados. As loções podem ser formuladas com uma base aquosa ou oleosae em geral também conterão um ou mais agentes emulsificantes, agentesestabilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspensão, agentes espessantesou agentes colorantes.

Formulações adequadas para administração tópica na bocaincluem balas contendo o ingrediente ativo em uma base aromatizada,usualmente sacarose e acácia ou tragacanto; pastilhas contendo o ingredienteativo em uma base inerte tal como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia; ecolutórios contendo o ingrediente ativo em um portador líquido adequado.

Formulações farmacêuticas adequadas para administração retalem que o portador seja um sólido, são o mais preferível representadas comosupositórios de dose unitária. Portadores adequados incluem a manteiga decacau e outros materiais comumente usados na técnica, e os supositóriospodem ser convenientemente formados por uma mistura do composto ativocom o(s) portador(es) amolecidos ou fundidos seguida por resfriamento econformação em moldes.

Formulações adequadas para administração vaginal podem serapresentadas como pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas oupulverizações contendo além do ingrediente ativo, esses portadores que sãoconhecidos na técnica como sendo apropriados.

Para administração intranasal, as proteínas terapêuticas dainvenção podem ser usadas como uma pulverização líquida ou pó dispersívelou na forma de gotas.

As gotas podem ser formuladas com uma base aquosa ou nãoaquosa também compreendendo um ou mais agentes dispersantes, agentessolubilizantes ou agentes de suspensão. As pulverizações líquidas sãoconvenientemente liberadas de embalagens pressurizadas.

Quanto à administração por inalação, as proteínas terapêuticasde acordo com a invenção podem ser convenientemente liberadas de uminsuflador, nebulizador ou uma embalagem pressurizada, ou outrosdispositivos convenientes de liberar uma pulverização em aerossol. Asembalagens pressurizadas podem compreender um propelente adequado, talcomo o diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano,dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossolpressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada provendo-se umaválcula para liberar uma quantidade medida.

Para administração por inalação ou insuflação, as proteínasterapêuticas de acordo com a invenção podem assumir a forma de umacomposição em pó seco, por exemplo uma mistura em pó do composto comuma base em pó adequada, tal como lactose ou amido. A composição em pópode ser apresentada na forma de dosagem unitária em, por exemplo, cápsulasou cartuchos ou, por exemplo, gelatina ou embalagens de ampolas, das quaiso pó pode ser administrado com o auxílio de um inalador ou insuflador.

Quando desejável, as formulações acima descritas adaptadaspara propiciar liberação prolongada do ingrediente ativo podem serempregadas.

As composições farmacêuticas de acordo com a invençãopodem também conter outros ingredientes ativos tais como agentesantimicrobianos, ou preservativos.

Além disso, considera-se que as proteínas terapêuticas dainvenção possam ser usadas em combinação com outros agentes terapêuticos.

As composições ou compostos da invenção podem ser usadospara tratar de uma variedade de condições. Por exemplo, existem muitascondições para as quais as terapias de tratamento são conhecidas dos médicoshabilitados na técnica, em que as proteínas terapêuticas obtidas da culturacelular (por exemplo, células de CHO) são empregadas. A presente invençãoconsidera que as proteínas terapêuticas produzidas em um sistema aviáriocontendo um padrão de glicosilação derivado de aves domésticas, possam serempregadas para tratar tais condições. Isto é, a invenção considera otratamento das condições conhecidas como sendo tratáveis pelas proteínasterapêuticas convencionalmente produzidas mediante o uso das proteínasterapêuticas produzidas de acordo com a invenção. Por exemplo, aeritropoietina produzida de acordo com a invenção pode ser usada para tratarde condições humanas tais como a anemia e a doença dos rins (por exemplo, adeficiência renal crônica), e o G-CSF produzido de acordo com a invençãopode ser usado para tratar de pacientes de câncer, como entendido na técnica.Geralmente, a dosagem administrada variará dependendo defatores conhecidos como a idade, a saúde e o peso do receptor, do tipo detratamento concomitante, da freqüência do tratamento, etc. Usualmente, umadosagem do ingrediente ativo pode situar-se entre cerca de 0,0001 e cerca demiligramas por quilograma de peso corporal. A dosagem precisa, afreqüência de administração e a extensão do tempo de tratamento, podem serdeterminados por um médico versado na técnica de administração da proteínaterapêutica respectiva.

Os seguintes exemplos específicos são fornecidos para ilustrara invenção e não devem ser interpretados como limitativos do excopo dasreivindicações.EXEMPLO 1

CONSTRUÇÃO DE VETOR

Um gene IacZ de pNLB, um vetor com base no vírus daleucose aviária (ALV) deficiente de replicação (Cosset et al. 1991), foisubstituído por um cassete de expressão consistindo de um promotor docitomegalovírus (CMV) e o gene repórter, β-lactamase. As construções dosvetores pNLB e pNLB-CMV-BL são graficamente representadas nas Figuras2A e 3B, respectivamente.

Para eficientemente substituir o gene IacZ de pNLB por umtransgene, um plasmídeo adaptador intermediário foi primeiramente criado, oAdaptador de pNLB. O Adaptador de pNLB foi criado pela inserção dofragmento Apal/Apal retro-mastigado de pNLB [Cosset et al., J. Virol. 65:3388-3394 (1991)] (em pNLB, os 289 bp dos resíduos de 5' ApaI a montantede IacZ e os resíduos de 3' ApaI dos segmentos LTR 3' e Gag) nos sítiosKpnI e SacI retro-mastigados de pBluescriptKS(-). O fragmento Mlul/Xbalsubstituto de pCMV-BL [Moore et al., Anal. Biochem. 247: 203-209 (1997)]foi introduzido nos sítios Kpnl/Ndel retro-mastigados do Adaptador pNLB,substituindo IacZ com o promotor de CMV e o gene BL (em pNLB, resíduosKpnI de 67 bp a montante de IacZ e resíduos NdeI de 100 bp a montante docódon de parada de IacZ), dessa forma criando pNLB-Adaptador-CMV-BL.Para criar pNLB-CMV-BL, o inserto HindIII/BIpI de pNLB (contendo IacZ)foi substituído pelo inserto HindIII/BIpI de pNLB-Adaptador-CMV-BL. Estaclonagem de duas etapas foi necessária porque a ligação direta dosfragmentos de extremidade embotada nos sítios de HindIII/BIpI de pNLBproduziu a maior parte dos subclones rearranjados, por razões desconhecidas.EXEMPLO 2

CRIAÇÃO DO REBANHO DE CRIADORES pNLB-CMV-BL

Sentas e Isoldes foram cultivados em FlO (Gibco), 5 % de sotode bezerro recém-nascido (Gibco), 1 % de soro de galinha (Gibco), 50 μg/mlde fleomicina (Cayla Laboratories) e 50 mg/ml de higromicina (Sigma). Aspartículas de transdução foram produzidas como descrito em Cosset et al.,1993, aqui incorporado como referência, com as seguintes exceções. Doisdias após a transfecção do vetor retroviral pNLB-CMV-BL (do Exemplo 1,acima) em 9x10 de Sentas, o vírus foi colhido em meio fresco por 6 a 16horas e filtrado. Todo o meio foi usado para transduzir 3 χ IO6 de Isoldes em

3 placas de 100 mm com polibreno adicionado até uma concentração final de

4 μg/ml. No dia seguinte, o meio foi substituído por meio contendo 50 μg/mlde fleomicina, 50 μg/ml de higromicina e 200 μg/ml de G418 (Sigma). Após10 a 12 dias, as colônias únicas resistentes ao G418 foram isoladas etransferidas para placas de 24 reservatórios. Após 7 a 10 dias, os títulos decada colônia foram determinados por transdução de Sentas seguido pelaseleção de G418. Tipicamente 2 das 60 colônias deram títulos em 1 a 3 χ IO5.25 Aquelas colônica foram expandidas e o vírus foi concentrado em 2 a 7 χ IO6,como descrito em Allioli et al., Dev. Biol. 165: 30-37 (1994), aquiincorporado como referência. A integridade do cassete de expressão de CMV-BL foi confirmada pelo enxaio quanto à β-lactamase no meio de célulastransduzidas com partículas de transdução de NLB-CMV-BL.O vetor de transdução, pNLB-CMV-BL, foi injetado nacavidade subgerminal de 546 embriões de embriões de White Leghorn SPFnão incubadas, dentre os quais 126 filhotes foram incubados e foramensaiados quanto à secreção da β-lactamase (Iactamase) no sangue. De modoa medir a concentração da lactamase ativa nas amostras desconhecidas, umensaio calorimétrico cinético foi empregado, no qual o PADAC, um substratopúrpura, é convertido em um composto amarelo especificamente pelalactamase. A atividade da lactamase foi quantificada pela monitoração dodecréscimo na OD570 nm durante um tempo de reação padrão e comparadacom uma curva padrão com níveis variados de lactamase purificada (referidocomo o "ensaio da lactamase"). A presença ou ausência da lactamase em umaamostra podem também ser determinadas mediante classificação visual para aconversão de púrpura em amarelo em uma amostra de teste durante a noite oupor vários dias (o "ensaio noturno da lactamase"). Este último método foiadequado para a detecção de níveis muitos baixos de lactamase ou para triarum grande número de amostrar. Em uma a quatro semanas de idade, asamostras de soro dos filhotes foram testadas quanto à presença de lactamase.Vinte e sete filhotes tiveram níveis muito baixos de lactamase em seu soro,que foram detectáveis apenas após o ensaio noturno da lactamase e, quandoestas aves amadureceram, a lactamase não mais foi detectável. Comomostrado na Tabela 1 abaixo e na Figura 4A, 9 aves adicionais (3 machos e 6fêmeas) tiveram níveis de lactamase do soro que variaram de 11,9 a 173,4ng/ml em seis a sete meses após o choco.TABELA 1

EXPRESSÃO DA β-LACTAMASE EM GALINHAS TRANSDUZIDASPOR NLB-CMV-BL

Média em ng/ml da β-Iactamase

<table>table see original document page 73</column></row><table>

1NA: não aplicável.

Os controles foram obtidos das galinhas não tratadas.

Representa a média de 5 a 20 ovos.

Exemplo 3

Expressão da β-lactamase na clara de ovo de galinhas gOCinqüenta e sete frangas transduzidas com o vetor retroviralpNLB-CMV-BL foram criadas até a maturidade sexual, e a clara de ovo decada galinha foi testada quanto à β-lactamase ativa (Iactamase) aos 8 mesesde idade. Das 57 aves, seis possuíam níveis significativos de lactamase quevariavam de 56,3 a 250,0 ng/ml (Tabela 1, acima). Nenhuma outra galinhaneste grupo teve níveis detectáveis de lactamase em sua clara de ovo, mesmoapós a incubação do PADAC com a amostra por vários dias. A lactamase nãofoi detectável na clara de ovo de 24 galinhas que receberam injeção simuladae de 42 galinhas que foram transduzidas com um vetor NLB que nãocarregava o transgene da lactamase. A expressão estável da lactamase foiainda detectável na clara de ovo das seis galinhas de expressão seis mesesapós os ensaios iniciais (Tabela 1, acima).

A lactamase foi detectada na clara de ovo de todas as seisgalinhas mediante um ensaio de Western blot com um anticorpo anti-β-lactamase. A lactamase da clara de ovo tinha o mesmo volume da lactamasepurificada bacterianamente produzida, que foi usada como um padrão. Aquantidade detectada na clara de ovo pela análise de Western foi compatívelcom aquela determinada pelo ensaio enzimático, indicando que umaproporção significativa da lactamase da clara de ovo era biologicamente ativa.A lactamase produzida pelas galinhas na clara de ovo armazenada em 4 0Cnão perdeu nenhuma atividade e não apresentou nenhuma mudança no pelomolecular, mesmo após vários meses de armazenagem. Esta observaçãopossibilitou a armazenagem de ovos contendo lactamase por períodosprolongados antes da análise.

Exemplo 4

Transmissão da linha germinativa e expressão do soro do transgene da β-lactamase em galinhas transgênicas gl e g2

O DNA foi extraído do esperma coletado de 56 gaios GO e trêsdos 56 aves que abrigavam níveis significativos do transgene no DNA do seuesperma, determinados por PCR quantitativa, foram selecionados parareprodução. Estes gaios foram os mesmos três que tinham os mais altos níveisde β-lactamase (lactamase) em seu sangue (gaios 2395, 2421 e 2428). O galo2395 deu origem a três filhotes transgênicos Gl (fora da progênie de 422),enquanto os outros dois não produziram nenhuma prole transgênica fora daprogênie total de 630). A análise de Southern do DNA do sangue de cada umdos três pintos transgênicos Gl confirmou que os transgenes estavam intactose que eles se achavam integrados em lócus aleatórios únicos. O soro dospintos transgênicos Gl, 5308, 5657 e 4133, em 6 a 11 semanas após a postura,continha 0,03, 2,0 e 6,0 μg/ml de lactamase, respectivamente. Os níveis delactamase caíram a níveis de 0,03, 1,1 e 5,0 μg/ml quando as aves foramensaiadas novamente com 6 a 7 meses de idade (Figura 4A).

A galinha 5657 e o galo 4133 deram origem a galinhas nãotransgênicas para se obter homozigotos da prole para o transgene. A linhagemdas galinhas transgênicas produzidas do galo 4133 ou da galinha 5657, e asgerações subseqüentes, são apresentados na Figura 5. O galo transgênico 5308também produziu cria, mas esta progênie de aves apresentou concentrações delactamase que ficaram ou muito baixas ou não detectáveis no soro e na clarados ovos. As concentrações de lactamase ativa no soro de pintos transgênicosG2 aleatoriamente selecionados foram medidas em 3 a 90 dias após o choco.Dos cinco transgênicos G2 produzidos da galinha 5657, todos tiveramlactamase ativa nas concentrações de 1,9 a 2,3 μg/ml (em comparação com aexpressão parental de 1,1 μg/ml, Figura 4B). Todas as amostras foramcoletadas durante o mesmo período de tempo, e assim esperou-se que asconcentrações de lactamase no soro da progênie fossem mais elevadas do quedos ancestrais desde que a concentração na galinha 5657 havia caídoproporcionalmente quando ela amadureceu. De forma semelhante, os cincopintos transgênicos aleatoriamente selecionados reproduzidos do galo 4133tiveram, todos eles, concentrações de lactamase do soro que eramsemelhantes, mais elevadas do que aquela de seus ancestrais (Figura 4B).Exemplo 5

Expressão da β-lactamase na clara de ovo de galinhas transgênicas

Os ovos da galinha Gl 5657 continham 130 ng de β-lactamaseativa (lactamase) por mililitro de clara de ovo (Figura 6A). As concentraçõesde lactamase foram mais elevadas nos primeiros poucos ovos depositados edepois alcançou um máximo que ficou estável por pelo menos nove meses.Os ovos de galinhas transgênicas de reprodução da galinha 5657 com um galonão transgênico tinham concentrações de lactamase que eram semelhantes àsde seus progenitores (Figura 6A). A galinha 6978 foi reproduzida da galinhaG2 8617 e parente do galo G2 8839, e foi homozigota quanto ao transgenecomo determinado por PCR quantitativa e análise de Southern. Comoesperado, a concentração da lactamase nos ovos da ave 6978 foi quase duasvezes mais elevada do que seu progenitor homozigoto (Figura 6B). Nenhumaoutra galinha G3 produzida da galinha 5657 foi analisada, porque a galinha6978 era a única fêmea em sua ninhada. E importante observar que os ovosdas galinhas 8867, 8868 e 8869 foram colhidos onze meses após e tiveramconcentrações semelhantes de lactamase (Figuras 6A e 6B), novamenteindicando que os níveis de expressão nas claras dos ovos foram compatíveiscom a totalidade do período de postura.

O galo 4133 foi cruzado com galinhas não transgênicas para seobter galinhas G2 hemizigotas. Das 15 galinhas transgênicas analisadas, todastinham lactamase na clara dos ovos em concentrações variando de 0,47 a 1,34μg/ml. Quatro galinhas representativas são mostradas na Figura 7A. Quandoensaiado 6 meses mais tarde, o nível médio de expressão havia caído deaproximadamente 1,0 μg/ml para 0,8 μg/ml (Figura 7A). Os níveis deexpressão foram elevados nos ovos iniciais e nivelados durante vários meses.Depois disso, as concentrações da lactamase nos ovos permaneceramconstantes.

A galinha G2 8150 e o galo G2 8191 parente, foram cruzadospara produzir galinhas G3 hemizigotas e homozigotas. Todas as galinhas G3transgênicas expressaram a lactamase na clara de seus ovos em concentraçõesvariando de 0,52 a 1,65 μg/ml (Figura 7B). A expressão média quanto àsgalinhas G3 que eram homozigotas foi 47 % mais elevada do que aquelasgalinhas G2 e galinhas G3 que eram hemizigotas. A quantidade de lactamasenos ovos das galinhas G2 e G3 reproduzidas do galo 4133 e sua prole variousignificativamente (Figuras 7A e 7B), embora os níveis nos ovos de qualquerdada galinha naquele grupo fossem relativamente constantes. Esperou-se quea expressão média da lactamase dobrasse para o genótipo homozigoto. Aanálise de Western blot confirmou que o transgene estava fielmenteproduzindo lactamase intacta nos ovos de G2 transgênicos. O nível delactamase detectado em um Western blot também se correlacionouintimamente com aquele determinado pelo ensaio de atividade enzimática,indicando que uma porção significativa da lactamase da clara de ovos erabioativa. Assim,vetores retrovirais foram com sucesso empregados paraimplementar expressão estável e confiável de um transgene nas galinhas.

A deposição da lactamase na gema foi detectável, mas inferioràquela da clara de ovo. Sete galinhas G2 ou G3 da linhagem do galo 4133,foram analisadas e a concentração na gema variou de 107 a 375 ng/ml oucerca de 20 % da concentração na clara de ovo. Não houve nenhumacorrelação entre os níveis de lactamase na gema e na clara dos ovos de umadada galinha (Harvey et al., iiExpression of exogenous protein in egg white oftransgenic chíckens" (abril de 2002) Nat. Biotechnol. 20: 396-399).Exemplo 6

Produção de machos criadores

White Leghorn fertilizados recém-postos. Sete a dez microlitros de partículasconcentradas foram injetados na cavidade subgerminal dos ovos providos deperfurações e os pintos foram incubados após selagem das perfurações. 546ovos receberam a injeção. O DNA do sangue foi extraído e analisado quanto àpresença do transgene, com o uso de um conjunto de sonda-preparadorprojetado para detectar o gene neo-resistente através do ensaio de Taqman.Como se pode observar na Tabela 2 abaixo, aproximadamente 25 % de todosos pintos tiveram níveis detectáveis de transgenes no DNA de seu sangue.

Para a transdução de pNLB-CMV-BL, foram usados ovos de

TABELA 2

SUMÁRIO DE TRANSGÊNESE COM OS VETORES NLB-CMV-BL

<table>table see original document page 77</column></row><table>Número de machos com transgene no

DNA de seu esperma (%) 3 (5,4 %)

TABELA 2

SUMÁRIO DE TRANSGÊNESE COM OS VETORES NLB-CMV-BL

<table>table see original document page 78</column></row><table>

Exemplo 7

Transmissão da linha germinativa do transgene

A detecção de Taqman do gene de neo-resistência no DNA doesperma foi usada para identificar os machos GO candidatos para areprodução. Três machos GO foram identificados, em que cada um tinha otransgene NLB-CMV-BL no DNA do seu esperma em níveis que se situavamacima dos antecessores. Todos os machos GO positivos quanto ao transgeneem seu esperma foram cruzados com galinhas transgênicas para identificarcompletamente a prole de Gl transgênica.

Quanto ao NBL-CMV-BL, 1026 pintos foram reproduzidos,respectivamente, e três pintos Gl foram obtidos para cada transgene (Tabela2, acima). Toda a progênie de Gl proveio do macho com o mais elevado nívelde transgene no DNA do seu esperma, não obstante um número equivalentede pintos tenha sido reproduzido de cada macho.Exemplo 8

Análise de southern de gls e g2s

A fim de confirmar a integração e a integridade das seqüênciasde vetor introduzidas, a análise de Southern blot foi realizada sobre o DNAdos transgênicos Gl e G2. O DNA do sangue foi digerido com HindIII ehibridizado a uma sonda de neo-recistência para deterctar fragmentos dejunção criados pelo sítio interno de HindIII observado no vetor pNLB-CMV-BL (Figura 3B) e nos sítios genômicos flanqueando o sítio de integração.Cada uma das 3 aves Gl carretando NLB-CMV-BL tinha um fragmento dejunção de tamanho único, indicando que o transgene havia se integrado emtrês diferentes sítios genômicos. Os Gls foram procriados em galinhas nãotransgênicas para se obter G2s hemizigotos. Como se pode observar na Tabela2 (acima), 50,8 % da progênie dos gaios Gl abrigando NLB-CMV-BL eramtransgênicos, como esperado pela segregação mendeliana de um transgeneintegrado único. A análise de Southern do DNA digerido por HindIII da prolede G2 detectou fragmentos de junção similares no tamanho àqueles que seoriginaram de seus progenitores transgênicos, indicando que o transgene foitransmitido intacto.Exemplo 9

Triagem do homozigoto da prole s3 para o transgene

De modo a obter-se homozigotos de galinhas transgênicas parao transgene, aves homozigotas G2 tendo NLB-CMV-BL integrado no mesmosítio (por exemplo, a progênie do mesmo macho Gl) foram cruzadas. Doisgrupos foram cruzados: o primeiro foi uma galinha e um galo originário domacho 4133 Gl e o segundo, da galinha 5657 Gl. O ensaio de Taqman foiusado para detectar quantitativamente o transgêne de neo-resistência naprogênie G3 com o uso de uma curva padrão. A curva padrão foi construídacom o uso de quantidades conhecidas do DNA genômico do hemizigotomacho transgênico 4133 para o transgene, determinado pela análise deSouthern. A curva padrão variou de IO3 a 1,6 χ IO4 total de cópias dotransgene, ou 0,2 a 3,1 cópias de transgenes por genoma diplóide. Tendo emvista que os componentes da reação não foram limitados durante a faseexponencial, a amplificação foi muito eficiente e deu valores reprodutíveispara um dado número de cópias. Houve uma diferença reprodutível de umciclo entre cada curva padrão diferindo duplamente no número de cópia.

A fim de determinar o número de alelos de transgenes na prolede G3, os DNAs foram amplificados e comparados com os padrões, ODNAdos não transgênicos não foram amplificados. As aves homozigotasquanto ao alelo transgênico deu origem a gráficos iniciando a amplificaçãoum ciclo mais cedo do que aquelas hemizigotas quanto ao alelo. O programade detecção de seqüências foi capaz de calcular o número de alelos em umaamostra de DNA desconhecida, com base na curva padrão, o limite do ciclo(Ct) em que um gráfico de amplificação da amostra apresentou uma elevaçãosignificativa. Os dados são apresentados na Tabela 3 abaixo.

A fim de confirmar a análise do número de cópias de Taqman,o DNA de aves selecionadas foi analisado pela Southern blotting com o usodo DNA digerido em PstI, e uma sonda complementar ao gene de neo-resistência para detectar um fragmento de 0,9 kb. A detecção de umfragmento pequeno foi escolhida, tendo em vista que a transferência de DNAsmenores do gel para a membrana é mais quantitativa. A intensidade de sinalda banda de 0,9 kb correspondeu bem ao número de cópias das avestransgênicas G3, como foi determinado pelo ensaio de Taqman. Os númerosde cópias de um adicional de dezoito aves transgênicas G3 analisadas porSouthern blotting, foram também compatíveis com aquele determinado porTaqman. Um total de 33 progênies foi analisado quanto à linhagem 4133, doqual 9 (27,3 %) eram de não transgênicos, 16 (48,5 %) eram hemizigotos, e 8(24,2 %) eram homozigotos. Um total de 10 progênies foi analisado quanto àlinhagem 5657, dentre as quais 5 (50,0 %) eram não transgênicas, 1 (10,0 %)era hemizigota e 4 (40,0 %) eram homozigotas. A relação observada de nãotransgênicas, hemizigotas e homozigotas quanto à progênie G3 da linhagemde 4133, não foi estatisticamente diferente da relação esperada de 1:2:1conforme se determinou pelo teste χ2 (Ρ é menor ou igual a 0,05). A progênieda linhagem 5657 não teve a distribuição esperada, mas isto pode ter sidodevido ao baixo número de progênies testadas (Harvey et al., iiConsistentproduction of transgenic chickens using replication deficient retroviralvectors and high-throughput screening procedures" (fevereiro de 2002)Poultry Science 81: 202-212).TABELA 3

DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DE TRANSGENES NAPROLE ORIGINADA DE TRANSGÊNICOS G2

<table>table see original document page 81</column></row><table>

1N- do Padrão: número padrão; NTC: nenhum controle de gabarito

2Ct: limite de ciclo; ciclo no qual uma fluorescência de amostra tenhaapresentado um aumento significativo acima dos antecessores.

As cópias por genoma diplóide foram determinadas pela divisão da médiapor 5100 e arredondando-se as primeiras casas decimais mais próximas.4NA: não aplicávelExemplo 10

Construção de vetor para o vetor pnlb-mdot-epo

Seguindo-se os preceitos do Exemplo 1 (Construção de Vetor)do relatório descritivo, um vetor pNLB-MDOT-EPO foi criado, substituindouma seqüência codificadora BL pela seqüência codificando EPO (Figura 8B),Ao invés de se usar o promotor de CMV, o MDOT foi usado (Figura 13).MDOT é um promotor sintético que contém elementos tanto do promotor deovomucóide (MD) quanto de ovotransferrina (TO). (Vetor pNLB-MDOT-EPO, a.k.a. pAVIJCR-A145.27.2.2).

A seqüência de DNA para a EPO humana com base no uso docódon otimizado do oviduto de galinha foi criada com o uso do programaBACKTRANSLATE da Wisconsin Package, versão 9.1 (Genetics ComputerGroup, Inc., Madison, Wis) com uma tabela de aplicação do códon compiladadas proteínas ovalbumina, lisozima, ovomucóide e ovotransferrina de galinha(<Gallus gallus). A seqüência de DNA foi sintetizada e clonada na projeçãoT's 3' de pCRII-TOPO (Invitrogen) pela Integrated DNA Technologies,Coralville, Iowa, em uma base contratual. A seqüência codificadora de EPOfoi então removida de pEpoMM com Hind III e Fse I, purificada de um Gelde agarose-TAE a 0,8 % e ligada a Hind III e Fse I digeridos, pCMV-IFNMMtratado com fosfatase alcalina. O plasmídeo resultante foi o pAVIJCR-Al37.43.2.2 que continha a seqüência codificando EPO controlada pelopromotor/intensificador prematuro imediato de citomegalovírus e o sítiopoliA de SV40. O plasmídeo pAVIJCR-A137.43.2.2 foi digerido com Nco I eFse Ieo fragmento apropriado foi ligado a um fragmento digerido por Nco Ie Fse I do pMDOTIFN para se obter pAVIJCR-A137.87.2.1 que continhaEPO conduzido pelo promotor MDOT. A fim de clonar a seqüênciacodificadora de EPO controlada pelo promotor MDOT no plasmídeoretroviral NLB, os plasmídeos pALVMDOTIFN e pAVIJCR-Al37.87.2.1foram digerido com Kpn I e Fse I. Os fragmentos de DNA apropriados forampurificados em um gel de agarose-TAE a 0,8 %, depois ligados etransformados dentro de células DH5 α. O plasmídeo resultante foi o pNLB-MDOT-EPO (a.k.a. pAVIJCR- A145.27.2.2).Exemplo 11

Produção de galinhas transgênicas e galinhas gl completamente transgênicasexpressando epo

A produção de partículas de transdução de NLB-MDOT-EPOfoi realizada como descrito para NLB-CMV-BL (ver Exemplo 2).Aproximadamente 300 ovos de White Leghorn foram perfurados de acordocom o procedimento de Speksnijder (Patente U.S. nfi 5.897.998), depoisinjetaram-se cerca de 7 χ IO4 partículas de transdução por ovo. Os ovos foramchocados 21 dias após a injeção, e os níveis de EPO humana foram medidospor ELISA da EPO das amostras de soro colhidas dos pintos uma semanaapós o choco.

A fim de se triar quanto aos gaios GO que continham otransgene de EPO em seu esperma, o DNA foi extraído das amostras deesperma dos gaios mediante extração de Chelex-100 (Walsh et al., 1991). Asamostras de DNA foram então submetidas à análise de Taqman® em umDetector de Seqüências 7700 (Perkin Elmer) usando-se os iniciadores "neofor-1" (5'- TGGATTGCACGCAGGTTCT-3'; SEQ ID NO: 5) e "neo rev-1"(5'- TGCCCAGTCATAGCCGAAT-3'; SEQ ID NO: 6) e o NEO-PROBE1rotulado FAM (5'-CCTCTCCACCCAAGCGGCCG-3'; SEQ ID NO: 7) paradetectar o transgene. Oito gaios FO com os mais elevados níveis do transgenenas amostras do seu esperma, foram cruzados com galinhas SPAFAS (WhiteLeghorn) não transgênicas mediante inseminação artificial. As amostras deDNA do sangue foram tríadas quanto à presença do transgene mediante aanálise de Taqman® como descrito acima.

Da prole de 1.054, 16 pintos foram observados seremtransgênicos (aves Gl). O soro dos pintos foi testado quanto à presença deEPO humano pelo ELISA da EPO, e a EPO estava presente em cerca de 70nanogramas/ml (ng/ml). A clara dos ovos das galinhas Gl foi também testadaquanto à presente de EPO humana mediante ELISA da EPO, e observou-seconter EPO humana em cerca de 70 ng/ml. A EPO presente nos ovos (isto é,derivada da seqüência codificadora otimizada da EPO humana) foi observadaser biologicamente ativa quando testada em uma linhagem de célulasresponsivas à EPO humana (células eritróides murinas HCD57) em um ensaiode cultura celular.Exemplo 12

Construção de vetor para pnlb-cmv-ifn

Seguindo-se os preceitos do Exemplo 1, um vetor pNLB-CMV-IFN foi criado (Figura 8A), substituindo uma seqüência codificadora deBL pela seqüência codificadora de IFN codificando a seqüência do Exemplo1.

Uma seqüência codificadora otimizada foi criada, na qual oscódons mais freqüentemente usados para cada aminoácido particularencontrado nas proteínas ovalbumina, lisozima, ovomucóide e ovotransferrinada clara de ovo, foram usados no projeto da seqüência codificadora de IFN-a2b humana otimizada que foi introduzida nos vetores da presente invenção.Mais especificamente, a seqüência de DNA para o IFN-α 2b humanootimizado baseia-se no uso do códon otimizado do oviduto de galinha, e foicriada com o uso do programa BACKTRANSLATE da Wisconsin Package,Versão 9.1 (Genetics Computer Group Inc., Madison, Wis.) com uma tabelade aplicação do códon compilada das proteínas ovalbumina, lisozima,ovomucóide e ovotransferrina de galinha {Gallus gallus). Por exemplo, opercentual de uso para os quatro códons do aminoácido alanina nas quatroproteínas da clara de ovo é de 34 % para GCU, 31 % para GCC, 26 % paraGCA e 8 % para GCG. Portanto, o GCU foi usado como o códon para amaioria das alaninas na seqüência codificadora de IFN-α 2b humanootimizado. Os vetores contendo o gene para IFN-α 2b humano otimizadoforam usados para criar aves transgênicas que expressem o interferon-α 2bderivado de aves domésticas transgênicas (IFN-α 2b TPD) em seus tecidos eovos.

Os gabaritos e os oligonucleotídeos iniciadores listados naTabela 4 abaixo foram amplificados por PCR com Pfu polimerase(Stratagene, La Jolla, Califórnia) com o uso de 20 ciclos de 94 0C por 1minuto; 50 0C por 30 segundos; e 72 0C por 1 minuto e 10 segundos. Osprodutos da PCR foram purificados de um gel de poliacrilamida-TBE a 12 %pelo método de "esmagar e embeber" (Maniatis et al. 1982), depois foramcombinados como gabaritos em uma reação de amplificação com o usoapenas de IFN-I e IFN-8 como iniciadores (ver Tabela 4). O produto de PCRresultante foi digerido com Hind III e Xba Ieo gel foi purificado de um gelde agarose-TAE a 2 %, depois ligado em Hind III e Xba I digerido,pBluescript KS tratado com fosfatase alcalina (Stratagene), resultando noplasmídeo pBluKSP-IFNMagMax. Ambos os filamentos foram seqüenciadospor seqüenciação de ciclo em um Seqüenciador de DNA ABI PRISM 377(Perkin-Elmer, Foster City, Califórnia) com o uso dos iniciadores T7 ou T3universais. As mutações em pBluKSP-IFN derivado dos gabaritos originaisdo oligonucleotídeo foram corrigidas por mutagênese dirigida ao sítio com oKit Transformador de Mutagênese Dirigida ao Sítio (Clontech, Palo Alto,Califórnia). A seqüência codificadora de IFN foi então removida dopBluKSP-IFN corrigido com Hind III e Xba I digerido, pCMV-BetaLa-3B-dH tratado com fosfatase alcalina. O plasmídeo resultante foi o pCMV-IFNque continha uma seqüência codificadora de IFN controlada pelopromotor/intensificador prematuro imediato de citomegalovírus e o sítiopoliA de SV40. De modo a clonar a seqüência codificadora de IFN controladapelo promotor/intensificador de CMV no plasmídeo retroviral NLB, o pCMV-IFN foi primeiro digerido com ClaI e XbaI5 depois ambas as extremidadesforam enchidas com o fragmento de Klenow da DNA polimerase (NewEngland BioLabs, Beverly, Massachusetts). O adaptador de pNLB foidigerido com NdeI e KpnI5 e ambas as extremidades foram tornadasembotadas pela T4 DNA polimerase (New England BioLabs). Os fragmentosde DNA apropriados foram purificados em um gel de agarose-TAE a 0,8 %,depois ligados e transformados nas células DH5 α. O plasmídeo resultante foio pNLB-adaptador-CMV-IFN. Este plasmídeo foi então digerido com MluI eparcialmente digerido com BlpI e o fragmento apropriado foi purificado emgel. O pNLB-CMV-EGFP foi digerido com MluI e BlpI5 depois tratado comfosfatase alcalina e purificado em gel. O fragmento parcial Mlul/Blpl depNLB-adaptador-CMV-IFN foi ligado ao grande fragmento derivado dodigesto Mlul/Blpl de pNLB-CMV-EGFP criando o pNLB-CMV-IFN.TABELA 4

<table>table see original document page 86</column></row><table>Exemplo 13

Produção de galinhas transgênicas e galinhas gl completamente transgênicasexpressando ifii

As partículas de transdução de pNLB-CMV-IFN foramproduzidas seguindo-se os procedimentos do Exemplo 2. Aproximadamente300 ovos de White Leghorn (Linhagem 0 da cepa) foram perfurados deacordo com o procedimento de Speksnijder (Patente U.S. na 5.897.998),depois receberam a aplicação de injeção com cerca de 7 χ IO4 partículastransdutora por ovo. Os ovos foram chocados 21 dias após a injeção, e osníveis de IFN humano foram medidos por ELISA de IFN das amostras desoro colhidas dos pintos uma semana após o choco.

De modo a triar quanto aos gaios GO que contivessem otransgene de IFN em seu esperma, o DNA foi extraído das amostras deesperma dos gaios mediante extração de Chelex-100 (Walsh et al., 1991). Asamostras de DNA foram então submetidas à análise de Taqman® em umDetector de Seqüências 7700 (Perkin Elmer) com o uso dos iniciadores "neofor-1" (5'- TGGATTGCACGCAGGTTCT-3'; SEQ ID NO: 5) e "neo rev-1"(5'- GTGCCCAGTCATAGCCGAAT-3'; SEQ ID NO: 6) e o NEO-PROBE1rotulado FAM (5'-CCTCTCCACCCAAGCGGCCG-3'; SEQ ID NO: 7) paradetectar o transgene. Três gaios GO com os mais elevados níveis do transgenenas amostras do seu esperma, foram cruzados com galinhas SPAFAS (WhiteLeghorn) não transgênicas mediante inseminação artificial. As amostras deDNA do sangue foram triadas quanto à presença do transgene mediante aanálise de Taqman® como descrito acima. Da prole de 1.597, um galo foiobservado ser transgênico (a.k.a. "Alphie"). O soro do Alphies foi testadoquanto à presença de hlFN pelo ELISA do hIFN, e o hlFN estava presente em200 ng/ml.

O esperma dos Alphies foi usado para inseminação artificial degalinhas SPAFAS (White Leghorn) não transgênicas. 106 das 202 (cerca de52 %) da prole continham o transgene, o que foi detectado pela análise deTaqman®. Os resultados desta prole seguiu um padrão de herança mendelianoe indicou que o Alphie é transgênico.

Exemplo 14

Análise de carboidrato do interferon-α 2b derivado de aves domésticastransgênicas (ifn-α 2b tpd)

A evidência experimental revelou um novo padrão deglicosilação no interferon-α 2b derivado de aves (isto é, IFN-α 2b TPD). OIFN-a 2b TPD foi observado conter duas novas formas glico (bandas 4 e 5são dissacarídeos prolongados em α-Gal, ver a Figura 9) não normalmenteobservadas no leucócito do sangue periférico humano derivado do interferon-α 2b (IFN-α 2b do PBL) ou do interferon-α humano natural (hlFN natural).Observou-se também que o IFN-α 2b TPD contém estruturas de carboidratoO-Iigadas que são similares ao IFN-α 2b do PBL e foi mais eficientementeproduzido em galinhas do que na forma humana.

A seqüência codificadora para o IFN-α 2b humano foiotimizada (Exemplo 12, acima) resultando em uma seqüência codificadora deIFN-α 2b humano. O IFN-α 2b TPD foi então produzido nas galinhas(Exemplo 13, acima). Uma análise de carboidratos, incluindo uma análise demonossacarídeos e análise FACE, revelou a composição de açúcar ou novopadrão de glicosilação da proteína. Como tal, o IFN-α 2b TPD apresentou osseguintes resíduos de monossacarídeos: N-Acetil-Galactosamina (NAcGal),

Galactose (Gal), N-Acetil-Glicosamina (NAcGlu) e Acido Siálico (SA).Nenhuma glicosilação N-Iigada foi encontrada no IFN-α 2b TPD. Ao invésdisso, o IFN-α 2b TPD foi observado ser O-glicosilado na Thr-106. Este tipode glicosilação é semelhante do IFN-α 2 humano, em que o resíduo de Thr naposição 106 é único para o IFN-α 2. Além disso, o IFN-α 2b TPD foiobservado não possuir nenhum resíduo de manose. Uma análise FACErevelou 6 bandas (Figura 9) que representam vários resíduos de açúcar, emque as bandas 1, 2 e 3 são não sialiladas, mono-sialiladas e di-sialiladas,respectivamente (Figura 10). A articulação do ácido siálico (SA) é alfa 2-3 àGalactose (Gal) e alfa 2-6 à N-Acetil-Galactosamina (NAcGal). A banda 6representa um tetrassacarídeo não sialilado. As bandas 4 e 5 são observadasserem dissacarídeos prolongados alfa-Galactose (alfa-Gal) que não sãoobservados no IFN-α 2b do PBL humano. A Figura 10 apresenta acomparação do IFN-α 2b TPD (hlFN da clara de ovo) com o IFN-α 2b doPBL humano (hlFN natural). As bandas menores se achavam presentes entreas bandas 3 e 4 e entre as bandas 4 e 5 no IFN-α 2b TPD (vide abaixo).

A proteína foi observada ser O-glicosilada na Thr-106 comresíduos específicos tais como:(i) Gal-NAcGal-

(ii) SA-Gal-NAcGal-

(iii) SA-Gal-NAcGal-.

(iv) Gal-NAcGlu-NAcGal-,

(v) Gal-Gal-NAcGal-

(vi) Gal-Gal-NAcGal-

em que Gal = Galactose,

NAcGal = N-Acetil-Galactosamina,

NAcGlu = N-Acetil-Glicosamina, e

SA = Ácido Siálico.

Os percentuais foram como segue:

(i) Gal-NAcGal- é de cerca de 20 %

(ii) SA-Gal-NAcGal- é de cerca de 29 %

(iii) SA-Gal-NAcGal- é de cerca de 9 %<formula>formula see original document page 90</formula>

As bandas menores se estiveram presentes entre as bandas 3 e4 e entre as bandas 4 e 5 que respondem por cerca de 17 % no IFN-α 2b TPD.Exemplo 15

Expressão dos mabs da transfecção do plasmídeo e transdução retroviral como uso do ires da emcv nas células aviárias

A cadeia leve (LC) e a cadeia pesada (HC) de um anticorpomonoclonal humano foram expressas a partir de um vetor único, o pCMV-LC-emcvIRES-HC, mediante a substituição de um IRES do vírus daencefalomiocardite (EMCV) (ver também Jang et ai. (1988) "A segment of the5' nontranslated region of encephalomyocarditis vírus RNA directs internaientry of ribosomes during in vitro translation" J. Virol. 62: 2636-2643) entreas seqüências codificadoras de LC e de HC. A transcrição foi conduzida pelopromotor do CMV.

De modo a testar a expressão dos anticorpos monoclonais dedois vetores separados, a LC ou a HC ligada ao promotor do CMV foramcotransfectados nas células LMH/2a, uma linhagem de células de hepatócitosde galinha responsiva ao estrogênio (ver também Binder et ai. (1990)iiExpression of endogenous and transfected apolipoprotein II and vitellogeninIIgenes in an estrogen responsive chicken liver cell Iine" Mol. Endocrinol. 4:201-208). A cotransfecção do pCMV-LC e pCMV-HC resultou em 392 ng/mlde MAbs determinados por um ELISA de MAb, enquanto a transfecção dopCMV-LC-emcvIRES-HC resultou em 185 ng/ml de MAb.

O cassete de CMV-LC-emcv-HC foi introduzido em um vetorretroviral com base no vírus da leucemia murina de Moloney (MLV), criandoo pL-CMV-LC-emcvIRES-HC-RN-BG. As células LMH (ver tambémKawaguchi et al. (1987) iiEstablishment and characterization of a chíckenhepatocellular carcinoma cell line, LMH" Câncer Res. 47: 4460-4464), alinhagem de progenitores de LMH/2a, foram usadas como células alvo porqueelas não são resistentes à neomicina. As células LMH foram transduzidas como vetor retroviral L-CMV-LC-emcvIRES-HC-RN-BG e selecionadas comneomicina e passaram por várias semanas. As células LMH foramseparadamente transduzidas e a neomicina foi selecionada com o vetor MLV,o LXRN. Os meios das células do LXRN foram negativos quanto a MAb,enquanto os meios das células transduzidas pelo L-CMV-LC-emcvIRES-HC-RN-BG continham 22 ng/ml de MAb.

Exemplo 16

Produção de galinhas transgênicas e galinhas gl completamente transgênicasexpressando mabs.

Um vetor pNLB-CMV-LC-emcv-HC é produzido pelasubstituição do cassete CMV-BL de pNLB-CMV-BL do Exemplo 1 pelocassete CMV-LC-emcv-HC do Exemplo 15.

As partículas de transdução do pNLB-CMV-LC-emcv-HC sãoproduzidas seguindo-se os procedimentos do Exemplo 2. Aproximadamente300 ovos de White Leghorn (Linhagem da cepa 0) são perfurados de acordocom o procedimento de Speksnijder (Patente U.S. n° 5.897.998) e recebementão a injeção comcerca de 7 χ IO4 partículas de transdução por ovo. Os ovossão chocados 21 dias após a injeção, e os níveis de MAb humano são medidospor ELISA a partir das amostras de soro colhidas de pintos uma semana apóso choco.

Os gaios GO que contém o transgene em seu esperma sãoidentificados pela análise de Taqman®. Três gaios GO com os mais elevadosníveis do transgene nas amostras de seu esperma são cruzados com galinhasSPAFAS (White Leghorn) não transgênicas mediante inseminação artificial.Mais de 1000 rebentos são triados e mais do que 10 pintos sãoobservados serem transgênicos (aves Gl), O soro dos pintos é testado quantoà presença de MAb por ELISA. O MAb é observado estar presente em umaquantidade de mais do que 10 μ^ηιΐ de soro. A gema dos ovos das galinhasGl é também testada quanto à presença do MAb por ELISA e observou-seestar presente em uma quantidade de mais do que 10 μg/ml da clara de ovo.

Exemplo 17

Construção de pnlb-cmv-hg-csf

A construção deste vetor substitui eficazmente a regiãocodificadora de IFN do vetor pNLB-CMV-IFN do Exemplo 12 pela seqüênciacodificadora de G-CSF. A ORF do CSF (matriz de leitura aberta do fatorestimulador de colônias de granulócitos humanos) foi amplificada do pORF9-hG-CSFb (cat. na porf-hgcsfb, Invivogen, San Diego, CA) com os iniciadores5' GCSF (ggggggaagctttcaccatggctggacctgcca; SEQ ID NO: 32) e 3' GCSF(actagacttttcagggctgggcaaggtggcg; SEQ ID NO: 33) para criar um produto dePCR de 642 pares de base (BP). De modo a fornecer a construção de pNLB-CMV-hG-CSF com uma seqüência 3' da seqüência codificadora de G-CSFidêntica àquela encontrada em pNLB-CMV-IFN alfa-2b, um fragmento de 86pares de base de pNLB-CMV-IFN alfa-2b, que se acha presente adjacente àextremidade 3' da seqüência codificadora de INF, foi amplificado por PCRcom o uso dos iniciadores 5' GCSF-NLB (ccagccctgaaaagtctagtatggggattggtg;SEQ ID NO: 34) e 3' GCSF-NLB (gggggggctcagctggaattccgcc; SEQ ID NO:35). Os dois produtos da PCR (642 bp e 86 bp) foram misturados e fundidospor amplificação de PCR com os iniciadores 5' GCSF e 3' GCSF-NLB. Oproduto da PCR foi clonado no vetor do plasmídeo pCR®4Blunt-TOPO®(Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante, e eletroporado nascélulas DH5a-E, produzindo pFusion-hG-CSF-NLB. O pFusion-hG-CSF-NLB foi digerido com Hind III e Blp Ieo fragmento de G-CSF de 690 bp foipurificado em gel. A seqüência codificadora de IFN alfa-2b foi removida dopNLB-CMV-IFN alfa-2b por digestão com Blp I. O vetor foi então religado eforam selecionados os clones que careciam do inserto codificador de IFN5criando pNLB-CMV-delta hlFN alfa-2b. O pNLB-CMV-delta IFN alfa-2b foidigerido com Blp I e parcialmente digerido com Hind III, e o fragmento dobetor Blp I-Hind III de 8732 bp foi purificado em gel. O fragmento de 8732bp foi ligado ao fragmento de G-CSF Hind IlVBlp I de 690 bp para criarpNLB-CMV-G-CSF. A ORF do G-CSF foi verificada por seqüenciação.

Exemplo 18

Produção de galinhas transgênicas expressando o fator estimulador decolônias de granulócitos humanos (hg-csf).

A produção de partículas de transdução de NLB-CMV-hG-CSF foi realizada como descrito para NLB-CMV-BL no Exemplo 2. Osembriões de 277 ovos de estágio X foram injetados com 7 μL de partículas detransdução de NLB-CMV-hG-CSF (os títulos foram de 2,1 χ 10^7 a 6,9 χ 10^7).86 pintos foram chocados e foram desenvolvidos até a muturidade sexual. 60pintos foram testados positivos quanto a G-CSF, os quais foram igualmentedivididos por sexo; 30 machos e 30 fêmeas. A clara de ovo de 21 galinhas foiensaiada por ELISA quanto à presença de hG-CSF. Cinco galinhas foramobservadas terem níveis significativos de proteína de hG-CSF na clara de ovoem níveis que variavam de 0,05 ug/ml a 0,5 μg/ml.

O DNA foi extraído das amostras de esperma de galo medianteextração de Chelex-100 (Walsh et ai., 1991). As amostras de DNA foramentão submetidas à análise de Taqman® em um Detector de Seqüências 7700(Perkin Elmer) com o uso dos iniciadores SJ-G-CSF dianteiro(cagagcttcctgctcaagtgctta) e SJ-G-CSF reverso (ttgtaggtggcacacagcttct) e asonda, a sonda SJ-G-CSF (agcaagtgaggaagatccagggcg), para detectar otransgene. O galo com os mais elevados níveis do transgene nas amostras doseu esperma foi cruzado com galinhas SPAFAS não transgênicas (WhiteLeghorn) por inseminação artificial.As amostras de DNA do sangue foram tríadas quanto àpresença do transgene pela análise de Taqman® como descrito acima. Daprole de 2264 filhotes, 13 Gls foram observados serem transgênicos e cadaum deles foi soro-positivo quanto à presença do G-CSF com uma galinha(XGF498) tendo aproximadamente 136,5 ng/ml de G-CSF no soro e 5,6μg/ml de G-CSF na clara de ovo, cada um medido por ELISA.

Dois gaios Gl (QGF910 e DD9027), os quais eram da mesmalinhagem do XGF498 (portanto tendo o transgene idêntico introduzido emposição idêntica no genoma) foram cruzados com galinhas não transgênicas,para produzir descendentes fêmeas que produzissem ovos contendo G-CSFderivado de aves domésticas. As quantidades em miligramas do G-CSF forampurificadas da clara de ovo colhida dos ovos dos descendentes de QGF910 eDD9027. Os padrões das estruturas de glicosilação representativas do G-CSFderivado de aves domésticas foram determinados do G-CSF obtido comoapresentado no Exemplo 20.

Exemplo 19

Produção de galinhas transgênicas expressando a proteína de fusão quatro-fcdo antígeno do linfócito citotóxico humano (ctla4fc).

pNLB-1,80M-CTLA4Fc e pNLB-3,90M-CTLA4Fc foramconstruídos como apresentado no Pedido de Patente U.S. rr 11/047.184,depositado em 31 de janeiro de 2005, cujo teor fica aqui incorporado em suatotalidade como referência. A produção das partículas de transdução dopNLB-1,80M-CTLA4Fc e do pNLB-3,90M-CTLA4Fc foi realizada comodescrito quanto a pNLB-CMV-BL no Exemplo 2. Injetaram-se em 193 ovosde white leghorn 7 μΐ de partículas de transdução de pNLB-l,80M-CTLA4Fc(os títulos foram de ~4 χ 10^6) e 72 pintos foram chocados. 199 ovos de whiteleghorn receberam a injeção com 7 μL de partículas de transdução de pNLB-3,90M-CTLA4Fc (os títulos foram de ~4 χ 10^6) e 20 pintos foram chocados.

As claras de ovo de 30 galinhas produzidas com as partículaspNLB-l,80M-CTLA4Fc foram ensaiadas por ELISA quanto à presença deCTLA4-Fc. Observou-se que uma galinha possuía níveis significativos deproteína de CTLA4-Fc na clara de ovo em um nível médio de 0,132 μg/ml (5ovos ensaiados)

As claras de ovo de sete galinhas produzidas com as partículasde pNLB-3,90M-CTLA4Fc foram ensaiadas por ELISA quanto à presença deCTLA4-Fc. Duas galinhas foram observadas terem níveis significativos deproteína de CTLA4-Fc na clara de ovo em um nível médio de 0,164 μg/ml (5ovos ensaiados) para uma galinha, e um nível médio de 0,123 μg/ml (5 ovosensaiados) para a segunda galinha positiva.

Exemplo 20

Análise de carboidrato de g-csf derivado de aves domésticas transgênicas

As estruturas de oligossacarídeos de G-CSF de TPD foramdeterminadas pelo emprego das seguintes técnicas de análise, as quais sãobem conhecidas dos médicos de experiência na técnica. As análises deMALDI-TOP-MS (Espectrometria de massa de tempo-de-trajetória deionização de dessorção a laser auxiliada por matriz) e de ESI MS/MS(espectrometria de massa em tandem de ionização em eletropulverização)foram realizadas sobre os oligossacarídeos após liberação da estruturapeptídica. Os oligossacarídeos O-Iigados foram quimicamente liberados daproteína e foram permetilados com o uso do método de NaOH envolvendo areação com iodeto de metila sob DMSO anidro e extraídos em clorofórmioantes da análise. A espectrometria de massa direta foi realizada sobre o G-CSF glicosilado intacto. As análises foram também realizadas sobre asestruturas de polissacarídeos com o uso da análise de HPLC. Resumidamente,após liberação da estrutura protéica, as estruturas foram separadas com o usode HPLC. As amostras das espécies de polissacarídeos individuais foramdigeridas com certas enzimas e os produtos da digestão foram analisados porHPLC levando em conta a determinação das estruturas conforme é entendidona técnica.

As estruturas, como determinadas, são mostradas abaixo. Deforma interessante a Estrutura Cea Estrutura D podem ser formasprecursoras da Estrutura E mostrada na Figura. Estimou-se, sem que ainvenção ficasse limitada a isto, que a estrutura A se acha presente no G-CSFglicosilado derivado de aves domésticas em cerca de 20 % a cerca de 40 % dotempo, e que a estrutura B se acha presente no G-CSF glicosilado derivado deaves domésticas em cerca de 5 % a cerca de 25 % do tempo, e que a estrutura

C se acha presente no G-CSF glicosilado derivado de aves domésticas emcerca de 10 % a cerca de 20 % do tempo, e que a estrutura D se acha presenteno G-CSF glicosilado derivado de aves domésticas em cerca de 5 % a 15 %do tempo, e que a estrutura E se acha presente no G-CSF glicosilado derivadode aves domésticas em cerca de 1 % a cerca de 5 % do tempo, e que aestrutura F se acha presente no G-CSF glicosilado derivado de avesdomésticas em cerca de 10 % a cerca de 25 % do tempo, e que a estrutura Gse acha presente no G-CSF glicosilado derivado de aves domésticas em cerca

<formula>formula see original document page 96</formula>

A análise dos monossacarídeos foi realizada por GC/MS(cromatografia gasosa/espectrometria de massa) sobre G-CSF derivado deaves domésticas que havia sido reforçado com Arabitol (padrão interno),hidrolisado, N-acetilado e derivado de TMS com o uso de métodos facilmentedisponíveis àqueles habilitados na técnica. A amostra derivada foi comparadacom uma mistura padrão de açúcares similarmente derivados. A análise deácido siálico do G-CSF derivado de aves domésticas foi realizada apósreforço com ácido cetodeoxinonulosônico, liofilizado, depois hidrolisado e re-liofilizado. A análise da amostra foi realizada em um sistema Dionex BioLCusando-se padrões apropriados. Estas análises mostraram a presença degalactose, glicose, N-acetilgalactosamina, N-acetilglicosamima e ácido siálico(ácido N-acetilneuramínico) como observado na Tabela 5. Os dados naTabela 5 substituem os dados preliminares gerados pela análise de HPAEC-PAD que determinou que um maior percentual de N-acetilglicosaminaestivesse presente.

TABELA 5

<table>table see original document page 97</column></row><table>

A análise de ligação foi realizada em uma amostra de glicanopermetilado do G-CSF derivado de aves domésticas que foi hidrolizado emTFA e reduzido em borodeuterida sódica. O borato foi removido por trêsadições de metanohácido acético glacial (9:1), seguidas por liofilização e,depois, acetilação por anidrido acético. Após a purificação pela extração comclorofórmio, a amostra foi examinada por GC/MS. Uma mistura de padrõesfoi também desenvolvida sob as mesmas condições. As articulações foramdeterminadas como segue:

i. A articulação de ácido siálico é de 2 a 3 para a galactose ede 2 a 6 para a N-acetilgalactosamina

ii. A articulação da galactose é de 2 a 3 para a N-acetilgalactosamina e de 2 a 4 para a N-acetilglicosamina.iii. A articulação da N-acetilglicosamina é 2 a 6 para a N-acetilgalactosamina.

Exemplo 21

Atividade de proliferação celular in vitro do g-csf derivado de avesdomésticas (g-csf de tpd).

A atividade biológica in vitro do G-CSF de TPD foidemonstrada com o uso do ensaio de proliferação celular NFS-60.Resumidamente, as células NFS-60 foram mantidas em meio de crescimentocontendo G-CSF. As culturas confluentes foram colhidas, lavadas eplaqueadas em uma densidade de IO5 células por reservatório com meio decrescimento sozinho. O G-CSF de TPD e o G-CSF humano de origembacteriana (isto é, Neupogen®) foram diluídos em série em meio decrescimento e adicionados a reservatórios separados em triplicata. Aproliferação celular foi determinada por redução metabólica de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) e foi quantificadaespectrofotometricamente. A atividade específica do G-CSF aviário foideterminada por comparação da ED50 do Neupogen® com aquela do G-CSFderivado de ave purificado. A atividade específica do G-CSF de TPD duranteum período de 14 dias foi determinada ser bem excedente daquela do G-CSFde origem bacteriana Neupogen® (G-CSF não glicosilado). Ver Figura 17.

Todos os documentos (por exemplo, as patentes U.S., ospedidos de patentes U.S., as publicações) citadas no relatório descritivoacima, são aqui incorporados como referência. Várias modificações evariações da presente invenção serão evidentes àqueles habilitados na técnica,sem que se afaste do escopo e do espírito da invenção. Não obstante ainvenção tenha sido descrita em conexão com as formas de realizaçãoespecíficas preferidas, deve ficar entendido que a invenção, comoreivindicada, não deve ficar indevidamente limitada a tais formas derealização específicas. De fato, as várias modificações das formas derealização descritas para realizar a invenção, que sejam óbvias àqueleshabilitados na técnica, situar-se-ão dentro do escopo das seguintesreivindicações.

Claims (45)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende G-CSF tendo um padrão de glicosilação derivado de aves domésticas, em que opadrão de glicosilação é outro que não aquele do G-CSF produzido em umacélula de CHO.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o G-CSF é isolado.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o G-CSF está presente em um ovo de casca dura.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o G-CSF é glicosilado na célula do oviduto de uma ave.

5. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracterizadapelo fato de que a célula do oviduto é uma célula da glândula tubular.

6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o G-CSF é glicosilado na célula do oviduto de uma galinha.

7. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o G-CSF é glicosilado na treonina 133.

8. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que é uma composição farmacêutica.

9. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o G-CSF tem a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41.

10. Composição de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o padrão de glicosilação é outro que não aqueledo G-CSF produzido em uma célula humana.

11. Composição, caracterizada pelo fato de que compreendeG-CSF em que o G-CSF é glicosilado com:<formula>formula see original document page 101</formula>

12. Composição de acordo com a reivindicação 11,caracterizada pelo fato de que o G-CSF é obtido de um ovo de casca dura.

13. Composição de acordo com a reivindicação 11,caracterizada pelo fato de que o G-CSF é isolado.

14. Composição de acordo com a reivindicação 11,caracterizada pelo fato de que o G-CSF é glicosilado na treonina 133.

15. Composição de acordo com a reivindicação 11,caracterizada pelo fato de que o G-CSF tem a seqüência de aminoácidos daSEQ ID NO: 41.

16. Composição, caracterizada pelo fato de que compreendeuma molécula de G-CSF glicosilada com:Gal-NAcGlu-NAcGal-,

17. Composição de acordo com a reivindicação 16,caracterizada pelo fato de que o G-CSF está presente em um ovo de cascadura.

18. Composição de acordo com a reivindicação 16,caracterizada pelo fato de que o G-CSF é isolado.

19. Composição de acordo com a reivindicação 16,caracterizada pelo fato de que é glicosilada na treonina 133.

20. Composição de acordo com a reivindicação 16,caracterizada pelo fato de que o G-CSF tem a seqüência de aminoácidos daSEQ ID NO: 41.

21. Composição, caracterizada pelo fato de que compreendeuma molécula de G-CSF glicosilada com:Gal-NAcGlu-NAcGal-,<formula>formula see original document page 102</formula>

22. Composição de acordo com a reivindicação 21,caracterizada pelo fato de que o G-CSF está presente em um ovo de cascadura.

23. Composição de acordo com a reivindicação 21,caracterizada pelo fato de que o G-CSF é isolado.

24. Composição de acordo com a reivindicação 21,caracterizada pelo fato de que é glicosilada na treonina 133.

25. Composição de acordo com a reivindicação 21,caracterizada pelo fato de que o G-CSF tem a seqüência de aminoácidos daSEQ ID NO: 41.

26. Composição, caracterizada pelo fato de que compreendeuma molécula de G-CSF glicosilada com:<formula>formula see original document page 103</formula>

27. Composição de acordo com a reivindicação 26,caracterizada pelo fato de que o G-CSF está presente em um ovo de cascadura.

28. Composição de acordo com a reivindicação 26,caracterizada pelo fato de que o G-CSF é isolado.

29. Composição de acordo com a reivindicação 26,caracterizada pelo fato de que é glicosilada na treonina 133.

30. Composição de acordo com a reivindicação 26,caracterizada pelo fato de que o G-CSF tem a seqüência de aminoácidos daSEQ ID NO: 41.

31. Composição, caracterizada pelo fato de que compreendeuma molécula de G-CSF glicosilada com:<formula>formula see original document page 103</formula>

32. Composição de acordo com a reivindicação 31,caracterizada pelo fato de que o G-CSF está presente em um ovo de cascadura.

33. Composição de acordo com a reivindicação 31,caracterizada pelo fato de que o G-CSF é isolado.

34. Composição de acordo com a reivindicação 31,caracterizada pelo fato de que é glicosilada na treonina 133.

35. Composição de acordo com a reivindicação 31,caracterizada pelo fato de que o G-CSF tem a seqüência de aminoácidos daSEQ ID NO: 41.

36. Composição, caracterizada pelo fato de que compreendeuma molécula de G-CSF glicosilada com:Gal-NAcGal-.

37. Composição de acordo com a reivindicação 36,caracterizada pelo fato de que o G-CSF está presente em um ovo de cascadura.

38. Composição de acordo com a reivindicação 36,caracterizada pelo fato de que o G-CSF é isolado.

39. Composição de acordo com a reivindicação 36,caracterizada pelo fato de que é glicosilada na treonina 133.

40. Composição de acordo com a reivindicação 36,caracterizada pelo fato de que o G-CSF tem a seqüência de aminoácidos daSEQ ID NO: 41.

41. Composição, caracterizada pelo fato de que compreendeG-CSF contendo um padrão de glicosilação em que o padrão de glicosilação éoutro que não aquele do G-CSF produzido em uma célula de CHO, e o G-CSF é produzido em uma célula de oviduto de uma galinha.

42. Composição de acordo com a reivindicação 42,caracterizada pelo fato de que o G-CSF é isolado.

43. Composição de acordo com a reivindicação 41,caracterizada pelo fato de que a célula de oviduto é uma célula da glândulatubular.

44. Método para aumentar a contagem dos glóbulos brancosem um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a umpaciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de G-CSF de TPD.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizadopelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade queaumenta a contagem dos glóbulos brancos em um paciente, segundo umaquantidade desejada.